ペプチド
【課題】ツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）と同等の糖認識特性を有しながら、他の物性を改変したレクチンペプチドを提供する。
【解決手段】ＰＴＬと同等のフコースα１→６糖鎖への結合活性を持ち、ＰＴＬの特定のアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸がリジン及び／又はアルギニンで置換されたペプチド、および該ペプチドを用いたフコースα１→６糖鎖関連疾患の診断薬。
【解決手段】ＰＴＬと同等のフコースα１→６糖鎖への結合活性を持ち、ＰＴＬの特定のアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸がリジン及び／又はアルギニンで置換されたペプチド、および該ペプチドを用いたフコースα１→６糖鎖関連疾患の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なペプチドに関し、より詳細には糖結合活性を有する新規なペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、担子菌の一種であるツチスギタケからツチスギタケレクチン（以下、ＰＴＬという）を新規に単離した（特許文献１）。ＰＴＬは、フコースα１→６糖鎖に特異的に認識するという特性を有する。フコースα１→６糖鎖と親和性を有する従来のレクチンとして、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）等が知られているが、これらのレクチンは、α１→６結合以外のフコースを持つ糖脂質系糖鎖や、フコースを持たないハイマンノース糖鎖にも親和性を示す。一方、ＰＴＬは、フコースα１→６糖鎖を特異的に認識するレクチンとして、従来のレクチンよりも優れている。
【０００３】
ＰＴＬは、その糖認識特性により、フコースα１→６糖鎖が関与する疾患の診断薬、フコースα１→６糖鎖の検出方法、フコースα１→６糖鎖の分別方法等への利用が多いに期待される。例えば、Ｎ結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースをα１→６結合として転移させるフコースα１→６転移酵素（α１→６ＦｕｃＴ）の遺伝子は、肝細胞の癌化にともなって発現することが知られている。この癌化した肝細胞の有無を、ＰＴＬを用いたレクチン親和電気泳動で検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の方法に従ってツチスギダケからＰＴＬを単離抽出することは容易であるが、ＰＴＬを化学合成できれば、安定供給、生産コスト低減、純度の向上等さまざまな点で有利である。さらに、等電点、溶解性、糖結合活性等の物性を自在に変更することができれば、その利用価値が一層高まる。
【０００６】
そこで、本発明の課題は、ＰＴＬのような糖認識特性を有し、さらに物性を変更または改善したペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を鋭意検討した結果、配列番号１のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸を置換、付加又は欠失することで解決できることを見いだした。すなわち、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸がリジン及び／又はアルギニンで置換されかつ糖結合活性を有するペプチドを提供する。
【０００８】
上記ペプチドは、リジン及び／又はアルギニンにより置換されるアミノ酸は、アラニン、プロリン、バリン、トレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。リジン又はアルギニンで置換されるアミノ酸は、アミノ酸配列Ｃ末端のトレオニン及びグリシンであることが好ましい。
【０００９】
上記ペプチドは、さらに、糖結合活性を有する限り、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンが付加されてもよい。
【００１０】
本発明は、また、配列番号１に示すアミノ酸配列に１又は数個のリジン及び／又はアルギニンが付加されかつ糖結合活性を有するペプチドを提供する。
【００１１】
上記ペプチドは、糖結合活性を有する限り、さらに、リジン及びアルギニン以外のアミノ酸が欠失されてもよい。
【００１２】
欠失するアミノ酸は、トレオニン及びグリシンの少なくとも一種であることが好ましい。
【００１３】
上記ペプチドの糖結合活性は、例えばフコースα１→６糖鎖への結合活性である。
【００１４】
上記ペプチドの等電点は、４．６７よりも高いことが好ましい。
【００１５】
本発明のペプチドは、標識されていることが好ましい。
【００１６】
本発明は、上記の同一又は異なるペプチド同士が複数会合しかつ糖結合活性を有するペプチドもまた提供する。
【００１７】
本発明は、例えば配列番号２〜１４のいずれかで示されるペプチドである。
【００１８】
本発明は、上記ペプチドを含む診断薬又はキットを提供する。
【００１９】
上記診断薬又はキットは、例えばフコースα１→６糖鎖を検出するのに有用である。
【００２０】
本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで置換することを含む、糖結合活性を有するペプチドの改変方法を提供する。
【００２１】
上記方法は、さらに、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンを付加してもよい。
【００２２】
本発明は、また、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで付加することを含む、糖結合活性を有するペプチドの改変方法を提供する。
【００２３】
上記方法は、さらに、リジン及び／又はアルギニン以外の１又は数個のアミノ酸を欠失させてもよい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、ＰＴＬに似た性質の新規なペプチドが安価かつ容易に提供される。本発明のペプチドは、ＰＴＬに対して、糖結合活性、赤血球凝集活性、等電点、溶解性、熱安定性等の物性を自在に変更することもできる。
【００２５】
このペプチドは、特にフコースα１→６糖鎖に対する特異性が高いことから、フコースα１→６糖鎖の特異的結合剤、糖鎖研究用試薬、フコースα１→６糖鎖が関係する腫瘍マーカーの正確な検出、予後判定、治療効果判定、並びに新規な腫瘍マーカーの探索等への利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＡＦＰ−Ｌ１とＡＦＰ−Ｌ３との分離試験を、従来のLCAを添加したゲルを用いて行った結果を示す。図中、実腺矢印は、ＡＦＰ−Ｌ３を示し、そして、波線矢印は、ＡＦＰ−Ｌ１を示している（以下、同じ）。
