ペグ化ポリペプチドの精製
本発明は、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用する、２つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法、及び実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを産生するための方法を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、特にペグ化（PEGylated）エリスロポエチンの精製のために有用なクロマトグラフィー分離方法の分野におけるものである。
【０００２】
発明の背景
タンパク質は今日の医学ポートフォリオにおいて重要な役割を果たしている。ヒトへの適用のために、全ての治療タンパク質は別個の基準を満たさなければならない。生物製剤のヒトに対する安全性を確実にするために、産生プロセスの間に蓄積する副産物を特に除去しなければならない。規制仕様を満たすために、１つ以上の精製工程を製造プロセスの後に続けなければならない。とりわけ、純度、処理量、及び収率が、適切な精製プロセスの決定において重要な役割を果たす。
【０００３】
微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（スルホプロピル又はカルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合モードイオン交換、チオフィリック（thiophilic）吸着（例えば、β−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを用いる）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）−及びＣｕ（ＩＩ）−アフィニティー材料を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動方法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）のような様々な方法がタンパク質精製のために十分に確立されておりそして広く使用されている（Vijayalakshmi, M.A., Appl.Biochem.Biotech.75 (1998) 93-102）。
【０００４】
例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とインターロイキン６（ＥＰ０４４２７２４）、ＰＥＧとエリスロポエチン（ＷＯ０１／０２０１７）、エンドスタチン及び免疫グロブリンを含むキメラ分子（ＵＳ２００５／００８６４９）、分泌抗体ベースの融合タンパク質（ＵＳ２００２／１４７３１１）、アルブミンを含む融合ポリペプチド（ＵＳ２００５／０１００９９１；ヒト血清アルブミンＵＳ５，８７６，９６９）、ペグ化ポリペプチド（ＵＳ２００５／０１１４０３７）、及びインターフェロン融合物のための共役が報告されている。
【０００５】
Necina, R., et al.（Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698）は、高電荷密度を示すイオン交換媒体による細胞培養上清から直接のヒトモノクローナル抗体の捕捉を報告した。ＷＯ８９／０５１５７において、細胞培養培地を陽イオン交換処理に直接的に供することによる産物免疫グロブリンの精製のための方法が報告されている。マウス腹水からのモノクローナルＩｇＧ抗体の１工程精製が、Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988), 79-88により記載されている。勾配洗浄を使用して、１つ以上の混入物から目的のポリペプチドを分離する、イオン交換クロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するための方法が、ＷＯ２００４／０２４８６６において報告されている。ＥＰ０５３０４４７において、３つのクロマトグラフィー工程の組み合わせによりＩｇＧモノクローナル抗体を精製するためのプロセスが報告されている。モノペグ化インターロイキン１受容体アンタゴニストの容易な精製が、Yu, G., et al.によりProcess Biotechnol. 42 (2007) 971-977において報告されている。Wang et al.（Wang, H., et al., Peptides 26 (2005) 1213-1218）は、２工程陽イオン交換クロマトグラフィーによる、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されたｈＴＦＦ３の精製を報告している。Yun et al.（Yun, Q., et al., J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74）は、２つの連続したイオン交換クロマトグラフィー工程によるペグ化ｒｈＧ−ＣＳＦの精製を報告している。ＷＯ２００７／０３９４３６及びＷＯ０１／０８７３２９は、ポリ（エチレングリコール）基に共有結合したエリスロポエチン及びエリスロポエチンタンパク質を含む液体医薬組成物を報告している。
【０００６】
発明の概要
本発明は、モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンを含む溶液を提供する工程、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する工程、及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において精製モノペグ化エリスロポエチンを回収する工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法であって、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用する方法を含む。
【０００７】
方法の一実施態様において、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程は異なる溶出方法を使用して実施される。別の実施態様において、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程は以下の工程：
ａ）モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンの混合物を含む水性緩衝溶液を、モノペグ化エリスロポエチンが第１のカラム中に含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程、
ｂ）モノペグ化エリスロポエチンを、通過流（through flowing）緩衝液のイオン強度の段階的増加を伴う段階溶出方法により第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程であって、モノペグ化エリスロポエチンの割合が、工程ａ）の適用された混合物と比較して増加する工程、
ｃ）回収されたモノペグ化エリスロポエチンを、前記モノペグ化エリスロポエチンが第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程であって、第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料は第１のカラム中の陽イオン交換材料と同じ型のものである工程、
ｄ）実質的に均質な形態の精製モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の連続増加を伴う連続溶出方法により、前記第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程
を含む。
【０００８】
方法の一実施態様において、陽イオン交換材料は強陽イオン交換材料である。好ましい実施態様において、強陽イオン交換材料はスルホプロピル陽イオン交換材料である。Toyopearl（登録商標）SP 650 Mが特に好ましい。別の実施態様において、モノペグ化エリスロポエチンは、工程ｄ）において、９５面積％超の純度の実質的に均質な形態で回収される。方法のさらなる実施態様において、方法の工程ｂ）におけるイオン強度の段階的増加は、２段階のイオン強度の増加である。好ましくは、モノペグ化エリスロポエチンは、段階溶出方法の第２段階において、即ち、イオン強度の第２の増加後に回収される。
【０００９】
本発明の別の局面は、モノペグ化エリスロポエチンの産生のための方法であって、以下の工程：
ａ）ペグ化試薬を使用することによりエリスロポエチンをペグ化する工程、
ｂ）ペグ化エリスロポエチンを２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製する工程であって、第１及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィーが同じ型の陽イオン交換材料を用いる工程、
ｃ）モノペグ化エリスロポエチンを、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから実質的に均質な形態で回収する工程
を含む。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用する、２つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法を含む。
【００１１】
本出願内で使用する「イオン交換材料」という用語は、イオン交換クロマトグラフィーにおいて固定相として使用される共有結合した荷電置換基を保有する不動性高分子量マトリクスを示す。全体的な電荷中性のために、共有結合していない対イオンはそれに結合する。「イオン交換材料」は、その共有結合していない対イオンを、周囲溶液の同様に荷電したイオンと交換する能力を有する。その交換可能な対イオンの電荷に応じて、「イオン交換樹脂」は、陽イオン交換樹脂又は陰イオン交換樹脂といわれる。荷電基（置換基）の性質に応じて、「イオン交換樹脂」は、例えば、陽イオン交換樹脂の場合、スルホン酸樹脂（Ｓ）、又はスルホプロピル樹脂（ＳＰ）、又はカルボキシメチル樹脂（ＣＭ）といわれる。荷電基／置換基の化学的性質に応じて、「イオン交換樹脂」を、共有結合した荷電置換基の強度に応じて、強又は弱イオン交換樹脂としてさらに分類することができる。例えば、強陽イオン交換樹脂は、荷電置換基としてスルホン酸基、好ましくはスルホプロピル基を有し、弱陽イオン交換樹脂は、荷電置換基としてカルボン酸基、好ましくはカルボキシメチル基を有し、そして、弱陰イオン交換樹脂は、荷電置換基としてジエチルアミノエチル基を有する。
【００１２】
例えば以下のような様々な型のイオン交換材料、即ち、固定相が、様々な名称の下、多数の会社から入手可能である：陽イオン交換材料Bio-Rex（登録商標）（例えば、タイプ70）、Chelex（登録商標）（例えば、タイプ100）、Macro-Prep（登録商標）（例えば、タイプCM、High S、25 S）、AG（登録商標）（例えば、タイプ50W、MP）（全てBioRad Laboratoriesから入手可能）、WCX 2（Ciphergenから入手可能）、Dowex（登録商標）MAC-3（Dow chemical companyから入手可能）、Mustang C及びMustang S（Pall Corporationから入手可能）、Cellulose CM（例えば、タイプ23、52）、hyper-D、partisphere（Whatman plc.から入手可能）、Amberlite（登録商標）IRC（例えば、タイプ76、747、748）、Amberlite（登録商標）GT 73、Toyopearl（登録商標）（例えば、タイプSP、CM、650M）（全てTosoh Bioscience GmbHから入手可能）、CM 1500及びCM 3000（BioChrom Labsから入手可能）、SP-Sepharose（商標）、CM-Sepharose（商標）（GE Healthcareから入手可能）、Poros樹脂（PerSeptive Biosystemsから入手可能）、Asahipak ES（例えば、タイプ502C）、CXpak P、IEC CM（例えば、タイプ825、2825、5025、LG）、IEC SP（例えば、タイプ420N、825）、IEC QA（例えば、タイプLG、825）（Shoko America Inc.から入手可能）、50W陽イオン交換樹脂（Eichrom Technologies Inc.から入手可能）。好ましくは、陽イオン交換材料は、Macro-Prep（登録商標）High Sもしくは25S、又はMacroCap SP、又はToyopearl（登録商標）SP 650M、又はSource S、又はSP Sepharose、又はPOLYCAT Aなどの強陽イオン交換材料である。例示的な陰イオン交換材料は、Dowex（登録商標）1（Dow chemical companyから入手可能）、AG（登録商標）（例えば、タイプ1、2、4）、Bio-Rex（登録商標）5、DEAE Bio-Gel 1、Macro-Prep（登録商標）DEAE（全てBioRad Laboratoriesから入手可能）、陰イオン交換樹脂タイプ1（Eichrom Technologies Inc.から入手可能）、Source Q、ANX Sepharose 4、DEAE Sepharose（例えば、タイプCL-6B、FF）、Q Sepharose、Capto Q、Capto S（全てGE Healthcareから入手可能）、AX-300（PerkinElmerから入手可能）、Asahipak ES-502C、AXpak WA（例えば、タイプ624、G）、IEC DEAE（全てShoko America Inc.から入手可能）、Amberlite（登録商標）IRA-96、Toyopearl（登録商標）DEAE、TSKgel DEAE（全てTosoh Bioscience GmbHから入手可能）、Mustang Q（Pall Corporationから入手可能）である。一実施態様において、陽イオン交換材料はスルホプロピル陽イオン交換材料である。
【００１３】
「同じ型の陽イオン交換材料」という用語は、同一の陽イオン交換材料を用いることにより実施される２つの連続したイオン交換クロマトグラフィー工程を示す。これは、連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程が、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程のために陽イオン交換材料の第１の部分を使用しそして第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程のために同じ陽イオン交換材料の第２の部分を使用するか、又は、両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程のために同じ陽イオン交換材料を使用するかのいずれかにより実施されることを意味する。一実施態様において、第２の陽イオン交換材料は、第１の陽イオン交換材料と同じ型の陽イオン交換材料であるが、同じ画分の陽イオン交換材料ではない。
【００１４】
「段階溶出」及び「段階溶出方法」という用語は、本出願内で互換的に使用され、例えば、溶出、即ち、材料からの結合した化合物の溶解を引き起こす物質の濃度が、一度に、即ち、１つの値／レベルから次の値／レベルに直接上昇させられるか又は低下させられる方法を示す。この「段階溶出」において、１つ以上の条件、例えば、ｐＨ、イオン強度、塩濃度、及び／又はクロマトグラフィー流を、一度に、第１の値、例えば、開始値から、第２の値、例えば、最終値まで変化させる、即ち、条件を、直線的変化とは対照的に、増加的に、即ち、段階的に変化させる。「段階溶出方法」において、イオン強度の各々の増加後に、新たな画分を採集する。この画分は、イオン強度の対応する増加を用いてイオン交換材料から回収される化合物を含む。各々の増加の後、条件を、溶出方法における次の工程まで維持する。「段階溶出」において、１つ以上の条件を、一度に、第１の値、例えば、開始値から、第２の値、例えば、最終値まで変化させる。変化は、一実施態様において、溶出を引き起こす物質の濃度の１０％以上である。即ち、この実施態様において、溶出を引き起こす物質の濃度は、第１段階において１００％であり、第２段階において１１０％以上であり、そして第３段階において１２０％以上である。別の実施態様において、変化は、溶出を引き起こす物質の濃度の５０％以上である。別の実施態様において、変化は、溶出を引き起こす物質の濃度の１２０％以上である。「段階溶出」は、条件を、直線的変化とは対照的に、増加的に、即ち、段階的に変化させることを示す。
