ペグインターフェロン及びリバビリンへの反応に関する処置前血清ＩＰ−１０定量と組み合わされたＩＬ２８Ｂ遺伝子多型性の予測値は、単独のこれらの生物マーカーのいずれとの比較においても高められる。
本発明は、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の結果を予測するために、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定をＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値と組み合わせる方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン（ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）及びリバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）への持続性ウイルス学的反応（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＳＶＲ）又は無−反応の結果を予測するために、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定をＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値と組み合わせる方法に関する。
【０００２】
フラビウイルス科のメンバーであるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、肝臓の慢性炎症を引き起こし、肝臓線維症、肝硬変及び肝臓ガンに導き得る血液−由来ウイルスである。世界中で約１憶７千万の人々がＨＣＶに感染し、処置の選択肢は限られている。慢性Ｃ型肝炎の処置のための現在の医療の標準は、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）の週に１回の注射及びリバビリンの１日２回の経口的投与から成る（非特許文献１）。しかしながら、４８週間の管理で処置された遺伝子型２又は３に感染した患者の８０％と比較して、４８週間の管理で処置された遺伝子型１又は４に感染した患者のわずか４０〜５０％しか持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）を達成しない。従って、明らかにＩＦＮ−α／リバビリン処置反応へのウイルス遺伝子型の要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）が存在する。さらに、現在の医療の標準は、多くの場合にうつ病及び貧血のような副作用を伴う（非特許文献１）。従って、ＨＣＶ患者のための新規な、より有効な、且つより安全な処置の選択肢を求める満たされない医学的要求がある。
【０００３】
従って、ＨＣＶ遺伝子型１の処置のための医療の標準は、現在、４８週間のポリエチレングリコール化ＩＦＮ−α及びリバビリンを、持続性ウイルス学的反応が達成されたか否かを決定するための２４週間の経過観察期間と一緒に含む。持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）は、治療を停止してから後の少なくとも２４週間の検出可能なＨＣＶ ＲＮＡの不在として定義される。これらの薬剤を用いる処置に関連する持続期間、経費及び罹病率は、反応をより良く理解し、処置戦略の修正から利益を得るであろう患者をあらかじめ同定したいという要求を当該技術分野で（ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ）確立した。
【０００４】
最近、種々の民族的背景からのＨＣＶ−感染患者におけるＩＬ２８Ｂ多型性と臨床的に決定されるウイルスのクリアランスの間の強い連鎖と一緒に、ＩＦＮ−αへの反応への遺伝子の寄与を示すデータが作られた（ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）。このデータは、サイトカイン血清マーカーにより以前に関連があるとされた処置の失敗への宿主の要素を支持し、最も一致することは、処置の開始の前に測定されるＩＰ−１０血清レベルのそれである。
【０００５】
抗−ＨＣＶ活性を示したＩＦＮ−λタンパク質はＩＬ２８Ａ／Ｂ及びＩＬ２９遺伝子によりコードされ（非特許文献２；非特許文献３）；ＩＬ２８Ｂ遺伝子はインターフェロン−λ３（ＩＦＮ−λ３）をコードする。最近の研究は、処置反応の予測マーカーの可能性のあるものとして、ＩＬ２８Ｂ遺伝子の３キロ塩基（ｔｈｒｅｅ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ）（３ｋｂ）上流の単ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）（ｒｓ１２９７９８６０，配列番号：１）を同定した（非特許文献４）。この発見は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子に近接して位置する他のＳＮＰマーカー（ｒｓ１２９８０２７５，配列番号：２及びｒｓ８０９９９１７，配列番号：３）を用いる他の独立した研究により確証された（非特許文献５；非特許文献６）。有利な変異体は、ＨＣＶ薬剤処置への反応における２倍より大きな差と強く関連することが示された。多−民族集団全体に及んで、有利な変異体の２つのコピーを保有する患者
の約８０％がＩＦＮ−α治療の間にウイルスをクリアリングし、処置から後の２４週間の間、ウイルスがないままであった。遺伝子の関連性は、ヨーロッパ人、アフリカ人及びアジア人患者を含む調べられたすべての民族グループにおいて、反応予測において重要であると思われる。これらの研究は、ＩＦＮ−α処置への反応の向上と結び付けられる、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＩＬ２８ＢのｍＲＮＡ発現がＩＬ２８Ｂ遺伝子型により影響を受けるという予備的な証拠も提供する。もっと後の研究において、この遺伝子型は、ヨーロッパ人及びアフリカ人の系統（ａｎｃｅｓｔｒｙ）の両方の患者（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）の中で、ＨＣＶ感染の自然の解決を強力に増加させることも示した（非特許文献７）。これらの研究は、個人的な薬剤設定においてＩＦＮ−αへの反応を予測し得るといういくらかの見込みも提供した。
【０００６】
無−反応に関するマーカーとしてのＩＦＮ−γ−誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０又はＣＸＣＬ１０）の同定の前に、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン（ＩＬ）１Ｂ、ＩＬ−１０及びＩＬ−８がＩＦＮ−α処置への無反応の血清マーカーとして同定された。ＩＰ−１０は、ＨＣＶ患者において肝臓内及び血清中の両方で高められることが示され、これらのレベルはＩＦＮ−αに反応する患者においてより無−反応ＨＣＶ患者において高められることが見出された。この観察は次いで、ベースラインレベルが処置反応予測に関する最も重要な決定因子であるヨーロッパ系コーカサス人ＤＩＴＴＯ研究（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃａｕｃａｓｉａｎ ＤＩＴＴＯ−ｓｔｕｄｙ）を含むより大きなデータセットにおいて確証された（非特許文献８；非特許文献９）。続いてＩＰ−１０発見はＨＣＶ／ＨＩＶ共−感染患者に拡大され（非特許文献１０）、それは続いて第２の研究において確証され、さらにこれらの患者における肝臓炎症及び線維症と関連付けられた（非特許文献１１）。ＩＰ−１０の関連性は種々の人種のグループにおいても示された（非特許文献１２）。
【０００７】
ＲＮＡ、細胞又はタンパク質レベルで示される高められた免疫反応はＩＦＮ−α／リバビリン治療へのより低い反応を示し得るという一般的な見解が当該技術分野において現れたが、これは臨床的に用いられるべき分析又は精巧化（ｓｏｐｈｙｓｔｉｃａｔｉｏｎ）のレベルに達しなかった。既知のマーカーにかかわらず、無−反応に関連する機構は明らかにならないままである。さらに、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型は、見込みはあるが、インターフェロン反応のすべての側面を説明しておらず、この発見がいかにしてウイルス遺伝子型、ウイルス負荷、体重、線維症及びＩＰ−１０のような他の既知の生物マーカーに関連するかはまだ明らかでない。ＩＬ２８Ｂ遺伝子産物ＩＦＮ−λ３の活性と免疫遺伝子の発現の間の分子的連鎖は、ＩＬ２８Ｂ及び下流のサイトカイン及びケモカインレベルが依存性であるはずであり、従ってＩＰ−１０のような下流血清マーカーは同じ表現型の現象を有効に記述するであろうことを示唆している。
【０００８】
最近記載されたＩＬ２８Ｂにおける遺伝子多型性は非常に刺激的であり、ペグインターフェロン及びリバビリンを用いる治療への持続性ウイルス学的反応を達成するための重要な予後的情報を与えることができる。しかしながら、独立のテストとしてのその臨床的有用性は依然として限られている。ＣＣ遺伝子型に関し、ＳＶＲの尤度は約８０％であると見積もられる。対照的に、ＴＣ異型接合体に関し、反応の尤度は約５０％に減少する。かくして遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）テストの陽性又は陰性予測値（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）は比較的低く、それは抗ウイルス治療のための決定におけるその使用を減少させるであろう。遺伝子的テストを他の容易に利用可能な抗ウイルス反応のマーカーと組み合わせて用いて、その予測能力を組み立てる（ｂｕｉｌｄ ｕｐｏｎ）方法は、陽性及び陰性予測値を向上させ、その臨床的有用性を向上させることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｄ ａｎｄ Ｈａｄｚｉｙａｎｎｉｓ著，Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ２４ Ｓｕｐｐｌ ２，２００４年，４７−５４
【非特許文献２】Ｋｏｔｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２００３年，６９
【非特許文献３】Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２００３年，６３
【非特許文献４】Ｇｅ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ４６１：２００９年，３９９
【非特許文献５】Ｓｕｐｐｉａｈ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：２００９年，１１００
【非特許文献６】Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：２００９年，１１０５
【非特許文献７】Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ４６１：２００９年，７９８
【非特許文献８】Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．著，ＪＩＤ １９４：２００６年，８９５
【非特許文献９】Ｌａｇｇｉｎｇ ｅｔ ａｌ．著，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４４：２００６年，１６１７
【非特許文献１０】Ｚｅｒｅｍｓｋｉ ｅｔ ａｌ．著，ＪＡＩＤＳ ４５：２００７年，２６２
【非特許文献１１】Ｒｅｉｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．著，Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ １３：２００８年，９６９
【非特許文献１２】Ｆｒｉｅｄ ｅｔ ａｌ．著，ＡＡＳＬＤ ２００８，ｐｏｓｔｅｒ １２２３
【発明の概要】
【００１０】
本発明の一部は、コーカサス人及びアフリカ系アメリカ人（Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ）におけるＨＣＶ試料の分析であり、予期せぬことに、その分析でＩＰ−１０血清レベル及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型が反応の相補的且つ独立した予測物質（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ）であること、ならびに特定的に、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型に関して異型接合性又は無−反応者遺伝子型に関して同型接合性のＨＣＶ感染患者において測定されるＩＰ−１０レベルが、ＩＦＮ−α処置に対する反応の決定において追加の価値を与えることが決定された。
【００１１】
ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ対立遺伝子識別キット（ａｌｌｅｌｉｃ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用い、ＮＩＨ−基金提供（ｆｕｎｄｅｄ）臨床試験であるＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃからの８０人の協力者に、ＩＬ２８Ｂ多型マーカーｒｓ１２９７９８６０を試験した。遺伝子型決定された患者は下部−研究（ｓｕｂ−ｓｔｕｄｙ）に含まれ、彼らに関し、保管された血清中で一パネルの（ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ）血清サイトカインを測定した（Ｆｒｉｅｄ ｅｔ ａｌ．著，ＥＡＳＬ ２００８）。本コホートは４０人のＳＶＲ及び４０人の無−反応者を含み、その中の３９人はコーカサス人であり、４１人はアフリカ系アメリカ人であった。ＣＣ、ＣＴ又はＴＴ遺伝子型がそれぞれ１９％、６１％及び２０％において見出され、８７％、４７％及び２５％の対応するＳＶＲ率が伴い（Ｃｈｉ２＝１３．４，ｐ＝０．００１２）、それはＧｅ ｅｔ ａｌ．（２００９年，Ｎａｔｕｒｅ ４６１：３９９）の初期の報告と一致している。
【００１２】
平均血清ＩＰ−１０レベルは類似であり、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型と関連していないと思われた（ｐ＝０．２８）。高（＞６００ｐｇ／ｍｌ）ＩＰ−１０レベルを有する患者における３６％に対し、低（＜６００ｐｇ／ｍｌ）ＩＰ−１０レベルを有する患者において７８％のＳＶＲ率が見出された（Ｃｈｉ２＝１７．１，ｐ＜０．０００１）。
【００１３】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型グループ内の血清ＩＰ−１０レベルは、ＳＶＲの尤度に関して追加の独立した情報を提供した（Ｃｈｉ２＝２７．５，ｐ＜０．０００１）。さらに特定的に、高ＩＰ−１０レベルを有する場合の３４％に対して低ＩＰ−１０レベルを有するＣＴ保有者は７９％のＳＶＲを有した。ＴＴ保有者の中で、類似の関連性が同定された（高ＩＰ−１０の場合の１０％に対して低ＩＰ−１０の場合の５０％）。
【００１４】
【表１】
【００１５】
従って、非−ＣＣ遺伝子型においてＩＬ２８Ｂ遺伝子型を処置前血清ＩＰ−１０測定値と組み合わせると、ペグインターフェロン及びリバビリンに対するＳＶＲ及び無−反応の間をさらに良く識別することにより、個々の患者に関する予測値は向上する。さらに特定的に、説明変数としてＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０の両方を含むＳＶＲの一般化線形モデルフィッティングは、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＜０．００１３）及び血清ＩＰ−１０（ｐ＜０．００１６）の有意な寄与効果を示すが、持続性ウイルス学的反応の評価におけるＩＬ２８ＢとＩＰ−１０の間の相互作用の寄与効果を示さない（ｐ＝０．７５）。
【００１６】
従って本発明は、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の結果を予測するために、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定をＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値と組み合わせる方法に関する。
【００１７】
より広い意味で、本発明は、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の結果を予測するために、ＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定、人種又はＣ型肝炎ウイルス負荷決定より成る群から選ばれる２つもしくはそれより多いパラメーターを組み合わせる方法に関する。
【００１８】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定をＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値と組み合わせる方法において、パラメーターである人種又はＣ型肝炎ウイルス負荷決定の１つ又は両方を、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の結果の予測のために加えることができる。
【００１９】
