ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法および用途
【課題】
標的タンパク質に高度に相互作用する有用なペプチドアプタマーを数多くプールすることを可能とする、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法を提供すること。
【解決手段】
上記課題を解決するために、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、統計学的なクラスター解析およびブロックシャッフリング法を利用する工程を含む、前記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法が提供される。
標的タンパク質に高度に相互作用する有用なペプチドアプタマーを数多くプールすることを可能とする、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法を提供すること。
【解決手段】
上記課題を解決するために、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、統計学的なクラスター解析およびブロックシャッフリング法を利用する工程を含む、前記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法に関する。より詳しくは、本発明は、第一のペプチドアプタマー群を統計解析およびブロックシャッフリング法で処理することにより、高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを回収することを特徴とする、上記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法に関する。
【０００２】
さらに本発明は、上記ペプチドアプタマーライブラリーを利用して、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーを作製する方法に関する。さらに、本発明は、上記いずれかのライブラリーを利用して、最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものの総称である。タンパク質間相互作用は、本質的にペプチド間相互作用である生理学的現象を基盤とする。したがって、ペプチドの中でも、特に酵素や受容体などのタンパク質に相互作用するペプチド（ペプチドアプタマー）は、酵素と疾患の関連性を解明する上でも非常に有用な研究対象であり、抗体医薬に続く有望な分子として期待されている。
【０００４】
これまでにペプチドアプタマーの研究は、組み合わせ合成、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイなどの手法を用いて実施されてきた（非特許文献１〜４）。ファージディスプレイは、ビリオン粒子の表面にファージＤＮＡにコードされたペプチドを表示する手法であり、新規なタンパク質およびペプチドをもたらすことに成功している。
【０００５】
しかし、ファージディスプレイは、処理できるペプチドおよび多様性の数が制限されるという問題があった。そこで、現在はリボソームディスプレイやｍＲＮＡディスプレイなどのインビトロシステムの開発が進められている。これまでにインビトロシステムを利用して、処理できるペプチドの分子スペクトルを拡張し、さらに１０１２−１５（ファージ・ディスプレイは１０９）にまで分子の多様性を拡大化することに成功している（非特許文献３および４）。
【非特許文献１】Acharya, A. N., Nefzi, A., Ostresh, J. M. & Houghten, R. A. (2001). J. Comb.Chem. 3, 189-195.
【非特許文献２】Smith, G. P. (1985). Science. 228, 1315-1317.
【非特許文献３】Hanes, J. & Pluckthun, A. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4937-4942.
【非特許文献４】Roberts, R. W. & Szostak, J. W. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297-12302.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、従来のインビトロシステムは、上記した長所があるにもかかわらず、方法論の不備が多いために、その使用は非常に制限されている。したがって、特定の疾患に関連する標的タンパク質に高度に相互作用（例えば、活性の促進または阻害など）する数多くの有用なペプチドアプタマーを含む、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法については未だ開発されていない。
【０００７】
したがって、本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。すなわち、本発明は、標的タンパク質に高度に相互作用する有用なペプチドアプタマーを数多くプールすることを可能とする、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００８】
さらに本発明は、作製したペプチドアプタマーライブラリーを利用して、標的タンパク質により高度に相互作用するコンビネーションペプチドを含む、コンビネーションペプチドライブラリーの作製方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、任意のペプチドアプタマー群から統計学的手法により得たアミノ酸配列情報に基づいてブロックシャッフリングする、ＡＳＡＣ（Ａｌｌ−Ｓｔｅｐｓ−Ａｌｌ−Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ）法を開発した。上記ＡＳＡＣ法を利用することで、高度に標的タンパク質に相互作用する多数のペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーを作製することに成功した。
【００１０】
さらに、本発明者らは、上記ペプチドアプタマーライブラリーから選ばれるペプチドアプタマーを基に、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーを合成し、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーを開発した。さらに、本発明者らは、これらのライブラリーの中から最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングすることができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成した発明である。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、前記共通アミノ酸配列を数個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの２以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法が提供される。
【００１２】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記クラスター解析が、アミノ酸配列間ハミング距離に基づいてアミノ酸配列をクラスタリングする手法である。
【００１３】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記ブロックシャッフリング法が、Ｙ連結に基づくブロックシャッフリング（Ｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｂｌｏｃｋ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ：ＹＬＢＳ）法である。
【００１４】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記ブロックがいずれも３、４、５または６個のアミノ酸からなる。
【００１５】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記標的タンパク質の相互作用が、標的タンパク質の活性を促進する作用または標的タンパク質の活性を阻害する作用である。
【００１６】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記標的タンパク質がアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼまたは金属プロテアーゼであり、より好ましくは、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＢまたはトリプシンである。
【００１７】
さらに本発明の別の側面によれば、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、前記の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも２種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法が提供される。
【００１８】
さらに本発明の別の側面によれば、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、前記の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも１種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも１種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【００１９】
好ましくは、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記スペーサーを介した連結が、ペプチドペアライブラリー法により達成される連結である。
【００２０】
好ましくは、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記スペーサーが、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれる配列のスペーサーである。
【００２１】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーまたはコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記タンパク質が酵素または受容体である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、第一のペプチドアプタマー群よりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーを作製することが可能になる。さらに、本発明により作製されたペプチドアプタマーライブラリーを利用して、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むライブラリーを作製することが可能になる。したがって、疾患に関連のある酵素を標的タンパク質として、これらのライブラリーから最も高度に上記標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングすることで、上記疾患の治療または予防するための組成物を作製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、前記共通アミノ酸配列を数個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの２以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および
