ペディオコッカス・ダムノサスの検出用プライマーおよびプローブ
【課題】ペディオコッカス・ダムノサスを正確に検出できるプライマーを提供する。
【解決手段】特定の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペディオコッカス・ダムノサス検出用プローブまたはプライマー。
【解決手段】特定の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペディオコッカス・ダムノサス検出用プローブまたはプライマー。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ペディオコッカス・ダムノサスの検出用プライマーおよびプローブに関し、より詳細には、ペディオコッカス・ダムノサスの検出用のＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール業界においては、微生物によるビールの汚染は深刻な問題をもたらす。ホップ由来の苦味物質は、ビールに苦味とともに微生物安定性も付与する。しかし、いくつかの種類の乳酸菌は、このような抗菌活性に対抗してビールで増殖することが出来る。
【０００３】
製品となったビール中で増殖する乳酸菌種としてはラクトバチラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）等の報告例が多い。特にペディオコッカス・ダムノサスはワイン中でも増殖し、中には粘性のある多糖を生産して品質を著しく低下させる菌株もあると報告されており、製造業者に与える経済的な打撃が大きい。
【０００４】
これまでにペディオコッカス属やラクトバチラス属のような乳酸菌を検出するためのプローブやプライマーが開発されている。
【０００５】
例えば、特許第３７４９５４０号（特許文献１）、特開２００１−２３１５６４号公報（特許文献２）、特開２００２−３４５７８号公報（特許文献３）、特表２００３−５１００９１号公報（特許文献４）、およびＷＯ２００５／０８０５９９号公報（特許文献５）に開示されているように、ペディオコッカス・ダムノサス等の５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、および２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子やそれらのスペーサー領域の塩基配列に基づいてペディオコッカス属やラクトバチラス属のような乳酸菌を検出するためのプローブやプライマーが開発されてきた。
【０００６】
また、Renoufら（Journal of Microbiological Methods, 2006, vol.67, 162-170）（非特許文献１）は、ペディオコッカス・ダムノサス等の乳酸球菌６菌種のｒｐｏＢ遺伝子の塩基配列を決定し、共通配列からプライマーを設計して、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、およびリアルタイムＰＣＲ法におけるメルティングカーブにより、各菌種を識別する方法を開発した。また、Suzukiら（Letters in Applied Microbiology, 2006, vol.42, 392-399）（非特許文献２）は、ペディオコッカス・ダムノサスのプラスミド上にコードされたｈｏｒＡ遺伝子の塩基配列をラクトバチラス・ブレビスのｈｏｒＡ遺伝子の塩基配列と比較し、以前に開発したｈｏｒＡ遺伝子検出用プライマーよりも特異性と検出感度が高いＰＣＲ用プライマーを開発した。
【０００７】
しかし、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列や２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は乳酸菌の間では相同性が高く、菌種に特異的な配列を特定することが困難なこともあると考えられる。また、開発された一部のプライマーは検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。
【０００８】
また、ＰＣＲ法は高度な温度制御や蛍光観察が必要なため、高価な機器を必要とする。
またＰＣＲは反応後に電気泳動、染色、写真撮影等が必要であり、遺伝子増幅工程後の結果判定までに時間がかかる。
【０００９】
土屋ら（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報（特許文献６））は、ペディオコッカス・ダムノサスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するＬＡＭＰプライマーを開発した。
【００１０】
しかし、前述の通り１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は乳酸菌の間では相同性が高く、菌種に特異的な配列を特定することが困難なこともあると考えられる。また、開発された一部のプライマーは検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第３７４９５４０号
【特許文献２】特開２００１−２３１５６４号公報
【特許文献３】特開２００２−３４５７８号公報
【特許文献４】特表２００３−５１００９１号公報
【特許文献５】ＷＯ２００５／０８０５９９号公報
【特許文献６】ＷＯ２００５／０９３０５９号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Journal of Microbiological Methods, 2006, vol.67, 162-170
【非特許文献２】Letters in Applied Microbiology, 2006, vol.42, 392-399
【発明の概要】
【００１３】
本発明者は、ペディオコッカス・ダムノサスＪＣＭ５８８６株のＬ−ＬＤＨ遺伝子全体とその周辺領域の塩基配列（配列番号６）を明らかにするとともに、この塩基配列に基づいて、ペディオコッカス・ダムノサス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってペディオコッカス・ダムノサスを正確に検出できることを見いだした。ペディオコッカス・ダムノサスのＬ−ＬＤＨ遺伝子全体とその周辺領域の塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。また、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子とその周辺領域の塩基配列に基づいて、ペディオコッカス・ダムノサスなど乳酸菌の菌種判定を行うことはこれまでに報告されていない。
【００１４】
本発明は、ペディオコッカス・ダムノサスを正確に検出できるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットを提供することを目的とする。本発明は、また、ペディオコッカス・ダムノサスを正確に同定できる検出方法を提供することを目的とする。
【００１５】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）検出用プローブまたはプライマー。
（１’） 配列番号６の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号６の３４０−４７６番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチド、にハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（２）前記（１）に記載の二種以上のプライマーからなる、ペディオコッカス・ダムノサス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
（３）下記ポリヌクレオチドを含んでなる、前記（２）に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
（４）配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、前記（３）に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
（５）前記（１）に記載の二種以上のプライマーからなる、ペディオコッカス・ダムノサス検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
（６）配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマーまたは前記（３）または（４）に記載のプライマーセット。
（７）配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマーまたは前記（３）または（４）に記載のプライマーセット。
（８）配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマーまたは前記（３）または（４）に記載のプライマーセット。
（９）前記（１）に記載のプローブまたはプライマー、前記（２）〜（４）のいずれか一項に記載のプライマーセット、または前記（５）に記載のプライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【００１６】
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、ペディオコッカス・ダムノサスを正確に検出することができる。特に、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセット（特に、ＬＡＭＰ法プライマーセット）によれば、ペディオコッカス・ダムノサスを、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【００１７】
ペディオコッカス・ダムノサスは、ビール、発泡酒、ワインなどの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒およびワイン）の品質管理や環境試料（例えば、原料用水）の検査に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーセット（ＳＰＤ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。ペディオコッカス・クラウセニＤＳＭ１４８００、ペディオコッカス・セリコラＤＳＭ１７７５７、ペディオコッカス・ペントサセウスＤＳＭ２０２８０、ペディオコッカス・デキストリニカスＤＳＭ２０２９３、ペディオコッカス・パルブルスＤＳＭ２０３３２、ラクトコッカス・ラクチスＤＳＭ２０４８１、ラクトバチラス・パラカゼイＪＣＭ１１６３、ラクトバチラス・ラムノサスＮＢＲＣ３４２５、ラクトバチラス・カゼイＪＣＭ１１３４、ＮＥＧＡ：ゲノムＤＮＡ無添加、ペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９、ＪＣＭ５８８６。
【図２】ペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株のコロニー形成数とＰＤＬ４ＬＢ４によるＬＡＭＰ法検出時間の近似曲線を示した図である。時間（Threshold time:分）は、濁度が０．１を超えたときの反応時間である。
【図３】各種乳酸菌のＬ-ＬＤＨ遺伝子部分配列の系統樹解析の結果を示した図である。
【図４】Ｌ−ＬＤＨ遺伝子のＯＲＦと、系統樹解析を行った領域（Phylogenetic tree）およびＬＡＭＰプライマーの設計領域（LAMP primer）との位置関係を示した制限酵素地図である。ＬＡＭＰプライマーの設計領域は配列番号６に対応する。
【発明の具体的説明】
【００１９】
プライマーおよびプローブ並びにプライマーセット
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３の４種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の６つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、３’末端側から５’末端側に向かって順番にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を作製する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００２０】
ＦＩＰは、標的配列のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２１】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００２２】
ＢＩＰは、標的配列のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２３】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００２４】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００２５】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を加速するためにループプライマー（ＬＦプライマーまたはＬＢプライマー）を１種類あるいは２種類追加してもよい。ループプライマーをＦ１−Ｆ２間の領域、あるいはＢ１−Ｂ２間の領域にアニールするように設計し、ＬＡＭＰ法反応系に追加して使用すると、これらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することにより、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される（例えば、特開２００２−３４５４９９号公報参照）。
【００２６】
具体的には、本発明のＬＡＭＰ法プライマーセットは、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００２７】
本発明では、配列番号１〜５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、プライマーやプローブとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーやプローブとして用いることができることはいうまでもない。
【００２８】
本発明では、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、プライマーやプローブとして用いることができる。
【００２９】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プローブ／プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブ／プライマーとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００３０】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００３１】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも３０塩基（例えば、３０〜７２塩基）、より好ましくは少なくとも４１塩基（例えば、４１〜６０塩基）、特に好ましくは少なくとも４３塩基（例えば、４３〜５４塩基）とすることができる。
【００３２】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも３０個、好ましくは少なくとも３８個、より好ましくは少なくとも４３個、特に好ましくは少なくとも４９個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００３３】
また、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１２塩基（例えば、１２〜２５塩基および１２〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも１７塩基（例えば、１７〜２５塩基および１７〜３０塩基）、特に好ましくは少なくとも１９塩基（例えば、１９〜２５塩基および１９〜３０塩基）とすることができる。
