ブタクサ（アンブロシアアルテミシーフォリア）の主要アレルゲンから得られるペプチドおよびこれらの使用
本発明は、ブタクサ花粉アレルゲンＡｍｂ ａ １から由来する６〜５０アミノ酸残基のペプチド、上記ペプチドを含む薬学的調製物、およびこれらの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Ａｍｂ ａ １由来ペプチドに関する。
【０００２】
ブタクサ（アンブロシア アルテミシーフォリア）およびヨモギ（アルテミシア ブルガリス）は、アステラカエア科またはコンポジタエ科の植物に属する、重要なアレルゲン性の草本である。ヨモギの花粉は、ヨーロッパにおいて晩夏および秋におけるアレルギー反応の主原因の１つであり、かつ花粉症にかかっている患者の約１０〜１４％に影響を与える。ブタクサ花粉は、アトピー性２７．１０の個体において約５０％の普及率を有して、米国におけるアレルゲン性タンパク質の主要な発生源である。ヨーロッパにおいて、現在、ブタクサアレルギーは、フランス、イタリア、オーストリア、ハンガリー、クロアチア、およびブルガリアにおけるある特定の地域において、急速に増加している。ブタクサの主要なアレルゲンであるＡｍｂ ａ １およびヨモギの主要なアレルゲンであるＡｒｔ ｖ １のそれぞれは、無関係なタンパク質である。Ａｍｂ ａ １は、３８ｋＤａの非糖修飾の酸性タンパク質である。天然のＡｍｂ ａ １は、精製中にタンパク質分解を受け、かつα鎖およびβ鎖と命名された２つの鎖に切断される。２６ｋＤａのα鎖は、１２ｋＤａのβ鎖と非供給結合的に会合することが報告されている（King et al. Immunochem 11:83-92, 1974）。Ａｍｂ ａ １の２本鎖の形態は、全長の分子とは免疫学的に識別不能と思われる（King et al. Arch Biochem Biophys 212:127-135, 1981）。
【０００３】
ブタクサから得られる天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １）は、最初に説明されかつ単離されたアレルゲンであった（King et al. Biochem 3:458-468, 1964）。Ａｍｂ ａ １をコードするｃＤＮＡは、Rafnar et alによって１９９１年にブタクサ花粉から単離された（J. Biol. Chem. 266:1229-1236）。しかしこれまでのところ、正しくフォールディングされかつ活性な組み換えＡｍｂ ａ １（ｒＡｍｂ ａ １）を大量に発現し、かつ精製する方法は、報告されていない。
【０００４】
国際公開第９６／１３５８９号は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを備える、Ａｍｂ ａ １から得られた単離されたペプチドに関する。
【０００５】
国際公開第９０／１１２９３号には、Ａｍｂ ａ １のアミノ酸配列が記載されている。また、これらにおいて、Ａｍｂ ａ １のペプチドが、Ｔ細胞エピトープを備え、かつアンブロシア特異的な免疫応答を誘発し得ることについて、確認されている。
【０００６】
国際公開第９９／３４８２６号は、アレルゲンから得られたペプチドを投与することによって、患者を脱感作する方法および手段に関する。当該ペプチドは、個体におけるＴ細胞応答を誘発可能である。
【０００７】
Michael J.G. et al（J.Br.Soc.Aller.Clin.Immunol. 20(6)(1990):669-674）において、Ａｍｂ ａ １のプロテアーゼ消化によって得られるペプチドのＴ細胞応答が調べられている。
【０００８】
Cardinale E.J. et al（J.Aller.Clin.Immunol. 107(2001):p 19）は、アレルゲンの同定および性質決定にとってのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の使用に関する。
【０００９】
同様に、米国特許第６，３３，５０１９号は、個体におけるＡｍｂ ａ １に対するＴ細胞応答を誘発し得るＡｍｂ ａ １に関する。
【００１０】
Griffith et al.（Int.Arch.Aller.Appl.Immunol. 96(1991):296-304）は、Ａｍｂ ａ １およびＡｍｂ ａ ２ファミリーの一員の配列多形に関する。
【００１１】
本発明の目的は、アレルギー（特にブタクサ花粉アレルゲンによって引き起こされるアレルギー）の処置、予防または診断に使用され得る、ブタクサ花粉アレルゲンＡｍｂ ａ １から得られるペプチドおよび分子を提供することである。
【００１２】
したがって、本発明は、Ａｍｂ ａ １、特に配列番号１２、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９およびこれらの機能的な等価物からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＡｍｂ ａ １から得られるペプチドに関する。
【００１３】
配列番号１２、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する本発明のペプチドが、アレルギー性の個体から単離されたＴ細胞と反応性を示すこと、したがってワクチン（特にブタクサ花粉アレルゲンによって引き起こされるアレルギーおよびブタクサ花粉アレルゲンと交差反応するアレルギーにとってのワクチン）の製造に使用され得ることが明らかになった。特に、配列番号５２、配列番号６８、配列番号８６、配列番号９１および配列番号１２６〜配列番号１３９を有するペプチドは、ブタクサ花粉アレルギーにかかっている個体から得られたサンプルと高いＴ細胞反応性を示す。
【００１４】
本発明のペプチドのさらなる利点は、それらのすべてがＩｇＥ結合活性を欠如していることである。したがって、これらのペプチドを備える分子は、個体に対して投与された場合に、アレルギー反応（例えば、ヒスタミン放出の増加）を誘発しない。
【００１５】
治療を目的としたアレルゲンから得られるペプチドは、Ａｍｂ ａ １に特異的なＩｇＥと結合しないか、または対応する未処置の精製Ａｍｂ ａ １もしくは組み替え的に生成されたＡｍｂ ａ １のβ鎖よりも、実質的に低い程度において当該ＩｇＥと結合（少なくとも１００倍だけ低い程度、より好ましくは少なくとも１０００倍だけ低い程度において結合）する。本発明のペプチドが診断試薬として使用される場合には、ペプチドまたはタンパク質が、未処置のＡｍｂ ａ １アレルゲンと比べて低下したＩｇＥ結合活性を有する必要はない。ペプチドのＩｇＥ結合活性は、例えばあらかじめＡｍｂ ａ １にさらされている個体（すなわち、アレルギーの個体）から得られる血清を用いた、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、測定され得る。簡単に説明すると、試験されるペプチドは、マイクロタイタープレートの壁を覆っている。上記壁を洗浄しかつブロッキングした後に、アレルギーの個体の血清または血漿からなる抗体溶液が、上記壁内においてインキュベートされる。当該アレルギーの個体は、試験されるペプチドまたはペプチドが由来するタンパク質にさらされている。通常、上記血漿は、インキュベーション前にＩｇＧが枯渇させられている。しかし、高い特異性を有する抗ＩｇＥ抗体が使用される場合には、枯渇は必須ではない。さらに、特定の免疫療法を受けていない個体は、いくつかの場合において、問題のアレルゲンに特異的なＩｇＧ抗体をほとんど検出不可能な状態である。標識された２次抗体が、上記壁内に加えられ、かつインキュベートされる。それから、ＩｇＥの結合量が、定量化され、かつ未処置の精製Ａｍｂ ａ １タンパク質によって結合されるＩｇＥの量と比較される。代替可能に、ペプチド結合活性は、ウエスタンブロッティング分析によって測定され得る。例えば、試験されるペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたポリアクリルアミドゲルに流される。それから、ペプチドは、ニトロセルロースに転写され、続いてアレルギー患者からの血清とインキュベートされる。それから、標識された２次抗体とのインキュベーションの後に、ＩｇＥの結合量が測定され、かつ定量化される。
【００１６】
ペプチドのＩｇＥ結合活性の測定に使用され得る他のアッセイは、競合ＥＬＩＳＡアッセイである。簡単に説明すると、ＩｇＥ抗体のプールが、ブタクサ花粉アレルギー個体から得られた血漿または血清を組み合わせることによって生成される。当該血漿または血清は、直接的ＥＬＩＳＡによって未処置のＡｍｂ ａ １とＩｇＥ反応性を有していることを示されている。このプールは、未処置のＡｍｂ ａ １に対するＩｇＥの結合を試験されるペプチドと比較するための、ＥＬＩＳＡ競合アッセイに使用される。未処置のＡｍｂ ａ １タンパク質および試験されるペプチドについてのＩｇＥ結合は、測定され、かつ定量化される。
【００１７】
さらに、本発明のペプチドは、マスト細胞または好塩基球からの媒介物質（例えば、ヒスタミン）の放出を生じないことが好ましい。ＩｇＥと結合するペプチドが媒介物質の放出を生じるか否かを測定するために、ヒスタミン放出アッセイが、標準的な試薬および手順を用いて実施され得る。簡単に説明すると、試験されるペプチドの緩衝化溶液は、アレルギー患者から得られた、等容積の完全なヘパリン添加血液と混合される。混合およびインキュベーションの後に、細胞がペレット化される。そして、上清が、例えば放出されたヒスタミンの量を測定するための放射免疫測定を用いて、処理されかつ分析される。
【００１８】
本発明の分子は、本発明のペプチドの２つ以上をあらゆる組み合わせにおいて備え得る。これらのペプチドは、互いに化学的に接合され得るか、または組み換え技術によって融合され得る。当該分子は、少なくとも２、３、４、５、７、１０、１５、２０のペプチド備え得る。
【００１９】
本発明の少なくとも１つのペプチドは、当該ペプチドをコードする配列を有する核酸を用いて形質転換された宿主細胞において、組み換えＤＮＡ技術によって、生成され得る。また、本発明の単離されたペプチドは、化学合成によって生成され得る。もちろん、タンパク質アレルゲンの化学的切断または酵素的切断によって、ペプチドを生成することも可能である。
【００２０】
ペプチドが組み換え技術によって生成される場合に、本発明の核酸（または上記ペプチド（または当該ペプチドの機能的な等価物）をコードする配列を有する核酸の等価物）を用いて形質転換された宿主細胞は、当該細胞にとって好適な培地において培養される。ペプチドは、当該技術において公知のペプチドおよびタンパク質を精製する技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から精製され得る。当該精製する技術としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動または当該ペプチドに特異的な抗体を用いた免疫精製が挙げられる。本発明の単離されたペプチドは、組み換えＤＮＡ技術によって生成された場合に、細胞由来の物質または培養培地を実質的に含んでいないか、または化学的に合成された場合に、化学的な前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含んでいないか、または化学的切断もしくは酵素的切断によって生成された場合に、他の物質もしくは試薬を含んでいない。
【００２１】
また、本発明のペプチドは、アミノ酸置換、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加によって改変され得る。したがって、本発明のペプチドは、配列番号１〜１３９のアミノ酸配列の少なくとも７アミノ酸残基を備えている。また、本発明の範囲には、１２アミノ酸残基を超えるペプチドが包含される。ここで、これらの付加的な残基は、未処置のＡｍｂ ａ １分子から取得され得、かつ未処置のＡｍｂ ａ １分子、無作為のアミノ酸または他のペプチドもしくはタンパク質において当該ペプチドと隣接して見られ得る。しかし、これらの改変されたペプチド（バリアント）は、未修飾のペプチドと類似の特性を示すか、または同一の特性さえも示す。特に、免疫原性の特性は、実質的に同一であるべきである。これは、これらの改変されたペプチドを対象にする抗体がまた、配列番号１〜１３９のアミノ酸配列を有するペプチドと結合することを意味する。
【００２２】
本発明において使用されるときに、“ペプチド”は、当該ペプチドが得られるタンパク質のアミノ酸配列の全体より少ないアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を指す。また、“ペプチド”という用語は、ペプチドの機能的な等価物もしくはバリアント、またはペプチドのあらゆる断片もしくは部分を指す。ペプチドの“機能的な等価物”は、同じかもしくは増強されたＭＨＣ結合能を有するペプチド、同じＴ細胞の亜集団を刺激可能なペプチド、Ｔ細胞応答（例えば、刺激（増殖またはサイトカイン分泌））の同じかもしくは増強された誘導能を有するペプチド、少なくとも同程度に低下したＩｇＥ結合を有するペプチド、およびＡｍｂ ａ １から直接に得られたペプチドと少なくとも同じ最小レベルのＩｇＥ合成刺激活性を誘導するペプチドを含む。最小のＩｇＥ刺激活性は、未処置の精製ブタクサ花粉アレルゲンによって誘発されるＩｇＥ産生量よりも少ない、ＩｇＥ合成刺激活性を指す。本発明のペプチドおよびこれらの機能的な等価物は、６〜５０、好ましくは７〜４５、より好ましくは８〜４０、さらに好ましくは９〜３５、特に１０〜３０のアミノ酸残基からなることが好ましい。本発明のペプチドの“機能的な等価物”は、上記ペプチドのＣ末端および／またはＮ末端において少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基をさらに備え得る。当該少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基は、連結基（例えば、システイン）として機能し得るか、または野生型Ａｍｂ ａ １において当該ペプチドと隣接して見られ得る。
【００２３】
本明細書において使用されるときに、“バリアント”という用語は、通常に関連する他のポリペプチドと１つ以上のアミノ酸残基だけ異なっている、アミノ酸配列を指す。バリアントは、“保存的な”変更を有し得る。ここで、置換されたアミノ酸は、類似の構造的特性または類似の化学的特性を有する。保存的なアミノ酸置換の１種は、類似の側鎖を有する残基が交換可能であることを指す。例えば、脂肪族の側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族−水酸基の側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族の側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性の側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；かつ硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。保存的なアミノ酸置換の好ましい群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。保存的な変更よりはまれに、バリアントは“非保存的な”変更を有し得る（例えば、トリプトファンとのグリシンの置換）。また、類似のより少ない変異としては、アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方が挙げられる。本発明のペプチドおよび分子の好ましいバリアントは、１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満の変更（置換、欠失および挿入のいずれか）を有する。
【００２４】
本発明の他の局面は、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、かつブタクサ花粉アレルゲンから得られるペプチドに関する。
【００２５】
本発明の他の局面は、本発明のペプチドの少なくとも１つ、およびＡｍｂ ａ １以外の免疫原から得られた第２のペプチドの少なくとも１つを備えるペプチドに関する。
【００２６】
本発明の分子は、Ａｍｂ ａ １に由来しない１つ以上の他の分子と、接合され得るか、化学的に結合され得るか、または融合され得る。当該分子は、例えば、本発明のブタクサ花粉アレルゲンペプチドおよび（例えば細菌起源またはウイルス起源の）上記第２の免疫原に対する免疫応答を誘導する、ワクチンとして使用され得る。
【００２７】
本発明のペプチドなどの小分子（ハプテン）に対する抗体を誘発するために、これらの小分子は、担体に結合（例えば、接合）され得る。この結合は、免疫原性のハプテンを作り出す。免疫原性は、個体に注入された後に抗体が生成されることを意味する。担体タンパク質に対するハプテンの結合は、しばしば共有結合的であるが、しかし、当該結合は、イオン性であり得るか、またはハプテンおよび担体を架橋する化学的構成要素を介してもたらされ得る。担体は典型的にタンパク質である。しかし、担体はまた、単量体または重合体の形態における糖および脂質を含有し得る。
【００２８】
本発明に係る免疫原は、好ましくはアレルゲンである。当該アレルゲンは、Ａｍｂ ａ ２、Ａｍｂ ａ ３、Ａｍｂ ａ ５、Ａｍｂ ａ ６、Ａｍｂ ａ ７、Ａｍｂ ａ ８、Ａｍｂ ａ ９、Ａｍｂ ａ １０、Ａｍｂ ｔ ５、Ａｒｔ ｖ １、Ａｒｔ ｖ ２、Ａｒｔ ｖ ３、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｒｔ ｖ ５、Ａｒｔ ｖ ６、Ｈｅｌ ａ １、Ｈｅｌ ａ ２、Ｈｅｌ ａ ３、Ｍｅｒ ａ １、Ｃｈｅ ａ １、Ｃｈｅ ａ ２、Ｃｈｅ ａ ３、Ｓａｌ ｋ １、Ｃａｔ ｒ １、Ｐｌａ ｌ １、Ｈｕｍ ｊ １、Ｐａｒ ｊ １、Ｐａｒ ｊ ２、Ｐａｒ ｊ ３、Ｐａｒ ｏ １、Ｃｙｎ ｄ １、Ｃｙｎ ｄ ７、Ｃｙｎ ｄ １２、Ｃｙｎ ｄ １５、Ｃｙｎ ｄ ２２ｗ、Ｃｙｎ ｄ ２３、Ｃｙｎ ｄ ２４、Ｄａｃ ｇ １、Ｄａｃ ｇ ２、Ｄａｃ ｇ ３、Ｄａｃ ｇ ５、Ｆｅｓ ｐ ４ｗ、Ｈｏｌ ｌ １、Ｌｏｌ ｐ １、Ｌｏｌ ｐ ２、Ｌｏｌ ｐ ３、Ｌｏｌ ｐ ５、Ｌｏｌ ｐ １１、Ｐｈａ ａ １、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２、Ｐｈｌ ｐ １３、Ｐｏａ ｐ １、Ｐｏａ ｐ ５、Ｓｏｒ ｈ １、Ｐｈｏ ｄ ２、Ａｌｎ ｇ １、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ６、Ｂｅｔ ｖ ７、Ｃａｒ ｂ １、Ｃａｓ ｓ １、Ｃａｓ ｓ ５、Ｃａｓ ｓ ８、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｃｏｒ ａ ９、Ｃｏｒ ａ １０、Ｃｏｒ ａ １１、Ｑｕｅ ａ １、Ｆｒａ ｅ １、Ｌｉｇ ｖ １、Ｏｌｅ ｅ １、Ｏｌｅ ｅ ２、Ｏｌｅ ｅ ３、Ｏｌｅ ｅ ４、Ｏｌｅ ｅ ５、Ｏｌｅ ｅ ６、Ｏｌｅ ｅ ７、Ｏｌｅ ｅ ８、Ｏｌｅ ｅ ９、Ｏｌｅ ｅ １０、Ｓｙｒ ｖ １、Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｒｙ ｊ ２、Ｃｕｐ ａ １、Ｃｕｐ ｓ １、Ｃｕｐ ｓ ３ｗ、Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ａ ２、Ｊｕｎ ａ ３、Ｊｕｎ ｏ ４、Ｊｕｎ ｓ １、Ｊｕｎ ｖ １、Ｐｌａ ａ １、Ｐｌａ ａ ２、Ｐｌａ ａ ３、Ａｃａ ｓ １３、Ｂｌｏ ｔ １、Ｂｌｏ ｔ ３、Ｂｌｏ ｔ ４、Ｂｌｏ ｔ ５、Ｂｌｏ ｔ ６、Ｂｌｏ ｔ １０、Ｂｌｏ ｔ １１、Ｂｌｏ ｔ １２、Ｂｌｏ ｔ １３、Ｂｌｏ ｔ １９、Ｄｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ １０、Ｄｅｒ ｆ １１、Ｄｅｒ ｆ １４、Ｄｅｒ ｆ １５、Ｄｅｒ ｆ １６、Ｄｅｒ ｆ １７、Ｄｅｒ ｆ １８ｗ、Ｄｅｒ ｍ １、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ６、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ ２０、Ｄｅｒ ｐ ２１、Ｅｕｒ ｍ ２、Ｅｕｒ ｍ １４、Ｇｌｙ ｄ ２，Ｌｅｐ ｄ １、Ｌｅｐ ｄ ２、Ｌｅｐ ｄ ５、Ｌｅｐ ｄ ７、Ｌｅｐ ｄ １０、Ｌｅｐ ｄ １３、Ｔｙｒ ｐ ２、Ｔｙｒ ｐ １３、Ｂｏｓ ｄ ２、Ｂｏｓ ｄ ３、Ｂｏｓ ｄ ４、Ｂｏｓ ｄ ５、Ｂｏｓ ｄ ６、Ｂｏｓ ｄ ７、Ｂｏｓ ｄ ８、Ｃａｎ ｆ １、Ｃａｎ ｆ ２、Ｃａｎ ｆ ３、Ｃａｎ ｆ ４、Ｅｑｕ ｃ １、Ｅｑｕ ｃ ２、Ｅｑｕ ｃ ３、Ｅｑｕ ｃ ４、Ｅｑｕ ｃ ５、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ５ｗ、Ｆｅｌ ｄ ６ｗ、Ｆｅｌ ｄ ７ｗ、Ｃａｖ ｐ １、Ｃａｖ ｐ ２、Ｍｕｓ ｍ １、Ｒａｔ ｎ １、Ａｌｔ ａ １、Ａｌｔ ａ ３、Ａｌｔ ａ ４、Ａｌｔ ａ ５、Ａｌｔ ａ ６、Ａｌｔ ａ ７、Ａｌｔ ａ ８、Ａｌｔ ａ １０、Ａｌｔ ａ １２、Ａｌｔ ａ １３、Ｃｌａ ｈ ２、Ｃｌａ ｈ ５、Ｃｌａ ｈ ６、Ｃｌａ ｈ ７、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｌａ ｈ ９、Ｃｌａ ｈ １０、Ｃｌａ ｈ １２、Ａｓｐ ｆｌ １３、Ａｓｐ ｆ １、Ａｓｐ ｆ ２、Ａｓｐ ｆ ３、Ａｓｐ ｆ ４、Ａｓｐ ｆ ５、Ａｓｐ ｆ ６、Ａｓｐ ｆ ７、Ａｓｐ ｆ ８、Ａｓｐ ｆ ９、Ａｓｐ ｆ １０、Ａｓｐ ｆ １１、Ａｓｐ ｆ １２、Ａｓｐ ｆ １３、Ａｓｐ ｆ １５、Ａｓｐ ｆ １６、Ａｓｐ ｆ １７、Ａｓｐ ｆ １８、Ａｓｐ ｆ ２２ｗ、Ａｓｐ ｆ ２３、Ａｓｐ ｆ ２７、Ａｓｐ ｆ ２８、Ａｓｐ ｆ ２９、Ａｓｐ ｎ １４、Ａｓｐ ｎ １８、Ａｓｐ ｎ ２５、Ａｓｐ ｏ １３、Ａｓｐ ｏ ２１、Ｐｅｎ ｂ １３、Ｐｅｎ ｂ ２６、Ｐｅｎ ｃｈ １３、Ｐｅｎ ｃｈ １８、Ｐｅｎ ｃｈ ２０、Ｐｅｎ ｃ ３、Ｐｅｎ ｃ １３、Ｐｅｎ ｃ １９、Ｐｅｎ ｃ ２２ｗ、Ｐｅｎ ｃ ２４、Ｐｅｎ ｏ １８、Ｆｕｓ ｃ １、Ｆｕｓ ｃ ２、Ｔｒｉ ｒ ２、Ｔｒｉ ｒ ４、Ｔｒｉ ｔ １、Ｔｒｉ ｔ ４、Ｃａｎｄ ａ １、Ｃａｎｄ ａ ３、Ｃａｎｄ ｂ ２、Ｐｓｉ ｃ １、Ｐｓｉ ｃ ２、Ｃｏｐ ｃ １、Ｃｏｐ ｃ ２、Ｃｏｐ ｃ ３、Ｃｏｐ ｃ ５、Ｃｏｐ ｃ ７、Ｒｈｏ ｍ １、Ｒｈｏ ｍ ２、Ｍａｌａ ｆ ２、Ｍａｌａ ｆ ３、Ｍａｌａ ｆ ４、Ｍａｌａ ｓ １、Ｍａｌａ ｓ ５、Ｍａｌａ ｓ ６、Ｍａｌａ ｓ ７、Ｍａｌａ ｓ ８、Ｍａｌａ ｓ ９、Ｍａｌａ ｓ １０、Ｍａｌａ ｓ １１、Ｍａｌａ ｓ １２、Ｍａｌａ ｓ １３、Ｅｐｉ ｐ １、Ａｅｄ ａ １、Ａｅｄ ａ ２、Ａｐｉ ｍ １、Ａｐｉ ｍ ２、Ａｐｉ ｍ ４、Ａｐｉ ｍ ６、Ａｐｉ ｍ ７、Ｂｏｍ ｐ １，Ｂｏｍ ｐ ４、Ｂｌａ ｇ １、Ｂｌａ ｇ ２、Ｂｌａ ｇ ４、Ｂｌａ ｇ ５、Ｂｌａ ｇ ６、Ｂｌａ ｇ ７、Ｂｌａ ｇ ８、Ｐｅｒ ａ １、Ｐｅｒ ａ ３、Ｐｅｒ ａ ６、Ｐｅｒ ａ ７、Ｃｈｉ ｋ １０、Ｃｈｉ ｔ １−９、Ｃｈｉ ｔ １．０１、Ｃｈｉ ｔ １．０２、Ｃｈｉ ｔ ２．０１０１、Ｃｈｉ ｔ ２．０１０２、Ｃｈｉ ｔ ３、Ｃｈｉ ｔ ４、Ｃｈｉ ｔ ５、Ｃｈｉ ｔ ６．０１、Ｃｈｉ ｔ ６．０２、Ｃｈｉ ｔ ７、Ｃｈｉ ｔ ８、Ｃｈｉ ｔ ９、Ｃｔｅ ｆ １、Ｃｔｅ ｆ ２、Ｃｔｅ ｆ ３、Ｔｈａ ｐ １、Ｌｅｐ ｓ １、Ｄｏｌ ｍ １、Ｄｏｌ ｍ ２、Ｄｏｌ ｍ ５、Ｄｏｌ ａ ５、Ｐｏｌ ａ １、Ｐｏｌ ａ ２、Ｐｏｌ ａ ５、Ｐｏｌ ｄ １、Ｐｏｌ ｄ ４、Ｐｏｌ ｄ ５、Ｐｏｌ ｅ １、Ｐｏｌ ｅ ５、Ｐｏｌ ｆ ５、Ｐｏｌ ｇ ５、Ｐｏｌ ｍ ５、Ｖｅｓｐ ｃ １、Ｖｅｓｐ ｃ ５、Ｖｅｓｐ ｍ １、Ｖｅｓｐ ｍ ５、Ｖｅｓ ｆ ５、Ｖｅｓ ｇ ５、Ｖｅｓ ｍ １、Ｖｅｓ ｍ ２、Ｖｅｓ ｍ ５、Ｖｅｓ ｐ ５、Ｖｅｓ ｓ ５、Ｖｅｓ ｖｉ ５、Ｖｅｓ ｖ １、Ｖｅｓ ｖ ２、Ｖｅｓ ｖ ５、Ｍｙｒ ｐ １、Ｍｙｒ ｐ ２、Ｓｏｌ ｇ ２、Ｓｏｌ ｇ ４、Ｓｏｌ ｉ ２、Ｓｏｌ ｉ ３、Ｓｏｌ ｉ ４、Ｓｏｌ ｓ ２、Ｔｒｉａ ｐ １、Ｇａｄ ｃ １、Ｓａｌ ｓ １、Ｂｏｓ ｄ ４、Ｂｏｓ ｄ ５、Ｂｏｓ ｄ ６、Ｂｏｓ ｄ ７、Ｂｏｓ ｄ ８、Ｇａｌ ｄ １、Ｇａｌ ｄ ２、Ｇａｌ ｄ ３、Ｇａｌ ｄ ４、Ｇａｌ ｄ ５、Ｍｅｔ ｅ １、Ｐｅｎ ａ １、Ｐｅｎ ｉ １、Ｐｅｎ ｍ １、Ｐｅｎ ｍ ２、Ｔｏｄ ｐ １、Ｈｅｌ ａｓ １、Ｈａｌ ｍ １、Ｒａｎ ｅ １、Ｒａｎ ｅ ２、Ｂｒａ ｊ １、Ｂｒａ ｎ １、Ｂｒａ ｏ ３、Ｂｒａ ｒ １、Ｂｒａ ｒ ２、Ｈｏｒ ｖ １５、Ｈｏｒ ｖ １６、Ｈｏｒ ｖ １７、Ｈｏｒ ｖ ２１、Ｓｅｃ ｃ ２０、Ｔｒｉ ａ １８、Ｔｒｉ ａ １９、Ｔｒｉ ａ ２５、Ｔｒｉ ａ ２６、Ｚｅａ ｍ １４、Ｚｅａ ｍ ２５、Ｏｒｙ ｓ １、Ａｐｉ ｇ １、Ａｐｉ ｇ ４、Ａｐｉ ｇ ５、Ｄａｕ ｃ １、Ｄａｕ ｃ ４、Ｃｏｒ ａ １．０４、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｆｒａ ａ ３、Ｆｒａ ａ ４、Ｍａｌ ｄ １、Ｍａｌ ｄ ２、Ｍａｌ ｄ ３、Ｍａｌ ｄ ４、Ｐｙｒ ｃ １、Ｐｙｒ ｃ ４、Ｐｙｒ ｃ ５、Ｐｅｒｓ ａ １、Ｐｒｕ ａｒ １、Ｐｒｕ ａｒ ３、Ｐｒｕ ａｖ １、Ｐｒｕ ａｖ ２、Ｐｒｕ ａｖ ３、Ｐｒｕ ａｖ ４、Ｐｒｕ ｄ ３、Ｐｒｕ ｄｕ ４、Ｐｒｕ ｐ ３、Ｐｒｕ ｐ ４、Ａｓｐａ ｏ １、Ｃｒｏ ｓ １、Ｃｒｏ ｓ ２、Ｌａｃ ｓ １、Ｖｉｔ ｖ １、Ｍｕｓ ｘｐ １、Ａｎａ ｃ １、Ａｎａ ｃ ２、Ｃｉｔ ｌ ３、Ｃｉｔ ｓ １、Ｃｉｔ ｓ ２、Ｃｉｔ ｓ ３、Ｌｉｔ ｃ １、Ｓｉｎ ａ １、Ｇｌｙ ｍ １、Ｇｌｙ ｍ ２、Ｇｌｙ ｍ ３、Ｇｌｙ ｍ ４、Ｖｉｇ ｒ １、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ４、Ａｒａ ｈ ５、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ ７、Ａｒａ ｈ ８、Ｌｅｎ ｃ １、Ｌｅｎ ｃ ２、Ｐｉｓ ｓ １、Ｐｉｓ ｓ ２、Ａｃｔ ｃ １、Ａｃｔ ｃ ２、Ｃａｐ ａ １ｗ、Ｃａｐ ａ ２、Ｌｙｃ ｅ １、Ｌｙｃ ｅ ２、Ｌｙｃ ｅ ３、Ｓｏｌａ ｔ １、Ｓｏｌａ ｔ ２、Ｓｏｌａ ｔ ３、Ｓｏｌａ ｔ ４、Ｂｅｒ ｅ １、Ｂｅｒ ｅ ２、Ｊｕｇ ｎ １、Ｊｕｇ ｎ ２、Ｊｕｇ ｒ １、Ｊｕｇ ｒ ２、Ｊｕｇ ｒ ３、Ａｎａ ｏ １、Ａｎａ ｏ ２、Ａｎａ ｏ ３、Ｒｉｃ ｃ １、Ｓｅｓ ｉ １、Ｓｅｓ ｉ ２、Ｓｅｓ ｉ ３、Ｓｅｓ ｉ ４、Ｓｅｓ ｉ ５、Ｓｅｓ ｉ ６、Ｃｕｃ ｍ １、Ｃｕｃ ｍ ２、Ｃｕｃ ｍ ３、Ｚｉｚ ｍ １、Ａｎｉ ｓ １、Ａｎｉ ｓ ２、Ａｎｉ ｓ ３、Ａｎｉ ｓ ４、Ａｒｇ ｒ、Ａｓｃ ｓ １、Ｃａｒ ｐ １、Ｄｅｎ ｎ １、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６．０１、Ｈｅｖ ｂ ６．０２、Ｈｅｖ ｂ ６．０３、Ｈｅｖ ｂ ７．０１、Ｈｅｖ ｂ ７．０２、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２、Ｈｅｖ ｂ １３、Ｈｏｍ ｓ １、Ｈｏｍ ｓ ２、Ｈｏｍ ｓ ３、Ｈｏｍ ｓ ４、Ｈｏｍ ｓ ５およびＴｒｉｐ ｓ １からなる群から選択されることが好ましい。
【００２９】
上記アレルゲンから得られる他のアレルゲンまたはペプチドに対して、ブタクサ花粉アレルゲンＡｍｂ ａ １から得られる本発明のペプチドを、融合および／または接合することが特に好ましい。そのような融合タンパク質／融合ポリペプチド／融合ペプチドまたはタンパク質接合物／ポリペプチド接合物／ペプチド接合物は、ワクチンまたは診断に使用する場合に有用である。
【００３０】
本発明の他の局面は、本発明に係るペプチドまたは分子をコードする核酸分子に関する。
【００３１】
本発明の核酸分子は、例えば、当該核酸分子によってコードされるペプチド／ポリペプチド／タンパク質の組み換え生成に使用され得る。さらに、それらはまた、治療的局面（例えば、遺伝子療法、細胞療法）に使用され得る。
【００３２】
本発明の他の局面は、本発明に係る核酸分子を備えるベクターに関する。
【００３３】
本発明の核酸分子は、ベクターに導入され得る。ベクターは、本発明のペプチドもしくは分子の組み換え生成、または治療的局面に使用され得る。
【００３４】
本明細書において使用されるときに、“ベクター”は、プラスミド、コスミドならびにウイルスＤＮＡおよびファージＤＮＡを指す。本発明に係る核酸分子を備えるプラスミドは、当該核酸分子と隣り合って、例えば、複製開始点、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー、栄養要求マーカー）、マルチクローニングサイト、当該核酸分子と作動可能に連結されたプロモータ領域および／または宿主のゲノムにベクターもしくはこれらの一部を相同組み込みする配列伸張鎖を含み得る。
【００３５】
本発明のベクターは、上記核酸分子と作動可能に連結されたプロモータをさらに備えて、したがって発現カセットを生じることが好ましい。
【００３６】
本発明の発現カセットは、プロモータおよび本発明のペプチドをコードする核酸分子を備える。プロモータは、本発明の核酸分子の５’末端（上流）に配置されていることが好ましい。発現カセットに使用されるプロモータは、当該プロモータがそれぞれの宿主によって制御され得るものであれば、あらゆるプロモータであり得る。
【００３７】
本発明のさらなる局面は、本発明に係る少なくとも１つの分子および／または少なくとも１つのペプチドを備えるワクチン調合物に関する。
【００３８】
配列番号１〜１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、かつブタクサ花粉アレルゲンＡｍｂ ａ １から得られる少なくとも１つのペプチドを備える、本発明のペプチドおよび／または分子は、ワクチン調合物に使用され得る。これらのペプチドが、ブタクサ花粉アレルゲンＡｍｂ ａ １に対するＴ細胞応答を誘発可能であるので、ワクチン調合物は、ブタクサ花粉アレルギーおよびブタクサ花粉アレルゲンと交差反応するアレルギー（例えば、ヨモギ花粉）の脱感作、予防または処置に使用され得る。ＩｇＥ結合活性の欠如に起因して、アレルギー性反応が上記ワクチンによって誘発されないか、または実質的に誘発されないので、ペプチドはワクチンに使用する場合に特に有利である。本発明のワクチン調合物は、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つの、より好ましくは少なくとも３つの本発明のペプチドを備え得る。
【００３９】
脱感作されるべき個体に対する本発明の治療的組成物の投与は、アレルゲンに対する個体の感受性を低下させる（すなわち、アレルギー反応を低下させる）ために有効な用量および期間において、公知の手法を用いて実施され得る。治療的組成物の有効量は、Ａｍｂ ａ １に対する個体の感受性の程度、年齢、性別および個体の体重、ならびにタンパク質またはこれらの断片による個体における抗原反応の誘発能といった要因にしたがって変わる。活性な化合物（すなわち、タンパク質またはこれらの断片）は、好都合な方法において投与される。当該方法は、例えば、注入（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮滴用、または直腸投与である。投与経路に依存して、活性な化合物は、酵素、酸、当該化合物を不活化し得る他の天然の条件（後述を参照すればよい）の作用から当該化合物を保護する物質に被覆され得る。例えば、単回投与ごとに、好ましくは約０．０５μｇ〜１０００μｇ、より好ましくは約０．１μｇ〜１０００μｇの活性な化合物（すなわち、タンパク質またはこれらの断片）が、注入によって投与され得る。投与計画は、最適な治療反応を提供するために調節され得る。例えば、治療状況の緊急性によって示されるように、種々の分割量が毎日投与され得るか、または単回の投与量が減らされ得る。
