プロテインキナーゼＡ検出用バイオセンサー及び、これを有するキット
【課題】プロテインキナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ；ＰＫＡ）を特異的に認識するプロテインキナーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＫＩ）ペプチドを含むＰＫＡ検出用バイオセンサー及び、該ＰＫＡ検出用バイオセンサーまたはバイオアレイを有するＰＫＡ関連疾病の診断用キットを提供する。
【解決手段】本発明はプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を特異的に感知するバイオセンサー及び、前記バイオセンサーを有する診断用キットに関するものである。より詳しく、本発明はカンチレバー及び、前記カンチレバー表面に固定されるプロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドを含むＰＫＡ検出用バイオセンサー及び、対象試料、前記ＰＫＡ検出用バイオセンサー及び定量手段を有するＰＫＡ活性増加と関する疾病の診断用キットに関するものである。
【解決手段】本発明はプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を特異的に感知するバイオセンサー及び、前記バイオセンサーを有する診断用キットに関するものである。より詳しく、本発明はカンチレバー及び、前記カンチレバー表面に固定されるプロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドを含むＰＫＡ検出用バイオセンサー及び、対象試料、前記ＰＫＡ検出用バイオセンサー及び定量手段を有するＰＫＡ活性増加と関する疾病の診断用キットに関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテインキナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ；ＰＫＡ）を特異的に感知するバイオセンサー及び、これを有する診断用キットに関するものである。より詳しくは、本発明はカンチレバー（片端固定レバー）及び、このカンチレバー表面に固定されたプロテインキナーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＫＩ）ペプチドを含むＰＫＡ検出用バイオセンサー及び、対象試料、前記ＰＫＡ検出用バイオセンサー及び定量手段を有するプロテインキナーゼ活性増加による疾病の診断用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼはＡＴＰのガンマ−ホスホリル基を蛋白質のセリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）またはチロシン（Ｔｙｒ）残基のヒドロキシル基に伝達する反応を触媒するもので、多様な細胞信号経路に重要な役割を果たす（非特許文献１）。プロテインキナーゼ活性の増加は普通癌、心血管症候群（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、免疫疾患、内分泌障害などの各種疾病状態で発見される。したがって、このような酵素は、前記疾病に関与すると考えられ、これに関する特異的な阻害剤の開発が活発に行われてきた。
【０００３】
特に、多様なプロテインキナーゼの中で、その性質が最も明らかになったプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）は、他のプロテインキナーゼの原型（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）として使用される。ＰＫＡはｃＡＭＰがない時、主に２つの調節サブユニットと２つの触媒サブユニットで構成される不活性状態の４量体ホロエンザイムとして存在する。細胞内ｃＡＭＰの濃度が増加すると、このような不活性ＰＫＡの調節サブユニットにｃＡＭＰが結合し、調節サブユニットと触媒サブユニットとの結合力を弱化させることによって、ホロエンザイムの、活性を有する触媒サブユニットが、調節サブユニットから分離され各種リン酸化反応を進行させる。また、活性を有する触媒サブユニットは生体内にある熱安定性抑制蛋白質であるプロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）との結合で活性が阻害される調節メカニズムも存在することが知られている。
【０００４】
特定の癌細胞はＰＫＡの触媒サブユニットを細胞外部に排出することに基づいて、細胞外ＰＫＡ触媒サブユニットと癌との相関関係が報告されている（非特許文献２）。このように排出される蛋白質は極少量であるので、特定の蛋白質を高い感度で定量的に測定する技術の重要性が強調されている。
【０００５】
今までプロテインキナーゼ活性を分析する多くの方法が開発された。このような方法としては、リン酸化された基質を分離する過程を必要とする放射性同位元素を利用する方法、リン酸化した基質を認識する抗体を利用する免疫反応分析法（ＥＬＩＳＡ）と最近開発された蛍光に基づく蛍光偏光度及び時間差蛍光共鳴エネルギー遷移（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用する非放射性分析法などがある。
【０００６】
最近、技術的発展でペプチドと蛋白質との間の相互作用を分析する多くの方法が開発されているが、特に、ペプチド−蛋白質結合研究に蛍光偏光法と毛細管電気泳動を利用する分析法がよく確立されている。しかし、このような方法で活性化したキナーゼを直接定量する方法は、酵素活性分析法やＥＬＩＳＡによる信号増幅法に比べて感度が良くないことが現実である。さらに、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）技術は生体分子相互作用分析のための効果的な技術として知られているが、非常に複雑であるという短所を有する。
【０００７】
前記のように感度が低いか複雑な従来のペプチド−蛋白質結合測定法の問題が改善された高感度の簡便な測定技術の開発が要求される。
【非特許文献１】Ｈ．Ｃ．Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｍ．Ａ． Ｏｏｓｔｅｒｗｅｇｅｌ， Ｋ．Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌ， ＴＯＤＡＹ １４（１９９３）５９２−５９７
【非特許文献２】Ｙｅｅ Ｓｏｏｋ Ｃｈｏｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９７（２）（２０００）８３５−８４０
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｏｆｆｉｎ，Ｍ．Ｌａｔｅｖ，Ｘ．Ｂｉ，Ｔ．Ｔ．Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７８（２０００）２０６−２１２
【非特許文献４】Ｊ．Ｌｅｗ， Ｎ．Ｃｏｒｕｈ， Ｉ．Ｔｓｉｇｅｌｎｙ， Ｓ．Ｇａｒｒｏｄ， Ｓ．Ｓ．Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）１５０７−１５１３
【非特許文献５】Ｙ．Ｌｅｅ， Ｅ．Ｋ．Ｌｅｅ， Ｙ．Ｗ．Ｃｈｏ，Ｔ．Ｍａｔｓｕｉ， Ｉ．−Ｃ．Ｋａｎｇ， Ｔ．−Ｓ．Ｋｉｍ， Ｍ．Ｈ．Ｈａｎ， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ３（２００３）２２８９−２３０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を特異的に認識するプロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドを含むＰＫＡ検出用バイオセンサーを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の課題は、前記のようなＰＫＡ検出用バイオセンサーまたはバイオアレイを有するＰＫＡ関連疾病の診断用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明はＰＫＡの活性部位であるＰＫＡ触媒サブユニットを特異的に認識するＰＫＩペプチド基板のＰＺＴ微細カンチレバーセンサーを利用して極少量の蛋白質を選択的に感知する検出技術を提供する。
【００１１】
一般に、プロテインキナーゼが活性化すると、活性化した酵素によって生成されるリン酸化した産物を測定する酵素活性分析法で信号を増幅させることで分析できるが、活性化したキナーゼの直接的な測定は酵素の状態とキナーゼを媒介とした現象に対するより正確な情報を提供すると期待される。したがって、本発明ではＰＫＡ、特にＰＫＡの触媒サブユニットに対して強い親和力を有するＰＫＡ阻害蛋白質であるＰＫＩのアミノ酸配列のうち５番目から２４番目までのアミノ酸配列を含むＰＫＩペプチドを利用し、極少量の結合を感知するのに適したカンチレバーセンサーを利用して活性化したＰＫＡを直接的に測定できるナノバイオセンサーアッセイ（ｎａｎｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ａｓｓａｙ）を開発した。
【００１２】
活性化した形態であるＰＫＡの触媒サブユニットを特異的に検出する方法は、主にキナーゼ活性による放射性同位元素及び抗体を利用する分析法と、ＰＫＡを認識する抗体を利用するウェスタン−ブロットなどが使用されてきたが、このような方法は有害な放射性同位元素を使用したり、低い検出限界などの短所を持っている。
【００１３】
そこで、本発明はＰＫＡに対するペプチドリガンド基盤のセンサーシステムに関するもので、具体的には、前記蛋白質の活性サブユニットである触媒サブユニットを特異的に認知するＰＫＩペプチドを利用する分析法を考案し、これを最適化して蛋白質との直接的な特異結合を定量分析に利用した。本方法ではＰＫＩペプチドをカンチレバー表面に固定させてＰＫＡの触媒サブユニットを捕獲することによって、放射性同位元素を利用する活性アッセイ法に比べて１００倍以上の感度と大きい躍動範囲（ダイナミックレンジ）を示し、蛍光偏光を利用する直接結合分析及び酵素付き抗体を利用する信号増幅法に比べても非常に感度の良い定量分析技術を提供する。本発明によると、癌、心血管症候群、免疫疾患、内分泌障害などの各種疾病状態標識分子である前記ＰＫＡの触媒サブユニットを特異的で簡便に検出できるので、前記疾病の診断に有用に適用することができる。
【００１４】
本発明の目的は、ＰＫＩペプチドリガンドを基盤としたＰＫＡ感知センサーを開発するための条件を最適化することにある。このために、ＰＫＡ触媒サブユニットと、その結合リガンドであるＰＫＩペプチドとの間の結合条件、特に、ＡＴＰ及びその濃度による影響を試験するために、マグネチックビーズ、毛細管電気泳動、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び蛍光偏光度分析法などを利用した。そして、ナノメカニカルＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３（ＰＺＴ）カンチレバーを製作してＡＴＰの有無によってセンサー表面に固定化したＰＫＩペプチドとＰＫＡ触媒サブユニットとの結合程度を測定し、その結果を利用してＰＫＡ触媒サブユニットを定量的に分析することを成功した。
【００１５】
最近、極度に弱い力、機械的な圧力と質量を測定するために微細カンチレバーに基づいたセンサーが開発されて前例のない感度と躍動範囲（ｄｙｎａｍｉｃ−ｒａｎｇｅ）で特定生体分子間の相互作用が測定できるようになった。初期に、このようなセンサーは主に空気中の構成物を検出するのに使用されたが、次第にカンチレバーの一側に薄い膜をコーティングしたり、生体分子認識因子を固定化して、溶液中にある特定物質を検出するのに関心が集まっている。一般に、カンチレバーは躍動状態と静的状態の両方で特定物質との結合を測定することができる。カンチレバーの２つの面の間の吸着による表面緊張の差は静的状態で測定できるが、狭い躍動範囲と寄生偏向のような限界を持っている。
【００１６】
反面、躍動モードカンチレバーは結合する表面における質量変化または硬度等、カンチレバーの機械的性質による共鳴振動数の変化（ｒｅｓｏｎａｎｃｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｈｉｆｔ）を測定するもので、これを利用する感知法は寄生偏向から生じる偏向信号（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）の変化に影響を受けないという長所を持つ。本発明は、前記のような特性を有するカンチレバーを使用して対象物質の検出感度を改善させたものである。
【００１７】