【００１５】
本出願内で互換的に使用される「連続溶出」及び「連続溶出方法」という用語は、例えば、溶出、即ち、クロマトグラフィー材料からの結合／吸着した化合物の溶解、を引き起こす物質の濃度が連続的に上昇させられるか又は低下させられる、即ち、各々が溶出を引き起こす物質の濃度の２％、好ましくは１％の変化より大きくない一連の小段階により濃度が変化する方法を示す。この「連続溶出」において、１つ以上の条件、例えば、ｐＨ、イオン強度、塩濃度、及び／又はクロマトグラフィー流を、直線的に、又は、指数関数的に、又は、漸近的に変化させてもよい。好ましくは、変化は直線的である。
【００１６】
本出願内で使用する「適用」という用語及びその文法的相当語句は、精製すべき目的の物質を含む溶液を固定相と接触させる精製方法の部分的工程を示す。これは、ａ）その中に固定相が位置づけられたクロマトグラフィーデバイスに溶液を加えること、又は、ｂ）固定相を溶液に加えることを示す。ａ）の場合、精製すべき目的の物質を含む溶液を固定相に通し、固定相と溶液中の物質との間の相互作用を可能にする。例えば、ｐＨ、伝導率、塩濃度、温度、及び／又は流速などの条件に応じて、溶液のいくらかの物質が固定相に結合し、従って溶液から除去される。他の物質は溶液中に残る。溶液中に残っている物質を素通り中に見出すことができる。「素通り」はクロマトグラフィーデバイスの通過後に得られる溶液を示し、これは目的の物質を含む適用した溶液、又は、カラムをフラッシュするため、もしくは、固定相に結合した１つ以上の物質の溶出を引き起こすために使用される緩衝液のいずれかでありうる。一実施態様において、クロマトグラフィーデバイスは、カラム、又はカセットである。目的の物質を、精製工程後に、当業者によく知られた方法、例えば、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、又は溶媒容積減少（solvent volume reduction）などにより溶液から回収して、実質的に均質な形態の目的の物質を得ることができる。ｂ）の場合、固定相を、例えば固体として、精製すべき目的の物質を含む溶液に加えて、固定相と溶液中の物質との間の相互作用を可能にする。相互作用後、固定相を、例えばろ過により除去し、そして、目的の物質は、固定相に結合し、そして溶液からそれと共に除去されるか、又は、固定相に結合せず、そして溶液中に残るかのいずれかである。
【００１７】
本出願内で使用する「結合するために適切な条件下で」という用語及びその文法的相当語句は、目的の物質、例えば、ペグ化エリスロポエチンが、それと接触させたときに固定相、例えば、イオン交換材料に結合することを示す。これは、目的の物質の１００％が結合することを必ずしも示さず、固定相に、目的の物質の本質的に１００％が結合する、即ち、目的の物質の少なくとも５０％が結合する、目的の物質の少なくとも７５％が結合する、目的の物質の少なくとも８５％が結合する、又は、目的の物質の９５％超が結合する。
【００１８】
本出願内で使用する「緩衝」という用語は、酸性又は塩基性物質の添加又は遊離に起因するｐＨの変化が緩衝物質によってならされている溶液を示す。そのような効果をもたらす任意の緩衝物質を使用できる。好ましくは、例えば、リン酸もしくはその塩、酢酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、モルホリン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸もしくはその塩、ヒスチジンもしくはその塩、グリシンもしくはその塩、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）もしくはその塩のような薬学的に許容しうる緩衝物質を使用する。一実施態様において、リン酸もしくはその塩、又は酢酸もしくはその塩、又はクエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩を緩衝物質として使用する。場合により、緩衝溶液は、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、又はクエン酸カリウムなどの追加の塩を含んでよい。
【００１９】
一般的なクロマトグラフィー方法及びその使用は、当業者に公知である。例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)；Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)；Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照のこと。
【００２０】
エリスロポエチンのペグ化は、通常、ポリペグ化エリスロポエチン、モノペグ化エリスロポエチン、非ペグ化エリスロポエチン、活性化ＰＥＧエステルの加水分解産物、例えば遊離ペグ化酸、ならびに、エリスロポエチン自体の加水分解産物などの様々な化合物の混合物をもたらす。実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを得るために、これらの物質を分離しなければならず、そして目的の化合物を精製しなければならない。
【００２１】
それゆえ、実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを得るための方法であって、以下の工程：
ａ）分子量が２０kDa〜４０kDaの活性化ペグ化試薬を使用してエリスロポエチンをペグ化する工程、
ｂ）工程ａ）において得られるペグ化エリスロポエチンを２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製する工程であって、第１及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が同じ型の陽イオン交換材料を用いる工程、
ｃ）モノペグ化エリスロポエチンを、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから実質的に均質な形態で回収する工程
を含む方法を提供することが本発明の局面である。
【００２２】
この方法は、グリコシル化された、即ち、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６（登録商標）細胞、又はＨｅＬａ細胞により産生され、その後に化学的にペグ化されたペグ化組換えポリペプチドの精製のために特に有用である。
【００２３】
方法の第１工程において、エリスロポエチンをペグ化する。ペグ化反応において使用するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマー分子は、分子量約２０kDa〜４０kDaを有する（本明細書で使用する「分子量」により、ＰＥＧの平均分子量が理解されるべきである。なぜなら、ポリマー化合物としてのＰＥＧは、規定された分子量を有して得られず、事実、分子量分布を有するからである；「約」という用語は、前記ＰＥＧ調製物において、いくらかの分子が示された分子量よりも大きく、そして、いくらかが小さいことを示し、即ち、約という用語は、その中でＰＥＧ分子の９５％が示される分子量の＋／−１０％以内の分子量を有する分子量分布を指す。例えば、分子量３０kDaは２７kDa〜３３kDaの範囲を示す。
【００２４】
「エリスロポエチン」という用語は、配列番号１又は配列番号２の配列を有するタンパク質、又はそれと実質的に相同であるタンパク質もしくはポリペプチドを指し、その生物学的特性は赤血球産生の刺激ならびに骨髄中の方向付けられた赤血球前駆細胞（committed erythroid progenitor）の分裂及び分化の刺激に関連する。組換えエリスロポエチンを、組換えＤＮＡ技術により、又は、内因性遺伝子活性化により、真核細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、又はＢＨＫ細胞、又はＨｅＬａ細胞における発現を介して調製してもよい。例えば、エリスロポエチン糖タンパク質は、ＵＳ５，７３３，７６１、ＵＳ５，６４１，６７０、ＵＳ５，７３３，７４６、ＷＯ９３／０９２２２、ＷＯ９４／１２６５０、ＷＯ９５／３１５６０、ＷＯ９０／１１３５４、ＷＯ９１／０６６６７、及びＷＯ９１／０９９５５において報告されるように内因性遺伝子活性化により発現される。一実施態様において、本発明によるエリスロポエチンはヒトＥＰＯの配列に基づく。別の実施態様において、ヒトエリスロポエチンは配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、好ましくは、ヒトエリスロポエチンは配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。「エリスロポエチン」という用語はまた、その中で１つ以上のアミノ酸残基が変化、欠失、又は挿入されており、そして改変されていないタンパク質と同じ生物学的活性を有する、例えばＥＰ１ ０６４９５１、又はＵＳ６，５８３，２７２において報告されるような、配列番号１又は配列番号２のタンパク質の変異体を示す。変異体は、グリコシル化のための１〜６個の付加部位を有するヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列を有しうる。ペグ化エリスロポエチンの比活性を、当技術分野において公知の種々のアッセイにより決定できる。本発明の精製ペグ化エリスロポエチンの生物学的活性は、ヒト患者への注射によるタンパク質の投与が、非注射群又は対照群の被験体と比較して、骨髄細胞による網状赤血球及び赤血球の産生増加をもたらすようなものである。本発明に従って得られそして精製されるペグ化エリスロポエチンの生物学的活性を、Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)に従う方法により試験することができる。
【００２５】
本発明による「ＰＥＧ」又は「ＰＥＧ基」は、本質的部分としてポリ（エチレングリコール）を含む残基を意味する。そのようなＰＥＧは、分子の化学合成から生じる結合（即ち、共役）反応のために必要であるか、又は、分子の部分の最適な距離のためのスペーサーである、さらなる化学基を含むことができる。これらのさらなる化学基は、ＰＥＧポリマー分子の分子量の算出のために使用されない。さらに、そのようなＰＥＧは、互いに連結された１つ以上のＰＥＧ側鎖からなりうる。１を超えるＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、多腕（multiarmed）又は分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧを、例えば、ポリエチレンオキシドの、グリセロール、ペンタエリスリトール、及びソルビトールを含む種々のポリオールへの付加により調製できる。分岐ＰＥＧは、例えば、ＥＰ０４７３０８４、ＵＳ５，９３２，４６２において記載されている。一実施態様において、分子量２０〜３５kDaを有するＰＥＧとして、直鎖ＰＥＧ分子が使用され、分子量３５kDa超、特に４０kDaを有するＰＥＧポリマーとして、分岐ＰＥＧが使用される。ＰＥＧ ４０kDaとして、２腕（two-armed）ＰＥＧが一実施態様において使用される。
【００２６】
「ペグ化」という用語は、ポリペプチドのＮ末端及び／又は内部リジン残基でのポリ（エチレングリコール）残基の共有結合を意味する。タンパク質のペグ化は当技術分野の技術水準において広く知られており、そして例えばVeronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417により概説されている。ＰＥＧを、様々な官能基、及び様々な分子量を有するポリエチレングリコール、直鎖及び分岐ＰＥＧならびに様々な連結基を使用して連結できる（Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18；Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304も参照のこと）。エリスロポエチンのペグ化を、例えば、ＷＯ００／４４７８５において記載されるようにペグ化試薬を用いて水溶液中で、一実施態様において分子量５kDa〜４０kDaのＮＨＳ活性化直鎖又は分岐ＰＥＧ分子を使用することにより実施できる。ペグ化を、Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229に従って固相で実施することもできる。ランダムにではなく、Ｎ末端がペグ化されたポリペプチドを、ＷＯ９４／０１４５１に従って産生することもできる。
【００２７】
そのような方法は、リジン残基の１つ以上のεアミノ基で、そして／又は、Ｎ末端アミノ基でペグ化されたエリスロポエチンをもたらす。Ｎ末端アミノ酸での選択的ペグ化を、Felix, A. M., et al., ACS Symp. Ser. 680 (Poly(ethylene glycol)) (1997) 218-238に従って実施できる。選択的Ｎ末端ペグ化を、固相合成の間に、Ｎα−ペグ化アミノ酸誘導体のペプチド鎖のＮ−１末端アミノ酸へのカップリングにより達成できる。側鎖のペグ化を、固相合成の間に、Ｎε−ペグ化リジン誘導体の成長中の鎖へのカップリングにより実施できる。Ｎ末端及び側鎖の組み合わせのペグ化は、上記のように固相合成内でか、又は、活性化ＰＥＧ試薬をアミノ脱保護ペプチドに適用することによる溶液相合成によるかのいずれかで実行可能である。
【００２８】
適切なＰＥＧ誘導体は、約５〜約４０kDa、一実施態様において約２０〜約４０kDa、好ましくは約３０kDa〜約３５kDaの平均分子量を有する活性化ＰＥＧ分子である。ＰＥＧ誘導体は一実施態様において直鎖又は分岐のＰＥＧである。ＰＥＧタンパク質及びＰＥＧペプチド共役体の調製における使用に適切な種々のＰＥＧ誘導体を、Shearwater Polymers（Huntsville, AL, U.S.A.；www.nektar.com）から得ることができる。
【００２９】
活性化ＰＥＧ誘導体は当技術分野において公知であり、そして例えば、ＰＥＧ−ビニルスルホンについて、Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368において記載されている。直鎖及び分岐鎖のＰＥＧ種は、ペグ化フラグメントの調製に適切である。反応性ＰＥＧ試薬の例は、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ、又はメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンである（ｍは好ましくは約４５０〜約９００の整数であり、そしてＲは１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐のＣ１−〜Ｃ６−アルキル、例えばメチル、エチル、イソプロピルなどであり、一実施態様においてＲ＝メチルである）：
【化１】
【００３０】
これらのヨード活性化物質の使用は当技術分野において公知であり、そして例えばHermanson, G. T.によりBioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148において記載されている。
【００３１】
一実施態様において、ＰＥＧ種は活性化ＰＥＧエステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオナート、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジルブタノアート、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド、例えばＰＥＧ−ＮＨＳである（Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。一実施態様において、活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、メトキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＷ３００００；Shearwater Polymers, Inc.）などのアルコキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用する
【化２】
［式中、Ｒ及びｍは上記で定義するとおりである］である。一実施態様において、ＰＥＧ種はメトキシポリ（エチレングリコール）酪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。「アルコキシ」という用語はアルキルエーテル基を指し、ここで「アルキル」という用語は、最高４個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖アルキル基、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシなど、好ましくはメトキシを意味する。