【００４０】
もちろん、本発明に係るペプチドまたは分子に対して結合された抗体を提供することも可能であり、かつ当該抗体は本発明の範囲内にある。また、当該抗体は、ワクチン調合物において使用され得る。
【００４１】
本発明に係る抗体としては、これらに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片および上述のあらゆるエピトープ結合断片が挙げられる。さらに、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）であると見做される。本発明の免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＤ型、ＩｇＡ型およびＩｇＹ型、免疫グロブリン分子のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスに属することが好ましい。
【００４２】
ポリクローナル抗体は、好ましくは補佐剤を用いて、ヒト以外の哺乳類に対して本発明のポリペプチドを投与すること、およびこれによって生じた血清を回収することによって調製され得る。長期間にわたって繰り返し注入することによって、高い力価を得ることができる。抗原の誘導に使用され得る哺乳類の種に特に限定はないが、ウサギまたはテンジクネズミを使用することが一般的に好ましいが、ウマ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ラット、ウシ、ヒツジ、ラクダなども使用され得る。抗原の生成において、本発明の免疫原の一定量が、例えば、好適な濃度にまで生理食塩水溶液を用いて希釈され、かつこれによって生じた希釈溶液が、例えば懸濁液を調製するための完全フロインドアジュバント、またはミネラルゲルとともに混合される。ミネラルゲルは、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性剤（例えば、リソレクチン、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ））、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および見込みのある有用なヒト免疫賦活剤（例えば、ＢＣＧ（ウシ型弱毒結核菌）およびコリネバクテリウム パルヴム）である。懸濁液および混合物は、単回投与ごとに約５０μｇ〜約２５００μｇの本発明のポリペプチドを用いて哺乳類（例えば、ウサギ）に対して、例えば腹腔内に投与される。懸濁液は、免疫をもたらすために、２〜３ヶ月以下、好ましくは約１ヶ月の期間にわたって約２週間ごとに投与されることが好ましい。抗体は、最後の投与から１〜２週間が経過した後に免疫した動物から血液を採取すること、血液を遠心分離することおよび血液から血清を単離することによって回収される。
【００４３】
モノクローナル抗体は、例えば、ヒトまたはマウス起源のものであり得る。マウスモノクローナル抗体は、Kohler and Milsteinの方法(Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256 (1975) 495)によって、例えば適切なマウスの骨髄腫細胞株との超免疫化マウスの脾臓細胞の融合によって、調製され得る。
【００４４】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体の製造方法は、当該技術において公知である。例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985)；Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986)；Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202；米国特許第５，８０７，７１５号明細書；米国特許第４，８１６，５６７号明細書および米国特許第４，８１６，３９７号明細書を参照すればよい。
【００４５】
ヒト化抗体は、ヒト以外の種の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）およびヒト免疫グロブリン分子のフレームワーク領域を有し、所望の抗原と結合するヒト以外の種の抗体から得られる抗体分子である。ヒトのフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合性を変更させるために、好ましくは向上させるために、ＣＤＲのドナー抗体から得られる対応する残基としばしば置換される。これらのフレームワーク置換は、当該分野において公知の方法によって確認される。当該公知の方法は、例えば、抗原結合性にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較である（例えば、Queen et alの米国特許第５，５８５，０８９号明細書；Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)を参照すればよい）。抗体は当該技術において知られる種々の技術を用いてヒト化され得る。抗体のヒト化に使用される技術としては、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；米国特許第５，５３０，１０１；および米国特許第５，５８５，０８９号明細書）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）もしくは表面形成（欧州特許第５９２，１０６号明細書；欧州特許第５１９，５９６号明細書；Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)；Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)；Roguska. et al., PNAS 91:969-913 (1994)）、およびチェインシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）が挙げられる。
【００４６】
本発明に係る抗体は、アレルギー、特にイエダニアレルギーにかかっている個体の受動免疫化に有利に使用され得る。受動免疫に関して、抗体は、ＩｇＧまたはこれらの誘導体（例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体）であることが好ましい。さらに、この抗体はまた、個体の脱感作に使用され得る。
【００４７】
本発明のワクチン調合物は、少なくとも１つの薬学的に受容可能な補佐剤、賦形剤および／または担体をさらに備える。
【００４８】
好ましく使用される薬学的に受容可能な担体は、生理食塩水、縮物油、鉱油、カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液またはポリビニルピロリドン水溶液である。好適な補佐剤としては、これらに限定されないが、界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リソレクチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール）；ポリアミン（例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、カルボポル）；ペプチド（例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン）；油乳濁物；ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）など、および免疫刺激複合体が挙げられる。補佐剤は、例えば、植物油を含有する組成物もしくはミョウバン、イソマンニドモノオレエート（ｉｓｏｍａｎｎｉｄｅ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）、およびアルミニウムモノステアレートであり得る。他の好ましい補佐剤としては、生物適合性マトリクス材料の微粒子またはビーズが挙げられる。本発明の分子は、微粒子またはマイクロカプセルに組み込まれて、個体に対する抗原性物質のばくろを延長し得て、したがって長期にわたって個体を感染から保護し得る。また、免疫原は、リポソームに組み込まれ得るか、または多糖類および／またはワクチン調合物に使用する他の重合体と接合され得る。
【００４９】
また、本発明の一部は、本発明の分子、特にペプチドおよび担体、好ましくは生物学的に受容可能な担体、より好ましくは薬学的に受容可能な担体を備える組成物である。典型的な担体は、水、緩衝化水溶液および水性のアルコール混合物などといった水性担体である。薬学的な使用、特にヒトにおける使用に向けた担体を備える組成物は、薬理学的に受容可能な担体を備える。当該担体の例は当該技術において公知である。
【００５０】
そのようなワクチンは、注射剤として、液体溶液剤または液体懸濁剤のいずれかとして調製される。また、ワクチンは、注射の前に液体が調製され得る、溶液または懸濁液に好適な個体の形態の注射剤として調製され得る。ワクチンは、生理学的に受容可能な希釈剤の存在下において、あらゆる都合の良い経路（例えば、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、静脈内、経口、鼻腔内、乳房内）によって標的の動物に投与され得る。抗原は、単回の用量または複数回の用量において投与され得る。本発明のワクチンは、冷蔵状態、凍結した形態、凍結乾燥した形態において保存され得る。ワクチンは、対照と比べて防御的な免疫応答を誘発するための有効量において、個体に投与され得る。有効量は、例えば、年齢および大きさとともに変わり、当業者によって容易に決定され得る。また、初回投与および追加抗原投与にとって好適な計画は、一定ではないが、初回投与の後に続く接種または他の投与によって代表され得る。
【００５１】
本発明のワクチン調合物は、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９からなる群から選択されるペプチドを備える少なくとも１つの分子を含有する。
【００５２】
本発明の特に好ましい実施形態において、ワクチン調合物は、配列番号５２、配列番号６８、配列番号８６、配列番号９１、および配列番号１２６〜配列番号１３９からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを備える。ここで、さらに好ましい調合物の実施形態は、配列番号５２および配列番号１３７〜１３９からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを備える。これらの分子は、ブタクサアレルギーにかかっている患者において高いＴ細胞反応性を示す（上記ペプチドは、ブタクサアレルギーに対して感作されたアレルギー性の、９０％を超える個体によって認識される）。さらに、これらの分子／ペプチドは、単独に調合され得るか、またはあらゆる組み合わせにおいて単一の調合物に調合され得る。したがって、ワクチン調合物は、配列番号５２、配列番号６８、配列番号８６、配列番号９１、および配列番号１２６〜配列番号１３９からなる群から選択される、好ましくは配列番号５２および配列番号１３７〜１３９からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのペプチドを備える。ペプチドの特に好ましい組み合わせは、配列番号５２および配列番号１３７；配列番号５２および配列番号１３８；配列番号５２および配列番号１３９；配列番号１３７および配列番号１３８；配列番号１３７および配列番号１３９；配列番号５２、配列番号１３７および配列番号１３８；配列番号５２、配列番号１３８および配列番号１３９；配列番号５２、配列番号１３７および配列番号１３９；配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９；配列番号５２、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９である。
【００５３】
本発明のさらに他の局面は、上記において概略を述べたようなワクチン調合物の製造に、本発明に係るペプチドおよび／または分子を使用することに関する。
【００５４】
ワクチン調合物は、個体におけるブタクサ花粉アレルギー、特にＡｍｂ ａ １によって引き起こされるアレルギーまたはブタクサ花粉アレルゲンと交差反応するアレルギーの予防または処置に使用される。
【００５５】
本発明の他の局面は、ブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性、または個体におけるブタクサアレルギーの診断に、本明細書に開示される分子を使用することに関する。
【００５６】
また、本発明の分子、特に本発明のペプチドは診断目的に使用され得る。本発明の分子およびペプチドは、Ａｍｂ ａ １と交差反応するアレルギーまたはブタクサアレルギーの検出および診断に使用され得る。例えば、これらのアレルギーの検出および診断は、（１）血中の構成要素（例えば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）を（複数の）ペプチドまたはタンパク質と結合させるために適切な条件において、Ａｍｂ ａ １の単離された１つもしくは複数のペプチドまたはＡｍｂ ａ １の単離されたα鎖もしくはβ鎖と、ブタクサアレルギーに対する感受性を評価される個体から得られる血液または血液からの生成物を組み合わせること、ならびに（２）そのような結合を生じる程度を測定することによってなされ得る。本発明のペプチドが使用され得るアレルギー性疾患にとっての他の診断方法としては、放射性アレルゲン吸着試験（ＲＡＳＴ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、表斜免疫測定（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ヒスタミン放出アッセイおよびＩｇＥ免疫ブロットが挙げられる。
【００５７】
本発明のさらなる局面は、ブタクサ花粉アレルゲンに対する個体の感受性を診断する方法に関する。当該方法は、以下の工程：
マスト細胞もしくは好塩基球および／または抗体、特にＩｇＥ分類の抗体を含有する、個体のサンプルを準備する工程、
本発明に係る分子／ペプチドと当該サンプルを接触させる工程、
上記分子との接触によって上記マスト細胞もしくは好塩基球から放出されたヒスタミンの量を測定する工程、および／または上記サンプルにおけるブタクサ花粉アレルゲン特異的抗体の量を測定する工程、
放出されたヒスタミンの上記量および／または上記サンプル中のブタクサ花粉アレルゲン特異的抗体の上記量が、ブタクサ花粉アレルギーもしくはブタクサ花粉アレルギーと交差反応を示すアレルギーにかかっていない個体から得られたサンプルと比べて増加している場合に、ブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性を診断する工程
を包含する。
【００５８】
本発明に係る方法に使用されるサンプルは、血液サンプル、涙液サンプル、唾液サンプルまたは鼻汁サンプルであることが好ましい。
【００５９】
本発明の更なる局面は、配列番号１４２または配列番号１４３のアミノ酸配列からなるＡｍｂ ａ １の単離されたα鎖、ならびに配列番号１４４または配列番号１４５のアミノ酸配列からなるＡｍｂ ａ １の単離されたβ鎖に関する。ここで、配列番号１４２のアミノ酸配列は、ＰＩＬＲＱＡＳＤＧＤ ＴＩＮＶＡＧＳＳＱＩ ＷＩＤＨＣＳＬＳＫＳ ＦＤＧＬＶＤＶＴＬＧ ＳＴＨＶＴＩＳＮＣＫ ＦＴＱＱＳＫＡＩＬＬ ＧＡＤＤＴＨＶＱＤＫ ＧＭＬＡＴＶＡＦＮＭ ＦＴＤＮＶＤＱＲＭＰ ＲＣＲＦＧＦＦＱＶＶ ＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹ ＡＩＧＧＳＳＡＰＴＩ ＬＣＱＧＮＲＦＬＡＰ ＤＤＱＩＫＫＮＶＬＡ ＲＴＧＴＧＡＡＥＳＭ ＡＷＮＷＲＳＤＫＤＬ ＬＥＮＧＡＩＦＶＴＳ ＧＳＤＰＶＬＴＰＶＱ ＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧ ＥＡＡＩＫＬＴＳＳＡ ＧＶＬＳＣＲＰＧＡＰ Ｃである。また、配列番号１４３のアミノ酸配列は、ＶＬＰＧＧＭＩＫＳＮ ＤＧＰＰＩＬＲＱＡＳ ＤＧＤＴＩＮＶＡＧＳ ＳＱＩＷＩＤＨＣＳＬ ＳＫＳＦＤＧＬＶＤＶ ＴＬＧＳＴＨＶＴＩＳ ＮＣＫＦＴＱＱＳＫＡ ＩＬＬＧＡＤＤＴＨＶ ＱＤＫＧＭＬＡＴＶＡ ＦＮＭＦＴＤＮＶＤＱ ＲＭＰＲＣＲＦＧＦＦ ＱＶＶＮＮＮＹＤＲＷ ＧＴＹＡＩＧＧＳＳＡ ＰＴＩＬＣＱＧＮＲＦ ＬＡＰＤＤＱＩＫＫＮ ＶＬＡＲＴＧＴＧＡＡ ＥＳＭＡＷＮＷＲＳＤ ＫＤＬＬＥＮＧＡＩＦ ＶＴＳＧＳＤＰＶＬＴ ＰＶＱＳＡＧＭＩＰＡ ＥＰＧＥＡＡＩＫＬＴ ＳＳＡＧＶＬＳＣＲＰ ＧＡＰＣである。また、配列番号１４４のアミノ酸配列は、ＡＥＧＶＧＥＩＬＰＳ ＶＮＥＴＲＳＬＱＡＣ ＥＡＹＮＩＩＤＫＣＷ ＲＧＫＡＤＷＥＮＮＲ ＱＡＬＡＤＣＡＱＧＦ ＡＫＧＴＹＧＧＫＷＧ ＤＶＹＴＶＴＳＮＬＤ ＤＤＶＡＮＰＫＥＧＴ ＬＲＦＡＡＡＱＮＲＰ ＬＷＩＩＦＫＮＤＭＶ ＩＮＬＮＱＥＬＶＶＮ ＳＤＫＴＩＤＧＲＧＶ ＫＶＥＩＩＮＧＧＬＴ ＬＭＮＶＫＮＩＩＩＨ ＮＩＮＩＨＤＶＫＶＬ ＰＧＧＭＩＫＳＮＤＧ Ｐである。また、配列番号１４５のアミノ酸配列は、ＡＥＧＶＧＥＩＬＰＳ ＶＮＥＴＲＳＬＱＡＣ ＥＡＹＮＩＩＤＫＣＷ ＲＧＫＡＤＷＥＮＮＲ ＱＡＬＡＤＣＡＱＧＦ ＡＫＧＴＹＧＧＫＷＧ ＤＶＹＴＶＴＳＮＬＤ ＤＤＶＡＮＰＫＥＧＴ ＬＲＦＡＡＡＱＮＲＰ ＬＷＩＩＦＫＮＤＭＶ ＩＮＬＮＱＥＬＶＶＮ ＳＤＫＴＩＤＧＲＧＶ ＫＶＥＩＩＮＧＧＬＴ ＬＭＮＶＫＮＩＩＩＨ ＮＩＮＩＨＤＶＫである。
【００６０】
Ａｍｂ ａ １は、２つの断片、α鎖（配列番号１４２または配列番号１４３）およびβ鎖（配列番号１４４）に実質的に分割され得る。意外にも両方の鎖が異なる免疫学的特性を示すことがわかった。Ａｍｂ ａ １のα鎖が低いＩｇＥ反応性を示す一方において、β鎖がＡｍｂ ａ １のＩｇＥエピトープのほとんどを含有している。
【００６１】
本発明のさらに他の局面は、本発明に係るＡｍｂ ａ １．３の単離されたα鎖およびＡｍｂ ａ １．３の単離されたβ鎖を備える薬学的調製物に関する。
【００６２】
本発明の他の局面は、個体におけるブタクサ花粉アレルギー、特にＡｍｂ ａ １によって引き起こされるアレルギーまたはブタクサ花粉アレルゲンと交差反応するアレルギーを処置する薬剤の製造に、本発明に係るＡｍｂ ａ １．３の単離されたα鎖およびＡｍｂ ａ １．３の単離されたβ鎖を使用することに関する。
【００６３】
本発明のさらなる局面は、個体におけるブタクサアレルギーもしくはブタクサ花粉アレルギーと交差反応するアレルギーの診断、またはブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性の診断に、本発明に係るＡｍｂ ａ １．３の単離されたα鎖およびＡｍｂ ａ １．３の単離されたβ鎖を使用することに関する。
【００６４】
本発明は、以下の図面および実施例によって例示されるが、これらに限定れるものではない。
【００６５】
図１は、８Ｍの尿素におけるニッケルキレートクロマトグラフィー（ＮＣＣ）を用いたｒＡｍｂ ａ １．３の精製を示す。サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシー染色を用いて分析された。精製画分は大きな凝集を示した。
【００６６】
図２は、組み換えＡｍｂ ａ １．３のＩｇＥドットブロット分析を示す。大腸菌において生成されたｒＡｍｂ ａ １．３は、上述のように精製され、かつニトロセルロース膜上にドット化された。１７人のブタクサ花粉アレルギー患者から得られた血清（１〜１７）は、試験され、かつｒＡｍｂ ａ １．３との非常に弱いＩｇＥ反応性を示したか、もしくはＩｇＥ反応性を示さなかった。同じ患者らは、ｎＡｍｂ ａ １との強いＩｇＥ反応性を示した。
【００６７】
図３は、精製された天然のＡｍｂ ａ １またはＡｍｂ ａ １．３を用いて、異なる濃度において刺激したＴＣＬを示す。最適濃度の値が示されている。Ｎ＝１３；ピアスン相関係数：０．９７９＊＊（ｐ＜０．０１）またはスピアマンのρ：０．９１２＊＊。
【００６８】
図４は、ＴＣＬ増殖アッセイにおけるアレルゲン力価測定（天然アレルゲンと対比した複数の組み換えアレルゲン（ｒＡｍｂ ａ １．３の異なるロット、ロットＬ１〜Ｌ４））の例を示す。ＳＴＡおよびＯＰＯは、２人の異なるブタクサアレルギー患者のそれぞれから得られたＴＣＬである。
【００６９】
図５は、ブタクサ抽出物およびｒＡｍｂ ａ １．３によってＴＣＬにおいて誘導される類似のサイトカイン産生を示す。
【００７０】
図６は、天然のＡｍｂ ａ １およびｒＡｍｂ ａ １．３によってＴＣＬおよびＴＣＣにおいて誘導される同等のサイトカイン産生を示す。
【００７１】
図７は、天然のＡｍｂ ａ １またはｒＡｍｂ ａ １．３を用いて誘導されたＴＣＬが類似のＴ細胞エピトープを認識することを示す。
【００７２】
図８は、Ａｍｂ ａ １．３の関連するＴ細胞活性化領域を示す。それぞれのエピトープを認識する患者の百分率が、３を超える刺激指標（ＳＩ＞３）および５を超える刺激指標（ＳＩ＞５）のそれぞれについて個別に分析された。
【００７３】
図９は、精製ｎＡｍｂ ａ １のＩｇＥ免疫ブロットを示す。ｎＡｍｂ ａ １が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、かつＰＶＤＦ膜上に電気ブロットされた。膜片は、ブタクサ花粉アレルギー患者から得られた血清を用いて（レーン１〜２９）か、または非アレルギーの提供者から得られた血清を用いて（レーンＣ）インキュベートされた。結合したＩｇＥは、125Ｉ−標識化ヤギ抗ヒトＩｇＥを用いて検出された。ブタクサ花粉感作患者は、オーストリア（レーン１〜１３）またはイタリア（レーン１４〜２９）において募られた。
【００７４】
図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＰＶＤＦ膜上への電気ブロットの後における、精製された天然のＡｍｂ ａ １のクーマシー染色を示す。プロセシングを受けていないｎＡｍｂ ａ １、α鎖およびβ鎖に対応するバンドは、Ｎ末端配列を得るためにエドマン分解にかけられた。
【００７５】
図１１は、プロセシングを受けていない天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【００７６】
図１２は、天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のα鎖のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【００７７】
図１３は、天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のβ鎖のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【００７８】
図１４は、Ａｍｂ ａ １アイソフォームならびにそれらのα鎖およびβ鎖の推定されるアミノ酸配列を示す。アイソフォームのＡｍｂ ａ １．１、Ａｍｂ ａ １．Ａｍｂ ａ １．２、Ａｍｂ ａ １．３、Ａｍｂ ａ １．４およびＡｍｂ ａ ２が、公開され（Rafnar et al., J. Biol. Chem. 266: 1229-1236, 1991）かつ特許された（米国特許第５，７７６，７６１号）。Ｒ２クローンが、抗Ａｍｂ ａ １の親和性精製ウサギ抗体を用いたブタクサ花粉ｃＤＮＡの花粉の免疫スクリーニングによって、研究室において単離された。そして、Ｒ２クローンは、タンパク質レベルにおいてＡｍｂ ａ １．３と同一である。下線が付された文字は、演算手順ＳｉｇｎａｌＰ（ HYPERLINK "http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/"http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）を用いて予測されたシグナルペプチドを表す。斜字体において表されているのは、Ｎ末端配列決定および天然のＡｍｂ ａ １の質量分析に基づく推定のβ鎖の配列である。斜字体および下線付きの文字は、Ｎ末端配列決定および天然のＡｍｂ ａ １の質量分析に基づく推定のα鎖の配列である（図１０〜１３；表４）。Ｎ末端配列分析によって、太字の配列が精製された天然のＡｍｂ ａ １調製においてタンパク質分解的に除かれた。
【００７９】
図１５は、Ａｍｂ ａ １アイソフォームの配列整合を示す。Ａｍｂ ａ １．１、、Ａｍｂ ａ １．２、Ａｍｂ ａ １．３およびＡｍｂ ａ ２のそれぞれがクローン化され、配列決定され、かつ公開された（Rafnar et al., J. Biol. Chem. 266: 1229-1236, 1991）。配列整合は、ソフトウェアＣｌｕｓｔａｗ（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl?page=npsa clustawl.html）を用いて生成された。図１４に示される推定される完全なアミノ酸配列は、整合に使用された。
【００８０】
図１６は、Ａｍｂ ａ １．３（Ｒ２クローン）の推定されるアミノ酸配列を示す。（ａ）Ｎ末端配列決定および精製された天然のＡｍｂ ａ １の質量分析（図１〜１３；表４を参照すればよい）からの情報に基づく推定のα鎖およびβ鎖。（ｂ）Ａｍｂ ａ １．３の組み換えのα鎖およびβ鎖を生成するために研究所において作製された第１のコンストラクト。（ｃ）２つの鎖の発現は、全長のＡｍｂ ａ １．３よりも良好であったが、得られた収量は低かった。さらに、α鎖からＴ細胞反応性のドメイン（四角の囲み、１７８〜１８９位のアミノ酸）を排除した。１７８〜１８９位のアミノ酸と対応するＴ細胞エピトープをα鎖に含めるために設計された、Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）。（ｄ）１７８〜１８９位のアミノ酸と対応するＴ細胞エピトープをα鎖に含めるために、かつ天然のＡｍｂ ａ １においてタンパク質分解的に除去されることが示されているＮ末端における最初の２０アミノ酸をβ鎖において排除するために設計された、Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン２）。
【００８１】
図１７は、大腸菌株ＢＬ２１およびＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳにおける、Ａｍｂ ａ １の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）の発現を示す。
【００８２】
図１８は、ニッケルカラム上における親和性精製後における、Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色を示す。α鎖およびβ鎖は、大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて高収率に得られた。精製された２つの鎖は、可溶性であり、かつ全長のＡｍｂ ａ １．３アレルゲンにともなう大きな問題であった凝集するあらゆる傾向を示さなかった。
【００８３】
図１９は、天然のＡｍｂ ａ １ならびにＡｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）のヒトＩｇＥを用いたＥＬＩＳＡを示す。
【００８４】
図２０は、Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）を用いたＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＬの増殖を示す。天然のＡｍｂ ａ １、異なる濃度の全長ｒＡｍｂ ａ １．３、ｒα鎖およびβ鎖が、刺激剤として使用された。ＴＣＬは、ｒＡｍｂ ａ １．３（Ａｍｂ）を用いて惹起された。
【００８５】
図２１は、全長のｒＡｍｂ ａ １．３、Ａｍｂ ａ １の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）を用いた、２つのＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＬの増殖応答を示す。ＴＣＬは、ｒＡｍｂ ａ １．３（Ａｍｂ）またはブタクサ花粉抽出物（ＲＷ）を用いて惹起された。
【００８６】
図２２は、Ａｍｂ ａ １．３における同定された関連するＴ細胞活性化領域を示す。１７／２６のエピトープは、Ａｍｂ ａ １のＣ末端領域に配置されている。したがって、上記α鎖およびβ鎖は、これらの関連するＴ細胞エピトープを含むように設計された。
【００８７】
〔実施例〕
（実施例１：Ａｍｂ ａ １をコードするｃＤＮＡの単離）
実施例１．１：ウサギ抗Ａｍｂ ａ １抗体の親和性精製
天然のＡｍｂ ａ １を用いて免疫したウサギからの血清は、当該技術において公知の通常の方法によって取得され得る。ブタクサ花粉ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングのために、Ａｍｂ ａ １特異的抗体は、親和性クロマトグラフィーによって精製された。ブタクサ花粉から精製された５ｍｇの天然のＡｍｂ ａ １は、ＣＮＢｒ活性化セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に対して結合させられた。ウサギ血清の結合後に、樹脂が洗浄され、かつ非常に特異性の高いＡｍｂ ａ １特異的抗体が、０．２Ｍのグリシン ｐＨ２．８を用いて溶出された。抗体は、直ちに中和され、かつｐＨ７．４の１×ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０．２４ｇのＫＨ2ＰＯ4、ＨＣｌを用いてｐＨ７．４に調節）に対して透析された。それから、精製された抗体は、免疫ブロッティングおよびライブラリスクリーニング実験に使用された。
【００８８】
実施例１．２：ブタクサ花粉ｃＤＮＡライブラリの構築および免疫スクリーニング
ブタクサ花粉ｃＤＮＡライブラリは、λ ＺＡＰ ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において構築された。精製されたウサギ抗Ａｍｂ ａ １抗体は、ブタクサ花粉ｃＤＮＡライブラリの４００，０００のプラーク（ｐｌａｑｕｅ）をスクリーニングするために使用された。４つの陽性Ａｍｂ ａ １クローンが単離され、かつＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターからのｐＢｌｕｅｓｃｒｐｔ ファージミドのインビボにおける切り出しに使用された。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４と名付けられたクローンは、ＤＮＡ配列決定に関して選抜された。ＤＮＡ配列決定は、フランキングプライマーＴ７およびＴ３を含む４つおよび５つのプライマーを用いた“プライマーウォーキング”技術によって実施された。Ｒ１およびＲ４のそれぞれは、５’末端において短く切断され、したがって本実験においてさらには使用されなかった。Ｒ２およびＲ３の両方の鎖は２回配列決定された。
【００８９】
実施例１．３：発現ベクターｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ−２へのクローニング