つまり、本発明はカンチレバー及び、前記カンチレバー表面に固定されたＰＫＩペプチドを含むＰＫＡ検出用バイオセンサー及び、検出対象試料、前記ＰＫＡ検出用バイオセンサーまたはバイオセンサーアレイ及び定量手段を有するプロテインキナーゼ活性増加と、それに関連する疾病の診断用キットに関するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明はＰＫＡに特異的に結合するＰＫＩから由来するペプチドに基づくＰＺＴ微細カンチレバーセンサーを用いた定量分析法で、癌標識分子であるＰＫＡ触媒サブユニットを従来の活性分析法より１００倍以上の感度で検出できるので、極微量の癌標識因子を検出する癌診断試験に有用に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００２０】
まず、本発明はカンチレバーと、前記カンチレバー表面に固定されたＰＫＩペプチドを含むＰＫＡ検出用バイオセンサーを提供する。
【００２１】
前記カンチレバーは幅が５乃至１００μｍの範囲にあり、長さは１０乃至３００μｍの範囲であるのが好ましい。カンチレバーの大きさが前記範囲より大きい場合には、所望する検出限界を得ることが難しく、より小さい場合には、高い検出限界を有するが、再現性を確保することが難しく、製造工程も複雑であるため、本発明のカンチレバーの大きさは前記の範囲にあるのが好ましい。カンチレバーの材質は躍動モードのカンチレバーで、メンブレン材質は高弾性特性を有するのが好ましく、ケイ素、窒化ケイ素（ＳｉＮｘ；ｘ＝１乃至１．５）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、ジルコニア（ＺｒＯ２）及びアルミナ（Ａｌ２Ｏ３）からなる群の中より選択された１つ以上の物質であるのが好ましい。例えば、本発明に使用されるカンチレバーは、５０×１５０×２μｍ（横×縦×厚さ）の大きさのＳｉウエハー表面に、前記メンブレン材質で窒化ケイ素が蒸着されたＳｉＮｘ／Ｓｉ基板で製作されたものであってもよい。また、前記カンチレバーは適切に表面改質されたものであってもよい。前記表面改質は能動型カンチレバーのための圧電薄膜を形成させるためで、表面改質物質としてＰｂ系ペロブスカイト酸化物または酸化亜鉛（ＺｎＯ）等を利用することができる。例えば、圧電薄膜形成は乾式あるいは湿式でＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３を表面に蒸着させて行ってもよい。本発明の一具体例において、前記カンチレバーはＳｉＮｘ／Ｓｉ基板にＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３が蒸着されたナノメカニカルＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３（ＰＺＴ）カンチレバーであり得る。
【００２２】
前記ＰＫＩペプチドはＰＫＡ触媒サブユニットと特異的に結合するペプチドである。前述した通り、ＰＫＡは２つの調節サブユニットと２つの触媒サブユニットで構成された４量体ホロエンザイムで、前記のように触媒活性を有する前記触媒サブユニットが調節サブユニットと結合して４量体状態で存在する場合は不活性の状態であり、触媒サブユニットがｃＡＭＰによって調節サブユニットと分離され遊離された状態で存在すれば活性化した状態となる。前記ＰＫＩは遊離された触媒サブユニットに特異的に結合するペプチドで、全ての哺乳類のＰＫＩを用いることができ、好ましくは、ヒトＰＫＩ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＢ２１１４１；ｍｔｄｖｅｔｔｙａｄ ｆｉａｓｇｒｔｇｒｒ ｎａｉｈｄｉｌｖｓｓ ａｓｇｎｓｎｅｌａｌ ｋｌａｇｌｄｉｎｋｔ ｅｇｅｅｄａｑｒｓｓ ｔｅｑｓｇｅａｑｇｅ ａａｋｓｅｓ；配列番号：１）を使用することができる。本発明で使用されるＰＫＩペプチドは、ＰＫＡの触媒サブユニットとの特異な結合活性を考慮して、少なくともＰＫＩの５番目から２４番目までの２０個のアミノ酸残基（ＴＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ；配列番号：２）を有するアミノ酸配列を含む２０乃至７６個のアミノ酸からなるペプチドであってもよく、より好ましくは、前記ＰＫＡの触媒サブユニットに特異的に結合するＰＫＩペプチドは５番目から２４番目までの２０個のアミノ酸残基「ＴＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ」（配列番号：２）を有するアミノ酸配列であるのが好ましい。前記アミノ酸番号は開始コドンによるアミノ酸であるメチオニンを除いて、その次のアミノ酸から算出したものである。
【００２３】
前記ＰＫＩペプチドは通常の如何なる化学的カップリング方法でも、カンチレバー表面に固定化できる。例えば、前記ＰＫＩペプチドの末端にビオチンを結合させて複合体を形成し、前記カンチレバー表面にストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を固定化し、ＰＫＩペプチドに結合されたビオチンとカンチレバー表面に固定化したストレプトアビジンとの相互作用によってＰＫＩペプチドをカンチレバー表面に固定化することができる。或いは、エポキシ基を有する物質でカンチレバー表面をコーティングし、ペプチドのアミノ基と反応をさせる方法でペプチドをカンチレバー表面に固定化することもできる。この他にも、ペプチドを表面に固定化できる全ての化学的カップリング方法を用いることができ、このような方法は当業者によく知られている。
【００２４】
本発明のＰＫＡとＰＫＩの結合有無は、カンチレバーの共鳴振動数変化によって測定できる。したがって、前記バイオセンサーは共鳴振動数変化の測定装置を追加的に有することができる。
【００２５】
本発明の前記バイオセンサーは、前記ＰＫＩが表面に固定されたカンチレバーを２つ以上備えてもよい。この場合、カンチレバーの個数は所望の検出感度と対象試料種類などによって適切に調節でき、通常３個乃至１２個にできる。また、カンチレバー間の間隔は特に制限しないが、最上の検出感度を得るために、１００乃至５００μｍが好ましい。この範囲より間隔が狭い場合には干渉の影響があり得て、反対に広い場合はチップの大きさが過剰に大きくなる短所がある。
【００２６】
また、他の側面において、本発明は検出対象試料と、前記バイオセンサーと、検出手段を含むＰＫＡの活性化に関連する疾患の診断用キットを提供する。
【００２７】
癌、心血管症候群、免疫疾患、内分泌障害などの各種疾病状態でＰＫＡの活性増加が観察されるので、ＰＫＡの活性を測定することによって、前記疾病を診断できる。ＰＫＡの活性は活性化状態である解離触媒サブユニットの存在水準で決定でき、解離触媒サブユニットの存在水準は、これと特異的に結合するＰＫＩペプチドとの結合程度によって測定できる。したがって、前記バイオセンサーまたはバイオアレイに固定化されたＰＫＩペプチドのＰＫＡ触媒サブユニットとの結合程度を測定してＰＫＡの活性化と関連する疾患を簡便で容易に診断できる。本発明の診断用キットによって診断可能なＰＫＡの活性化によって診断可能な疾病は、癌、心血管症候群、免疫疾患、内分泌障害、脳卒中、感染性疾患からなる群の中から選択されたものでもよい。
【００２８】
前記調節サブユニットから分離されて活性化したＰＫＡ触媒サブユニットは、ＡＴＰの存在下でＰＫＩペプチドと効果的に結合するので（下記の実施形態１参照）、本発明の診断用キットはＰＫＡ活性の検出効率を高めるために、ＡＴＰ溶液を追加的に含むことができる。つまり、検出対象試料を適切な濃度のＡＴＰ溶液と反応させて、前記試料内のＰＫＡを活性化することができる。この時、試料内ＰＫＡを効果的に活性化するために、前記ＡＴＰの濃度は１０乃至１０００μＭであるのが好ましく、１０乃至５００μＭであるのがさらに好ましい。
【００２９】
前記検出対象試料は患者から得たもので、患者の如何なる細胞または組織でもよいが、好ましくは、血液、血漿などの最少侵襲で確保可能な試料または分泌体液からなる群の中から選択されるが好ましい。前記患者は如何なる哺乳類でもよいが、好ましくはヒトである。
【００３０】
本発明の診断用キットに含まれる検出手段は試料内のＰＫＡと前記バイオセンサのカンチレバー表面に固定化されたＰＫＩとの結合を検出する全ての手段を含む。例えば、前記検出手段はカンチレバーの共鳴振動数変化を測定する手段であり得る。
【００３１】
以下、本発明を実施形態を通じてより詳しく説明する。しかし、これらの実施形態は本発明の例示に過ぎず、本発明の範囲がこれら実施形態によって制限されるわけではない。
【実施例】
【００３２】
下記の実施形態において、本発明者らはＰＫＡ触媒サブユニットを特異的に認識するＰＫＩペプチド基盤のＰＺＴ微細カンチレバーセンサーを利用して、従来の活性分析法より１００倍以上の感度を有する方法を考案し、これを実施した。本発明の実施形態ではＰＫＡ触媒サブユニットとペプチドリガンドであるＰＫＩペプチドとの結合を蛍光偏光法と毛細管電気泳動、ＳＰＲ及びＥＬＩＳＡ法を利用して測定した。また、それぞれについてＡＴＰがＰＫＡ触媒サブユニットとＰＫＩペプチドの結合に与える影響を調べた。さらに、本発明の実施形態ではＰＺＴ微細カンチレバーにＰＫＩペプチドを固定化してＰＫＡ触媒サブユニットの検出限界とＡＴＰが結合に与える影響も調べた。
【００３３】
実施形態１：ＰＫＩペプチドによるＰＫＡ活性阻害及びＰＫＡ−ＰＫＩ結合に対するＡＴＰの影響
１．１．蛍光偏光度を利用するＰＫＡ活性測定によるＰＫＩペプチドのＰＫＡ活性阻害測定による結合分析
本実施形態では蛍光標識された基質ペプチドがリン酸化されると、陽イオン性ポリアミノ酸と選択的な結合を行うことによって、蛍光偏光度増加を誘発させる原理を利用したキナーゼアッセイ（非特許文献３）を使用し、本実施形態に適合するようにその条件を最適化した。正味の電荷（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）値が０である蛍光標識された基質ペプチドを使用して、キナーゼによってリン酸化されて陰電荷を帯びると、陽イオン性ポリアミノ酸との静電気的な相互作用で結合が生じるので、これによる蛍光偏光度の変化を測定してキナーゼの活性を分析した。
【００３４】
ＰＫＡに対する分析条件を最適化するために、ＰＫＡの基質であるｋｅｍｐｔｉｄｅ（ＬＲＲＡＳＬＧ）のＮ−末端に蛍光標識分子であるフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を付着し、これを含んで全電荷が０になるようにして、ＰＫＡによってリン酸化されると、（−）電荷を帯びるように設計したものを購入した（Ｆ-ｋｅｍｐｔｉｄｅ；ＰＥＰＴＲＯＮ社、韓国）。このような基質ペプチドであるＦ−ｋｅｍｐｔｉｄｅ（１μＭ）を使用して、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴの緩衝溶液で１００μＭのＡＴＰ存在下でＰＫＡと反応させた。反応後、Ｆ−ｋｅｍｐｔｉｄｅの最終濃度が０．１μＭになるように、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝溶液（ｐＨ７．５）に希釈し、ｐｏｌｙ−Ａｒｇ（ＭＷ７５，０００〜１５０，０００）の濃度を増加させながら蛍光偏光度を測定した。蛍光偏光度は発光測定器（ＬＳ−５０Ｂ ｌｕｍｉｎｏｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、米国）を使用して、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５２０ｎｍで測定した。
【００３５】
前記で得られた結果を図１のＡに示した。前記図１のＡから分かるように、ＰＫＡと反応後のＦ−ｋｅｍｐｔｉｄｅはｐｏｌｙ−Ａｒｇの濃度が増加することによって蛍光偏光度が顕著に増加したが、ＰＫＡと反応をさせなかったＦ−ｋｅｍｐｔｉｄｅの場合には蛍光偏光度がほとんど増加しなかった。反面、ｐｏｌｙ−Ａｒｇを添加しなかった時には、リン酸化された基質とリン酸化されていない基質の蛍光偏光度値の差がなかった。
【００３６】
リン酸化された基質とリン酸化されていない基質の蛍光偏光度値の差が最大であるｐｏｌｙ−Ａｒｇの最適濃度は５μＭに決め、この濃度でＰＫＡの時間に応じる反応を前記の方法で測定した。その結果、ＰＫＡとの反応時間が増加することによって蛍光偏光度が増加し、飽和した結果を示し、これを図１のＢに示した。
【００３７】
また、蛍光偏光度を利用する活性阻害分析のために、Ｎ−末端にビオチンを有するＰＫＩペプチド（５番目から２０番目までの２０個のアミノ酸残基を持つ）であるビオチン−ＰＫＩ（５−２４）（ビオチン−ＴＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ；配列番号：２）を合成した（ＰＥＰＴＲＯＮ社、韓国）。多様な濃度のビオチン−ＰＫＩ（５−２４）存在下に１３．２ｎＭのＰＫＡと１μＭのＦ-ｋｅｍｐｔｉｄｅを混合して室温で１５分間反応させた後に分析した結果、蛍光偏光度値がＰＫＩ濃度に逆比例することが分かり、ＩＣ５０値が約５４ｎＭであった（図２参照）。
【００３８】