【００３４】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１７個、特に好ましくは少なくとも１９個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００３５】
相同ポリヌクレオチドおよび配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００３６】
相同ポリヌクレオチドは、更に、対応する塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００３７】
ここで「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【００３８】
配列番号１〜５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドの例を示すと以下の通りである。
・配列番号１の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１の連続する少なくとも４３個（４３〜７２個）、より好ましくは、少なくとも５４個（５４〜７２個）、更に好ましくは、少なくとも６０個（６０〜７２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号２の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２の連続する少なくとも１７個（１７〜２３個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２３個）、更に好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
・配列番号３の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号３の連続する少なくとも４３個（４３〜５４個）、より好ましくは、少なくとも４９個（４９〜５４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で７２塩基、好ましくは最大で６０塩基、より好ましくは最大で５４塩基とすることができる）。
・配列番号４の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号４の連続する少なくとも１７個（１７〜２２個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２２個）、更に好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２２個）のヌクレオチドのヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
・配列番号５の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号５の連続する少なくとも１７個（１７〜２１個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２３塩基とすることができる）。
【００３９】
本発明では、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号６の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
【００４０】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号６の塩基配列の相補配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００４１】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、更に、配列番号６の塩基配列の相補配列に１または数個の変異が導入された少なくとも１０塩基の改変塩基配列からなり、かつ配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列に１または数個の変異が導入された少なくとも１０塩基の改変塩基配列からなり、かつ配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００４２】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）として用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも４３個（例えば、４３〜５４塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で７２塩基、好ましくは最大で６０塩基、より好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００４３】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法プライマー（Ｆ３、Ｂ３、ＬＢ、およびＬＦ）として用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１９個（例えば、１９〜２３個および１９〜２５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００４４】
本発明においては、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペディオコッカス・ダムノサスを検出するためのＬＡＭＰ法プライマーセットを選択することができる。ＬＡＭＰ法は周知であり、当業者であればＬＡＭＰ法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種類のプライマー、すなわち、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、ＬＦおよびＬＢを使用することもできる。ＬＡＭＰ法においては、好ましくは、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種のプライマーのうち、少なくともＦＩＰおよびＢＩＰのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号６の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号６の３４０−４７６番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、ＬＡＭＰ法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号６の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号６の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号６の配列の外側の領域）に対合するように選択してもよい。
【００４５】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜２４個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２４個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００４６】
本発明においては、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペディオコッカス・ダムノサスを検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。ＰＣＲ法は周知であり、当業者であればＰＣＲ法プライマーペアを適宜選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号６の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号６の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号６の塩基配列またはその相補配列に対合し、他方のプライマーが配列番号６の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号６の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。ＰＣＲ法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号６の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号６の３４０−４７６番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
【００４７】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００４８】
本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M. et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００４９】
本発明によるプライマー、プローブ、およびプライマーセットは、それぞれ単独で使用しても、適宜組み合わせて使用してもよい。すなわち、本発明によるプライマー、プローブ、およびプライマーセットは、乳酸菌のうちペディオコッカス・ダムノサスを検出することができるが、他の乳酸菌（例えば、ラクトバチラス属乳酸菌）判定用プライマー、プローブ、およびプライマーセット（例えば、特開２００８−５７７９号公報および本願実施例１）や、ビール混濁乳酸菌判定用プライマー、プローブ、およびプライマーセット（例えば、特開２００８−５４６３２号公報）と組み合わせることにより、より正確に試料中の乳酸菌を同定できるとともに、試料の混濁可能性を判定することができる。
【００５０】
従って、本発明によるプライマー、プローブ、およびプライマーセットは、単独で、あるいは組み合わせて、キットの形態で提供することができる。従って、例えば、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットと、１以上の他のラクトバチラス属乳酸菌のＬＡＭＰ法プライマーセットと組み合わせて含んでなる、飲料（例えば、酒類）を混濁させる乳酸菌の検出キットが提供される。
【００５１】
ＬＡＭＰ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、反応用試薬混合液）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００５２】
ＰＣＲ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＰＣＲ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、精製水）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００５３】
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、酒類の品質低下の原因となるペディオコッカス・ダムノサスを正確に識別することができる。従って、本発明によるプライマーセットおよび本発明によるキットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒およびワイン）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【００５４】
ペディオコッカス・ダムノサスは、ビール、発泡酒およびワインの製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因乳酸菌種として見いだされることがある。従って、本発明によるプライマーセットおよび本発明によるキットは、好ましくは、ビール、発泡酒およびワインの品質管理に用いることができる。
【００５５】
検出方法および判定方法
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、ペディオコッカス・ダムノサスの検出に用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法が提供される。
【００５６】
ペディオコッカス・ダムノサスは各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒およびワイン）を混濁させる原因菌である。従って、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、ペディオコッカス・ダムノサスの検出のみならず、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒およびワイン）の混濁可能性の判定に用いることができる。すなわち、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットにより検出対象菌種が検出された場合には、混濁菌が試料中に存在していると、あるいは試料が混濁する見込みがあると判定することができる。従って、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、各種飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、各種飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００５７】
ここで、ハイブリダイゼーションの検出方法は周知であり、その検出のための装置、器具は市販のものを用いることができる。ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法など周知の核酸増幅法を使用して増幅産物の有無等を検出することにより、あるいはサザンブロット法など周知の核酸検出法を使用してハイブリダイゼーション複合体の有無等を検出することにより、実施することができる。
【００５８】
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００５９】
すなわち、本発明によれば、
（ａ）本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペディオコッカス・ダムノサスの存在を示す、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法が提供される。
【００６０】
本発明によれば、また、
（ａ）本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、各種飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００６１】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【００６２】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応については後述する。
【００６３】
試料中に検出対象菌種が存在する場合には、標的とする特定の領域が増幅され、増幅産物が生成する。増幅産物が生成した場合には、核酸増幅反応が実施された試料溶液が白濁することから、試料溶液の濁度を測定することにより増幅産物の有無を決定することができる。ＬＡＭＰ法における濁度の測定は周知であり、市販のエンドポイント濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−１００）やリアルタイム濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−２００）を用いて濁度の測定をすることができる。