本発明のさらに別の側面は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型が多型マーカー、ｒｓ１２９７９８６０、ｒｓ１２９８０２７５及び／又はｒｓ８０９９９１７あるいはこれらのマーカーと連鎖不平衡にある他のいずれかの遺伝子マーカーを含むことである。
【００２０】
本発明は、これらの２つの個別のマーカー（ＩＬ２８Ｂ遺伝子型、血清ＩＰ−１０レベル）のいずれかと比較して、ＨＣＶに感染した個々の患者に関してペグインターフェロン及びリバビリンへのＳＶＲと無−反応の間をさらに良く識別することにも関する。
【００２１】
予期せぬことに、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０に関する結果を組み合わせる
ことは、ＴＴ又はＴＣ遺伝子型の中で持続性ウイルス学的反応に関する陰性予測値を向上させる。
【００２２】
本発明の一部は、少なくともＩＬ２８Ｂ多型性及びＨＣＶ−感染患者からの血清中のＩＰ−１０レベルの決定又は測定のための手段を含んでなる診断アッセイでもある。
【００２３】
本発明の別の態様は、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の予測のための、本方法から得られる結果情報を用いるモデル研究ソフトウェアを含んでなるコンピューターシステムである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】インターフェロンα／リバビリン治療への５０人の反応（ＳＶＲ）及び５０人の無反応ＨＣＶ患者において測定される３７種のサイトカインの処置前血清濃度を示すヒートマップ（ｈｅａｔｍａｐ）。
【図２Ａ】ＩＦＮ治療への反応者におけるベースラインでのＩＰ−１０測定値対無反応者におけるベースラインでのＩＰ−１０測定値を示すグラフ。
【図２Ｂ】患者をＩＰ−１０測定値の６００ｐｇ／ｍｌの閾値に従って層別したモザイクプロット。
【図３】１００人のＨＣＶ患者においてベースラインで測定される３７種のサイトカインを含む相関マトリックス。
【図４】ＩＦＮα＋リバビリン処置への反応者及び無反応者におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｒｓ１２９７９８６０）分布。
【図５】８０人のＨＣＶ患者における処置前血清ＩＰ−１０濃度との関連におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｒｓ１２９７９８６０）。
【図６】治療結果との関連におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０濃度（６００ｐｇ／ｍｌより高いか又は低い）の組み合わせ分析。
【図７】ＩＬ２８Ｂ遺伝子型のみに基づく（上のパネル）、ＩＰ−１０血清レベルのみに基づく（中のパネル）ならびにＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０レベルの組み合わせ分析に基づくＨＣＶ患者における処置結果の予測値を比較するグラフによるまとめ。
【図８】血清ＩＰ−１０レベルに基づく、ペグインターフェロン及びリバビリン処置への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）をフィッティングするロジスティック回帰分析ならびに遺伝子型のそれぞれに関する回帰曲線のグラフ図。
【図９Ａ】反応者（ＳＶＲ）及び無−反応者患者における処置前血清ＩＰ−１０データの分布グラフ。
【図９Ｂ】反応者（ＳＶＲ）及び無−反応者患者における処置前血清ＩＰ−１０レベル及び処置反応結果に基づくモザイクプロット。
【図１０】コホート全体における、又は人種グループごとに層別された、処置前血清ＩＰ−１０レベルに基づく反応者（ＳＶＲ）である確率をフィッティングするロジスティック回帰分析のグラフによるまとめ。
【図１１Ａ】コーカサス系アメリカ人においてＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従って層別されたＨＣＶ患者中の処置前血清ＩＰ−１０。
【図１１Ｂ】アフリカ系アメリカ人においてＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従って層別されたＨＣＶ患者中の処置前血清ＩＰ−１０。
【図１２】処置前血清ＩＰ−１０及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従って層別されたＨＣＶ患者における持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）率（％）。
【図１３】血清ＩＰ−１０レベルのみに基づく、又は血清ＩＰ−１０のレベルとＩＬ２８Ｂ遺伝子型の組み合わせに基づく、ペグ−インターフェロン及びリバビリン処置への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）をフィッティングするロジスティック回帰分析のグラフによるまとめ。
【図１４】ペグ−インターフェロン及びリバビリン処置へのＳＶＲの予測における、処置前血清ＩＰ−１０、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型、人種、ベースラインＨＣＶウイルス負荷又はこれらのパラメーターの組み合わせに関する受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析。
【図１５】ｐｅｇＩＦＮ及びリバビリン治療への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）の予測物質。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
実施例の節
【実施例１】
【００２６】
患者及び処置
ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃ研究は、遺伝子型１感染を有するＡＡ及びＣＡの中での反応の率及び予測物質を評価するため、ならびに治療への無反応に関する理由を同定するために設計された、慢性Ｃ型肝炎の組み合わせペグインターフェロン及びリバビリン治療の多施設治験（ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｓｔｕｄｙ）であった。ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃ試験の設計及び一次的結果は他の場所で報告された［Ｃｏｎｊｅｅｖａｒａｍ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｉｎ Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ ａｎｄ Ｃａｕｃａｓｉａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３１（２）：２００６年，ｐ．４７０−７］。治療未経験（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｎａｉｖｅ）であり、遺伝子型１に感染しており、検出可能なＨＣＶ ＲＮＡを有し、且つ慢性ＨＣＶの組織学的証拠を有する１８歳及びそれより年長の患者は、関与する資格があった。１日当たり２杯又は同等量（２０ｇ）より多くのアルコール消費の歴史又は過去６ヶ月以内のアルコール乱用の証拠を有する患者は除外した。すべての患者は登録の１８ヶ月内に肝臓生検を受けた。患者は、自己申告に基づいて人種によりアフリカ系アメリカ又はコーカサス人種として、及び民族性によりヒスパニック又は非−ヒスパニックとして分類された。すべての協力者は合衆国で生れたことが必要であった。
【００２７】
患者は少なくとも２４週間、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）１８０μｇを毎週、及びリバビリン（Ｃｏｐｅｇｕｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）１０００〜１２００ｍｇを毎日与えられた。２４週までにＨＣＶ Ｒ
ＮＡ陰性になった患者は、合計で４８週間処置を続け、ＨＣＶ ＲＮＡ陽性のままであった患者は処置を停止し、無−反応者（ＮＲ）と考えられた。試験の一次的終点は、治療の停止後少なくとも２４週間の検出可能なＨＣＶ ＲＮＡの不在として定義される持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）であった。
【００２８】
ＩＰ−１０を含む血清サイトカインの分析
抗ウイルス治療への５０人の持続性ウイルス学的反応者（ＳＶＲ）及び５０人の無−反応者（ＮＲ）をＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃコホートから選び、それらをサイトカイン分析中に含めた。４８週間のＩＦＮに基づく治療への再発者は、この事後分析（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）に含めなかった。コホートは、５１人のアフリカ系アメリカ人（ＡＡ）及び４９人のコーカサス系アメリカ人（ＣＡ）から成った。コホートは４１人の女性及び５９人の男性を含んだ。
【００２９】
Ｌｕｍｉｎｅｘシステム上で商業的に入手可能なヒト２３−プレックス（ｐｌｅｘ）及び２７−プレックスパネルサイトカインＢｉｏＰｌｅｘアッセイ（ＢｉｏＲａｄ，カタログ番号それぞれ＃１７１−Ａ１１１２３及び＃１７１−Ａ１１１２７）を用い、製造者の指示に従って、ベースラインで集められた血清試料において５０種のサイトカインを測定した。大多数の試料において、ベースラインでマルチプレックスアッセイにおいて分析された５０種のサイトカインから、３７種を確実に定量することができた。血清ＩＰ−１０レベルの分析に特別な注意がはらわれ、それはヒトサイトカイン２７−プレックスパネルＢｉｏＰｌｅｘアッセイの一部として決定された。このアッセイにおけるＩＰ−１０測定値のダイナミックレンジは３．１−５０，９３８ｐｇ／ｍｌであり、６．５ｐｇ／ｍｌの検出限界を有した。
【００３０】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定
血清ＩＰ−１０濃度が分析された（上記を参照されたい）８０人の患者（４０人の反応者、４０人の無反応者）のサブセットにつき、遺伝子型決定を行った。
【００３１】
この患者サブセットは３９人のＡＡ及び４１人のＣＡを含んだ。
【００３２】
ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ対立遺伝子識別キット及びＡＢＩ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ，４６１：２００９年，７９８−８０２）により記載された通りに、ＩＬ２８Ｂ多型マーカーｒｓ１２９７９８６０を調べた。
【００３３】
統計的分析
ＳＡＳ又はＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ）を用いて統計的分析を行った。Ｔｉｂｃｏ Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェア又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４ソフトウェアを用いてグラフを作成した。
【００３４】
ＩＰ１０はＳＶＲと関連している
十分に特性化されたアメリカ人コホートにおいて、選ばれたサイトカインの処置前分布が処置反応（持続性ウイルス学的反応，ＳＶＲ）を予測できるか否かを決定するために、５０種のサイトカイン及びケモカインの包括的配列（ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｒｒａｙ）を用い、ＨＣＶ処置を受けたＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃコホート中の１００人の患者からの血清試料を評価した。図１における反応者対無−反応者のヒートマップ分析に描かれている通り、分析された５０種のサイトカインから３７種を確実に測定することができた。ＩＰ−１０以外の（下記を参照されたい）すべてのサイトカインのベースラインレベルは、反応者と無−反応者の間で有意に異ならなかった。
【００３５】
ベースラインにおける平均血清ＩＰ−１０濃度は、無反応者と比較して反応者において有意により低かった（１１４９±８５ｐｇ／ｍｌに対して６８７±６８ｐｇ／ｍｌ，ｐ＜０．００１）（図２Ａ）。ＩＰ−１０測定値の予測値の可能性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）を評価するために、以前の他の研究において適用されたと類似して、６００ｐｇ／ｍｌの閾値に従って患者を層別した。
［Ｚｅｒｅｍｓｋｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １０：ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ／ＨＩＶ−ｃｏｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ，４５（３）：２００７年，ｐ．２６２−８‖Ｂｕｔｅｒａ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｐｌａｓｍａ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．Ｂｌｏｏｄ，１０６（４）：２００５年，ｐ．１１７５−８２．‖Ｄｉａｇｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．著，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｅｒｕｍ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １０ ｌｅｖｅｌｓ ｗｉｔｈ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐｌｕｓ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．Ｇｕｔ，５５（３）：２００６年，ｐ．３７４−９．‖Ｌａｇｇｉｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．著，ＩＰ−１０ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｖｉｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＣＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４４（６）：２００６年，ｐ．１６１７−２５．‖Ｎａｒｕｍｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−１０ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８（１１）：１９９７年，ｐ．５５３６−４４．‖Ｒｏｍｅｒｏ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ）−ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−１０：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ，ｖｉｒａｌ ｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ＩＦＮ−ａｌｐｈａ ２ａ ａｎｄ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，１９４（７）：２００６年，ｐ．８９５−９０３．］
【００３６】
低いベースラインＩＰ−１０レベル（＜６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の７９パーセント（２６／３３）は、治療に対する反応者であり（陽性予測値＝７９％）、高いベースラインＩＰ−１０レベル（＞６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の６４％（４３／６７）は治療に対する無反応者であろう（陰性予測値＝６４％）（図２Ｂ）。全体として、この結果は、処置前血清ＩＰ−１０レベルに基づいて治療反応を予測するテストに関して５２％（２６／５０）の特異度及び８６％（４３／５０）の敏感度を生ずる。
【００３７】
評価された３７種のサイトカインを用いる相関マトリックス分析に基づくと、ベースラインでＩＰ−１０と相関する他のサイトカインはなかった（図３）。サイトカインのいくつかのグループはベースラインで互いに相関していることが注目されたが、いずれも処置反応と関連しなかった。重要なことに、交差妥当化モデルを用いる３７種のサイトカインの分析は、ベースラインＩＰ−１０に加えられるいずれのサイトカインもその反応者対無反応者の誤分類率を向上させなかったことを明らかにした（約３０％）。
【００３８】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型はＳＶＲと関連している
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従う患者集団の層別は、処置反応との有意な（尤度比 ｃｈｉ−平方：ｐ＜０．００１２）関連性を明らかにし（図４）、ＣＣ遺伝子型は高いＳＶＲ率（ＣＣ遺伝子型において８７％のＳＶＲ）と関連していたが、ＴＴ遺伝子型は無−反応者と関連していた（ＴＴ遺伝子型において７５％の無−反応者）。
【００３９】
