ペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法
【課題】 本発明は、例えば生きた細胞の観察、分析及び処理に適し、蓋体を装着したままで蛍光観察と微分干渉観察を併用することができるペトリディッシュを提供する。
【解決手段】
蓋体１０と容器体２０とを備え、これら蓋体１０と容器体２０の双方に互いに対向する透孔１１，２１をそれぞれ形成し、これら透孔１１，２１を光の透過が可能な板部材１２，２２によってそれぞれ閉塞した構成とする。少なくとも蓋体１０の板部材１２は、その自家蛍光を抑えるとともに光学的に均質処理した構成とし、好ましくは、蓋体１０の透孔１１を、容器体２０の透孔２１のより大きくした構成とする。
【解決手段】
蓋体１０と容器体２０とを備え、これら蓋体１０と容器体２０の双方に互いに対向する透孔１１，２１をそれぞれ形成し、これら透孔１１，２１を光の透過が可能な板部材１２，２２によってそれぞれ閉塞した構成とする。少なくとも蓋体１０の板部材１２は、その自家蛍光を抑えるとともに光学的に均質処理した構成とし、好ましくは、蓋体１０の透孔１１を、容器体２０の透孔２１のより大きくした構成とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば生きた細胞の観察、分析及び処理に適し、蓋体を装着したままで蛍光観察と微分干渉観察を併用することができるペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法の提供を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
図８は従来の一般的なガラスボトムのペトリディッシュを示す断面図である。同図において、従来のペトリディッシュ１００は、主として透明なスチロール樹脂等からなる蓋体１１０と容器体２０とからなり、容器体２０の底部に形成した透孔２１にガラススリップ２２を接着した構成となっていた。これら蓋体１１０の上面と容器体２０の下面とには、それぞれ円環状の高台１１１及び２３が一体的成形してあり、これら蓋体１１０の上面と容器体２０の下面とに傷が付くのを防止している。なお、蓋体１１０の高台１１１の内径を、容器体２０の高台２３の外径よりも大きくして、複数のペトリディッシュ１００を重ねて置けるようにしてある。
【０００３】
このようなペトリディッシュ１００を用いて培養細胞等の試料３１を処理、観察又は分析する場合は、容器２０内を培養液やバッファ又は生理食塩水等の溶液（メディウム）３２で満たすとともに、ガラススリップ２２に前記試料３１を植え付ける。その後、容器２０に蓋体１１０を装着することによって、溶液３２へのゴミや不要物の混入、及び、溶液３２の蒸発を防ぐ。
【０００４】
次に、上記ペトリディッシュ中の試料を正立顕微鏡で観察する場合について図８及び図９を参照しつつ説明する。図９は正立顕微鏡を示す概略図である。同図において、正立顕微鏡２００における試料３１の照明光の投下方法には、透過照明と反射又は落射照明の２種類がある。
【０００５】
まず、透過照明について説明すると、光源２０１から出射された照明光は、鏡基２０２を通って照明レンズ２０３を透過し、コンデンサレンズ２０４により集光された後、ペトリディッシュ１００の下面側からステージ２０５上に載置した試料に到達する。その後、試料３１を透過した光、又は試料３１から出た光は対物レンズ２０６に到達し、鏡筒２０７を経て接眼レンズ２０８から観察されるか、図示しない撮像装置で記録される。なお、ペトリディッシュ１００の蓋体１１０を外して容器体２０内の溶液３２に直接、対物レンズ２０６の先端を浸して観察する方法も行われている。
【０００６】
次いで、反射又は落射照明について説明すると、光源２０９から出射された照明光は、投光管２１０を経て対物レンズ２０６に到達する。該対物レンズ２０６により試料３１に集光された光は、該試料３１により反射、散乱、又は蛍光励起されて再び対物レンズ２０６に戻り、投光管２１０を通過して鏡筒２０７を経て接眼レンズ２０８から観察されるか、前記撮像装置で記録される。
【０００７】
次に、上記ペトリディッシュ中の試料を倒立顕微鏡で観察する場合について図８及び図１０を参照しつつ説明する。図１０は倒立顕微鏡を示す概略図である。同図において、倒立顕微鏡３００も上記と同様、試料３１の照明光の投下方法に、透過照明と反射又は落射照明の２種類を採用している。
【０００８】
まず、透過照明について説明すると、光源３０１から出射された照明光は、透過照明支柱３０２に取り付けた投光管３０３を経てコンデンサレンズ３０４を透過し、ステージ３０５上に載置したペトリディッシュ１００内の試料３１に集光される。試料３１を透過した光、又は試料３１から出た光は、対物レンズ３０６に到達し、鏡体３０７を経て接眼レンズ３０８から観察されるか、前記撮像装置で記録される。
【０００９】
次いで、反射又は落射照明について説明すると、光源３０９から出射された照明光は、鏡体３０７を経て対物レンズ３０６に到達する。該対物レンズ３０６によって試料３１に集光された光は、該試料３１により反射，散乱，又は蛍光励起されて再び対物レンズ３０６に戻り、鏡体３０７を経て接眼レンズ３０８から観察されるか、前記撮像装置で記録される。
【００１０】
このような正立顕微鏡２００又は倒立顕微鏡３００を用いた試料３１の処理、観察又は分析では、ペトリディッシュ１００の容器体２０の底面がスチロール樹脂等の樹脂の方がガラスよりも細胞の定着性が良好であるが、光学的にはガラスの方が好都合であることが多い。
【００１１】
例えば、試料３１となる細胞は、光学的に透明に近く、明視野透過照明観察ではコントラストがつき難い。そこで、位相差観察や微分干渉観察が行われるのであるが、位相差観察の場合は、容器体２０の底面が透明樹脂製であると、該透明樹脂と細胞膜との角度が９０°に近い程過剰なコントラストを生じてハーレーションが現れてしまう。一方、微分干渉観察の場合は、容器体２０の底面が透明樹脂製であると、微分干渉観察のコントラストの要素であるシアリング量が均一にならない。このような透明樹脂の光学的な不均質性がコントラストを生み、細胞のイメージと重なり、目的の細胞観察が行えないという不都合を生じる。
【００１２】
また、上述のような光学顕微鏡観察を行うために試料３１を支持するには、該支持部材が光学的に均質な性質を有している必要であり、さらに、分析や処理を行うためには熱的に安定であることが要求される。これに加え、試料３１が生体や細胞である場合では、該試料３１への影響が少ない性質であることが必要である。そこで、上記構成からなるガラスボトムのペトリディッシュ１００を採用し、細胞に代表される透明性の高い試料３１の観察が可能となった。
【００１３】
このようなガラスボトムのペトリディッシュ１００を用いて、哺乳動物の細胞分裂における染色体と微小管の挙動に関する研究論文を下記非特許文献として挙げる。該非特許文献の379ページに35mm径のガラスボトム培養ディッシュ内の細胞を油浸（オイル）対物レンズで観察する方法と装置が開示されている。
【非特許文献１】Tokuko Haraguchi, Toru Kaneda, Yasushi Hiraoka [Dynamics of chromosomes and microtubules visualized by multiple-wavelength fluorescence imaging in living mammalian cell: effects of mitotic inhibitors on cell cycle progression] Genes to cell (1997) 2, 369-380