Ｒ２（Ａｍｂ ａ １．３）ｃＤＮＡは、発現ベクターｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ−２に連結された。クローニング手順に関して、２つの隣接するクローニングプライマーが構築された。完全なｃＤＮＡ配列は、推定されるシグナルペプチドをコードする７５ヌクレオチドだけ５’末端において切断された。以下のプライマー：Ｒａｇ−Ｎｃｏ−ｆｏｒｗａｒｄ：５'−ＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧ−ＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＣＣＴＴＣＡＧ−３'（配列番号１４０）およびＲａｇ−Ｘｈｏ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＧＧＣＡＴＧＡＧ−３’（配列番号１４１）が使用された。Ｎｃｏ ＩおよびＸｈｏ Ｉの制限酵素部位が、５’末端および３’末端に導入された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物は、制限酵素のＮｃｏ ＩおよびＸｈｏ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて消化され、かつベクターｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ−２のそれぞれの部位に対して連結された。生じたｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ−２／Ｒ２コンストラクトは、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ配列決定の手順（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にしたがって配列決定された。
【００９０】
実施例１．４：大腸菌における組み換え Ｒ２（Ａｍｂ ａ １）の発現
組み換えタンパク質発現は、コンストラクトｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ−２／Ｒ２を受容れている形質転換受容性の大腸菌株ＢＬ２１ ＤＥ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。形質転換体は、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上において選択され、単一の形質転換体コロニーが拾い上げられた。いくつかの小規模発現実験が実施され、かつ大規模タンパク質生成を試みる前に最適化された。培養培地（１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌのグリセロール、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび１．５ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．４に調節された）は、３％のオーバーナイト培養の条件において接種され、１５０μｇ／ｍＬのペニシリン （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）を有する培養培地において増殖させられた。醗酵は、１０ＬのＢｉｏｆｌｏｗ ３０００ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．）、３７℃、７％の飽和率の２００〜４００ｒｐｍの攪拌、および１．０のＯＤ600における０．４ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導の条件において実施された。細菌細胞（１０Ｌの培養液から６０〜８０ｇの湿重量の細胞）が、誘導から３時間後に遠心分離によって回収され、かつ１００ｍＬのＴｒｉｓ塩基、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨ未調節、１００ｍＬ／１ｇの細胞）に懸濁された。新たに溶解されたライソザイム（１００μｇ／１ｇの細胞）の添加および１時間にわたる室温におけるインキュベーションの後に、細胞は３回の凍結融解サイクルによって溶解された。可溶画分の分離が遠心分離によってなされ、かつ未処理の封入体が、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡを用いて２〜３回洗浄され、その後に５０％のエタノール、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０を用いて２回洗浄された。精製された封入体は、５００ｍＬの８Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０に溶解された。
【００９１】
実施例１．５：組み換えＲ２（Ａｍｂ ａ １．３）アレルゲンの精製
溶液は、製造者の手引書にしたがってＮｉＣｌ2を用いて帯電させた後に、直前の工程において説明された緩衝液を用いてあらかじめ平衡化した１５０ｍＬのＣｈｅｌａｔｉｏｎｇ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に乗せられた。クロマトグラフィーのすべての段階は、Ｂｉｏｐｉｌｏｔ ＦＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）において実施された。結合したタンパク質は、０〜３００ｍＭの範囲のイミダゾール直線勾配を用いて溶出された。画分の精製は、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。ほぼ純粋なＡｍｂ ａ １．３を含有する画分は、２ｍＭのＥＤＴＡを用いて安定化され、続いてＶｉｖａｆｌｏｗ ５０ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）におけるゲルろ過段階によって、５０ｍＬの容積まで濃縮されて調製された。ゲルろ過は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）カラム上において、８Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２ｍＭのＥＤＴＡにおいて実施された。純粋なＡｍｂ ａ １画分は、限外ろ過によって約３ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度にまでふたたび濃縮された。凍結乾燥の前にリフォールディング手順が実施された。リフォールディング手順において、ジスルフィド結合が、１０ｍＭのメルカプトエタノールの添加によって還元され、続いて１０００〜２０００倍の容積を有する５ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3に対する４℃における透析の間にふたたび酸化された。
【００９２】
実施例１．６：精製組み換えＡｍｂ ａ １のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および免疫ブロット分析
タンパク質は、１５％のアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および分子量基準ＲＰＮ ７５６（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたクーマシー染色分析された。アレルギー患者から得られた血清は、陽性のＩｇＥ反応性に関して試験された。ｒＡｍｂ ａ １およびｒＡｒｔ ｖ ６は、１５％（重量／重量）のポリアクリルアミドゲルにおいて分離され、かつＰＶＤＦ膜上に電気ブロッティング
された。ブロッキング緩衝液（それぞれ１Ｌに対して、７．５ｇのＮａＨ2ＰＯ4、５ｇのＢＳＡおよび５ｍＬのＴｗｅｅｎ ２０）を用いて非特異的タンパク質結合部位をブロッキングした後に、膜は、室温において６時間以上にわたって患者の血清（ブロッキング緩衝液に１：１０において希釈された）とともにインキュベートされた。膜は、少なくとも３０分間にわたってブロッキング緩衝液を用いて洗浄された後に、ブロッキング緩衝液に希釈された（１：４０）放射線標識［125Ｉ］抗ヒトＩｇＥ（ＲＡＳＴ、５□Ｃｉ、ＭｅｄＰｒｏ）とともに、オーバーナイトで室温においてインキュベートされた。第２の３０分間の洗浄の後に、膜は画像化プレート上に配置された。スクリーンは、少なくとも２４時間にわたって露光され、かつ検出用のＰｈｏｔｏＩｍａｇｅｒ Ｂａｓ １８００ ＩＩスキャナーおよび機器の指示ソフトウェア（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて現像された。
【００９３】
実施例１．７：Ａｍｂ ａ １アイソフォームをコードするｃＤＮＡクローン
ブタクサ花粉ライブラリから単離されたＲ２クローンおよびＲ３クローンは、完全であり、かつＡｍｂ ａ １アイソフォームにコードされた。推測されたＲ３のアミノ酸配列は、成熟Ａｍｂ ａ １．１アイソフォームと１つのアミノ酸において異なっていた。成熟Ａｍｂ ａ １．１の５０位におけるグリシンが、Ｒ３においてアラニンに交換されている。推測されたＲ２のアミノ酸配列は、Ａｍｂ ａ １．３アイソフォームと同一である。Ｒ２クローンは、ここに記載されているすべての実験に使用された。以下においてＲ２クローンをＡｍｂ ａ １．３と呼ぶ。
【００９４】
実施例１．８：Ａｍｂ ａ １．３の組み換え生成およびＩｇＥ結合活性
ＩｇＥ結合活性に関して、大腸菌において全長のｒＡｍｂ ａ １．３を生成する最初の試みは、希望を与えるものではなかった。何よりも、タンパク質分解性の切断が、大腸菌において生成されたｒＡｍｂ ａ １．３の精製の間に生じた。ｒＡｍｂ ａ １．３の収量は、１０Ｌの発酵培養液から約１５ｍｇのｒＡｍｂ ａ １．３であった。ｒＡｍｂ ａ １．３は、まったく封入体のみに見られ、したがってリフォールディング手順の使用が必要であった。しかし、全長のｒＡｍｂ ａ １．３の正確なリフォールディングは、困難であることが分かった。リフォールディングに関する異なる標準的な手法を用いた後に、最良の調製物は、ほとんどが不溶性の凝集体を構成した（図１を参照すればよい）。
【００９５】
精製手順の種々の変更および異なる安定化剤の種々の添加は、正しくフォールディングされた可溶性のタンパク質を生じなかった。非変性アッセイ（例えば、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ）において、ｒＡｍｂ ａ １．３は、ヒトＩｇＥと結合できなかった（図２）。還元および熱処理（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロッティングにとっての標準的な手法）の後にのみ、ｒＡｍｂ ａ １．３は、患者のＩｇＥと反応した。これらの結果は、上述のように生成されたｒＡｍｂ ａ １．３が、アレルギーの診断および治療に好適な試薬ではないことを明らかに証明した。したがって、完全なＩｇＥ結合活性を有する組み換え試薬を生成する他の方法が、実施例４に記載の通りに実施された。その低いＩｇＥ結合活性にもかかわらず、ｒＡｍｂ ａ １．３は、Ｔ細胞エピトープマッピングおよび増殖アッセイに首尾よく使用されたので、正しいフォールディングは、Ｔ細胞の認識に必須ではない。
【００９６】
（実施例２：Ａｍｂ ａ １のＴ細胞認識）
実施例２．１：患者
Ａｍｂ ａ １に対するＴ細胞応答は、確立されたインビトロにおける培養系（Jahn-Schmid et al., J. Immunol. 169: 6005-11, 2002; Jahn-Schmid et al., J. Allergy Clin. Immunol., 115: 399-404, 2005）を用いて、詳細に性質決定された。典型的な病歴、陽性の皮膚プリック試験およびブタクサ抽出物に関するＣＡＰ／ＲＡＳＴ試験を有する、臨床的に十分に規定される合計８５人の患者（ウィーンから７５人およびミラノから１０人）が含められた。
【００９７】
実施例２．２ＰＢＭＣ、Ａｍｂ ａ １特異的Ｔ細胞株（ＴＣＬ）およびＴ細胞クローン（ＴＣＣ）
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が、フィコール密度勾配遠心分離によって、アレルギー患者の末梢血から単離された。アレルゲン特異的なＴ細胞株（ＴＣＬ）およびＴ細胞クローン（ＴＣＣ）を生成するために、１．５×１０6のＰＢＭＣが、２４ウェルの平底培養プレート（コスター、ＵＳＡ）において、最適量（４μｇ／ｍｌ）のブタクサ抽出物またはヨモギ抽出物、またはｒＡｍｂ ａ １．３（１０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激された。５日後にヒトｒＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、ボーリンガー、マンハイム、ドイツ）が加えられ、かつ培養は、さらに７日間にわたって続けられた。それから、Ｔ細胞芽球が密度遠心分離によって単離された。Ｔ細胞芽球のほとんどは、ＩＬ−２および放射線照射を受けたＰＢＭＣを用いて増やされた。小数のＴ細胞芽球は、限界希釈によって単クローン性のＴ細胞株を確立するために使用された。放射線照射を受けた（６０Ｇｙ）２×１０5のＰＢＭＣ、０．２５％（容積／容積）のＰＨＡ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）およびｒＩＬ−２（４Ｕ／ウェル）の存在下における上述の培地を入れた、９６ウェルの丸底プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎｅ）に、０．３のＴ細胞／ウェルが播かれた。１４〜２１日後に、成長している微量培養物は、わずかな間隔を置いて、ｒＩＬ−２および放射線照射を受けたＰＢＭＣを用いて増やされた。ＴＣＣの特異性は、放射線照射を受けた異質遺伝子型ＰＢＭＣ、ＨＬＡ適合ＰＢＭＣまたは放射線照射を受けたＥＢＶ癌化の異質遺伝子型Ｂ細胞、ならびに５μｇ／ｍｌのＡｍｂ ａ １．３を用いた、増殖アッセイにおいて評価された。４８時間後に、トリチウムを含む（3Ｈ）−チミジンの細胞への取り込みが、１分ごとのカウント（ｃｐｍ）における増殖の測定に利用された。刺激指標（ＳＩ；ＴＣＣ＋自己のＡＰＣ＋抗原を含有する培養において得られたｃｐｍと、ＴＣＣおよびＡＰＣ単独を含有する培養において得られたｃｐｍとの間の比率）が＞１０であった場合に、応答は陽性と見做された。アレルゲン特異的ＴＣＣは、放射線照射を受けた自己のＡＰＣおよびアレルゲン、または異質遺伝子型の支持細胞およびｒＩＬ−２を用いた刺激の交互の転換によって増やされた。自己反応性に起因して異なる程度のバックグラウンド増殖を示したＰＢＭＣおよびＴＣＬに関して、＞３のＳＩまたはそれぞれ１０，０００ｄｐｍは、抗原特異性に関するカットオフ値（ｃｕｔ−ｏｆｆ）と見做された。
【００９８】
Ａｍｂ ａ １特異的なＴＣＬおよびＴＣＣは、Ａｍｂ ａ １．３のＴ細胞エピトープを同定するために使用された。Ｔ細胞株は、Ａｍｂ ａ １．３のＣ末端ペプチドを代表する１２１の合成ペプチド（１２０の１２ｍｅｒペプチドおよび１つの１３ｍｅｒのペプチド）の一群（Ｐｅｐｓｅｔ、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ、ドイツ）を用いて刺激された。ペプチドは、Ａｍｂ ａ １．３のアミノ酸配列にしたがって合成されており、かつ隣りあうペプチドと９アミノ酸残基だけ重複している（表１）。ペプチドは、刺激のために５μｇ／ｍｌの濃度において使用され、かつＴ細胞株の増殖は、４８時間後の3Ｈ−チミジンの取り込みによって測定された。ＴＣＬにおける自己反応性によって引き起こされるしばしば観察された高いバックグラウンドのために、少なくとも１０の刺激ペプチドを用いて（ペプチドは無毒である）観察されたｃｐｍの平均が、ＳＩの算出における陰性対照として使用された。本明細書を通して、刺激指標が少なくとも３．０であった場合に、ペプチドが１つのＴ細胞エピトープを備えていた。また、ＳＩ≧５．０を有する強い刺激ペプチドは、表２および３に示されている。
【００９９】
【表１】
【０１００】
【表２】
【０１０１】
実施例２．３：サイトカインの測定
Ｔ細胞は、洗浄され、かつ刺激物（５μｇ／ｍｌ）の存在下において４８時間にわたって放射線照射を受けた自己のＡＰＣとともにインキュベートされた。生じた上清におけるサイトカインレベルは、適合抗体対（Ｅｎｄｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いたＥＬＩＳＡ（感度の限界： ＩＬ−４：９ｐｇ／ｍｌ、ＩＦＮ−γ：９ｐｇ／ｍｌ）において測定された。ＴＣＣおよびＡＰＣ単独を含有する株が、陰性対照の役割を果たした。＞１０のＩＦＮ−γ／ＩＬ−４の割合を有するＴＣＣは、Ｔｈ１と分類され、当該割合が０．１〜１０のＴＣＣはＴｈ０と分類され、かつ当該割合が＜０．１のＴＣＣはＴｈ２と分類された。
【０１０２】
実施例２．４：フローサイトメトリー
ＴＣＣの表現型は、ＦＡＣＳｃａｎならびにＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体である、抗Ｌｅｕ／ＣＤ３、抗Ｌｅｕ ２ａ／ＣＤ８、抗ＴＣＲ αβ ＷＴ ３１、抗ＴＣＲ γδおよびＣＲＴＨ２＋ヤギ抗ラットＰＥ（すべての抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡから入手された）を用いた、フローサイトメトリーによって分析された。
【０１０３】
実施例２．５：天然Ａｍｂ ａ １とのｒＡｍｂ ａ １の比較
組み換えＡｍｂ ａ １．３アイソフォームが天然のＡｍｂ ａ １（アイソフォームの混合物）と比べてＴ細胞を刺激したかを確認するために、ＰＢＭＣおよびＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＬおよびＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＣは、異なる濃度の天然のＡｍｂ ａ １またはｒＡｍｂ ａ １．３を用いて刺激された。増殖およびサイトカイン応答が測定された。両方のアレルゲンの刺激能は、濃度の範囲の全体に渡って安定であり、天然のＡｍｂ ａ １およびｒＡｍｂ ａ １．３は、同等のＴ細胞増殖（図３および４）およびサイトカイン産生（図５および６）を一般的に誘導した。クローンレベルにおいて、ｒＡｍｂ ａ １．３の異なるエピトープを認識するＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＣが試験されたうちの１／６は、天然Ａｍｂ ａ １に対して反応しなかった（エピトープ：２６５〜２７６アミノ酸）。ブタクサ抽出物または組み換えＡｍｂ ａ １．３を用いて誘導されたＴＣＬは、類似のＴ細胞エピトープパターンを示した（図７）。
【０１０４】
実施例２．６：Ａｍｂ ａ １のＴ細胞エピトープ
Ａｍｂ ａ １．３のＴ細胞エピトープマッピングが実施されて、異なる患者（ウィーンから３７人およびイタリアから９人）から得られた４８のＴＣＬを評価した（表２）。当該ＴＣＬは、ブタクサ抽出物（天然のアレルゲンを含有している）またはｒＡｍｂ ａ １．３を用いて惹起されている。ブタクサ抽出物またはｒＡｍｂ ａ １．３のいずれかを用いて誘導された、同じ個体からのＴＣＬは、類似のＴ細胞エピトープを認識した（表２、図７）。オーストリア人およびイタリア人の患者は、類似のエピトープ認識プロファイルを示した。したがって、これらのデータは、さらなる分析と組み合わせられた（表３）。多くの吸入アレルゲンにとって典型的な、多数のＴ細胞活性化領域がＡｍｂ ａ １．３において検出された。単一の個体からのＴ細胞によって認識されたペプチドの数は、平均して１７．８のペプチドであり、２から最大で６０のペプチドの範囲であった（ＳＩ＞３に関して中央値＝１６；それぞれ０〜３６／１１．９／ＳＩ＞５に関して１２）（表３を参照すればよい）。合計して２６の関連する、１２〜１８位のアミノ酸を備えるＴ細胞活性化領域（すなわち、≧１０％の試験された患者によって認識された）が同定された。これらのエピトープ含有領域は、普及の等級に分けられた（ＳＩ＞５を参照すればよい）。
【０１０５】
１１の領域が１０〜２０％の患者において陽性であった：
ペプチド２０（８２〜９３位のアミノ酸）、ＧＫＷＧＤＶＹＴＶＴＳＮ（配列番号２０）、１４．６％によって認識された；
ペプチド４２（１４８〜１５９位のアミノ酸）、ペプチドＥＩＩＮＧＧＬＴＬＭＮＶ（配列番号４２）、１０．４％によって認識された；
ペプチド４４（１５４〜１６５位のアミノ酸）、ＬＴＬＭＮＶＫＮＩＩＩＨ（配列番号４４）、１８．８％によって認識された；
ペプチド７８（２５６〜２６７位のアミノ酸）、ＫＧＭＬＡＴＶＡＦＮＭＦ（配列番号７８）、１２．５％によって認識された；
ペプチド８０〜８１（２６２〜２７６位のアミノ酸）、ＶＡＦＮＭＦＴＤＮＶＤＱＲＭＰ（配列番号１２２）、１２．５％によって認識された；
ペプチド８３（２７１〜２８２位のアミノ酸）、ＶＤＱＲＭＰＲＣＲＦＧＦ（配列番号８３）、１６．７％によって認識された；
ペプチド８８〜８９（２８６〜３００位のアミノ酸）、ＶＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹＡＩＧＧ（配列番号１２３）、１２．５％によって認識された；
ペプチド９４（３０４〜３１５位のアミノ酸）、ＰＴＩＬＣＱＧＮＲＦＬＡ（配列番号９４）、１８．８％によって認識された；
ペプチド９８〜９９（３１６〜３３０位のアミノ酸）、ＰＤＤＱＩＫＫＮＶＬＡＲＴＧＴ（配列番号１２４）、１６．７％によって認識された；
ペプチド１００（３２２〜３３３位のアミノ酸）、ＫＮＶＬＡＲＴＧＴＧＡＡ（配列番号１００）、１０．４％によって認識された；
ペプチド１０１／１０２（３２５〜３３９位のアミノ酸）、ＬＡＲＴＧＴＧＡＡＥＳＭＡＷＮ（配列番号１２５）、１４．６％によって認識された。
【０１０６】
９の領域が２１〜３０％の患者において陽性であった：
ペプチド２７〜２８（１０３〜１１７位のアミノ酸）、ＥＧＴＬＲＦＡＡＡＱＮＲＰＬＷ（配列番号１２６）、２２．９％によって認識された；
ペプチド３０〜３１（１１２〜１２６位のアミノ酸）、ＱＮＲＰＬＷＩＩＦＫＮＤＭＶＩ（配列番号１２７）、２０．８％によって認識された；
ペプチド３３〜３４（１２１〜１３５位のアミノ酸）、ＫＮＤＭＶＩＮＬＮＱＥＬＶＶＮ（配列番号１２８）、２７．１％によって認識された；
ペプチド３６〜３７（１３０〜１４４位のアミノ酸）、ＱＥＬＶＶＮＳＤＫＴＩＤＧＲＧ（配列番号１２９）、２５．０％によって認識された；
ペプチド４６〜４８（１６０〜１７７位のアミノ酸）、ＫＮＩＩＩＨＮＩＮＩＨＤＶＫＶＬＰＧ（配列番号１３０）、２０．８％によって認識された；
ペプチド８６（２８０〜２９１位のアミノ酸）、ＦＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤ（配列番号８６）、２０．６％によって認識された；
ペプチド９１（２９５〜３０６位のアミノ酸）、ＴＹＡＩＧＧＳＳＡＰＴＩ（配列番号９１）、２２．９％によって認識された；
ペプチド１０９〜１１１（３４９〜３６６位のアミノ酸）、ＮＧＡＩＦＶＴＳＧＳＤＰＶＬＴＰＶＱ（配列番号１３１）、２２．９％によって認識された；
ペプチド１１８〜１２０（３７６〜３９３位のアミノ酸）３９３、ＧＥＡＡＩＫＬＴＳＳＡＧＶＬＳＣＲＰ（配列番号１３２）、２０．８％によって認識された。
【０１０７】
３つの領域が３１〜４９％の患者において陽性であった：
ペプチド３８〜４０（１３６〜１５３位のアミノ酸）、ＳＤＫＴＩＤＧＲＧＶＫＶＥＩＩＮＧＧ（配列番号１３３）、３３．３％によって認識された；
ペプチド６８（２２６〜２３７位のアミノ酸）、ＧＳＴＨＶＴＩＳＮＣＫＦ（配列番号６８）、３３．３％によって認識された；
ペプチド１１４〜１１５（３６４〜３７８位のアミノ酸）、ＰＶＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＡ（配列番号１３４）、３５．４％によって認識された。
【０１０８】
３つの領域が＞５０％の患者において陽性であった：
ペプチド５２（１７８〜１８９位のアミノ酸）、ＧＭＩＫＳＮＤＧＰＰＩＬ（配列番号５２）、５６．３％によって認識された；
ペプチド５９〜６１（１９９〜２１６位のアミノ酸）、ＮＶＡＧＳＳＱＩＷＩＤＨＣＳＬＳＫＳ（配列番号１３５）、５８．３％によって認識された；
ペプチド１０７〜１０８（３４３〜３５７位のアミノ酸）、ＤＫＤＬＬＥＮＧＡＩＦＶＴＳＧ（配列番号１３６）、５６．３％によって認識された。
【０１０９】
５０％を超えるアレルギー患者において増殖性応答を誘導する３つのＴ細胞活性化領域は、免疫優性エピトープであると決定した（図８、表３）。
【０１１０】
あるペプチドのＴ細胞活性化能は、認識の頻度と一般的に相関しない。したがって、“陽性指標（ＰＩ；陽性患者の百分率×ＳＩの平均）”が他の重要なエピトープを明らかにするために算出された。ＰＩは、９８〜２３００までの範囲内であり、かつ上述の３つの免疫優性領域および４つのさらなる領域（ＰＩ＞７００；２７％の最高値）を、Ａｍｂ ａ １．３における強い免疫原性領域として決定した：
４６〜４８：１６０〜１７７位のアミノ酸：ＫＮＩＩＩＨＮＩＮＩＨＤＶＫＶＬＰＧ（配列番号１３０）
１０９〜１１１：３４９〜３６６位のアミノ酸：ＮＧＡＩＦＶＴＳＧＳＤＰＶＬＴＰＶＱ（配列番号１３１）
１１４〜１１５：３６４〜３７８位のアミノ酸：ＰＶＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＡ（配列番号１３４）
１１８〜１２０：３７６〜３９３位のアミノ酸：ＧＥＡＡＩＫＬＴＳＳＡＧＶＬＳＣＲＰ（配列番号１３２）。
【０１１１】
ＴＣＬに加えて、１０人の異なるブタクサ花粉アレルギー患者から１００を超えるＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＣが確立された。１つのＣＤ８＋ＴＣＣを除いて、これらのＴＣＣは、ＣＤ４+ＴＣＲ αβ+Ｔ細胞であることが示された。１０８のＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＣ（ｎ＝１０の患者）におけるサイトカイン産生の調査によって、これらのＴＣＣの大部分（５０％）においてＴｈ２様サイトカインプロファイルが明らかになった（Ｔｈ１：１１％；Ｔｈ０ ３９％）。さらに、調査された６８のＴＣＣ（患者 ｎ＝８）のうちの７４％がＣＲＴｈ２を発現した。ＣＲＴｈ２は、Ｔｈ２Ｔ細胞の表面マーカーであり、またわれわれの株におけるＡｍｂ ａ １特異的Ｔ細胞が関連するアレルゲン性Ｔ細胞を代表することを示している。Ａｍｂ ａ １特異的ＴＣＣを用いたＡｍｂ ａ １．３のＴ細胞エピトープマッピングは、ＴＣＬから得られたデータを反映していた。その結果から、Ａｍｂ ａ １の提示が多様である（制限要素としてＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＰまたは−ＤＱを含む）ことが示された。
【０１１２】
米国特許第６，３３５，０２０号明細書（ブタクサ花粉由来のアレルゲン性ペプチド）において、Ｔ細胞反応性の主要な４つの領域：５７〜１０１位、１８２〜２１５位、２８０〜３２２位および３４２〜３７７位のアミノ酸が報告されている（図６）。このエピトープ分布は、本発明のエピトープといくつかの内容物に関して異なる。例えば、５７〜１０１位のアミノ酸の領域に対比して、１０１〜１８０位のアミノ酸内のエピトープがはるかに頻度よく認識されることが見出された。関連する木本花粉アレルゲンＣｈａ ｏ １（ヒノキ）、Ｃｒｙ ｊ １（スギ）に由来するＴ細胞エピトープは、他者によって説明されている（Sone et al., Clin Exp Allergy, 35: 664-71, 2005）。これらのアレルゲンの主要なエピトープは、Ａｍｂ ａ １における副次的なＴ細胞エピトープと相同な領域に配置されている。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
【表４】
【０１１５】
【表５】
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
【表７】
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
（実施例３：Ａｍｂ ａ １のα鎖およびβ鎖の性質決定）
ｎＡｍｂ ａ １は、精製の間に自然発生的にタンパク質分解を受け、かつｎＡｍｂ ａ １は、２つの鎖（α鎖およびβ鎖）のそれぞれに切断される。種々の国（イタリア、カナダおよびオーストリア）における患者から回収された血清を用いたデータによって、ほとんど（９０％）の患者が１２ｋＤａのβ鎖を認識したことが示された。これに対して、α鎖は、試験された患者の６５％のみのＩｇＥ抗体と弱く結合した（図９）。
【０１２１】
Ｔ細胞エピトープの同定を目的とした実験（実施例２に記載した）において、これらのＴ細胞活性化領域が４５％を超えるアレルギー患者において増殖性応答を誘導し、したがって免疫優性エピトープとして明らかになったこと（表３、図８）が見出された。興味深いことに、これらおよび他のＴ細胞活性化領域は、α鎖に対応するＡｍｂ ａ １のＣ末端領域に集まっている。したがって、これまでに公開された研究（King et al. Arch. Biochem. Biophys. 212: 127-135, 1981）とは反対に、今回、集められたデータは、Ａｍｂ ａ １の２つの鎖の免疫学的特性が異なることを示している。これらの発見が、大腸菌においてこれらの鎖を別々に生成させることの可能性、ならびにアレルギーの診断および免疫療法にとっての候補ワクチンとして利用する可能性を調査することに導いた。弱いＩｇＥ結合能を有するが、高い免疫原性（Ｔ細胞活性化）を有するα鎖は、特異的な免疫療法にとっての最適のツールである。一方において、高いＩｇＥ反応性のβ鎖は、ブタクサ花粉アレルギーを診断するための候補物である。
【０１２２】
このために、α鎖およびβ鎖の生成に使用する正確な切断部位を決定するための実験が実施された。当該実験は、ブタクサ花粉からのＡｍｂ ａ １の抽出および精製の間におけるＡｍｂ ａ １に関して説明されている（King et al. Immunochem. 11: 83-92, 1974）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の推定の他には、構造的なデータがＡｍｂ ａ １鎖に関して公開されていない。精製された天然Ａｍｂ ａ １（King et al. Immunochem. 11: 83-92, 1974を参照すればよい）は、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析によって分析され、かつＡｍｂ ａ １の未処理のα鎖およびβ鎖に対応するバンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／電気ブロッティング／クーマシー染色の後にエドマン分解にかけられた。このようにして、プロセシングを受けた天然Ａｍｂ ａ １およびプロセシングを受けていない天然のＡｍｂ ａ １の正確な質量およびＮ末端配列を決定することが可能になった（図１０〜１３、表４）。
【０１２３】
実施例３．１：Ｎ末端配列分析
天然Ａｍｂ ａ １は、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、かつポリビニル ジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に電気ブロットされた。Ａｍｂ ａ １およびその断片に対応するバンドが切り出され、かつ室温において１時間にわたって４０％（容積／容積）のアセトニトリルおよび３０％（容積／容積）のトリフルオロ酢酸の水溶液においてインキュベートすることによって、タンパク質が溶出された。サンプルは、真空乾燥され、水に再懸濁され、かつＨＰ Ｇ１００５Ａシークエンシングシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて配列決定された。
【０１２４】
実施例３．２：マトリックス支援レーザイオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析
シナピン酸およびウシ膵臓トリプシンの分子ピークが、カリブレーションに使用された。１００ｍＭのＤＴＴを含む０．５μｌ（〜０．７μｌ）の天然Ａｍｂ ａ １タンパク質溶液、および０．５μｌのシナピン酸マトリクスが、５０％（容積／容積）のアセトニトリルおよび０．１％（容積／容積）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の飽和溶液に溶解され、混合され、かつ標的スライド塗布された。サンプルは、Ｋｏｍｐａｃｔ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＩＶ質量分析器（Ｓｈｉｍａｚｕ）を用いて直線飛行モードにおいて分析された。
【０１２５】
実施例３．３：結果