【図２】ＡＦＰ−Ｌ１とＡＦＰ−Ｌ３との分離試験を、対照のペプチド（配列番号１）を用いて行った結果を示す。
【図３】ＡＦＰ−Ｌ１とＡＦＰ−Ｌ３との分離試験を、実施例９のペプチド（配列番号１０）を用いて行った結果を示す。
【図４】ＡＦＰ−Ｌ１とＡＦＰ−Ｌ３との分離試験を、実施例６のペプチド（配列番号７）を用いて行った結果を示す。
【図５】癌患者血清（３検体）について、実施例６のペプチドを用いたＡＦＰ分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に、本発明のペプチドを詳細に説明する。本発明のペプチドは、担子菌の一種であるツチスギダケに含まれるＰＴＬをベースとする。ＰＴＬのアミノ酸配列の一種を配列番号１に示す。ＰＴＬは、特許文献１に記載の製造方法、アミノ酸配列に基づいた化学合成、遺伝子工学的手法等により取得できる。
【００２８】
本発明のペプチドの一実施態様は、配列番号１に示すアミノ酸配列が１又は数個のリジンで置換されかつ糖結合活性を有するペプチドである。塩基性アミノ酸であるリジンで置換すると、糖結合活性を強化する、また、糖結合活性を維持しつつペプチドの等電点を増加することができることが判明した。そのような例として、配列番号２、３、４、５及び１０が挙げられる。等電点の増大は、親和電気泳動分析の分解能の向上に寄与する。
【００２９】
本発明の別の一実施態様は、配列番号１に示すアミノ酸配列が１又は数個のアルギニンで置換されかつ糖結合活性を有するペプチドが提供される。塩基性アミノ酸であるアルギニンで置換すると、糖結合活性を維持しつつ、ペプチドの等電点を増加することができることが判明した。そのような例として、配列番号１２が挙げられる。
【００３０】
リジン又はアルギニンで置換する場所によっては、糖結合活性の強さが変わり得る。置換されるアミノ酸は、アラニン、プロリン、バリン、トレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
【００３１】
リジンで置換される場合、特にアミノ酸Ｎ末端のアラニン（配列番号２〜５）、プロリン（配列番号３〜５）、バリン（配列番号４〜５）、あるいはアミノ酸配列Ｃ末端のトレオニン及びグリシンが２個のリジンで置換されることが好ましい。そのような例として、配列番号１０が挙げられる。
【００３２】
アルギニンで置換される場合、特にアミノ酸配列Ｃ末端のトレオニン及びグリシンが２個のアルギニンで置換されることが好ましい。そのような例として、配列番号１２が挙げられる。
【００３３】
置換されるアミノ酸の個数は、１個又は数個であり、好ましくは１〜４個である。
【００３４】
上記リジン及び／又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列に、さらに、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンを付加してもよい。そのような例として、配列番号９が挙げられる。
【００３５】
本発明の別の一実施態様は、配列番号１に示すアミノ酸配列にリジン及び／又はアルギニンが付加されかつ糖結合活性を有するペプチドが提供される。そのような例として、配列番号１４が挙げられる。
【００３６】
付加されるアミノ酸の個数は、１個又は数個であり、好ましくは１〜２個である。
【００３７】
上記リジン及び／又はアルギニンで置換及び／又は付加された場合、さらにリジン又はアルギニン以外のアミノ酸が欠失することは、糖結合活性を有する限り可能である。そのような例として、配列番号６〜８、１１及び１３が挙げられる。
【００３８】
リジンで置換又は付加される場合、欠失してもよいアミノ酸としては、トレオニン及びグリシンの少なくとも一種が好ましい。トレオニン欠失の例として、配列番号８及び１３、そして、グリシン欠失の例として、配列番号６、７、８、１１及び１３が挙げられる。
【００３９】
アミノ酸の欠失を伴う場合、リジンで置換してもよいアミノ酸は、トレオニン（配列番号６、７及び１１）、アラニン（配列番号７）、チロシン（配列番号７及び８）、及びヒスチジン（配列番号１３）からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
【００４０】
欠失されるアミノ酸の個数は、１個又は数個であり、好ましくは１〜２個である。
【００４１】
配列番号１のアミノ酸配列に対して置換、欠失及び付加の少なくとも一種で変更されるアミノ酸の数は、１〜数個であり、好ましくは１〜４個である。
【００４２】
本発明のペプチドは、糖結合活性を有する限り、その特異性は問わない。特に、ＰＴＬのようにフコースα１→６糖鎖への糖結合特異性を有することが好ましい。糖結合特異性の測定は、常法により行うことができる。例えば、ペプチドを添加した溶液をキャピラリー電気泳動装置に充填し、標識した標準糖鎖を展開させる。泳動後、標識に基づいた検出手段で検出する。
【００４３】
本発明のペプチドの等電点は、ＰＴＬの等電点（４．６７）よりも高いことが利用上好ましく、さらに４．６９〜９．００の範囲にある。
【００４４】
本発明のペプチドは、標識されていることが好ましい。標識手段は、特に制限なく公知の標識化方法を適用できる。例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合等を挙げることができる。標識化合物としては、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物等を挙げることができる。具体的には、ビオチン（実施例１３及び１４）、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりペプチドと結合することができる。
【００４５】
本発明のペプチドは、同一又は異なるペプチドがサブユニットとなって複数会合しかつ糖結合活性を有するペプチドでもよい。会合により、糖結合活性や赤血球凝集活性の向上を図ることができる。
【００４６】
ペプチドの会合する数は、通常、２個以上であり、好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜４個である。複数のペプチドを会合させる方法は、糖結合活性を消失させない限り、特に制限されない。例えば、アビジン−ビオチン反応（実施例１４）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等の縮合剤による反応が挙げられる。
【００４７】