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述した従来のペトリディッシュ１００の容器２０内を培養液等の溶液３２で満たした場合は、液表面の波、蒸発による濃度変化や濃度勾配の発生、蒸発の二次的効果による対流の影響がない、又は少なければならない。したがって、このような外部からの影響を遮断するために蓋体１１０は必須といえる。一方で、生きた細胞の所定部分（例えば、核など）を蛍光観察する場合に、位相差観察、ホフマン観察、又は微分干渉観察を併用して細胞全体の形態を観察することが行われている。
【００１５】
しかし、透明樹脂製の蓋体１１０を装着したままで微分干渉観察を行うと、該透明樹脂の光学的性質が不均質であるために偏光が生じてしまい、蓋体１１０を介した試料３１への集光が適正に行えず、又は蓋体１１０を介した観察では十分な解像が得られず、結局、蓋体１１０を外さなければ微分干渉観察を行うことができないという問題があった。
【００１６】
すなわち、微分干渉観察は、偏光を使った光学系であるため、光路途中に歪みや組成等に起因する光学的性質が不均質なプラスチック部材が介在すると、解像（ないし見え方）が著しく悪くなる。このため、従来のガラスボトムのペトリディッシュ１００を使用して蛍光観察と微分干渉観察を併用する場合は蓋体１１０を取り外さなければならない。
【００１７】
ところが、生きた細胞の観察において、蓋体１１０を取り外すことは雑菌の混入につながるため、数時間程度の短時間の観察に限られてしまう。また、一度蓋体１１０を開けて観察したペトリディッシュ１００は雑菌が繁殖してしまうおそれがあるため、その後の形態の観察に期待できない。ここで、溶液３２に抗生物質を添加する手法もあるが、試料たる細胞への影響が懸念され、近年では敬遠されている手法である。このため、生きた細胞を数日に渡って観察する場合は、該細胞の所定部分を蛍光観察するとともに、該蛍光観察用の対物レンズを使用して、前記細胞の全体の外観形状を、わずかなコントラストのある画像か、対物外位相差観察するほかなかった。
【００１８】
また、高倍の対物レンズを使用する場合では、対物レンズのワーキングディスタンス（ＷＤ）が短い。例えば、100倍の対物レンズのＷＤは0.15ｍｍ程度のものがある。これに対応するコンデンサレンズのＷＤは0.7ｍｍ程度になる。このため、ペトリディッシュ１００の蓋体１１０が厚さ0.5〜1ｍｍ程度の透明樹脂で形成されているならば、もはや微分干渉観察を行うことができないという問題もあった。
【００１９】
なお、蛍光観察と位相差観察又はホフマン観察とを組み合わせた場合は、オイル対物の使用を前提とする蛍光観察から、ドライタイプの対物レンズの使用を前提とする位相差観察又はホフマン観察に切り替えるときに、今まで観察していた領域がずれてしまったり、蛍光観察時の残留オイルの付着によって位相差観察又はホフマン観察時に結像不良が生じてしまったりするという問題があった。また、対物レンズの交換をなくすために、位相差観察又はホフマン観察と同じ対物レンズで蛍光観察を行うと、対物レンズ内のスリット、位相膜又はナイフエッジ等のモジュレータによる光量ロスが発生してしまうという問題がある。
【００２０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、蓋体を装着したままで蛍光観察と微分干渉観察を併用することができるとともに、当該微分干渉観察においてコンデンサレンズと対物レンズ間の空気層をなくすことができ、高解像度及び高倍の微分干渉観察と蛍光観察の併用が可能となるペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記目的を達成するために、本発明の第１のペトリディッシュは、蓋体と容器体とを備え、少なくとも前記蓋体に透孔を形成し、該透孔を光の透過が可能な板部材によって閉塞した構成としてあり、好ましくは、前記蓋体と容器体の双方に互いに対向する透孔をそれぞれ形成し、これら透孔を前記板部材によってそれぞれ閉塞した構成とする。
【００２２】
上記目的を達成するために、本発明の第２のペトリディッシュは、蓋体と容器体とを備え、前記蓋体に、前記容器体の内側に向かって突出する透孔部を形成し、該透孔部の下端開口を光の透過が可能な板部材によって閉塞するとともに、前記容器体に、前記透孔部に対向する透孔を形成し、該透孔を光の透過が可能な他の板部材によって閉塞した構成としてある。
【００２３】
より好ましくは、上記第１及び第２のペトリディッシュにおいて、前記板部材の自家蛍光を抑えた構成、若しくは、前記板部材を光学的に均質処理したガラスとした構成、若しくは、前記板部材を石英ガラスとした構成、又は、前記蓋体の透孔を、前記容器体の透孔のより大きくした構成とする。
【００２４】
上記目的を達成するために、本発明のチャンバー装置は、上記ペトリディッシュにおける、前記蓋体に溶液の供給と排出を行うための少なくとも２本のパイプを貫通させ、これらパイプを通じて前記容器体内に入れた前記溶液を循環させた構成としてあり、好ましくは、前記蓋体に前記溶液以外の添加物質を前記容器体内に供給するための他のパイプを貫通させた構成とする。
【００２５】
上記目的を達成するために、本発明の光学顕微鏡観察方法は、上記ペトリディッシュ又はチャンバー装置における、前記蓋体の板部材の上方から前記容器体内に照明光を照射するとともに、該容器体の板部材の下方から対物レンズによって試料の観察を行うようにしている。好ましくは、前記照明光を試料に集光させるためのコンデンサレンズと前記蓋体の板部材との間にオイル又は液体を介在させ、前記試料の観察を、蛍光観察と微分干渉観察との併用とする。上記目的を達成するために、本発明の試料分析方法は、上記光学顕微鏡観察方法により得た観察画像に基づいて前記試料の分析を行うようにしている。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法によれば、ペトリディッシュ又はチャンバー装置における蓋体の板部材を介して偏光のない照明光を試料に照射することができる。これにより、蓋体を取り外すことなく、一般的なオイル対物レンズを使用して、生きた細胞の蛍光観察と微分干渉観察を行うことが可能となる。また、蓋体を取り外すことがないので、生きた細胞の蛍光観察と微分干渉観察を長時間に渡って行った場合でも該細胞が劣化しないという効果を奏する。
【００２７】
さらに、ペトリディッシュ又はチャンバー装置における蓋体に、容器体の内側に向かって突出する透孔部を形成し、該透孔部の下端開口を光の透過が可能な板部材によって閉塞した場合は、該蓋体の板部材が容器体内の溶液に浸かり、該板部材と試料の間に存在していた空気層をなくすことができ、照明光の集光にオイルコンデンサレンズを用いることによって、これまで生きた細胞の蛍光観察と併用が不可能であった高解像、高倍の微分干渉観察が可能となる。
【００２８】
これに加え、本発明のチャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法によれば、容器体内の溶液を一定の成分、濃度、温度に保つとともに、該容器体内の溶液を新鮮に保つことができる。また、あらかじめ設定した時間、濃度、量の添加物質をパイプから供給することにより、試料たる生きた細胞に刺激を与え、又は環境変化への反応を知るための実験を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の実施形態に係るペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法について図面を参照しつつ説明する。まず、本発明の第１実施形態に係るペトリディッシュについて、図１を参照して説明する。図１は本発明の第１実施形態に係るペトリディッシュを示す断面図である。なお、上述した従来技術と同様の箇所については、同一の符号を付して詳細な説明は省略する。
【００３０】