【００６４】
後記実施例で示すように、試料溶液がある一定の濁度に達するまでの時間を測定することにより、検定試料中の菌体数を決定することができる。すなわち、本発明による検出方法の別の面によれば、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施するとともに、核酸増幅反応の開始から試料がある一定の濁度に達するまでの時間を測定し、その時間から検体中の菌体数を求める工程を含む、ペディオコッカス・ダムノサスの定量方法が提供される。具体的には、以下の通りである。
【００６５】
本発明によれば、
（ａ）本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｂ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および（ｂ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、ペディオコッカス・ダムノサスの定量方法が提供される。
【００６６】
本発明による定量方法においては、菌体数と一定の濁度に達するまでの時間との検量線を予め作成しておき、この検量線に基づいて、測定した時間から検体中の菌体数を求めることができる。検量線は、例えば、菌体を段階的に希釈した試料を準備し、それぞれについてＬＡＭＰ法による核酸増幅法を実施し、菌体のコロニー形成数の対数に対して、核酸増幅反応の開始から濁度が０．１になるまでの時間をプロットすることにより作成することができる。
【００６７】
本発明による検出方法および定量方法においては、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３からなるプライマーセットに、ループプライマー（ＬＦおよび／またはＬＢ）を追加して、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施してもよい。具体的には、本発明による検出方法および定量方法においては、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。
【００６８】
本発明による検出方法のうちＰＣＲ法による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＰＣＲ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００６９】
より具体的には、本発明によれば、
（ｃ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｄ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペディオコッカス・ダムノサスの存在を示す、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法が提供される。
【００７０】
本発明によれば、また、
（ｃ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｄ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、各種飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００７１】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【００７２】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＰＣＲ法による核酸増幅反応は周知であり、当業者であればＰＣＲ法およびその改変方法の実施条件等を適宜設定し、ＰＣＲ法を実施することができる。
【００７３】
本発明による検出方法のうちプローブによる検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対する本発明によるプローブのハイブリダイゼーションを実施した後、核酸複合体の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００７４】
より具体的には、本発明によれば、
（ｅ）本発明によるプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｆ）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペディオコッカス・ダムノサスの存在を示す、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法が提供される。
【００７５】
本発明によれば、また、
（ｅ）本発明によるプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｆ）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、各種飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００７６】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性元素（例えば、３２Ｐおよび１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、ＦＩＴＣ）、酵素反応に関与する分子（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。
【００７７】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体の検出に先立って、未結合プローブやハイブリダイズしないその他の成分を除去してもよい。
【００７８】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、ＬＡＭＰ法のみならず、ＬＡＭＰ法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。
【００７９】
ＬＡＭＰ法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、ＷＯ００／２８０８２号公報やNotomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
【００８０】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キットに従って実施することができるが、例えば、サンプルのＤＮＡ、プライマー溶液、および市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キット（例えば、栄研化学社製Loopamp ＤＮＡ増幅キット）で提供される試薬を、キットに添付されている説明書に従って混合して一定温度（６０〜６５℃）に保ち、一定時間（標準で１時間）反応させることにより実施できる。
【００８１】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
（ｉ）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（ii）ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（iii）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
（iv）ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
（ｖ）上記（iv）の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（vi）上記（ｖ）の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
（vii）上記（ｖ）の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
（viii）上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニ−リングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【００８２】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも用いることができる。
【００８３】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、約６０〜約６５℃（例えば６５℃）においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることができる。
【００８４】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットをＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の条件の下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株のターゲット領域が増幅される。このような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよく、また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出してもよい。
【００８５】
核酸増幅が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００８６】
ＰＣＲ法による核酸増幅反応
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して、ペディオコッカス・ダムノサスの識別に用いることができる。
【００８７】
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００８８】
ＰＣＲ法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
【００８９】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【００９０】
これらをＬＡＭＰ法やＰＣＲ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする乳酸菌株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする乳酸菌株を選択するためにシクロヘキシミドなどの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白 核酸 酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【００９１】
本発明によるプライマーセットおよびキットを用いたペディオコッカス・ダムノサスの検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【００９２】
まず、試料中に存在すると考えられるペディオコッカス・ダムノサスを適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法を実施し、ペディオコッカス・ダムノサスの特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は検出対象菌種の存在を示す。また、検出対象菌種の存在は、混濁菌が試料中に存在していること、あるいは試料が混濁する見込みを示す。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００９４】
実施例１：ＬＡＭＰ法プライマーセットによるペディオコッカス・ダムノサスの検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液を１００μｌ添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて中和し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。
（ｂ）ＬＡＭＰ用プライマー
以下のペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order（http://genome.e-mp.jp/index.html）、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００μＭの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、ＦＩＰ、ＢＩＰプライマー：１６μＭ、Ｆ３、Ｂ３プライマー：２μＭ、ＬＦ、ＬＢプライマー：８μＭとなるように混合し、希釈した。
［ペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーセット（ＰＤＬ４ＬＢ４）］
FIP：CCTTTCAATTTATAATTTCAGTACAAGTATAACACGTTAACATTTTTCAATAAATATGAGTTACTAAATACG （配列番号１）
F3： ACCAAATTTTTTTCGTCGCAATT（配列番号２）
BIP：TATTGTCTAATACACCAAATCATCAAAAAGTTGTGTTGAGCCATAGCAAATGCA （配列番号３）
B3： ACAAATTCTTCGGCAATTCCTT（配列番号４）
LB： GATGGCGCTGTTGGTTCTAGT（配列番号５）
なお、上記プライマーセットは、本発明者が取得したペディオコッカス・ダムノサスＪＣＭ５８８６株の新規Ｌ−ＬＤＨ遺伝子（配列番号６）のうち、プロモーター領域およびその周辺領域の塩基配列に基づいて設計した。
【００９５】
また、以下の乳酸菌判定用プライマーセットを準備し、菌種判定試験に供した。
【００９６】
［ラクトバチラス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）およびその近縁種検出用プライマーセット（ＬＣＮ３ＬＦ１）］
FIP CCGTTTTCTTACTTGGTTAAGTCCTCGGGAAGTCCAGTGATGGATGG（配列番号７）
F3 TGATCAGGTAGATAGGCTAGAAGT（配列番号８）
BIP GGTAGGAAAACGATATTATCTAGTTTTGAGAGATCCTTCAGGCTATCGCCA（配列番号９）
B3 TTCGGCATGGGAACAGGT（配列番号１０）
LF ACCGATTAGTACTAGTCCGCT（配列番号１１）
上記プライマーセットは、ラクトバチラス・パラコリノイデス（Lactobacillus paracollinoides）ＪＣＭ１１９６９株の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列（配列番号１２）に基づいて設計した。
【００９７】
［ラクトバチラス・バッキ（Lactobacillus backi）およびその近縁種検出用プライマーセット（ＨＭ６ＬＦ１ＬＢ１）］
FIP ACGGCACTTCCACTTCCAACTTCCTTTATGGAAGTAAGACCCCT（配列番号１３）
F3 CCCGCAAGATTAGATTTCCCA（配列番号１４）
BIP GTCGGAAACAATGTTTCCGCGTAGCTCTCAAAACTGGACCTTCT（配列番号１５）
B3 CCACACCACTATCTGAGAACTT（配列番号１６）
LF CTATCTACCTGATCATCTCTC（配列番号１７）
LB GTGTTCAAAGGTCAAAGAAAAT（配列番号１８）
なお、上記プライマーセットは、ラクトバチラス・バッキ近縁株であるビール工場分離株ＢＫ２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７９４）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子全体、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列（配列番号１９）に基づいて設計した。