本発明は、また、上記ペプチドを含む診断薬又はキットを提供する。この診断薬又はキットは、フコースα１→６糖鎖の検出に有用である。この検出には、フコースα１→６糖鎖の増大や減少の傾向をつかむことも含まれる。フコースα１→６糖鎖が関連する疾患の例としては、肝細胞癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、小腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、膵癌、小細胞肺癌、非小細胞癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、軟部肉腫、骨肉腫、メラノーマ、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、急性リンパ腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病等の悪性腫瘍；膵炎；アレルギー疾患；自己免疫疾患；肺気腫等の循環器疾患の診断に使用することが期待される。
【００４８】
本発明の診断薬又はキットには、本発明のペプチド以外に、診断薬分野で汎用の試薬（バッファー等）を含めることができる。また、本発明の診断薬又はキットには、腫瘍マーカーの診断薬として公知（例えば、抗体や既知のレクチン）のものを含めることもできる。
【００４９】
本発明は、また、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで置換することを含むペプチドの改変方法を提供する。
【００５０】
上記方法は、さらに、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンを付加してもよい。
【００５１】
上記方法は、さらに、リジン及びアルギニン以外の１又は数個のアミノ酸を欠失又は置換させてもよい。
【００５２】
本発明は、また、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで付加することを含む、糖結合活性を有するペプチドの改変方法を提供する。
【００５３】
上記方法は、さらに、リジン及びアルギニン以外の１又は数個のアミノ酸を欠失又は置換させてもよい。
【００５４】
上記のペプチドの実際の取得方法は、特に制限されない。例えば、ペプチド固相合成法や液層合成法があり、Ｆｍｏｃ（Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−Ｍｅｔｈｏｘｙ−Ｃａｒｂｏｎｙｌ）法、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ Ｏｘｙ Ｃａｒｂｏｎｙ）法、Ｃｂｚ（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）法等の有機合成化学的手法や遺伝子工学的手法が可能である。
【実施例】
【００５５】
以下に、実施例及び比較例を示して、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〜１４、比較例１〜６〕
（ペプチドの合成）
表１に示すアミノ酸配列をもつペプチドを、実際にＦｌｕｏｒｅｎｙｌ−Ｍｅｔｈｏｘｙ−Ｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｆｍｏｃ）法で合成した。合成されたペプチドのアミノ酸数、溶解性、等電点（Ｔｈｅｏｒｉｔｉｃａｌ ＰＩ）、及び分子量を表１に併記する。アミノ酸配列の下線を付した箇所が対照（配列番号１）と比べて置換、欠失又は付加されている。
【００５６】
（標識ペプチドの合成）
実施例１３（表１）では、上記Ｆｍｏｃ法でアミノ酸配列のペプチドを合成し、定法により、ビオチン標識した。得られた標識ペプチドの溶解性を、表１に示す。
【００５７】
（多価ペプチドの作製）
実施例１４では、実施例１３の標識ペプチドをビオチン−アビジン反応させることで多価ペプチドを作製した。具体的には、実施例１３のビオチン標識ペプチド及びストレプトアビジン（ベクター社製）を、それぞれ、１ｍｇずつチューブに量り取り、リン酸緩衝生理食塩水で１ｍｇ／ｍｌにした。ストレプトアビジン溶液６８μｌ、ビオチン標識ペプチド溶液４５μｌを混合し、室温で３０分反応させた。その後、セファデックスＧ２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いたゲルろ過で精製した。作製した多価ペプチドの溶解性を表１に示す。
【００５８】
（レクチンの準備）
比較のために、フコース特異的レクチンと言われている市販レクチンとして、
比較例１ ： ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ、生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、
比較例２ ： ミヤコグサレクチン（Ｌｏｔｕｓ、生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、
比較例３ ： ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ、生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、
比較例４ ： 麹菌レクチン（ＡＯＬ、東京化成工業（株）−月桂冠（株）製）
比較例５ ： レンズマメレクチン（ＬＣＡ、生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、
比較例６ ： エンドウマメレクチン（ＰＳＡ、生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）
を準備した。
【００５９】
【表１】
【００６０】
（糖結合特異性の測定）
キャピラリー電気泳動装置には、Ｐ／ＡＣＥ−ＭＤＱ（ベックマンコールター社製）を用いた。表２Ａ〜Ｃに示す糖鎖を８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＡＰＴＳ）で標識した。検出には、レーザー蛍光検出（ｅｘ ４８８ｎｍ／ｅｍ ５２０ｎｍ）を用いた（ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ． ２７８， Ｎｏ． ３４， Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｕｇｕｓｔ ２２， ｐｐ． ３２４３９−３２４４７）。なお、ペプチド、標識ペプチド、多価ペプチド及びレクチンは、０．１Ｍトリス−酢酸緩衝液で０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。
【００６１】
【表２Ａ】
【００６２】
【表２Ｂ】
【００６３】
【表２Ｃ】
【００６４】
結合の判定は、ペプチドのない条件下での標識糖鎖のマイグレーションタイムを基準に０．０６分以上の遅れた場合を結合があると判断した。ペプチド又はレクチンの濃度が０．０１ｍｇ／ｍｌで結合が見られた場合を◎、０．０５ｍｇ／ｍｌで結合が見られた場合を○、０．１ｍｇ／ｍｌで結合が見られた場合を□、そして、１ｍｇ／ｍｌで結合が見られた場合を△と評価を記入した。１ｍｇ／ｍｌで結合していないものを×とした。結果を表３及び表４に示す。