ＩＰ１０血清レベル及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型の加算的且つ独立した効果
平均血清ＩＰ−１０レベルは、３つのＩＬ２８Ｂ遺伝子型のグループの間で有意に異ならず、ＣＣ遺伝子型をＣＴ及びＴＴ遺伝子型を合わせたグループに対して比較した場合も有意に異ならなかった（図５）。
【００４０】
次に、以前にいくつかの研究で用いられたことがある（上記を参照されたい）６００ｐｇ／ｍｌの閾値より高いか又は低いＩＰ−１０レベルに従って、患者を層別した。次いで処置前血清ＩＰ−１０レベルに基づく層別をＩＬ２８Ｂ遺伝子型と組み合わせて分析した。この組み合わせ分析の表示データを図６に示す。
【００４１】
この発見は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び処置前血清ＩＬ−１０濃度の組み合わせ分析により、個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリン処置への（無−）反応の予測性を有意に向上させることができることを示している。
【００４２】
さらに特定的に、高いＩＰ−１０レベルを有する場合の３４％に対して、低いＩＰ−１０を有するＣＴ保有者は７９％のＳＶＲを有した。ＴＴ保有者の間で、類似の関連性が同定された（高ＩＰ−１０の場合の１０％に対して低ＩＰ−１０の場合にＳＶＲ＝５０％）。（表１を参照されたい）
【００４３】
【表２】
【００４４】
図７は、個々の分析（ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及びＩＰ−１０レベル）と組み合わせ分析の比較概要を示す。行われた均一性に関するｃｈｉ−平方テストは、２つもしくはそれより多い集団（例えば種々のＩＬ２８Ｂ遺伝子型グループ）が共通の特性（すなわちＳＶＲ反応）を有する観察の同じ割合を有するかどうかを調べる。両方の個々の分析は、処置反応を有意に予測できる。それでも、両方のマーカーを組み合わせると明白な加算効果があり、個々の患者に関する処置反応及び無−反応の両方の予測値を向上させる。この組み合わせ分析は、反応者対無−反応者の高度に有意な層別を生ずる。さらに特定的に、説明変数としてＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０（６００ｐｇ／ｍｌより高いか又は低い）の両方を含むＳＶＲの一般化線形モデル研究（ＳＡＳ ｐｒｏｃ ｇｅｎｍｏｄ）は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＜０．００１３）及び血清ＩＰ−１０（ｐ＜０．００１６）の有意な寄与効果を示すが、持続性ウイルス学的反応の評価におけるＩＬ２８ＢとＩＰ−１０の間の相互作用の寄与効果を示さない（ｐ＝０．７５）。
【００４５】
最後に、血清ＩＰ−１０レベル（連続変数として処理される）及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型（カテゴリー変数）に基づくＳＶＲ反応のロジスティック回帰モデル研究は、血清ＩＰ−１０レベルに従って反応者と無−反応者を明確に分離し、反応曲線中にＩＬ２８Ｂ遺伝子型依存性シフトを有する（図８）。
【００４６】
一緒にすると、３つの発見は、処置前血清ＩＰ−１０レベル及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型の組み合わせの予測値が、ペグインターフェロン及びリバビリン治療への持続性ウイルス学的反応の予測において個々のマーカーのそれぞれより能力が優れており、ＨＣＶ患者において個人的な薬剤を導く見込みを保有していることを示している。
【実施例２】
【００４７】
この研究において、ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃコホート中の２７２人の患者（１１５人の無−反応者及び１５７人のＳＶＲ）からの血清試料中で処置前ＩＰ−１０レベルを測定した。この分析は、ＣＡ及びＡＡ患者の両方において、ＩＰ−１０が等しくＳＶＲを予測できることを示した。次いで処置前血清ＩＰ−１０レベルとＩＬ２８Ｂ遺伝子型の組み合わせを、このコホートにおいてｐｅｇＩＦＮ及びリバビリンへの反応の予測物質として評価した。
【００４８】
患者及び方法
患者．ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃ研究は、遺伝子型１感染を有するＡＡ及びＣＡの中での反応の率及び予測物質を評価するため、ならびに治療への無反応に関する理由を同定するために設計された、慢性Ｃ型肝炎の組み合わせｐｅｇＩＦＮ及びリバビリン治療の多施設治験であった。ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃ試験の設計及び一次的結果は他の場所で報告された［Ｃｏｎｊｅｅｖａｒａｍ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ ａｎｄ Ｃａｕｃａｓｉａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３１（２）：２００６年，ｐ．４７０−７］。治療未経験であり、遺伝子型１に感染しており、検出可能なＨＣＶ ＲＮＡを有し、且つ慢性ＨＣＶの組織学的証拠を有する成人は、関与する資格があった。患者は、自己申告に基づいて人種によりアフリカ系アメリカ人又はコーカサス人として、及び民族性によりヒスパニック又は非−ヒスパニックとして分類された。すべての協力者は合衆国で生れたことが必要であった。合衆国全体に及ぶ８つの臨床施設から４０１人の患者を登録し、２００２年７月から２００３年１２月の間に治療を開始した。
【００４９】
本研究のために、全ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃコホートから、１５７人の持続性ウイルス学的反応者（ＳＶＲ）（１０４人のＣＡ、５３人のＡＡ）及び１１５人の無−反応者（３４人のＣＡ、８１人のＡＡ）を含んでなる２７２人の患者のサブセットから血清試料を得た。この研究で分析されるすべての検体はＩＲＢ−承認の治験実施計画書（ＩＲＢ−ａｐｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）の下に得られ、それに関して協力者は遺伝子テストに関する同意を含む書面によるインフォームドコンセントを与えた。
【００５０】
処置．患者は少なくとも２４週間、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）１８０μｇを毎週、及びリバビリン（Ｃｏｐｅｇｕｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）１０００〜１２００ｍｇを毎日与えられた。２４週までにＨＣＶ
ＲＮＡ陰性になった患者は、合計で４８週間処置を続け、ＨＣＶ ＲＮＡ陽性のままで
あった患者は処置を停止し、無−反応者と考えられた。試験の一次的終点は、治療の停止後少なくとも２４週間の検出可能なＨＣＶ ＲＮＡの不在として定義されるＳＶＲであった。
【００５１】
ＨＣＶ ＲＮＡの定量．中心実験室（ｃｅｎｔｒａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ＳｅｒａＣａｒｅ ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）において、Ｃｏｂａｓ Ａｍｐｌｉｃｏｒ Ａｓｓａｙ（感度 ５０ＩＵ／ｍｌ：Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を用いてＨＣＶ ＲＮＡテストを行った。選ばれた試料を、ＨＣＶ ＲＮＡレベルに関してＣｏｂａｓ Ａｍｐｌｉｃｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ａｓｓａｙにより、及びＨＣＶ ＲＮＡ遺伝子型に関してＶｅｒｓａｎｔ ＨＣＶ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａｓｓａｙ（Ｂａｙｅｒ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）によりテストした。
【００５２】
肝臓組織学．すべての患者は、スクリーニングの１８ヶ月内に肝臓生検を受け、それは中心病理学者によって盲検により読まれた（ｒｅａｄ ｂｌｉｎｄｅｄ）。すべての生検は、Ｉｓｈａｋの修正組織学的活性指数（ＨＡＩ）採点システム（Ｉｓｈａｋ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ（ＨＡＩ） ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて炎症を等級付けし、線維症を段階付けすることにより、Ｃ型肝炎の重度に関して評価された。
【００５３】
血清ＩＰ−１０の定量．処置の開始の前にベースラインにおいて集められた血清試料中で、商業的に入手可能なＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０イムノアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、インターフェロン−γ誘導タンパク質−１０（ＩＰ−１０）を測定した。すべての試料を１：２で希釈し、二重に分析した。このアッセイにおけるＩＰ−１０測定値の線状ダイナミックレンジは８−５００ｐｇ／ｍｌであり、７．８ｐｇ／ｍｌに検出限界を有した。１０００ｐｇ／ｍｌより高いＩＰ−１０濃度を有する試料を１：５で希釈し、再−分析した。
【００５４】
ＩＬ２８Ｂの遺伝子型決定．Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ，４６１：２００９年，７９８−８０２）により記載された通りに、ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ対立遺伝子識別キット及びＡＢＩ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＩＬ２８Ｂ多型マーカーｒｓ１２９７９８６０を分析した。我々のコホートからの２１０人の患者からのＤＮＡ試料を遺伝子決定した。
【００５５】
統計的方法．ＪＭＰ ７．０．２又はＳＡＳ バージョン９．１ソフトウェア（両方ともＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃから）を用いて標準的な統計的分析を行った。分布正規性条件（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｉｔｙ ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎ）を満たすために、統計的テストにおける使用の前にＩＰ−１０濃度を対数変換した。種々の分類モデル（対角線的識別分析（ｄｉａｇｏｎａｌ ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、ランダムフォレスト（ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、サポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ）及びバギング（ｂａｇｇｉｎｇ））ならびに受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析の評価のために、公然と利用できるＲ中のパッケージ（バージョン２．８．０）を用いた。ＳＡＳにおけるｐｒｏｃ ｌｏｇｉｓｔｉｃ及びｐｒｏｃ ｇｅｎｍｏｄ法を用いて、それぞれロジスティック回帰モデル及び一般化線形モデルのフィッティングを行った。有効統計ソフトウェアツール又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いてグラフを作成した。
【００５６】
結果
研究コホートに含まれる患者．
この研究のために、ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃコホートからの抗ウイルス治療への１５７人の持続性ウイルス学的反応者（ＳＶＲ）及び１１５人の無−反応者からの血清試料が含まれた。ＳＶＲ及び無−反応者の定義は上の節で示した。ウイルス再発、再燃を有するか、又は利用できるウイルス学的データが１２週間より短い患者は排除した。コホートは１３４人のＡＡ及び１３８人のＣＡから成った。このコホートのベースライン患者特性は以下の通りであった：年齢 ４８．４±７．４歳；ウイルス負荷 ４．６±５．７Ｘ１０６ＩＵ／ｍｌ；血小板数 ２１４±７３Ｘ１０６個の細胞／ｍｍ３；アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ） ９０．０±７２．９ＩＵ／ｌ；合計ビリルビン ０．７０±０．３５ｍｇ／ｄｌ；アルブミン ４．１±０．４０ｇ／ｄｌ；及びヘマトクリット ４３．２±３．８％（すべてのデータは平均±ＳＤとして）。コホートは９６人の女性及び１７６人の男性を含み、１９％が４−６のＩｓｈａｋ線維症採点を有した。我々のコホートにおける２７２人の患者中の２１０人からの試料はＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定に利用され得、１２３人はＳＶＲであり８７人は無−反応者であり、その中で１１１人はＣＡであり、９９人はＡＡであった。
【００５７】
ベースライン血清ＩＰ−１０測定及び処置反応．
平均血清ＩＰ−１０レベルは、無−反応者患者と比較してＳＶＲにおいて有意により低かった（７０４±４４ｐｇ／ｍｌに対して４３７±３１ｐｇ／ｍｌ，ｐ＜０．００１）（図９Ａ、表２）。ＩＰ−１０測定値の予測値の可能性を評価するために、我々は先行研究において用いられてきた６００ｐｇ／ｍｌの閾値に従って患者を層別した。低いベースラインＩＰ−１０レベル（＜６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の６９パーセント（１２９／１８８）は治療への反応者であったが（陽性予測値、ＰＰＶ＝６９％）、高いベースラインＩＰ−１０レベル（＞６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の６７％（５６／８３）は治療への無−反応者であった（陰性予測値、ＮＰＶ＝６７％）（図９Ｂ）。全体としてこれは、処置前血清ＩＰ−１０レベルに基づいて治療反応を予測できるテストに関して８２％（１２９／１５７）の特異度及び４９％（５６／１１５）の敏感度を生ずる。
【００５８】
我々は、ＲＯＣ曲線分析に基づいて最良の識別能力を有するカットオフ値を計算することにより、ＳＶＲ患者の同定のために用いられる６００ｐｇ／ｍｌのＩＰ−１０閾値を評価した。我々のデータセットにおいて、３７０ｐｇ／ｍｌの閾濃度がＳＶＲ患者の予測において特異度（８０％）と敏感度（５６％）の最適の組み合わせであることが明らかになった。次いで我々は、ＳＶＲならびに無−反応の両方を正しく予測するための我々の最適ＩＰ−１０レベルを決定した。５５０ｐｇ／ｍｌの閾値は、真陽性者又は陰性者の最高の率（６９％）を与え、文献中で用いられてきた６００ｐｇ／ｍｌのカットオフと十分に相関した（我々のデータセットにおいて６８％の真陽性者又は陰性者が予測された）。最後に、処置前ＩＰ−１０濃度のロジスティック回帰分析は、個々の患者において測定される特定のＩＰ−１０レベルに関するＳＶＲの確率のフィッティングを可能にし、高度に有意なＩＰ−１０の効果を示した（ｐ＜０．０００１；図１０，灰色の曲線）。
【００５９】
血清ＩＰ−１０レベルへの人種の影響．
ＣＡ及びＡＡの処置前ＩＰ−１０血清レベルを比較すると、反応者（ｐ＝０．７５）及び無−反応者（ｐ＝０．９７）の別々の分析において有意な差は観察されなかった（表２）。研究コホート全体において観察されたＣＡとＡＡの間のベースライン血清ＩＰ−１０レベルおける有意な（ｐ＝０．０１５）差は、コホートの不均衡な組成により最も良く説明され得るようである（ＡＡサブグループにおける４０％と比較してＣＡサブグループにおけるＩＦＮ処置反応率は７５％であった）。ＩＦＮ治療への反応者及び無−反応者の間のＩＰ−１０血清レベルにおける高度に有意な差は、ＣＡ及びＡＡの両方において見出された（表２）。ベースラインＩＰ−１０レベルのロジスティック回帰分析を用い、ＣＡ及びＡＡ患者に関する処置反応曲線を作成した（図１０）。ＡＡ及びＣＡ患者に関する反応
曲線は、ＩＰ−１０（ｐ＜０．０００１）及び人種（ｐ＜０．０００１）の両方の有意な影響を明らかにしたが、ＩＰ−１０と人種の間の有意な相互作用を明らかにしなかった（ｐ＝０．０８）。
【００６０】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び処置反応
遺伝子型決定された２１０人の患者の中の３０％はＣＣであり、４９％はＣＴであり、２１％はＴＴであった。ＩＬ２８Ｂ遺伝子型と処置反応の間の有意な関連性が観察された：対応するＳＶＲ率はＣＣに関して８７％であり、ＣＴに関して５０％であり、ＴＴに関して３９％であった（ｐ＜０．０００１）（表３）。コーカサス系アメリカ人の場合、４９％は９１％のＳＶＲを有するＣＣであり、４１％は６７％のＳＶＲを有するＣＴであり、１０％は４５％のＳＶＲを有するＴＴであった（ｐ＜０．００１）。アフリカ系アメリカ人の場合、わずか９％が６７％のＳＶＲを有するＣＣであり、５８％が３５％のＳＶＲを有するＣＴであり、３３％が３６％のＳＶＲを有するＴＴであった（ｐ＝０．２０）。
【００６１】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び処置前ＩＰ−１０レベルと処置反応との関連性
