ブタウィルスの遺伝子を発現するアライグマポックスウィルス
本発明は、ベクターが、ヘマグルチニン（ｈａ）および／またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座で、単独またはブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ―２）のオープンリーディングフレーム、好ましくはＯＲＦ２と組み合わせた、一つ以上のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス株の複数のオープンリーディングフレーム、好ましくはＯＲＦ５、ＯＲＦ６および／またはＯＲＦ３／ＯＲＦ４／ＯＲＦ７によりコードされる、一つ以上の抗原タンパク質を発現する、新規の組換えアライグマポックスウィルスベクターワクチンに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単独、またはブタサーコウィルス（ＰＣＶ）と組み合わせて、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）の遺伝子を発現する、新規の組換えアライグマポックスウィルスベクター、およびＰＣＶおよび／またはＰＲＲＳＶにより引き起こされる疾患の予防におけるワクチンとしての、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）は、プラス鎖ＲＮＡウィルスであり、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ属に属する。ＰＲＲＳＶはブタに感染し、北米で１９８７年に最初に検出された「ブタミステリー病」を引き起こした後、１９９０年に欧州各地へと病気が広がった。１９９０年以来、ＰＲＲＳＶはブタの群れの生産に深刻な打撃を与え、ブタ産業に対する大きな世界的脅威となっている。
【０００３】
現在ではブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）として知られる、ブタミステリー病（青耳病、ブタの生殖器・呼吸器症候群（ＰＥＡＲＳ）または呼吸器症候群（ＳＩＲＳ）とも呼ばれる）は、妊娠後期の異常に高い流産件数、食欲不振、死産、胎児ミイラ化、分娩後呼吸系疾患、出生直後に呼吸器病または二次感染により死ぬ弱い子ブタをもたらす、妊娠した雌ブタの生殖不全を特徴とする。子ブタにおいては、ＰＲＲＳＶ感染は、呼吸困難と、７０％以上もの子ブタの死亡率に達しうる高い死亡率をもたらしうる。より年齢が高いブタは、軽度の呼吸器病または二次感染の兆候を示しうる。ウィルスはブタ集団に急速に広がり、最初の感染後２〜３ヶ月で群の最高９５％のブタが血清陽性となりうる。感染が安定化しても、若い雌ブタにより排泄されるＰＲＲＳＶが、妊娠した雌ブタに影響し、生殖の問題が再び発生する可能性が高い。ブタ育成群におけるＰＲＲＳの経済的打撃は、かなりのものである。
【０００４】
ブタミステリー病の原因としてオランダで最初に単離されたＰＲＲＳＶは、Ｌｅｌｙｓｔａｄウィルス（ＬＶ）として同定された（Ｇ．Ｗｅｓｖｏｏｒｔ等、Ｖｅｔ．Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ ３：１２１―１３０（１９９１））。そのすぐ後に、スペインで異なるＯｌｏｔ分離株が見つかった（Ｐｌａｎａ等、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３３：２０３．２１１，１９９２）。その後、ＰＲＲＳＶの新しい分離株が、いくつかの刊行物に記載されている（例えば、特許文献１、特許文献２および特許文献３を参照）。
【０００５】
さらなる刊行物は、全Ｌｅｌｙｓｔａｄウィルス（ＬＶ）ゲノム（Ｊ．Ｊ．Ｍ．Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ等、「Ｌｅｌｙｓｔａｄ ｖｉｒｕｓ，ｔｈｅ ｃａｕｓａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ａｂｏｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＥＡＲＳ），ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＬＤＶ ａｎｄ ＥＡＶ，」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９２：６２―７２（１９９３））；Ｔｕｂｉｎｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）ＰＲＲＳウィルス分離株（ＴＶ）ゲノムのセグメント（Ｋ―Ｋ．Ｃｏｚｅｌｍａｎｎ等、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ，」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：３２９―３３９（１９９３））および他の分離株等、ＰＲＲＳウィルス分離株の構造的特性を明らかにし、遺伝子のクローニングおよび配列決定を可能にした。
【０００６】
アルテリウィルスビリオンは、一般に直径が５０〜７０ｎｍであり、ハニカム様表層構造を伴う密着したエンベロープに囲まれた、直径３５ｎｍの異性体（大方は二十面体）のヌクレオカプシドを含む。ゲノムは、１３〜１５ｋｂの大きさの、線形のプラスセンスの単一の分子、ｓｓＲＮＡから成る。ＰＲＲＳウィルスは、５０〜６０ｎｍの大きさを有し、約３０〜３５ｎｍのエンベロープがヌクレオカプシド、および単一のＲＮＡ分子に含まれる。ＰＲＲＳＶのゲノムＲＮＡは、約１５ｋｂ（１５０００塩基対）である。ゲノムは、ＲＮＡレプリカーゼ（ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂ）、糖タンパク質ＧＰ２〜ＧＰ５、膜内在性タンパク質Ｍ、およびヌクレオカプシドタンパク質Ｎ（ＯＲＦ２〜７）をコードする。ゲノムＲＮＡは、フルレングスのマイナスセンス複製中間体により合成される。
【０００７】
ＰＲＲＳＶゲノムの一本鎖ＲＮＡ分子は、３’末端にポリＡテールを含む。構造は、ウィルスタンパク質をコードする七つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ＯＲＦ１〜ＯＲＦ７は、それらの間に小さな重複セグメントを示す。ウィルスタンパク質の合成は、長さが異なるが、類似の３’ポリアデニル化末端および非コード５’末端配列から始まる５’リーダー配列の、一群のサブゲノム転写産物（ｍＲＮＡ）から生成される。このウィルスタンパク質発現の形は、ネステッドｍＲＮＡと考えられ、過去にコロナウィルスについて記載されている（Ｗ．Ｊ．Ｍ．Ｓｐａａｎ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２９３９―２９５２（１９８８））。Ｌｅｌｙｓｔａｄ（ＬＶ）およびＴｕｂｉｎｇｅｎ（ＴＶ）ＰＲＲＳＶウィルス分離株のヌクレオチド配列に基づいて、他のアルテリウィルスで観察されたものとの相同性により、ウィルスゲノムにおいて、ＯＲＦ１（ａおよびｂ）が、ウィルスポリメラーゼおよびレプリカーゼをコードすることが提唱されている。ＯＲＦ２〜ＯＲＦ６は、ウィルスエンベロープタンパク質をコードし、ＯＲＦ７は、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする。ウィルスレプリカーゼおよびポリメラーゼは、それぞれ２６０および１６３ｋＤａの大きなサイズのタンパク質であり、いずれも、三つの潜在的グリコシル化部位を含む。３’末端に位置するエンベロープタンパク質（ＯＲＦ２〜６）は小さく、３０および１９ｋＤａの間である。それら全てが、二つ以上の潜在的グリコシル化部位を含み、特にＯＲＦ３は７つの部位を含む。これらのタンパク質は全て、アミノ（Ｎ）およびカルボキシ（Ｃ）末端に、リーダー配列および膜アンカとして働きうる疎水性配列を含む。一般にそれらは、膜に結合されるそれらの位置と調和する、疎水性タンパク質である。ＯＲＦ６は、Ｎ末端の９０アミノ酸残基内に位置する３つの疎水性セグメントを有する。ウィルスヌクレオカプシドに対応する可能性があるＯＲＦ７によりコードされるタンパク質は、Ｎ末端にアルギニン、リシンおよびヒスチジン残基を伴って強塩基性である。ＬＶおよびＴＶウィルスポリメラーゼ、構造タンパク質およびヌクレオカプシドのアミノ酸配列は、ＬＤＶウィルスとの比較において２９％および６７％の間の同一性を示し、ＥＡＶウィルスとの比較において２０％および３６％の間の同一性を示す。
【０００８】
ＰＲＲＳＶにより引き起こされる病気は、ブタ産業への深刻な世界的損失の原因である。このため、ＰＲＲＳＶにより引き起こされる感染を防止できるワクチンを開発する研究が行われている。以前のワクチン開発は、ＰＲＲＳＶが宿主細胞（ブタ）の一次肺胞マクロファージおよびサル腎臓細胞系統において成長するという事実を基礎とする。大部分において、特許文献４、特許文献２、特許文献３および特許文献５に説明されるＰＲＲＳＶに対する過去のワクチンは、マクロファージで成長させ、その後不活性化させたウィルスから得られる従来のワクチンである。ワクチンは、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）を回避し、雌ブタの生殖異常を防止できるものとして開示される。
【０００９】
ブタの健康にとってやはり重要なのは、離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）と呼ばれる別の病気の蔓延である。ＰＭＷＳは、典型的に生後約５〜１８週間目の離乳期子ブタを襲うが、子ブタの健康への現在のまたは潜在的な脅威として広がっており、世界のブタ産業の経済的利益に深刻な影響を与える。ＰＭＷＳの臨床徴候は、進行性の体重減少、呼吸困難、頻呼吸、貧血、下痢および黄疸からなる。離乳期子ブタに多いが、この衰弱性疾患は、ブタ、雄ブタおよび成熟豚を含むブタ科の任意の動物に影響しうる。死亡率は世界中で１％〜２％の範囲であり、一部の複雑なケースでは最高４０％に上りうる。ブタサーコウィルス２型（一般にＰＣＶ―２と呼ばれる）は、ＰＭＷＳの主な原因物質として同定されている（Ｇ．Ｍ．Ａｌｌａｎ等、「Ｎｏｖｅｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｐｉｇｓ ｗｉｔｈ ｗａｓｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，」Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．，Ｖｏｌ．１４２，ｐａｇｅｓ４６７―４６８，１９９８；Ｇ．Ｍ．Ａｌｌａｎ等、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ―ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｐｉｇｓ ｗｉｔｈ ａ ｗａｓｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ＵＳＡ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅ，」Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ３―１０，１９９８）。したがって、危険にさらされた動物の集団ワクチン接種の標的としてのＰＭＷＳの原因微生物ＰＣＶ２に対する有効なワクチンの開発により、ブタ科におけるＰＭＷＳの発生を防ぐことが、ブタ産業内の重要な目標である。
【００１０】
特許文献６は、特許文献７に対応し、カナダ、カリフォルニアおよびフランスのＰＭＷＳに感染した豚から採取された肺または神経節試料からの、五つの単離されたＰＣＶ株と、多価免疫原性組成物における少なくとも一つのブタパルボウィルス抗原と組み合わせたそれらの使用に関する。ＯＲＦ１〜ＯＲＦ１３からなるＰＣＶ２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされるタンパク質が、特許中に広く説明されているが、免疫原性を有する特定のタンパク質の実例がない。特許は、ＰＣＶ抗原をコードする核酸分子を含み、ｉｎ ｖｉｖｏで発現する、ＤＮＡプラスミド、線形ＤＮＡ分子および組換えウィルスからなるベクターを開示する。
【００１１】
特許文献８は、離乳後多臓器発育不良症候群（ＰＭＷＳ）に侵された農場から得られた肺または神経節試料から単離された、新規のブタサーコウィルス株に関する。特にこの特許は、これらの株の精製された製剤、従来の弱毒化または不活性化ワクチン、組換え生ワクチン、プラスミドワクチンおよびサブユニットワクチン、ならびに試薬および診断法を記載する。特許は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現ベクターにおけるサブユニットの産生に使用でき、またはウィルスまたはプラスミド型ｉｎ ｖｉｖｏ発現ベクターに組み込まれる配列として使用できる単離されたＤＮＡ分子配列を含むベクターをさらに開示する。特許は、ブタヘルペスウィルス、ブタアデノウィルスまたはポックスウィルス、特にＡｕｊｅｓｋｙ病ウィルス、ワクシニアウィルス、トリポックスウィルスまたはブタポックスウィルスであるものとして、そのベクターを広く説明する。
【００１２】
過去に、あるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）遺伝子（ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７）が、異なるベクトル系に発現されている：バキュロウィルス、仮狂犬病（Ｐｓｕｅｄｏｒａｂｉｅｓ）ウィルス、ＴＧＥＶおよびプラスミドＤＮＡ。これらの発現系は全て、一つのウィルスコンストラクトに一つまたは二つのオープンリーディングフレームだけを発現可能であることにより制限される。
【００１３】
例えば、特許文献９は、Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ昆虫細胞）細胞培養を許容宿主として用いたバキュロウィルス発現系において産生された、ＰＲＲＳＶ Ｓｐａｎｉｓｈ分離株（ＰＲＲＳ―Ｏｌｏｔ）のＯＲＦ２〜ＯＲＦ７に対応するブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）の原因ウィルスの組換えタンパク質に関する。この特許は、家畜のブタをＰＲＲＳから保護できるワクチンの製剤、およびブタ生体試料における抗ＰＲＲＳＶ抗体ならびにＰＲＲＳＶの検出のための診断キットの準備に適するものとして、組換えタンパク質を記載する。特に、特許は、組換えバキュロウィルスを含む組換え発現系と、ＰＲＲＳ―Ｏｌｏｔ分離株のＯＲＦ２〜ＯＲＦ７からなる群より選択される少なくとも一つの単離されたヌクレオチド配列から単離されたウィルスサブユニットタンパク質を、バキュロウィルス導入ベクターから発現する方法とに関する。特許は、少なくとも一つの組換えＰＲＲＳＶタンパク質を含む組換えワクチンも記載する。
【００１４】
ブタ抗原の発現およびワクチンとしての使用のための組換えアライグマポックスウィルスの話題に関して、相当量の情報が公開されている。例えば、特許文献１０は、アライグマポックスウィルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ「Ｕ」ゲノム領域、ＨｉｎｄＩＩＩ「Ｍ」ゲノム領域またはＨｉｎｄＩＩＩ「Ｎ」ゲノム領域内の非必須領域への、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２〜７の一つ等の、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタインフルエンザウィルスヘマグルチニン（ＳＩＶ ＨＡ）、ブタインフルエンザウィルスノイラミニダーゼ（ＳＩＶ ＮＡ）、およびブタパルボウィルス（ＰＰＶ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一つまたは二つの外来ＤＮＡ配列の挿入を提供する、組換えアライグマポックスウィルス（ＲＣＮＶ）ベクターを開示する。アライグマポックスウィルスィルスゲノムは、ウィルスゲノムのアライグマポックスウィルス宿主域遺伝子の欠失を含むものとして、特許中に記載される。特許は、外来ＤＮＡ配列をアライグマポックスウィルスゲノムに挿入することにより組換えアライグマポックスウィルスを生成するための、相同ベクターを提供する。実施例においては、この特許は、外来性ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ「Ｕ」ゲノム領域への挿入を行う方法を示すにとどまる。ＤＮＡ配列分析は、特許権者らにより開示されるＨｉｎｄＩＩＩ「Ｕ」ゲノム領域が、組換えアライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン（ｈａ）挿入および／またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）領域ではないことを示す。
【００１５】
特許文献１１は、組換えブタアデノウィルスを用いたウィルスベクターおよびワクチンを開示する。特に、この特許は、ｉｎ ｖｉｖｏで後者が複製され、挿入された異種ヌクレオチド配列を発現することを可能にする条件下でブタアデノウィルスに挿入された異種ヌクレオチド配列を含む、ｉｎ ｖｉｖｏ複製および組換えブタアデノウィルスを記載する。特許は、ブタアデノウィルス（ＰＡＶ）セロタイプ３または５（ＰＡＶ―３ ＰＡＶ―５）からのアデノウィルスゲノムの使用、および、主要後期プロモータ（ＭＬＰ）の下流に位置するＰＡＶ―３またはＰＡＶ―５ゲノムのＥ３領域の非必須ゾーンに少なくとも一つの産物をコードする異種ヌクレオチド配列の挿入を、さらに記載する。特許は、参照ヌクレオチド配列の全部または一部を含むＤＮＡフラグメントにも関する。組換えＰＡＶベクターが、仮性狂犬病ウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス、パルボウィルスィルス、ブタコレラウィルス、ブタサーコウィルス２型、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群より選択されるブタ病原体を発現することが示される。
【００１６】
特許文献１２は、ブタサーコウィルス２型からの外来ＤＮＡを含むアビポックスウィルス等の組換えポックスウィルスの使用、ならびにブタサーコウィルス２型により引き起こされる病気を治療または防止する方法を扱う。特に、同特許の組換えポックスウィルスは、ブタサーコウィルス２型のＯＲＦ１〜１３からなる単離されたＤＮＡ分子を含み、組換えポックスウィルスは、組換えＡＬＶＡＣカナリアポックスウィルスである。
【００１７】
特許文献１３は、ＰＣＶ―２抗原を含む免疫原性組成物の投与により、ＰＣＶ―２に対する免疫応答を誘導することにより、ブタにおけるブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ―２）のウィルス負荷を減少させる方法に関する。同特許は、外来性ＰＣＶ―２ヌクレオチド配列を含むベクターとしての抗原を記載し、ＰＣＶ―２ヌクレオチド配列が、ＯＲＦ４、ＯＲＦ１３、またはＯＲＦ４およびＯＲＦ１３をコードし、発現する。同特許に示されるいくつかの実施形態においては、免疫原性組成物は、一つ以上の追加的ブタ病原体を含む。特許に開示される方法において使用される組成物は、少なくとも一つの追加的ブタ病原体からの少なくとも一つの免疫原、またはこのような免疫原を発現するベクターをさらに含み、追加的ブタ病原体は、ＰＲＲＳ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、萎縮性鼻炎、仮性狂犬病、ブタコレラ、ブタインフルエンザ、脳心筋炎ウィルス、およびＰＰＶからなる群より選択される。同特許に開示されるベクターには、ＤＮＡベクタープラスミド、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌、バキュロウィルス等のウィルス、ブタヘルペスウィルスまたはオーエスキー病ウィルス（仮性狂犬病）を含むヘルペスウィルス、ブタアデノウィルスを含むアデノウィルス、および、ワクシニアウィルス、アビポックスウィルス、カナリアポックスウィルス、アライグマポックスおよびブタポックスウィルスを含むポックスウィルスが含まれる。
【００１８】
チミジンキナーゼ遺伝子またはヘマグルチニン遺伝子に挿入された二つ以上の外来性遺伝子を含む、多価組換えアライグマポックスウィルスを扱う、特許文献１４の開示およびそれに継続する特許文献１５。後のネコ病原体曝露に対してネコを免疫化するワクチンとしての多価組換えアライグマポックスウィルスの使用が、これら二つの関連特許に開示される。外来性遺伝子が挿入される挿入ベクターの構築と；挿入された遺伝子に隣接するのは、アライグマポックスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子またはヘマグルチニン遺伝子に再結合できる配列であり；外来性遺伝子を含む挿入ベクターとアライグマポックスウィルスとの両方を、感受性宿主細胞へ導入するステップと；生じたプラークから組換えアライグマポックスウィルスを選択するステップを伴う、組換えプロセスにより、多価組換えアライグマポックスウィルスを作成する方法も、開示される。特許の多価組換えアライグマポックスウィルスは、ネコ細胞において感染および複製でき、ウィルス複製に必須でないアライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子またはチミジンキナーゼ遺伝子からなる領域に挿入された二つ以上の外来性遺伝子を含み、特に外来性遺伝子は、発現のためにプロモータに作動可能に連結され；各外来性遺伝子が、ネコ病原体抗原をコードする。特許は、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ Ｅｎｖ）、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ Ｇａｇ）、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ Ｅｎｖ）、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ Ｍ）、ネコ科の伝染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ Ｎ）、ネコカリシウィルス（ＦＣＶカプシドタンパク質）、ネコジステンパウィルス（ＦＰＶ ＶＰ２）、および狂犬病―Ｇ等の、ネコ病原体抗原をコードする外来性遺伝子を記載する。
【００１９】
家畜ワクチンの分野におけるあらゆる努力にもかかわらず、単数または複数のウィルスによる感染からブタを適切に保護する、安全かつ有効な一価または多価ＰＣＶおよび／またはＰＲＲＳＶ組換えワクチンの必要が、当分野に依然として存在する。ブタにおいてＰＭＷＳおよび／またはＰＲＲＳに対する適切な防御免疫応答を与えうる組換えワクチンの投与による、ＰＣＶおよび／またはＰＲＲＳＶにより引き起こされる感染または病気の予防のための、安全かつ有効な方法も必要とされる。ブタに対する投与時の安全性および有効性に加えて、従来の不活性化ＰＲＲＳＶワクチンを上回る他の利益が、遊離ウィルスまたは不活性化ウィルスのその病原状態への復帰による不測の感染のリスクを除去する組換えワクチンにより達成される。安全かつ有効なアライグマポックスウィルスベクター化ブタワクチンの開発が、重篤なブタ疾患を防止し、ワクチン生産の間の従業員の安全を確保し、病原ウィルスが商業生産で用いられる不活性化および除染処理を生き残る一切の可能性を完全に排除するための使用において重要な利点をもたらすことは、明らかである。
【００２０】
本明細書にあげられる全ての特許および刊行物は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０５２９５８４号明細書
【特許文献２】国際公開第９３／０６２１１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９３／０７８９８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９２／２１３７５号パンフレット
【特許文献５】西国特許第９３０１９７３号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２１７，８８３号明細書
【特許文献７】仏国特許第２，７８１，１５９号明細書
【特許文献８】米国特許第６，３６８，６０１号明細書
【特許文献９】米国特許第５，８８８，５１３号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，２９４，１７６号明細書
【特許文献１１】米国特許第７，１０９，０２５号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，４９７，８８３号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，２１１，３７９号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，２４１，９８９号明細書
【特許文献１５】米国特許第７，０８７，２３４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、その最も広い態様においては、ベクターが、ｈａおよび／またはｔｋ遺伝子座で、単独またはブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ―２）の一つ以上のオープンリーディングフレームと組み合わせて、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）分離株によりコードされる抗原タンパク質の一つ以上、好ましくは一つ以上のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）分離株の複数のオープンリーディングフレームによりコードされる抗原タンパク質を発現する、安全かつ有効な組換えポックスウィルスベクターワクチンを提供する。特定の実施形態では、ベクターは、ＦｅＬＶ Ｐ２７＋表現型をもつネコ白血病ウィルスの糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。ＦｅＬＶ Ｐ２７＋またはＰＣＶ―２カプシド遺伝子は、異なる組み合わせにおいてクローンをスクリーニングするためのユニークなマーカとして有用である。本発明は、保護を必要とするブタに強力な新規の組換えワクチンを投与することにより、離乳後多臓器性発育不良症候群および／またはブタ繁殖・呼吸障害症候群からブタを保護する方法も提供する。
【００２３】
したがって、本発明の第一の態様は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）タンパク質をコードする一つ以上の外来性核酸分子を含む、組換えアライグマポックスウィルスベクター（ｒＲＣＰＶ）を提供する。
【００２４】
同組換えアライグマポックスウィルスベクターにおいては、
ａ．）少なくとも一つの核酸分子が、アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座またはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され；または
ｂ．）少なくとも二つの核酸分子が、アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座またはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され；または
ｃ．）少なくとも一つの核酸分子が、アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座に挿入され、少なくとも一つの核酸分子が、チミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され；または
一実施形態においては、アライグマポックスウィルスベクターは、アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座に挿入される少なくとも二つの核酸分子と、チミジンキナーゼ遺伝子座に挿入される少なくとも二つの核酸分子とを含む。
【００２５】
一実施形態においては、組換えアライグマポックスウィルスベクターは、アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼおよびヘマグルチニン遺伝子座に加えて、アライグマポックスウィルスゲノムの第三の非必須部位に挿入されるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。組換えアライグマポックスウィルスゲノムの任意の非必須部位が、本発明における使用に予定されうる。
【００２６】
一実施形態においては、アライグマポックスウィルスゲノムの第三の非必須部位は、セリンプロテアーゼインヒビター部位である。
【００２７】
一実施形態においては、一つ以上の外来性核酸分子の各々が、一つ以上のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスのオープンリーディングフレームをコードする。オープンリーディングフレームは、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００２８】
一実施形態においては、ポックスウィルスベクターは、同じブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスタンパク質の少なくとも二つの複製をコードする。同じタンパク質の二つの複製が、二つの異なる核酸分子によりコードされ、または同じ核酸分子によりコードされうる。同じタンパク質の二つの複製が、一つのプロモータに作動可能に連結され、または同じタンパク質の二つの複製が、別々のプロモータに作動可能に連結されうる。同じタンパク質の二つの複製は、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７およびその組み合わせからなる群より選択される、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスのオープンリーディングフレームによりコードされる。
【００２９】
一実施形態においては、二つ以上の核分子が、アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座および／またはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入される。
【００３０】