前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【００２４】
本明細書にいう「標的タンパク質」とは、所望の標的となるタンパク質であれば特に制限されないが、上記タンパク質としては酵素や受容体が好ましい。標的タンパク質としての具体的な例としては、カテプシンＤやカテプシンＥなどのアスパラギン酸プロテアーゼ、カテプシンＢなどのシステインプロテアーゼ、またはトリプシンなどのセリンプロテアーゼなどを挙げることができる。
【００２５】
これらのプロテアーゼのうち、例えば、カテプシンＥは、免疫反応の一部として外来タンパク質を分解消化する作用を有し、リンパ腺や他の細胞において発現することが知られている。これまでに、カテプシンＥの異常活性はアトピーや癌などの疾患に関連することが知られているが、カテプシンＥ活性を特異的に促進または阻害する分子については未だ知られていない。したがって、実施例で示したような、カテプシンＥの活性を促進または阻害するなどの相互作用を示すペプチドアプタマーをプールすることは、アトピーや癌の予防または治療剤の創製において非常に有用である。
【００２６】
本明細書にいう「相互作用」とは、標的タンパク質の有する機能または作用に影響を与えるものであれば特に制限されないが、例えば、標的タンパク質（酵素）の活性促進や活性阻害、標的タンパク質（受容体）のリガンドの結合促進や結合阻害などを意味し、広義には機能または作用の調節や適正化なども含みうる。
【００２７】
本明細書にいう「ペプチドアプタマー」とは、上記した通り、酵素や受容体などのタンパク質に相互作用するペプチドであれば特に制限されず、例えば、タンパク質に相互作用するアミノ酸残基の数が２〜１００個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜２０個、最適に好ましくは２〜１０個程度のペプチドをいう。したがって、「ペプチドアプタマーライブラリー」とは、上記したペプチドアプタマーが複数集まった集団をいう。より具体的には、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの規模は１０１０以上、好ましくは１０１１以上、より好ましくは１０１２以上である。
【００２８】
本明細書にいう「標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマー」とは、例えば、標的タンパク質に相互作用して、標的タンパク質の生理活性を阻害または促進等するペプチドアプタマーであって、本発明のペプチドアプタマーライブラリーを作製する際の出発（原料）分子を意味する。したがって、本明細書にいう「標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群」は、本発明のペプチドアプタマーライブラリーを作製する際の出発分子の母集団（ライブラリー）を意味するものである。このような標的タンパク質に相互作用する第一の群としては、例えば、実施例で示した第一ライブラリーを挙げることができる。
【００２９】
本明細書にいう「アミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する」とは、統計学的手法を用いてアミノ酸配列を分類（クラスタリング）することができれば特に制限されないが、例えば、アミノ酸配列間のハミング距離を計算し、その結果に基づいてアミノ酸配列を分類する方法を挙げることができる。ここで、「ハミング距離」とは、特定の文字数を持つ二種の文字列の中で、対応する位置にある異なった文字の個数をいう。例えば、一文字表記で表したアミノ酸配列ＥＤＮＴＳとＡＤＮＫＳの間のハミング距離は、ＡとＫの位置の相違から２として計算される。このようにして計算されたハミング距離に基づき、統計アルゴリズムにより計算することにより系統樹を作製することができる。これらは手動でも可能であるが、例えば、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（サービスの主体：http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）などの計算ソフトを用いれば簡便に作製できる。
【００３０】
本明細書にいう「各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する」とは、例えば、上記クラスター解析により一つの枝にまとめられたペプチドアプタマー群のアミノ酸配列について、共通するアミノ酸配列を手動または情報処理ソフトを使うなどして自動で抽出することを意味する。
【００３１】
本明細書にいう「数個のアミノ酸」とは、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸を意味し、好ましくは３、４、５または６個のアミノ酸、より好ましくは４個のアミノ酸である。本明細書でいう「数個のアミノ酸からなるブロックに分ける」としては、例えば、８アミノ酸残基からなるペプチドを４個のアミノ酸を一つの単位として２つのブロックに分けるなどが該当する。したがって、共通アミノ酸配列を集めて、得られた配列情報から可変領域と定常領域に分け、可変領域を対象として数個のアミノ酸からなる１〜４程度のブロックに分ければよい。
【００３２】
本明細書にいう「ブロックシャッフリング法」とは、例えば、可変領域が８アミノ酸残基からなる異なる２種のペプチドを４個のアミノ酸（前半・中央・後半）ごとにブロック化し、得られた計６ブロックをシャッフリングすることにより確率論的な組み合わせで種々のペプチドを合成することができる方法をいう。そのような方法として、例えば、本発明者らによって開発されたＹ連結に基づくブロックシャッフリング（Ｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｂｌｏｃｋ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ：ＹＬＢＳ）法がある（例えば、K.Kitamra et al., Protein Engineering, （２００２）、Vol.15、No.10、pp.843-853を参照）。
【００３３】
上記ＹＬＢＳ法の概略は図１に示した通りであり、この図を用いて以下に説明する。
２種の一本鎖ＤＮＡ（５’ハーフ鎖と３’ハーフ鎖）をシャッフリング用配列として作製する。これらの５’ハーフ鎖と３’ハーフ鎖において、単一のブロック配列を３’末端または５’末端のいずれかに配置する。さらに、各鎖のステム領域は相補的であり、ＰＣＲのプライマー結合領域として作用するＤブランチ領域（図中のＢＤ５とＢＤ３）が含まれる。３’ハーフ鎖の５’末端はライゲーション反応のために予めリン酸化されている必要がある。５’ハーフ鎖および３’ハーフ鎖の同量（通常１０ｐｍｏｌ／１０μｌ）の組み合わせが用いられ、ステム領域でハイブリダイゼーションされる。５’ハーフ鎖の３’末端および３’ハーフ鎖の５’末端は、０．１ｍＭ ＡＴＰの存在下で５０ＵのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（タカラ、京都、日本）でライゲートされる。ライゲーション生成物のプレ増幅後（このステップを省くことも可能）、プレ５’ハーフ鎖およびプレ３’ハーフ鎖のＰＣＲ産物が２種のＰＣＲ（図中の２種のプライマーセット：ｐＳ５／ｐＢＤ３とｐＢＤ３／ｐＳ３）により得られる。ステム領域を含むプライマー（プライマー、ｐＳ５およびｐＳ３）をあらかじめ５’末端でビオチン化しておき、次のＹライゲーションサイクル用一本鎖ＤＮＡを作製するために使用する。ＰＣＲ産物は対応する制限酵素（３’ハーフ鎖はＭｂｏＩＩ、５’ハーフ鎖はＡｌｗＩ）で分離消化され、その後アルカリ変性により分離された一本鎖ＤＮＡはアビジン−ビオチン結合（ストレプトアビジン被覆磁性ビーズを使用）によって回収される。プレ５’ハーフのビオチン化鎖とプレ３’ハーフの非ビオチン化鎖は、引き続き５’ハーフ鎖および３’ハーフ鎖として、次のＹライゲーションサイクルで使用される。サイクル数ｎに依存して、ライゲートされるブロックのサイズおよび多様性が指数的に増加しうる：サイズは２ｎ（＝ｓ）であり生産物多様性はｄｓ（ｄは開始時のブロックの多様性の値）。例えば、ｄ＝８であれば、ＰＣＲ生産物の多様性は、６４、４０９６、１．７×１０７、２．８×１０１４と増加する。なお、図中の○で囲まれたＢおよびＰは、それぞれビオチン化とリン酸化を示す。したがって、上記したようなブロックシャッフリング法によれば、多様性のある数多くのペプチドアプタマーからなる第二の群を作製することができる。
【００３４】
本明細書にいう「第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマー」とは、第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと比較した場合に、同等またはそれより高度に標的タンパク質に相互作用を示すペプチドアプタマーを意味する。ここで、「高度に標的タンパク質に相互作用する」とは、例えば、相互作用が活性阻害作用である場合は標的タンパク質の活性をより大きい度合いで阻害することを意味し、または相互作用が活性促進作用である場合は標的タンパク質の活性をより大きい度合いで促進することを意味する。または、「同等またはそれより高度に標的タンパク質に相互作用を示すペプチドアプタマー」とは、基準となる相互作用と比べて同じかそれよりも大きい度合いで標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを意味する。
【００３５】
本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも２種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【００３６】
別の側面によれば、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも１種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも１種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【００３７】
