ヘムタンパク質ポリマー製造用モノマーおよびそのモノマーから得られるポリマー
【課題】大分子量を有するタンパク質を規則的に配列させることにより得られる、さらに大分子量を有するタンパク質ポリマーの提供を提供する。
【解決手段】一般式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩を用いることにより、大分子量を有するタンパク質ポリマーを得ることができる。前記式（Ｉ）中、 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、は低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、Ｙは特定の基を、Ｘはヘムタンパク質の変異体を意味する。
【解決手段】一般式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩を用いることにより、大分子量を有するタンパク質ポリマーを得ることができる。前記式（Ｉ）中、 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、は低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、Ｙは特定の基を、Ｘはヘムタンパク質の変異体を意味する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘムタンパク質ポリマー製造用モノマーおよびそのモノマーから得られるポリマーに関する。より詳細には、本発明は、ヘムタンパク質ポリマー製造用モノマー、およびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、小分子量を有する有機化合物を様々な相互作用、例えば配位結合、共有結合、イオン結合等により規則的に配列させ、大分子量を有する有機化合物を製造することが試みられている（例えば、非特許文献１参照）。このようにして製造された大分子量の有機化合物は、様々な機能を有するナノデバイスとしての利用が期待されている。
【０００３】
一方、もともと大分子量を有する有機化合物、例えばタンパク質を様々な相互作用、例えば配位結合、共有結合、イオン結合等により規則的に配列させ、さらに大分子量を有する有機化合物を製造することは、非常に困難である。この困難さの理由としては、高次立体構造を有するタンパク質の表面に存在する官能基に対して適切に化学修飾を施すことが困難であること、かつ、そのように化学修飾されたタンパク質同士を相互作用させるようなしくみを開発するのが困難であることなどが挙げられる。
【非特許文献１】J.-M. Lehn, "Supramolecular Chemistry: Concepts and Perspectives" ドイツ、Weinheim、VCH社出版、１９９５年.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、大分子量を有するタンパク質を規則的に配列させることにより得られる、さらに大分子量を有するタンパク質ポリマーの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一般式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩である。
【０００６】
【化９】
【０００７】
前記式（Ｉ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【０００８】
【化１０】
【０００９】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００１０】
また、本発明は、一般式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩である。
【００１１】
【化１１】
【００１２】
前記式（ＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【００１３】
【化１２】
【００１４】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味する。
【００１５】
また、本発明は、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩である。
【００１６】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩および前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩は、ヘムタンパク質ポリマー製造用モノマーとして有用である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩は、大分子量を有する。そのヘムタンパク質モノマーまたはその塩を、ヘムを利用して規則的に配列させることにより、さらに大分子量を有するヘムタンパク質ポリマーを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、前記のように、前記一般式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩である。
【００１９】
また、本発明は、前記のように、前記一般式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩である。
【００２０】
また、本発明は、前記のように、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩である。なお、前記ヘムタンパク質ポリマーまたはその塩を構成する、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩は、１種類であっても、２種類以上の混合物であってもよい。また、前記ヘムタンパク質ポリマーは、一般式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーであるのが好ましい。
【００２１】
【化１３】
【００２２】
前記式（ＩＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【００２３】
【化１４】
【００２４】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００２５】
本発明において、「低級」は特に指示がなければ、炭素原子が１〜６個、好ましくは炭素原子１〜４個を意味する。
【００２６】
「低級アルキル基」および「ハロゲン原子で置換された低級アルキル基」中の「低級アルキル基」としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等のような直鎖状もしくは分岐鎖状の炭素数１〜６のアルカンの残基を意味する。低級アルキル基の好ましい例としては、炭素数１〜５のアルキルが挙げられる。好ましい炭素数１〜５のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
【００２７】
「低級アルケニル基」としては、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−、２−もしくは３−ブテニル、１−、２−、３−もしくは４−ペンテニル、１−、２−、３−、４−もしくは５−へキセニル等の炭素数２〜６個を有する直鎖または分枝鎖アルケニル基が挙げられる。好ましい低級アルケニル基としては、ビニルが挙げられる。
【００２８】
「ハロゲン原子」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられ、中でもフッ素が好ましい。
【００２９】
「ハロゲン原子で置換された低級アルキル基」の例としては、前記低級アルキル基の１以上の水素原子が、前記ハロゲン原子で置き換えられたものを意味する。前記ハロゲン原子で置換された低級アルキル基の好ましい例としては、ヨウ化メチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル等が挙げられる。好ましいハロゲン原子で置換された低級アルキル基としては、トリフルオロメチルが挙げられる。
【００３０】
本発明のモノマーまたはポリマーおよびその塩は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【００３１】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩、および前記式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーまたはその塩において、前記ヘムタンパク質は、ヘムを１以上有するタンパク質であれば特に限定されないが、例えば、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼが挙げられる。前記シトクロムとしては、例えばシトクロムｂ562、シトクロムｂ5、シトクロムＰ４５０CAMが挙げられ、中でもシトクロムｂ562が好ましい。前記ヘモグロビンとしては、例えばヘモグロビン（human）、ヘモグロビン（bovine）、ヘモグロビン(equine)、ヘモグロビン(rat)が挙げられ、中でもヘモグロビン（human）が好ましい。前記ミオグロビンとしては、例えばミオグロビン(sus scrofa)、ミオグロビン(equine)、ミオグロビン(human)、ミオグロビン（sperm whale）が挙げられ、中でもミオグロビン(sus scrofa)が好ましい。前記ペルオキシダーゼとしては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼ、カタラーゼが挙げられ、中でも西洋ワサビペルオキシダーゼが好ましい。
【００３２】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（Ｉ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味するのが好ましい。
【００３３】
式
【００３４】
【化１５】
【００３５】
で表わされるヘムタンパク質の変異体は、前記ヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、シトクロムの場合、（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトクロムとして機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号１で表わされるアミノ酸配列は、天然のシトクロムb562のアミノ酸配列である。天然のシトクロムb562のアミノ酸配列は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1QPU（１９９９年６月２日付）のものが挙げられ、前記配列番号１で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1QPUのものに対応する。システインに置き換えられる前記１つのアミノ酸残基は、前記シトクロムが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記シトクロムに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。このような置換を行うため、例えば配列番号１のアミノ酸配列において、第１〜１０６番目のアミノ酸残基、好ましくは第６０、６２、６３、６６、６７、７０、７３、７４、７６、７８、８９、９０、９６、９９および１００番目のアミノ酸残基、より好ましくは第６０、第６３、第６６、第６７および第１００番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えることができる。
【００３６】
また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、ヘモグロビンの場合、（ａ）配列番号９または配列番号１０で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号９または配列番号１０で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモグロビン（human）として機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号９で表わされるアミノ酸配列は、天然のヘモグロビンαサブユニットのアミノ酸配列であり、前記配列番号１０で表わされるアミノ酸配列は、天然のヘモグロビンのβサブユニットのアミノ酸配列である。天然のヘモグロビンのアミノ酸配列は、配列番号９および配列番号１０で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1GZX（２００２年７月８日付）のものが挙げられ、前記配列番号９および配列番号１０で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1GZXのものに対応する。システインに置き換えらえる前記１つのアミノ酸残基は、前記ヘモグロビンが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記ヘモグロビンに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。
【００３７】
また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、ミオグロビンの場合、（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつミオグロビンとして機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列は、天然のミオグロビン(sus scrofa)のアミノ酸配列である。天然のミオグロビンのアミノ酸配列は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号１MWD（１９９８年８月１１日付）のものが挙げられ、前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号１MWDのものに対応する。システインに置き換えらえる前記１つのアミノ酸残基は、前記ミオグロビンが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記ミオグロビンに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。このような置換を行うため、例えば配列番号２のアミノ酸配列において、第１〜１５３番目のアミノ酸残基、好ましくは第８、１２、１６、５３，１０２，１０６，１１３，１１７，１２１，１２６，１３３，１４０および１４７番目のアミノ酸残基、より好ましくは第１３３および第１４０番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えることができる。
【００３８】
また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、（ａ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号３で表わされるアミノ酸配列は、天然の西洋ワサビペルオキシダーゼのアミノ酸配列である。天然の西洋ワサビペルオキシダーゼのアミノ酸配列は、配列番号３で表わされるものに限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1ATJ（１９９８年２月４日付）のものが挙げられ、前記配列番号３で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1ATJのものに対応する。システインに置き換えられる前記１つのアミノ酸残基は、前記西洋ワサビペルオキシダーゼが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記西洋ワサビペルオキシダーゼに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。
【００３９】
前記変異体中、前述のように、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００４０】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（Ｉ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるのがより好ましい。
【００４１】
また、前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（Ｉ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるのがより好ましい。
【００４２】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（Ｉ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるのがさらに好ましい。
【００４３】
また、前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（Ｉ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるのがさらに好ましい。
【００４４】
また、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味するのが好ましい。
【００４５】
前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるのがより好ましい。
【００４６】
また、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるのがより好ましい。
【００４７】
前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるのがさらに好ましい。
【００４８】
また、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるのがさらに好ましい。
【００４９】
また、本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記ヘムタンパク質モノマーが、前記式（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味する式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーであるのが好ましい。
【００５０】
本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記ヘムタンパク質モノマーが、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムである式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーがより好ましい。
【００５１】
本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記ヘムタンパク質モノマーが、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムである式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーがより好ましい。
【００５２】
本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記ヘムタンパク質モノマーが、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンである式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーがさらに好ましい。
【００５３】
また、本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記ヘムタンパク質モノマーが、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンである式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーがさらに好ましい。
【００５４】
また、前記式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記式（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味するヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩が好ましい。
【００５５】
また、前記式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩、
ならびに、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩からなる群から選択される１以上がより好ましい。
【００５６】
前記式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩、
ならびに
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩からなる群から選択される１以上がさらに好ましい。
