プライマーダイマーからの非特異的増幅を減少させる方法
【課題】 核酸の増幅方法の改良方法、より詳しくは、核酸増幅時に形成されるプライマーダイマーからの非特異的増幅を減少させる。
【解決手段】 核酸増幅反応において、プライマーダイマーに結合する物質をサンプルに添加することを特徴とする、プライマーダイマー形成に伴う非特異的な増幅反応を抑制する。プライマーダイマーに結合する物質としては、ミスマッチ結合タンパク質のようなミスマッチ認識能を有する物質や、ＤＮＡ組換え酵素のようなＤＮＡ組換え能を有する物質を用いることができる。
【解決手段】 核酸増幅反応において、プライマーダイマーに結合する物質をサンプルに添加することを特徴とする、プライマーダイマー形成に伴う非特異的な増幅反応を抑制する。プライマーダイマーに結合する物質としては、ミスマッチ結合タンパク質のようなミスマッチ認識能を有する物質や、ＤＮＡ組換え酵素のようなＤＮＡ組換え能を有する物質を用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅方法の改良方法、より詳しくは、核酸増幅時に形成されるプライマーダイマーからの非特異的増幅を減少させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲをはじめとして核酸の増幅技術は種々知られているが、プライマーを用いる増幅方法のすべてにおいて、プライマー同士が対合したプライマーダイマーの形成は共通した問題である。２種類のプライマーを用いた場合には特に、プライマーダイマー生じると、これが鋳型ＤＮＡとして働いて、非特異的な増幅産物が作られてしまう問題がある。これは、本来の目的であるＤＮＡ産物に、それ以外のＤＮＡ断片が混入するという問題だけでなく、非特異的な増幅反応にプライマーが消費され、目的とするＤＮＡ増幅の効率が低下するという問題を招く。
【０００３】
このような問題を解決するためには、まずプライマーダイマーを形成し辛いプライマーを設計することが重要である。プライマーの設計には、オリゴヌクレオチドの長さ、Ｔｍ値、配列の物理的特徴、プライマーの相互作用の可能性など様々な要素を考慮する必要があるが、これだけではプライマーダイマーの問題を完全に解決はできない。プライマーダイマーによる非特異的な増幅産物の問題を解決するために、電気泳動により非特異的増幅産物と目的とするＤＮＡ産物とを分離し、目的とする増幅物のバンドを切り出す方法や、増幅反応後の反応液をスピンカラムにかけるなどの方法があり、後者の例としてＵｌｔｒａ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ ｋｉｔ （日本ジェネティクス社）、Ｂａｙ Ｇｅｎｅ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔ（Ｂａｙ Ｇｅｎｅ社）などが市販されている。
【０００４】
一方、プライマーダイマー形成に伴う非特異的増幅産物と目的産物とを区別できる検出方法も開発されている。例えばＰＣＲ法により増幅を行なう際、連続的なモニタリングにより目的産物に由来する蛍光とプライマーダイマーのような非特異的結合に由来する蛍光を区別できる検出方法がある。またプライマーの５’末端に色素ＱＳＹ７またはＱＳＹ９を結合させ、プライマーダイマーに結合したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどのフルオロフォア付近の蛍光をクエンチングするようにデザインされたプライマーも開発されている。目的とする増幅物の場合、結合したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどの核酸色素分子は、クエンチャーから離れていき蛍光を発するが、プライマーダイマーのような短い鎖のものは、クエンチャーにより蛍光を発することがないので、目的とする増幅物のみのシグナルを得ることができる。
【０００５】
さらに、反応自体を抑制する方法も種々開発されてきた。増幅反応を行なう際、プライマーダイマーは低温においてより形成され易く、ＤＮＡポリメラーゼも通常は低温でもある程度活性を有しているため、プライマーダイマーからの非特異的核酸増幅が起きやすい。これを防ぐ方法としては、ホットスタート法があげられる。これは、ＤＮＡポリメラーゼの反応を反応液の温度を上昇させてからのみ起きるようにする方法である。具体的には、高温下で不足しているコンポーネントを追加する方法、ワックスバリアー法、ＤＮＡポリメラーゼの抗体やアプタマーを用いる方法、加熱処理することで活性化するＤＮＡポリメラーゼを用いる方法などが挙げられる。しかしこれらの方法には、操作が煩雑になること、抗体などの高価な試薬が必要であることなどの問題点があった。また、もともと反応温度が低い増幅反応には利用ができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、プライマーダイマー形成に伴う、非特異的増幅産物と目的産物とを区別する方法や、非特異的増幅産物の増幅を減少させる方法が開発されているが、操作が容易であり、かつ、効果の高い方法は未だ見出されていない。
そこで、本発明は、プライマーダイマーの形成による非特異的増幅産物の増幅を防ぐ効率的かつ操作が容易な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
今回の発明は、上記のようなプライマーダイマーの形成による非特異的な増幅を抑制する新しい方法を提供する。
発明者らは、ミスマッチ結合タンパク質あるいは組換え酵素タンパク質のようなプライマーダイマーに結合する物質を増幅反応溶液に添加することにより、プライマーダイマーの形成に起因する非特異的な増幅を著しく減少できることを発見した。これらのタンパク質は、プライマーダイマーの非相補的対合部分に結合し、ＤＮＡポリメラーゼによる３’末端からのＤＮＡ鎖伸長反応を中止させる。これにより、プライマーダイマーからは非特異的増幅が減少する。
【０００８】
すなわち、本発明は、核酸増幅反応においてプライマーダイマーに結合する物質をサンプルに添加することを特徴とする、プライマーダイマー形成に伴う非特異的な増幅反応を抑制する方法を提供する。
この方法において、プライマーダイマーに結合する物質として、ミスマッチ認識能を有する物質、好ましくはミスマッチ結合タンパク質を用いることができる。ミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物を例示できる。プライマーダイマーに結合する物質は、サンプルに０．１％〜１０％、好ましくは０．５％〜２％、より好ましくは０．７％〜１．３％の濃度で添加することができる。
【０００９】
また、この方法において、プライマーダイマーに結合する物質として、ＤＮＡ組換え能を有する物質、好ましくはＤＮＡ組換え酵素を用いることができる。ＤＮＡ組換え酵素としては、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子または一本鎖結合タンパク質を例示できる。
【００１０】
また、本発明の別の側面として、プライマーダイマーに結合する物質と、プライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする、目的とする核酸領域を増幅する方法、標的核酸配列の有無を判定する方法、又は、標的核酸配列における変異、欠失及び／又は挿入の有無を判定する方法を提供する。
【００１１】
これらの方法において、プライマーダイマーに結合する物質として、ミスマッチ認識能を有する物質、好ましくは、ミスマッチ結合タンパク質を用いることができる。ミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物を例示できる。
【００１２】
また、これらの方法において、プライマーダイマーに結合する物質として、ＤＮＡ組換え能を有する物質、好ましくはＤＮＡ組換え酵素を用いることができる。ＤＮＡ組換え酵素としては、ＲｅｃＡタンパク質を例示できる。
【００１３】
これらの方法における核酸増幅方法には、ＰＣＲ法又は等温増幅法を使用できる。等温増幅反応としては、ＳＤＡ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、Ｑベータリプリカーゼ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法を例示できる。
また、等温増幅法に用いられるプライマーには、標的核酸配列を増幅できる少なくとも２種のプライマーセットを含んでなり、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を第一のプライマーの３’側に含み、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなり、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分にふくんでなり、かつ相互がハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折り返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなるものを使用できる。このようなプライマーセットは、ＰＣＴ／ＪＰ０４／０１９３４９に詳細に記載されている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ミスマッチ結合タンパク質あるいは組換え酵素タンパク質がプライマー同士からなるミスマッチ配列に結合し、その増幅を抑制し、さらに、目的とする配列特異的な増幅のみを起こさせることで、目的配列を増幅するための感度、特異性が向上する効果が得られる。