同図において、本実施例のペトリディッシュ１は、透明なスチロール樹脂等からなる蓋体１０と容器体２０とからなっている。蓋体１０のほぼ中央には円形の透孔１１が形成してある。該透孔１１は、容器体２０の底部に形成した透孔２１と対向する位置関係を有しており、その裏側（容器体２０側）から光の透過が可能な板部材１２を接着することにより閉塞してある。
【００３１】
該板部材１２は、その偏光や複屈折などの光学的な解像低下要因を低減するために、自家蛍光を抑え、且つ光学的に均質処理したものが好ましい。例えば、自家蛍光を抑えるために、極めて肉厚の薄い板ガラス、無蛍光材により形成した板ガラスなどを用いることができる。また、光学的な均質処理として、板部材１２の波長選択性を低減するために反射防止膜を施すこと、歪みをなくすこと、光学的性質を均質にしやすい組成物を使用すること、内部応力を均一化することなどを挙げることができる。このような観点から、板部材１２の材料としては、化学的に合成した不純物の少ない合成石英ガラスが好ましい。但し、容器体２０の板部材２２と同様のガラススリップであっても十分な解像を得ることが可能である。なお、蓋体１０の板部材１２と、容器体２０の板部材２２とは、観察方法に応じて光学的、熱的又は形状的に同じ材質の場合もあれば、異なる材質の場合もある。
【００３２】
一方、板部材１２を透孔１１に固定するための接着剤としては、膨潤性と自家蛍光性をともに有しないもの、又は目的に応じていずれか一方のみを有しないものが望ましく、蓋体１０と板部材１２の接合面を全て該接着剤で満たした構成、又は、少量の接着剤により気密及び水密を確保することができる最低限の範囲で封止した構成としてもよい。なお、これら蓋体１０と板部材１２の接合は、接着剤による接着に限らず、熱接合などの他の接合手段によることもできる。
【００３３】
また、透孔１１と板部材１２の形状は、本実施形態の如き円形に限らず、例えば、矩形や楕円形などとしてもよい。但し、透孔１１から入射される照明光の一部が容器体２０内の試料３１に到達する途中で遮られることのない形状及び大きさとする必要がある。したがって、蓋体１０の透孔１１の直径Ｌ1を、容器体２０の透孔２１の直径Ｌ2と同じ又は大きくすることが望ましい。ここで、図２は上記ペトリディッシュ１の変更例を示す断面図であり、同図に示すように、蓋体１０の板部材１２は、透孔１１の表側から接着又は接合してもよい。
【００３４】
次に、本発明の第１実施形態に係る光学顕微鏡観察方法について、図３を参照しつつ説明する。図３は本発明の第１実施形態に係る光学顕微鏡観察方法を説明するための概略図である。
【００３５】
本実施形態では、図２に示すペトリディッシュ１と、図１０に示す倒立顕微鏡３００とを用いて試料３１の蛍光観察と微分干渉観察を行う。まず、図１０に示す倒立顕微鏡３００のステージ３０５に本ペトリディッシュ１を載置する。次いで、図３に示すように、本ペトリディッシュ１における蓋体１０の板部材１２の上方から容器体２０内に照明光Ｓを照射するとともに、該容器体２０の板部材２２の下方から対物レンズ３０６によって試料３１の蛍光観察と微分干渉観察を同時ないし交互に行う。なお、板部材２２と対物レンズ３０６の相互間（間隔＝約0.1mm）はオイル３０６ａで満たしてある。その後、このような蛍光観察と微分干渉観察により得た観察画像に基づいて試料３１の分析を行う。
【００３６】
このような本実施形態のペトリディッシュ及び光学顕微鏡観察方法によれば、蓋体１０の板部材１２を光学的に均質としたことによって、該板部材１２を介して偏光のない照明光を試料３１に照射することができる。これにより、蓋体１０を取り外すことなく、一般的なオイル対物レンズを使用して、生きた細胞の蛍光観察と微分干渉観察を行うことが可能となる。また、蓋体１０を取り外すことがないので、生きた細胞の蛍光観察と微分干渉観察を長時間に渡って行った場合でも該細胞が劣化しないという効果を奏する。
【００３７】
また、光学的に均質な板部材１２を透過した照明光により良好な微分干渉観察、又は蛍光観察と微分干渉観察の観察画像を得ることができるので、該観察画像に基づいて試料３１の分析が良好に行えるようになる。
【００３８】
次に、本発明の第２実施形態に係るペトリディッシュについて、図４を参照して説明する。図４は本発明の第２実施形態に係るペトリディッシュを示す断面図である。なお、上述した実施形態と同様の箇所については、同一の符号を付して詳細な説明は省略する。
【００３９】
同図において、本実施例のペトリディッシュ２は、蓋体４０に、容器体２０の内側に向かって突出する円筒状の透孔部４１を形成し、該透孔部４１の下端開口４１ａを光の透過が可能な板部材４２によって閉塞した構成としてある。このような構成により、蓋体４０の板部材４２が容器体２０内の溶液３２に浸かり、該板部材４２と試料３１の間に存在していた空気層をなくしている。また、該板部材４２と試料３１の間隔は約1.5mm程度に設定してある。
【００４０】
なお、上記第１実施形態と同様に、板部材４２は、その偏光や複屈折などの光学的な解像低下要因を低減するために、自家蛍光を抑え、且つ光学的に均質処理したものが好ましい。また、照明光の入射損失を防止するために蓋体４０の透孔部４１の直径Ｌ1を、容器体２０の透孔２１の直径Ｌ2と同じ又は大きくすることが望ましい。
【００４１】
次に、本発明の第２実施形態に係る光学顕微鏡観察方法について、図５を参照しつつ説明する。図５は本発明の第２実施形態に係る光学顕微鏡観察方法を説明するための概略図である。
【００４２】
上記第１実施形態と同様に、図４に示すペトリディッシュ２と、図１０に示す倒立顕微鏡３００とを用いて試料３１の蛍光観察と微分干渉観察を行うが、本実施形態では、コンデンサレンズ３０４と蓋体４０の板部材４２の相互間（間隔＝約0.1mm）をオイル３０４ａで満たしたオイルコンデンサレンズを使用している。
【００４３】
まず、図１０に示す倒立顕微鏡３００のステージ３０５に本ペトリディッシュ２を載置する。次いで、図５に示すように、本ペトリディッシュ２における蓋体４０の透孔部４１にコンデンサレンズ３０４を挿入し、オイル３０４ａ及び板部材４２を介して容器体２０内に照明光Ｓを照射する。一方で、該容器体２０の板部材２２の下方から対物レンズ３０６によって試料３１の蛍光観察と微分干渉観察を同時ないし交互に行う。その後、このような蛍光観察と微分干渉観察により得た観察画像に基づいて試料３１の分析を行う。
【００４４】
このような本実施形態のペトリディッシュ及び光学顕微鏡観察方法によれば、ペトリディッシュ２における蓋体４０の板部材４２が容器体２０内の溶液３２に浸かり、該板部材４２と試料３１の間に存在していた空気層をなくすことができ、オイルコンデンサレンズの使用と相まって、これまで生きた細胞の蛍光観察と併用が不可能であった高解像の微分干渉観察が可能となる。
【００４５】
詳述すると、図１及び図２に示すような、板部材１２と空気の界面、及び空気と溶液３２の界面は屈折率差、すなわち、反射率と屈折率が大きい。反射率が大きいことは試料３１に到達する光量が減少し、かつ、屈折率が大きいことは収差が大きく、焦点でのエアリーディスクが大きくなって空間分解能が落ちることを意味する。
【００４６】
本実施形態のペトリディッシュ２の如く、蓋体４０の板部材４２が容器体２０内の溶液３２が浸かれば、反射率と屈折率が大きい２つの界面を排除することができ、反射率と屈折率の小さい板部材４２と溶液３２の界面のみが残ることになる。そして、該界面の影響は、板部材４２と溶液３２の屈折率を同じ又は極めて近い値とすることにより無視することができる。
【００４７】
これに加え、オイルコンデンサレンズは、高いＮＡ(開口角)の照明が可能であり、これがシングルセルの観察に適した照明を可能にする。また、コンデンサレンズ３０４と対物レンズ３０６の間には空気層が一切介在しない。この結果、高倍の観察に適した照明と、微弱な蛍光を検知するような観察とが可能となる。