一実施形態においては、二つ以上の外来性核酸分子が、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、およびＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７からなる群より選択される、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスの少なくとも二つのオープンリーディングフレームをコードする。
【００３１】
一実施形態においては、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスは、ＩＳＵ１２（Ｉｏｗａ）、Ｏｌｏｔ／９１（Ｓｐａｎｉｓｈ）または両方である。
【００３２】
一実施形態においては、組換えアライグマポックスウィルスベクターは、ブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ２）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする核酸分子をさらに含む。
【００３３】
一実施形態においては、ブタサーコウィルス２のオープンリーディングフレームは、ＯＲＦ２である。
【００３４】
一実施形態においては、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２が、アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に、別に挿入されうる。
【００３５】
一実施形態においては、組換えアライグマポックスウィルスベクターは、Ｐ２７＋表現型をもつネコ白血病ウィルスの糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００３６】
一実施形態においては、アライグマポックスウィルスは、生存しており、複製可能である。
【００３７】
本発明の第二の態様は、免疫学的に有効な量の本明細書に記載の任意の組換えアライグマポックスウィルスベクターを一つ以上と、必要に応じて適切な担体、希釈剤またはアジュバントとを含む、組換えブタワクチンを提供する。
【００３８】
一実施形態においては、組換えブタワクチンは、免疫学的に有効な量の本明細書に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターを二つ以上と、必要に応じて適切な担体または希釈剤とを含む。
【００３９】
一実施形態においては、アライグマポックスウィルスは、生存しており、複製可能である。
【００４０】
一実施形態においては、ワクチンは、アジュバントを含まない。
【００４１】
一実施形態においては、ワクチンは、単回用量または反復用量として投与される。
【００４２】
一実施形態においては、組換えブタワクチンは、少なくとも一つの追加的ブタ抗原をさらに含む。追加的ブタ抗原は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ抗原、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｍ ｓｕｉｓ抗原、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ抗原、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ抗原、レプトスピラ菌抗原、ブタインフルエンザウィルス抗原、ブタパルボウィルス抗原、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ抗原、ブタ呼吸器コロナウィルス抗原、ロタウィルス抗原、Ａｕｊｅｓｋｙ病、ブタ伝染性胃腸炎抗原の原因となる病原体由来の抗原およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００４３】
本発明の第三の態様は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供し、方法は、本明細書に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターを一つ以上含む組換えブタワクチンを、ブタ動物に投与するステップを含む。
【００４４】
一実施形態においては、免疫応答は、液性応答または抗体媒介性応答である。一実施形態においては、免疫応答は、細胞媒介性またはＴ細胞媒介性免疫応答である。
【００４５】
一実施形態においては、約４．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜約７．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲のワクチン用量を投与することにより、防御免疫応答が誘導される。
【００４６】
一実施形態においては、免疫応答を誘導するために利用される組換えブタワクチンは、生きた複製可能な組換えアライグマポックスウィルスベクター（単数または複数）を一つ以上含む。
【００４７】
一実施形態においては、免疫応答を誘導するために利用される組換えブタワクチンは、生きた複製可能な組換えアライグマポックスウィルスベクター（単数または複数）を二つ以上含む。
【００４８】
本発明の第四の態様は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群および離乳後多臓器性発育不良症候群を防止する方法を提供し、方法は、免疫学的に有効な量の本明細書に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター（単数または複数）を一つ以上と、必要に応じて適切な担体、希釈剤またはアジュバントとを含む、組換えブタワクチンを、保護を必要とするブタ動物に投与するステップを含む。
【００４９】
一実施形態においては、組換えアライグマポックスウィルスベクター（単数または複数）は、生存しており、複製可能である。
【００５０】
本発明の第五の態様は、哺乳類においてブタウィルスに対する防御免疫応答を誘導するため、または哺乳類のブタ繁殖・呼吸障害症候群および／または離乳後多臓器性発育不良症候群を防止するための薬物の製剤のための、本発明の任意のベクターまたはワクチンの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１−１】ｐＦＤ２０００Ａ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：１）。
【図１−２】ｐＦＤ２０００Ａ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：１）。
【図１−３】ｐＦＤ２０００Ａ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：１）。
【図２−１】ｐＦＤ２００１ ＴＫ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：２）。
【図２−２】ｐＦＤ２００１ ＴＫ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：２）。
【図３−１】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：３）。
【図３−２】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：３）。
【図３−３】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：３）。
【図４−１】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＧＰＶ―ＰＶ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：４）。
【図４−２】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＧＰＶ―ＰＶ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：４）。
【図４−３】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＧＰＶ―ＰＶ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：４）。
【図５】ＰＣＶ２Ａ ＯＲＦ２―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：５）。
【図６】ＰＣＶ２Ｂ ＯＲＦ２―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：６）。
【図７】ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２―ＯＲＦ３―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：７）。
【図８】ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２―ＯＲＦ４―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：８）。
【図９】ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２―ＯＲＦ５―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：９）。
【図１０】ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２―ＯＲＦ６―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：１０）。
【図１１】ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２―ＯＲＦ７―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：１１）。
【図１２】ＰＲＲＳＶ Ｏｌｏｔ９１―ＯＲＦ５―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：１２）。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明の方法および治療方法論が説明される前に、本発明が、記載される特定の方法および実験条件に限定されず、かかる方法および条件が変動しうることが理解されねばならない。本明細書において用いられる用語が、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、制限を意図するものではなく、本発明の範囲が添付の請求の範囲においてのみ制限されることも理解されなければならない。
【００５３】
本明細書および添付の請求の範囲において用いられるところの、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈による別段の明示がない限り、複数形も含まれる。したがって、例えば、「方法」への言及には、本明細書に説明される種類の、および／または本開示を読んだ当業者に明らかとなる、一つ以上の方法および／またはステップが含まれる。
【００５４】
したがって、本出願においては、従来技術の通常の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が用いられうる。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｂｙｒｄ，ＣＭ ａｎｄ Ｈｒｕｂｙ，ＤＥ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２６９：Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｐｏｘｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，ｐａｇｅｓ ３１―４０；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ｈｅｒｅｉｎ「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照。
【００５５】
本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施およびテストに使用されうるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載の全ての刊行物は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００５６】
定義
本明細書において用いられる用語は、当業者に認識され、知られている意味を有するが、便宜と完全のために、特定の用語とその意味を以下に記載する。
【００５７】
「約」という用語は、２０％の範囲内、より好ましくは１０％の範囲内、より好ましくは５％の範囲内を意味する。
【００５８】
「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物をいう。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織デポー剤として、また、免疫応答を非特異的に増強するリンパ系活性化剤としても働きうる（Ｈｏｏｄ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，１９８４，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ｐ．３８４）。状況によって、アジュバントの非存在下での抗原単独による初回曝露は、液性または細胞性免疫応答の誘発に失敗しうる。アジュバントには、完全フロインドアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルション等の界面活性物質、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ―Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等の潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるがこれに限定されない。アジュバントは、薬理学上許容可能であるのが好ましい。
【００５９】
「抗原」という用語は、動物における抗体産生またはＴ細胞応答を刺激しうる、化合物、組成物または免疫原性物質をさし、動物に注射または吸収される組成物を含む。用語は、個々の巨大分子、または、同種または異種の抗原性巨大分子集団をさすために用いられうる。抗原は、特異的な液性または細胞性免疫の産物と反応する。「抗原」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質フラグメント、核酸、オリゴ糖、多糖、有機または無機化学物質または組成物等を含む部分を広く含む。さらに、抗原は、任意のウィルス、バクテリア、寄生虫、原生動物、または真菌類から導出または入手でき、全生物でありうる。「抗原」という用語には、全ての関連の抗原エピトープが含まれる。同様に、例えば核酸免疫化の場合等において、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、定義に含まれる。合成抗原、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープおよび他の組換または合成的に誘導された抗原も、含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎ等（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７ ２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎ等（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４２ ３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：４０２ ４０８；Ｇａｒｄｎｅｒ等（１９９８）１２ｔｈ Ｗｏｒｌｄ ＡＩＤＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｊｕｎ．２８ Ｊｕｌ．３，１９９８）。
【００６０】
「によりコードされる」または「コードする」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をさし、ポリペプチド配列は、少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが核酸配列によりコードされる。配列によりコードされるポリペプチドにより免疫学的に同定可能である、ポリペプチド配列も含まれる。したがって、抗原の「ポリペプチド」、「タンパク質」、または「アミノ酸」配列は、抗原のポリペプチドまたはアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の類似性、好ましくは少なくとも８０％の類似性、より好ましくは約９０〜９５％の類似性、最も好ましくは約９９％の類似性を有しうる。
【００６１】
本明細書で用いられるところの「外来性」という用語は、アライグマポックスウィルスゲノムの外部で生成、開始、誘導、または開発されるもの、すなわちポックスウィルスゲノムの外部を起源とするもの、例えば、アライグマポックスウィルスゲノムに対して外来性であると考えられる、ＰＲＲＳＶから入手または単離された遺伝子材料を含むことが意図される。
【００６２】
本発明の文脈において用いられるところの「遺伝子」とは、遺伝的機能が伴う、核酸分子（染色体、プラスミド等）におけるヌクレオチドの配列である。遺伝子は、生物のゲノムの中の特定の物理的位置（「遺伝子座位」または「遺伝子座」）を占めるポリヌクレオチド配列（例えば哺乳類のＤＮＡ配列）を含む、例えば生物の遺伝性単位である。遺伝子は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えばｔＲＮＡ）等の発現産物をコードしうる。あるいは、遺伝子は、発現産物をコードせず、タンパク質および／または核酸の結合等の特定のイベント／機能の遺伝子位置（例えばファージ結合部位）を画定しうる。典型的に、遺伝子は、ポリペプチドコード配列等のコード配列、およびプロモータ配列、ポリアデニル化配列、転写調節配列（例えばエンハンサ配列）等の非コード配列を含む。多くの真核生物遺伝子は、「イントロン」（非コード配列）により中断される「エクソン」（コード配列）を有する。あるケースでは、遺伝子が、別の遺伝子（単数または複数）と配列を共有しうる（例えばオーバーラップ遺伝子）。
【００６３】
抗原またはワクチン組成物に対する「免疫応答」は、目的の抗原またはワクチン組成物に存在する分子に対する液性および／または細胞媒介性免疫応答の、対象における発現である。本発明の目的を達成する上では、「液性免疫応答」は、抗体により媒介される免疫応答であり、本発明の抗原／ワクチンに対する親和性をもつ抗体の生成を伴うものであり、一方で「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介されるものである。「細胞性免疫応答」は、クラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に伴う抗原エピトープの提示により誘発される。これが、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球細胞（「ＣＴＬ」）を活性化する。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされ、細胞表面に発現されるタンパク質に伴って提示されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはそのような微生物に感染した細胞の細胞溶解を誘導および促進するのを助ける。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関わる。ヘルパーＴ細胞は、機能を刺激し、その表面上のＭＨＣ分子に伴ってペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性を集中するのを助ける働きをする。「細胞性免疫応答」は、活性化Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞から誘導されるものを含む他の白血球により産生される、サイトカイン、ケモカインおよび他のそのような分子の産生をもいう。細胞媒介免疫応答を刺激する特定の抗原または組成物の能力は、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞障害の細胞アッセイ、感作した対象における抗原に特異的なＴリンパ球のアッセイ、または抗原による再刺激に応答したＴ細胞によるサイトカイン産生の測定等、多数のアッセイにより決定されうる。そのようなアッセイは、公知技術である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９―４１９９；Ｄｏｅ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９―２３７６を参照。
【００６４】
「免疫原性ＯＲＦ」または「免疫原性ｏｒｆ」とは、免疫応答を誘発するオープンリーディングフレームをさす。
【００６５】
本明細書で使用されるところの「免疫学的に有効な量」とは、当業者に知られる標準的なアッセイで測定されるところにより、免疫応答、細胞性（Ｔ細胞）または液性（Ｂ細胞または抗体）応答を誘発するのに十分な抗原またはワクチンの量をいう。例えば、本発明に関して、「免疫学的に有効な量」は、≧４．５〜７．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの最低保護用量（力価）である。免疫原としての抗原の有効性は、増殖アッセイにより、Ｔ細胞のその特異的標的細胞を溶解する能力を測定するためのクロミウム放出アッセイ等の細胞溶解アッセイにより、または血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することでＢ細胞活性のレベルを測定することにより、測定されうる。さらに、免疫化された宿主を注射された抗原に曝露することにより、免疫応答の保護のレベルが測定されうる。例えば、免疫応答が望まれる抗原がウィルスまたは腫瘍細胞である場合には、「免疫学的に有効な量」の抗原により誘導される保護のレベルが、動物のウィルスまたは腫瘍細胞曝露後の生存率または死亡率を検出することにより測定される。
【００６６】
本明細書で定義されるところの、アライグマポックスウィルスゲノムにおける「非必須部位」とは、ウィルス感染または複製に必要でない、ウィルスゲノムにおける領域を意味する。アライグマポックスウィルスゲノムにおける非必須部位の例には、チミジンキナーゼ（ＴＫ）部位、ヘマグルチニン（ＨＡ）部位およびセリンプロテアーゼインヒビター部位が含まれるがこれに限定されない。アライグマポックスウィルスのＴＫ部位は、Ｃ．Ｌｕｔｚｅ―Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍ．ＳｉｄｈｕおよびＡ．Ｋａｐｐｅｌｅｒ，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １０（１９９５），ｐｐ．８１―８４に記載される。アライグマポックスウィルスのＴＫ遺伝子の配列は、ＰｕｂＭｅｄアクセッション番号ＤＱ０６６５４４およびＵ０８２２８にも見つけられる。アライグマポックスウィルスのＨＡ部位は、Ｃａｖａｌｌａｒｏ ＫＦおよびＥｓｐｏｓｉｔｏ，ＪＪ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２），１９０（１）：４３４―９に記載される。アライグマポックスウィルスのＨＡ遺伝子の配列は、ＰｕｂＭｅｄアクセッション番号ＡＦ３７５１１６にも見つけられる。
【００６７】
「核酸分子」または「核酸配列」という用語は、タンパク質合成の方向を指示する、すなわちタンパク質をコードおよび発現する、プリンおよびピリミジン塩基の反復単位等の反復ヌクレオチドの長い鎖をさす、その通常の意味を有する。用語が請求項において使用される場合には、核酸は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスタンパク質をコードする既知の外来性または外来遺伝子、好ましくはオープンリーディングフレーム遺伝子をさす。
【００６８】
本明細書で使用されるところの「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」、または「ｏｒｆ」という用語は、介在終止コドンを伴わずに特定のウィルスタンパク質をコードするために必要とされる最小限のヌクレオチド配列をさす。
【００６９】
「作動可能に連結される」は、そのように記載される成分が、それらの通常の機能を実行するように配置される、要素の配置をさす。したがって、コード配列（例えば抗原または関心をコードする配列）に作動可能に連結された所与のプロモータは、調節タンパク質および適当な酵素が存在するときに、コード配列の発現をもたらしうる。いくつかの場合には、ある調節要素は、その発現を誘導するように機能する限り、コード配列と連続する必要はない。例えば、介在する非翻訳非転写配列が、プロモータとコード配列の間に存在でき、プロモータ配列はなお、コード配列に「作動可能に連結される」とみなされうる。したがって、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、これがその後トランスＲＮＡスプライシングされ、コード配列によりコードされるタンパク質に翻訳されるとき、コード配列は、細胞において転写および翻訳制御配列に「作動可能に連結される」。
【００７０】
「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」という用語は、互換可能に使用され、Ｓｕｉｄａｅ科に属する任意の動物、例えばブタ（ｐｉｇ）などをさす。
【００７１】
「保護」免疫応答は、哺乳類を感染から保護する働きをする、液性または細胞性免疫応答を誘発するワクチンの能力をさす。ブタ哺乳類のコントロール集団、例えばワクチンを投与されない感染動物と比較して統計学的に有意の改善があれば、提供される保護は絶対的である必要はない、すなわち感染が完全に防止または根絶される必要はない。保護は、感染の症状発現の重症度または迅速性を軽減することに限定されうる。
【００７２】
単に本明細書で用いられるところの「組換え」という用語は、単に、標準的な遺伝子操作方法により作製されるアライグマポックスウィルスコンストラクトをいう。
【００７３】
「複製可能」という用語は、適切な宿主細胞内で複製、複写、または再生することが可能な、微生物、例えばアライグマポックスウィルス等のウィルスをさす。
【００７４】
「ワクチン」または「ワクチン組成物」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、動物において免疫応答を誘導し、および／または感染による疾患または死亡の可能性から動物を保護する、少なくとも一つの免疫学的に活性の成分を含む医薬組成物をさし、活性成分の免疫学的活性を増強する一つ以上の追加的成分を含んでも、または含まなくてもよい。ワクチンは、医薬組成物に典型的なさらなる成分を、さらに含みうる。
【００７５】
「ベクター」は、宿主生物における複製が可能なＤＮＡ分子であり、組換えＤＮＡ分子を構築するために遺伝子が挿入される。
【００７６】
一般的な説明
本発明によれば、ベクターが、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスタンパク質をコードする一つ以上の外来性核酸分子を含む、ユニークな組換えポックスウィルスベクターが提供される。一実施形態においては、ポックスウィルスベクターは、同じブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスタンパク質の少なくとも二つのコピーをコードしうる。同じタンパク質の二つのコピーが、二つの異なる核酸分子によりコードされ、または、同じタンパク質の二つのコピーが、同じ核酸分子によりコードされうる。同じタンパク質の二つのコピーが、一つのプロモータ、または別々のプロモータに作動可能に連結されうる。
【００７７】
タンパク質は、ヘマグルチニン（ｈａ）および／またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座のそれぞれで、ブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ―２）のＯＲＦ１〜ＯＲＦ１３、好ましくはＯＲＦ２等の一つ以上のオープンリーディングフレームを伴って、または伴わずに、一つ以上のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）分離株のＯＲＦ１ａまたはＯＲＦ１ｂ〜ＯＲＦ７、好ましくはＯＲＦ５、ＯＲＦ６および／またはＯＲＦ３／ＯＲＦ４／ＯＲＦ７等のオープンリーディングフレームによりコードされうる。本明細書に説明される任意の核酸分子の挿入のための、ポックスウィルスゲノムの別の第三非必須部位は、セリンプロテアーゼインヒビター部位である。特定の一実施形態では、二つ以上の外来性核酸分子が、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、およびＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７からなる群より選択される、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスの二つ以上のオープンリーディングフレームをコードする。
【００７８】
ＦｅＬＶ Ｐ２７＋表現型（ＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡで青色）をもつネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）の糖タンパク質を発現する遺伝子も、ｈａおよび／またはｔｋ遺伝子座で挿入される。これらのコンストラクトにおいては、ＦｅＬＶ Ｐ２７＋またはＰＣＶ―２ ＯＲＦ２（カプシド遺伝子）が、異なる組み合わせにおいてクローンをスクリーニングするためのユニークなマーカとして使用される。好ましいＰＲＲＳＶ分離株は、ＩＳＵ１２（Ｉｏｗａ）およびＯｌｏｔ／９１（Ｓｐａｎｉｓｈ）株を含むが、他の分離株が、以下の実施例において本発明を示す株と容易に置換されうる。