【００５７】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーの塩、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーの塩、および式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーの塩は、前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマー、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマー、および式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーの、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩がそれぞれ挙げられる。
【００５８】
次に、本発明の式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法の一例を説明する。
【００５９】
その製造方法は、一般式（ＩＶ）で表わされるヘムリンカーと、一般式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質とを反応させて、請求項１に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩を得ることを特徴とする（スキーム１参照）。
【００６０】
【化１６】
【００６１】
前記式（Ｉ）および式（ＩＶ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式（Ｉ）および式（Ｖ）中、式
【００６２】
【化１７】
【００６３】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００６４】
前記式（ＩＶ）中、低級アルキル基および低級アルケニル基の定義は、前記のとおりである。
【００６５】
前記製造方法において、式（ＩＶ）で表わされるヘムリンカーと、式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質との反応は、不活性ガス（例えばアルゴン、窒素等）雰囲気下に、触媒存在下に溶媒中で行うことができる。前記触媒としては、例えば酸、塩基等が挙げられる。前記酸としては塩酸、硫酸、硝酸、トルエンスルホン酸、酢酸等が挙げられる。前記塩基としては、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、ホウ酸、リン酸、水素化ナトリウム、水素化カルシウム等が挙げられる。
【００６６】
前記製造方法において、反応溶媒は限定されないが、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液）等が挙げられる。前記溶媒は、１種類を用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。前記溶媒としては、ジメチルスルホキシドおよび緩衝液から選択されるのが好ましく、ジメチルスルホキシドおよびトリス塩酸緩衝液の混合物がより好ましい。
前記製造方法において、反応温度は限定されないが、例えば０℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜６０℃、より好ましくは２０℃〜３０℃である。
【００６７】
前記製造方法において、反応時間は限定されないが、例えば３０分〜２４時間、好ましくは２時間〜１０時間、より好ましくは５時間〜８時間である。
【００６８】
前記製造方法において、式（ＩＶ）で表されるヘムリンカーに対し使用される式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質のモル比（式（ＩＶ）で表されるヘムリンカー：式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質）は、例えば１００：１〜５：１、好ましくは５０：１〜１０：１、より好ましくは２０：１〜１０：１である。
【００６９】
前記製造方法において、前記式（ＩＶ）で表されるヘムリンカーは、市販で入手してもよいし、公知文献を参照して自家製造してもよい。
【００７０】
前記製造方法において、前記式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質は、例えば以下のようにして製造することができる。
【００７１】
前記式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質の遺伝子は、天然のヘムタンパク質の遺伝子の塩基配列に基づいて、モルモットのトータルＲＮＡ等を利用してクローニングしてもよく、また、ホスホロアミダイト法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して行える。また、前記式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質の遺伝子を宿主細胞内に導入すればよい。
【００７２】
前記宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等が挙げられる。前記遺伝子導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いる方法、マイクロピペットインジェクション法等があげられる。または、宿主染色体への組込み型もしくは自律複製・分配可能な人工染色体もしくはプラスミド型を用いて、それを導入してよい。
【００７３】
前記宿主細胞内に導入する遺伝子は、宿主細胞内で恒常的または任意に発現するように、必要な調節配列と作動的に連結されていることが好ましい。前記調節配列とは、宿主細胞内において、作動的に連結された前記遺伝子の発現に必要な塩基配列であって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。前記作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。
【００７４】
また、本発明の式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法の一例を説明する。
【００７５】
その製造方法は、式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩を酸で処理することにより、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩を得ることを特徴とする（スキーム２参照）。
【００７６】
【化１８】
【００７７】
前記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【００７８】
【化１９】
【００７９】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００８０】
前記製造方法において、式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩の酸処理反応は、触媒存在下に溶媒中で行うことができる。前記触媒としては、例えば酸、塩基等が挙げられる。前記酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等が挙げられる。前記塩基としては、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等が挙げられる
前記製造方法において、反応溶媒は限定されないが、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液）等が挙げられる。前記溶媒は、１種類を用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。前記溶媒としては、ジメチルスルホキシドおよび緩衝液から選択されるのが好ましく、ジメチルスルホキシドおよびトリス塩酸緩衝液の混合物がより好ましい。
【００８１】
前記製造方法において、反応温度は限定されないが、例えば０℃〜３０℃、好ましくは０℃〜１０℃、より好ましくは３℃〜５℃である。
【００８２】
前記製造方法において、酸処理は、ｐＨが、例えば０．５〜３．０、好ましくは１．５〜２．５、より好ましくは１．８〜２．１で行うことができる。
【００８３】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩および前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法において、前記ヘムタンパク質は、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼであるのが好ましい。
【００８４】
また、本発明のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法の一例を説明する。
【００８５】
その製造方法は、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩を中性条件下で処理することにより、ヘムタンパク質ポリマーまたはその塩を得ることを特徴とする。
【００８６】
前記製造方法において、反応溶媒は限定されないが、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液）等が挙げられる。前記溶媒は、１種類を用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。前記溶媒としては、緩衝液から選択されるのが好ましく、トリス塩酸緩衝液がより好ましい。
【００８７】
前記製造方法において、反応温度は限定されないが、例えば０℃〜３０℃、好ましくは０℃〜１０℃、より好ましくは３℃〜５℃である。
【００８８】
前記製造方法において、中性条件下での処理は、ｐＨが、例えば６．０〜１０．０、好ましくは６．５〜８．５、より好ましくは７．０〜８．０で行うことができる。
【００８９】
前記本発明のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法において、前記ヘムタンパク質ポリマーは、式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーであるのが好ましい（スキーム３参照）。
【００９０】
【化２０】
【００９１】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【００９２】
【化２１】
【００９３】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００９４】
前記製造方法において、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩は、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩１種類の化合物であっても、その位置異性体である化合物またはその塩が共存する、混合物であってもよい。式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩と、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩の位置異性体である化合物またはその塩との混合物である場合、得られる式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーも、位置異性体の混合物になる。
【００９５】
また、前記本発明のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法において、前記ヘムタンパク質は、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼであるのが好ましい。
【００９６】
本発明の式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩は、前記ヘムタンパク質がシトクロム、ヘモグロビンおよびミオグロビンである場合、酸素を貯蔵する生体ポリマーとして有用である。また、前記ヘムタンパク質がペルオキシダーゼである場合、酵素の集合体として有用である。
【００９７】
本発明の式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩は、酸性もしくは塩基性条件下で、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩に分解することができる。従って、本発明のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩は、ｐＨによって集合状態を制御するｐＨ応答性タンパク質ポリマーとして有用である。
【００９８】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例により限定されない。
【００９９】
種々のスペクトルは、以下の機器を用いて測定した。
【０１００】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは日本電子ＪＥＯＬ ＥＸ２７０核磁気共鳴装置（２７０ＭＨｚ）を用いて測定し、測定溶媒の残存シグナルを内部基準として使用した。エレクトロスプレーイオン化法による飛行時間型質量分析（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）はアプライド・バイオシステム・マリナー（Applied Biosystems Mariner）ＡＰＩ−ＴＯＦワークステーション（Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を用いて測定した。紫外可視吸収スペクトルは島津製作所製自記分光高度計ＵＶ−２５５０もしくはＵＶ−３１５０を用いて測定した。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは日本分光ＪＡＳＣＯ Ｊ８２０円二色性分散計を用いて測定した。水溶液のｐＨは堀場製作所製ｐＨメーターＦ−５２を用いて測定した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）はＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡFPLCシステムにスーパーデック(Superdex）２００ １０／３００ ＧＬカラム（排除限界１．３×１０6Ｄａ）を接続し、検出にはＵＰＣ−９００検出器を用いて測定した。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）はデジタル・インスツゥルメンツ（Digital Instruments）社製ナノスコープ（Nanoscope）ＩＩＩａを用いて測定した。
【０１０１】
また、出発原料は、以下の文献を参考にして製造した。
プロトポルフィリンＩＸモノｔ−ブチルエステル２：T. Matsuo, T. Hayashi, Y. Hisaeda, J. Am. Chem. Soc. 124, 11234 (2002)。
モノＮ−Ｂｏｃ保護ジアミン類。ジアミン（２）、ジアミン(8)およびジアミン（１３）：M. Trester-Zedlitz, K. Kamada, S. K. Burley, D. Fenyo, B. T. Chait, T. W. Muir, J. Am. Chem. Soc. 125, 2416 (2003)および、R. Schneider, F. Schmitt, C. Frochot, Y. Fort, N. Lourette, F. Guillemin, J.-F. Mueller, M. Barberi-Heyob, Bioorg. Med. Chem. 13, 2799 (2005)。
Ｎ−ヨードスクシンイミド：A. Hampton, L. A. Slotin, R. R. Chawla, J. Med. Chem. 19, 1279 (1976)。
その他の一般試薬は市販品をそのまま用いた。
【実施例１】
【０１０２】
（１）式１（８）で示す化合物の製造
式１（８）で示す化合物は、以下のスキーム４に従い製造した。
【０１０３】
【化２２】
【０１０４】
（ｉ）式３（８）で表わす化合物の製造
窒素雰囲下、５０ｍＬのナス型フラスコにプロトポルフィリンＩＸモノｔ−ブチルエステル２（２５５ｍｇ，４．１×１０-4ｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン（ジアミン（８）、２０８ｍｇ，８．４×１０-4ｍｏｌ）およびＤＭＦ（２５ｍＬ）を加えて溶解させた。溶液を氷浴によって冷却し、そこへジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ，２９０ｍｇ，１．１×１０-3ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）およびトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ，１７０ｍｇ，１．７×１０-3ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）をそれぞれ加えた。この溶液を遮光下、室温にて４時間撹拌した後、再び同じ量のＤＰＰＡおよびＥｔ3ＮのＤＭＦ溶液を加えた。さらに２時間撹拌した後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／アセトン＝５／１）によって精製した。得られた固体を最少量のクロロホルムに溶解させ、そこへヘキサンを加えることによって生じた沈殿を集め、標題化合物３（８）およびその位置異性体との混合物を得た（２１８ｍｇ，６３％、紫色、固体））。
【０１０５】
1H NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ： 10.55 (s, 1H) 10.46 (s, 1H) 10.41 (s, 0.5H) 10.35 (s, 0.5H) 10.29 (s, 0.5H) 10.22 (s, 0.5H)（位置異性体の存在により、メソ-プロトンのシグナルは６つに分割した。存在比は、ピーク強度に基づき、１：１である。）, 8.56-8.42 (m, 2H) 6.44 (m, 2H) 6.19 (m, 2H) 4.59-4.49 (m, 4H) 3.68-3.46 (m, 16H) 3.36 (m, 2H) 3.11 (m, 2H) 2.96 (m, 2H) 2.89 (m, 2H) 2.45 (m, 2H) 2.36 (m, 2H) 1.40 (s, 9H) 1.38 (s, 9H) -3.27 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 850.07 (M + H)+、C49H64N6O7について計算値：850.08;
UV-vis (CHCl3)λmax / nm (吸収) 630 (0.042) 579 (0.056) 543 (0.090) 507 (0.11) 408 (1.27)。
【０１０６】
（ｉｉ）式４(８)で表わす化合物の製造
窒素雰囲気下、５０ｍＬのナス型フラスコに化合物３（８）（２０５ｍｇ，２．４×１０-4ｍｏｌ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を氷浴で冷却しながらそれぞれ加えた。その後、反応溶液を室温に戻し、撹拌した。７時間後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣へ最少量のメタノールを加えて溶解させた。そこへジエチルエーテルを加えて、生じた沈殿を集めて標題化合物４（８）およびその位置異性体との混合物を得た（１３９ｍｇ，８３％、紫色、固体）。
【０１０７】
1H NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ： 10.47 (s, 1H) 10.23 (s, 0.5H) 10.20 (s, 1H) 10.15 (s, 1H) 10.05 (s, 0.5H) 9.98 (s, 0.5H)（位置異性体の存在により、メソ-プロトンのシグナルは６つに分割した。存在比は、ピーク強度に基づき、１：１である。）, 8.45-8.31 (m, 2H) 6.42 (m, 2H) 6.17 (m, 2H) 4.63-4.55 (m, 4H) 3.59-3.45 (m, 16H) 3.34 (m, 2H) 3.05-2.96 (m, 6H) 2.47 (m, 2H) 2.39 (m, 2H) -3.80 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 693.97 (M - TFA)+, C40H49N6O5について計算値：693.85;
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 628 (0.018) 574 (0.042) 538 (0.055) 504 (0.057) 399 (0.93).
（ｉｉｉ）式５（８）で表わす化合物の製造
５０ｍＬのナス型フラスコに化合物４（８）（１０９ｍｇ，１．４×１０-4ｍｏｌ）、塩化鉄（ＩＩ）一水和物（６３０ｍｇ）および炭酸水素ナトリウム（４０ｍｇ）を加え、窒素飽和にしたクロロホルムとメタノールの混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝１０／１、２０ｍＬ）に溶解させ、加熱還流を行った。４時間後、反応混合物を室温まで冷却し、溶媒を減圧留去した。残渣をクロロホルムとメタノールの混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝２／１）に溶解させ、０．０５Ｍ塩酸で洗浄した。有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に最少量のメタノールを加えて溶解させ、そこへジエチルエーテルを加えて生じた沈殿を集め、水でよく洗浄し、乾燥させることによって標題の化合物５（８）およびその位置異性体との混合物を得た（９２ｍｇ，８０％、紫色、固体）。