本明細書にいう「コンビネーションペプチドアプタマー」は、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも２種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させるか、または、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも１種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも１種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させることにより作製が可能である。スペーサーとしては、一定数のアミノ酸残基からなるスペーサーであれば特に制限されないが、例えば、３〜３０アミノ酸残基、好ましくは５〜１５アミノ酸残基、より好ましくは８〜１２アミノ酸残基からなるスペーサーが用いられる。スペーサーの例として、グリシンからなる配列（Ｇ１０およびＧ１５；アルファベットはアミノ酸の一文字表記を表し、数字はアミノ酸の数を表す。以下同じ。）、グリシンおよびセリンからなる配列（Ｇ３ＳＧ３Ｇ２およびＧ３ＳＧ３ＳＧ３ＳＧ３）ならびにグリシンおよびプロリンからなる配列（Ｇ３ＰＧ３ＰＧ２およびＧ３ＰＧ３ＰＧ３ＰＧ３）などがあり、具体例としては配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれる配列を利用できる。
【００３８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
１ 材料および方法
（１）ライブラリーの構築
組み合わせＤＮＡおよびＩＶＶ（in vitro virus）ペプチドライブラリーは、ＹＬＢＳ法およびｃＤＮＡディスプレイによって構築された。これらの実験に使用されたＤＮＡブロックおよびプライマーの配列を表１および表２にまとめた。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【００４２】
（２）選択に使用されたＣＥ固定化ビーズ
カテプシンＥ（ＣＥ）は通常知られる方法に従ってネズミ脾臓から調製された。精製ＣＥは、メーカーの指示に従って、化学的に安定したアミド結合を形成する化合物をカップリングし得るアミンを使用することにより、ＮＨＳ活性化セファロース・ビーズ（ＧＥヘルスケア）上で固定された。酵素をカップリングしたビーズは、使用時まで４℃で１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）中に保管された。カップリング効率は、カップリングしていない酵素の吸光度を遊離酵素の吸光度と比較することにより計算された。
【００４３】
（３）親和性選択
選択緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．２）の１００μｌ中のＩＶＶペプチドライブラリーは、ＣＥ固定化ビーズの５μｌと３０分間混合され、２５℃で３０分間インキュベートされた。ビーズは、選択ラウンドごと、つまり、ラウンド１は２：２：１、ラウンド２は２：２：２、ラウンド３は３：３：３に変えて洗浄プロトコールに従って、２００μｌの選択緩衝液、洗浄緩衝液−１（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２）および洗浄緩衝液−２（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２）で洗浄された。最後に、ビーズは、溶出緩衝液−１（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．２）の２００μｌ中で懸濁され、５分間３７℃でインキュベートされた。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）の後、ビーズは溶出緩衝液−１で再び洗浄された。結合した上清は保管された（Ｓｕｐ１）。ビーズは、溶出緩衝液−２（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．２）で懸濁され、５分間９５℃でインキュベートされた。インキュベーション後、ビーズは取り除かれ、および上清は保管された（Ｓｕｐ２）。Ｓｕｐ１とＳｕｐ２の中のＩＶＶはＢｉｏ−Ｓｐｉｎカラム（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）で精製された。
【００４４】
（４）機能選択
親和性選択のラウンド３の結果として作製されたＤＮＡライブラリーは、可変領域としてＩＶＶ−ＳＦ−連結ＤＮＡ構築物（図２）に挿入された。反応緩衝液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ４．５）の１００μｌ中のＩＶＶ−ＳＦ−連結ペプチドライブラリーは、ＣＥ固定ビーズの５μｌと混合され、１０分間４０℃でインキュベートされた。インキュベーション後に、ビーズは親和性選択に記載した通りに、洗浄および溶出された。
【００４５】
選択緩衝液、洗浄緩衝液−１および洗浄緩衝液−２を使用した洗浄繰り返し回数のプロトコールは、選択ラウンド（Ｆ１−Ｆ９）によって以下のように実行された：Ｆ１は３：３：３；Ｆ２は４：５：３；Ｆ３は５：５：５；Ｆ４は５：７：５；Ｆ５は５：７：７；Ｆ６は５：１０：７；Ｆ７は ５：１０：１０；Ｆ８は５：１５：１０；Ｆ９は５：１５：１５。
【００４６】
（５）ＩＶＶからのペプチドの回収
ＰＣＲ溶液（７．５μｌ、５ｐｍｏｌのＤＮＡ）は、インビトロ翻訳システムキット（和光純薬システム、和光）の１２．５μｌのＡ溶液および５μｌのＢ溶液で混合され、および１時間３７℃でインキュベートされた。事前に２００μｌの１×結合緩衝液（ＴａＫａＲａ）で２度洗浄され、および２５μｌの２×結合緩衝液で懸濁された磁気ビーズ懸濁液（１０μｌ、Ｍａｇｎｏｔｅｘ ＳＡ、ＴａＫａＲａ）は、翻訳混合物に加えられ、１時間３７℃でインキュベートされた。インキュベーション後、磁気ビーズは磁石で取り除かれ、２００μｌの０．０１％ ＢＳＡ溶液で洗浄された。
【００４７】
ビーズは、２ＵのファクターＸａを含む、ファクターＸａ反応混合物（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．８）の中で懸濁され、混合の後に１時間３７℃でインキュベートされた。上清は磁石で回収され、０．２５μｌの１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でｐＨを調節された。次に、事前に１×Ｘａ緩衝液（ｐＨ ８．０）で洗浄されたＸａ除去樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）の１０μｌが、回収された溶液に加えられ、混合の後に１０分間室温でインキュベートされた。上清は遠心分離によって回収された。回収されたペプチドは合計１０ｐｍｏｌであると見積もられ、溶液の２μｌが阻害活性を測定するために使用された。
【００４８】
（６）活性分析
阻害活性分析のために、（ＩＶＶまたは有機合成の何れかから得られた）ペプチドアプタマーは、９０μｌの選択緩衝液において１：１のモル比で（０．１％のＢＳＡ中の）ＣＥとプレインキュベートされた。次に、０．１ｍＭ 蛍光性ＣＥ基質（ペプチド研究所）の１０μｌが溶液に加えられ、１０分間４０℃でインキュベートされた。反応生成物の蛍光強度（λｅｍ：４３０ｎｍ、λｅｘ：３６０ｎｍ）は、蛍光マイクロプレートリーダー（ＦｌｕＰＯＬＯ、ＴａＫａＲａ）によって測定された。
【００４９】
パーセント阻害は下記式（１）によって計算された：
コントロールの％阻害＝１００×（１−Ｓｆ／ＣＥｆ） （１）
上記式（１）中、Ｓｆは酵素（ＣＥ）、蛍光性基質および潜在的な阻害剤を含む試料溶液の蛍光強度であり、ＣＥｆはブランク溶液の蛍光強度であり、阻害剤のない試料溶液と同様である。
【００５０】
（７）マルチ・ミクロ・ヴェッセル（ＭＭＶ）およびその中での反応
ＭＭＶに基づいたクローン淘汰用のＤＮＡ構築物、およびＭＭＶを使用した実験操作を、図３の中で簡潔に示した。ＭＭＶは、光照射による重合反応を開始するためにＤＭＤ（ディジタル多重反射鏡装置）プロジェクターを使用して、アクリルアミド（１８％）ゲルで作られた。ＭＭＶは、通常２．５×２．５ｃｍ２の面積の上に１０２４個の小さなウェルを保持する。ここでＰＣＲ、インビトロ転写、インビトロ翻訳およびカテプシンＥ−反応のすべてが行なわれた。
【００５１】
（８）ＩＣ５０阻害の特性
ＣＥは上記された通りに、ペプチド・クローンの濃度を変えてインキュベートされた。パーセント阻害は上記式（１）によって計算された。ＩＣ５０（５０％の阻害が観察された濃度）は、投与−反応曲線から決定された。
【００５２】
（９）解離定数の測定
解離定数の測定はＦｒｉｇｕｅｔらの方法を改良して実施された。上記の方法の中で言及されているように、それぞれのペプチドのＩＶＶが用意された。大型のｍＲＮＡおよびリボソームは、ペプチド結合物を遊離するために３０分間２５℃でリボヌクレアーゼＡおよびリボヌクレアーゼＨ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて消化によって放出された。一定量のペプチド結合物（〜２ｎＭ）はＣＥの量を変えて（１ｎＭ〜１μＭ）１時間インキュベートされた。混合物は、一定量の固定化ＣＥ（〜２００ｎＭ）に適用され、さらに３０分間インキュベートされた。ＰＢＳ−Ｔ（リン酸緩衝化塩溶液；０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いた数回の洗浄後、Ｐｅｎｔａ．Ｈｉｓ ＨＲＰ（ＱＩＡＧＥＮ）が１／２０００希釈で加えられ、１時間インキュベートされた。ビーズはＰＢＳ−Ｔで徹底的に洗浄され、その後基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、シグマ）を添加した。発色をさせた後、反応は０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって止められた。吸光度はマイクロプレート・リーダ（Ｔｅｃａｎ）を用いて４５０ｎｍで測定された。データはＧｒａｐｈＰａｄプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社）を使用してプロットされた。
【００５３】
（１０）ペプチドペアライブラリー法（図１２）
ペプチドペアライブラリー法は下記の通りに実施した。
［ａ］材料
【００５４】
［ｂ］ペプチドアプタマーの連結候補
配列表の配列番号４および５の配列が、ペプチドアプタマーをコードするＤＮＡ配列と連結させる配列として用いられた。ペプチドアプタマーをコードするＤＮＡは、配列番号４の５’末端または配列番号５の３’末端に連結する。
【００５５】
ＣＥに相互作用するペプチドおよびＹタグを配列表の配列番号６〜１８とした（表３）。
【００５６】
【表３】
【００５７】
［ｃ］プライマー
ペプチドペアライブラリー法に用いたプライマーを配列表の配列番号１９〜２８とした（表４）。
【００５８】
【表４】
【００５９】
［ｄ］バッファー
【００６０】
［ｅ］方法
（１）ペプチドとスペーサーの結合
４）電気泳動
５）５’ハーフＤＮＡの抽出
（２）ペプチドとｙタグの連結
４）電気泳動
５）３’ハーフＤＮＡの抽出
（３）ペプチド＋スペーサー＋ペプチド＋ｙタグの連結
３）電気泳動
４）ＤＮＡの抽出
【００６１】
２ 結果
（１）ペプチドアプタマーの選択（淘汰）のための戦略
ｍＲＮＡディスプレイに基づいたインビトロ選択を使用して、ペプチドアプタマーの選択および淘汰の戦略を開発した（図４）。第一ライブラリーは、新規な機能を備えた生物活性分子の同定において不可欠である。第二ライブラリーの選択は、分子淘汰のさらなる選抜を可能にする。第一および第二ライブラリーの選択段階は、両方とも二種の淘汰、すなわち集団淘汰とクローン淘汰を含んでいる。