平均血清ＩＰ−１０レベルは、コーカサス人（ｐ＝０．２７）及びアフリカ系アメリカ人（ｐ＝０．５８）の両方において、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型にかかわらず、すべての患者に関して類似していた（図１１）。血清ＩＰ−１０とＩＬ２８Ｂ遺伝子型の間のこの相関性の欠如は、これらのマーカーの両方に関して観察されるＳＶＲとの関連性が独立していることを示す。処置前ＩＰ−１０レベルに関する６００ｐｇ／ｍｌのカットオフを用いると、利用できる血清ＩＰ−１０及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型の両方のデータを有する我々のコホートの患者に関するＳＶＲ率は（ｎ＝２１０）、低いＩＰ−１０レベル（＜６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の場合に６９％であり、高いＩＰ−１０レベル（＞６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の場合に３５％であった（ｐ＜０．０００１）。
【００６２】
名目ロジスティック回帰におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０（６００ｐｇ／ｍｌより高いかもしくは低い）の関数としてのＳＶＲのモデル研究は、ＳＶＲの予測（Ｃｈｉ２＝５５，ｐ＜０．００１）におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＜０．０００１）及び血清ＩＰ−１０（ｐ＜０．００１５）の有意な加算的効果を明らかにしたが、ＩＬ２８ＢとＩＰ−１０の間の相互作用を明らかにしなかった（ｐ＝０．６６）。図１２は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型グループ内のベースラインＩＰ−１０レベルがＳＶＲ率に関する加算的且つ独立した情報を与えたことを視覚化している。さらに特定的に、ベースラインＩＰ−１０レベルは、ＩＬ２８Ｂ Ｔ−対立遺伝子保有者において最も役に立った。ＣＴ保有者に関する全体的な反応率は５０％であったが、高いＩＰ−１０レベルを有する場合の２４％に対して低いＩＰ−１０レベルを有する者の場合に６４％がＳＶＲを有した。ＴＴ遺伝子型の場合、３９％がＳＶＲを有し、低処置前ＩＰ−１０グループ内で４８％であり、高ＩＰ−１０グループ内で２０％であった。連続変数として処理される血清ＩＰ−１０レベル及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型に基づくＳＶＲ反応のロジスティック回帰モデル研究は、反応曲線における追加的且つ有意なＩＬ２８Ｂ遺伝子型−依存性シフトを有する血清ＩＰ−１０レベルに従う、ＳＶＲの確率のより個別化された（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ）予測を可能にした（図１３）。予測モデルのより定量的な比較を可能にする相補的受信者操作特性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｓｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）曲線分析は、単独の処置前血清ＩＰ−１０に基づくモデル（０．７１）対単独のＩＬ２８Ｂ遺伝子型に基づくモデル（０．７０）に関して類似のＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）の値を明らかにした。しかしながら、両方のマーカーを組み合わせたモデルに関し、もっとずっと高いＲＯＣ ＡＵＣ値（０．８０）が達成された（図１４）。一緒にすると、これらのデータは、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型を処置前血清ＩＰ−１０測定値と組み合わせることは、特に非−ＣＣ遺伝子型においてＳＶＲの予測値を明白に向上させることを示している。
【００６３】
人種グループごとに分析を行う時にも、同じ且つ有意な傾向が見出された（表４）。例えばアフリカ系アメリカ人において、ベースラインＩＰ−１０レベルに伴う差はＣＴ及びＴＴのＩＬ２８Ｂ遺伝子型に関してさらにもっと衝撃的であった。低いＩＰ−１０を有するＣＴ保有者の場合、高いＩＰ−１０を有する場合の１７％に対してＳＶＲは４８％であり、低いＩＰ−１０を有するＴＴ保有種の場合、高いＩＰ−１０を有する場合の２５％に対してＳＶＲは４３％であった。
【００６４】
処置反応の予測のためにＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び処置前ＩＰ−１０レベルを他のベースラインパラメーターと組み合わせること．
我々は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０に加えて他のベースラインパラメーターがＳＶＲの予測を有意に向上させ得るかどうかを評価した。この分析において我々は、ロジスティック回帰モデルに年齢、性別、人種、処置前ウイルス負荷、Ｉｓｈａｋ線維症採点、ＡＬＴ、脂肪症及び組織学的活性指数を加えた。含まれるすべてのパラメーターの中で、処置前ウイルス負荷（ｐ＜０．０００１）、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＝０．０００４）、ベースラインＩＰ−１０レベル（ｐ＝０．００３３）及び人種（ｐ＝０．００１１）のみがモデルに有意に寄与した。変数のいずれの対の間でも相互作用は有意でなかった（すべてｐ＞０．１）。すべての変数をカテゴリー変数として処理すると（例えば連続変数としてではなく、６００ｐｇ／ｍｌより高いかもしくは低いＩＰ−１０）、得られる一般化線形モデルは同じ４つの有意な変数及びＩＳＨＡＫ線維症採点を含んだ（図１５）。
【００６５】
これらの多変量解析において同定される最も有意な変数を含むモデルの予測力を比較するＲＯＣ曲線分析を行った（図１４）。ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０を組み合わせたモデルのＡＵＣ（ＡＵＣ ０．８０）は、単独のＩＬ２８Ｂ遺伝子型に基づくモデル（ＡＵＣ ０．７０）を含む個々の変数に基づくモデルより明らかに能力が優れていた。人種及びベースラインウイルス負荷を加えることはモデルをさらに向上させたが、加えられた増加は中程度であった（ＡＵＣは最高で０．８５）。
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
【表５】
【００６９】
図１−１５の説明
図１．インターフェロンα／リバビリン治療への５０人の反応（ＳＶＲ）及び５０人の無反応ＨＣＶ患者において測定される３７種のサイトカインの処置前血清濃度を示すヒートマップ。
【００７０】
図２．ＩＦＮ治療への反応者におけるベースラインでのＩＰ−１０測定値対無反応者におけるＩＰ−１０測定値。［Ａ］無−反応者に対してＩＦＮ処置に反応する患者において、ベースラインで有意に（ｐ＜０．００１）より低いＩＰ−１０血清レベルが観察された。水平線は、グループごとの平均値を示す。ＩＰ−１０測定値の予測値の可能性を評価するために、患者を６００ｐｇ／ｍｌの閾値に従って層別した（破線）。［Ｂ］無−反応者のグループと比較して反応者において、高い（＞６００ｐｇ／ｍｌ）ＩＰ−１０レベルを有する患者の有意により小さい割合が見出された（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｃｈｉ平方＝１６．３，ｐ＜０．００１）。
【００７１】
図３．１００人のＨＣＶ患者において（処置前試料）ベースラインで測定される３７種のサイトカインを含む相関マトリックス。青い四角は、それぞれ６０％より高い（明るい青
）、７０％より高い（中度の青）又は８０％より高い（暗い青）サイトカイン間の相関を示す。赤い四角は、ＩＰ−１０と他のすべての３６種のサイトインの相関を示す（すべて６０％より低い）。
【００７２】
図４．ＩＦＮα＋リバビリン処置への反応者及び無反応者におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｒｓ１２９７９８６０）分布。データは、それぞれ反応者又は無反応者の患者の数（ｎ）又はパーセンテージ（Ｒｏｗ％）として示される。図の右側にグラフ図を示す。
【００７３】
図５．８０人のＨＣＶ患者における処置前血清ＩＰ−１０濃度との関連におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｒｓ１２９７９８６０）。患者をＩＬ２８Ｂ遺伝子型ごとに（左）、又はＣＣ遺伝子型対ＣＴ／ＴＴ遺伝子型の比較により（右）グループ分けした。有意なＩＬ２８Ｂ遺伝子型に関連する差は観察されなかった。
【００７４】
図６．治療結果との関連におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０濃度（６００ｐｇ／ｍｌより高いか又は低い）の組み合わせ分析。図は、ＩＦＮα／リバビリン処置に反応した、又は反応しなかった患者の数（Ｎ）（左のパネル）ならびに遺伝子型及びＩＰ−１０レベルごとの患者の割合（％として）を示す。
【００７５】
図７．ＩＬ２８Ｂ遺伝子型のみに基づく（上のパネル）、ＩＰ−１０血清レベルのみに基づく（中のパネル）ならびにＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０レベルの組み合わせ分析に基づくＨＣＶ患者における処置結果の予測値を比較するグラフによるまとめ。棒中のパーセンテージは、特定のサブグループ中のＳＶＲ反応者の割合を示す。各サブグループ（棒）中の患者の合計数を棒の右側に示す。
【００７６】
図８．血清ＩＰ−１０レベルに基づく、ペグインターフェロン及びリバビリン処置への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）をフィッティングするロジスティック回帰分析のグラフ図（灰色の曲線）。次にＩＬ２８Ｂ遺伝子型をモデルに加え、遺伝子型のそれぞれに関する回帰曲線を生じた（ＣＣ：青、ＣＴ：赤、ＴＴ：緑）。サブグループのそれぞれにおける患者の比較的少ない数は、このモデルにおいて血清ＩＰ−１０の寄与のみが有意な（ｐ＝０．０１７）寄与因子（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ）として明らかになり、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＝０．３１）又はＩＰ−１０とＩＬ２８Ｂの間の相互作用（ｐ＝０．９３）は有意な寄与因子として明らかにならなかったことを説明し得る。各患者試料は図の上部（反応者）又は下部（無−反応者）に丸として示されている；丸の色はＩＬ２８Ｂ遺伝子型を示す。
【００７７】
図９．反応者（ＳＶＲ）及び無−反応者患者における処置前血清ＩＰ−１０（ｐｇ／ｍｌ）。（Ａ）ＩＰ−１０データの分布グラフ；（Ｂ）ＩＰ−１０レベル（６００ｐｇ／ｍｌより高い又は低いで層別）及び処置反応結果に基づくモザイクプロット。
【００７８】
図１０．コホート全体における（灰色の曲線）、又は人種グループごとに層別された（コーカサス系−アメリカ人：赤、アフリカ系−アメリカ人：青）、処置前血清ＩＰ−１０レベル（ｐｇ／ｍｌ）に基づく反応者（ＳＶＲ）である確率をフィッティングするロジスティック回帰分析のグラフによるまとめ。各患者試料は図の上部（ＳＶＲ）又は下部（無−反応者）に丸として示されている。ロジスティック回帰モデルは、ＩＰ−１０（ｐ＜０．０００１）及び人種（ｐ＜０．０００１）の有意な影響を明らかにしたが、ＩＰ−１０と人種の間の有意な相互作用を明らかにしなかった（ｐ＝０．０８）。
【００７９】
図１１．（Ａ）コーカサス系−アメリカ人及び（Ｂ）アフリカ系アメリカ人におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従って層別されたＨＣＶ患者中の処置前血清ＩＰ−１０（ｐｇ／ｍｌ）。一元配置ＡＮＯＶＡ（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従うＩ
Ｐ−１０レベルにおける有意な差を示さなかった。
【００８０】
図１２．処置前血清ＩＰ−１０（６００ｐｇ／ｍｌより高い対低い）及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従って層別されたＨＣＶ患者における持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）率（％）。単独の血清ＩＰ−１０又は単独のＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従うＳＶＲ率をグラフの垂直の壁上に示す（白い前面）。各サブグループに関してＳＶＲ率及び患者の数（ＳＶＲの数／サブグループ全体の数）を棒の内部に示す。尤度比Ｃｈｉ２分析は、試料グループ全体に及ぶ反応の均一性を確証した（Ｃｈｉ２＝５５；ｐ＜０．０００１）。
【００８１】
図１３．血清ＩＰ−１０レベルのみに基づく（灰色の曲線）、又は血清ＩＰ−１０のレベル（ｐｇ／ｍｌ）とＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ＣＣ：赤、ＣＴ：緑、ＴＴ：青）の組み合わせに基づく、ペグ−インターフェロン及びリバビリン処置への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）をフィッティングするロジスティック回帰分析のグラフによるまとめ。各患者試料は図の上部（ＳＶＲ）又は下部（無−反応者）に丸として示されている；丸の色はＩＬ２８Ｂ遺伝子型を示す。ロジスティック回帰モデルは、ＩＰ−１０（ｐ＜０．０００１）及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＜０．０００１）の有意な影響を明らかにしたが、ＩＰ−１０とＩＬ２８Ｂ遺伝子型の間の有意な相互作用は明らかにしなかった（ｐ＝０．３）。
【００８２】
図１４．ペグ−インターフェロン及びリバビリン処置へのＳＶＲの予測における、処置前血清ＩＰ−１０、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型、人種、ベースラインＨＣＶウイルス負荷又はこれらのパラメーターの組み合わせに関する受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析。凡例中の数字は、モデル比較のために用いることができるＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）統計量を示す。
【００８３】
図１５．ｐｅｇＩＦＮ及びリバビリン治療への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）の予測物質。ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及びＩＰ−１０のベースライン（処置前）測定値、ＨＣＶウイルス負荷、線維症段階（ＩＳＨＡＫ）、年齢、性別、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、脂肪症（脂肪得点）ならびに門脈及び小葉組織学的活性指数（ＨＡＩ）を含むロジスティック回帰モデルからオッズ比を計算した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン（ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）及びリバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）への持続性ウイルス学的反応（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＳＶＲ）又は無−反応の結果を予測するために、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定をＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値と組み合わせる方法に関する。
【０００２】
フラビウイルス科のメンバーであるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、肝臓の慢性炎症を引き起こし、肝臓線維症、肝硬変及び肝臓ガンに導き得る血液−由来ウイルスである。世界中で約１憶７千万の人々がＨＣＶに感染し、処置の選択肢は限られている。慢性Ｃ型肝炎の処置のための現在の医療の標準は、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）の週に１回の注射及びリバビリンの１日２回の経口的投与から成る（非特許文献１）。しかしながら、４８週間の管理で処置された遺伝子型２又は３に感染した患者の８０％と比較して、４８週間の管理で処置された遺伝子型１又は４に感染した患者のわずか４０〜５０％しか持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）を達成しない。従って、明らかにＩＦＮ−α／リバビリン処置反応へのウイルス遺伝子型の要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）が存在する。さらに、現在の医療の標準は、多くの場合にうつ病及び貧血のような副作用を伴う（非特許文献１）。従って、ＨＣＶ患者のための新規な、より有効な、且つより安全な処置の選択肢を求める満たされない医学的要求がある。
【０００３】
