プロテオソームを用いた感染性疾患に対する予防接種
プロテオソームベース免疫活性組成物の治療用処方物を作製および使用するための方法が提供される。１つの局面において、本発明は、抗原に対して免疫応答を誘導するための方法を提供し、この方法は、抗原に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有する。別の局面において、本発明は、微生物感染を処置または予防するための方法を提供し、この方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般的に、感染性疾患または毒性因子に対して防御するための鼻送達ワクチンに関し、そして特に、微生物病原体または毒性因子（例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、痘瘡ウイルス、リシントキシンおよびボツリヌストキシン）に関連する種々の疾患を処置または予防するためのプロテオソームベース組成物およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
有効な免疫応答は、生来の免疫系（侵襲性病原体に対する防御の第１ライン）と適応（特異）免疫応答との間の連絡に依存する（一般的に、Ｋｌｅｉｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９７を参照のこと）。Ｔリンパ球は、エフェクター分子の放出を制御することによって上記適応免疫応答を協同して働かせるために、重要である。例えば、Ｔヘルパー（Ｔｈ）１細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を生成し、これらは、細胞媒介性免疫の発達のために重要である（Ｍｏｓｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：２３４８、１９８６；ＳｔｒｅｅｔおよびＭｏｓｍａｎｎ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．５：１７１、１９９１）。対照的に、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を生成し、これらは、ＩｇＥ生成の刺激、粘膜肥満細胞症および好酸球増加症のために重要である（Ｍｏｓｍａｎｎら；ＳｒｔｅｅｔおよびＭｏｓｍａｎｎ）。Ｔｈ１（１型応答）表現型またはＴｈ２（２型応答）表現型へのシフトは、病原体に対する防御のために重要でありながら、１つの方向または別の方向のシフトはまた、自己免疫疾患（Ｔｈ１）または炎症性疾患（Ｔｈ２）の誘導と関連し得る。
【０００３】
この点において、ワクチンは、適応免疫応答を誘導するために開発され、そして使用されている。ワクチンは、代表的に、弱毒化微生物または微生物抗原（すなわち、微生物成分（例えば、タンパク質または核酸））を含み、特異免疫応答を活性化する。しかし、宿主において抗原が防御免疫応答を誘導する能力は、ときに、上記抗原を免疫刺激因子またはアジュバントとともに処方することによって増強されなければならない。１００年にわたる間、アルミニウムベースの無機塩（総称して、ミョウバンとして公知）は、ヒトの用途のために承認された唯一のアジュバントであった。歴史的に、ミョウバンは、筋内に注射される場合に、吸収されるタンパク質に対する応答を有意に増強することによる、有効なアジュバントであった。しかし、近年、ミョウバンアジュバントは、以下の報告に起因して、精査を受ける状態となっている（１）ミョウバンは、高度に精製された組み換えタンパク質に基づく新しい世代のワクチン抗原に対して、弱いアジュバントである；（２）ミョウバンは、報告によると、いくらかのワクチンレシピエントにおいて、ＩｇＥ抗体を誘導し得、そしてアレルギー反応と関連する；そして（３）ミョウバンは、注射部位における有害反応として証明されている持続的な免疫応答を誘導し得る。これらの有害反応は、ミョウバン吸着ワクチンの、抗原特異免疫応答を２型表現型（すなわち、炎症性免疫）へと偏らせる傾向と関連することが見出されている。さらに、ミョウバンベースのワクチンは、注射経路によるヒトにおける用途のために、唯一、承認されている。
【０００４】
他の公知のアジュバントとしては、フロイントアジュバント（完全または不完全）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ、また、エンドトキシンとも呼ばれる）およびｐｅｒｔｕｓｓｉｓアジュバント（殺したＢｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ生物の生理食塩水懸濁液）が挙げられる。フロイントアジュバントは、油／水エマルジョン中の微生物の混合物からなる。しかし、この物質に対する頻繁な毒性生理学的反応および免疫学的反応に起因して、フロイントアジュバントは、ヒトにおいては使用され得ない。ＬＰＳは、生来の免疫応答を開始することによって免疫系を刺激するが、ＬＰＳは、利用可能なアジュバントであるには毒性が強すぎる。構造的にエンドトキシンと関連する分子（例えば、モノホスホリルリピドＡ（「ＭＰＬ」または無毒化ＬＰＳ））は、臨床試験においてアジュバントとして試験されている。調査されている他の潜在的なアジュバントとしては、サポニン（米国特許第６，０８０，７２５号；同第６，２６２，０２９号；および同第５，９７７，０８１号を参照のこと）；両親媒性アルデヒド（米国特許第６，６４９，１７２号を参照のこと）；プロテオソーム（米国特許第５，７２６，２９２号および同第５，９８５，２８４号；米国特許出願番号２００１／００５３３６８および２００３／００４４４２５を参照のこと）；および環式アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（米国特許第６，５２５，０２８号を参照のこと）が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、当該分野において、抗原とともに同時投与されて、より強力な免疫応答を促進し、微生物感染または毒性因子に対して防御し得る、優れた免疫刺激性化合物を同定および開発する必要性が認識されている。本発明は、このような必要性を満たし、そして他の関連する利点をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の簡単な要旨）
本開示は、抗原のためのアジュバント処方物を提供し、特に、例えば、感染性疾患もしくは毒性因子の作用の処置または予防のような種々の治療設定における使用のための、種々の抗原を有する処方物のためのプロテオソームベースのアジュバントを提供する。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、抗原に対して免疫応答を誘導するための方法を提供し、この方法は、抗原に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有する。別の局面において、本発明は、微生物感染を処置または予防するための方法を提供し、この方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有する。特定の実施形態において、上記免疫原性組成物の抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓまたはＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来の１つ以上を含む。特定の他の実施形態において、上記免疫原性組成物の抗原は、ポックスウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、フィロウイルスまたはピコルナウイルス由来を含む。さらに他の実施形態において、上記免疫原性組成物の抗原は、１以上のトキシンを含む。さらに他の実施形態において、上記抗原は、組み換え抗原である。さらに他の実施形態において、上記免疫原性組成物は、複数の異なる抗原を含む。関連する実施形態において、上記複数の抗原は、ウイルス、微生物、寄生生物、トキシンまたはそれらの組み合わせを含み得る。
【０００８】
特定の実施形態において、上記免疫原性組成物は、粘膜、経腸、非経口、経皮、経粘膜、鼻もしくは吸入、またはそれらの組み合わせから選択される経路によって投与される。関連する実施形態において、上記免疫原性組成物は、防御免疫応答を誘導する。他の実施形態において、上記抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの防御抗原、Ｂｏｒｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来のＦ１抗原もしくはＶ抗原、Ｆ１−Ｖ抗原融合タンパク質抗原またはそれらの組み合わせを含む。さらに他の実施形態において、上記抗原は、痘瘡ウイルスまたはワクシニアウイルス由来の１つ以上の抗原を含む。さらに他の実施形態において、上記抗原は、ボツリヌストキシン、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢまたはそのフラグメントもしくは改変体のうちの１つ以上を含む。
【０００９】
さらに他の実施形態において、いずれの上述の免疫原性組成物も、その免疫原性組成物中に、約１％〜約５００％の範囲のプロテオソームタンパク質の百分率として、リポサッカリド最終重量含量を有する。他の実施形態において、上記プロテオソームおよびリポサッカリドは、同じ微生物から得られても異なる微生物から得られてもよい（例えば、グラム陰性細菌）。いくつかの実施形態において、上記リポサッカリドは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種またはそれらの組み合わせから選択されるグラム陰性細菌由来である。他の実施形態において、上記プロテオソームは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種由来である。特定の実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来であるプロテオソームおよびＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来であるリポサッカリドを有する。他の実施形態において、いずれの上述の免疫原性組成物も、約５：１〜約１：５００の範囲にあるプロテオソーム：抗原の比を有するか、またはその比は、少なくとも１：２、１：５もしくは１：１０である。さらに他の実施形態において、いずれの上述の免疫原性組成物も、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤をさらに含有する。
【００１０】
別の局面において、本開示は、抗原に対して免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法は、抗原に対する免疫応答を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、アジュバントおよび抗原を含有し、ここで、上記アジュバントは、プロテオソームおよびリポサッカリドを含有し、そして上記アジュバント：抗原の比は、約１：５〜約１：５００の範囲にあるか、または少なくとも１：５であり、それにより、上記抗原に対して免疫応答が誘導される。関連する局面において、微生物感染を処置または予防するための方法が提供され、この方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、アジュバントおよび抗原を含有し、ここで、上記アジュバントは、プロテオソームおよびリポサッカリドを含有し、そして上記アジュバント：抗原の比は、約１：５〜約１：５００の範囲にあるか、または少なくとも１：５であり、それにより、微生物感染は処置または予防される。特定の実施形態において、上述の免疫原性組成物のうちのいずれかが提供され、ここで、上記抗原は、微生物抗原、ウイルス抗原またはトキシン抗原のうちの少なくとも１つである。
【００１１】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって明白になる。さらに、種々の参考文献が本明細書中で述べられ、これらの参考文献は、特定の手順または組成物をより詳細に記載し、そして従って、その全体が参考として援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明を記述する前に、本明細書中の以下で使用される特定の用語の定義を記述することは、その理解に対する補助となり得る。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「プロテオソームまたはＰｒｏｊｕｖａｎｔ」とは、グラム陰性細菌（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、（例えば、Ｌｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８、１９８８；Ｌｏｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８００、１９８８；Ｌｙｎｃｈら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４、１９８４；Ｌｏｗｅｌｌ、「Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」第２版、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｉｌ、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、１９３頁、１９９７における；米国特許第５，７２６，２９２号；米国特許第４，７０７，５４３号を参照のこと））由来の外膜タンパク質（ＯＭＰ、またはポーリンとしても公知）の調製物をいい、これらは、免疫原（例えば、微生物抗原またはウイルス抗原）のためのキャリアまたはアジュバントとして有用である。プロテオソームは、疎水性であり、そしてヒトの用途のために安全であり、そして特定のウイルスに対してサイズにおいて適合性である。プロテオソームは、２０ｎｍ〜８００ｎｍの小胞または小胞様のＯＭＰクラスターへと自己集合し、そしてタンパク質抗原（Ａｇ）（特に、疎水性部分を有する抗原）を非共有結合的に組み込むか、調和するか、（例えば、静電気的または疎水的に）会合するか、またはそうでなければ協同して働くという興味深い能力を有する。小胞または小胞様の形態の上記外膜タンパク質成分（複数分子膜性構造または１つ以上のＯＭＰの溶解顆粒様ＯＭＰ組成物を含む）をもたらす任意の調製方法は、プロテオソームの定義内に含まれる。プロテオソームは、例えば、当該分野において記載されるように調製され得る（例えば、米国特許第５，７２６，２９２号または同第５，９８５，２８４号を参照のこと）。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「リポサッカリド」とは、グラム陰性細菌（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）または他のグラム陰性細菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ種、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種、Ｂｏｒｒｅｌｌｉａ種、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ種、Ｅｈｒｌｉｃｈａ種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ種、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓを含む）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ種、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ腫、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｐｒｏｔｅｕｓ種、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ種、他のＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｅｒｒａｔｉａ種、他のＳｈｉｇｅｌｌａ種、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ種、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ種、Ｖｉｂｒｉｏ種またはＹｅｒｓｉｎｉａ種を含む）由来の天然（単離されるかまたは天然構造を有するように合成的に調製される）または改変されたリポサッカリドもしくはリポオリゴサッカリド（まとめて、また、「ＬＰＳ」と呼ばれる）をいう。上記リポサッカリドは、無毒化形態（すなわち、リピドＡコアが除去されている）にあっても、無毒化されていない形態にあってもよい。本開示におい
て、リポサッカリドは、無毒化される必要はなく、好ましくは、無毒化されない。上記リポサッカリドは、例えば、米国特許出願公開番号２００３／００４４４２５に記載されるように調製され得る。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「プロテオソーム：ＬＰＳまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎまたはＩＶＸまたはＩＶＸ−９０８」とは、本明細書中に記載されるように少なくとも１種のリポサッカリドと混合されて、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物（これは、免疫刺激組成物として機能し得る）を提供するＰｒｏｊｕｖａｎｔの調製物をいう。従って、上記ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎの２つの基本成分から構成され得、このＰｒｏｔｏｌｌｉｎの２つの基本成分は、（１）グラム陰性細菌（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）から調製されたプロテオソーム（すなわち、Ｐｒｏｊｕｖａｎｔ）の外膜タンパク質調製物、および（２）１つ以上のリポサッカリドの調製物を含む。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎはまた、必要に応じて、脂質、糖脂質、糖タンパク質、低分子などおよびそれらの組み合わせを含有することが理解されるべきである。上記Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎは、例えば、米国特許出願公開番号２００３／００４４４２５に記載されるように調製され得る。
【００１６】
Ｐｒｏｊｕｖａｎｔは、一般的に、（天然に存在するかまたは改変された）疎水性部分（また、「フット（ｆｏｏｔ）」または「アンカー」と呼ばれる）を有する抗原と組み合わせて使用される。しかし、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（外因的に付加されたＬＰＳを有する）は、疎水性フットドメインを含まず、本質的には大部分が親水性である抗原とともに使用され得るか、または疎水性フットを含む抗原と会合し得るか、またはそれらの組み合わせである。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「トキシンまたは毒性因子」とは、抗原性であり、そして特定の微生物もしくはいくつかのより高等な植物種および動物種の代謝または成長の間に、細胞もしくは組織の欠くことのできない部分（例えば、エンドトキシン）として、細胞外生成物（例えば、エキソトキシン）としてまたはその２つの組み合わせとして形成または作製される、有害物質または有毒物質をいう。本開示の免疫原性組成物における使用のために、トキシンまたは毒性因子は、「トキソイド」の形態にあり、それにより、上記免疫原性組成物は、有毒でも有害でもないことが理解されるべきである。「トキソイド」形態は、抗原性をなお保持しながら、上記因子の有毒特性を破壊する（すなわち、抗トキシンを誘導し得るかまたは免疫応答を中和し得る）ように処理されているトキシンである。トキソイドを生じるトキシンの「処理」としては、化学的処理（例えば、ホルムアルデヒド）、変異、フラグメントおよびそれらの組み合わせが挙げられる。例示的なトキシンとしては、リシントキシン、ボツリヌストキシン、アルファトキシン、イプシロントキシン（ｅｐｉｓｏｌｎｔｏｘｉｎ）、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ、テトロドトキシン、蛇毒トキシン（ｓｎａｅ ｖｅｎｏｍ ｔｏｘｉｎ）、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、サキシトキシン、トリコテセンマイコトキシンなどが挙げられる。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「免疫原性組成物」とは、適応（特異）免疫応答を開始させるか、増強するか、活性化するか、刺激するか、増大するか、増進するか、増幅するかもしくは促進し得る、任意の１つ以上の化合物または因子をいい、これらは、細胞性（Ｔ細胞）もしくは体液性（Ｂ細胞）、またはそれらの組み合わせであり得る。好ましくは、上記適応免疫応答は、防御的であるか、中和するか、またはその両方である。免疫原の代表的な例としては、微生物抗原（例えば、１つ以上の本発明の細菌タンパク質、ウイルスタンパク質または寄生生物タンパク質）または非微生物抗原（例えば、植物（リシン）、渦鞭毛藻類（サキシトキシン）などのような他の供給源から得られる抗原）である。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「特異免疫応答または獲得免疫応答または適応免疫応答」とは、感染性因子または抗原に予め曝露することの結果としてもたらされる、哺乳動物免疫系によって媒介される抵抗性をいう。例えば、特異免疫は、天然に獲得される（開存性または潜伏性）感染または意図的な予防接種からの結果であり得る。さらに、特異免疫は、生来の別のものからの抗体の転移（例えば、母性遺伝）または意図的な予防接種による抗体もしくは免疫細胞の転移（例えば、抗体媒介性免疫療法）から、受動的かつ一時的に獲得され得る。
【００２０】
本説明において、任意の濃度範囲、百分率範囲、比の範囲または他の整数範囲は、別に示されなければ、その列挙される範囲および必要に応じてその分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）内の任意の整数値を含むことが理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、「約」または「本質的に構成する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、±１５％を意味する。代替物の使用（例えば、「または」）は、その代替物の１つ、両方またはその任意の組み合わせを意味することが理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、不定冠詞（例えば、「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」）の使用は、名詞または名詞熟語の単数形および複数形をいうことが理解されるべきである。さらに、本明細書中に記載される種々の成分または組成物もしくは順序、構造および置換の組み合わせから誘導される、個々の組成物、処方物もしくは化合物、または組成物、処方物もしくは化合物の群は、各組成物もしくは化合物、または組成物もしくは化合物の群が独立して述べられるのと同じ程度に、本出願によって開示されることが理解されるべきである。従って、特定の順序、構造または置換の選択は、本発明の範囲内である。
【００２１】
上述のように、そして本明細書中で記載されるように、本発明は、免疫原性組成物を使用および作製して、種々の感染性疾患を処置もしくは予防するか、または毒性因子と関連する病理学的状態を処置もしくは予防するための組成物および方法を提供する。特に、例えば、限定された量のアジュバントおよび過剰量の抗原を用いて処方された、アジュバント（例えば、プロテオソームまたはリポサッカリドを有するプロテオソーム）および抗原（例えば、微生物抗原またはトキシン）を含有する免疫原性組成物が提供される。従って、本発明は、一般的に、プロテオソームベースのアジュバントが、強力な免疫刺激活性を有し、それにより、多量の抗原が、少量のアジュバントを用いて処方されて、新規かつ有用なワクチン処方物を提供するという、驚くべき発見に関する。プロテオソーム：ＬＰＳまたは１つ以上の微生物抗原を用いて処方されたプロテオソームを含有する免疫原性組成物が、以下により詳細に議論される。特定の局面において、本説明の組成物は、治療用途（例えば、特異免疫応答を誘導するか、または（感染に対する）防御免疫を提供し、そして（毒性因子に対する）免疫性を中和することができる免疫応答を誘導することによる、微生物感染の処置または予防）のために適切である。
【００２２】
（プロテオソームベースのワクチンアジュバント−（「Ｐｒｏｊｕｖａｎｔ」および「Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ」））
本発明は、免疫応答を誘導可能な１つ以上の抗原を含有する免疫原性組成物に関する。上述のように、多くの抗原は、アジュバントを用いて処方されなければ、免疫原性が乏しい。ヒトにおける用途のために承認されている唯一のアジュバントは、ミョウバンであるが、このアジュバントは、上記に記載のような制限を有する。代替的なアジュバントを同定するための多様な努力にも関わらず、（特に、感染性疾患および毒性因子に対する）免疫を必要としている個体を免疫するための有効な組成物に対する必要性が、いまだ存在している。
【００２３】
本開示のプロテオソームベースのアジュバントは、ワクチン処方物において使用され得、このワクチン処方物は、種々の抗原供給源を含み得る。例えば、生きている減弱した微生物、殺した微生物、分裂した抗原、サブユニット抗原、毒性因子抗原およびそれらの組み合わせである。サブユニットワクチンの有効性を最大にするためには、上記抗原は、強力な免疫刺激因子またはアジュバントと組み合わせられるべきである。例示的なアジュバントとしては、ミョウバン（水酸化アルミニウム、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標））、リン酸アルミニウム、プロテオソームアジュバント（例えば、米国特許第５，７２６，２９２号および同第５，９８５，２８４号、ならびに米国特許出願公開番号２００１／００５３３６８および２００３／００４４４２５を参照のこと）、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）、リポソーム（リピドＡを含む、およびリピドＡを含まない）、Ｄｅｔｏｘ（Ｒｉｂｉ／Ｃｏｒｉｘａ）、ＭＦ５９または他の油および水のエマルジョン型アジュバント（例えば、ナノエマルジョン（例えば、米国特許第５，７１６，６３７号を参照のこと）またはサブミクロンエマルジョン（例えば、米国特許第５，９６１，９７０号を参照のこと）ならびにフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントが挙げられる。特に好ましいアジュバントは、プロテオソームまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎである。
【００２４】
プロテオソームは、代表的には、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種由来の外膜タンパク質（ＯＭＰ）から構成されるが、他のグラム陰性細菌（例えば、Ｌｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８、１９８８；Ｌｏｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８００、１９８８；Ｌｙｎｃｈら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４、１９８４；米国特許第５，７２６，２９２号；同第４，７０７，５４３号を参照のこと）に由来し得る。プロテオソームは、２０ｎｍ〜８００ｎｍの小胞または小胞様のＯＭＰクラスターへと自己集合し、そしてタンパク質抗原（Ａｇ）（特に、疎水性部分を有する抗原）を非共有結合的に組み込むか、調和するか、会合するか、またはそうでなければ協同して働くという興味深い能力を有する。プロテオソームは、疎水性であり、そしてヒトの用途のために安全であり、そして特定のウイルスに対してサイズにおいて適合性である。背景のために、そして理論と結びつけられることは所望されず、プロテオソームとタンパク質（例えば、抗原）とを混合することは、上記抗原とプロテオソームとの間の非共有結合的な会合または調和を含む組成物を提供し、例えば、透析によって、溶解用界面活性剤が選択的に除去されるかまたは減少されると、会合または調和が形成する。プロテオソームは、当該分野において記載されるように、または米国特許出願番号２００１／００５３３６８および２００３／００４４４２５に記載されるように、調製され得る。
【００２５】
上記外膜タンパク質成分の小胞または小胞様の形態（１つ以上のＯＭＰの溶解顆粒様ＯＭＰ組成物を含む）をもたらす任意の調製方法は、「プロテオソーム」の定義内に含まれる。１つの実施形態において、上記プロテオソームは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種由来であり、そしてより好ましくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来である。特定の実施形態において、プロテオソームは、キャリアではなくアジュバントである。特定の他の実施形態において、プロテオソームは、アジュバントであり得、そして抗体送達組成物であり得る。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書中に記載されるような１つ以上の抗原（例えば、微生物抗原、ウイルス抗原、寄生生物抗原、真菌抗原、トキシン抗原およびそのフラグメントまたは改変体）およびアジュバントを含有し、ここで上記アジュバントは、ＰｒｏｊｕｖａｎｔまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎを含む。本明細書中で記載されるように、上記抗原は、組み換え供給源由来であり得るか、または例えば、（界面活性剤）分裂抗原を含み得る。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明は、免疫刺激因子（例えば、リポサッカリド）をさらに含有する免疫原性組成物を提供する。すなわち、上記アジュバントは、調製されてさらなる免疫刺激因子を含有し得る。例えば、上記Ｐｒｏｊｕｖａｎｔは、リポサッカリドと混合されて、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントを提供し得る。従って、上記ＯＭＰ−ＬＰＳ（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ）アジュバントは、２つの基本成分からなり得る。上記第１の成分は、グラム陰性細菌（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）から調製されるプロテオソームの外膜タンパク質調製物（すなわち、Ｐｒｏｊｕｖａｎｔ）である。上記第２の成分は、リポサッカリドの調製物である。上記リポサッカリドは、米国特許出願番号２００１／００５３３６８および２００３／００４４４２５に記載されるように調製され得る。上記第２の成分は、脂質、糖脂質、糖タンパク質、低分子などおよびそれらの組み合わせを含有し得ることがまた、意図される。