【００６２】
集団淘汰は、プールされた分子のライブラリーを選別する。しかし、クローン淘汰は、クローンごとに分子を個々に選別する。これに加えて、従来方式の困難な段階を回避するために、用途の広い有用性のあるマイクロアレイ、換言すればマルチ・ミクロ・ヴェッセル（ＭＭＶ）を用いるクローニングである新たな方法を用いた。この種のマイクロアレイの導入は、選択の後期段階における迅速なスクリーニングに非常に有用であった。淘汰の進行とともに、より低活性の分子が削除されていくと同時に、各ライブラリー内の多様性は減少していく。第二ライブラリーの構築は、第一ライブラリーの淘汰で生成した配列情報に基づいて達成される。すなわち、第一ライブラリーから選ばれたペプチドブロックを使用して行う、ブロックシャッフリング法（Ａｌｌ−ｓｔｅｐｓ−ａｌｌ−ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ（ＡＳＡＣ）法）を開発して組み込んだｅＲＡＰＡＮＳＹ（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｒａｐｉｄ ｐａｎｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）と呼ばれるシステムを用いて、カテプシンＥ阻害ペプチドの選択に成功し、この方法の有効性を実証した。
【００６３】
（２）第一ライブラリーの選択
ＹＬＢＳ法を使用して、図２の中で示されるように、第一ライブラリーが構築された。ｅＲＡＰＡＮＳＹ（図４に示されるシステム）においてライブラリーをＩＶＶ型（図５）にすることが重要である。すなわち機能的な分子（ペプチド）とその情報分子（ｍＲＮＡであり、引き続きｃＤＮＡに変換される）が連結される。このように作られたライブラリーは、スクリーニングに使用できる：親和性選択および機能選択（図２）。後者が特定の分子構築物、すなわち、プロテアーゼ阻害剤のためのＳＦ連結を必要としている一方、前者はターゲット分子への結合を評価することにより通常実行される。
【００６４】
図６に示される通りに、スクリーニングが進行するとともに、いずれの選択でもより大きな活性をもつペプチド集団に移行していった。個々にスクリーニングして得られたライブラリーのメンバーをクローニングすることによって、ペプスタチンＡ（これまでに同定された最も有力なＣＥ阻害剤）のＣＥ阻害活性のおよそ３０％を有するＣＥ阻害ペプチドを生成した（図６および表５）。
【００６５】
【表５】
【００６６】
ＩＶＶ由来のペプチド（つまり、エンドヌクレアーゼ分解（図４のクローン淘汰段階）によってＩＶＶからＤＮＡとリンカー部分を分離することにより得られたペプチド）を使用して、選択されたペプチドを化学的に合成する前に、これらのクローンの阻害活性は迅速に測定した。選択された分子のコーディングＤＮＡ配列に基づいてペプチドを合成し、それらの真の活性（Ａｓｙと名付けられた）を確認した。しかし、ＩＶＶ由来ペプチド（Ａｄｐと名付けられた）によっておおよその活性をモニターすることができた（表５）。
【００６７】
興味深いことには、ＩＶＶ由来ペプチド（Ａｄｐ）とＩＶＶｓ自体（Ａｉｖ）との活性の間に優れた相関性があった。一般に、ＩＶＶの阻害活性は同系統のＩＶＶ由来ペプチド（約２倍以上；表１）より大きく、恐らくＩＶＶのかさばったＤＮＡ部分がカテプシンＥの活性部位中への基質のアクセスを妨害することにより、ペプチドの阻害作用を増強する場合があることを示唆している。
【００６８】
（３）第二ライブラリーに対して使用されたブロック
第一ライブラリーの選択の生産物が８つのアミノ酸を含む可変領域を含んでいたために、４個のアミノ酸を一つのブロック単位とした。それらの阻害性ペプチド（表５中のＰｉ１〜Ｐｉ６）は、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用してクラスター分析された（図７）。そして、四量体配列は、比較的高い阻害活性（表５中のＰｉ１、Ｐｉ５およびＰｉ６）を示したコンセンサスペプチド配列から同定された。これらの４ペプチド配列に加えて、カテプシンＥ基質配列としてのＳＦ連結の構築に必要な、保存された領域（ＧＧＲＰ／ＰＴＩＦＦＲＬＫ／ＤＹＫＤＤＤＤＫ）の配列も四量体に分割され、および出発ブロック（図８）として使用された。
【００６９】
これは、共通のペプチド配列のある部分がキメラ・ペプチドのフォールディングに影響を与え、その結果その機能に影響がある場合がありうるからである。
さらに、多様性を増強するために二つの任意のブロック（Ｘ１とＸ２）を加えた。出発ブロックとしてこれらの１６個の四量体配列を使用して、徹底的にシャッフルされたＤＮＡライブラリーは、連結化（つまり、１、２、３、４、５および６個までのブロックの連結化；したがって、このライブラリーはａｌｌ ｓｔｅｐｓ ａｎｄ ａｌｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ（ＡＳＡＣ）ライブラリーとして指定された）のすべての段階の生産物を含めて生成された。このように生成されたライブラリーは、第二ライブラリーの選択に使用された。
【００７０】
（４）第二ライブラリーの選択
この段階のほとんどのペプチドが前の選択によってカテプシンＥへの親和性を有するものになっているので、親和性に基づいた選択過程は省略された。したがって、機能（ＳＦ−連結）選択が直接行なわれた。また、予想通りに、このプールからスクリーニングされた分子群からの平均活性は第一ラウンドの選択後に観察された平均活性より高かった（第二ライブラリー（２ｎｄ Ａ）の平均活性と第一ライブラリー（１ｓｔ Ｆ）との平均活性の比較）（図９）。
２回目のＳＦ−連結選択 （図１０および表５）の後にクローン・ペプチドの阻害活性を測定することによりシャッフルされたペプチドの阻害活性の向上が確認された。さらに大きな阻害活性のペプチドを同定するために、ＭＭＶを用いたクローン淘汰実験が行なわれた。
【００７１】
ＭＭＶをライブラリーＤＮＡの転写および翻訳に用いて得られたＭＭＶ中のペプチドが酵素反応を阻害すると、蛍光シグナルが生成しない。この原理に基づき、阻害活性の高いペプチド分子が提案されたわずかな体積の溶液のウェルからウェルへの転送などの必要な手順のすべては、遠心操作によって行なわれた。表１にまとめたように、（２Ａｍ−２１および２Ａｍ−３０１など、この研究で生成されたペプチドの中で最も大きな阻害活性を有した）Ａｓｙの活性の４０％以上の阻害活性もつペプチドはＭＭＶを使用した第二ライブラリーの選択後に得られた。したがって、ブロック・シャッフルされた第二ライブラリー方法は、約５０％（４５．２％、３１．５％（２Ａｍ−３０１）（Ｆ９−６５））近くに活性を増強することができた。
【００７２】
次に、アスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ（ＣＤ））、システインプロテアーゼ（カテプシンＢ（ＣＢ））およびセリンプロテアーゼ（トリプシン）（図１１）の活性阻害を調べるために、スクリーニングで選択されたペプチドのいくつかについて実験した。ペプチド２Ａｍ−３０１がＣＤ、ＣＢまたはトリプシンに対して阻害または亢進活性を示した。興味深いことに、ペプチド２Ａ−２８およびＦ９−６５がカテプシンＤ亢進活性を有した。これはアスパラギン酸プロテアーゼに対する特異性を示唆する。これらのプロテアーゼは同じアスパラギン酸プロテアーゼカテゴリーに属する。また、それらの三次元構造は解明されており、これらの三次元構造は類似しているので、ＣＥおよびＣＤ活性において全く逆の効果を示したことは興味深い。
【００７３】
（５）ペプチドペアライブラリー法の結果
図１２および表３に示した通り、カテプシンＥの活性を促進または阻害する種々のコンビネーションペプチドアプタマーを取得することができた。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、ＹＬＢＳ法のサイクルを示す。
【図２】図２は、選択のために使われたＤＮＡ分子の遺伝子領域を示す。
【図３】図３は、ＭＭＶに基づく選択のための操作手順フローを示す。
【図４】図４は、機能性ペプチド迅速淘汰系（ｅＲＡＰＡＮＳＹ）の概念図を示す。
【図５】図５は、磁性ビーズを使用したＳＦ連結ペプチド選択方法概念図を示す。
【図６】図６は、第一ライブラリー選択結果を示す。
【図７】図７は、第二ライブラリーの作製におけるクラスター解析結果を示す。
【図８】図８は、第二ライブラリーを構築するために使用されたペプチドブロックの模式図を示す。
【図９】図９は、第一ライブラリーの機能選択生産物（１ｓｔ Ｆ）、第二ライブラリーの活性化ペプチド選択生産物（２ｎｄ Ａ）、およびＭＭＶを用いた活性選択により得られた第二ライブラリー選択生産物の平均阻害活性を示す。
【図１０】図１０は、第二ライブラリー選択後に得られた高度に阻害活性を示した１２クローンの結果を示す。
【図１１】図１１は、各クローンの特異性試験結果を示す。
【図１２】図１２は、ペプチドペアライブラリー法の概念図および結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法に関する。より詳しくは、本発明は、第一のペプチドアプタマー群を統計解析およびブロックシャッフリング法で処理することにより、高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを回収することを特徴とする、上記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法に関する。
【０００２】
さらに本発明は、上記ペプチドアプタマーライブラリーを利用して、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーを作製する方法に関する。さらに、本発明は、上記いずれかのライブラリーを利用して、最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものの総称である。タンパク質間相互作用は、本質的にペプチド間相互作用である生理学的現象を基盤とする。したがって、ペプチドの中でも、特に酵素や受容体などのタンパク質に相互作用するペプチド（ペプチドアプタマー）は、酵素と疾患の関連性を解明する上でも非常に有用な研究対象であり、抗体医薬に続く有望な分子として期待されている。
【０００４】
これまでにペプチドアプタマーの研究は、組み合わせ合成、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイなどの手法を用いて実施されてきた（非特許文献１〜４）。ファージディスプレイは、ビリオン粒子の表面にファージＤＮＡにコードされたペプチドを表示する手法であり、新規なタンパク質およびペプチドをもたらすことに成功している。
【０００５】
しかし、ファージディスプレイは、処理できるペプチドおよび多様性の数が制限されるという問題があった。そこで、現在はリボソームディスプレイやｍＲＮＡディスプレイなどのインビトロシステムの開発が進められている。これまでにインビトロシステムを利用して、処理できるペプチドの分子スペクトルを拡張し、さらに１０１２−１５（ファージ・ディスプレイは１０９）にまで分子の多様性を拡大化することに成功している（非特許文献３および４）。
【非特許文献１】Acharya, A. N., Nefzi, A., Ostresh, J. M. & Houghten, R. A. (2001). J. Comb.Chem. 3, 189-195.