【００９８】
［ラクトバチラス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）検出用プライマーセット（ＬＬ１２）］
FIP GGTCAGATCTATCGTCAAGCTGATGGCCTAAATAACATGCAAGTCGA（配列番号２０）
F3 TCAGGACGAACGTTGGC（配列番号２１）
BIP AACCTGCCCAGAAGAAGGGGTGGTTCTCGTTGTTATACGGT（配列番号２２）
B3 GAAGCGATAGCATAAAAGCCA（配列番号２３）
なお、上記プライマーセットは、特許第３６７７０５６号公報により明らかにされたラクトバチラス・リンドネリの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて設計した。
（ｃ）ＬＡＭＰ増幅反応溶液調製
ＬＡＭＰ法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Ｌｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムＤＮＡ溶液：２．５μｌ、プライマー溶液：２．５μｌ、２倍濃度反応用緩衝液：１２．５μｌ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ：１μｌ、滅菌水：６．５μｌを添加し、全量２５μｌの反応液を調製した。
（ｄ）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計ＬＡ−２００、あるいは栄研化学社製ＬＡ−３２０Ｃを使用した。反応チューブをセットし、６５℃一定（ボンネットは７５℃）で反応させ、その間の濁度変化を６秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
（ｅ）プライマーの評価
ペディオコッカス・ダムノサスに対して作成した菌種特異的なプライマーと、各種乳酸菌に特異的なプライマーについて乳酸菌の各種標準株等を使ってＬＡＭＰ法で特異性を評価した。結果は表１〜３に示される通りであった。
表１：各種乳酸菌標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応１００分以内に増幅なし、−−：反応８０分以内に増幅なし）
【表１】
表２：各種偏性嫌気性菌標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応１００分以内に増幅なし、−−：反応８０分以内に増幅なし）
【表２】
表３：ビール工場分離乳酸菌株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応１００分以内に増幅なし、−−：反応８０分以内に増幅なし）
【表３】
【００９９】
ＰＤＬ４ＬＢ４を用いた場合はペディオコッカス・ダムノサスの菌株に、反応開始６０分程度でＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた。特に、ＰＤＬ４ＬＢ４プライマーは、海外の菌株保存機関のペディオコッカス・ダムノサス保存株や工場分離株等、分離元が異なる株を特異的に検出できた。一方で、検査対象以外の乳酸菌標準株（同じペディオコッカス属のペディオコッカス・ダムノサス以外の7菌種を含む）、偏性嫌気性菌標準株、ビール工場分離乳酸菌を使用してＰＤＬ４ＬＢ４プライマーの特異性を評価したところ、ペディオコッカス・ダムノサス以外からは増幅は見られなかった。
【０１００】
ＬＣＮ３ＬＦ１を用いた場合はラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種であるラクトバチラス・パラコリノイデス等の菌株に、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた。ＨＭ６ＬＦ１ＬＢ１を用いた場合はラクトバチラス・バッキおよびその近縁種に、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた。ＬＬ１２を用いた場合はラクトバチラス・リンドネリに、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた。
【０１０１】
さらに、ＬＣＮ３ＬＦ１、ＨＭ６ＬＦ１ＬＢ１、ＬＬ１２について、検査対象以外の乳酸菌標準株、偏性嫌気性菌標準株、ビール工場分離乳酸菌を使用して各プライマーの特異性を評価したところ、各プライマーが検査対象にしている株以外からはほとんど増幅が見られなかった。
【０１０２】
以上により、本発明によるプライマーセットは、検査対象とするペディオコッカス・ダムノサスを菌種レベルで正確に検出できることが示された。本発明によるプライマーを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけでペディオコッカス・ダムノサスを正確に検出することができる。また、本発明によるプライマーセットを他の乳酸菌検出用プライマーセットと組み合わせることにより、乳酸菌の菌種判定をより正確に行うことができる。
【０１０３】
実施例２：特許文献にあるプライマーの評価
（ａ）特許文献のプライマー
土屋らの特許文献（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）に記載されていた以下のペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーセット（ＳＰＤ１）について、実施例１（ｂ）と同様にＬＡＭＰ法用プライマー溶液を調製した。ペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーセット（ＳＰＤ１）は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的としている。
［ペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーセット（ＳＰＤ１）］
FIP： GAAATCATCTTCGATGCAAGCTAGGACGCACTTTCGTTGATTGAA（配列番号２４）
F3： TGGAGAGTTTGATCCTGGCTC（配列番号２５）
BIP： ATTTTTAAAAGATGGCTTCGGCGGTGAGCCTTTATCTCACCAA（配列番号２６）
B3： GCTGCTGGCACGTAGTTAGCC（配列番号２７）
LB： CTGGATGGACCCGCGGCGT（配列番号２８）
実施例１（ｃ）および（ｄ）の記載に従って、上記プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により各種菌株の検出を行った。結果は図１に示される通りであった。
（ｂ）プライマーの評価
その結果、ＳＰＤ１は試験した乳酸菌株のいくつかの菌種と反応し、特異性が低いと考えられた。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の設計に使用された配列の菌種特異性が低く、交差反応したと考えられた。
【０１０４】
実施例３：ＬＡＭＰ法の検出限界
ＬＡＭＰ法の増幅効率を検討するために、ｍ−ＮＢＢ液体培地で培養したペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株の菌体を遠心分離して集菌し、その菌体を滅菌水に懸濁し、段階的に希釈して上記した方法でＤＮＡ抽出し、これをＬＡＭＰ法に供した。その結果、ＬＡＭＰ法では１０２ｃｆｕレベルの少ない菌体量からも増幅が観察された。
【０１０５】
また、菌体の各段階の希釈液から抽出したゲノムＤＮＡを使ったときにＬＡＭＰ反応で濁度が０．１を越えた時間を検出時間として、各プライマーの検出時間とコロニー形成数の対数をグラフにしたところ、累乗近似によりある程度高い相関係数の近似曲線を描くことが出来た（Ｒ２＝０．９８５）。ＰＤＬ４ＬＢ４について得られた近似曲線は図２に示される通りである。また、各プライマーの検出限界と検量線の相関係数との関係は下記に示される通りである。これを検量線とすることにより、１０２−１０７ｃｆｕの範囲で、サンプル中のペディオコッカス・ダムノサスの存在を定量的にある程度推測することが可能であることが示された。
【０１０６】
［プライマーの検出限界と検量線の相関係数］
検出限界 検量線近似式 検量線相関係数（Ｒ２）
ＰＤＬ４ＬＢ４ 1.6x102 cfu y = 3340.4x-1.6641 0.985
【０１０７】
実施例４：ビールからの検出
ビール製造工程中では、多くの場合、麦汁に下面発酵酵母を多量に添加して発酵させるが、外部から汚染する乳酸菌の菌数は製造用酵母に比べると非常に少ない。ビールに下面発酵酵母を懸濁させた液からの乳酸菌の検出限界について検討した。ｍ−ＮＢＢ固体培地で培養したペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株の菌体を白金耳でかき取り、滅菌水に懸濁後、段階的に希釈して遠心分離し、その菌体にビールに多量の下面発酵酵母を懸濁させた液を添加して懸濁させた。その後、１回集菌洗浄し、実施例１（ａ）に記載した方法でまとめてＤＮＡ抽出し、ＰＤＬ４ＬＢ４を使ったＬＡＭＰ法でペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株が検出可能かどうか検討した。その結果、ビールによる反応阻害および下面発酵酵母の存在に関係なく、滅菌水に懸濁した場合とほとんど同じ検出限界（１０２ｃｆｕレベル）でペディオコッカス・ダムノサスが検出できることがわかった。なお、同様の実験で下面発酵酵母を懸濁していないビールからの検出も検討し、同じ検出限界で検出できることを確認した。
【０１０８】
ペディオコッカス・ダムノサスの検出限界
ビール＋下面発酵酵母（1 x 107 cells） 6.9 x 102 cfu
【０１０９】
実施例５：ワインからの検出
ペディオコッカス・ダムノサスはワイン中でも増殖し、中には粘性のある多糖を生産して品質を著しく低下させる菌株もあると報告されている。赤ワインからの乳酸菌の検出限界について検討した。ｍ−ＮＢＢ固体培地で培養したペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株の菌体を白金耳でかき取り、フィルター除菌した赤ワインに懸濁後、同じ赤ワインで段階的に希釈した。そのチューブを遠心分離し、上澄みを捨てて沈殿を得た。その後、１回滅菌水で集菌洗浄し、実施例１（ａ）に記載した方法でＤＮＡ抽出したゲノムＤＮＡ溶液と、１回５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液で集菌洗浄して得られた沈殿をさらに１回滅菌水で集菌洗浄し、実施例１（ａ）に記載した方法でＤＮＡ抽出したゲノムＤＮＡ溶液をそれぞれ作成し、ＰＤＬ４ＬＢ４を使ったＬＡＭＰ法でペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株が検出可能かどうか検討した。尚、ＬＡＭＰ法での増幅の観察は１８０分まで行った。その結果、上述した方法で２回集菌洗浄した場合に検出限界は滅菌水の場合と同レベル（１０２ｃｆｕレベル）となった。集菌洗浄を２回にしたことで洗浄効率が高まったことと、ＥＤＴＡ溶液を用いることにより赤ワインが低ｐＨであることや金属イオンの存在の影響を取り除くことが出来たことが効果的であったと考えられる。
【０１１０】
赤ワインからのＰＣＲ法、およびリアルタイムＰＣＲ法による検出限界は、それぞれ１０２ｃｆｕレベル、１０１ｃｆｕレベルとされており（Gindreau, E. et al. Journal of Applied Microbiology 2001, vol. 90, 535-542、Delaherche, A. et al. Journal of Applied Microbiology 2004, vol. 97, 910-915）、今回のＬＡＭＰ法による検出限界はそれらと同等か若干悪い値となったが、これらの報告ではワイン中のポリフェノールを除く為のＰＶＰ処理を行う等４時間以上かかるＤＮＡ精製作業を行ったり、高価なリアルタイムＰＣＲ用のサーマルサイクラー等を使っている。上記手法では安価な試薬を用いた簡便なＤＮＡ抽出法を用いており、ＤＮＡ精製法の改良で検出限界はより改善する可能性があるが、製造現場で行うことを想定したこのような簡便なＤＮＡ抽出方法とより安価な検出装置を用いたＬＡＭＰ法でも同程度の検出感度で検査が出来ることが分かった。
【０１１１】
ペディオコッカス・ダムノサスの検出限界
滅菌水懸濁液 1.6x102 cfu
赤ワイン懸濁液（集菌洗浄１回） 2.8x103 cfu
赤ワイン懸濁液（集菌洗浄２回） 1.9x102 cfu
【０１１２】
実施例６：系統樹解析
各種乳酸菌株のＬ-ＬＤＨ遺伝子配列を決定し、系統樹解析することで菌種判定に有効であるかどうかを調べた。すなわち、各種乳酸菌株のＬ−ＬＤＨ遺伝子の部分配列のうち上流側約４５０塩基の塩基配列を決定し、系統樹を作成した。系統樹解析にはCLUSTAL Wソフトウェアを使用した。
その結果、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子の系統樹（図３）は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の系統樹（Zhang B. et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, vol.55, pp.2167-2170(2005)）と近似していることが判明した。すなわち、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子の塩基配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と同様に菌種同定に使用できることが確認された。但し、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子の部分配列のうち上流側約４５０塩基の塩基配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と同様に各菌種間の相同性が比較的高かったため、本発明ではこの部分配列よりも外側（５’上流側）の遺伝子配列も判読し、菌種間で差がより大きい領域（特にプロモーター領域）を見出し、ＬＡＭＰプライマーを設計した（図４）。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ペディオコッカス・ダムノサスの検出用プライマーおよびプローブに関し、より詳細には、ペディオコッカス・ダムノサスの検出用のＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール業界においては、微生物によるビールの汚染は深刻な問題をもたらす。ホップ由来の苦味物質は、ビールに苦味とともに微生物安定性も付与する。しかし、いくつかの種類の乳酸菌は、このような抗菌活性に対抗してビールで増殖することが出来る。
【０００３】
製品となったビール中で増殖する乳酸菌種としてはラクトバチラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）等の報告例が多い。特にペディオコッカス・ダムノサスはワイン中でも増殖し、中には粘性のある多糖を生産して品質を著しく低下させる菌株もあると報告されており、製造業者に与える経済的な打撃が大きい。
【０００４】
これまでにペディオコッカス属やラクトバチラス属のような乳酸菌を検出するためのプローブやプライマーが開発されている。
【０００５】
例えば、特許第３７４９５４０号（特許文献１）、特開２００１−２３１５６４号公報（特許文献２）、特開２００２−３４５７８号公報（特許文献３）、特表２００３−５１００９１号公報（特許文献４）、およびＷＯ２００５／０８０５９９号公報（特許文献５）に開示されているように、ペディオコッカス・ダムノサス等の５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、および２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子やそれらのスペーサー領域の塩基配列に基づいてペディオコッカス属やラクトバチラス属のような乳酸菌を検出するためのプローブやプライマーが開発されてきた。