【００２７】
本明細書中で記載されるように、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントの上記２つの成分は、特定の開始比で処方されて、上記成分間の相互作用を最適化し得、その結果、安定な会合および本発明の免疫原性組成物の調製物における使用のための上記成分の処方物をもたらす。上記プロセスは、一般的に、選択された界面活性剤溶液（例えば、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００またはＭｅｇａ−１０）中で成分を混合する工程、そして次いで、透析または好ましくは、透析／限外濾過法によって、界面活性剤の量を予め決められた好ましい濃度に減少しながら、上記ＯＭＰ成分およびＬＰＳ成分を効果的に複合体化する工程を包含する。上記２つの成分の混合、共沈殿または凍結乾燥はまた、充分かつ安定な会合または処方物を生じるために使用され得る。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書中に記載されるような１つ以上の抗原およびアジュバントを含有し、ここで、上記アジュバントは、Ｐｒｏｊｕｖａｎｔ（すなわち、プロテオソーム）およびリポサッカリドを含有する。
【００２８】
好ましい実施形態において、プロテオソームタンパク質全体の百分率としての最終リポサッカリド重量含量は、約１％〜約５００％の範囲、より好ましくは、約１０％〜約２００％の範囲、または約３０％〜約１５０％の範囲にあり得る。本発明の別の実施形態は、上記プロテオソームが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓから調製され、そして上記リポサッカリドが、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓから調製され、そして上記最終リポサッカリド含量が、プロテオソームタンパク質全体の５０重量％〜１５０重量％の間である、アジュバントを含む。別の実施形態において、プロテオソームは、ＯＭＰ全体の約０．５％〜約５％までの範囲にわたる内因性リポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）含量を用いて調製される。本発明の別の実施形態は、約１２％〜約２５％の範囲の内因性リポサッカリドを有するプロテオソームを提供し、そして好ましい実施形態においては、ＯＭＰ全体の約１５％と約２０％との間である。本発明はまた、任意のグラム陰性細菌種由来のリポサッカリドを含有する組成物を提供し、このグラム陰性細菌種は、プロテオソームの供給源であるグラム陰性細菌種と同じであっても、異なる細菌種であってもよい。
【００２９】
特定の実施形態において、上記プロテオソームまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎ：抗原の比は、上記混合物において、１：１より大きいか、２：１より大きいか、３：１より大きいかまたは４：１より大きい。上記比は、８：１と同じくらい高くてもまたはそれより高くてもよい。別の実施形態において、免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の上記比は、約１：１〜約１：５００の範囲にわたり、好ましくは、上記比は、少なくとも１：５、少なくとも１：１０、少なくとも１：２０、少なくとも１：５０または少なくとも１：１００である。本発明の予想外の結果は、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ：抗原の比が、抗原が免疫応答を誘導する能力に対して有意に影響することなく、劇的に減少し得た（１：２〜１：２００）ことである。
【００３０】
（抗原）
本発明は、１つ以上の抗原を含有する免疫原性組成物に関し、この抗原は、使用されて、免疫応答（例えば、防御免疫応答）を誘導し得る。本発明は、本明細書中に記載されるように、被験体に、１つ以上の抗原またはそのフラグメントもしくは改変体、融合タンパク質、多価免疫原またはこのような免疫原の混合物を、上記抗原に対して特異的な免疫応答（細胞性または体液性）（これは、防御免疫であり得る）を誘導するために充分な用量で投与することによって、微生物感染を処置および予防するための方法にさらに関する。上記抗原は、好ましくは、臨床的に関連する微生物（例えば、細菌、ウイルス（例えば、インフルエンザ、麻疹、コロナウイルス）、寄生生物（例えば、Ｔｒｙｐａｎｓｏｍｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、病原性微生物）、真菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）など）由来である。例えば、上記抗原は、炭疽（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、胃癌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、Ｑ熱（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、百日咳（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、例えば、ＦＨＡ）、ボツリヌス症（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型）、ガス壊疽（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、野兎病（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、類鼻疽（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、ブルセラ症（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、性感染症（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）の原因因子のような微生物、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのようなトキシン産生生物（イプシロントキシン、これらのグラム陽性嫌気性芽胞形成微生物によって産生される１２のタンパク質トキシンのうちの１つ）由来であり得る。
【００３１】
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの５つの株（Ａ〜Ｅ）が存在し、各々は、独特な一連のトキシンを産生する；イプシロントキシンは、Ｂ型およびＤ型によって産生される。イプシロントキシンは、細胞からのカリウムおよび流体の漏出を引き起こす実行ポリペプチドとして公知である。イプシロントキシンに加えて、上記Ａ型〜Ｅ型は、アルファトキシン、ベータトキシン、イプシロントキシンまたはイオタトキシンのうちの１つ以上を産生し得る。上記イプシロントキシンは、汚染された食物もしくは水の摂取、またはエアロゾル化トキシンの吸入によって広がり得る。関連する別の例示的なトキシンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによって産生されるブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。ＳＥＢは、吸入した場合に病気を引き起こすことが公知であり、そして恐らく、食物中毒の原因である。ＳＥＢ中毒個体の免疫系は、損傷されており、そして死と関連することは多くはないが、重大かつ広範に拡大する無力化する病気（例えば、高熱、悪寒、頭痛、筋肉痛、まぶたの裏の炎症、吐き気、嘔吐および下痢）となる。現在利用可能なワクチンまたは抗ＳＥＢは存在しない。
【００３２】
特定の実施形態において、単離されたＬＰＳは、抗原、例えば、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓから単離されたＬＰＳであり得、このＬＰＳは、歯肉疾患、歯周疾患、虫歯（ｔｏｏｔｈ ｄｅｃａｙ）などを処置または予防するためのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答の刺激における使用のために、プロテオソームを用いて処方され得る。
【００３３】
他の代表的な例としては、特定のウイルス（例えば、ノーウォークウイルス、天然痘ウイルス、西ナイルウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＲＳウイルスなど）由来の抗原が挙げられる。フィロウイルスの例としては、マルブルクウイルスおよびエボラウイルスが挙げられ；フラビウイルスの例としては、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルスが挙げられ；アレナウイルスの例としては、Ｊｕｎｉｎ（アルゼンチン出血熱）ウイルスが挙げられ；ラッサ熱ウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、Ｍａｃｈｕｐｏ（ボリビア出血熱）ウイルス；ブンヤウイルスの例としては、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ハンターン（朝鮮出血熱）ウイルス、リフトバレー熱ウイルスが挙げられ；ピコナウイルスの例としては、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルスが挙げられ；オルトミクソウイルスの例としては、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ，Ｃ（例えば、ＨＡ抗原）、トゴトウイルスが挙げられ；アルファウイルスの例としては、チクングニアウイルス、東部脳炎ウイルス、ベネズエラ脳炎ウイルス、西部脳炎ウイルスが挙げられる。真菌の例としては、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｅｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａが挙げられ；そして寄生生物の例としては、トリパノソーマ症、リーシュマニア、肺ペストおよびライム病（Ｂｏｒｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の原因因子が挙げられる。さらに、本発明の抗原は、毒性因子（例えば、リシン、ボツリヌス）であり得る。
【００３４】
本明細書中で記載される場合、上記抗原は、組み換え的に、合成的に調製されてもよく、生物学的供給源から単離されてもよく、組み換え的または化学的に改変されてもよく、そして任意のそれらの組み合わせでよい。微生物抗原またはそのフラグメントは、種々の生物学的供給源（例えば、感染被験体組織または培養細胞株）から調製され得る。一次的な単離は、例えば、末梢血液細胞由来または呼吸分泌物由来であり得る。好ましくは、上記単離された微生物は、一次細胞培養物または当該分野で公知の確立された細胞株において増幅される。特定の実施形態において、上記抗原またはそのフラグメントは、完全な微生物粒子から単離される。本明細書中で使用される場合、用語「単離された」または「由来する」は、その物質が、その元々の環境または天然の環境から取り除かれることを意味する。例えば、生きている動物もしくは細胞、またはウイルスに存在する、天然に存在する核酸分子またはポリペプチドは、単離されていないが、同じ核酸分子またはポリペプチドは、その天然系においてともに存在する物質のいくつかまたは全てから分離される場合には、単離されている。例えば、核酸分子は、ベクターに含まれ得、そして／またはこのような核酸は、組成物の一部であり得、そしてさらに、このようなベクターまたは組成物は、元々の核酸分子の天然の環境の一部ではないという点で、単離されている。別の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、抗原またはその改変体およびフラグメント）は、部分的に精製されるかまたは均一になるまで精製されるかのいずれかであり得る。
【００３５】
本発明は、合成抗原（融合タンパク質を含む）を生成するための方法をさらに提供する。上記免疫原性ポリペプチド成分は、標準的な化学的方法（自動手順による合成を含む）によって合成され得る。一般的に、免疫原性のポリペプチドまたはペプチドは、カップリング剤としてＨＡＴＵを用いた標準的な固相Ｆｍｏｃ保護方法に基づいて合成される。上記免疫原性ペプチドは、適切なスカベンジャーを含有するトリフルオロ酢酸を用いて固相樹脂から切断され得、このトリフルオロ酢酸はまた、側鎖官能基を脱保護する。粗製免疫原性ペプチドは、分取逆相クロマトグラフィーを用いてさらに精製され得る。他の精製方法（例えば、分割クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動またはイオン交換クロマトグラフィー）が、使用され得る。当該分野で公知の他の合成技術（例えば、ｔＢｏｃ保護方法、種々のカップリング試薬の使用など）が、同様の免疫原性ペプチドを生成するために用いられ得る。さらに、任意の天然に存在するアミノ酸もしくはその誘導体または天然に存在しないアミノ酸もしくはその誘導体（Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸およびその組み合わせを含む）が使用され得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、本発明の微生物抗原またはそのフラグメントは、組み換え体であり得、ここで、所望される抗原は、核酸発現構築物において発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に結合されたポリヌクレオチドから発現される。例えば、上記免疫原をコードする核酸発現構築物を含む宿主細胞（例えば、バキュロウイルスおよび哺乳動物細胞株）は、培養されて、組み換えタンパク質免疫原またはそのフラグメントを生成し得る。上記抗原は、アミノ酸配列にさらに融合または結合され得、この配列は、ＰｒｏｊｕｖａｎｔもしくはＰｒｏｔｏｌｌｉｎとの非共有結合的会合を容易にするか、またはそうでなければ促進するための疎水性のアンカーまたはフットであり得る。上記抗原ポリペプチドは、微生物感染に対して防御免疫応答（細胞性または体液性）を誘導し得る少なくとも１つのエピトープを有するような、ポリペプチドの任意の部分を含み得る。本発明の免疫原性ポリペプチドはまた、直線状形態に整列され得るかまたは組み合わせられ得、そして各免疫原は、反復されてもされなくてもよく、ここで、上記反復は、１回または複数回生じ得る。さらに、複数の種々の免疫原性ポリペプチド（例えば、タンパク質改変体またはそのフラグメント）は、選択され、そしてカクテル組成物中に混合されるかまたは合わせられて、防御免疫応答の誘導における使用のための多価ワクチンを提供し得る。
【００３７】
本開示の免疫原性組成物における使用のための特定の例示的な抗原についてのさらなる詳細を提供するために、以下の説明を提供する。
【００３８】
（Ａ．ペスト）
ペストは、黒死病としてもまた公知であり、長い歴史を有する疾患である。中世のペストの流行は、ヨーロッパにおいて３千万人までもの人々を死に追いやった。天然の発症は、風土病性地域において世界中でなお生じているが、抗生物質処置の有用性に起因して、上記疾患は、病的状態をほとんど引き起こさず、そして死亡は、稀にしか生じない。しかし、ペストを取り巻く恐怖は、それが生物戦闘兵器として使用され得る可能性によって、近年増大している。
【００３９】
腺ペストは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓに感染したノミに咬まれることによってヒトへと広がり、そして比較的容易に診断され、そして従って、抗菌剤によって効果的に処置される。ペストの最も致死的な形態である肺ペストは、呼吸経路によるか、または腺ペストもしくは敗血性ペストの拡大の結果として、感染され、かつ処置されていない人によって、人から人へと伝達される。曝露後の肺ペストの処置は、その迅速な経過に起因して、より問題がある。抗菌剤処置が、感染症状を示してから２４時間以内になされなければ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓを吸入したほとんどの人は、死亡する。ペストの起こり得る意図的な伝播に対する懸念によって、ペストの最も有毒な肺性形態に対して防御可能な安全なワクチンの開発が、非常に優先されている。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本発明は、ペストに対して免疫応答を誘導するための方法を提供し、この方法は、ペストに対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上のペスト抗原またはその改変体もしくはフラグメントを含有する。他の実施形態において、本発明は、ペスト感染を処置または予防するための方法を提供し、この方法は、ペスト感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上のペスト抗原またはその改変体もしくはフラグメントを含有し、ここで、上記ペスト感染は、処置または予防される。特定の実施形態において、上記免疫原性組成物において使用されるペスト抗原は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来のＦ１抗原もしくはＶ抗原、またはＦ１−Ｖ抗原融合タンパク質抗原、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００４１】
（Ｂ．天然痘）
１つの実施形態において、例えば、ヒトにおいて天然痘疾患を引き起こす痘瘡ウイルスによる感染に対して防御免疫応答を引き起こすウイルス抗原を含有するＰｒｏｔｏｌｌｉｎ処方物は、本明細書中で企図される。痘瘡ウイルスは、ポックスウイルス科と呼ばれるウイルスファミリーの最も有名なメンバーであり、そして歴史的に、ヒトの文明に対して重要かつ劇的な効果を有してきた。上記ポックスウイルス科は、ＤＮＡウイルスの大きなファミリーであり、感染宿主細胞の細胞質において複製する。痘瘡ウイルスの感染は、感染したもののうちの２０％〜３０％を死に追いやり、そして高度に感染性である。２０年の牛痘ウイルスワクチンおよびワクシニアウイルスワクチンを用いた予防免疫は、１９７０年代後半までに、ヒトにおける天然痘疾患の発症を効果的に撲滅してきたものの、天然痘ウイルスが、天然に存在するウイルス集団からかまたは生物学的戦闘兵器としての予測されない集団への意図的な導入の結果としてのいずれかで、重要かつ致命的な疾患として再興し得るという懸念は、残ったままである。
【００４２】
感染宿主細胞から精製されたウイルス粒子は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分解された場合、３０以上もの多くの別個のポリペプチドのバンドを構成する。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株のゲノム配列は、６５個超のアミノ酸からなる約１８５個の独自の重複しないオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。慣例により、オルトポックスウイルスＯＲＦの命名は、ＨｉｎｄＩＩ制限エンドヌクレアーゼフラグメントを用いた文字、その後、そのＯＲＦの数（左から右）、そしてそのＯＲＦの方向に依存したＬまたはＲからなる。痘瘡ウイルスのインド株およびバングラディッシュ株の完全配列およびほぼ同一の配列はまた、約１８７個のＯＲＦを含み、これらのうちの１５０個は、ワクシニアウイルスのＯＲＦに対して、９０％超の配列同一性を有する。痘瘡ウイルスコードポリペプチドに対して９０％の配列同一性を有する、ワクシニアウイルスＯＲＦによってコードされるポリペプチドのうちの１つ以上は、ワクシニアウイルス免疫後の防御に関与する免疫応答を媒介すると考えられている。限定するわけではないが、例として、多くのＯＲＦは、防御免疫応答の誘導に関与し得る細胞外ウイルス特異的ポリペプチドをコードすることが、公知である。それらとしては、Ｆ１３Ｌ ＯＲＦによってコードされる非グリコシル化４１．８ｋＤａタンパク質；Ａ３４Ｒ ＯＲＦによってコードされるＮ−グリコシル化１９．５ｋＤａタンパク質；Ａ３６Ｒ ＯＲＦによってコードされる２５．１ｋＤａタンパク質；Ａ５６Ｒ ＯＲＦによってコードされるＮ−およびＯ−グリコシル化赤血球凝集素タンパク質；およびＢ５Ｒ ＯＲＦによってコードされるグリコシル化３５．１ｋＤａタンパク質が挙げられる。これらのタンパク質の１つ以上に対する免疫応答は、体液性免疫応答または細胞媒介性免疫応答を誘導すると考えられており、これらの免疫応答は、痘瘡ウイルス感染から防御し得るかまたは感染の病原性効果を減少し得る。均衡がとれているかまたは微調整されたＴＨ１／Ｔｈ２サイトカインプロファイルに優先的に関与する感染宿主の免疫応答は、痘瘡ウイルス感染および天然痘疾患の発症の予防または処置において有効であると考えられている。
【００４３】
オルトウイルスの４種のメンバーは、ヒト感染を引き起こし得、それらは、サル痘ウイルス、牛痘ウイルス、痘瘡ウイルスおよびワクシニアウイルスである。牛痘ウイルスおよびワクシニアウイルスは、天然痘感染に対してヒトを予防接種するために、広く使用されている。なぜなら、それらは、痘瘡ウイルスによる感染と比較して、重篤な合併症を生じにくいからである。かなりの程度まで、天然痘は、深刻な健康への脅威であることから撲滅されており、そして続けられた広範に広がる集団全般の予防接種は、中止されている。しかし、天然ウイルスの再興または生物学的脅威因子としての天然痘ウイルスの迅速かつ広範な開発、および生ウイルスを用いた予防接種から生じる、起こり得る所望されない副作用から、天然痘に対する代替的なワクチンの開発の必要性が生じている。
【００４４】
今日まで、天然痘ウイルス（すなわち、痘瘡ウイルス）感染に対する非生存サブユニットワクチンは存在していない。現在のワクチン処方物は、防御免疫応答（しばしば、所望されない副作用）を引き起こすために、減弱した生ウイルスの使用を必要とする。特定の実施形態において、本発明は、天然痘に対して免疫応答を誘導するための方法を提供し、この方法は、天然痘に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上の天然痘抗原または天然痘ウイルス粒子抽出物を含有する。他の実施形態において、本発明は、天然痘感染を処置または予防するための方法を提供し、この方法は、天然痘感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上の天然痘抗原または天然痘ウイルス粒子抽出物を含有し、ここで、上記天然痘感染は、処置または予防される。
【００４５】
（Ｃ．リシン）
本発明のさらに別の局面において、非感染性の毒性因子または有毒因子に対して免疫応答を引き起こし得るプロテオソームベースのワクチン組成物は、本明細書中で企図される。このような非感染性因子としては、例えば、豆植物Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓから産生されるリシントキシンが挙げられ、このリシントキシンは、ヒト、動物および昆虫に対して有毒である。リシンは、トウゴマによって産生される細胞毒であり、吸入または摂取による中毒は、リシンによって引き起こされる。リシン中毒は、用量に依存して、摂取の２時間〜３時間以内に開始して、腹痛、嘔吐、下痢を引き起こし得る。リシン中毒は、阻止されない場合、数日以内に重篤な脱水症へと進行し、そして血圧を低下させて、摂取（または吸入）後３日〜５日以内に死に至る。リシンは、実に容易に産生され、そして、小さい粒子としての吸入またはその後の摂取によって中毒（毒性）を引き起こし得る、強力なトキシンである。リシンはまた、かなり安定である。リシン中毒の症状としては、衰弱、発熱、咳および肺水腫、その後の重篤な呼吸窮迫症および低酸素血症による死が挙げられる。げっ歯動物においては、エアロゾル曝露の組織病理は、脈管水腫および肺胞水腫（ａｌｅｖｅｏｌａｒ ｅｄｅｍａ）を伴う気管炎、気管支炎および間質性肺炎を引き起こす壊死性気道損傷によって特徴付けられる。げっ歯動物において、リシンは、他の曝露経路によるよりも吸入によってより有毒である。地理的に集中した個体の有意な数におけるリシン中毒の症状は、エアロゾル化リシンに対する曝露を示唆し得る。
【００４６】
細胞毒性は、真核生物リボソームを特異的かつ不可逆的に不活性化するメカニズムを介する、タンパク質合成の阻害によって媒介される。従って、リシンはまた、公知のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）である。上記ＲＩＰ（例えば、リシン）は、一般的に、２つのジスルフィド結合されたポリペプチド鎖から構成される。一方のポリペプチド鎖は、細胞への結合および細胞質への取り込みを媒介し、他方の鎖は、タンパク質合成を阻害するために機能する。特定の実施形態において、本発明は、リシントキシンに対して免疫応答を誘導するための方法を提供し、この方法は、リシントキシンに対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上のリシントキシン抗原またはそのフラグメントもしくは改変体を含有し、ここで、上記リシントキシン抗原は、抗体応答の中和を誘導する。従って、宿主Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答を調節し、そしてトキシン活性を不活性化または減弱するリシン免疫原性ポリペプチドを含有するプロテオソームワクチン処方物は、本明細書中で企図される。
【００４７】
（Ｃ．ボツリヌス中毒）
ボツリヌス中毒は、バシラス属のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍによって産生される７つの異なる神経毒のうちのいずれかによる中毒によって引き起こされる。上記ボツリヌストキシンは、約１５０，０００ＫＤａの分子量を有するタンパク質であり、末梢コリン作動性シナプスでニューロンのシナプス前膜に結合して、アセチルコリンの放出を阻害し、そして神経伝達を遮断する。上記遮断は、上記コリン作動性自律神経系および神経筋接合部において、臨床的に最も明らかである。吸入ボツリヌス中毒の症状は、曝露後２４時間〜３６時間の早さで開始し得るかまたは数日の遅さで開始し得る。初期の徴候および症状としては、下垂、全身性衰弱、倦怠および眩暈感が挙げられる。呼吸不全の発症は、突然にあり得る。
【００４８】
特定の実施形態において、本発明は、ボツリヌストキシンに対して免疫応答を誘導するための方法を提供し、この方法は、ボツリヌストキシンに対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上のボツリヌストキシン抗原またはそのフラグメントもしくは改変体を含有し、ここで、上記ボツリヌストキシン抗原は、抗体応答の中和を誘導する。
【００４９】
（免疫原性組成物および使用方法）
本発明はまた、１つ以上の抗原を含有する免疫原性組成物に関し、この組成物は、免疫応答（例えば、防御免疫応答）を誘導するために使用され得る。本発明は、本明細書中で記載されるように、１つ以上の抗原もしくはそのフラグメント、融合タンパク質、多価免疫原またはこのような抗原の混合物を、上記抗原に対して特異的な免疫応答（細胞性または体液性）（この免疫応答は、防御免疫応答であり得る）を誘導するために充分な用量で被験体に投与することによって、微生物感染もしくは毒性因子の影響を処置または予防するための方法にさらに関する。抗原およびその改変体、またはこのような免疫原のカクテルは、好ましくは、本発明の方法において使用される場合、アジュバント（例えば、ＰｒｏｊｕｖａｎｔまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎ）を含有する組成物の一部である。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、１つ以上のさらなる微生物抗原（例えば、ウイルス抗原、微生物抗原、寄生生物抗原またはそれらの組み合わせ）をさらに含有し得る。例えば、ペストまたは炭疽に対する免疫原性はまた、風疹抗原およびムンプス抗原に対する抗原を含み得る。
【００５０】
上記免疫原性組成物は、１つ以上の抗原またはそのフラグメントに加えて、薬学的に受容可能なビヒクル、キャリア、希釈剤または賦形剤、そして必要に応じて、他の成分をさらに含有し得る。例えば、本発明の免疫原性組成物との使用のために適切な薬学的に受容可能なキャリアまたは他の成分としては、濃縮剤、緩衝剤、溶媒、湿潤剤、保存剤、キレート剤、添加アジュバントなど、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５１】
さらに、本発明の薬学的組成物は、希釈剤（例えば、水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））をさらに含有し得る。好ましくは、希釈剤は、約０．１ｍＭ〜約１Ｍ、より好ましくは、約０．５ｍＭ〜約５００ｍＭ、さらにより好ましくは、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、そして最も好ましくは、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の最終ホスフェート濃度；および約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ、そして最も好ましくは、約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭの範囲の最終塩濃度を有するＰＢＳである。好ましくは、上記最終ＰＢＳ濃度は、約５ｍＭのホスフェートおよび約１５０ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ）である。特定の実施形態において、本発明の抗原およびアジュバント（例えば、ＰｒｏｊｕｖａｎｔまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎ）のカクテルを含有する上述の免疫原性組成物のいずれもが、好ましくは、滅菌である。
【００５２】