まとめると、データ（図１０〜１３、表４）によって、Ａｍｂ ａ １の予測されるアミノ酸配列内のα鎖およびβ鎖の正確な位置づけを可能になりし、かついくつかのタンパク質分解段階がこれらの生成に関わることが示された。
（ｉ）プロセシングを受けていないＡｍｂ ａ １のＮ末端配列は、１７〜２０アミノ酸がタンパク質のＮ末端配列から除かれていることを示した。
（ｉｉ）β鎖は、１３８アミノ酸長であり、かつＡｍｂ ａ １のＮ末端部分に対応する（成熟タンパク質（Ａｍｂ ａ １．１アイソフォームをテンプレートとして採用している）の１８〜１５５位のアミノ酸）。
（ｉｉｉ）α鎖は、２０７アミノ酸長であり、かつＡｍｂ ａ １のＣ末端部分に対応する（成熟タンパク質（Ａｍｂ ａ １．１アイソフォームをテンプレートとして採用している）の１６５〜３７１位のアミノ酸）。
（ｉｖ）９つのアミノ酸が、β鎖のＣ末端とα鎖のＮ末端との間から除去されている。
【０１２６】
図１４は、Ａｍｂ ａ １の予測されるアミノ酸配列を、それらの配列上に位置づけられた推定のα鎖およびβ鎖とともに示す。
【０１２７】
【表１０】
【０１２８】
（実施例４：Ａｍｂ ａ １．３のα鎖およびβ鎖の組み換え生成）
実施例４．１：天然のプロセシングに従って設計された、Ａｍｂ ａ １．３のα鎖およびβ鎖の発現ベクターの構築および精製
プラスミドの構築および鎖の精製が実施例４．２に記載の通りに実施された。２つの鎖における差異は、図１６に示されている。表５は、α鎖およびβ鎖の組み換え生成用の種々の構築物をまとめたものである。
【０１２９】
実施例４．２：Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）の組み換え生成
本実験によって、改変された鎖の個別の生成が、全長のＡｍｂ ａ １．３分子の生成よりもはるかに有効であることが証明された。α鎖の生成収量は、１Ｌの発酵培養物につき約１００ｍｇであった。さらに、α鎖およびβ鎖の両方に関して大きな凝集体の形成は認められなかった（図１８）。
【０１３０】
実施例４．２．１：プラスミド構築
改変した鎖にしたがって設計されたプライマーを用いた、もとのＲ２クローンからの１００μｌの標準的なＰＣＲが実施された。ＰＣＲ産物は、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアガロースゲルから溶出された。両方のプライマーセット（β用およびα用）は、５’末端にＮｃｏ Ｉ部位ならびに３’末端にストップコドンおよびＸｈｏ Ｉを含んでいた。これらの酵素を用いてＰＣＲ断片およびベクターｐＨｉｓｐａｒａｌｌｅｌ−２は、オーバーナイト、３７℃において消化された。アガロースゲルからの溶出（Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ ｕｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ）の後に、ＰＣＲ断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標準的なライゲーション手順にしたがってベクターに連結された。連結反応は、電気穿孔法によって細菌株ＴＧ１（Ｋ１２、Ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／Ｆ’［ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＺＤＭ１５］）を形質転換するために使用された。１００μｌの形質転換体をプレートに播いた後に、ＬＢａｍｐ寒天プレートは、オーバーナイト、３７℃においてインキュベートされた。ＰＣＲコロニースクリーニングが使用されて、陽性のクローンを選択した（コロニーの少量がクローニングプライマーを用いた標準的なＰＣＲ用の鋳型として使用される）。選択されたクローンは、５０ｍｌのＳＢ培養およびプラスミド精製に使用された。挿入物は、ＡＢＩシークエンシングキットを用いて配列決定された。正しい配列を有するプラスミドが使用されて、細菌株ＢＬ２１およびＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。予備的な実験によって、大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを用いればより高い発現レベルが実現されることが示された（図１７）。
【０１３１】
実施例４．２．２：Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン２）の発現および精製
新たに形質転換された細菌から得られた１０〜２０のクローンは、０．５〜０．７のＯＤ600までＳＢにおいて増殖され、それから０．４ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導された。発現は、４〜５時間にわたって実施され、それから培養物が遠心分離（５，０００ｇ）によってペレット化された。細菌のペレットが開始緩衝液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ）に再懸濁された。細胞は、３回の凍結融解（液体窒素における凍結および２５℃における融解）によって溶解された。懸濁物は、ライソザイム（５ｍｇ／ｍｌ）、Ｄｎａｓｅ（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて処理され、かつ５分間にわたって超音波処理された。遠心分離（１５，０００ｇ）の後に、ペレットは、尿素開始緩衝液（開始緩衝液＋６Ｍの尿素＋１０ｍＭのイミダゾール）に再懸濁された。遠心分離（１５，０００ｇ）の後に、上清は、ＨｉｓＴｒａｐ Ｎｉ2+カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にかけられた。溶出は、溶出緩衝液（尿素開始緩衝液＋４００ｍＭのイミダゾール）を有する勾配によって実施された。画分がプールされ、かつ５００ｍＭのＬ−Ａｒｇ ｐＨ８．５に対して３回透析された。その後に、タンパク質は、ＰＢＳに対して透析された。Ａｍｂ ａ １の精製されたα鎖およびβ鎖（図１８）は、ＩｇＥ結合アッセイおよびＴ細胞増殖アッセイに使用された。
【０１３２】
実施例４．２．３：Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）に対するＴ細胞応答
表３におけるＴ細胞エピトープの結果と比較した場合に、４５／４６（９８％）の患者は、Ａｍｂ ａ １α鎖における１つ以上のエピトープを認識するだろう。したがって、Ａｍｂ ａ １の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）に対するＴ細胞応答は、利用可能なＡｍｂ ａ １反応性のＴＣＬ（ｎ＝６）およびＴＣＣ（ｎ＝２）を用いて、実施例２に記載のように増殖アッセイにおいて試験された。
【０１３３】
実施例４．３：組み換え生成
天然にプロセシングを受けたＡｍｂ ａ １にしたがって設計されたα鎖およびβ鎖の生成は、非常に低い収量のためにあまり希望を与えるものではなかった。しかし、Ｔ細胞エピトープマッピング実験から得られたデータによって、１つの重要なエピトープが、ほとんどのＴ細胞反応性ドメイン（図１６、アミノ酸１７８〜１８９）を有するα鎖に含まれていないことが示された。したがって、新たな鎖はこのＴ細胞エピトープ（表５、図１６）を含むように設計された。
【０１３４】
実施例４．４：ＩｇＥ結合
実施例３において示された通り、Ａｍｂ ａ １の天然にプロセシングを受けたα鎖およびβ鎖は、異なる免疫学的特性を有している。α鎖が低いＩｇＥ反応性を示す一方において、β鎖はＡｍｂ ａ １のＩｇＥエピトープのほとんどを含有している。したがって、精製されたα鎖のＩｇＥ結合活性を試験するために、ブタクサアレルギー患者から得られた血清を用いてＥＬＩＳＡが実施された。１２人の患者からの結果によって、α鎖が、インビトロにおいて低いＩｇＥ結合活性を示すこと／ＩｇＥ結合活性を示さないことが確かめられた（図１９）。実験は、β鎖の生成および性質決定のために実施されている。
【０１３５】
実施例４．５：Ｔ細胞反応性
試験された６つのＴＣＬのうちＡｍｂ ａ １に対する強い反応性を有する２つのＴＣＬが図２０に示されている。α鎖は、増殖の刺激に関してβ鎖よりもはるかに有効であった（Ａｍｂ ａ １の応答の、８２％および８４％に対して３８％および１９％）。この知見は、これらの２つのＴＣＬのエピトープ認識パターンによって説明され得る（図２を参照すればよい）。また、他の２つのＴＣＬは、それらのエピトーププロファイルにしたがってα鎖および／またはβ鎖と反応した（図２１）。
【０１３６】
Ａｍｂ ａ １−α内のエピトープに対して特異的な２つのＴＣＣは、Ａｍｂ ａ １．３ほどには強くない程度にα鎖と反応するが、β鎖とは反応しない。
【０１３７】
【表１１】
【０１３８】
（まとめ）
要約すると、Ａｍｂ ａ １の関連する２６のＴ細胞活性化領域が、確実性に関する閾値としてＳＩ＞５を選んで、同定された（図８および２２）。
【０１３９】
４８人の異なる患者から得られたＴ細胞株によって認識されたＴ細胞エピトープの分析において、１７／２６のエピトープが、Ａｍｂ ａ １．３のＣ末端領域（α鎖）に配置されている一方において、β鎖が、患者の１０〜３０％のみによって主に認識される少数のＴ細胞エピトープを含有することが見出された（図８、表３）。
【０１４０】
しかし、５０％を超える患者によって認識される、関連する／免疫優勢なＴ細胞エピトープ配列は、天然に生じる鎖（α鎖においてほんの部分的に代表される）に切断される。この重要なＴ細胞活性化領域を網羅するために、本発明は、β鎖のＣ末端からα鎖のＮ末端までの１６アミノ酸残基を加えることによる、α鎖の改変（改変したバージョン１；図１６、表５）を含む。したがって、Ａｍｂ ａ １．３α鎖の改変（バーｓジョン１）した構築物は、Ａｍｂ ａ １の最も頻繁に認識される３つのＴ細胞エピトープを含む（図２２）。
【０１４１】
ブタクサ花粉アレルギー用のワクチンとしての、Ａｍｂ ａ １．３のα鎖の全体（改変したバージョン１）の使用は、試験された患者（ｎ＝４８）の１００％を保護するだろう。
【０１４２】
ブタクサ花粉アレルギー患者のペプチド免疫療法に対する、本明細書において同定された３つの免疫優勢Ｔ細胞エピトープの組み合わせの使用は、患者の９３％を保護するだろう。
ＧＭＩＫＳＮＤＧＰＰＩＬ（ペプチド５２；配列番号５２）
ＧＳＳＱＩＷＩＤＨＣＳＬＳＫＳ（ペプチド６０〜６１；配列番号１３７）
ＤＫＤＬＬＥＮＧＡＩＦＶＴＳＧＳＤＰＶＬＴＰＶＱ（ペプチド１０７〜１１１；配列番号１３８）。
【０１４３】
以下の４つのペプチドの混合物は、患者の９５．８％を保護するだろう。
ＧＭＩＫＳＮＤＧＰＰＩＬ（ペプチド５２；配列番号５２）
ＧＳＳＱＩＷＩＤＨＣＳＬＳＫＳ（ペプチド６０〜６１；配列番号１３７）
ＤＫＤＬＬＥＮＧＡＩＦＶＴＳＧＳＤＰＶＬＴＰＶＱ（ペプチド１０７〜１１１；配列番号１３８）
ＡＩＫＬＴＳＳＡＧＶＬＳＣＲＰ（ペプチド１１９〜１２０；配列番号１３９）。
【０１４４】
また、この最適なペプチドの組み合わせに対して、以下の頻繁に認識されるペプチドの追加が考えられ得る。
ＫＮＩＩＩＨＮＩＮＩＨＤＶＫＶＬＰＧ（ペプチド４６〜４８；配列番号１３０）
ＧＳＴＨＶＴＩＳＮＣＫＦ（ペプチド６８；配列番号６８）
ＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＡ（ペプチド１１５；配列番号１１５）。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】８Ｍの尿素におけるニッケルキレートクロマトグラフィー（ＮＣＣ）を用いたｒＡｍｂ ａ １．３の精製を示す。
【図２】組み換えＡｍｂ ａ １．３のＩｇＥドットブロット分析を示す。
【図３】精製された天然のＡｍｂ ａ １またはＡｍｂ ａ １．３を用いて、異なる濃度において刺激したＴＣＬを示す。
【図４】ＴＣＬ増殖アッセイにおけるアレルゲン力価測定（天然アレルゲンと対比した複数の組み換えアレルゲン（ｒＡｍｂ ａ １．３の異なるロット、ロットＬ１〜Ｌ４））の例を示す。
【図５】ブタクサ抽出物およびｒＡｍｂ ａ １．３によってＴＣＬにおいて誘導される類似のサイトカイン産生を示す。
【図６】天然のＡｍｂ ａ １およびｒＡｍｂ ａ １．３によってＴＣＬおよびＴＣＣにおいて誘導される同等のサイトカイン産生を示す。
【図７】天然のＡｍｂ ａ １またはｒＡｍｂ ａ １．３を用いて誘導されたＴＣＬが類似のＴ細胞エピトープを認識することを示す。
【図８】Ａｍｂ ａ １．３の関連するＴ細胞活性化領域を示す。
【図９】精製ｎＡｍｂ ａ １のＩｇＥ免疫ブロットを示す。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＰＶＤＦ膜上への電気ブロットの後における、精製された天然のＡｍｂ ａ １のクーマシー染色を示す。
【図１１】プロセシングを受けていない天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【図１２】天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のα鎖のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【図１３】天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のβ鎖のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【図１４】Ａｍｂ ａ １アイソフォームならびにそれらのα鎖およびβ鎖の推定されるアミノ酸配列を示す。
【図１５】Ａｍｂ ａ １アイソフォームの配列整合を示す。
【図１６】Ａｍｂ ａ １．３（Ｒ２クローン）の推定されるアミノ酸配列を示す。
【図１７】大腸菌株ＢＬ２１およびＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳにおける、Ａｍｂ ａ １の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）の発現を示す。
【図１８】ニッケルカラム上における親和性精製後における、Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色を示す。
【図１９】天然のＡｍｂ ａ １ならびにＡｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）のヒトＩｇＥを用いたＥＬＩＳＡを示す。
【図２０】ｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）を用いたＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＬの増殖を示す。
【図２１】全長のｒＡｍｂ ａ １．３、Ａｍｂ ａ １の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）を用いた、２つのＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＬの増殖応答を示す。
【図２２】Ａｍｂ ａ １．３における同定された関連するＴ細胞活性化領域を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Ａｍｂ ａ １由来ペプチドに関する。
【０００２】
ブタクサ（アンブロシア アルテミシーフォリア）およびヨモギ（アルテミシア ブルガリス）は、アステラカエア科またはコンポジタエ科の植物に属する、重要なアレルゲン性の草本である。ヨモギの花粉は、ヨーロッパにおいて晩夏および秋におけるアレルギー反応の主原因の１つであり、かつ花粉症にかかっている患者の約１０〜１４％に影響を与える。ブタクサ花粉は、アトピー性２７．１０の個体において約５０％の普及率を有して、米国におけるアレルゲン性タンパク質の主要な発生源である。ヨーロッパにおいて、現在、ブタクサアレルギーは、フランス、イタリア、オーストリア、ハンガリー、クロアチア、およびブルガリアにおけるある特定の地域において、急速に増加している。ブタクサの主要なアレルゲンであるＡｍｂ ａ １およびヨモギの主要なアレルゲンであるＡｒｔ ｖ １のそれぞれは、無関係なタンパク質である。Ａｍｂ ａ １は、３８ｋＤａの非糖修飾の酸性タンパク質である。天然のＡｍｂ ａ １は、精製中にタンパク質分解を受け、かつα鎖およびβ鎖と命名された２つの鎖に切断される。２６ｋＤａのα鎖は、１２ｋＤａのβ鎖と非供給結合的に会合することが報告されている（King et al. Immunochem 11:83-92, 1974）。Ａｍｂ ａ １の２本鎖の形態は、全長の分子とは免疫学的に識別不能と思われる（King et al. Arch Biochem Biophys 212:127-135, 1981）。
【０００３】
ブタクサから得られる天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １）は、最初に説明されかつ単離されたアレルゲンであった（King et al. Biochem 3:458-468, 1964）。Ａｍｂ ａ １をコードするｃＤＮＡは、Rafnar et alによって１９９１年にブタクサ花粉から単離された（J. Biol. Chem. 266:1229-1236）。しかしこれまでのところ、正しくフォールディングされかつ活性な組み換えＡｍｂ ａ １（ｒＡｍｂ ａ １）を大量に発現し、かつ精製する方法は、報告されていない。
【０００４】
国際公開第９６／１３５８９号は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを備える、Ａｍｂ ａ １から得られた単離されたペプチドに関する。
【０００５】
国際公開第９０／１１２９３号には、Ａｍｂ ａ １のアミノ酸配列が記載されている。また、これらにおいて、Ａｍｂ ａ １のペプチドが、Ｔ細胞エピトープを備え、かつアンブロシア特異的な免疫応答を誘発し得ることについて、確認されている。
【０００６】
国際公開第９９／３４８２６号は、アレルゲンから得られたペプチドを投与することによって、患者を脱感作する方法および手段に関する。当該ペプチドは、個体におけるＴ細胞応答を誘発可能である。
【０００７】
Michael J.G. et al（J.Br.Soc.Aller.Clin.Immunol. 20(6)(1990):669-674）において、Ａｍｂ ａ １のプロテアーゼ消化によって得られるペプチドのＴ細胞応答が調べられている。
【０００８】
Cardinale E.J. et al（J.Aller.Clin.Immunol. 107(2001):p 19）は、アレルゲンの同定および性質決定にとってのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の使用に関する。
【０００９】
同様に、米国特許第６，３３，５０１９号は、個体におけるＡｍｂ ａ １に対するＴ細胞応答を誘発し得るＡｍｂ ａ １に関する。
【００１０】
Griffith et al.（Int.Arch.Aller.Appl.Immunol. 96(1991):296-304）は、Ａｍｂ ａ １およびＡｍｂ ａ ２ファミリーの一員の配列多形に関する。
【００１１】
本発明の目的は、アレルギー（特にブタクサ花粉アレルゲンによって引き起こされるアレルギー）の処置、予防または診断に使用され得る、ブタクサ花粉アレルゲンＡｍｂ ａ １から得られるペプチドおよび分子を提供することである。
【００１２】
したがって、本発明は、Ａｍｂ ａ １、特に配列番号１２、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９およびこれらの機能的な等価物からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＡｍｂ ａ １から得られるペプチドに関する。
【００１３】
配列番号１２、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する本発明のペプチドが、アレルギー性の個体から単離されたＴ細胞と反応性を示すこと、したがってワクチン（特にブタクサ花粉アレルゲンによって引き起こされるアレルギーおよびブタクサ花粉アレルゲンと交差反応するアレルギーにとってのワクチン）の製造に使用され得ることが明らかになった。特に、配列番号５２、配列番号６８、配列番号８６、配列番号９１および配列番号１２６〜配列番号１３９を有するペプチドは、ブタクサ花粉アレルギーにかかっている個体から得られたサンプルと高いＴ細胞反応性を示す。
【００１４】
本発明のペプチドのさらなる利点は、それらのすべてがＩｇＥ結合活性を欠如していることである。したがって、これらのペプチドを備える分子は、個体に対して投与された場合に、アレルギー反応（例えば、ヒスタミン放出の増加）を誘発しない。
【００１５】
治療を目的としたアレルゲンから得られるペプチドは、Ａｍｂ ａ １に特異的なＩｇＥと結合しないか、または対応する未処置の精製Ａｍｂ ａ １もしくは組み替え的に生成されたＡｍｂ ａ １のβ鎖よりも、実質的に低い程度において当該ＩｇＥと結合（少なくとも１００倍だけ低い程度、より好ましくは少なくとも１０００倍だけ低い程度において結合）する。本発明のペプチドが診断試薬として使用される場合には、ペプチドまたはタンパク質が、未処置のＡｍｂ ａ １アレルゲンと比べて低下したＩｇＥ結合活性を有する必要はない。ペプチドのＩｇＥ結合活性は、例えばあらかじめＡｍｂ ａ １にさらされている個体（すなわち、アレルギーの個体）から得られる血清を用いた、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、測定され得る。簡単に説明すると、試験されるペプチドは、マイクロタイタープレートの壁を覆っている。上記壁を洗浄しかつブロッキングした後に、アレルギーの個体の血清または血漿からなる抗体溶液が、上記壁内においてインキュベートされる。当該アレルギーの個体は、試験されるペプチドまたはペプチドが由来するタンパク質にさらされている。通常、上記血漿は、インキュベーション前にＩｇＧが枯渇させられている。しかし、高い特異性を有する抗ＩｇＥ抗体が使用される場合には、枯渇は必須ではない。さらに、特定の免疫療法を受けていない個体は、いくつかの場合において、問題のアレルゲンに特異的なＩｇＧ抗体をほとんど検出不可能な状態である。標識された２次抗体が、上記壁内に加えられ、かつインキュベートされる。それから、ＩｇＥの結合量が、定量化され、かつ未処置の精製Ａｍｂ ａ １タンパク質によって結合されるＩｇＥの量と比較される。代替可能に、ペプチド結合活性は、ウエスタンブロッティング分析によって測定され得る。例えば、試験されるペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたポリアクリルアミドゲルに流される。それから、ペプチドは、ニトロセルロースに転写され、続いてアレルギー患者からの血清とインキュベートされる。それから、標識された２次抗体とのインキュベーションの後に、ＩｇＥの結合量が測定され、かつ定量化される。
【００１６】
ペプチドのＩｇＥ結合活性の測定に使用され得る他のアッセイは、競合ＥＬＩＳＡアッセイである。簡単に説明すると、ＩｇＥ抗体のプールが、ブタクサ花粉アレルギー個体から得られた血漿または血清を組み合わせることによって生成される。当該血漿または血清は、直接的ＥＬＩＳＡによって未処置のＡｍｂ ａ １とＩｇＥ反応性を有していることを示されている。このプールは、未処置のＡｍｂ ａ １に対するＩｇＥの結合を試験されるペプチドと比較するための、ＥＬＩＳＡ競合アッセイに使用される。未処置のＡｍｂ ａ １タンパク質および試験されるペプチドについてのＩｇＥ結合は、測定され、かつ定量化される。
【００１７】
さらに、本発明のペプチドは、マスト細胞または好塩基球からの媒介物質（例えば、ヒスタミン）の放出を生じないことが好ましい。ＩｇＥと結合するペプチドが媒介物質の放出を生じるか否かを測定するために、ヒスタミン放出アッセイが、標準的な試薬および手順を用いて実施され得る。簡単に説明すると、試験されるペプチドの緩衝化溶液は、アレルギー患者から得られた、等容積の完全なヘパリン添加血液と混合される。混合およびインキュベーションの後に、細胞がペレット化される。そして、上清が、例えば放出されたヒスタミンの量を測定するための放射免疫測定を用いて、処理されかつ分析される。
【００１８】
本発明の分子は、本発明のペプチドの２つ以上をあらゆる組み合わせにおいて備え得る。これらのペプチドは、互いに化学的に接合され得るか、または組み換え技術によって融合され得る。当該分子は、少なくとも２、３、４、５、７、１０、１５、２０のペプチド備え得る。
【００１９】
本発明の少なくとも１つのペプチドは、当該ペプチドをコードする配列を有する核酸を用いて形質転換された宿主細胞において、組み換えＤＮＡ技術によって、生成され得る。また、本発明の単離されたペプチドは、化学合成によって生成され得る。もちろん、タンパク質アレルゲンの化学的切断または酵素的切断によって、ペプチドを生成することも可能である。
【００２０】
ペプチドが組み換え技術によって生成される場合に、本発明の核酸（または上記ペプチド（または当該ペプチドの機能的な等価物）をコードする配列を有する核酸の等価物）を用いて形質転換された宿主細胞は、当該細胞にとって好適な培地において培養される。ペプチドは、当該技術において公知のペプチドおよびタンパク質を精製する技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から精製され得る。当該精製する技術としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動または当該ペプチドに特異的な抗体を用いた免疫精製が挙げられる。本発明の単離されたペプチドは、組み換えＤＮＡ技術によって生成された場合に、細胞由来の物質または培養培地を実質的に含んでいないか、または化学的に合成された場合に、化学的な前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含んでいないか、または化学的切断もしくは酵素的切断によって生成された場合に、他の物質もしくは試薬を含んでいない。
【００２１】
また、本発明のペプチドは、アミノ酸置換、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加によって改変され得る。したがって、本発明のペプチドは、配列番号１〜１３９のアミノ酸配列の少なくとも７アミノ酸残基を備えている。また、本発明の範囲には、１２アミノ酸残基を超えるペプチドが包含される。ここで、これらの付加的な残基は、未処置のＡｍｂ ａ １分子から取得され得、かつ未処置のＡｍｂ ａ １分子、無作為のアミノ酸または他のペプチドもしくはタンパク質において当該ペプチドと隣接して見られ得る。しかし、これらの改変されたペプチド（バリアント）は、未修飾のペプチドと類似の特性を示すか、または同一の特性さえも示す。特に、免疫原性の特性は、実質的に同一であるべきである。これは、これらの改変されたペプチドを対象にする抗体がまた、配列番号１〜１３９のアミノ酸配列を有するペプチドと結合することを意味する。
【００２２】
本発明において使用されるときに、“ペプチド”は、当該ペプチドが得られるタンパク質のアミノ酸配列の全体より少ないアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を指す。また、“ペプチド”という用語は、ペプチドの機能的な等価物もしくはバリアント、またはペプチドのあらゆる断片もしくは部分を指す。ペプチドの“機能的な等価物”は、同じかもしくは増強されたＭＨＣ結合能を有するペプチド、同じＴ細胞の亜集団を刺激可能なペプチド、Ｔ細胞応答（例えば、刺激（増殖またはサイトカイン分泌））の同じかもしくは増強された誘導能を有するペプチド、少なくとも同程度に低下したＩｇＥ結合を有するペプチド、およびＡｍｂ ａ １から直接に得られたペプチドと少なくとも同じ最小レベルのＩｇＥ合成刺激活性を誘導するペプチドを含む。最小のＩｇＥ刺激活性は、未処置の精製ブタクサ花粉アレルゲンによって誘発されるＩｇＥ産生量よりも少ない、ＩｇＥ合成刺激活性を指す。本発明のペプチドおよびこれらの機能的な等価物は、６〜５０、好ましくは７〜４５、より好ましくは８〜４０、さらに好ましくは９〜３５、特に１０〜３０のアミノ酸残基からなることが好ましい。本発明のペプチドの“機能的な等価物”は、上記ペプチドのＣ末端および／またはＮ末端において少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基をさらに備え得る。当該少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基は、連結基（例えば、システイン）として機能し得るか、または野生型Ａｍｂ ａ １において当該ペプチドと隣接して見られ得る。
【００２３】
本明細書において使用されるときに、“バリアント”という用語は、通常に関連する他のポリペプチドと１つ以上のアミノ酸残基だけ異なっている、アミノ酸配列を指す。バリアントは、“保存的な”変更を有し得る。ここで、置換されたアミノ酸は、類似の構造的特性または類似の化学的特性を有する。保存的なアミノ酸置換の１種は、類似の側鎖を有する残基が交換可能であることを指す。例えば、脂肪族の側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族−水酸基の側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族の側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性の側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；かつ硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。保存的なアミノ酸置換の好ましい群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。保存的な変更よりはまれに、バリアントは“非保存的な”変更を有し得る（例えば、トリプトファンとのグリシンの置換）。また、類似のより少ない変異としては、アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方が挙げられる。本発明のペプチドおよび分子の好ましいバリアントは、１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満の変更（置換、欠失および挿入のいずれか）を有する。
【００２４】
本発明の他の局面は、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、かつブタクサ花粉アレルゲンから得られるペプチドに関する。
【００２５】
本発明の他の局面は、本発明のペプチドの少なくとも１つ、およびＡｍｂ ａ １以外の免疫原から得られた第２のペプチドの少なくとも１つを備えるペプチドに関する。
【００２６】
本発明の分子は、Ａｍｂ ａ １に由来しない１つ以上の他の分子と、接合され得るか、化学的に結合され得るか、または融合され得る。当該分子は、例えば、本発明のブタクサ花粉アレルゲンペプチドおよび（例えば細菌起源またはウイルス起源の）上記第２の免疫原に対する免疫応答を誘導する、ワクチンとして使用され得る。
【００２７】
本発明のペプチドなどの小分子（ハプテン）に対する抗体を誘発するために、これらの小分子は、担体に結合（例えば、接合）され得る。この結合は、免疫原性のハプテンを作り出す。免疫原性は、個体に注入された後に抗体が生成されることを意味する。担体タンパク質に対するハプテンの結合は、しばしば共有結合的であるが、しかし、当該結合は、イオン性であり得るか、またはハプテンおよび担体を架橋する化学的構成要素を介してもたらされ得る。担体は典型的にタンパク質である。しかし、担体はまた、単量体または重合体の形態における糖および脂質を含有し得る。
【００２８】