【０００６】
また、Renoufら（Journal of Microbiological Methods, 2006, vol.67, 162-170）（非特許文献１）は、ペディオコッカス・ダムノサス等の乳酸球菌６菌種のｒｐｏＢ遺伝子の塩基配列を決定し、共通配列からプライマーを設計して、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、およびリアルタイムＰＣＲ法におけるメルティングカーブにより、各菌種を識別する方法を開発した。また、Suzukiら（Letters in Applied Microbiology, 2006, vol.42, 392-399）（非特許文献２）は、ペディオコッカス・ダムノサスのプラスミド上にコードされたｈｏｒＡ遺伝子の塩基配列をラクトバチラス・ブレビスのｈｏｒＡ遺伝子の塩基配列と比較し、以前に開発したｈｏｒＡ遺伝子検出用プライマーよりも特異性と検出感度が高いＰＣＲ用プライマーを開発した。
【０００７】
しかし、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列や２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は乳酸菌の間では相同性が高く、菌種に特異的な配列を特定することが困難なこともあると考えられる。また、開発された一部のプライマーは検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。
【０００８】
また、ＰＣＲ法は高度な温度制御や蛍光観察が必要なため、高価な機器を必要とする。
またＰＣＲは反応後に電気泳動、染色、写真撮影等が必要であり、遺伝子増幅工程後の結果判定までに時間がかかる。
【０００９】
土屋ら（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報（特許文献６））は、ペディオコッカス・ダムノサスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するＬＡＭＰプライマーを開発した。
【００１０】
しかし、前述の通り１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は乳酸菌の間では相同性が高く、菌種に特異的な配列を特定することが困難なこともあると考えられる。また、開発された一部のプライマーは検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第３７４９５４０号
【特許文献２】特開２００１−２３１５６４号公報
【特許文献３】特開２００２−３４５７８号公報
【特許文献４】特表２００３−５１００９１号公報
【特許文献５】ＷＯ２００５／０８０５９９号公報
【特許文献６】ＷＯ２００５／０９３０５９号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Journal of Microbiological Methods, 2006, vol.67, 162-170
【非特許文献２】Letters in Applied Microbiology, 2006, vol.42, 392-399
【発明の概要】
【００１３】
本発明者は、ペディオコッカス・ダムノサスＪＣＭ５８８６株のＬ−ＬＤＨ遺伝子全体とその周辺領域の塩基配列（配列番号６）を明らかにするとともに、この塩基配列に基づいて、ペディオコッカス・ダムノサス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってペディオコッカス・ダムノサスを正確に検出できることを見いだした。ペディオコッカス・ダムノサスのＬ−ＬＤＨ遺伝子全体とその周辺領域の塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。また、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子とその周辺領域の塩基配列に基づいて、ペディオコッカス・ダムノサスなど乳酸菌の菌種判定を行うことはこれまでに報告されていない。
【００１４】
本発明は、ペディオコッカス・ダムノサスを正確に検出できるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットを提供することを目的とする。本発明は、また、ペディオコッカス・ダムノサスを正確に同定できる検出方法を提供することを目的とする。
【００１５】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）検出用プローブまたはプライマー。
（１’） 配列番号６の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号６の３４０−４７６番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチド、にハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（２）前記（１）に記載の二種以上のプライマーからなる、ペディオコッカス・ダムノサス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
（３）下記ポリヌクレオチドを含んでなる、前記（２）に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
（４）配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、前記（３）に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
（５）前記（１）に記載の二種以上のプライマーからなる、ペディオコッカス・ダムノサス検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
（６）配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマーまたは前記（３）または（４）に記載のプライマーセット。
（７）配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマーまたは前記（３）または（４）に記載のプライマーセット。
（８）配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマーまたは前記（３）または（４）に記載のプライマーセット。
（９）前記（１）に記載のプローブまたはプライマー、前記（２）〜（４）のいずれか一項に記載のプライマーセット、または前記（５）に記載のプライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【００１６】
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、ペディオコッカス・ダムノサスを正確に検出することができる。特に、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセット（特に、ＬＡＭＰ法プライマーセット）によれば、ペディオコッカス・ダムノサスを、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【００１７】
ペディオコッカス・ダムノサスは、ビール、発泡酒、ワインなどの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒およびワイン）の品質管理や環境試料（例えば、原料用水）の検査に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーセット（ＳＰＤ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。ペディオコッカス・クラウセニＤＳＭ１４８００、ペディオコッカス・セリコラＤＳＭ１７７５７、ペディオコッカス・ペントサセウスＤＳＭ２０２８０、ペディオコッカス・デキストリニカスＤＳＭ２０２９３、ペディオコッカス・パルブルスＤＳＭ２０３３２、ラクトコッカス・ラクチスＤＳＭ２０４８１、ラクトバチラス・パラカゼイＪＣＭ１１６３、ラクトバチラス・ラムノサスＮＢＲＣ３４２５、ラクトバチラス・カゼイＪＣＭ１１３４、ＮＥＧＡ：ゲノムＤＮＡ無添加、ペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９、ＪＣＭ５８８６。
【図２】ペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株のコロニー形成数とＰＤＬ４ＬＢ４によるＬＡＭＰ法検出時間の近似曲線を示した図である。時間（Threshold time:分）は、濁度が０．１を超えたときの反応時間である。
【図３】各種乳酸菌のＬ-ＬＤＨ遺伝子部分配列の系統樹解析の結果を示した図である。
【図４】Ｌ−ＬＤＨ遺伝子のＯＲＦと、系統樹解析を行った領域（Phylogenetic tree）およびＬＡＭＰプライマーの設計領域（LAMP primer）との位置関係を示した制限酵素地図である。ＬＡＭＰプライマーの設計領域は配列番号６に対応する。
【発明の具体的説明】
【００１９】
プライマーおよびプローブ並びにプライマーセット
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３の４種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の６つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、３’末端側から５’末端側に向かって順番にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を作製する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００２０】
ＦＩＰは、標的配列のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２１】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００２２】
ＢＩＰは、標的配列のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２３】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００２４】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００２５】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を加速するためにループプライマー（ＬＦプライマーまたはＬＢプライマー）を１種類あるいは２種類追加してもよい。ループプライマーをＦ１−Ｆ２間の領域、あるいはＢ１−Ｂ２間の領域にアニールするように設計し、ＬＡＭＰ法反応系に追加して使用すると、これらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することにより、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される（例えば、特開２００２−３４５４９９号公報参照）。
【００２６】
具体的には、本発明のＬＡＭＰ法プライマーセットは、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００２７】
本発明では、配列番号１〜５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、プライマーやプローブとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーやプローブとして用いることができることはいうまでもない。
【００２８】
本発明では、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、プライマーやプローブとして用いることができる。
【００２９】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プローブ／プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブ／プライマーとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００３０】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００３１】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも３０塩基（例えば、３０〜７２塩基）、より好ましくは少なくとも４１塩基（例えば、４１〜６０塩基）、特に好ましくは少なくとも４３塩基（例えば、４３〜５４塩基）とすることができる。
【００３２】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも３０個、好ましくは少なくとも３８個、より好ましくは少なくとも４３個、特に好ましくは少なくとも４９個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００３３】
また、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１２塩基（例えば、１２〜２５塩基および１２〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも１７塩基（例えば、１７〜２５塩基および１７〜３０塩基）、特に好ましくは少なくとも１９塩基（例えば、１９〜２５塩基および１９〜３０塩基）とすることができる。
【００３４】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１７個、特に好ましくは少なくとも１９個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００３５】
相同ポリヌクレオチドおよび配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００３６】
相同ポリヌクレオチドは、更に、対応する塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００３７】
ここで「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【００３８】
配列番号１〜５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドの例を示すと以下の通りである。
・配列番号１の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１の連続する少なくとも４３個（４３〜７２個）、より好ましくは、少なくとも５４個（５４〜７２個）、更に好ましくは、少なくとも６０個（６０〜７２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号２の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２の連続する少なくとも１７個（１７〜２３個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２３個）、更に好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
・配列番号３の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号３の連続する少なくとも４３個（４３〜５４個）、より好ましくは、少なくとも４９個（４９〜５４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で７２塩基、好ましくは最大で６０塩基、より好ましくは最大で５４塩基とすることができる）。