従って、ＨＣＶ遺伝子型１の処置のための医療の標準は、現在、４８週間のポリエチレングリコール化ＩＦＮ−α及びリバビリンを、持続性ウイルス学的反応が達成されたか否かを決定するための２４週間の経過観察期間と一緒に含む。持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）は、治療を停止してから後の少なくとも２４週間の検出可能なＨＣＶ ＲＮＡの不在として定義される。これらの薬剤を用いる処置に関連する持続期間、経費及び罹病率は、反応をより良く理解し、処置戦略の修正から利益を得るであろう患者をあらかじめ同定したいという要求を当該技術分野で（ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ）確立した。
【０００４】
最近、種々の民族的背景からのＨＣＶ−感染患者におけるＩＬ２８Ｂ多型性と臨床的に決定されるウイルスのクリアランスの間の強い連鎖と一緒に、ＩＦＮ−αへの反応への遺伝子の寄与を示すデータが作られた（ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）。このデータは、サイトカイン血清マーカーにより以前に関連があるとされた処置の失敗への宿主の要素を支持し、最も一致することは、処置の開始の前に測定されるＩＰ−１０血清レベルのそれである。
【０００５】
抗−ＨＣＶ活性を示したＩＦＮ−λタンパク質はＩＬ２８Ａ／Ｂ及びＩＬ２９遺伝子によりコードされ（非特許文献２；非特許文献３）；ＩＬ２８Ｂ遺伝子はインターフェロン−λ３（ＩＦＮ−λ３）をコードする。最近の研究は、処置反応の予測マーカーの可能性のあるものとして、ＩＬ２８Ｂ遺伝子の３キロ塩基（ｔｈｒｅｅ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ）（３ｋｂ）上流の単ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）（ｒｓ１２９７９８６０，配列番号：１）を同定した（非特許文献４）。この発見は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子に近接して位置する他のＳＮＰマーカー（ｒｓ１２９８０２７５，配列番号：２及びｒｓ８０９９９１７，配列番号：３）を用いる他の独立した研究により確証された（非特許文献５；非特許文献６）。有利な変異体は、ＨＣＶ薬剤処置への反応における２倍より大きな差と強く関連することが示された。多−民族集団全体に及んで、有利な変異体の２つのコピーを保有する患者
の約８０％がＩＦＮ−α治療の間にウイルスをクリアリングし、処置から後の２４週間の間、ウイルスがないままであった。遺伝子の関連性は、ヨーロッパ人、アフリカ人及びアジア人患者を含む調べられたすべての民族グループにおいて、反応予測において重要であると思われる。これらの研究は、ＩＦＮ−α処置への反応の向上と結び付けられる、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＩＬ２８ＢのｍＲＮＡ発現がＩＬ２８Ｂ遺伝子型により影響を受けるという予備的な証拠も提供する。もっと後の研究において、この遺伝子型は、ヨーロッパ人及びアフリカ人の系統（ａｎｃｅｓｔｒｙ）の両方の患者（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）の中で、ＨＣＶ感染の自然の解決を強力に増加させることも示した（非特許文献７）。これらの研究は、個人的な薬剤設定においてＩＦＮ−αへの反応を予測し得るといういくらかの見込みも提供した。
【０００６】
無−反応に関するマーカーとしてのＩＦＮ−γ−誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０又はＣＸＣＬ１０）の同定の前に、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン（ＩＬ）１Ｂ、ＩＬ−１０及びＩＬ−８がＩＦＮ−α処置への無反応の血清マーカーとして同定された。ＩＰ−１０は、ＨＣＶ患者において肝臓内及び血清中の両方で高められることが示され、これらのレベルはＩＦＮ−αに反応する患者においてより無−反応ＨＣＶ患者において高められることが見出された。この観察は次いで、ベースラインレベルが処置反応予測に関する最も重要な決定因子であるヨーロッパ系コーカサス人ＤＩＴＴＯ研究（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃａｕｃａｓｉａｎ ＤＩＴＴＯ−ｓｔｕｄｙ）を含むより大きなデータセットにおいて確証された（非特許文献８；非特許文献９）。続いてＩＰ−１０発見はＨＣＶ／ＨＩＶ共−感染患者に拡大され（非特許文献１０）、それは続いて第２の研究において確証され、さらにこれらの患者における肝臓炎症及び線維症と関連付けられた（非特許文献１１）。ＩＰ−１０の関連性は種々の人種のグループにおいても示された（非特許文献１２）。
【０００７】
ＲＮＡ、細胞又はタンパク質レベルで示される高められた免疫反応はＩＦＮ−α／リバビリン治療へのより低い反応を示し得るという一般的な見解が当該技術分野において現れたが、これは臨床的に用いられるべき分析又は精巧化（ｓｏｐｈｙｓｔｉｃａｔｉｏｎ）のレベルに達しなかった。既知のマーカーにかかわらず、無−反応に関連する機構は明らかにならないままである。さらに、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型は、見込みはあるが、インターフェロン反応のすべての側面を説明しておらず、この発見がいかにしてウイルス遺伝子型、ウイルス負荷、体重、線維症及びＩＰ−１０のような他の既知の生物マーカーに関連するかはまだ明らかでない。ＩＬ２８Ｂ遺伝子産物ＩＦＮ−λ３の活性と免疫遺伝子の発現の間の分子的連鎖は、ＩＬ２８Ｂ及び下流のサイトカイン及びケモカインレベルが依存性であるはずであり、従ってＩＰ−１０のような下流血清マーカーは同じ表現型の現象を有効に記述するであろうことを示唆している。
【０００８】
最近記載されたＩＬ２８Ｂにおける遺伝子多型性は非常に刺激的であり、ペグインターフェロン及びリバビリンを用いる治療への持続性ウイルス学的反応を達成するための重要な予後的情報を与えることができる。しかしながら、独立のテストとしてのその臨床的有用性は依然として限られている。ＣＣ遺伝子型に関し、ＳＶＲの尤度は約８０％であると見積もられる。対照的に、ＴＣ異型接合体に関し、反応の尤度は約５０％に減少する。かくして遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）テストの陽性又は陰性予測値（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）は比較的低く、それは抗ウイルス治療のための決定におけるその使用を減少させるであろう。遺伝子的テストを他の容易に利用可能な抗ウイルス反応のマーカーと組み合わせて用いて、その予測能力を組み立てる（ｂｕｉｌｄ ｕｐｏｎ）方法は、陽性及び陰性予測値を向上させ、その臨床的有用性を向上させることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｄ ａｎｄ Ｈａｄｚｉｙａｎｎｉｓ著，Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ２４ Ｓｕｐｐｌ ２，２００４年，４７−５４
【非特許文献２】Ｋｏｔｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２００３年，６９
【非特許文献３】Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２００３年，６３
【非特許文献４】Ｇｅ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ４６１：２００９年，３９９
【非特許文献５】Ｓｕｐｐｉａｈ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：２００９年，１１００
【非特許文献６】Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：２００９年，１１０５
【非特許文献７】Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ４６１：２００９年，７９８
【非特許文献８】Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．著，ＪＩＤ １９４：２００６年，８９５
【非特許文献９】Ｌａｇｇｉｎｇ ｅｔ ａｌ．著，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４４：２００６年，１６１７
【非特許文献１０】Ｚｅｒｅｍｓｋｉ ｅｔ ａｌ．著，ＪＡＩＤＳ ４５：２００７年，２６２
【非特許文献１１】Ｒｅｉｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．著，Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ １３：２００８年，９６９
【非特許文献１２】Ｆｒｉｅｄ ｅｔ ａｌ．著，ＡＡＳＬＤ ２００８，ｐｏｓｔｅｒ １２２３
【発明の概要】
【００１０】
本発明の一部は、コーカサス人及びアフリカ系アメリカ人（Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ）におけるＨＣＶ試料の分析であり、予期せぬことに、その分析でＩＰ−１０血清レベル及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型が反応の相補的且つ独立した予測物質（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ）であること、ならびに特定的に、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型に関して異型接合性又は無−反応者遺伝子型に関して同型接合性のＨＣＶ感染患者において測定されるＩＰ−１０レベルが、ＩＦＮ−α処置に対する反応の決定において追加の価値を与えることが決定された。
【００１１】
ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ対立遺伝子識別キット（ａｌｌｅｌｉｃ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用い、ＮＩＨ−基金提供（ｆｕｎｄｅｄ）臨床試験であるＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃからの８０人の協力者に、ＩＬ２８Ｂ多型マーカーｒｓ１２９７９８６０を試験した。遺伝子型決定された患者は下部−研究（ｓｕｂ−ｓｔｕｄｙ）に含まれ、彼らに関し、保管された血清中で一パネルの（ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ）血清サイトカインを測定した（Ｆｒｉｅｄ ｅｔ ａｌ．著，ＥＡＳＬ ２００８）。本コホートは４０人のＳＶＲ及び４０人の無−反応者を含み、その中の３９人はコーカサス人であり、４１人はアフリカ系アメリカ人であった。ＣＣ、ＣＴ又はＴＴ遺伝子型がそれぞれ１９％、６１％及び２０％において見出され、８７％、４７％及び２５％の対応するＳＶＲ率が伴い（Ｃｈｉ２＝１３．４，ｐ＝０．００１２）、それはＧｅ ｅｔ ａｌ．（２００９年，Ｎａｔｕｒｅ ４６１：３９９）の初期の報告と一致している。
【００１２】
平均血清ＩＰ−１０レベルは類似であり、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型と関連していないと思われた（ｐ＝０．２８）。高（＞６００ｐｇ／ｍｌ）ＩＰ−１０レベルを有する患者における３６％に対し、低（＜６００ｐｇ／ｍｌ）ＩＰ−１０レベルを有する患者において７８％のＳＶＲ率が見出された（Ｃｈｉ２＝１７．１，ｐ＜０．０００１）。
【００１３】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型グループ内の血清ＩＰ−１０レベルは、ＳＶＲの尤度に関して追加の独立した情報を提供した（Ｃｈｉ２＝２７．５，ｐ＜０．０００１）。さらに特定的に、高ＩＰ−１０レベルを有する場合の３４％に対して低ＩＰ−１０レベルを有するＣＴ保有者は７９％のＳＶＲを有した。ＴＴ保有者の中で、類似の関連性が同定された（高ＩＰ−１０の場合の１０％に対して低ＩＰ−１０の場合の５０％）。
【００１４】
【表１】
【００１５】
従って、非−ＣＣ遺伝子型においてＩＬ２８Ｂ遺伝子型を処置前血清ＩＰ−１０測定値と組み合わせると、ペグインターフェロン及びリバビリンに対するＳＶＲ及び無−反応の間をさらに良く識別することにより、個々の患者に関する予測値は向上する。さらに特定的に、説明変数としてＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０の両方を含むＳＶＲの一般化線形モデルフィッティングは、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＜０．００１３）及び血清ＩＰ−１０（ｐ＜０．００１６）の有意な寄与効果を示すが、持続性ウイルス学的反応の評価におけるＩＬ２８ＢとＩＰ−１０の間の相互作用の寄与効果を示さない（ｐ＝０．７５）。
【００１６】
従って本発明は、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の結果を予測するために、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定をＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値と組み合わせる方法に関する。
【００１７】
より広い意味で、本発明は、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の結果を予測するために、ＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定、人種又はＣ型肝炎ウイルス負荷決定より成る群から選ばれる２つもしくはそれより多いパラメーターを組み合わせる方法に関する。
【００１８】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定をＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値と組み合わせる方法において、パラメーターである人種又はＣ型肝炎ウイルス負荷決定の１つ又は両方を、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の結果の予測のために加えることができる。
【００１９】
本発明のさらに別の側面は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型が多型マーカー、ｒｓ１２９７９８６０、ｒｓ１２９８０２７５及び／又はｒｓ８０９９９１７あるいはこれらのマーカーと連鎖不平衡にある他のいずれかの遺伝子マーカーを含むことである。
【００２０】
本発明は、これらの２つの個別のマーカー（ＩＬ２８Ｂ遺伝子型、血清ＩＰ−１０レベル）のいずれかと比較して、ＨＣＶに感染した個々の患者に関してペグインターフェロン及びリバビリンへのＳＶＲと無−反応の間をさらに良く識別することにも関する。
【００２１】
予期せぬことに、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０に関する結果を組み合わせる
ことは、ＴＴ又はＴＣ遺伝子型の中で持続性ウイルス学的反応に関する陰性予測値を向上させる。
【００２２】
本発明の一部は、少なくともＩＬ２８Ｂ多型性及びＨＣＶ−感染患者からの血清中のＩＰ−１０レベルの決定又は測定のための手段を含んでなる診断アッセイでもある。
【００２３】
本発明の別の態様は、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の予測のための、本方法から得られる結果情報を用いるモデル研究ソフトウェアを含んでなるコンピューターシステムである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】インターフェロンα／リバビリン治療への５０人の反応（ＳＶＲ）及び５０人の無反応ＨＣＶ患者において測定される３７種のサイトカインの処置前血清濃度を示すヒートマップ（ｈｅａｔｍａｐ）。
【図２Ａ】ＩＦＮ治療への反応者におけるベースラインでのＩＰ−１０測定値対無反応者におけるベースラインでのＩＰ−１０測定値を示すグラフ。
【図２Ｂ】患者をＩＰ−１０測定値の６００ｐｇ／ｍｌの閾値に従って層別したモザイクプロット。
【図３】１００人のＨＣＶ患者においてベースラインで測定される３７種のサイトカインを含む相関マトリックス。
【図４】ＩＦＮα＋リバビリン処置への反応者及び無反応者におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｒｓ１２９７９８６０）分布。
【図５】８０人のＨＣＶ患者における処置前血清ＩＰ−１０濃度との関連におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｒｓ１２９７９８６０）。
【図６】治療結果との関連におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０濃度（６００ｐｇ／ｍｌより高いか又は低い）の組み合わせ分析。
【図７】ＩＬ２８Ｂ遺伝子型のみに基づく（上のパネル）、ＩＰ−１０血清レベルのみに基づく（中のパネル）ならびにＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０レベルの組み合わせ分析に基づくＨＣＶ患者における処置結果の予測値を比較するグラフによるまとめ。