【００３２】
本出願内で使用する「実質的に均質な形態」という用語は、得られる、含まれる、又は使用されるペグ化エリスロポエチンが、規定された数の付着したＰＥＧ基を有するものであることを示す。一実施態様において、ペグ化エリスロポエチンはモノペグ化エリスロポエチンである。調製物は、未反応（即ち、ＰＥＧ基を欠く）エリスロポエチン、ポリペグ化エリスロポエチン、ならびにペグ化反応の間に生成されるポリペプチドのフラグメントを含みうる。「実質的に均質な形態」という用語は、モノペグ化エリスロポエチンの調製物が、一実施態様において少なくとも５０％（w/w）のモノペグ化エリスロポエチン、少なくとも７５％のモノペグ化エリスロポエチン、少なくとも９０％のモノペグ化エリスロポエチン、又は９５％超のモノペグ化エリスロポエチンを含むことを示す。パーセント値は、それからモノペグ化エリスロポエチンが得られる陽イオン交換クロマトグラフィー精製に対応するクロマトグラムの面積％に基づく。
【００３３】
本発明は、実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを得るためのモノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法を報告する。驚くべきことに、両方が同じ型の陽イオン交換材料を用いる２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程の組み合わせが、実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを提供することが見出された。それゆえ、本発明は、モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンを含む溶液を提供する工程、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する工程、及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において精製モノペグ化エリスロポエチンを回収する工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法であって、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用する方法を提供する。一実施態様において、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程における回収は、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程における回収とは異なる溶出方法による。別の実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムは、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後、及び、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に再生される。
【００３４】
第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程における精製モノペグ化エリスロポエチンの回収は、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー材料からモノペグ化エリスロポエチンを溶出することによる。本発明による方法の一実施態様において、用いられる溶出方法における２つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程は異なる。第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、この実施態様において、段階溶出方法として実施され、即ち、使用される緩衝液のイオン強度は段階的に、即ち、一度に、１つのイオン強度値から次のイオン強度値に、好ましくは１０％以上の変化で増加させられる。段階溶出方法は、一実施態様において、３段階溶出方法として実施される。第１の工程において、主にポリペグ化エリスロポエチンが陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出される。イオン強度の第２の増加によって、基本的に、対応するサイズ排除クロマトグラムの面積に基づいて（面積％）６０％超の純度でモノペグ化エリスロポエチンが溶出される。イオン強度の第３の増加によって、主に残りの非ペグ化エリスロポエチンがカラムから溶出される。
【００３５】
第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、一実施態様において、連続溶出方法として実施し、即ち、緩衝液のイオン強度を連続的に、好ましくは５％未満の変化で増加させる。一実施態様において対応するクロマトグラムの面積に基づき０．５％未満の低分子量形態を含む、実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを得るために、モノペグ化エリスロポエチンを含む溶出画分を合わせる。緩衝液は、好ましくは濃度１０mM〜２５０mM、一実施態様において５０mM〜１５０mM、別の実施態様において約１００mMで存在する。それゆえ、本発明の方法において、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程は以下の工程：
ａ）モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチン、及び低分子量形態の混合物を含む水性緩衝溶液を、モノペグ化エリスロポエチンが第１のカラム中に含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程、
ｂ）モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の段階的増加を伴う段階溶出方法により第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程であって、回収された溶液中のモノペグ化エリスロポエチンの相対含量が、工程ａ）の適用された混合物と比較して増加する工程、
ｃ）工程ｂ）からの回収されたモノペグ化エリスロポエチンを、前記エリスロポエチンが第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程であって、第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料は第１のカラム中の陽イオン交換材料と同じ型のものである工程、
ｄ）実質的に均質な形態の精製モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の連続増加を伴う連続溶出方法により、前記第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程
である。
【００３６】
ポリペプチドのペグ化によって、通常、均質な形態のペグ化産物は提供されない。さらに、それは、モノペグ化、ポリペグ化、及び非ペグ化産物の混合物として得られる。それゆえ、方法の工程ａ）において適用されるペグ化エリスロポエチンの溶液は、水性緩衝液中のモノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチン、及び低分子量形態又はフラグメントの混合物である。異なる物質の相対含量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により決定される。例示的なクロマトグラムを図１に示す。図１における相関するピークの面積の合計、即ち、ピーク下の面積は、サイズ排除クロマトグラムの総面積である。単一ピークの割合は、面積％として、即ち、クロマトグラムの総面積の相対的面積割合として与えられる。
【００３７】
一般的なクロマトグラフィー方法、その使用、及び関連用語は、当業者に公知である。例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)及び他の関連テキストを参照のこと。クロマトグラフィーの間、緩衝液が陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを通って流れる。この「通過流緩衝液」は、クロマトグラフィー方法の工程の要件に従って調整される。それは、目的の物質を、クロマトグラフィー材料に輸送し（適用）、そしてそれから輸送する（溶出）。
【００３８】
第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において、モノペグ化、ポリペグ化、及び非ペグ化エリスロポエチンの混合物を、タンパク質濃度０．７〜１．５mg/ml、好ましくは約１mg/mlで、水性緩衝溶液中第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する。一実施態様において、水性緩衝溶液は約１００mMリン酸カリウム、約ｐＨ３．０を有する。本出願内で使用する「約」という用語は、所定の値の周囲１０％、即ち、±１０％の範囲を示す。適用前後に第１のカラムを一実施態様において同じ緩衝溶液で洗浄する。段階溶出方法における第１段階のために、緩衝液を、約１００mMリン酸カリウム、約９０mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の緩衝液に変える。この緩衝液を用いて、加水分解された活性化ＰＥＧ試薬、即ち、対応するペグ化炭酸、未反応カップリング試薬、及びポリペグ化エリスロポエチンを、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出する。３段階溶出方法における第２段階のために、緩衝液を、約１００mMリン酸カリウム、約２５０mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の緩衝液に変える。この工程において、モノペグ化エリスロポエチンを第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する。この溶出工程の採集された通過流緩衝液を、精製水で約１：５（v/v）〜１：８（v/v）、好ましくは１：５（v/v）希釈する。例示的な第１の陽イオン交換クロマトグラフィーを図２に示す。３段階溶出方法における第３段階のために、緩衝液を、約１００mMリン酸カリウム、約７５０mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の緩衝液に変える。この工程において、非ペグ化エリスロポエチンを第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する。
【００３９】
第１の陽イオン交換クロマトグラフィーの第２段階の採集された通過流緩衝液は、相対含量が増加したモノペグ化エリスロポエチンを含んでおり、即ち、モノペグ化エリスロポエチンの重量又は面積％での（第２段階の採集された通過流緩衝液のサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラムにおける）割合が、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程の前と比較した場合に増加している。一実施態様において、モノペグ化エリスロポエチンの相対含量は少なくとも６０面積％である。別の実施態様において、モノペグ化エリスロポエチンの相対含量は少なくとも８０面積％である。
【００４０】
モノペグ化エリスロポエチンのさらなる精製のために、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する。第２の陽イオン交換クロマトグラフィーのために、約１００mMのリン酸カリウム濃度及び約ｐＨ３．０のｐＨに調整した第２の溶出工程の採集されそして希釈された通過流緩衝液を、第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと同じ型の、陽イオン交換材料を含む第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する。一実施態様において、第２の陽イオン交換カラム及びそれに含まれる陽イオン交換材料は、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程におけるものと同じである。モノペグ化エリスロポエチンを、約５０mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の濃度約１００mMのリン酸カリウム緩衝液で開始し、そして、約５００mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の濃度約１００mMのリン酸カリウム緩衝液で終了する直線勾配を適用することにより第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する。塩化ナトリウム濃度の変化は、１０カラム容積にわたり直線的である。通過流緩衝液を分画し、そして各画分を１Mリン酸水素二カリウムで希釈して、ｐＨ値を約ｐＨ６〜８に増加させる。例示的なクロマトグラムを図３に示す。
【００４１】
第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程後、モノペグ化エリスロポエチンが、実質的に均質な形態で、一実施態様において少なくとも９５面積％の純度で得られる。
【００４２】
イオン交換クロマトグラフィーの技術は当業者によく知られている。陽イオン交換材料に結合したポリペプチドの回収工程において、イオン交換カラムを通過する緩衝液／溶液のイオン強度、即ち、伝導率が増加する。これを、緩衝塩濃度の増加によるか、又は、他の塩、いわゆる溶出塩の緩衝溶液への添加によるかのいずれかにより達成できる。溶出方法に応じて、緩衝液／塩濃度を、一度に（段階溶出方法）、又は、連続的に（連続溶出方法）、濃縮された緩衝液又は溶出塩溶液の分別添加により増加させる。好ましい溶出塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、又はクエン酸もしくはリン酸の他の塩、又はこれらの成分の任意の混合物である。一実施態様において、溶出塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、又はこれらの混合物である。
【００４３】
本発明の一実施態様において、陽イオン交換材料は、好ましくはToyopearl（登録商標）SP 650 Mなどの強陽イオン交換材料である。溶出を引き起こす塩の濃度は、一実施態様において５mM〜５００mMの範囲内、好ましくは５mM〜４００mMの範囲内、より好ましくは５mM〜２５０mMの範囲内である。本発明の別の実施態様において、溶出を引き起こす塩は、同時に、緩衝物質として使用される（例えば、クエン酸もしくはその塩又はリン酸もしくはその塩など）。
【００４４】
モノペグ化エリスロポエチンを、当技術分野において公知の方法により、薬学的に許容しうる担体又はビヒクルとの注射のために適切な医薬組成物中で使用してもよい。例えば、適切な組成物は、ＷＯ９７／０９９９６、ＷＯ９７／４０８５０、ＷＯ９８／５８６６０、及びＷＯ９９／０７４０１において記載されている。本発明の産物を処方するための好ましい薬学的に許容しうる担体には、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質などがある。本発明の化合物を、等張化剤、例えば１３２mM塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７の１０mMリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液中で処方してもよい。場合により、医薬組成物は保存剤を含んでもよい。医薬組成物は、様々な量のモノペグ化エリスロポエチン、例えば１０〜１０００μg/ml、例えば５０μg又は４００μgを含んでもよい。
【００４５】