上記組成物は、無菌環境下でそれらを調製することによって滅菌され得るか、またはそれらは、当該分野で利用可能な方法を用いて最終的に滅菌され得るかのいずれかである。多くの医薬品は、滅菌であるように製造され、そしてこの基準は、ＵＳＰ ＸＸＩＩ＜１２１１＞により規定されている。この実施形態における滅菌は、この産業において受容され、そして上記ＵＳＰ ＸＸＩＩ＜１２１１＞に列挙されている多くの手段（ガス滅菌、電離放射線または濾過を含む）によって達成され得る。滅菌は、無菌処理と呼ばれ、また、ＵＳＰ ＸＸＩＩ＜１２１１＞に規定されている方法によって維持され得る。ガス滅菌のために使用される受容可能な気体としては、エチレンオキシドが挙げられる。電離放射線法のために使用される受容可能な放射線型としては、例えば、コバルト６０供給源からのγ線および電子線が挙げられる。γ線放射の代表的な用量は、２．５ＭＲａｄである。必要に応じて、濾過は、適切な孔サイズ（例えば、０．２２μｍ）を有し、そして適切な材料（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））からなるフィルタを用いて達成され得る。用語「ＵＳＰ」とは、米国薬局方（ｗｗｗ．ｕｓｐ．ｏｒｇ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤを参照のこと）をいう。プロテオソームまたはＯＭＰ−ＬＰＳは、充分小さい粒子を生じるという事実に起因して、本発明の免疫原性組成物は、０．８μのフィルタ、０．４５μのフィルタまたは０．２μのフィルタを通して濾過され得る。従って、好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、濾過によって滅菌される。このことは、非常に有益である。なぜなら、このような夾雑物の存在による任意の複雑化を除去することが、所望されるからである。
【００５３】
本発明はまた、微生物感染を処置または予防するための方法に関し、この方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、免疫原性組成物を投与する工程を包含し、この免疫原性組成物は、アジュバントおよび１つ以上の抗原を含有し、ここで、上記アジュバントは、プロテオソームまたはＯＭＰ−ＬＰＳのいずれかを含む。別の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、免疫応答（細胞性もしくは体液性、またはその両方、これらは、１型細胞応答または２型細胞応答に有利であり得る）を誘導するために使用され得る。抗原処方物を用いた処置または免疫応答の誘導のために適切な被験体は、疾患を発達させるための危険性の充分に確立された指標、または存在する疾患の充分に確立されたに証明によって規定され得る。本明細書中で使用される場合、用語「処置する」および「改善する」とは、統計学的に有意な様式で、疾患の少なくとも１つの局面もしくはマーカーを処置するか、阻害するか、軽減するか、改善するか、減少するか、予防するかまたは変化させるために充分な量あるいは充分な時間での、所望される組成物または化合物の治療用投与をいうことが理解されるべきである。本発明の抗原を用いて処置され得るか、改善され得るかまたは予防され得る感染としては、その感染が、一次感染、二次感染、日和見感染などのいずれであるにせよ、本明細書中に記載されるいずれかの微生物によって引き起こされるかまたは起因する感染が挙げられる。他の例示的な抗原は、本明細書中で記載されるトキシンまたはその改変体である。
【００５４】
本明細書中で記載される場合、上記抗原は、組み換え的に、合成的に調製されてもよく、生物学的供給源から単離されてもよく、組み換え的または化学的に改変されてもよく、そして任意のそれらの組み合わせでもよい。微生物抗原またはそのフラグメントは、種々の生物学的供給源（例えば、感染被験体組織または培養細胞株）から調製され得る。一次的な単離は、例えば、末梢血液細胞由来または呼吸分泌物由来であり得る。好ましくは、上記単離された微生物は、初代細胞培養物または当該分野で公知の樹立細胞株において増幅される。特定の実施形態において、上記抗原またはそのフラグメントは、完全な微生物粒子から単離される。本明細書中で使用される場合、用語「単離された」または「由来する」は、その物質が、その元々の環境または天然の環境から取り除かれることを意味する。例えば、生きている動物もしくは細胞、またはウイルスに存在する、天然に生じる核酸分子またはポリペプチドは、単離されていないが、同じ核酸分子またはポリペプチドは、その天然系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離される場合には、単離されている。例えば、核酸分子は、ベクターに含まれ得、またはこのような核酸は、組成物の一部であり得、そしてさらに、このようなベクターまたは組成物は、元々の核酸分子の天然の環境の一部ではないという点で、単離されている。別の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、抗原またはその改変体およびフラグメント）は、部分的に精製されるかまたは均一になるまで精製されるかのいずれかであり得る。
【００５５】
本発明は、合成抗原（融合タンパク質を含む）を生成するための方法をさらに提供する。上記免疫原性ポリペプチド成分は、標準的な化学的方法（自動手順による合成を含む）によって合成され得る。一般的に、免疫原性のポリペプチドまたはペプチドは、カップリング剤としてＨＡＴＵを用いた標準的な固相Ｆｍｏｃ保護方法に基づいて合成される。上記免疫原性ペプチドは、適切なスカベンジャーを含有するトリフルオロ酢酸を用いて固相樹脂から切断され得、このトリフルオロ酢酸はまた、側鎖官能基を脱保護する。粗製免疫原性ペプチドは、分取逆相クロマトグラフィーを用いてさらに精製され得る。他の精製方法（例えば、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動またはイオン交換クロマトグラフィー）が、使用され得る。当該分野で公知の他の合成技術（例えば、ｔＢｏｃ保護方法、種々のカップリング試薬の使用など）が、同様の免疫原性ペプチドを生成するために用いられ得る。さらに、任意の天然に存在するアミノ酸もしくはその誘導体または天然に存在しないアミノ酸もしくはその誘導体（Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸およびその組み合わせを含む）が使用され得る。
【００５６】
本明細書中に記載される場合、本発明の微生物抗原またはそのフラグメントは、組み換え体であり得、ここで、所望される抗原は、核酸発現構築物において発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に結合されたポリヌクレオチドから発現される。例えば、上記免疫原コード核酸発現構築物を含む宿主細胞（例えば、バキュロウイルスおよび哺乳動物細胞株）は、培養されて、組み換えタンパク質免疫原またはそのフラグメントを生成し得る。上記抗原は、さらなるアミノ酸配列にさらに融合または結合され得、この配列は、抗原融合体と、ＰｒｏｊｕｖａｎｔもしくはＰｒｏｔｏｌｌｉｎとの非共有結合的会合を容易にするか、またはそうでなければ促進するための疎水性のアンカーまたはフットであり得る。上記抗原ポリペプチドは、微生物感染に対して防御免疫応答（細胞性または体液性）を誘導し得る少なくとも１つのエピトープを有するような、ポリペプチドの任意の部分を含み得る。本発明の免疫原性ポリペプチドはまた、直線状形態に整列され得るかまたは組み合わせられ得、そして各免疫原は、反復されてもされなくてもよく、ここで、上記反復は、１回または複数回生じ得る。さらに、複数の種々の免疫原性ポリペプチド（例えば、タンパク質改変体またはそのフラグメント）は、選択され、そしてカクテル組成物中に混合されるかまたは合わせられて、防御免疫応答の誘導における使用のための多価ワクチンを提供し得る。
【００５７】
本開示の免疫刺激組成物、免疫調節組成物および免疫原性組成物を調製するための方法は、本明細書中に記載され、そして当該分野において公知である（例えば、米国特許出願公開番号２００１／００５３３６８および２００３／００４４４２５を参照のこと）。上記抗原およびアジュバントは、特定の開始比で処方されて、上記成分間の相互作用（または協同作用）を最適化し、その結果、上記２つの成分のかなりの部分が、互いに非共有結合会合（または、非特異的並置）することをもたらす。例えば、少なくとも１つの抗原と、プロテオソーム（ｐｒｏｊｕｖａｎｔ）またはＰｒｏｔｏｌｌｉｎとの混合物は、界面活性剤の存在下で調製され、そして透析／限外濾過によって、上記混合物から上記界面活性剤を減少または除去することにより、上記抗原と、上記アジュバントとの会合（または協同作用）が導かれる。特定の実施形態において、上記混合物中の上記Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（またはプロテオソーム）：抗原の比は、約１：１〜約５：１の範囲である。上記比は、８：１以上に高くあり得る。特定の他の実施形態において、上記混合物中の上記Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（またはプロテオソーム）：抗原の比は、約１：１〜約１：５００の範囲であるか、または約１：２〜約１：２００の範囲にあるか、または約１：２〜約１：１００の範囲にあるか、または約１：５〜約１：５０の範囲にあるか、または約１：２〜約１：２０の範囲にあるか、または少なくとも１：５、１：１０、１：２０もしくは１：１００の範囲にある。上記２つの成分の界面活性剤ベースの溶液は、同じ界面活性剤を含んでも異なる界面活性剤を含んでもよく、そして１つより多くの界面活性剤が、限外濾過／透析に供される混合物中に存在し得る。適切な界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢおよびＭｅｇａ−１０が挙げられる。他の界面活性剤（例えば、オクトグリコシド）がまた、使用され得る。上記界面活性剤は、上記組成物を調製するために使用される成分を溶解するために役に立つ。界面活性剤の混合物の使用は、特に有利である。もちろん、この混合物は、最終処方物の前に、除去されるかまたはその濃度は、透析／限外濾過によって減少される。
【００５８】
本発明の１つ以上の抗原およびプロテオソームベースのアジュバントを含有する免疫原性組成物は、その組成物が被験体（例えば、ヒトまたは動物）に投与され得る任意の形態にあり得る。例えば、本発明の免疫原性組成物は、液体の溶液として調製され、そして投与されても、固体形態（例えば、凍結乾燥されて）として調製されてもよく、この固体形態は、投与に合わせて、固体形態で投与されても溶液中に再懸濁されてもよい。上記免疫原性ポリペプチド組成物は、そこに含有される活性成分が、被験体もしくは患者への上記組成物の投与の際に生物利用可能であり得るか、または遅延放出を介して生物利用可能であり得るように、処方される。被験体または患者に投与される組成物は、一用量単位以上の形態をとり、ここで、例えば、ドロップは、単一用量単位であり得、そして本発明の１つ以上の化合物のエアロゾル形態の容器は、複数の用量単位を保有し得る。特定の好ましい実施形態において、本発明の免疫原または免疫原（例えば、抗原）のカクテルを含有する任意の上述の薬学的組成物は、容器内にあり、好ましくは、滅菌容器内にある。特定の投与プロトコールの設計（投薬レベルおよび投与のタイミングを含む）は、当業者に周知の慣用的な方法を用いるこのような手順を最適化することによって、決定される。
【００５９】
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物は、鼻に投与される。他の代表的な投与経路としては、経腸、非経口、経皮／経粘膜、鼻および吸入が挙げられる。用語「経腸」とは、本明細書中で使用される場合、上記免疫原性組成物が、胃腸管または経口粘膜（経口、直腸および舌下を含む）を介して吸収される、投与経路である。用語「非経口」は、本明細書中で使用される場合、胃腸管を迂回する投与経路（動脈内、皮膚内、筋内、鼻内、眼内、腹腔内、静脈内、皮下、粘膜下および膣内の注射技術または注入技術を含む）を説明する。用語「経皮／経粘膜」は、本明細書中で使用される場合、上記免疫原性組成物が、皮膚を介するかまたは皮膚を通って投与される（局所的を含む）、投与経路である。用語「鼻」および「吸入」は、上記免疫原性組成物が、肺樹（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｔｒｅｅ）内に導入される（肺内または経肺を含む）、投与技術を含む。好ましくは、本発明の組成物は、鼻に投与される。
【００６０】
例えば、本明細書中に記載されるように、鼻に投与されるＰｒｏｔｏｌｌｉｎと組み合わされたＦ１−Ｖは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）を用いて処方されたＦ１−Ｖの筋内注射によって誘導される抗Ｆ１−Ｖ ＩｇＧ力価に匹敵する、血清抗Ｆ１−Ｖ ＩｇＧ力価を誘導した。しかし、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）／Ｆ１−Ｖとは異なり、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ／Ｆ１−Ｖはまた、肺洗浄流体において検出されたように、特異的なＩｇＡ応答およびＩｇＧ応答を誘導した。免疫したマウスを、その後、エアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｔｉｓを用いて攻撃した。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ／Ｆ１−Ｖ免疫マウスは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／Ｆ１−Ｖ群において６０％であるのに対して、高用量（２５５ＬＤ５０）の攻撃に対して８０％が防御され、他方、両方のワクチンは、上記生物の低用量（１７０ＬＤ５０）の攻撃に対して９０％〜１００％防御的であった。
【００６１】
本明細書中において参照され、そして／または、出願データシートに列挙される全ての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願および非特許刊行物は、本明細書中でそれらの全体が参考として援用される。記載されている本発明、以下の実施例は、本発明を例示することが意図され、本発明を限定しない。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
（血清免疫応答および粘膜免疫応答を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイ）
ＥＬＩＳＡを、本用途に従う試験免疫刺激因子または試験免疫原性処方物およびコントロールで免疫した動物から得られた生物の全体ならびに抗原特異的なＩｇＧ力価、ＩｇＡ力価およびＩｇＭ力価を決定するために使用した。サンプルは、マウスおよびウサギにおける血清、鼻洗浄物および肺粘膜洗浄物を含んだ。標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを使用して、直線性、特異性、感受性および再現性を決定した。簡単に言えば、試験サンプル（血清および洗浄流体）の連続希釈液を、精製した抗原またはその誘導体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。固定化抗原に結合する抗原特異的抗体を、動物および抗体サブタイプに特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体で検出した。ＨＲＰ抗体の相互作用および洗浄の後、ＨＲＰ基質（ＴＭＢ）とともにインキュベーションした後に結合したＨＲＰ抗体の量を検出し、そして４９０ｎｍの吸光度を測定した。上記試験サンプルの抗体濃度を、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに対する精製した標準抗体を用いて（これらは並行して実施された）標準曲線から計算した。別個のアッセイにおいて測定したので、必要に応じて、粘膜洗浄流体サンプルにおける特異的抗体レベルを、上記サンプル中のＩｇＡ総量またはＩｇＧ総量と比較して検出した特異的抗体を表すことによって標準化および正規化した。この技術は、ヒト臨床試験において収集した鼻洗浄流体に対して実施したアッセイにおいて、優れた再現性および一貫性をもたらした。ＥＬＩＳＡデータを、長期変形（ｌｏｎｇ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）データを用いた統計的分析により、９５％信頼レベルでの幾何学的平均として表す。
【００６３】
（実施例２）
（粘膜抗体産生の分析）
マウスおよびウサギにおける肺洗浄物および鼻洗浄物を収集して、本用途に従う免疫刺激因子または免疫原性処方物に対する免疫応答を分析した。マウスにおいて、鼻洗浄物および肺洗浄物を、気管にカニューレ挿入することによって実施し、そして０．１％ウシ血清アルブミンおよびプロテアーゼインヒビター（０．２ｍＭ ＡＥＢＳＲ、１μｇ／ｍＬ アプロチニン、３．２５μＭ ベスタチン、１０μＭ ロイペプチンを含有するＧｅｎｅｒａｌ Ｕｓｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充した１ｍｌ ＰＢＳを、気管を通して上方へポンプした。外鼻孔から出てきた流体を収集し、ボルテックスし、そして次いで、遠心して組織および細胞の残骸を除去した。その上清を−７０℃でアッセイまで保存した。カニューレを気管に再び挿入し、そしてそのカニューレを肺へと向けて維持することにより、肺流体を収集した。肺を、ＰＢＳを補充した１．０ｍＬ プロテアーゼで２回洗浄し、その流体を収集し、そしてボルテックスし、そして遠心によってその細胞の残骸を除去した。肺洗浄物および鼻洗浄物を、−７０℃でアッセイするまで保存した。ウサギ粘膜流体を同様に収集し、必要に応じてその容量を調節した。特定の実施形態において、粘膜サンプルを収集した後、頚部および縦隔のリンパ節を外科手術的に除去し、そして単球細胞を単離し、そして本明細書中で記載されるようなＥＬＩＳＰＯＴ抗体アッセイ、サイトカインアッセイおよびＣＭＩアッセイのために培養した。
【００６４】
（実施例３）
（ペスト抗原Ｆ１−Ｖを用いて処方したＰｒｏｔｏｌｌｉｎによる免疫）
例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓを用いた致死的な攻撃に対して防御可能な免疫応答を誘発するペスト抗原（Ｆ１−Ｖ）を用いて処方した、プロテオソーム：ＬＰＳ（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ）組成物の性能を試験する。上記Ｆ１−Ｖ免疫応答を、０日目および２１日目に、２０匹の６週齢〜８週齢の雌Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ）群を免疫することによって評価した。免疫のために、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎの新しく解凍したアリコートおよびＦ１−Ｖの溶液を、免疫前に１６時間より短い時間混合した。鼻内（ｉ．ｎ．）投与のために、マウスを、イソフルラン吸入によってまず軽く麻酔し、次いで２５μｌのワクチンサンプルまたは適切なコントロールサンプル（ＰｒｏｔｏｌｌｉｎまたはＦ１−Ｖのみ）を、各マウスの外鼻孔（外鼻孔あたり１２．５μｌ）に適用した。並行した実験において、マウスを、後足に注射した、５００ｍｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に吸着された２５μｌのＦ１−Ｖで、筋内（ｉ．ｍ．）に免疫した。コントロールｉ．ｍ．注射をまた、実施した。その後、３５日目および５５日目に、各群からの１０匹のマウスをＣＯ２による窒息および瀉血によって安楽死させた。血清を得て、アッセイまで−８０℃で保存した。鼻洗浄物サンプルおよび肺洗浄物サンプルを得て、アッセイまで−８０℃で保存した。脾臓を、インビトロ再刺激および放出サイトカインの評価のために処理した。各群からの残りの１０匹のマウスを、エアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ ９２株）の１７０〜２５０ＬＤ５０の吸入によって、３５日目または５５日目に攻撃して、防御を評価した。マウスを、罹患率および死亡率の決定のために、攻撃後２８日間モニタリングした。
【００６５】
Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを用いて処方されたＦ１−Ｖ抗原の２用量で鼻内に免疫したマウスから得られた、血清サンプルおよび肺洗浄流体サンプルに存在する抗体を、Ｆ１−Ｖのみで鼻内に免疫したマウスまたはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）吸着Ｆ１−Ｖで筋内に免疫したマウスからの血清サンプルおよび肺洗浄流体サンプルに存在する抗体と比較した。結果を、図１および２に示す。驚くべきことに、試験した全ての濃度において、ＰｒｏｔｏｌｌｉｎとＦ１−Ｖとの全ての組み合わせは、免疫原性が高く、そして、１ｍｇ／ｍｌと９ｍｇ／ｍｌとの間のＦ１−Ｖ特異的血清ＩｇＧ力価を誘導した（図１および２）。Ｆ１−Ｖ濃度とＰｒｏｔｏｌｌｉｎ濃度との任意の組み合わせによって誘導される特異的ＩｇＧ力価、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着された２０μｇのＦ１−Ｖの筋内注射によって誘導される特異的ＩｇＧ力価に、有意な差はなかった（Ｐ＞０．０５）。Ｆ１−Ｖ処方ワクチンによって誘導される全ての特異的血清ＩｇＧ力価は、非アジュバント添加Ｆ１−Ｖコントロールの鼻内投与によって誘導されるものよりも、有意に高く（Ｐ≦０．００１）、そしてコントロールマウスからの血清においては、Ｆ１−Ｖ特異的抗体は検出されなかった。これらの実験の予測されなかった結果は、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ：抗原の比は、劇的（１：２〜１：２００）に減少され得、抗原が免疫応答を誘導するという能力に、有意な影響を与えないということである。この開示の前には、アジュバントの量を減少することは、免疫応答の減少をもたらすと予測されていた。
【００６６】
肺洗浄物サンプルを、ＥＬＩＳＡによってアッセイして、存在する特異的な抗Ｆ１−Ｖ抗体、抗Ｆ１抗体および抗Ｖ抗体のレベルを決定した（図３）。結果は、粘膜（例えば、鼻内）経路による免疫は、Ｆ１−Ｖ特異的肺ＩｇＡの高力価によって応答される、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ添加Ｆ１−Ｖ抗原で鼻内に免疫したマウスの全ての群のように、粘膜抗体を誘導する有効な手段であることを確かめる。これらの実験において、上記ＩｇＡ応答は、最も高い用量のＰｒｏｔｏｌｌｉｎで免疫したマウスからの肺洗浄物サンプルにおいて、最も高かった；ＡＮＯＶＡ分析は、やはり予測されなかったように、Ｆ１−ＶとＰｒｏｔｏｌｌｉｎとの任意の組み合わせによって誘導される上記ＩｇＡ力価に、有意な差はないことを示した。非アジュバント添加Ｆ１−Ｖは、鼻内に投与され、わずかに検出可能なＩｇＡレベルを誘導した；分泌ＩｇＡは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）吸着Ｆ１−Ｖで筋内注射したマウスからのサンプルにおいては検出されなかった。上記Ｆ１−Ｖ抗原の上記Ｆ１部分およびＶ部分に対する肺洗浄物サンプルのアッセイは、上記免疫応答は、主に、上記Ｆ１−Ｖ融合タンパク質の上記Ｖ成分に対して検出されることを示した（表１）。しかし、肺洗浄物サンプルはまた、その力価が、上記血清力価の小さい百分率を示すにすぎないにしても、Ｆ１−Ｖ特異的ＩｇＧのかなりの力価を含んでいた（０．１１％〜０．５６％；中央値０．１７５％）。
【００６７】
上記Ｆ１成分およびＶ成分の両方を認識する血清抗体が誘導されたか否かを決定するために、２０μｇ用量のＦ１−Ｖ抗原で免疫した全てのマウスからの血清を、Ｆ１およびＶに対して別個に分析した。全ての場合、そして両方のサンプリング時間において、上記Ｆ１−Ｖ抗原の上記Ｆ１部分およびＶ部分の両方に対して特異的な血清ＩｇＧ抗体および肺洗浄流体ＩｇＡ抗体を、検出した（表１）。これらの実験において評価した上記Ｆ１−Ｖ抗原の処方または送達経路に関わらず、上記血清の抗Ｆ１抗体と抗Ｖ抗体との比に有意な差はなかった。
【００６８】
【表１】
（実施例４）
（エアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｔｉｓで免疫したマウスの攻撃）
これらの実験を、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを用いて処方されたＦ１−Ｖによる鼻内免疫によって誘導される、免疫防御レベルを評価するために設計した。マウスを、生存エアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｔｉｓに対する全身曝露によって攻撃し、そして攻撃からの防御レベルを、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ上に吸着されたＦ１−Ｖの注射によって誘導される防御レベル、およびＦ１−ＶのみまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎのみを鼻内に投与したコントロールマウスと比較した。これらの実験において、２０μｇ用量のＦ１−Ｖで免疫したマウスに対する結果のみを、図４および５に示す。３５日目、そして１７０ ＬＤ５０ Ｙ．ｐｅｓｔｉｓの攻撃用量において、１μｇまたは２．５μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎを添加した５μｇ、２０μｇまたは５０μｇのＦ１−Ｖで鼻内に免疫したマウスは、死に対して１００％防御し、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ上に吸着されたＦ１−Ｖによって注射したマウスも同様であった。５μｇ、２０μｇまたは５０μｇのＦ１−Ｖおよび０．２５μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎで鼻内に免疫したマウスは、それぞれ、９０％、１００％、そして９０％防御され、他方、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含まない同じ用量のＦ１−Ｖで鼻内に免疫したマウスは、それぞれ、３０％、４０％、そして４０％防御されたにすぎなかった。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを受けたコントロールマウスは、攻撃後４日目より長く生存しなかった。処方されたＦ１−Ｖで免疫した全てのマウス群に対する生存率は、コントロールマウスまたは処方されないＦ１−Ｖで免疫したマウスにおける生存率と比較して、有意に高かった（フィッシャーの正確確率検定により、Ｐ≦０．０５またはそれより良い）。攻撃後５５日目の生存率は、３５日目のデータと非常に類似していた。Ｆ１−Ｖを用いて処方された２．５μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎで免疫した全てのマウスは、攻撃に対して完全に防御され、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着されたＦ１−Ｖの注射によって免疫したマウスも同様であった。５０μｇまたは２０μｇのＦ１−Ｖを用いて処方された１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎで免疫したマウスはまた、１００％防御され、ＰｒｏｔｏｌｌｉｎとＦ１−Ｖとの全ての他の組み合わせは、９０％の防御を誘導した。処方されたＦ１−Ｖで免疫した全てのマウスにおいて、上記観察された防御は、アジュバント未添加Ｆ１−Ｖで免疫したマウス（１０％〜３０％の防御）、または生存動物が存在しなかったマウスのコントロール群と比較して、有意に高かった（Ｐ≦０．０１またはそれより良い）。１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎを含むかもしくは含まない５０μｇのＦ１−Ｖで鼻内に免疫したマウス、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着された２０μｇのＦ１−Ｖを注射したマウスを、２５５ ＬＤ５０のエアロゾル化生存Ｙ．ｐｅｓｔｉｓに対する全身曝露によって５５日目に攻撃した。それぞれ、８０％、２０％および６０％のマウスが、高用量の致死的攻撃に対して生存し、他方、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを与えられたコントロールマウスは、全て死亡した。処方されたＦ１−Ｖによる免疫は、コントロールマウスと比較して、死に対して有意な防御を誘導した（鼻へのＰｒｏｔｏｌｌｉｎ添加Ｆ１−Ｖについて、Ｐ≦０．００１；注射Ｆ１−Ｖについて、Ｐ≦０．０１）。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ添加Ｆ１−Ｖでの鼻免疫はまた、Ｆ１−Ｖのみでの免疫よりも、死に対するマウスの防御において有意に良好であったが（Ｐ≦０．０５）、これは、上記誘導された防御が、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含まない鼻内へのＦ１−Ｖによって誘導されるよりも有意に良好ではない場合の注射Ｆ１−Ｖに対する事実ではなかった（Ｐ＝０．９５）。
【００６９】
（実施例５）
（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ：ペスト抗原で免疫後のサイトカインプロファイルの決定）
鼻内投与Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎまたは注射Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）アジュバント添加Ｆ１−Ｖワクチンによって誘導される適応免疫応答の表現型（１型または２型）を比較するために、免疫したマウスの選択された群からの脾臓細胞を、Ｆ１−Ｖを用いて、インビトロで再刺激し、そして培養上清中に放出されたＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−５サイトカインの量を、測定した（図６）。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（１μｇ）と混合されたＦ１−Ｖ（５０μｇ）で鼻内に免疫したマウスからの脾臓細胞は、高レベルのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌することによって、インビトロ再刺激に応答し、そして非常に低い量のＩＬ−５がまた、検出された。対照的に、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ上に吸着されたＦ１−Ｖ（２０μｇ）の注射によって免疫したマウスからの脾臓細胞は、比較的少量のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分泌することによって応答したが、かなりの量のＩＬ−５が検出された。従って、Ｆ１−Ｖ抗原を用いて処方された（アジュバント添加された）Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎの鼻内投与によって誘導されるサイトカインプロファイルは、１型免疫応答を誘導することが確かであり、一方、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ(登録商標）を用いて処方されたＦ１−Ｖ抗原の筋内注射によって誘導されたサイトカインプロファイルは、２型応答であることが、かなり確かである。