【００７９】
したがって、本発明の目的は、一つのウィルスコンストラクトにおいて、アライグマポックスウィルス（ＲＣＮＶ）ゲノムのヘマグルチニン（ｈａ）および／またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座で、単独またはブタサーコウィルス（ＰＣＶ２）のＯＲＦと組み合わせて、Ｕ．Ｓ．およびＥ．Ｕ．株のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）の四つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現することで、強力なワクチンを作成することである。
【００８０】
別の本発明の目的は、ＬａｃＺのような従来のスクリーニングマーカではなく、限界希釈およびｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークアプローチ、または限界希釈およびウィルスＥＬＩＳＡをスクリーニングマーカとして利用する新しいクローンスクリーニングシステムを使用することである。
【００８１】
前述の目的は、ｒＲＣＮＶが、ヘマグルチニン（ｈａ）および／またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座のそれぞれで、ＰＣＶ―２のオープンリーディングフレーム、好ましくはＯＲＦ２を伴って、または伴わずに、一つ以上のＰＲＲＳＶ分離株の複数のオープンリーディングフレーム、好ましくはＯＲＦ５、ＯＲＦ６および／またはＯＲＦ３／ＯＲＦ４／ＯＲＦ７を発現する、組換えアライグマポックスウィルスベクター（ｒＲＣＮＶ）を含む新規なワクチンを提供することにより達成される。
【００８２】
過去の発現系は、一つのウィルスコンストラクトにおいて、ＰＲＲＳＶ遺伝子の一つまたは二つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）だけを発現する能力において制限されていた。本発明は、単独またはブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ―２）のオープンリーディングフレームと組み合わせた、Ｕ．Ｓ．およびＥ．Ｕ．株のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）の四つ以上のＯＲＦの発現を都合よく可能にする。これまで従来技術では説明されていない、本発明の優れた発現系は、一つのウィルスコンストラクトにおける、アライグマポックスウィルス（ＲＣＮＶ）ゲノムのｈａおよび／またはｔｋ遺伝子座および／またはセリンプロテアーゼインヒビター遺伝子座への、ＰＲＲＳＶからの複数のＯＲＦの挿入を可能にし、これにより、ブタをＰＲＲＳから保護する強力な組換えワクチンをつくる。
【００８３】
本発明は、限界希釈およびｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークアプローチまたは限界希釈およびＥＬＩＳＡをスクリーニングマーカとして利用するスクリーニングシステムを使用する。このスクリーニングシステムは、非常に有益に、一つのウィルスコンストラクトにおいて複数部位の発現を提供する。
【００８４】
アライグマポックスウィルス（Ｈｅｒｍａｎ株）は、Ｙ．Ｆ．Ｈｅｒｍａｎにより、Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄで１９６１〜１９６２年に、臨床症状のないアライグマの気道から最初に単離された（Ｙ．Ｆ．Ｈｅｒｍａｎ，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｒａｃｃｏｏｎｓ，”Ｉｎ：Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｐｒｏｃ．，６４ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．１１７（１９６４））。本発明のｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳコンストラクトにおいては、ＰＲＲＳＶ遺伝子の一つ以上の株の、例えばＯＲＦ５、ＯＲＦ６および／またはＯＲＦ３／ＯＲＦ４／ＯＲＦ７等の複数のオープンリーディングフレームの、アライグマポックスウィルス（ＲＣＮＶ）ゲノムのｈａおよび／またはｔｋ遺伝子座への挿入は、非病原性Ｈｅｒｍａｎ株をさらに弱毒化させる。都合のよいことに、本発明のｒＲＣＮＶベクター化ＰＲＲＳＶワクチンは、ワクチン産生の間の従業員の安全性も改善し、商業生産の間に使用される不活性化および除染処理を病原性ウィルスが生存する一切の機会を完全に除去する。
【００８５】
本発明に記載される科学的進歩および新規な方法は、通常の技術を有する当業者により、ＩＳＵ１２およびＯｌｏｔ／９１以外のＰＲＲＳＶ株から得られる複数のオープンリーディングフレームの抗原タンパク質に使用され、アライグマポックスウィルスベクターのｔｋおよび／またはｈａ遺伝子座で挿入されて、ＰＲＲＳに対する保護のための免疫原性ワクチンが提供されうると考えられる。たとえば、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ株ＶＲ―２３３２、Ｅｕｒｏｐｅａｎ株Ｌｅｌｙｓｔａｄ Ｖｉｒｕｓ等の他の株が、ＩＳＵ１２および／またはＯｌｏｔ／９１株に容易に代替されうる。ＲＮＡウィルスは突然変異しやすいため、代替的に、新しい野外分離株またはウィルス変異体の所望のＯＲＦ遺伝子が単離され、本発明の組換えワクチンにおいて利用されうる。それにもかかわらず、現在までに見つけられているＰＲＲＳＶの多くの変異体と多数の分離株の間に高い相同性があり、したがって、本発明のワクチンコンストラクトにおける、ＯＲＦ５またはＯＲＦ６等の一定のオープンリーディングフレームの使用は、ＰＲＲＳに対して有意に有効であるという利点を有する。４０％程度の低い相同性を有する分離株では、本発明のコンストラクトの実際的利点は、複数のウィルスソースから複数のＯＲＦの抗原タンパク質を容易に収容して、有効な、より広域スペクトルワクチンを提供できることである。このような子ブタの接種プログラムの成功によるＰＲＲＳの防止は、病気の有効な長期的治療がないだけに、ブタ産業にとって非常に重要である。
【００８６】
本発明において有用なポックスウィルスベクターは、アライグマポックスウィルス、カナリアポックスウィルス、フォウルポックスウィルス、ブタポックスウィルス、ワクシニアウィルス等を含みうるがこれに限定されないが、アライグマポックスウィルスが用いられるのが好ましいことが、さらに予定される。本発明の方法の実行において、不活性化されたポックスウィルスベクターを用いうるが、生ベクターが好ましい。
【００８７】
本発明は、保護を必要とするブタに強力な新規の組換えワクチンを投与することにより、離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）および／またはブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）からブタを保護する、新規の方法も提供する。
【００８８】
本発明の方法においては、免疫学的に有効な量の本発明のワクチンが、動物における防御免疫応答を誘導するために、ＰＭＷＳおよび／またはＰＲＲＳからの保護を必要とするブタ、特に若年の子ブタに投与される。ブタに与えられる有効な免疫化量は、ＰＣＶ―２および／またはＰＲＲＳＶの有害効果からブタを保護するために、ワクチンに対する十分な免疫応答が達成されるものである。ワクチンが、ワクチン分野の標準値により必要とされる、少なくとも有意な数の予防接種されたブタを保護できるとき、防御免疫応答が得られたと考えられる。動物に予防接種し、良好なワクチン接種効果を誘発する免疫学的に有効な投与量または有効な免疫化量は、例えば標準的滴定研究等のルーチン試験により、容易に決定され、または直ちに滴定されうる。
【００８９】
本発明の新規なワクチンコンストラクトは、生後離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）および／またはブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）の防止のために、生後約３ヵ月の健常な子ブタのワクチン接種のために用いられる。ワクチンは、成熟または成体の雌ブタ（すなわち三ヵ月より高齢）にも、交配前に与えられうる。ワクチンは、単回用量で投与され、または抗体価が下落し、ブースター注射が必要とみなされる場合には、反復用量において投与されうる。ワクチンは、健常動物に単回接種において投与されて、疾患からの長期間の保護を提供し、動物を少なくとも一〜三年またはそれ以上保護するのが好ましい。適切な投与量は、標準的な用量滴定研究により決定される。ワクチンは、本明細書に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター化コンストラクトのいずれか一つを、免疫学的に有効な量含みうる。別の実施形態においては、ワクチンは、本明細書に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターコンストラクトの任意の二つ以上を、免疫学的に有効な量含みうる。
【００９０】
ワクチンは、任意の投与経路、経口、鼻腔内、経皮（すなわち全身吸収のために皮膚表面上または皮膚表面に適用される）、非経口等により、容易に与えられうるが、いくつかの経路は、具体的な動物および取扱者により、ロジスティック的により困難でありうる。非経口投与経路は、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内（すなわち注射または他の方法により皮下に配置される）経路等を含むがこれに限定されない。ワクチンは、皮下投与されるのが好ましい。
【００９１】
ポックスウィルスベクターは、生存しており、または不活性化ウィルスワクチンを調製する従来の方法により、例えばＢＥＩ（バイナリエチレンイミン）、ホルマリン等を用いて、不活性化されればよく、ＢＥＩが好ましい不活性化剤であるが、本発明のワクチンには、最適かつ強力な免疫学的効力のために、生アライグマポックスウィルスを用いるのが非常に望ましい。
【００９２】
有益に、ＰＣＶ―２および／またはＰＲＲＳＶの複数のＯＲＦを発現する生組換えＲＣＮＶは、単独で、または適切な担体、希釈剤およびアジュバントとの組み合わせにおいて、ワクチンとして有用である。ワクチン産物は、保存剤；安定剤；乳化剤；水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；水酸化ナトリウム、塩酸等のｐＨ調整剤；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０等の界面活性剤（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販のポリソルベート８０）；リポソーム；ｉｓｃｏｍアジュバント；ムラミルジペプチド等の合成糖ペプチド；デキストランまたは例えばリン酸アルミニウム、硫酸デキストラン、ＤＥＡＥ―Ｄｅｘｔｒａｎ等とのデキストランの組み合わせ等の増量剤；ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）等のカルボキシポリメチレン（Ｂ．Ｆ．ＧｏｏｄｒｉｃｈＣｏｍｐａｎｙ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏから市販のポリアクリルポリマー）；エチレン無水マレイン酸またはエチレン／無水マレイン酸コポリマー（ＥＭＡ（登録商標）、ほぼ等しい量のエチレンおよび無水マレイン酸を有する線形エチレン／無水マレイン酸コポリマー、約７５，０００〜１００，０００の推定平均分子量を有する、Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販）；ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）Ａ６４０のような、アクリル酸およびメタアクリル酸の混合物とのスチレンのコポリマー等のアクリルコポリマーエマルション（例えば米国特許第５，０４７，２３８号、Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから市販の、スチレンと混合されたアクリル酸およびメタアクリル酸の非融合水性アクリル酸コポリマー）；ミコバクテリウム細胞壁抽出物等の細菌細胞壁；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等のコリネバクテリウム由来アジュバント；Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅ等のプロピオニバクテリウム由来アジュバント；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（カルメット―ゲラン菌またはＢＣＧ）；オルビウィルス等のサブウィルス粒子アジュバント；コレラ毒素；Ｎ，Ｎ―ジオクタデシル―Ｎ’Ｎ’―ビス（２―ヒドロキシエチル）―プロパンジアミン（アブリジン）；一リン酸化リピドＡ；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ、Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹから市販）；その合成物および混合物を含むがこれに限定されない様々な典型的な無毒性の薬理学上許容可能な添加物、希釈剤およびアジュバントを必要に応じて含みうる。本ワクチンで用いられうるさらなる添加物には、デキストロース、従来の酸化防止剤および従来のキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等が含まれるがこれに限定されない。ワクチン処方を必要に応じて補充しうる他の薬理学上許容可能なアジュバントには、ポリアニオン、ポリカチオン、ペプチド、鉱油エマルション、免疫修飾物質、様々な組み合わせ等が含まれるがこれに限定されない。適切なアジュバントのさらなる非限定的な例には、スクアランおよびスクアレン（または他の動物起源の油類）；ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）等のポリオキシエチレン―ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（Ｌ１２１、例えばＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販）；サポニン；Ｑｕｉｌ Ａ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの精製形態の商品名、Ｉｓｃｏｔｅｃ ＡＢ，ＳｗｅｄｅｎおよびＳｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ ａ／ｓ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能）；ＭＡＲＣＯＬ（登録商標）等の鉱油（液体飽和炭化水素の精製混合物、Ｅｘｘｏｎ―Ｍｏｂｉｌ，Ｆａｉｒｆａｘ，ＶＡ．から市販）；落花生油等の植物油；インターロイキン２およびインターロイキン１２等のインターロイキン；ガンマインターフェロン等のインターフェロン；動物ポックスウィルスタンパク質またはその混合物が含まれる。適切な安定剤の例には、スクロース、ゼラチン、ペプトン、ＮＺ―アミーネまたはＮＺ―アミーネＡＳ等の消化タンパク質抽出物が含まれるがこれに限定されない。乳化剤の例には、注射可能薬物または鼻腔内ワクチンに有用な、鉱油、植物油、落花生油および他の標準的な代謝性の無毒性油が含まれるがこれに限定されない。水酸化アルミニウムが、サポニンまたはＱｕｉｌ Ａ等の他のアジュバントと混合されて、サポニン―水酸化アルミニウムまたはＱｕｉｌ Ａ―水酸化アルミニウム等の組み合わせが形成されるのが好ましい。
【００９３】
好ましいアジュバントは、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、アクリル酸およびメタアクリル酸の混合物とのスチレンのコポリマー、鉱油エマルションまたはその組み合わせを含む。本発明のｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳコンストラクトの能力を大幅に増強する特に好ましいアジュバントシステムには、ＥＭＡ―３１（登録商標）（ほぼ等しい量のエチレンおよび無水マレイン酸を有する線形エチレン／無水マレイン酸コポリマー、約７５，０００〜１００，０００の推定平均分子量を有する、Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより市販）等のエチレン／マレイン酸コポリマーの組み合わせ、およびＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）（スチレンと混合されたアクリル酸およびメタアクリル酸の非融合水性アクリル酸コポリマー（アクリルスチレンエマルション）、Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから市販）等のアクリル酸コポリマーエマルションが含まれる。
【００９４】
本発明の組換えワクチン組成物は、例えばＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｍ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、レプトスピラ菌、ブタインフルエンザウィルス（ＳＩＶ）、ブタパルボウィルス、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ブタ呼吸器型コロナウィルス、ロタウィルス、Ａｕｊｅｚｋｙ病、ブタ伝染性胃腸炎等の原因となる病原体の、一つ以上の追加的なブタ抗原との混合物も必要に応じて含みうる。
【００９５】
任意の周知の方法を用いて、本発明の遺伝的コンストラクトを調製しうる。例えば、特定の制限部位を利用して、任意の所望の核酸配列を、標準的な方法を用いてアライグマポックスウィルスベクターへ挿入しうる。あるいは、大きな配列の挿入が望ましいとき、または本明細書に記載のように複数の遺伝子を挿入することが望まれるときには、相同的組み換え技術を利用しうる。この方法では、複数の遺伝子が挿入される挿入部位に隣接するプラスミド配列が、遺伝子組換えを媒介するために、アライグマポックスウィルスゲノムに存在する配列と十分な相同性を有する配列を含む。隣接配列は、ヘマグルチニン遺伝子座またはチミジンキナーゼ遺伝子座、またはセリンプロテアーゼインヒビター遺伝子座等、アライグマポックスウィルスの成長および増殖に必須でないアライグマポックスウィルスの領域に相同でなければならない。一つのプロモータを用いて、再結合される二つの外来性遺伝子の発現を誘導しうるが、各プロモータが個別の遺伝子に作動可能に連結された、挿入ベクターにおける二つのプロモータの使用も、効率的な発現を提供する。
【００９６】
一般に、ウィルスｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳは、ｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークアプローチにより、例えば五つの主要なステップにしたがって構築されうる：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２（Ｉｏｗａ）およびＯｌｏｔ／９１（Ｓｐａｎｉｓｈ分離株）株のＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７またはＯＲＦ３を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬへクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ７（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）またはプラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ３（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびｒＲＣＮＶ―ＦｅＬＶ；（４）限界希釈およびｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークアプローチによるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｂｔｗの分子キャラクタリゼーションを決定。あるいは、ｗｈｉｔｅ―ｔｏ―ｂｌｕｅプラークアプローチを用い、以下の五つの主要なステップが実行されうる：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵＩ２およびＯｌｏｔ／９１株のＯＲＦ５およびＯＲＦ６、ＦｅＬＶ Ｐ２７を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬへクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＦｅＬＶ Ｐ２７（Ｐ１１）―ＰＲＲＳ ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）またはｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５／／ＬａｃＺ（Ｐ７．５）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびＲＣＮＶ；（４）限界希釈およびＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡまたはＬａｃＺによるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｗｔｂの分子キャラクタリゼーションを決定。
【００９７】
本発明のｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ―ＰＣＶは、以下の五つの主要なステップにより構築されうる：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２およびＯｌｏｔ／９１株のＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ３およびＰＣＶ２ ＯＲＦ２（カプシド遺伝子）を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬへクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ３（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）―ＰＣＶ２ ＯＲＦ２（Ｐ１１またはＰＳＥＬ）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびＲＣＮＶ；（４）限界希釈およびＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡ（スクリーニングマーカとして）によるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｐｃｖの分子キャラクタリゼーションを決定。あるいは、ｗｈｉｔｅ―ｔｏ―ｂｌｕｅプラークアプローチを用い、以下の四つの主要なステップが実行されうる：（１）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２をプラスミドｐＦＤ２００１ＴＫへまたはｐＦＤ２００６ＴＫへクローニングして、プラスミドｐＦＤ２００１ＴＫ ＰＣＶ ＯＲＦ２を生成；（２）スリーウェイの感染／トランスフェクションにより、クローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ１のプラスミドおよびｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ ＯＲＦ３（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）；（３）限界希釈およびＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡまたはＬａｃＺによるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ／／ＰＣＶの分子キャラクタリゼーションを決定。
【実施例】
【００９８】
以下の実施例は、本発明のある態様を示す。しかし、これらの実施例は例示を目的とするにとどまり、本発明の条件および範囲について完全に限定するものではないと理解されなければならない。当然のことながら、典型的な反応条件（例えば温度、反応時間等）が与えられている場合には、一般にあまり好都合ではないものの、指定の範囲を上回る条件および下回る条件の両方が使用されてもよい。実施例は、室温（約２３℃〜約２８℃）で、大気圧で行われる。本明細書に引用される全ての部分およびパーセントは重量に基づき、全ての温度は、別段の明示がない限り摂氏で表される。
【００９９】
（実施例１）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳの構築（ＢＬＵＥ―ＴＯ―ＷＨＩＴＥプラークアプローチ）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｂｔｗが、以下の五つの主要なステップにより構築された：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２（Ｉｏｗａ）およびＯｌｏｔ／９１（Ｓｐａｎｉｓｈ分離株）株のＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７またはＯＲＦ３を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬにクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ７またはＯＲＦ３（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびｒＲＣＮＶ―ＦｅＬＶ；（４）限界希釈およびｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークアプローチによるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｂｔｗの分子キャラクタリゼーションを決定。
【０１００】
ｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークスクリーニングアプローチは、ＦｅＬＶ Ｐ２７＋表現型（ＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡで青色）をもつ親ウィルスｒＲＣＮＶ―ＦｅＬＶを使用する。ｒＲＣＮＶ―ＦｅＬＶおよびｐＦＤ２００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ７―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）―ＯＲＦ６―ＯＲＦ５の間のＲＣＮＶ ＨＡ隣接配列の相同的組み換えにより、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦがｈａ遺伝子座で挿入されて親株におけるＦｅＬＶ ｇａｇ―ｅｎｖ ｇｐ８５の配列（ｒＲＣＮＶ―ＦｅＬＶ青色プラーク）に置き換えられるために、組換えｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳの表現型が、青色から白色プラークに変化する。
【０１０１】
（実施例２）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳの構築（ＷＨＩＴＥ―ＴＯ―ＢＬＵＥプラークアプローチ）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｗｔｂが、以下の五つの主要なステップにより構築された：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵＩ２およびＯｌｏｔ／９１株のＯＲＦ５およびＯＲＦ６、ＦｅＬＶ Ｐ２７を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬにクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＦｅＬＶ Ｐ２７（Ｐ１１）―ＰＲＲＳ ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびＲＣＮＶ；（４）限界希釈およびＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡまたはＬａｃＺによるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｗｔｂの分子キャラクタリゼーションを決定。
【０１０２】
ｗｈｉｔｅ―ｔｏ―ｂｌｕｅプラークスクリーニングアプローチは、ＦｅＬＶ Ｐ２７＋またはＬａｃＺ表現型（ＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡにおいて青色またはＬａｃＺ＋表現型）をもつ組換えウィルスｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｗｔｂを使用し、野生型ＲＣＮＶは、ＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡまたはＬａｃＺ染色において白色を示す。
【０１０３】
（実施例３）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ―ＰＣＶの構築
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｐｃｖは、以下の五つの主要なステップにより構築される：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２およびＯｌｏｔ／９１株のＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ３およびＰＣＶ２ ＯＲＦ２（カプシド遺伝子）を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬへクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ３（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）―ＰＣＶ２ ＯＲＦ２（Ｐ１１またはＰＳＥＬ）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびＲＣＮＶ；（４）限界希釈およびＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡ（スクリーニングマーカとして）によるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｐｃｖの分子キャラクタリゼーションを決定。