本発明のエリスロポエチン糖タンパク質産物の投与は、ヒトにおいて赤血球の形成をもたらす。それゆえ、モノペグ化エリスロポエチン糖タンパク質産物の投与によって、赤血球の産生において重要であるこのエリスロポエチンタンパク質が補充される。モノペグ化エリスロポエチン糖タンパク質産物を含む医薬組成物を、独立しているか又は状態もしくは疾患の一部としての、低いか又は欠損した赤血球産生により特徴付けられる血液障害を経験しているヒト患者に、種々の手段により投与するために有効な強度で処方しうる。医薬組成物を、皮下又は静脈内注射などの注射により投与してもよい。モノペグ化エリスロポエチン糖タンパク質産物の平均量は変動しうる。共役体の正確な量は、処置される状態の正確な型、処置される患者の状態、ならびに組成物中の他の成分などの要因に支配される優先度の問題である。例えば、０．０１〜１０μg/kg体重、好ましくは０．１〜１μg/kg体重を、例えば週１回投与してもよい。
【００４６】
以下の実施例、配列表、及び図面は本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神から逸脱することなく、記載した手順を改変できることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ピーク及び物質の相関を含む異なってペグ化されたエリスロポエチンの混合物のＳＥ−ＨＰＬＣ。
【図２】段階溶出方法の例示的なクロマトグラム。
【図３】連続溶出方法の例示的なクロマトグラム。
【００４８】
材料及び方法
ＳＥ−ＨＰＬＣ
ＳＥ−ＨＰＬＣによって、その見掛けの分子量に従ってタンパク質が分離される。それゆえ、この方法によって、モノペグ化エリスロポエチン、低分子量形態及びフラグメント、ポリペグ化形態及びエリスロポエチンのより高度な凝集体の存在を検出できる。ＨＰＬＣには２２０nm検出器及びSuperose 6 HRカラム（寸法１０×３００mm、Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-0537-01）又はSuperose 6 10/300 GLカラム（Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-5172-01）が備えられている。カラムを、均一溶媒条件下で、室温で、約０．４ml/分の流速を使用して操作する。移動相緩衝液は、３００mM塩化ナトリウムを含むｐＨ６．８の５０mMリン酸ナトリウム緩衝液である。使用するＨＰＬＣシステムに応じて、方法を、１００μL又は５００μLのいずれかの試料適用容積で実施できる。試料を、移動相緩衝液で、約０．５mg/mL（１００μL負荷）又は約０．１mg/mL（５００μL負荷）のタンパク質濃度に希釈する。タンパク質濃度が０．１mg/mL未満の試料を、未希釈で使用できる。溶出タンパク質を検出器波長２２０nmで検出する。
【００４９】
実施例１
エリスロポエチンの発酵及び精製
エリスロポエチンを、例えば、ＷＯ０１／８７３２９に従って産生し、そしてＷＯ９６／１３５７１８において報告されるように精製できる。
【００５０】
実施例２
二官能性試薬でのエリスロポエチンのペグ化
ａ）エリスロポエチンの活性化
ブロック化チオール基、ＳＡＴＡ（スクシンイミジルアセチルチオアセタート）、又はＳＡＴＰ（スクシンイミジルアセチルチオプロピオナート）（ＤＭＳＯ中１０mg/mlで溶解）を含む指定量の試薬を、ベンジル保護エリスロポエチンの溶液に、ここでは５０mM塩化ナトリウムを補充したｐＨ７．３の１０mMリン酸カリウム緩衝液中５mg/mlタンパク質１mlに加えた。反応混合物を約３０分間（２５℃で）撹拌し、そして１Mリジン溶液を最終濃度１０mMに加えることにより停止させた。過剰量のＳＡＴＡ及びＳＡＴＰを、５０mM塩化ナトリウム及び２mM ＥＤＴＡを含むｐＨ６．２の１０mMリン酸カリウム緩衝液に対する透析により除去した。保護アセチル基をヒドロキシアミンを用いて除去した。
【００５１】
ｂ）活性化エリスロポエチンのペグ化
３８０mgのメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ＭＷ３０．０００；Shearwater Polymers, Inc., Huntsville (Alabama, USA)）を、９５mgの活性化エリスロポエチンを含む溶液中に溶解した（５０mM塩化ナトリウム及び２mM ＥＤＴＡを含む１０mMリン酸カリウム緩衝液中（ｐＨ６．２）中４．５mg/ml）。結果として得られる、溶液中の活性化エリスロポエチンとメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドとの間のモル比は１：２〜１：４であった。１Mヒドロキシアミン水溶液を最終濃度３０mM（ｐＨ６．２）に上記の溶液に加えることにより、活性化エリスロポエチンの共有結合したブロック化チオール基を脱ブロックした。結果として得られる、溶液の反応混合物中の活性化エリスロポエチンは、遊離チオール（−ＳＨ）基を含んだ。チオール基の脱ブロックの直後に、今や遊離チオール（−ＳＨ）基を含む活性化エリスロポエチンとメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドとの間の９０分間のカップリング反応（撹拌しながら、２５℃）を続けた。カップリング反応を、０．２Mシステイン水溶液を最終濃度２mMに反応混合物に加えることにより停止した。３０分後、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドと反応しなかった活性化エリスロポエチンの過剰の遊離チオール基を、ＤＭＳＯ中の０．５M Ｎ−メチルマレイミド溶液を最終濃度５mMに達するように加えることによりブロックした。３０分後、結果として得られる、今やペグ化エリスロポエチンを含む反応混合物を精製できる。
【００５２】
実施例３
モノペグ化エリスロポエチンの精製
ａ）SP Toyopearl 650 Mでの第１のクロマトグラフィー
産物の第１のクロマトグラフィーを、SP Toyopearl 650Mを充填したスルホプロピル（ＳＰ）カラムで実施する。カラムを室温で操作する。第１のカラムの最高負荷容量は、カラム容積（ＣＶ）１リットル当たり１．５gタンパク質として規定される。カラムを、ｐＨ２．９〜３．１の１００mMリン酸カリウム緩衝液（ＳＰ−Ａ緩衝液）で平衡化した。負荷工程後、カラムを、漸増量のＮａＣｌを含む一連のリン酸カリウム緩衝液で洗浄及び溶出した。加水分解されたＰＥＧ試薬及びポリペグ化形態を、それぞれ、ＳＰ−Ａ緩衝液、及び９０mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．９〜３．１）（ＳＰ−Ｂ緩衝液）での素通り及びその後の洗浄工程において除去した。
【００５３】
モノペグ化エリスロポエチンを、２５０mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．９〜３．１）（ＳＰ−Ｃ緩衝液）を適用することにより溶出し、容器中に採集し、そして精製水で直接１：５希釈した。この採集した溶出液を「ＳＰ溶出液プールＩ」と称する。
【００５４】
続いてカラムを７５０mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．９〜３．１）（ＳＰ−Ｄ緩衝液）で洗浄して、未反応エリスロポエチンを除去し、そしてカラムを再生した。
【００５５】
ｂ）SP Toyopearl 650 Mでの第２のクロマトグラフィー
第２のカラムを室温で操作した。ＳＰ−Ａ緩衝液での平衡化後、ＳＰ溶出液プールＩをカラムに適用し、その後カラムをＳＰ−Ａ緩衝液で洗浄した。モノペグ化エリスロポエチンを、５０〜５００mMの塩化ナトリウムの傾きでの直線勾配を、ｐＨ２．９〜３．１の１００mMリン酸カリウム緩衝液で緩衝化した１０カラム容積にわたり適用することにより溶出した。産物ピークを８個までの単一画分に分画し、そして各画分を１Mリン酸水素二カリウムで直接希釈して、ｐＨを６〜８に増加させた。
【００５６】
モノペグ化エリスロポエチンの溶出が完了した後、勾配の傾きを増加させて、５００mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．９〜３．１）での即時のカラム洗浄を導くことができる。
【００５７】
ｃ）SP Toyopearl 650 Mカラムの再生
両方のカラムの樹脂を一連の７工程において再生した。カラムを精製水、続いて０．５M水酸化ナトリウム溶液でフラッシュした。アルカリ溶液を精製水で置換し、続いて酸洗浄した（０．５Mリン酸二水素ナトリウム、１Mリン酸）。別の精製水工程後、カラムを０．５M水酸化ナトリウムで≧４時間、脱発熱物資化（depyrogenate）した。苛性再生後、カラムを精製水で再び洗浄した。カラムパラメーターのまとめについては表１及び表２を参照のこと。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、特にペグ化（PEGylated）エリスロポエチンの精製のために有用なクロマトグラフィー分離方法の分野におけるものである。
【０００２】
発明の背景
タンパク質は今日の医学ポートフォリオにおいて重要な役割を果たしている。ヒトへの適用のために、全ての治療タンパク質は別個の基準を満たさなければならない。生物製剤のヒトに対する安全性を確実にするために、産生プロセスの間に蓄積する副産物を特に除去しなければならない。規制仕様を満たすために、１つ以上の精製工程を製造プロセスの後に続けなければならない。とりわけ、純度、処理量、及び収率が、適切な精製プロセスの決定において重要な役割を果たす。
【０００３】
微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（スルホプロピル又はカルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合モードイオン交換、チオフィリック（thiophilic）吸着（例えば、β−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを用いる）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）−及びＣｕ（ＩＩ）−アフィニティー材料を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動方法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）のような様々な方法がタンパク質精製のために十分に確立されておりそして広く使用されている（Vijayalakshmi, M.A., Appl.Biochem.Biotech.75 (1998) 93-102）。
【０００４】
例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とインターロイキン６（ＥＰ０４４２７２４）、ＰＥＧとエリスロポエチン（ＷＯ０１／０２０１７）、エンドスタチン及び免疫グロブリンを含むキメラ分子（ＵＳ２００５／００８６４９）、分泌抗体ベースの融合タンパク質（ＵＳ２００２／１４７３１１）、アルブミンを含む融合ポリペプチド（ＵＳ２００５／０１００９９１；ヒト血清アルブミンＵＳ５，８７６，９６９）、ペグ化ポリペプチド（ＵＳ２００５／０１１４０３７）、及びインターフェロン融合物のための共役が報告されている。
【０００５】
Necina, R., et al.（Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698）は、高電荷密度を示すイオン交換媒体による細胞培養上清から直接のヒトモノクローナル抗体の捕捉を報告した。ＷＯ８９／０５１５７において、細胞培養培地を陽イオン交換処理に直接的に供することによる産物免疫グロブリンの精製のための方法が報告されている。マウス腹水からのモノクローナルＩｇＧ抗体の１工程精製が、Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988), 79-88により記載されている。勾配洗浄を使用して、１つ以上の混入物から目的のポリペプチドを分離する、イオン交換クロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するための方法が、ＷＯ２００４／０２４８６６において報告されている。ＥＰ０５３０４４７において、３つのクロマトグラフィー工程の組み合わせによりＩｇＧモノクローナル抗体を精製するためのプロセスが報告されている。モノペグ化インターロイキン１受容体アンタゴニストの容易な精製が、Yu, G., et al.によりProcess Biotechnol. 42 (2007) 971-977において報告されている。Wang et al.（Wang, H., et al., Peptides 26 (2005) 1213-1218）は、２工程陽イオン交換クロマトグラフィーによる、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されたｈＴＦＦ３の精製を報告している。Yun et al.（Yun, Q., et al., J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74）は、２つの連続したイオン交換クロマトグラフィー工程によるペグ化ｒｈＧ−ＣＳＦの精製を報告している。ＷＯ２００７／０３９４３６及びＷＯ０１／０８７３２９は、ポリ（エチレングリコール）基に共有結合したエリスロポエチン及びエリスロポエチンタンパク質を含む液体医薬組成物を報告している。
【０００６】
発明の概要
本発明は、モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンを含む溶液を提供する工程、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する工程、及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において精製モノペグ化エリスロポエチンを回収する工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法であって、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用する方法を含む。
【０００７】
方法の一実施態様において、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程は異なる溶出方法を使用して実施される。別の実施態様において、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程は以下の工程：
ａ）モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンの混合物を含む水性緩衝溶液を、モノペグ化エリスロポエチンが第１のカラム中に含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程、
ｂ）モノペグ化エリスロポエチンを、通過流（through flowing）緩衝液のイオン強度の段階的増加を伴う段階溶出方法により第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程であって、モノペグ化エリスロポエチンの割合が、工程ａ）の適用された混合物と比較して増加する工程、
ｃ）回収されたモノペグ化エリスロポエチンを、前記モノペグ化エリスロポエチンが第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程であって、第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料は第１のカラム中の陽イオン交換材料と同じ型のものである工程、
ｄ）実質的に均質な形態の精製モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の連続増加を伴う連続溶出方法により、前記第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程
を含む。
【０００８】
方法の一実施態様において、陽イオン交換材料は強陽イオン交換材料である。好ましい実施態様において、強陽イオン交換材料はスルホプロピル陽イオン交換材料である。Toyopearl（登録商標）SP 650 Mが特に好ましい。別の実施態様において、モノペグ化エリスロポエチンは、工程ｄ）において、９５面積％超の純度の実質的に均質な形態で回収される。方法のさらなる実施態様において、方法の工程ｂ）におけるイオン強度の段階的増加は、２段階のイオン強度の増加である。好ましくは、モノペグ化エリスロポエチンは、段階溶出方法の第２段階において、即ち、イオン強度の第２の増加後に回収される。
【０００９】
本発明の別の局面は、モノペグ化エリスロポエチンの産生のための方法であって、以下の工程：
ａ）ペグ化試薬を使用することによりエリスロポエチンをペグ化する工程、