【非特許文献２】Smith, G. P. (1985). Science. 228, 1315-1317.
【非特許文献３】Hanes, J. & Pluckthun, A. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4937-4942.
【非特許文献４】Roberts, R. W. & Szostak, J. W. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297-12302.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、従来のインビトロシステムは、上記した長所があるにもかかわらず、方法論の不備が多いために、その使用は非常に制限されている。したがって、特定の疾患に関連する標的タンパク質に高度に相互作用（例えば、活性の促進または阻害など）する数多くの有用なペプチドアプタマーを含む、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法については未だ開発されていない。
【０００７】
したがって、本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。すなわち、本発明は、標的タンパク質に高度に相互作用する有用なペプチドアプタマーを数多くプールすることを可能とする、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００８】
さらに本発明は、作製したペプチドアプタマーライブラリーを利用して、標的タンパク質により高度に相互作用するコンビネーションペプチドを含む、コンビネーションペプチドライブラリーの作製方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、任意のペプチドアプタマー群から統計学的手法により得たアミノ酸配列情報に基づいてブロックシャッフリングする、ＡＳＡＣ（Ａｌｌ−Ｓｔｅｐｓ−Ａｌｌ−Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ）法を開発した。上記ＡＳＡＣ法を利用することで、高度に標的タンパク質に相互作用する多数のペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーを作製することに成功した。
【００１０】
さらに、本発明者らは、上記ペプチドアプタマーライブラリーから選ばれるペプチドアプタマーを基に、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーを合成し、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーを開発した。さらに、本発明者らは、これらのライブラリーの中から最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングすることができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成した発明である。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、前記共通アミノ酸配列を数個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの２以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法が提供される。
【００１２】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記クラスター解析が、アミノ酸配列間ハミング距離に基づいてアミノ酸配列をクラスタリングする手法である。
【００１３】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記ブロックシャッフリング法が、Ｙ連結に基づくブロックシャッフリング（Ｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｂｌｏｃｋ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ：ＹＬＢＳ）法である。
【００１４】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記ブロックがいずれも３、４、５または６個のアミノ酸からなる。
【００１５】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記標的タンパク質の相互作用が、標的タンパク質の活性を促進する作用または標的タンパク質の活性を阻害する作用である。
【００１６】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記標的タンパク質がアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼまたは金属プロテアーゼであり、より好ましくは、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＢまたはトリプシンである。
【００１７】
さらに本発明の別の側面によれば、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、前記の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも２種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法が提供される。
【００１８】
さらに本発明の別の側面によれば、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、前記の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも１種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも１種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【００１９】
好ましくは、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記スペーサーを介した連結が、ペプチドペアライブラリー法により達成される連結である。
【００２０】
好ましくは、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記スペーサーが、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれる配列のスペーサーである。
【００２１】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーまたはコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記タンパク質が酵素または受容体である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、第一のペプチドアプタマー群よりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーを作製することが可能になる。さらに、本発明により作製されたペプチドアプタマーライブラリーを利用して、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むライブラリーを作製することが可能になる。したがって、疾患に関連のある酵素を標的タンパク質として、これらのライブラリーから最も高度に上記標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングすることで、上記疾患の治療または予防するための組成物を作製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、前記共通アミノ酸配列を数個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの２以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および
前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【００２４】
本明細書にいう「標的タンパク質」とは、所望の標的となるタンパク質であれば特に制限されないが、上記タンパク質としては酵素や受容体が好ましい。標的タンパク質としての具体的な例としては、カテプシンＤやカテプシンＥなどのアスパラギン酸プロテアーゼ、カテプシンＢなどのシステインプロテアーゼ、またはトリプシンなどのセリンプロテアーゼなどを挙げることができる。
【００２５】
これらのプロテアーゼのうち、例えば、カテプシンＥは、免疫反応の一部として外来タンパク質を分解消化する作用を有し、リンパ腺や他の細胞において発現することが知られている。これまでに、カテプシンＥの異常活性はアトピーや癌などの疾患に関連することが知られているが、カテプシンＥ活性を特異的に促進または阻害する分子については未だ知られていない。したがって、実施例で示したような、カテプシンＥの活性を促進または阻害するなどの相互作用を示すペプチドアプタマーをプールすることは、アトピーや癌の予防または治療剤の創製において非常に有用である。
【００２６】
本明細書にいう「相互作用」とは、標的タンパク質の有する機能または作用に影響を与えるものであれば特に制限されないが、例えば、標的タンパク質（酵素）の活性促進や活性阻害、標的タンパク質（受容体）のリガンドの結合促進や結合阻害などを意味し、広義には機能または作用の調節や適正化なども含みうる。
【００２７】
本明細書にいう「ペプチドアプタマー」とは、上記した通り、酵素や受容体などのタンパク質に相互作用するペプチドであれば特に制限されず、例えば、タンパク質に相互作用するアミノ酸残基の数が２〜１００個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜２０個、最適に好ましくは２〜１０個程度のペプチドをいう。したがって、「ペプチドアプタマーライブラリー」とは、上記したペプチドアプタマーが複数集まった集団をいう。より具体的には、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの規模は１０１０以上、好ましくは１０１１以上、より好ましくは１０１２以上である。
【００２８】
本明細書にいう「標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマー」とは、例えば、標的タンパク質に相互作用して、標的タンパク質の生理活性を阻害または促進等するペプチドアプタマーであって、本発明のペプチドアプタマーライブラリーを作製する際の出発（原料）分子を意味する。したがって、本明細書にいう「標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群」は、本発明のペプチドアプタマーライブラリーを作製する際の出発分子の母集団（ライブラリー）を意味するものである。このような標的タンパク質に相互作用する第一の群としては、例えば、実施例で示した第一ライブラリーを挙げることができる。
【００２９】
本明細書にいう「アミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する」とは、統計学的手法を用いてアミノ酸配列を分類（クラスタリング）することができれば特に制限されないが、例えば、アミノ酸配列間のハミング距離を計算し、その結果に基づいてアミノ酸配列を分類する方法を挙げることができる。ここで、「ハミング距離」とは、特定の文字数を持つ二種の文字列の中で、対応する位置にある異なった文字の個数をいう。例えば、一文字表記で表したアミノ酸配列ＥＤＮＴＳとＡＤＮＫＳの間のハミング距離は、ＡとＫの位置の相違から２として計算される。このようにして計算されたハミング距離に基づき、統計アルゴリズムにより計算することにより系統樹を作製することができる。これらは手動でも可能であるが、例えば、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（サービスの主体：http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）などの計算ソフトを用いれば簡便に作製できる。