本発明に係る免疫原は、好ましくはアレルゲンである。当該アレルゲンは、Ａｍｂ ａ ２、Ａｍｂ ａ ３、Ａｍｂ ａ ５、Ａｍｂ ａ ６、Ａｍｂ ａ ７、Ａｍｂ ａ ８、Ａｍｂ ａ ９、Ａｍｂ ａ １０、Ａｍｂ ｔ ５、Ａｒｔ ｖ １、Ａｒｔ ｖ ２、Ａｒｔ ｖ ３、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｒｔ ｖ ５、Ａｒｔ ｖ ６、Ｈｅｌ ａ １、Ｈｅｌ ａ ２、Ｈｅｌ ａ ３、Ｍｅｒ ａ １、Ｃｈｅ ａ １、Ｃｈｅ ａ ２、Ｃｈｅ ａ ３、Ｓａｌ ｋ １、Ｃａｔ ｒ １、Ｐｌａ ｌ １、Ｈｕｍ ｊ １、Ｐａｒ ｊ １、Ｐａｒ ｊ ２、Ｐａｒ ｊ ３、Ｐａｒ ｏ １、Ｃｙｎ ｄ １、Ｃｙｎ ｄ ７、Ｃｙｎ ｄ １２、Ｃｙｎ ｄ １５、Ｃｙｎ ｄ ２２ｗ、Ｃｙｎ ｄ ２３、Ｃｙｎ ｄ ２４、Ｄａｃ ｇ １、Ｄａｃ ｇ ２、Ｄａｃ ｇ ３、Ｄａｃ ｇ ５、Ｆｅｓ ｐ ４ｗ、Ｈｏｌ ｌ １、Ｌｏｌ ｐ １、Ｌｏｌ ｐ ２、Ｌｏｌ ｐ ３、Ｌｏｌ ｐ ５、Ｌｏｌ ｐ １１、Ｐｈａ ａ １、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２、Ｐｈｌ ｐ １３、Ｐｏａ ｐ １、Ｐｏａ ｐ ５、Ｓｏｒ ｈ １、Ｐｈｏ ｄ ２、Ａｌｎ ｇ １、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ６、Ｂｅｔ ｖ ７、Ｃａｒ ｂ １、Ｃａｓ ｓ １、Ｃａｓ ｓ ５、Ｃａｓ ｓ ８、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｃｏｒ ａ ９、Ｃｏｒ ａ １０、Ｃｏｒ ａ １１、Ｑｕｅ ａ １、Ｆｒａ ｅ １、Ｌｉｇ ｖ １、Ｏｌｅ ｅ １、Ｏｌｅ ｅ ２、Ｏｌｅ ｅ ３、Ｏｌｅ ｅ ４、Ｏｌｅ ｅ ５、Ｏｌｅ ｅ ６、Ｏｌｅ ｅ ７、Ｏｌｅ ｅ ８、Ｏｌｅ ｅ ９、Ｏｌｅ ｅ １０、Ｓｙｒ ｖ １、Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｒｙ ｊ ２、Ｃｕｐ ａ １、Ｃｕｐ ｓ １、Ｃｕｐ ｓ ３ｗ、Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ａ ２、Ｊｕｎ ａ ３、Ｊｕｎ ｏ ４、Ｊｕｎ ｓ １、Ｊｕｎ ｖ １、Ｐｌａ ａ １、Ｐｌａ ａ ２、Ｐｌａ ａ ３、Ａｃａ ｓ １３、Ｂｌｏ ｔ １、Ｂｌｏ ｔ ３、Ｂｌｏ ｔ ４、Ｂｌｏ ｔ ５、Ｂｌｏ ｔ ６、Ｂｌｏ ｔ １０、Ｂｌｏ ｔ １１、Ｂｌｏ ｔ １２、Ｂｌｏ ｔ １３、Ｂｌｏ ｔ １９、Ｄｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ １０、Ｄｅｒ ｆ １１、Ｄｅｒ ｆ １４、Ｄｅｒ ｆ １５、Ｄｅｒ ｆ １６、Ｄｅｒ ｆ １７、Ｄｅｒ ｆ １８ｗ、Ｄｅｒ ｍ １、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ６、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ ２０、Ｄｅｒ ｐ ２１、Ｅｕｒ ｍ ２、Ｅｕｒ ｍ １４、Ｇｌｙ ｄ ２，Ｌｅｐ ｄ １、Ｌｅｐ ｄ ２、Ｌｅｐ ｄ ５、Ｌｅｐ ｄ ７、Ｌｅｐ ｄ １０、Ｌｅｐ ｄ １３、Ｔｙｒ ｐ ２、Ｔｙｒ ｐ １３、Ｂｏｓ ｄ ２、Ｂｏｓ ｄ ３、Ｂｏｓ ｄ ４、Ｂｏｓ ｄ ５、Ｂｏｓ ｄ ６、Ｂｏｓ ｄ ７、Ｂｏｓ ｄ ８、Ｃａｎ ｆ １、Ｃａｎ ｆ ２、Ｃａｎ ｆ ３、Ｃａｎ ｆ ４、Ｅｑｕ ｃ １、Ｅｑｕ ｃ ２、Ｅｑｕ ｃ ３、Ｅｑｕ ｃ ４、Ｅｑｕ ｃ ５、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ５ｗ、Ｆｅｌ ｄ ６ｗ、Ｆｅｌ ｄ ７ｗ、Ｃａｖ ｐ １、Ｃａｖ ｐ ２、Ｍｕｓ ｍ １、Ｒａｔ ｎ １、Ａｌｔ ａ １、Ａｌｔ ａ ３、Ａｌｔ ａ ４、Ａｌｔ ａ ５、Ａｌｔ ａ ６、Ａｌｔ ａ ７、Ａｌｔ ａ ８、Ａｌｔ ａ １０、Ａｌｔ ａ １２、Ａｌｔ ａ １３、Ｃｌａ ｈ ２、Ｃｌａ ｈ ５、Ｃｌａ ｈ ６、Ｃｌａ ｈ ７、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｌａ ｈ ９、Ｃｌａ ｈ １０、Ｃｌａ ｈ １２、Ａｓｐ ｆｌ １３、Ａｓｐ ｆ １、Ａｓｐ ｆ ２、Ａｓｐ ｆ ３、Ａｓｐ ｆ ４、Ａｓｐ ｆ ５、Ａｓｐ ｆ ６、Ａｓｐ ｆ ７、Ａｓｐ ｆ ８、Ａｓｐ ｆ ９、Ａｓｐ ｆ １０、Ａｓｐ ｆ １１、Ａｓｐ ｆ １２、Ａｓｐ ｆ １３、Ａｓｐ ｆ １５、Ａｓｐ ｆ １６、Ａｓｐ ｆ １７、Ａｓｐ ｆ １８、Ａｓｐ ｆ ２２ｗ、Ａｓｐ ｆ ２３、Ａｓｐ ｆ ２７、Ａｓｐ ｆ ２８、Ａｓｐ ｆ ２９、Ａｓｐ ｎ １４、Ａｓｐ ｎ １８、Ａｓｐ ｎ ２５、Ａｓｐ ｏ １３、Ａｓｐ ｏ ２１、Ｐｅｎ ｂ １３、Ｐｅｎ ｂ ２６、Ｐｅｎ ｃｈ １３、Ｐｅｎ ｃｈ １８、Ｐｅｎ ｃｈ ２０、Ｐｅｎ ｃ ３、Ｐｅｎ ｃ １３、Ｐｅｎ ｃ １９、Ｐｅｎ ｃ ２２ｗ、Ｐｅｎ ｃ ２４、Ｐｅｎ ｏ １８、Ｆｕｓ ｃ １、Ｆｕｓ ｃ ２、Ｔｒｉ ｒ ２、Ｔｒｉ ｒ ４、Ｔｒｉ ｔ １、Ｔｒｉ ｔ ４、Ｃａｎｄ ａ １、Ｃａｎｄ ａ ３、Ｃａｎｄ ｂ ２、Ｐｓｉ ｃ １、Ｐｓｉ ｃ ２、Ｃｏｐ ｃ １、Ｃｏｐ ｃ ２、Ｃｏｐ ｃ ３、Ｃｏｐ ｃ ５、Ｃｏｐ ｃ ７、Ｒｈｏ ｍ １、Ｒｈｏ ｍ ２、Ｍａｌａ ｆ ２、Ｍａｌａ ｆ ３、Ｍａｌａ ｆ ４、Ｍａｌａ ｓ １、Ｍａｌａ ｓ ５、Ｍａｌａ ｓ ６、Ｍａｌａ ｓ ７、Ｍａｌａ ｓ ８、Ｍａｌａ ｓ ９、Ｍａｌａ ｓ １０、Ｍａｌａ ｓ １１、Ｍａｌａ ｓ １２、Ｍａｌａ ｓ １３、Ｅｐｉ ｐ １、Ａｅｄ ａ １、Ａｅｄ ａ ２、Ａｐｉ ｍ １、Ａｐｉ ｍ ２、Ａｐｉ ｍ ４、Ａｐｉ ｍ ６、Ａｐｉ ｍ ７、Ｂｏｍ ｐ １，Ｂｏｍ ｐ ４、Ｂｌａ ｇ １、Ｂｌａ ｇ ２、Ｂｌａ ｇ ４、Ｂｌａ ｇ ５、Ｂｌａ ｇ ６、Ｂｌａ ｇ ７、Ｂｌａ ｇ ８、Ｐｅｒ ａ １、Ｐｅｒ ａ ３、Ｐｅｒ ａ ６、Ｐｅｒ ａ ７、Ｃｈｉ ｋ １０、Ｃｈｉ ｔ １−９、Ｃｈｉ ｔ １．０１、Ｃｈｉ ｔ １．０２、Ｃｈｉ ｔ ２．０１０１、Ｃｈｉ ｔ ２．０１０２、Ｃｈｉ ｔ ３、Ｃｈｉ ｔ ４、Ｃｈｉ ｔ ５、Ｃｈｉ ｔ ６．０１、Ｃｈｉ ｔ ６．０２、Ｃｈｉ ｔ ７、Ｃｈｉ ｔ ８、Ｃｈｉ ｔ ９、Ｃｔｅ ｆ １、Ｃｔｅ ｆ ２、Ｃｔｅ ｆ ３、Ｔｈａ ｐ １、Ｌｅｐ ｓ １、Ｄｏｌ ｍ １、Ｄｏｌ ｍ ２、Ｄｏｌ ｍ ５、Ｄｏｌ ａ ５、Ｐｏｌ ａ １、Ｐｏｌ ａ ２、Ｐｏｌ ａ ５、Ｐｏｌ ｄ １、Ｐｏｌ ｄ ４、Ｐｏｌ ｄ ５、Ｐｏｌ ｅ １、Ｐｏｌ ｅ ５、Ｐｏｌ ｆ ５、Ｐｏｌ ｇ ５、Ｐｏｌ ｍ ５、Ｖｅｓｐ ｃ １、Ｖｅｓｐ ｃ ５、Ｖｅｓｐ ｍ １、Ｖｅｓｐ ｍ ５、Ｖｅｓ ｆ ５、Ｖｅｓ ｇ ５、Ｖｅｓ ｍ １、Ｖｅｓ ｍ ２、Ｖｅｓ ｍ ５、Ｖｅｓ ｐ ５、Ｖｅｓ ｓ ５、Ｖｅｓ ｖｉ ５、Ｖｅｓ ｖ １、Ｖｅｓ ｖ ２、Ｖｅｓ ｖ ５、Ｍｙｒ ｐ １、Ｍｙｒ ｐ ２、Ｓｏｌ ｇ ２、Ｓｏｌ ｇ ４、Ｓｏｌ ｉ ２、Ｓｏｌ ｉ ３、Ｓｏｌ ｉ ４、Ｓｏｌ ｓ ２、Ｔｒｉａ ｐ １、Ｇａｄ ｃ １、Ｓａｌ ｓ １、Ｂｏｓ ｄ ４、Ｂｏｓ ｄ ５、Ｂｏｓ ｄ ６、Ｂｏｓ ｄ ７、Ｂｏｓ ｄ ８、Ｇａｌ ｄ １、Ｇａｌ ｄ ２、Ｇａｌ ｄ ３、Ｇａｌ ｄ ４、Ｇａｌ ｄ ５、Ｍｅｔ ｅ １、Ｐｅｎ ａ １、Ｐｅｎ ｉ １、Ｐｅｎ ｍ １、Ｐｅｎ ｍ ２、Ｔｏｄ ｐ １、Ｈｅｌ ａｓ １、Ｈａｌ ｍ １、Ｒａｎ ｅ １、Ｒａｎ ｅ ２、Ｂｒａ ｊ １、Ｂｒａ ｎ １、Ｂｒａ ｏ ３、Ｂｒａ ｒ １、Ｂｒａ ｒ ２、Ｈｏｒ ｖ １５、Ｈｏｒ ｖ １６、Ｈｏｒ ｖ １７、Ｈｏｒ ｖ ２１、Ｓｅｃ ｃ ２０、Ｔｒｉ ａ １８、Ｔｒｉ ａ １９、Ｔｒｉ ａ ２５、Ｔｒｉ ａ ２６、Ｚｅａ ｍ １４、Ｚｅａ ｍ ２５、Ｏｒｙ ｓ １、Ａｐｉ ｇ １、Ａｐｉ ｇ ４、Ａｐｉ ｇ ５、Ｄａｕ ｃ １、Ｄａｕ ｃ ４、Ｃｏｒ ａ １．０４、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｆｒａ ａ ３、Ｆｒａ ａ ４、Ｍａｌ ｄ １、Ｍａｌ ｄ ２、Ｍａｌ ｄ ３、Ｍａｌ ｄ ４、Ｐｙｒ ｃ １、Ｐｙｒ ｃ ４、Ｐｙｒ ｃ ５、Ｐｅｒｓ ａ １、Ｐｒｕ ａｒ １、Ｐｒｕ ａｒ ３、Ｐｒｕ ａｖ １、Ｐｒｕ ａｖ ２、Ｐｒｕ ａｖ ３、Ｐｒｕ ａｖ ４、Ｐｒｕ ｄ ３、Ｐｒｕ ｄｕ ４、Ｐｒｕ ｐ ３、Ｐｒｕ ｐ ４、Ａｓｐａ ｏ １、Ｃｒｏ ｓ １、Ｃｒｏ ｓ ２、Ｌａｃ ｓ １、Ｖｉｔ ｖ １、Ｍｕｓ ｘｐ １、Ａｎａ ｃ １、Ａｎａ ｃ ２、Ｃｉｔ ｌ ３、Ｃｉｔ ｓ １、Ｃｉｔ ｓ ２、Ｃｉｔ ｓ ３、Ｌｉｔ ｃ １、Ｓｉｎ ａ １、Ｇｌｙ ｍ １、Ｇｌｙ ｍ ２、Ｇｌｙ ｍ ３、Ｇｌｙ ｍ ４、Ｖｉｇ ｒ １、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ４、Ａｒａ ｈ ５、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ ７、Ａｒａ ｈ ８、Ｌｅｎ ｃ １、Ｌｅｎ ｃ ２、Ｐｉｓ ｓ １、Ｐｉｓ ｓ ２、Ａｃｔ ｃ １、Ａｃｔ ｃ ２、Ｃａｐ ａ １ｗ、Ｃａｐ ａ ２、Ｌｙｃ ｅ １、Ｌｙｃ ｅ ２、Ｌｙｃ ｅ ３、Ｓｏｌａ ｔ １、Ｓｏｌａ ｔ ２、Ｓｏｌａ ｔ ３、Ｓｏｌａ ｔ ４、Ｂｅｒ ｅ １、Ｂｅｒ ｅ ２、Ｊｕｇ ｎ １、Ｊｕｇ ｎ ２、Ｊｕｇ ｒ １、Ｊｕｇ ｒ ２、Ｊｕｇ ｒ ３、Ａｎａ ｏ １、Ａｎａ ｏ ２、Ａｎａ ｏ ３、Ｒｉｃ ｃ １、Ｓｅｓ ｉ １、Ｓｅｓ ｉ ２、Ｓｅｓ ｉ ３、Ｓｅｓ ｉ ４、Ｓｅｓ ｉ ５、Ｓｅｓ ｉ ６、Ｃｕｃ ｍ １、Ｃｕｃ ｍ ２、Ｃｕｃ ｍ ３、Ｚｉｚ ｍ １、Ａｎｉ ｓ １、Ａｎｉ ｓ ２、Ａｎｉ ｓ ３、Ａｎｉ ｓ ４、Ａｒｇ ｒ、Ａｓｃ ｓ １、Ｃａｒ ｐ １、Ｄｅｎ ｎ １、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６．０１、Ｈｅｖ ｂ ６．０２、Ｈｅｖ ｂ ６．０３、Ｈｅｖ ｂ ７．０１、Ｈｅｖ ｂ ７．０２、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２、Ｈｅｖ ｂ １３、Ｈｏｍ ｓ １、Ｈｏｍ ｓ ２、Ｈｏｍ ｓ ３、Ｈｏｍ ｓ ４、Ｈｏｍ ｓ ５およびＴｒｉｐ ｓ １からなる群から選択されることが好ましい。
【００２９】
上記アレルゲンから得られる他のアレルゲンまたはペプチドに対して、ブタクサ花粉アレルゲンＡｍｂ ａ １から得られる本発明のペプチドを、融合および／または接合することが特に好ましい。そのような融合タンパク質／融合ポリペプチド／融合ペプチドまたはタンパク質接合物／ポリペプチド接合物／ペプチド接合物は、ワクチンまたは診断に使用する場合に有用である。
【００３０】
本発明の他の局面は、本発明に係るペプチドまたは分子をコードする核酸分子に関する。
【００３１】
本発明の核酸分子は、例えば、当該核酸分子によってコードされるペプチド／ポリペプチド／タンパク質の組み換え生成に使用され得る。さらに、それらはまた、治療的局面（例えば、遺伝子療法、細胞療法）に使用され得る。
【００３２】
本発明の他の局面は、本発明に係る核酸分子を備えるベクターに関する。
【００３３】
本発明の核酸分子は、ベクターに導入され得る。ベクターは、本発明のペプチドもしくは分子の組み換え生成、または治療的局面に使用され得る。
【００３４】
本明細書において使用されるときに、“ベクター”は、プラスミド、コスミドならびにウイルスＤＮＡおよびファージＤＮＡを指す。本発明に係る核酸分子を備えるプラスミドは、当該核酸分子と隣り合って、例えば、複製開始点、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー、栄養要求マーカー）、マルチクローニングサイト、当該核酸分子と作動可能に連結されたプロモータ領域および／または宿主のゲノムにベクターもしくはこれらの一部を相同組み込みする配列伸張鎖を含み得る。
【００３５】
本発明のベクターは、上記核酸分子と作動可能に連結されたプロモータをさらに備えて、したがって発現カセットを生じることが好ましい。
【００３６】
本発明の発現カセットは、プロモータおよび本発明のペプチドをコードする核酸分子を備える。プロモータは、本発明の核酸分子の５’末端（上流）に配置されていることが好ましい。発現カセットに使用されるプロモータは、当該プロモータがそれぞれの宿主によって制御され得るものであれば、あらゆるプロモータであり得る。
【００３７】
本発明のさらなる局面は、本発明に係る少なくとも１つの分子および／または少なくとも１つのペプチドを備えるワクチン調合物に関する。
【００３８】
配列番号１〜１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、かつブタクサ花粉アレルゲンＡｍｂ ａ １から得られる少なくとも１つのペプチドを備える、本発明のペプチドおよび／または分子は、ワクチン調合物に使用され得る。これらのペプチドが、ブタクサ花粉アレルゲンＡｍｂ ａ １に対するＴ細胞応答を誘発可能であるので、ワクチン調合物は、ブタクサ花粉アレルギーおよびブタクサ花粉アレルゲンと交差反応するアレルギー（例えば、ヨモギ花粉）の脱感作、予防または処置に使用され得る。ＩｇＥ結合活性の欠如に起因して、アレルギー性反応が上記ワクチンによって誘発されないか、または実質的に誘発されないので、ペプチドはワクチンに使用する場合に特に有利である。本発明のワクチン調合物は、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つの、より好ましくは少なくとも３つの本発明のペプチドを備え得る。
【００３９】
脱感作されるべき個体に対する本発明の治療的組成物の投与は、アレルゲンに対する個体の感受性を低下させる（すなわち、アレルギー反応を低下させる）ために有効な用量および期間において、公知の手法を用いて実施され得る。治療的組成物の有効量は、Ａｍｂ ａ １に対する個体の感受性の程度、年齢、性別および個体の体重、ならびにタンパク質またはこれらの断片による個体における抗原反応の誘発能といった要因にしたがって変わる。活性な化合物（すなわち、タンパク質またはこれらの断片）は、好都合な方法において投与される。当該方法は、例えば、注入（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮滴用、または直腸投与である。投与経路に依存して、活性な化合物は、酵素、酸、当該化合物を不活化し得る他の天然の条件（後述を参照すればよい）の作用から当該化合物を保護する物質に被覆され得る。例えば、単回投与ごとに、好ましくは約０．０５μｇ〜１０００μｇ、より好ましくは約０．１μｇ〜１０００μｇの活性な化合物（すなわち、タンパク質またはこれらの断片）が、注入によって投与され得る。投与計画は、最適な治療反応を提供するために調節され得る。例えば、治療状況の緊急性によって示されるように、種々の分割量が毎日投与され得るか、または単回の投与量が減らされ得る。
【００４０】
もちろん、本発明に係るペプチドまたは分子に対して結合された抗体を提供することも可能であり、かつ当該抗体は本発明の範囲内にある。また、当該抗体は、ワクチン調合物において使用され得る。
【００４１】
本発明に係る抗体としては、これらに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片および上述のあらゆるエピトープ結合断片が挙げられる。さらに、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）であると見做される。本発明の免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＤ型、ＩｇＡ型およびＩｇＹ型、免疫グロブリン分子のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスに属することが好ましい。
【００４２】
ポリクローナル抗体は、好ましくは補佐剤を用いて、ヒト以外の哺乳類に対して本発明のポリペプチドを投与すること、およびこれによって生じた血清を回収することによって調製され得る。長期間にわたって繰り返し注入することによって、高い力価を得ることができる。抗原の誘導に使用され得る哺乳類の種に特に限定はないが、ウサギまたはテンジクネズミを使用することが一般的に好ましいが、ウマ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ラット、ウシ、ヒツジ、ラクダなども使用され得る。抗原の生成において、本発明の免疫原の一定量が、例えば、好適な濃度にまで生理食塩水溶液を用いて希釈され、かつこれによって生じた希釈溶液が、例えば懸濁液を調製するための完全フロインドアジュバント、またはミネラルゲルとともに混合される。ミネラルゲルは、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性剤（例えば、リソレクチン、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ））、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および見込みのある有用なヒト免疫賦活剤（例えば、ＢＣＧ（ウシ型弱毒結核菌）およびコリネバクテリウム パルヴム）である。懸濁液および混合物は、単回投与ごとに約５０μｇ〜約２５００μｇの本発明のポリペプチドを用いて哺乳類（例えば、ウサギ）に対して、例えば腹腔内に投与される。懸濁液は、免疫をもたらすために、２〜３ヶ月以下、好ましくは約１ヶ月の期間にわたって約２週間ごとに投与されることが好ましい。抗体は、最後の投与から１〜２週間が経過した後に免疫した動物から血液を採取すること、血液を遠心分離することおよび血液から血清を単離することによって回収される。
【００４３】
モノクローナル抗体は、例えば、ヒトまたはマウス起源のものであり得る。マウスモノクローナル抗体は、Kohler and Milsteinの方法(Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256 (1975) 495)によって、例えば適切なマウスの骨髄腫細胞株との超免疫化マウスの脾臓細胞の融合によって、調製され得る。
【００４４】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体の製造方法は、当該技術において公知である。例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985)；Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986)；Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202；米国特許第５，８０７，７１５号明細書；米国特許第４，８１６，５６７号明細書および米国特許第４，８１６，３９７号明細書を参照すればよい。
【００４５】
ヒト化抗体は、ヒト以外の種の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）およびヒト免疫グロブリン分子のフレームワーク領域を有し、所望の抗原と結合するヒト以外の種の抗体から得られる抗体分子である。ヒトのフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合性を変更させるために、好ましくは向上させるために、ＣＤＲのドナー抗体から得られる対応する残基としばしば置換される。これらのフレームワーク置換は、当該分野において公知の方法によって確認される。当該公知の方法は、例えば、抗原結合性にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較である（例えば、Queen et alの米国特許第５，５８５，０８９号明細書；Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)を参照すればよい）。抗体は当該技術において知られる種々の技術を用いてヒト化され得る。抗体のヒト化に使用される技術としては、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；米国特許第５，５３０，１０１；および米国特許第５，５８５，０８９号明細書）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）もしくは表面形成（欧州特許第５９２，１０６号明細書；欧州特許第５１９，５９６号明細書；Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)；Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)；Roguska. et al., PNAS 91:969-913 (1994)）、およびチェインシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）が挙げられる。
【００４６】
本発明に係る抗体は、アレルギー、特にイエダニアレルギーにかかっている個体の受動免疫化に有利に使用され得る。受動免疫に関して、抗体は、ＩｇＧまたはこれらの誘導体（例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体）であることが好ましい。さらに、この抗体はまた、個体の脱感作に使用され得る。
【００４７】
本発明のワクチン調合物は、少なくとも１つの薬学的に受容可能な補佐剤、賦形剤および／または担体をさらに備える。
【００４８】
好ましく使用される薬学的に受容可能な担体は、生理食塩水、縮物油、鉱油、カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液またはポリビニルピロリドン水溶液である。好適な補佐剤としては、これらに限定されないが、界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リソレクチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール）；ポリアミン（例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、カルボポル）；ペプチド（例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン）；油乳濁物；ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）など、および免疫刺激複合体が挙げられる。補佐剤は、例えば、植物油を含有する組成物もしくはミョウバン、イソマンニドモノオレエート（ｉｓｏｍａｎｎｉｄｅ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）、およびアルミニウムモノステアレートであり得る。他の好ましい補佐剤としては、生物適合性マトリクス材料の微粒子またはビーズが挙げられる。本発明の分子は、微粒子またはマイクロカプセルに組み込まれて、個体に対する抗原性物質のばくろを延長し得て、したがって長期にわたって個体を感染から保護し得る。また、免疫原は、リポソームに組み込まれ得るか、または多糖類および／またはワクチン調合物に使用する他の重合体と接合され得る。
【００４９】
また、本発明の一部は、本発明の分子、特にペプチドおよび担体、好ましくは生物学的に受容可能な担体、より好ましくは薬学的に受容可能な担体を備える組成物である。典型的な担体は、水、緩衝化水溶液および水性のアルコール混合物などといった水性担体である。薬学的な使用、特にヒトにおける使用に向けた担体を備える組成物は、薬理学的に受容可能な担体を備える。当該担体の例は当該技術において公知である。
【００５０】
そのようなワクチンは、注射剤として、液体溶液剤または液体懸濁剤のいずれかとして調製される。また、ワクチンは、注射の前に液体が調製され得る、溶液または懸濁液に好適な個体の形態の注射剤として調製され得る。ワクチンは、生理学的に受容可能な希釈剤の存在下において、あらゆる都合の良い経路（例えば、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、静脈内、経口、鼻腔内、乳房内）によって標的の動物に投与され得る。抗原は、単回の用量または複数回の用量において投与され得る。本発明のワクチンは、冷蔵状態、凍結した形態、凍結乾燥した形態において保存され得る。ワクチンは、対照と比べて防御的な免疫応答を誘発するための有効量において、個体に投与され得る。有効量は、例えば、年齢および大きさとともに変わり、当業者によって容易に決定され得る。また、初回投与および追加抗原投与にとって好適な計画は、一定ではないが、初回投与の後に続く接種または他の投与によって代表され得る。
【００５１】
本発明のワクチン調合物は、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９からなる群から選択されるペプチドを備える少なくとも１つの分子を含有する。
【００５２】
本発明の特に好ましい実施形態において、ワクチン調合物は、配列番号５２、配列番号６８、配列番号８６、配列番号９１、および配列番号１２６〜配列番号１３９からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを備える。ここで、さらに好ましい調合物の実施形態は、配列番号５２および配列番号１３７〜１３９からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを備える。これらの分子は、ブタクサアレルギーにかかっている患者において高いＴ細胞反応性を示す（上記ペプチドは、ブタクサアレルギーに対して感作されたアレルギー性の、９０％を超える個体によって認識される）。さらに、これらの分子／ペプチドは、単独に調合され得るか、またはあらゆる組み合わせにおいて単一の調合物に調合され得る。したがって、ワクチン調合物は、配列番号５２、配列番号６８、配列番号８６、配列番号９１、および配列番号１２６〜配列番号１３９からなる群から選択される、好ましくは配列番号５２および配列番号１３７〜１３９からなる群から選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのペプチドを備える。ペプチドの特に好ましい組み合わせは、配列番号５２および配列番号１３７；配列番号５２および配列番号１３８；配列番号５２および配列番号１３９；配列番号１３７および配列番号１３８；配列番号１３７および配列番号１３９；配列番号５２、配列番号１３７および配列番号１３８；配列番号５２、配列番号１３８および配列番号１３９；配列番号５２、配列番号１３７および配列番号１３９；配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９；配列番号５２、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９である。
【００５３】
本発明のさらに他の局面は、上記において概略を述べたようなワクチン調合物の製造に、本発明に係るペプチドおよび／または分子を使用することに関する。
【００５４】
ワクチン調合物は、個体におけるブタクサ花粉アレルギー、特にＡｍｂ ａ １によって引き起こされるアレルギーまたはブタクサ花粉アレルゲンと交差反応するアレルギーの予防または処置に使用される。
【００５５】
本発明の他の局面は、ブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性、または個体におけるブタクサアレルギーの診断に、本明細書に開示される分子を使用することに関する。
【００５６】
また、本発明の分子、特に本発明のペプチドは診断目的に使用され得る。本発明の分子およびペプチドは、Ａｍｂ ａ １と交差反応するアレルギーまたはブタクサアレルギーの検出および診断に使用され得る。例えば、これらのアレルギーの検出および診断は、（１）血中の構成要素（例えば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）を（複数の）ペプチドまたはタンパク質と結合させるために適切な条件において、Ａｍｂ ａ １の単離された１つもしくは複数のペプチドまたはＡｍｂ ａ １の単離されたα鎖もしくはβ鎖と、ブタクサアレルギーに対する感受性を評価される個体から得られる血液または血液からの生成物を組み合わせること、ならびに（２）そのような結合を生じる程度を測定することによってなされ得る。本発明のペプチドが使用され得るアレルギー性疾患にとっての他の診断方法としては、放射性アレルゲン吸着試験（ＲＡＳＴ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、表斜免疫測定（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ヒスタミン放出アッセイおよびＩｇＥ免疫ブロットが挙げられる。
【００５７】
本発明のさらなる局面は、ブタクサ花粉アレルゲンに対する個体の感受性を診断する方法に関する。当該方法は、以下の工程：
マスト細胞もしくは好塩基球および／または抗体、特にＩｇＥ分類の抗体を含有する、個体のサンプルを準備する工程、
本発明に係る分子／ペプチドと当該サンプルを接触させる工程、
上記分子との接触によって上記マスト細胞もしくは好塩基球から放出されたヒスタミンの量を測定する工程、および／または上記サンプルにおけるブタクサ花粉アレルゲン特異的抗体の量を測定する工程、
放出されたヒスタミンの上記量および／または上記サンプル中のブタクサ花粉アレルゲン特異的抗体の上記量が、ブタクサ花粉アレルギーもしくはブタクサ花粉アレルギーと交差反応を示すアレルギーにかかっていない個体から得られたサンプルと比べて増加している場合に、ブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性を診断する工程
を包含する。
【００５８】
本発明に係る方法に使用されるサンプルは、血液サンプル、涙液サンプル、唾液サンプルまたは鼻汁サンプルであることが好ましい。
【００５９】
本発明の更なる局面は、配列番号１４２または配列番号１４３のアミノ酸配列からなるＡｍｂ ａ １の単離されたα鎖、ならびに配列番号１４４または配列番号１４５のアミノ酸配列からなるＡｍｂ ａ １の単離されたβ鎖に関する。ここで、配列番号１４２のアミノ酸配列は、ＰＩＬＲＱＡＳＤＧＤ ＴＩＮＶＡＧＳＳＱＩ ＷＩＤＨＣＳＬＳＫＳ ＦＤＧＬＶＤＶＴＬＧ ＳＴＨＶＴＩＳＮＣＫ ＦＴＱＱＳＫＡＩＬＬ ＧＡＤＤＴＨＶＱＤＫ ＧＭＬＡＴＶＡＦＮＭ ＦＴＤＮＶＤＱＲＭＰ ＲＣＲＦＧＦＦＱＶＶ ＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹ ＡＩＧＧＳＳＡＰＴＩ ＬＣＱＧＮＲＦＬＡＰ ＤＤＱＩＫＫＮＶＬＡ ＲＴＧＴＧＡＡＥＳＭ ＡＷＮＷＲＳＤＫＤＬ ＬＥＮＧＡＩＦＶＴＳ ＧＳＤＰＶＬＴＰＶＱ ＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧ ＥＡＡＩＫＬＴＳＳＡ ＧＶＬＳＣＲＰＧＡＰ Ｃである。また、配列番号１４３のアミノ酸配列は、ＶＬＰＧＧＭＩＫＳＮ ＤＧＰＰＩＬＲＱＡＳ ＤＧＤＴＩＮＶＡＧＳ ＳＱＩＷＩＤＨＣＳＬ ＳＫＳＦＤＧＬＶＤＶ ＴＬＧＳＴＨＶＴＩＳ ＮＣＫＦＴＱＱＳＫＡ ＩＬＬＧＡＤＤＴＨＶ ＱＤＫＧＭＬＡＴＶＡ ＦＮＭＦＴＤＮＶＤＱ ＲＭＰＲＣＲＦＧＦＦ ＱＶＶＮＮＮＹＤＲＷ ＧＴＹＡＩＧＧＳＳＡ ＰＴＩＬＣＱＧＮＲＦ ＬＡＰＤＤＱＩＫＫＮ ＶＬＡＲＴＧＴＧＡＡ ＥＳＭＡＷＮＷＲＳＤ ＫＤＬＬＥＮＧＡＩＦ ＶＴＳＧＳＤＰＶＬＴ ＰＶＱＳＡＧＭＩＰＡ ＥＰＧＥＡＡＩＫＬＴ ＳＳＡＧＶＬＳＣＲＰ ＧＡＰＣである。また、配列番号１４４のアミノ酸配列は、ＡＥＧＶＧＥＩＬＰＳ ＶＮＥＴＲＳＬＱＡＣ ＥＡＹＮＩＩＤＫＣＷ ＲＧＫＡＤＷＥＮＮＲ ＱＡＬＡＤＣＡＱＧＦ ＡＫＧＴＹＧＧＫＷＧ ＤＶＹＴＶＴＳＮＬＤ ＤＤＶＡＮＰＫＥＧＴ ＬＲＦＡＡＡＱＮＲＰ ＬＷＩＩＦＫＮＤＭＶ ＩＮＬＮＱＥＬＶＶＮ ＳＤＫＴＩＤＧＲＧＶ ＫＶＥＩＩＮＧＧＬＴ ＬＭＮＶＫＮＩＩＩＨ ＮＩＮＩＨＤＶＫＶＬ ＰＧＧＭＩＫＳＮＤＧ Ｐである。また、配列番号１４５のアミノ酸配列は、ＡＥＧＶＧＥＩＬＰＳ ＶＮＥＴＲＳＬＱＡＣ ＥＡＹＮＩＩＤＫＣＷ ＲＧＫＡＤＷＥＮＮＲ ＱＡＬＡＤＣＡＱＧＦ ＡＫＧＴＹＧＧＫＷＧ ＤＶＹＴＶＴＳＮＬＤ ＤＤＶＡＮＰＫＥＧＴ ＬＲＦＡＡＡＱＮＲＰ ＬＷＩＩＦＫＮＤＭＶ ＩＮＬＮＱＥＬＶＶＮ ＳＤＫＴＩＤＧＲＧＶ ＫＶＥＩＩＮＧＧＬＴ ＬＭＮＶＫＮＩＩＩＨ ＮＩＮＩＨＤＶＫである。