【０１０８】
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 746.81 (M−Cl--HCl)+, C40H46FeN6O5について計算値：746.68;
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 627 (0.021) 538 (0.035, sh) 502 (0.053) 397 (0.91)。
【０１０９】
（ｉｖ）式１（８）で表わす化合物の製造
５０ｍＬのナス型フラスコに、化合物５（８）（８０ｍｇ，９．８×１０-5ｍｏｌ）、Ｎ−ヨードスクシンイミド（３６７ｍｇ，１．３×１０-3ｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（４７ｍｇ）を加え、アセトンと水の混合溶媒（アセトン／水＝１／１、２０ｍＬ）に溶解させた。室温にて２時間撹拌した後、溶液中のアセトンを減圧留去によって取り除いた。残りのけん濁した水溶液にジクロロメタン（３０ｍＬ×３）を加え、抽出操作を行った。有機層をまとめて０．０１Ｍ塩酸で洗浄し（３０ｍＬ×３）、有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に最少量のジクロロメタンを加えて溶解させ、そこへジエチルエーテルを加えることによって析出した沈殿を集め、表題化合物１（８）およびその位置異性体との混合物を得た（６２ｍｇ，６９％、暗紫色、固体）。
【０１１０】
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 915.01 (M−Cl-)+, C42H47FeIN6O6について計算値： 914.61;
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 627 (0.030) 538 (0.050, sh) 502 (0.072) 397 (1.35)。
【０１１１】
（２）シトクロムｂ562変異体（Ｈ６３Ｃ）の調製
部位特異的変異体の生成は、タカラ（ＴａＫａＲａ）社製ＬＡ ＰＣＲインビトロ突然変異生成キット（in vitro Mutagenesis）を用いて、付属のプロトコルに従い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行った。野生型シトクロムｂ562（以下ｂ562と略す）の発現プラスミド（ｐＵＣ１１８）を持つ大腸菌ＴＧ１を大量培養してプラスミドを調製し、Ｈ６３Ｃ変異体を調製するためのテンプレートとした。変異部位導入プライマー（配列番号５）
【０１１２】
【化２３】
【０１１３】
（下線部がミスマッチ塩基対）とＭ１３プライマーＭ４（配列番号６）（５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）、もしくはＭ１３プライマーＲＶ配列番号７（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）とＭＵＴ４プライマー配列番号８（５’−ＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＡＧＣＴＴＡＣＡＴ−３’）を用い、それぞれの系でＰＣＲによる第１段階のＤＮＡ増幅を行った。これら２つの第１段階ＰＣＲ産物からヘテロな２本鎖ＤＮＡを調製し、Ｍ１３プライマーＲＶとＭ１３プライマーＭ４を用いて、このヘテロな２本鎖ＤＮＡのＰＣＲによる第２段階の増幅を行った。ｂ562変異体の塩基配列を持つＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＨｉｎｄIIIによって切り出し、ｐＵＣ１１８ベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII部位に特異的に連結した。その後、大腸菌（Escherichia coli）菌株ＴＧ１を得られた発現プラスミドによって形質転換した。Ｈ６３Ｃ変異体の塩基配列はＤＮＡシークエンシングにより確認した（配列番号４）。その際、Ａｌａ３７の位置にも変異が見られたが、無変化の変異であった（ＧＣＣがＧＣＧに変異）。変異体タンパク質は大腸菌株ＴＧ１を用い、文献（Y. Kawamata, S. Machida, T. Ogawa, K. Horie, T. Nagamune, J. Lumin. 98, 141 (2002)）に従って野生型ｂ562の発現と同様の操作で大量発現した。発現したタンパク質は、陽イオン交換カラム（ＣＭ−５２、２．７ｃｍ×１８ｃｍ）とゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０、１．５ｃｍ×１００ｃｍ）によって精製し、Ｒｚ＝Ａ418／Ａ280≧６．０のフラクションを回収して以下の実験に使用した。
【０１１４】
（３）ヘムタンパク質モノマーおよびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーの製造（スキーム５参照）
【０１１５】
【化２４】
【０１１６】
前記式（Ｖ−１）
【０１１７】
【化２５】
【０１１８】
は、実施例１（２）において発現したタンパク質変異体である、シトクロムｂ562変異体（Ｈ６３Ｃ）を意味し、前記変異体は、天然のシトクロムｂ562のアミノ酸配列中、第６３番目のヒスチジン残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【０１１９】
窒素雰囲気下、３０ｍＬの二つ口フラスコに窒素飽和の３ｍＬの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ＮａＯＨを加えてｐＨ９．０に調整したもの）および化合物１（８）（２．４８×１０-6ｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（０．１ｍＬ）を加えて室温にて撹拌した。そこへ、実施例１（２）において発現したＨ６３Ｃのストック溶液（２００μＬ，０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液中濃度１．２４×１０-3Ｍ、ｐＨ７．３、１×１０-4ＭのＥＤＴＡを含む）を滴下して加え、溶液を窒素下、室温にて穏やかに撹拌した。７時間後、化合物１（８）とＨ６３Ｃ（Ｖ−１）の結合体であるヘムタンパク質モノマー（Ｉ−１）を得た。
【０１２０】
前記溶液中のヘムタンパク質モノマー（Ｉ−１）に塩酸を加えてｐＨ１．９とし、ヘムタンパク質モノマー（ＩＩ−１）を得た。前記ヘムタンパク質モノマー（ＩＩ−１）の水溶液へ２−ブタノン（５ｍＬ×４）を加えて抽出操作を行った。水層を分離して透析膜（Ｗａｋｏ，ＭＷＣＯ、１４，０００Ｄａ）へと移し、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）によって４℃で透析を行った（５００ｍＬ×２時間×３）。得られたヘムタンパク質ポリマー（８）の水溶液を限外ろ過によって約１０-3Ｍまで濃縮し、冷暗所にて保管した。
【０１２１】
前記ヘムタンパク質ポリマー（８）は、式（ＩＩＩ−１）の構造であると推測できる。
【０１２２】
【化２６】
【０１２３】
前記式（Ｖ−１）
【０１２４】
【化２７】
【０１２５】
は、実施例１（２）において発現したタンパク質変異体である、シトクロムｂ562変異体（Ｈ６３Ｃ）を意味し、前記変異体は、天然のシトクロムｂ562のアミノ酸配列中、第６３番目のヒスチジン残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【実施例２】
【０１２６】
（１）式１（２）で示す化合物の製造
式１（２）で示す化合物は、以下のスキーム６に従い製造した。詳細には、Ｎ−Ｂｏｃ−１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン（ジアミン（８））の代わりに、Ｎ−Ｂｏｃ−１，２−ジアミノエタン（ジアミン（２））を用いた以外は、実施例１（１）の式１（８）で示す化合物の製造と同様にして行った。
【０１２７】
【化２８】
【０１２８】
得られた化合物３（２）、化合物４（２）、化合物５（２）および化合物１（２）のデータを以下に示す。
【０１２９】
化合物3(2): 収率33%。
1H NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ10.47 (s, 1H) 10.38 (s, 1H) 10.36 (s, 0.5H) 10.30 (s, 0.5H) 10.21 (s, 0.5H) 10.16 (s, 0.5H) 8.51-8.38 (m, 2H) 6.45-6.16 (m, 4H), 4.60-4.45 (m, 4H), 3.65-3.41 (m, 16H) 3.43 (m, 2H) 3.33 (m, 2H) 1.33 (s, 9H) 1.26 (s, 9H) -3.39 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 761.70 (M + H)+, C45H57N6O5について計算値： 761.97;
UV-vis (CHCl3) λmax / nm (吸収) 630 (0.032) 575 (0.041) 542 (0.070) 506 (0.084) 408 (1.02)。
【０１３０】
化合物4(2):収率 88%。
1H NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ 10.64 (s, 1H) 10.44 (s, 1H) 10.36 (m, 1H) 10.25 (m, 1H) 8.52-8.42 (m, 2H) 6.47-6.17 (m, 4H), 4.63-4.50 (m, 4H), 3.67-3.52 (m, 16H) 3.42-3.28 (m, 4H) -3.29 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 605.31 (M - TFA)+, C36H41N6O3について計算値： 605.75;
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収)627 (0.034) 574 (0.048) 537 (0.087) 503 (0.10) 401 (1.12)。
【０１３１】
化合物5(2): 収率 93%。
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 658.21 (M−Cl--HCl)+, C36H38FeN6O3について計算値： 658.57
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 598 (0.082) 478 (0.13) 398 (1.02)。
【０１３２】
化合物１(2): 収率 定量的。
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 626.16 (M-Cl-)+, C38H39FeIN6O4について計算値： 626.50
UV-vis (MeOH) λmax /nm (吸収) 610 (0.027) 495 (0.061) 397 (1.04)。
【０１３３】
（２）ヘムタンパク質モノマーおよびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーの製造（スキーム７参照）
式１（２）で示す化合物を用いて、ヘムタンパク質モノマーおよびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマー（２）を以下のスキーム７に従い製造した。詳細には、化合物１（８）の代わりに、化合物１（２）を用いた以外は、実施例１（３）のスキーム５に示す製造と同様にして行った。
【０１３４】
【化２９】
【０１３５】
前記ヘムタンパク質ポリマー（２）は、式（ＩＩＩ−２）の構造であると推測できる。
【０１３６】
【化３０】
【０１３７】
前記式
【０１３８】
【化３１】
【０１３９】
については前記と同様。
【実施例３】
【０１４０】
（１）式１（１３）で示す化合物の製造
式１（１３）で示す化合物は、以下のスキーム８に従い製造した。詳細には、Ｎ−Ｂｏｃ−１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン（ジアミン（８））の代わりに、Ｎ−ＢＯＣ−ジエチレングリコール−ビス（３−アミノプロピル）エーテル（ジアミン（１３））を用いた以外は、実施例１（１）の式１（８）で示す化合物の製造と同様にして行った。
【０１４１】
【化３２】
【０１４２】
得られた化合物３（１３）、化合物４（１３）、化合物５（１３）および化合物１（１３）のデータを以下に示す。
【０１４３】
化合物3(13): 収率 49%。
1H-NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ 10.34 (s, 1H) 10.21 (s, 0.5H) 10.17 (s, 1H) 10.14 (s, 1H) 10.03 (s, 0.5H) 9.95 (s, 0.5H) 8.39-8.25 (m, 2H) 6.41-6.14 (m, 4H) 4.60-4.38 (m, 4H) 3.62-3.45 (m, 16H) 3.34-3.15 (m, 12H) 3.06 (m, 2H) 2.76 (m, 2H) 2.61 (m, 2H) 2.44 (m, 2H) 1.74 (m, 2H) 1.49 (s, 9H) 1.43 (s, 9H) 1.39 (m, 2H), −3.80 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 921.83 (M + H)+, C53H72N6O8について計算値： 922.18;
UV-vis (CHCl3) λmax / nm (吸収) 630 (0.032) 576 (0.042) 540 (0.072) 506 (0.088) 408 (1.05)。
【０１４４】
化合物4(13): 収率 82%。
1H NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ 10.41 (s, 1H) 10.19 (s, 0.5H) 10.14 (br, 1.5H) 10.00 (s, 0.5H) 9.94 (s, 0.5H) 8.42-8.27 (m, 2H) 6.43-6.12 (m, 4H), 4.60-4.41 (m, 4H), 3.61-3.47 (m, 16H) 3.33-3.22 (m, 8H) 3.13 (m, 2H) 2.93 (m, 2H) 2.80 (m, 2H) 2.71 (m, 2H) 1.90 (m,2H) 1.44 (m, 2H) -3.88 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 765.55 (M - TFA)+, C44H57N6O6 について計算値：765.96;
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 628 (0.035) 574 (0.044) 538 (0.073) 504 (0.090) 401 (1.02)。
【０１４５】
化合物5(13): 化合物5(13)は水溶性が高く、最後の沈殿の水洗浄を充分に行うことが出来なかった。このため、精製を行わずに次の反応に用いた。
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 818.70 (M -Cl--HCl)+, C44H54FeN6O6 について計算値：818.72
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 601 (0.037) 494 (0.080) 396 (1.07)。
【０１４６】
化合物1(13):化合物1(13)は、更にシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製操作を行った(クロロホルム/メタノール = 10/1, v/v)。収率 19%。
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 986.66 (M−Cl-)+, C46H55FeIN6O7 について計算値：986.71
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 596 (0.082) 483 (0.11) 398 (1.06)。
【０１４７】
（２）ヘムタンパク質モノマーおよびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーの製造（スキーム９参照）
式１（１３）で示す化合物を用いて、ヘムタンパク質モノマーおよびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマー（１３）を以下のスキーム９に従い製造した。詳細には、化合物１（８）の代わりに、化合物１（１３）を用いた以外は、実施例１（３）のスキーム５に示す製造と同様にして行った。
【０１４８】
【化３３】
【０１４９】
前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）は、式（ＩＩＩ−３）の構造であると推測できる。
【０１５０】
【化３４】
【０１５１】
前記式
【０１５２】
【化３５】
【０１５３】
については前記と同様。
［実施例１から３で得られたポリマーに関する種々性質］
（ｉ）ＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定
前記Ｈ６３ＣのＵＶ−ｖｉｓスペクトルと、実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを図１（ａ）および図１（ｂ）にそれぞれ示す。前記ＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）中２５℃で測定した。図１（ａ）および図１（ｂ）より、前記Ｈ６３Ｃおよび前記ヘムタンパク質ポリマー（８）が野生型シトクロムｂ562に特徴的な４１８、５３０および５６４ｎｍにおける吸収を有することを確認した。従って、野生型シトクロムｂ562にヘムリンカーを導入した本発明のヘムタンパク質ポリマー（８）の鉄が、野生型シトクムｂ562と同様にヘムポケットに保持されていることが確認できた。
【０１５４】
（ｉｉ）質量スペクトルの測定
前記ヘムタンパク質ポリマーのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルおよびデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２にそれぞれ示す。実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ａ）に、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ｂ）に示す。前記ヘムタンパク質ポリマー（８）の分子量の計算値は、１２５３２．９である。図２（ｂ）から、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）の分子量は計算値と一致していることが確認できた。
【０１５５】
また、実施例２で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（２）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ｃ）に、前記ヘムタンパク質ポリマー（２）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ｄ）に示す。前記ヘムタンパク質ポリマー（２）の分子量の計算値は、１２４４４．８である。図２（ｄ）から、前記ヘムタンパク質ポリマー（２）の分子量は計算値と一致していることが確認できた。
【０１５６】
また、実施例３で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ｅ）に、前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ｆ）に示す。前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）の分子量の計算値は、１２６０６．０である。図２（ｆ）から、前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）の分子量は計算値と一致していることが確認できた。
【０１５７】
（ｉｉｉ）反応性チオールの含有量を測定
また、実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）および前記Ｈ６３Ｃについて、反応性チオールの含有量を評価した。この評価は、５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）中、２５℃において、過剰なジチオビスニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）存在下における前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のＵＶスペクトルを測定することにより行った。その結果を、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）については図３（ａ）に、前記Ｈ６３Ｃについては図３（ｂ）に示す。図３（ａ）において、ａは前記ヘムタンパク質ポリマー（８）自体のＵＶスペクトル、ｂはＤＴＮＢ自体のＵＶスペクトル、ｃは過剰なＤＴＮＢと前記ヘムタンパク質ポリマー（８）との混合物のＵＶスペクトル、およびｄは前記ｃ−ａ−ｂの差のスペクトルである。前記ヘムタンパク質ポリマー（８）の代わりに前記Ｈ６３Ｃを用いた場合の結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）において、ａは前記Ｈ６３Ｃ自体のＵＶスペクトル、ｂはＤＴＮＢ自体のＵＶスペクトル、ｃは過剰なＤＴＮＢと前記Ｈ６３Ｃとの混合物のＵＶスペクトル、およびｄは前記ｃ−ａ−ｂの差のスペクトルである。前記図３（ａ）および図３（ｂ）から、反応性チオールの含有量は、図３ｂにおける４５０ｎｍにおける吸光度の増加に基づき、前記Ｈ６３Ｃについてはひとつのタンパク質あたりにひとつの反応性チオールが含まれており、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）では反応性チオールが含まれていないことが確認できた。従って、本発明のヘムタンパク質ポリマーでは、Ｈ６３Ｃの反応性チオールの位置に前記ヘムリンカーが修飾されていることが確認できた。