本法は、感染症から、ＳＮＰ、変異など、幅広い増幅、検出の分野に応用可能なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ＤＮＡの２本鎖において部分的に対合できない（ミスマッチ）塩基対が生じたときに、細菌や酵母等には、これを修復するための機構があることが既に知られている。この修復は「ミスマッチ結合タンパク質」と呼ばれるタンパク質（「ミスマッチ認識タンパク質」とも称される）によって行なわれるものであり、ＭｕｔＳタンパク質（特表平９−５０４６９９号公報）、ＭｕｔＭタンパク質（特開２０００−３００２６５号公報）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合したＭｕｔＳタンパク質（国際公開第９９／０６５９１号パンフレット）などの様々なミスマッチ結合タンパクの使用が報告されている。さらに、近年、ミスマッチ結合タンパク質を利用してミスマッチを検出する遺伝子診断法が開発されている（Ｍ．Ｇｏｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１４，４７−５０，１９９７）。核酸中における特定のヌクレオチドにおける多型および突然変異の検出法としては、例えば、変異のない対照核酸と、変異が存在することが疑われる被検核酸とをハイブリダイズさせ、そこにミスマッチ認識タンパク質を導入することによりミスマッチを検出する方法が知られている。
【００１６】
本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組み合わせ、またはＧとＣの組み合わせ）ではないことを意味する。ミスマッチには、１つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、１または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００１７】
プライマーダイマーは、プライマーの一部あるいは全体が他のプライマーと対合し、非相補的な領域を含む二本鎖構造をとる。このようなヘテロ二本鎖構造により、本来的には生成しないはずの誤った増幅産物がもたらされる。そこで、核酸増幅反応に用いられる反応液中にミスマッチ結合タンパク質を添加しておけば、上記のようなヘテロ二本鎖構造にこのミスマッチ結合タンパク質が結合し、その後の増幅反応が妨げられる。従って、ミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、誤った増幅産物の生成を防ぐことが可能となる。
【００１８】
本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸におけるミスマッチを認識し、そのミスマッチの部位に結合することが可能なタンパク質であればよく、例えば、当業者に公知のいずれのものであってもよい。使用されるミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＨｅｘＡ、ＭＳＨ１〜６、Ｒｅｐ３、ＲＮａｓｅＡ、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、レゾルバーゼなどが挙げられ、好ましくはＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物であり、より好ましくはＭｕｔＳであるが、これらに限定されない。
また、本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に作製することも可能である。
【００１９】
タンパク質にアミノ酸変異を導入する方法としては、多くの方法が知られている。例えば、部位特異的変異導入法としては、 Ｗ．Ｐ．ＤｅｎｇとＪ．Ａ．Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００，８１，１９９２）、Ｋ．Ｌ．ＭａｋａｍａｙｅとＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｄｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４，９６７９−９６９８，１９８６）などが知られており、ランダム変異導入法としては、基本的な修復系を欠損した大腸菌 ＸＬ１−Ｒｅｄ 株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いる方法、亜硝酸ナトリウム等を用いて化学的に塩基を修飾する方法（Ｊ．−Ｊ．Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，１１，２０４−２１１，１９９１）などが知られている。このようなミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＭ、ＭｕｔＳおよびそれらの類似体など、多くのものが知られている（Ｒａｄｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０:５２３−５３８（１９８６）；Ｒａｄａｍａｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．，Ａｕｇｕｓｔ １９８８，ｐｐ４０−４６；Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６５９７−６６００（１９８９）；Ｌａｈｕｅ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５:１６０−１６４（１９８８）；Ｊｉｒｉｃｎｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ，．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７８４３−７８５３（１９８８）；Ｓｕ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６８２９−６８３５（１９８８）；Ｌａｈｕｅ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．１９８：３７−４３（１９８８）；Ｄｏｈｅｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．２０６：１８１−１８４（１９８７）；Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｔｉｃｓ １１５：６０５−６１０（１９８７）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＭｕｔｓ（Ｌｕ，Ａ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１８：５９３−６００（１９８８）；ＨａｂｅｒＬ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：１９７−２０２（１９８８）；Ｐａｎｇ、Ｐ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：１００７−１０１５（１９８５））；及びＰｒｉｅｂｅ Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｌｏ．１７０：１９０−１９６（１９８８））。
【００２０】
ミスマッチ結合タンパク質は、一本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は、一本鎖結合タンパク質により阻害されることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、一本鎖結合タンパク質を併用することが好ましい。
一本鎖核酸にミスマッチ結合タンパク質が結合するのを阻害するために使用する一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、当技術分野において公知の任意のＳＳＢとすることができる。好ましいＳＳＢとしては、大腸菌、ショウジョウバエ、およびアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、およびＴ４バクテリオファージ由来の遺伝子３２タンパク質、ならびに他の種に由来するこれらの相当物が挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明に用いられる一本鎖結合タンパク質は、一本鎖核酸に結合しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に作製することも可能である。
【００２１】