【図８】血清ＩＰ−１０レベルに基づく、ペグインターフェロン及びリバビリン処置への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）をフィッティングするロジスティック回帰分析ならびに遺伝子型のそれぞれに関する回帰曲線のグラフ図。
【図９Ａ】反応者（ＳＶＲ）及び無−反応者患者における処置前血清ＩＰ−１０データの分布グラフ。
【図９Ｂ】反応者（ＳＶＲ）及び無−反応者患者における処置前血清ＩＰ−１０レベル及び処置反応結果に基づくモザイクプロット。
【図１０】コホート全体における、又は人種グループごとに層別された、処置前血清ＩＰ−１０レベルに基づく反応者（ＳＶＲ）である確率をフィッティングするロジスティック回帰分析のグラフによるまとめ。
【図１１Ａ】コーカサス系アメリカ人においてＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従って層別されたＨＣＶ患者中の処置前血清ＩＰ−１０。
【図１１Ｂ】アフリカ系アメリカ人においてＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従って層別されたＨＣＶ患者中の処置前血清ＩＰ−１０。
【図１２】処置前血清ＩＰ−１０及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従って層別されたＨＣＶ患者における持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）率（％）。
【図１３】血清ＩＰ−１０レベルのみに基づく、又は血清ＩＰ−１０のレベルとＩＬ２８Ｂ遺伝子型の組み合わせに基づく、ペグ−インターフェロン及びリバビリン処置への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）をフィッティングするロジスティック回帰分析のグラフによるまとめ。
【図１４】ペグ−インターフェロン及びリバビリン処置へのＳＶＲの予測における、処置前血清ＩＰ−１０、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型、人種、ベースラインＨＣＶウイルス負荷又はこれらのパラメーターの組み合わせに関する受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析。
【図１５】ｐｅｇＩＦＮ及びリバビリン治療への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）の予測物質。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
実施例の節
【実施例１】
【００２６】
患者及び処置
ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃ研究は、遺伝子型１感染を有するＡＡ及びＣＡの中での反応の率及び予測物質を評価するため、ならびに治療への無反応に関する理由を同定するために設計された、慢性Ｃ型肝炎の組み合わせペグインターフェロン及びリバビリン治療の多施設治験（ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｓｔｕｄｙ）であった。ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃ試験の設計及び一次的結果は他の場所で報告された［Ｃｏｎｊｅｅｖａｒａｍ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｉｎ Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ ａｎｄ Ｃａｕｃａｓｉａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３１（２）：２００６年，ｐ．４７０−７］。治療未経験（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｎａｉｖｅ）であり、遺伝子型１に感染しており、検出可能なＨＣＶ ＲＮＡを有し、且つ慢性ＨＣＶの組織学的証拠を有する１８歳及びそれより年長の患者は、関与する資格があった。１日当たり２杯又は同等量（２０ｇ）より多くのアルコール消費の歴史又は過去６ヶ月以内のアルコール乱用の証拠を有する患者は除外した。すべての患者は登録の１８ヶ月内に肝臓生検を受けた。患者は、自己申告に基づいて人種によりアフリカ系アメリカ又はコーカサス人種として、及び民族性によりヒスパニック又は非−ヒスパニックとして分類された。すべての協力者は合衆国で生れたことが必要であった。
【００２７】
患者は少なくとも２４週間、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）１８０μｇを毎週、及びリバビリン（Ｃｏｐｅｇｕｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）１０００〜１２００ｍｇを毎日与えられた。２４週までにＨＣＶ Ｒ
ＮＡ陰性になった患者は、合計で４８週間処置を続け、ＨＣＶ ＲＮＡ陽性のままであった患者は処置を停止し、無−反応者（ＮＲ）と考えられた。試験の一次的終点は、治療の停止後少なくとも２４週間の検出可能なＨＣＶ ＲＮＡの不在として定義される持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）であった。
【００２８】
ＩＰ−１０を含む血清サイトカインの分析
抗ウイルス治療への５０人の持続性ウイルス学的反応者（ＳＶＲ）及び５０人の無−反応者（ＮＲ）をＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃコホートから選び、それらをサイトカイン分析中に含めた。４８週間のＩＦＮに基づく治療への再発者は、この事後分析（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）に含めなかった。コホートは、５１人のアフリカ系アメリカ人（ＡＡ）及び４９人のコーカサス系アメリカ人（ＣＡ）から成った。コホートは４１人の女性及び５９人の男性を含んだ。
【００２９】
Ｌｕｍｉｎｅｘシステム上で商業的に入手可能なヒト２３−プレックス（ｐｌｅｘ）及び２７−プレックスパネルサイトカインＢｉｏＰｌｅｘアッセイ（ＢｉｏＲａｄ，カタログ番号それぞれ＃１７１−Ａ１１１２３及び＃１７１−Ａ１１１２７）を用い、製造者の指示に従って、ベースラインで集められた血清試料において５０種のサイトカインを測定した。大多数の試料において、ベースラインでマルチプレックスアッセイにおいて分析された５０種のサイトカインから、３７種を確実に定量することができた。血清ＩＰ−１０レベルの分析に特別な注意がはらわれ、それはヒトサイトカイン２７−プレックスパネルＢｉｏＰｌｅｘアッセイの一部として決定された。このアッセイにおけるＩＰ−１０測定値のダイナミックレンジは３．１−５０，９３８ｐｇ／ｍｌであり、６．５ｐｇ／ｍｌの検出限界を有した。
【００３０】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定
血清ＩＰ−１０濃度が分析された（上記を参照されたい）８０人の患者（４０人の反応者、４０人の無反応者）のサブセットにつき、遺伝子型決定を行った。
【００３１】
この患者サブセットは３９人のＡＡ及び４１人のＣＡを含んだ。
【００３２】
ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ対立遺伝子識別キット及びＡＢＩ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ，４６１：２００９年，７９８−８０２）により記載された通りに、ＩＬ２８Ｂ多型マーカーｒｓ１２９７９８６０を調べた。
【００３３】
統計的分析
ＳＡＳ又はＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ）を用いて統計的分析を行った。Ｔｉｂｃｏ Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェア又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４ソフトウェアを用いてグラフを作成した。
【００３４】
ＩＰ１０はＳＶＲと関連している
十分に特性化されたアメリカ人コホートにおいて、選ばれたサイトカインの処置前分布が処置反応（持続性ウイルス学的反応，ＳＶＲ）を予測できるか否かを決定するために、５０種のサイトカイン及びケモカインの包括的配列（ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｒｒａｙ）を用い、ＨＣＶ処置を受けたＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃコホート中の１００人の患者からの血清試料を評価した。図１における反応者対無−反応者のヒートマップ分析に描かれている通り、分析された５０種のサイトカインから３７種を確実に測定することができた。ＩＰ−１０以外の（下記を参照されたい）すべてのサイトカインのベースラインレベルは、反応者と無−反応者の間で有意に異ならなかった。
【００３５】
ベースラインにおける平均血清ＩＰ−１０濃度は、無反応者と比較して反応者において有意により低かった（１１４９±８５ｐｇ／ｍｌに対して６８７±６８ｐｇ／ｍｌ，ｐ＜０．００１）（図２Ａ）。ＩＰ−１０測定値の予測値の可能性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）を評価するために、以前の他の研究において適用されたと類似して、６００ｐｇ／ｍｌの閾値に従って患者を層別した。
［Ｚｅｒｅｍｓｋｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １０：ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ／ＨＩＶ−ｃｏｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ，４５（３）：２００７年，ｐ．２６２−８‖Ｂｕｔｅｒａ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｐｌａｓｍａ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．Ｂｌｏｏｄ，１０６（４）：２００５年，ｐ．１１７５−８２．‖Ｄｉａｇｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．著，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｅｒｕｍ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １０ ｌｅｖｅｌｓ ｗｉｔｈ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐｌｕｓ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．Ｇｕｔ，５５（３）：２００６年，ｐ．３７４−９．‖Ｌａｇｇｉｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．著，ＩＰ−１０ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｖｉｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＣＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４４（６）：２００６年，ｐ．１６１７−２５．‖Ｎａｒｕｍｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−１０ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８（１１）：１９９７年，ｐ．５５３６−４４．‖Ｒｏｍｅｒｏ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ）−ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−１０：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ，ｖｉｒａｌ ｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ＩＦＮ−ａｌｐｈａ ２ａ ａｎｄ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，１９４（７）：２００６年，ｐ．８９５−９０３．］
【００３６】
低いベースラインＩＰ−１０レベル（＜６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の７９パーセント（２６／３３）は、治療に対する反応者であり（陽性予測値＝７９％）、高いベースラインＩＰ−１０レベル（＞６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の６４％（４３／６７）は治療に対する無反応者であろう（陰性予測値＝６４％）（図２Ｂ）。全体として、この結果は、処置前血清ＩＰ−１０レベルに基づいて治療反応を予測するテストに関して５２％（２６／５０）の特異度及び８６％（４３／５０）の敏感度を生ずる。
【００３７】
評価された３７種のサイトカインを用いる相関マトリックス分析に基づくと、ベースラインでＩＰ−１０と相関する他のサイトカインはなかった（図３）。サイトカインのいくつかのグループはベースラインで互いに相関していることが注目されたが、いずれも処置反応と関連しなかった。重要なことに、交差妥当化モデルを用いる３７種のサイトカインの分析は、ベースラインＩＰ−１０に加えられるいずれのサイトカインもその反応者対無反応者の誤分類率を向上させなかったことを明らかにした（約３０％）。
【００３８】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型はＳＶＲと関連している
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従う患者集団の層別は、処置反応との有意な（尤度比 ｃｈｉ−平方：ｐ＜０．００１２）関連性を明らかにし（図４）、ＣＣ遺伝子型は高いＳＶＲ率（ＣＣ遺伝子型において８７％のＳＶＲ）と関連していたが、ＴＴ遺伝子型は無−反応者と関連していた（ＴＴ遺伝子型において７５％の無−反応者）。
【００３９】
ＩＰ１０血清レベル及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型の加算的且つ独立した効果
平均血清ＩＰ−１０レベルは、３つのＩＬ２８Ｂ遺伝子型のグループの間で有意に異ならず、ＣＣ遺伝子型をＣＴ及びＴＴ遺伝子型を合わせたグループに対して比較した場合も有意に異ならなかった（図５）。
【００４０】
次に、以前にいくつかの研究で用いられたことがある（上記を参照されたい）６００ｐｇ／ｍｌの閾値より高いか又は低いＩＰ−１０レベルに従って、患者を層別した。次いで処置前血清ＩＰ−１０レベルに基づく層別をＩＬ２８Ｂ遺伝子型と組み合わせて分析した。この組み合わせ分析の表示データを図６に示す。
【００４１】
この発見は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び処置前血清ＩＬ−１０濃度の組み合わせ分析により、個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリン処置への（無−）反応の予測性を有意に向上させることができることを示している。
【００４２】
さらに特定的に、高いＩＰ−１０レベルを有する場合の３４％に対して、低いＩＰ−１０を有するＣＴ保有者は７９％のＳＶＲを有した。ＴＴ保有者の間で、類似の関連性が同定された（高ＩＰ−１０の場合の１０％に対して低ＩＰ−１０の場合にＳＶＲ＝５０％）。（表１を参照されたい）
【００４３】
【表２】
【００４４】
図７は、個々の分析（ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及びＩＰ−１０レベル）と組み合わせ分析の比較概要を示す。行われた均一性に関するｃｈｉ−平方テストは、２つもしくはそれより多い集団（例えば種々のＩＬ２８Ｂ遺伝子型グループ）が共通の特性（すなわちＳＶＲ反応）を有する観察の同じ割合を有するかどうかを調べる。両方の個々の分析は、処置反応を有意に予測できる。それでも、両方のマーカーを組み合わせると明白な加算効果があり、個々の患者に関する処置反応及び無−反応の両方の予測値を向上させる。この組み合わせ分析は、反応者対無−反応者の高度に有意な層別を生ずる。さらに特定的に、説明変数としてＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０（６００ｐｇ／ｍｌより高いか又は低い）の両方を含むＳＶＲの一般化線形モデル研究（ＳＡＳ ｐｒｏｃ ｇｅｎｍｏｄ）は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＜０．００１３）及び血清ＩＰ−１０（ｐ＜０．００１６）の有意な寄与効果を示すが、持続性ウイルス学的反応の評価におけるＩＬ２８ＢとＩＰ−１０の間の相互作用の寄与効果を示さない（ｐ＝０．７５）。
【００４５】
最後に、血清ＩＰ−１０レベル（連続変数として処理される）及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型（カテゴリー変数）に基づくＳＶＲ反応のロジスティック回帰モデル研究は、血清ＩＰ−１０レベルに従って反応者と無−反応者を明確に分離し、反応曲線中にＩＬ２８Ｂ遺伝子型依存性シフトを有する（図８）。