ｂ）ペグ化エリスロポエチンを２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製する工程であって、第１及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィーが同じ型の陽イオン交換材料を用いる工程、
ｃ）モノペグ化エリスロポエチンを、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから実質的に均質な形態で回収する工程
を含む。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用する、２つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法を含む。
【００１１】
本出願内で使用する「イオン交換材料」という用語は、イオン交換クロマトグラフィーにおいて固定相として使用される共有結合した荷電置換基を保有する不動性高分子量マトリクスを示す。全体的な電荷中性のために、共有結合していない対イオンはそれに結合する。「イオン交換材料」は、その共有結合していない対イオンを、周囲溶液の同様に荷電したイオンと交換する能力を有する。その交換可能な対イオンの電荷に応じて、「イオン交換樹脂」は、陽イオン交換樹脂又は陰イオン交換樹脂といわれる。荷電基（置換基）の性質に応じて、「イオン交換樹脂」は、例えば、陽イオン交換樹脂の場合、スルホン酸樹脂（Ｓ）、又はスルホプロピル樹脂（ＳＰ）、又はカルボキシメチル樹脂（ＣＭ）といわれる。荷電基／置換基の化学的性質に応じて、「イオン交換樹脂」を、共有結合した荷電置換基の強度に応じて、強又は弱イオン交換樹脂としてさらに分類することができる。例えば、強陽イオン交換樹脂は、荷電置換基としてスルホン酸基、好ましくはスルホプロピル基を有し、弱陽イオン交換樹脂は、荷電置換基としてカルボン酸基、好ましくはカルボキシメチル基を有し、そして、弱陰イオン交換樹脂は、荷電置換基としてジエチルアミノエチル基を有する。
【００１２】
例えば以下のような様々な型のイオン交換材料、即ち、固定相が、様々な名称の下、多数の会社から入手可能である：陽イオン交換材料Bio-Rex（登録商標）（例えば、タイプ70）、Chelex（登録商標）（例えば、タイプ100）、Macro-Prep（登録商標）（例えば、タイプCM、High S、25 S）、AG（登録商標）（例えば、タイプ50W、MP）（全てBioRad Laboratoriesから入手可能）、WCX 2（Ciphergenから入手可能）、Dowex（登録商標）MAC-3（Dow chemical companyから入手可能）、Mustang C及びMustang S（Pall Corporationから入手可能）、Cellulose CM（例えば、タイプ23、52）、hyper-D、partisphere（Whatman plc.から入手可能）、Amberlite（登録商標）IRC（例えば、タイプ76、747、748）、Amberlite（登録商標）GT 73、Toyopearl（登録商標）（例えば、タイプSP、CM、650M）（全てTosoh Bioscience GmbHから入手可能）、CM 1500及びCM 3000（BioChrom Labsから入手可能）、SP-Sepharose（商標）、CM-Sepharose（商標）（GE Healthcareから入手可能）、Poros樹脂（PerSeptive Biosystemsから入手可能）、Asahipak ES（例えば、タイプ502C）、CXpak P、IEC CM（例えば、タイプ825、2825、5025、LG）、IEC SP（例えば、タイプ420N、825）、IEC QA（例えば、タイプLG、825）（Shoko America Inc.から入手可能）、50W陽イオン交換樹脂（Eichrom Technologies Inc.から入手可能）。好ましくは、陽イオン交換材料は、Macro-Prep（登録商標）High Sもしくは25S、又はMacroCap SP、又はToyopearl（登録商標）SP 650M、又はSource S、又はSP Sepharose、又はPOLYCAT Aなどの強陽イオン交換材料である。例示的な陰イオン交換材料は、Dowex（登録商標）1（Dow chemical companyから入手可能）、AG（登録商標）（例えば、タイプ1、2、4）、Bio-Rex（登録商標）5、DEAE Bio-Gel 1、Macro-Prep（登録商標）DEAE（全てBioRad Laboratoriesから入手可能）、陰イオン交換樹脂タイプ1（Eichrom Technologies Inc.から入手可能）、Source Q、ANX Sepharose 4、DEAE Sepharose（例えば、タイプCL-6B、FF）、Q Sepharose、Capto Q、Capto S（全てGE Healthcareから入手可能）、AX-300（PerkinElmerから入手可能）、Asahipak ES-502C、AXpak WA（例えば、タイプ624、G）、IEC DEAE（全てShoko America Inc.から入手可能）、Amberlite（登録商標）IRA-96、Toyopearl（登録商標）DEAE、TSKgel DEAE（全てTosoh Bioscience GmbHから入手可能）、Mustang Q（Pall Corporationから入手可能）である。一実施態様において、陽イオン交換材料はスルホプロピル陽イオン交換材料である。
【００１３】
「同じ型の陽イオン交換材料」という用語は、同一の陽イオン交換材料を用いることにより実施される２つの連続したイオン交換クロマトグラフィー工程を示す。これは、連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程が、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程のために陽イオン交換材料の第１の部分を使用しそして第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程のために同じ陽イオン交換材料の第２の部分を使用するか、又は、両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程のために同じ陽イオン交換材料を使用するかのいずれかにより実施されることを意味する。一実施態様において、第２の陽イオン交換材料は、第１の陽イオン交換材料と同じ型の陽イオン交換材料であるが、同じ画分の陽イオン交換材料ではない。
【００１４】
「段階溶出」及び「段階溶出方法」という用語は、本出願内で互換的に使用され、例えば、溶出、即ち、材料からの結合した化合物の溶解を引き起こす物質の濃度が、一度に、即ち、１つの値／レベルから次の値／レベルに直接上昇させられるか又は低下させられる方法を示す。この「段階溶出」において、１つ以上の条件、例えば、ｐＨ、イオン強度、塩濃度、及び／又はクロマトグラフィー流を、一度に、第１の値、例えば、開始値から、第２の値、例えば、最終値まで変化させる、即ち、条件を、直線的変化とは対照的に、増加的に、即ち、段階的に変化させる。「段階溶出方法」において、イオン強度の各々の増加後に、新たな画分を採集する。この画分は、イオン強度の対応する増加を用いてイオン交換材料から回収される化合物を含む。各々の増加の後、条件を、溶出方法における次の工程まで維持する。「段階溶出」において、１つ以上の条件を、一度に、第１の値、例えば、開始値から、第２の値、例えば、最終値まで変化させる。変化は、一実施態様において、溶出を引き起こす物質の濃度の１０％以上である。即ち、この実施態様において、溶出を引き起こす物質の濃度は、第１段階において１００％であり、第２段階において１１０％以上であり、そして第３段階において１２０％以上である。別の実施態様において、変化は、溶出を引き起こす物質の濃度の５０％以上である。別の実施態様において、変化は、溶出を引き起こす物質の濃度の１２０％以上である。「段階溶出」は、条件を、直線的変化とは対照的に、増加的に、即ち、段階的に変化させることを示す。
【００１５】
本出願内で互換的に使用される「連続溶出」及び「連続溶出方法」という用語は、例えば、溶出、即ち、クロマトグラフィー材料からの結合／吸着した化合物の溶解、を引き起こす物質の濃度が連続的に上昇させられるか又は低下させられる、即ち、各々が溶出を引き起こす物質の濃度の２％、好ましくは１％の変化より大きくない一連の小段階により濃度が変化する方法を示す。この「連続溶出」において、１つ以上の条件、例えば、ｐＨ、イオン強度、塩濃度、及び／又はクロマトグラフィー流を、直線的に、又は、指数関数的に、又は、漸近的に変化させてもよい。好ましくは、変化は直線的である。
【００１６】
本出願内で使用する「適用」という用語及びその文法的相当語句は、精製すべき目的の物質を含む溶液を固定相と接触させる精製方法の部分的工程を示す。これは、ａ）その中に固定相が位置づけられたクロマトグラフィーデバイスに溶液を加えること、又は、ｂ）固定相を溶液に加えることを示す。ａ）の場合、精製すべき目的の物質を含む溶液を固定相に通し、固定相と溶液中の物質との間の相互作用を可能にする。例えば、ｐＨ、伝導率、塩濃度、温度、及び／又は流速などの条件に応じて、溶液のいくらかの物質が固定相に結合し、従って溶液から除去される。他の物質は溶液中に残る。溶液中に残っている物質を素通り中に見出すことができる。「素通り」はクロマトグラフィーデバイスの通過後に得られる溶液を示し、これは目的の物質を含む適用した溶液、又は、カラムをフラッシュするため、もしくは、固定相に結合した１つ以上の物質の溶出を引き起こすために使用される緩衝液のいずれかでありうる。一実施態様において、クロマトグラフィーデバイスは、カラム、又はカセットである。目的の物質を、精製工程後に、当業者によく知られた方法、例えば、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、又は溶媒容積減少（solvent volume reduction）などにより溶液から回収して、実質的に均質な形態の目的の物質を得ることができる。ｂ）の場合、固定相を、例えば固体として、精製すべき目的の物質を含む溶液に加えて、固定相と溶液中の物質との間の相互作用を可能にする。相互作用後、固定相を、例えばろ過により除去し、そして、目的の物質は、固定相に結合し、そして溶液からそれと共に除去されるか、又は、固定相に結合せず、そして溶液中に残るかのいずれかである。
【００１７】
本出願内で使用する「結合するために適切な条件下で」という用語及びその文法的相当語句は、目的の物質、例えば、ペグ化エリスロポエチンが、それと接触させたときに固定相、例えば、イオン交換材料に結合することを示す。これは、目的の物質の１００％が結合することを必ずしも示さず、固定相に、目的の物質の本質的に１００％が結合する、即ち、目的の物質の少なくとも５０％が結合する、目的の物質の少なくとも７５％が結合する、目的の物質の少なくとも８５％が結合する、又は、目的の物質の９５％超が結合する。
【００１８】
本出願内で使用する「緩衝」という用語は、酸性又は塩基性物質の添加又は遊離に起因するｐＨの変化が緩衝物質によってならされている溶液を示す。そのような効果をもたらす任意の緩衝物質を使用できる。好ましくは、例えば、リン酸もしくはその塩、酢酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、モルホリン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸もしくはその塩、ヒスチジンもしくはその塩、グリシンもしくはその塩、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）もしくはその塩のような薬学的に許容しうる緩衝物質を使用する。一実施態様において、リン酸もしくはその塩、又は酢酸もしくはその塩、又はクエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩を緩衝物質として使用する。場合により、緩衝溶液は、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、又はクエン酸カリウムなどの追加の塩を含んでよい。
【００１９】
一般的なクロマトグラフィー方法及びその使用は、当業者に公知である。例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)；Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)；Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照のこと。
【００２０】
エリスロポエチンのペグ化は、通常、ポリペグ化エリスロポエチン、モノペグ化エリスロポエチン、非ペグ化エリスロポエチン、活性化ＰＥＧエステルの加水分解産物、例えば遊離ペグ化酸、ならびに、エリスロポエチン自体の加水分解産物などの様々な化合物の混合物をもたらす。実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを得るために、これらの物質を分離しなければならず、そして目的の化合物を精製しなければならない。
【００２１】
それゆえ、実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを得るための方法であって、以下の工程：
ａ）分子量が２０kDa〜４０kDaの活性化ペグ化試薬を使用してエリスロポエチンをペグ化する工程、
ｂ）工程ａ）において得られるペグ化エリスロポエチンを２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製する工程であって、第１及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が同じ型の陽イオン交換材料を用いる工程、
ｃ）モノペグ化エリスロポエチンを、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから実質的に均質な形態で回収する工程
を含む方法を提供することが本発明の局面である。
【００２２】
この方法は、グリコシル化された、即ち、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６（登録商標）細胞、又はＨｅＬａ細胞により産生され、その後に化学的にペグ化されたペグ化組換えポリペプチドの精製のために特に有用である。
【００２３】
方法の第１工程において、エリスロポエチンをペグ化する。ペグ化反応において使用するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマー分子は、分子量約２０kDa〜４０kDaを有する（本明細書で使用する「分子量」により、ＰＥＧの平均分子量が理解されるべきである。なぜなら、ポリマー化合物としてのＰＥＧは、規定された分子量を有して得られず、事実、分子量分布を有するからである；「約」という用語は、前記ＰＥＧ調製物において、いくらかの分子が示された分子量よりも大きく、そして、いくらかが小さいことを示し、即ち、約という用語は、その中でＰＥＧ分子の９５％が示される分子量の＋／−１０％以内の分子量を有する分子量分布を指す。例えば、分子量３０kDaは２７kDa〜３３kDaの範囲を示す。
【００２４】
「エリスロポエチン」という用語は、配列番号１又は配列番号２の配列を有するタンパク質、又はそれと実質的に相同であるタンパク質もしくはポリペプチドを指し、その生物学的特性は赤血球産生の刺激ならびに骨髄中の方向付けられた赤血球前駆細胞（committed erythroid progenitor）の分裂及び分化の刺激に関連する。組換えエリスロポエチンを、組換えＤＮＡ技術により、又は、内因性遺伝子活性化により、真核細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、又はＢＨＫ細胞、又はＨｅＬａ細胞における発現を介して調製してもよい。例えば、エリスロポエチン糖タンパク質は、ＵＳ５，７３３，７６１、ＵＳ５，６４１，６７０、ＵＳ５，７３３，７４６、ＷＯ９３／０９２２２、ＷＯ９４／１２６５０、ＷＯ９５／３１５６０、ＷＯ９０／１１３５４、ＷＯ９１／０６６６７、及びＷＯ９１／０９９５５において報告されるように内因性遺伝子活性化により発現される。一実施態様において、本発明によるエリスロポエチンはヒトＥＰＯの配列に基づく。別の実施態様において、ヒトエリスロポエチンは配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、好ましくは、ヒトエリスロポエチンは配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。「エリスロポエチン」という用語はまた、その中で１つ以上のアミノ酸残基が変化、欠失、又は挿入されており、そして改変されていないタンパク質と同じ生物学的活性を有する、例えばＥＰ１ ０６４９５１、又はＵＳ６，５８３，２７２において報告されるような、配列番号１又は配列番号２のタンパク質の変異体を示す。変異体は、グリコシル化のための１〜６個の付加部位を有するヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列を有しうる。ペグ化エリスロポエチンの比活性を、当技術分野において公知の種々のアッセイにより決定できる。本発明の精製ペグ化エリスロポエチンの生物学的活性は、ヒト患者への注射によるタンパク質の投与が、非注射群又は対照群の被験体と比較して、骨髄細胞による網状赤血球及び赤血球の産生増加をもたらすようなものである。本発明に従って得られそして精製されるペグ化エリスロポエチンの生物学的活性を、Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)に従う方法により試験することができる。