また、ミスマッチ結合タンパク質は、ミスマッチを含まない二本鎖核酸にも結合することがあり、あらかじめ活性剤を用いてミスマッチ結合タンパク質を活性化しておくことにより、このようなミスマッチ結合タンパク質の誤った結合が防止できることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、ミスマッチ結合タンパク質の活性剤によりあらかじめ活性化されたものを用いることが好ましい。
ミスマッチ結合タンパク質を活性化するための活性剤は、当業者であれば適宜選択することができる。ミスマッチ結合タンパク質を活性化するための活性剤として、好ましくは、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、ＡＤＰ（アデノシン５’−二リン酸）、ＡＴＰ−γ−Ｓ(アデノシン５’−Ｏ−（３−チオ三リン酸））、ＡＭＰ−ＰＮＰ（アデノシン５’−［β、γ−イミド］三リン酸）などの化合物であり、あるいは、ミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つとされるが、これらに限定されない。ミスマッチ結合タンパク質の活性化は、ミスマッチ結合タンパク質と活性剤とを、室温で数秒間から数分間インキュベートすることにより行うことができる。
【００２２】
本発明に用いる組換え酵素タンパク質は、当業者が適宜選択することができる。例えば、ＲｅｃＡタンパク質を用いることができる。
【００２３】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本実施例により本発明を制限または限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００２４】
［ヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子中の標的核酸配列の増幅］
本例では、鋳型としてヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用して、その中に含まれるヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子中の標的核酸配列の増幅を行なった。プライマーとしては、下記の配列を有するプライマーペアを用いた。また、鋳型に対する各プライマー領域の位置関係は図１（配列番号１）に示す通りとした。フォワードプライマーＦ１は、その３’末端側にある配列（２２ｍｅｒ：下線部）が鋳型にアニーリングし、５’末端側にある配列（１６ｍｅｒ：下線部以外）がその領域内で折り畳まれて図２に示す構造をとるように設計されている。リバースプライマーＲ１は、その３’末端側にある配列（２０ｍｅｒ：下線部）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’末端側にある配列（１０ｍｅｒ：下線部以外）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの３’末端残基の１６塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。
【００２５】
プライマーペア：
Ｆ１：ＧＧＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＣＣＡＣＡＴＡＡＡＧ（配列番号１）
Ｒ１：ＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＡＡＡＧＣＡＣＴＧＡＧＴＡ（配列番号２）。
【００２６】
次の組成を有する２５μＬの反応液を調製し、６０℃で１時間インキュベートした。鋳型は二本鎖のまま反応させた。また、鋳型の代わりに滅菌水を添加した溶液についても同様に実験を行なった。
反応液の組成は、以下の通りである。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ4（８ｍＭ）、ＤＭＳＯ（３％）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（１％）、ｄＮＴＰ（１．４ｍＭ）、それぞれ２０００ｎＭの上記のプライマー対および鋳型（１００ｎｇ）、さらに１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）（最終的に１００，０００倍希釈となる濃度）、ＭｕｔＳ（０．８μｇ）を２５μＬ中に含有する。各サンプルの組成を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
結果を図３に示す。図中、●はサンプル１を、○はサンプル２を、▲はサンプル４をそれぞれ表す。サンプル３、サンプル５及びサンプル６は、蛍光強度が測定期間中、常に０であった。サンプル１とサンプル２の結果を比較すると、サンプル２の方が若干増幅速度が遅くなっている。これはＭｕｔＳを添加しない場合、形成されたプライマーダイマーを鋳型とした非特異的な増幅反応によるプライマーの消費されるため、目的とする領域の増幅効率に若干の影響があったことが理由として考えられる。サンプル４では、本来鋳型ＤＮＡがないため，増幅反応は起こらないはずであるが、時間の経過につれて増幅が見られる。これは、プライマーダイマーの形成に起因する非特異的増幅と考えられる。これに対し、サンプル３では増幅が見られず、ＭｕｔＳが非特異的増幅の抑制に効果的であることが判った。
【実施例２】
【００２９】
［ヒトＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の検出］
ヒトＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝子の検出を行なった。プライマーとして、次の塩基配列からなるプライマーを設計した。各プライマーと標的塩基配列の関係は、図４に示したとおりである。
【００３０】
ＲＡ（Ｒ１＋Ｒ２）／配列番号３
５’−ＧＧＧＡＡＣＣＣＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴＡＣＴＴＡＡＡＡＡＣＣＴＧＴＧＴＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＣＣＡＡＡＡＴＡＴＣ−３’
【００３１】
アウタープライマーＲ３／配列番号４
５’−ＡＧＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＡＴＣ−３’
【００３２】
ＦＡ（Ｆ１＋Ｆ２）／配列番号５
５’−ＣＧＧＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＡＧ−３’
【００３３】
アウタープライマーＦ３／配列番号６
５’−ＣＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＡＴＡＴＴＧＴＡＴＣ−３’
【００３４】
上記塩基配列からなるプライマーを用い、ヒトＣＰＹ２Ｃ遺伝子を組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＥｃｏＲＩで直鎖状にしたもの）１０〜１９ ｍｏｌ／ｔｕｂｅ（約６００００分子）を鋳型とし、６０℃で２時間反応させた。鋳型は２本鎖のまま反応させた。反応液の組成は次のとおりである。
【００３５】
・反応液組成（２５μＬ中）
２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．８
１０ ｍＭ ＫＣｌ
１０ ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4
４ ｍＭ ＭｇＳＯ4
１Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
０．４ ｍＭ ｄＮＴＰ
８Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）
ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）（最終的に１００，０００倍希釈となる濃度）
０．８μｇ ＭｕｔＳ
【００３６】
プライマー：
１６００ｎＭ ＦＡ
１６００ｎＭ ＲＡ
２００ｎＭ Ｆ３
２００ｎＭ Ｒ３
【００３７】
各サンプル反応液の組成を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
結果を図５に示す。図中、●はサンプル１を、▲はサンプル２を、×はサンプル３をそれぞれ表す。サンプル４は、蛍光強度が測定期間中、常に０であった。サンプル３と４を増幅した結果を比べると、ＭｕｔＳが無い場合、鋳型ＤＮＡが無い場合でも１時間を過ぎると非特異的な増幅が観察されたが、ＭｕｔＳの添加により、この非特異的増幅をほぼ完全に抑制できることが判った。これによりＭｕｔＳは特異的配列を検出する感度、特異性が向上する効果があると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子に対する各プライマー領域の位置関係を示す図である。
【図２】フォワードプライマーＦ１の立体構造を示す図である。
【図３】実施例１の結果を示す図である。
【図４】ＣＹＰ２Ｃ１９配列に対する各プライマーの位置関係を示す図である。