【００４８】
なお、上記実施形態では、コンデンサレンズ３０４と、蓋体４０の板部材４２との間にオイルを介在させているが、該板部材４２の表面に凹部を形成してオイルその他の液体を保持するようにしてもよい。また、コンデンサレンズの切り替えや作動距離（ＷＤ）を考慮して、蓋部４０における透孔部４１の直径を大きくするとともに、その深さを浅くすることにより、該コンデンサレンズの焦点位置を上下に移動することなく、交換又は切り替え可能とすることができる。
【００４９】
次に、本発明の一実施形態に係るチャンバー装置について、図６を参照して説明する。図６は本発明の一実施形態に係るチャンバー装置を示す断面図である。なお、上述した実施形態と同様の箇所については、同一の符号を付して詳細な説明は省略する。
【００５０】
同図において、本実施形態のチャンバー装置３は、図２に示す本ペトリディッシュ１の蓋体１０に２つの貫通孔１４，１５を穿設するとともに、これら貫通孔１４，１５のそれぞれにパイプ５１，５２を挿通し、前記貫通孔１４，１５をそれぞれシール部材６１，６２で封止した構成としてある。
【００５１】
パイプ５１は、容器体２０内に溶液３２を供給するためのものであり、また、パイプ５２は、容器体２０内の溶液３２を排出するためのものである。これらパイプ５１，５２をガラス、金属又はプラスチック製とし、図示しない溶液循環装置のポンプに接続して、容器体２０内の溶液３２が循環するようになっている。
【００５２】
また、図７は上記チャンバー装置３の変更例を示す断面図である。同図に示すように、供給側の貫通孔１４に溶液３２供給用の前記パイプ５１のほかに、添加物質を容器体２０内に供給するためのパイプ５３を追加した構成としてある。貫通孔１４は２つ孔のシール部材６３により封止してある。
【００５３】
なお、シール部材６１，６２，６３として、例えば、シリコンゴムやフッ素ゴムなどのシール性の良好な材料を用い、これらシール部材６１，６２には、パイプ５１，５２の挿通前は弾性で閉じた状態となって、圧入したパイプ５１，５２を密着保持可能な孔を設ける。このようなシール部材６１，６２，６３によって、各パイプ５１，５２，５３の先端を所定の高さに保持することができる。例えば、排出用のパイプ５２を所定の高さに保持することによって、溶液３２の液面を一定に保つことができる。
【００５４】
このような本実施形態のチャンバー装置３によれば、容器体２０内の溶液３２を一定の成分、濃度、温度に保つとともに、容器体２０内の溶液３２を新鮮に保つことができる。また、あらかじめ設定した時間、濃度、量の添加物質をパイプ５３から供給することにより、試料３１たる生きた細胞に刺激を与え、又は環境変化への反応を知るための実験を行うことができる。
【００５５】
例えば、パイプ５１から所定温度に保たれた溶液３２を供給するとともに、パイプ５３から炭酸ガスを供給することにより、容器体２０内の溶液３２を温度３７℃弱、CO2濃度５％に保つことができ、これに加えて、本チャンバー装置３が置かれた環境の湿度を９０％に保つことにより、試料３１たる生きた細胞の活性を長期間に渡って維持することができる。
【００５６】
また、本チャンバー装置３は、上述した実施形態に係るペトリディッシュ１と同様の顕微鏡観察に用いることができ、この場合は、蓋体１０と容器体２０を挟み込んで固定したり、クランプやクレンメルで押さえたりするとよい。
【００５７】
なお、本発明のペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法は、上述した各実施形態に限定されるものではない。例えば、本発明のペトリディッシュは、正立顕微鏡、倒立顕微鏡、実体顕微鏡、又はペトリディッシュの上下から観察する顕微鏡の他、写真装置にも適用可能である。光学や磁気、放射線を利用する分析装置にも適用可能である。また、本発明のペトリディッシュ及びチャンバー装置は、上記実施形態の如き、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法に限らず、試料準備段階における種々の処理方法にも適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の第１実施形態に係るペトリディッシュを示す断面図である。
【図２】上記ペトリディッシュの変更例を示す断面図である。
【図３】発明の第１実施形態に係る光学顕微鏡観察方法を説明するための概略図である。
【図４】本発明の第２実施形態に係るペトリディッシュを示す断面図である。
【図５】本発明の第２実施形態に係る光学顕微鏡観察方法を説明するための概略図である。
【図６】本発明の一実施形態に係るチャンバー装置を示す断面図である。
【図７】上記チャンバー装置の変更例を示す断面図である。
【図８】従来の一般的なガラスボトムのペトリディッシュを示す断面図である。
【図９】正立顕微鏡を示す概略図である。
【図１０】倒立顕微鏡を示す概略図である。
【符号の説明】
【００５９】
１，２ ペトリディッシュ
１０ 蓋体
１１ 透孔
１２ 板部材
１３ 高台
１４，１５ 貫通孔
２０ 容器体
２１ 透孔
２２ 板部材（ガラススリップ）
２３ 高台
３１ 試料
３２ 溶液
４０ 蓋体
４１ 透孔部
４２ 板部材
４３ 高台
３ チャンバー装置
５１，５２，５３ パイプ
６１，６２，６３ パッキン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば生きた細胞の観察、分析及び処理に適し、蓋体を装着したままで蛍光観察と微分干渉観察を併用することができるペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法の提供を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
図８は従来の一般的なガラスボトムのペトリディッシュを示す断面図である。同図において、従来のペトリディッシュ１００は、主として透明なスチロール樹脂等からなる蓋体１１０と容器体２０とからなり、容器体２０の底部に形成した透孔２１にガラススリップ２２を接着した構成となっていた。これら蓋体１１０の上面と容器体２０の下面とには、それぞれ円環状の高台１１１及び２３が一体的成形してあり、これら蓋体１１０の上面と容器体２０の下面とに傷が付くのを防止している。なお、蓋体１１０の高台１１１の内径を、容器体２０の高台２３の外径よりも大きくして、複数のペトリディッシュ１００を重ねて置けるようにしてある。
【０００３】
このようなペトリディッシュ１００を用いて培養細胞等の試料３１を処理、観察又は分析する場合は、容器２０内を培養液やバッファ又は生理食塩水等の溶液（メディウム）３２で満たすとともに、ガラススリップ２２に前記試料３１を植え付ける。その後、容器２０に蓋体１１０を装着することによって、溶液３２へのゴミや不要物の混入、及び、溶液３２の蒸発を防ぐ。
【０００４】
次に、上記ペトリディッシュ中の試料を正立顕微鏡で観察する場合について図８及び図９を参照しつつ説明する。図９は正立顕微鏡を示す概略図である。同図において、正立顕微鏡２００における試料３１の照明光の投下方法には、透過照明と反射又は落射照明の２種類がある。
【０００５】
まず、透過照明について説明すると、光源２０１から出射された照明光は、鏡基２０２を通って照明レンズ２０３を透過し、コンデンサレンズ２０４により集光された後、ペトリディッシュ１００の下面側からステージ２０５上に載置した試料に到達する。その後、試料３１を透過した光、又は試料３１から出た光は対物レンズ２０６に到達し、鏡筒２０７を経て接眼レンズ２０８から観察されるか、図示しない撮像装置で記録される。なお、ペトリディッシュ１００の蓋体１１０を外して容器体２０内の溶液３２に直接、対物レンズ２０６の先端を浸して観察する方法も行われている。