【００６５】
【表３】
【００６６】
【表４】
【００６７】
表３と表４との対比から、本発明のペプチドは、既知のレクチンと異なり、フコースα１−６糖鎖にのみ結合し、フコースα１−２糖鎖やフコースα１−３糖鎖、フコースα１−４糖鎖には結合しなかったことがわかる。
【００６８】
（赤血球凝集活性試験）
９６ウェルＵ底タイタープレートの一段にＰＢＳを各２０μl入れ、ウェルに試料溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ入れ、順次１／２希釈系列を作製した。上記の系列に、ウサギ２％赤血球溶液をそれぞれ４０μｌ添加し、室温で約６０分放置後、赤血球凝集活性を肉眼にて観察した。凝集が認められた最大希釈度の逆数を原液の凝集力価とし、凝集力価の２を底とする対数を赤血球凝集活性とした。
【００６９】
実施例１〜１３のペプチドでは、赤血球凝集活性がなかった。一方、実施例１４の多価ペプチドでは、表５に示すとおり、赤血球凝集活性を確認した。
【００７０】
【表５】
【００７１】
（熱安定性試験）
対照のペプチド、実施例６及び９、並びに比較例３〜５のレクチンを、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。この溶液をマイクロチューブに５０μｌ加え、３０〜１００℃で３０分間保温した。また、保温しないものは分析時まで４℃に保存した。保温後、すぐに氷冷し、４倍に希釈後、上記キャピラリー電気泳動を用いて、フコース糖鎖（NG2AF）（糖鎖23）に対する結合の有無を測定した。結果を表６に示す。
【００７２】
【表６】
○：結合有り
×：結合無し
【００７３】
対照のペプチド並びに実施例６及び９は、１００℃の保温をおこなっても、すべて糖結合活性を保持していた。一方、比較例３〜５のレクチンは、７０℃以上で糖結合活性を失っていた。
【００７４】
（溶解性試験）
表７に示すペプチド及びレクチンを、０．１ｍｇ／ｍｌになるように、以下の５種類の緩衝液：
Ａ ： リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
Ｂ ： １０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．４）
Ｃ ： １０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．４）
Ｄ ： １０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．４）
Ｅ ： １０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．４）
で溶解した。その後、卓上遠心機で２分間遠心し、沈殿物の有無を評価した。評価基準は、以下のとおりである。
○ ：不溶物なし（溶解良好）
△ ：不溶物わずかにあり
× ：不溶物多い（溶解不良）
結果を表７に示す。
【００７５】
【表７】
【００７６】
本発明のペプチドでは、いずれの緩衝液にも良好に溶解したが、ＬＣＡ（比較例５）やＰＳＡ（比較例６）では、十分に溶解しない緩衝液が存在した。
【００７７】
（ＡＦＰ−Ｌ３の親和電気泳動法による分析）
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）は、肝細胞癌のマーカーである。しかし、慢性肝炎や肝硬変のような非肝癌患者でも上昇するため、軽度（〜１００ｎｇ／ｍｌ）〜中等度（〜４００ｎｇ／ｍｌ）高の症例での鑑別は困難とされている。ＡＦＰレクチン分画のうち、非肝癌患者の多くはＬ１画分に出現し、肝細胞癌患者ではＬ３画分が増加する。ＡＦＰレクチン分画は、肝細胞癌と肝良性疾患との鑑別診断に有用である。
【００７８】
Ｌ３画分（ＡＦＰ−Ｌ３型）として、癌患者（肝細胞癌）由来の血清ＡＦＰの糖鎖の構造を以下に示す。
【００７９】
【化１】
【００８０】
Ｌ１画分（ＡＦＰ−Ｌ1型）として、胎生期の良性疾患（急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、先天性胆道閉鎖症）由来の血清ＡＦＰの糖鎖の構造を以下に示す。
【化２】
【００８１】
（親和電気泳動用ゲルの調製）
レクチン親和電気泳動は、以下の文献を参考におこなった（ Ｔａｋｅｔａ， Ｋ．， 臨床検査， ３９ （１）， ６６ （１９９５） 、Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａ． Ｃｈｉｍｉｃａ． Ａｃｔａ， ２１４， ３ （１９９３） 、Ｙａｍａｓｈｉｔａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５３， ２９７０ （１９９３）、Ｔａｋｅｔａ， Ｋ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， ５６９， ２２９ （１９９１）、Ｔａｋｅｔａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ９９， ５０８ （１９９０）、Ｔａｋｅｔａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １０， ５６２ （１９８９））。
【００８２】
ペプチド（対照、実施例９、実施例６）及びＬＣＡを、ぞれぞれ、３ｍｇ／ｍｌになるように純水で溶解した。保温したアガロース溶液４．２ｍｌにペプチド溶液又はＬＣＡ溶液０．３ｍｌを加え、緩やかに混和した。ゲル型に流し入れ、１０〜２０分間室温で放置した。ゲル型から外し、親和電気泳動用ゲルとした。
【００８３】
（分析試料）
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製）、フコシル化ＡＦＰ（ＡＦＰ−Ｌ３）（和光純薬工業株式会社製）を使用した。ＡＦＰ及びＡＦＰ−Ｌ３をそれぞれ４μｇ／ｍｌ及び０．１μｇ／ｍｌになるように調製し、分析試料とした。
【００８４】
（電気泳動）
電気泳動装置（カヤガキ社製）に５０ｍＭベロナール（ｐＨ ８．６）（緩衝液Ａ）を緩衝液層に満たし、親和電気泳動用ゲルを設置した。分析試料２μｌに２％ブロムフェノールブルー１μｌを加えた溶液をゲルのウェルに添加し、電気泳動をおこなった。
【００８５】
（転写）
予め緩衝液Ａに浸した抗ＡＦＰ膜にゲルを乗せ、その上に濾紙、アクリル板、重しを乗せ、３０分間放置し、転写をおこなった。
【００８６】
（免疫染色）
転写した抗ＡＦＰ膜を洗浄後、抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体溶液に抗ＡＦＰ膜を浸し、室温で30分間静置した。洗浄液に浸して、洗浄した。西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体溶液に抗ＡＦＰ膜を浸した。洗浄後、ＰＯＤイムノステインセット（和光純薬工業社製）で発色させ、蒸留水でよく洗浄後、乾燥させた。