【０１５８】
（ｉｖ）ＣＤスペクトルの測定
前記ヘムタンパク質ポリマーおよび前記Ｈ６３Ｃについて、ＣＤスペクトルを測定した。その結果を図４に示す。図４中、前記Ｈ６３ＣのＣＤスペクトルはａ、実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のＣＤスペクトルはｂ、実施例２で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（２）のＣＤスペクトルがｃ、実施例３で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）のＣＤスペクトルはｄである。前記図４から、前記ヘムタンパク質ポリマーは、前記Ｈ６３Ｃのものと比較して、極小波長およびモル楕円率に変化が無いことから、前記ヘムタンパク質ポリマー（２）、ヘムタンパク質ポリマー（８）およびヘムタンパク質ポリマー（１３）は、前記Ｈ６３Ｃの立体構造を保ったまま、ポリマーを形成していることが確認できた。
【０１５９】
（ｖ）サイズ排除クロマトグラムの測定
前記ヘムタンパク質ポリマーについて、サイズ排除クロマトグラフィーを測定した。溶出溶媒には５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）に０．１５ＭのＮａＣｌを加えたものを用いた。測定は温度４℃、流速０．５ｍＬ／分にて行った。その結果を図５（ａ）に示す。図５（ａ）中、実施例１で得られた前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のクロマトグラムはｂ、実施例２で得られた前記ヘムタンパク質ポリマー（２）のクロマトグラムはａ、実施例３で得られた前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）のクロマトグラムはｃである。標準サンプルとして、前記と同様の条件で溶出したサンプルについての結果を図５（ｂ）に示す。図５（ｂ）中、ｄは２０００ｋＤａのブルーデキストラン（排除限界における溶出位置を決めるためのサンプル）、ｅは４４０ｋＤａのフェリチン、ｆは２３２ｋＤのカタラーゼ、ｇは６７ｋＤａのアルブミン、ｈは２５ｋＤａのケモトリプシノーゲンおよびｉは１２．５ｋＤａのＨ６３Ｃについてのクロマトグラムである。図５（ａ）および図５（ｂ）から、ヘム由来の吸収帯である４００ｎｍにおける光吸収を検出することによって、ヘムタンパク質ポリマーの溶出を確認した。ヘム部分とタンパク質部分とが同時に溶出しているのを確認するために、２８０ｎｍ検出によっても同様にＳＥＣ測定を行ったところ、４００ｎｍ検出における溶出のクロマトグラムと一致したことから、ヘム部分とタンパク質部分とは複合体であるポリマーを形成しながら同時に溶出していることを確認した。
【０１６０】
（ｖｉ）濃度を変化させた条件下でのサイズ排除クロマトグラムの測定
実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）について、前記ポリマーの濃度を１２μＭ、５０μＭ、１２５μＭ、３１０μＭおよび１２５０μＭのそれぞれにおいて、前記（ｖ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラムを測定した。その結果を図６に示す。図６から、前記ポリマー（８）の濃度が高くなるにつれ、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）の長さが長くなり、かつヘムタンパク質モノマーの量が低下することが確認できた。
【０１６１】
（ｖｉｉ）ヘムを添加することによる、ヘムタンパク質モノマーからヘムタンパク質ポリマーへの変換阻害
前記（ｖｉ）で得られた結果から、前記ヘムタンパク質ポリマーは、濃度依存的にヘムタンパク質モノマーと平衡状態にあることが考えられる。この点をさらに確認するため、様々な濃度のヘムを添加した条件下で、前記（ｖ）と同様にしてヘムタンパク質ポリマー（８）のサイズ排除クロマトグラムを測定した。前記ヘムの濃度としては、（ヘムの濃度）／（実施例１で得られたヘムタンパク質ポリマー（８）の濃度）が、０、０．３、０．６、１．０、１．５および２．０を用いた。その結果を図７に示す。図７より、ヘムの濃度が高いほど、低分子のヘムタンパク質モノマー（またはダイマー）が得られることが確認できた。従って、前記ヘムタンパク質モノマーからヘムタンパク質ポリマーへ変換する際、前記ヘムはヘムタンパク質モノマーの反応部分をふさぐことにより、変換を阻害することが確認できた。
【０１６２】
（ｖｉｉｉ）希薄濃度におけるＵＶスペクトルの測定
実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）等について、前記ポリマーの濃度を２．５ｍＭから２．５μＭへと希釈し、前記（ｉｉｉ）と同様にしてＵＶスペクトルを連続的に測定した。その結果を図８に示す。図８（ａ）は、実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）の時間経過に伴うスペクトルを、図８（ｂ）は、図８（ａ）の差スペクトルを、図８（ｃ）は、天然のヘムと、Ｈ６３ＣのＵＶスペクトルを、図８（ｄ）は、図８（ｃ）の差スペクトルを示す。図８から、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）は、濃度を希釈することによってＵＶスペクトルの形状がＨ６３Ｃのスペクトルから天然のヘムのスペクトルへと時間経過とともに変化することが確認された。従って、前記ヘムタンパク質ポリマーは、濃度を希釈することによって、前記ヘムタンパク質ポリマー(8)の鉄が、ヘムポケットに保持された状態からヘムポケット外へと解離した状態へと遷移し、モノマーへと解離すると推定した。
【０１６３】
（ｉｘ）ヘムタンパク質モノマーとヘムタンパク質ポリマーとの平衡
前記ポリマーとモノマーとの平衡を、前記ヘムタンパク質ポリマー（２）、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）および前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）をそれぞれ２２５倍に希釈した後、前記（ｖｉｉｉ）と同様にしてＵＶスペクトルを測定した。その結果を図９に示す。断片的な変化は、４１８ｎｍにおける吸光度の変化に基づき計算した。図９から、平衡に達するまでに要する時間は、前前記ヘムタンパク質ポリマー（２）、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）、前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）の順番で長くなることが確認できた。
【０１６４】
（ｘ）原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定
ＡＦＭ測定に用いたサンプルは以下のように調製した。高配向性焼結グラファイト（ＨＯＰＧ）基板の表面を壁開し、その壁開面を実施例１および３で得たヘムタンパク質ポリマーの水溶液（約１０-8Ｍ、０．０５Ｍトリス緩衝液中、ｐＨ７．３）に数秒間浸漬した。基板を溶液から引き上げた後、水でよく洗浄し、室温にて塩化カルシウムの入ったデシケーター内にてよく乾燥させた後、ＡＦＭ測定装置にセットした。測定はタッピングモードで行い、スキャン速度は２Ｈｚ、探針には曲率半径が約１０ｎｍのシリコン単結晶を用いた。実施例１で得たヘムタンパク質ポリマーと実施例２で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージを図１０に示す。図１０（ａ）は、１．５５μｍ×１．５５μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例１で得たヘムタンパク質ポリマー（８）のＡＦＭイメージ、図１０（ｂ）は、１．６７μｍ×１．６７μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例１で得たヘムタンパク質ポリマー（８）のＡＦＭイメージ、図１０（ｃ）は、１．８７μｍ×１．８７μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例３で得たヘムタンパク質ポリマー(１３)のＡＦＭイメージ、図１０（ｄ）は、１．８５μｍ×１．８５μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例３で得たヘムタンパク質ポリマー(１３)のＡＦＭイメージを示す。図１０（ａ）および（ｂ）から、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）ではいくつかのワイヤー状の組織体が確認できた。図１０（ｃ）および（ｄ）から、前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）では、濃度条件が希薄なためにモノマーへの解離が起こり、有意なワイヤー状組織体は確認できなかった。また、図１１（ａ）には、１．８０μｍ×１．８０μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例２で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージと、その断面図を示す。図１１ｂには、３６４ｎｍ×３６４ｎｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例２で得たヘムタンパク質ポリマー（２）のＡＦＭイメージを示す。図１１（ａ）から、多数の観測されたワイヤー状の組織体は、ＨＯＰＧ基板からの高さが均一であることが確認できた。また図１１（ｂ）から、ひとつの観測されたワイヤー状の組織体の長さが約３５０ｎｍに達しており、ヘムタンパク質が約１４０量体を形成したものと推定した。
【０１６５】
前記ＡＦＭイメージから、本発明によって得られたヘムタンパク質モノマーは、直径約２．５ｎｍ、高さ約５．０ｎｍの円柱状であり、ヘムタンパク質ポリマーは、それが連なった高さ２．５〜５．０ｎｍ、幅２．５〜５．０ｎｍ、長さ２〜５００ｎｍの集合体（図１２参照）を形成しているものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明のヘムタンパク質ポリマーは、酵素の集合体として用いることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１ａ】図１ａは、Ｈ６３ＣのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図１ｂ】図１ｂは、ヘムタンパク質ポリマー（８）のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図２】図２は、ヘムタンパク質ポリマー（８）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。図２（ａ）は、ヘムタンパク質ポリマー（８）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２（ｂ）はヘムタンパク質ポリマー（８）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２（ｃ）は、ヘムタンパク質ポリマー（２）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２（ｄ）はヘムタンパク質ポリマー（２）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２（ｅ）はヘムタンパク質ポリマー（１３）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２（ｆ）はヘムタンパク質ポリマー（１３）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルをそれぞれ示す。
【図３ａ】図３ａは、ヘムタンパク質ポリマー（８）とＤＴＮＢのＵＶスペクトルを示す。図中、ａはヘムタンパク質ポリマー（８）自体のＵＶスペクトル、ｂはＤＴＮＢ自体のＵＶスペクトル、ｃは過剰なＤＴＮＢと前記ヘムタンパク質ポリマー（８）との混合物のＵＶスペクトル、およびｄは前記ｃ−ａ−ｂの差のスペクトルである。
【図３ｂ】図３ｂは、Ｈ６３ＣとＤＴＮＢのＵＶスペクトルを示す。図中、ａは前記Ｈ６３Ｃ自体のＵＶスペクトル、ｂはＤＴＮＢ自体のＵＶスペクトル、ｃは過剰なＤＴＮＢと前記Ｈ６３Ｃとの混合物のＵＶスペクトル、およびｄは前記ｃ−ａ−ｂの差のスペクトルである。
【図４】図４は、前記ヘムタンパク質ポリマーおよび前記Ｈ６３ＣのＣＤスペクトルを示す。
【図５】図５は、前記ヘムタンパク質ポリマーと標準物質のサイズ排除クロマトグラムを示す。図５（ａ）は、前記ヘムタンパク質ポリマーのクロマトグラムを、図５（ｂ）は標準物質のクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、ヘムタンパク質ポリマー濃度を変化させた条件下でのサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図７】図７は、様々なヘム濃度の条件下におけるヘムタンパク質ポリマーのサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図８】図８は、希薄濃度におけるＵＶスペクトルを示す。図８（ａ）は、実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマーのスペクトルを、図８（ｂ）は、図８（ａ）の差スペクトルを、図８（ｃ）は、天然のヘムと、Ｈ６３ＣのＵＶスペクトルを、図８（ｄ）は、図８（ｃ）の差スペクトルを示す。
【図９】図９は、２２５倍に希釈した前記ヘムタンパク質ポリマーと前記ヘムタンパク質モノマーとの平衡を示すＵＶスペクトルの時間変化を示す。
【図１０】図１０は、ヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージを示す。図１０（ａ）は、１．５５μｍ×１．５５μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例１で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージ、図１０（ｂ）は、１．６７μｍ×１．６７μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例１で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージ、図１０（ｃ）は、１．８７μｍ×１．８７μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例３で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージ、図１０（ｄ）は、１．８５μｍ×１．８５μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例３で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージを示す。
【図１１ａ】図１１ａは、１．８０μｍ×１．８０μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例２で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージと、その断面図を示す。
【図１１ｂ】図１１ｂは、３６４ｎｍ×３６４ｎｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例２で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージを示す。
【図１２】図１２は、ヘムタンパク質ポリマーの模式図を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１６８】
配列番号１ シトクロムｂ562
配列番号２ ミオグロビン（sus scrofa）
配列番号３ 西洋ワサビペルオキシダーゼ
配列番号４ Ｈ６３Ｃシトクロムｂ562
配列番号５ 変異部位導入プライマー
配列番号６ Ｍ１３プライマーＭ４
配列番号７ Ｍ１３プライマーＲＶ
配列番号８ ＭＵＴ４プライマー
配列番号９ ヘモグロビンαサブユニット（human）
配列番号１０ ヘモグロビンβサブユニット（human）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘムタンパク質ポリマー製造用モノマーおよびそのモノマーから得られるポリマーに関する。より詳細には、本発明は、ヘムタンパク質ポリマー製造用モノマー、およびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、小分子量を有する有機化合物を様々な相互作用、例えば配位結合、共有結合、イオン結合等により規則的に配列させ、大分子量を有する有機化合物を製造することが試みられている（例えば、非特許文献１参照）。このようにして製造された大分子量の有機化合物は、様々な機能を有するナノデバイスとしての利用が期待されている。
【０００３】
一方、もともと大分子量を有する有機化合物、例えばタンパク質を様々な相互作用、例えば配位結合、共有結合、イオン結合等により規則的に配列させ、さらに大分子量を有する有機化合物を製造することは、非常に困難である。この困難さの理由としては、高次立体構造を有するタンパク質の表面に存在する官能基に対して適切に化学修飾を施すことが困難であること、かつ、そのように化学修飾されたタンパク質同士を相互作用させるようなしくみを開発するのが困難であることなどが挙げられる。
【非特許文献１】J.-M. Lehn, "Supramolecular Chemistry: Concepts and Perspectives" ドイツ、Weinheim、VCH社出版、１９９５年.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、大分子量を有するタンパク質を規則的に配列させることにより得られる、さらに大分子量を有するタンパク質ポリマーの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一般式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩である。
【０００６】
【化９】
【０００７】
前記式（Ｉ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【０００８】
【化１０】
【０００９】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００１０】
また、本発明は、一般式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩である。
【００１１】
【化１１】
【００１２】
前記式（ＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【００１３】
【化１２】
【００１４】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味する。
【００１５】
また、本発明は、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩である。
【００１６】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩および前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩は、ヘムタンパク質ポリマー製造用モノマーとして有用である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩は、大分子量を有する。そのヘムタンパク質モノマーまたはその塩を、ヘムを利用して規則的に配列させることにより、さらに大分子量を有するヘムタンパク質ポリマーを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、前記のように、前記一般式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩である。
【００１９】
また、本発明は、前記のように、前記一般式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩である。
【００２０】
また、本発明は、前記のように、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩である。なお、前記ヘムタンパク質ポリマーまたはその塩を構成する、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩は、１種類であっても、２種類以上の混合物であってもよい。また、前記ヘムタンパク質ポリマーは、一般式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーであるのが好ましい。