【０１０４】
ＰＣＶ２アプローチは、ＰＣＶ―２カプシドＥＬＩＳＡを、クローンのスクリーニングのため、および一つのウィルスコンストラクトにおいてｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ／ＰＣＶの新規の組合せワクチンを作製するための、ユニークなマーカとして使用する。
【０１０５】
あるいは、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｐｃｖは、以下の四つの主要なステップにより構築される：（１）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２（カプシド遺伝子）をプラスミドｐＦＤ２００１ＴＫまたはｐＦＤ２００６ＴＫへクローニングして、プラスミドｐＦＤ２００１ＴＫ ＰＣＶ２ ＯＲＦ２（Ｐ１１またはＰＳＥＬ）を生成；（２）スリーウェイの感染／トランスフェクションにより、クローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ１のプラスミドおよびｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ；（３）限界希釈およびＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡ（スクリーニングマーカとして）によるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ／／ＰＣＶの分子キャラクタリゼーションを決定。
【０１０６】
（実施例４）
ブタにおけるｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳワクチン候補の効力研究
上述のコンストラクト（ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｂｔｗ、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｗｔｂおよびｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｐｃｖ）が、免疫増強アジュバントを伴って、または伴わずに調製され、ブタにおけるワクチン効力が評価される。曝露研究の成功結果が、ブタにおける組換えＰＲＲＳ、ＰＣＶまたは組み合わせワクチンの効力を示す。
【０１０７】
（実施例５）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶの構築
簡潔にいうと、ブタ生殖器呼吸器症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）ＩＳＵ１２（ＵＳ株）のエンベロープ糖タンパク質（ｏｒｆ５）遺伝子および基質タンパク質（ｏｒｆ６）遺伝子、およびＰＲＲＳＶ Ｏｌｏｔ９１（ＥＵ株）のエンベロープ糖タンパク質（ｏｒｆ５）遺伝子の、ＲＣＮＶゲノム、非病原性Ｈｅｒｍａｎ株の血球凝集（ｈａ）遺伝子座への挿入により、ウィルスｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶが構築された。
【０１０８】
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶの構築プロセスは、二つの主なステップにより提供された。第一に、ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２株のＰＣＲ増幅された６０３ｂｐ ｏｒｆ５および５２５ｂｐ ｏｒｆ６と、ＰＲＲＳＶ Ｏｌｏｔ９１株の６０６ｂｐ ｏｒｆ５が、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬベクター（プロモータＰ１１の制御下のｌａｃＺリポーター遺伝子を含む）にサブクローニングされて、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＰＲＲＳＶ Ｏｌｏｔ９１ ｏｒｆ５―（ＳＥＬ）―ＩＳＵ１２ ｏｒｆ６（ＳＥＬ）―ＩＳＵ１２ ｏｒｆ５（ＳＥＬ）が生成された。ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２ ｏｒｆ５およびｏｒｆ６と、ＰＲＲＳＶ Ｏｌｏ９１ ｏｒｆ５遺伝子の両方が、プロモータＰＳＥＬの制御下で同時発現される。第二に、ＣＯＳ―７細胞におけるｒＲＣＮＶ―ＦＣＶ（２２８０―ＤＤ１）およびプラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＰＲＲＳＶ Ｏｌｏｔ９１ ｏｒｆ５―（ＳＥＬ）―ＩＳＵ１２ ｏｒｆ６（ＳＥＬ）―ＩＳＵ１２ ｏｒｆ５（ＳＥＬ）のスリーウェイの共感染／トランスフェクションが行われて、ｈａ遺伝子座での対立遺伝子交換によりｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶが生成された。青色プラーク（Ｌａｃ＋）が、ベロ細胞におけるプラーク精製の五つの連続ラウンドによりクローニングされた。クローン候補は、０．０５％ラクトアルブミン水解物（ＬＡＨ）、３０μｇ／ｍＬ硫酸ゲンタマイシンおよび５％ウシ胎児血清を補充したＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）を使用して、ベロ細胞においてさらに二回拡張され、その後、遺伝子特異的ＰＣＲにより確認された。七代継代を用いて、プレマスターシードが調製された。マスターシードが、プレマスターシードの１：２０，０００希釈により確立され、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶと指定され、これにおいて、生ベクターとしてのアライグマポックスウィルスが、ｈａ遺伝子座でそれぞれＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２およびＯｌｏｔ９１株のＰＲＲＳＶエンベロープ糖タンパク質（ｏｒｆ５）および基質タンパク質（Ｍ）を発現できる。ＰＲＲＳＶワクチンのマスターシードウィルス、生アライグマポックスウィルスベクター（ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶ）は、ＰＲＲＳＶ ｏｒｆ５またはｏｒｆ６遺伝子（単数または複数）―特異的ＰＣＲ法により同定された。ブタ生殖器呼吸器症候群ウィルスワクチン、単独またはＳｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ ＤｏｓｅおよびまたはＳｕｖａｘｙｎ ＭＨ―ｏｎｅと組み合わせた生／不活性化アライグマポックスウィルスベクター、または生キメラｃＰＣＶ１―２およびまたは改変生Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｅｎｕｍｏｎｉａｅ（例えばＪ株）の免疫原性研究が、子ブタおよび成熟雌ブタにおいて行われている。
【０１０９】
（実施例６）
子ブタにおける、単独またはＳｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ Ｄｏｓｅと組み合わせたブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスワクチン、生アライグマポックスウィルスベクターの免疫原性研究
ＰＲＲＳＶ画分の効力を示すために、ブタに、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶワクチン（凍結乾燥ケーキ）およびアジュバントを含む滅菌水またはＳｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ Ｄｏｓｅを希釈剤としたものが、２〜３週間隔の二用量レジメンにおいて投与された後、第二ワクチン接種の２〜３週後に毒性ＰＲＲＳＶ曝露またはＰＲＲＳＶ／ＰＣＶ２同時曝露が行われる。ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶ画分の効力が、ＰＲＲＳＶウィルス血症の減少およびＰＲＲＳＶにより引き起こされる肺損傷の減少に基づいて評価される。Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＣＶ２ Ｏｎｅは、ＦＤＡＨの専売アジュバントで調製された不活性化Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ１―Ｔｙｐｅ２ Ｃｈｉｍｅｒａ（ｃＰＣＶ１―２）を含む。
【０１１０】
材料および方法
試験動物
少なくとも４０匹の（予防接種２０匹およびコントロール２０匹）、生後３週目以上の通常の混血雄および雌ブタが、この研究に使用される。研究用のブタは、商業農場から購入され、耳札を使用して識別される。ブタは、単一のソース群から得られる。第一ワクチン接種時に、ブタは、ＩＤＥＸＸ ＨｅｒｄＣｈｅｃｋ ＥＬＩＳＡキット（Ｓ／Ｐ比＜０．４）による決定により、ＰＲＲＳＶに対して血清陰性である。
【０１１１】
テストワクチン
テストワクチンの組成
凍結乾燥画分：ワクチンは、生ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶからなる。ワクチンのウィルス力価は、研究において投与される用量を確立するために、五つの反復アッセイにおいて滴定される。液体画分：希釈剤は、Ｓｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ Ｄｏｓｅまたは２０％ＳＬ―ＣＤアジュバントである。ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶの凍結乾燥画分が、ワクチン接種時に液体画分により再水和される。
【０１１２】
研究デザイン
提唱される研究は、ランダム化完全ブロックデザイン（優越性試験）である。同腹子が、各研究組に配分される。そして、各研究における同腹子中の子ブタが、以下のように二つの群に分割される：
【０１１３】
【表１】
ワクチン接種
ワクチン接種経路は、頸部右側の筋注である。
【０１１４】
研究１のブタ：群Ｖ１は、２．０ｍＬ用量のｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶ＋Ｓｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ Ｄｏｓｅが二度与えられ；コントロール群Ｃ１のブタは、２．０ｍＬ用量のＳｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ Ｄｏｓｅが二度与えられる。
【０１１５】
研究２のブタ：群Ｖ２は、２．０ｍＬ用量のｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶ＋水／ＳＬ―ＣＤが二度与えられ；コントロール群Ｃ２のブタは、２．０ｍＬ用量の水―ＳＬ―ＣＤアジュバントが二度与えられる。
【０１１６】
一回目のワクチン接種が、生後３週間目で行われ、反復ワクチン接種が２〜３週後に行われる。
【０１１７】
曝露
全ての動物が、二回目のワクチン接種の二〜三週後に毒性曝露される。
【０１１８】
群Ｖ１およびＣ１のブタは、少なくとも２×１０４．８ＦＡＩＤ５０の野生型病原性ＰＣＶ２（株４０８９５）、および少なくとも２×１０４．０ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳＶ（ＩＳＵ―１２または等価物）に曝露される。これら二つの曝露材料は、曝露の前に少なくとも３０分間混合される。曝露用量は、鼻腔内４ｍＬである（鼻孔あたり２ｍＬ）。
【０１１９】
群Ｖ２およびＣ２のブタは、少なくとも２×１０４．０ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳＶ（ＩＳＵ―１２または等価物）に曝露される。曝露用量は、鼻腔内２ｍＬである（鼻孔あたり１ｍＬ）。添付２の曝露記録を参照。
【０１２０】
曝露ウィルスは、曝露の日に、ＰＣＶ２特異的およびＰＲＲＳＶ特異的間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により滴定される。
【０１２１】
観察
全てのブタは、曝露後（ＤＰＣ）−２から１０日まで毎日臨床徴候および温度が観察される。任意の異常観察は、研究ディレクターまたはプラント獣医師に報告される。
【０１２２】
モニタされる臨床徴候には、食欲不振、嗜眠、抑うつ、下痢、くしゃみ、咳、鼻汁、眼漏、呼吸困難および死亡が含まれるがこれに限定されない。任意のブタが曝露後観察期間中に死亡した場合には、剖検が行われ、最終的報告に剖検報告が付される。
【０１２３】
試料収集およびテスト
試料収集
鼻スワブ
鼻スワブが、ワクチン接種一の後（ＤＰＶ１）０日目に集められ、ＰＲＲＳＶおよびＰＣＶ２が単離されて、ワクチン接種前にテスト動物にＰＲＲＳＶまたはＰＣＶ２感染がないことが確認される。
【０１２４】
鼻腔スワブ試料は、３ｍＬのＭＥＭとラクトアルブミン水解物（ＬＡＨ）およびゲンタマイシン（６０μｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含む個別の滅菌チューブに配置され、テストされるまで−５０℃より低温で貯蔵される。
【０１２５】
血清試料
ブタは、ＥＬＩＳＡテストでは、０ＤＰＶ１、０ＤＰＶ２、７ＤＰＶ２、１４ＤＰＶ２、−１、６、および９日目に；ＰＣＲ法では−１、３、６、および９日目に、血清試料（１０ｍＬ以下）のために採血される。
【０１２６】
剖検
全ての動物が、ＤＰＣ１０〜１１日目で剖検される。肺損傷採点のために肺が集められる。
【０１２７】
試料テスト
酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＰＲＲＳＶに対する血清抗体が、ＩＤＥＸＸ（登録商標）ＨｅｒｄＣｈｅｃｋ ＥＬＩＳＡキット（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）により検出される。簡潔にいうと、血清試料が、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ中に１：４０に希釈され、各試料１００μＬが、抗原コートされた９６穴プレートにデュプリケートで加えられる（一つのウェルはＰＲＲＳＶ抗原用、一つのウェルは正常宿主細胞（ＮＨＣ）抗原用）。室温での３０分のインキュベーション時間後、液体がデカントされ、約３００μＬのリン酸緩衝洗浄溶液で、プレートが３〜５回洗浄される。そして、１００μＬの抗―ブタ―ＨＲＰＯ結合体が全てのウェルに加えられる。プレートが、室温で３０分間インキュベートされる。インキュベーション時間後、プレートは、再び上記のように洗浄される。そして、１００μＬのＴＭＢ基質溶液が、各ウェルに加えられる。プレートが１５分間室温でインキュベートされた後、１００μＬのストップ溶液が全てのウェルに加えられて反応が止められる。そして、光学濃度（ＯＤ）が、マイクロプレートリーダーにより６５０ｎｍで測定される。任意の血清力価が、試料／陽性（Ｓ／Ｐ）比として報告され、試料ＯＤ―ＰＲＲＳＶマイナス試料ＯＤ―ＮＨＣの量を平均陽性コントロール―ＰＲＲＳＶマイナス平均陽性コントロール―ＮＨＣの量で割ることにより、決定される。
【０１２８】
ＰＣＲ法
ＰＲＲＳＶ特異的ＲＴ―ＰＣＲテストを用いて、血清中のＰＲＲＳＶの存在が検出される。ＲＮＡ―抽出が、ＱｌＡａｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、血清試料に実行される。
【０１２９】
肺損傷採点
個々のブタの肺が、損傷により影響される肺実質の量に基づく肉眼による総損傷につき、二人の独立したスコアラにより検査される。損傷のスコアラは、各ブタへの治療の内容に対して遮蔽される。簡潔にいうと、ＰＲＲＳＶのような損傷（色および構造に基づいて）が見られる肺葉の割合を推定することにより、各肺葉における肺損傷のスコアが決定され、その肺葉に可能なポイント数と掛け合わせられる。各肺葉の最大スコアが、肺葉が占める全肺容量の相対的割合により決定される。そして、全ての肺葉の背面および腹側面からのスコアが足し合わされて、各ブタの合計スコアが得られる。各動物の可能な最大合計スコアは、１００である。
【０１３０】
一時的結果
肺損傷の減少を主張するために、肺に存在する損傷の合計スコアが評価される。
【０１３１】
二時的結果
二次的結果は、ＰＲＲＳＶウィルス血症の発生である。
【０１３２】
統計的分析
推定量
肺損傷の重症度減少の評価では、推定量は、緩和画分（ＭＦ）統計量である。緩和画分は、以下のように計算される：
【０１３３】
【化１】
式中、
Ｗ１＝ウィルコクソン順位和統計量
ｎｃ＝コントロール群における対象数
ｎｖ＝各ワクチン接種群における対象数
である。
＊注：各研究組につきＭＦ統計量が推定される。
【０１３４】
区間推定を計算する方法の説明
各研究組の緩和画分の９５％信頼区間が、計算される。
【０１３５】
仮説
肺損傷の重症度減少の主張のため：
ＨＯ：Ｍｖ＝Ｍｃ
ＨＡ：Ｍｖ≠Ｍｃ
Ｍｖ＝ワクチン接種群における肺損傷スコアランクの中央値
Ｍｃ＝コントロール群における肺損傷スコアランクの中央値
これらの研究は、各研究組において、ワクチン接種群とプラセボコントロール群との間で肺損傷の重症度（ランク）に差がないという帰無仮説をテストする。
【０１３６】
他の統計的考慮事項
ブタ同腹子の分布は、同腹子間で無作為に割付けされる。
【０１３７】
統計的分析
統計的方法
一次的結果
動物中のスコアのテスト再現性が、クラス内相関により評価される。テスト再現性が十分であると考えられる場合には、各ブタの平均肺スコアが、各スコアラからの肺スコアを平均することにより計算される。計算された肺スコアは、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｒａｎｋ Ｓｕｍにより、計算された肺スコアを独立変数とし、含まれる治療を従属変数として、研究組ごとに二つの投与群の間で比較される。十分完全なブロックがある場合には、分析が同腹子ごとに階層化される。ＨＬシフトが推定される。ＭＦが、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ統計から推定される。
【０１３８】
二次的結果
二次的結果は、ウィルス血症の発生につき評価される。単一のウィルス血症の発生により、ブタがウィルス血症陽性に分類される（ＹｅｓまたはＮｏ）。ウィルス血症は、一般化線型混合モデルにおいて、ウィルス血症の発生（ＹｅｓまたはＮｏ）を二項独立変数とし、含まれる治療を従属変数として、投与群間で比較される。十分完全なブロックがある場合には、同腹子はモデルにおいてランダム効果共変量として含まれる。
【０１３９】
全ての統計的分析は、ＳＡＳシステム（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）を用いて実行される。有意水準は、ｐ＜０．０５に設定される。
【０１４０】
以上において、本発明の特定の実施形態の詳細な記載が、制限ではなく例示の目的で提供された。本開示に基づいて当業者に明らかな他の全ての変形、派生物および等価物が、請求される本発明の範囲内に含まれるものと理解されねばならない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単独、またはブタサーコウィルス（ＰＣＶ）と組み合わせて、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）の遺伝子を発現する、新規の組換えアライグマポックスウィルスベクター、およびＰＣＶおよび／またはＰＲＲＳＶにより引き起こされる疾患の予防におけるワクチンとしての、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）は、プラス鎖ＲＮＡウィルスであり、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ属に属する。ＰＲＲＳＶはブタに感染し、北米で１９８７年に最初に検出された「ブタミステリー病」を引き起こした後、１９９０年に欧州各地へと病気が広がった。１９９０年以来、ＰＲＲＳＶはブタの群れの生産に深刻な打撃を与え、ブタ産業に対する大きな世界的脅威となっている。
【０００３】
現在ではブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）として知られる、ブタミステリー病（青耳病、ブタの生殖器・呼吸器症候群（ＰＥＡＲＳ）または呼吸器症候群（ＳＩＲＳ）とも呼ばれる）は、妊娠後期の異常に高い流産件数、食欲不振、死産、胎児ミイラ化、分娩後呼吸系疾患、出生直後に呼吸器病または二次感染により死ぬ弱い子ブタをもたらす、妊娠した雌ブタの生殖不全を特徴とする。子ブタにおいては、ＰＲＲＳＶ感染は、呼吸困難と、７０％以上もの子ブタの死亡率に達しうる高い死亡率をもたらしうる。より年齢が高いブタは、軽度の呼吸器病または二次感染の兆候を示しうる。ウィルスはブタ集団に急速に広がり、最初の感染後２〜３ヶ月で群の最高９５％のブタが血清陽性となりうる。感染が安定化しても、若い雌ブタにより排泄されるＰＲＲＳＶが、妊娠した雌ブタに影響し、生殖の問題が再び発生する可能性が高い。ブタ育成群におけるＰＲＲＳの経済的打撃は、かなりのものである。
【０００４】
ブタミステリー病の原因としてオランダで最初に単離されたＰＲＲＳＶは、Ｌｅｌｙｓｔａｄウィルス（ＬＶ）として同定された（Ｇ．Ｗｅｓｖｏｏｒｔ等、Ｖｅｔ．Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ ３：１２１―１３０（１９９１））。そのすぐ後に、スペインで異なるＯｌｏｔ分離株が見つかった（Ｐｌａｎａ等、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３３：２０３．２１１，１９９２）。その後、ＰＲＲＳＶの新しい分離株が、いくつかの刊行物に記載されている（例えば、特許文献１、特許文献２および特許文献３を参照）。
【０００５】
さらなる刊行物は、全Ｌｅｌｙｓｔａｄウィルス（ＬＶ）ゲノム（Ｊ．Ｊ．Ｍ．Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ等、「Ｌｅｌｙｓｔａｄ ｖｉｒｕｓ，ｔｈｅ ｃａｕｓａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ａｂｏｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＥＡＲＳ），ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＬＤＶ ａｎｄ ＥＡＶ，」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９２：６２―７２（１９９３））；Ｔｕｂｉｎｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）ＰＲＲＳウィルス分離株（ＴＶ）ゲノムのセグメント（Ｋ―Ｋ．Ｃｏｚｅｌｍａｎｎ等、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ，」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：３２９―３３９（１９９３））および他の分離株等、ＰＲＲＳウィルス分離株の構造的特性を明らかにし、遺伝子のクローニングおよび配列決定を可能にした。
【０００６】
アルテリウィルスビリオンは、一般に直径が５０〜７０ｎｍであり、ハニカム様表層構造を伴う密着したエンベロープに囲まれた、直径３５ｎｍの異性体（大方は二十面体）のヌクレオカプシドを含む。ゲノムは、１３〜１５ｋｂの大きさの、線形のプラスセンスの単一の分子、ｓｓＲＮＡから成る。ＰＲＲＳウィルスは、５０〜６０ｎｍの大きさを有し、約３０〜３５ｎｍのエンベロープがヌクレオカプシド、および単一のＲＮＡ分子に含まれる。ＰＲＲＳＶのゲノムＲＮＡは、約１５ｋｂ（１５０００塩基対）である。ゲノムは、ＲＮＡレプリカーゼ（ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂ）、糖タンパク質ＧＰ２〜ＧＰ５、膜内在性タンパク質Ｍ、およびヌクレオカプシドタンパク質Ｎ（ＯＲＦ２〜７）をコードする。ゲノムＲＮＡは、フルレングスのマイナスセンス複製中間体により合成される。
【０００７】
ＰＲＲＳＶゲノムの一本鎖ＲＮＡ分子は、３’末端にポリＡテールを含む。構造は、ウィルスタンパク質をコードする七つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ＯＲＦ１〜ＯＲＦ７は、それらの間に小さな重複セグメントを示す。ウィルスタンパク質の合成は、長さが異なるが、類似の３’ポリアデニル化末端および非コード５’末端配列から始まる５’リーダー配列の、一群のサブゲノム転写産物（ｍＲＮＡ）から生成される。このウィルスタンパク質発現の形は、ネステッドｍＲＮＡと考えられ、過去にコロナウィルスについて記載されている（Ｗ．Ｊ．Ｍ．Ｓｐａａｎ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２９３９―２９５２（１９８８））。Ｌｅｌｙｓｔａｄ（ＬＶ）およびＴｕｂｉｎｇｅｎ（ＴＶ）ＰＲＲＳＶウィルス分離株のヌクレオチド配列に基づいて、他のアルテリウィルスで観察されたものとの相同性により、ウィルスゲノムにおいて、ＯＲＦ１（ａおよびｂ）が、ウィルスポリメラーゼおよびレプリカーゼをコードすることが提唱されている。ＯＲＦ２〜ＯＲＦ６は、ウィルスエンベロープタンパク質をコードし、ＯＲＦ７は、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする。ウィルスレプリカーゼおよびポリメラーゼは、それぞれ２６０および１６３ｋＤａの大きなサイズのタンパク質であり、いずれも、三つの潜在的グリコシル化部位を含む。３’末端に位置するエンベロープタンパク質（ＯＲＦ２〜６）は小さく、３０および１９ｋＤａの間である。それら全てが、二つ以上の潜在的グリコシル化部位を含み、特にＯＲＦ３は７つの部位を含む。これらのタンパク質は全て、アミノ（Ｎ）およびカルボキシ（Ｃ）末端に、リーダー配列および膜アンカとして働きうる疎水性配列を含む。一般にそれらは、膜に結合されるそれらの位置と調和する、疎水性タンパク質である。ＯＲＦ６は、Ｎ末端の９０アミノ酸残基内に位置する３つの疎水性セグメントを有する。ウィルスヌクレオカプシドに対応する可能性があるＯＲＦ７によりコードされるタンパク質は、Ｎ末端にアルギニン、リシンおよびヒスチジン残基を伴って強塩基性である。ＬＶおよびＴＶウィルスポリメラーゼ、構造タンパク質およびヌクレオカプシドのアミノ酸配列は、ＬＤＶウィルスとの比較において２９％および６７％の間の同一性を示し、ＥＡＶウィルスとの比較において２０％および３６％の間の同一性を示す。
【０００８】
ＰＲＲＳＶにより引き起こされる病気は、ブタ産業への深刻な世界的損失の原因である。このため、ＰＲＲＳＶにより引き起こされる感染を防止できるワクチンを開発する研究が行われている。以前のワクチン開発は、ＰＲＲＳＶが宿主細胞（ブタ）の一次肺胞マクロファージおよびサル腎臓細胞系統において成長するという事実を基礎とする。大部分において、特許文献４、特許文献２、特許文献３および特許文献５に説明されるＰＲＲＳＶに対する過去のワクチンは、マクロファージで成長させ、その後不活性化させたウィルスから得られる従来のワクチンである。ワクチンは、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）を回避し、雌ブタの生殖異常を防止できるものとして開示される。
【０００９】
ブタの健康にとってやはり重要なのは、離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）と呼ばれる別の病気の蔓延である。ＰＭＷＳは、典型的に生後約５〜１８週間目の離乳期子ブタを襲うが、子ブタの健康への現在のまたは潜在的な脅威として広がっており、世界のブタ産業の経済的利益に深刻な影響を与える。ＰＭＷＳの臨床徴候は、進行性の体重減少、呼吸困難、頻呼吸、貧血、下痢および黄疸からなる。離乳期子ブタに多いが、この衰弱性疾患は、ブタ、雄ブタおよび成熟豚を含むブタ科の任意の動物に影響しうる。死亡率は世界中で１％〜２％の範囲であり、一部の複雑なケースでは最高４０％に上りうる。ブタサーコウィルス２型（一般にＰＣＶ―２と呼ばれる）は、ＰＭＷＳの主な原因物質として同定されている（Ｇ．Ｍ．Ａｌｌａｎ等、「Ｎｏｖｅｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｐｉｇｓ ｗｉｔｈ ｗａｓｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，」Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．，Ｖｏｌ．１４２，ｐａｇｅｓ４６７―４６８，１９９８；Ｇ．Ｍ．Ａｌｌａｎ等、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ―ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｐｉｇｓ ｗｉｔｈ ａ ｗａｓｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ＵＳＡ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅ，」Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ３―１０，１９９８）。したがって、危険にさらされた動物の集団ワクチン接種の標的としてのＰＭＷＳの原因微生物ＰＣＶ２に対する有効なワクチンの開発により、ブタ科におけるＰＭＷＳの発生を防ぐことが、ブタ産業内の重要な目標である。
【００１０】