【００６０】
Ａｍｂ ａ １は、２つの断片、α鎖（配列番号１４２または配列番号１４３）およびβ鎖（配列番号１４４）に実質的に分割され得る。意外にも両方の鎖が異なる免疫学的特性を示すことがわかった。Ａｍｂ ａ １のα鎖が低いＩｇＥ反応性を示す一方において、β鎖がＡｍｂ ａ １のＩｇＥエピトープのほとんどを含有している。
【００６１】
本発明のさらに他の局面は、本発明に係るＡｍｂ ａ １．３の単離されたα鎖およびＡｍｂ ａ １．３の単離されたβ鎖を備える薬学的調製物に関する。
【００６２】
本発明の他の局面は、個体におけるブタクサ花粉アレルギー、特にＡｍｂ ａ １によって引き起こされるアレルギーまたはブタクサ花粉アレルゲンと交差反応するアレルギーを処置する薬剤の製造に、本発明に係るＡｍｂ ａ １．３の単離されたα鎖およびＡｍｂ ａ １．３の単離されたβ鎖を使用することに関する。
【００６３】
本発明のさらなる局面は、個体におけるブタクサアレルギーもしくはブタクサ花粉アレルギーと交差反応するアレルギーの診断、またはブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性の診断に、本発明に係るＡｍｂ ａ １．３の単離されたα鎖およびＡｍｂ ａ １．３の単離されたβ鎖を使用することに関する。
【００６４】
本発明は、以下の図面および実施例によって例示されるが、これらに限定れるものではない。
【００６５】
図１は、８Ｍの尿素におけるニッケルキレートクロマトグラフィー（ＮＣＣ）を用いたｒＡｍｂ ａ １．３の精製を示す。サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシー染色を用いて分析された。精製画分は大きな凝集を示した。
【００６６】
図２は、組み換えＡｍｂ ａ １．３のＩｇＥドットブロット分析を示す。大腸菌において生成されたｒＡｍｂ ａ １．３は、上述のように精製され、かつニトロセルロース膜上にドット化された。１７人のブタクサ花粉アレルギー患者から得られた血清（１〜１７）は、試験され、かつｒＡｍｂ ａ １．３との非常に弱いＩｇＥ反応性を示したか、もしくはＩｇＥ反応性を示さなかった。同じ患者らは、ｎＡｍｂ ａ １との強いＩｇＥ反応性を示した。
【００６７】
図３は、精製された天然のＡｍｂ ａ １またはＡｍｂ ａ １．３を用いて、異なる濃度において刺激したＴＣＬを示す。最適濃度の値が示されている。Ｎ＝１３；ピアスン相関係数：０．９７９＊＊（ｐ＜０．０１）またはスピアマンのρ：０．９１２＊＊。
【００６８】
図４は、ＴＣＬ増殖アッセイにおけるアレルゲン力価測定（天然アレルゲンと対比した複数の組み換えアレルゲン（ｒＡｍｂ ａ １．３の異なるロット、ロットＬ１〜Ｌ４））の例を示す。ＳＴＡおよびＯＰＯは、２人の異なるブタクサアレルギー患者のそれぞれから得られたＴＣＬである。
【００６９】
図５は、ブタクサ抽出物およびｒＡｍｂ ａ １．３によってＴＣＬにおいて誘導される類似のサイトカイン産生を示す。
【００７０】
図６は、天然のＡｍｂ ａ １およびｒＡｍｂ ａ １．３によってＴＣＬおよびＴＣＣにおいて誘導される同等のサイトカイン産生を示す。
【００７１】
図７は、天然のＡｍｂ ａ １またはｒＡｍｂ ａ １．３を用いて誘導されたＴＣＬが類似のＴ細胞エピトープを認識することを示す。
【００７２】
図８は、Ａｍｂ ａ １．３の関連するＴ細胞活性化領域を示す。それぞれのエピトープを認識する患者の百分率が、３を超える刺激指標（ＳＩ＞３）および５を超える刺激指標（ＳＩ＞５）のそれぞれについて個別に分析された。
【００７３】
図９は、精製ｎＡｍｂ ａ １のＩｇＥ免疫ブロットを示す。ｎＡｍｂ ａ １が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、かつＰＶＤＦ膜上に電気ブロットされた。膜片は、ブタクサ花粉アレルギー患者から得られた血清を用いて（レーン１〜２９）か、または非アレルギーの提供者から得られた血清を用いて（レーンＣ）インキュベートされた。結合したＩｇＥは、125Ｉ−標識化ヤギ抗ヒトＩｇＥを用いて検出された。ブタクサ花粉感作患者は、オーストリア（レーン１〜１３）またはイタリア（レーン１４〜２９）において募られた。
【００７４】
図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＰＶＤＦ膜上への電気ブロットの後における、精製された天然のＡｍｂ ａ １のクーマシー染色を示す。プロセシングを受けていないｎＡｍｂ ａ １、α鎖およびβ鎖に対応するバンドは、Ｎ末端配列を得るためにエドマン分解にかけられた。
【００７５】
図１１は、プロセシングを受けていない天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【００７６】
図１２は、天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のα鎖のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【００７７】
図１３は、天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のβ鎖のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【００７８】
図１４は、Ａｍｂ ａ １アイソフォームならびにそれらのα鎖およびβ鎖の推定されるアミノ酸配列を示す。アイソフォームのＡｍｂ ａ １．１、Ａｍｂ ａ １．Ａｍｂ ａ １．２、Ａｍｂ ａ １．３、Ａｍｂ ａ １．４およびＡｍｂ ａ ２が、公開され（Rafnar et al., J. Biol. Chem. 266: 1229-1236, 1991）かつ特許された（米国特許第５，７７６，７６１号）。Ｒ２クローンが、抗Ａｍｂ ａ １の親和性精製ウサギ抗体を用いたブタクサ花粉ｃＤＮＡの花粉の免疫スクリーニングによって、研究室において単離された。そして、Ｒ２クローンは、タンパク質レベルにおいてＡｍｂ ａ １．３と同一である。下線が付された文字は、演算手順ＳｉｇｎａｌＰ（ HYPERLINK "http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/"http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）を用いて予測されたシグナルペプチドを表す。斜字体において表されているのは、Ｎ末端配列決定および天然のＡｍｂ ａ １の質量分析に基づく推定のβ鎖の配列である。斜字体および下線付きの文字は、Ｎ末端配列決定および天然のＡｍｂ ａ １の質量分析に基づく推定のα鎖の配列である（図１０〜１３；表４）。Ｎ末端配列分析によって、太字の配列が精製された天然のＡｍｂ ａ １調製においてタンパク質分解的に除かれた。
【００７９】
図１５は、Ａｍｂ ａ １アイソフォームの配列整合を示す。Ａｍｂ ａ １．１、、Ａｍｂ ａ １．２、Ａｍｂ ａ １．３およびＡｍｂ ａ ２のそれぞれがクローン化され、配列決定され、かつ公開された（Rafnar et al., J. Biol. Chem. 266: 1229-1236, 1991）。配列整合は、ソフトウェアＣｌｕｓｔａｗ（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl?page=npsa clustawl.html）を用いて生成された。図１４に示される推定される完全なアミノ酸配列は、整合に使用された。
【００８０】
図１６は、Ａｍｂ ａ １．３（Ｒ２クローン）の推定されるアミノ酸配列を示す。（ａ）Ｎ末端配列決定および精製された天然のＡｍｂ ａ １の質量分析（図１〜１３；表４を参照すればよい）からの情報に基づく推定のα鎖およびβ鎖。（ｂ）Ａｍｂ ａ １．３の組み換えのα鎖およびβ鎖を生成するために研究所において作製された第１のコンストラクト。（ｃ）２つの鎖の発現は、全長のＡｍｂ ａ １．３よりも良好であったが、得られた収量は低かった。さらに、α鎖からＴ細胞反応性のドメイン（四角の囲み、１７８〜１８９位のアミノ酸）を排除した。１７８〜１８９位のアミノ酸と対応するＴ細胞エピトープをα鎖に含めるために設計された、Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）。（ｄ）１７８〜１８９位のアミノ酸と対応するＴ細胞エピトープをα鎖に含めるために、かつ天然のＡｍｂ ａ １においてタンパク質分解的に除去されることが示されているＮ末端における最初の２０アミノ酸をβ鎖において排除するために設計された、Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン２）。
【００８１】
図１７は、大腸菌株ＢＬ２１およびＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳにおける、Ａｍｂ ａ １の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）の発現を示す。
【００８２】
図１８は、ニッケルカラム上における親和性精製後における、Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色を示す。α鎖およびβ鎖は、大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて高収率に得られた。精製された２つの鎖は、可溶性であり、かつ全長のＡｍｂ ａ １．３アレルゲンにともなう大きな問題であった凝集するあらゆる傾向を示さなかった。
【００８３】
図１９は、天然のＡｍｂ ａ １ならびにＡｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）のヒトＩｇＥを用いたＥＬＩＳＡを示す。
【００８４】
図２０は、Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）を用いたＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＬの増殖を示す。天然のＡｍｂ ａ １、異なる濃度の全長ｒＡｍｂ ａ １．３、ｒα鎖およびβ鎖が、刺激剤として使用された。ＴＣＬは、ｒＡｍｂ ａ １．３（Ａｍｂ）を用いて惹起された。
【００８５】
図２１は、全長のｒＡｍｂ ａ １．３、Ａｍｂ ａ １の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）を用いた、２つのＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＬの増殖応答を示す。ＴＣＬは、ｒＡｍｂ ａ １．３（Ａｍｂ）またはブタクサ花粉抽出物（ＲＷ）を用いて惹起された。
【００８６】
図２２は、Ａｍｂ ａ １．３における同定された関連するＴ細胞活性化領域を示す。１７／２６のエピトープは、Ａｍｂ ａ １のＣ末端領域に配置されている。したがって、上記α鎖およびβ鎖は、これらの関連するＴ細胞エピトープを含むように設計された。
【００８７】
〔実施例〕
（実施例１：Ａｍｂ ａ １をコードするｃＤＮＡの単離）
実施例１．１：ウサギ抗Ａｍｂ ａ １抗体の親和性精製
天然のＡｍｂ ａ １を用いて免疫したウサギからの血清は、当該技術において公知の通常の方法によって取得され得る。ブタクサ花粉ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングのために、Ａｍｂ ａ １特異的抗体は、親和性クロマトグラフィーによって精製された。ブタクサ花粉から精製された５ｍｇの天然のＡｍｂ ａ １は、ＣＮＢｒ活性化セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に対して結合させられた。ウサギ血清の結合後に、樹脂が洗浄され、かつ非常に特異性の高いＡｍｂ ａ １特異的抗体が、０．２Ｍのグリシン ｐＨ２．８を用いて溶出された。抗体は、直ちに中和され、かつｐＨ７．４の１×ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０．２４ｇのＫＨ2ＰＯ4、ＨＣｌを用いてｐＨ７．４に調節）に対して透析された。それから、精製された抗体は、免疫ブロッティングおよびライブラリスクリーニング実験に使用された。
【００８８】
実施例１．２：ブタクサ花粉ｃＤＮＡライブラリの構築および免疫スクリーニング
ブタクサ花粉ｃＤＮＡライブラリは、λ ＺＡＰ ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において構築された。精製されたウサギ抗Ａｍｂ ａ １抗体は、ブタクサ花粉ｃＤＮＡライブラリの４００，０００のプラーク（ｐｌａｑｕｅ）をスクリーニングするために使用された。４つの陽性Ａｍｂ ａ １クローンが単離され、かつＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターからのｐＢｌｕｅｓｃｒｐｔ ファージミドのインビボにおける切り出しに使用された。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４と名付けられたクローンは、ＤＮＡ配列決定に関して選抜された。ＤＮＡ配列決定は、フランキングプライマーＴ７およびＴ３を含む４つおよび５つのプライマーを用いた“プライマーウォーキング”技術によって実施された。Ｒ１およびＲ４のそれぞれは、５’末端において短く切断され、したがって本実験においてさらには使用されなかった。Ｒ２およびＲ３の両方の鎖は２回配列決定された。
【００８９】
実施例１．３：発現ベクターｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ−２へのクローニング
Ｒ２（Ａｍｂ ａ １．３）ｃＤＮＡは、発現ベクターｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ−２に連結された。クローニング手順に関して、２つの隣接するクローニングプライマーが構築された。完全なｃＤＮＡ配列は、推定されるシグナルペプチドをコードする７５ヌクレオチドだけ５’末端において切断された。以下のプライマー：Ｒａｇ−Ｎｃｏ−ｆｏｒｗａｒｄ：５'−ＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧ−ＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＣＣＴＴＣＡＧ−３'（配列番号１４０）およびＲａｇ−Ｘｈｏ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＧＧＣＡＴＧＡＧ−３’（配列番号１４１）が使用された。Ｎｃｏ ＩおよびＸｈｏ Ｉの制限酵素部位が、５’末端および３’末端に導入された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物は、制限酵素のＮｃｏ ＩおよびＸｈｏ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて消化され、かつベクターｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ−２のそれぞれの部位に対して連結された。生じたｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ−２／Ｒ２コンストラクトは、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ配列決定の手順（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にしたがって配列決定された。
【００９０】
実施例１．４：大腸菌における組み換え Ｒ２（Ａｍｂ ａ １）の発現
組み換えタンパク質発現は、コンストラクトｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ−２／Ｒ２を受容れている形質転換受容性の大腸菌株ＢＬ２１ ＤＥ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。形質転換体は、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上において選択され、単一の形質転換体コロニーが拾い上げられた。いくつかの小規模発現実験が実施され、かつ大規模タンパク質生成を試みる前に最適化された。培養培地（１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌのグリセロール、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび１．５ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．４に調節された）は、３％のオーバーナイト培養の条件において接種され、１５０μｇ／ｍＬのペニシリン （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）を有する培養培地において増殖させられた。醗酵は、１０ＬのＢｉｏｆｌｏｗ ３０００ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．）、３７℃、７％の飽和率の２００〜４００ｒｐｍの攪拌、および１．０のＯＤ600における０．４ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導の条件において実施された。細菌細胞（１０Ｌの培養液から６０〜８０ｇの湿重量の細胞）が、誘導から３時間後に遠心分離によって回収され、かつ１００ｍＬのＴｒｉｓ塩基、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨ未調節、１００ｍＬ／１ｇの細胞）に懸濁された。新たに溶解されたライソザイム（１００μｇ／１ｇの細胞）の添加および１時間にわたる室温におけるインキュベーションの後に、細胞は３回の凍結融解サイクルによって溶解された。可溶画分の分離が遠心分離によってなされ、かつ未処理の封入体が、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡを用いて２〜３回洗浄され、その後に５０％のエタノール、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０を用いて２回洗浄された。精製された封入体は、５００ｍＬの８Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０に溶解された。
【００９１】
実施例１．５：組み換えＲ２（Ａｍｂ ａ １．３）アレルゲンの精製
溶液は、製造者の手引書にしたがってＮｉＣｌ2を用いて帯電させた後に、直前の工程において説明された緩衝液を用いてあらかじめ平衡化した１５０ｍＬのＣｈｅｌａｔｉｏｎｇ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に乗せられた。クロマトグラフィーのすべての段階は、Ｂｉｏｐｉｌｏｔ ＦＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）において実施された。結合したタンパク質は、０〜３００ｍＭの範囲のイミダゾール直線勾配を用いて溶出された。画分の精製は、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。ほぼ純粋なＡｍｂ ａ １．３を含有する画分は、２ｍＭのＥＤＴＡを用いて安定化され、続いてＶｉｖａｆｌｏｗ ５０ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）におけるゲルろ過段階によって、５０ｍＬの容積まで濃縮されて調製された。ゲルろ過は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）カラム上において、８Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２ｍＭのＥＤＴＡにおいて実施された。純粋なＡｍｂ ａ １画分は、限外ろ過によって約３ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度にまでふたたび濃縮された。凍結乾燥の前にリフォールディング手順が実施された。リフォールディング手順において、ジスルフィド結合が、１０ｍＭのメルカプトエタノールの添加によって還元され、続いて１０００〜２０００倍の容積を有する５ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3に対する４℃における透析の間にふたたび酸化された。
【００９２】
実施例１．６：精製組み換えＡｍｂ ａ １のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および免疫ブロット分析
タンパク質は、１５％のアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および分子量基準ＲＰＮ ７５６（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたクーマシー染色分析された。アレルギー患者から得られた血清は、陽性のＩｇＥ反応性に関して試験された。ｒＡｍｂ ａ １およびｒＡｒｔ ｖ ６は、１５％（重量／重量）のポリアクリルアミドゲルにおいて分離され、かつＰＶＤＦ膜上に電気ブロッティング
された。ブロッキング緩衝液（それぞれ１Ｌに対して、７．５ｇのＮａＨ2ＰＯ4、５ｇのＢＳＡおよび５ｍＬのＴｗｅｅｎ ２０）を用いて非特異的タンパク質結合部位をブロッキングした後に、膜は、室温において６時間以上にわたって患者の血清（ブロッキング緩衝液に１：１０において希釈された）とともにインキュベートされた。膜は、少なくとも３０分間にわたってブロッキング緩衝液を用いて洗浄された後に、ブロッキング緩衝液に希釈された（１：４０）放射線標識［125Ｉ］抗ヒトＩｇＥ（ＲＡＳＴ、５□Ｃｉ、ＭｅｄＰｒｏ）とともに、オーバーナイトで室温においてインキュベートされた。第２の３０分間の洗浄の後に、膜は画像化プレート上に配置された。スクリーンは、少なくとも２４時間にわたって露光され、かつ検出用のＰｈｏｔｏＩｍａｇｅｒ Ｂａｓ １８００ ＩＩスキャナーおよび機器の指示ソフトウェア（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて現像された。
【００９３】
実施例１．７：Ａｍｂ ａ １アイソフォームをコードするｃＤＮＡクローン
ブタクサ花粉ライブラリから単離されたＲ２クローンおよびＲ３クローンは、完全であり、かつＡｍｂ ａ １アイソフォームにコードされた。推測されたＲ３のアミノ酸配列は、成熟Ａｍｂ ａ １．１アイソフォームと１つのアミノ酸において異なっていた。成熟Ａｍｂ ａ １．１の５０位におけるグリシンが、Ｒ３においてアラニンに交換されている。推測されたＲ２のアミノ酸配列は、Ａｍｂ ａ １．３アイソフォームと同一である。Ｒ２クローンは、ここに記載されているすべての実験に使用された。以下においてＲ２クローンをＡｍｂ ａ １．３と呼ぶ。
【００９４】
実施例１．８：Ａｍｂ ａ １．３の組み換え生成およびＩｇＥ結合活性
ＩｇＥ結合活性に関して、大腸菌において全長のｒＡｍｂ ａ １．３を生成する最初の試みは、希望を与えるものではなかった。何よりも、タンパク質分解性の切断が、大腸菌において生成されたｒＡｍｂ ａ １．３の精製の間に生じた。ｒＡｍｂ ａ １．３の収量は、１０Ｌの発酵培養液から約１５ｍｇのｒＡｍｂ ａ １．３であった。ｒＡｍｂ ａ １．３は、まったく封入体のみに見られ、したがってリフォールディング手順の使用が必要であった。しかし、全長のｒＡｍｂ ａ １．３の正確なリフォールディングは、困難であることが分かった。リフォールディングに関する異なる標準的な手法を用いた後に、最良の調製物は、ほとんどが不溶性の凝集体を構成した（図１を参照すればよい）。
【００９５】
精製手順の種々の変更および異なる安定化剤の種々の添加は、正しくフォールディングされた可溶性のタンパク質を生じなかった。非変性アッセイ（例えば、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ）において、ｒＡｍｂ ａ １．３は、ヒトＩｇＥと結合できなかった（図２）。還元および熱処理（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロッティングにとっての標準的な手法）の後にのみ、ｒＡｍｂ ａ １．３は、患者のＩｇＥと反応した。これらの結果は、上述のように生成されたｒＡｍｂ ａ １．３が、アレルギーの診断および治療に好適な試薬ではないことを明らかに証明した。したがって、完全なＩｇＥ結合活性を有する組み換え試薬を生成する他の方法が、実施例４に記載の通りに実施された。その低いＩｇＥ結合活性にもかかわらず、ｒＡｍｂ ａ １．３は、Ｔ細胞エピトープマッピングおよび増殖アッセイに首尾よく使用されたので、正しいフォールディングは、Ｔ細胞の認識に必須ではない。
【００９６】
（実施例２：Ａｍｂ ａ １のＴ細胞認識）
実施例２．１：患者
Ａｍｂ ａ １に対するＴ細胞応答は、確立されたインビトロにおける培養系（Jahn-Schmid et al., J. Immunol. 169: 6005-11, 2002; Jahn-Schmid et al., J. Allergy Clin. Immunol., 115: 399-404, 2005）を用いて、詳細に性質決定された。典型的な病歴、陽性の皮膚プリック試験およびブタクサ抽出物に関するＣＡＰ／ＲＡＳＴ試験を有する、臨床的に十分に規定される合計８５人の患者（ウィーンから７５人およびミラノから１０人）が含められた。
【００９７】
実施例２．２ＰＢＭＣ、Ａｍｂ ａ １特異的Ｔ細胞株（ＴＣＬ）およびＴ細胞クローン（ＴＣＣ）
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が、フィコール密度勾配遠心分離によって、アレルギー患者の末梢血から単離された。アレルゲン特異的なＴ細胞株（ＴＣＬ）およびＴ細胞クローン（ＴＣＣ）を生成するために、１．５×１０6のＰＢＭＣが、２４ウェルの平底培養プレート（コスター、ＵＳＡ）において、最適量（４μｇ／ｍｌ）のブタクサ抽出物またはヨモギ抽出物、またはｒＡｍｂ ａ １．３（１０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激された。５日後にヒトｒＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、ボーリンガー、マンハイム、ドイツ）が加えられ、かつ培養は、さらに７日間にわたって続けられた。それから、Ｔ細胞芽球が密度遠心分離によって単離された。Ｔ細胞芽球のほとんどは、ＩＬ−２および放射線照射を受けたＰＢＭＣを用いて増やされた。小数のＴ細胞芽球は、限界希釈によって単クローン性のＴ細胞株を確立するために使用された。放射線照射を受けた（６０Ｇｙ）２×１０5のＰＢＭＣ、０．２５％（容積／容積）のＰＨＡ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）およびｒＩＬ−２（４Ｕ／ウェル）の存在下における上述の培地を入れた、９６ウェルの丸底プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎｅ）に、０．３のＴ細胞／ウェルが播かれた。１４〜２１日後に、成長している微量培養物は、わずかな間隔を置いて、ｒＩＬ−２および放射線照射を受けたＰＢＭＣを用いて増やされた。ＴＣＣの特異性は、放射線照射を受けた異質遺伝子型ＰＢＭＣ、ＨＬＡ適合ＰＢＭＣまたは放射線照射を受けたＥＢＶ癌化の異質遺伝子型Ｂ細胞、ならびに５μｇ／ｍｌのＡｍｂ ａ １．３を用いた、増殖アッセイにおいて評価された。４８時間後に、トリチウムを含む（3Ｈ）−チミジンの細胞への取り込みが、１分ごとのカウント（ｃｐｍ）における増殖の測定に利用された。刺激指標（ＳＩ；ＴＣＣ＋自己のＡＰＣ＋抗原を含有する培養において得られたｃｐｍと、ＴＣＣおよびＡＰＣ単独を含有する培養において得られたｃｐｍとの間の比率）が＞１０であった場合に、応答は陽性と見做された。アレルゲン特異的ＴＣＣは、放射線照射を受けた自己のＡＰＣおよびアレルゲン、または異質遺伝子型の支持細胞およびｒＩＬ−２を用いた刺激の交互の転換によって増やされた。自己反応性に起因して異なる程度のバックグラウンド増殖を示したＰＢＭＣおよびＴＣＬに関して、＞３のＳＩまたはそれぞれ１０，０００ｄｐｍは、抗原特異性に関するカットオフ値（ｃｕｔ−ｏｆｆ）と見做された。
【００９８】
Ａｍｂ ａ １特異的なＴＣＬおよびＴＣＣは、Ａｍｂ ａ １．３のＴ細胞エピトープを同定するために使用された。Ｔ細胞株は、Ａｍｂ ａ １．３のＣ末端ペプチドを代表する１２１の合成ペプチド（１２０の１２ｍｅｒペプチドおよび１つの１３ｍｅｒのペプチド）の一群（Ｐｅｐｓｅｔ、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ、ドイツ）を用いて刺激された。ペプチドは、Ａｍｂ ａ １．３のアミノ酸配列にしたがって合成されており、かつ隣りあうペプチドと９アミノ酸残基だけ重複している（表１）。ペプチドは、刺激のために５μｇ／ｍｌの濃度において使用され、かつＴ細胞株の増殖は、４８時間後の3Ｈ−チミジンの取り込みによって測定された。ＴＣＬにおける自己反応性によって引き起こされるしばしば観察された高いバックグラウンドのために、少なくとも１０の刺激ペプチドを用いて（ペプチドは無毒である）観察されたｃｐｍの平均が、ＳＩの算出における陰性対照として使用された。本明細書を通して、刺激指標が少なくとも３．０であった場合に、ペプチドが１つのＴ細胞エピトープを備えていた。また、ＳＩ≧５．０を有する強い刺激ペプチドは、表２および３に示されている。
【００９９】
【表１】
【０１００】
【表２】
【０１０１】
実施例２．３：サイトカインの測定
Ｔ細胞は、洗浄され、かつ刺激物（５μｇ／ｍｌ）の存在下において４８時間にわたって放射線照射を受けた自己のＡＰＣとともにインキュベートされた。生じた上清におけるサイトカインレベルは、適合抗体対（Ｅｎｄｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いたＥＬＩＳＡ（感度の限界： ＩＬ−４：９ｐｇ／ｍｌ、ＩＦＮ−γ：９ｐｇ／ｍｌ）において測定された。ＴＣＣおよびＡＰＣ単独を含有する株が、陰性対照の役割を果たした。＞１０のＩＦＮ−γ／ＩＬ−４の割合を有するＴＣＣは、Ｔｈ１と分類され、当該割合が０．１〜１０のＴＣＣはＴｈ０と分類され、かつ当該割合が＜０．１のＴＣＣはＴｈ２と分類された。
【０１０２】
実施例２．４：フローサイトメトリー
ＴＣＣの表現型は、ＦＡＣＳｃａｎならびにＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体である、抗Ｌｅｕ／ＣＤ３、抗Ｌｅｕ ２ａ／ＣＤ８、抗ＴＣＲ αβ ＷＴ ３１、抗ＴＣＲ γδおよびＣＲＴＨ２＋ヤギ抗ラットＰＥ（すべての抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡから入手された）を用いた、フローサイトメトリーによって分析された。
【０１０３】
実施例２．５：天然Ａｍｂ ａ １とのｒＡｍｂ ａ １の比較