【００２５】
本発明による「ＰＥＧ」又は「ＰＥＧ基」は、本質的部分としてポリ（エチレングリコール）を含む残基を意味する。そのようなＰＥＧは、分子の化学合成から生じる結合（即ち、共役）反応のために必要であるか、又は、分子の部分の最適な距離のためのスペーサーである、さらなる化学基を含むことができる。これらのさらなる化学基は、ＰＥＧポリマー分子の分子量の算出のために使用されない。さらに、そのようなＰＥＧは、互いに連結された１つ以上のＰＥＧ側鎖からなりうる。１を超えるＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、多腕（multiarmed）又は分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧを、例えば、ポリエチレンオキシドの、グリセロール、ペンタエリスリトール、及びソルビトールを含む種々のポリオールへの付加により調製できる。分岐ＰＥＧは、例えば、ＥＰ０４７３０８４、ＵＳ５，９３２，４６２において記載されている。一実施態様において、分子量２０〜３５kDaを有するＰＥＧとして、直鎖ＰＥＧ分子が使用され、分子量３５kDa超、特に４０kDaを有するＰＥＧポリマーとして、分岐ＰＥＧが使用される。ＰＥＧ ４０kDaとして、２腕（two-armed）ＰＥＧが一実施態様において使用される。
【００２６】
「ペグ化」という用語は、ポリペプチドのＮ末端及び／又は内部リジン残基でのポリ（エチレングリコール）残基の共有結合を意味する。タンパク質のペグ化は当技術分野の技術水準において広く知られており、そして例えばVeronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417により概説されている。ＰＥＧを、様々な官能基、及び様々な分子量を有するポリエチレングリコール、直鎖及び分岐ＰＥＧならびに様々な連結基を使用して連結できる（Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18；Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304も参照のこと）。エリスロポエチンのペグ化を、例えば、ＷＯ００／４４７８５において記載されるようにペグ化試薬を用いて水溶液中で、一実施態様において分子量５kDa〜４０kDaのＮＨＳ活性化直鎖又は分岐ＰＥＧ分子を使用することにより実施できる。ペグ化を、Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229に従って固相で実施することもできる。ランダムにではなく、Ｎ末端がペグ化されたポリペプチドを、ＷＯ９４／０１４５１に従って産生することもできる。
【００２７】
そのような方法は、リジン残基の１つ以上のεアミノ基で、そして／又は、Ｎ末端アミノ基でペグ化されたエリスロポエチンをもたらす。Ｎ末端アミノ酸での選択的ペグ化を、Felix, A. M., et al., ACS Symp. Ser. 680 (Poly(ethylene glycol)) (1997) 218-238に従って実施できる。選択的Ｎ末端ペグ化を、固相合成の間に、Ｎα−ペグ化アミノ酸誘導体のペプチド鎖のＮ−１末端アミノ酸へのカップリングにより達成できる。側鎖のペグ化を、固相合成の間に、Ｎε−ペグ化リジン誘導体の成長中の鎖へのカップリングにより実施できる。Ｎ末端及び側鎖の組み合わせのペグ化は、上記のように固相合成内でか、又は、活性化ＰＥＧ試薬をアミノ脱保護ペプチドに適用することによる溶液相合成によるかのいずれかで実行可能である。
【００２８】
適切なＰＥＧ誘導体は、約５〜約４０kDa、一実施態様において約２０〜約４０kDa、好ましくは約３０kDa〜約３５kDaの平均分子量を有する活性化ＰＥＧ分子である。ＰＥＧ誘導体は一実施態様において直鎖又は分岐のＰＥＧである。ＰＥＧタンパク質及びＰＥＧペプチド共役体の調製における使用に適切な種々のＰＥＧ誘導体を、Shearwater Polymers（Huntsville, AL, U.S.A.；www.nektar.com）から得ることができる。
【００２９】
活性化ＰＥＧ誘導体は当技術分野において公知であり、そして例えば、ＰＥＧ−ビニルスルホンについて、Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368において記載されている。直鎖及び分岐鎖のＰＥＧ種は、ペグ化フラグメントの調製に適切である。反応性ＰＥＧ試薬の例は、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ、又はメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンである（ｍは好ましくは約４５０〜約９００の整数であり、そしてＲは１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐のＣ１−〜Ｃ６−アルキル、例えばメチル、エチル、イソプロピルなどであり、一実施態様においてＲ＝メチルである）：
【化１】
【００３０】
これらのヨード活性化物質の使用は当技術分野において公知であり、そして例えばHermanson, G. T.によりBioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148において記載されている。
【００３１】
一実施態様において、ＰＥＧ種は活性化ＰＥＧエステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオナート、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジルブタノアート、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド、例えばＰＥＧ−ＮＨＳである（Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。一実施態様において、活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、メトキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＷ３００００；Shearwater Polymers, Inc.）などのアルコキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用する
【化２】
［式中、Ｒ及びｍは上記で定義するとおりである］である。一実施態様において、ＰＥＧ種はメトキシポリ（エチレングリコール）酪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。「アルコキシ」という用語はアルキルエーテル基を指し、ここで「アルキル」という用語は、最高４個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖アルキル基、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシなど、好ましくはメトキシを意味する。
【００３２】
本出願内で使用する「実質的に均質な形態」という用語は、得られる、含まれる、又は使用されるペグ化エリスロポエチンが、規定された数の付着したＰＥＧ基を有するものであることを示す。一実施態様において、ペグ化エリスロポエチンはモノペグ化エリスロポエチンである。調製物は、未反応（即ち、ＰＥＧ基を欠く）エリスロポエチン、ポリペグ化エリスロポエチン、ならびにペグ化反応の間に生成されるポリペプチドのフラグメントを含みうる。「実質的に均質な形態」という用語は、モノペグ化エリスロポエチンの調製物が、一実施態様において少なくとも５０％（w/w）のモノペグ化エリスロポエチン、少なくとも７５％のモノペグ化エリスロポエチン、少なくとも９０％のモノペグ化エリスロポエチン、又は９５％超のモノペグ化エリスロポエチンを含むことを示す。パーセント値は、それからモノペグ化エリスロポエチンが得られる陽イオン交換クロマトグラフィー精製に対応するクロマトグラムの面積％に基づく。
【００３３】
本発明は、実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを得るためのモノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法を報告する。驚くべきことに、両方が同じ型の陽イオン交換材料を用いる２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程の組み合わせが、実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを提供することが見出された。それゆえ、本発明は、モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンを含む溶液を提供する工程、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する工程、及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において精製モノペグ化エリスロポエチンを回収する工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法であって、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用する方法を提供する。一実施態様において、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程における回収は、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程における回収とは異なる溶出方法による。別の実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムは、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後、及び、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に再生される。
【００３４】
第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程における精製モノペグ化エリスロポエチンの回収は、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー材料からモノペグ化エリスロポエチンを溶出することによる。本発明による方法の一実施態様において、用いられる溶出方法における２つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程は異なる。第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、この実施態様において、段階溶出方法として実施され、即ち、使用される緩衝液のイオン強度は段階的に、即ち、一度に、１つのイオン強度値から次のイオン強度値に、好ましくは１０％以上の変化で増加させられる。段階溶出方法は、一実施態様において、３段階溶出方法として実施される。第１の工程において、主にポリペグ化エリスロポエチンが陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出される。イオン強度の第２の増加によって、基本的に、対応するサイズ排除クロマトグラムの面積に基づいて（面積％）６０％超の純度でモノペグ化エリスロポエチンが溶出される。イオン強度の第３の増加によって、主に残りの非ペグ化エリスロポエチンがカラムから溶出される。
【００３５】
第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、一実施態様において、連続溶出方法として実施し、即ち、緩衝液のイオン強度を連続的に、好ましくは５％未満の変化で増加させる。一実施態様において対応するクロマトグラムの面積に基づき０．５％未満の低分子量形態を含む、実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを得るために、モノペグ化エリスロポエチンを含む溶出画分を合わせる。緩衝液は、好ましくは濃度１０mM〜２５０mM、一実施態様において５０mM〜１５０mM、別の実施態様において約１００mMで存在する。それゆえ、本発明の方法において、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程は以下の工程：
ａ）モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチン、及び低分子量形態の混合物を含む水性緩衝溶液を、モノペグ化エリスロポエチンが第１のカラム中に含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程、
ｂ）モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の段階的増加を伴う段階溶出方法により第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程であって、回収された溶液中のモノペグ化エリスロポエチンの相対含量が、工程ａ）の適用された混合物と比較して増加する工程、
ｃ）工程ｂ）からの回収されたモノペグ化エリスロポエチンを、前記エリスロポエチンが第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程であって、第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料は第１のカラム中の陽イオン交換材料と同じ型のものである工程、
ｄ）実質的に均質な形態の精製モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の連続増加を伴う連続溶出方法により、前記第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程
である。
【００３６】
ポリペプチドのペグ化によって、通常、均質な形態のペグ化産物は提供されない。さらに、それは、モノペグ化、ポリペグ化、及び非ペグ化産物の混合物として得られる。それゆえ、方法の工程ａ）において適用されるペグ化エリスロポエチンの溶液は、水性緩衝液中のモノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチン、及び低分子量形態又はフラグメントの混合物である。異なる物質の相対含量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により決定される。例示的なクロマトグラムを図１に示す。図１における相関するピークの面積の合計、即ち、ピーク下の面積は、サイズ排除クロマトグラムの総面積である。単一ピークの割合は、面積％として、即ち、クロマトグラムの総面積の相対的面積割合として与えられる。
【００３７】
一般的なクロマトグラフィー方法、その使用、及び関連用語は、当業者に公知である。例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)及び他の関連テキストを参照のこと。クロマトグラフィーの間、緩衝液が陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを通って流れる。この「通過流緩衝液」は、クロマトグラフィー方法の工程の要件に従って調整される。それは、目的の物質を、クロマトグラフィー材料に輸送し（適用）、そしてそれから輸送する（溶出）。
【００３８】