【図５】実施例２の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅方法の改良方法、より詳しくは、核酸増幅時に形成されるプライマーダイマーからの非特異的増幅を減少させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲをはじめとして核酸の増幅技術は種々知られているが、プライマーを用いる増幅方法のすべてにおいて、プライマー同士が対合したプライマーダイマーの形成は共通した問題である。２種類のプライマーを用いた場合には特に、プライマーダイマー生じると、これが鋳型ＤＮＡとして働いて、非特異的な増幅産物が作られてしまう問題がある。これは、本来の目的であるＤＮＡ産物に、それ以外のＤＮＡ断片が混入するという問題だけでなく、非特異的な増幅反応にプライマーが消費され、目的とするＤＮＡ増幅の効率が低下するという問題を招く。
【０００３】
このような問題を解決するためには、まずプライマーダイマーを形成し辛いプライマーを設計することが重要である。プライマーの設計には、オリゴヌクレオチドの長さ、Ｔｍ値、配列の物理的特徴、プライマーの相互作用の可能性など様々な要素を考慮する必要があるが、これだけではプライマーダイマーの問題を完全に解決はできない。プライマーダイマーによる非特異的な増幅産物の問題を解決するために、電気泳動により非特異的増幅産物と目的とするＤＮＡ産物とを分離し、目的とする増幅物のバンドを切り出す方法や、増幅反応後の反応液をスピンカラムにかけるなどの方法があり、後者の例としてＵｌｔｒａ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ ｋｉｔ （日本ジェネティクス社）、Ｂａｙ Ｇｅｎｅ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔ（Ｂａｙ Ｇｅｎｅ社）などが市販されている。
【０００４】
一方、プライマーダイマー形成に伴う非特異的増幅産物と目的産物とを区別できる検出方法も開発されている。例えばＰＣＲ法により増幅を行なう際、連続的なモニタリングにより目的産物に由来する蛍光とプライマーダイマーのような非特異的結合に由来する蛍光を区別できる検出方法がある。またプライマーの５’末端に色素ＱＳＹ７またはＱＳＹ９を結合させ、プライマーダイマーに結合したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどのフルオロフォア付近の蛍光をクエンチングするようにデザインされたプライマーも開発されている。目的とする増幅物の場合、結合したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどの核酸色素分子は、クエンチャーから離れていき蛍光を発するが、プライマーダイマーのような短い鎖のものは、クエンチャーにより蛍光を発することがないので、目的とする増幅物のみのシグナルを得ることができる。
【０００５】
さらに、反応自体を抑制する方法も種々開発されてきた。増幅反応を行なう際、プライマーダイマーは低温においてより形成され易く、ＤＮＡポリメラーゼも通常は低温でもある程度活性を有しているため、プライマーダイマーからの非特異的核酸増幅が起きやすい。これを防ぐ方法としては、ホットスタート法があげられる。これは、ＤＮＡポリメラーゼの反応を反応液の温度を上昇させてからのみ起きるようにする方法である。具体的には、高温下で不足しているコンポーネントを追加する方法、ワックスバリアー法、ＤＮＡポリメラーゼの抗体やアプタマーを用いる方法、加熱処理することで活性化するＤＮＡポリメラーゼを用いる方法などが挙げられる。しかしこれらの方法には、操作が煩雑になること、抗体などの高価な試薬が必要であることなどの問題点があった。また、もともと反応温度が低い増幅反応には利用ができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、プライマーダイマー形成に伴う、非特異的増幅産物と目的産物とを区別する方法や、非特異的増幅産物の増幅を減少させる方法が開発されているが、操作が容易であり、かつ、効果の高い方法は未だ見出されていない。
そこで、本発明は、プライマーダイマーの形成による非特異的増幅産物の増幅を防ぐ効率的かつ操作が容易な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
今回の発明は、上記のようなプライマーダイマーの形成による非特異的な増幅を抑制する新しい方法を提供する。
発明者らは、ミスマッチ結合タンパク質あるいは組換え酵素タンパク質のようなプライマーダイマーに結合する物質を増幅反応溶液に添加することにより、プライマーダイマーの形成に起因する非特異的な増幅を著しく減少できることを発見した。これらのタンパク質は、プライマーダイマーの非相補的対合部分に結合し、ＤＮＡポリメラーゼによる３’末端からのＤＮＡ鎖伸長反応を中止させる。これにより、プライマーダイマーからは非特異的増幅が減少する。
【０００８】
すなわち、本発明は、核酸増幅反応においてプライマーダイマーに結合する物質をサンプルに添加することを特徴とする、プライマーダイマー形成に伴う非特異的な増幅反応を抑制する方法を提供する。
この方法において、プライマーダイマーに結合する物質として、ミスマッチ認識能を有する物質、好ましくはミスマッチ結合タンパク質を用いることができる。ミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物を例示できる。プライマーダイマーに結合する物質は、サンプルに０．１％〜１０％、好ましくは０．５％〜２％、より好ましくは０．７％〜１．３％の濃度で添加することができる。
【０００９】
また、この方法において、プライマーダイマーに結合する物質として、ＤＮＡ組換え能を有する物質、好ましくはＤＮＡ組換え酵素を用いることができる。ＤＮＡ組換え酵素としては、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子または一本鎖結合タンパク質を例示できる。
【００１０】
また、本発明の別の側面として、プライマーダイマーに結合する物質と、プライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする、目的とする核酸領域を増幅する方法、標的核酸配列の有無を判定する方法、又は、標的核酸配列における変異、欠失及び／又は挿入の有無を判定する方法を提供する。
【００１１】
これらの方法において、プライマーダイマーに結合する物質として、ミスマッチ認識能を有する物質、好ましくは、ミスマッチ結合タンパク質を用いることができる。ミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物を例示できる。
【００１２】
また、これらの方法において、プライマーダイマーに結合する物質として、ＤＮＡ組換え能を有する物質、好ましくはＤＮＡ組換え酵素を用いることができる。ＤＮＡ組換え酵素としては、ＲｅｃＡタンパク質を例示できる。
【００１３】
これらの方法における核酸増幅方法には、ＰＣＲ法又は等温増幅法を使用できる。等温増幅反応としては、ＳＤＡ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、Ｑベータリプリカーゼ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法を例示できる。
また、等温増幅法に用いられるプライマーには、標的核酸配列を増幅できる少なくとも２種のプライマーセットを含んでなり、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を第一のプライマーの３’側に含み、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなり、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分にふくんでなり、かつ相互がハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折り返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなるものを使用できる。このようなプライマーセットは、ＰＣＴ／ＪＰ０４／０１９３４９に詳細に記載されている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ミスマッチ結合タンパク質あるいは組換え酵素タンパク質がプライマー同士からなるミスマッチ配列に結合し、その増幅を抑制し、さらに、目的とする配列特異的な増幅のみを起こさせることで、目的配列を増幅するための感度、特異性が向上する効果が得られる。
本法は、感染症から、ＳＮＰ、変異など、幅広い増幅、検出の分野に応用可能なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ＤＮＡの２本鎖において部分的に対合できない（ミスマッチ）塩基対が生じたときに、細菌や酵母等には、これを修復するための機構があることが既に知られている。この修復は「ミスマッチ結合タンパク質」と呼ばれるタンパク質（「ミスマッチ認識タンパク質」とも称される）によって行なわれるものであり、ＭｕｔＳタンパク質（特表平９−５０４６９９号公報）、ＭｕｔＭタンパク質（特開２０００−３００２６５号公報）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合したＭｕｔＳタンパク質（国際公開第９９／０６５９１号パンフレット）などの様々なミスマッチ結合タンパクの使用が報告されている。さらに、近年、ミスマッチ結合タンパク質を利用してミスマッチを検出する遺伝子診断法が開発されている（Ｍ．Ｇｏｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１４，４７−５０，１９９７）。核酸中における特定のヌクレオチドにおける多型および突然変異の検出法としては、例えば、変異のない対照核酸と、変異が存在することが疑われる被検核酸とをハイブリダイズさせ、そこにミスマッチ認識タンパク質を導入することによりミスマッチを検出する方法が知られている。