【００７０】
（実施例６）
(Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ：炭疽免疫原性処方物は、免疫応答の中和を引き起こす)
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの組み換え防御抗原（ｒＰＡ）を用いたＰｒｏｔｏｌｌｉｎ処方物を、細胞培養物アッセイ系を用いて、ＰＡ媒介性マクロファージ殺傷の統計学的に有意な減少を誘導可能な免疫応答を誘導する能力に対して評価した。１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎと混合した５μｇまたは２５μｇのｒＰＡ（Ｌｉｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で鼻内に免疫したマウス（０日目、１４日目）は、５μｇまたは２５μｇのｒＰＡのみで鼻内に免疫したマウスの特異的抗ｒＰＡ血清ＩｇＧレベルおよび特異的抗ｒＰＡ肺ＩｇＡよりも、有意に高い特異的抗ｒＰＡ血清ＩｇＧレベルおよび特異的抗ｒＰＡ肺ＩｇＡレベルを示し（Ｐ＜０．０５）（図７）、このことは、低レベルのＰｒｏｔｏｌｌｉｎのアジュバント化（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）はまた、ｒＰＡ抗原を用いても有効であることを示す。上記ＰｒｏｔｏｌｌｉｎのみおよびｒＰＡのみのコントロール群における粘膜ＩｇＡレベルは、このアッセイの検出レベルよりも低かった。
【００７１】
特異的抗ｒＰＡ抗体がＰＡ媒介性マクロファージ貪食を中和する能力を評価した。炭疽ＰＡ中和アッセイをまた、これらの動物からの血清サンプルおよび肺洗浄流体サンプルを用いて、記載されるように実施した。このアッセイのために、２×１０５ ＲＡＷ２６４．７細胞を、滅菌９６ウェルプレートにプレートし、そして３７℃で２４時間、５％ＣＯ２中でインキュベートした。（ＰＡ免疫マウスからの）血清サンプルまたは肺洗浄流体サンプルの連続希釈液を、ＰＡ溶液とともに１時間、３７℃でインキュベートし、次いで、細胞を含むウェルに添加した。その後、ＬＦの溶液を上記ウェルに添加して、上記プレートを、３７℃で、５％ＣＯ２中で４時間インキュベートした。次いで、（細胞生存度を測定するための）ＭＴＴの溶液を、各ウェルに添加し、そして上記プレートを、さらに４時間、３７℃で５％ＣＯ２中でインキュベートした。上記反応を、５０％ ＤＭＦ（ｐＨ ４．３）中の２０％ ＳＤＳ添加することによって停止し、そして上記プレートを、６９０ｎｍを参照として、５７０ｎｍで読んだ。このアッセイは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを有するｒＰＡのプロテオソームアジュバント化鼻内ワクチンが、筋内ミョウバンアジュバント化ワクチンがそうであるのに匹敵する、ｒＰＡ活性を中和する抗体レベルを誘導することを示した（図８）。しかし、サンプル間の顕著な差は、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ処方物ｒＰＡで免疫したマウスからの肺洗浄物サンプル中に存在する、中和ＩｇＡ抗体の存在である。
【００７２】
（実施例７）
（さらなる炭疽ワクチン処方物の調製）
鼻Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ炭疽ワクチンを、免疫の前に、上記炭疽ＰＡ抗原と、ＬＰＳを添加した可溶性の事前に形成したプロテオソーム（すなわち、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ）とを混合することによって作製した。ｒＰＡおよびｒＰＡアンカー抗原の両方を、いくつかのＰｒｏｔｏｌｌｉｎの様式で評価して、最適なＰｒｏｔｏｌｌｉｎ：免疫抗原の比を有する処方物を決定した。例えば、コントロール処方物としては、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみまたは（必要に応じて）１つ以上のコントロール抗原（例えば、組み換え連鎖球菌性タンパク質）と混合したＰｒｏｔｏｌｌｉｎが挙げられ、このコントロール抗原は、疎水性アンカー配列を含むかまたは欠いている。従って、種々の供給源からのＬＰＳを含有するＰｒｏｔｏｌｌｉｎの処方物、種々のＰｒｏｔｏｌｌｉｎ：ＬＰＳの比および種々のＰｒｏｔｏｌｌｉｎ：ｒＰＡ抗原の比を評価する。ｒＰＡアンカーは、非常に低いレベルのＬＰＳ（２重量％未満）を有するプロテオソームを用いて処方する。特定の実施形態において、上記プロテオソームアジュバント調製物は、添加された外因性ＬＰＳを有しない。これまで、プロテオソームは、それ自体が、前臨床毒性研究において、ならびに第１相および第２相の安全なプロテオソーム鼻インフルエンザワクチンの免疫原性実験的攻撃試験で、５００人近くにおいて使用されている。
【００７３】
ＬＰＳの好ましい様式のプロセス開発（ＬＰＳ微生物性供給源に関して）およびＰｒｏｔｏｌｌｉｎの好ましい処方（ＬＰＳ供給源およびプロテオソーム：ＬＰＳの比に関して）を、ＬＰＳ供給源に関するＰｒｏｔｏｌｌｉｎの成分およびプロテオソーム：ＬＰＳの比を同定するために設計した免疫原性研究の結果に基づいて、実施する。ＬＰＳのための好ましい微生物供給源の発酵の後、ＬＰＳ精製および分析を行う。次いで、選択されたＬＰＳを、選択された比でプロテオソームＯＭＰ粒子と混合して、好ましいＰｒｏｔｏｌｌｉｎを形成する。上記ＬＰＳと上記ＯＭＰとの会合の程度は、キャピラリー電気泳動を用いた、特別に開発された「遊離−対−結合」アッセイ、ＬＰＳ「スパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）」研究および必要に応じて他の分析において、立証される。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎの特徴付けとしては、代表的に、ＫＤＯ、ＮＭＲおよび銀染色ＰＡＧＥを用いたＬＰＳ含量の分析、プロテオソームＯＭＰ含量のためには、必要に応じて、ＬＣ−ＭＳ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（Ｃ．Ｂｌｕｅ ＆ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ ｗ／ＭＡｂ ＆ ＰＡｂｓ）、Ｎ−末端配列決定、アミノ酸分析、ＬｏｗｒｙまたはＢＣＡによる総タンパク質およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いた分析、そして残査ＬＰＳ、核酸および界面活性剤のためには、それぞれ、ＫＤＯアッセイ、核酸アッセイおよびＨＰＬＣアッセイを用いた分析が挙げられる。
【００７４】
（実施例８）
（炭疽に対する免疫を評価するための細胞媒介性免疫アッセイ）
プロテオソームベースのＰＡワクチンでの免疫後に誘導される細胞性免疫応答を、種々の方法を用いて研究する。例えば、Ｔ細胞由来のサイトカインを、マウスの脾臓および／またはリンパ節から単離された、ＰＡ再刺激した精製Ｔ細胞または濃縮Ｔ細胞において評価する。１型（例えば、ＩＦＮ−γ）サイトカインおよび２型（例えば、ＩＬ−４およびＩＬ−５）サイトカインを、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴを含む１つ以上の方法によって決定し、そして細胞内サイトカインを、フローサイトメトリーによって決定した。ＰＢＭＣ由来のＰＡ再刺激したＰＢＭＣ Ｔ細胞の増殖を使用して、ウサギサイトカインに特異的な試薬の欠如に起因するウサギにおけるＣＭＩ応答を評価する。Ｔリンパ球増殖アッセイを使用して、種々の動物モデルにおいて、クローン性増殖に対する免疫の効果および記憶リンパ球の存在を測定する。動物を犠牲にした後、縦隔リンパ節および頚リンパ節を、標準的な技術を用いて外科的に取り出し、上記リンパ球を単離し、培養して、そしてその単離細胞にＰＡを添加する。増殖を、Ｈ３−チミジンの取り込みによって測定する。偽ワクチンで免疫した動物由来の細胞を、ネガティブコントロールとして使用する。アッセイ結果を、粘膜免疫に関与し、そして炭疽攻撃研究において決定されるように免疫の効力に関連する、リンパ節におけるＴ細胞分化に対する免疫の効果を決定するために使用する。
【００７５】
上述から、本発明の具体的な実施形態が、本明細書中で例示の目的のために記載されるが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（２．５μｇ、１μｇまたは０．２５μｇ）を含むかもしくは含まないかで、５０μｇ、２０μｇまたは５μｇのＦ１−Ｖを用いて鼻内に２回免疫したマウス、またはミョウバン（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標））に吸着されたＦ１−Ｖを２０μｇ用いて粘膜内に注射したマウスからの血清ＩｇＧ力価を示す。上記マウスの半分を、一次免疫後３５日目に、そして他の半分を５５日目に安楽死させた。力価を、特異的抗体濃度（血清ＩｇＧに対してμｇ／ｍｌ；肺のＩｇＡおよびＩｇＧに対してｎｇ／ｍｌ）の幾何平均値として表し、そして９５％信頼限界を示す。
【図２】図２は、図１に記載されたように免疫したマウスからの肺ＩｇＧ力価を示す。
【図３】図３は、図１に記載されたように免疫したマウスからの肺ＩｇＡ力価を示す。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、エアロゾル化Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｉｔｉｓの致死用量を用いた攻撃に対するマウスの生存を示す。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（０．２５μｇ、１μｇまたは２．５μｇ）もしくは含まないかで鼻内に、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着されて筋内に、２０μｇのＦ１−Ｖで２回免疫したマウスを、一次免疫後（Ａ）３５日目または（Ｂ）５５日目に、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓの１７０ＬＤ５０に対する全身曝露によって攻撃した。全ての研究において、（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを受けた）全てのコントロールマウスは、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓに攻撃された場合に死亡し、使用した接種材料が致死的であったことを確認した。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、エアロゾル化Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｉｔｉｓの致死用量を用いた攻撃に対するマウスの生存を示す。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（０．２５μｇ、１μｇまたは２．５μｇ）もしくは含まないかで鼻内に、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着されて筋内に、２０μｇのＦ１−Ｖで２回免疫したマウスを、一次免疫後（Ａ）３５日目または（Ｂ）５５日目に、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓの１７０ＬＤ５０に対する全身曝露によって攻撃した。全ての研究において、（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを受けた）全てのコントロールマウスは、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓに攻撃された場合に死亡し、使用した接種材料が致死的であったことを確認した。
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂは、エアロゾル化Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｉｔｉｓの致死用量を用いた攻撃に対するマウスの生存を示す。１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎを含むかもしくは含まないかで鼻内に、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着されて筋内に、５０μｇのＦ１−Ｖで２回免疫したマウスを、（Ａ）一次免疫後５５日目に、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓの２５５ＬＤ５０に対する全身曝露によって攻撃した；（Ｂ）は、１７０致死用量のエアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓで一次免疫後、３５日目および５５日目（異なる群のマウス）に攻撃したマウスの生存を示す。マウスを、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（０．２５μｇ、１μｇまたは２．５μｇ）もしくは含まないかで、鼻内に、５μｇのＦ１−Ｖで２回免疫した。全てのコントロールマウス（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを受けたマウス）は、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓで攻撃された場合に死亡し、使用した接種材料が致死的であったことを確認した。
【図５Ｂ】図５Ａおよび図５Ｂは、エアロゾル化Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｉｔｉｓの致死用量を用いた攻撃に対するマウスの生存を示す。１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎを含むかもしくは含まないかで鼻内に、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着されて筋内に、５０μｇのＦ１−Ｖで２回免疫したマウスを、（Ａ）一次免疫後５５日目に、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓの２５５ＬＤ５０に対する全身曝露によって攻撃した；（Ｂ）は、１７０致死用量のエアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓで一次免疫後、３５日目および５５日目（異なる群のマウス）に攻撃したマウスの生存を示す。マウスを、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（０．２５μｇ、１μｇまたは２．５μｇ）もしくは含まないかで、鼻内に、５μｇのＦ１−Ｖで２回免疫した。全てのコントロールマウス（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを受けたマウス）は、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓで攻撃された場合に死亡し、使用した接種材料が致死的であったことを確認した。
【図６】図６は、抗原ＦＩ−Ｖを用いてインビボで刺激した脾臓細胞から放出された、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−５の量を示す。脾臓細胞を、免疫後３５日目に、１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎを含むかもしくは含まないかで、５０μｇのＦ１−Ｖで鼻内に免疫したマウス、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着した２０μｇのＦ１−Ｖを筋内に注射したマウスから収集した。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（１μｇ）または含まないで混合した、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の５μｇまたは２５μｇの組み換え防御抗原（ｒＰＡ）で鼻内に免疫した（０日目および１４日目）マウスにおける、血清ＩｇＧレベルおよび肺ＩｇＡレベルを示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（１μｇ）または含まないで混合した、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の５μｇまたは２５μｇの組み換え防御抗原（ｒＰＡ）で鼻内に免疫した（０日目および１４日目）マウスにおける、血清ＩｇＧレベルおよび肺ＩｇＡレベルを示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎと混合したｒＰＡで免疫したマウス由来の血清洗浄流体および肺洗浄流体を用いた、炭疽中和アッセイの結果を示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎと混合したｒＰＡで免疫したマウス由来の血清洗浄流体および肺洗浄流体を用いた、炭疽中和アッセイの結果を示す。
【図９】図９は、リポソーム（鼻内（ｉ．ｎ．））、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（鼻内）、またはＡｌｈｙｄｒｐｇｅｌ（登録商標）（腹腔内（ｉ．ｐ．））と混合したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ由来の１５μｇの組み換え糸状赤血球凝集素（ｒＦＨＡ）で免疫した（１日目、２１日目および３１日目）マウスにおける、血清ＩｇＧを示す。コントロールとして、マウスを、ＱｕａｄｒａｃｅｌＴＭで腹腔内に（ポジティブ）、そして賦形剤ＰＢＳ単独で鼻内に（ネガティブ）免疫した。ＱｕａｄｒａｃｅｌＴＭ（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｌｔｄ．）は、抗原のなかでもとりわけ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ ＦＨＡを含有するワクチンである。力価を、最後の免疫後７日目（３８日目）に収集した血清における抗ｒＦＨＡレベルを測定することによって、決定した（１日目のマウスからの血清中に見出された（存在すれば）バックグラウンド力価レベル未満）。
【図１０】図１０は、図９について記載されたのと同じ組成物において処方されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ由来の１５μｇの組み換え糸状赤血球凝集素（ｒＦＨＡ）で免疫した（１日目、２１日目および３１日目）マウスにおける、唾液ＩｇＡを示す。
【図１１】図１１は、図９について記載されたように免疫したマウス由来のプールした血清における、抗ｒＦＨＡ血清ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧｌ）を示す。
【図１２】図１２は、最後の免疫後１１日目（４２日目）にエアロゾル化Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｉｓで攻撃した場合の、図９について記載されたように免疫したマウスの肺において見られる、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓレベルを示す。肺のカウントを、エアロゾル攻撃後１日目、３日目、７日目および１４日目に測定した。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般的に、感染性疾患または毒性因子に対して防御するための鼻送達ワクチンに関し、そして特に、微生物病原体または毒性因子（例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、痘瘡ウイルス、リシントキシンおよびボツリヌストキシン）に関連する種々の疾患を処置または予防するためのプロテオソームベース組成物およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
有効な免疫応答は、生来の免疫系（侵襲性病原体に対する防御の第１ライン）と適応（特異）免疫応答との間の連絡に依存する（一般的に、Ｋｌｅｉｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９７を参照のこと）。Ｔリンパ球は、エフェクター分子の放出を制御することによって上記適応免疫応答を協同して働かせるために、重要である。例えば、Ｔヘルパー（Ｔｈ）１細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を生成し、これらは、細胞媒介性免疫の発達のために重要である（Ｍｏｓｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：２３４８、１９８６；ＳｔｒｅｅｔおよびＭｏｓｍａｎｎ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．５：１７１、１９９１）。対照的に、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を生成し、これらは、ＩｇＥ生成の刺激、粘膜肥満細胞症および好酸球増加症のために重要である（Ｍｏｓｍａｎｎら；ＳｒｔｅｅｔおよびＭｏｓｍａｎｎ）。Ｔｈ１（１型応答）表現型またはＴｈ２（２型応答）表現型へのシフトは、病原体に対する防御のために重要でありながら、１つの方向または別の方向のシフトはまた、自己免疫疾患（Ｔｈ１）または炎症性疾患（Ｔｈ２）の誘導と関連し得る。
【０００３】
この点において、ワクチンは、適応免疫応答を誘導するために開発され、そして使用されている。ワクチンは、代表的に、弱毒化微生物または微生物抗原（すなわち、微生物成分（例えば、タンパク質または核酸））を含み、特異免疫応答を活性化する。しかし、宿主において抗原が防御免疫応答を誘導する能力は、ときに、上記抗原を免疫刺激因子またはアジュバントとともに処方することによって増強されなければならない。１００年にわたる間、アルミニウムベースの無機塩（総称して、ミョウバンとして公知）は、ヒトの用途のために承認された唯一のアジュバントであった。歴史的に、ミョウバンは、筋内に注射される場合に、吸収されるタンパク質に対する応答を有意に増強することによる、有効なアジュバントであった。しかし、近年、ミョウバンアジュバントは、以下の報告に起因して、精査を受ける状態となっている（１）ミョウバンは、高度に精製された組み換えタンパク質に基づく新しい世代のワクチン抗原に対して、弱いアジュバントである；（２）ミョウバンは、報告によると、いくらかのワクチンレシピエントにおいて、ＩｇＥ抗体を誘導し得、そしてアレルギー反応と関連する；そして（３）ミョウバンは、注射部位における有害反応として証明されている持続的な免疫応答を誘導し得る。これらの有害反応は、ミョウバン吸着ワクチンの、抗原特異免疫応答を２型表現型（すなわち、炎症性免疫）へと偏らせる傾向と関連することが見出されている。さらに、ミョウバンベースのワクチンは、注射経路によるヒトにおける用途のために、唯一、承認されている。
【０００４】
他の公知のアジュバントとしては、フロイントアジュバント（完全または不完全）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ、また、エンドトキシンとも呼ばれる）およびｐｅｒｔｕｓｓｉｓアジュバント（殺したＢｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ生物の生理食塩水懸濁液）が挙げられる。フロイントアジュバントは、油／水エマルジョン中の微生物の混合物からなる。しかし、この物質に対する頻繁な毒性生理学的反応および免疫学的反応に起因して、フロイントアジュバントは、ヒトにおいては使用され得ない。ＬＰＳは、生来の免疫応答を開始することによって免疫系を刺激するが、ＬＰＳは、利用可能なアジュバントであるには毒性が強すぎる。構造的にエンドトキシンと関連する分子（例えば、モノホスホリルリピドＡ（「ＭＰＬ」または無毒化ＬＰＳ））は、臨床試験においてアジュバントとして試験されている。調査されている他の潜在的なアジュバントとしては、サポニン（米国特許第６，０８０，７２５号；同第６，２６２，０２９号；および同第５，９７７，０８１号を参照のこと）；両親媒性アルデヒド（米国特許第６，６４９，１７２号を参照のこと）；プロテオソーム（米国特許第５，７２６，２９２号および同第５，９８５，２８４号；米国特許出願番号２００１／００５３３６８および２００３／００４４４２５を参照のこと）；および環式アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（米国特許第６，５２５，０２８号を参照のこと）が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、当該分野において、抗原とともに同時投与されて、より強力な免疫応答を促進し、微生物感染または毒性因子に対して防御し得る、優れた免疫刺激性化合物を同定および開発する必要性が認識されている。本発明は、このような必要性を満たし、そして他の関連する利点をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の簡単な要旨）
本開示は、抗原のためのアジュバント処方物を提供し、特に、例えば、感染性疾患もしくは毒性因子の作用の処置または予防のような種々の治療設定における使用のための、種々の抗原を有する処方物のためのプロテオソームベースのアジュバントを提供する。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、抗原に対して免疫応答を誘導するための方法を提供し、この方法は、抗原に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有する。別の局面において、本発明は、微生物感染を処置または予防するための方法を提供し、この方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有する。特定の実施形態において、上記免疫原性組成物の抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓまたはＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来の１つ以上を含む。特定の他の実施形態において、上記免疫原性組成物の抗原は、ポックスウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、フィロウイルスまたはピコルナウイルス由来を含む。さらに他の実施形態において、上記免疫原性組成物の抗原は、１以上のトキシンを含む。さらに他の実施形態において、上記抗原は、組み換え抗原である。さらに他の実施形態において、上記免疫原性組成物は、複数の異なる抗原を含む。関連する実施形態において、上記複数の抗原は、ウイルス、微生物、寄生生物、トキシンまたはそれらの組み合わせを含み得る。
【０００８】
特定の実施形態において、上記免疫原性組成物は、粘膜、経腸、非経口、経皮、経粘膜、鼻もしくは吸入、またはそれらの組み合わせから選択される経路によって投与される。関連する実施形態において、上記免疫原性組成物は、防御免疫応答を誘導する。他の実施形態において、上記抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの防御抗原、Ｂｏｒｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来のＦ１抗原もしくはＶ抗原、Ｆ１−Ｖ抗原融合タンパク質抗原またはそれらの組み合わせを含む。さらに他の実施形態において、上記抗原は、痘瘡ウイルスまたはワクシニアウイルス由来の１つ以上の抗原を含む。さらに他の実施形態において、上記抗原は、ボツリヌストキシン、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢまたはそのフラグメントもしくは改変体のうちの１つ以上を含む。
【０００９】
さらに他の実施形態において、いずれの上述の免疫原性組成物も、その免疫原性組成物中に、約１％〜約５００％の範囲のプロテオソームタンパク質の百分率として、リポサッカリド最終重量含量を有する。他の実施形態において、上記プロテオソームおよびリポサッカリドは、同じ微生物から得られても異なる微生物から得られてもよい（例えば、グラム陰性細菌）。いくつかの実施形態において、上記リポサッカリドは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種またはそれらの組み合わせから選択されるグラム陰性細菌由来である。他の実施形態において、上記プロテオソームは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種由来である。特定の実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来であるプロテオソームおよびＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来であるリポサッカリドを有する。他の実施形態において、いずれの上述の免疫原性組成物も、約５：１〜約１：５００の範囲にあるプロテオソーム：抗原の比を有するか、またはその比は、少なくとも１：２、１：５もしくは１：１０である。さらに他の実施形態において、いずれの上述の免疫原性組成物も、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤をさらに含有する。
【００１０】
別の局面において、本開示は、抗原に対して免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法は、抗原に対する免疫応答を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、アジュバントおよび抗原を含有し、ここで、上記アジュバントは、プロテオソームおよびリポサッカリドを含有し、そして上記アジュバント：抗原の比は、約１：５〜約１：５００の範囲にあるか、または少なくとも１：５であり、それにより、上記抗原に対して免疫応答が誘導される。関連する局面において、微生物感染を処置または予防するための方法が提供され、この方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、アジュバントおよび抗原を含有し、ここで、上記アジュバントは、プロテオソームおよびリポサッカリドを含有し、そして上記アジュバント：抗原の比は、約１：５〜約１：５００の範囲にあるか、または少なくとも１：５であり、それにより、微生物感染は処置または予防される。特定の実施形態において、上述の免疫原性組成物のうちのいずれかが提供され、ここで、上記抗原は、微生物抗原、ウイルス抗原またはトキシン抗原のうちの少なくとも１つである。