第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において、モノペグ化、ポリペグ化、及び非ペグ化エリスロポエチンの混合物を、タンパク質濃度０．７〜１．５mg/ml、好ましくは約１mg/mlで、水性緩衝溶液中第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する。一実施態様において、水性緩衝溶液は約１００mMリン酸カリウム、約ｐＨ３．０を有する。本出願内で使用する「約」という用語は、所定の値の周囲１０％、即ち、±１０％の範囲を示す。適用前後に第１のカラムを一実施態様において同じ緩衝溶液で洗浄する。段階溶出方法における第１段階のために、緩衝液を、約１００mMリン酸カリウム、約９０mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の緩衝液に変える。この緩衝液を用いて、加水分解された活性化ＰＥＧ試薬、即ち、対応するペグ化炭酸、未反応カップリング試薬、及びポリペグ化エリスロポエチンを、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出する。３段階溶出方法における第２段階のために、緩衝液を、約１００mMリン酸カリウム、約２５０mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の緩衝液に変える。この工程において、モノペグ化エリスロポエチンを第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する。この溶出工程の採集された通過流緩衝液を、精製水で約１：５（v/v）〜１：８（v/v）、好ましくは１：５（v/v）希釈する。例示的な第１の陽イオン交換クロマトグラフィーを図２に示す。３段階溶出方法における第３段階のために、緩衝液を、約１００mMリン酸カリウム、約７５０mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の緩衝液に変える。この工程において、非ペグ化エリスロポエチンを第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する。
【００３９】
第１の陽イオン交換クロマトグラフィーの第２段階の採集された通過流緩衝液は、相対含量が増加したモノペグ化エリスロポエチンを含んでおり、即ち、モノペグ化エリスロポエチンの重量又は面積％での（第２段階の採集された通過流緩衝液のサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラムにおける）割合が、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程の前と比較した場合に増加している。一実施態様において、モノペグ化エリスロポエチンの相対含量は少なくとも６０面積％である。別の実施態様において、モノペグ化エリスロポエチンの相対含量は少なくとも８０面積％である。
【００４０】
モノペグ化エリスロポエチンのさらなる精製のために、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する。第２の陽イオン交換クロマトグラフィーのために、約１００mMのリン酸カリウム濃度及び約ｐＨ３．０のｐＨに調整した第２の溶出工程の採集されそして希釈された通過流緩衝液を、第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと同じ型の、陽イオン交換材料を含む第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する。一実施態様において、第２の陽イオン交換カラム及びそれに含まれる陽イオン交換材料は、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程におけるものと同じである。モノペグ化エリスロポエチンを、約５０mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の濃度約１００mMのリン酸カリウム緩衝液で開始し、そして、約５００mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の濃度約１００mMのリン酸カリウム緩衝液で終了する直線勾配を適用することにより第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する。塩化ナトリウム濃度の変化は、１０カラム容積にわたり直線的である。通過流緩衝液を分画し、そして各画分を１Mリン酸水素二カリウムで希釈して、ｐＨ値を約ｐＨ６〜８に増加させる。例示的なクロマトグラムを図３に示す。
【００４１】
第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程後、モノペグ化エリスロポエチンが、実質的に均質な形態で、一実施態様において少なくとも９５面積％の純度で得られる。
【００４２】
イオン交換クロマトグラフィーの技術は当業者によく知られている。陽イオン交換材料に結合したポリペプチドの回収工程において、イオン交換カラムを通過する緩衝液／溶液のイオン強度、即ち、伝導率が増加する。これを、緩衝塩濃度の増加によるか、又は、他の塩、いわゆる溶出塩の緩衝溶液への添加によるかのいずれかにより達成できる。溶出方法に応じて、緩衝液／塩濃度を、一度に（段階溶出方法）、又は、連続的に（連続溶出方法）、濃縮された緩衝液又は溶出塩溶液の分別添加により増加させる。好ましい溶出塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、又はクエン酸もしくはリン酸の他の塩、又はこれらの成分の任意の混合物である。一実施態様において、溶出塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、又はこれらの混合物である。
【００４３】
本発明の一実施態様において、陽イオン交換材料は、好ましくはToyopearl（登録商標）SP 650 Mなどの強陽イオン交換材料である。溶出を引き起こす塩の濃度は、一実施態様において５mM〜５００mMの範囲内、好ましくは５mM〜４００mMの範囲内、より好ましくは５mM〜２５０mMの範囲内である。本発明の別の実施態様において、溶出を引き起こす塩は、同時に、緩衝物質として使用される（例えば、クエン酸もしくはその塩又はリン酸もしくはその塩など）。
【００４４】
モノペグ化エリスロポエチンを、当技術分野において公知の方法により、薬学的に許容しうる担体又はビヒクルとの注射のために適切な医薬組成物中で使用してもよい。例えば、適切な組成物は、ＷＯ９７／０９９９６、ＷＯ９７／４０８５０、ＷＯ９８／５８６６０、及びＷＯ９９／０７４０１において記載されている。本発明の産物を処方するための好ましい薬学的に許容しうる担体には、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質などがある。本発明の化合物を、等張化剤、例えば１３２mM塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７の１０mMリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液中で処方してもよい。場合により、医薬組成物は保存剤を含んでもよい。医薬組成物は、様々な量のモノペグ化エリスロポエチン、例えば１０〜１０００μg/ml、例えば５０μg又は４００μgを含んでもよい。
【００４５】
本発明のエリスロポエチン糖タンパク質産物の投与は、ヒトにおいて赤血球の形成をもたらす。それゆえ、モノペグ化エリスロポエチン糖タンパク質産物の投与によって、赤血球の産生において重要であるこのエリスロポエチンタンパク質が補充される。モノペグ化エリスロポエチン糖タンパク質産物を含む医薬組成物を、独立しているか又は状態もしくは疾患の一部としての、低いか又は欠損した赤血球産生により特徴付けられる血液障害を経験しているヒト患者に、種々の手段により投与するために有効な強度で処方しうる。医薬組成物を、皮下又は静脈内注射などの注射により投与してもよい。モノペグ化エリスロポエチン糖タンパク質産物の平均量は変動しうる。共役体の正確な量は、処置される状態の正確な型、処置される患者の状態、ならびに組成物中の他の成分などの要因に支配される優先度の問題である。例えば、０．０１〜１０μg/kg体重、好ましくは０．１〜１μg/kg体重を、例えば週１回投与してもよい。
【００４６】
以下の実施例、配列表、及び図面は本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神から逸脱することなく、記載した手順を改変できることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ピーク及び物質の相関を含む異なってペグ化されたエリスロポエチンの混合物のＳＥ−ＨＰＬＣ。
【図２】段階溶出方法の例示的なクロマトグラム。
【図３】連続溶出方法の例示的なクロマトグラム。
【００４８】
材料及び方法
ＳＥ−ＨＰＬＣ
ＳＥ−ＨＰＬＣによって、その見掛けの分子量に従ってタンパク質が分離される。それゆえ、この方法によって、モノペグ化エリスロポエチン、低分子量形態及びフラグメント、ポリペグ化形態及びエリスロポエチンのより高度な凝集体の存在を検出できる。ＨＰＬＣには２２０nm検出器及びSuperose 6 HRカラム（寸法１０×３００mm、Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-0537-01）又はSuperose 6 10/300 GLカラム（Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-5172-01）が備えられている。カラムを、均一溶媒条件下で、室温で、約０．４ml/分の流速を使用して操作する。移動相緩衝液は、３００mM塩化ナトリウムを含むｐＨ６．８の５０mMリン酸ナトリウム緩衝液である。使用するＨＰＬＣシステムに応じて、方法を、１００μL又は５００μLのいずれかの試料適用容積で実施できる。試料を、移動相緩衝液で、約０．５mg/mL（１００μL負荷）又は約０．１mg/mL（５００μL負荷）のタンパク質濃度に希釈する。タンパク質濃度が０．１mg/mL未満の試料を、未希釈で使用できる。溶出タンパク質を検出器波長２２０nmで検出する。
【００４９】
実施例１
エリスロポエチンの発酵及び精製
エリスロポエチンを、例えば、ＷＯ０１／８７３２９に従って産生し、そしてＷＯ９６／１３５７１８において報告されるように精製できる。
【００５０】
実施例２
二官能性試薬でのエリスロポエチンのペグ化
ａ）エリスロポエチンの活性化
ブロック化チオール基、ＳＡＴＡ（スクシンイミジルアセチルチオアセタート）、又はＳＡＴＰ（スクシンイミジルアセチルチオプロピオナート）（ＤＭＳＯ中１０mg/mlで溶解）を含む指定量の試薬を、ベンジル保護エリスロポエチンの溶液に、ここでは５０mM塩化ナトリウムを補充したｐＨ７．３の１０mMリン酸カリウム緩衝液中５mg/mlタンパク質１mlに加えた。反応混合物を約３０分間（２５℃で）撹拌し、そして１Mリジン溶液を最終濃度１０mMに加えることにより停止させた。過剰量のＳＡＴＡ及びＳＡＴＰを、５０mM塩化ナトリウム及び２mM ＥＤＴＡを含むｐＨ６．２の１０mMリン酸カリウム緩衝液に対する透析により除去した。保護アセチル基をヒドロキシアミンを用いて除去した。
【００５１】
ｂ）活性化エリスロポエチンのペグ化
３８０mgのメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ＭＷ３０．０００；Shearwater Polymers, Inc., Huntsville (Alabama, USA)）を、９５mgの活性化エリスロポエチンを含む溶液中に溶解した（５０mM塩化ナトリウム及び２mM ＥＤＴＡを含む１０mMリン酸カリウム緩衝液中（ｐＨ６．２）中４．５mg/ml）。結果として得られる、溶液中の活性化エリスロポエチンとメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドとの間のモル比は１：２〜１：４であった。１Mヒドロキシアミン水溶液を最終濃度３０mM（ｐＨ６．２）に上記の溶液に加えることにより、活性化エリスロポエチンの共有結合したブロック化チオール基を脱ブロックした。結果として得られる、溶液の反応混合物中の活性化エリスロポエチンは、遊離チオール（−ＳＨ）基を含んだ。チオール基の脱ブロックの直後に、今や遊離チオール（−ＳＨ）基を含む活性化エリスロポエチンとメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドとの間の９０分間のカップリング反応（撹拌しながら、２５℃）を続けた。カップリング反応を、０．２Mシステイン水溶液を最終濃度２mMに反応混合物に加えることにより停止した。３０分後、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドと反応しなかった活性化エリスロポエチンの過剰の遊離チオール基を、ＤＭＳＯ中の０．５M Ｎ−メチルマレイミド溶液を最終濃度５mMに達するように加えることによりブロックした。３０分後、結果として得られる、今やペグ化エリスロポエチンを含む反応混合物を精製できる。
【００５２】
実施例３
モノペグ化エリスロポエチンの精製
ａ）SP Toyopearl 650 Mでの第１のクロマトグラフィー
産物の第１のクロマトグラフィーを、SP Toyopearl 650Mを充填したスルホプロピル（ＳＰ）カラムで実施する。カラムを室温で操作する。第１のカラムの最高負荷容量は、カラム容積（ＣＶ）１リットル当たり１．５gタンパク質として規定される。カラムを、ｐＨ２．９〜３．１の１００mMリン酸カリウム緩衝液（ＳＰ−Ａ緩衝液）で平衡化した。負荷工程後、カラムを、漸増量のＮａＣｌを含む一連のリン酸カリウム緩衝液で洗浄及び溶出した。加水分解されたＰＥＧ試薬及びポリペグ化形態を、それぞれ、ＳＰ−Ａ緩衝液、及び９０mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．９〜３．１）（ＳＰ−Ｂ緩衝液）での素通り及びその後の洗浄工程において除去した。
【００５３】
モノペグ化エリスロポエチンを、２５０mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．９〜３．１）（ＳＰ−Ｃ緩衝液）を適用することにより溶出し、容器中に採集し、そして精製水で直接１：５希釈した。この採集した溶出液を「ＳＰ溶出液プールＩ」と称する。
【００５４】
続いてカラムを７５０mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．９〜３．１）（ＳＰ−Ｄ緩衝液）で洗浄して、未反応エリスロポエチンを除去し、そしてカラムを再生した。
【００５５】
ｂ）SP Toyopearl 650 Mでの第２のクロマトグラフィー
第２のカラムを室温で操作した。ＳＰ−Ａ緩衝液での平衡化後、ＳＰ溶出液プールＩをカラムに適用し、その後カラムをＳＰ−Ａ緩衝液で洗浄した。モノペグ化エリスロポエチンを、５０〜５００mMの塩化ナトリウムの傾きでの直線勾配を、ｐＨ２．９〜３．１の１００mMリン酸カリウム緩衝液で緩衝化した１０カラム容積にわたり適用することにより溶出した。産物ピークを８個までの単一画分に分画し、そして各画分を１Mリン酸水素二カリウムで直接希釈して、ｐＨを６〜８に増加させた。
【００５６】
モノペグ化エリスロポエチンの溶出が完了した後、勾配の傾きを増加させて、５００mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．９〜３．１）での即時のカラム洗浄を導くことができる。
【００５７】
ｃ）SP Toyopearl 650 Mカラムの再生
両方のカラムの樹脂を一連の７工程において再生した。カラムを精製水、続いて０．５M水酸化ナトリウム溶液でフラッシュした。アルカリ溶液を精製水で置換し、続いて酸洗浄した（０．５Mリン酸二水素ナトリウム、１Mリン酸）。別の精製水工程後、カラムを０．５M水酸化ナトリウムで≧４時間、脱発熱物資化（depyrogenate）した。苛性再生後、カラムを精製水で再び洗浄した。カラムパラメーターのまとめについては表１及び表２を参照のこと。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンを含む溶液を提供する工程、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する工程、及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において精製モノペグ化エリスロポエチンを回収する工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法であって、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