【００２１】
【化１３】
【００２２】
前記式（ＩＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【００２３】
【化１４】
【００２４】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００２５】
本発明において、「低級」は特に指示がなければ、炭素原子が１〜６個、好ましくは炭素原子１〜４個を意味する。
【００２６】
「低級アルキル基」および「ハロゲン原子で置換された低級アルキル基」中の「低級アルキル基」としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等のような直鎖状もしくは分岐鎖状の炭素数１〜６のアルカンの残基を意味する。低級アルキル基の好ましい例としては、炭素数１〜５のアルキルが挙げられる。好ましい炭素数１〜５のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
【００２７】
「低級アルケニル基」としては、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−、２−もしくは３−ブテニル、１−、２−、３−もしくは４−ペンテニル、１−、２−、３−、４−もしくは５−へキセニル等の炭素数２〜６個を有する直鎖または分枝鎖アルケニル基が挙げられる。好ましい低級アルケニル基としては、ビニルが挙げられる。
【００２８】
「ハロゲン原子」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられ、中でもフッ素が好ましい。
【００２９】
「ハロゲン原子で置換された低級アルキル基」の例としては、前記低級アルキル基の１以上の水素原子が、前記ハロゲン原子で置き換えられたものを意味する。前記ハロゲン原子で置換された低級アルキル基の好ましい例としては、ヨウ化メチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル等が挙げられる。好ましいハロゲン原子で置換された低級アルキル基としては、トリフルオロメチルが挙げられる。
【００３０】
本発明のモノマーまたはポリマーおよびその塩は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【００３１】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩、および前記式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーまたはその塩において、前記ヘムタンパク質は、ヘムを１以上有するタンパク質であれば特に限定されないが、例えば、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼが挙げられる。前記シトクロムとしては、例えばシトクロムｂ562、シトクロムｂ5、シトクロムＰ４５０CAMが挙げられ、中でもシトクロムｂ562が好ましい。前記ヘモグロビンとしては、例えばヘモグロビン（human）、ヘモグロビン（bovine）、ヘモグロビン(equine)、ヘモグロビン(rat)が挙げられ、中でもヘモグロビン（human）が好ましい。前記ミオグロビンとしては、例えばミオグロビン(sus scrofa)、ミオグロビン(equine)、ミオグロビン(human)、ミオグロビン（sperm whale）が挙げられ、中でもミオグロビン(sus scrofa)が好ましい。前記ペルオキシダーゼとしては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼ、カタラーゼが挙げられ、中でも西洋ワサビペルオキシダーゼが好ましい。
【００３２】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（Ｉ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味するのが好ましい。
【００３３】
式
【００３４】
【化１５】
【００３５】
で表わされるヘムタンパク質の変異体は、前記ヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、シトクロムの場合、（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトクロムとして機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号１で表わされるアミノ酸配列は、天然のシトクロムb562のアミノ酸配列である。天然のシトクロムb562のアミノ酸配列は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1QPU（１９９９年６月２日付）のものが挙げられ、前記配列番号１で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1QPUのものに対応する。システインに置き換えられる前記１つのアミノ酸残基は、前記シトクロムが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記シトクロムに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。このような置換を行うため、例えば配列番号１のアミノ酸配列において、第１〜１０６番目のアミノ酸残基、好ましくは第６０、６２、６３、６６、６７、７０、７３、７４、７６、７８、８９、９０、９６、９９および１００番目のアミノ酸残基、より好ましくは第６０、第６３、第６６、第６７および第１００番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えることができる。
【００３６】
また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、ヘモグロビンの場合、（ａ）配列番号９または配列番号１０で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号９または配列番号１０で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモグロビン（human）として機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号９で表わされるアミノ酸配列は、天然のヘモグロビンαサブユニットのアミノ酸配列であり、前記配列番号１０で表わされるアミノ酸配列は、天然のヘモグロビンのβサブユニットのアミノ酸配列である。天然のヘモグロビンのアミノ酸配列は、配列番号９および配列番号１０で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1GZX（２００２年７月８日付）のものが挙げられ、前記配列番号９および配列番号１０で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1GZXのものに対応する。システインに置き換えらえる前記１つのアミノ酸残基は、前記ヘモグロビンが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記ヘモグロビンに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。
【００３７】
また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、ミオグロビンの場合、（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつミオグロビンとして機能するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列は、天然のミオグロビン(sus scrofa)のアミノ酸配列である。天然のミオグロビンのアミノ酸配列は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号１MWD（１９９８年８月１１日付）のものが挙げられ、前記配列番号２で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号１MWDのものに対応する。システインに置き換えらえる前記１つのアミノ酸残基は、前記ミオグロビンが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記ミオグロビンに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。このような置換を行うため、例えば配列番号２のアミノ酸配列において、第１〜１５３番目のアミノ酸残基、好ましくは第８、１２、１６、５３，１０２，１０６，１１３，１１７，１２１，１２６，１３３，１４０および１４７番目のアミノ酸残基、より好ましくは第１３３および第１４０番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えることができる。
【００３８】
また、このようなヘムタンパク質の変異体は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、（ａ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１つのアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、１もしくは２個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質を意味する。なお、前記配列番号３で表わされるアミノ酸配列は、天然の西洋ワサビペルオキシダーゼのアミノ酸配列である。天然の西洋ワサビペルオキシダーゼのアミノ酸配列は、配列番号３で表わされるものに限定されず、Protein Data Bankにおいて、適切なものを選択すればよい。具体的には、ＩＤ番号1ATJ（１９９８年２月４日付）のものが挙げられ、前記配列番号３で表わされるアミノ酸配列は、ＩＤ番号1ATJのものに対応する。システインに置き換えられる前記１つのアミノ酸残基は、前記西洋ワサビペルオキシダーゼが立体構造をとる際、構造の外側に配置されるようなアミノ酸残基が好ましい。また、システイン残基に置き換えられたことにより、前記西洋ワサビペルオキシダーゼに含まれるヘムの構造に影響を与えない必要がある。
【００３９】
前記変異体中、前述のように、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００４０】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（Ｉ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるのがより好ましい。
【００４１】
また、前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（Ｉ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるのがより好ましい。
【００４２】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（Ｉ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるのがさらに好ましい。
【００４３】
また、前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（Ｉ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるのがさらに好ましい。
【００４４】
また、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味するのが好ましい。
【００４５】
前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるのがより好ましい。
【００４６】
また、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるのがより好ましい。
【００４７】
前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるのがさらに好ましい。
【００４８】
また、前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩としては、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるのがさらに好ましい。
【００４９】
また、本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記ヘムタンパク質モノマーが、前記式（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味する式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーであるのが好ましい。
【００５０】
本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記ヘムタンパク質モノマーが、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムである式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーがより好ましい。
【００５１】
本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記ヘムタンパク質モノマーが、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムである式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーがより好ましい。
【００５２】
本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記ヘムタンパク質モノマーが、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンである式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーがさらに好ましい。
【００５３】
また、本発明のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記ヘムタンパク質モノマーが、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンである式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーがさらに好ましい。
【００５４】
また、前記式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記式（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味するヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩が好ましい。
【００５５】
また、前記式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩、
ならびに、
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、低級アルキル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜３の整数を意味し、
前記ヘムタンパク質がシトクロムであるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩からなる群から選択される１以上がより好ましい。
【００５６】
前記式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーまたはその塩としては、前記式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩、
ならびに
前記式（ＩＩ）中、Ｒ2およびＲ4は、それぞれ独立して、メチル基であり、Ｒ1およびＲ3は、それぞれ独立して、ビニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−または−（ＣＨ2）3−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）3−で表わされる基であり、
前記ヘムタンパク質が配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するシトクロムであり、前記１つのアミノ酸残基が第６３番目のヒスチジンであるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩からなる群から選択される１以上がさらに好ましい。
【００５７】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーの塩、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーの塩、および式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーの塩は、前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマー、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマー、および式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーの、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩がそれぞれ挙げられる。
【００５８】
次に、本発明の式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法の一例を説明する。
【００５９】
その製造方法は、一般式（ＩＶ）で表わされるヘムリンカーと、一般式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質とを反応させて、請求項１に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩を得ることを特徴とする（スキーム１参照）。
【００６０】
【化１６】
【００６１】
前記式（Ｉ）および式（ＩＶ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式（Ｉ）および式（Ｖ）中、式
【００６２】
【化１７】
【００６３】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００６４】
前記式（ＩＶ）中、低級アルキル基および低級アルケニル基の定義は、前記のとおりである。
【００６５】
前記製造方法において、式（ＩＶ）で表わされるヘムリンカーと、式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質との反応は、不活性ガス（例えばアルゴン、窒素等）雰囲気下に、触媒存在下に溶媒中で行うことができる。前記触媒としては、例えば酸、塩基等が挙げられる。前記酸としては塩酸、硫酸、硝酸、トルエンスルホン酸、酢酸等が挙げられる。前記塩基としては、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、ホウ酸、リン酸、水素化ナトリウム、水素化カルシウム等が挙げられる。
【００６６】
前記製造方法において、反応溶媒は限定されないが、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液）等が挙げられる。前記溶媒は、１種類を用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。前記溶媒としては、ジメチルスルホキシドおよび緩衝液から選択されるのが好ましく、ジメチルスルホキシドおよびトリス塩酸緩衝液の混合物がより好ましい。
前記製造方法において、反応温度は限定されないが、例えば０℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜６０℃、より好ましくは２０℃〜３０℃である。
【００６７】
前記製造方法において、反応時間は限定されないが、例えば３０分〜２４時間、好ましくは２時間〜１０時間、より好ましくは５時間〜８時間である。
【００６８】
前記製造方法において、式（ＩＶ）で表されるヘムリンカーに対し使用される式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質のモル比（式（ＩＶ）で表されるヘムリンカー：式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質）は、例えば１００：１〜５：１、好ましくは５０：１〜１０：１、より好ましくは２０：１〜１０：１である。
【００６９】
前記製造方法において、前記式（ＩＶ）で表されるヘムリンカーは、市販で入手してもよいし、公知文献を参照して自家製造してもよい。
【００７０】
前記製造方法において、前記式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質は、例えば以下のようにして製造することができる。
【００７１】