特許文献６は、特許文献７に対応し、カナダ、カリフォルニアおよびフランスのＰＭＷＳに感染した豚から採取された肺または神経節試料からの、五つの単離されたＰＣＶ株と、多価免疫原性組成物における少なくとも一つのブタパルボウィルス抗原と組み合わせたそれらの使用に関する。ＯＲＦ１〜ＯＲＦ１３からなるＰＣＶ２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされるタンパク質が、特許中に広く説明されているが、免疫原性を有する特定のタンパク質の実例がない。特許は、ＰＣＶ抗原をコードする核酸分子を含み、ｉｎ ｖｉｖｏで発現する、ＤＮＡプラスミド、線形ＤＮＡ分子および組換えウィルスからなるベクターを開示する。
【００１１】
特許文献８は、離乳後多臓器発育不良症候群（ＰＭＷＳ）に侵された農場から得られた肺または神経節試料から単離された、新規のブタサーコウィルス株に関する。特にこの特許は、これらの株の精製された製剤、従来の弱毒化または不活性化ワクチン、組換え生ワクチン、プラスミドワクチンおよびサブユニットワクチン、ならびに試薬および診断法を記載する。特許は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現ベクターにおけるサブユニットの産生に使用でき、またはウィルスまたはプラスミド型ｉｎ ｖｉｖｏ発現ベクターに組み込まれる配列として使用できる単離されたＤＮＡ分子配列を含むベクターをさらに開示する。特許は、ブタヘルペスウィルス、ブタアデノウィルスまたはポックスウィルス、特にＡｕｊｅｓｋｙ病ウィルス、ワクシニアウィルス、トリポックスウィルスまたはブタポックスウィルスであるものとして、そのベクターを広く説明する。
【００１２】
過去に、あるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）遺伝子（ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７）が、異なるベクトル系に発現されている：バキュロウィルス、仮狂犬病（Ｐｓｕｅｄｏｒａｂｉｅｓ）ウィルス、ＴＧＥＶおよびプラスミドＤＮＡ。これらの発現系は全て、一つのウィルスコンストラクトに一つまたは二つのオープンリーディングフレームだけを発現可能であることにより制限される。
【００１３】
例えば、特許文献９は、Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ昆虫細胞）細胞培養を許容宿主として用いたバキュロウィルス発現系において産生された、ＰＲＲＳＶ Ｓｐａｎｉｓｈ分離株（ＰＲＲＳ―Ｏｌｏｔ）のＯＲＦ２〜ＯＲＦ７に対応するブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）の原因ウィルスの組換えタンパク質に関する。この特許は、家畜のブタをＰＲＲＳから保護できるワクチンの製剤、およびブタ生体試料における抗ＰＲＲＳＶ抗体ならびにＰＲＲＳＶの検出のための診断キットの準備に適するものとして、組換えタンパク質を記載する。特に、特許は、組換えバキュロウィルスを含む組換え発現系と、ＰＲＲＳ―Ｏｌｏｔ分離株のＯＲＦ２〜ＯＲＦ７からなる群より選択される少なくとも一つの単離されたヌクレオチド配列から単離されたウィルスサブユニットタンパク質を、バキュロウィルス導入ベクターから発現する方法とに関する。特許は、少なくとも一つの組換えＰＲＲＳＶタンパク質を含む組換えワクチンも記載する。
【００１４】
ブタ抗原の発現およびワクチンとしての使用のための組換えアライグマポックスウィルスの話題に関して、相当量の情報が公開されている。例えば、特許文献１０は、アライグマポックスウィルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ「Ｕ」ゲノム領域、ＨｉｎｄＩＩＩ「Ｍ」ゲノム領域またはＨｉｎｄＩＩＩ「Ｎ」ゲノム領域内の非必須領域への、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２〜７の一つ等の、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタインフルエンザウィルスヘマグルチニン（ＳＩＶ ＨＡ）、ブタインフルエンザウィルスノイラミニダーゼ（ＳＩＶ ＮＡ）、およびブタパルボウィルス（ＰＰＶ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一つまたは二つの外来ＤＮＡ配列の挿入を提供する、組換えアライグマポックスウィルス（ＲＣＮＶ）ベクターを開示する。アライグマポックスウィルスィルスゲノムは、ウィルスゲノムのアライグマポックスウィルス宿主域遺伝子の欠失を含むものとして、特許中に記載される。特許は、外来ＤＮＡ配列をアライグマポックスウィルスゲノムに挿入することにより組換えアライグマポックスウィルスを生成するための、相同ベクターを提供する。実施例においては、この特許は、外来性ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ「Ｕ」ゲノム領域への挿入を行う方法を示すにとどまる。ＤＮＡ配列分析は、特許権者らにより開示されるＨｉｎｄＩＩＩ「Ｕ」ゲノム領域が、組換えアライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン（ｈａ）挿入および／またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）領域ではないことを示す。
【００１５】
特許文献１１は、組換えブタアデノウィルスを用いたウィルスベクターおよびワクチンを開示する。特に、この特許は、ｉｎ ｖｉｖｏで後者が複製され、挿入された異種ヌクレオチド配列を発現することを可能にする条件下でブタアデノウィルスに挿入された異種ヌクレオチド配列を含む、ｉｎ ｖｉｖｏ複製および組換えブタアデノウィルスを記載する。特許は、ブタアデノウィルス（ＰＡＶ）セロタイプ３または５（ＰＡＶ―３ ＰＡＶ―５）からのアデノウィルスゲノムの使用、および、主要後期プロモータ（ＭＬＰ）の下流に位置するＰＡＶ―３またはＰＡＶ―５ゲノムのＥ３領域の非必須ゾーンに少なくとも一つの産物をコードする異種ヌクレオチド配列の挿入を、さらに記載する。特許は、参照ヌクレオチド配列の全部または一部を含むＤＮＡフラグメントにも関する。組換えＰＡＶベクターが、仮性狂犬病ウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス、パルボウィルスィルス、ブタコレラウィルス、ブタサーコウィルス２型、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群より選択されるブタ病原体を発現することが示される。
【００１６】
特許文献１２は、ブタサーコウィルス２型からの外来ＤＮＡを含むアビポックスウィルス等の組換えポックスウィルスの使用、ならびにブタサーコウィルス２型により引き起こされる病気を治療または防止する方法を扱う。特に、同特許の組換えポックスウィルスは、ブタサーコウィルス２型のＯＲＦ１〜１３からなる単離されたＤＮＡ分子を含み、組換えポックスウィルスは、組換えＡＬＶＡＣカナリアポックスウィルスである。
【００１７】
特許文献１３は、ＰＣＶ―２抗原を含む免疫原性組成物の投与により、ＰＣＶ―２に対する免疫応答を誘導することにより、ブタにおけるブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ―２）のウィルス負荷を減少させる方法に関する。同特許は、外来性ＰＣＶ―２ヌクレオチド配列を含むベクターとしての抗原を記載し、ＰＣＶ―２ヌクレオチド配列が、ＯＲＦ４、ＯＲＦ１３、またはＯＲＦ４およびＯＲＦ１３をコードし、発現する。同特許に示されるいくつかの実施形態においては、免疫原性組成物は、一つ以上の追加的ブタ病原体を含む。特許に開示される方法において使用される組成物は、少なくとも一つの追加的ブタ病原体からの少なくとも一つの免疫原、またはこのような免疫原を発現するベクターをさらに含み、追加的ブタ病原体は、ＰＲＲＳ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、萎縮性鼻炎、仮性狂犬病、ブタコレラ、ブタインフルエンザ、脳心筋炎ウィルス、およびＰＰＶからなる群より選択される。同特許に開示されるベクターには、ＤＮＡベクタープラスミド、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌、バキュロウィルス等のウィルス、ブタヘルペスウィルスまたはオーエスキー病ウィルス（仮性狂犬病）を含むヘルペスウィルス、ブタアデノウィルスを含むアデノウィルス、および、ワクシニアウィルス、アビポックスウィルス、カナリアポックスウィルス、アライグマポックスおよびブタポックスウィルスを含むポックスウィルスが含まれる。
【００１８】
チミジンキナーゼ遺伝子またはヘマグルチニン遺伝子に挿入された二つ以上の外来性遺伝子を含む、多価組換えアライグマポックスウィルスを扱う、特許文献１４の開示およびそれに継続する特許文献１５。後のネコ病原体曝露に対してネコを免疫化するワクチンとしての多価組換えアライグマポックスウィルスの使用が、これら二つの関連特許に開示される。外来性遺伝子が挿入される挿入ベクターの構築と；挿入された遺伝子に隣接するのは、アライグマポックスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子またはヘマグルチニン遺伝子に再結合できる配列であり；外来性遺伝子を含む挿入ベクターとアライグマポックスウィルスとの両方を、感受性宿主細胞へ導入するステップと；生じたプラークから組換えアライグマポックスウィルスを選択するステップを伴う、組換えプロセスにより、多価組換えアライグマポックスウィルスを作成する方法も、開示される。特許の多価組換えアライグマポックスウィルスは、ネコ細胞において感染および複製でき、ウィルス複製に必須でないアライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子またはチミジンキナーゼ遺伝子からなる領域に挿入された二つ以上の外来性遺伝子を含み、特に外来性遺伝子は、発現のためにプロモータに作動可能に連結され；各外来性遺伝子が、ネコ病原体抗原をコードする。特許は、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ Ｅｎｖ）、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ Ｇａｇ）、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ Ｅｎｖ）、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ Ｍ）、ネコ科の伝染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ Ｎ）、ネコカリシウィルス（ＦＣＶカプシドタンパク質）、ネコジステンパウィルス（ＦＰＶ ＶＰ２）、および狂犬病―Ｇ等の、ネコ病原体抗原をコードする外来性遺伝子を記載する。
【００１９】
家畜ワクチンの分野におけるあらゆる努力にもかかわらず、単数または複数のウィルスによる感染からブタを適切に保護する、安全かつ有効な一価または多価ＰＣＶおよび／またはＰＲＲＳＶ組換えワクチンの必要が、当分野に依然として存在する。ブタにおいてＰＭＷＳおよび／またはＰＲＲＳに対する適切な防御免疫応答を与えうる組換えワクチンの投与による、ＰＣＶおよび／またはＰＲＲＳＶにより引き起こされる感染または病気の予防のための、安全かつ有効な方法も必要とされる。ブタに対する投与時の安全性および有効性に加えて、従来の不活性化ＰＲＲＳＶワクチンを上回る他の利益が、遊離ウィルスまたは不活性化ウィルスのその病原状態への復帰による不測の感染のリスクを除去する組換えワクチンにより達成される。安全かつ有効なアライグマポックスウィルスベクター化ブタワクチンの開発が、重篤なブタ疾患を防止し、ワクチン生産の間の従業員の安全を確保し、病原ウィルスが商業生産で用いられる不活性化および除染処理を生き残る一切の可能性を完全に排除するための使用において重要な利点をもたらすことは、明らかである。
【００２０】
本明細書にあげられる全ての特許および刊行物は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０５２９５８４号明細書
【特許文献２】国際公開第９３／０６２１１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９３／０７８９８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９２／２１３７５号パンフレット
【特許文献５】西国特許第９３０１９７３号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２１７，８８３号明細書
【特許文献７】仏国特許第２，７８１，１５９号明細書
【特許文献８】米国特許第６，３６８，６０１号明細書
【特許文献９】米国特許第５，８８８，５１３号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，２９４，１７６号明細書
【特許文献１１】米国特許第７，１０９，０２５号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，４９７，８８３号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，２１１，３７９号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，２４１，９８９号明細書
【特許文献１５】米国特許第７，０８７，２３４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、その最も広い態様においては、ベクターが、ｈａおよび／またはｔｋ遺伝子座で、単独またはブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ―２）の一つ以上のオープンリーディングフレームと組み合わせて、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）分離株によりコードされる抗原タンパク質の一つ以上、好ましくは一つ以上のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）分離株の複数のオープンリーディングフレームによりコードされる抗原タンパク質を発現する、安全かつ有効な組換えポックスウィルスベクターワクチンを提供する。特定の実施形態では、ベクターは、ＦｅＬＶ Ｐ２７＋表現型をもつネコ白血病ウィルスの糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。ＦｅＬＶ Ｐ２７＋またはＰＣＶ―２カプシド遺伝子は、異なる組み合わせにおいてクローンをスクリーニングするためのユニークなマーカとして有用である。本発明は、保護を必要とするブタに強力な新規の組換えワクチンを投与することにより、離乳後多臓器性発育不良症候群および／またはブタ繁殖・呼吸障害症候群からブタを保護する方法も提供する。
【００２３】
したがって、本発明の第一の態様は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）タンパク質をコードする一つ以上の外来性核酸分子を含む、組換えアライグマポックスウィルスベクター（ｒＲＣＰＶ）を提供する。
【００２４】
同組換えアライグマポックスウィルスベクターにおいては、
ａ．）少なくとも一つの核酸分子が、アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座またはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され；または
ｂ．）少なくとも二つの核酸分子が、アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座またはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され；または
ｃ．）少なくとも一つの核酸分子が、アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座に挿入され、少なくとも一つの核酸分子が、チミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され；または
一実施形態においては、アライグマポックスウィルスベクターは、アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座に挿入される少なくとも二つの核酸分子と、チミジンキナーゼ遺伝子座に挿入される少なくとも二つの核酸分子とを含む。
【００２５】
一実施形態においては、組換えアライグマポックスウィルスベクターは、アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼおよびヘマグルチニン遺伝子座に加えて、アライグマポックスウィルスゲノムの第三の非必須部位に挿入されるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。組換えアライグマポックスウィルスゲノムの任意の非必須部位が、本発明における使用に予定されうる。
【００２６】
一実施形態においては、アライグマポックスウィルスゲノムの第三の非必須部位は、セリンプロテアーゼインヒビター部位である。
【００２７】
一実施形態においては、一つ以上の外来性核酸分子の各々が、一つ以上のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスのオープンリーディングフレームをコードする。オープンリーディングフレームは、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００２８】
一実施形態においては、ポックスウィルスベクターは、同じブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスタンパク質の少なくとも二つの複製をコードする。同じタンパク質の二つの複製が、二つの異なる核酸分子によりコードされ、または同じ核酸分子によりコードされうる。同じタンパク質の二つの複製が、一つのプロモータに作動可能に連結され、または同じタンパク質の二つの複製が、別々のプロモータに作動可能に連結されうる。同じタンパク質の二つの複製は、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７およびその組み合わせからなる群より選択される、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスのオープンリーディングフレームによりコードされる。
【００２９】
一実施形態においては、二つ以上の核分子が、アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座および／またはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入される。
【００３０】
一実施形態においては、二つ以上の外来性核酸分子が、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、およびＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７からなる群より選択される、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスの少なくとも二つのオープンリーディングフレームをコードする。
【００３１】
一実施形態においては、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスは、ＩＳＵ１２（Ｉｏｗａ）、Ｏｌｏｔ／９１（Ｓｐａｎｉｓｈ）または両方である。
【００３２】
一実施形態においては、組換えアライグマポックスウィルスベクターは、ブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ２）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする核酸分子をさらに含む。
【００３３】
一実施形態においては、ブタサーコウィルス２のオープンリーディングフレームは、ＯＲＦ２である。
【００３４】
一実施形態においては、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２が、アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に、別に挿入されうる。
【００３５】
一実施形態においては、組換えアライグマポックスウィルスベクターは、Ｐ２７＋表現型をもつネコ白血病ウィルスの糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００３６】
一実施形態においては、アライグマポックスウィルスは、生存しており、複製可能である。
【００３７】
本発明の第二の態様は、免疫学的に有効な量の本明細書に記載の任意の組換えアライグマポックスウィルスベクターを一つ以上と、必要に応じて適切な担体、希釈剤またはアジュバントとを含む、組換えブタワクチンを提供する。
【００３８】
一実施形態においては、組換えブタワクチンは、免疫学的に有効な量の本明細書に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターを二つ以上と、必要に応じて適切な担体または希釈剤とを含む。
【００３９】
一実施形態においては、アライグマポックスウィルスは、生存しており、複製可能である。
【００４０】
一実施形態においては、ワクチンは、アジュバントを含まない。
【００４１】
一実施形態においては、ワクチンは、単回用量または反復用量として投与される。
【００４２】
一実施形態においては、組換えブタワクチンは、少なくとも一つの追加的ブタ抗原をさらに含む。追加的ブタ抗原は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ抗原、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｍ ｓｕｉｓ抗原、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ抗原、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ抗原、レプトスピラ菌抗原、ブタインフルエンザウィルス抗原、ブタパルボウィルス抗原、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ抗原、ブタ呼吸器コロナウィルス抗原、ロタウィルス抗原、Ａｕｊｅｓｋｙ病、ブタ伝染性胃腸炎抗原の原因となる病原体由来の抗原およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００４３】
本発明の第三の態様は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供し、方法は、本明細書に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターを一つ以上含む組換えブタワクチンを、ブタ動物に投与するステップを含む。
【００４４】
一実施形態においては、免疫応答は、液性応答または抗体媒介性応答である。一実施形態においては、免疫応答は、細胞媒介性またはＴ細胞媒介性免疫応答である。
【００４５】
一実施形態においては、約４．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜約７．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲のワクチン用量を投与することにより、防御免疫応答が誘導される。
【００４６】
一実施形態においては、免疫応答を誘導するために利用される組換えブタワクチンは、生きた複製可能な組換えアライグマポックスウィルスベクター（単数または複数）を一つ以上含む。
【００４７】
一実施形態においては、免疫応答を誘導するために利用される組換えブタワクチンは、生きた複製可能な組換えアライグマポックスウィルスベクター（単数または複数）を二つ以上含む。
【００４８】
本発明の第四の態様は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群および離乳後多臓器性発育不良症候群を防止する方法を提供し、方法は、免疫学的に有効な量の本明細書に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター（単数または複数）を一つ以上と、必要に応じて適切な担体、希釈剤またはアジュバントとを含む、組換えブタワクチンを、保護を必要とするブタ動物に投与するステップを含む。
【００４９】
一実施形態においては、組換えアライグマポックスウィルスベクター（単数または複数）は、生存しており、複製可能である。
【００５０】
本発明の第五の態様は、哺乳類においてブタウィルスに対する防御免疫応答を誘導するため、または哺乳類のブタ繁殖・呼吸障害症候群および／または離乳後多臓器性発育不良症候群を防止するための薬物の製剤のための、本発明の任意のベクターまたはワクチンの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１−１】ｐＦＤ２０００Ａ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：１）。
【図１−２】ｐＦＤ２０００Ａ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：１）。
【図１−３】ｐＦＤ２０００Ａ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：１）。
【図２−１】ｐＦＤ２００１ ＴＫ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：２）。
【図２−２】ｐＦＤ２００１ ＴＫ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：２）。
【図３−１】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：３）。
【図３−２】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：３）。
【図３−３】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：３）。
【図４−１】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＧＰＶ―ＰＶ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：４）。
【図４−２】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＧＰＶ―ＰＶ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：４）。
【図４−３】ｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＧＰＶ―ＰＶ―ＦＤＡＨプラスミドの核酸配列である（配列番号：４）。
【図５】ＰＣＶ２Ａ ＯＲＦ２―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：５）。
【図６】ＰＣＶ２Ｂ ＯＲＦ２―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：６）。
【図７】ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２―ＯＲＦ３―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：７）。
【図８】ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２―ＯＲＦ４―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：８）。
【図９】ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２―ＯＲＦ５―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：９）。
【図１０】ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２―ＯＲＦ６―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：１０）。
【図１１】ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２―ＯＲＦ７―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：１１）。
【図１２】ＰＲＲＳＶ Ｏｌｏｔ９１―ＯＲＦ５―ＦＤＡＨの核酸配列である（配列番号：１２）。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明の方法および治療方法論が説明される前に、本発明が、記載される特定の方法および実験条件に限定されず、かかる方法および条件が変動しうることが理解されねばならない。本明細書において用いられる用語が、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、制限を意図するものではなく、本発明の範囲が添付の請求の範囲においてのみ制限されることも理解されなければならない。
【００５３】
本明細書および添付の請求の範囲において用いられるところの、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈による別段の明示がない限り、複数形も含まれる。したがって、例えば、「方法」への言及には、本明細書に説明される種類の、および／または本開示を読んだ当業者に明らかとなる、一つ以上の方法および／またはステップが含まれる。
【００５４】
したがって、本出願においては、従来技術の通常の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が用いられうる。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｂｙｒｄ，ＣＭ ａｎｄ Ｈｒｕｂｙ，ＤＥ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２６９：Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｐｏｘｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，ｐａｇｅｓ ３１―４０；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ｈｅｒｅｉｎ「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照。