【００８７】
図１にLCAゲル、図２に対照のペプチド、図３に実施例９のペプチド、そして図４に実施例６のペプチドを用いた場合のそれぞれのＡＦＰ分離結果を示す。
【００８８】
図２に示す対照のペプチドでは、等電点が４．６７と低いために、ＡＦＰ−Ｌ１とＡＦＰ−Ｌ３との分離が若干不十分である。これでは、肝臓がんの診断法に適用し難い。一方、本発明に従う実施例９のペプチド（等電点６．７７）及び実施例６のペプチド（等電点８．０１）では、図３及び４に示すように、非常に良好な分離を得ることができた。これらの結果から、腫瘍マーカーであるＡＦＰの糖鎖変化を、本発明のペプチドドで分離及び検出できる可能性が示された。
【００８９】
実施例９及び実施例６のペプチドの場合、ＬＣＡよりも熱安定性に優れることから、親和電気泳動用ゲル作製時の加温による活性低下の恐れが極めて低い。本発明のように等電点の異なるアガロースを作製できることは、その他の腫瘍マーカーの分離や検出にも有効であると予測される。
【００９０】
（患者検体のＡＦＰの親和電気泳動法による検出試験）
実施例６のペプチドを使用し、ヒト血清の分析をレクチン親和電気泳動法でおこなった。分析試料には、健常人血清、肝臓がん患者血清（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ社より購入）を使用した。使用した患者のクリニカルデータを以下の表８に示す。
【００９１】
【表８】
【００９２】
癌患者血清（３検体）について、実施例６のペプチドを用いたＡＦＰ分析結果を図５に示す。患者１と患者３は、ＡＦＰ値が５ｎｇ/ｍｌ以上であり、かつ、癌化の指標であるＡＦＰ−Ｌ３の出現を明確に分析できている。また、同法を用いて健常人血清（３検体）のＡＦＰ分析をおこなったところ、ＡＦＰは検出されなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なペプチドに関し、より詳細には糖結合活性を有する新規なペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、担子菌の一種であるツチスギタケからツチスギタケレクチン（以下、ＰＴＬという）を新規に単離した（特許文献１）。ＰＴＬは、フコースα１→６糖鎖に特異的に認識するという特性を有する。フコースα１→６糖鎖と親和性を有する従来のレクチンとして、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）等が知られているが、これらのレクチンは、α１→６結合以外のフコースを持つ糖脂質系糖鎖や、フコースを持たないハイマンノース糖鎖にも親和性を示す。一方、ＰＴＬは、フコースα１→６糖鎖を特異的に認識するレクチンとして、従来のレクチンよりも優れている。
【０００３】
ＰＴＬは、その糖認識特性により、フコースα１→６糖鎖が関与する疾患の診断薬、フコースα１→６糖鎖の検出方法、フコースα１→６糖鎖の分別方法等への利用が多いに期待される。例えば、Ｎ結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースをα１→６結合として転移させるフコースα１→６転移酵素（α１→６ＦｕｃＴ）の遺伝子は、肝細胞の癌化にともなって発現することが知られている。この癌化した肝細胞の有無を、ＰＴＬを用いたレクチン親和電気泳動で検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の方法に従ってツチスギダケからＰＴＬを単離抽出することは容易であるが、ＰＴＬを化学合成できれば、安定供給、生産コスト低減、純度の向上等さまざまな点で有利である。さらに、等電点、溶解性、糖結合活性等の物性を自在に変更することができれば、その利用価値が一層高まる。
【０００６】
そこで、本発明の課題は、ＰＴＬのような糖認識特性を有し、さらに物性を変更または改善したペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を鋭意検討した結果、配列番号１のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸を置換、付加又は欠失することで解決できることを見いだした。すなわち、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸がリジン及び／又はアルギニンで置換されかつ糖結合活性を有するペプチドを提供する。
【０００８】
上記ペプチドは、リジン及び／又はアルギニンにより置換されるアミノ酸は、アラニン、プロリン、バリン、トレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。リジン又はアルギニンで置換されるアミノ酸は、アミノ酸配列Ｃ末端のトレオニン及びグリシンであることが好ましい。
【０００９】
上記ペプチドは、さらに、糖結合活性を有する限り、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンが付加されてもよい。
【００１０】
本発明は、また、配列番号１に示すアミノ酸配列に１又は数個のリジン及び／又はアルギニンが付加されかつ糖結合活性を有するペプチドを提供する。
【００１１】
上記ペプチドは、糖結合活性を有する限り、さらに、リジン及びアルギニン以外のアミノ酸が欠失されてもよい。
【００１２】
欠失するアミノ酸は、トレオニン及びグリシンの少なくとも一種であることが好ましい。
【００１３】
上記ペプチドの糖結合活性は、例えばフコースα１→６糖鎖への結合活性である。
【００１４】
上記ペプチドの等電点は、４．６７よりも高いことが好ましい。
【００１５】
本発明のペプチドは、標識されていることが好ましい。
【００１６】
本発明は、上記の同一又は異なるペプチド同士が複数会合しかつ糖結合活性を有するペプチドもまた提供する。
【００１７】
本発明は、例えば配列番号２〜１４のいずれかで示されるペプチドである。
【００１８】
本発明は、上記ペプチドを含む診断薬又はキットを提供する。
【００１９】
上記診断薬又はキットは、例えばフコースα１→６糖鎖を検出するのに有用である。
【００２０】
本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで置換することを含む、糖結合活性を有するペプチドの改変方法を提供する。
【００２１】
上記方法は、さらに、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンを付加してもよい。
【００２２】
本発明は、また、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで付加することを含む、糖結合活性を有するペプチドの改変方法を提供する。
【００２３】