前記式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質の遺伝子は、天然のヘムタンパク質の遺伝子の塩基配列に基づいて、モルモットのトータルＲＮＡ等を利用してクローニングしてもよく、また、ホスホロアミダイト法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して行える。また、前記式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質の遺伝子を宿主細胞内に導入すればよい。
【００７２】
前記宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等が挙げられる。前記遺伝子導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いる方法、マイクロピペットインジェクション法等があげられる。または、宿主染色体への組込み型もしくは自律複製・分配可能な人工染色体もしくはプラスミド型を用いて、それを導入してよい。
【００７３】
前記宿主細胞内に導入する遺伝子は、宿主細胞内で恒常的または任意に発現するように、必要な調節配列と作動的に連結されていることが好ましい。前記調節配列とは、宿主細胞内において、作動的に連結された前記遺伝子の発現に必要な塩基配列であって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。前記作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。
【００７４】
また、本発明の式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法の一例を説明する。
【００７５】
その製造方法は、式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩を酸で処理することにより、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩を得ることを特徴とする（スキーム２参照）。
【００７６】
【化１８】
【００７７】
前記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【００７８】
【化１９】
【００７９】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００８０】
前記製造方法において、式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩の酸処理反応は、触媒存在下に溶媒中で行うことができる。前記触媒としては、例えば酸、塩基等が挙げられる。前記酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等が挙げられる。前記塩基としては、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等が挙げられる
前記製造方法において、反応溶媒は限定されないが、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液）等が挙げられる。前記溶媒は、１種類を用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。前記溶媒としては、ジメチルスルホキシドおよび緩衝液から選択されるのが好ましく、ジメチルスルホキシドおよびトリス塩酸緩衝液の混合物がより好ましい。
【００８１】
前記製造方法において、反応温度は限定されないが、例えば０℃〜３０℃、好ましくは０℃〜１０℃、より好ましくは３℃〜５℃である。
【００８２】
前記製造方法において、酸処理は、ｐＨが、例えば０．５〜３．０、好ましくは１．５〜２．５、より好ましくは１．８〜２．１で行うことができる。
【００８３】
前記式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩および前記式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法において、前記ヘムタンパク質は、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼであるのが好ましい。
【００８４】
また、本発明のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法の一例を説明する。
【００８５】
その製造方法は、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩を中性条件下で処理することにより、ヘムタンパク質ポリマーまたはその塩を得ることを特徴とする。
【００８６】
前記製造方法において、反応溶媒は限定されないが、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液）等が挙げられる。前記溶媒は、１種類を用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。前記溶媒としては、緩衝液から選択されるのが好ましく、トリス塩酸緩衝液がより好ましい。
【００８７】
前記製造方法において、反応温度は限定されないが、例えば０℃〜３０℃、好ましくは０℃〜１０℃、より好ましくは３℃〜５℃である。
【００８８】
前記製造方法において、中性条件下での処理は、ｐＨが、例えば６．０〜１０．０、好ましくは６．５〜８．５、より好ましくは７．０〜８．０で行うことができる。
【００８９】
前記本発明のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法において、前記ヘムタンパク質ポリマーは、式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーであるのが好ましい（スキーム３参照）。
【００９０】
【化２０】
【００９１】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【００９２】
【化２１】
【００９３】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【００９４】
前記製造方法において、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩は、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩１種類の化合物であっても、その位置異性体である化合物またはその塩が共存する、混合物であってもよい。式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩と、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩の位置異性体である化合物またはその塩との混合物である場合、得られる式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーも、位置異性体の混合物になる。
【００９５】
また、前記本発明のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法において、前記ヘムタンパク質は、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼであるのが好ましい。
【００９６】
本発明の式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩は、前記ヘムタンパク質がシトクロム、ヘモグロビンおよびミオグロビンである場合、酸素を貯蔵する生体ポリマーとして有用である。また、前記ヘムタンパク質がペルオキシダーゼである場合、酵素の集合体として有用である。
【００９７】
本発明の式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩は、酸性もしくは塩基性条件下で、式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩に分解することができる。従って、本発明のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩は、ｐＨによって集合状態を制御するｐＨ応答性タンパク質ポリマーとして有用である。
【００９８】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例により限定されない。
【００９９】
種々のスペクトルは、以下の機器を用いて測定した。
【０１００】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは日本電子ＪＥＯＬ ＥＸ２７０核磁気共鳴装置（２７０ＭＨｚ）を用いて測定し、測定溶媒の残存シグナルを内部基準として使用した。エレクトロスプレーイオン化法による飛行時間型質量分析（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）はアプライド・バイオシステム・マリナー（Applied Biosystems Mariner）ＡＰＩ−ＴＯＦワークステーション（Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を用いて測定した。紫外可視吸収スペクトルは島津製作所製自記分光高度計ＵＶ−２５５０もしくはＵＶ−３１５０を用いて測定した。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは日本分光ＪＡＳＣＯ Ｊ８２０円二色性分散計を用いて測定した。水溶液のｐＨは堀場製作所製ｐＨメーターＦ−５２を用いて測定した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）はＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡFPLCシステムにスーパーデック(Superdex）２００ １０／３００ ＧＬカラム（排除限界１．３×１０6Ｄａ）を接続し、検出にはＵＰＣ−９００検出器を用いて測定した。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）はデジタル・インスツゥルメンツ（Digital Instruments）社製ナノスコープ（Nanoscope）ＩＩＩａを用いて測定した。
【０１０１】
また、出発原料は、以下の文献を参考にして製造した。
プロトポルフィリンＩＸモノｔ−ブチルエステル２：T. Matsuo, T. Hayashi, Y. Hisaeda, J. Am. Chem. Soc. 124, 11234 (2002)。
モノＮ−Ｂｏｃ保護ジアミン類。ジアミン（２）、ジアミン(8)およびジアミン（１３）：M. Trester-Zedlitz, K. Kamada, S. K. Burley, D. Fenyo, B. T. Chait, T. W. Muir, J. Am. Chem. Soc. 125, 2416 (2003)および、R. Schneider, F. Schmitt, C. Frochot, Y. Fort, N. Lourette, F. Guillemin, J.-F. Mueller, M. Barberi-Heyob, Bioorg. Med. Chem. 13, 2799 (2005)。
Ｎ−ヨードスクシンイミド：A. Hampton, L. A. Slotin, R. R. Chawla, J. Med. Chem. 19, 1279 (1976)。
その他の一般試薬は市販品をそのまま用いた。
【実施例１】
【０１０２】
（１）式１（８）で示す化合物の製造
式１（８）で示す化合物は、以下のスキーム４に従い製造した。
【０１０３】
【化２２】
【０１０４】
（ｉ）式３（８）で表わす化合物の製造
窒素雰囲下、５０ｍＬのナス型フラスコにプロトポルフィリンＩＸモノｔ−ブチルエステル２（２５５ｍｇ，４．１×１０-4ｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン（ジアミン（８）、２０８ｍｇ，８．４×１０-4ｍｏｌ）およびＤＭＦ（２５ｍＬ）を加えて溶解させた。溶液を氷浴によって冷却し、そこへジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ，２９０ｍｇ，１．１×１０-3ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）およびトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ，１７０ｍｇ，１．７×１０-3ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）をそれぞれ加えた。この溶液を遮光下、室温にて４時間撹拌した後、再び同じ量のＤＰＰＡおよびＥｔ3ＮのＤＭＦ溶液を加えた。さらに２時間撹拌した後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／アセトン＝５／１）によって精製した。得られた固体を最少量のクロロホルムに溶解させ、そこへヘキサンを加えることによって生じた沈殿を集め、標題化合物３（８）およびその位置異性体との混合物を得た（２１８ｍｇ，６３％、紫色、固体））。
【０１０５】
1H NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ： 10.55 (s, 1H) 10.46 (s, 1H) 10.41 (s, 0.5H) 10.35 (s, 0.5H) 10.29 (s, 0.5H) 10.22 (s, 0.5H)（位置異性体の存在により、メソ-プロトンのシグナルは６つに分割した。存在比は、ピーク強度に基づき、１：１である。）, 8.56-8.42 (m, 2H) 6.44 (m, 2H) 6.19 (m, 2H) 4.59-4.49 (m, 4H) 3.68-3.46 (m, 16H) 3.36 (m, 2H) 3.11 (m, 2H) 2.96 (m, 2H) 2.89 (m, 2H) 2.45 (m, 2H) 2.36 (m, 2H) 1.40 (s, 9H) 1.38 (s, 9H) -3.27 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 850.07 (M + H)+、C49H64N6O7について計算値：850.08;
UV-vis (CHCl3)λmax / nm (吸収) 630 (0.042) 579 (0.056) 543 (0.090) 507 (0.11) 408 (1.27)。
【０１０６】
（ｉｉ）式４(８)で表わす化合物の製造
窒素雰囲気下、５０ｍＬのナス型フラスコに化合物３（８）（２０５ｍｇ，２．４×１０-4ｍｏｌ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を氷浴で冷却しながらそれぞれ加えた。その後、反応溶液を室温に戻し、撹拌した。７時間後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣へ最少量のメタノールを加えて溶解させた。そこへジエチルエーテルを加えて、生じた沈殿を集めて標題化合物４（８）およびその位置異性体との混合物を得た（１３９ｍｇ，８３％、紫色、固体）。
【０１０７】
1H NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ： 10.47 (s, 1H) 10.23 (s, 0.5H) 10.20 (s, 1H) 10.15 (s, 1H) 10.05 (s, 0.5H) 9.98 (s, 0.5H)（位置異性体の存在により、メソ-プロトンのシグナルは６つに分割した。存在比は、ピーク強度に基づき、１：１である。）, 8.45-8.31 (m, 2H) 6.42 (m, 2H) 6.17 (m, 2H) 4.63-4.55 (m, 4H) 3.59-3.45 (m, 16H) 3.34 (m, 2H) 3.05-2.96 (m, 6H) 2.47 (m, 2H) 2.39 (m, 2H) -3.80 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 693.97 (M - TFA)+, C40H49N6O5について計算値：693.85;
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 628 (0.018) 574 (0.042) 538 (0.055) 504 (0.057) 399 (0.93).
（ｉｉｉ）式５（８）で表わす化合物の製造
５０ｍＬのナス型フラスコに化合物４（８）（１０９ｍｇ，１．４×１０-4ｍｏｌ）、塩化鉄（ＩＩ）一水和物（６３０ｍｇ）および炭酸水素ナトリウム（４０ｍｇ）を加え、窒素飽和にしたクロロホルムとメタノールの混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝１０／１、２０ｍＬ）に溶解させ、加熱還流を行った。４時間後、反応混合物を室温まで冷却し、溶媒を減圧留去した。残渣をクロロホルムとメタノールの混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝２／１）に溶解させ、０．０５Ｍ塩酸で洗浄した。有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に最少量のメタノールを加えて溶解させ、そこへジエチルエーテルを加えて生じた沈殿を集め、水でよく洗浄し、乾燥させることによって標題の化合物５（８）およびその位置異性体との混合物を得た（９２ｍｇ，８０％、紫色、固体）。
【０１０８】
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 746.81 (M−Cl--HCl)+, C40H46FeN6O5について計算値：746.68;
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 627 (0.021) 538 (0.035, sh) 502 (0.053) 397 (0.91)。
【０１０９】
（ｉｖ）式１（８）で表わす化合物の製造
５０ｍＬのナス型フラスコに、化合物５（８）（８０ｍｇ，９．８×１０-5ｍｏｌ）、Ｎ−ヨードスクシンイミド（３６７ｍｇ，１．３×１０-3ｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（４７ｍｇ）を加え、アセトンと水の混合溶媒（アセトン／水＝１／１、２０ｍＬ）に溶解させた。室温にて２時間撹拌した後、溶液中のアセトンを減圧留去によって取り除いた。残りのけん濁した水溶液にジクロロメタン（３０ｍＬ×３）を加え、抽出操作を行った。有機層をまとめて０．０１Ｍ塩酸で洗浄し（３０ｍＬ×３）、有機層を分離後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に最少量のジクロロメタンを加えて溶解させ、そこへジエチルエーテルを加えることによって析出した沈殿を集め、表題化合物１（８）およびその位置異性体との混合物を得た（６２ｍｇ，６９％、暗紫色、固体）。
【０１１０】
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 915.01 (M−Cl-)+, C42H47FeIN6O6について計算値： 914.61;
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 627 (0.030) 538 (0.050, sh) 502 (0.072) 397 (1.35)。
【０１１１】
（２）シトクロムｂ562変異体（Ｈ６３Ｃ）の調製
部位特異的変異体の生成は、タカラ（ＴａＫａＲａ）社製ＬＡ ＰＣＲインビトロ突然変異生成キット（in vitro Mutagenesis）を用いて、付属のプロトコルに従い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行った。野生型シトクロムｂ562（以下ｂ562と略す）の発現プラスミド（ｐＵＣ１１８）を持つ大腸菌ＴＧ１を大量培養してプラスミドを調製し、Ｈ６３Ｃ変異体を調製するためのテンプレートとした。変異部位導入プライマー（配列番号５）
【０１１２】
【化２３】
【０１１３】
（下線部がミスマッチ塩基対）とＭ１３プライマーＭ４（配列番号６）（５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）、もしくはＭ１３プライマーＲＶ配列番号７（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）とＭＵＴ４プライマー配列番号８（５’−ＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＡＧＣＴＴＡＣＡＴ−３’）を用い、それぞれの系でＰＣＲによる第１段階のＤＮＡ増幅を行った。これら２つの第１段階ＰＣＲ産物からヘテロな２本鎖ＤＮＡを調製し、Ｍ１３プライマーＲＶとＭ１３プライマーＭ４を用いて、このヘテロな２本鎖ＤＮＡのＰＣＲによる第２段階の増幅を行った。ｂ562変異体の塩基配列を持つＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＨｉｎｄIIIによって切り出し、ｐＵＣ１１８ベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII部位に特異的に連結した。その後、大腸菌（Escherichia coli）菌株ＴＧ１を得られた発現プラスミドによって形質転換した。Ｈ６３Ｃ変異体の塩基配列はＤＮＡシークエンシングにより確認した（配列番号４）。その際、Ａｌａ３７の位置にも変異が見られたが、無変化の変異であった（ＧＣＣがＧＣＧに変異）。変異体タンパク質は大腸菌株ＴＧ１を用い、文献（Y. Kawamata, S. Machida, T. Ogawa, K. Horie, T. Nagamune, J. Lumin. 98, 141 (2002)）に従って野生型ｂ562の発現と同様の操作で大量発現した。発現したタンパク質は、陽イオン交換カラム（ＣＭ−５２、２．７ｃｍ×１８ｃｍ）とゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０、１．５ｃｍ×１００ｃｍ）によって精製し、Ｒｚ＝Ａ418／Ａ280≧６．０のフラクションを回収して以下の実験に使用した。