その後、磁性を持つビーズ（Ｍ−２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ、Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ノルウェー）にビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を固定してＰＫＡを捕集する実験を実施した。ストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズにビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用してビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を固定化した後、ＡＴＰがある場合とない場合の条件で１３．２ｎＭのＰＫＡを含んでいる緩衝溶液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）にビーズ濃度を変化しながら添加して、１分間反応させた。ビーズを除去した後、上澄液を取ってＰＫＡの活性を分析した。その結果、ＰＫＡはビーズのＰＫＩペプチド結合するが、４００μＭのＡＴＰがある時にビーズにさらによく結合することが明らかになり、これはＡＴＰがＰＫＡ−ＰＫＩ結合を促進することを意味する。このような結果はＰＫＩ蛋白質によるＰＫＡの阻害においてＡＴＰのｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ（協同結合）が必要であるという従来の報告と一致する（非特許文献４）。
【００３９】
１．２．毛細管電気泳動とＳＰＲを利用したＰＫＡ−ＰＫＩ結合に対するＡＴＰの影響
ＰＫＡ−ＰＫＩ結合に対するＡＴＰの影響を毛細管電気泳動で分析するために、Ｎ−末端にフルオレセインで蛍光標識されたＦ−ＰＫＩ（５−２４）を合成した（ＰＥＰＴＲＯＮ社、韓国）。毛細管電気泳動装置は溶融シリカ（ｆｕｓｅｄ−ｓｉｌｉｃａ）ｃａｐｉｌｌａｒｙ（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ社、米国；長さ２７ｃｍ、内径５０μｍ）が装着されたＢｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ５０００ ＣＥ−ＬＩＦ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社、米国）を使用して実施した。システムに付属している４８８ｎｍ波長の３ｍＷアルゴンイオン（Ａｒ−ｉｏｎ）レーザーで蛍光物質を励起させ、５２０±１０ｎｍのフィルターで、発光したシグナルはＬＩＦ検出器によって捕集した。分析及び毛細管処理に使用された全ての溶液は０．２μｍ孔径（ｐｏｒｅ−ｓｉｚｅ）フィルターでろ過し、毛細管は１ＮのＮａＯＨと蒸溜水をそれぞれ５分間流して洗浄した後に使用し、各電気泳動の間には１ＮのＮａＯＨ、蒸溜水、緩衝溶液で２分ずつ毛細管を洗浄した。試料は０．５ｐｓｉで１秒間注入され、１０．８ｋＶの電気をかけて分離した。電気泳動用緩衝溶液は５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１ＭのＮＤＳＢ−１９５、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭのＤＴＴを含んでいて、ＰＫＡ−ＰＫＩ反応溶液に５ｍＭのＭｇＣｌ２を追加的に添加した。
【００４０】
１ＭのＮＤＳＢ−１９５と０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００がガラス表面のペプチドの吸着を減少させることが知られており、これらを緩衝液に添加して再現性のあるペプチドピークを得、その結果を図３に示した。図３から分かるように、ＡＴＰが含まれていない緩衝液にＦ−ＰＫＩ（５−２４）とＰＫＡを添加して毛細管電気泳動で分析した時、ＰＫＡがない場合に比べてＦ−ＰＫＩ（５−２４）のピーク値がほとんど減少していない。反面、Ｆ−ＰＫＩ（５−２４）とＰＫＡの複合体ピークを分離してみることはできなかったが、ＡＴＰの濃度が増加することによってＦ−ＰＫＩのピークが減少し、このような結果はＡＴＰがＦ−ＰＫＩ（５−２４）とＰＫＡの複合体形成に寄与することを間接的に証明する。一方、５００μＭのＡＴＰとＦ−ＰＫＩのみを混合した場合、Ｆ−ＰＫＩ（５−２４）ピークの変化はなかった。
【００４１】
次に、ＰＫＡ−ＰＫＩ結合に対するＡＴＰの影響をＳＰＲ分析器であるＢｉａｃｏｒｅ３０００ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉａｃｏｒｅ社、米国）を利用して分析した。ＣＭ５ ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ（Ｂｉａｃｏｒｅ社、米国）表面をＮ−エチル−Ｎ'−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ，Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）で活性化した後、５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンを流してアミンカップリング法でセンサー表面にストレプトアビジンを固定化した。このように固定されたストレプトアビジンにビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を５μＭ／ｍｉｎの速度で１００秒間流して結合させた後、このセンサーに１３２ｎＭのＰＫＡをＡＴＰ濃度を変化させながら混合した溶液を３０μＭ／ｍｉｎの速度で１００秒間流した後、２００秒間緩衝溶液を流して計測図を得て、これを図４に示した。
【００４２】
前記図４に示された結果から、ビオチン−ＰＫＩ（５−２４）が固定されたセンサー表面にＰＫＡが相互作用することにおいてＡＴＰの濃度が影響を与えるということが分かった。ここで、ＡＴＰの濃度増加によってＰＫＡのｏｎ−ｒａｔｅは増加し、ｏｆｆ−ｒａｔｅは減少する傾向が見られた。ＰＫＩの代わりにＰＫＡに対する親和力が１０μＭ以上の結合力の弱いペプチドであるビオチン−Ａｌａ−ｋｅｍｐｔｉｄｅ（ビオチン−ＬＲＲＡＡＬＧ）で同じ実験を行った時には、高濃度のＡＴＰ存在下でもＰＫＡの結合が全く見られなかった。
【００４３】
１．３．蛍光偏光度を利用したＰＫＡ−ＰＫＩ結合分析
ＰＫＡ−ＰＫＩ結合をより直接的に確認するために、Ｆ−ＰＫＩ（５−２４）を利用して前記実施形態１の方法で蛍光偏光度を測定及び分析し、その結果を図５のＡに示した。前記図５のＡから分かるように、１３．２、６６、１３２ｎＭのＰＫＡに対して各々ＰＫＡの濃度が一定な状態で、ＡＴＰの濃度が増加することによって蛍光偏光度が増加して飽和状態に到達することが分かる。１００ｎＭのＦ−ＰＫＩ（５−２４）を５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ緩衝溶液に混合してＰＫＡの濃度を変化させながら蛍光偏光度を測定して、その結果を図５のＢに示した。図５のＢに示されているように、１００μＭのＡＴＰを添加した場合にはＰＫＡ５３ｎＭまでその値が線形的に増加し、ＡＴＰ不在時に非特異結合による微々たる蛍光偏光変化が現れた。
【００４４】
実施形態２：微細カンチレバー分析
バイオセンサーとして利用するために外部発振器（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ）より電気的信号分析が便利なｓｍａｒｔ ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌで構成されたＰＺＴナノメカニカルカンチレバーセンサーアレイを製作した。
【００４５】
１００ｍｍ直径のｐ−ｄｏｐｅｄ Ｓｉウエハーに低圧化学蒸着法（ＬＰＣＶＤ）で１．２μｍ厚さの低応力シリコンナイトライドを蒸着した。Ｐｔ／Ｔａ薄膜の下部電極をシリコンナイトライド／シリコン基板にＲＦマグネトロンスパッタリングした後、基板にジオール系ゾル−ゲル技法によって０．５μｍＰＺＴ薄膜を成膜した。ここに、ＤＣスパッタリングで上部電極にＰｔ層を集積して金属−強誘電体−金属型蓄電器(ｍｅｔａｌ−ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒｉｃ−ｍｅｔａｌｃａｐａｃｉｔｏｒ）構造を作った。
【００４６】
イオンミリング（ｉｏｎ ｍｉｌｌｉｎｇ）方式で上部電極でＰｔをエッチングした後、誘導結合プラズマを利用して圧電物質であるＰＺＴをエッチングした。Ｐｔ下部電極もやはりイオンミリングでパターニングし、下部ＳｉＮｘ窓は反応性イオンエッチングでパターニングした後、ＫＯＨシリコンエッチング液で湿式エッチング処理した。最後に、反応性イオンエッチングでＳｉＮｘエッチングしてカンチレバーを完成し、ＳｉＯ２薄膜を蒸着して電気化学的保護層を作った。本実施形態のバイオセンサーは３または１２個のカンチレバーアレイで構成し、各カンチレバーの寸法は５０μｍ×１５０μｍになるようにした。
【００４７】
ＰＫＡ結合アッセイのために、前記のように製作されたカンチレバー表面を次の通りに機能化し、このように製作されたカンチレバーを図６のＡに模式的に示した。
【００４８】
まず、電子ビーム蒸発器(ｅ−ｂｅａｍ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を利用して、ナノメカニカルＰＺＴカンチレバーの下部ＳｉＮｘ面上にＣｒ（１０ｎｍ）／Ａｕ（５０ｎｍ）層を蒸着した。このように処理したカンチレバーをＨ２Ｏ２：Ｈ２ＳＯ４（１：４ ｖｏｌ／ｖｏｌ）溶液と脱イオン水で順次に洗浄した。洗浄されたカンチレバー表面上に蛋白質のアンモニウムイオンを認識して固定化させることができるＣａｌｉｘｃｒｏｗｎ（ａｃａｌｉｘａｒｅｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を処理して、自己組織化単分子層（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；ＳＡＭ）を形成した（非特許文献５）。次に、ストレプトアビジン（１０μｇ／ｍｌ ＰＢＳ中）を常温で一時間処理してＣａｌｉｘｃｒｏｗｎ ＳＡＭにストレプトアビジンを固定した後、３０ｍｌのＰＢＳＴ（ＰＢＳ中、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）で洗浄して、窒素ガス下で乾燥させた。非特異結合を最少化するために、前記のように処理されたカンチレバーを５％のＢＳＡを含むＰＢＳに常温で一時間浸漬してＰＢＳＴで洗浄した後、２００ｎＭのビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を含むＰＢＳ緩衝溶液で常温で一時間処理して３０ｍｌのＰＢＳＴで洗浄した後、窒素ガス下で乾燥させた。ビオチン−ＰＫＩ（５−２４）が固定されたカンチレバーに常温で３０分間ＰＫＡ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２中、１ｍＭのＤＴＴ）を処理し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴで洗浄した後、精密インピーダンス解析器（４２９４Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＵＳＡ）でカンチレバーの共鳴振動数を測定して、その結果を図６のＢに示した。
【００４９】
Ｃａｌｉｘｃｒｏｗｎ ＳＡＭで表面処理されたカンチレバーにストレプトアビジンを固定化した後、ビオチン−ＰＫＩを結合させてＰＫＡ−ＰＫＩの結合に対するＡＴＰの影響を調べるために、ＡＴＰの有無によって多様な濃度のＰＫＡを含む反応溶液に反応させた。ＰＫＡ−ＰＫＩ結合を定量的に測定するために、３個の同じ大きさ（５０μｍ×１５０μｍ）のカンチレバーアレイセンサーを使用した。カンチレバーの共鳴振動数が飽和された値に至るまで反復的に測定した時、ＡＴＰを含む場合に共鳴振動数がさらに大きく変化し、この結果はＡＴＰがＰＫＡ−ＰＫＩの結合を助けるということを意味する。
【００５０】
次に、このような結合を定量的側面で測定した。図７のＣに示したように、ＡＴＰ存在時にＰＫＡの活性サブユニットの濃度が増加することによって、共鳴振動数の差も増加することが確認された。また、ＡＴＰ存在時に活性化したＰＫＡを探知することにおいて、感度限界は１０ｐＭ以下であると確認された。これは微細カンチレバーとＰＫＡ触媒サブユニットに対する特異的ペプチドの組合わせで、簡単で直接的に活性化したＰＫＡに対するセンサーシステムを提供する。また、このようなペプチド基盤のカンチレバーセンサーは活性化した形態のＰＫＡが特定癌腫細胞株から細胞外部に排出されるという点を考慮すると、癌などの診断にも利用できる。
【００５１】
比較例１：３２Ｐ−ＡＴＰを利用した活性測定
前記のような本発明のカンチレバーセンサーによる測定と比較するために、放射性同位元素を利用したＰＫＡの活性測定を行った。ＰＫＡの基質ペプチドとしてｋｅｍｐｔｉｄｅ １０μＭ）を使用して、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ緩衝溶液で３２Ｐ−ＡＴＰ（５μＣｉ）を含む５０μＭのＡＴＰ存在下でＰＫＡ触媒サブユニットの濃度を変化させながら、試料当り５０μＬの容量で常温で１５分間反応させた。反応試料に１０μＬの３０％（ｖ／ｖ）リン酸を添加して反応を停止させた後、リン酸化したｋｅｍｐｔｉｄｅの放射能定量のために停止した反応試料のうちの４０μＬをＰ８１ホスホセルロースペーパーにスポッティングして、多量の脱イオン水で５回以上３時間程度十分に洗浄し、反応していない３２Ｐ−ＡＴＰを除去し、Ｐ８１ホスホセルロースペーパーを乾燥した後、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｉｍａｇｅｒ（ＢＡＳ３２Ｐ−ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）にて放射能定量を行った。前記で得られた結果を図７のＡに示し、これから少なくとも１ｎＭ以上のＰＫＡで活性分析が可能であることが分かった。