【００５５】
本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施およびテストに使用されうるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載の全ての刊行物は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００５６】
定義
本明細書において用いられる用語は、当業者に認識され、知られている意味を有するが、便宜と完全のために、特定の用語とその意味を以下に記載する。
【００５７】
「約」という用語は、２０％の範囲内、より好ましくは１０％の範囲内、より好ましくは５％の範囲内を意味する。
【００５８】
「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物をいう。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織デポー剤として、また、免疫応答を非特異的に増強するリンパ系活性化剤としても働きうる（Ｈｏｏｄ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，１９８４，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ｐ．３８４）。状況によって、アジュバントの非存在下での抗原単独による初回曝露は、液性または細胞性免疫応答の誘発に失敗しうる。アジュバントには、完全フロインドアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルション等の界面活性物質、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ―Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等の潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるがこれに限定されない。アジュバントは、薬理学上許容可能であるのが好ましい。
【００５９】
「抗原」という用語は、動物における抗体産生またはＴ細胞応答を刺激しうる、化合物、組成物または免疫原性物質をさし、動物に注射または吸収される組成物を含む。用語は、個々の巨大分子、または、同種または異種の抗原性巨大分子集団をさすために用いられうる。抗原は、特異的な液性または細胞性免疫の産物と反応する。「抗原」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質フラグメント、核酸、オリゴ糖、多糖、有機または無機化学物質または組成物等を含む部分を広く含む。さらに、抗原は、任意のウィルス、バクテリア、寄生虫、原生動物、または真菌類から導出または入手でき、全生物でありうる。「抗原」という用語には、全ての関連の抗原エピトープが含まれる。同様に、例えば核酸免疫化の場合等において、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、定義に含まれる。合成抗原、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープおよび他の組換または合成的に誘導された抗原も、含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎ等（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７ ２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎ等（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４２ ３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：４０２ ４０８；Ｇａｒｄｎｅｒ等（１９９８）１２ｔｈ Ｗｏｒｌｄ ＡＩＤＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｊｕｎ．２８ Ｊｕｌ．３，１９９８）。
【００６０】
「によりコードされる」または「コードする」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をさし、ポリペプチド配列は、少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが核酸配列によりコードされる。配列によりコードされるポリペプチドにより免疫学的に同定可能である、ポリペプチド配列も含まれる。したがって、抗原の「ポリペプチド」、「タンパク質」、または「アミノ酸」配列は、抗原のポリペプチドまたはアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の類似性、好ましくは少なくとも８０％の類似性、より好ましくは約９０〜９５％の類似性、最も好ましくは約９９％の類似性を有しうる。
【００６１】
本明細書で用いられるところの「外来性」という用語は、アライグマポックスウィルスゲノムの外部で生成、開始、誘導、または開発されるもの、すなわちポックスウィルスゲノムの外部を起源とするもの、例えば、アライグマポックスウィルスゲノムに対して外来性であると考えられる、ＰＲＲＳＶから入手または単離された遺伝子材料を含むことが意図される。
【００６２】
本発明の文脈において用いられるところの「遺伝子」とは、遺伝的機能が伴う、核酸分子（染色体、プラスミド等）におけるヌクレオチドの配列である。遺伝子は、生物のゲノムの中の特定の物理的位置（「遺伝子座位」または「遺伝子座」）を占めるポリヌクレオチド配列（例えば哺乳類のＤＮＡ配列）を含む、例えば生物の遺伝性単位である。遺伝子は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えばｔＲＮＡ）等の発現産物をコードしうる。あるいは、遺伝子は、発現産物をコードせず、タンパク質および／または核酸の結合等の特定のイベント／機能の遺伝子位置（例えばファージ結合部位）を画定しうる。典型的に、遺伝子は、ポリペプチドコード配列等のコード配列、およびプロモータ配列、ポリアデニル化配列、転写調節配列（例えばエンハンサ配列）等の非コード配列を含む。多くの真核生物遺伝子は、「イントロン」（非コード配列）により中断される「エクソン」（コード配列）を有する。あるケースでは、遺伝子が、別の遺伝子（単数または複数）と配列を共有しうる（例えばオーバーラップ遺伝子）。
【００６３】
抗原またはワクチン組成物に対する「免疫応答」は、目的の抗原またはワクチン組成物に存在する分子に対する液性および／または細胞媒介性免疫応答の、対象における発現である。本発明の目的を達成する上では、「液性免疫応答」は、抗体により媒介される免疫応答であり、本発明の抗原／ワクチンに対する親和性をもつ抗体の生成を伴うものであり、一方で「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介されるものである。「細胞性免疫応答」は、クラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に伴う抗原エピトープの提示により誘発される。これが、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球細胞（「ＣＴＬ」）を活性化する。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされ、細胞表面に発現されるタンパク質に伴って提示されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはそのような微生物に感染した細胞の細胞溶解を誘導および促進するのを助ける。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関わる。ヘルパーＴ細胞は、機能を刺激し、その表面上のＭＨＣ分子に伴ってペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性を集中するのを助ける働きをする。「細胞性免疫応答」は、活性化Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞から誘導されるものを含む他の白血球により産生される、サイトカイン、ケモカインおよび他のそのような分子の産生をもいう。細胞媒介免疫応答を刺激する特定の抗原または組成物の能力は、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞障害の細胞アッセイ、感作した対象における抗原に特異的なＴリンパ球のアッセイ、または抗原による再刺激に応答したＴ細胞によるサイトカイン産生の測定等、多数のアッセイにより決定されうる。そのようなアッセイは、公知技術である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９―４１９９；Ｄｏｅ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９―２３７６を参照。
【００６４】
「免疫原性ＯＲＦ」または「免疫原性ｏｒｆ」とは、免疫応答を誘発するオープンリーディングフレームをさす。
【００６５】
本明細書で使用されるところの「免疫学的に有効な量」とは、当業者に知られる標準的なアッセイで測定されるところにより、免疫応答、細胞性（Ｔ細胞）または液性（Ｂ細胞または抗体）応答を誘発するのに十分な抗原またはワクチンの量をいう。例えば、本発明に関して、「免疫学的に有効な量」は、≧４．５〜７．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの最低保護用量（力価）である。免疫原としての抗原の有効性は、増殖アッセイにより、Ｔ細胞のその特異的標的細胞を溶解する能力を測定するためのクロミウム放出アッセイ等の細胞溶解アッセイにより、または血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することでＢ細胞活性のレベルを測定することにより、測定されうる。さらに、免疫化された宿主を注射された抗原に曝露することにより、免疫応答の保護のレベルが測定されうる。例えば、免疫応答が望まれる抗原がウィルスまたは腫瘍細胞である場合には、「免疫学的に有効な量」の抗原により誘導される保護のレベルが、動物のウィルスまたは腫瘍細胞曝露後の生存率または死亡率を検出することにより測定される。
【００６６】
本明細書で定義されるところの、アライグマポックスウィルスゲノムにおける「非必須部位」とは、ウィルス感染または複製に必要でない、ウィルスゲノムにおける領域を意味する。アライグマポックスウィルスゲノムにおける非必須部位の例には、チミジンキナーゼ（ＴＫ）部位、ヘマグルチニン（ＨＡ）部位およびセリンプロテアーゼインヒビター部位が含まれるがこれに限定されない。アライグマポックスウィルスのＴＫ部位は、Ｃ．Ｌｕｔｚｅ―Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍ．ＳｉｄｈｕおよびＡ．Ｋａｐｐｅｌｅｒ，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １０（１９９５），ｐｐ．８１―８４に記載される。アライグマポックスウィルスのＴＫ遺伝子の配列は、ＰｕｂＭｅｄアクセッション番号ＤＱ０６６５４４およびＵ０８２２８にも見つけられる。アライグマポックスウィルスのＨＡ部位は、Ｃａｖａｌｌａｒｏ ＫＦおよびＥｓｐｏｓｉｔｏ，ＪＪ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２），１９０（１）：４３４―９に記載される。アライグマポックスウィルスのＨＡ遺伝子の配列は、ＰｕｂＭｅｄアクセッション番号ＡＦ３７５１１６にも見つけられる。
【００６７】
「核酸分子」または「核酸配列」という用語は、タンパク質合成の方向を指示する、すなわちタンパク質をコードおよび発現する、プリンおよびピリミジン塩基の反復単位等の反復ヌクレオチドの長い鎖をさす、その通常の意味を有する。用語が請求項において使用される場合には、核酸は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスタンパク質をコードする既知の外来性または外来遺伝子、好ましくはオープンリーディングフレーム遺伝子をさす。
【００６８】
本明細書で使用されるところの「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」、または「ｏｒｆ」という用語は、介在終止コドンを伴わずに特定のウィルスタンパク質をコードするために必要とされる最小限のヌクレオチド配列をさす。
【００６９】
「作動可能に連結される」は、そのように記載される成分が、それらの通常の機能を実行するように配置される、要素の配置をさす。したがって、コード配列（例えば抗原または関心をコードする配列）に作動可能に連結された所与のプロモータは、調節タンパク質および適当な酵素が存在するときに、コード配列の発現をもたらしうる。いくつかの場合には、ある調節要素は、その発現を誘導するように機能する限り、コード配列と連続する必要はない。例えば、介在する非翻訳非転写配列が、プロモータとコード配列の間に存在でき、プロモータ配列はなお、コード配列に「作動可能に連結される」とみなされうる。したがって、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、これがその後トランスＲＮＡスプライシングされ、コード配列によりコードされるタンパク質に翻訳されるとき、コード配列は、細胞において転写および翻訳制御配列に「作動可能に連結される」。
【００７０】
「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」という用語は、互換可能に使用され、Ｓｕｉｄａｅ科に属する任意の動物、例えばブタ（ｐｉｇ）などをさす。
【００７１】
「保護」免疫応答は、哺乳類を感染から保護する働きをする、液性または細胞性免疫応答を誘発するワクチンの能力をさす。ブタ哺乳類のコントロール集団、例えばワクチンを投与されない感染動物と比較して統計学的に有意の改善があれば、提供される保護は絶対的である必要はない、すなわち感染が完全に防止または根絶される必要はない。保護は、感染の症状発現の重症度または迅速性を軽減することに限定されうる。
【００７２】
単に本明細書で用いられるところの「組換え」という用語は、単に、標準的な遺伝子操作方法により作製されるアライグマポックスウィルスコンストラクトをいう。
【００７３】
「複製可能」という用語は、適切な宿主細胞内で複製、複写、または再生することが可能な、微生物、例えばアライグマポックスウィルス等のウィルスをさす。
【００７４】
「ワクチン」または「ワクチン組成物」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、動物において免疫応答を誘導し、および／または感染による疾患または死亡の可能性から動物を保護する、少なくとも一つの免疫学的に活性の成分を含む医薬組成物をさし、活性成分の免疫学的活性を増強する一つ以上の追加的成分を含んでも、または含まなくてもよい。ワクチンは、医薬組成物に典型的なさらなる成分を、さらに含みうる。
【００７５】
「ベクター」は、宿主生物における複製が可能なＤＮＡ分子であり、組換えＤＮＡ分子を構築するために遺伝子が挿入される。
【００７６】
一般的な説明
本発明によれば、ベクターが、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスタンパク質をコードする一つ以上の外来性核酸分子を含む、ユニークな組換えポックスウィルスベクターが提供される。一実施形態においては、ポックスウィルスベクターは、同じブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスタンパク質の少なくとも二つのコピーをコードしうる。同じタンパク質の二つのコピーが、二つの異なる核酸分子によりコードされ、または、同じタンパク質の二つのコピーが、同じ核酸分子によりコードされうる。同じタンパク質の二つのコピーが、一つのプロモータ、または別々のプロモータに作動可能に連結されうる。
【００７７】
タンパク質は、ヘマグルチニン（ｈａ）および／またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座のそれぞれで、ブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ―２）のＯＲＦ１〜ＯＲＦ１３、好ましくはＯＲＦ２等の一つ以上のオープンリーディングフレームを伴って、または伴わずに、一つ以上のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）分離株のＯＲＦ１ａまたはＯＲＦ１ｂ〜ＯＲＦ７、好ましくはＯＲＦ５、ＯＲＦ６および／またはＯＲＦ３／ＯＲＦ４／ＯＲＦ７等のオープンリーディングフレームによりコードされうる。本明細書に説明される任意の核酸分子の挿入のための、ポックスウィルスゲノムの別の第三非必須部位は、セリンプロテアーゼインヒビター部位である。特定の一実施形態では、二つ以上の外来性核酸分子が、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、およびＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７からなる群より選択される、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスの二つ以上のオープンリーディングフレームをコードする。
【００７８】
ＦｅＬＶ Ｐ２７＋表現型（ＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡで青色）をもつネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）の糖タンパク質を発現する遺伝子も、ｈａおよび／またはｔｋ遺伝子座で挿入される。これらのコンストラクトにおいては、ＦｅＬＶ Ｐ２７＋またはＰＣＶ―２ ＯＲＦ２（カプシド遺伝子）が、異なる組み合わせにおいてクローンをスクリーニングするためのユニークなマーカとして使用される。好ましいＰＲＲＳＶ分離株は、ＩＳＵ１２（Ｉｏｗａ）およびＯｌｏｔ／９１（Ｓｐａｎｉｓｈ）株を含むが、他の分離株が、以下の実施例において本発明を示す株と容易に置換されうる。
【００７９】
したがって、本発明の目的は、一つのウィルスコンストラクトにおいて、アライグマポックスウィルス（ＲＣＮＶ）ゲノムのヘマグルチニン（ｈａ）および／またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座で、単独またはブタサーコウィルス（ＰＣＶ２）のＯＲＦと組み合わせて、Ｕ．Ｓ．およびＥ．Ｕ．株のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）の四つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現することで、強力なワクチンを作成することである。
【００８０】
別の本発明の目的は、ＬａｃＺのような従来のスクリーニングマーカではなく、限界希釈およびｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークアプローチ、または限界希釈およびウィルスＥＬＩＳＡをスクリーニングマーカとして利用する新しいクローンスクリーニングシステムを使用することである。
【００８１】
前述の目的は、ｒＲＣＮＶが、ヘマグルチニン（ｈａ）および／またはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座のそれぞれで、ＰＣＶ―２のオープンリーディングフレーム、好ましくはＯＲＦ２を伴って、または伴わずに、一つ以上のＰＲＲＳＶ分離株の複数のオープンリーディングフレーム、好ましくはＯＲＦ５、ＯＲＦ６および／またはＯＲＦ３／ＯＲＦ４／ＯＲＦ７を発現する、組換えアライグマポックスウィルスベクター（ｒＲＣＮＶ）を含む新規なワクチンを提供することにより達成される。
【００８２】
過去の発現系は、一つのウィルスコンストラクトにおいて、ＰＲＲＳＶ遺伝子の一つまたは二つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）だけを発現する能力において制限されていた。本発明は、単独またはブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ―２）のオープンリーディングフレームと組み合わせた、Ｕ．Ｓ．およびＥ．Ｕ．株のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）の四つ以上のＯＲＦの発現を都合よく可能にする。これまで従来技術では説明されていない、本発明の優れた発現系は、一つのウィルスコンストラクトにおける、アライグマポックスウィルス（ＲＣＮＶ）ゲノムのｈａおよび／またはｔｋ遺伝子座および／またはセリンプロテアーゼインヒビター遺伝子座への、ＰＲＲＳＶからの複数のＯＲＦの挿入を可能にし、これにより、ブタをＰＲＲＳから保護する強力な組換えワクチンをつくる。
【００８３】
本発明は、限界希釈およびｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークアプローチまたは限界希釈およびＥＬＩＳＡをスクリーニングマーカとして利用するスクリーニングシステムを使用する。このスクリーニングシステムは、非常に有益に、一つのウィルスコンストラクトにおいて複数部位の発現を提供する。
【００８４】
アライグマポックスウィルス（Ｈｅｒｍａｎ株）は、Ｙ．Ｆ．Ｈｅｒｍａｎにより、Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄで１９６１〜１９６２年に、臨床症状のないアライグマの気道から最初に単離された（Ｙ．Ｆ．Ｈｅｒｍａｎ，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｒａｃｃｏｏｎｓ，”Ｉｎ：Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｐｒｏｃ．，６４ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．１１７（１９６４））。本発明のｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳコンストラクトにおいては、ＰＲＲＳＶ遺伝子の一つ以上の株の、例えばＯＲＦ５、ＯＲＦ６および／またはＯＲＦ３／ＯＲＦ４／ＯＲＦ７等の複数のオープンリーディングフレームの、アライグマポックスウィルス（ＲＣＮＶ）ゲノムのｈａおよび／またはｔｋ遺伝子座への挿入は、非病原性Ｈｅｒｍａｎ株をさらに弱毒化させる。都合のよいことに、本発明のｒＲＣＮＶベクター化ＰＲＲＳＶワクチンは、ワクチン産生の間の従業員の安全性も改善し、商業生産の間に使用される不活性化および除染処理を病原性ウィルスが生存する一切の機会を完全に除去する。
【００８５】
本発明に記載される科学的進歩および新規な方法は、通常の技術を有する当業者により、ＩＳＵ１２およびＯｌｏｔ／９１以外のＰＲＲＳＶ株から得られる複数のオープンリーディングフレームの抗原タンパク質に使用され、アライグマポックスウィルスベクターのｔｋおよび／またはｈａ遺伝子座で挿入されて、ＰＲＲＳに対する保護のための免疫原性ワクチンが提供されうると考えられる。たとえば、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ株ＶＲ―２３３２、Ｅｕｒｏｐｅａｎ株Ｌｅｌｙｓｔａｄ Ｖｉｒｕｓ等の他の株が、ＩＳＵ１２および／またはＯｌｏｔ／９１株に容易に代替されうる。ＲＮＡウィルスは突然変異しやすいため、代替的に、新しい野外分離株またはウィルス変異体の所望のＯＲＦ遺伝子が単離され、本発明の組換えワクチンにおいて利用されうる。それにもかかわらず、現在までに見つけられているＰＲＲＳＶの多くの変異体と多数の分離株の間に高い相同性があり、したがって、本発明のワクチンコンストラクトにおける、ＯＲＦ５またはＯＲＦ６等の一定のオープンリーディングフレームの使用は、ＰＲＲＳに対して有意に有効であるという利点を有する。４０％程度の低い相同性を有する分離株では、本発明のコンストラクトの実際的利点は、複数のウィルスソースから複数のＯＲＦの抗原タンパク質を容易に収容して、有効な、より広域スペクトルワクチンを提供できることである。このような子ブタの接種プログラムの成功によるＰＲＲＳの防止は、病気の有効な長期的治療がないだけに、ブタ産業にとって非常に重要である。
【００８６】
本発明において有用なポックスウィルスベクターは、アライグマポックスウィルス、カナリアポックスウィルス、フォウルポックスウィルス、ブタポックスウィルス、ワクシニアウィルス等を含みうるがこれに限定されないが、アライグマポックスウィルスが用いられるのが好ましいことが、さらに予定される。本発明の方法の実行において、不活性化されたポックスウィルスベクターを用いうるが、生ベクターが好ましい。
【００８７】
本発明は、保護を必要とするブタに強力な新規の組換えワクチンを投与することにより、離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）および／またはブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）からブタを保護する、新規の方法も提供する。
【００８８】
本発明の方法においては、免疫学的に有効な量の本発明のワクチンが、動物における防御免疫応答を誘導するために、ＰＭＷＳおよび／またはＰＲＲＳからの保護を必要とするブタ、特に若年の子ブタに投与される。ブタに与えられる有効な免疫化量は、ＰＣＶ―２および／またはＰＲＲＳＶの有害効果からブタを保護するために、ワクチンに対する十分な免疫応答が達成されるものである。ワクチンが、ワクチン分野の標準値により必要とされる、少なくとも有意な数の予防接種されたブタを保護できるとき、防御免疫応答が得られたと考えられる。動物に予防接種し、良好なワクチン接種効果を誘発する免疫学的に有効な投与量または有効な免疫化量は、例えば標準的滴定研究等のルーチン試験により、容易に決定され、または直ちに滴定されうる。
【００８９】
本発明の新規なワクチンコンストラクトは、生後離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）および／またはブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）の防止のために、生後約３ヵ月の健常な子ブタのワクチン接種のために用いられる。ワクチンは、成熟または成体の雌ブタ（すなわち三ヵ月より高齢）にも、交配前に与えられうる。ワクチンは、単回用量で投与され、または抗体価が下落し、ブースター注射が必要とみなされる場合には、反復用量において投与されうる。ワクチンは、健常動物に単回接種において投与されて、疾患からの長期間の保護を提供し、動物を少なくとも一〜三年またはそれ以上保護するのが好ましい。適切な投与量は、標準的な用量滴定研究により決定される。ワクチンは、本明細書に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター化コンストラクトのいずれか一つを、免疫学的に有効な量含みうる。別の実施形態においては、ワクチンは、本明細書に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターコンストラクトの任意の二つ以上を、免疫学的に有効な量含みうる。
【００９０】
ワクチンは、任意の投与経路、経口、鼻腔内、経皮（すなわち全身吸収のために皮膚表面上または皮膚表面に適用される）、非経口等により、容易に与えられうるが、いくつかの経路は、具体的な動物および取扱者により、ロジスティック的により困難でありうる。非経口投与経路は、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内（すなわち注射または他の方法により皮下に配置される）経路等を含むがこれに限定されない。ワクチンは、皮下投与されるのが好ましい。
【００９１】
ポックスウィルスベクターは、生存しており、または不活性化ウィルスワクチンを調製する従来の方法により、例えばＢＥＩ（バイナリエチレンイミン）、ホルマリン等を用いて、不活性化されればよく、ＢＥＩが好ましい不活性化剤であるが、本発明のワクチンには、最適かつ強力な免疫学的効力のために、生アライグマポックスウィルスを用いるのが非常に望ましい。
【００９２】