・配列番号４の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号４の連続する少なくとも１７個（１７〜２２個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２２個）、更に好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２２個）のヌクレオチドのヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
・配列番号５の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号５の連続する少なくとも１７個（１７〜２１個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２３塩基とすることができる）。
【００３９】
本発明では、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号６の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
【００４０】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号６の塩基配列の相補配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００４１】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、更に、配列番号６の塩基配列の相補配列に１または数個の変異が導入された少なくとも１０塩基の改変塩基配列からなり、かつ配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列に１または数個の変異が導入された少なくとも１０塩基の改変塩基配列からなり、かつ配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００４２】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）として用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも４３個（例えば、４３〜５４塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で７２塩基、好ましくは最大で６０塩基、より好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００４３】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法プライマー（Ｆ３、Ｂ３、ＬＢ、およびＬＦ）として用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１９個（例えば、１９〜２３個および１９〜２５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００４４】
本発明においては、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペディオコッカス・ダムノサスを検出するためのＬＡＭＰ法プライマーセットを選択することができる。ＬＡＭＰ法は周知であり、当業者であればＬＡＭＰ法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種類のプライマー、すなわち、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、ＬＦおよびＬＢを使用することもできる。ＬＡＭＰ法においては、好ましくは、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種のプライマーのうち、少なくともＦＩＰおよびＢＩＰのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号６の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号６の３４０−４７６番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、ＬＡＭＰ法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号６の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号６の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号６の配列の外側の領域）に対合するように選択してもよい。
【００４５】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜２４個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２４個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００４６】
本発明においては、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペディオコッカス・ダムノサスを検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。ＰＣＲ法は周知であり、当業者であればＰＣＲ法プライマーペアを適宜選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号６の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号６の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号６の塩基配列またはその相補配列に対合し、他方のプライマーが配列番号６の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号６の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。ＰＣＲ法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号６の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号６の３４０−４７６番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
【００４７】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００４８】
本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M. et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００４９】
本発明によるプライマー、プローブ、およびプライマーセットは、それぞれ単独で使用しても、適宜組み合わせて使用してもよい。すなわち、本発明によるプライマー、プローブ、およびプライマーセットは、乳酸菌のうちペディオコッカス・ダムノサスを検出することができるが、他の乳酸菌（例えば、ラクトバチラス属乳酸菌）判定用プライマー、プローブ、およびプライマーセット（例えば、特開２００８−５７７９号公報および本願実施例１）や、ビール混濁乳酸菌判定用プライマー、プローブ、およびプライマーセット（例えば、特開２００８−５４６３２号公報）と組み合わせることにより、より正確に試料中の乳酸菌を同定できるとともに、試料の混濁可能性を判定することができる。
【００５０】
従って、本発明によるプライマー、プローブ、およびプライマーセットは、単独で、あるいは組み合わせて、キットの形態で提供することができる。従って、例えば、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットと、１以上の他のラクトバチラス属乳酸菌のＬＡＭＰ法プライマーセットと組み合わせて含んでなる、飲料（例えば、酒類）を混濁させる乳酸菌の検出キットが提供される。
【００５１】
ＬＡＭＰ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、反応用試薬混合液）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００５２】
ＰＣＲ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＰＣＲ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、精製水）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００５３】
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、酒類の品質低下の原因となるペディオコッカス・ダムノサスを正確に識別することができる。従って、本発明によるプライマーセットおよび本発明によるキットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒およびワイン）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【００５４】
ペディオコッカス・ダムノサスは、ビール、発泡酒およびワインの製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因乳酸菌種として見いだされることがある。従って、本発明によるプライマーセットおよび本発明によるキットは、好ましくは、ビール、発泡酒およびワインの品質管理に用いることができる。
【００５５】
検出方法および判定方法
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、ペディオコッカス・ダムノサスの検出に用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法が提供される。
【００５６】
ペディオコッカス・ダムノサスは各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒およびワイン）を混濁させる原因菌である。従って、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、ペディオコッカス・ダムノサスの検出のみならず、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒およびワイン）の混濁可能性の判定に用いることができる。すなわち、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットにより検出対象菌種が検出された場合には、混濁菌が試料中に存在していると、あるいは試料が混濁する見込みがあると判定することができる。従って、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、各種飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、各種飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００５７】
ここで、ハイブリダイゼーションの検出方法は周知であり、その検出のための装置、器具は市販のものを用いることができる。ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法など周知の核酸増幅法を使用して増幅産物の有無等を検出することにより、あるいはサザンブロット法など周知の核酸検出法を使用してハイブリダイゼーション複合体の有無等を検出することにより、実施することができる。
【００５８】
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００５９】
すなわち、本発明によれば、
（ａ）本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペディオコッカス・ダムノサスの存在を示す、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法が提供される。
【００６０】
本発明によれば、また、
（ａ）本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、各種飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００６１】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【００６２】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応については後述する。
【００６３】
試料中に検出対象菌種が存在する場合には、標的とする特定の領域が増幅され、増幅産物が生成する。増幅産物が生成した場合には、核酸増幅反応が実施された試料溶液が白濁することから、試料溶液の濁度を測定することにより増幅産物の有無を決定することができる。ＬＡＭＰ法における濁度の測定は周知であり、市販のエンドポイント濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−１００）やリアルタイム濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−２００）を用いて濁度の測定をすることができる。
【００６４】
後記実施例で示すように、試料溶液がある一定の濁度に達するまでの時間を測定することにより、検定試料中の菌体数を決定することができる。すなわち、本発明による検出方法の別の面によれば、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施するとともに、核酸増幅反応の開始から試料がある一定の濁度に達するまでの時間を測定し、その時間から検体中の菌体数を求める工程を含む、ペディオコッカス・ダムノサスの定量方法が提供される。具体的には、以下の通りである。
【００６５】
本発明によれば、
（ａ）本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｂ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および（ｂ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、ペディオコッカス・ダムノサスの定量方法が提供される。
【００６６】
本発明による定量方法においては、菌体数と一定の濁度に達するまでの時間との検量線を予め作成しておき、この検量線に基づいて、測定した時間から検体中の菌体数を求めることができる。検量線は、例えば、菌体を段階的に希釈した試料を準備し、それぞれについてＬＡＭＰ法による核酸増幅法を実施し、菌体のコロニー形成数の対数に対して、核酸増幅反応の開始から濁度が０．１になるまでの時間をプロットすることにより作成することができる。
【００６７】
本発明による検出方法および定量方法においては、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３からなるプライマーセットに、ループプライマー（ＬＦおよび／またはＬＢ）を追加して、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施してもよい。具体的には、本発明による検出方法および定量方法においては、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。
【００６８】
本発明による検出方法のうちＰＣＲ法による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＰＣＲ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００６９】