【０００６】
次いで、反射又は落射照明について説明すると、光源２０９から出射された照明光は、投光管２１０を経て対物レンズ２０６に到達する。該対物レンズ２０６により試料３１に集光された光は、該試料３１により反射、散乱、又は蛍光励起されて再び対物レンズ２０６に戻り、投光管２１０を通過して鏡筒２０７を経て接眼レンズ２０８から観察されるか、前記撮像装置で記録される。
【０００７】
次に、上記ペトリディッシュ中の試料を倒立顕微鏡で観察する場合について図８及び図１０を参照しつつ説明する。図１０は倒立顕微鏡を示す概略図である。同図において、倒立顕微鏡３００も上記と同様、試料３１の照明光の投下方法に、透過照明と反射又は落射照明の２種類を採用している。
【０００８】
まず、透過照明について説明すると、光源３０１から出射された照明光は、透過照明支柱３０２に取り付けた投光管３０３を経てコンデンサレンズ３０４を透過し、ステージ３０５上に載置したペトリディッシュ１００内の試料３１に集光される。試料３１を透過した光、又は試料３１から出た光は、対物レンズ３０６に到達し、鏡体３０７を経て接眼レンズ３０８から観察されるか、前記撮像装置で記録される。
【０００９】
次いで、反射又は落射照明について説明すると、光源３０９から出射された照明光は、鏡体３０７を経て対物レンズ３０６に到達する。該対物レンズ３０６によって試料３１に集光された光は、該試料３１により反射，散乱，又は蛍光励起されて再び対物レンズ３０６に戻り、鏡体３０７を経て接眼レンズ３０８から観察されるか、前記撮像装置で記録される。
【００１０】
このような正立顕微鏡２００又は倒立顕微鏡３００を用いた試料３１の処理、観察又は分析では、ペトリディッシュ１００の容器体２０の底面がスチロール樹脂等の樹脂の方がガラスよりも細胞の定着性が良好であるが、光学的にはガラスの方が好都合であることが多い。
【００１１】
例えば、試料３１となる細胞は、光学的に透明に近く、明視野透過照明観察ではコントラストがつき難い。そこで、位相差観察や微分干渉観察が行われるのであるが、位相差観察の場合は、容器体２０の底面が透明樹脂製であると、該透明樹脂と細胞膜との角度が９０°に近い程過剰なコントラストを生じてハーレーションが現れてしまう。一方、微分干渉観察の場合は、容器体２０の底面が透明樹脂製であると、微分干渉観察のコントラストの要素であるシアリング量が均一にならない。このような透明樹脂の光学的な不均質性がコントラストを生み、細胞のイメージと重なり、目的の細胞観察が行えないという不都合を生じる。
【００１２】
また、上述のような光学顕微鏡観察を行うために試料３１を支持するには、該支持部材が光学的に均質な性質を有している必要であり、さらに、分析や処理を行うためには熱的に安定であることが要求される。これに加え、試料３１が生体や細胞である場合では、該試料３１への影響が少ない性質であることが必要である。そこで、上記構成からなるガラスボトムのペトリディッシュ１００を採用し、細胞に代表される透明性の高い試料３１の観察が可能となった。
【００１３】
このようなガラスボトムのペトリディッシュ１００を用いて、哺乳動物の細胞分裂における染色体と微小管の挙動に関する研究論文を下記非特許文献として挙げる。該非特許文献の379ページに35mm径のガラスボトム培養ディッシュ内の細胞を油浸（オイル）対物レンズで観察する方法と装置が開示されている。
【非特許文献１】Tokuko Haraguchi, Toru Kaneda, Yasushi Hiraoka [Dynamics of chromosomes and microtubules visualized by multiple-wavelength fluorescence imaging in living mammalian cell: effects of mitotic inhibitors on cell cycle progression] Genes to cell (1997) 2, 369-380
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述した従来のペトリディッシュ１００の容器２０内を培養液等の溶液３２で満たした場合は、液表面の波、蒸発による濃度変化や濃度勾配の発生、蒸発の二次的効果による対流の影響がない、又は少なければならない。したがって、このような外部からの影響を遮断するために蓋体１１０は必須といえる。一方で、生きた細胞の所定部分（例えば、核など）を蛍光観察する場合に、位相差観察、ホフマン観察、又は微分干渉観察を併用して細胞全体の形態を観察することが行われている。
【００１５】
しかし、透明樹脂製の蓋体１１０を装着したままで微分干渉観察を行うと、該透明樹脂の光学的性質が不均質であるために偏光が生じてしまい、蓋体１１０を介した試料３１への集光が適正に行えず、又は蓋体１１０を介した観察では十分な解像が得られず、結局、蓋体１１０を外さなければ微分干渉観察を行うことができないという問題があった。
【００１６】
すなわち、微分干渉観察は、偏光を使った光学系であるため、光路途中に歪みや組成等に起因する光学的性質が不均質なプラスチック部材が介在すると、解像（ないし見え方）が著しく悪くなる。このため、従来のガラスボトムのペトリディッシュ１００を使用して蛍光観察と微分干渉観察を併用する場合は蓋体１１０を取り外さなければならない。
【００１７】
ところが、生きた細胞の観察において、蓋体１１０を取り外すことは雑菌の混入につながるため、数時間程度の短時間の観察に限られてしまう。また、一度蓋体１１０を開けて観察したペトリディッシュ１００は雑菌が繁殖してしまうおそれがあるため、その後の形態の観察に期待できない。ここで、溶液３２に抗生物質を添加する手法もあるが、試料たる細胞への影響が懸念され、近年では敬遠されている手法である。このため、生きた細胞を数日に渡って観察する場合は、該細胞の所定部分を蛍光観察するとともに、該蛍光観察用の対物レンズを使用して、前記細胞の全体の外観形状を、わずかなコントラストのある画像か、対物外位相差観察するほかなかった。
【００１８】
また、高倍の対物レンズを使用する場合では、対物レンズのワーキングディスタンス（ＷＤ）が短い。例えば、100倍の対物レンズのＷＤは0.15ｍｍ程度のものがある。これに対応するコンデンサレンズのＷＤは0.7ｍｍ程度になる。このため、ペトリディッシュ１００の蓋体１１０が厚さ0.5〜1ｍｍ程度の透明樹脂で形成されているならば、もはや微分干渉観察を行うことができないという問題もあった。
【００１９】
なお、蛍光観察と位相差観察又はホフマン観察とを組み合わせた場合は、オイル対物の使用を前提とする蛍光観察から、ドライタイプの対物レンズの使用を前提とする位相差観察又はホフマン観察に切り替えるときに、今まで観察していた領域がずれてしまったり、蛍光観察時の残留オイルの付着によって位相差観察又はホフマン観察時に結像不良が生じてしまったりするという問題があった。また、対物レンズの交換をなくすために、位相差観察又はホフマン観察と同じ対物レンズで蛍光観察を行うと、対物レンズ内のスリット、位相膜又はナイフエッジ等のモジュレータによる光量ロスが発生してしまうという問題がある。
【００２０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、蓋体を装着したままで蛍光観察と微分干渉観察を併用することができるとともに、当該微分干渉観察においてコンデンサレンズと対物レンズ間の空気層をなくすことができ、高解像度及び高倍の微分干渉観察と蛍光観察の併用が可能となるペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記目的を達成するために、本発明の第１のペトリディッシュは、蓋体と容器体とを備え、少なくとも前記蓋体に透孔を形成し、該透孔を光の透過が可能な板部材によって閉塞した構成としてあり、好ましくは、前記蓋体と容器体の双方に互いに対向する透孔をそれぞれ形成し、これら透孔を前記板部材によってそれぞれ閉塞した構成とする。