【００５２】
比較例２：Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）を利用する分析
本発明のカンチレバーセンサーによる測定と比較するための他の方法として、抗体に付着された酵素による信号増幅が可能なＥＬＩＳＡを利用する検出方法でＰＫＡ−ＰＫＩ結合を分析した。ストレプトアビジンがコーティングされた９６−マイクロウェルプレートにビオチン−ＰＫＩ（５−２４）ペプチドをＰＢＳＴ緩衝溶液（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中で結合させた後、５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれているＰＢＳＴにＰＫＡ触媒サブユニットの濃度を異ならせて添加し、１時間程度反応させた。５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれた３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＫＡ触媒サブユニットを特異的に認識する抗体（マウスモノクローナル抗体、ａｂｃａｍ社、ＵＫ）を５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれたＰＢＳＴに１／５００に希釈した１００μＬずつ添加した後、常温で１時間結合させた。
【００５３】
再び、５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれた３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した後、この抗体を認識する二次抗体であるＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）付着された抗体（ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ、ａｂｃａｍ社、ＵＫ）を５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれたＰＢＳＴに１／５，０００に希釈して、１００μＬずつ添加して１時間結合させた。５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれた３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（３，３，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＧｅｎＤＥＰＯＴ社、ＵＳＡ）１００μＬを添加して約３０分間反応させた後、１００μＬのＴＭＢ停止緩衝液（ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ）（ＧｅｎＤＥＰＯＴ社、ＵＳＡ）を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５４】
その結果を図７のＢに示し、これから少なくとも１ｎＭ以上のＰＫＡで吸光度変化による信号感知が可能であることが分かった。
【００５５】
結果
前記比較例１及び２からの結果と、均質蛍光偏光測定による結合分析結果を実施形態のカンチレバーから得られたデータを比較して、図８のＡ、Ｂに示した。
【００５６】
図８から分かるように、本発明のＰＫＩペプチドをカンチレバー表面に固定してＰＫＡの触媒サブユニットの結合を共鳴振動数で分析した方法が、放射線同位元素を利用する活性測定法に比べて１００倍以上の感度と大きい躍動範囲を示し、蛍光偏光を利用する直接結合分析及び酵素付き抗体を利用する信号増幅方法に比べて非常に感度が優れていることが分かる。結論的に、微細カンチレバーとＰＫＡ触媒サブユニットに対する特異なペプチドの組合わせで、簡単で直接的な活性化したＰＫＡに対するセンサーシステムを使用すると、極微量のＰＫＡ触媒サブユニットを二次的信号増幅なく従来方法に比べて簡単に定量することができ、このような方法はＰＫＡ触媒サブユニットを測定する癌診断に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、実施形態１によってｐｏｌｙ−Ａｒｇ存在下で蛍光偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＦＰ）測定でプロテインキナーゼＡ活性を測定した結果を示し、Ａは、１μＭのＦ−ｋｅｍｐｔｉｄｅを１００μＭのＡＴＰを含む反応バッファーで１３．２ｎＭのＰＫＡと室温で１５分間反応させた後、Ｆ−ｋｅｍｐｔｉｄｅを１００ｎＭに希薄にし、ｐｏｌｙ−Ａｒｇ濃度を増加させながらＦＰの変化を測定した結果を示すグラフ（●＋ＰＫＡ／○−ＰＫＡ）であり、Ｂは、ＰＫＡによるリン酸化反応の時間による変化を５μＭのｐｏｌｙ−Ａｒｇ存在下で測定したＦＰの変化値を示すグラフである。
【図２】図２は、ビオチン−ＰＫＩ（５−２４）とＰＫＡの結合によるＰＫＡの活性阻害を実施形態１の活性分析法（１３．２ｎＭのＰＫＡと１μＭのＦ−ｋｅｍｐｔｉｄｅを混合して室温で１５分間反応させる）で定量分析した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、１１０ｎＭのＰＫＡと５０ｎＭのＦ−ＰＫＩ（５−２４）ペプチド間の結合を、ＡＴＰ濃度を０、０．０２５、０．１、１、１０、５００μＭに増加させながら、毛細管電気泳動法で分析した電気泳動図である。この時、最も高いピークはＰＫＡのないＦ−ＰＫＩ（５−２４）のみの電気泳動図である。
【図４】図４は、ＳＰＲ分析によってＰＫＡとビオチン−ＰＫＩ（５−２４）ペプチド間の結合を分析した結果を示し、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を通じて、ビオチン−ＰＫＩ（５−２４）ペプチドが表面に固定化しているＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５バイオセンサーを使用し、多様な濃度（１、５、１０、５０、１００μＭ）のＡＴＰと混合されたＰＫＡ溶液を前記ＰＫＩペプチドが結合されたチップと基準チップ（ストレプトアビジンのみ固定しているチップ）にそれぞれ適用して、前記ＰＫＩペプチドが結合されたチップでの反応から前記基準チップの反応を差し引いて得られた計測図である。
【図５】図５は、ＰＫＡとＦ−ＰＫＩ（５−２４）の結合を室温で均質蛍光偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＦＰ）測定法で分析した結果で、Ａは、１００ｎＭのＦ−ＰＫＩ（５−２４）と１３．２ｎＭ（●）．６６ｎＭ（▲）または１３２ｎＭ（■）のＰＫＡとをＡＴＰ濃度を増加させながら反応バッファーで混合し、蛍光偏光変化を測定して得られた結果を示すグラフであり、Ｂは、１００ｎＭＦ−ＰＫＩ（５−２４）をＰＫＡ触媒サブユニットの濃度を増加させながら混合して、蛍光偏光を測定した結果を示すグラフである（◆＋１００μＭのＡＴＰ／●−ＡＴＰ）。
【図６】図６のＡは、ＰＺＴカンチレバーのＡｕ表面にＣａｌｉｘｃｒｏｗｎ ＳＡＭ（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：自己組織化単分子層）、ストレプトアビジン及びビオチン−ＰＫＩ（５−２４）が固定されており、これにＡＴＰと結合されたＰＫＡ触媒サブユニットとを反応させ、ＰＫＡ触媒サブユニットを捕獲するセンサーアッセイの概略的模式図である。図６のＢは、このような構成のセンサーアッセイにおいて、３個の５０μｍ×１５０μｍアレイで構成されたカンチレバーチップ（５ｃｍ×５ｃｍ）上で１３２ｎＭのＰＫＡをインキュベートして測定した共鳴振動数変化を示すグラフである（＋／−１００μＭのＡＴＰ）。
【図７】図７は、既存のＰＫＡ定量分析法を本発明と比較したもので、Ａは放射性同位元素である３２Ｐで標識されたＡＴＰを利用してＰＫＡの濃度を変化させながら、基質のリン酸化程度を分析したＰＫＡ活性分析結果であり、Ｂは、ビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を固定した９６−マイクロウェルプレートにＰＫＡの濃度を変化しながらインキュベートして、捕獲されたＰＫＡを酵素付きＰＫＡ特異的抗体を利用して分析したＥＬＩＳＡ結果であり、Ｃは、本発明によるビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を固定した１２個の５０μｍ×１５０μｍアレイで構成されたカンチレバーチップ（５ｃｍ×５ｃｍ）にＰＫＡ濃度を変化しながらインキュベートして結合されたＰＫＡを共鳴振動数変化法で測定した結果を示すグラフである（■＋１００μＭのＡＴＰ／●−ＡＴＰ）。
【図８】図８は、本発明のカンチレバーを利用する方法と他の分析法との測定結果を比較したもので、Ａは、図７のＣに示した本発明の結果を図７のＡに示した放射性同位元素を使用した活性分析結果と共にフローティングしたグラフであり、Ｂはは、図７のＣに示した本発明の結果を図５のＢに示した蛍光偏光を利用した直接的な結合分析結果及び図７のＢに示す抗体に付着された酵素による信号増幅が可能なＥＬＩＳＡを利用した検出結果と共にフローティングしたグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテインキナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ；ＰＫＡ）を特異的に感知するバイオセンサー及び、これを有する診断用キットに関するものである。より詳しくは、本発明はカンチレバー（片端固定レバー）及び、このカンチレバー表面に固定されたプロテインキナーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＫＩ）ペプチドを含むＰＫＡ検出用バイオセンサー及び、対象試料、前記ＰＫＡ検出用バイオセンサー及び定量手段を有するプロテインキナーゼ活性増加による疾病の診断用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼはＡＴＰのガンマ−ホスホリル基を蛋白質のセリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）またはチロシン（Ｔｙｒ）残基のヒドロキシル基に伝達する反応を触媒するもので、多様な細胞信号経路に重要な役割を果たす（非特許文献１）。プロテインキナーゼ活性の増加は普通癌、心血管症候群（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、免疫疾患、内分泌障害などの各種疾病状態で発見される。したがって、このような酵素は、前記疾病に関与すると考えられ、これに関する特異的な阻害剤の開発が活発に行われてきた。
【０００３】
特に、多様なプロテインキナーゼの中で、その性質が最も明らかになったプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）は、他のプロテインキナーゼの原型（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）として使用される。ＰＫＡはｃＡＭＰがない時、主に２つの調節サブユニットと２つの触媒サブユニットで構成される不活性状態の４量体ホロエンザイムとして存在する。細胞内ｃＡＭＰの濃度が増加すると、このような不活性ＰＫＡの調節サブユニットにｃＡＭＰが結合し、調節サブユニットと触媒サブユニットとの結合力を弱化させることによって、ホロエンザイムの、活性を有する触媒サブユニットが、調節サブユニットから分離され各種リン酸化反応を進行させる。また、活性を有する触媒サブユニットは生体内にある熱安定性抑制蛋白質であるプロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）との結合で活性が阻害される調節メカニズムも存在することが知られている。
【０００４】
特定の癌細胞はＰＫＡの触媒サブユニットを細胞外部に排出することに基づいて、細胞外ＰＫＡ触媒サブユニットと癌との相関関係が報告されている（非特許文献２）。このように排出される蛋白質は極少量であるので、特定の蛋白質を高い感度で定量的に測定する技術の重要性が強調されている。
【０００５】
今までプロテインキナーゼ活性を分析する多くの方法が開発された。このような方法としては、リン酸化された基質を分離する過程を必要とする放射性同位元素を利用する方法、リン酸化した基質を認識する抗体を利用する免疫反応分析法（ＥＬＩＳＡ）と最近開発された蛍光に基づく蛍光偏光度及び時間差蛍光共鳴エネルギー遷移（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用する非放射性分析法などがある。