【００１６】
本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組み合わせ、またはＧとＣの組み合わせ）ではないことを意味する。ミスマッチには、１つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、１または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００１７】
プライマーダイマーは、プライマーの一部あるいは全体が他のプライマーと対合し、非相補的な領域を含む二本鎖構造をとる。このようなヘテロ二本鎖構造により、本来的には生成しないはずの誤った増幅産物がもたらされる。そこで、核酸増幅反応に用いられる反応液中にミスマッチ結合タンパク質を添加しておけば、上記のようなヘテロ二本鎖構造にこのミスマッチ結合タンパク質が結合し、その後の増幅反応が妨げられる。従って、ミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、誤った増幅産物の生成を防ぐことが可能となる。
【００１８】
本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸におけるミスマッチを認識し、そのミスマッチの部位に結合することが可能なタンパク質であればよく、例えば、当業者に公知のいずれのものであってもよい。使用されるミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＨｅｘＡ、ＭＳＨ１〜６、Ｒｅｐ３、ＲＮａｓｅＡ、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、レゾルバーゼなどが挙げられ、好ましくはＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物であり、より好ましくはＭｕｔＳであるが、これらに限定されない。
また、本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に作製することも可能である。
【００１９】
タンパク質にアミノ酸変異を導入する方法としては、多くの方法が知られている。例えば、部位特異的変異導入法としては、 Ｗ．Ｐ．ＤｅｎｇとＪ．Ａ．Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００，８１，１９９２）、Ｋ．Ｌ．ＭａｋａｍａｙｅとＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｄｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４，９６７９−９６９８，１９８６）などが知られており、ランダム変異導入法としては、基本的な修復系を欠損した大腸菌 ＸＬ１−Ｒｅｄ 株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いる方法、亜硝酸ナトリウム等を用いて化学的に塩基を修飾する方法（Ｊ．−Ｊ．Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，１１，２０４−２１１，１９９１）などが知られている。このようなミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＭ、ＭｕｔＳおよびそれらの類似体など、多くのものが知られている（Ｒａｄｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０:５２３−５３８（１９８６）；Ｒａｄａｍａｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．，Ａｕｇｕｓｔ １９８８，ｐｐ４０−４６；Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６５９７−６６００（１９８９）；Ｌａｈｕｅ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５:１６０−１６４（１９８８）；Ｊｉｒｉｃｎｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ，．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７８４３−７８５３（１９８８）；Ｓｕ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６８２９−６８３５（１９８８）；Ｌａｈｕｅ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．１９８：３７−４３（１９８８）；Ｄｏｈｅｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．２０６：１８１−１８４（１９８７）；Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｔｉｃｓ １１５：６０５−６１０（１９８７）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＭｕｔｓ（Ｌｕ，Ａ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１８：５９３−６００（１９８８）；ＨａｂｅｒＬ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：１９７−２０２（１９８８）；Ｐａｎｇ、Ｐ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：１００７−１０１５（１９８５））；及びＰｒｉｅｂｅ Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｌｏ．１７０：１９０−１９６（１９８８））。
【００２０】
ミスマッチ結合タンパク質は、一本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は、一本鎖結合タンパク質により阻害されることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、一本鎖結合タンパク質を併用することが好ましい。
一本鎖核酸にミスマッチ結合タンパク質が結合するのを阻害するために使用する一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、当技術分野において公知の任意のＳＳＢとすることができる。好ましいＳＳＢとしては、大腸菌、ショウジョウバエ、およびアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、およびＴ４バクテリオファージ由来の遺伝子３２タンパク質、ならびに他の種に由来するこれらの相当物が挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明に用いられる一本鎖結合タンパク質は、一本鎖核酸に結合しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に作製することも可能である。
【００２１】
また、ミスマッチ結合タンパク質は、ミスマッチを含まない二本鎖核酸にも結合することがあり、あらかじめ活性剤を用いてミスマッチ結合タンパク質を活性化しておくことにより、このようなミスマッチ結合タンパク質の誤った結合が防止できることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、ミスマッチ結合タンパク質の活性剤によりあらかじめ活性化されたものを用いることが好ましい。
ミスマッチ結合タンパク質を活性化するための活性剤は、当業者であれば適宜選択することができる。ミスマッチ結合タンパク質を活性化するための活性剤として、好ましくは、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、ＡＤＰ（アデノシン５’−二リン酸）、ＡＴＰ−γ−Ｓ(アデノシン５’−Ｏ−（３−チオ三リン酸））、ＡＭＰ−ＰＮＰ（アデノシン５’−［β、γ−イミド］三リン酸）などの化合物であり、あるいは、ミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つとされるが、これらに限定されない。ミスマッチ結合タンパク質の活性化は、ミスマッチ結合タンパク質と活性剤とを、室温で数秒間から数分間インキュベートすることにより行うことができる。
【００２２】