【００２２】
上記目的を達成するために、本発明の第２のペトリディッシュは、蓋体と容器体とを備え、前記蓋体に、前記容器体の内側に向かって突出する透孔部を形成し、該透孔部の下端開口を光の透過が可能な板部材によって閉塞するとともに、前記容器体に、前記透孔部に対向する透孔を形成し、該透孔を光の透過が可能な他の板部材によって閉塞した構成としてある。
【００２３】
より好ましくは、上記第１及び第２のペトリディッシュにおいて、前記板部材の自家蛍光を抑えた構成、若しくは、前記板部材を光学的に均質処理したガラスとした構成、若しくは、前記板部材を石英ガラスとした構成、又は、前記蓋体の透孔を、前記容器体の透孔のより大きくした構成とする。
【００２４】
上記目的を達成するために、本発明のチャンバー装置は、上記ペトリディッシュにおける、前記蓋体に溶液の供給と排出を行うための少なくとも２本のパイプを貫通させ、これらパイプを通じて前記容器体内に入れた前記溶液を循環させた構成としてあり、好ましくは、前記蓋体に前記溶液以外の添加物質を前記容器体内に供給するための他のパイプを貫通させた構成とする。
【００２５】
上記目的を達成するために、本発明の光学顕微鏡観察方法は、上記ペトリディッシュ又はチャンバー装置における、前記蓋体の板部材の上方から前記容器体内に照明光を照射するとともに、該容器体の板部材の下方から対物レンズによって試料の観察を行うようにしている。好ましくは、前記照明光を試料に集光させるためのコンデンサレンズと前記蓋体の板部材との間にオイル又は液体を介在させ、前記試料の観察を、蛍光観察と微分干渉観察との併用とする。上記目的を達成するために、本発明の試料分析方法は、上記光学顕微鏡観察方法により得た観察画像に基づいて前記試料の分析を行うようにしている。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法によれば、ペトリディッシュ又はチャンバー装置における蓋体の板部材を介して偏光のない照明光を試料に照射することができる。これにより、蓋体を取り外すことなく、一般的なオイル対物レンズを使用して、生きた細胞の蛍光観察と微分干渉観察を行うことが可能となる。また、蓋体を取り外すことがないので、生きた細胞の蛍光観察と微分干渉観察を長時間に渡って行った場合でも該細胞が劣化しないという効果を奏する。
【００２７】
さらに、ペトリディッシュ又はチャンバー装置における蓋体に、容器体の内側に向かって突出する透孔部を形成し、該透孔部の下端開口を光の透過が可能な板部材によって閉塞した場合は、該蓋体の板部材が容器体内の溶液に浸かり、該板部材と試料の間に存在していた空気層をなくすことができ、照明光の集光にオイルコンデンサレンズを用いることによって、これまで生きた細胞の蛍光観察と併用が不可能であった高解像、高倍の微分干渉観察が可能となる。
【００２８】
これに加え、本発明のチャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法によれば、容器体内の溶液を一定の成分、濃度、温度に保つとともに、該容器体内の溶液を新鮮に保つことができる。また、あらかじめ設定した時間、濃度、量の添加物質をパイプから供給することにより、試料たる生きた細胞に刺激を与え、又は環境変化への反応を知るための実験を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の実施形態に係るペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法について図面を参照しつつ説明する。まず、本発明の第１実施形態に係るペトリディッシュについて、図１を参照して説明する。図１は本発明の第１実施形態に係るペトリディッシュを示す断面図である。なお、上述した従来技術と同様の箇所については、同一の符号を付して詳細な説明は省略する。
【００３０】
同図において、本実施例のペトリディッシュ１は、透明なスチロール樹脂等からなる蓋体１０と容器体２０とからなっている。蓋体１０のほぼ中央には円形の透孔１１が形成してある。該透孔１１は、容器体２０の底部に形成した透孔２１と対向する位置関係を有しており、その裏側（容器体２０側）から光の透過が可能な板部材１２を接着することにより閉塞してある。
【００３１】
該板部材１２は、その偏光や複屈折などの光学的な解像低下要因を低減するために、自家蛍光を抑え、且つ光学的に均質処理したものが好ましい。例えば、自家蛍光を抑えるために、極めて肉厚の薄い板ガラス、無蛍光材により形成した板ガラスなどを用いることができる。また、光学的な均質処理として、板部材１２の波長選択性を低減するために反射防止膜を施すこと、歪みをなくすこと、光学的性質を均質にしやすい組成物を使用すること、内部応力を均一化することなどを挙げることができる。このような観点から、板部材１２の材料としては、化学的に合成した不純物の少ない合成石英ガラスが好ましい。但し、容器体２０の板部材２２と同様のガラススリップであっても十分な解像を得ることが可能である。なお、蓋体１０の板部材１２と、容器体２０の板部材２２とは、観察方法に応じて光学的、熱的又は形状的に同じ材質の場合もあれば、異なる材質の場合もある。
【００３２】
一方、板部材１２を透孔１１に固定するための接着剤としては、膨潤性と自家蛍光性をともに有しないもの、又は目的に応じていずれか一方のみを有しないものが望ましく、蓋体１０と板部材１２の接合面を全て該接着剤で満たした構成、又は、少量の接着剤により気密及び水密を確保することができる最低限の範囲で封止した構成としてもよい。なお、これら蓋体１０と板部材１２の接合は、接着剤による接着に限らず、熱接合などの他の接合手段によることもできる。
【００３３】
また、透孔１１と板部材１２の形状は、本実施形態の如き円形に限らず、例えば、矩形や楕円形などとしてもよい。但し、透孔１１から入射される照明光の一部が容器体２０内の試料３１に到達する途中で遮られることのない形状及び大きさとする必要がある。したがって、蓋体１０の透孔１１の直径Ｌ1を、容器体２０の透孔２１の直径Ｌ2と同じ又は大きくすることが望ましい。ここで、図２は上記ペトリディッシュ１の変更例を示す断面図であり、同図に示すように、蓋体１０の板部材１２は、透孔１１の表側から接着又は接合してもよい。
【００３４】
次に、本発明の第１実施形態に係る光学顕微鏡観察方法について、図３を参照しつつ説明する。図３は本発明の第１実施形態に係る光学顕微鏡観察方法を説明するための概略図である。
【００３５】
本実施形態では、図２に示すペトリディッシュ１と、図１０に示す倒立顕微鏡３００とを用いて試料３１の蛍光観察と微分干渉観察を行う。まず、図１０に示す倒立顕微鏡３００のステージ３０５に本ペトリディッシュ１を載置する。次いで、図３に示すように、本ペトリディッシュ１における蓋体１０の板部材１２の上方から容器体２０内に照明光Ｓを照射するとともに、該容器体２０の板部材２２の下方から対物レンズ３０６によって試料３１の蛍光観察と微分干渉観察を同時ないし交互に行う。なお、板部材２２と対物レンズ３０６の相互間（間隔＝約0.1mm）はオイル３０６ａで満たしてある。その後、このような蛍光観察と微分干渉観察により得た観察画像に基づいて試料３１の分析を行う。
【００３６】