組み換えＡｍｂ ａ １．３アイソフォームが天然のＡｍｂ ａ １（アイソフォームの混合物）と比べてＴ細胞を刺激したかを確認するために、ＰＢＭＣおよびＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＬおよびＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＣは、異なる濃度の天然のＡｍｂ ａ １またはｒＡｍｂ ａ １．３を用いて刺激された。増殖およびサイトカイン応答が測定された。両方のアレルゲンの刺激能は、濃度の範囲の全体に渡って安定であり、天然のＡｍｂ ａ １およびｒＡｍｂ ａ １．３は、同等のＴ細胞増殖（図３および４）およびサイトカイン産生（図５および６）を一般的に誘導した。クローンレベルにおいて、ｒＡｍｂ ａ １．３の異なるエピトープを認識するＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＣが試験されたうちの１／６は、天然Ａｍｂ ａ １に対して反応しなかった（エピトープ：２６５〜２７６アミノ酸）。ブタクサ抽出物または組み換えＡｍｂ ａ １．３を用いて誘導されたＴＣＬは、類似のＴ細胞エピトープパターンを示した（図７）。
【０１０４】
実施例２．６：Ａｍｂ ａ １のＴ細胞エピトープ
Ａｍｂ ａ １．３のＴ細胞エピトープマッピングが実施されて、異なる患者（ウィーンから３７人およびイタリアから９人）から得られた４８のＴＣＬを評価した（表２）。当該ＴＣＬは、ブタクサ抽出物（天然のアレルゲンを含有している）またはｒＡｍｂ ａ １．３を用いて惹起されている。ブタクサ抽出物またはｒＡｍｂ ａ １．３のいずれかを用いて誘導された、同じ個体からのＴＣＬは、類似のＴ細胞エピトープを認識した（表２、図７）。オーストリア人およびイタリア人の患者は、類似のエピトープ認識プロファイルを示した。したがって、これらのデータは、さらなる分析と組み合わせられた（表３）。多くの吸入アレルゲンにとって典型的な、多数のＴ細胞活性化領域がＡｍｂ ａ １．３において検出された。単一の個体からのＴ細胞によって認識されたペプチドの数は、平均して１７．８のペプチドであり、２から最大で６０のペプチドの範囲であった（ＳＩ＞３に関して中央値＝１６；それぞれ０〜３６／１１．９／ＳＩ＞５に関して１２）（表３を参照すればよい）。合計して２６の関連する、１２〜１８位のアミノ酸を備えるＴ細胞活性化領域（すなわち、≧１０％の試験された患者によって認識された）が同定された。これらのエピトープ含有領域は、普及の等級に分けられた（ＳＩ＞５を参照すればよい）。
【０１０５】
１１の領域が１０〜２０％の患者において陽性であった：
ペプチド２０（８２〜９３位のアミノ酸）、ＧＫＷＧＤＶＹＴＶＴＳＮ（配列番号２０）、１４．６％によって認識された；
ペプチド４２（１４８〜１５９位のアミノ酸）、ペプチドＥＩＩＮＧＧＬＴＬＭＮＶ（配列番号４２）、１０．４％によって認識された；
ペプチド４４（１５４〜１６５位のアミノ酸）、ＬＴＬＭＮＶＫＮＩＩＩＨ（配列番号４４）、１８．８％によって認識された；
ペプチド７８（２５６〜２６７位のアミノ酸）、ＫＧＭＬＡＴＶＡＦＮＭＦ（配列番号７８）、１２．５％によって認識された；
ペプチド８０〜８１（２６２〜２７６位のアミノ酸）、ＶＡＦＮＭＦＴＤＮＶＤＱＲＭＰ（配列番号１２２）、１２．５％によって認識された；
ペプチド８３（２７１〜２８２位のアミノ酸）、ＶＤＱＲＭＰＲＣＲＦＧＦ（配列番号８３）、１６．７％によって認識された；
ペプチド８８〜８９（２８６〜３００位のアミノ酸）、ＶＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹＡＩＧＧ（配列番号１２３）、１２．５％によって認識された；
ペプチド９４（３０４〜３１５位のアミノ酸）、ＰＴＩＬＣＱＧＮＲＦＬＡ（配列番号９４）、１８．８％によって認識された；
ペプチド９８〜９９（３１６〜３３０位のアミノ酸）、ＰＤＤＱＩＫＫＮＶＬＡＲＴＧＴ（配列番号１２４）、１６．７％によって認識された；
ペプチド１００（３２２〜３３３位のアミノ酸）、ＫＮＶＬＡＲＴＧＴＧＡＡ（配列番号１００）、１０．４％によって認識された；
ペプチド１０１／１０２（３２５〜３３９位のアミノ酸）、ＬＡＲＴＧＴＧＡＡＥＳＭＡＷＮ（配列番号１２５）、１４．６％によって認識された。
【０１０６】
９の領域が２１〜３０％の患者において陽性であった：
ペプチド２７〜２８（１０３〜１１７位のアミノ酸）、ＥＧＴＬＲＦＡＡＡＱＮＲＰＬＷ（配列番号１２６）、２２．９％によって認識された；
ペプチド３０〜３１（１１２〜１２６位のアミノ酸）、ＱＮＲＰＬＷＩＩＦＫＮＤＭＶＩ（配列番号１２７）、２０．８％によって認識された；
ペプチド３３〜３４（１２１〜１３５位のアミノ酸）、ＫＮＤＭＶＩＮＬＮＱＥＬＶＶＮ（配列番号１２８）、２７．１％によって認識された；
ペプチド３６〜３７（１３０〜１４４位のアミノ酸）、ＱＥＬＶＶＮＳＤＫＴＩＤＧＲＧ（配列番号１２９）、２５．０％によって認識された；
ペプチド４６〜４８（１６０〜１７７位のアミノ酸）、ＫＮＩＩＩＨＮＩＮＩＨＤＶＫＶＬＰＧ（配列番号１３０）、２０．８％によって認識された；
ペプチド８６（２８０〜２９１位のアミノ酸）、ＦＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤ（配列番号８６）、２０．６％によって認識された；
ペプチド９１（２９５〜３０６位のアミノ酸）、ＴＹＡＩＧＧＳＳＡＰＴＩ（配列番号９１）、２２．９％によって認識された；
ペプチド１０９〜１１１（３４９〜３６６位のアミノ酸）、ＮＧＡＩＦＶＴＳＧＳＤＰＶＬＴＰＶＱ（配列番号１３１）、２２．９％によって認識された；
ペプチド１１８〜１２０（３７６〜３９３位のアミノ酸）３９３、ＧＥＡＡＩＫＬＴＳＳＡＧＶＬＳＣＲＰ（配列番号１３２）、２０．８％によって認識された。
【０１０７】
３つの領域が３１〜４９％の患者において陽性であった：
ペプチド３８〜４０（１３６〜１５３位のアミノ酸）、ＳＤＫＴＩＤＧＲＧＶＫＶＥＩＩＮＧＧ（配列番号１３３）、３３．３％によって認識された；
ペプチド６８（２２６〜２３７位のアミノ酸）、ＧＳＴＨＶＴＩＳＮＣＫＦ（配列番号６８）、３３．３％によって認識された；
ペプチド１１４〜１１５（３６４〜３７８位のアミノ酸）、ＰＶＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＡ（配列番号１３４）、３５．４％によって認識された。
【０１０８】
３つの領域が＞５０％の患者において陽性であった：
ペプチド５２（１７８〜１８９位のアミノ酸）、ＧＭＩＫＳＮＤＧＰＰＩＬ（配列番号５２）、５６．３％によって認識された；
ペプチド５９〜６１（１９９〜２１６位のアミノ酸）、ＮＶＡＧＳＳＱＩＷＩＤＨＣＳＬＳＫＳ（配列番号１３５）、５８．３％によって認識された；
ペプチド１０７〜１０８（３４３〜３５７位のアミノ酸）、ＤＫＤＬＬＥＮＧＡＩＦＶＴＳＧ（配列番号１３６）、５６．３％によって認識された。
【０１０９】
５０％を超えるアレルギー患者において増殖性応答を誘導する３つのＴ細胞活性化領域は、免疫優性エピトープであると決定した（図８、表３）。
【０１１０】
あるペプチドのＴ細胞活性化能は、認識の頻度と一般的に相関しない。したがって、“陽性指標（ＰＩ；陽性患者の百分率×ＳＩの平均）”が他の重要なエピトープを明らかにするために算出された。ＰＩは、９８〜２３００までの範囲内であり、かつ上述の３つの免疫優性領域および４つのさらなる領域（ＰＩ＞７００；２７％の最高値）を、Ａｍｂ ａ １．３における強い免疫原性領域として決定した：
４６〜４８：１６０〜１７７位のアミノ酸：ＫＮＩＩＩＨＮＩＮＩＨＤＶＫＶＬＰＧ（配列番号１３０）
１０９〜１１１：３４９〜３６６位のアミノ酸：ＮＧＡＩＦＶＴＳＧＳＤＰＶＬＴＰＶＱ（配列番号１３１）
１１４〜１１５：３６４〜３７８位のアミノ酸：ＰＶＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＡ（配列番号１３４）
１１８〜１２０：３７６〜３９３位のアミノ酸：ＧＥＡＡＩＫＬＴＳＳＡＧＶＬＳＣＲＰ（配列番号１３２）。
【０１１１】
ＴＣＬに加えて、１０人の異なるブタクサ花粉アレルギー患者から１００を超えるＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＣが確立された。１つのＣＤ８＋ＴＣＣを除いて、これらのＴＣＣは、ＣＤ４+ＴＣＲ αβ+Ｔ細胞であることが示された。１０８のＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＣ（ｎ＝１０の患者）におけるサイトカイン産生の調査によって、これらのＴＣＣの大部分（５０％）においてＴｈ２様サイトカインプロファイルが明らかになった（Ｔｈ１：１１％；Ｔｈ０ ３９％）。さらに、調査された６８のＴＣＣ（患者 ｎ＝８）のうちの７４％がＣＲＴｈ２を発現した。ＣＲＴｈ２は、Ｔｈ２Ｔ細胞の表面マーカーであり、またわれわれの株におけるＡｍｂ ａ １特異的Ｔ細胞が関連するアレルゲン性Ｔ細胞を代表することを示している。Ａｍｂ ａ １特異的ＴＣＣを用いたＡｍｂ ａ １．３のＴ細胞エピトープマッピングは、ＴＣＬから得られたデータを反映していた。その結果から、Ａｍｂ ａ １の提示が多様である（制限要素としてＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＰまたは−ＤＱを含む）ことが示された。
【０１１２】
米国特許第６，３３５，０２０号明細書（ブタクサ花粉由来のアレルゲン性ペプチド）において、Ｔ細胞反応性の主要な４つの領域：５７〜１０１位、１８２〜２１５位、２８０〜３２２位および３４２〜３７７位のアミノ酸が報告されている（図６）。このエピトープ分布は、本発明のエピトープといくつかの内容物に関して異なる。例えば、５７〜１０１位のアミノ酸の領域に対比して、１０１〜１８０位のアミノ酸内のエピトープがはるかに頻度よく認識されることが見出された。関連する木本花粉アレルゲンＣｈａ ｏ １（ヒノキ）、Ｃｒｙ ｊ １（スギ）に由来するＴ細胞エピトープは、他者によって説明されている（Sone et al., Clin Exp Allergy, 35: 664-71, 2005）。これらのアレルゲンの主要なエピトープは、Ａｍｂ ａ １における副次的なＴ細胞エピトープと相同な領域に配置されている。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
【表４】
【０１１５】
【表５】
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
【表７】
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
（実施例３：Ａｍｂ ａ １のα鎖およびβ鎖の性質決定）
ｎＡｍｂ ａ １は、精製の間に自然発生的にタンパク質分解を受け、かつｎＡｍｂ ａ １は、２つの鎖（α鎖およびβ鎖）のそれぞれに切断される。種々の国（イタリア、カナダおよびオーストリア）における患者から回収された血清を用いたデータによって、ほとんど（９０％）の患者が１２ｋＤａのβ鎖を認識したことが示された。これに対して、α鎖は、試験された患者の６５％のみのＩｇＥ抗体と弱く結合した（図９）。
【０１２１】
Ｔ細胞エピトープの同定を目的とした実験（実施例２に記載した）において、これらのＴ細胞活性化領域が４５％を超えるアレルギー患者において増殖性応答を誘導し、したがって免疫優性エピトープとして明らかになったこと（表３、図８）が見出された。興味深いことに、これらおよび他のＴ細胞活性化領域は、α鎖に対応するＡｍｂ ａ １のＣ末端領域に集まっている。したがって、これまでに公開された研究（King et al. Arch. Biochem. Biophys. 212: 127-135, 1981）とは反対に、今回、集められたデータは、Ａｍｂ ａ １の２つの鎖の免疫学的特性が異なることを示している。これらの発見が、大腸菌においてこれらの鎖を別々に生成させることの可能性、ならびにアレルギーの診断および免疫療法にとっての候補ワクチンとして利用する可能性を調査することに導いた。弱いＩｇＥ結合能を有するが、高い免疫原性（Ｔ細胞活性化）を有するα鎖は、特異的な免疫療法にとっての最適のツールである。一方において、高いＩｇＥ反応性のβ鎖は、ブタクサ花粉アレルギーを診断するための候補物である。
【０１２２】
このために、α鎖およびβ鎖の生成に使用する正確な切断部位を決定するための実験が実施された。当該実験は、ブタクサ花粉からのＡｍｂ ａ １の抽出および精製の間におけるＡｍｂ ａ １に関して説明されている（King et al. Immunochem. 11: 83-92, 1974）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の推定の他には、構造的なデータがＡｍｂ ａ １鎖に関して公開されていない。精製された天然Ａｍｂ ａ １（King et al. Immunochem. 11: 83-92, 1974を参照すればよい）は、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析によって分析され、かつＡｍｂ ａ １の未処理のα鎖およびβ鎖に対応するバンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／電気ブロッティング／クーマシー染色の後にエドマン分解にかけられた。このようにして、プロセシングを受けた天然Ａｍｂ ａ １およびプロセシングを受けていない天然のＡｍｂ ａ １の正確な質量およびＮ末端配列を決定することが可能になった（図１０〜１３、表４）。
【０１２３】
実施例３．１：Ｎ末端配列分析
天然Ａｍｂ ａ １は、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、かつポリビニル ジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に電気ブロットされた。Ａｍｂ ａ １およびその断片に対応するバンドが切り出され、かつ室温において１時間にわたって４０％（容積／容積）のアセトニトリルおよび３０％（容積／容積）のトリフルオロ酢酸の水溶液においてインキュベートすることによって、タンパク質が溶出された。サンプルは、真空乾燥され、水に再懸濁され、かつＨＰ Ｇ１００５Ａシークエンシングシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて配列決定された。
【０１２４】
実施例３．２：マトリックス支援レーザイオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析
シナピン酸およびウシ膵臓トリプシンの分子ピークが、カリブレーションに使用された。１００ｍＭのＤＴＴを含む０．５μｌ（〜０．７μｌ）の天然Ａｍｂ ａ １タンパク質溶液、および０．５μｌのシナピン酸マトリクスが、５０％（容積／容積）のアセトニトリルおよび０．１％（容積／容積）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の飽和溶液に溶解され、混合され、かつ標的スライド塗布された。サンプルは、Ｋｏｍｐａｃｔ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＩＶ質量分析器（Ｓｈｉｍａｚｕ）を用いて直線飛行モードにおいて分析された。
【０１２５】
実施例３．３：結果
まとめると、データ（図１０〜１３、表４）によって、Ａｍｂ ａ １の予測されるアミノ酸配列内のα鎖およびβ鎖の正確な位置づけを可能になりし、かついくつかのタンパク質分解段階がこれらの生成に関わることが示された。
（ｉ）プロセシングを受けていないＡｍｂ ａ １のＮ末端配列は、１７〜２０アミノ酸がタンパク質のＮ末端配列から除かれていることを示した。
（ｉｉ）β鎖は、１３８アミノ酸長であり、かつＡｍｂ ａ １のＮ末端部分に対応する（成熟タンパク質（Ａｍｂ ａ １．１アイソフォームをテンプレートとして採用している）の１８〜１５５位のアミノ酸）。
（ｉｉｉ）α鎖は、２０７アミノ酸長であり、かつＡｍｂ ａ １のＣ末端部分に対応する（成熟タンパク質（Ａｍｂ ａ １．１アイソフォームをテンプレートとして採用している）の１６５〜３７１位のアミノ酸）。
（ｉｖ）９つのアミノ酸が、β鎖のＣ末端とα鎖のＮ末端との間から除去されている。
【０１２６】
図１４は、Ａｍｂ ａ １の予測されるアミノ酸配列を、それらの配列上に位置づけられた推定のα鎖およびβ鎖とともに示す。
【０１２７】
【表１０】
【０１２８】
（実施例４：Ａｍｂ ａ １．３のα鎖およびβ鎖の組み換え生成）
実施例４．１：天然のプロセシングに従って設計された、Ａｍｂ ａ １．３のα鎖およびβ鎖の発現ベクターの構築および精製
プラスミドの構築および鎖の精製が実施例４．２に記載の通りに実施された。２つの鎖における差異は、図１６に示されている。表５は、α鎖およびβ鎖の組み換え生成用の種々の構築物をまとめたものである。
【０１２９】
実施例４．２：Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）の組み換え生成
本実験によって、改変された鎖の個別の生成が、全長のＡｍｂ ａ １．３分子の生成よりもはるかに有効であることが証明された。α鎖の生成収量は、１Ｌの発酵培養物につき約１００ｍｇであった。さらに、α鎖およびβ鎖の両方に関して大きな凝集体の形成は認められなかった（図１８）。
【０１３０】
実施例４．２．１：プラスミド構築
改変した鎖にしたがって設計されたプライマーを用いた、もとのＲ２クローンからの１００μｌの標準的なＰＣＲが実施された。ＰＣＲ産物は、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアガロースゲルから溶出された。両方のプライマーセット（β用およびα用）は、５’末端にＮｃｏ Ｉ部位ならびに３’末端にストップコドンおよびＸｈｏ Ｉを含んでいた。これらの酵素を用いてＰＣＲ断片およびベクターｐＨｉｓｐａｒａｌｌｅｌ−２は、オーバーナイト、３７℃において消化された。アガロースゲルからの溶出（Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ ｕｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ）の後に、ＰＣＲ断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標準的なライゲーション手順にしたがってベクターに連結された。連結反応は、電気穿孔法によって細菌株ＴＧ１（Ｋ１２、Ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／Ｆ’［ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＺＤＭ１５］）を形質転換するために使用された。１００μｌの形質転換体をプレートに播いた後に、ＬＢａｍｐ寒天プレートは、オーバーナイト、３７℃においてインキュベートされた。ＰＣＲコロニースクリーニングが使用されて、陽性のクローンを選択した（コロニーの少量がクローニングプライマーを用いた標準的なＰＣＲ用の鋳型として使用される）。選択されたクローンは、５０ｍｌのＳＢ培養およびプラスミド精製に使用された。挿入物は、ＡＢＩシークエンシングキットを用いて配列決定された。正しい配列を有するプラスミドが使用されて、細菌株ＢＬ２１およびＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。予備的な実験によって、大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを用いればより高い発現レベルが実現されることが示された（図１７）。
【０１３１】
実施例４．２．２：Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン２）の発現および精製
新たに形質転換された細菌から得られた１０〜２０のクローンは、０．５〜０．７のＯＤ600までＳＢにおいて増殖され、それから０．４ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導された。発現は、４〜５時間にわたって実施され、それから培養物が遠心分離（５，０００ｇ）によってペレット化された。細菌のペレットが開始緩衝液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ）に再懸濁された。細胞は、３回の凍結融解（液体窒素における凍結および２５℃における融解）によって溶解された。懸濁物は、ライソザイム（５ｍｇ／ｍｌ）、Ｄｎａｓｅ（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて処理され、かつ５分間にわたって超音波処理された。遠心分離（１５，０００ｇ）の後に、ペレットは、尿素開始緩衝液（開始緩衝液＋６Ｍの尿素＋１０ｍＭのイミダゾール）に再懸濁された。遠心分離（１５，０００ｇ）の後に、上清は、ＨｉｓＴｒａｐ Ｎｉ2+カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にかけられた。溶出は、溶出緩衝液（尿素開始緩衝液＋４００ｍＭのイミダゾール）を有する勾配によって実施された。画分がプールされ、かつ５００ｍＭのＬ−Ａｒｇ ｐＨ８．５に対して３回透析された。その後に、タンパク質は、ＰＢＳに対して透析された。Ａｍｂ ａ １の精製されたα鎖およびβ鎖（図１８）は、ＩｇＥ結合アッセイおよびＴ細胞増殖アッセイに使用された。
【０１３２】
実施例４．２．３：Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）に対するＴ細胞応答
表３におけるＴ細胞エピトープの結果と比較した場合に、４５／４６（９８％）の患者は、Ａｍｂ ａ １α鎖における１つ以上のエピトープを認識するだろう。したがって、Ａｍｂ ａ １の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）に対するＴ細胞応答は、利用可能なＡｍｂ ａ １反応性のＴＣＬ（ｎ＝６）およびＴＣＣ（ｎ＝２）を用いて、実施例２に記載のように増殖アッセイにおいて試験された。
【０１３３】
実施例４．３：組み換え生成
天然にプロセシングを受けたＡｍｂ ａ １にしたがって設計されたα鎖およびβ鎖の生成は、非常に低い収量のためにあまり希望を与えるものではなかった。しかし、Ｔ細胞エピトープマッピング実験から得られたデータによって、１つの重要なエピトープが、ほとんどのＴ細胞反応性ドメイン（図１６、アミノ酸１７８〜１８９）を有するα鎖に含まれていないことが示された。したがって、新たな鎖はこのＴ細胞エピトープ（表５、図１６）を含むように設計された。
【０１３４】
実施例４．４：ＩｇＥ結合
実施例３において示された通り、Ａｍｂ ａ １の天然にプロセシングを受けたα鎖およびβ鎖は、異なる免疫学的特性を有している。α鎖が低いＩｇＥ反応性を示す一方において、β鎖はＡｍｂ ａ １のＩｇＥエピトープのほとんどを含有している。したがって、精製されたα鎖のＩｇＥ結合活性を試験するために、ブタクサアレルギー患者から得られた血清を用いてＥＬＩＳＡが実施された。１２人の患者からの結果によって、α鎖が、インビトロにおいて低いＩｇＥ結合活性を示すこと／ＩｇＥ結合活性を示さないことが確かめられた（図１９）。実験は、β鎖の生成および性質決定のために実施されている。
【０１３５】
実施例４．５：Ｔ細胞反応性
試験された６つのＴＣＬのうちＡｍｂ ａ １に対する強い反応性を有する２つのＴＣＬが図２０に示されている。α鎖は、増殖の刺激に関してβ鎖よりもはるかに有効であった（Ａｍｂ ａ １の応答の、８２％および８４％に対して３８％および１９％）。この知見は、これらの２つのＴＣＬのエピトープ認識パターンによって説明され得る（図２を参照すればよい）。また、他の２つのＴＣＬは、それらのエピトーププロファイルにしたがってα鎖および／またはβ鎖と反応した（図２１）。
【０１３６】
Ａｍｂ ａ １−α内のエピトープに対して特異的な２つのＴＣＣは、Ａｍｂ ａ １．３ほどには強くない程度にα鎖と反応するが、β鎖とは反応しない。
【０１３７】
【表１１】
【０１３８】
（まとめ）
要約すると、Ａｍｂ ａ １の関連する２６のＴ細胞活性化領域が、確実性に関する閾値としてＳＩ＞５を選んで、同定された（図８および２２）。
【０１３９】
４８人の異なる患者から得られたＴ細胞株によって認識されたＴ細胞エピトープの分析において、１７／２６のエピトープが、Ａｍｂ ａ １．３のＣ末端領域（α鎖）に配置されている一方において、β鎖が、患者の１０〜３０％のみによって主に認識される少数のＴ細胞エピトープを含有することが見出された（図８、表３）。
【０１４０】
しかし、５０％を超える患者によって認識される、関連する／免疫優勢なＴ細胞エピトープ配列は、天然に生じる鎖（α鎖においてほんの部分的に代表される）に切断される。この重要なＴ細胞活性化領域を網羅するために、本発明は、β鎖のＣ末端からα鎖のＮ末端までの１６アミノ酸残基を加えることによる、α鎖の改変（改変したバージョン１；図１６、表５）を含む。したがって、Ａｍｂ ａ １．３α鎖の改変（バーｓジョン１）した構築物は、Ａｍｂ ａ １の最も頻繁に認識される３つのＴ細胞エピトープを含む（図２２）。
【０１４１】
ブタクサ花粉アレルギー用のワクチンとしての、Ａｍｂ ａ １．３のα鎖の全体（改変したバージョン１）の使用は、試験された患者（ｎ＝４８）の１００％を保護するだろう。
【０１４２】
ブタクサ花粉アレルギー患者のペプチド免疫療法に対する、本明細書において同定された３つの免疫優勢Ｔ細胞エピトープの組み合わせの使用は、患者の９３％を保護するだろう。
ＧＭＩＫＳＮＤＧＰＰＩＬ（ペプチド５２；配列番号５２）
ＧＳＳＱＩＷＩＤＨＣＳＬＳＫＳ（ペプチド６０〜６１；配列番号１３７）
ＤＫＤＬＬＥＮＧＡＩＦＶＴＳＧＳＤＰＶＬＴＰＶＱ（ペプチド１０７〜１１１；配列番号１３８）。
【０１４３】
以下の４つのペプチドの混合物は、患者の９５．８％を保護するだろう。
ＧＭＩＫＳＮＤＧＰＰＩＬ（ペプチド５２；配列番号５２）
ＧＳＳＱＩＷＩＤＨＣＳＬＳＫＳ（ペプチド６０〜６１；配列番号１３７）
ＤＫＤＬＬＥＮＧＡＩＦＶＴＳＧＳＤＰＶＬＴＰＶＱ（ペプチド１０７〜１１１；配列番号１３８）
ＡＩＫＬＴＳＳＡＧＶＬＳＣＲＰ（ペプチド１１９〜１２０；配列番号１３９）。
【０１４４】
また、この最適なペプチドの組み合わせに対して、以下の頻繁に認識されるペプチドの追加が考えられ得る。
ＫＮＩＩＩＨＮＩＮＩＨＤＶＫＶＬＰＧ（ペプチド４６〜４８；配列番号１３０）
ＧＳＴＨＶＴＩＳＮＣＫＦ（ペプチド６８；配列番号６８）
ＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＡ（ペプチド１１５；配列番号１１５）。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】８Ｍの尿素におけるニッケルキレートクロマトグラフィー（ＮＣＣ）を用いたｒＡｍｂ ａ １．３の精製を示す。
【図２】組み換えＡｍｂ ａ １．３のＩｇＥドットブロット分析を示す。
【図３】精製された天然のＡｍｂ ａ １またはＡｍｂ ａ １．３を用いて、異なる濃度において刺激したＴＣＬを示す。
【図４】ＴＣＬ増殖アッセイにおけるアレルゲン力価測定（天然アレルゲンと対比した複数の組み換えアレルゲン（ｒＡｍｂ ａ １．３の異なるロット、ロットＬ１〜Ｌ４））の例を示す。
【図５】ブタクサ抽出物およびｒＡｍｂ ａ １．３によってＴＣＬにおいて誘導される類似のサイトカイン産生を示す。
【図６】天然のＡｍｂ ａ １およびｒＡｍｂ ａ １．３によってＴＣＬおよびＴＣＣにおいて誘導される同等のサイトカイン産生を示す。
【図７】天然のＡｍｂ ａ １またはｒＡｍｂ ａ １．３を用いて誘導されたＴＣＬが類似のＴ細胞エピトープを認識することを示す。
【図８】Ａｍｂ ａ １．３の関連するＴ細胞活性化領域を示す。
【図９】精製ｎＡｍｂ ａ １のＩｇＥ免疫ブロットを示す。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＰＶＤＦ膜上への電気ブロットの後における、精製された天然のＡｍｂ ａ １のクーマシー染色を示す。
【図１１】プロセシングを受けていない天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【図１２】天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のα鎖のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【図１３】天然のＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １、図１０を参照すればよい）のβ鎖のＮ末端配列およびＡｍｂ ａ １アイソフォームの推測されるアミノ酸配列との整合を示す。
【図１４】Ａｍｂ ａ １アイソフォームならびにそれらのα鎖およびβ鎖の推定されるアミノ酸配列を示す。
【図１５】Ａｍｂ ａ １アイソフォームの配列整合を示す。
【図１６】Ａｍｂ ａ １．３（Ｒ２クローン）の推定されるアミノ酸配列を示す。
【図１７】大腸菌株ＢＬ２１およびＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳにおける、Ａｍｂ ａ １の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）の発現を示す。
【図１８】ニッケルカラム上における親和性精製後における、Ａｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色を示す。
【図１９】天然のＡｍｂ ａ １ならびにＡｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）のヒトＩｇＥを用いたＥＬＩＳＡを示す。
【図２０】ｍｂ ａ １．３の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）を用いたＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＬの増殖を示す。
【図２１】全長のｒＡｍｂ ａ １．３、Ａｍｂ ａ １の改変したα鎖およびβ鎖（バージョン１）を用いた、２つのＡｍｂ ａ １特異的ＴＣＬの増殖応答を示す。
【図２２】Ａｍｂ ａ １．３における同定された関連するＴ細胞活性化領域を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５２、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのペプチドを備える、ワクチン調合物。
【請求項２】
少なくとも１つの薬学的に受容可能な補佐剤、賦形剤および／または担体をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載のワクチン調合物。
【請求項３】
配列番号１２、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９およびこれらの機能的な等価物からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、かつブタクサ花粉アレルゲンＡｍｂ ａ １から得られる、ペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載のペプチドの少なくとも１つ、および免疫原から得られる第２のペプチドの少なくとも１つを備える、分子。
【請求項５】