上記方法は、さらに、リジン及び／又はアルギニン以外の１又は数個のアミノ酸を欠失させてもよい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、ＰＴＬに似た性質の新規なペプチドが安価かつ容易に提供される。本発明のペプチドは、ＰＴＬに対して、糖結合活性、赤血球凝集活性、等電点、溶解性、熱安定性等の物性を自在に変更することもできる。
【００２５】
このペプチドは、特にフコースα１→６糖鎖に対する特異性が高いことから、フコースα１→６糖鎖の特異的結合剤、糖鎖研究用試薬、フコースα１→６糖鎖が関係する腫瘍マーカーの正確な検出、予後判定、治療効果判定、並びに新規な腫瘍マーカーの探索等への利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＡＦＰ−Ｌ１とＡＦＰ−Ｌ３との分離試験を、従来のLCAを添加したゲルを用いて行った結果を示す。図中、実腺矢印は、ＡＦＰ−Ｌ３を示し、そして、波線矢印は、ＡＦＰ−Ｌ１を示している（以下、同じ）。
【図２】ＡＦＰ−Ｌ１とＡＦＰ−Ｌ３との分離試験を、対照のペプチド（配列番号１）を用いて行った結果を示す。
【図３】ＡＦＰ−Ｌ１とＡＦＰ−Ｌ３との分離試験を、実施例９のペプチド（配列番号１０）を用いて行った結果を示す。
【図４】ＡＦＰ−Ｌ１とＡＦＰ−Ｌ３との分離試験を、実施例６のペプチド（配列番号７）を用いて行った結果を示す。
【図５】癌患者血清（３検体）について、実施例６のペプチドを用いたＡＦＰ分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に、本発明のペプチドを詳細に説明する。本発明のペプチドは、担子菌の一種であるツチスギダケに含まれるＰＴＬをベースとする。ＰＴＬのアミノ酸配列の一種を配列番号１に示す。ＰＴＬは、特許文献１に記載の製造方法、アミノ酸配列に基づいた化学合成、遺伝子工学的手法等により取得できる。
【００２８】
本発明のペプチドの一実施態様は、配列番号１に示すアミノ酸配列が１又は数個のリジンで置換されかつ糖結合活性を有するペプチドである。塩基性アミノ酸であるリジンで置換すると、糖結合活性を強化する、また、糖結合活性を維持しつつペプチドの等電点を増加することができることが判明した。そのような例として、配列番号２、３、４、５及び１０が挙げられる。等電点の増大は、親和電気泳動分析の分解能の向上に寄与する。
【００２９】
本発明の別の一実施態様は、配列番号１に示すアミノ酸配列が１又は数個のアルギニンで置換されかつ糖結合活性を有するペプチドが提供される。塩基性アミノ酸であるアルギニンで置換すると、糖結合活性を維持しつつ、ペプチドの等電点を増加することができることが判明した。そのような例として、配列番号１２が挙げられる。
【００３０】
リジン又はアルギニンで置換する場所によっては、糖結合活性の強さが変わり得る。置換されるアミノ酸は、アラニン、プロリン、バリン、トレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
【００３１】
リジンで置換される場合、特にアミノ酸Ｎ末端のアラニン（配列番号２〜５）、プロリン（配列番号３〜５）、バリン（配列番号４〜５）、あるいはアミノ酸配列Ｃ末端のトレオニン及びグリシンが２個のリジンで置換されることが好ましい。そのような例として、配列番号１０が挙げられる。
【００３２】
アルギニンで置換される場合、特にアミノ酸配列Ｃ末端のトレオニン及びグリシンが２個のアルギニンで置換されることが好ましい。そのような例として、配列番号１２が挙げられる。
【００３３】
置換されるアミノ酸の個数は、１個又は数個であり、好ましくは１〜４個である。
【００３４】
上記リジン及び／又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列に、さらに、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンを付加してもよい。そのような例として、配列番号９が挙げられる。
【００３５】
本発明の別の一実施態様は、配列番号１に示すアミノ酸配列にリジン及び／又はアルギニンが付加されかつ糖結合活性を有するペプチドが提供される。そのような例として、配列番号１４が挙げられる。
【００３６】
付加されるアミノ酸の個数は、１個又は数個であり、好ましくは１〜２個である。
【００３７】
上記リジン及び／又はアルギニンで置換及び／又は付加された場合、さらにリジン又はアルギニン以外のアミノ酸が欠失することは、糖結合活性を有する限り可能である。そのような例として、配列番号６〜８、１１及び１３が挙げられる。
【００３８】
リジンで置換又は付加される場合、欠失してもよいアミノ酸としては、トレオニン及びグリシンの少なくとも一種が好ましい。トレオニン欠失の例として、配列番号８及び１３、そして、グリシン欠失の例として、配列番号６、７、８、１１及び１３が挙げられる。
【００３９】
アミノ酸の欠失を伴う場合、リジンで置換してもよいアミノ酸は、トレオニン（配列番号６、７及び１１）、アラニン（配列番号７）、チロシン（配列番号７及び８）、及びヒスチジン（配列番号１３）からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
【００４０】
欠失されるアミノ酸の個数は、１個又は数個であり、好ましくは１〜２個である。
【００４１】
配列番号１のアミノ酸配列に対して置換、欠失及び付加の少なくとも一種で変更されるアミノ酸の数は、１〜数個であり、好ましくは１〜４個である。
【００４２】
本発明のペプチドは、糖結合活性を有する限り、その特異性は問わない。特に、ＰＴＬのようにフコースα１→６糖鎖への糖結合特異性を有することが好ましい。糖結合特異性の測定は、常法により行うことができる。例えば、ペプチドを添加した溶液をキャピラリー電気泳動装置に充填し、標識した標準糖鎖を展開させる。泳動後、標識に基づいた検出手段で検出する。
【００４３】
本発明のペプチドの等電点は、ＰＴＬの等電点（４．６７）よりも高いことが利用上好ましく、さらに４．６９〜９．００の範囲にある。
【００４４】
本発明のペプチドは、標識されていることが好ましい。標識手段は、特に制限なく公知の標識化方法を適用できる。例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合等を挙げることができる。標識化合物としては、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物等を挙げることができる。具体的には、ビオチン（実施例１３及び１４）、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりペプチドと結合することができる。
【００４５】
本発明のペプチドは、同一又は異なるペプチドがサブユニットとなって複数会合しかつ糖結合活性を有するペプチドでもよい。会合により、糖結合活性や赤血球凝集活性の向上を図ることができる。
【００４６】