【００１１】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって明白になる。さらに、種々の参考文献が本明細書中で述べられ、これらの参考文献は、特定の手順または組成物をより詳細に記載し、そして従って、その全体が参考として援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明を記述する前に、本明細書中の以下で使用される特定の用語の定義を記述することは、その理解に対する補助となり得る。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「プロテオソームまたはＰｒｏｊｕｖａｎｔ」とは、グラム陰性細菌（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、（例えば、Ｌｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８、１９８８；Ｌｏｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８００、１９８８；Ｌｙｎｃｈら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４、１９８４；Ｌｏｗｅｌｌ、「Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」第２版、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｉｌ、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、１９３頁、１９９７における；米国特許第５，７２６，２９２号；米国特許第４，７０７，５４３号を参照のこと））由来の外膜タンパク質（ＯＭＰ、またはポーリンとしても公知）の調製物をいい、これらは、免疫原（例えば、微生物抗原またはウイルス抗原）のためのキャリアまたはアジュバントとして有用である。プロテオソームは、疎水性であり、そしてヒトの用途のために安全であり、そして特定のウイルスに対してサイズにおいて適合性である。プロテオソームは、２０ｎｍ〜８００ｎｍの小胞または小胞様のＯＭＰクラスターへと自己集合し、そしてタンパク質抗原（Ａｇ）（特に、疎水性部分を有する抗原）を非共有結合的に組み込むか、調和するか、（例えば、静電気的または疎水的に）会合するか、またはそうでなければ協同して働くという興味深い能力を有する。小胞または小胞様の形態の上記外膜タンパク質成分（複数分子膜性構造または１つ以上のＯＭＰの溶解顆粒様ＯＭＰ組成物を含む）をもたらす任意の調製方法は、プロテオソームの定義内に含まれる。プロテオソームは、例えば、当該分野において記載されるように調製され得る（例えば、米国特許第５，７２６，２９２号または同第５，９８５，２８４号を参照のこと）。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「リポサッカリド」とは、グラム陰性細菌（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）または他のグラム陰性細菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ種、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種、Ｂｏｒｒｅｌｌｉａ種、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ種、Ｅｈｒｌｉｃｈａ種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ種、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓを含む）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ種、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ腫、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｐｒｏｔｅｕｓ種、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ種、他のＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｅｒｒａｔｉａ種、他のＳｈｉｇｅｌｌａ種、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ種、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ種、Ｖｉｂｒｉｏ種またはＹｅｒｓｉｎｉａ種を含む）由来の天然（単離されるかまたは天然構造を有するように合成的に調製される）または改変されたリポサッカリドもしくはリポオリゴサッカリド（まとめて、また、「ＬＰＳ」と呼ばれる）をいう。上記リポサッカリドは、無毒化形態（すなわち、リピドＡコアが除去されている）にあっても、無毒化されていない形態にあってもよい。本開示におい
て、リポサッカリドは、無毒化される必要はなく、好ましくは、無毒化されない。上記リポサッカリドは、例えば、米国特許出願公開番号２００３／００４４４２５に記載されるように調製され得る。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「プロテオソーム：ＬＰＳまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎまたはＩＶＸまたはＩＶＸ−９０８」とは、本明細書中に記載されるように少なくとも１種のリポサッカリドと混合されて、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物（これは、免疫刺激組成物として機能し得る）を提供するＰｒｏｊｕｖａｎｔの調製物をいう。従って、上記ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎの２つの基本成分から構成され得、このＰｒｏｔｏｌｌｉｎの２つの基本成分は、（１）グラム陰性細菌（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）から調製されたプロテオソーム（すなわち、Ｐｒｏｊｕｖａｎｔ）の外膜タンパク質調製物、および（２）１つ以上のリポサッカリドの調製物を含む。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎはまた、必要に応じて、脂質、糖脂質、糖タンパク質、低分子などおよびそれらの組み合わせを含有することが理解されるべきである。上記Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎは、例えば、米国特許出願公開番号２００３／００４４４２５に記載されるように調製され得る。
【００１６】
Ｐｒｏｊｕｖａｎｔは、一般的に、（天然に存在するかまたは改変された）疎水性部分（また、「フット（ｆｏｏｔ）」または「アンカー」と呼ばれる）を有する抗原と組み合わせて使用される。しかし、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（外因的に付加されたＬＰＳを有する）は、疎水性フットドメインを含まず、本質的には大部分が親水性である抗原とともに使用され得るか、または疎水性フットを含む抗原と会合し得るか、またはそれらの組み合わせである。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「トキシンまたは毒性因子」とは、抗原性であり、そして特定の微生物もしくはいくつかのより高等な植物種および動物種の代謝または成長の間に、細胞もしくは組織の欠くことのできない部分（例えば、エンドトキシン）として、細胞外生成物（例えば、エキソトキシン）としてまたはその２つの組み合わせとして形成または作製される、有害物質または有毒物質をいう。本開示の免疫原性組成物における使用のために、トキシンまたは毒性因子は、「トキソイド」の形態にあり、それにより、上記免疫原性組成物は、有毒でも有害でもないことが理解されるべきである。「トキソイド」形態は、抗原性をなお保持しながら、上記因子の有毒特性を破壊する（すなわち、抗トキシンを誘導し得るかまたは免疫応答を中和し得る）ように処理されているトキシンである。トキソイドを生じるトキシンの「処理」としては、化学的処理（例えば、ホルムアルデヒド）、変異、フラグメントおよびそれらの組み合わせが挙げられる。例示的なトキシンとしては、リシントキシン、ボツリヌストキシン、アルファトキシン、イプシロントキシン（ｅｐｉｓｏｌｎｔｏｘｉｎ）、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ、テトロドトキシン、蛇毒トキシン（ｓｎａｅ ｖｅｎｏｍ ｔｏｘｉｎ）、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、サキシトキシン、トリコテセンマイコトキシンなどが挙げられる。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「免疫原性組成物」とは、適応（特異）免疫応答を開始させるか、増強するか、活性化するか、刺激するか、増大するか、増進するか、増幅するかもしくは促進し得る、任意の１つ以上の化合物または因子をいい、これらは、細胞性（Ｔ細胞）もしくは体液性（Ｂ細胞）、またはそれらの組み合わせであり得る。好ましくは、上記適応免疫応答は、防御的であるか、中和するか、またはその両方である。免疫原の代表的な例としては、微生物抗原（例えば、１つ以上の本発明の細菌タンパク質、ウイルスタンパク質または寄生生物タンパク質）または非微生物抗原（例えば、植物（リシン）、渦鞭毛藻類（サキシトキシン）などのような他の供給源から得られる抗原）である。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「特異免疫応答または獲得免疫応答または適応免疫応答」とは、感染性因子または抗原に予め曝露することの結果としてもたらされる、哺乳動物免疫系によって媒介される抵抗性をいう。例えば、特異免疫は、天然に獲得される（開存性または潜伏性）感染または意図的な予防接種からの結果であり得る。さらに、特異免疫は、生来の別のものからの抗体の転移（例えば、母性遺伝）または意図的な予防接種による抗体もしくは免疫細胞の転移（例えば、抗体媒介性免疫療法）から、受動的かつ一時的に獲得され得る。
【００２０】
本説明において、任意の濃度範囲、百分率範囲、比の範囲または他の整数範囲は、別に示されなければ、その列挙される範囲および必要に応じてその分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）内の任意の整数値を含むことが理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、「約」または「本質的に構成する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、±１５％を意味する。代替物の使用（例えば、「または」）は、その代替物の１つ、両方またはその任意の組み合わせを意味することが理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、不定冠詞（例えば、「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」）の使用は、名詞または名詞熟語の単数形および複数形をいうことが理解されるべきである。さらに、本明細書中に記載される種々の成分または組成物もしくは順序、構造および置換の組み合わせから誘導される、個々の組成物、処方物もしくは化合物、または組成物、処方物もしくは化合物の群は、各組成物もしくは化合物、または組成物もしくは化合物の群が独立して述べられるのと同じ程度に、本出願によって開示されることが理解されるべきである。従って、特定の順序、構造または置換の選択は、本発明の範囲内である。
【００２１】
上述のように、そして本明細書中で記載されるように、本発明は、免疫原性組成物を使用および作製して、種々の感染性疾患を処置もしくは予防するか、または毒性因子と関連する病理学的状態を処置もしくは予防するための組成物および方法を提供する。特に、例えば、限定された量のアジュバントおよび過剰量の抗原を用いて処方された、アジュバント（例えば、プロテオソームまたはリポサッカリドを有するプロテオソーム）および抗原（例えば、微生物抗原またはトキシン）を含有する免疫原性組成物が提供される。従って、本発明は、一般的に、プロテオソームベースのアジュバントが、強力な免疫刺激活性を有し、それにより、多量の抗原が、少量のアジュバントを用いて処方されて、新規かつ有用なワクチン処方物を提供するという、驚くべき発見に関する。プロテオソーム：ＬＰＳまたは１つ以上の微生物抗原を用いて処方されたプロテオソームを含有する免疫原性組成物が、以下により詳細に議論される。特定の局面において、本説明の組成物は、治療用途（例えば、特異免疫応答を誘導するか、または（感染に対する）防御免疫を提供し、そして（毒性因子に対する）免疫性を中和することができる免疫応答を誘導することによる、微生物感染の処置または予防）のために適切である。
【００２２】
（プロテオソームベースのワクチンアジュバント−（「Ｐｒｏｊｕｖａｎｔ」および「Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ」））
本発明は、免疫応答を誘導可能な１つ以上の抗原を含有する免疫原性組成物に関する。上述のように、多くの抗原は、アジュバントを用いて処方されなければ、免疫原性が乏しい。ヒトにおける用途のために承認されている唯一のアジュバントは、ミョウバンであるが、このアジュバントは、上記に記載のような制限を有する。代替的なアジュバントを同定するための多様な努力にも関わらず、（特に、感染性疾患および毒性因子に対する）免疫を必要としている個体を免疫するための有効な組成物に対する必要性が、いまだ存在している。
【００２３】
本開示のプロテオソームベースのアジュバントは、ワクチン処方物において使用され得、このワクチン処方物は、種々の抗原供給源を含み得る。例えば、生きている減弱した微生物、殺した微生物、分裂した抗原、サブユニット抗原、毒性因子抗原およびそれらの組み合わせである。サブユニットワクチンの有効性を最大にするためには、上記抗原は、強力な免疫刺激因子またはアジュバントと組み合わせられるべきである。例示的なアジュバントとしては、ミョウバン（水酸化アルミニウム、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標））、リン酸アルミニウム、プロテオソームアジュバント（例えば、米国特許第５，７２６，２９２号および同第５，９８５，２８４号、ならびに米国特許出願公開番号２００１／００５３３６８および２００３／００４４４２５を参照のこと）、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）、リポソーム（リピドＡを含む、およびリピドＡを含まない）、Ｄｅｔｏｘ（Ｒｉｂｉ／Ｃｏｒｉｘａ）、ＭＦ５９または他の油および水のエマルジョン型アジュバント（例えば、ナノエマルジョン（例えば、米国特許第５，７１６，６３７号を参照のこと）またはサブミクロンエマルジョン（例えば、米国特許第５，９６１，９７０号を参照のこと）ならびにフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントが挙げられる。特に好ましいアジュバントは、プロテオソームまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎである。
【００２４】
プロテオソームは、代表的には、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種由来の外膜タンパク質（ＯＭＰ）から構成されるが、他のグラム陰性細菌（例えば、Ｌｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８、１９８８；Ｌｏｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８００、１９８８；Ｌｙｎｃｈら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４、１９８４；米国特許第５，７２６，２９２号；同第４，７０７，５４３号を参照のこと）に由来し得る。プロテオソームは、２０ｎｍ〜８００ｎｍの小胞または小胞様のＯＭＰクラスターへと自己集合し、そしてタンパク質抗原（Ａｇ）（特に、疎水性部分を有する抗原）を非共有結合的に組み込むか、調和するか、会合するか、またはそうでなければ協同して働くという興味深い能力を有する。プロテオソームは、疎水性であり、そしてヒトの用途のために安全であり、そして特定のウイルスに対してサイズにおいて適合性である。背景のために、そして理論と結びつけられることは所望されず、プロテオソームとタンパク質（例えば、抗原）とを混合することは、上記抗原とプロテオソームとの間の非共有結合的な会合または調和を含む組成物を提供し、例えば、透析によって、溶解用界面活性剤が選択的に除去されるかまたは減少されると、会合または調和が形成する。プロテオソームは、当該分野において記載されるように、または米国特許出願番号２００１／００５３３６８および２００３／００４４４２５に記載されるように、調製され得る。
【００２５】
上記外膜タンパク質成分の小胞または小胞様の形態（１つ以上のＯＭＰの溶解顆粒様ＯＭＰ組成物を含む）をもたらす任意の調製方法は、「プロテオソーム」の定義内に含まれる。１つの実施形態において、上記プロテオソームは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種由来であり、そしてより好ましくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来である。特定の実施形態において、プロテオソームは、キャリアではなくアジュバントである。特定の他の実施形態において、プロテオソームは、アジュバントであり得、そして抗体送達組成物であり得る。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書中に記載されるような１つ以上の抗原（例えば、微生物抗原、ウイルス抗原、寄生生物抗原、真菌抗原、トキシン抗原およびそのフラグメントまたは改変体）およびアジュバントを含有し、ここで上記アジュバントは、ＰｒｏｊｕｖａｎｔまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎを含む。本明細書中で記載されるように、上記抗原は、組み換え供給源由来であり得るか、または例えば、（界面活性剤）分裂抗原を含み得る。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明は、免疫刺激因子（例えば、リポサッカリド）をさらに含有する免疫原性組成物を提供する。すなわち、上記アジュバントは、調製されてさらなる免疫刺激因子を含有し得る。例えば、上記Ｐｒｏｊｕｖａｎｔは、リポサッカリドと混合されて、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントを提供し得る。従って、上記ＯＭＰ−ＬＰＳ（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ）アジュバントは、２つの基本成分からなり得る。上記第１の成分は、グラム陰性細菌（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）から調製されるプロテオソームの外膜タンパク質調製物（すなわち、Ｐｒｏｊｕｖａｎｔ）である。上記第２の成分は、リポサッカリドの調製物である。上記リポサッカリドは、米国特許出願番号２００１／００５３３６８および２００３／００４４４２５に記載されるように調製され得る。上記第２の成分は、脂質、糖脂質、糖タンパク質、低分子などおよびそれらの組み合わせを含有し得ることがまた、意図される。
【００２７】
本明細書中で記載されるように、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントの上記２つの成分は、特定の開始比で処方されて、上記成分間の相互作用を最適化し得、その結果、安定な会合および本発明の免疫原性組成物の調製物における使用のための上記成分の処方物をもたらす。上記プロセスは、一般的に、選択された界面活性剤溶液（例えば、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００またはＭｅｇａ−１０）中で成分を混合する工程、そして次いで、透析または好ましくは、透析／限外濾過法によって、界面活性剤の量を予め決められた好ましい濃度に減少しながら、上記ＯＭＰ成分およびＬＰＳ成分を効果的に複合体化する工程を包含する。上記２つの成分の混合、共沈殿または凍結乾燥はまた、充分かつ安定な会合または処方物を生じるために使用され得る。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書中に記載されるような１つ以上の抗原およびアジュバントを含有し、ここで、上記アジュバントは、Ｐｒｏｊｕｖａｎｔ（すなわち、プロテオソーム）およびリポサッカリドを含有する。
【００２８】
好ましい実施形態において、プロテオソームタンパク質全体の百分率としての最終リポサッカリド重量含量は、約１％〜約５００％の範囲、より好ましくは、約１０％〜約２００％の範囲、または約３０％〜約１５０％の範囲にあり得る。本発明の別の実施形態は、上記プロテオソームが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓから調製され、そして上記リポサッカリドが、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓから調製され、そして上記最終リポサッカリド含量が、プロテオソームタンパク質全体の５０重量％〜１５０重量％の間である、アジュバントを含む。別の実施形態において、プロテオソームは、ＯＭＰ全体の約０．５％〜約５％までの範囲にわたる内因性リポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）含量を用いて調製される。本発明の別の実施形態は、約１２％〜約２５％の範囲の内因性リポサッカリドを有するプロテオソームを提供し、そして好ましい実施形態においては、ＯＭＰ全体の約１５％と約２０％との間である。本発明はまた、任意のグラム陰性細菌種由来のリポサッカリドを含有する組成物を提供し、このグラム陰性細菌種は、プロテオソームの供給源であるグラム陰性細菌種と同じであっても、異なる細菌種であってもよい。
【００２９】
特定の実施形態において、上記プロテオソームまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎ：抗原の比は、上記混合物において、１：１より大きいか、２：１より大きいか、３：１より大きいかまたは４：１より大きい。上記比は、８：１と同じくらい高くてもまたはそれより高くてもよい。別の実施形態において、免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の上記比は、約１：１〜約１：５００の範囲にわたり、好ましくは、上記比は、少なくとも１：５、少なくとも１：１０、少なくとも１：２０、少なくとも１：５０または少なくとも１：１００である。本発明の予想外の結果は、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ：抗原の比が、抗原が免疫応答を誘導する能力に対して有意に影響することなく、劇的に減少し得た（１：２〜１：２００）ことである。
【００３０】
（抗原）
本発明は、１つ以上の抗原を含有する免疫原性組成物に関し、この抗原は、使用されて、免疫応答（例えば、防御免疫応答）を誘導し得る。本発明は、本明細書中に記載されるように、被験体に、１つ以上の抗原またはそのフラグメントもしくは改変体、融合タンパク質、多価免疫原またはこのような免疫原の混合物を、上記抗原に対して特異的な免疫応答（細胞性または体液性）（これは、防御免疫であり得る）を誘導するために充分な用量で投与することによって、微生物感染を処置および予防するための方法にさらに関する。上記抗原は、好ましくは、臨床的に関連する微生物（例えば、細菌、ウイルス（例えば、インフルエンザ、麻疹、コロナウイルス）、寄生生物（例えば、Ｔｒｙｐａｎｓｏｍｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、病原性微生物）、真菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）など）由来である。例えば、上記抗原は、炭疽（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、胃癌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、Ｑ熱（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、百日咳（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、例えば、ＦＨＡ）、ボツリヌス症（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型）、ガス壊疽（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、野兎病（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、類鼻疽（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、ブルセラ症（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、性感染症（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）の原因因子のような微生物、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのようなトキシン産生生物（イプシロントキシン、これらのグラム陽性嫌気性芽胞形成微生物によって産生される１２のタンパク質トキシンのうちの１つ）由来であり得る。
【００３１】
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの５つの株（Ａ〜Ｅ）が存在し、各々は、独特な一連のトキシンを産生する；イプシロントキシンは、Ｂ型およびＤ型によって産生される。イプシロントキシンは、細胞からのカリウムおよび流体の漏出を引き起こす実行ポリペプチドとして公知である。イプシロントキシンに加えて、上記Ａ型〜Ｅ型は、アルファトキシン、ベータトキシン、イプシロントキシンまたはイオタトキシンのうちの１つ以上を産生し得る。上記イプシロントキシンは、汚染された食物もしくは水の摂取、またはエアロゾル化トキシンの吸入によって広がり得る。関連する別の例示的なトキシンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによって産生されるブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。ＳＥＢは、吸入した場合に病気を引き起こすことが公知であり、そして恐らく、食物中毒の原因である。ＳＥＢ中毒個体の免疫系は、損傷されており、そして死と関連することは多くはないが、重大かつ広範に拡大する無力化する病気（例えば、高熱、悪寒、頭痛、筋肉痛、まぶたの裏の炎症、吐き気、嘔吐および下痢）となる。現在利用可能なワクチンまたは抗ＳＥＢは存在しない。
【００３２】
特定の実施形態において、単離されたＬＰＳは、抗原、例えば、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓから単離されたＬＰＳであり得、このＬＰＳは、歯肉疾患、歯周疾患、虫歯（ｔｏｏｔｈ ｄｅｃａｙ）などを処置または予防するためのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答の刺激における使用のために、プロテオソームを用いて処方され得る。
【００３３】
他の代表的な例としては、特定のウイルス（例えば、ノーウォークウイルス、天然痘ウイルス、西ナイルウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＲＳウイルスなど）由来の抗原が挙げられる。フィロウイルスの例としては、マルブルクウイルスおよびエボラウイルスが挙げられ；フラビウイルスの例としては、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルスが挙げられ；アレナウイルスの例としては、Ｊｕｎｉｎ（アルゼンチン出血熱）ウイルスが挙げられ；ラッサ熱ウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、Ｍａｃｈｕｐｏ（ボリビア出血熱）ウイルス；ブンヤウイルスの例としては、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ハンターン（朝鮮出血熱）ウイルス、リフトバレー熱ウイルスが挙げられ；ピコナウイルスの例としては、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルスが挙げられ；オルトミクソウイルスの例としては、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ，Ｃ（例えば、ＨＡ抗原）、トゴトウイルスが挙げられ；アルファウイルスの例としては、チクングニアウイルス、東部脳炎ウイルス、ベネズエラ脳炎ウイルス、西部脳炎ウイルスが挙げられる。真菌の例としては、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｅｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａが挙げられ；そして寄生生物の例としては、トリパノソーマ症、リーシュマニア、肺ペストおよびライム病（Ｂｏｒｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の原因因子が挙げられる。さらに、本発明の抗原は、毒性因子（例えば、リシン、ボツリヌス）であり得る。
【００３４】