上記免疫原が、好ましくはＡｍｂ ａ ２、Ａｍｂ ａ ３、Ａｍｂ ａ ５、Ａｍｂ ａ ６、Ａｍｂ ａ ７、Ａｍｂ ａ ８、Ａｍｂ ａ ９、Ａｍｂ ａ １０、Ａｍｂ ｔ ５、Ａｒｔ ｖ １、Ａｒｔ ｖ ２、Ａｒｔ ｖ ３、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｒｔ ｖ ５、Ａｒｔ ｖ ６、Ｈｅｌ ａ １、Ｈｅｌ ａ ２、Ｈｅｌ ａ ３、Ｍｅｒ ａ １、Ｃｈｅ ａ １、Ｃｈｅ ａ ２、Ｃｈｅ ａ ３、Ｓａｌ ｋ １、Ｃａｔ ｒ １、Ｐｌａ ｌ １、Ｈｕｍ ｊ １、Ｐａｒ ｊ １、Ｐａｒ ｊ ２、Ｐａｒ ｊ ３、Ｐａｒ ｏ １、Ｃｙｎ ｄ １、Ｃｙｎ ｄ ７、Ｃｙｎ ｄ １２、Ｃｙｎ ｄ １５、Ｃｙｎ ｄ ２２ｗ、Ｃｙｎ ｄ ２３、Ｃｙｎ ｄ ２４、Ｄａｃ ｇ １、Ｄａｃ ｇ ２、Ｄａｃ ｇ ３、Ｄａｃ ｇ ５、Ｆｅｓ ｐ ４ｗ、Ｈｏｌ ｌ １、Ｌｏｌ ｐ １、Ｌｏｌ ｐ ２、Ｌｏｌ ｐ ３、Ｌｏｌ ｐ ５、Ｌｏｌ ｐ １１、Ｐｈａ ａ １、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２、Ｐｈｌ ｐ １３、Ｐｏａ ｐ １、Ｐｏａ ｐ ５、Ｓｏｒ ｈ １、Ｐｈｏ ｄ ２、Ａｌｎ ｇ １、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ６、Ｂｅｔ ｖ ７、Ｃａｒ ｂ １、Ｃａｓ ｓ １、Ｃａｓ ｓ ５、Ｃａｓ ｓ ８、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｃｏｒ ａ ９、Ｃｏｒ ａ １０、Ｃｏｒ ａ １１、Ｑｕｅ ａ １、Ｆｒａ ｅ １、Ｌｉｇ ｖ １、Ｏｌｅ ｅ １、Ｏｌｅ ｅ ２、Ｏｌｅ ｅ ３、Ｏｌｅ ｅ ４、Ｏｌｅ ｅ ５、Ｏｌｅ ｅ ６、Ｏｌｅ ｅ ７、Ｏｌｅ ｅ ８、Ｏｌｅ ｅ ９、Ｏｌｅ ｅ １０、Ｓｙｒ ｖ １、Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｒｙ ｊ ２、Ｃｕｐ ａ １、Ｃｕｐ ｓ １、Ｃｕｐ ｓ ３ｗ、Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ａ ２、Ｊｕｎ ａ ３、Ｊｕｎ ｏ ４、Ｊｕｎ ｓ １、Ｊｕｎ ｖ １、Ｐｌａ ａ １、Ｐｌａ ａ ２、Ｐｌａ ａ ３、Ａｃａ ｓ １３、Ｂｌｏ ｔ １、Ｂｌｏ ｔ ３、Ｂｌｏ ｔ ４、Ｂｌｏ ｔ ５、Ｂｌｏ ｔ ６、Ｂｌｏ ｔ １０、Ｂｌｏ ｔ １１、Ｂｌｏ ｔ １２、Ｂｌｏ ｔ １３、Ｂｌｏ ｔ １９、Ｄｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ １０、Ｄｅｒ ｆ １１、Ｄｅｒ ｆ １４、Ｄｅｒ ｆ １５、Ｄｅｒ ｆ １６、Ｄｅｒ ｆ １７、Ｄｅｒ ｆ １８ｗ、Ｄｅｒ ｍ １、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ６、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ ２０、Ｄｅｒ ｐ ２１、Ｅｕｒ ｍ ２、Ｅｕｒ ｍ １４、Ｇｌｙ ｄ ２，Ｌｅｐ ｄ １、Ｌｅｐ ｄ ２、Ｌｅｐ ｄ ５、Ｌｅｐ ｄ ７、Ｌｅｐ ｄ １０、Ｌｅｐ ｄ １３、Ｔｙｒ ｐ ２、Ｔｙｒ ｐ １３、Ｂｏｓ ｄ ２、Ｂｏｓ ｄ ３、Ｂｏｓ ｄ ４、Ｂｏｓ ｄ ５、Ｂｏｓ ｄ ６、Ｂｏｓ ｄ ７、Ｂｏｓ ｄ ８、Ｃａｎ ｆ １、Ｃａｎ ｆ ２、Ｃａｎ ｆ ３、Ｃａｎ ｆ ４、Ｅｑｕ ｃ １、Ｅｑｕ ｃ ２、Ｅｑｕ ｃ ３、Ｅｑｕ ｃ ４、Ｅｑｕ ｃ ５、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ５ｗ、Ｆｅｌ ｄ ６ｗ、Ｆｅｌ ｄ ７ｗ、Ｃａｖ ｐ １、Ｃａｖ ｐ ２、Ｍｕｓ ｍ １、Ｒａｔ ｎ １、Ａｌｔ ａ １、Ａｌｔ ａ ３、Ａｌｔ ａ ４、Ａｌｔ ａ ５、Ａｌｔ ａ ６、Ａｌｔ ａ ７、Ａｌｔ ａ ８、Ａｌｔ ａ １０、Ａｌｔ ａ １２、Ａｌｔ ａ １３、Ｃｌａ ｈ ２、Ｃｌａ ｈ ５、Ｃｌａ ｈ ６、Ｃｌａ ｈ ７、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｌａ ｈ ９、Ｃｌａ ｈ １０、Ｃｌａ ｈ １２、Ａｓｐ ｆｌ １３、Ａｓｐ ｆ １、Ａｓｐ ｆ ２、Ａｓｐ ｆ ３、Ａｓｐ ｆ ４、Ａｓｐ ｆ ５、Ａｓｐ ｆ ６、Ａｓｐ ｆ ７、Ａｓｐ ｆ ８、Ａｓｐ ｆ ９、Ａｓｐ ｆ １０、Ａｓｐ ｆ １１、Ａｓｐ ｆ １２、Ａｓｐ ｆ １３、Ａｓｐ ｆ １５、Ａｓｐ ｆ １６、Ａｓｐ ｆ １７、Ａｓｐ ｆ １８、Ａｓｐ ｆ ２２ｗ、Ａｓｐ ｆ ２３、Ａｓｐ ｆ ２７、Ａｓｐ ｆ ２８、Ａｓｐ ｆ ２９、Ａｓｐ ｎ １４、Ａｓｐ ｎ １８、Ａｓｐ ｎ ２５、Ａｓｐ ｏ １３、Ａｓｐ ｏ ２１、Ｐｅｎ ｂ １３、Ｐｅｎ ｂ ２６、Ｐｅｎ ｃｈ １３、Ｐｅｎ ｃｈ １８、Ｐｅｎ ｃｈ ２０、Ｐｅｎ ｃ ３、Ｐｅｎ ｃ １３、Ｐｅｎ ｃ １９、Ｐｅｎ ｃ ２２ｗ、Ｐｅｎ ｃ ２４、Ｐｅｎ ｏ １８、Ｆｕｓ ｃ １、Ｆｕｓ ｃ ２、Ｔｒｉ ｒ ２、Ｔｒｉ ｒ ４、Ｔｒｉ ｔ １、Ｔｒｉ ｔ ４、Ｃａｎｄ ａ １、Ｃａｎｄ ａ ３、Ｃａｎｄ ｂ ２、Ｐｓｉ ｃ １、Ｐｓｉ ｃ ２、Ｃｏｐ ｃ １、Ｃｏｐ ｃ ２、Ｃｏｐ ｃ ３、Ｃｏｐ ｃ ５、Ｃｏｐ ｃ ７、Ｒｈｏ ｍ １、Ｒｈｏ ｍ ２、Ｍａｌａ ｆ ２、Ｍａｌａ ｆ ３、Ｍａｌａ ｆ ４、Ｍａｌａ ｓ １、Ｍａｌａ ｓ ５、Ｍａｌａ ｓ ６、Ｍａｌａ ｓ ７、Ｍａｌａ ｓ ８、Ｍａｌａ ｓ ９、Ｍａｌａ ｓ １０、Ｍａｌａ ｓ １１、Ｍａｌａ ｓ １２、Ｍａｌａ ｓ １３、Ｅｐｉ ｐ １、Ａｅｄ ａ １、Ａｅｄ ａ ２、Ａｐｉ ｍ １、Ａｐｉ ｍ ２、Ａｐｉ ｍ ４、Ａｐｉ ｍ ６、Ａｐｉ ｍ ７、Ｂｏｍ ｐ １，Ｂｏｍ ｐ ４、Ｂｌａ ｇ １、Ｂｌａ ｇ ２、Ｂｌａ ｇ ４、Ｂｌａ ｇ ５、Ｂｌａ ｇ ６、Ｂｌａ ｇ ７、Ｂｌａ ｇ ８、Ｐｅｒ ａ １、Ｐｅｒ ａ ３、Ｐｅｒ ａ ６、Ｐｅｒ ａ ７、Ｃｈｉ ｋ １０、Ｃｈｉ ｔ １−９、Ｃｈｉ ｔ １．０１、Ｃｈｉ ｔ １．０２、Ｃｈｉ ｔ ２．０１０１、Ｃｈｉ ｔ ２．０１０２、Ｃｈｉ ｔ ３、Ｃｈｉ ｔ ４、Ｃｈｉ ｔ ５、Ｃｈｉ ｔ ６．０１、Ｃｈｉ ｔ ６．０２、Ｃｈｉ ｔ ７、Ｃｈｉ ｔ ８、Ｃｈｉ ｔ ９、Ｃｔｅ ｆ １、Ｃｔｅ ｆ ２、Ｃｔｅ ｆ ３、Ｔｈａ ｐ １、Ｌｅｐ ｓ １、Ｄｏｌ ｍ １、Ｄｏｌ ｍ ２、Ｄｏｌ ｍ ５、Ｄｏｌ ａ ５、Ｐｏｌ ａ １、Ｐｏｌ ａ ２、Ｐｏｌ ａ ５、Ｐｏｌ ｄ １、Ｐｏｌ ｄ ４、Ｐｏｌ ｄ ５、Ｐｏｌ ｅ １、Ｐｏｌ ｅ ５、Ｐｏｌ ｆ ５、Ｐｏｌ ｇ ５、Ｐｏｌ ｍ ５、Ｖｅｓｐ ｃ １、Ｖｅｓｐ ｃ ５、Ｖｅｓｐ ｍ １、Ｖｅｓｐ ｍ ５、Ｖｅｓ ｆ ５、Ｖｅｓ ｇ ５、Ｖｅｓ ｍ １、Ｖｅｓ ｍ ２、Ｖｅｓ ｍ ５、Ｖｅｓ ｐ ５、Ｖｅｓ ｓ ５、Ｖｅｓ ｖｉ ５、Ｖｅｓ ｖ １、Ｖｅｓ ｖ ２、Ｖｅｓ ｖ ５、Ｍｙｒ ｐ １、Ｍｙｒ ｐ ２、Ｓｏｌ ｇ ２、Ｓｏｌ ｇ ４、Ｓｏｌ ｉ ２、Ｓｏｌ ｉ ３、Ｓｏｌ ｉ ４、Ｓｏｌ ｓ ２、Ｔｒｉａ ｐ １、Ｇａｄ ｃ １、Ｓａｌ ｓ １、Ｂｏｓ ｄ ４、Ｂｏｓ ｄ ５、Ｂｏｓ ｄ ６、Ｂｏｓ ｄ ７、Ｂｏｓ ｄ ８、Ｇａｌ ｄ １、Ｇａｌ ｄ ２、Ｇａｌ ｄ ３、Ｇａｌ ｄ ４、Ｇａｌ ｄ ５、Ｍｅｔ ｅ １、Ｐｅｎ ａ １、Ｐｅｎ ｉ １、Ｐｅｎ ｍ １、Ｐｅｎ ｍ ２、Ｔｏｄ ｐ １、Ｈｅｌ ａｓ １、Ｈａｌ ｍ １、Ｒａｎ ｅ １、Ｒａｎ ｅ ２、Ｂｒａ ｊ １、Ｂｒａ ｎ １、Ｂｒａ ｏ ３、Ｂｒａ ｒ １、Ｂｒａ ｒ ２、Ｈｏｒ ｖ １５、Ｈｏｒ ｖ １６、Ｈｏｒ ｖ １７、Ｈｏｒ ｖ ２１、Ｓｅｃ ｃ ２０、Ｔｒｉ ａ １８、Ｔｒｉ ａ １９、Ｔｒｉ ａ ２５、Ｔｒｉ ａ ２６、Ｚｅａ ｍ １４、Ｚｅａ ｍ ２５、Ｏｒｙ ｓ １、Ａｐｉ ｇ １、Ａｐｉ ｇ ４、Ａｐｉ ｇ ５、Ｄａｕ ｃ １、Ｄａｕ ｃ ４、Ｃｏｒ ａ １．０４、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｆｒａ ａ ３、Ｆｒａ ａ ４、Ｍａｌ ｄ １、Ｍａｌ ｄ ２、Ｍａｌ ｄ ３、Ｍａｌ ｄ ４、Ｐｙｒ ｃ １、Ｐｙｒ ｃ ４、Ｐｙｒ ｃ ５、Ｐｅｒｓ ａ １、Ｐｒｕ ａｒ １、Ｐｒｕ ａｒ ３、Ｐｒｕ ａｖ １、Ｐｒｕ ａｖ ２、Ｐｒｕ ａｖ ３、Ｐｒｕ ａｖ ４、Ｐｒｕ ｄ ３、Ｐｒｕ ｄｕ ４、Ｐｒｕ ｐ ３、Ｐｒｕ ｐ ４、Ａｓｐａ ｏ １、Ｃｒｏ ｓ １、Ｃｒｏ ｓ ２、Ｌａｃ ｓ １、Ｖｉｔ ｖ １、Ｍｕｓ ｘｐ １、Ａｎａ ｃ １、Ａｎａ ｃ ２、Ｃｉｔ ｌ ３、Ｃｉｔ ｓ １、Ｃｉｔ ｓ ２、Ｃｉｔ ｓ ３、Ｌｉｔ ｃ １、Ｓｉｎ ａ １、Ｇｌｙ ｍ １、Ｇｌｙ ｍ ２、Ｇｌｙ ｍ ３、Ｇｌｙ ｍ ４、Ｖｉｇ ｒ １、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ４、Ａｒａ ｈ ５、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ ７、Ａｒａ ｈ ８、Ｌｅｎ ｃ １、Ｌｅｎ ｃ ２、Ｐｉｓ ｓ １、Ｐｉｓ ｓ ２、Ａｃｔ ｃ １、Ａｃｔ ｃ ２、Ｃａｐ ａ １ｗ、Ｃａｐ ａ ２、Ｌｙｃ ｅ １、Ｌｙｃ ｅ ２、Ｌｙｃ ｅ ３、Ｓｏｌａ ｔ １、Ｓｏｌａ ｔ ２、Ｓｏｌａ ｔ ３、Ｓｏｌａ ｔ ４、Ｂｅｒ ｅ １、Ｂｅｒ ｅ ２、Ｊｕｇ ｎ １、Ｊｕｇ ｎ ２、Ｊｕｇ ｒ １、Ｊｕｇ ｒ ２、Ｊｕｇ ｒ ３、Ａｎａ ｏ １、Ａｎａ ｏ ２、Ａｎａ ｏ ３、Ｒｉｃ ｃ １、Ｓｅｓ ｉ １、Ｓｅｓ ｉ ２、Ｓｅｓ ｉ ３、Ｓｅｓ ｉ ４、Ｓｅｓ ｉ ５、Ｓｅｓ ｉ ６、Ｃｕｃ ｍ １、Ｃｕｃ ｍ ２、Ｃｕｃ ｍ ３、Ｚｉｚ ｍ １、Ａｎｉ ｓ １、Ａｎｉ ｓ ２、Ａｎｉ ｓ ３、Ａｎｉ ｓ ４、Ａｒｇ ｒ、Ａｓｃ ｓ １、Ｃａｒ ｐ １、Ｄｅｎ ｎ １、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６．０１、Ｈｅｖ ｂ ６．０２、Ｈｅｖ ｂ ６．０３、Ｈｅｖ ｂ ７．０１、Ｈｅｖ ｂ ７．０２、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２、Ｈｅｖ ｂ １３、Ｈｏｍ ｓ １、Ｈｏｍ ｓ ２、Ｈｏｍ ｓ ３、Ｈｏｍ ｓ ４、Ｈｏｍ ｓ ５およびＴｒｉｐ ｓ １からなる群から選択される、アレルゲンであることを特徴とする請求項４に記載の分子。
【請求項６】
請求項３に記載のペプチドまたは請求項４もしくは５に記載の分子をコードする、核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子を備える、ベクター。
【請求項８】
上記核酸分子に対して作動可能に連結されたプロモータをさらに備えることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項３に記載のペプチドの少なくとも１つ、および／または請求項４もしくは５に記載の分子の少なくとも１つを備える、ワクチン調合物。
【請求項１０】
少なくとも１つの薬学的に受容可能な補佐剤、賦形剤および／または担体をさらに備えることを特徴とする請求項９に記載のワクチン調合物。
【請求項１１】
配列番号５２、配列番号６９、配列番号８６、配列番号９１および／または配列番号１２６〜１３９、好ましくは配列番号５２および／または配列番号１３７〜１３９からなるアミノ酸を有する少なくとも１つのペプチドおよび／または分子を備えることを特徴とする請求項９または１０に記載のワクチン調合物。
【請求項１２】
ワクチン調合物の製造に関する、請求項３に記載のペプチドの少なくとも１つ、および／または請求項４もしくは５に記載の分子の使用。
【請求項１３】
上記ワクチン調合物が、個体におけるブタクサ花粉アレルギー、特にＡｍｂ ａ １によって引き起こされるアレルギー、またはブタクサ花粉アレルギーと交差反応するアレルギーを処置または予防するためのものであることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
個体におけるブタクサアレルギーもしくはブタクサ花粉アレルギーと交差反応するアレルギーの診断、またはブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性の分析に関する、請求項３に記載のペプチドの少なくとも１つおよび／または請求項４もしくは５に記載の分子の使用。
【請求項１５】
以下の工程：
マスト細胞および／または抗体、特にＩｇＥクラスの抗体を含有する、個体のサンプルを準備する工程、
請求項３に記載のペプチドの少なくとも１つおよび／または請求項４もしくは５に記載の分子の少なくとも１つと、上記サンプルを接触させる工程、
上記分子との接触によって上記マスト細胞から放出されたヒスタミンの量を測定する工程、および／または上記サンプルにおけるブタクサ花粉アレルゲン特異的抗体の量を測定する工程、
放出されたヒスタミンの上記量および／またはサンプルにおけるブタクサ花粉アレルゲン特異的抗体の上記量が、ブタクサ花粉アレルギーと交差反応を示すアレルギーまたはブタクサ花粉アレルギーにかかっていない個体から得られたサンプルと比べて増加している場合に、ブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性を診断する工程
を包含するブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性を診断する、方法。
【請求項１６】
上記サンプルが、血液サンプル、涙液サンプル、唾液サンプルまたは鼻汁サンプルであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号１４２または配列番号１４３のアミノ酸配列からなる単離されたＡｍｂ ａ １．３のα鎖。
【請求項１８】
配列番号１４４または配列番号１４５のアミノ酸配列からなる単離されたＡｍｂ ａ １．３のβ鎖。
【請求項１９】
請求項１７に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のα鎖および／または請求項１８に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のβ鎖を備える、薬学的調製物。
【請求項２０】
個体におけるブタクサ花粉アレルギー、特にＡｍｂ ａ １によって引き起こされるアレルギー、またはブタクサ花粉アレルギーと交差反応するアレルギーを処置する薬物の製造に関する、請求項１７に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のα鎖および／または請求項１８に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のβ鎖の使用。
【請求項２１】
個体におけるブタクサアレルギーもしくはブタクサ花粉アレルギーと交差反応するアレルギーの診断、またはブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性の診断に関する、請求項１７に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のα鎖および／または請求項１８に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のβ鎖の使用。
【請求項１】
配列番号５２、配列番号１３７、配列番号１３８および配列番号１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのペプチドを備える、ワクチン調合物。
【請求項２】
少なくとも１つの薬学的に受容可能な補佐剤、賦形剤および／または担体をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載のワクチン調合物。
【請求項３】
配列番号１２、配列番号２０、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９およびこれらの機能的な等価物からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、かつブタクサ花粉アレルゲンＡｍｂ ａ １から得られる、ペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載のペプチドの少なくとも１つ、および免疫原から得られる第２のペプチドの少なくとも１つを備える、分子。
【請求項５】
上記免疫原が、好ましくはＡｍｂ ａ ２、Ａｍｂ ａ ３、Ａｍｂ ａ ５、Ａｍｂ ａ ６、Ａｍｂ ａ ７、Ａｍｂ ａ ８、Ａｍｂ ａ ９、Ａｍｂ ａ １０、Ａｍｂ ｔ ５、Ａｒｔ ｖ １、Ａｒｔ ｖ ２、Ａｒｔ ｖ ３、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｒｔ ｖ ５、Ａｒｔ ｖ ６、Ｈｅｌ ａ １、Ｈｅｌ ａ ２、Ｈｅｌ ａ ３、Ｍｅｒ ａ １、Ｃｈｅ ａ １、Ｃｈｅ ａ ２、Ｃｈｅ ａ ３、Ｓａｌ ｋ １、Ｃａｔ ｒ １、Ｐｌａ ｌ １、Ｈｕｍ ｊ １、Ｐａｒ ｊ １、Ｐａｒ ｊ ２、Ｐａｒ ｊ ３、Ｐａｒ ｏ １、Ｃｙｎ ｄ １、Ｃｙｎ ｄ ７、Ｃｙｎ ｄ １２、Ｃｙｎ ｄ １５、Ｃｙｎ ｄ ２２ｗ、Ｃｙｎ ｄ ２３、Ｃｙｎ ｄ ２４、Ｄａｃ ｇ １、Ｄａｃ ｇ ２、Ｄａｃ ｇ ３、Ｄａｃ ｇ ５、Ｆｅｓ ｐ ４ｗ、Ｈｏｌ ｌ １、Ｌｏｌ ｐ １、Ｌｏｌ ｐ ２、Ｌｏｌ ｐ ３、Ｌｏｌ ｐ ５、Ｌｏｌ ｐ １１、Ｐｈａ ａ １、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２、Ｐｈｌ ｐ １３、Ｐｏａ ｐ １、Ｐｏａ ｐ ５、Ｓｏｒ ｈ １、Ｐｈｏ ｄ ２、Ａｌｎ ｇ １、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ６、Ｂｅｔ ｖ ７、Ｃａｒ ｂ １、Ｃａｓ ｓ １、Ｃａｓ ｓ ５、Ｃａｓ ｓ ８、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｃｏｒ ａ ９、Ｃｏｒ ａ １０、Ｃｏｒ ａ １１、Ｑｕｅ ａ １、Ｆｒａ ｅ １、Ｌｉｇ ｖ １、Ｏｌｅ ｅ １、Ｏｌｅ ｅ ２、Ｏｌｅ ｅ ３、Ｏｌｅ ｅ ４、Ｏｌｅ ｅ ５、Ｏｌｅ ｅ ６、Ｏｌｅ ｅ ７、Ｏｌｅ ｅ ８、Ｏｌｅ ｅ ９、Ｏｌｅ ｅ １０、Ｓｙｒ ｖ １、Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｒｙ ｊ ２、Ｃｕｐ ａ １、Ｃｕｐ ｓ １、Ｃｕｐ ｓ ３ｗ、Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ａ ２、Ｊｕｎ ａ ３、Ｊｕｎ ｏ ４、Ｊｕｎ ｓ １、Ｊｕｎ ｖ １、Ｐｌａ ａ １、Ｐｌａ ａ ２、Ｐｌａ ａ ３、Ａｃａ ｓ １３、Ｂｌｏ ｔ １、Ｂｌｏ ｔ ３、Ｂｌｏ ｔ ４、Ｂｌｏ ｔ ５、Ｂｌｏ ｔ ６、Ｂｌｏ ｔ １０、Ｂｌｏ ｔ １１、Ｂｌｏ ｔ １２、Ｂｌｏ ｔ １３、Ｂｌｏ ｔ １９、Ｄｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ３、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ １０、Ｄｅｒ ｆ １１、Ｄｅｒ ｆ １４、Ｄｅｒ ｆ １５、Ｄｅｒ ｆ １６、Ｄｅｒ ｆ １７、Ｄｅｒ ｆ １８ｗ、Ｄｅｒ ｍ １、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ６、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ ２０、Ｄｅｒ ｐ ２１、Ｅｕｒ ｍ ２、Ｅｕｒ ｍ １４、Ｇｌｙ ｄ ２，Ｌｅｐ ｄ １、Ｌｅｐ ｄ ２、Ｌｅｐ ｄ ５、Ｌｅｐ ｄ ７、Ｌｅｐ ｄ １０、Ｌｅｐ ｄ １３、Ｔｙｒ ｐ ２、Ｔｙｒ ｐ １３、Ｂｏｓ ｄ ２、Ｂｏｓ ｄ ３、Ｂｏｓ ｄ ４、Ｂｏｓ ｄ ５、Ｂｏｓ ｄ ６、Ｂｏｓ ｄ ７、Ｂｏｓ ｄ ８、Ｃａｎ ｆ １、Ｃａｎ ｆ ２、Ｃａｎ ｆ ３、Ｃａｎ ｆ ４、Ｅｑｕ ｃ １、Ｅｑｕ ｃ ２、Ｅｑｕ ｃ ３、Ｅｑｕ ｃ ４、Ｅｑｕ ｃ ５、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ５ｗ、Ｆｅｌ ｄ ６ｗ、Ｆｅｌ ｄ ７ｗ、Ｃａｖ ｐ １、Ｃａｖ ｐ ２、Ｍｕｓ ｍ １、Ｒａｔ ｎ １、Ａｌｔ ａ １、Ａｌｔ ａ ３、Ａｌｔ ａ ４、Ａｌｔ ａ ５、Ａｌｔ ａ ６、Ａｌｔ ａ ７、Ａｌｔ ａ ８、Ａｌｔ ａ １０、Ａｌｔ ａ １２、Ａｌｔ ａ １３、Ｃｌａ ｈ ２、Ｃｌａ ｈ ５、Ｃｌａ ｈ ６、Ｃｌａ ｈ ７、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｌａ ｈ ９、Ｃｌａ ｈ １０、Ｃｌａ ｈ １２、Ａｓｐ ｆｌ １３、Ａｓｐ ｆ １、Ａｓｐ ｆ ２、Ａｓｐ ｆ ３、Ａｓｐ ｆ ４、Ａｓｐ ｆ ５、Ａｓｐ ｆ ６、Ａｓｐ ｆ ７、Ａｓｐ ｆ ８、Ａｓｐ ｆ ９、Ａｓｐ ｆ １０、Ａｓｐ ｆ １１、Ａｓｐ ｆ １２、Ａｓｐ ｆ １３、Ａｓｐ ｆ １５、Ａｓｐ ｆ １６、Ａｓｐ ｆ １７、Ａｓｐ ｆ １８、Ａｓｐ ｆ ２２ｗ、Ａｓｐ ｆ ２３、Ａｓｐ ｆ ２７、Ａｓｐ ｆ ２８、Ａｓｐ ｆ ２９、Ａｓｐ ｎ １４、Ａｓｐ ｎ １８、Ａｓｐ ｎ ２５、Ａｓｐ ｏ １３、Ａｓｐ ｏ ２１、Ｐｅｎ ｂ １３、Ｐｅｎ ｂ ２６、Ｐｅｎ ｃｈ １３、Ｐｅｎ ｃｈ １８、Ｐｅｎ ｃｈ ２０、Ｐｅｎ ｃ ３、Ｐｅｎ ｃ １３、Ｐｅｎ ｃ １９、Ｐｅｎ ｃ ２２ｗ、Ｐｅｎ ｃ ２４、Ｐｅｎ ｏ １８、Ｆｕｓ ｃ １、Ｆｕｓ ｃ ２、Ｔｒｉ ｒ ２、Ｔｒｉ ｒ ４、Ｔｒｉ ｔ １、Ｔｒｉ ｔ ４、Ｃａｎｄ ａ １、Ｃａｎｄ ａ ３、Ｃａｎｄ ｂ ２、Ｐｓｉ ｃ １、Ｐｓｉ ｃ ２、Ｃｏｐ ｃ １、Ｃｏｐ ｃ ２、Ｃｏｐ ｃ ３、Ｃｏｐ ｃ ５、Ｃｏｐ ｃ ７、Ｒｈｏ ｍ １、Ｒｈｏ ｍ ２、Ｍａｌａ ｆ ２、Ｍａｌａ ｆ ３、Ｍａｌａ ｆ ４、Ｍａｌａ ｓ １、Ｍａｌａ ｓ ５、Ｍａｌａ ｓ ６、Ｍａｌａ ｓ ７、Ｍａｌａ ｓ ８、Ｍａｌａ ｓ ９、Ｍａｌａ ｓ １０、Ｍａｌａ ｓ １１、Ｍａｌａ ｓ １２、Ｍａｌａ ｓ １３、Ｅｐｉ ｐ １、Ａｅｄ ａ １、Ａｅｄ ａ ２、Ａｐｉ ｍ １、Ａｐｉ ｍ ２、Ａｐｉ ｍ ４、Ａｐｉ ｍ ６、Ａｐｉ ｍ ７、Ｂｏｍ ｐ １，Ｂｏｍ ｐ ４、Ｂｌａ ｇ １、Ｂｌａ ｇ ２、Ｂｌａ ｇ ４、Ｂｌａ ｇ ５、Ｂｌａ ｇ ６、Ｂｌａ ｇ ７、Ｂｌａ ｇ ８、Ｐｅｒ ａ １、Ｐｅｒ ａ ３、Ｐｅｒ ａ ６、Ｐｅｒ ａ ７、Ｃｈｉ ｋ １０、Ｃｈｉ ｔ １−９、Ｃｈｉ ｔ １．０１、Ｃｈｉ ｔ １．０２、Ｃｈｉ ｔ ２．０１０１、Ｃｈｉ ｔ ２．０１０２、Ｃｈｉ ｔ ３、Ｃｈｉ ｔ ４、Ｃｈｉ ｔ ５、Ｃｈｉ ｔ ６．０１、Ｃｈｉ ｔ ６．０２、Ｃｈｉ ｔ ７、Ｃｈｉ ｔ ８、Ｃｈｉ ｔ ９、Ｃｔｅ ｆ １、Ｃｔｅ ｆ ２、Ｃｔｅ ｆ ３、Ｔｈａ ｐ １、Ｌｅｐ ｓ １、Ｄｏｌ ｍ １、Ｄｏｌ ｍ ２、Ｄｏｌ ｍ ５、Ｄｏｌ ａ ５、Ｐｏｌ ａ １、Ｐｏｌ ａ ２、Ｐｏｌ ａ ５、Ｐｏｌ ｄ １、Ｐｏｌ ｄ ４、Ｐｏｌ ｄ ５、Ｐｏｌ ｅ １、Ｐｏｌ ｅ ５、Ｐｏｌ ｆ ５、Ｐｏｌ ｇ ５、Ｐｏｌ ｍ ５、Ｖｅｓｐ ｃ １、Ｖｅｓｐ ｃ ５、Ｖｅｓｐ ｍ １、Ｖｅｓｐ ｍ ５、Ｖｅｓ ｆ ５、Ｖｅｓ ｇ ５、Ｖｅｓ ｍ １、Ｖｅｓ ｍ ２、Ｖｅｓ ｍ ５、Ｖｅｓ ｐ ５、Ｖｅｓ ｓ ５、Ｖｅｓ ｖｉ ５、Ｖｅｓ ｖ １、Ｖｅｓ ｖ ２、Ｖｅｓ ｖ ５、Ｍｙｒ ｐ １、Ｍｙｒ ｐ ２、Ｓｏｌ ｇ ２、Ｓｏｌ ｇ ４、Ｓｏｌ ｉ ２、Ｓｏｌ ｉ ３、Ｓｏｌ ｉ ４、Ｓｏｌ ｓ ２、Ｔｒｉａ ｐ １、Ｇａｄ ｃ １、Ｓａｌ ｓ １、Ｂｏｓ ｄ ４、Ｂｏｓ ｄ ５、Ｂｏｓ ｄ ６、Ｂｏｓ ｄ ７、Ｂｏｓ ｄ ８、Ｇａｌ ｄ １、Ｇａｌ ｄ ２、Ｇａｌ ｄ ３、Ｇａｌ ｄ ４、Ｇａｌ ｄ ５、Ｍｅｔ ｅ １、Ｐｅｎ ａ １、Ｐｅｎ ｉ １、Ｐｅｎ ｍ １、Ｐｅｎ ｍ ２、Ｔｏｄ ｐ １、Ｈｅｌ ａｓ １、Ｈａｌ ｍ １、Ｒａｎ ｅ １、Ｒａｎ ｅ ２、Ｂｒａ ｊ １、Ｂｒａ ｎ １、Ｂｒａ ｏ ３、Ｂｒａ ｒ １、Ｂｒａ ｒ ２、Ｈｏｒ ｖ １５、Ｈｏｒ ｖ １６、Ｈｏｒ ｖ １７、Ｈｏｒ ｖ ２１、Ｓｅｃ ｃ ２０、Ｔｒｉ ａ １８、Ｔｒｉ ａ １９、Ｔｒｉ ａ ２５、Ｔｒｉ ａ ２６、Ｚｅａ ｍ １４、Ｚｅａ ｍ ２５、Ｏｒｙ ｓ １、Ａｐｉ ｇ １、Ａｐｉ ｇ ４、Ａｐｉ ｇ ５、Ｄａｕ ｃ １、Ｄａｕ ｃ ４、Ｃｏｒ ａ １．０４、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｆｒａ ａ ３、Ｆｒａ ａ ４、Ｍａｌ ｄ １、Ｍａｌ ｄ ２、Ｍａｌ ｄ ３、Ｍａｌ ｄ ４、Ｐｙｒ ｃ １、Ｐｙｒ ｃ ４、Ｐｙｒ ｃ ５、Ｐｅｒｓ ａ １、Ｐｒｕ ａｒ １、Ｐｒｕ ａｒ ３、Ｐｒｕ ａｖ １、Ｐｒｕ ａｖ ２、Ｐｒｕ ａｖ ３、Ｐｒｕ ａｖ ４、Ｐｒｕ ｄ ３、Ｐｒｕ ｄｕ ４、Ｐｒｕ ｐ ３、Ｐｒｕ ｐ ４、Ａｓｐａ ｏ １、Ｃｒｏ ｓ １、Ｃｒｏ ｓ ２、Ｌａｃ ｓ １、Ｖｉｔ ｖ １、Ｍｕｓ ｘｐ １、Ａｎａ ｃ １、Ａｎａ ｃ ２、Ｃｉｔ ｌ ３、Ｃｉｔ ｓ １、Ｃｉｔ ｓ ２、Ｃｉｔ ｓ ３、Ｌｉｔ ｃ １、Ｓｉｎ ａ １、Ｇｌｙ ｍ １、Ｇｌｙ ｍ ２、Ｇｌｙ ｍ ３、Ｇｌｙ ｍ ４、Ｖｉｇ ｒ １、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ４、Ａｒａ ｈ ５、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ ７、Ａｒａ ｈ ８、Ｌｅｎ ｃ １、Ｌｅｎ ｃ ２、Ｐｉｓ ｓ １、Ｐｉｓ ｓ ２、Ａｃｔ ｃ １、Ａｃｔ ｃ ２、Ｃａｐ ａ １ｗ、Ｃａｐ ａ ２、Ｌｙｃ ｅ １、Ｌｙｃ ｅ ２、Ｌｙｃ ｅ ３、Ｓｏｌａ ｔ １、Ｓｏｌａ ｔ ２、Ｓｏｌａ ｔ ３、Ｓｏｌａ ｔ ４、Ｂｅｒ ｅ １、Ｂｅｒ ｅ ２、Ｊｕｇ ｎ １、Ｊｕｇ ｎ ２、Ｊｕｇ ｒ １、Ｊｕｇ ｒ ２、Ｊｕｇ ｒ ３、Ａｎａ ｏ １、Ａｎａ ｏ ２、Ａｎａ ｏ ３、Ｒｉｃ ｃ １、Ｓｅｓ ｉ １、Ｓｅｓ ｉ ２、Ｓｅｓ ｉ ３、Ｓｅｓ ｉ ４、Ｓｅｓ ｉ ５、Ｓｅｓ ｉ ６、Ｃｕｃ ｍ １、Ｃｕｃ ｍ ２、Ｃｕｃ ｍ ３、Ｚｉｚ ｍ １、Ａｎｉ ｓ １、Ａｎｉ ｓ ２、Ａｎｉ ｓ ３、Ａｎｉ ｓ ４、Ａｒｇ ｒ、Ａｓｃ ｓ １、Ｃａｒ ｐ １、Ｄｅｎ ｎ １、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６．０１、Ｈｅｖ ｂ ６．０２、Ｈｅｖ ｂ ６．０３、Ｈｅｖ ｂ ７．０１、Ｈｅｖ ｂ ７．０２、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２、Ｈｅｖ ｂ １３、Ｈｏｍ ｓ １、Ｈｏｍ ｓ ２、Ｈｏｍ ｓ ３、Ｈｏｍ ｓ ４、Ｈｏｍ ｓ ５およびＴｒｉｐ ｓ １からなる群から選択される、アレルゲンであることを特徴とする請求項４に記載の分子。
【請求項６】
請求項３に記載のペプチドまたは請求項４もしくは５に記載の分子をコードする、核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子を備える、ベクター。
【請求項８】
上記核酸分子に対して作動可能に連結されたプロモータをさらに備えることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項３に記載のペプチドの少なくとも１つ、および／または請求項４もしくは５に記載の分子の少なくとも１つを備える、ワクチン調合物。
【請求項１０】
少なくとも１つの薬学的に受容可能な補佐剤、賦形剤および／または担体をさらに備えることを特徴とする請求項９に記載のワクチン調合物。
【請求項１１】
配列番号５２、配列番号６９、配列番号８６、配列番号９１および／または配列番号１２６〜１３９、好ましくは配列番号５２および／または配列番号１３７〜１３９からなるアミノ酸を有する少なくとも１つのペプチドおよび／または分子を備えることを特徴とする請求項９または１０に記載のワクチン調合物。
【請求項１２】
ワクチン調合物の製造に関する、請求項３に記載のペプチドの少なくとも１つ、および／または請求項４もしくは５に記載の分子の使用。
【請求項１３】
上記ワクチン調合物が、個体におけるブタクサ花粉アレルギー、特にＡｍｂ ａ １によって引き起こされるアレルギー、またはブタクサ花粉アレルギーと交差反応するアレルギーを処置または予防するためのものであることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
個体におけるブタクサアレルギーもしくはブタクサ花粉アレルギーと交差反応するアレルギーの診断、またはブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性の分析に関する、請求項３に記載のペプチドの少なくとも１つおよび／または請求項４もしくは５に記載の分子の使用。
【請求項１５】
以下の工程：
マスト細胞および／または抗体、特にＩｇＥクラスの抗体を含有する、個体のサンプルを準備する工程、
請求項３に記載のペプチドの少なくとも１つおよび／または請求項４もしくは５に記載の分子の少なくとも１つと、上記サンプルを接触させる工程、
上記分子との接触によって上記マスト細胞から放出されたヒスタミンの量を測定する工程、および／または上記サンプルにおけるブタクサ花粉アレルゲン特異的抗体の量を測定する工程、
放出されたヒスタミンの上記量および／またはサンプルにおけるブタクサ花粉アレルゲン特異的抗体の上記量が、ブタクサ花粉アレルギーと交差反応を示すアレルギーまたはブタクサ花粉アレルギーにかかっていない個体から得られたサンプルと比べて増加している場合に、ブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性を診断する工程
を包含するブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性を診断する、方法。
【請求項１６】
上記サンプルが、血液サンプル、涙液サンプル、唾液サンプルまたは鼻汁サンプルであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号１４２または配列番号１４３のアミノ酸配列からなる単離されたＡｍｂ ａ １．３のα鎖。
【請求項１８】
配列番号１４４または配列番号１４５のアミノ酸配列からなる単離されたＡｍｂ ａ １．３のβ鎖。
【請求項１９】
請求項１７に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のα鎖および／または請求項１８に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のβ鎖を備える、薬学的調製物。
【請求項２０】
個体におけるブタクサ花粉アレルギー、特にＡｍｂ ａ １によって引き起こされるアレルギー、またはブタクサ花粉アレルギーと交差反応するアレルギーを処置する薬物の製造に関する、請求項１７に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のα鎖および／または請求項１８に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のβ鎖の使用。
【請求項２１】
個体におけるブタクサアレルギーもしくはブタクサ花粉アレルギーと交差反応するアレルギーの診断、またはブタクサ花粉アレルゲン、特にＡｍｂ ａ １に対する個体の感受性の診断に関する、請求項１７に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のα鎖および／または請求項１８に記載の単離されたＡｍｂ ａ １．３のβ鎖の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２０１０−５１８８１３（Ｐ２０１０−５１８８１３Ａ）
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４９３７３（Ｐ２００９−５４９３７３）
【出願日】平成２０年２月１３日（２００８．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１０９２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９８７４９
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０７１８０４２３）ビオマイ アクチエンゲゼルシャフト (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１３日（２００８．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１０９２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９８７４９
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０７１８０４２３）ビオマイ アクチエンゲゼルシャフト (12)
【Ｆターム（参考）】
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