ペプチドの会合する数は、通常、２個以上であり、好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜４個である。複数のペプチドを会合させる方法は、糖結合活性を消失させない限り、特に制限されない。例えば、アビジン−ビオチン反応（実施例１４）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等の縮合剤による反応が挙げられる。
【００４７】
本発明は、また、上記ペプチドを含む診断薬又はキットを提供する。この診断薬又はキットは、フコースα１→６糖鎖の検出に有用である。この検出には、フコースα１→６糖鎖の増大や減少の傾向をつかむことも含まれる。フコースα１→６糖鎖が関連する疾患の例としては、肝細胞癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、小腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、膵癌、小細胞肺癌、非小細胞癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、軟部肉腫、骨肉腫、メラノーマ、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、急性リンパ腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病等の悪性腫瘍；膵炎；アレルギー疾患；自己免疫疾患；肺気腫等の循環器疾患の診断に使用することが期待される。
【００４８】
本発明の診断薬又はキットには、本発明のペプチド以外に、診断薬分野で汎用の試薬（バッファー等）を含めることができる。また、本発明の診断薬又はキットには、腫瘍マーカーの診断薬として公知（例えば、抗体や既知のレクチン）のものを含めることもできる。
【００４９】
本発明は、また、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで置換することを含むペプチドの改変方法を提供する。
【００５０】
上記方法は、さらに、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンを付加してもよい。
【００５１】
上記方法は、さらに、リジン及びアルギニン以外の１又は数個のアミノ酸を欠失又は置換させてもよい。
【００５２】
本発明は、また、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで付加することを含む、糖結合活性を有するペプチドの改変方法を提供する。
【００５３】
上記方法は、さらに、リジン及びアルギニン以外の１又は数個のアミノ酸を欠失又は置換させてもよい。
【００５４】
上記のペプチドの実際の取得方法は、特に制限されない。例えば、ペプチド固相合成法や液層合成法があり、Ｆｍｏｃ（Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−Ｍｅｔｈｏｘｙ−Ｃａｒｂｏｎｙｌ）法、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ Ｏｘｙ Ｃａｒｂｏｎｙ）法、Ｃｂｚ（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）法等の有機合成化学的手法や遺伝子工学的手法が可能である。
【実施例】
【００５５】
以下に、実施例及び比較例を示して、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〜１４、比較例１〜６〕
（ペプチドの合成）
表１に示すアミノ酸配列をもつペプチドを、実際にＦｌｕｏｒｅｎｙｌ−Ｍｅｔｈｏｘｙ−Ｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｆｍｏｃ）法で合成した。合成されたペプチドのアミノ酸数、溶解性、等電点（Ｔｈｅｏｒｉｔｉｃａｌ ＰＩ）、及び分子量を表１に併記する。アミノ酸配列の下線を付した箇所が対照（配列番号１）と比べて置換、欠失又は付加されている。
【００５６】
（標識ペプチドの合成）
実施例１３（表１）では、上記Ｆｍｏｃ法でアミノ酸配列のペプチドを合成し、定法により、ビオチン標識した。得られた標識ペプチドの溶解性を、表１に示す。
【００５７】
（多価ペプチドの作製）
実施例１４では、実施例１３の標識ペプチドをビオチン−アビジン反応させることで多価ペプチドを作製した。具体的には、実施例１３のビオチン標識ペプチド及びストレプトアビジン（ベクター社製）を、それぞれ、１ｍｇずつチューブに量り取り、リン酸緩衝生理食塩水で１ｍｇ／ｍｌにした。ストレプトアビジン溶液６８μｌ、ビオチン標識ペプチド溶液４５μｌを混合し、室温で３０分反応させた。その後、セファデックスＧ２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いたゲルろ過で精製した。作製した多価ペプチドの溶解性を表１に示す。
【００５８】
（レクチンの準備）
比較のために、フコース特異的レクチンと言われている市販レクチンとして、
比較例１ ： ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ、生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、
比較例２ ： ミヤコグサレクチン（Ｌｏｔｕｓ、生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、
比較例３ ： ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ、生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、
比較例４ ： 麹菌レクチン（ＡＯＬ、東京化成工業（株）−月桂冠（株）製）
比較例５ ： レンズマメレクチン（ＬＣＡ、生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、
比較例６ ： エンドウマメレクチン（ＰＳＡ、生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）
を準備した。
【００５９】
【表１】
【００６０】
（糖結合特異性の測定）
キャピラリー電気泳動装置には、Ｐ／ＡＣＥ−ＭＤＱ（ベックマンコールター社製）を用いた。表２Ａ〜Ｃに示す糖鎖を８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＡＰＴＳ）で標識した。検出には、レーザー蛍光検出（ｅｘ ４８８ｎｍ／ｅｍ ５２０ｎｍ）を用いた（ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ． ２７８， Ｎｏ． ３４， Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｕｇｕｓｔ ２２， ｐｐ． ３２４３９−３２４４７）。なお、ペプチド、標識ペプチド、多価ペプチド及びレクチンは、０．１Ｍトリス−酢酸緩衝液で０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。