【０００６】
最近、技術的発展でペプチドと蛋白質との間の相互作用を分析する多くの方法が開発されているが、特に、ペプチド−蛋白質結合研究に蛍光偏光法と毛細管電気泳動を利用する分析法がよく確立されている。しかし、このような方法で活性化したキナーゼを直接定量する方法は、酵素活性分析法やＥＬＩＳＡによる信号増幅法に比べて感度が良くないことが現実である。さらに、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）技術は生体分子相互作用分析のための効果的な技術として知られているが、非常に複雑であるという短所を有する。
【０００７】
前記のように感度が低いか複雑な従来のペプチド−蛋白質結合測定法の問題が改善された高感度の簡便な測定技術の開発が要求される。
【非特許文献１】Ｈ．Ｃ．Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｍ．Ａ． Ｏｏｓｔｅｒｗｅｇｅｌ， Ｋ．Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌ， ＴＯＤＡＹ １４（１９９３）５９２−５９７
【非特許文献２】Ｙｅｅ Ｓｏｏｋ Ｃｈｏｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９７（２）（２０００）８３５−８４０
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｏｆｆｉｎ，Ｍ．Ｌａｔｅｖ，Ｘ．Ｂｉ，Ｔ．Ｔ．Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７８（２０００）２０６−２１２
【非特許文献４】Ｊ．Ｌｅｗ， Ｎ．Ｃｏｒｕｈ， Ｉ．Ｔｓｉｇｅｌｎｙ， Ｓ．Ｇａｒｒｏｄ， Ｓ．Ｓ．Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）１５０７−１５１３
【非特許文献５】Ｙ．Ｌｅｅ， Ｅ．Ｋ．Ｌｅｅ， Ｙ．Ｗ．Ｃｈｏ，Ｔ．Ｍａｔｓｕｉ， Ｉ．−Ｃ．Ｋａｎｇ， Ｔ．−Ｓ．Ｋｉｍ， Ｍ．Ｈ．Ｈａｎ， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ３（２００３）２２８９−２３０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を特異的に認識するプロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドを含むＰＫＡ検出用バイオセンサーを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の課題は、前記のようなＰＫＡ検出用バイオセンサーまたはバイオアレイを有するＰＫＡ関連疾病の診断用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明はＰＫＡの活性部位であるＰＫＡ触媒サブユニットを特異的に認識するＰＫＩペプチド基板のＰＺＴ微細カンチレバーセンサーを利用して極少量の蛋白質を選択的に感知する検出技術を提供する。
【００１１】
一般に、プロテインキナーゼが活性化すると、活性化した酵素によって生成されるリン酸化した産物を測定する酵素活性分析法で信号を増幅させることで分析できるが、活性化したキナーゼの直接的な測定は酵素の状態とキナーゼを媒介とした現象に対するより正確な情報を提供すると期待される。したがって、本発明ではＰＫＡ、特にＰＫＡの触媒サブユニットに対して強い親和力を有するＰＫＡ阻害蛋白質であるＰＫＩのアミノ酸配列のうち５番目から２４番目までのアミノ酸配列を含むＰＫＩペプチドを利用し、極少量の結合を感知するのに適したカンチレバーセンサーを利用して活性化したＰＫＡを直接的に測定できるナノバイオセンサーアッセイ（ｎａｎｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ａｓｓａｙ）を開発した。
【００１２】
活性化した形態であるＰＫＡの触媒サブユニットを特異的に検出する方法は、主にキナーゼ活性による放射性同位元素及び抗体を利用する分析法と、ＰＫＡを認識する抗体を利用するウェスタン−ブロットなどが使用されてきたが、このような方法は有害な放射性同位元素を使用したり、低い検出限界などの短所を持っている。
【００１３】
そこで、本発明はＰＫＡに対するペプチドリガンド基盤のセンサーシステムに関するもので、具体的には、前記蛋白質の活性サブユニットである触媒サブユニットを特異的に認知するＰＫＩペプチドを利用する分析法を考案し、これを最適化して蛋白質との直接的な特異結合を定量分析に利用した。本方法ではＰＫＩペプチドをカンチレバー表面に固定させてＰＫＡの触媒サブユニットを捕獲することによって、放射性同位元素を利用する活性アッセイ法に比べて１００倍以上の感度と大きい躍動範囲（ダイナミックレンジ）を示し、蛍光偏光を利用する直接結合分析及び酵素付き抗体を利用する信号増幅法に比べても非常に感度の良い定量分析技術を提供する。本発明によると、癌、心血管症候群、免疫疾患、内分泌障害などの各種疾病状態標識分子である前記ＰＫＡの触媒サブユニットを特異的で簡便に検出できるので、前記疾病の診断に有用に適用することができる。
【００１４】
本発明の目的は、ＰＫＩペプチドリガンドを基盤としたＰＫＡ感知センサーを開発するための条件を最適化することにある。このために、ＰＫＡ触媒サブユニットと、その結合リガンドであるＰＫＩペプチドとの間の結合条件、特に、ＡＴＰ及びその濃度による影響を試験するために、マグネチックビーズ、毛細管電気泳動、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び蛍光偏光度分析法などを利用した。そして、ナノメカニカルＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３（ＰＺＴ）カンチレバーを製作してＡＴＰの有無によってセンサー表面に固定化したＰＫＩペプチドとＰＫＡ触媒サブユニットとの結合程度を測定し、その結果を利用してＰＫＡ触媒サブユニットを定量的に分析することを成功した。
【００１５】
最近、極度に弱い力、機械的な圧力と質量を測定するために微細カンチレバーに基づいたセンサーが開発されて前例のない感度と躍動範囲（ｄｙｎａｍｉｃ−ｒａｎｇｅ）で特定生体分子間の相互作用が測定できるようになった。初期に、このようなセンサーは主に空気中の構成物を検出するのに使用されたが、次第にカンチレバーの一側に薄い膜をコーティングしたり、生体分子認識因子を固定化して、溶液中にある特定物質を検出するのに関心が集まっている。一般に、カンチレバーは躍動状態と静的状態の両方で特定物質との結合を測定することができる。カンチレバーの２つの面の間の吸着による表面緊張の差は静的状態で測定できるが、狭い躍動範囲と寄生偏向のような限界を持っている。
【００１６】
反面、躍動モードカンチレバーは結合する表面における質量変化または硬度等、カンチレバーの機械的性質による共鳴振動数の変化（ｒｅｓｏｎａｎｃｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｈｉｆｔ）を測定するもので、これを利用する感知法は寄生偏向から生じる偏向信号（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）の変化に影響を受けないという長所を持つ。本発明は、前記のような特性を有するカンチレバーを使用して対象物質の検出感度を改善させたものである。
【００１７】
つまり、本発明はカンチレバー及び、前記カンチレバー表面に固定されたＰＫＩペプチドを含むＰＫＡ検出用バイオセンサー及び、検出対象試料、前記ＰＫＡ検出用バイオセンサーまたはバイオセンサーアレイ及び定量手段を有するプロテインキナーゼ活性増加と、それに関連する疾病の診断用キットに関するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明はＰＫＡに特異的に結合するＰＫＩから由来するペプチドに基づくＰＺＴ微細カンチレバーセンサーを用いた定量分析法で、癌標識分子であるＰＫＡ触媒サブユニットを従来の活性分析法より１００倍以上の感度で検出できるので、極微量の癌標識因子を検出する癌診断試験に有用に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００２０】
まず、本発明はカンチレバーと、前記カンチレバー表面に固定されたＰＫＩペプチドを含むＰＫＡ検出用バイオセンサーを提供する。
【００２１】
前記カンチレバーは幅が５乃至１００μｍの範囲にあり、長さは１０乃至３００μｍの範囲であるのが好ましい。カンチレバーの大きさが前記範囲より大きい場合には、所望する検出限界を得ることが難しく、より小さい場合には、高い検出限界を有するが、再現性を確保することが難しく、製造工程も複雑であるため、本発明のカンチレバーの大きさは前記の範囲にあるのが好ましい。カンチレバーの材質は躍動モードのカンチレバーで、メンブレン材質は高弾性特性を有するのが好ましく、ケイ素、窒化ケイ素（ＳｉＮｘ；ｘ＝１乃至１．５）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、ジルコニア（ＺｒＯ２）及びアルミナ（Ａｌ２Ｏ３）からなる群の中より選択された１つ以上の物質であるのが好ましい。例えば、本発明に使用されるカンチレバーは、５０×１５０×２μｍ（横×縦×厚さ）の大きさのＳｉウエハー表面に、前記メンブレン材質で窒化ケイ素が蒸着されたＳｉＮｘ／Ｓｉ基板で製作されたものであってもよい。また、前記カンチレバーは適切に表面改質されたものであってもよい。前記表面改質は能動型カンチレバーのための圧電薄膜を形成させるためで、表面改質物質としてＰｂ系ペロブスカイト酸化物または酸化亜鉛（ＺｎＯ）等を利用することができる。例えば、圧電薄膜形成は乾式あるいは湿式でＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３を表面に蒸着させて行ってもよい。本発明の一具体例において、前記カンチレバーはＳｉＮｘ／Ｓｉ基板にＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３が蒸着されたナノメカニカルＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３（ＰＺＴ）カンチレバーであり得る。
【００２２】
前記ＰＫＩペプチドはＰＫＡ触媒サブユニットと特異的に結合するペプチドである。前述した通り、ＰＫＡは２つの調節サブユニットと２つの触媒サブユニットで構成された４量体ホロエンザイムで、前記のように触媒活性を有する前記触媒サブユニットが調節サブユニットと結合して４量体状態で存在する場合は不活性の状態であり、触媒サブユニットがｃＡＭＰによって調節サブユニットと分離され遊離された状態で存在すれば活性化した状態となる。前記ＰＫＩは遊離された触媒サブユニットに特異的に結合するペプチドで、全ての哺乳類のＰＫＩを用いることができ、好ましくは、ヒトＰＫＩ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＢ２１１４１；ｍｔｄｖｅｔｔｙａｄ ｆｉａｓｇｒｔｇｒｒ ｎａｉｈｄｉｌｖｓｓ ａｓｇｎｓｎｅｌａｌ ｋｌａｇｌｄｉｎｋｔ ｅｇｅｅｄａｑｒｓｓ ｔｅｑｓｇｅａｑｇｅ ａａｋｓｅｓ；配列番号：１）を使用することができる。本発明で使用されるＰＫＩペプチドは、ＰＫＡの触媒サブユニットとの特異な結合活性を考慮して、少なくともＰＫＩの５番目から２４番目までの２０個のアミノ酸残基（ＴＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ；配列番号：２）を有するアミノ酸配列を含む２０乃至７６個のアミノ酸からなるペプチドであってもよく、より好ましくは、前記ＰＫＡの触媒サブユニットに特異的に結合するＰＫＩペプチドは５番目から２４番目までの２０個のアミノ酸残基「ＴＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ」（配列番号：２）を有するアミノ酸配列であるのが好ましい。前記アミノ酸番号は開始コドンによるアミノ酸であるメチオニンを除いて、その次のアミノ酸から算出したものである。
【００２３】
前記ＰＫＩペプチドは通常の如何なる化学的カップリング方法でも、カンチレバー表面に固定化できる。例えば、前記ＰＫＩペプチドの末端にビオチンを結合させて複合体を形成し、前記カンチレバー表面にストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を固定化し、ＰＫＩペプチドに結合されたビオチンとカンチレバー表面に固定化したストレプトアビジンとの相互作用によってＰＫＩペプチドをカンチレバー表面に固定化することができる。或いは、エポキシ基を有する物質でカンチレバー表面をコーティングし、ペプチドのアミノ基と反応をさせる方法でペプチドをカンチレバー表面に固定化することもできる。この他にも、ペプチドを表面に固定化できる全ての化学的カップリング方法を用いることができ、このような方法は当業者によく知られている。
【００２４】