【００４６】
一緒にすると、３つの発見は、処置前血清ＩＰ−１０レベル及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型の組み合わせの予測値が、ペグインターフェロン及びリバビリン治療への持続性ウイルス学的反応の予測において個々のマーカーのそれぞれより能力が優れており、ＨＣＶ患者において個人的な薬剤を導く見込みを保有していることを示している。
【実施例２】
【００４７】
この研究において、ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃコホート中の２７２人の患者（１１５人の無−反応者及び１５７人のＳＶＲ）からの血清試料中で処置前ＩＰ−１０レベルを測定した。この分析は、ＣＡ及びＡＡ患者の両方において、ＩＰ−１０が等しくＳＶＲを予測できることを示した。次いで処置前血清ＩＰ−１０レベルとＩＬ２８Ｂ遺伝子型の組み合わせを、このコホートにおいてｐｅｇＩＦＮ及びリバビリンへの反応の予測物質として評価した。
【００４８】
患者及び方法
患者．ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃ研究は、遺伝子型１感染を有するＡＡ及びＣＡの中での反応の率及び予測物質を評価するため、ならびに治療への無反応に関する理由を同定するために設計された、慢性Ｃ型肝炎の組み合わせｐｅｇＩＦＮ及びリバビリン治療の多施設治験であった。ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃ試験の設計及び一次的結果は他の場所で報告された［Ｃｏｎｊｅｅｖａｒａｍ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ ａｎｄ Ｃａｕｃａｓｉａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３１（２）：２００６年，ｐ．４７０−７］。治療未経験であり、遺伝子型１に感染しており、検出可能なＨＣＶ ＲＮＡを有し、且つ慢性ＨＣＶの組織学的証拠を有する成人は、関与する資格があった。患者は、自己申告に基づいて人種によりアフリカ系アメリカ人又はコーカサス人として、及び民族性によりヒスパニック又は非−ヒスパニックとして分類された。すべての協力者は合衆国で生れたことが必要であった。合衆国全体に及ぶ８つの臨床施設から４０１人の患者を登録し、２００２年７月から２００３年１２月の間に治療を開始した。
【００４９】
本研究のために、全ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃコホートから、１５７人の持続性ウイルス学的反応者（ＳＶＲ）（１０４人のＣＡ、５３人のＡＡ）及び１１５人の無−反応者（３４人のＣＡ、８１人のＡＡ）を含んでなる２７２人の患者のサブセットから血清試料を得た。この研究で分析されるすべての検体はＩＲＢ−承認の治験実施計画書（ＩＲＢ−ａｐｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）の下に得られ、それに関して協力者は遺伝子テストに関する同意を含む書面によるインフォームドコンセントを与えた。
【００５０】
処置．患者は少なくとも２４週間、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）１８０μｇを毎週、及びリバビリン（Ｃｏｐｅｇｕｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）１０００〜１２００ｍｇを毎日与えられた。２４週までにＨＣＶ
ＲＮＡ陰性になった患者は、合計で４８週間処置を続け、ＨＣＶ ＲＮＡ陽性のままで
あった患者は処置を停止し、無−反応者と考えられた。試験の一次的終点は、治療の停止後少なくとも２４週間の検出可能なＨＣＶ ＲＮＡの不在として定義されるＳＶＲであった。
【００５１】
ＨＣＶ ＲＮＡの定量．中心実験室（ｃｅｎｔｒａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ＳｅｒａＣａｒｅ ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）において、Ｃｏｂａｓ Ａｍｐｌｉｃｏｒ Ａｓｓａｙ（感度 ５０ＩＵ／ｍｌ：Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を用いてＨＣＶ ＲＮＡテストを行った。選ばれた試料を、ＨＣＶ ＲＮＡレベルに関してＣｏｂａｓ Ａｍｐｌｉｃｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ａｓｓａｙにより、及びＨＣＶ ＲＮＡ遺伝子型に関してＶｅｒｓａｎｔ ＨＣＶ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａｓｓａｙ（Ｂａｙｅｒ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）によりテストした。
【００５２】
肝臓組織学．すべての患者は、スクリーニングの１８ヶ月内に肝臓生検を受け、それは中心病理学者によって盲検により読まれた（ｒｅａｄ ｂｌｉｎｄｅｄ）。すべての生検は、Ｉｓｈａｋの修正組織学的活性指数（ＨＡＩ）採点システム（Ｉｓｈａｋ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ（ＨＡＩ） ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて炎症を等級付けし、線維症を段階付けすることにより、Ｃ型肝炎の重度に関して評価された。
【００５３】
血清ＩＰ−１０の定量．処置の開始の前にベースラインにおいて集められた血清試料中で、商業的に入手可能なＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０イムノアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、インターフェロン−γ誘導タンパク質−１０（ＩＰ−１０）を測定した。すべての試料を１：２で希釈し、二重に分析した。このアッセイにおけるＩＰ−１０測定値の線状ダイナミックレンジは８−５００ｐｇ／ｍｌであり、７．８ｐｇ／ｍｌに検出限界を有した。１０００ｐｇ／ｍｌより高いＩＰ−１０濃度を有する試料を１：５で希釈し、再−分析した。
【００５４】
ＩＬ２８Ｂの遺伝子型決定．Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ，４６１：２００９年，７９８−８０２）により記載された通りに、ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ対立遺伝子識別キット及びＡＢＩ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＩＬ２８Ｂ多型マーカーｒｓ１２９７９８６０を分析した。我々のコホートからの２１０人の患者からのＤＮＡ試料を遺伝子決定した。
【００５５】
統計的方法．ＪＭＰ ７．０．２又はＳＡＳ バージョン９．１ソフトウェア（両方ともＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃから）を用いて標準的な統計的分析を行った。分布正規性条件（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｉｔｙ ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎ）を満たすために、統計的テストにおける使用の前にＩＰ−１０濃度を対数変換した。種々の分類モデル（対角線的識別分析（ｄｉａｇｏｎａｌ ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、ランダムフォレスト（ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、サポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ）及びバギング（ｂａｇｇｉｎｇ））ならびに受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析の評価のために、公然と利用できるＲ中のパッケージ（バージョン２．８．０）を用いた。ＳＡＳにおけるｐｒｏｃ ｌｏｇｉｓｔｉｃ及びｐｒｏｃ ｇｅｎｍｏｄ法を用いて、それぞれロジスティック回帰モデル及び一般化線形モデルのフィッティングを行った。有効統計ソフトウェアツール又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いてグラフを作成した。
【００５６】
結果
研究コホートに含まれる患者．
この研究のために、ＶＩＲＡＨＥＰ−Ｃコホートからの抗ウイルス治療への１５７人の持続性ウイルス学的反応者（ＳＶＲ）及び１１５人の無−反応者からの血清試料が含まれた。ＳＶＲ及び無−反応者の定義は上の節で示した。ウイルス再発、再燃を有するか、又は利用できるウイルス学的データが１２週間より短い患者は排除した。コホートは１３４人のＡＡ及び１３８人のＣＡから成った。このコホートのベースライン患者特性は以下の通りであった：年齢 ４８．４±７．４歳；ウイルス負荷 ４．６±５．７Ｘ１０６ＩＵ／ｍｌ；血小板数 ２１４±７３Ｘ１０６個の細胞／ｍｍ３；アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ） ９０．０±７２．９ＩＵ／ｌ；合計ビリルビン ０．７０±０．３５ｍｇ／ｄｌ；アルブミン ４．１±０．４０ｇ／ｄｌ；及びヘマトクリット ４３．２±３．８％（すべてのデータは平均±ＳＤとして）。コホートは９６人の女性及び１７６人の男性を含み、１９％が４−６のＩｓｈａｋ線維症採点を有した。我々のコホートにおける２７２人の患者中の２１０人からの試料はＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定に利用され得、１２３人はＳＶＲであり８７人は無−反応者であり、その中で１１１人はＣＡであり、９９人はＡＡであった。
【００５７】
ベースライン血清ＩＰ−１０測定及び処置反応．
平均血清ＩＰ−１０レベルは、無−反応者患者と比較してＳＶＲにおいて有意により低かった（７０４±４４ｐｇ／ｍｌに対して４３７±３１ｐｇ／ｍｌ，ｐ＜０．００１）（図９Ａ、表２）。ＩＰ−１０測定値の予測値の可能性を評価するために、我々は先行研究において用いられてきた６００ｐｇ／ｍｌの閾値に従って患者を層別した。低いベースラインＩＰ−１０レベル（＜６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の６９パーセント（１２９／１８８）は治療への反応者であったが（陽性予測値、ＰＰＶ＝６９％）、高いベースラインＩＰ−１０レベル（＞６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の６７％（５６／８３）は治療への無−反応者であった（陰性予測値、ＮＰＶ＝６７％）（図９Ｂ）。全体としてこれは、処置前血清ＩＰ−１０レベルに基づいて治療反応を予測できるテストに関して８２％（１２９／１５７）の特異度及び４９％（５６／１１５）の敏感度を生ずる。
【００５８】
我々は、ＲＯＣ曲線分析に基づいて最良の識別能力を有するカットオフ値を計算することにより、ＳＶＲ患者の同定のために用いられる６００ｐｇ／ｍｌのＩＰ−１０閾値を評価した。我々のデータセットにおいて、３７０ｐｇ／ｍｌの閾濃度がＳＶＲ患者の予測において特異度（８０％）と敏感度（５６％）の最適の組み合わせであることが明らかになった。次いで我々は、ＳＶＲならびに無−反応の両方を正しく予測するための我々の最適ＩＰ−１０レベルを決定した。５５０ｐｇ／ｍｌの閾値は、真陽性者又は陰性者の最高の率（６９％）を与え、文献中で用いられてきた６００ｐｇ／ｍｌのカットオフと十分に相関した（我々のデータセットにおいて６８％の真陽性者又は陰性者が予測された）。最後に、処置前ＩＰ−１０濃度のロジスティック回帰分析は、個々の患者において測定される特定のＩＰ−１０レベルに関するＳＶＲの確率のフィッティングを可能にし、高度に有意なＩＰ−１０の効果を示した（ｐ＜０．０００１；図１０，灰色の曲線）。
【００５９】
血清ＩＰ−１０レベルへの人種の影響．
ＣＡ及びＡＡの処置前ＩＰ−１０血清レベルを比較すると、反応者（ｐ＝０．７５）及び無−反応者（ｐ＝０．９７）の別々の分析において有意な差は観察されなかった（表２）。研究コホート全体において観察されたＣＡとＡＡの間のベースライン血清ＩＰ−１０レベルおける有意な（ｐ＝０．０１５）差は、コホートの不均衡な組成により最も良く説明され得るようである（ＡＡサブグループにおける４０％と比較してＣＡサブグループにおけるＩＦＮ処置反応率は７５％であった）。ＩＦＮ治療への反応者及び無−反応者の間のＩＰ−１０血清レベルにおける高度に有意な差は、ＣＡ及びＡＡの両方において見出された（表２）。ベースラインＩＰ−１０レベルのロジスティック回帰分析を用い、ＣＡ及びＡＡ患者に関する処置反応曲線を作成した（図１０）。ＡＡ及びＣＡ患者に関する反応
曲線は、ＩＰ−１０（ｐ＜０．０００１）及び人種（ｐ＜０．０００１）の両方の有意な影響を明らかにしたが、ＩＰ−１０と人種の間の有意な相互作用を明らかにしなかった（ｐ＝０．０８）。
【００６０】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び処置反応
遺伝子型決定された２１０人の患者の中の３０％はＣＣであり、４９％はＣＴであり、２１％はＴＴであった。ＩＬ２８Ｂ遺伝子型と処置反応の間の有意な関連性が観察された：対応するＳＶＲ率はＣＣに関して８７％であり、ＣＴに関して５０％であり、ＴＴに関して３９％であった（ｐ＜０．０００１）（表３）。コーカサス系アメリカ人の場合、４９％は９１％のＳＶＲを有するＣＣであり、４１％は６７％のＳＶＲを有するＣＴであり、１０％は４５％のＳＶＲを有するＴＴであった（ｐ＜０．００１）。アフリカ系アメリカ人の場合、わずか９％が６７％のＳＶＲを有するＣＣであり、５８％が３５％のＳＶＲを有するＣＴであり、３３％が３６％のＳＶＲを有するＴＴであった（ｐ＝０．２０）。
【００６１】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び処置前ＩＰ−１０レベルと処置反応との関連性
平均血清ＩＰ−１０レベルは、コーカサス人（ｐ＝０．２７）及びアフリカ系アメリカ人（ｐ＝０．５８）の両方において、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型にかかわらず、すべての患者に関して類似していた（図１１）。血清ＩＰ−１０とＩＬ２８Ｂ遺伝子型の間のこの相関性の欠如は、これらのマーカーの両方に関して観察されるＳＶＲとの関連性が独立していることを示す。処置前ＩＰ−１０レベルに関する６００ｐｇ／ｍｌのカットオフを用いると、利用できる血清ＩＰ−１０及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型の両方のデータを有する我々のコホートの患者に関するＳＶＲ率は（ｎ＝２１０）、低いＩＰ−１０レベル（＜６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の場合に６９％であり、高いＩＰ−１０レベル（＞６００ｐｇ／ｍｌ）を有する患者の場合に３５％であった（ｐ＜０．０００１）。
【００６２】
名目ロジスティック回帰におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０（６００ｐｇ／ｍｌより高いかもしくは低い）の関数としてのＳＶＲのモデル研究は、ＳＶＲの予測（Ｃｈｉ２＝５５，ｐ＜０．００１）におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＜０．０００１）及び血清ＩＰ−１０（ｐ＜０．００１５）の有意な加算的効果を明らかにしたが、ＩＬ２８ＢとＩＰ−１０の間の相互作用を明らかにしなかった（ｐ＝０．６６）。図１２は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型グループ内のベースラインＩＰ−１０レベルがＳＶＲ率に関する加算的且つ独立した情報を与えたことを視覚化している。さらに特定的に、ベースラインＩＰ−１０レベルは、ＩＬ２８Ｂ Ｔ−対立遺伝子保有者において最も役に立った。ＣＴ保有者に関する全体的な反応率は５０％であったが、高いＩＰ−１０レベルを有する場合の２４％に対して低いＩＰ−１０レベルを有する者の場合に６４％がＳＶＲを有した。ＴＴ遺伝子型の場合、３９％がＳＶＲを有し、低処置前ＩＰ−１０グループ内で４８％であり、高ＩＰ−１０グループ内で２０％であった。連続変数として処理される血清ＩＰ−１０レベル及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型に基づくＳＶＲ反応のロジスティック回帰モデル研究は、反応曲線における追加的且つ有意なＩＬ２８Ｂ遺伝子型−依存性シフトを有する血清ＩＰ−１０レベルに従う、ＳＶＲの確率のより個別化された（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ）予測を可能にした（図１３）。予測モデルのより定量的な比較を可能にする相補的受信者操作特性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｓｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）曲線分析は、単独の処置前血清ＩＰ−１０に基づくモデル（０．７１）対単独のＩＬ２８Ｂ遺伝子型に基づくモデル（０．７０）に関して類似のＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）の値を明らかにした。しかしながら、両方のマーカーを組み合わせたモデルに関し、もっとずっと高いＲＯＣ ＡＵＣ値（０．８０）が達成された（図１４）。一緒にすると、これらのデータは、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型を処置前血清ＩＰ−１０測定値と組み合わせることは、特に非−ＣＣ遺伝子型においてＳＶＲの予測値を明白に向上させることを示している。