【００３０】
本明細書にいう「各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する」とは、例えば、上記クラスター解析により一つの枝にまとめられたペプチドアプタマー群のアミノ酸配列について、共通するアミノ酸配列を手動または情報処理ソフトを使うなどして自動で抽出することを意味する。
【００３１】
本明細書にいう「数個のアミノ酸」とは、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸を意味し、好ましくは３、４、５または６個のアミノ酸、より好ましくは４個のアミノ酸である。本明細書でいう「数個のアミノ酸からなるブロックに分ける」としては、例えば、８アミノ酸残基からなるペプチドを４個のアミノ酸を一つの単位として２つのブロックに分けるなどが該当する。したがって、共通アミノ酸配列を集めて、得られた配列情報から可変領域と定常領域に分け、可変領域を対象として数個のアミノ酸からなる１〜４程度のブロックに分ければよい。
【００３２】
本明細書にいう「ブロックシャッフリング法」とは、例えば、可変領域が８アミノ酸残基からなる異なる２種のペプチドを４個のアミノ酸（前半・中央・後半）ごとにブロック化し、得られた計６ブロックをシャッフリングすることにより確率論的な組み合わせで種々のペプチドを合成することができる方法をいう。そのような方法として、例えば、本発明者らによって開発されたＹ連結に基づくブロックシャッフリング（Ｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｂｌｏｃｋ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ：ＹＬＢＳ）法がある（例えば、K.Kitamra et al., Protein Engineering, （２００２）、Vol.15、No.10、pp.843-853を参照）。
【００３３】
上記ＹＬＢＳ法の概略は図１に示した通りであり、この図を用いて以下に説明する。
２種の一本鎖ＤＮＡ（５’ハーフ鎖と３’ハーフ鎖）をシャッフリング用配列として作製する。これらの５’ハーフ鎖と３’ハーフ鎖において、単一のブロック配列を３’末端または５’末端のいずれかに配置する。さらに、各鎖のステム領域は相補的であり、ＰＣＲのプライマー結合領域として作用するＤブランチ領域（図中のＢＤ５とＢＤ３）が含まれる。３’ハーフ鎖の５’末端はライゲーション反応のために予めリン酸化されている必要がある。５’ハーフ鎖および３’ハーフ鎖の同量（通常１０ｐｍｏｌ／１０μｌ）の組み合わせが用いられ、ステム領域でハイブリダイゼーションされる。５’ハーフ鎖の３’末端および３’ハーフ鎖の５’末端は、０．１ｍＭ ＡＴＰの存在下で５０ＵのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（タカラ、京都、日本）でライゲートされる。ライゲーション生成物のプレ増幅後（このステップを省くことも可能）、プレ５’ハーフ鎖およびプレ３’ハーフ鎖のＰＣＲ産物が２種のＰＣＲ（図中の２種のプライマーセット：ｐＳ５／ｐＢＤ３とｐＢＤ３／ｐＳ３）により得られる。ステム領域を含むプライマー（プライマー、ｐＳ５およびｐＳ３）をあらかじめ５’末端でビオチン化しておき、次のＹライゲーションサイクル用一本鎖ＤＮＡを作製するために使用する。ＰＣＲ産物は対応する制限酵素（３’ハーフ鎖はＭｂｏＩＩ、５’ハーフ鎖はＡｌｗＩ）で分離消化され、その後アルカリ変性により分離された一本鎖ＤＮＡはアビジン−ビオチン結合（ストレプトアビジン被覆磁性ビーズを使用）によって回収される。プレ５’ハーフのビオチン化鎖とプレ３’ハーフの非ビオチン化鎖は、引き続き５’ハーフ鎖および３’ハーフ鎖として、次のＹライゲーションサイクルで使用される。サイクル数ｎに依存して、ライゲートされるブロックのサイズおよび多様性が指数的に増加しうる：サイズは２ｎ（＝ｓ）であり生産物多様性はｄｓ（ｄは開始時のブロックの多様性の値）。例えば、ｄ＝８であれば、ＰＣＲ生産物の多様性は、６４、４０９６、１．７×１０７、２．８×１０１４と増加する。なお、図中の○で囲まれたＢおよびＰは、それぞれビオチン化とリン酸化を示す。したがって、上記したようなブロックシャッフリング法によれば、多様性のある数多くのペプチドアプタマーからなる第二の群を作製することができる。
【００３４】
本明細書にいう「第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマー」とは、第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと比較した場合に、同等またはそれより高度に標的タンパク質に相互作用を示すペプチドアプタマーを意味する。ここで、「高度に標的タンパク質に相互作用する」とは、例えば、相互作用が活性阻害作用である場合は標的タンパク質の活性をより大きい度合いで阻害することを意味し、または相互作用が活性促進作用である場合は標的タンパク質の活性をより大きい度合いで促進することを意味する。または、「同等またはそれより高度に標的タンパク質に相互作用を示すペプチドアプタマー」とは、基準となる相互作用と比べて同じかそれよりも大きい度合いで標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを意味する。
【００３５】
本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも２種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【００３６】
別の側面によれば、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも１種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも１種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【００３７】
本明細書にいう「コンビネーションペプチドアプタマー」は、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも２種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させるか、または、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも１種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも１種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させることにより作製が可能である。スペーサーとしては、一定数のアミノ酸残基からなるスペーサーであれば特に制限されないが、例えば、３〜３０アミノ酸残基、好ましくは５〜１５アミノ酸残基、より好ましくは８〜１２アミノ酸残基からなるスペーサーが用いられる。スペーサーの例として、グリシンからなる配列（Ｇ１０およびＧ１５；アルファベットはアミノ酸の一文字表記を表し、数字はアミノ酸の数を表す。以下同じ。）、グリシンおよびセリンからなる配列（Ｇ３ＳＧ３Ｇ２およびＧ３ＳＧ３ＳＧ３ＳＧ３）ならびにグリシンおよびプロリンからなる配列（Ｇ３ＰＧ３ＰＧ２およびＧ３ＰＧ３ＰＧ３ＰＧ３）などがあり、具体例としては配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれる配列を利用できる。
【００３８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
１ 材料および方法
（１）ライブラリーの構築
組み合わせＤＮＡおよびＩＶＶ（in vitro virus）ペプチドライブラリーは、ＹＬＢＳ法およびｃＤＮＡディスプレイによって構築された。これらの実験に使用されたＤＮＡブロックおよびプライマーの配列を表１および表２にまとめた。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【００４２】
（２）選択に使用されたＣＥ固定化ビーズ
カテプシンＥ（ＣＥ）は通常知られる方法に従ってネズミ脾臓から調製された。精製ＣＥは、メーカーの指示に従って、化学的に安定したアミド結合を形成する化合物をカップリングし得るアミンを使用することにより、ＮＨＳ活性化セファロース・ビーズ（ＧＥヘルスケア）上で固定された。酵素をカップリングしたビーズは、使用時まで４℃で１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）中に保管された。カップリング効率は、カップリングしていない酵素の吸光度を遊離酵素の吸光度と比較することにより計算された。
【００４３】
（３）親和性選択
選択緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．２）の１００μｌ中のＩＶＶペプチドライブラリーは、ＣＥ固定化ビーズの５μｌと３０分間混合され、２５℃で３０分間インキュベートされた。ビーズは、選択ラウンドごと、つまり、ラウンド１は２：２：１、ラウンド２は２：２：２、ラウンド３は３：３：３に変えて洗浄プロトコールに従って、２００μｌの選択緩衝液、洗浄緩衝液−１（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２）および洗浄緩衝液−２（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２）で洗浄された。最後に、ビーズは、溶出緩衝液−１（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．２）の２００μｌ中で懸濁され、５分間３７℃でインキュベートされた。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）の後、ビーズは溶出緩衝液−１で再び洗浄された。結合した上清は保管された（Ｓｕｐ１）。ビーズは、溶出緩衝液−２（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．２）で懸濁され、５分間９５℃でインキュベートされた。インキュベーション後、ビーズは取り除かれ、および上清は保管された（Ｓｕｐ２）。Ｓｕｐ１とＳｕｐ２の中のＩＶＶはＢｉｏ−Ｓｐｉｎカラム（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）で精製された。
【００４４】
（４）機能選択
親和性選択のラウンド３の結果として作製されたＤＮＡライブラリーは、可変領域としてＩＶＶ−ＳＦ−連結ＤＮＡ構築物（図２）に挿入された。反応緩衝液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ４．５）の１００μｌ中のＩＶＶ−ＳＦ−連結ペプチドライブラリーは、ＣＥ固定ビーズの５μｌと混合され、１０分間４０℃でインキュベートされた。インキュベーション後に、ビーズは親和性選択に記載した通りに、洗浄および溶出された。
【００４５】
選択緩衝液、洗浄緩衝液−１および洗浄緩衝液−２を使用した洗浄繰り返し回数のプロトコールは、選択ラウンド（Ｆ１−Ｆ９）によって以下のように実行された：Ｆ１は３：３：３；Ｆ２は４：５：３；Ｆ３は５：５：５；Ｆ４は５：７：５；Ｆ５は５：７：７；Ｆ６は５：１０：７；Ｆ７は ５：１０：１０；Ｆ８は５：１５：１０；Ｆ９は５：１５：１５。
【００４６】
（５）ＩＶＶからのペプチドの回収