本発明のＰＫＡとＰＫＩの結合有無は、カンチレバーの共鳴振動数変化によって測定できる。したがって、前記バイオセンサーは共鳴振動数変化の測定装置を追加的に有することができる。
【００２５】
本発明の前記バイオセンサーは、前記ＰＫＩが表面に固定されたカンチレバーを２つ以上備えてもよい。この場合、カンチレバーの個数は所望の検出感度と対象試料種類などによって適切に調節でき、通常３個乃至１２個にできる。また、カンチレバー間の間隔は特に制限しないが、最上の検出感度を得るために、１００乃至５００μｍが好ましい。この範囲より間隔が狭い場合には干渉の影響があり得て、反対に広い場合はチップの大きさが過剰に大きくなる短所がある。
【００２６】
また、他の側面において、本発明は検出対象試料と、前記バイオセンサーと、検出手段を含むＰＫＡの活性化に関連する疾患の診断用キットを提供する。
【００２７】
癌、心血管症候群、免疫疾患、内分泌障害などの各種疾病状態でＰＫＡの活性増加が観察されるので、ＰＫＡの活性を測定することによって、前記疾病を診断できる。ＰＫＡの活性は活性化状態である解離触媒サブユニットの存在水準で決定でき、解離触媒サブユニットの存在水準は、これと特異的に結合するＰＫＩペプチドとの結合程度によって測定できる。したがって、前記バイオセンサーまたはバイオアレイに固定化されたＰＫＩペプチドのＰＫＡ触媒サブユニットとの結合程度を測定してＰＫＡの活性化と関連する疾患を簡便で容易に診断できる。本発明の診断用キットによって診断可能なＰＫＡの活性化によって診断可能な疾病は、癌、心血管症候群、免疫疾患、内分泌障害、脳卒中、感染性疾患からなる群の中から選択されたものでもよい。
【００２８】
前記調節サブユニットから分離されて活性化したＰＫＡ触媒サブユニットは、ＡＴＰの存在下でＰＫＩペプチドと効果的に結合するので（下記の実施形態１参照）、本発明の診断用キットはＰＫＡ活性の検出効率を高めるために、ＡＴＰ溶液を追加的に含むことができる。つまり、検出対象試料を適切な濃度のＡＴＰ溶液と反応させて、前記試料内のＰＫＡを活性化することができる。この時、試料内ＰＫＡを効果的に活性化するために、前記ＡＴＰの濃度は１０乃至１０００μＭであるのが好ましく、１０乃至５００μＭであるのがさらに好ましい。
【００２９】
前記検出対象試料は患者から得たもので、患者の如何なる細胞または組織でもよいが、好ましくは、血液、血漿などの最少侵襲で確保可能な試料または分泌体液からなる群の中から選択されるが好ましい。前記患者は如何なる哺乳類でもよいが、好ましくはヒトである。
【００３０】
本発明の診断用キットに含まれる検出手段は試料内のＰＫＡと前記バイオセンサのカンチレバー表面に固定化されたＰＫＩとの結合を検出する全ての手段を含む。例えば、前記検出手段はカンチレバーの共鳴振動数変化を測定する手段であり得る。
【００３１】
以下、本発明を実施形態を通じてより詳しく説明する。しかし、これらの実施形態は本発明の例示に過ぎず、本発明の範囲がこれら実施形態によって制限されるわけではない。
【実施例】
【００３２】
下記の実施形態において、本発明者らはＰＫＡ触媒サブユニットを特異的に認識するＰＫＩペプチド基盤のＰＺＴ微細カンチレバーセンサーを利用して、従来の活性分析法より１００倍以上の感度を有する方法を考案し、これを実施した。本発明の実施形態ではＰＫＡ触媒サブユニットとペプチドリガンドであるＰＫＩペプチドとの結合を蛍光偏光法と毛細管電気泳動、ＳＰＲ及びＥＬＩＳＡ法を利用して測定した。また、それぞれについてＡＴＰがＰＫＡ触媒サブユニットとＰＫＩペプチドの結合に与える影響を調べた。さらに、本発明の実施形態ではＰＺＴ微細カンチレバーにＰＫＩペプチドを固定化してＰＫＡ触媒サブユニットの検出限界とＡＴＰが結合に与える影響も調べた。
【００３３】
実施形態１：ＰＫＩペプチドによるＰＫＡ活性阻害及びＰＫＡ−ＰＫＩ結合に対するＡＴＰの影響
１．１．蛍光偏光度を利用するＰＫＡ活性測定によるＰＫＩペプチドのＰＫＡ活性阻害測定による結合分析
本実施形態では蛍光標識された基質ペプチドがリン酸化されると、陽イオン性ポリアミノ酸と選択的な結合を行うことによって、蛍光偏光度増加を誘発させる原理を利用したキナーゼアッセイ（非特許文献３）を使用し、本実施形態に適合するようにその条件を最適化した。正味の電荷（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）値が０である蛍光標識された基質ペプチドを使用して、キナーゼによってリン酸化されて陰電荷を帯びると、陽イオン性ポリアミノ酸との静電気的な相互作用で結合が生じるので、これによる蛍光偏光度の変化を測定してキナーゼの活性を分析した。
【００３４】
ＰＫＡに対する分析条件を最適化するために、ＰＫＡの基質であるｋｅｍｐｔｉｄｅ（ＬＲＲＡＳＬＧ）のＮ−末端に蛍光標識分子であるフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を付着し、これを含んで全電荷が０になるようにして、ＰＫＡによってリン酸化されると、（−）電荷を帯びるように設計したものを購入した（Ｆ-ｋｅｍｐｔｉｄｅ；ＰＥＰＴＲＯＮ社、韓国）。このような基質ペプチドであるＦ−ｋｅｍｐｔｉｄｅ（１μＭ）を使用して、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴの緩衝溶液で１００μＭのＡＴＰ存在下でＰＫＡと反応させた。反応後、Ｆ−ｋｅｍｐｔｉｄｅの最終濃度が０．１μＭになるように、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝溶液（ｐＨ７．５）に希釈し、ｐｏｌｙ−Ａｒｇ（ＭＷ７５，０００〜１５０，０００）の濃度を増加させながら蛍光偏光度を測定した。蛍光偏光度は発光測定器（ＬＳ−５０Ｂ ｌｕｍｉｎｏｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、米国）を使用して、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５２０ｎｍで測定した。
【００３５】
前記で得られた結果を図１のＡに示した。前記図１のＡから分かるように、ＰＫＡと反応後のＦ−ｋｅｍｐｔｉｄｅはｐｏｌｙ−Ａｒｇの濃度が増加することによって蛍光偏光度が顕著に増加したが、ＰＫＡと反応をさせなかったＦ−ｋｅｍｐｔｉｄｅの場合には蛍光偏光度がほとんど増加しなかった。反面、ｐｏｌｙ−Ａｒｇを添加しなかった時には、リン酸化された基質とリン酸化されていない基質の蛍光偏光度値の差がなかった。
【００３６】
リン酸化された基質とリン酸化されていない基質の蛍光偏光度値の差が最大であるｐｏｌｙ−Ａｒｇの最適濃度は５μＭに決め、この濃度でＰＫＡの時間に応じる反応を前記の方法で測定した。その結果、ＰＫＡとの反応時間が増加することによって蛍光偏光度が増加し、飽和した結果を示し、これを図１のＢに示した。
【００３７】
また、蛍光偏光度を利用する活性阻害分析のために、Ｎ−末端にビオチンを有するＰＫＩペプチド（５番目から２０番目までの２０個のアミノ酸残基を持つ）であるビオチン−ＰＫＩ（５−２４）（ビオチン−ＴＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ；配列番号：２）を合成した（ＰＥＰＴＲＯＮ社、韓国）。多様な濃度のビオチン−ＰＫＩ（５−２４）存在下に１３．２ｎＭのＰＫＡと１μＭのＦ-ｋｅｍｐｔｉｄｅを混合して室温で１５分間反応させた後に分析した結果、蛍光偏光度値がＰＫＩ濃度に逆比例することが分かり、ＩＣ５０値が約５４ｎＭであった（図２参照）。
【００３８】
その後、磁性を持つビーズ（Ｍ−２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ、Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ノルウェー）にビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を固定してＰＫＡを捕集する実験を実施した。ストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズにビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用してビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を固定化した後、ＡＴＰがある場合とない場合の条件で１３．２ｎＭのＰＫＡを含んでいる緩衝溶液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）にビーズ濃度を変化しながら添加して、１分間反応させた。ビーズを除去した後、上澄液を取ってＰＫＡの活性を分析した。その結果、ＰＫＡはビーズのＰＫＩペプチド結合するが、４００μＭのＡＴＰがある時にビーズにさらによく結合することが明らかになり、これはＡＴＰがＰＫＡ−ＰＫＩ結合を促進することを意味する。このような結果はＰＫＩ蛋白質によるＰＫＡの阻害においてＡＴＰのｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ（協同結合）が必要であるという従来の報告と一致する（非特許文献４）。
【００３９】
１．２．毛細管電気泳動とＳＰＲを利用したＰＫＡ−ＰＫＩ結合に対するＡＴＰの影響
ＰＫＡ−ＰＫＩ結合に対するＡＴＰの影響を毛細管電気泳動で分析するために、Ｎ−末端にフルオレセインで蛍光標識されたＦ−ＰＫＩ（５−２４）を合成した（ＰＥＰＴＲＯＮ社、韓国）。毛細管電気泳動装置は溶融シリカ（ｆｕｓｅｄ−ｓｉｌｉｃａ）ｃａｐｉｌｌａｒｙ（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ社、米国；長さ２７ｃｍ、内径５０μｍ）が装着されたＢｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ５０００ ＣＥ−ＬＩＦ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社、米国）を使用して実施した。システムに付属している４８８ｎｍ波長の３ｍＷアルゴンイオン（Ａｒ−ｉｏｎ）レーザーで蛍光物質を励起させ、５２０±１０ｎｍのフィルターで、発光したシグナルはＬＩＦ検出器によって捕集した。分析及び毛細管処理に使用された全ての溶液は０．２μｍ孔径（ｐｏｒｅ−ｓｉｚｅ）フィルターでろ過し、毛細管は１ＮのＮａＯＨと蒸溜水をそれぞれ５分間流して洗浄した後に使用し、各電気泳動の間には１ＮのＮａＯＨ、蒸溜水、緩衝溶液で２分ずつ毛細管を洗浄した。試料は０．５ｐｓｉで１秒間注入され、１０．８ｋＶの電気をかけて分離した。電気泳動用緩衝溶液は５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１ＭのＮＤＳＢ−１９５、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭのＤＴＴを含んでいて、ＰＫＡ−ＰＫＩ反応溶液に５ｍＭのＭｇＣｌ２を追加的に添加した。
【００４０】
１ＭのＮＤＳＢ−１９５と０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００がガラス表面のペプチドの吸着を減少させることが知られており、これらを緩衝液に添加して再現性のあるペプチドピークを得、その結果を図３に示した。図３から分かるように、ＡＴＰが含まれていない緩衝液にＦ−ＰＫＩ（５−２４）とＰＫＡを添加して毛細管電気泳動で分析した時、ＰＫＡがない場合に比べてＦ−ＰＫＩ（５−２４）のピーク値がほとんど減少していない。反面、Ｆ−ＰＫＩ（５−２４）とＰＫＡの複合体ピークを分離してみることはできなかったが、ＡＴＰの濃度が増加することによってＦ−ＰＫＩのピークが減少し、このような結果はＡＴＰがＦ−ＰＫＩ（５−２４）とＰＫＡの複合体形成に寄与することを間接的に証明する。一方、５００μＭのＡＴＰとＦ−ＰＫＩのみを混合した場合、Ｆ−ＰＫＩ（５−２４）ピークの変化はなかった。
【００４１】
次に、ＰＫＡ−ＰＫＩ結合に対するＡＴＰの影響をＳＰＲ分析器であるＢｉａｃｏｒｅ３０００ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉａｃｏｒｅ社、米国）を利用して分析した。ＣＭ５ ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ（Ｂｉａｃｏｒｅ社、米国）表面をＮ−エチル−Ｎ'−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ，Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）で活性化した後、５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンを流してアミンカップリング法でセンサー表面にストレプトアビジンを固定化した。このように固定されたストレプトアビジンにビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を５μＭ／ｍｉｎの速度で１００秒間流して結合させた後、このセンサーに１３２ｎＭのＰＫＡをＡＴＰ濃度を変化させながら混合した溶液を３０μＭ／ｍｉｎの速度で１００秒間流した後、２００秒間緩衝溶液を流して計測図を得て、これを図４に示した。