このような本実施形態のペトリディッシュ及び光学顕微鏡観察方法によれば、蓋体１０の板部材１２を光学的に均質としたことによって、該板部材１２を介して偏光のない照明光を試料３１に照射することができる。これにより、蓋体１０を取り外すことなく、一般的なオイル対物レンズを使用して、生きた細胞の蛍光観察と微分干渉観察を行うことが可能となる。また、蓋体１０を取り外すことがないので、生きた細胞の蛍光観察と微分干渉観察を長時間に渡って行った場合でも該細胞が劣化しないという効果を奏する。
【００３７】
また、光学的に均質な板部材１２を透過した照明光により良好な微分干渉観察、又は蛍光観察と微分干渉観察の観察画像を得ることができるので、該観察画像に基づいて試料３１の分析が良好に行えるようになる。
【００３８】
次に、本発明の第２実施形態に係るペトリディッシュについて、図４を参照して説明する。図４は本発明の第２実施形態に係るペトリディッシュを示す断面図である。なお、上述した実施形態と同様の箇所については、同一の符号を付して詳細な説明は省略する。
【００３９】
同図において、本実施例のペトリディッシュ２は、蓋体４０に、容器体２０の内側に向かって突出する円筒状の透孔部４１を形成し、該透孔部４１の下端開口４１ａを光の透過が可能な板部材４２によって閉塞した構成としてある。このような構成により、蓋体４０の板部材４２が容器体２０内の溶液３２に浸かり、該板部材４２と試料３１の間に存在していた空気層をなくしている。また、該板部材４２と試料３１の間隔は約1.5mm程度に設定してある。
【００４０】
なお、上記第１実施形態と同様に、板部材４２は、その偏光や複屈折などの光学的な解像低下要因を低減するために、自家蛍光を抑え、且つ光学的に均質処理したものが好ましい。また、照明光の入射損失を防止するために蓋体４０の透孔部４１の直径Ｌ1を、容器体２０の透孔２１の直径Ｌ2と同じ又は大きくすることが望ましい。
【００４１】
次に、本発明の第２実施形態に係る光学顕微鏡観察方法について、図５を参照しつつ説明する。図５は本発明の第２実施形態に係る光学顕微鏡観察方法を説明するための概略図である。
【００４２】
上記第１実施形態と同様に、図４に示すペトリディッシュ２と、図１０に示す倒立顕微鏡３００とを用いて試料３１の蛍光観察と微分干渉観察を行うが、本実施形態では、コンデンサレンズ３０４と蓋体４０の板部材４２の相互間（間隔＝約0.1mm）をオイル３０４ａで満たしたオイルコンデンサレンズを使用している。
【００４３】
まず、図１０に示す倒立顕微鏡３００のステージ３０５に本ペトリディッシュ２を載置する。次いで、図５に示すように、本ペトリディッシュ２における蓋体４０の透孔部４１にコンデンサレンズ３０４を挿入し、オイル３０４ａ及び板部材４２を介して容器体２０内に照明光Ｓを照射する。一方で、該容器体２０の板部材２２の下方から対物レンズ３０６によって試料３１の蛍光観察と微分干渉観察を同時ないし交互に行う。その後、このような蛍光観察と微分干渉観察により得た観察画像に基づいて試料３１の分析を行う。
【００４４】
このような本実施形態のペトリディッシュ及び光学顕微鏡観察方法によれば、ペトリディッシュ２における蓋体４０の板部材４２が容器体２０内の溶液３２に浸かり、該板部材４２と試料３１の間に存在していた空気層をなくすことができ、オイルコンデンサレンズの使用と相まって、これまで生きた細胞の蛍光観察と併用が不可能であった高解像の微分干渉観察が可能となる。
【００４５】
詳述すると、図１及び図２に示すような、板部材１２と空気の界面、及び空気と溶液３２の界面は屈折率差、すなわち、反射率と屈折率が大きい。反射率が大きいことは試料３１に到達する光量が減少し、かつ、屈折率が大きいことは収差が大きく、焦点でのエアリーディスクが大きくなって空間分解能が落ちることを意味する。
【００４６】
本実施形態のペトリディッシュ２の如く、蓋体４０の板部材４２が容器体２０内の溶液３２が浸かれば、反射率と屈折率が大きい２つの界面を排除することができ、反射率と屈折率の小さい板部材４２と溶液３２の界面のみが残ることになる。そして、該界面の影響は、板部材４２と溶液３２の屈折率を同じ又は極めて近い値とすることにより無視することができる。
【００４７】
これに加え、オイルコンデンサレンズは、高いＮＡ(開口角)の照明が可能であり、これがシングルセルの観察に適した照明を可能にする。また、コンデンサレンズ３０４と対物レンズ３０６の間には空気層が一切介在しない。この結果、高倍の観察に適した照明と、微弱な蛍光を検知するような観察とが可能となる。
【００４８】
なお、上記実施形態では、コンデンサレンズ３０４と、蓋体４０の板部材４２との間にオイルを介在させているが、該板部材４２の表面に凹部を形成してオイルその他の液体を保持するようにしてもよい。また、コンデンサレンズの切り替えや作動距離（ＷＤ）を考慮して、蓋部４０における透孔部４１の直径を大きくするとともに、その深さを浅くすることにより、該コンデンサレンズの焦点位置を上下に移動することなく、交換又は切り替え可能とすることができる。
【００４９】
次に、本発明の一実施形態に係るチャンバー装置について、図６を参照して説明する。図６は本発明の一実施形態に係るチャンバー装置を示す断面図である。なお、上述した実施形態と同様の箇所については、同一の符号を付して詳細な説明は省略する。
【００５０】
同図において、本実施形態のチャンバー装置３は、図２に示す本ペトリディッシュ１の蓋体１０に２つの貫通孔１４，１５を穿設するとともに、これら貫通孔１４，１５のそれぞれにパイプ５１，５２を挿通し、前記貫通孔１４，１５をそれぞれシール部材６１，６２で封止した構成としてある。
【００５１】
パイプ５１は、容器体２０内に溶液３２を供給するためのものであり、また、パイプ５２は、容器体２０内の溶液３２を排出するためのものである。これらパイプ５１，５２をガラス、金属又はプラスチック製とし、図示しない溶液循環装置のポンプに接続して、容器体２０内の溶液３２が循環するようになっている。
【００５２】
また、図７は上記チャンバー装置３の変更例を示す断面図である。同図に示すように、供給側の貫通孔１４に溶液３２供給用の前記パイプ５１のほかに、添加物質を容器体２０内に供給するためのパイプ５３を追加した構成としてある。貫通孔１４は２つ孔のシール部材６３により封止してある。
【００５３】
なお、シール部材６１，６２，６３として、例えば、シリコンゴムやフッ素ゴムなどのシール性の良好な材料を用い、これらシール部材６１，６２には、パイプ５１，５２の挿通前は弾性で閉じた状態となって、圧入したパイプ５１，５２を密着保持可能な孔を設ける。このようなシール部材６１，６２，６３によって、各パイプ５１，５２，５３の先端を所定の高さに保持することができる。例えば、排出用のパイプ５２を所定の高さに保持することによって、溶液３２の液面を一定に保つことができる。
【００５４】
このような本実施形態のチャンバー装置３によれば、容器体２０内の溶液３２を一定の成分、濃度、温度に保つとともに、容器体２０内の溶液３２を新鮮に保つことができる。また、あらかじめ設定した時間、濃度、量の添加物質をパイプ５３から供給することにより、試料３１たる生きた細胞に刺激を与え、又は環境変化への反応を知るための実験を行うことができる。
【００５５】
例えば、パイプ５１から所定温度に保たれた溶液３２を供給するとともに、パイプ５３から炭酸ガスを供給することにより、容器体２０内の溶液３２を温度３７℃弱、CO2濃度５％に保つことができ、これに加えて、本チャンバー装置３が置かれた環境の湿度を９０％に保つことにより、試料３１たる生きた細胞の活性を長期間に渡って維持することができる。
【００５６】
また、本チャンバー装置３は、上述した実施形態に係るペトリディッシュ１と同様の顕微鏡観察に用いることができ、この場合は、蓋体１０と容器体２０を挟み込んで固定したり、クランプやクレンメルで押さえたりするとよい。
【００５７】