本発明に用いる組換え酵素タンパク質は、当業者が適宜選択することができる。例えば、ＲｅｃＡタンパク質を用いることができる。
【００２３】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本実施例により本発明を制限または限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００２４】
［ヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子中の標的核酸配列の増幅］
本例では、鋳型としてヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用して、その中に含まれるヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子中の標的核酸配列の増幅を行なった。プライマーとしては、下記の配列を有するプライマーペアを用いた。また、鋳型に対する各プライマー領域の位置関係は図１（配列番号１）に示す通りとした。フォワードプライマーＦ１は、その３’末端側にある配列（２２ｍｅｒ：下線部）が鋳型にアニーリングし、５’末端側にある配列（１６ｍｅｒ：下線部以外）がその領域内で折り畳まれて図２に示す構造をとるように設計されている。リバースプライマーＲ１は、その３’末端側にある配列（２０ｍｅｒ：下線部）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’末端側にある配列（１０ｍｅｒ：下線部以外）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの３’末端残基の１６塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。
【００２５】
プライマーペア：
Ｆ１：ＧＧＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＣＣＡＣＡＴＡＡＡＧ（配列番号１）
Ｒ１：ＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＡＡＡＧＣＡＣＴＧＡＧＴＡ（配列番号２）。
【００２６】
次の組成を有する２５μＬの反応液を調製し、６０℃で１時間インキュベートした。鋳型は二本鎖のまま反応させた。また、鋳型の代わりに滅菌水を添加した溶液についても同様に実験を行なった。
反応液の組成は、以下の通りである。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ4（８ｍＭ）、ＤＭＳＯ（３％）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（１％）、ｄＮＴＰ（１．４ｍＭ）、それぞれ２０００ｎＭの上記のプライマー対および鋳型（１００ｎｇ）、さらに１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）（最終的に１００，０００倍希釈となる濃度）、ＭｕｔＳ（０．８μｇ）を２５μＬ中に含有する。各サンプルの組成を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
結果を図３に示す。図中、●はサンプル１を、○はサンプル２を、▲はサンプル４をそれぞれ表す。サンプル３、サンプル５及びサンプル６は、蛍光強度が測定期間中、常に０であった。サンプル１とサンプル２の結果を比較すると、サンプル２の方が若干増幅速度が遅くなっている。これはＭｕｔＳを添加しない場合、形成されたプライマーダイマーを鋳型とした非特異的な増幅反応によるプライマーの消費されるため、目的とする領域の増幅効率に若干の影響があったことが理由として考えられる。サンプル４では、本来鋳型ＤＮＡがないため，増幅反応は起こらないはずであるが、時間の経過につれて増幅が見られる。これは、プライマーダイマーの形成に起因する非特異的増幅と考えられる。これに対し、サンプル３では増幅が見られず、ＭｕｔＳが非特異的増幅の抑制に効果的であることが判った。
【実施例２】
【００２９】
［ヒトＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の検出］
ヒトＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝子の検出を行なった。プライマーとして、次の塩基配列からなるプライマーを設計した。各プライマーと標的塩基配列の関係は、図４に示したとおりである。
【００３０】
ＲＡ（Ｒ１＋Ｒ２）／配列番号３
５’−ＧＧＧＡＡＣＣＣＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴＡＣＴＴＡＡＡＡＡＣＣＴＧＴＧＴＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＣＣＡＡＡＡＴＡＴＣ−３’
【００３１】
アウタープライマーＲ３／配列番号４
５’−ＡＧＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＡＴＣ−３’
【００３２】
ＦＡ（Ｆ１＋Ｆ２）／配列番号５
５’−ＣＧＧＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＡＧ−３’
【００３３】
アウタープライマーＦ３／配列番号６
５’−ＣＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＡＴＡＴＴＧＴＡＴＣ−３’
【００３４】
上記塩基配列からなるプライマーを用い、ヒトＣＰＹ２Ｃ遺伝子を組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＥｃｏＲＩで直鎖状にしたもの）１０〜１９ ｍｏｌ／ｔｕｂｅ（約６００００分子）を鋳型とし、６０℃で２時間反応させた。鋳型は２本鎖のまま反応させた。反応液の組成は次のとおりである。
【００３５】
・反応液組成（２５μＬ中）
２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．８
１０ ｍＭ ＫＣｌ
１０ ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4
４ ｍＭ ＭｇＳＯ4
１Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
０．４ ｍＭ ｄＮＴＰ
８Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）
ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）（最終的に１００，０００倍希釈となる濃度）
０．８μｇ ＭｕｔＳ
【００３６】
プライマー：
１６００ｎＭ ＦＡ
１６００ｎＭ ＲＡ
２００ｎＭ Ｆ３
２００ｎＭ Ｒ３
【００３７】
各サンプル反応液の組成を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
結果を図５に示す。図中、●はサンプル１を、▲はサンプル２を、×はサンプル３をそれぞれ表す。サンプル４は、蛍光強度が測定期間中、常に０であった。サンプル３と４を増幅した結果を比べると、ＭｕｔＳが無い場合、鋳型ＤＮＡが無い場合でも１時間を過ぎると非特異的な増幅が観察されたが、ＭｕｔＳの添加により、この非特異的増幅をほぼ完全に抑制できることが判った。これによりＭｕｔＳは特異的配列を検出する感度、特異性が向上する効果があると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ヒトＳＴＳ ＤＹＳ２３７遺伝子に対する各プライマー領域の位置関係を示す図である。
【図２】フォワードプライマーＦ１の立体構造を示す図である。
【図３】実施例１の結果を示す図である。
【図４】ＣＹＰ２Ｃ１９配列に対する各プライマーの位置関係を示す図である。
【図５】実施例２の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応においてプライマーダイマーに結合する物質をサンプルに添加することを特徴とする、プライマーダイマー形成に伴う非特異的な増幅反応を抑制する方法。
【請求項２】
プライマーダイマーに結合する物質が、ミスマッチ認識能を有する物質である請求項１の方法。
【請求項３】
ミスマッチ認識能を有する物質が、ミスマッチ結合タンパク質である請求項２の方法。
【請求項４】
ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物である請求項３の方法
【請求項５】
プライマーダイマーに結合する物質を０．１％〜１０％の濃度でサンプルに添加する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
プライマーダイマーに結合する物質を０．５％〜２％の濃度でサンプルに添加する請求項５の方法。
【請求項７】
プライマーダイマーに結合する物質を０．７％〜１．３％の濃度でサンプルに添加する請求項６の方法。
【請求項８】
プライマーダイマーに結合する物質が、ＤＮＡ組換え能を有する物質である請求項１の方法。
【請求項９】