ＰＣＲ溶液（７．５μｌ、５ｐｍｏｌのＤＮＡ）は、インビトロ翻訳システムキット（和光純薬システム、和光）の１２．５μｌのＡ溶液および５μｌのＢ溶液で混合され、および１時間３７℃でインキュベートされた。事前に２００μｌの１×結合緩衝液（ＴａＫａＲａ）で２度洗浄され、および２５μｌの２×結合緩衝液で懸濁された磁気ビーズ懸濁液（１０μｌ、Ｍａｇｎｏｔｅｘ ＳＡ、ＴａＫａＲａ）は、翻訳混合物に加えられ、１時間３７℃でインキュベートされた。インキュベーション後、磁気ビーズは磁石で取り除かれ、２００μｌの０．０１％ ＢＳＡ溶液で洗浄された。
【００４７】
ビーズは、２ＵのファクターＸａを含む、ファクターＸａ反応混合物（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．８）の中で懸濁され、混合の後に１時間３７℃でインキュベートされた。上清は磁石で回収され、０．２５μｌの１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でｐＨを調節された。次に、事前に１×Ｘａ緩衝液（ｐＨ ８．０）で洗浄されたＸａ除去樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）の１０μｌが、回収された溶液に加えられ、混合の後に１０分間室温でインキュベートされた。上清は遠心分離によって回収された。回収されたペプチドは合計１０ｐｍｏｌであると見積もられ、溶液の２μｌが阻害活性を測定するために使用された。
【００４８】
（６）活性分析
阻害活性分析のために、（ＩＶＶまたは有機合成の何れかから得られた）ペプチドアプタマーは、９０μｌの選択緩衝液において１：１のモル比で（０．１％のＢＳＡ中の）ＣＥとプレインキュベートされた。次に、０．１ｍＭ 蛍光性ＣＥ基質（ペプチド研究所）の１０μｌが溶液に加えられ、１０分間４０℃でインキュベートされた。反応生成物の蛍光強度（λｅｍ：４３０ｎｍ、λｅｘ：３６０ｎｍ）は、蛍光マイクロプレートリーダー（ＦｌｕＰＯＬＯ、ＴａＫａＲａ）によって測定された。
【００４９】
パーセント阻害は下記式（１）によって計算された：
コントロールの％阻害＝１００×（１−Ｓｆ／ＣＥｆ） （１）
上記式（１）中、Ｓｆは酵素（ＣＥ）、蛍光性基質および潜在的な阻害剤を含む試料溶液の蛍光強度であり、ＣＥｆはブランク溶液の蛍光強度であり、阻害剤のない試料溶液と同様である。
【００５０】
（７）マルチ・ミクロ・ヴェッセル（ＭＭＶ）およびその中での反応
ＭＭＶに基づいたクローン淘汰用のＤＮＡ構築物、およびＭＭＶを使用した実験操作を、図３の中で簡潔に示した。ＭＭＶは、光照射による重合反応を開始するためにＤＭＤ（ディジタル多重反射鏡装置）プロジェクターを使用して、アクリルアミド（１８％）ゲルで作られた。ＭＭＶは、通常２．５×２．５ｃｍ２の面積の上に１０２４個の小さなウェルを保持する。ここでＰＣＲ、インビトロ転写、インビトロ翻訳およびカテプシンＥ−反応のすべてが行なわれた。
【００５１】
（８）ＩＣ５０阻害の特性
ＣＥは上記された通りに、ペプチド・クローンの濃度を変えてインキュベートされた。パーセント阻害は上記式（１）によって計算された。ＩＣ５０（５０％の阻害が観察された濃度）は、投与−反応曲線から決定された。
【００５２】
（９）解離定数の測定
解離定数の測定はＦｒｉｇｕｅｔらの方法を改良して実施された。上記の方法の中で言及されているように、それぞれのペプチドのＩＶＶが用意された。大型のｍＲＮＡおよびリボソームは、ペプチド結合物を遊離するために３０分間２５℃でリボヌクレアーゼＡおよびリボヌクレアーゼＨ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて消化によって放出された。一定量のペプチド結合物（〜２ｎＭ）はＣＥの量を変えて（１ｎＭ〜１μＭ）１時間インキュベートされた。混合物は、一定量の固定化ＣＥ（〜２００ｎＭ）に適用され、さらに３０分間インキュベートされた。ＰＢＳ−Ｔ（リン酸緩衝化塩溶液；０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いた数回の洗浄後、Ｐｅｎｔａ．Ｈｉｓ ＨＲＰ（ＱＩＡＧＥＮ）が１／２０００希釈で加えられ、１時間インキュベートされた。ビーズはＰＢＳ−Ｔで徹底的に洗浄され、その後基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、シグマ）を添加した。発色をさせた後、反応は０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって止められた。吸光度はマイクロプレート・リーダ（Ｔｅｃａｎ）を用いて４５０ｎｍで測定された。データはＧｒａｐｈＰａｄプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社）を使用してプロットされた。
【００５３】
（１０）ペプチドペアライブラリー法（図１２）
ペプチドペアライブラリー法は下記の通りに実施した。
［ａ］材料
【００５４】
［ｂ］ペプチドアプタマーの連結候補
配列表の配列番号４および５の配列が、ペプチドアプタマーをコードするＤＮＡ配列と連結させる配列として用いられた。ペプチドアプタマーをコードするＤＮＡは、配列番号４の５’末端または配列番号５の３’末端に連結する。
【００５５】
ＣＥに相互作用するペプチドおよびＹタグを配列表の配列番号６〜１８とした（表３）。
【００５６】
【表３】
【００５７】
［ｃ］プライマー
ペプチドペアライブラリー法に用いたプライマーを配列表の配列番号１９〜２８とした（表４）。
【００５８】
【表４】
【００５９】
［ｄ］バッファー
【００６０】
［ｅ］方法
（１）ペプチドとスペーサーの結合
４）電気泳動
５）５’ハーフＤＮＡの抽出
（２）ペプチドとｙタグの連結
４）電気泳動
５）３’ハーフＤＮＡの抽出
（３）ペプチド＋スペーサー＋ペプチド＋ｙタグの連結
３）電気泳動
４）ＤＮＡの抽出
【００６１】
２ 結果
（１）ペプチドアプタマーの選択（淘汰）のための戦略
ｍＲＮＡディスプレイに基づいたインビトロ選択を使用して、ペプチドアプタマーの選択および淘汰の戦略を開発した（図４）。第一ライブラリーは、新規な機能を備えた生物活性分子の同定において不可欠である。第二ライブラリーの選択は、分子淘汰のさらなる選抜を可能にする。第一および第二ライブラリーの選択段階は、両方とも二種の淘汰、すなわち集団淘汰とクローン淘汰を含んでいる。
【００６２】
集団淘汰は、プールされた分子のライブラリーを選別する。しかし、クローン淘汰は、クローンごとに分子を個々に選別する。これに加えて、従来方式の困難な段階を回避するために、用途の広い有用性のあるマイクロアレイ、換言すればマルチ・ミクロ・ヴェッセル（ＭＭＶ）を用いるクローニングである新たな方法を用いた。この種のマイクロアレイの導入は、選択の後期段階における迅速なスクリーニングに非常に有用であった。淘汰の進行とともに、より低活性の分子が削除されていくと同時に、各ライブラリー内の多様性は減少していく。第二ライブラリーの構築は、第一ライブラリーの淘汰で生成した配列情報に基づいて達成される。すなわち、第一ライブラリーから選ばれたペプチドブロックを使用して行う、ブロックシャッフリング法（Ａｌｌ−ｓｔｅｐｓ−ａｌｌ−ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ（ＡＳＡＣ）法）を開発して組み込んだｅＲＡＰＡＮＳＹ（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｒａｐｉｄ ｐａｎｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）と呼ばれるシステムを用いて、カテプシンＥ阻害ペプチドの選択に成功し、この方法の有効性を実証した。
【００６３】
（２）第一ライブラリーの選択
ＹＬＢＳ法を使用して、図２の中で示されるように、第一ライブラリーが構築された。ｅＲＡＰＡＮＳＹ（図４に示されるシステム）においてライブラリーをＩＶＶ型（図５）にすることが重要である。すなわち機能的な分子（ペプチド）とその情報分子（ｍＲＮＡであり、引き続きｃＤＮＡに変換される）が連結される。このように作られたライブラリーは、スクリーニングに使用できる：親和性選択および機能選択（図２）。後者が特定の分子構築物、すなわち、プロテアーゼ阻害剤のためのＳＦ連結を必要としている一方、前者はターゲット分子への結合を評価することにより通常実行される。
【００６４】
図６に示される通りに、スクリーニングが進行するとともに、いずれの選択でもより大きな活性をもつペプチド集団に移行していった。個々にスクリーニングして得られたライブラリーのメンバーをクローニングすることによって、ペプスタチンＡ（これまでに同定された最も有力なＣＥ阻害剤）のＣＥ阻害活性のおよそ３０％を有するＣＥ阻害ペプチドを生成した（図６および表５）。
【００６５】
【表５】
【００６６】
ＩＶＶ由来のペプチド（つまり、エンドヌクレアーゼ分解（図４のクローン淘汰段階）によってＩＶＶからＤＮＡとリンカー部分を分離することにより得られたペプチド）を使用して、選択されたペプチドを化学的に合成する前に、これらのクローンの阻害活性は迅速に測定した。選択された分子のコーディングＤＮＡ配列に基づいてペプチドを合成し、それらの真の活性（Ａｓｙと名付けられた）を確認した。しかし、ＩＶＶ由来ペプチド（Ａｄｐと名付けられた）によっておおよその活性をモニターすることができた（表５）。
【００６７】
興味深いことには、ＩＶＶ由来ペプチド（Ａｄｐ）とＩＶＶｓ自体（Ａｉｖ）との活性の間に優れた相関性があった。一般に、ＩＶＶの阻害活性は同系統のＩＶＶ由来ペプチド（約２倍以上；表１）より大きく、恐らくＩＶＶのかさばったＤＮＡ部分がカテプシンＥの活性部位中への基質のアクセスを妨害することにより、ペプチドの阻害作用を増強する場合があることを示唆している。
【００６８】
（３）第二ライブラリーに対して使用されたブロック
第一ライブラリーの選択の生産物が８つのアミノ酸を含む可変領域を含んでいたために、４個のアミノ酸を一つのブロック単位とした。それらの阻害性ペプチド（表５中のＰｉ１〜Ｐｉ６）は、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用してクラスター分析された（図７）。そして、四量体配列は、比較的高い阻害活性（表５中のＰｉ１、Ｐｉ５およびＰｉ６）を示したコンセンサスペプチド配列から同定された。これらの４ペプチド配列に加えて、カテプシンＥ基質配列としてのＳＦ連結の構築に必要な、保存された領域（ＧＧＲＰ／ＰＴＩＦＦＲＬＫ／ＤＹＫＤＤＤＤＫ）の配列も四量体に分割され、および出発ブロック（図８）として使用された。
【００６９】
これは、共通のペプチド配列のある部分がキメラ・ペプチドのフォールディングに影響を与え、その結果その機能に影響がある場合がありうるからである。
さらに、多様性を増強するために二つの任意のブロック（Ｘ１とＸ２）を加えた。出発ブロックとしてこれらの１６個の四量体配列を使用して、徹底的にシャッフルされたＤＮＡライブラリーは、連結化（つまり、１、２、３、４、５および６個までのブロックの連結化；したがって、このライブラリーはａｌｌ ｓｔｅｐｓ ａｎｄ ａｌｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ（ＡＳＡＣ）ライブラリーとして指定された）のすべての段階の生産物を含めて生成された。このように生成されたライブラリーは、第二ライブラリーの選択に使用された。
【００７０】
（４）第二ライブラリーの選択
この段階のほとんどのペプチドが前の選択によってカテプシンＥへの親和性を有するものになっているので、親和性に基づいた選択過程は省略された。したがって、機能（ＳＦ−連結）選択が直接行なわれた。また、予想通りに、このプールからスクリーニングされた分子群からの平均活性は第一ラウンドの選択後に観察された平均活性より高かった（第二ライブラリー（２ｎｄ Ａ）の平均活性と第一ライブラリー（１ｓｔ Ｆ）との平均活性の比較）（図９）。
２回目のＳＦ−連結選択 （図１０および表５）の後にクローン・ペプチドの阻害活性を測定することによりシャッフルされたペプチドの阻害活性の向上が確認された。さらに大きな阻害活性のペプチドを同定するために、ＭＭＶを用いたクローン淘汰実験が行なわれた。
【００７１】