本明細書中で記載される場合、上記抗原は、組み換え的に、合成的に調製されてもよく、生物学的供給源から単離されてもよく、組み換え的または化学的に改変されてもよく、そして任意のそれらの組み合わせでよい。微生物抗原またはそのフラグメントは、種々の生物学的供給源（例えば、感染被験体組織または培養細胞株）から調製され得る。一次的な単離は、例えば、末梢血液細胞由来または呼吸分泌物由来であり得る。好ましくは、上記単離された微生物は、一次細胞培養物または当該分野で公知の確立された細胞株において増幅される。特定の実施形態において、上記抗原またはそのフラグメントは、完全な微生物粒子から単離される。本明細書中で使用される場合、用語「単離された」または「由来する」は、その物質が、その元々の環境または天然の環境から取り除かれることを意味する。例えば、生きている動物もしくは細胞、またはウイルスに存在する、天然に存在する核酸分子またはポリペプチドは、単離されていないが、同じ核酸分子またはポリペプチドは、その天然系においてともに存在する物質のいくつかまたは全てから分離される場合には、単離されている。例えば、核酸分子は、ベクターに含まれ得、そして／またはこのような核酸は、組成物の一部であり得、そしてさらに、このようなベクターまたは組成物は、元々の核酸分子の天然の環境の一部ではないという点で、単離されている。別の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、抗原またはその改変体およびフラグメント）は、部分的に精製されるかまたは均一になるまで精製されるかのいずれかであり得る。
【００３５】
本発明は、合成抗原（融合タンパク質を含む）を生成するための方法をさらに提供する。上記免疫原性ポリペプチド成分は、標準的な化学的方法（自動手順による合成を含む）によって合成され得る。一般的に、免疫原性のポリペプチドまたはペプチドは、カップリング剤としてＨＡＴＵを用いた標準的な固相Ｆｍｏｃ保護方法に基づいて合成される。上記免疫原性ペプチドは、適切なスカベンジャーを含有するトリフルオロ酢酸を用いて固相樹脂から切断され得、このトリフルオロ酢酸はまた、側鎖官能基を脱保護する。粗製免疫原性ペプチドは、分取逆相クロマトグラフィーを用いてさらに精製され得る。他の精製方法（例えば、分割クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動またはイオン交換クロマトグラフィー）が、使用され得る。当該分野で公知の他の合成技術（例えば、ｔＢｏｃ保護方法、種々のカップリング試薬の使用など）が、同様の免疫原性ペプチドを生成するために用いられ得る。さらに、任意の天然に存在するアミノ酸もしくはその誘導体または天然に存在しないアミノ酸もしくはその誘導体（Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸およびその組み合わせを含む）が使用され得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、本発明の微生物抗原またはそのフラグメントは、組み換え体であり得、ここで、所望される抗原は、核酸発現構築物において発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に結合されたポリヌクレオチドから発現される。例えば、上記免疫原をコードする核酸発現構築物を含む宿主細胞（例えば、バキュロウイルスおよび哺乳動物細胞株）は、培養されて、組み換えタンパク質免疫原またはそのフラグメントを生成し得る。上記抗原は、アミノ酸配列にさらに融合または結合され得、この配列は、ＰｒｏｊｕｖａｎｔもしくはＰｒｏｔｏｌｌｉｎとの非共有結合的会合を容易にするか、またはそうでなければ促進するための疎水性のアンカーまたはフットであり得る。上記抗原ポリペプチドは、微生物感染に対して防御免疫応答（細胞性または体液性）を誘導し得る少なくとも１つのエピトープを有するような、ポリペプチドの任意の部分を含み得る。本発明の免疫原性ポリペプチドはまた、直線状形態に整列され得るかまたは組み合わせられ得、そして各免疫原は、反復されてもされなくてもよく、ここで、上記反復は、１回または複数回生じ得る。さらに、複数の種々の免疫原性ポリペプチド（例えば、タンパク質改変体またはそのフラグメント）は、選択され、そしてカクテル組成物中に混合されるかまたは合わせられて、防御免疫応答の誘導における使用のための多価ワクチンを提供し得る。
【００３７】
本開示の免疫原性組成物における使用のための特定の例示的な抗原についてのさらなる詳細を提供するために、以下の説明を提供する。
【００３８】
（Ａ．ペスト）
ペストは、黒死病としてもまた公知であり、長い歴史を有する疾患である。中世のペストの流行は、ヨーロッパにおいて３千万人までもの人々を死に追いやった。天然の発症は、風土病性地域において世界中でなお生じているが、抗生物質処置の有用性に起因して、上記疾患は、病的状態をほとんど引き起こさず、そして死亡は、稀にしか生じない。しかし、ペストを取り巻く恐怖は、それが生物戦闘兵器として使用され得る可能性によって、近年増大している。
【００３９】
腺ペストは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓに感染したノミに咬まれることによってヒトへと広がり、そして比較的容易に診断され、そして従って、抗菌剤によって効果的に処置される。ペストの最も致死的な形態である肺ペストは、呼吸経路によるか、または腺ペストもしくは敗血性ペストの拡大の結果として、感染され、かつ処置されていない人によって、人から人へと伝達される。曝露後の肺ペストの処置は、その迅速な経過に起因して、より問題がある。抗菌剤処置が、感染症状を示してから２４時間以内になされなければ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓを吸入したほとんどの人は、死亡する。ペストの起こり得る意図的な伝播に対する懸念によって、ペストの最も有毒な肺性形態に対して防御可能な安全なワクチンの開発が、非常に優先されている。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本発明は、ペストに対して免疫応答を誘導するための方法を提供し、この方法は、ペストに対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上のペスト抗原またはその改変体もしくはフラグメントを含有する。他の実施形態において、本発明は、ペスト感染を処置または予防するための方法を提供し、この方法は、ペスト感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上のペスト抗原またはその改変体もしくはフラグメントを含有し、ここで、上記ペスト感染は、処置または予防される。特定の実施形態において、上記免疫原性組成物において使用されるペスト抗原は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来のＦ１抗原もしくはＶ抗原、またはＦ１−Ｖ抗原融合タンパク質抗原、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００４１】
（Ｂ．天然痘）
１つの実施形態において、例えば、ヒトにおいて天然痘疾患を引き起こす痘瘡ウイルスによる感染に対して防御免疫応答を引き起こすウイルス抗原を含有するＰｒｏｔｏｌｌｉｎ処方物は、本明細書中で企図される。痘瘡ウイルスは、ポックスウイルス科と呼ばれるウイルスファミリーの最も有名なメンバーであり、そして歴史的に、ヒトの文明に対して重要かつ劇的な効果を有してきた。上記ポックスウイルス科は、ＤＮＡウイルスの大きなファミリーであり、感染宿主細胞の細胞質において複製する。痘瘡ウイルスの感染は、感染したもののうちの２０％〜３０％を死に追いやり、そして高度に感染性である。２０年の牛痘ウイルスワクチンおよびワクシニアウイルスワクチンを用いた予防免疫は、１９７０年代後半までに、ヒトにおける天然痘疾患の発症を効果的に撲滅してきたものの、天然痘ウイルスが、天然に存在するウイルス集団からかまたは生物学的戦闘兵器としての予測されない集団への意図的な導入の結果としてのいずれかで、重要かつ致命的な疾患として再興し得るという懸念は、残ったままである。
【００４２】
感染宿主細胞から精製されたウイルス粒子は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分解された場合、３０以上もの多くの別個のポリペプチドのバンドを構成する。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株のゲノム配列は、６５個超のアミノ酸からなる約１８５個の独自の重複しないオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。慣例により、オルトポックスウイルスＯＲＦの命名は、ＨｉｎｄＩＩ制限エンドヌクレアーゼフラグメントを用いた文字、その後、そのＯＲＦの数（左から右）、そしてそのＯＲＦの方向に依存したＬまたはＲからなる。痘瘡ウイルスのインド株およびバングラディッシュ株の完全配列およびほぼ同一の配列はまた、約１８７個のＯＲＦを含み、これらのうちの１５０個は、ワクシニアウイルスのＯＲＦに対して、９０％超の配列同一性を有する。痘瘡ウイルスコードポリペプチドに対して９０％の配列同一性を有する、ワクシニアウイルスＯＲＦによってコードされるポリペプチドのうちの１つ以上は、ワクシニアウイルス免疫後の防御に関与する免疫応答を媒介すると考えられている。限定するわけではないが、例として、多くのＯＲＦは、防御免疫応答の誘導に関与し得る細胞外ウイルス特異的ポリペプチドをコードすることが、公知である。それらとしては、Ｆ１３Ｌ ＯＲＦによってコードされる非グリコシル化４１．８ｋＤａタンパク質；Ａ３４Ｒ ＯＲＦによってコードされるＮ−グリコシル化１９．５ｋＤａタンパク質；Ａ３６Ｒ ＯＲＦによってコードされる２５．１ｋＤａタンパク質；Ａ５６Ｒ ＯＲＦによってコードされるＮ−およびＯ−グリコシル化赤血球凝集素タンパク質；およびＢ５Ｒ ＯＲＦによってコードされるグリコシル化３５．１ｋＤａタンパク質が挙げられる。これらのタンパク質の１つ以上に対する免疫応答は、体液性免疫応答または細胞媒介性免疫応答を誘導すると考えられており、これらの免疫応答は、痘瘡ウイルス感染から防御し得るかまたは感染の病原性効果を減少し得る。均衡がとれているかまたは微調整されたＴＨ１／Ｔｈ２サイトカインプロファイルに優先的に関与する感染宿主の免疫応答は、痘瘡ウイルス感染および天然痘疾患の発症の予防または処置において有効であると考えられている。
【００４３】
オルトウイルスの４種のメンバーは、ヒト感染を引き起こし得、それらは、サル痘ウイルス、牛痘ウイルス、痘瘡ウイルスおよびワクシニアウイルスである。牛痘ウイルスおよびワクシニアウイルスは、天然痘感染に対してヒトを予防接種するために、広く使用されている。なぜなら、それらは、痘瘡ウイルスによる感染と比較して、重篤な合併症を生じにくいからである。かなりの程度まで、天然痘は、深刻な健康への脅威であることから撲滅されており、そして続けられた広範に広がる集団全般の予防接種は、中止されている。しかし、天然ウイルスの再興または生物学的脅威因子としての天然痘ウイルスの迅速かつ広範な開発、および生ウイルスを用いた予防接種から生じる、起こり得る所望されない副作用から、天然痘に対する代替的なワクチンの開発の必要性が生じている。
【００４４】
今日まで、天然痘ウイルス（すなわち、痘瘡ウイルス）感染に対する非生存サブユニットワクチンは存在していない。現在のワクチン処方物は、防御免疫応答（しばしば、所望されない副作用）を引き起こすために、減弱した生ウイルスの使用を必要とする。特定の実施形態において、本発明は、天然痘に対して免疫応答を誘導するための方法を提供し、この方法は、天然痘に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上の天然痘抗原または天然痘ウイルス粒子抽出物を含有する。他の実施形態において、本発明は、天然痘感染を処置または予防するための方法を提供し、この方法は、天然痘感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上の天然痘抗原または天然痘ウイルス粒子抽出物を含有し、ここで、上記天然痘感染は、処置または予防される。
【００４５】
（Ｃ．リシン）
本発明のさらに別の局面において、非感染性の毒性因子または有毒因子に対して免疫応答を引き起こし得るプロテオソームベースのワクチン組成物は、本明細書中で企図される。このような非感染性因子としては、例えば、豆植物Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓから産生されるリシントキシンが挙げられ、このリシントキシンは、ヒト、動物および昆虫に対して有毒である。リシンは、トウゴマによって産生される細胞毒であり、吸入または摂取による中毒は、リシンによって引き起こされる。リシン中毒は、用量に依存して、摂取の２時間〜３時間以内に開始して、腹痛、嘔吐、下痢を引き起こし得る。リシン中毒は、阻止されない場合、数日以内に重篤な脱水症へと進行し、そして血圧を低下させて、摂取（または吸入）後３日〜５日以内に死に至る。リシンは、実に容易に産生され、そして、小さい粒子としての吸入またはその後の摂取によって中毒（毒性）を引き起こし得る、強力なトキシンである。リシンはまた、かなり安定である。リシン中毒の症状としては、衰弱、発熱、咳および肺水腫、その後の重篤な呼吸窮迫症および低酸素血症による死が挙げられる。げっ歯動物においては、エアロゾル曝露の組織病理は、脈管水腫および肺胞水腫（ａｌｅｖｅｏｌａｒ ｅｄｅｍａ）を伴う気管炎、気管支炎および間質性肺炎を引き起こす壊死性気道損傷によって特徴付けられる。げっ歯動物において、リシンは、他の曝露経路によるよりも吸入によってより有毒である。地理的に集中した個体の有意な数におけるリシン中毒の症状は、エアロゾル化リシンに対する曝露を示唆し得る。
【００４６】
細胞毒性は、真核生物リボソームを特異的かつ不可逆的に不活性化するメカニズムを介する、タンパク質合成の阻害によって媒介される。従って、リシンはまた、公知のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）である。上記ＲＩＰ（例えば、リシン）は、一般的に、２つのジスルフィド結合されたポリペプチド鎖から構成される。一方のポリペプチド鎖は、細胞への結合および細胞質への取り込みを媒介し、他方の鎖は、タンパク質合成を阻害するために機能する。特定の実施形態において、本発明は、リシントキシンに対して免疫応答を誘導するための方法を提供し、この方法は、リシントキシンに対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上のリシントキシン抗原またはそのフラグメントもしくは改変体を含有し、ここで、上記リシントキシン抗原は、抗体応答の中和を誘導する。従って、宿主Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答を調節し、そしてトキシン活性を不活性化または減弱するリシン免疫原性ポリペプチドを含有するプロテオソームワクチン処方物は、本明細書中で企図される。
【００４７】
（Ｃ．ボツリヌス中毒）
ボツリヌス中毒は、バシラス属のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍによって産生される７つの異なる神経毒のうちのいずれかによる中毒によって引き起こされる。上記ボツリヌストキシンは、約１５０，０００ＫＤａの分子量を有するタンパク質であり、末梢コリン作動性シナプスでニューロンのシナプス前膜に結合して、アセチルコリンの放出を阻害し、そして神経伝達を遮断する。上記遮断は、上記コリン作動性自律神経系および神経筋接合部において、臨床的に最も明らかである。吸入ボツリヌス中毒の症状は、曝露後２４時間〜３６時間の早さで開始し得るかまたは数日の遅さで開始し得る。初期の徴候および症状としては、下垂、全身性衰弱、倦怠および眩暈感が挙げられる。呼吸不全の発症は、突然にあり得る。
【００４８】
特定の実施形態において、本発明は、ボツリヌストキシンに対して免疫応答を誘導するための方法を提供し、この方法は、ボツリヌストキシンに対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリド、および１つ以上のボツリヌストキシン抗原またはそのフラグメントもしくは改変体を含有し、ここで、上記ボツリヌストキシン抗原は、抗体応答の中和を誘導する。
【００４９】
（免疫原性組成物および使用方法）
本発明はまた、１つ以上の抗原を含有する免疫原性組成物に関し、この組成物は、免疫応答（例えば、防御免疫応答）を誘導するために使用され得る。本発明は、本明細書中で記載されるように、１つ以上の抗原もしくはそのフラグメント、融合タンパク質、多価免疫原またはこのような抗原の混合物を、上記抗原に対して特異的な免疫応答（細胞性または体液性）（この免疫応答は、防御免疫応答であり得る）を誘導するために充分な用量で被験体に投与することによって、微生物感染もしくは毒性因子の影響を処置または予防するための方法にさらに関する。抗原およびその改変体、またはこのような免疫原のカクテルは、好ましくは、本発明の方法において使用される場合、アジュバント（例えば、ＰｒｏｊｕｖａｎｔまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎ）を含有する組成物の一部である。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、１つ以上のさらなる微生物抗原（例えば、ウイルス抗原、微生物抗原、寄生生物抗原またはそれらの組み合わせ）をさらに含有し得る。例えば、ペストまたは炭疽に対する免疫原性はまた、風疹抗原およびムンプス抗原に対する抗原を含み得る。
【００５０】
上記免疫原性組成物は、１つ以上の抗原またはそのフラグメントに加えて、薬学的に受容可能なビヒクル、キャリア、希釈剤または賦形剤、そして必要に応じて、他の成分をさらに含有し得る。例えば、本発明の免疫原性組成物との使用のために適切な薬学的に受容可能なキャリアまたは他の成分としては、濃縮剤、緩衝剤、溶媒、湿潤剤、保存剤、キレート剤、添加アジュバントなど、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５１】
さらに、本発明の薬学的組成物は、希釈剤（例えば、水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））をさらに含有し得る。好ましくは、希釈剤は、約０．１ｍＭ〜約１Ｍ、より好ましくは、約０．５ｍＭ〜約５００ｍＭ、さらにより好ましくは、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、そして最も好ましくは、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の最終ホスフェート濃度；および約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ、そして最も好ましくは、約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭの範囲の最終塩濃度を有するＰＢＳである。好ましくは、上記最終ＰＢＳ濃度は、約５ｍＭのホスフェートおよび約１５０ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ）である。特定の実施形態において、本発明の抗原およびアジュバント（例えば、ＰｒｏｊｕｖａｎｔまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎ）のカクテルを含有する上述の免疫原性組成物のいずれもが、好ましくは、滅菌である。
【００５２】
上記組成物は、無菌環境下でそれらを調製することによって滅菌され得るか、またはそれらは、当該分野で利用可能な方法を用いて最終的に滅菌され得るかのいずれかである。多くの医薬品は、滅菌であるように製造され、そしてこの基準は、ＵＳＰ ＸＸＩＩ＜１２１１＞により規定されている。この実施形態における滅菌は、この産業において受容され、そして上記ＵＳＰ ＸＸＩＩ＜１２１１＞に列挙されている多くの手段（ガス滅菌、電離放射線または濾過を含む）によって達成され得る。滅菌は、無菌処理と呼ばれ、また、ＵＳＰ ＸＸＩＩ＜１２１１＞に規定されている方法によって維持され得る。ガス滅菌のために使用される受容可能な気体としては、エチレンオキシドが挙げられる。電離放射線法のために使用される受容可能な放射線型としては、例えば、コバルト６０供給源からのγ線および電子線が挙げられる。γ線放射の代表的な用量は、２．５ＭＲａｄである。必要に応じて、濾過は、適切な孔サイズ（例えば、０．２２μｍ）を有し、そして適切な材料（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））からなるフィルタを用いて達成され得る。用語「ＵＳＰ」とは、米国薬局方（ｗｗｗ．ｕｓｐ．ｏｒｇ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤを参照のこと）をいう。プロテオソームまたはＯＭＰ−ＬＰＳは、充分小さい粒子を生じるという事実に起因して、本発明の免疫原性組成物は、０．８μのフィルタ、０．４５μのフィルタまたは０．２μのフィルタを通して濾過され得る。従って、好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、濾過によって滅菌される。このことは、非常に有益である。なぜなら、このような夾雑物の存在による任意の複雑化を除去することが、所望されるからである。
【００５３】
本発明はまた、微生物感染を処置または予防するための方法に関し、この方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、免疫原性組成物を投与する工程を包含し、この免疫原性組成物は、アジュバントおよび１つ以上の抗原を含有し、ここで、上記アジュバントは、プロテオソームまたはＯＭＰ−ＬＰＳのいずれかを含む。別の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、免疫応答（細胞性もしくは体液性、またはその両方、これらは、１型細胞応答または２型細胞応答に有利であり得る）を誘導するために使用され得る。抗原処方物を用いた処置または免疫応答の誘導のために適切な被験体は、疾患を発達させるための危険性の充分に確立された指標、または存在する疾患の充分に確立されたに証明によって規定され得る。本明細書中で使用される場合、用語「処置する」および「改善する」とは、統計学的に有意な様式で、疾患の少なくとも１つの局面もしくはマーカーを処置するか、阻害するか、軽減するか、改善するか、減少するか、予防するかまたは変化させるために充分な量あるいは充分な時間での、所望される組成物または化合物の治療用投与をいうことが理解されるべきである。本発明の抗原を用いて処置され得るか、改善され得るかまたは予防され得る感染としては、その感染が、一次感染、二次感染、日和見感染などのいずれであるにせよ、本明細書中に記載されるいずれかの微生物によって引き起こされるかまたは起因する感染が挙げられる。他の例示的な抗原は、本明細書中で記載されるトキシンまたはその改変体である。
【００５４】
本明細書中で記載される場合、上記抗原は、組み換え的に、合成的に調製されてもよく、生物学的供給源から単離されてもよく、組み換え的または化学的に改変されてもよく、そして任意のそれらの組み合わせでもよい。微生物抗原またはそのフラグメントは、種々の生物学的供給源（例えば、感染被験体組織または培養細胞株）から調製され得る。一次的な単離は、例えば、末梢血液細胞由来または呼吸分泌物由来であり得る。好ましくは、上記単離された微生物は、初代細胞培養物または当該分野で公知の樹立細胞株において増幅される。特定の実施形態において、上記抗原またはそのフラグメントは、完全な微生物粒子から単離される。本明細書中で使用される場合、用語「単離された」または「由来する」は、その物質が、その元々の環境または天然の環境から取り除かれることを意味する。例えば、生きている動物もしくは細胞、またはウイルスに存在する、天然に生じる核酸分子またはポリペプチドは、単離されていないが、同じ核酸分子またはポリペプチドは、その天然系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離される場合には、単離されている。例えば、核酸分子は、ベクターに含まれ得、またはこのような核酸は、組成物の一部であり得、そしてさらに、このようなベクターまたは組成物は、元々の核酸分子の天然の環境の一部ではないという点で、単離されている。別の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、抗原またはその改変体およびフラグメント）は、部分的に精製されるかまたは均一になるまで精製されるかのいずれかであり得る。
【００５５】
本発明は、合成抗原（融合タンパク質を含む）を生成するための方法をさらに提供する。上記免疫原性ポリペプチド成分は、標準的な化学的方法（自動手順による合成を含む）によって合成され得る。一般的に、免疫原性のポリペプチドまたはペプチドは、カップリング剤としてＨＡＴＵを用いた標準的な固相Ｆｍｏｃ保護方法に基づいて合成される。上記免疫原性ペプチドは、適切なスカベンジャーを含有するトリフルオロ酢酸を用いて固相樹脂から切断され得、このトリフルオロ酢酸はまた、側鎖官能基を脱保護する。粗製免疫原性ペプチドは、分取逆相クロマトグラフィーを用いてさらに精製され得る。他の精製方法（例えば、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動またはイオン交換クロマトグラフィー）が、使用され得る。当該分野で公知の他の合成技術（例えば、ｔＢｏｃ保護方法、種々のカップリング試薬の使用など）が、同様の免疫原性ペプチドを生成するために用いられ得る。さらに、任意の天然に存在するアミノ酸もしくはその誘導体または天然に存在しないアミノ酸もしくはその誘導体（Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸およびその組み合わせを含む）が使用され得る。
【００５６】
本明細書中に記載される場合、本発明の微生物抗原またはそのフラグメントは、組み換え体であり得、ここで、所望される抗原は、核酸発現構築物において発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に結合されたポリヌクレオチドから発現される。例えば、上記免疫原コード核酸発現構築物を含む宿主細胞（例えば、バキュロウイルスおよび哺乳動物細胞株）は、培養されて、組み換えタンパク質免疫原またはそのフラグメントを生成し得る。上記抗原は、さらなるアミノ酸配列にさらに融合または結合され得、この配列は、抗原融合体と、ＰｒｏｊｕｖａｎｔもしくはＰｒｏｔｏｌｌｉｎとの非共有結合的会合を容易にするか、またはそうでなければ促進するための疎水性のアンカーまたはフットであり得る。上記抗原ポリペプチドは、微生物感染に対して防御免疫応答（細胞性または体液性）を誘導し得る少なくとも１つのエピトープを有するような、ポリペプチドの任意の部分を含み得る。本発明の免疫原性ポリペプチドはまた、直線状形態に整列され得るかまたは組み合わせられ得、そして各免疫原は、反復されてもされなくてもよく、ここで、上記反復は、１回または複数回生じ得る。さらに、複数の種々の免疫原性ポリペプチド（例えば、タンパク質改変体またはそのフラグメント）は、選択され、そしてカクテル組成物中に混合されるかまたは合わせられて、防御免疫応答の誘導における使用のための多価ワクチンを提供し得る。
【００５７】
本開示の免疫刺激組成物、免疫調節組成物および免疫原性組成物を調製するための方法は、本明細書中に記載され、そして当該分野において公知である（例えば、米国特許出願公開番号２００１／００５３３６８および２００３／００４４４２５を参照のこと）。上記抗原およびアジュバントは、特定の開始比で処方されて、上記成分間の相互作用（または協同作用）を最適化し、その結果、上記２つの成分のかなりの部分が、互いに非共有結合会合（または、非特異的並置）することをもたらす。例えば、少なくとも１つの抗原と、プロテオソーム（ｐｒｏｊｕｖａｎｔ）またはＰｒｏｔｏｌｌｉｎとの混合物は、界面活性剤の存在下で調製され、そして透析／限外濾過によって、上記混合物から上記界面活性剤を減少または除去することにより、上記抗原と、上記アジュバントとの会合（または協同作用）が導かれる。特定の実施形態において、上記混合物中の上記Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（またはプロテオソーム）：抗原の比は、約１：１〜約５：１の範囲である。上記比は、８：１以上に高くあり得る。特定の他の実施形態において、上記混合物中の上記Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（またはプロテオソーム）：抗原の比は、約１：１〜約１：５００の範囲であるか、または約１：２〜約１：２００の範囲にあるか、または約１：２〜約１：１００の範囲にあるか、または約１：５〜約１：５０の範囲にあるか、または約１：２〜約１：２０の範囲にあるか、または少なくとも１：５、１：１０、１：２０もしくは１：１００の範囲にある。上記２つの成分の界面活性剤ベースの溶液は、同じ界面活性剤を含んでも異なる界面活性剤を含んでもよく、そして１つより多くの界面活性剤が、限外濾過／透析に供される混合物中に存在し得る。適切な界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢおよびＭｅｇａ−１０が挙げられる。他の界面活性剤（例えば、オクトグリコシド）がまた、使用され得る。上記界面活性剤は、上記組成物を調製するために使用される成分を溶解するために役に立つ。界面活性剤の混合物の使用は、特に有利である。もちろん、この混合物は、最終処方物の前に、除去されるかまたはその濃度は、透析／限外濾過によって減少される。
【００５８】
本発明の１つ以上の抗原およびプロテオソームベースのアジュバントを含有する免疫原性組成物は、その組成物が被験体（例えば、ヒトまたは動物）に投与され得る任意の形態にあり得る。例えば、本発明の免疫原性組成物は、液体の溶液として調製され、そして投与されても、固体形態（例えば、凍結乾燥されて）として調製されてもよく、この固体形態は、投与に合わせて、固体形態で投与されても溶液中に再懸濁されてもよい。上記免疫原性ポリペプチド組成物は、そこに含有される活性成分が、被験体もしくは患者への上記組成物の投与の際に生物利用可能であり得るか、または遅延放出を介して生物利用可能であり得るように、処方される。被験体または患者に投与される組成物は、一用量単位以上の形態をとり、ここで、例えば、ドロップは、単一用量単位であり得、そして本発明の１つ以上の化合物のエアロゾル形態の容器は、複数の用量単位を保有し得る。特定の好ましい実施形態において、本発明の免疫原または免疫原（例えば、抗原）のカクテルを含有する任意の上述の薬学的組成物は、容器内にあり、好ましくは、滅菌容器内にある。特定の投与プロトコールの設計（投薬レベルおよび投与のタイミングを含む）は、当業者に周知の慣用的な方法を用いるこのような手順を最適化することによって、決定される。
【００５９】
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物は、鼻に投与される。他の代表的な投与経路としては、経腸、非経口、経皮／経粘膜、鼻および吸入が挙げられる。用語「経腸」とは、本明細書中で使用される場合、上記免疫原性組成物が、胃腸管または経口粘膜（経口、直腸および舌下を含む）を介して吸収される、投与経路である。用語「非経口」は、本明細書中で使用される場合、胃腸管を迂回する投与経路（動脈内、皮膚内、筋内、鼻内、眼内、腹腔内、静脈内、皮下、粘膜下および膣内の注射技術または注入技術を含む）を説明する。用語「経皮／経粘膜」は、本明細書中で使用される場合、上記免疫原性組成物が、皮膚を介するかまたは皮膚を通って投与される（局所的を含む）、投与経路である。用語「鼻」および「吸入」は、上記免疫原性組成物が、肺樹（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｔｒｅｅ）内に導入される（肺内または経肺を含む）、投与技術を含む。好ましくは、本発明の組成物は、鼻に投与される。