【００６３】
人種グループごとに分析を行う時にも、同じ且つ有意な傾向が見出された（表４）。例えばアフリカ系アメリカ人において、ベースラインＩＰ−１０レベルに伴う差はＣＴ及びＴＴのＩＬ２８Ｂ遺伝子型に関してさらにもっと衝撃的であった。低いＩＰ−１０を有するＣＴ保有者の場合、高いＩＰ−１０を有する場合の１７％に対してＳＶＲは４８％であり、低いＩＰ−１０を有するＴＴ保有種の場合、高いＩＰ−１０を有する場合の２５％に対してＳＶＲは４３％であった。
【００６４】
処置反応の予測のためにＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び処置前ＩＰ−１０レベルを他のベースラインパラメーターと組み合わせること．
我々は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０に加えて他のベースラインパラメーターがＳＶＲの予測を有意に向上させ得るかどうかを評価した。この分析において我々は、ロジスティック回帰モデルに年齢、性別、人種、処置前ウイルス負荷、Ｉｓｈａｋ線維症採点、ＡＬＴ、脂肪症及び組織学的活性指数を加えた。含まれるすべてのパラメーターの中で、処置前ウイルス負荷（ｐ＜０．０００１）、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＝０．０００４）、ベースラインＩＰ−１０レベル（ｐ＝０．００３３）及び人種（ｐ＝０．００１１）のみがモデルに有意に寄与した。変数のいずれの対の間でも相互作用は有意でなかった（すべてｐ＞０．１）。すべての変数をカテゴリー変数として処理すると（例えば連続変数としてではなく、６００ｐｇ／ｍｌより高いかもしくは低いＩＰ−１０）、得られる一般化線形モデルは同じ４つの有意な変数及びＩＳＨＡＫ線維症採点を含んだ（図１５）。
【００６５】
これらの多変量解析において同定される最も有意な変数を含むモデルの予測力を比較するＲＯＣ曲線分析を行った（図１４）。ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０を組み合わせたモデルのＡＵＣ（ＡＵＣ ０．８０）は、単独のＩＬ２８Ｂ遺伝子型に基づくモデル（ＡＵＣ ０．７０）を含む個々の変数に基づくモデルより明らかに能力が優れていた。人種及びベースラインウイルス負荷を加えることはモデルをさらに向上させたが、加えられた増加は中程度であった（ＡＵＣは最高で０．８５）。
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
【表５】
【００６９】
図１−１５の説明
図１．インターフェロンα／リバビリン治療への５０人の反応（ＳＶＲ）及び５０人の無反応ＨＣＶ患者において測定される３７種のサイトカインの処置前血清濃度を示すヒートマップ。
【００７０】
図２．ＩＦＮ治療への反応者におけるベースラインでのＩＰ−１０測定値対無反応者におけるＩＰ−１０測定値。［Ａ］無−反応者に対してＩＦＮ処置に反応する患者において、ベースラインで有意に（ｐ＜０．００１）より低いＩＰ−１０血清レベルが観察された。水平線は、グループごとの平均値を示す。ＩＰ−１０測定値の予測値の可能性を評価するために、患者を６００ｐｇ／ｍｌの閾値に従って層別した（破線）。［Ｂ］無−反応者のグループと比較して反応者において、高い（＞６００ｐｇ／ｍｌ）ＩＰ−１０レベルを有する患者の有意により小さい割合が見出された（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｃｈｉ平方＝１６．３，ｐ＜０．００１）。
【００７１】
図３．１００人のＨＣＶ患者において（処置前試料）ベースラインで測定される３７種のサイトカインを含む相関マトリックス。青い四角は、それぞれ６０％より高い（明るい青
）、７０％より高い（中度の青）又は８０％より高い（暗い青）サイトカイン間の相関を示す。赤い四角は、ＩＰ−１０と他のすべての３６種のサイトインの相関を示す（すべて６０％より低い）。
【００７２】
図４．ＩＦＮα＋リバビリン処置への反応者及び無反応者におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｒｓ１２９７９８６０）分布。データは、それぞれ反応者又は無反応者の患者の数（ｎ）又はパーセンテージ（Ｒｏｗ％）として示される。図の右側にグラフ図を示す。
【００７３】
図５．８０人のＨＣＶ患者における処置前血清ＩＰ−１０濃度との関連におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｒｓ１２９７９８６０）。患者をＩＬ２８Ｂ遺伝子型ごとに（左）、又はＣＣ遺伝子型対ＣＴ／ＴＴ遺伝子型の比較により（右）グループ分けした。有意なＩＬ２８Ｂ遺伝子型に関連する差は観察されなかった。
【００７４】
図６．治療結果との関連におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０濃度（６００ｐｇ／ｍｌより高いか又は低い）の組み合わせ分析。図は、ＩＦＮα／リバビリン処置に反応した、又は反応しなかった患者の数（Ｎ）（左のパネル）ならびに遺伝子型及びＩＰ−１０レベルごとの患者の割合（％として）を示す。
【００７５】
図７．ＩＬ２８Ｂ遺伝子型のみに基づく（上のパネル）、ＩＰ−１０血清レベルのみに基づく（中のパネル）ならびにＩＬ２８Ｂ遺伝子型及び血清ＩＰ−１０レベルの組み合わせ分析に基づくＨＣＶ患者における処置結果の予測値を比較するグラフによるまとめ。棒中のパーセンテージは、特定のサブグループ中のＳＶＲ反応者の割合を示す。各サブグループ（棒）中の患者の合計数を棒の右側に示す。
【００７６】
図８．血清ＩＰ−１０レベルに基づく、ペグインターフェロン及びリバビリン処置への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）をフィッティングするロジスティック回帰分析のグラフ図（灰色の曲線）。次にＩＬ２８Ｂ遺伝子型をモデルに加え、遺伝子型のそれぞれに関する回帰曲線を生じた（ＣＣ：青、ＣＴ：赤、ＴＴ：緑）。サブグループのそれぞれにおける患者の比較的少ない数は、このモデルにおいて血清ＩＰ−１０の寄与のみが有意な（ｐ＝０．０１７）寄与因子（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ）として明らかになり、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＝０．３１）又はＩＰ−１０とＩＬ２８Ｂの間の相互作用（ｐ＝０．９３）は有意な寄与因子として明らかにならなかったことを説明し得る。各患者試料は図の上部（反応者）又は下部（無−反応者）に丸として示されている；丸の色はＩＬ２８Ｂ遺伝子型を示す。
【００７７】
図９．反応者（ＳＶＲ）及び無−反応者患者における処置前血清ＩＰ−１０（ｐｇ／ｍｌ）。（Ａ）ＩＰ−１０データの分布グラフ；（Ｂ）ＩＰ−１０レベル（６００ｐｇ／ｍｌより高い又は低いで層別）及び処置反応結果に基づくモザイクプロット。
【００７８】
図１０．コホート全体における（灰色の曲線）、又は人種グループごとに層別された（コーカサス系−アメリカ人：赤、アフリカ系−アメリカ人：青）、処置前血清ＩＰ−１０レベル（ｐｇ／ｍｌ）に基づく反応者（ＳＶＲ）である確率をフィッティングするロジスティック回帰分析のグラフによるまとめ。各患者試料は図の上部（ＳＶＲ）又は下部（無−反応者）に丸として示されている。ロジスティック回帰モデルは、ＩＰ−１０（ｐ＜０．０００１）及び人種（ｐ＜０．０００１）の有意な影響を明らかにしたが、ＩＰ−１０と人種の間の有意な相互作用を明らかにしなかった（ｐ＝０．０８）。
【００７９】
図１１．（Ａ）コーカサス系−アメリカ人及び（Ｂ）アフリカ系アメリカ人におけるＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従って層別されたＨＣＶ患者中の処置前血清ＩＰ−１０（ｐｇ／ｍｌ）。一元配置ＡＮＯＶＡ（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）は、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従うＩ
Ｐ−１０レベルにおける有意な差を示さなかった。
【００８０】
図１２．処置前血清ＩＰ−１０（６００ｐｇ／ｍｌより高い対低い）及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従って層別されたＨＣＶ患者における持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）率（％）。単独の血清ＩＰ−１０又は単独のＩＬ２８Ｂ遺伝子型に従うＳＶＲ率をグラフの垂直の壁上に示す（白い前面）。各サブグループに関してＳＶＲ率及び患者の数（ＳＶＲの数／サブグループ全体の数）を棒の内部に示す。尤度比Ｃｈｉ２分析は、試料グループ全体に及ぶ反応の均一性を確証した（Ｃｈｉ２＝５５；ｐ＜０．０００１）。
【００８１】
図１３．血清ＩＰ−１０レベルのみに基づく（灰色の曲線）、又は血清ＩＰ−１０のレベル（ｐｇ／ｍｌ）とＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ＣＣ：赤、ＣＴ：緑、ＴＴ：青）の組み合わせに基づく、ペグ−インターフェロン及びリバビリン処置への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）をフィッティングするロジスティック回帰分析のグラフによるまとめ。各患者試料は図の上部（ＳＶＲ）又は下部（無−反応者）に丸として示されている；丸の色はＩＬ２８Ｂ遺伝子型を示す。ロジスティック回帰モデルは、ＩＰ−１０（ｐ＜０．０００１）及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型（ｐ＜０．０００１）の有意な影響を明らかにしたが、ＩＰ−１０とＩＬ２８Ｂ遺伝子型の間の有意な相互作用は明らかにしなかった（ｐ＝０．３）。
【００８２】
図１４．ペグ−インターフェロン及びリバビリン処置へのＳＶＲの予測における、処置前血清ＩＰ−１０、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型、人種、ベースラインＨＣＶウイルス負荷又はこれらのパラメーターの組み合わせに関する受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析。凡例中の数字は、モデル比較のために用いることができるＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）統計量を示す。
【００８３】
図１５．ｐｅｇＩＦＮ及びリバビリン治療への持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）の予測物質。ＩＬ２８Ｂ遺伝子型及びＩＰ−１０のベースライン（処置前）測定値、ＨＣＶウイルス負荷、線維症段階（ＩＳＨＡＫ）、年齢、性別、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、脂肪症（脂肪得点）ならびに門脈及び小葉組織学的活性指数（ＨＡＩ）を含むロジスティック回帰モデルからオッズ比を計算した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶに感染した個々の患者に関してペグインターフロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の結果を予測するために、ＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定、人種又はＣ型肝炎ウイルス負荷決定より成る群から選ばれる２つもしくはそれより多いパラメーターを組み合わせる方法。
【請求項２】
ＨＣＶに感染した個々の患者に関してペグインターフロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の結果を予測するために、該ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定を該ＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値と組み合わせる請求項１に従う方法。
【請求項３】
人種のパラメーターを加える請求項２に従う方法。
【請求項４】
Ｃ型肝炎ウイルス負荷決定を加える請求項２に従う方法。
【請求項５】
人種のパラメーター及びＣ型肝炎ウイルス負荷決定を加える請求項２に従う方法。
【請求項６】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型が多型マーカーｒｓ１２９７９８６０、ｒｓ１２９８０２７５及び／又はｒｓ８０９９９１７あるいはこれらのマーカーと連鎖不平衡にある他の遺伝子マーカーを含む請求項１〜５のいずれかに従う方法。
【請求項７】
組み合わせ測定が、これらの２つの個々のマーカー（ＩＬ２８Ｂ遺伝子型、血清ＩＰ−１０レベル）のいずれとの比較においても、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへのＳＶＲ及び無−反応の間をさらに良く識別する請求項６に従う方法。
【請求項８】
少なくともＩＬ２８Ｂ多型性及びＨＣＶ−感染患者からの血清中のＩＰ−１０レベルの決定又は測定のための手段を含んでなる請求項１〜７のいずれかに従う方法において使用するための診断アッセイ。
【請求項９】
ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の予測のための請求項１〜７のいずれかの方法から得られる結果情報を用いるモデル研究ソフトウェアを含んでなるコンピューターシステム。
【請求項１】
ＨＣＶに感染した個々の患者に関してペグインターフロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の結果を予測するために、ＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値、ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定、人種又はＣ型肝炎ウイルス負荷決定より成る群から選ばれる２つもしくはそれより多いパラメーターを組み合わせる方法。
【請求項２】
ＨＣＶに感染した個々の患者に関してペグインターフロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の結果を予測するために、該ＩＬ２８Ｂ遺伝子型決定を該ＩＰ−１０の処置前血清レベル測定値と組み合わせる請求項１に従う方法。
【請求項３】
人種のパラメーターを加える請求項２に従う方法。
【請求項４】
Ｃ型肝炎ウイルス負荷決定を加える請求項２に従う方法。
【請求項５】
人種のパラメーター及びＣ型肝炎ウイルス負荷決定を加える請求項２に従う方法。
【請求項６】
ＩＬ２８Ｂ遺伝子型が多型マーカーｒｓ１２９７９８６０、ｒｓ１２９８０２７５及び／又はｒｓ８０９９９１７あるいはこれらのマーカーと連鎖不平衡にある他の遺伝子マーカーを含む請求項１〜５のいずれかに従う方法。
【請求項７】
組み合わせ測定が、これらの２つの個々のマーカー（ＩＬ２８Ｂ遺伝子型、血清ＩＰ−１０レベル）のいずれとの比較においても、ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへのＳＶＲ及び無−反応の間をさらに良く識別する請求項６に従う方法。
【請求項８】
少なくともＩＬ２８Ｂ多型性及びＨＣＶ−感染患者からの血清中のＩＰ−１０レベルの決定又は測定のための手段を含んでなる請求項１〜７のいずれかに従う方法において使用するための診断アッセイ。
【請求項９】
ＨＣＶに感染した個々の患者に関するペグインターフェロン及びリバビリンへの持続性ウイルス学的反応（ＳＶＲ）又は無−反応の予測のための請求項１〜７のいずれかの方法から得られる結果情報を用いるモデル研究ソフトウェアを含んでなるコンピューターシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１３−５１４７９６（Ｐ２０１３−５１４７９６Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４５３０７（Ｐ２０１２−５４５３０７）
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０７０４２９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７６８１４
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５１２１１６１２５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０７０４２９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７６８１４
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５１２１１６１２５）
【Ｆターム（参考）】
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