ＭＭＶをライブラリーＤＮＡの転写および翻訳に用いて得られたＭＭＶ中のペプチドが酵素反応を阻害すると、蛍光シグナルが生成しない。この原理に基づき、阻害活性の高いペプチド分子が提案されたわずかな体積の溶液のウェルからウェルへの転送などの必要な手順のすべては、遠心操作によって行なわれた。表１にまとめたように、（２Ａｍ−２１および２Ａｍ−３０１など、この研究で生成されたペプチドの中で最も大きな阻害活性を有した）Ａｓｙの活性の４０％以上の阻害活性もつペプチドはＭＭＶを使用した第二ライブラリーの選択後に得られた。したがって、ブロック・シャッフルされた第二ライブラリー方法は、約５０％（４５．２％、３１．５％（２Ａｍ−３０１）（Ｆ９−６５））近くに活性を増強することができた。
【００７２】
次に、アスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ（ＣＤ））、システインプロテアーゼ（カテプシンＢ（ＣＢ））およびセリンプロテアーゼ（トリプシン）（図１１）の活性阻害を調べるために、スクリーニングで選択されたペプチドのいくつかについて実験した。ペプチド２Ａｍ−３０１がＣＤ、ＣＢまたはトリプシンに対して阻害または亢進活性を示した。興味深いことに、ペプチド２Ａ−２８およびＦ９−６５がカテプシンＤ亢進活性を有した。これはアスパラギン酸プロテアーゼに対する特異性を示唆する。これらのプロテアーゼは同じアスパラギン酸プロテアーゼカテゴリーに属する。また、それらの三次元構造は解明されており、これらの三次元構造は類似しているので、ＣＥおよびＣＤ活性において全く逆の効果を示したことは興味深い。
【００７３】
（５）ペプチドペアライブラリー法の結果
図１２および表３に示した通り、カテプシンＥの活性を促進または阻害する種々のコンビネーションペプチドアプタマーを取得することができた。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、ＹＬＢＳ法のサイクルを示す。
【図２】図２は、選択のために使われたＤＮＡ分子の遺伝子領域を示す。
【図３】図３は、ＭＭＶに基づく選択のための操作手順フローを示す。
【図４】図４は、機能性ペプチド迅速淘汰系（ｅＲＡＰＡＮＳＹ）の概念図を示す。
【図５】図５は、磁性ビーズを使用したＳＦ連結ペプチド選択方法概念図を示す。
【図６】図６は、第一ライブラリー選択結果を示す。
【図７】図７は、第二ライブラリーの作製におけるクラスター解析結果を示す。
【図８】図８は、第二ライブラリーを構築するために使用されたペプチドブロックの模式図を示す。
【図９】図９は、第一ライブラリーの機能選択生産物（１ｓｔ Ｆ）、第二ライブラリーの活性化ペプチド選択生産物（２ｎｄ Ａ）、およびＭＭＶを用いた活性選択により得られた第二ライブラリー選択生産物の平均阻害活性を示す。
【図１０】図１０は、第二ライブラリー選択後に得られた高度に阻害活性を示した１２クローンの結果を示す。
【図１１】図１１は、各クローンの特異性試験結果を示す。
【図１２】図１２は、ペプチドペアライブラリー法の概念図および結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、
各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、
前記共通アミノ酸配列を数個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの２以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および
前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記クラスター解析が、アミノ酸配列間ハミング距離に基づいてアミノ酸配列をクラスタリングする手法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ブロックシャッフリング法が、Ｙ連結に基づくブロックシャッフリング（Ｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｂｌｏｃｋ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ：ＹＬＢＳ）法である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ブロックがいずれも３、４、５または６個のアミノ酸からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記標的タンパク質の相互作用が、標的タンパク質の活性を促進する作用または標的タンパク質の活性を阻害する作用である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的タンパク質がアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼまたは金属プロテアーゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記アスパラギン酸プロテアーゼがカテプシンＤまたはカテプシンＥであり；前記システインプロテアーゼがカテプシンＢであり；または前記セリンプロテアーゼがトリプシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
請求項１〜７に記載の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも２種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および
前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。
【請求項９】
標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
請求項１〜７に記載の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも１種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも１種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および
前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記スペーサーを介した連結が、ペプチドペアライブラリー法により達成される連結である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記スペーサーが、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれる配列のスペーサーである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が酵素または受容体である、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１】
標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、
各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、
前記共通アミノ酸配列を数個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの２以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および
前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記クラスター解析が、アミノ酸配列間ハミング距離に基づいてアミノ酸配列をクラスタリングする手法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ブロックシャッフリング法が、Ｙ連結に基づくブロックシャッフリング（Ｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｂｌｏｃｋ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ：ＹＬＢＳ）法である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ブロックがいずれも３、４、５または６個のアミノ酸からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記標的タンパク質の相互作用が、標的タンパク質の活性を促進する作用または標的タンパク質の活性を阻害する作用である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的タンパク質がアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼまたは金属プロテアーゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記アスパラギン酸プロテアーゼがカテプシンＤまたはカテプシンＥであり；前記システインプロテアーゼがカテプシンＢであり；または前記セリンプロテアーゼがトリプシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
請求項１〜７に記載の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも２種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および
前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。
【請求項９】
標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
請求項１〜７に記載の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも１種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも１種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および
前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記スペーサーを介した連結が、ペプチドペアライブラリー法により達成される連結である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記スペーサーが、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれる配列のスペーサーである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が酵素または受容体である、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００９−１４９５４９（Ｐ２００９−１４９５４９Ａ）
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２８０６０（Ｐ２００７−３２８０６０）
【出願日】平成１９年１２月１９日（２００７．１２．１９）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１９０５４８）国立大学法人埼玉大学 (292)
【出願人】（５０５３８９５６９）財団法人埼玉県中小企業振興公社 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１９日（２００７．１２．１９）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１９０５４８）国立大学法人埼玉大学 (292)
【出願人】（５０５３８９５６９）財団法人埼玉県中小企業振興公社 (7)
【Ｆターム（参考）】
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