【００６０】
例えば、本明細書中に記載されるように、鼻に投与されるＰｒｏｔｏｌｌｉｎと組み合わされたＦ１−Ｖは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）を用いて処方されたＦ１−Ｖの筋内注射によって誘導される抗Ｆ１−Ｖ ＩｇＧ力価に匹敵する、血清抗Ｆ１−Ｖ ＩｇＧ力価を誘導した。しかし、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）／Ｆ１−Ｖとは異なり、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ／Ｆ１−Ｖはまた、肺洗浄流体において検出されたように、特異的なＩｇＡ応答およびＩｇＧ応答を誘導した。免疫したマウスを、その後、エアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｔｉｓを用いて攻撃した。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ／Ｆ１−Ｖ免疫マウスは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／Ｆ１−Ｖ群において６０％であるのに対して、高用量（２５５ＬＤ５０）の攻撃に対して８０％が防御され、他方、両方のワクチンは、上記生物の低用量（１７０ＬＤ５０）の攻撃に対して９０％〜１００％防御的であった。
【００６１】
本明細書中において参照され、そして／または、出願データシートに列挙される全ての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願および非特許刊行物は、本明細書中でそれらの全体が参考として援用される。記載されている本発明、以下の実施例は、本発明を例示することが意図され、本発明を限定しない。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
（血清免疫応答および粘膜免疫応答を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイ）
ＥＬＩＳＡを、本用途に従う試験免疫刺激因子または試験免疫原性処方物およびコントロールで免疫した動物から得られた生物の全体ならびに抗原特異的なＩｇＧ力価、ＩｇＡ力価およびＩｇＭ力価を決定するために使用した。サンプルは、マウスおよびウサギにおける血清、鼻洗浄物および肺粘膜洗浄物を含んだ。標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを使用して、直線性、特異性、感受性および再現性を決定した。簡単に言えば、試験サンプル（血清および洗浄流体）の連続希釈液を、精製した抗原またはその誘導体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。固定化抗原に結合する抗原特異的抗体を、動物および抗体サブタイプに特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体で検出した。ＨＲＰ抗体の相互作用および洗浄の後、ＨＲＰ基質（ＴＭＢ）とともにインキュベーションした後に結合したＨＲＰ抗体の量を検出し、そして４９０ｎｍの吸光度を測定した。上記試験サンプルの抗体濃度を、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに対する精製した標準抗体を用いて（これらは並行して実施された）標準曲線から計算した。別個のアッセイにおいて測定したので、必要に応じて、粘膜洗浄流体サンプルにおける特異的抗体レベルを、上記サンプル中のＩｇＡ総量またはＩｇＧ総量と比較して検出した特異的抗体を表すことによって標準化および正規化した。この技術は、ヒト臨床試験において収集した鼻洗浄流体に対して実施したアッセイにおいて、優れた再現性および一貫性をもたらした。ＥＬＩＳＡデータを、長期変形（ｌｏｎｇ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）データを用いた統計的分析により、９５％信頼レベルでの幾何学的平均として表す。
【００６３】
（実施例２）
（粘膜抗体産生の分析）
マウスおよびウサギにおける肺洗浄物および鼻洗浄物を収集して、本用途に従う免疫刺激因子または免疫原性処方物に対する免疫応答を分析した。マウスにおいて、鼻洗浄物および肺洗浄物を、気管にカニューレ挿入することによって実施し、そして０．１％ウシ血清アルブミンおよびプロテアーゼインヒビター（０．２ｍＭ ＡＥＢＳＲ、１μｇ／ｍＬ アプロチニン、３．２５μＭ ベスタチン、１０μＭ ロイペプチンを含有するＧｅｎｅｒａｌ Ｕｓｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充した１ｍｌ ＰＢＳを、気管を通して上方へポンプした。外鼻孔から出てきた流体を収集し、ボルテックスし、そして次いで、遠心して組織および細胞の残骸を除去した。その上清を−７０℃でアッセイまで保存した。カニューレを気管に再び挿入し、そしてそのカニューレを肺へと向けて維持することにより、肺流体を収集した。肺を、ＰＢＳを補充した１．０ｍＬ プロテアーゼで２回洗浄し、その流体を収集し、そしてボルテックスし、そして遠心によってその細胞の残骸を除去した。肺洗浄物および鼻洗浄物を、−７０℃でアッセイするまで保存した。ウサギ粘膜流体を同様に収集し、必要に応じてその容量を調節した。特定の実施形態において、粘膜サンプルを収集した後、頚部および縦隔のリンパ節を外科手術的に除去し、そして単球細胞を単離し、そして本明細書中で記載されるようなＥＬＩＳＰＯＴ抗体アッセイ、サイトカインアッセイおよびＣＭＩアッセイのために培養した。
【００６４】
（実施例３）
（ペスト抗原Ｆ１−Ｖを用いて処方したＰｒｏｔｏｌｌｉｎによる免疫）
例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓを用いた致死的な攻撃に対して防御可能な免疫応答を誘発するペスト抗原（Ｆ１−Ｖ）を用いて処方した、プロテオソーム：ＬＰＳ（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ）組成物の性能を試験する。上記Ｆ１−Ｖ免疫応答を、０日目および２１日目に、２０匹の６週齢〜８週齢の雌Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ）群を免疫することによって評価した。免疫のために、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎの新しく解凍したアリコートおよびＦ１−Ｖの溶液を、免疫前に１６時間より短い時間混合した。鼻内（ｉ．ｎ．）投与のために、マウスを、イソフルラン吸入によってまず軽く麻酔し、次いで２５μｌのワクチンサンプルまたは適切なコントロールサンプル（ＰｒｏｔｏｌｌｉｎまたはＦ１−Ｖのみ）を、各マウスの外鼻孔（外鼻孔あたり１２．５μｌ）に適用した。並行した実験において、マウスを、後足に注射した、５００ｍｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に吸着された２５μｌのＦ１−Ｖで、筋内（ｉ．ｍ．）に免疫した。コントロールｉ．ｍ．注射をまた、実施した。その後、３５日目および５５日目に、各群からの１０匹のマウスをＣＯ２による窒息および瀉血によって安楽死させた。血清を得て、アッセイまで−８０℃で保存した。鼻洗浄物サンプルおよび肺洗浄物サンプルを得て、アッセイまで−８０℃で保存した。脾臓を、インビトロ再刺激および放出サイトカインの評価のために処理した。各群からの残りの１０匹のマウスを、エアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ ９２株）の１７０〜２５０ＬＤ５０の吸入によって、３５日目または５５日目に攻撃して、防御を評価した。マウスを、罹患率および死亡率の決定のために、攻撃後２８日間モニタリングした。
【００６５】
Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを用いて処方されたＦ１−Ｖ抗原の２用量で鼻内に免疫したマウスから得られた、血清サンプルおよび肺洗浄流体サンプルに存在する抗体を、Ｆ１−Ｖのみで鼻内に免疫したマウスまたはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）吸着Ｆ１−Ｖで筋内に免疫したマウスからの血清サンプルおよび肺洗浄流体サンプルに存在する抗体と比較した。結果を、図１および２に示す。驚くべきことに、試験した全ての濃度において、ＰｒｏｔｏｌｌｉｎとＦ１−Ｖとの全ての組み合わせは、免疫原性が高く、そして、１ｍｇ／ｍｌと９ｍｇ／ｍｌとの間のＦ１−Ｖ特異的血清ＩｇＧ力価を誘導した（図１および２）。Ｆ１−Ｖ濃度とＰｒｏｔｏｌｌｉｎ濃度との任意の組み合わせによって誘導される特異的ＩｇＧ力価、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着された２０μｇのＦ１−Ｖの筋内注射によって誘導される特異的ＩｇＧ力価に、有意な差はなかった（Ｐ＞０．０５）。Ｆ１−Ｖ処方ワクチンによって誘導される全ての特異的血清ＩｇＧ力価は、非アジュバント添加Ｆ１−Ｖコントロールの鼻内投与によって誘導されるものよりも、有意に高く（Ｐ≦０．００１）、そしてコントロールマウスからの血清においては、Ｆ１−Ｖ特異的抗体は検出されなかった。これらの実験の予測されなかった結果は、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ：抗原の比は、劇的（１：２〜１：２００）に減少され得、抗原が免疫応答を誘導するという能力に、有意な影響を与えないということである。この開示の前には、アジュバントの量を減少することは、免疫応答の減少をもたらすと予測されていた。
【００６６】
肺洗浄物サンプルを、ＥＬＩＳＡによってアッセイして、存在する特異的な抗Ｆ１−Ｖ抗体、抗Ｆ１抗体および抗Ｖ抗体のレベルを決定した（図３）。結果は、粘膜（例えば、鼻内）経路による免疫は、Ｆ１−Ｖ特異的肺ＩｇＡの高力価によって応答される、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ添加Ｆ１−Ｖ抗原で鼻内に免疫したマウスの全ての群のように、粘膜抗体を誘導する有効な手段であることを確かめる。これらの実験において、上記ＩｇＡ応答は、最も高い用量のＰｒｏｔｏｌｌｉｎで免疫したマウスからの肺洗浄物サンプルにおいて、最も高かった；ＡＮＯＶＡ分析は、やはり予測されなかったように、Ｆ１−ＶとＰｒｏｔｏｌｌｉｎとの任意の組み合わせによって誘導される上記ＩｇＡ力価に、有意な差はないことを示した。非アジュバント添加Ｆ１−Ｖは、鼻内に投与され、わずかに検出可能なＩｇＡレベルを誘導した；分泌ＩｇＡは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）吸着Ｆ１−Ｖで筋内注射したマウスからのサンプルにおいては検出されなかった。上記Ｆ１−Ｖ抗原の上記Ｆ１部分およびＶ部分に対する肺洗浄物サンプルのアッセイは、上記免疫応答は、主に、上記Ｆ１−Ｖ融合タンパク質の上記Ｖ成分に対して検出されることを示した（表１）。しかし、肺洗浄物サンプルはまた、その力価が、上記血清力価の小さい百分率を示すにすぎないにしても、Ｆ１−Ｖ特異的ＩｇＧのかなりの力価を含んでいた（０．１１％〜０．５６％；中央値０．１７５％）。
【００６７】
上記Ｆ１成分およびＶ成分の両方を認識する血清抗体が誘導されたか否かを決定するために、２０μｇ用量のＦ１−Ｖ抗原で免疫した全てのマウスからの血清を、Ｆ１およびＶに対して別個に分析した。全ての場合、そして両方のサンプリング時間において、上記Ｆ１−Ｖ抗原の上記Ｆ１部分およびＶ部分の両方に対して特異的な血清ＩｇＧ抗体および肺洗浄流体ＩｇＡ抗体を、検出した（表１）。これらの実験において評価した上記Ｆ１−Ｖ抗原の処方または送達経路に関わらず、上記血清の抗Ｆ１抗体と抗Ｖ抗体との比に有意な差はなかった。
【００６８】
【表１】
（実施例４）
（エアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｔｉｓで免疫したマウスの攻撃）
これらの実験を、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを用いて処方されたＦ１−Ｖによる鼻内免疫によって誘導される、免疫防御レベルを評価するために設計した。マウスを、生存エアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｔｉｓに対する全身曝露によって攻撃し、そして攻撃からの防御レベルを、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ上に吸着されたＦ１−Ｖの注射によって誘導される防御レベル、およびＦ１−ＶのみまたはＰｒｏｔｏｌｌｉｎのみを鼻内に投与したコントロールマウスと比較した。これらの実験において、２０μｇ用量のＦ１−Ｖで免疫したマウスに対する結果のみを、図４および５に示す。３５日目、そして１７０ ＬＤ５０ Ｙ．ｐｅｓｔｉｓの攻撃用量において、１μｇまたは２．５μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎを添加した５μｇ、２０μｇまたは５０μｇのＦ１−Ｖで鼻内に免疫したマウスは、死に対して１００％防御し、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ上に吸着されたＦ１−Ｖによって注射したマウスも同様であった。５μｇ、２０μｇまたは５０μｇのＦ１−Ｖおよび０．２５μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎで鼻内に免疫したマウスは、それぞれ、９０％、１００％、そして９０％防御され、他方、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含まない同じ用量のＦ１−Ｖで鼻内に免疫したマウスは、それぞれ、３０％、４０％、そして４０％防御されたにすぎなかった。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを受けたコントロールマウスは、攻撃後４日目より長く生存しなかった。処方されたＦ１−Ｖで免疫した全てのマウス群に対する生存率は、コントロールマウスまたは処方されないＦ１−Ｖで免疫したマウスにおける生存率と比較して、有意に高かった（フィッシャーの正確確率検定により、Ｐ≦０．０５またはそれより良い）。攻撃後５５日目の生存率は、３５日目のデータと非常に類似していた。Ｆ１−Ｖを用いて処方された２．５μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎで免疫した全てのマウスは、攻撃に対して完全に防御され、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着されたＦ１−Ｖの注射によって免疫したマウスも同様であった。５０μｇまたは２０μｇのＦ１−Ｖを用いて処方された１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎで免疫したマウスはまた、１００％防御され、ＰｒｏｔｏｌｌｉｎとＦ１−Ｖとの全ての他の組み合わせは、９０％の防御を誘導した。処方されたＦ１−Ｖで免疫した全てのマウスにおいて、上記観察された防御は、アジュバント未添加Ｆ１−Ｖで免疫したマウス（１０％〜３０％の防御）、または生存動物が存在しなかったマウスのコントロール群と比較して、有意に高かった（Ｐ≦０．０１またはそれより良い）。１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎを含むかもしくは含まない５０μｇのＦ１−Ｖで鼻内に免疫したマウス、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着された２０μｇのＦ１−Ｖを注射したマウスを、２５５ ＬＤ５０のエアロゾル化生存Ｙ．ｐｅｓｔｉｓに対する全身曝露によって５５日目に攻撃した。それぞれ、８０％、２０％および６０％のマウスが、高用量の致死的攻撃に対して生存し、他方、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを与えられたコントロールマウスは、全て死亡した。処方されたＦ１−Ｖによる免疫は、コントロールマウスと比較して、死に対して有意な防御を誘導した（鼻へのＰｒｏｔｏｌｌｉｎ添加Ｆ１−Ｖについて、Ｐ≦０．００１；注射Ｆ１−Ｖについて、Ｐ≦０．０１）。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ添加Ｆ１−Ｖでの鼻免疫はまた、Ｆ１−Ｖのみでの免疫よりも、死に対するマウスの防御において有意に良好であったが（Ｐ≦０．０５）、これは、上記誘導された防御が、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含まない鼻内へのＦ１−Ｖによって誘導されるよりも有意に良好ではない場合の注射Ｆ１−Ｖに対する事実ではなかった（Ｐ＝０．９５）。
【００６９】
（実施例５）
（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ：ペスト抗原で免疫後のサイトカインプロファイルの決定）
鼻内投与Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎまたは注射Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）アジュバント添加Ｆ１−Ｖワクチンによって誘導される適応免疫応答の表現型（１型または２型）を比較するために、免疫したマウスの選択された群からの脾臓細胞を、Ｆ１−Ｖを用いて、インビトロで再刺激し、そして培養上清中に放出されたＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−５サイトカインの量を、測定した（図６）。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（１μｇ）と混合されたＦ１−Ｖ（５０μｇ）で鼻内に免疫したマウスからの脾臓細胞は、高レベルのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を分泌することによって、インビトロ再刺激に応答し、そして非常に低い量のＩＬ−５がまた、検出された。対照的に、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ上に吸着されたＦ１−Ｖ（２０μｇ）の注射によって免疫したマウスからの脾臓細胞は、比較的少量のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分泌することによって応答したが、かなりの量のＩＬ−５が検出された。従って、Ｆ１−Ｖ抗原を用いて処方された（アジュバント添加された）Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎの鼻内投与によって誘導されるサイトカインプロファイルは、１型免疫応答を誘導することが確かであり、一方、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ(登録商標）を用いて処方されたＦ１−Ｖ抗原の筋内注射によって誘導されたサイトカインプロファイルは、２型応答であることが、かなり確かである。
【００７０】
（実施例６）
(Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ：炭疽免疫原性処方物は、免疫応答の中和を引き起こす)
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの組み換え防御抗原（ｒＰＡ）を用いたＰｒｏｔｏｌｌｉｎ処方物を、細胞培養物アッセイ系を用いて、ＰＡ媒介性マクロファージ殺傷の統計学的に有意な減少を誘導可能な免疫応答を誘導する能力に対して評価した。１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎと混合した５μｇまたは２５μｇのｒＰＡ（Ｌｉｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で鼻内に免疫したマウス（０日目、１４日目）は、５μｇまたは２５μｇのｒＰＡのみで鼻内に免疫したマウスの特異的抗ｒＰＡ血清ＩｇＧレベルおよび特異的抗ｒＰＡ肺ＩｇＡよりも、有意に高い特異的抗ｒＰＡ血清ＩｇＧレベルおよび特異的抗ｒＰＡ肺ＩｇＡレベルを示し（Ｐ＜０．０５）（図７）、このことは、低レベルのＰｒｏｔｏｌｌｉｎのアジュバント化（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）はまた、ｒＰＡ抗原を用いても有効であることを示す。上記ＰｒｏｔｏｌｌｉｎのみおよびｒＰＡのみのコントロール群における粘膜ＩｇＡレベルは、このアッセイの検出レベルよりも低かった。
【００７１】
特異的抗ｒＰＡ抗体がＰＡ媒介性マクロファージ貪食を中和する能力を評価した。炭疽ＰＡ中和アッセイをまた、これらの動物からの血清サンプルおよび肺洗浄流体サンプルを用いて、記載されるように実施した。このアッセイのために、２×１０５ ＲＡＷ２６４．７細胞を、滅菌９６ウェルプレートにプレートし、そして３７℃で２４時間、５％ＣＯ２中でインキュベートした。（ＰＡ免疫マウスからの）血清サンプルまたは肺洗浄流体サンプルの連続希釈液を、ＰＡ溶液とともに１時間、３７℃でインキュベートし、次いで、細胞を含むウェルに添加した。その後、ＬＦの溶液を上記ウェルに添加して、上記プレートを、３７℃で、５％ＣＯ２中で４時間インキュベートした。次いで、（細胞生存度を測定するための）ＭＴＴの溶液を、各ウェルに添加し、そして上記プレートを、さらに４時間、３７℃で５％ＣＯ２中でインキュベートした。上記反応を、５０％ ＤＭＦ（ｐＨ ４．３）中の２０％ ＳＤＳ添加することによって停止し、そして上記プレートを、６９０ｎｍを参照として、５７０ｎｍで読んだ。このアッセイは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを有するｒＰＡのプロテオソームアジュバント化鼻内ワクチンが、筋内ミョウバンアジュバント化ワクチンがそうであるのに匹敵する、ｒＰＡ活性を中和する抗体レベルを誘導することを示した（図８）。しかし、サンプル間の顕著な差は、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ処方物ｒＰＡで免疫したマウスからの肺洗浄物サンプル中に存在する、中和ＩｇＡ抗体の存在である。
【００７２】
（実施例７）
（さらなる炭疽ワクチン処方物の調製）
鼻Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ炭疽ワクチンを、免疫の前に、上記炭疽ＰＡ抗原と、ＬＰＳを添加した可溶性の事前に形成したプロテオソーム（すなわち、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ）とを混合することによって作製した。ｒＰＡおよびｒＰＡアンカー抗原の両方を、いくつかのＰｒｏｔｏｌｌｉｎの様式で評価して、最適なＰｒｏｔｏｌｌｉｎ：免疫抗原の比を有する処方物を決定した。例えば、コントロール処方物としては、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみまたは（必要に応じて）１つ以上のコントロール抗原（例えば、組み換え連鎖球菌性タンパク質）と混合したＰｒｏｔｏｌｌｉｎが挙げられ、このコントロール抗原は、疎水性アンカー配列を含むかまたは欠いている。従って、種々の供給源からのＬＰＳを含有するＰｒｏｔｏｌｌｉｎの処方物、種々のＰｒｏｔｏｌｌｉｎ：ＬＰＳの比および種々のＰｒｏｔｏｌｌｉｎ：ｒＰＡ抗原の比を評価する。ｒＰＡアンカーは、非常に低いレベルのＬＰＳ（２重量％未満）を有するプロテオソームを用いて処方する。特定の実施形態において、上記プロテオソームアジュバント調製物は、添加された外因性ＬＰＳを有しない。これまで、プロテオソームは、それ自体が、前臨床毒性研究において、ならびに第１相および第２相の安全なプロテオソーム鼻インフルエンザワクチンの免疫原性実験的攻撃試験で、５００人近くにおいて使用されている。
【００７３】
ＬＰＳの好ましい様式のプロセス開発（ＬＰＳ微生物性供給源に関して）およびＰｒｏｔｏｌｌｉｎの好ましい処方（ＬＰＳ供給源およびプロテオソーム：ＬＰＳの比に関して）を、ＬＰＳ供給源に関するＰｒｏｔｏｌｌｉｎの成分およびプロテオソーム：ＬＰＳの比を同定するために設計した免疫原性研究の結果に基づいて、実施する。ＬＰＳのための好ましい微生物供給源の発酵の後、ＬＰＳ精製および分析を行う。次いで、選択されたＬＰＳを、選択された比でプロテオソームＯＭＰ粒子と混合して、好ましいＰｒｏｔｏｌｌｉｎを形成する。上記ＬＰＳと上記ＯＭＰとの会合の程度は、キャピラリー電気泳動を用いた、特別に開発された「遊離−対−結合」アッセイ、ＬＰＳ「スパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）」研究および必要に応じて他の分析において、立証される。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎの特徴付けとしては、代表的に、ＫＤＯ、ＮＭＲおよび銀染色ＰＡＧＥを用いたＬＰＳ含量の分析、プロテオソームＯＭＰ含量のためには、必要に応じて、ＬＣ−ＭＳ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（Ｃ．Ｂｌｕｅ ＆ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ ｗ／ＭＡｂ ＆ ＰＡｂｓ）、Ｎ−末端配列決定、アミノ酸分析、ＬｏｗｒｙまたはＢＣＡによる総タンパク質およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いた分析、そして残査ＬＰＳ、核酸および界面活性剤のためには、それぞれ、ＫＤＯアッセイ、核酸アッセイおよびＨＰＬＣアッセイを用いた分析が挙げられる。
【００７４】
（実施例８）
（炭疽に対する免疫を評価するための細胞媒介性免疫アッセイ）
プロテオソームベースのＰＡワクチンでの免疫後に誘導される細胞性免疫応答を、種々の方法を用いて研究する。例えば、Ｔ細胞由来のサイトカインを、マウスの脾臓および／またはリンパ節から単離された、ＰＡ再刺激した精製Ｔ細胞または濃縮Ｔ細胞において評価する。１型（例えば、ＩＦＮ−γ）サイトカインおよび２型（例えば、ＩＬ−４およびＩＬ−５）サイトカインを、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴを含む１つ以上の方法によって決定し、そして細胞内サイトカインを、フローサイトメトリーによって決定した。ＰＢＭＣ由来のＰＡ再刺激したＰＢＭＣ Ｔ細胞の増殖を使用して、ウサギサイトカインに特異的な試薬の欠如に起因するウサギにおけるＣＭＩ応答を評価する。Ｔリンパ球増殖アッセイを使用して、種々の動物モデルにおいて、クローン性増殖に対する免疫の効果および記憶リンパ球の存在を測定する。動物を犠牲にした後、縦隔リンパ節および頚リンパ節を、標準的な技術を用いて外科的に取り出し、上記リンパ球を単離し、培養して、そしてその単離細胞にＰＡを添加する。増殖を、Ｈ３−チミジンの取り込みによって測定する。偽ワクチンで免疫した動物由来の細胞を、ネガティブコントロールとして使用する。アッセイ結果を、粘膜免疫に関与し、そして炭疽攻撃研究において決定されるように免疫の効力に関連する、リンパ節におけるＴ細胞分化に対する免疫の効果を決定するために使用する。
【００７５】
上述から、本発明の具体的な実施形態が、本明細書中で例示の目的のために記載されるが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（２．５μｇ、１μｇまたは０．２５μｇ）を含むかもしくは含まないかで、５０μｇ、２０μｇまたは５μｇのＦ１−Ｖを用いて鼻内に２回免疫したマウス、またはミョウバン（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標））に吸着されたＦ１−Ｖを２０μｇ用いて粘膜内に注射したマウスからの血清ＩｇＧ力価を示す。上記マウスの半分を、一次免疫後３５日目に、そして他の半分を５５日目に安楽死させた。力価を、特異的抗体濃度（血清ＩｇＧに対してμｇ／ｍｌ；肺のＩｇＡおよびＩｇＧに対してｎｇ／ｍｌ）の幾何平均値として表し、そして９５％信頼限界を示す。
【図２】図２は、図１に記載されたように免疫したマウスからの肺ＩｇＧ力価を示す。
【図３】図３は、図１に記載されたように免疫したマウスからの肺ＩｇＡ力価を示す。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、エアロゾル化Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｉｔｉｓの致死用量を用いた攻撃に対するマウスの生存を示す。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（０．２５μｇ、１μｇまたは２．５μｇ）もしくは含まないかで鼻内に、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着されて筋内に、２０μｇのＦ１−Ｖで２回免疫したマウスを、一次免疫後（Ａ）３５日目または（Ｂ）５５日目に、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓの１７０ＬＤ５０に対する全身曝露によって攻撃した。全ての研究において、（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを受けた）全てのコントロールマウスは、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓに攻撃された場合に死亡し、使用した接種材料が致死的であったことを確認した。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、エアロゾル化Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｉｔｉｓの致死用量を用いた攻撃に対するマウスの生存を示す。Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（０．２５μｇ、１μｇまたは２．５μｇ）もしくは含まないかで鼻内に、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着されて筋内に、２０μｇのＦ１−Ｖで２回免疫したマウスを、一次免疫後（Ａ）３５日目または（Ｂ）５５日目に、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓの１７０ＬＤ５０に対する全身曝露によって攻撃した。全ての研究において、（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを受けた）全てのコントロールマウスは、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓに攻撃された場合に死亡し、使用した接種材料が致死的であったことを確認した。