【０１１４】
（３）ヘムタンパク質モノマーおよびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーの製造（スキーム５参照）
【０１１５】
【化２４】
【０１１６】
前記式（Ｖ−１）
【０１１７】
【化２５】
【０１１８】
は、実施例１（２）において発現したタンパク質変異体である、シトクロムｂ562変異体（Ｈ６３Ｃ）を意味し、前記変異体は、天然のシトクロムｂ562のアミノ酸配列中、第６３番目のヒスチジン残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【０１１９】
窒素雰囲気下、３０ｍＬの二つ口フラスコに窒素飽和の３ｍＬの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ＮａＯＨを加えてｐＨ９．０に調整したもの）および化合物１（８）（２．４８×１０-6ｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（０．１ｍＬ）を加えて室温にて撹拌した。そこへ、実施例１（２）において発現したＨ６３Ｃのストック溶液（２００μＬ，０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液中濃度１．２４×１０-3Ｍ、ｐＨ７．３、１×１０-4ＭのＥＤＴＡを含む）を滴下して加え、溶液を窒素下、室温にて穏やかに撹拌した。７時間後、化合物１（８）とＨ６３Ｃ（Ｖ−１）の結合体であるヘムタンパク質モノマー（Ｉ−１）を得た。
【０１２０】
前記溶液中のヘムタンパク質モノマー（Ｉ−１）に塩酸を加えてｐＨ１．９とし、ヘムタンパク質モノマー（ＩＩ−１）を得た。前記ヘムタンパク質モノマー（ＩＩ−１）の水溶液へ２−ブタノン（５ｍＬ×４）を加えて抽出操作を行った。水層を分離して透析膜（Ｗａｋｏ，ＭＷＣＯ、１４，０００Ｄａ）へと移し、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）によって４℃で透析を行った（５００ｍＬ×２時間×３）。得られたヘムタンパク質ポリマー（８）の水溶液を限外ろ過によって約１０-3Ｍまで濃縮し、冷暗所にて保管した。
【０１２１】
前記ヘムタンパク質ポリマー（８）は、式（ＩＩＩ−１）の構造であると推測できる。
【０１２２】
【化２６】
【０１２３】
前記式（Ｖ−１）
【０１２４】
【化２７】
【０１２５】
は、実施例１（２）において発現したタンパク質変異体である、シトクロムｂ562変異体（Ｈ６３Ｃ）を意味し、前記変異体は、天然のシトクロムｂ562のアミノ酸配列中、第６３番目のヒスチジン残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【実施例２】
【０１２６】
（１）式１（２）で示す化合物の製造
式１（２）で示す化合物は、以下のスキーム６に従い製造した。詳細には、Ｎ−Ｂｏｃ−１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン（ジアミン（８））の代わりに、Ｎ−Ｂｏｃ−１，２−ジアミノエタン（ジアミン（２））を用いた以外は、実施例１（１）の式１（８）で示す化合物の製造と同様にして行った。
【０１２７】
【化２８】
【０１２８】
得られた化合物３（２）、化合物４（２）、化合物５（２）および化合物１（２）のデータを以下に示す。
【０１２９】
化合物3(2): 収率33%。
1H NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ10.47 (s, 1H) 10.38 (s, 1H) 10.36 (s, 0.5H) 10.30 (s, 0.5H) 10.21 (s, 0.5H) 10.16 (s, 0.5H) 8.51-8.38 (m, 2H) 6.45-6.16 (m, 4H), 4.60-4.45 (m, 4H), 3.65-3.41 (m, 16H) 3.43 (m, 2H) 3.33 (m, 2H) 1.33 (s, 9H) 1.26 (s, 9H) -3.39 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 761.70 (M + H)+, C45H57N6O5について計算値： 761.97;
UV-vis (CHCl3) λmax / nm (吸収) 630 (0.032) 575 (0.041) 542 (0.070) 506 (0.084) 408 (1.02)。
【０１３０】
化合物4(2):収率 88%。
1H NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ 10.64 (s, 1H) 10.44 (s, 1H) 10.36 (m, 1H) 10.25 (m, 1H) 8.52-8.42 (m, 2H) 6.47-6.17 (m, 4H), 4.63-4.50 (m, 4H), 3.67-3.52 (m, 16H) 3.42-3.28 (m, 4H) -3.29 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 605.31 (M - TFA)+, C36H41N6O3について計算値： 605.75;
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収)627 (0.034) 574 (0.048) 537 (0.087) 503 (0.10) 401 (1.12)。
【０１３１】
化合物5(2): 収率 93%。
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 658.21 (M−Cl--HCl)+, C36H38FeN6O3について計算値： 658.57
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 598 (0.082) 478 (0.13) 398 (1.02)。
【０１３２】
化合物１(2): 収率 定量的。
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 626.16 (M-Cl-)+, C38H39FeIN6O4について計算値： 626.50
UV-vis (MeOH) λmax /nm (吸収) 610 (0.027) 495 (0.061) 397 (1.04)。
【０１３３】
（２）ヘムタンパク質モノマーおよびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーの製造（スキーム７参照）
式１（２）で示す化合物を用いて、ヘムタンパク質モノマーおよびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマー（２）を以下のスキーム７に従い製造した。詳細には、化合物１（８）の代わりに、化合物１（２）を用いた以外は、実施例１（３）のスキーム５に示す製造と同様にして行った。
【０１３４】
【化２９】
【０１３５】
前記ヘムタンパク質ポリマー（２）は、式（ＩＩＩ−２）の構造であると推測できる。
【０１３６】
【化３０】
【０１３７】
前記式
【０１３８】
【化３１】
【０１３９】
については前記と同様。
【実施例３】
【０１４０】
（１）式１（１３）で示す化合物の製造
式１（１３）で示す化合物は、以下のスキーム８に従い製造した。詳細には、Ｎ−Ｂｏｃ−１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン（ジアミン（８））の代わりに、Ｎ−ＢＯＣ−ジエチレングリコール−ビス（３−アミノプロピル）エーテル（ジアミン（１３））を用いた以外は、実施例１（１）の式１（８）で示す化合物の製造と同様にして行った。
【０１４１】
【化３２】
【０１４２】
得られた化合物３（１３）、化合物４（１３）、化合物５（１３）および化合物１（１３）のデータを以下に示す。
【０１４３】
化合物3(13): 収率 49%。
1H-NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ 10.34 (s, 1H) 10.21 (s, 0.5H) 10.17 (s, 1H) 10.14 (s, 1H) 10.03 (s, 0.5H) 9.95 (s, 0.5H) 8.39-8.25 (m, 2H) 6.41-6.14 (m, 4H) 4.60-4.38 (m, 4H) 3.62-3.45 (m, 16H) 3.34-3.15 (m, 12H) 3.06 (m, 2H) 2.76 (m, 2H) 2.61 (m, 2H) 2.44 (m, 2H) 1.74 (m, 2H) 1.49 (s, 9H) 1.43 (s, 9H) 1.39 (m, 2H), −3.80 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 921.83 (M + H)+, C53H72N6O8について計算値： 922.18;
UV-vis (CHCl3) λmax / nm (吸収) 630 (0.032) 576 (0.042) 540 (0.072) 506 (0.088) 408 (1.05)。
【０１４４】
化合物4(13): 収率 82%。
1H NMR (270 MHz, ピリジン-d5) δ 10.41 (s, 1H) 10.19 (s, 0.5H) 10.14 (br, 1.5H) 10.00 (s, 0.5H) 9.94 (s, 0.5H) 8.42-8.27 (m, 2H) 6.43-6.12 (m, 4H), 4.60-4.41 (m, 4H), 3.61-3.47 (m, 16H) 3.33-3.22 (m, 8H) 3.13 (m, 2H) 2.93 (m, 2H) 2.80 (m, 2H) 2.71 (m, 2H) 1.90 (m,2H) 1.44 (m, 2H) -3.88 (s, 2H);
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 765.55 (M - TFA)+, C44H57N6O6 について計算値：765.96;
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 628 (0.035) 574 (0.044) 538 (0.073) 504 (0.090) 401 (1.02)。
【０１４５】
化合物5(13): 化合物5(13)は水溶性が高く、最後の沈殿の水洗浄を充分に行うことが出来なかった。このため、精製を行わずに次の反応に用いた。
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 818.70 (M -Cl--HCl)+, C44H54FeN6O6 について計算値：818.72
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 601 (0.037) 494 (0.080) 396 (1.07)。
【０１４６】
化合物1(13):化合物1(13)は、更にシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製操作を行った(クロロホルム/メタノール = 10/1, v/v)。収率 19%。
ESI-TOF-MS (positive mode) m/z 986.66 (M−Cl-)+, C46H55FeIN6O7 について計算値：986.71
UV-vis (MeOH) λmax / nm (吸収) 596 (0.082) 483 (0.11) 398 (1.06)。
【０１４７】
（２）ヘムタンパク質モノマーおよびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーの製造（スキーム９参照）
式１（１３）で示す化合物を用いて、ヘムタンパク質モノマーおよびそのモノマーをモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマー（１３）を以下のスキーム９に従い製造した。詳細には、化合物１（８）の代わりに、化合物１（１３）を用いた以外は、実施例１（３）のスキーム５に示す製造と同様にして行った。
【０１４８】
【化３３】
【０１４９】
前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）は、式（ＩＩＩ−３）の構造であると推測できる。
【０１５０】
【化３４】
【０１５１】
前記式
【０１５２】
【化３５】
【０１５３】
については前記と同様。
［実施例１から３で得られたポリマーに関する種々性質］
（ｉ）ＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定
前記Ｈ６３ＣのＵＶ−ｖｉｓスペクトルと、実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを図１（ａ）および図１（ｂ）にそれぞれ示す。前記ＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）中２５℃で測定した。図１（ａ）および図１（ｂ）より、前記Ｈ６３Ｃおよび前記ヘムタンパク質ポリマー（８）が野生型シトクロムｂ562に特徴的な４１８、５３０および５６４ｎｍにおける吸収を有することを確認した。従って、野生型シトクロムｂ562にヘムリンカーを導入した本発明のヘムタンパク質ポリマー（８）の鉄が、野生型シトクムｂ562と同様にヘムポケットに保持されていることが確認できた。
【０１５４】
（ｉｉ）質量スペクトルの測定
前記ヘムタンパク質ポリマーのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルおよびデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２にそれぞれ示す。実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ａ）に、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ｂ）に示す。前記ヘムタンパク質ポリマー（８）の分子量の計算値は、１２５３２．９である。図２（ｂ）から、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）の分子量は計算値と一致していることが確認できた。
【０１５５】
また、実施例２で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（２）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ｃ）に、前記ヘムタンパク質ポリマー（２）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ｄ）に示す。前記ヘムタンパク質ポリマー（２）の分子量の計算値は、１２４４４．８である。図２（ｄ）から、前記ヘムタンパク質ポリマー（２）の分子量は計算値と一致していることが確認できた。
【０１５６】
また、実施例３で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ｅ）に、前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図２（ｆ）に示す。前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）の分子量の計算値は、１２６０６．０である。図２（ｆ）から、前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）の分子量は計算値と一致していることが確認できた。
【０１５７】
（ｉｉｉ）反応性チオールの含有量を測定
また、実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）および前記Ｈ６３Ｃについて、反応性チオールの含有量を評価した。この評価は、５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）中、２５℃において、過剰なジチオビスニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）存在下における前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のＵＶスペクトルを測定することにより行った。その結果を、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）については図３（ａ）に、前記Ｈ６３Ｃについては図３（ｂ）に示す。図３（ａ）において、ａは前記ヘムタンパク質ポリマー（８）自体のＵＶスペクトル、ｂはＤＴＮＢ自体のＵＶスペクトル、ｃは過剰なＤＴＮＢと前記ヘムタンパク質ポリマー（８）との混合物のＵＶスペクトル、およびｄは前記ｃ−ａ−ｂの差のスペクトルである。前記ヘムタンパク質ポリマー（８）の代わりに前記Ｈ６３Ｃを用いた場合の結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）において、ａは前記Ｈ６３Ｃ自体のＵＶスペクトル、ｂはＤＴＮＢ自体のＵＶスペクトル、ｃは過剰なＤＴＮＢと前記Ｈ６３Ｃとの混合物のＵＶスペクトル、およびｄは前記ｃ−ａ−ｂの差のスペクトルである。前記図３（ａ）および図３（ｂ）から、反応性チオールの含有量は、図３ｂにおける４５０ｎｍにおける吸光度の増加に基づき、前記Ｈ６３Ｃについてはひとつのタンパク質あたりにひとつの反応性チオールが含まれており、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）では反応性チオールが含まれていないことが確認できた。従って、本発明のヘムタンパク質ポリマーでは、Ｈ６３Ｃの反応性チオールの位置に前記ヘムリンカーが修飾されていることが確認できた。
【０１５８】
（ｉｖ）ＣＤスペクトルの測定
前記ヘムタンパク質ポリマーおよび前記Ｈ６３Ｃについて、ＣＤスペクトルを測定した。その結果を図４に示す。図４中、前記Ｈ６３ＣのＣＤスペクトルはａ、実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のＣＤスペクトルはｂ、実施例２で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（２）のＣＤスペクトルがｃ、実施例３で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）のＣＤスペクトルはｄである。前記図４から、前記ヘムタンパク質ポリマーは、前記Ｈ６３Ｃのものと比較して、極小波長およびモル楕円率に変化が無いことから、前記ヘムタンパク質ポリマー（２）、ヘムタンパク質ポリマー（８）およびヘムタンパク質ポリマー（１３）は、前記Ｈ６３Ｃの立体構造を保ったまま、ポリマーを形成していることが確認できた。
【０１５９】
（ｖ）サイズ排除クロマトグラムの測定
前記ヘムタンパク質ポリマーについて、サイズ排除クロマトグラフィーを測定した。溶出溶媒には５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）に０．１５ＭのＮａＣｌを加えたものを用いた。測定は温度４℃、流速０．５ｍＬ／分にて行った。その結果を図５（ａ）に示す。図５（ａ）中、実施例１で得られた前記ヘムタンパク質ポリマー（８）のクロマトグラムはｂ、実施例２で得られた前記ヘムタンパク質ポリマー（２）のクロマトグラムはａ、実施例３で得られた前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）のクロマトグラムはｃである。標準サンプルとして、前記と同様の条件で溶出したサンプルについての結果を図５（ｂ）に示す。図５（ｂ）中、ｄは２０００ｋＤａのブルーデキストラン（排除限界における溶出位置を決めるためのサンプル）、ｅは４４０ｋＤａのフェリチン、ｆは２３２ｋＤのカタラーゼ、ｇは６７ｋＤａのアルブミン、ｈは２５ｋＤａのケモトリプシノーゲンおよびｉは１２．５ｋＤａのＨ６３Ｃについてのクロマトグラムである。図５（ａ）および図５（ｂ）から、ヘム由来の吸収帯である４００ｎｍにおける光吸収を検出することによって、ヘムタンパク質ポリマーの溶出を確認した。ヘム部分とタンパク質部分とが同時に溶出しているのを確認するために、２８０ｎｍ検出によっても同様にＳＥＣ測定を行ったところ、４００ｎｍ検出における溶出のクロマトグラムと一致したことから、ヘム部分とタンパク質部分とは複合体であるポリマーを形成しながら同時に溶出していることを確認した。
【０１６０】
（ｖｉ）濃度を変化させた条件下でのサイズ排除クロマトグラムの測定
実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）について、前記ポリマーの濃度を１２μＭ、５０μＭ、１２５μＭ、３１０μＭおよび１２５０μＭのそれぞれにおいて、前記（ｖ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラムを測定した。その結果を図６に示す。図６から、前記ポリマー（８）の濃度が高くなるにつれ、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）の長さが長くなり、かつヘムタンパク質モノマーの量が低下することが確認できた。
【０１６１】
（ｖｉｉ）ヘムを添加することによる、ヘムタンパク質モノマーからヘムタンパク質ポリマーへの変換阻害