有益に、ＰＣＶ―２および／またはＰＲＲＳＶの複数のＯＲＦを発現する生組換えＲＣＮＶは、単独で、または適切な担体、希釈剤およびアジュバントとの組み合わせにおいて、ワクチンとして有用である。ワクチン産物は、保存剤；安定剤；乳化剤；水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；水酸化ナトリウム、塩酸等のｐＨ調整剤；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０等の界面活性剤（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販のポリソルベート８０）；リポソーム；ｉｓｃｏｍアジュバント；ムラミルジペプチド等の合成糖ペプチド；デキストランまたは例えばリン酸アルミニウム、硫酸デキストラン、ＤＥＡＥ―Ｄｅｘｔｒａｎ等とのデキストランの組み合わせ等の増量剤；ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）等のカルボキシポリメチレン（Ｂ．Ｆ．ＧｏｏｄｒｉｃｈＣｏｍｐａｎｙ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏから市販のポリアクリルポリマー）；エチレン無水マレイン酸またはエチレン／無水マレイン酸コポリマー（ＥＭＡ（登録商標）、ほぼ等しい量のエチレンおよび無水マレイン酸を有する線形エチレン／無水マレイン酸コポリマー、約７５，０００〜１００，０００の推定平均分子量を有する、Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販）；ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）Ａ６４０のような、アクリル酸およびメタアクリル酸の混合物とのスチレンのコポリマー等のアクリルコポリマーエマルション（例えば米国特許第５，０４７，２３８号、Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから市販の、スチレンと混合されたアクリル酸およびメタアクリル酸の非融合水性アクリル酸コポリマー）；ミコバクテリウム細胞壁抽出物等の細菌細胞壁；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等のコリネバクテリウム由来アジュバント；Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅ等のプロピオニバクテリウム由来アジュバント；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（カルメット―ゲラン菌またはＢＣＧ）；オルビウィルス等のサブウィルス粒子アジュバント；コレラ毒素；Ｎ，Ｎ―ジオクタデシル―Ｎ’Ｎ’―ビス（２―ヒドロキシエチル）―プロパンジアミン（アブリジン）；一リン酸化リピドＡ；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ、Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹから市販）；その合成物および混合物を含むがこれに限定されない様々な典型的な無毒性の薬理学上許容可能な添加物、希釈剤およびアジュバントを必要に応じて含みうる。本ワクチンで用いられうるさらなる添加物には、デキストロース、従来の酸化防止剤および従来のキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等が含まれるがこれに限定されない。ワクチン処方を必要に応じて補充しうる他の薬理学上許容可能なアジュバントには、ポリアニオン、ポリカチオン、ペプチド、鉱油エマルション、免疫修飾物質、様々な組み合わせ等が含まれるがこれに限定されない。適切なアジュバントのさらなる非限定的な例には、スクアランおよびスクアレン（または他の動物起源の油類）；ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）等のポリオキシエチレン―ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（Ｌ１２１、例えばＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販）；サポニン；Ｑｕｉｌ Ａ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの精製形態の商品名、Ｉｓｃｏｔｅｃ ＡＢ，ＳｗｅｄｅｎおよびＳｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ ａ／ｓ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能）；ＭＡＲＣＯＬ（登録商標）等の鉱油（液体飽和炭化水素の精製混合物、Ｅｘｘｏｎ―Ｍｏｂｉｌ，Ｆａｉｒｆａｘ，ＶＡ．から市販）；落花生油等の植物油；インターロイキン２およびインターロイキン１２等のインターロイキン；ガンマインターフェロン等のインターフェロン；動物ポックスウィルスタンパク質またはその混合物が含まれる。適切な安定剤の例には、スクロース、ゼラチン、ペプトン、ＮＺ―アミーネまたはＮＺ―アミーネＡＳ等の消化タンパク質抽出物が含まれるがこれに限定されない。乳化剤の例には、注射可能薬物または鼻腔内ワクチンに有用な、鉱油、植物油、落花生油および他の標準的な代謝性の無毒性油が含まれるがこれに限定されない。水酸化アルミニウムが、サポニンまたはＱｕｉｌ Ａ等の他のアジュバントと混合されて、サポニン―水酸化アルミニウムまたはＱｕｉｌ Ａ―水酸化アルミニウム等の組み合わせが形成されるのが好ましい。
【００９３】
好ましいアジュバントは、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、アクリル酸およびメタアクリル酸の混合物とのスチレンのコポリマー、鉱油エマルションまたはその組み合わせを含む。本発明のｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳコンストラクトの能力を大幅に増強する特に好ましいアジュバントシステムには、ＥＭＡ―３１（登録商標）（ほぼ等しい量のエチレンおよび無水マレイン酸を有する線形エチレン／無水マレイン酸コポリマー、約７５，０００〜１００，０００の推定平均分子量を有する、Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより市販）等のエチレン／マレイン酸コポリマーの組み合わせ、およびＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）（スチレンと混合されたアクリル酸およびメタアクリル酸の非融合水性アクリル酸コポリマー（アクリルスチレンエマルション）、Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから市販）等のアクリル酸コポリマーエマルションが含まれる。
【００９４】
本発明の組換えワクチン組成物は、例えばＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｍ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、レプトスピラ菌、ブタインフルエンザウィルス（ＳＩＶ）、ブタパルボウィルス、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ブタ呼吸器型コロナウィルス、ロタウィルス、Ａｕｊｅｚｋｙ病、ブタ伝染性胃腸炎等の原因となる病原体の、一つ以上の追加的なブタ抗原との混合物も必要に応じて含みうる。
【００９５】
任意の周知の方法を用いて、本発明の遺伝的コンストラクトを調製しうる。例えば、特定の制限部位を利用して、任意の所望の核酸配列を、標準的な方法を用いてアライグマポックスウィルスベクターへ挿入しうる。あるいは、大きな配列の挿入が望ましいとき、または本明細書に記載のように複数の遺伝子を挿入することが望まれるときには、相同的組み換え技術を利用しうる。この方法では、複数の遺伝子が挿入される挿入部位に隣接するプラスミド配列が、遺伝子組換えを媒介するために、アライグマポックスウィルスゲノムに存在する配列と十分な相同性を有する配列を含む。隣接配列は、ヘマグルチニン遺伝子座またはチミジンキナーゼ遺伝子座、またはセリンプロテアーゼインヒビター遺伝子座等、アライグマポックスウィルスの成長および増殖に必須でないアライグマポックスウィルスの領域に相同でなければならない。一つのプロモータを用いて、再結合される二つの外来性遺伝子の発現を誘導しうるが、各プロモータが個別の遺伝子に作動可能に連結された、挿入ベクターにおける二つのプロモータの使用も、効率的な発現を提供する。
【００９６】
一般に、ウィルスｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳは、ｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークアプローチにより、例えば五つの主要なステップにしたがって構築されうる：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２（Ｉｏｗａ）およびＯｌｏｔ／９１（Ｓｐａｎｉｓｈ分離株）株のＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７またはＯＲＦ３を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬへクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ７（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）またはプラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ３（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびｒＲＣＮＶ―ＦｅＬＶ；（４）限界希釈およびｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークアプローチによるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｂｔｗの分子キャラクタリゼーションを決定。あるいは、ｗｈｉｔｅ―ｔｏ―ｂｌｕｅプラークアプローチを用い、以下の五つの主要なステップが実行されうる：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵＩ２およびＯｌｏｔ／９１株のＯＲＦ５およびＯＲＦ６、ＦｅＬＶ Ｐ２７を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬへクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＦｅＬＶ Ｐ２７（Ｐ１１）―ＰＲＲＳ ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）またはｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５／／ＬａｃＺ（Ｐ７．５）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびＲＣＮＶ；（４）限界希釈およびＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡまたはＬａｃＺによるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｗｔｂの分子キャラクタリゼーションを決定。
【００９７】
本発明のｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ―ＰＣＶは、以下の五つの主要なステップにより構築されうる：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２およびＯｌｏｔ／９１株のＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ３およびＰＣＶ２ ＯＲＦ２（カプシド遺伝子）を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬへクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ３（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）―ＰＣＶ２ ＯＲＦ２（Ｐ１１またはＰＳＥＬ）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびＲＣＮＶ；（４）限界希釈およびＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡ（スクリーニングマーカとして）によるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｐｃｖの分子キャラクタリゼーションを決定。あるいは、ｗｈｉｔｅ―ｔｏ―ｂｌｕｅプラークアプローチを用い、以下の四つの主要なステップが実行されうる：（１）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２をプラスミドｐＦＤ２００１ＴＫへまたはｐＦＤ２００６ＴＫへクローニングして、プラスミドｐＦＤ２００１ＴＫ ＰＣＶ ＯＲＦ２を生成；（２）スリーウェイの感染／トランスフェクションにより、クローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ１のプラスミドおよびｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ ＯＲＦ３（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）；（３）限界希釈およびＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡまたはＬａｃＺによるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ／／ＰＣＶの分子キャラクタリゼーションを決定。
【実施例】
【００９８】
以下の実施例は、本発明のある態様を示す。しかし、これらの実施例は例示を目的とするにとどまり、本発明の条件および範囲について完全に限定するものではないと理解されなければならない。当然のことながら、典型的な反応条件（例えば温度、反応時間等）が与えられている場合には、一般にあまり好都合ではないものの、指定の範囲を上回る条件および下回る条件の両方が使用されてもよい。実施例は、室温（約２３℃〜約２８℃）で、大気圧で行われる。本明細書に引用される全ての部分およびパーセントは重量に基づき、全ての温度は、別段の明示がない限り摂氏で表される。
【００９９】
（実施例１）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳの構築（ＢＬＵＥ―ＴＯ―ＷＨＩＴＥプラークアプローチ）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｂｔｗが、以下の五つの主要なステップにより構築された：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２（Ｉｏｗａ）およびＯｌｏｔ／９１（Ｓｐａｎｉｓｈ分離株）株のＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７またはＯＲＦ３を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬにクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ７またはＯＲＦ３（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびｒＲＣＮＶ―ＦｅＬＶ；（４）限界希釈およびｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークアプローチによるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｂｔｗの分子キャラクタリゼーションを決定。
【０１００】
ｂｌｕｅ―ｔｏ―ｗｈｉｔｅプラークスクリーニングアプローチは、ＦｅＬＶ Ｐ２７＋表現型（ＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡで青色）をもつ親ウィルスｒＲＣＮＶ―ＦｅＬＶを使用する。ｒＲＣＮＶ―ＦｅＬＶおよびｐＦＤ２００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ７―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）―ＯＲＦ６―ＯＲＦ５の間のＲＣＮＶ ＨＡ隣接配列の相同的組み換えにより、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦがｈａ遺伝子座で挿入されて親株におけるＦｅＬＶ ｇａｇ―ｅｎｖ ｇｐ８５の配列（ｒＲＣＮＶ―ＦｅＬＶ青色プラーク）に置き換えられるために、組換えｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳの表現型が、青色から白色プラークに変化する。
【０１０１】
（実施例２）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳの構築（ＷＨＩＴＥ―ＴＯ―ＢＬＵＥプラークアプローチ）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｗｔｂが、以下の五つの主要なステップにより構築された：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵＩ２およびＯｌｏｔ／９１株のＯＲＦ５およびＯＲＦ６、ＦｅＬＶ Ｐ２７を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬにクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＦｅＬＶ Ｐ２７（Ｐ１１）―ＰＲＲＳ ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびＲＣＮＶ；（４）限界希釈およびＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡまたはＬａｃＺによるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｗｔｂの分子キャラクタリゼーションを決定。
【０１０２】
ｗｈｉｔｅ―ｔｏ―ｂｌｕｅプラークスクリーニングアプローチは、ＦｅＬＶ Ｐ２７＋またはＬａｃＺ表現型（ＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡにおいて青色またはＬａｃＺ＋表現型）をもつ組換えウィルスｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｗｔｂを使用し、野生型ＲＣＮＶは、ＦｅＬＶ Ｐ２７ ＥＬＩＳＡまたはＬａｃＺ染色において白色を示す。
【０１０３】
（実施例３）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ―ＰＣＶの構築
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｐｃｖは、以下の五つの主要なステップにより構築される：（１）ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２およびＯｌｏｔ／９１株のＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ３およびＰＣＶ２ ＯＲＦ２（カプシド遺伝子）を、プラスミドｐＦＤ２０００Ａおよび／またはｐＦＤ２００３ＳＥＬへクローニング；（２）プラスミドｐＦＤ２０００Ａ ＰＲＲＳ ＯＲＦ３（Ｐ１１）―ＯＲＦ５（Ｏｌｏｔ）（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ６（ＰＳＥＬ）―ＯＲＦ５（ＰＳＥＬ）―ＰＣＶ２ ＯＲＦ２（Ｐ１１またはＰＳＥＬ）を構築；（３）スリーウェイの感染／トランスフェクションによりクローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ２のプラスミドおよびＲＣＮＶ；（４）限界希釈およびＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡ（スクリーニングマーカとして）によるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｐｃｖの分子キャラクタリゼーションを決定。
【０１０４】
ＰＣＶ２アプローチは、ＰＣＶ―２カプシドＥＬＩＳＡを、クローンのスクリーニングのため、および一つのウィルスコンストラクトにおいてｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ／ＰＣＶの新規の組合せワクチンを作製するための、ユニークなマーカとして使用する。
【０１０５】
あるいは、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｐｃｖは、以下の四つの主要なステップにより構築される：（１）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２（カプシド遺伝子）をプラスミドｐＦＤ２００１ＴＫまたはｐＦＤ２００６ＴＫへクローニングして、プラスミドｐＦＤ２００１ＴＫ ＰＣＶ２ ＯＲＦ２（Ｐ１１またはＰＳＥＬ）を生成；（２）スリーウェイの感染／トランスフェクションにより、クローンプールを作製：ＣＯＳ７細胞、ステップ１のプラスミドおよびｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ；（３）限界希釈およびＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡ（スクリーニングマーカとして）によるクローンスクリーニング；および（５）ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳ／／ＰＣＶの分子キャラクタリゼーションを決定。
【０１０６】
（実施例４）
ブタにおけるｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳワクチン候補の効力研究
上述のコンストラクト（ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｂｔｗ、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｗｔｂおよびｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳｐｃｖ）が、免疫増強アジュバントを伴って、または伴わずに調製され、ブタにおけるワクチン効力が評価される。曝露研究の成功結果が、ブタにおける組換えＰＲＲＳ、ＰＣＶまたは組み合わせワクチンの効力を示す。
【０１０７】
（実施例５）
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶの構築
簡潔にいうと、ブタ生殖器呼吸器症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）ＩＳＵ１２（ＵＳ株）のエンベロープ糖タンパク質（ｏｒｆ５）遺伝子および基質タンパク質（ｏｒｆ６）遺伝子、およびＰＲＲＳＶ Ｏｌｏｔ９１（ＥＵ株）のエンベロープ糖タンパク質（ｏｒｆ５）遺伝子の、ＲＣＮＶゲノム、非病原性Ｈｅｒｍａｎ株の血球凝集（ｈａ）遺伝子座への挿入により、ウィルスｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶが構築された。
【０１０８】
ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶの構築プロセスは、二つの主なステップにより提供された。第一に、ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２株のＰＣＲ増幅された６０３ｂｐ ｏｒｆ５および５２５ｂｐ ｏｒｆ６と、ＰＲＲＳＶ Ｏｌｏｔ９１株の６０６ｂｐ ｏｒｆ５が、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬベクター（プロモータＰ１１の制御下のｌａｃＺリポーター遺伝子を含む）にサブクローニングされて、プラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＰＲＲＳＶ Ｏｌｏｔ９１ ｏｒｆ５―（ＳＥＬ）―ＩＳＵ１２ ｏｒｆ６（ＳＥＬ）―ＩＳＵ１２ ｏｒｆ５（ＳＥＬ）が生成された。ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２ ｏｒｆ５およびｏｒｆ６と、ＰＲＲＳＶ Ｏｌｏ９１ ｏｒｆ５遺伝子の両方が、プロモータＰＳＥＬの制御下で同時発現される。第二に、ＣＯＳ―７細胞におけるｒＲＣＮＶ―ＦＣＶ（２２８０―ＤＤ１）およびプラスミドｐＦＤ２００３ＳＥＬ―ＰＲＲＳＶ Ｏｌｏｔ９１ ｏｒｆ５―（ＳＥＬ）―ＩＳＵ１２ ｏｒｆ６（ＳＥＬ）―ＩＳＵ１２ ｏｒｆ５（ＳＥＬ）のスリーウェイの共感染／トランスフェクションが行われて、ｈａ遺伝子座での対立遺伝子交換によりｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶが生成された。青色プラーク（Ｌａｃ＋）が、ベロ細胞におけるプラーク精製の五つの連続ラウンドによりクローニングされた。クローン候補は、０．０５％ラクトアルブミン水解物（ＬＡＨ）、３０μｇ／ｍＬ硫酸ゲンタマイシンおよび５％ウシ胎児血清を補充したＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）を使用して、ベロ細胞においてさらに二回拡張され、その後、遺伝子特異的ＰＣＲにより確認された。七代継代を用いて、プレマスターシードが調製された。マスターシードが、プレマスターシードの１：２０，０００希釈により確立され、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶと指定され、これにおいて、生ベクターとしてのアライグマポックスウィルスが、ｈａ遺伝子座でそれぞれＰＲＲＳＶ ＩＳＵ１２およびＯｌｏｔ９１株のＰＲＲＳＶエンベロープ糖タンパク質（ｏｒｆ５）および基質タンパク質（Ｍ）を発現できる。ＰＲＲＳＶワクチンのマスターシードウィルス、生アライグマポックスウィルスベクター（ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶ）は、ＰＲＲＳＶ ｏｒｆ５またはｏｒｆ６遺伝子（単数または複数）―特異的ＰＣＲ法により同定された。ブタ生殖器呼吸器症候群ウィルスワクチン、単独またはＳｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ ＤｏｓｅおよびまたはＳｕｖａｘｙｎ ＭＨ―ｏｎｅと組み合わせた生／不活性化アライグマポックスウィルスベクター、または生キメラｃＰＣＶ１―２およびまたは改変生Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｅｎｕｍｏｎｉａｅ（例えばＪ株）の免疫原性研究が、子ブタおよび成熟雌ブタにおいて行われている。
【０１０９】
（実施例６）
子ブタにおける、単独またはＳｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ Ｄｏｓｅと組み合わせたブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスワクチン、生アライグマポックスウィルスベクターの免疫原性研究
ＰＲＲＳＶ画分の効力を示すために、ブタに、ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶワクチン（凍結乾燥ケーキ）およびアジュバントを含む滅菌水またはＳｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ Ｄｏｓｅを希釈剤としたものが、２〜３週間隔の二用量レジメンにおいて投与された後、第二ワクチン接種の２〜３週後に毒性ＰＲＲＳＶ曝露またはＰＲＲＳＶ／ＰＣＶ２同時曝露が行われる。ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶ画分の効力が、ＰＲＲＳＶウィルス血症の減少およびＰＲＲＳＶにより引き起こされる肺損傷の減少に基づいて評価される。Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＣＶ２ Ｏｎｅは、ＦＤＡＨの専売アジュバントで調製された不活性化Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ１―Ｔｙｐｅ２ Ｃｈｉｍｅｒａ（ｃＰＣＶ１―２）を含む。
【０１１０】
材料および方法
試験動物
少なくとも４０匹の（予防接種２０匹およびコントロール２０匹）、生後３週目以上の通常の混血雄および雌ブタが、この研究に使用される。研究用のブタは、商業農場から購入され、耳札を使用して識別される。ブタは、単一のソース群から得られる。第一ワクチン接種時に、ブタは、ＩＤＥＸＸ ＨｅｒｄＣｈｅｃｋ ＥＬＩＳＡキット（Ｓ／Ｐ比＜０．４）による決定により、ＰＲＲＳＶに対して血清陰性である。
【０１１１】
テストワクチン
テストワクチンの組成
凍結乾燥画分：ワクチンは、生ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶからなる。ワクチンのウィルス力価は、研究において投与される用量を確立するために、五つの反復アッセイにおいて滴定される。液体画分：希釈剤は、Ｓｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ Ｄｏｓｅまたは２０％ＳＬ―ＣＤアジュバントである。ｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶの凍結乾燥画分が、ワクチン接種時に液体画分により再水和される。
【０１１２】
研究デザイン
提唱される研究は、ランダム化完全ブロックデザイン（優越性試験）である。同腹子が、各研究組に配分される。そして、各研究における同腹子中の子ブタが、以下のように二つの群に分割される：
【０１１３】
【表１】
ワクチン接種
ワクチン接種経路は、頸部右側の筋注である。
【０１１４】
研究１のブタ：群Ｖ１は、２．０ｍＬ用量のｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶ＋Ｓｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ Ｄｏｓｅが二度与えられ；コントロール群Ｃ１のブタは、２．０ｍＬ用量のＳｕｖａｘｙｎ ＰＣＶ２ Ｏｎｅ Ｄｏｓｅが二度与えられる。
【０１１５】
研究２のブタ：群Ｖ２は、２．０ｍＬ用量のｒＲＣＮＶ―ＰＲＲＳＶ＋水／ＳＬ―ＣＤが二度与えられ；コントロール群Ｃ２のブタは、２．０ｍＬ用量の水―ＳＬ―ＣＤアジュバントが二度与えられる。
【０１１６】
一回目のワクチン接種が、生後３週間目で行われ、反復ワクチン接種が２〜３週後に行われる。
【０１１７】
曝露
全ての動物が、二回目のワクチン接種の二〜三週後に毒性曝露される。
【０１１８】
群Ｖ１およびＣ１のブタは、少なくとも２×１０４．８ＦＡＩＤ５０の野生型病原性ＰＣＶ２（株４０８９５）、および少なくとも２×１０４．０ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳＶ（ＩＳＵ―１２または等価物）に曝露される。これら二つの曝露材料は、曝露の前に少なくとも３０分間混合される。曝露用量は、鼻腔内４ｍＬである（鼻孔あたり２ｍＬ）。
【０１１９】
群Ｖ２およびＣ２のブタは、少なくとも２×１０４．０ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳＶ（ＩＳＵ―１２または等価物）に曝露される。曝露用量は、鼻腔内２ｍＬである（鼻孔あたり１ｍＬ）。添付２の曝露記録を参照。