より具体的には、本発明によれば、
（ｃ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｄ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペディオコッカス・ダムノサスの存在を示す、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法が提供される。
【００７０】
本発明によれば、また、
（ｃ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｄ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、各種飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００７１】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【００７２】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＰＣＲ法による核酸増幅反応は周知であり、当業者であればＰＣＲ法およびその改変方法の実施条件等を適宜設定し、ＰＣＲ法を実施することができる。
【００７３】
本発明による検出方法のうちプローブによる検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対する本発明によるプローブのハイブリダイゼーションを実施した後、核酸複合体の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００７４】
より具体的には、本発明によれば、
（ｅ）本発明によるプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｆ）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペディオコッカス・ダムノサスの存在を示す、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法が提供される。
【００７５】
本発明によれば、また、
（ｅ）本発明によるプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｆ）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、各種飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００７６】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性元素（例えば、３２Ｐおよび１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、ＦＩＴＣ）、酵素反応に関与する分子（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。
【００７７】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体の検出に先立って、未結合プローブやハイブリダイズしないその他の成分を除去してもよい。
【００７８】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、ＬＡＭＰ法のみならず、ＬＡＭＰ法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。
【００７９】
ＬＡＭＰ法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、ＷＯ００／２８０８２号公報やNotomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
【００８０】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キットに従って実施することができるが、例えば、サンプルのＤＮＡ、プライマー溶液、および市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キット（例えば、栄研化学社製Loopamp ＤＮＡ増幅キット）で提供される試薬を、キットに添付されている説明書に従って混合して一定温度（６０〜６５℃）に保ち、一定時間（標準で１時間）反応させることにより実施できる。
【００８１】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
（ｉ）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（ii）ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（iii）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
（iv）ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
（ｖ）上記（iv）の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（vi）上記（ｖ）の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
（vii）上記（ｖ）の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
（viii）上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニ−リングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【００８２】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも用いることができる。
【００８３】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、約６０〜約６５℃（例えば６５℃）においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることができる。
【００８４】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットをＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の条件の下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株のターゲット領域が増幅される。このような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよく、また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出してもよい。
【００８５】
核酸増幅が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００８６】
ＰＣＲ法による核酸増幅反応
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して、ペディオコッカス・ダムノサスの識別に用いることができる。
【００８７】
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００８８】
ＰＣＲ法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
【００８９】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【００９０】
これらをＬＡＭＰ法やＰＣＲ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする乳酸菌株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする乳酸菌株を選択するためにシクロヘキシミドなどの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白 核酸 酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【００９１】
本発明によるプライマーセットおよびキットを用いたペディオコッカス・ダムノサスの検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【００９２】
まず、試料中に存在すると考えられるペディオコッカス・ダムノサスを適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法を実施し、ペディオコッカス・ダムノサスの特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は検出対象菌種の存在を示す。また、検出対象菌種の存在は、混濁菌が試料中に存在していること、あるいは試料が混濁する見込みを示す。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００９４】
実施例１：ＬＡＭＰ法プライマーセットによるペディオコッカス・ダムノサスの検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液を１００μｌ添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて中和し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。
（ｂ）ＬＡＭＰ用プライマー
以下のペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order（http://genome.e-mp.jp/index.html）、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００μＭの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、ＦＩＰ、ＢＩＰプライマー：１６μＭ、Ｆ３、Ｂ３プライマー：２μＭ、ＬＦ、ＬＢプライマー：８μＭとなるように混合し、希釈した。
［ペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーセット（ＰＤＬ４ＬＢ４）］
FIP：CCTTTCAATTTATAATTTCAGTACAAGTATAACACGTTAACATTTTTCAATAAATATGAGTTACTAAATACG （配列番号１）
F3： ACCAAATTTTTTTCGTCGCAATT（配列番号２）
BIP：TATTGTCTAATACACCAAATCATCAAAAAGTTGTGTTGAGCCATAGCAAATGCA （配列番号３）
B3： ACAAATTCTTCGGCAATTCCTT（配列番号４）
LB： GATGGCGCTGTTGGTTCTAGT（配列番号５）
なお、上記プライマーセットは、本発明者が取得したペディオコッカス・ダムノサスＪＣＭ５８８６株の新規Ｌ−ＬＤＨ遺伝子（配列番号６）のうち、プロモーター領域およびその周辺領域の塩基配列に基づいて設計した。
【００９５】
また、以下の乳酸菌判定用プライマーセットを準備し、菌種判定試験に供した。
【００９６】
［ラクトバチラス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）およびその近縁種検出用プライマーセット（ＬＣＮ３ＬＦ１）］
FIP CCGTTTTCTTACTTGGTTAAGTCCTCGGGAAGTCCAGTGATGGATGG（配列番号７）
F3 TGATCAGGTAGATAGGCTAGAAGT（配列番号８）
BIP GGTAGGAAAACGATATTATCTAGTTTTGAGAGATCCTTCAGGCTATCGCCA（配列番号９）
B3 TTCGGCATGGGAACAGGT（配列番号１０）
LF ACCGATTAGTACTAGTCCGCT（配列番号１１）
上記プライマーセットは、ラクトバチラス・パラコリノイデス（Lactobacillus paracollinoides）ＪＣＭ１１９６９株の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列（配列番号１２）に基づいて設計した。
【００９７】
［ラクトバチラス・バッキ（Lactobacillus backi）およびその近縁種検出用プライマーセット（ＨＭ６ＬＦ１ＬＢ１）］
FIP ACGGCACTTCCACTTCCAACTTCCTTTATGGAAGTAAGACCCCT（配列番号１３）
F3 CCCGCAAGATTAGATTTCCCA（配列番号１４）
BIP GTCGGAAACAATGTTTCCGCGTAGCTCTCAAAACTGGACCTTCT（配列番号１５）
B3 CCACACCACTATCTGAGAACTT（配列番号１６）
LF CTATCTACCTGATCATCTCTC（配列番号１７）
LB GTGTTCAAAGGTCAAAGAAAAT（配列番号１８）
なお、上記プライマーセットは、ラクトバチラス・バッキ近縁株であるビール工場分離株ＢＫ２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７９４）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子全体、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列（配列番号１９）に基づいて設計した。
【００９８】
［ラクトバチラス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）検出用プライマーセット（ＬＬ１２）］
FIP GGTCAGATCTATCGTCAAGCTGATGGCCTAAATAACATGCAAGTCGA（配列番号２０）
F3 TCAGGACGAACGTTGGC（配列番号２１）
BIP AACCTGCCCAGAAGAAGGGGTGGTTCTCGTTGTTATACGGT（配列番号２２）
B3 GAAGCGATAGCATAAAAGCCA（配列番号２３）
なお、上記プライマーセットは、特許第３６７７０５６号公報により明らかにされたラクトバチラス・リンドネリの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて設計した。
（ｃ）ＬＡＭＰ増幅反応溶液調製
ＬＡＭＰ法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Ｌｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムＤＮＡ溶液：２．５μｌ、プライマー溶液：２．５μｌ、２倍濃度反応用緩衝液：１２．５μｌ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ：１μｌ、滅菌水：６．５μｌを添加し、全量２５μｌの反応液を調製した。
（ｄ）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計ＬＡ−２００、あるいは栄研化学社製ＬＡ−３２０Ｃを使用した。反応チューブをセットし、６５℃一定（ボンネットは７５℃）で反応させ、その間の濁度変化を６秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
（ｅ）プライマーの評価
ペディオコッカス・ダムノサスに対して作成した菌種特異的なプライマーと、各種乳酸菌に特異的なプライマーについて乳酸菌の各種標準株等を使ってＬＡＭＰ法で特異性を評価した。結果は表１〜３に示される通りであった。
表１：各種乳酸菌標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応１００分以内に増幅なし、−−：反応８０分以内に増幅なし）
【表１】