前記（ｖｉ）で得られた結果から、前記ヘムタンパク質ポリマーは、濃度依存的にヘムタンパク質モノマーと平衡状態にあることが考えられる。この点をさらに確認するため、様々な濃度のヘムを添加した条件下で、前記（ｖ）と同様にしてヘムタンパク質ポリマー（８）のサイズ排除クロマトグラムを測定した。前記ヘムの濃度としては、（ヘムの濃度）／（実施例１で得られたヘムタンパク質ポリマー（８）の濃度）が、０、０．３、０．６、１．０、１．５および２．０を用いた。その結果を図７に示す。図７より、ヘムの濃度が高いほど、低分子のヘムタンパク質モノマー（またはダイマー）が得られることが確認できた。従って、前記ヘムタンパク質モノマーからヘムタンパク質ポリマーへ変換する際、前記ヘムはヘムタンパク質モノマーの反応部分をふさぐことにより、変換を阻害することが確認できた。
【０１６２】
（ｖｉｉｉ）希薄濃度におけるＵＶスペクトルの測定
実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）等について、前記ポリマーの濃度を２．５ｍＭから２．５μＭへと希釈し、前記（ｉｉｉ）と同様にしてＵＶスペクトルを連続的に測定した。その結果を図８に示す。図８（ａ）は、実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマー（８）の時間経過に伴うスペクトルを、図８（ｂ）は、図８（ａ）の差スペクトルを、図８（ｃ）は、天然のヘムと、Ｈ６３ＣのＵＶスペクトルを、図８（ｄ）は、図８（ｃ）の差スペクトルを示す。図８から、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）は、濃度を希釈することによってＵＶスペクトルの形状がＨ６３Ｃのスペクトルから天然のヘムのスペクトルへと時間経過とともに変化することが確認された。従って、前記ヘムタンパク質ポリマーは、濃度を希釈することによって、前記ヘムタンパク質ポリマー(8)の鉄が、ヘムポケットに保持された状態からヘムポケット外へと解離した状態へと遷移し、モノマーへと解離すると推定した。
【０１６３】
（ｉｘ）ヘムタンパク質モノマーとヘムタンパク質ポリマーとの平衡
前記ポリマーとモノマーとの平衡を、前記ヘムタンパク質ポリマー（２）、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）および前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）をそれぞれ２２５倍に希釈した後、前記（ｖｉｉｉ）と同様にしてＵＶスペクトルを測定した。その結果を図９に示す。断片的な変化は、４１８ｎｍにおける吸光度の変化に基づき計算した。図９から、平衡に達するまでに要する時間は、前前記ヘムタンパク質ポリマー（２）、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）、前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）の順番で長くなることが確認できた。
【０１６４】
（ｘ）原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定
ＡＦＭ測定に用いたサンプルは以下のように調製した。高配向性焼結グラファイト（ＨＯＰＧ）基板の表面を壁開し、その壁開面を実施例１および３で得たヘムタンパク質ポリマーの水溶液（約１０-8Ｍ、０．０５Ｍトリス緩衝液中、ｐＨ７．３）に数秒間浸漬した。基板を溶液から引き上げた後、水でよく洗浄し、室温にて塩化カルシウムの入ったデシケーター内にてよく乾燥させた後、ＡＦＭ測定装置にセットした。測定はタッピングモードで行い、スキャン速度は２Ｈｚ、探針には曲率半径が約１０ｎｍのシリコン単結晶を用いた。実施例１で得たヘムタンパク質ポリマーと実施例２で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージを図１０に示す。図１０（ａ）は、１．５５μｍ×１．５５μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例１で得たヘムタンパク質ポリマー（８）のＡＦＭイメージ、図１０（ｂ）は、１．６７μｍ×１．６７μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例１で得たヘムタンパク質ポリマー（８）のＡＦＭイメージ、図１０（ｃ）は、１．８７μｍ×１．８７μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例３で得たヘムタンパク質ポリマー(１３)のＡＦＭイメージ、図１０（ｄ）は、１．８５μｍ×１．８５μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例３で得たヘムタンパク質ポリマー(１３)のＡＦＭイメージを示す。図１０（ａ）および（ｂ）から、前記ヘムタンパク質ポリマー（８）ではいくつかのワイヤー状の組織体が確認できた。図１０（ｃ）および（ｄ）から、前記ヘムタンパク質ポリマー（１３）では、濃度条件が希薄なためにモノマーへの解離が起こり、有意なワイヤー状組織体は確認できなかった。また、図１１（ａ）には、１．８０μｍ×１．８０μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例２で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージと、その断面図を示す。図１１ｂには、３６４ｎｍ×３６４ｎｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例２で得たヘムタンパク質ポリマー（２）のＡＦＭイメージを示す。図１１（ａ）から、多数の観測されたワイヤー状の組織体は、ＨＯＰＧ基板からの高さが均一であることが確認できた。また図１１（ｂ）から、ひとつの観測されたワイヤー状の組織体の長さが約３５０ｎｍに達しており、ヘムタンパク質が約１４０量体を形成したものと推定した。
【０１６５】
前記ＡＦＭイメージから、本発明によって得られたヘムタンパク質モノマーは、直径約２．５ｎｍ、高さ約５．０ｎｍの円柱状であり、ヘムタンパク質ポリマーは、それが連なった高さ２．５〜５．０ｎｍ、幅２．５〜５．０ｎｍ、長さ２〜５００ｎｍの集合体（図１２参照）を形成しているものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明のヘムタンパク質ポリマーは、酵素の集合体として用いることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１ａ】図１ａは、Ｈ６３ＣのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図１ｂ】図１ｂは、ヘムタンパク質ポリマー（８）のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図２】図２は、ヘムタンパク質ポリマー（８）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。図２（ａ）は、ヘムタンパク質ポリマー（８）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２（ｂ）はヘムタンパク質ポリマー（８）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２（ｃ）は、ヘムタンパク質ポリマー（２）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２（ｄ）はヘムタンパク質ポリマー（２）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２（ｅ）はヘムタンパク質ポリマー（１３）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを、図２（ｆ）はヘムタンパク質ポリマー（１３）のデコンボリューション化したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルをそれぞれ示す。
【図３ａ】図３ａは、ヘムタンパク質ポリマー（８）とＤＴＮＢのＵＶスペクトルを示す。図中、ａはヘムタンパク質ポリマー（８）自体のＵＶスペクトル、ｂはＤＴＮＢ自体のＵＶスペクトル、ｃは過剰なＤＴＮＢと前記ヘムタンパク質ポリマー（８）との混合物のＵＶスペクトル、およびｄは前記ｃ−ａ−ｂの差のスペクトルである。
【図３ｂ】図３ｂは、Ｈ６３ＣとＤＴＮＢのＵＶスペクトルを示す。図中、ａは前記Ｈ６３Ｃ自体のＵＶスペクトル、ｂはＤＴＮＢ自体のＵＶスペクトル、ｃは過剰なＤＴＮＢと前記Ｈ６３Ｃとの混合物のＵＶスペクトル、およびｄは前記ｃ−ａ−ｂの差のスペクトルである。
【図４】図４は、前記ヘムタンパク質ポリマーおよび前記Ｈ６３ＣのＣＤスペクトルを示す。
【図５】図５は、前記ヘムタンパク質ポリマーと標準物質のサイズ排除クロマトグラムを示す。図５（ａ）は、前記ヘムタンパク質ポリマーのクロマトグラムを、図５（ｂ）は標準物質のクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、ヘムタンパク質ポリマー濃度を変化させた条件下でのサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図７】図７は、様々なヘム濃度の条件下におけるヘムタンパク質ポリマーのサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図８】図８は、希薄濃度におけるＵＶスペクトルを示す。図８（ａ）は、実施例１で得た前記ヘムタンパク質ポリマーのスペクトルを、図８（ｂ）は、図８（ａ）の差スペクトルを、図８（ｃ）は、天然のヘムと、Ｈ６３ＣのＵＶスペクトルを、図８（ｄ）は、図８（ｃ）の差スペクトルを示す。
【図９】図９は、２２５倍に希釈した前記ヘムタンパク質ポリマーと前記ヘムタンパク質モノマーとの平衡を示すＵＶスペクトルの時間変化を示す。
【図１０】図１０は、ヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージを示す。図１０（ａ）は、１．５５μｍ×１．５５μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例１で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージ、図１０（ｂ）は、１．６７μｍ×１．６７μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例１で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージ、図１０（ｃ）は、１．８７μｍ×１．８７μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例３で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージ、図１０（ｄ）は、１．８５μｍ×１．８５μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例３で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージを示す。
【図１１ａ】図１１ａは、１．８０μｍ×１．８０μｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例２で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージと、その断面図を示す。
【図１１ｂ】図１１ｂは、３６４ｎｍ×３６４ｎｍサイズのＨＯＰＧ上の実施例２で得たヘムタンパク質ポリマーのＡＦＭイメージを示す。
【図１２】図１２は、ヘムタンパク質ポリマーの模式図を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１６８】
配列番号１ シトクロムｂ562
配列番号２ ミオグロビン（sus scrofa）
配列番号３ 西洋ワサビペルオキシダーゼ
配列番号４ Ｈ６３Ｃシトクロムｂ562
配列番号５ 変異部位導入プライマー
配列番号６ Ｍ１３プライマーＭ４
配列番号７ Ｍ１３プライマーＲＶ
配列番号８ ＭＵＴ４プライマー
配列番号９ ヘモグロビンαサブユニット（human）
配列番号１０ ヘモグロビンβサブユニット（human）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩。
【化１】
前記式（Ｉ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【化２】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【請求項２】
一般式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩。
【化３】
前記式（ＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【化４】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味する。
【請求項３】
前記ヘムタンパク質が、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼである請求項１または２に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩。
【請求項４】
請求項２に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩。
【請求項５】
前記ヘムタンパク質ポリマーが、一般式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーである請求項４に記載のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩。
【化５】
前記式（ＩＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【化６】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【請求項６】
請求項１に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法であって、
一般式（ＩＶ）で表わされるヘムリンカーと、一般式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質とを反応させて、請求項１に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩を得る製造方法。
【化７】
前記式（ＩＶ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式（Ｖ）
【化８】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【請求項７】
請求項２に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法であって、
請求項１に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩を酸で処理することにより、請求項２に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩を得る製造方法。
【請求項８】
請求項４に記載のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法であって、
請求項２に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩を中性条件下で処理することにより、請求項４に記載のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩を得る製造方法。
【請求項９】
前記ヘムタンパク質ポリマーが、請求項４に記載のヘムタンパク質ポリマーである請求項７に記載のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法。
【請求項１０】
前記ヘムタンパク質が、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼである請求項８または９に記載のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法。
【請求項１】
一般式（Ｉ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩。
【化１】
前記式（Ｉ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【化２】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【請求項２】
一般式（ＩＩ）で表わされるヘムタンパク質モノマーまたはその塩。
【化３】
前記式（ＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【化４】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味する。
【請求項３】
前記ヘムタンパク質が、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼである請求項１または２に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩。
【請求項４】
請求項２に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩をモノマー単位とするヘムタンパク質ポリマーまたはその塩。
【請求項５】
前記ヘムタンパク質ポリマーが、一般式（ＩＩＩ）で表わされるヘムタンパク質ポリマーである請求項４に記載のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩。
【化５】
前記式（ＩＩＩ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式
【化６】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【請求項６】
請求項１に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法であって、
一般式（ＩＶ）で表わされるヘムリンカーと、一般式（Ｖ）で表わされるヘムタンパク質とを反応させて、請求項１に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩を得る製造方法。
【化７】
前記式（ＩＶ）中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基または低級アルケニル基を意味し、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−または−（ＣＨ2）n1−Ｏ−（ＣＨ2）n2−Ｏ−（ＣＨ2）n3−Ｏ−（ＣＨ2）n4−で表わされる基であり、ここでｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜２０の整数を意味し、
式（Ｖ）
【化８】
は、ヘムタンパク質の変異体を意味し、前記変異体は、天然のヘムタンパク質のアミノ酸配列中、１つのアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えたものである。前記変異体中、−ＳＨは、前記システイン残基の側鎖チオール基を意味し、Ｆｅは、前記ヘムタンパク質に含まれるポルフィリン基の４つの窒素原子と結合している。
【請求項７】
請求項２に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩の製造方法であって、
請求項１に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩を酸で処理することにより、請求項２に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩を得る製造方法。
【請求項８】
請求項４に記載のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法であって、
請求項２に記載のヘムタンパク質モノマーまたはその塩を中性条件下で処理することにより、請求項４に記載のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩を得る製造方法。
【請求項９】
前記ヘムタンパク質ポリマーが、請求項４に記載のヘムタンパク質ポリマーである請求項７に記載のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法。
【請求項１０】
前記ヘムタンパク質が、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、またはペルオキシダーゼである請求項８または９に記載のヘムタンパク質ポリマーまたはその塩の製造方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２】
【図１ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２】
【公開番号】特開２００８−２２２５６５（Ｐ２００８−２２２５６５Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５９１０９（Ｐ２００７−５９１０９）
【出願日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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