方法において、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程が異なる溶出方法を使用して実施されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程が以下の工程：
ａ）モノ、ポリ、非ペグ化エリスロポエチン、及び低分子量形態の混合物を含む水性緩衝溶液を、モノペグ化エリスロポエチンが第１のカラム中に含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程、
ｂ）モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の段階的増加を伴う段階溶出方法により第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程であって、回収された溶液中のモノペグ化エリスロポエチンの割合が、適用された混合物と比較して増加する工程、
ｃ）工程ｂ）の回収されたモノペグ化エリスロポエチンを、前記モノペグ化エリスロポエチンが第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程であって、第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料は第１のカラム中の陽イオン交換材料と同じ型のものである工程、
ｄ）実質的に均質な形態の精製モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の連続増加を伴う連続溶出方法により、前記第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程
を含むことを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
陽イオン交換材料がスルホプロピル陽イオン交換材料であるであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
方法の工程ｂ）におけるイオン強度の段階的増加が３段階のイオン強度の増加であることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）において回収されるモノペグ化エリスロポエチンが段階溶出方法の第２段階において回収されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）において、ポリペグ化エリスロポエチンが通過流緩衝液の第１のイオン強度の増加後に回収され、モノペグ化エリスロポエチンが通過流緩衝液の第２のイオン強度の増加後に回収され、そして非ペグ化エリスロポエチンが通過流緩衝液の第３のイオン強度の増加後に回収されることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）の段階溶出方法において溶出を引き起こす塩濃度の差が、段階溶出方法の段階の各々において１２０％以上であることを特徴とする、請求項３〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
水性緩衝溶液がリン酸もしくはその塩、又はクエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩を緩衝物質として含むことを特徴とする、請求項３〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
工程ｄ）において、約５０mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の濃度約１００mMのリン酸カリウム緩衝液で開始し、そして約５００mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の濃度約１００mMのリン酸カリウム緩衝液で終了する直線勾配を適用することにより第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムからモノペグ化エリスロポエチンが回収され、塩化ナトリウム濃度の変化が１０カラム容積にわたり直線的であることを特徴とする、請求項３〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
モノペグ化エリスロポエチンの産生のための方法であって、以下の工程：
ａ）エリスロポエチンをペグ化する工程、
ｂ）モノペグ化エリスロポエチンを２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製する工程であって、第１及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が同じ型の陽イオン交換材料を用いる工程、
ｃ）モノペグ化エリスロポエチンを、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから実質的に均質な形態で回収する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
方法において、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程が異なる溶出方法を使用して実施されることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
第２の陽イオン交換材料が、第１の陽イオン交換材料と同じ型の陽イオン交換材料であるが、同じ画分の陽イオン交換材料ではないことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
ＰＥＧ残基が、直鎖ＰＥＧとして２０〜３５kDaの、そして分岐ＰＥＧとして４０kDaの分子量を有することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
モノペグ化エリスロポエチンが、サイズ排除ＨＰＬＣにより決定される９５面積％超のモノペグ化エリスロポエチンを含む実質的に均質な形態で得られることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
モノペグ化エリスロポエチンが、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において、サイズ排除ＨＰＬＣにより決定される６０面積％超の純度で回収されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
水性緩衝溶液が約１００mMリン酸カリウム緩衝液を含み、そして約３．０のｐＨを有することを特徴とする、請求項３〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
クロマトグラフィー工程において、溶液のｐＨ値が約３．０であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
陽イオン交換クロマトグラフィーカラムからのペグ化エリスロポエチンの溶出を引き起こす塩が、クエン酸ナトリウム又は塩化ナトリウム又は塩化カリウムであることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
エリスロポエチンが配列番号１又は２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンを含む溶液を提供する工程、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する工程、及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において精製モノペグ化エリスロポエチンを回収する工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法であって、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
方法において、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程が異なる溶出方法を使用して実施されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程が以下の工程：
ａ）モノ、ポリ、非ペグ化エリスロポエチン、及び低分子量形態の混合物を含む水性緩衝溶液を、モノペグ化エリスロポエチンが第１のカラム中に含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程、
ｂ）モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の段階的増加を伴う段階溶出方法により第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程であって、回収された溶液中のモノペグ化エリスロポエチンの割合が、適用された混合物と比較して増加する工程、
ｃ）工程ｂ）の回収されたモノペグ化エリスロポエチンを、前記モノペグ化エリスロポエチンが第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程であって、第２のカラムに含まれる陽イオン交換材料は第１のカラム中の陽イオン交換材料と同じ型のものである工程、
ｄ）実質的に均質な形態の精製モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の連続増加を伴う連続溶出方法により、前記第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程
を含むことを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
陽イオン交換材料がスルホプロピル陽イオン交換材料であるであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
方法の工程ｂ）におけるイオン強度の段階的増加が３段階のイオン強度の増加であることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）において回収されるモノペグ化エリスロポエチンが段階溶出方法の第２段階において回収されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）において、ポリペグ化エリスロポエチンが通過流緩衝液の第１のイオン強度の増加後に回収され、モノペグ化エリスロポエチンが通過流緩衝液の第２のイオン強度の増加後に回収され、そして非ペグ化エリスロポエチンが通過流緩衝液の第３のイオン強度の増加後に回収されることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）の段階溶出方法において溶出を引き起こす塩濃度の差が、段階溶出方法の段階の各々において１２０％以上であることを特徴とする、請求項３〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
水性緩衝溶液がリン酸もしくはその塩、又はクエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩を緩衝物質として含むことを特徴とする、請求項３〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
工程ｄ）において、約５０mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の濃度約１００mMのリン酸カリウム緩衝液で開始し、そして約５００mM塩化ナトリウムを含む約ｐＨ３．０の濃度約１００mMのリン酸カリウム緩衝液で終了する直線勾配を適用することにより第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムからモノペグ化エリスロポエチンが回収され、塩化ナトリウム濃度の変化が１０カラム容積にわたり直線的であることを特徴とする、請求項３〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
モノペグ化エリスロポエチンの産生のための方法であって、以下の工程：
ａ）エリスロポエチンをペグ化する工程、
ｂ）モノペグ化エリスロポエチンを２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製する工程であって、第１及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が同じ型の陽イオン交換材料を用いる工程、
ｃ）モノペグ化エリスロポエチンを、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから実質的に均質な形態で回収する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
方法において、２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程が異なる溶出方法を使用して実施されることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
第２の陽イオン交換材料が、第１の陽イオン交換材料と同じ型の陽イオン交換材料であるが、同じ画分の陽イオン交換材料ではないことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
ＰＥＧ残基が、直鎖ＰＥＧとして２０〜３５kDaの、そして分岐ＰＥＧとして４０kDaの分子量を有することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
モノペグ化エリスロポエチンが、サイズ排除ＨＰＬＣにより決定される９５面積％超のモノペグ化エリスロポエチンを含む実質的に均質な形態で得られることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
モノペグ化エリスロポエチンが、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において、サイズ排除ＨＰＬＣにより決定される６０面積％超の純度で回収されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
水性緩衝溶液が約１００mMリン酸カリウム緩衝液を含み、そして約３．０のｐＨを有することを特徴とする、請求項３〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
クロマトグラフィー工程において、溶液のｐＨ値が約３．０であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
陽イオン交換クロマトグラフィーカラムからのペグ化エリスロポエチンの溶出を引き起こす塩が、クエン酸ナトリウム又は塩化ナトリウム又は塩化カリウムであることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
エリスロポエチンが配列番号１又は２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５３３６６４（Ｐ２０１０−５３３６６４Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１６４１４（Ｐ２０１０−５１６４１４）
【出願日】平成２０年７月１５日（２００８．７．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００５７６７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１０２７０
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１５日（２００８．７．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００５７６７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１０２７０
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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