表２：各種偏性嫌気性菌標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応１００分以内に増幅なし、−−：反応８０分以内に増幅なし）
【表２】
表３：ビール工場分離乳酸菌株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応１００分以内に増幅なし、−−：反応８０分以内に増幅なし）
【表３】
【００９９】
ＰＤＬ４ＬＢ４を用いた場合はペディオコッカス・ダムノサスの菌株に、反応開始６０分程度でＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた。特に、ＰＤＬ４ＬＢ４プライマーは、海外の菌株保存機関のペディオコッカス・ダムノサス保存株や工場分離株等、分離元が異なる株を特異的に検出できた。一方で、検査対象以外の乳酸菌標準株（同じペディオコッカス属のペディオコッカス・ダムノサス以外の7菌種を含む）、偏性嫌気性菌標準株、ビール工場分離乳酸菌を使用してＰＤＬ４ＬＢ４プライマーの特異性を評価したところ、ペディオコッカス・ダムノサス以外からは増幅は見られなかった。
【０１００】
ＬＣＮ３ＬＦ１を用いた場合はラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種であるラクトバチラス・パラコリノイデス等の菌株に、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた。ＨＭ６ＬＦ１ＬＢ１を用いた場合はラクトバチラス・バッキおよびその近縁種に、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた。ＬＬ１２を用いた場合はラクトバチラス・リンドネリに、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた。
【０１０１】
さらに、ＬＣＮ３ＬＦ１、ＨＭ６ＬＦ１ＬＢ１、ＬＬ１２について、検査対象以外の乳酸菌標準株、偏性嫌気性菌標準株、ビール工場分離乳酸菌を使用して各プライマーの特異性を評価したところ、各プライマーが検査対象にしている株以外からはほとんど増幅が見られなかった。
【０１０２】
以上により、本発明によるプライマーセットは、検査対象とするペディオコッカス・ダムノサスを菌種レベルで正確に検出できることが示された。本発明によるプライマーを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけでペディオコッカス・ダムノサスを正確に検出することができる。また、本発明によるプライマーセットを他の乳酸菌検出用プライマーセットと組み合わせることにより、乳酸菌の菌種判定をより正確に行うことができる。
【０１０３】
実施例２：特許文献にあるプライマーの評価
（ａ）特許文献のプライマー
土屋らの特許文献（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）に記載されていた以下のペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーセット（ＳＰＤ１）について、実施例１（ｂ）と同様にＬＡＭＰ法用プライマー溶液を調製した。ペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーセット（ＳＰＤ１）は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的としている。
［ペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーセット（ＳＰＤ１）］
FIP： GAAATCATCTTCGATGCAAGCTAGGACGCACTTTCGTTGATTGAA（配列番号２４）
F3： TGGAGAGTTTGATCCTGGCTC（配列番号２５）
BIP： ATTTTTAAAAGATGGCTTCGGCGGTGAGCCTTTATCTCACCAA（配列番号２６）
B3： GCTGCTGGCACGTAGTTAGCC（配列番号２７）
LB： CTGGATGGACCCGCGGCGT（配列番号２８）
実施例１（ｃ）および（ｄ）の記載に従って、上記プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により各種菌株の検出を行った。結果は図１に示される通りであった。
（ｂ）プライマーの評価
その結果、ＳＰＤ１は試験した乳酸菌株のいくつかの菌種と反応し、特異性が低いと考えられた。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の設計に使用された配列の菌種特異性が低く、交差反応したと考えられた。
【０１０４】
実施例３：ＬＡＭＰ法の検出限界
ＬＡＭＰ法の増幅効率を検討するために、ｍ−ＮＢＢ液体培地で培養したペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株の菌体を遠心分離して集菌し、その菌体を滅菌水に懸濁し、段階的に希釈して上記した方法でＤＮＡ抽出し、これをＬＡＭＰ法に供した。その結果、ＬＡＭＰ法では１０２ｃｆｕレベルの少ない菌体量からも増幅が観察された。
【０１０５】
また、菌体の各段階の希釈液から抽出したゲノムＤＮＡを使ったときにＬＡＭＰ反応で濁度が０．１を越えた時間を検出時間として、各プライマーの検出時間とコロニー形成数の対数をグラフにしたところ、累乗近似によりある程度高い相関係数の近似曲線を描くことが出来た（Ｒ２＝０．９８５）。ＰＤＬ４ＬＢ４について得られた近似曲線は図２に示される通りである。また、各プライマーの検出限界と検量線の相関係数との関係は下記に示される通りである。これを検量線とすることにより、１０２−１０７ｃｆｕの範囲で、サンプル中のペディオコッカス・ダムノサスの存在を定量的にある程度推測することが可能であることが示された。
【０１０６】
［プライマーの検出限界と検量線の相関係数］
検出限界 検量線近似式 検量線相関係数（Ｒ２）
ＰＤＬ４ＬＢ４ 1.6x102 cfu y = 3340.4x-1.6641 0.985
【０１０７】
実施例４：ビールからの検出
ビール製造工程中では、多くの場合、麦汁に下面発酵酵母を多量に添加して発酵させるが、外部から汚染する乳酸菌の菌数は製造用酵母に比べると非常に少ない。ビールに下面発酵酵母を懸濁させた液からの乳酸菌の検出限界について検討した。ｍ−ＮＢＢ固体培地で培養したペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株の菌体を白金耳でかき取り、滅菌水に懸濁後、段階的に希釈して遠心分離し、その菌体にビールに多量の下面発酵酵母を懸濁させた液を添加して懸濁させた。その後、１回集菌洗浄し、実施例１（ａ）に記載した方法でまとめてＤＮＡ抽出し、ＰＤＬ４ＬＢ４を使ったＬＡＭＰ法でペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株が検出可能かどうか検討した。その結果、ビールによる反応阻害および下面発酵酵母の存在に関係なく、滅菌水に懸濁した場合とほとんど同じ検出限界（１０２ｃｆｕレベル）でペディオコッカス・ダムノサスが検出できることがわかった。なお、同様の実験で下面発酵酵母を懸濁していないビールからの検出も検討し、同じ検出限界で検出できることを確認した。
【０１０８】
ペディオコッカス・ダムノサスの検出限界
ビール＋下面発酵酵母（1 x 107 cells） 6.9 x 102 cfu
【０１０９】
実施例５：ワインからの検出
ペディオコッカス・ダムノサスはワイン中でも増殖し、中には粘性のある多糖を生産して品質を著しく低下させる菌株もあると報告されている。赤ワインからの乳酸菌の検出限界について検討した。ｍ−ＮＢＢ固体培地で培養したペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株の菌体を白金耳でかき取り、フィルター除菌した赤ワインに懸濁後、同じ赤ワインで段階的に希釈した。そのチューブを遠心分離し、上澄みを捨てて沈殿を得た。その後、１回滅菌水で集菌洗浄し、実施例１（ａ）に記載した方法でＤＮＡ抽出したゲノムＤＮＡ溶液と、１回５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液で集菌洗浄して得られた沈殿をさらに１回滅菌水で集菌洗浄し、実施例１（ａ）に記載した方法でＤＮＡ抽出したゲノムＤＮＡ溶液をそれぞれ作成し、ＰＤＬ４ＬＢ４を使ったＬＡＭＰ法でペディオコッカス・ダムノサスＤＳＭ２０２８９株が検出可能かどうか検討した。尚、ＬＡＭＰ法での増幅の観察は１８０分まで行った。その結果、上述した方法で２回集菌洗浄した場合に検出限界は滅菌水の場合と同レベル（１０２ｃｆｕレベル）となった。集菌洗浄を２回にしたことで洗浄効率が高まったことと、ＥＤＴＡ溶液を用いることにより赤ワインが低ｐＨであることや金属イオンの存在の影響を取り除くことが出来たことが効果的であったと考えられる。
【０１１０】
赤ワインからのＰＣＲ法、およびリアルタイムＰＣＲ法による検出限界は、それぞれ１０２ｃｆｕレベル、１０１ｃｆｕレベルとされており（Gindreau, E. et al. Journal of Applied Microbiology 2001, vol. 90, 535-542、Delaherche, A. et al. Journal of Applied Microbiology 2004, vol. 97, 910-915）、今回のＬＡＭＰ法による検出限界はそれらと同等か若干悪い値となったが、これらの報告ではワイン中のポリフェノールを除く為のＰＶＰ処理を行う等４時間以上かかるＤＮＡ精製作業を行ったり、高価なリアルタイムＰＣＲ用のサーマルサイクラー等を使っている。上記手法では安価な試薬を用いた簡便なＤＮＡ抽出法を用いており、ＤＮＡ精製法の改良で検出限界はより改善する可能性があるが、製造現場で行うことを想定したこのような簡便なＤＮＡ抽出方法とより安価な検出装置を用いたＬＡＭＰ法でも同程度の検出感度で検査が出来ることが分かった。
【０１１１】
ペディオコッカス・ダムノサスの検出限界
滅菌水懸濁液 1.6x102 cfu
赤ワイン懸濁液（集菌洗浄１回） 2.8x103 cfu
赤ワイン懸濁液（集菌洗浄２回） 1.9x102 cfu
【０１１２】
実施例６：系統樹解析
各種乳酸菌株のＬ-ＬＤＨ遺伝子配列を決定し、系統樹解析することで菌種判定に有効であるかどうかを調べた。すなわち、各種乳酸菌株のＬ−ＬＤＨ遺伝子の部分配列のうち上流側約４５０塩基の塩基配列を決定し、系統樹を作成した。系統樹解析にはCLUSTAL Wソフトウェアを使用した。
その結果、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子の系統樹（図３）は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の系統樹（Zhang B. et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, vol.55, pp.2167-2170(2005)）と近似していることが判明した。すなわち、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子の塩基配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と同様に菌種同定に使用できることが確認された。但し、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子の部分配列のうち上流側約４５０塩基の塩基配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と同様に各菌種間の相同性が比較的高かったため、本発明ではこの部分配列よりも外側（５’上流側）の遺伝子配列も判読し、菌種間で差がより大きい領域（特にプロモーター領域）を見出し、ＬＡＭＰプライマーを設計した（図４）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）検出用プローブまたはプライマー。
【請求項２】
請求項１に記載の二種以上のプライマーからなる、ペディオコッカス・ダムノサス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項３】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項２に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項３に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項５】
請求項１に記載の二種以上のプライマーからなる、ペディオコッカス・ダムノサス検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項６】
配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマーまたは請求項３または４に記載のプライマーセット。
【請求項７】
配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマーまたは請求項３または４に記載のプライマーセット。
【請求項８】
配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマーまたは請求項３または４に記載のプライマーセット。
【請求項９】
請求項１に記載のプローブまたはプライマー、請求項２〜４のいずれか一項に記載のプライマーセット、または請求項５に記載のプライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【請求項１】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）検出用プローブまたはプライマー。
【請求項２】
請求項１に記載の二種以上のプライマーからなる、ペディオコッカス・ダムノサス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項３】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項２に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項３に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項５】
請求項１に記載の二種以上のプライマーからなる、ペディオコッカス・ダムノサス検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項６】
配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマーまたは請求項３または４に記載のプライマーセット。
【請求項７】
配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマーまたは請求項３または４に記載のプライマーセット。
【請求項８】
配列番号１〜６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマーまたは請求項３または４に記載のプライマーセット。
【請求項９】
請求項１に記載のプローブまたはプライマー、請求項２〜４のいずれか一項に記載のプライマーセット、または請求項５に記載のプライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−８１９３５（Ｐ２０１０−８１９３５Ａ）
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０２６０４（Ｐ２００９−２０２６０４）
【出願日】平成２１年９月２日（２００９．９．２）
【出願人】（３０７０２７５７７）麒麟麦酒株式会社 (350)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２日（２００９．９．２）
【出願人】（３０７０２７５７７）麒麟麦酒株式会社 (350)
【Ｆターム（参考）】
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