【００４２】
前記図４に示された結果から、ビオチン−ＰＫＩ（５−２４）が固定されたセンサー表面にＰＫＡが相互作用することにおいてＡＴＰの濃度が影響を与えるということが分かった。ここで、ＡＴＰの濃度増加によってＰＫＡのｏｎ−ｒａｔｅは増加し、ｏｆｆ−ｒａｔｅは減少する傾向が見られた。ＰＫＩの代わりにＰＫＡに対する親和力が１０μＭ以上の結合力の弱いペプチドであるビオチン−Ａｌａ−ｋｅｍｐｔｉｄｅ（ビオチン−ＬＲＲＡＡＬＧ）で同じ実験を行った時には、高濃度のＡＴＰ存在下でもＰＫＡの結合が全く見られなかった。
【００４３】
１．３．蛍光偏光度を利用したＰＫＡ−ＰＫＩ結合分析
ＰＫＡ−ＰＫＩ結合をより直接的に確認するために、Ｆ−ＰＫＩ（５−２４）を利用して前記実施形態１の方法で蛍光偏光度を測定及び分析し、その結果を図５のＡに示した。前記図５のＡから分かるように、１３．２、６６、１３２ｎＭのＰＫＡに対して各々ＰＫＡの濃度が一定な状態で、ＡＴＰの濃度が増加することによって蛍光偏光度が増加して飽和状態に到達することが分かる。１００ｎＭのＦ−ＰＫＩ（５−２４）を５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ緩衝溶液に混合してＰＫＡの濃度を変化させながら蛍光偏光度を測定して、その結果を図５のＢに示した。図５のＢに示されているように、１００μＭのＡＴＰを添加した場合にはＰＫＡ５３ｎＭまでその値が線形的に増加し、ＡＴＰ不在時に非特異結合による微々たる蛍光偏光変化が現れた。
【００４４】
実施形態２：微細カンチレバー分析
バイオセンサーとして利用するために外部発振器（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ）より電気的信号分析が便利なｓｍａｒｔ ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌで構成されたＰＺＴナノメカニカルカンチレバーセンサーアレイを製作した。
【００４５】
１００ｍｍ直径のｐ−ｄｏｐｅｄ Ｓｉウエハーに低圧化学蒸着法（ＬＰＣＶＤ）で１．２μｍ厚さの低応力シリコンナイトライドを蒸着した。Ｐｔ／Ｔａ薄膜の下部電極をシリコンナイトライド／シリコン基板にＲＦマグネトロンスパッタリングした後、基板にジオール系ゾル−ゲル技法によって０．５μｍＰＺＴ薄膜を成膜した。ここに、ＤＣスパッタリングで上部電極にＰｔ層を集積して金属−強誘電体−金属型蓄電器(ｍｅｔａｌ−ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒｉｃ−ｍｅｔａｌｃａｐａｃｉｔｏｒ）構造を作った。
【００４６】
イオンミリング（ｉｏｎ ｍｉｌｌｉｎｇ）方式で上部電極でＰｔをエッチングした後、誘導結合プラズマを利用して圧電物質であるＰＺＴをエッチングした。Ｐｔ下部電極もやはりイオンミリングでパターニングし、下部ＳｉＮｘ窓は反応性イオンエッチングでパターニングした後、ＫＯＨシリコンエッチング液で湿式エッチング処理した。最後に、反応性イオンエッチングでＳｉＮｘエッチングしてカンチレバーを完成し、ＳｉＯ２薄膜を蒸着して電気化学的保護層を作った。本実施形態のバイオセンサーは３または１２個のカンチレバーアレイで構成し、各カンチレバーの寸法は５０μｍ×１５０μｍになるようにした。
【００４７】
ＰＫＡ結合アッセイのために、前記のように製作されたカンチレバー表面を次の通りに機能化し、このように製作されたカンチレバーを図６のＡに模式的に示した。
【００４８】
まず、電子ビーム蒸発器(ｅ−ｂｅａｍ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を利用して、ナノメカニカルＰＺＴカンチレバーの下部ＳｉＮｘ面上にＣｒ（１０ｎｍ）／Ａｕ（５０ｎｍ）層を蒸着した。このように処理したカンチレバーをＨ２Ｏ２：Ｈ２ＳＯ４（１：４ ｖｏｌ／ｖｏｌ）溶液と脱イオン水で順次に洗浄した。洗浄されたカンチレバー表面上に蛋白質のアンモニウムイオンを認識して固定化させることができるＣａｌｉｘｃｒｏｗｎ（ａｃａｌｉｘａｒｅｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を処理して、自己組織化単分子層（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；ＳＡＭ）を形成した（非特許文献５）。次に、ストレプトアビジン（１０μｇ／ｍｌ ＰＢＳ中）を常温で一時間処理してＣａｌｉｘｃｒｏｗｎ ＳＡＭにストレプトアビジンを固定した後、３０ｍｌのＰＢＳＴ（ＰＢＳ中、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）で洗浄して、窒素ガス下で乾燥させた。非特異結合を最少化するために、前記のように処理されたカンチレバーを５％のＢＳＡを含むＰＢＳに常温で一時間浸漬してＰＢＳＴで洗浄した後、２００ｎＭのビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を含むＰＢＳ緩衝溶液で常温で一時間処理して３０ｍｌのＰＢＳＴで洗浄した後、窒素ガス下で乾燥させた。ビオチン−ＰＫＩ（５−２４）が固定されたカンチレバーに常温で３０分間ＰＫＡ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２中、１ｍＭのＤＴＴ）を処理し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴで洗浄した後、精密インピーダンス解析器（４２９４Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＵＳＡ）でカンチレバーの共鳴振動数を測定して、その結果を図６のＢに示した。
【００４９】
Ｃａｌｉｘｃｒｏｗｎ ＳＡＭで表面処理されたカンチレバーにストレプトアビジンを固定化した後、ビオチン−ＰＫＩを結合させてＰＫＡ−ＰＫＩの結合に対するＡＴＰの影響を調べるために、ＡＴＰの有無によって多様な濃度のＰＫＡを含む反応溶液に反応させた。ＰＫＡ−ＰＫＩ結合を定量的に測定するために、３個の同じ大きさ（５０μｍ×１５０μｍ）のカンチレバーアレイセンサーを使用した。カンチレバーの共鳴振動数が飽和された値に至るまで反復的に測定した時、ＡＴＰを含む場合に共鳴振動数がさらに大きく変化し、この結果はＡＴＰがＰＫＡ−ＰＫＩの結合を助けるということを意味する。
【００５０】
次に、このような結合を定量的側面で測定した。図７のＣに示したように、ＡＴＰ存在時にＰＫＡの活性サブユニットの濃度が増加することによって、共鳴振動数の差も増加することが確認された。また、ＡＴＰ存在時に活性化したＰＫＡを探知することにおいて、感度限界は１０ｐＭ以下であると確認された。これは微細カンチレバーとＰＫＡ触媒サブユニットに対する特異的ペプチドの組合わせで、簡単で直接的に活性化したＰＫＡに対するセンサーシステムを提供する。また、このようなペプチド基盤のカンチレバーセンサーは活性化した形態のＰＫＡが特定癌腫細胞株から細胞外部に排出されるという点を考慮すると、癌などの診断にも利用できる。
【００５１】
比較例１：３２Ｐ−ＡＴＰを利用した活性測定
前記のような本発明のカンチレバーセンサーによる測定と比較するために、放射性同位元素を利用したＰＫＡの活性測定を行った。ＰＫＡの基質ペプチドとしてｋｅｍｐｔｉｄｅ １０μＭ）を使用して、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ緩衝溶液で３２Ｐ−ＡＴＰ（５μＣｉ）を含む５０μＭのＡＴＰ存在下でＰＫＡ触媒サブユニットの濃度を変化させながら、試料当り５０μＬの容量で常温で１５分間反応させた。反応試料に１０μＬの３０％（ｖ／ｖ）リン酸を添加して反応を停止させた後、リン酸化したｋｅｍｐｔｉｄｅの放射能定量のために停止した反応試料のうちの４０μＬをＰ８１ホスホセルロースペーパーにスポッティングして、多量の脱イオン水で５回以上３時間程度十分に洗浄し、反応していない３２Ｐ−ＡＴＰを除去し、Ｐ８１ホスホセルロースペーパーを乾燥した後、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｉｍａｇｅｒ（ＢＡＳ３２Ｐ−ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）にて放射能定量を行った。前記で得られた結果を図７のＡに示し、これから少なくとも１ｎＭ以上のＰＫＡで活性分析が可能であることが分かった。
【００５２】
比較例２：Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）を利用する分析
本発明のカンチレバーセンサーによる測定と比較するための他の方法として、抗体に付着された酵素による信号増幅が可能なＥＬＩＳＡを利用する検出方法でＰＫＡ−ＰＫＩ結合を分析した。ストレプトアビジンがコーティングされた９６−マイクロウェルプレートにビオチン−ＰＫＩ（５−２４）ペプチドをＰＢＳＴ緩衝溶液（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中で結合させた後、５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれているＰＢＳＴにＰＫＡ触媒サブユニットの濃度を異ならせて添加し、１時間程度反応させた。５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれた３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＫＡ触媒サブユニットを特異的に認識する抗体（マウスモノクローナル抗体、ａｂｃａｍ社、ＵＫ）を５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれたＰＢＳＴに１／５００に希釈した１００μＬずつ添加した後、常温で１時間結合させた。
【００５３】
再び、５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれた３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した後、この抗体を認識する二次抗体であるＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）付着された抗体（ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ、ａｂｃａｍ社、ＵＫ）を５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれたＰＢＳＴに１／５，０００に希釈して、１００μＬずつ添加して１時間結合させた。５ｍＭのＭｇＣｌ２と２００μＭのＡＴＰが含まれた３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（３，３，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＧｅｎＤＥＰＯＴ社、ＵＳＡ）１００μＬを添加して約３０分間反応させた後、１００μＬのＴＭＢ停止緩衝液（ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ）（ＧｅｎＤＥＰＯＴ社、ＵＳＡ）を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５４】
その結果を図７のＢに示し、これから少なくとも１ｎＭ以上のＰＫＡで吸光度変化による信号感知が可能であることが分かった。
【００５５】
結果
前記比較例１及び２からの結果と、均質蛍光偏光測定による結合分析結果を実施形態のカンチレバーから得られたデータを比較して、図８のＡ、Ｂに示した。
【００５６】
図８から分かるように、本発明のＰＫＩペプチドをカンチレバー表面に固定してＰＫＡの触媒サブユニットの結合を共鳴振動数で分析した方法が、放射線同位元素を利用する活性測定法に比べて１００倍以上の感度と大きい躍動範囲を示し、蛍光偏光を利用する直接結合分析及び酵素付き抗体を利用する信号増幅方法に比べて非常に感度が優れていることが分かる。結論的に、微細カンチレバーとＰＫＡ触媒サブユニットに対する特異なペプチドの組合わせで、簡単で直接的な活性化したＰＫＡに対するセンサーシステムを使用すると、極微量のＰＫＡ触媒サブユニットを二次的信号増幅なく従来方法に比べて簡単に定量することができ、このような方法はＰＫＡ触媒サブユニットを測定する癌診断に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、実施形態１によってｐｏｌｙ−Ａｒｇ存在下で蛍光偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＦＰ）測定でプロテインキナーゼＡ活性を測定した結果を示し、Ａは、１μＭのＦ−ｋｅｍｐｔｉｄｅを１００μＭのＡＴＰを含む反応バッファーで１３．２ｎＭのＰＫＡと室温で１５分間反応させた後、Ｆ−ｋｅｍｐｔｉｄｅを１００ｎＭに希薄にし、ｐｏｌｙ−Ａｒｇ濃度を増加させながらＦＰの変化を測定した結果を示すグラフ（●＋ＰＫＡ／○−ＰＫＡ）であり、Ｂは、ＰＫＡによるリン酸化反応の時間による変化を５μＭのｐｏｌｙ−Ａｒｇ存在下で測定したＦＰの変化値を示すグラフである。