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂは、エアロゾル化Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｉｔｉｓの致死用量を用いた攻撃に対するマウスの生存を示す。１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎを含むかもしくは含まないかで鼻内に、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着されて筋内に、５０μｇのＦ１−Ｖで２回免疫したマウスを、（Ａ）一次免疫後５５日目に、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓの２５５ＬＤ５０に対する全身曝露によって攻撃した；（Ｂ）は、１７０致死用量のエアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓで一次免疫後、３５日目および５５日目（異なる群のマウス）に攻撃したマウスの生存を示す。マウスを、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（０．２５μｇ、１μｇまたは２．５μｇ）もしくは含まないかで、鼻内に、５μｇのＦ１−Ｖで２回免疫した。全てのコントロールマウス（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを受けたマウス）は、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓで攻撃された場合に死亡し、使用した接種材料が致死的であったことを確認した。
【図５Ｂ】図５Ａおよび図５Ｂは、エアロゾル化Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｉｔｉｓの致死用量を用いた攻撃に対するマウスの生存を示す。１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎを含むかもしくは含まないかで鼻内に、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着されて筋内に、５０μｇのＦ１−Ｖで２回免疫したマウスを、（Ａ）一次免疫後５５日目に、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓの２５５ＬＤ５０に対する全身曝露によって攻撃した；（Ｂ）は、１７０致死用量のエアロゾル化Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓで一次免疫後、３５日目および５５日目（異なる群のマウス）に攻撃したマウスの生存を示す。マウスを、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（０．２５μｇ、１μｇまたは２．５μｇ）もしくは含まないかで、鼻内に、５μｇのＦ１−Ｖで２回免疫した。全てのコントロールマウス（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎのみを受けたマウス）は、Ｙ．ｐｅｓｉｔｉｓで攻撃された場合に死亡し、使用した接種材料が致死的であったことを確認した。
【図６】図６は、抗原ＦＩ−Ｖを用いてインビボで刺激した脾臓細胞から放出された、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−５の量を示す。脾臓細胞を、免疫後３５日目に、１μｇのＰｒｏｔｏｌｌｉｎを含むかもしくは含まないかで、５０μｇのＦ１−Ｖで鼻内に免疫したマウス、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着した２０μｇのＦ１−Ｖを筋内に注射したマウスから収集した。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（１μｇ）または含まないで混合した、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の５μｇまたは２５μｇの組み換え防御抗原（ｒＰＡ）で鼻内に免疫した（０日目および１４日目）マウスにおける、血清ＩｇＧレベルおよび肺ＩｇＡレベルを示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎを含むか（１μｇ）または含まないで混合した、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の５μｇまたは２５μｇの組み換え防御抗原（ｒＰＡ）で鼻内に免疫した（０日目および１４日目）マウスにおける、血清ＩｇＧレベルおよび肺ＩｇＡレベルを示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎと混合したｒＰＡで免疫したマウス由来の血清洗浄流体および肺洗浄流体を用いた、炭疽中和アッセイの結果を示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎと混合したｒＰＡで免疫したマウス由来の血清洗浄流体および肺洗浄流体を用いた、炭疽中和アッセイの結果を示す。
【図９】図９は、リポソーム（鼻内（ｉ．ｎ．））、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（鼻内）、またはＡｌｈｙｄｒｐｇｅｌ（登録商標）（腹腔内（ｉ．ｐ．））と混合したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ由来の１５μｇの組み換え糸状赤血球凝集素（ｒＦＨＡ）で免疫した（１日目、２１日目および３１日目）マウスにおける、血清ＩｇＧを示す。コントロールとして、マウスを、ＱｕａｄｒａｃｅｌＴＭで腹腔内に（ポジティブ）、そして賦形剤ＰＢＳ単独で鼻内に（ネガティブ）免疫した。ＱｕａｄｒａｃｅｌＴＭ（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｌｔｄ．）は、抗原のなかでもとりわけ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ ＦＨＡを含有するワクチンである。力価を、最後の免疫後７日目（３８日目）に収集した血清における抗ｒＦＨＡレベルを測定することによって、決定した（１日目のマウスからの血清中に見出された（存在すれば）バックグラウンド力価レベル未満）。
【図１０】図１０は、図９について記載されたのと同じ組成物において処方されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ由来の１５μｇの組み換え糸状赤血球凝集素（ｒＦＨＡ）で免疫した（１日目、２１日目および３１日目）マウスにおける、唾液ＩｇＡを示す。
【図１１】図１１は、図９について記載されたように免疫したマウス由来のプールした血清における、抗ｒＦＨＡ血清ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧｌ）を示す。
【図１２】図１２は、最後の免疫後１１日目（４２日目）にエアロゾル化Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｉｓで攻撃した場合の、図９について記載されたように免疫したマウスの肺において見られる、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓレベルを示す。肺のカウントを、エアロゾル攻撃後１日目、３日目、７日目および１４日目に測定した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に対して免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、抗原に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有し、該抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓまたはＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来であり、それにより、該抗原に対して免疫応答が誘導される、方法。
【請求項２】
微生物感染を処置または予防するための方法であって、該方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有し、該抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓまたはＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来であり、それにより、微生物感染が処置または予防される、方法。
【請求項４】
前記抗原は、組み換え抗原である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の防御抗原である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来のＦ１抗原もしくはＶ抗原、またはそれらの組み合わせである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｆ１抗原およびＶ抗原は、Ｆ１−Ｖ抗原融合タンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫原性組成物は、複数の異なる抗原を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の抗原は、ウイルス、微生物、寄生生物、トキシンまたはそれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫原性組成物は、粘膜、経腸、非経口、経皮、経粘膜、鼻および吸入からなる群より選択される経路によって投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫原性組成物は、鼻に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プロテオソームタンパク質の百分率としての前記リポサッカリド最終重量含量は、約１％〜約５００％の範囲にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロテオソームおよびリポサッカリドは、同じ微生物から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロテオソームおよびリポサッカリドは、異なる微生物由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記リポサッカリドは、グラム陰性細菌由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記リポサッカリドは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるグラム陰性細菌由来である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテオソームは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテオソームは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来であり、そして前記リポサッカリドは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、約５：１〜約１：５００の範囲にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、少なくとも１：２である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、少なくとも１：１０である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫原性組成物は、防御免疫応答を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫原性組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤をさらに含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有する組成物であって、該抗原は、Ｆ１−Ｖ抗原融合タンパク質である、組成物。
【請求項２５】
プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有する組成物であって、該抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の防御抗原である、組成物。
【請求項２６】
前記組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤をさらに含有する、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
プロテオソームタンパク質の百分率としての前記リポサッカリド最終重量含量は、約１％〜約５００％の範囲にある、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記プロテオソームおよびリポサッカリドは、同じ微生物から得られる、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２９】
前記プロテオソームおよびリポサッカリドは、異なる微生物由来である、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項３０】
前記プロテオソームは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来であり、そして前記リポサッカリドは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来である、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項３１】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、約５：１〜約１：５００の範囲にある、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項３２】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、少なくとも１：２である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、少なくとも１：１０である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
抗原に対して免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、抗原に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有し、該抗原は、ポックスウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、フィロウイルスまたはピコルナウイルス由来であり、それにより、該抗原に対して免疫応答が誘導される、方法。
【請求項３５】
微生物感染を処置または予防するための方法であって、該方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有し、該抗原は、ポックスウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、フィロウイルスまたはピコルナウイルス由来であり、それにより、微生物感染が処置または予防される、方法。
【請求項３６】
前記抗原は、痘瘡ウイルス由来である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗原は、ワクシニアウイルス由来である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
抗原に対して免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、抗原に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有し、該抗原は、トキシンであり、それにより、該トキシンに対して免疫応答が誘導される、方法。
【請求項３９】
前記抗原は、ボツリヌストキシンまたはそのフラグメントである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗原は、リシントキシンまたはそのフラグメントである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗原は、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢまたはそのフラグメントである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
抗原に対して免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、抗原に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、アジュバントおよび抗原を含有し、該アジュバントは、プロテオソームおよびリポサッカリドを含み、そして該アジュバント：抗原の比は、約１：５〜約１：５００の範囲にあり、それにより、該抗原に対して免疫応答が誘導される、方法。
【請求項４３】
微生物感染を処置または予防するための方法であって、該方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、アジュバントおよび抗原を含有し、該アジュバントは、プロテオソームおよびリポサッカリドを含み、そして該アジュバント：抗原の比は、約１：５〜約１：５００の範囲にあり、それにより、微生物感染が処置または予防される、方法。
【請求項４４】
前記抗原は、微生物抗原、ウイルス抗原またはトキシン抗原のうちの少なくとも１つである、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項１】
抗原に対して免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、抗原に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有し、該抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓまたはＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来であり、それにより、該抗原に対して免疫応答が誘導される、方法。
【請求項２】
微生物感染を処置または予防するための方法であって、該方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有し、該抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓまたはＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来であり、それにより、微生物感染が処置または予防される、方法。
【請求項４】
前記抗原は、組み換え抗原である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の防御抗原である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来のＦ１抗原もしくはＶ抗原、またはそれらの組み合わせである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｆ１抗原およびＶ抗原は、Ｆ１−Ｖ抗原融合タンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫原性組成物は、複数の異なる抗原を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の抗原は、ウイルス、微生物、寄生生物、トキシンまたはそれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫原性組成物は、粘膜、経腸、非経口、経皮、経粘膜、鼻および吸入からなる群より選択される経路によって投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫原性組成物は、鼻に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プロテオソームタンパク質の百分率としての前記リポサッカリド最終重量含量は、約１％〜約５００％の範囲にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロテオソームおよびリポサッカリドは、同じ微生物から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロテオソームおよびリポサッカリドは、異なる微生物由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記リポサッカリドは、グラム陰性細菌由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記リポサッカリドは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるグラム陰性細菌由来である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテオソームは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテオソームは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来であり、そして前記リポサッカリドは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、約５：１〜約１：５００の範囲にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、少なくとも１：２である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、少なくとも１：１０である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫原性組成物は、防御免疫応答を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫原性組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤をさらに含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有する組成物であって、該抗原は、Ｆ１−Ｖ抗原融合タンパク質である、組成物。
【請求項２５】
プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有する組成物であって、該抗原は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の防御抗原である、組成物。
【請求項２６】
前記組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤をさらに含有する、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
プロテオソームタンパク質の百分率としての前記リポサッカリド最終重量含量は、約１％〜約５００％の範囲にある、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記プロテオソームおよびリポサッカリドは、同じ微生物から得られる、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２９】
前記プロテオソームおよびリポサッカリドは、異なる微生物由来である、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項３０】
前記プロテオソームは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来であり、そして前記リポサッカリドは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来である、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項３１】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、約５：１〜約１：５００の範囲にある、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項３２】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、少なくとも１：２である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記免疫原性組成物のプロテオソーム：抗原の比は、少なくとも１：１０である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
抗原に対して免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、抗原に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有し、該抗原は、ポックスウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、フィロウイルスまたはピコルナウイルス由来であり、それにより、該抗原に対して免疫応答が誘導される、方法。
【請求項３５】
微生物感染を処置または予防するための方法であって、該方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有し、該抗原は、ポックスウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、フィロウイルスまたはピコルナウイルス由来であり、それにより、微生物感染が処置または予防される、方法。
【請求項３６】
前記抗原は、痘瘡ウイルス由来である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗原は、ワクシニアウイルス由来である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
抗原に対して免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、抗原に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、プロテオソーム、リポサッカリドおよび抗原を含有し、該抗原は、トキシンであり、それにより、該トキシンに対して免疫応答が誘導される、方法。
【請求項３９】
前記抗原は、ボツリヌストキシンまたはそのフラグメントである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗原は、リシントキシンまたはそのフラグメントである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗原は、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢまたはそのフラグメントである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
抗原に対して免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、抗原に対する免疫応答の誘導を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、アジュバントおよび抗原を含有し、該アジュバントは、プロテオソームおよびリポサッカリドを含み、そして該アジュバント：抗原の比は、約１：５〜約１：５００の範囲にあり、それにより、該抗原に対して免疫応答が誘導される、方法。
【請求項４３】
微生物感染を処置または予防するための方法であって、該方法は、微生物感染の処置または予防を必要としている被験体に、治療有効量の免疫原性組成物を投与する工程を包含し、該免疫原性組成物は、アジュバントおよび抗原を含有し、該アジュバントは、プロテオソームおよびリポサッカリドを含み、そして該アジュバント：抗原の比は、約１：５〜約１：５００の範囲にあり、それにより、微生物感染が処置または予防される、方法。
【請求項４４】
前記抗原は、微生物抗原、ウイルス抗原またはトキシン抗原のうちの少なくとも１つである、請求項４２または４３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００６−５２５３７３（Ｐ２００６−５２５３７３Ａ）
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１４３１４（Ｐ２００６−５１４３１４）
【出願日】平成１６年５月５日（２００４．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４２３６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９８６３６
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０２２９６９１４）アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月５日（２００４．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４２３６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９８６３６
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０２２９６９１４）アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック (9)
【Ｆターム（参考）】
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