ＤＮＡ組換え能を有する物質が、ＤＮＡ組換え酵素である請求項８の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡ組換え酵素が、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子または一本鎖結合タンパク質である請求項９の方法。
【請求項１１】
目的とする核酸領域を増幅する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
標的核酸配列の有無を判定する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
標的核酸配列における変異、欠失及び／又は挿入の有無を判定する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
プライマーダイマーに結合する物質が、ミスマッチ認識能を有する物質である請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ミスマッチ認識能を有する物質が、ミスマッチ結合タンパク質である請求項１４方法。
【請求項１６】
ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物である請求項１５の方法。
【請求項１７】
プライマーダイマーに結合する物質が、ＤＮＡ組換え能を有する物質である請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ組換え能を有する物質が、ＤＮＡ組換え酵素である請求項１７の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ組換え酵素が、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子または一本鎖結合タンパク質である請求項１８の方法。
【請求項２０】
核酸増幅方法が、ＰＣＲ法である請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸増幅反応が、等温増幅法である請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
等温増幅反応が、ＳＤＡ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、Ｑベータリプリカーゼ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法からなる群から選択される方法である請求項２１の方法。
【請求項２３】
プライマーが、標的核酸配列を増幅できる少なくとも２種のプライマーセットを含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を第一のプライマーの３’側に含み、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互がハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折り返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる
ことを特徴とする請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応においてプライマーダイマーに結合する物質をサンプルに添加することを特徴とする、プライマーダイマー形成に伴う非特異的な増幅反応を抑制する方法。
【請求項２】
プライマーダイマーに結合する物質が、ミスマッチ認識能を有する物質である請求項１の方法。
【請求項３】
ミスマッチ認識能を有する物質が、ミスマッチ結合タンパク質である請求項２の方法。
【請求項４】
ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物である請求項３の方法
【請求項５】
プライマーダイマーに結合する物質を０．１％〜１０％の濃度でサンプルに添加する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
プライマーダイマーに結合する物質を０．５％〜２％の濃度でサンプルに添加する請求項５の方法。
【請求項７】
プライマーダイマーに結合する物質を０．７％〜１．３％の濃度でサンプルに添加する請求項６の方法。
【請求項８】
プライマーダイマーに結合する物質が、ＤＮＡ組換え能を有する物質である請求項１の方法。
【請求項９】
ＤＮＡ組換え能を有する物質が、ＤＮＡ組換え酵素である請求項８の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡ組換え酵素が、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子または一本鎖結合タンパク質である請求項９の方法。
【請求項１１】
核酸増幅反応においてＲｅｃＡタンパク質、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２及びＭＳＨ６からなる群から選択される一種以上のタンパク質をサンプルに添加することを特徴とする、非特異的な産物の合成及び／又は増幅を防止する方法。
【請求項１２】
目的とする核酸領域を増幅する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
標的核酸配列の有無を判定する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
標的核酸配列における変異、欠失及び／又は挿入の有無を判定する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
プライマーダイマーに結合する物質が、ミスマッチ認識能を有する物質である請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ミスマッチ認識能を有する物質が、ミスマッチ結合タンパク質である請求項１５の方法。
【請求項１７】
ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物である請求項１６の方法。
【請求項１８】
プライマーダイマーに結合する物質が、ＤＮＡ組換え能を有する物質である請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ組換え能を有する物質が、ＤＮＡ組換え酵素である請求項１８の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ組換え酵素が、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子または一本鎖結合タンパク質である請求項１９の方法。
【請求項２１】
核酸増幅方法が、ＰＣＲ法である請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
核酸増幅反応が、等温増幅法である請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
等温増幅反応が、ＳＤＡ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、Ｑベータリプリカーゼ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法からなる群から選択される方法である請求項２２の方法。
【請求項２４】
プライマーが、標的核酸配列を増幅できる少なくとも２種のプライマーセットを含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を第一のプライマーの３’側に含み、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互がハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折り返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる
ことを特徴とする請求項１２〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
核酸増幅反応においてプライマーダイマーに結合する物質をサンプルに添加することを特徴とする、プライマーダイマー形成に伴う非特異的な増幅反応を抑制する方法。
【請求項２】
プライマーダイマーに結合する物質が、ミスマッチ認識能を有する物質である請求項１の方法。
【請求項３】
ミスマッチ認識能を有する物質が、ミスマッチ結合タンパク質である請求項２の方法。
【請求項４】
ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物である請求項３の方法
【請求項５】
プライマーダイマーに結合する物質を０．１％〜１０％の濃度でサンプルに添加する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
プライマーダイマーに結合する物質を０．５％〜２％の濃度でサンプルに添加する請求項５の方法。
【請求項７】
プライマーダイマーに結合する物質を０．７％〜１．３％の濃度でサンプルに添加する請求項６の方法。
【請求項８】