【図２】図２は、ビオチン−ＰＫＩ（５−２４）とＰＫＡの結合によるＰＫＡの活性阻害を実施形態１の活性分析法（１３．２ｎＭのＰＫＡと１μＭのＦ−ｋｅｍｐｔｉｄｅを混合して室温で１５分間反応させる）で定量分析した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、１１０ｎＭのＰＫＡと５０ｎＭのＦ−ＰＫＩ（５−２４）ペプチド間の結合を、ＡＴＰ濃度を０、０．０２５、０．１、１、１０、５００μＭに増加させながら、毛細管電気泳動法で分析した電気泳動図である。この時、最も高いピークはＰＫＡのないＦ−ＰＫＩ（５−２４）のみの電気泳動図である。
【図４】図４は、ＳＰＲ分析によってＰＫＡとビオチン−ＰＫＩ（５−２４）ペプチド間の結合を分析した結果を示し、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を通じて、ビオチン−ＰＫＩ（５−２４）ペプチドが表面に固定化しているＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５バイオセンサーを使用し、多様な濃度（１、５、１０、５０、１００μＭ）のＡＴＰと混合されたＰＫＡ溶液を前記ＰＫＩペプチドが結合されたチップと基準チップ（ストレプトアビジンのみ固定しているチップ）にそれぞれ適用して、前記ＰＫＩペプチドが結合されたチップでの反応から前記基準チップの反応を差し引いて得られた計測図である。
【図５】図５は、ＰＫＡとＦ−ＰＫＩ（５−２４）の結合を室温で均質蛍光偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＦＰ）測定法で分析した結果で、Ａは、１００ｎＭのＦ−ＰＫＩ（５−２４）と１３．２ｎＭ（●）．６６ｎＭ（▲）または１３２ｎＭ（■）のＰＫＡとをＡＴＰ濃度を増加させながら反応バッファーで混合し、蛍光偏光変化を測定して得られた結果を示すグラフであり、Ｂは、１００ｎＭＦ−ＰＫＩ（５−２４）をＰＫＡ触媒サブユニットの濃度を増加させながら混合して、蛍光偏光を測定した結果を示すグラフである（◆＋１００μＭのＡＴＰ／●−ＡＴＰ）。
【図６】図６のＡは、ＰＺＴカンチレバーのＡｕ表面にＣａｌｉｘｃｒｏｗｎ ＳＡＭ（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：自己組織化単分子層）、ストレプトアビジン及びビオチン−ＰＫＩ（５−２４）が固定されており、これにＡＴＰと結合されたＰＫＡ触媒サブユニットとを反応させ、ＰＫＡ触媒サブユニットを捕獲するセンサーアッセイの概略的模式図である。図６のＢは、このような構成のセンサーアッセイにおいて、３個の５０μｍ×１５０μｍアレイで構成されたカンチレバーチップ（５ｃｍ×５ｃｍ）上で１３２ｎＭのＰＫＡをインキュベートして測定した共鳴振動数変化を示すグラフである（＋／−１００μＭのＡＴＰ）。
【図７】図７は、既存のＰＫＡ定量分析法を本発明と比較したもので、Ａは放射性同位元素である３２Ｐで標識されたＡＴＰを利用してＰＫＡの濃度を変化させながら、基質のリン酸化程度を分析したＰＫＡ活性分析結果であり、Ｂは、ビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を固定した９６−マイクロウェルプレートにＰＫＡの濃度を変化しながらインキュベートして、捕獲されたＰＫＡを酵素付きＰＫＡ特異的抗体を利用して分析したＥＬＩＳＡ結果であり、Ｃは、本発明によるビオチン−ＰＫＩ（５−２４）を固定した１２個の５０μｍ×１５０μｍアレイで構成されたカンチレバーチップ（５ｃｍ×５ｃｍ）にＰＫＡ濃度を変化しながらインキュベートして結合されたＰＫＡを共鳴振動数変化法で測定した結果を示すグラフである（■＋１００μＭのＡＴＰ／●−ＡＴＰ）。
【図８】図８は、本発明のカンチレバーを利用する方法と他の分析法との測定結果を比較したもので、Ａは、図７のＣに示した本発明の結果を図７のＡに示した放射性同位元素を使用した活性分析結果と共にフローティングしたグラフであり、Ｂはは、図７のＣに示した本発明の結果を図５のＢに示した蛍光偏光を利用した直接的な結合分析結果及び図７のＢに示す抗体に付着された酵素による信号増幅が可能なＥＬＩＳＡを利用した検出結果と共にフローティングしたグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンチレバー及び、前記カンチレバー表面に固定されたプロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドを含み、
前記プロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドは配列番号：１の５番目から２４番目までの２０個のアミノ酸残基を含む２０個乃至７６個のアミノ酸を有することを特徴とするプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項２】
前記プロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドは配列番号：１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項３】
前記プロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項４】
前記カンチレバーは幅が５乃至１００μｍの範囲で、長さは１０乃至３００μｍであり、ケイ素、窒化ケイ素（ＳｉＮｘ；ｘ＝１乃至１．５）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、ジルコニア（ＺｒＯ２）及びアルミナ（Ａｌ２Ｏ３）からなる群の中から選択したメンブレンを含むことを特徴とする、請求項１に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項５】
前記カンチレバーの表面がＰｂ系ペロブスカイト酸化物または酸化亜鉛（ＺｎＯ）からなる群の中より選択される１つ以上の物質に改質されることを特徴とする、請求項４に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項６】
前記カンチレバーはＳｉＮｘ／Ｓｉ（ｘ＝１乃至１．５）基板にＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３が蒸着されたＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３（ＰＺＴ）カンチレバーである、請求項５に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー
【請求項７】
前記カンチレバー表面にストレプトアビジンが固定化され、前記ＰＫＩペプチドのＮ−末端にはビオチンが結合され、ストレプトアビジンとビオチンの間の相互作用によってＰＫＩペプチドがカンチレバー表面に固定化されることを特徴とする、請求項１に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項８】
共鳴振動数変化測定手段を追加的に有することを特徴とする、請求項１に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項９】
ＰＫＩペプチドが表面に結合されたカンチレバーを２つ以上有することを特徴とする、請求項１乃至８のうちの一項に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項１０】
前記２つ以上のカンチレバー間の間隔が１００乃至５００μｍであることを特徴とする、請求項９に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項１１】
検出対象試料；
１つ以上の請求項１乃至８に記載のバイオセンサー；及び
定量手段を有することを特徴とするプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）過多活性と関する疾病の診断用キット。
【請求項１２】
前記疾病は癌、心血管症候群、免疫疾患、内分泌障害、脳卒中及び感染性疾患からなる群の中より選択される１つ以上の疾病であることを特徴とする、請求項１１に記載の診断用キット。
【請求項１３】
１０乃至１０００μＭのＡＴＰを追加的に含むことを特徴とする、請求項１１に記載の診断用キット。
【請求項１】
カンチレバー及び、前記カンチレバー表面に固定されたプロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドを含み、
前記プロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドは配列番号：１の５番目から２４番目までの２０個のアミノ酸残基を含む２０個乃至７６個のアミノ酸を有することを特徴とするプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項２】
前記プロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドは配列番号：１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項３】
前記プロテインキナーゼ抑制剤（ＰＫＩ）ペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項４】
前記カンチレバーは幅が５乃至１００μｍの範囲で、長さは１０乃至３００μｍであり、ケイ素、窒化ケイ素（ＳｉＮｘ；ｘ＝１乃至１．５）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、ジルコニア（ＺｒＯ２）及びアルミナ（Ａｌ２Ｏ３）からなる群の中から選択したメンブレンを含むことを特徴とする、請求項１に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項５】
前記カンチレバーの表面がＰｂ系ペロブスカイト酸化物または酸化亜鉛（ＺｎＯ）からなる群の中より選択される１つ以上の物質に改質されることを特徴とする、請求項４に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項６】
前記カンチレバーはＳｉＮｘ／Ｓｉ（ｘ＝１乃至１．５）基板にＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３が蒸着されたＰｂ（Ｚｒ０．５２Ｔｉ０．４８）Ｏ３（ＰＺＴ）カンチレバーである、請求項５に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー
【請求項７】
前記カンチレバー表面にストレプトアビジンが固定化され、前記ＰＫＩペプチドのＮ−末端にはビオチンが結合され、ストレプトアビジンとビオチンの間の相互作用によってＰＫＩペプチドがカンチレバー表面に固定化されることを特徴とする、請求項１に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項８】
共鳴振動数変化測定手段を追加的に有することを特徴とする、請求項１に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項９】
ＰＫＩペプチドが表面に結合されたカンチレバーを２つ以上有することを特徴とする、請求項１乃至８のうちの一項に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項１０】
前記２つ以上のカンチレバー間の間隔が１００乃至５００μｍであることを特徴とする、請求項９に記載のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）検出用バイオセンサー。
【請求項１１】
検出対象試料；
１つ以上の請求項１乃至８に記載のバイオセンサー；及び
定量手段を有することを特徴とするプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）過多活性と関する疾病の診断用キット。
【請求項１２】
前記疾病は癌、心血管症候群、免疫疾患、内分泌障害、脳卒中及び感染性疾患からなる群の中より選択される１つ以上の疾病であることを特徴とする、請求項１１に記載の診断用キット。
【請求項１３】
１０乃至１０００μＭのＡＴＰを追加的に含むことを特徴とする、請求項１１に記載の診断用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図６】
【公開番号】特開２００８−３２６７６（Ｐ２００８−３２６７６Ａ）
【公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３１８８１６（Ｐ２００６−３１８８１６）
【出願日】平成１８年１１月２７日（２００６．１１．２７）
【出願人】（５９１０７４１１６）韓国科学技術研究院 (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２７日（２００６．１１．２７）
【出願人】（５９１０７４１１６）韓国科学技術研究院 (17)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]