【０１２０】
曝露ウィルスは、曝露の日に、ＰＣＶ２特異的およびＰＲＲＳＶ特異的間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により滴定される。
【０１２１】
観察
全てのブタは、曝露後（ＤＰＣ）−２から１０日まで毎日臨床徴候および温度が観察される。任意の異常観察は、研究ディレクターまたはプラント獣医師に報告される。
【０１２２】
モニタされる臨床徴候には、食欲不振、嗜眠、抑うつ、下痢、くしゃみ、咳、鼻汁、眼漏、呼吸困難および死亡が含まれるがこれに限定されない。任意のブタが曝露後観察期間中に死亡した場合には、剖検が行われ、最終的報告に剖検報告が付される。
【０１２３】
試料収集およびテスト
試料収集
鼻スワブ
鼻スワブが、ワクチン接種一の後（ＤＰＶ１）０日目に集められ、ＰＲＲＳＶおよびＰＣＶ２が単離されて、ワクチン接種前にテスト動物にＰＲＲＳＶまたはＰＣＶ２感染がないことが確認される。
【０１２４】
鼻腔スワブ試料は、３ｍＬのＭＥＭとラクトアルブミン水解物（ＬＡＨ）およびゲンタマイシン（６０μｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含む個別の滅菌チューブに配置され、テストされるまで−５０℃より低温で貯蔵される。
【０１２５】
血清試料
ブタは、ＥＬＩＳＡテストでは、０ＤＰＶ１、０ＤＰＶ２、７ＤＰＶ２、１４ＤＰＶ２、−１、６、および９日目に；ＰＣＲ法では−１、３、６、および９日目に、血清試料（１０ｍＬ以下）のために採血される。
【０１２６】
剖検
全ての動物が、ＤＰＣ１０〜１１日目で剖検される。肺損傷採点のために肺が集められる。
【０１２７】
試料テスト
酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＰＲＲＳＶに対する血清抗体が、ＩＤＥＸＸ（登録商標）ＨｅｒｄＣｈｅｃｋ ＥＬＩＳＡキット（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）により検出される。簡潔にいうと、血清試料が、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ中に１：４０に希釈され、各試料１００μＬが、抗原コートされた９６穴プレートにデュプリケートで加えられる（一つのウェルはＰＲＲＳＶ抗原用、一つのウェルは正常宿主細胞（ＮＨＣ）抗原用）。室温での３０分のインキュベーション時間後、液体がデカントされ、約３００μＬのリン酸緩衝洗浄溶液で、プレートが３〜５回洗浄される。そして、１００μＬの抗―ブタ―ＨＲＰＯ結合体が全てのウェルに加えられる。プレートが、室温で３０分間インキュベートされる。インキュベーション時間後、プレートは、再び上記のように洗浄される。そして、１００μＬのＴＭＢ基質溶液が、各ウェルに加えられる。プレートが１５分間室温でインキュベートされた後、１００μＬのストップ溶液が全てのウェルに加えられて反応が止められる。そして、光学濃度（ＯＤ）が、マイクロプレートリーダーにより６５０ｎｍで測定される。任意の血清力価が、試料／陽性（Ｓ／Ｐ）比として報告され、試料ＯＤ―ＰＲＲＳＶマイナス試料ＯＤ―ＮＨＣの量を平均陽性コントロール―ＰＲＲＳＶマイナス平均陽性コントロール―ＮＨＣの量で割ることにより、決定される。
【０１２８】
ＰＣＲ法
ＰＲＲＳＶ特異的ＲＴ―ＰＣＲテストを用いて、血清中のＰＲＲＳＶの存在が検出される。ＲＮＡ―抽出が、ＱｌＡａｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、血清試料に実行される。
【０１２９】
肺損傷採点
個々のブタの肺が、損傷により影響される肺実質の量に基づく肉眼による総損傷につき、二人の独立したスコアラにより検査される。損傷のスコアラは、各ブタへの治療の内容に対して遮蔽される。簡潔にいうと、ＰＲＲＳＶのような損傷（色および構造に基づいて）が見られる肺葉の割合を推定することにより、各肺葉における肺損傷のスコアが決定され、その肺葉に可能なポイント数と掛け合わせられる。各肺葉の最大スコアが、肺葉が占める全肺容量の相対的割合により決定される。そして、全ての肺葉の背面および腹側面からのスコアが足し合わされて、各ブタの合計スコアが得られる。各動物の可能な最大合計スコアは、１００である。
【０１３０】
一時的結果
肺損傷の減少を主張するために、肺に存在する損傷の合計スコアが評価される。
【０１３１】
二時的結果
二次的結果は、ＰＲＲＳＶウィルス血症の発生である。
【０１３２】
統計的分析
推定量
肺損傷の重症度減少の評価では、推定量は、緩和画分（ＭＦ）統計量である。緩和画分は、以下のように計算される：
【０１３３】
【化１】
式中、
Ｗ１＝ウィルコクソン順位和統計量
ｎｃ＝コントロール群における対象数
ｎｖ＝各ワクチン接種群における対象数
である。
＊注：各研究組につきＭＦ統計量が推定される。
【０１３４】
区間推定を計算する方法の説明
各研究組の緩和画分の９５％信頼区間が、計算される。
【０１３５】
仮説
肺損傷の重症度減少の主張のため：
ＨＯ：Ｍｖ＝Ｍｃ
ＨＡ：Ｍｖ≠Ｍｃ
Ｍｖ＝ワクチン接種群における肺損傷スコアランクの中央値
Ｍｃ＝コントロール群における肺損傷スコアランクの中央値
これらの研究は、各研究組において、ワクチン接種群とプラセボコントロール群との間で肺損傷の重症度（ランク）に差がないという帰無仮説をテストする。
【０１３６】
他の統計的考慮事項
ブタ同腹子の分布は、同腹子間で無作為に割付けされる。
【０１３７】
統計的分析
統計的方法
一次的結果
動物中のスコアのテスト再現性が、クラス内相関により評価される。テスト再現性が十分であると考えられる場合には、各ブタの平均肺スコアが、各スコアラからの肺スコアを平均することにより計算される。計算された肺スコアは、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｒａｎｋ Ｓｕｍにより、計算された肺スコアを独立変数とし、含まれる治療を従属変数として、研究組ごとに二つの投与群の間で比較される。十分完全なブロックがある場合には、分析が同腹子ごとに階層化される。ＨＬシフトが推定される。ＭＦが、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ統計から推定される。
【０１３８】
二次的結果
二次的結果は、ウィルス血症の発生につき評価される。単一のウィルス血症の発生により、ブタがウィルス血症陽性に分類される（ＹｅｓまたはＮｏ）。ウィルス血症は、一般化線型混合モデルにおいて、ウィルス血症の発生（ＹｅｓまたはＮｏ）を二項独立変数とし、含まれる治療を従属変数として、投与群間で比較される。十分完全なブロックがある場合には、同腹子はモデルにおいてランダム効果共変量として含まれる。
【０１３９】
全ての統計的分析は、ＳＡＳシステム（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）を用いて実行される。有意水準は、ｐ＜０．０５に設定される。
【０１４０】
以上において、本発明の特定の実施形態の詳細な記載が、制限ではなく例示の目的で提供された。本開示に基づいて当業者に明らかな他の全ての変形、派生物および等価物が、請求される本発明の範囲内に含まれるものと理解されねばならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）タンパク質をコードする一つ以上の外来性核酸分子を含む、組換えアライグマポックスウィルスベクター（ｒＲＣＰＶ）であって、
（ａ）少なくとも一つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座またはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され；または、
（ｂ）少なくとも二つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座またはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され；または、
（ｃ）少なくとも一つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座に挿入され、少なくとも一つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入される、
組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項２】
少なくとも二つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座に挿入され、少なくとも二つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入される、請求項１に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項３】
前記アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼおよびヘマグルチニン遺伝子座に加えて、前記アライグマポックスウィルスゲノムの第三の非必須部位に挿入されるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、請求項１または２に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項４】
前記アライグマポックスウィルスゲノムの第三の非必須部位が、セリンプロテアーゼインヒビター部位である、請求項３に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項５】
前記ポックスウィルスベクターが、同じブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスタンパク質の少なくとも二つのコピーをコードする、請求項１〜４のいずれかに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項６】
前記同じタンパク質の前記二つのコピーが、二つの異なる核酸分子によりコードされる、請求項５に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項７】
前記同じタンパク質の前記二つのコピーが、同じ核酸分子によりコードされる、請求項５に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項８】
前記同じタンパク質の前記二つのコピーが、一つのプロモータに作動可能に連結される、請求項７に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項９】
前記同じタンパク質の前記二つのコピーが、別々のプロモータに作動可能に連結される、請求項６または７のいずれかに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１０】
前記同じタンパク質の前記二つのコピーが、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７およびその組み合わせからなる群より選択される、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる、請求項６、７、８または９のいずれかに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１１】
前記外来性核酸分子の各々が、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦをコードする、請求項１または２のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１２】
前記ＯＲＦは、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７およびその組み合わせからなる群より選択される一つ以上である、請求項１１に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１３】
前記二つ以上の外来性核酸分子が、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、およびＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７からなる群より選択される二つ以上のＰＲＲＳＶ ＯＲＦをコードする、請求項２に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１４】
前記ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスが、ＩＳＵ１２（Ｉｏｗａ）、Ｏｌｏｔ／９１（Ｓｐａｎｉｓｈ）または両者である、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１５】
二つ以上の核分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座に挿入される、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１６】
ブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ２）のオープンリーディングフレームをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１５に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１７】
前記ＰＣＶ２オープンリーディングフレームが、ＯＲＦ２である、請求項１６に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１８】
前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に、別々に挿入される、請求項１７に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１９】
ネコ白血病ウィルスＰ２７＋表現型の糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項２０】
前記アライグマポックスウィルスが、生存しており、かつ複製可能である、請求項１〜１９のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項２１】
免疫学的に有効な量の、請求項１〜２０のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターと、必要に応じて適切な担体、希釈剤またはアジュバントとを含む、組換えブタワクチン。
【請求項２２】
免疫学的に有効な量の、二つ以上の請求項１〜２０のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターと、必要に応じて適切な担体または希釈剤とを含む、組換えブタワクチン。
【請求項２３】
前記アライグマポックスウィルスが、生存しており、かつ複製可能である、請求項２１または２２のいずれか一つに記載の組換えブタワクチン。
【請求項２４】
少なくとも一つの追加的なブタ抗原をさらに含む、請求項２１または２２に記載の組換えブタワクチン。
【請求項２５】
前記追加的なブタ抗原が、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ抗原、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｍ ｓｕｉｓ抗原、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ抗原、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ抗原、レプトスピラ菌抗原、ブタインフルエンザウィルス抗原、ブタパルボウィルス抗原、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ抗原、ブタ呼吸器コロナウィルス抗原、ロタウィルス抗原、Ａｕｊｅｓｋｙ病、ブタ伝染性胃腸炎抗原の原因となる病原体由来の抗原およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項２４に記載の組換えブタワクチン。
【請求項２６】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的に有効な量の、請求項２１〜２５のいずれか一つに記載の組換えブタワクチンを、ブタ動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２７】
前記組換えブタワクチンが、生存しており、かつ複製可能な組換えアライグマポックスウィルスベクターを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群および離乳後多臓器性発育不良症候群を防止する方法であって、免疫学的に有効な量の、請求項１６〜１９のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターと、必要に応じて、適切な担体、希釈剤またはアジュバントとを含む、組換えブタワクチンを、保護を必要とするブタ動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２９】
前記組換えアライグマポックスウィルスベクターが、生存しており、かつ複製可能である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ワクチンの前記免疫学的に有効な量が、約４．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜約７．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ワクチンが、単回用量または反復用量として投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記ワクチンが、アジュバントを含まない、請求項２１〜２５のいずれかに記載の組換えブタワクチン。
【請求項１】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）タンパク質をコードする一つ以上の外来性核酸分子を含む、組換えアライグマポックスウィルスベクター（ｒＲＣＰＶ）であって、
（ａ）少なくとも一つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座またはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され；または、
（ｂ）少なくとも二つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座またはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され；または、
（ｃ）少なくとも一つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座に挿入され、少なくとも一つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入される、
組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項２】
少なくとも二つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座に挿入され、少なくとも二つの核酸分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入される、請求項１に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項３】
前記アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼおよびヘマグルチニン遺伝子座に加えて、前記アライグマポックスウィルスゲノムの第三の非必須部位に挿入されるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、請求項１または２に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項４】
前記アライグマポックスウィルスゲノムの第三の非必須部位が、セリンプロテアーゼインヒビター部位である、請求項３に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項５】
前記ポックスウィルスベクターが、同じブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスタンパク質の少なくとも二つのコピーをコードする、請求項１〜４のいずれかに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項６】
前記同じタンパク質の前記二つのコピーが、二つの異なる核酸分子によりコードされる、請求項５に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項７】
前記同じタンパク質の前記二つのコピーが、同じ核酸分子によりコードされる、請求項５に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項８】
前記同じタンパク質の前記二つのコピーが、一つのプロモータに作動可能に連結される、請求項７に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項９】
前記同じタンパク質の前記二つのコピーが、別々のプロモータに作動可能に連結される、請求項６または７のいずれかに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１０】
前記同じタンパク質の前記二つのコピーが、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７およびその組み合わせからなる群より選択される、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる、請求項６、７、８または９のいずれかに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１１】
前記外来性核酸分子の各々が、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦをコードする、請求項１または２のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１２】
前記ＯＲＦは、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７およびその組み合わせからなる群より選択される一つ以上である、請求項１１に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１３】
前記二つ以上の外来性核酸分子が、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ７、ＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７、およびＯＲＦ３―ＯＲＦ４―ＯＲＦ５―ＯＲＦ６―ＯＲＦ７からなる群より選択される二つ以上のＰＲＲＳＶ ＯＲＦをコードする、請求項２に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１４】
前記ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスが、ＩＳＵ１２（Ｉｏｗａ）、Ｏｌｏｔ／９１（Ｓｐａｎｉｓｈ）または両者である、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１５】
二つ以上の核分子が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのヘマグルチニン遺伝子座に挿入される、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１６】
ブタサーコウィルス２型（ＰＣＶ２）のオープンリーディングフレームをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１５に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１７】
前記ＰＣＶ２オープンリーディングフレームが、ＯＲＦ２である、請求項１６に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１８】
前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２が、前記アライグマポックスウィルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に、別々に挿入される、請求項１７に記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項１９】
ネコ白血病ウィルスＰ２７＋表現型の糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項２０】
前記アライグマポックスウィルスが、生存しており、かつ複製可能である、請求項１〜１９のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクター。
【請求項２１】
免疫学的に有効な量の、請求項１〜２０のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターと、必要に応じて適切な担体、希釈剤またはアジュバントとを含む、組換えブタワクチン。
【請求項２２】
免疫学的に有効な量の、二つ以上の請求項１〜２０のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターと、必要に応じて適切な担体または希釈剤とを含む、組換えブタワクチン。
【請求項２３】
前記アライグマポックスウィルスが、生存しており、かつ複製可能である、請求項２１または２２のいずれか一つに記載の組換えブタワクチン。
【請求項２４】
少なくとも一つの追加的なブタ抗原をさらに含む、請求項２１または２２に記載の組換えブタワクチン。
【請求項２５】
前記追加的なブタ抗原が、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ抗原、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｍ ｓｕｉｓ抗原、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ抗原、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ抗原、レプトスピラ菌抗原、ブタインフルエンザウィルス抗原、ブタパルボウィルス抗原、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ抗原、ブタ呼吸器コロナウィルス抗原、ロタウィルス抗原、Ａｕｊｅｓｋｙ病、ブタ伝染性胃腸炎抗原の原因となる病原体由来の抗原およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項２４に記載の組換えブタワクチン。
【請求項２６】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的に有効な量の、請求項２１〜２５のいずれか一つに記載の組換えブタワクチンを、ブタ動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２７】
前記組換えブタワクチンが、生存しており、かつ複製可能な組換えアライグマポックスウィルスベクターを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群および離乳後多臓器性発育不良症候群を防止する方法であって、免疫学的に有効な量の、請求項１６〜１９のいずれか一つに記載の組換えアライグマポックスウィルスベクターと、必要に応じて、適切な担体、希釈剤またはアジュバントとを含む、組換えブタワクチンを、保護を必要とするブタ動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項２９】
前記組換えアライグマポックスウィルスベクターが、生存しており、かつ複製可能である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ワクチンの前記免疫学的に有効な量が、約４．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜約７．５Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ワクチンが、単回用量または反復用量として投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記ワクチンが、アジュバントを含まない、請求項２１〜２５のいずれかに記載の組換えブタワクチン。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１０−５２８６０４（Ｐ２０１０−５２８６０４Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０３１７（Ｐ２０１０−５１０３１７）
【出願日】平成２０年５月２８日（２００８．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２９１３０
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（３０９０４０７０１）ワイス・エルエルシー (181)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２８日（２００８．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２９１３０
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（３０９０４０７０１）ワイス・エルエルシー (181)
【Ｆターム（参考）】
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