なお、本発明のペトリディッシュ、チャンバー装置、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法は、上述した各実施形態に限定されるものではない。例えば、本発明のペトリディッシュは、正立顕微鏡、倒立顕微鏡、実体顕微鏡、又はペトリディッシュの上下から観察する顕微鏡の他、写真装置にも適用可能である。光学や磁気、放射線を利用する分析装置にも適用可能である。また、本発明のペトリディッシュ及びチャンバー装置は、上記実施形態の如き、光学顕微鏡観察方法及び試料分析方法に限らず、試料準備段階における種々の処理方法にも適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の第１実施形態に係るペトリディッシュを示す断面図である。
【図２】上記ペトリディッシュの変更例を示す断面図である。
【図３】発明の第１実施形態に係る光学顕微鏡観察方法を説明するための概略図である。
【図４】本発明の第２実施形態に係るペトリディッシュを示す断面図である。
【図５】本発明の第２実施形態に係る光学顕微鏡観察方法を説明するための概略図である。
【図６】本発明の一実施形態に係るチャンバー装置を示す断面図である。
【図７】上記チャンバー装置の変更例を示す断面図である。
【図８】従来の一般的なガラスボトムのペトリディッシュを示す断面図である。
【図９】正立顕微鏡を示す概略図である。
【図１０】倒立顕微鏡を示す概略図である。
【符号の説明】
【００５９】
１，２ ペトリディッシュ
１０ 蓋体
１１ 透孔
１２ 板部材
１３ 高台
１４，１５ 貫通孔
２０ 容器体
２１ 透孔
２２ 板部材（ガラススリップ）
２３ 高台
３１ 試料
３２ 溶液
４０ 蓋体
４１ 透孔部
４２ 板部材
４３ 高台
３ チャンバー装置
５１，５２，５３ パイプ
６１，６２，６３ パッキン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蓋体と容器体とを備え、少なくとも前記蓋体に透孔を形成し、該透孔を光の透過が可能な板部材によって閉塞したことを特徴とするペトリディッシュ。
【請求項２】
前記蓋体と容器体の双方に互いに対向する透孔をそれぞれ形成し、これら透孔を前記板部材によってそれぞれ閉塞したことを特徴とする請求項１記載のペトリディッシュ。
【請求項３】
蓋体と容器体とを備え、前記蓋体に、前記容器体の内側に向かって突出する透孔部を形成し、該透孔部の下端開口を光の透過が可能な板部材によって閉塞するとともに、前記容器体に、前記透孔部に対向する透孔を形成し、該透孔を光の透過が可能な他の板部材によって閉塞したことを特徴とするペトリディッシュ。
【請求項４】
前記板部材の自家蛍光を抑えたことを特徴とする請求項１〜３いずれか記載のペトリディッシュ。
【請求項５】
前記板部材を光学的に均質処理したガラスとしたことを特徴とする請求項１〜４いずれか記載のペトリディッシュ。
【請求項６】
前記板部材を石英ガラスとしたことを特徴とする請求項１〜５いずれか記載のペトリディッシュ。
【請求項７】
前記蓋体の透孔を、前記容器体の透孔のより大きくしたことを特徴とする請求項２〜６いずれか記載のペトリディッシュ。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか記載のペトリディッシュにおける、前記蓋体に溶液の供給と排出を行うための少なくとも２本のパイプを貫通させ、これらパイプを通じて前記容器体内に入れた前記溶液を循環させたことを特徴とするチャンバー装置。
【請求項９】
前記蓋体に前記溶液以外の添加物質を前記容器体内に供給するための他のパイプを貫通させたことを特徴とする請求項８記載のチャンバー装置。
【請求項１０】
請求項２〜７いずれか記載のペトリディッシュ若しくは請求項８又は９記載のチャンバー装置における、前記蓋体の板部材の上方から前記容器体内に照明光を照射するとともに、該容器体の板部材の下方から対物レンズによって試料の観察を行うことを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項１１】
前記照明光を試料に集光させるためのコンデンサレンズと前記蓋体の板部材との間にオイル又は液体を介在させたことを特徴とする請求項１０記載の光学顕微鏡観察方法。
【請求項１２】
前記試料の観察を、蛍光観察と微分干渉観察との併用としたことを特徴とする請求項１０又は１１記載の光学顕微鏡観察方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２いずれか記載の光学顕微鏡観察方法により得た観察画像に基づいて前記試料の分析を行うことを特徴とする試料分析方法。
【請求項１】
蓋体と容器体とを備え、少なくとも前記蓋体に透孔を形成し、該透孔を光の透過が可能な板部材によって閉塞したことを特徴とするペトリディッシュ。
【請求項２】
前記蓋体と容器体の双方に互いに対向する透孔をそれぞれ形成し、これら透孔を前記板部材によってそれぞれ閉塞したことを特徴とする請求項１記載のペトリディッシュ。
【請求項３】
蓋体と容器体とを備え、前記蓋体に、前記容器体の内側に向かって突出する透孔部を形成し、該透孔部の下端開口を光の透過が可能な板部材によって閉塞するとともに、前記容器体に、前記透孔部に対向する透孔を形成し、該透孔を光の透過が可能な他の板部材によって閉塞したことを特徴とするペトリディッシュ。
【請求項４】
前記板部材の自家蛍光を抑えたことを特徴とする請求項１〜３いずれか記載のペトリディッシュ。
【請求項５】
前記板部材を光学的に均質処理したガラスとしたことを特徴とする請求項１〜４いずれか記載のペトリディッシュ。
【請求項６】
前記板部材を石英ガラスとしたことを特徴とする請求項１〜５いずれか記載のペトリディッシュ。
【請求項７】
前記蓋体の透孔を、前記容器体の透孔のより大きくしたことを特徴とする請求項２〜６いずれか記載のペトリディッシュ。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか記載のペトリディッシュにおける、前記蓋体に溶液の供給と排出を行うための少なくとも２本のパイプを貫通させ、これらパイプを通じて前記容器体内に入れた前記溶液を循環させたことを特徴とするチャンバー装置。
【請求項９】
前記蓋体に前記溶液以外の添加物質を前記容器体内に供給するための他のパイプを貫通させたことを特徴とする請求項８記載のチャンバー装置。
【請求項１０】
請求項２〜７いずれか記載のペトリディッシュ若しくは請求項８又は９記載のチャンバー装置における、前記蓋体の板部材の上方から前記容器体内に照明光を照射するとともに、該容器体の板部材の下方から対物レンズによって試料の観察を行うことを特徴とする光学顕微鏡観察方法。
【請求項１１】
前記照明光を試料に集光させるためのコンデンサレンズと前記蓋体の板部材との間にオイル又は液体を介在させたことを特徴とする請求項１０記載の光学顕微鏡観察方法。
【請求項１２】
前記試料の観察を、蛍光観察と微分干渉観察との併用としたことを特徴とする請求項１０又は１１記載の光学顕微鏡観察方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２いずれか記載の光学顕微鏡観察方法により得た観察画像に基づいて前記試料の分析を行うことを特徴とする試料分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−３０５８３（Ｐ２００６−３０５８３Ａ）
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２０９１７５（Ｐ２００４−２０９１７５）
【出願日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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