プライマーダイマーに結合する物質が、ＤＮＡ組換え能を有する物質である請求項１の方法。
【請求項９】
ＤＮＡ組換え能を有する物質が、ＤＮＡ組換え酵素である請求項８の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡ組換え酵素が、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子または一本鎖結合タンパク質である請求項９の方法。
【請求項１１】
目的とする核酸領域を増幅する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
標的核酸配列の有無を判定する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
標的核酸配列における変異、欠失及び／又は挿入の有無を判定する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
プライマーダイマーに結合する物質が、ミスマッチ認識能を有する物質である請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ミスマッチ認識能を有する物質が、ミスマッチ結合タンパク質である請求項１４方法。
【請求項１６】
ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物である請求項１５の方法。
【請求項１７】
プライマーダイマーに結合する物質が、ＤＮＡ組換え能を有する物質である請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ組換え能を有する物質が、ＤＮＡ組換え酵素である請求項１７の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ組換え酵素が、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子または一本鎖結合タンパク質である請求項１８の方法。
【請求項２０】
核酸増幅方法が、ＰＣＲ法である請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸増幅反応が、等温増幅法である請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
等温増幅反応が、ＳＤＡ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、Ｑベータリプリカーゼ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法からなる群から選択される方法である請求項２１の方法。
【請求項２３】
プライマーが、標的核酸配列を増幅できる少なくとも２種のプライマーセットを含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を第一のプライマーの３’側に含み、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互がハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折り返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる
ことを特徴とする請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応においてプライマーダイマーに結合する物質をサンプルに添加することを特徴とする、プライマーダイマー形成に伴う非特異的な増幅反応を抑制する方法。
【請求項２】
プライマーダイマーに結合する物質が、ミスマッチ認識能を有する物質である請求項１の方法。
【請求項３】
ミスマッチ認識能を有する物質が、ミスマッチ結合タンパク質である請求項２の方法。
【請求項４】
ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物である請求項３の方法
【請求項５】
プライマーダイマーに結合する物質を０．１％〜１０％の濃度でサンプルに添加する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
プライマーダイマーに結合する物質を０．５％〜２％の濃度でサンプルに添加する請求項５の方法。
【請求項７】
プライマーダイマーに結合する物質を０．７％〜１．３％の濃度でサンプルに添加する請求項６の方法。
【請求項８】
プライマーダイマーに結合する物質が、ＤＮＡ組換え能を有する物質である請求項１の方法。
【請求項９】
ＤＮＡ組換え能を有する物質が、ＤＮＡ組換え酵素である請求項８の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡ組換え酵素が、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子または一本鎖結合タンパク質である請求項９の方法。
【請求項１１】
核酸増幅反応においてＲｅｃＡタンパク質、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２及びＭＳＨ６からなる群から選択される一種以上のタンパク質をサンプルに添加することを特徴とする、非特異的な産物の合成及び／又は増幅を防止する方法。
【請求項１２】
目的とする核酸領域を増幅する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
標的核酸配列の有無を判定する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
標的核酸配列における変異、欠失及び／又は挿入の有無を判定する方法であって、プライマーダイマーに結合する物質とプライマーとをサンプルに添加するステップと、前記サンプルをインキュベートするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
プライマーダイマーに結合する物質が、ミスマッチ認識能を有する物質である請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ミスマッチ認識能を有する物質が、ミスマッチ結合タンパク質である請求項１５の方法。
【請求項１７】
ミスマッチ結合タンパク質が、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはこれらの混合物である請求項１６の方法。
【請求項１８】
プライマーダイマーに結合する物質が、ＤＮＡ組換え能を有する物質である請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ組換え能を有する物質が、ＤＮＡ組換え酵素である請求項１８の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ組換え酵素が、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子または一本鎖結合タンパク質である請求項１９の方法。
【請求項２１】
核酸増幅方法が、ＰＣＲ法である請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
核酸増幅反応が、等温増幅法である請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
等温増幅反応が、ＳＤＡ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、Ｑベータリプリカーゼ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法からなる群から選択される方法である請求項２２の方法。
【請求項２４】
プライマーが、標的核酸配列を増幅できる少なくとも２種のプライマーセットを含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を第一のプライマーの３’側に含み、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互がハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折り返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる
ことを特徴とする請求項１２〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−２５４７８４（Ｐ２００６−２５４７８４Ａ）
【公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−７６５２９（Ｐ２００５−７６５２９）
【出願日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０１２９３６６６）株式会社ダナフォーム (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０１２９３６６６）株式会社ダナフォーム (25)
【Ｆターム（参考）】
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