【００６１】
【表２Ａ】
【００６２】
【表２Ｂ】
【００６３】
【表２Ｃ】
【００６４】
結合の判定は、ペプチドのない条件下での標識糖鎖のマイグレーションタイムを基準に０．０６分以上の遅れた場合を結合があると判断した。ペプチド又はレクチンの濃度が０．０１ｍｇ／ｍｌで結合が見られた場合を◎、０．０５ｍｇ／ｍｌで結合が見られた場合を○、０．１ｍｇ／ｍｌで結合が見られた場合を□、そして、１ｍｇ／ｍｌで結合が見られた場合を△と評価を記入した。１ｍｇ／ｍｌで結合していないものを×とした。結果を表３及び表４に示す。
【００６５】
【表３】
【００６６】
【表４】
【００６７】
表３と表４との対比から、本発明のペプチドは、既知のレクチンと異なり、フコースα１−６糖鎖にのみ結合し、フコースα１−２糖鎖やフコースα１−３糖鎖、フコースα１−４糖鎖には結合しなかったことがわかる。
【００６８】
（赤血球凝集活性試験）
９６ウェルＵ底タイタープレートの一段にＰＢＳを各２０μl入れ、ウェルに試料溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ入れ、順次１／２希釈系列を作製した。上記の系列に、ウサギ２％赤血球溶液をそれぞれ４０μｌ添加し、室温で約６０分放置後、赤血球凝集活性を肉眼にて観察した。凝集が認められた最大希釈度の逆数を原液の凝集力価とし、凝集力価の２を底とする対数を赤血球凝集活性とした。
【００６９】
実施例１〜１３のペプチドでは、赤血球凝集活性がなかった。一方、実施例１４の多価ペプチドでは、表５に示すとおり、赤血球凝集活性を確認した。
【００７０】
【表５】
【００７１】
（熱安定性試験）
対照のペプチド、実施例６及び９、並びに比較例３〜５のレクチンを、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。この溶液をマイクロチューブに５０μｌ加え、３０〜１００℃で３０分間保温した。また、保温しないものは分析時まで４℃に保存した。保温後、すぐに氷冷し、４倍に希釈後、上記キャピラリー電気泳動を用いて、フコース糖鎖（NG2AF）（糖鎖23）に対する結合の有無を測定した。結果を表６に示す。
【００７２】
【表６】
○：結合有り
×：結合無し
【００７３】
対照のペプチド並びに実施例６及び９は、１００℃の保温をおこなっても、すべて糖結合活性を保持していた。一方、比較例３〜５のレクチンは、７０℃以上で糖結合活性を失っていた。
【００７４】
（溶解性試験）
表７に示すペプチド及びレクチンを、０．１ｍｇ／ｍｌになるように、以下の５種類の緩衝液：
Ａ ： リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
Ｂ ： １０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．４）
Ｃ ： １０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．４）
Ｄ ： １０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．４）
Ｅ ： １０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．４）
で溶解した。その後、卓上遠心機で２分間遠心し、沈殿物の有無を評価した。評価基準は、以下のとおりである。
○ ：不溶物なし（溶解良好）
△ ：不溶物わずかにあり
× ：不溶物多い（溶解不良）
結果を表７に示す。
【００７５】
【表７】
【００７６】
本発明のペプチドでは、いずれの緩衝液にも良好に溶解したが、ＬＣＡ（比較例５）やＰＳＡ（比較例６）では、十分に溶解しない緩衝液が存在した。
【００７７】
（ＡＦＰ−Ｌ３の親和電気泳動法による分析）
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）は、肝細胞癌のマーカーである。しかし、慢性肝炎や肝硬変のような非肝癌患者でも上昇するため、軽度（〜１００ｎｇ／ｍｌ）〜中等度（〜４００ｎｇ／ｍｌ）高の症例での鑑別は困難とされている。ＡＦＰレクチン分画のうち、非肝癌患者の多くはＬ１画分に出現し、肝細胞癌患者ではＬ３画分が増加する。ＡＦＰレクチン分画は、肝細胞癌と肝良性疾患との鑑別診断に有用である。
【００７８】
Ｌ３画分（ＡＦＰ−Ｌ３型）として、癌患者（肝細胞癌）由来の血清ＡＦＰの糖鎖の構造を以下に示す。
【００７９】
【化１】
【００８０】
Ｌ１画分（ＡＦＰ−Ｌ1型）として、胎生期の良性疾患（急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、先天性胆道閉鎖症）由来の血清ＡＦＰの糖鎖の構造を以下に示す。
【化２】
【００８１】
（親和電気泳動用ゲルの調製）
レクチン親和電気泳動は、以下の文献を参考におこなった（ Ｔａｋｅｔａ， Ｋ．， 臨床検査， ３９ （１）， ６６ （１９９５） 、Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａ． Ｃｈｉｍｉｃａ． Ａｃｔａ， ２１４， ３ （１９９３） 、Ｙａｍａｓｈｉｔａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５３， ２９７０ （１９９３）、Ｔａｋｅｔａ， Ｋ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， ５６９， ２２９ （１９９１）、Ｔａｋｅｔａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ９９， ５０８ （１９９０）、Ｔａｋｅｔａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １０， ５６２ （１９８９））。
【００８２】
ペプチド（対照、実施例９、実施例６）及びＬＣＡを、ぞれぞれ、３ｍｇ／ｍｌになるように純水で溶解した。保温したアガロース溶液４．２ｍｌにペプチド溶液又はＬＣＡ溶液０．３ｍｌを加え、緩やかに混和した。ゲル型に流し入れ、１０〜２０分間室温で放置した。ゲル型から外し、親和電気泳動用ゲルとした。
【００８３】
（分析試料）
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製）、フコシル化ＡＦＰ（ＡＦＰ−Ｌ３）（和光純薬工業株式会社製）を使用した。ＡＦＰ及びＡＦＰ−Ｌ３をそれぞれ４μｇ／ｍｌ及び０．１μｇ／ｍｌになるように調製し、分析試料とした。
【００８４】
（電気泳動）
電気泳動装置（カヤガキ社製）に５０ｍＭベロナール（ｐＨ ８．６）（緩衝液Ａ）を緩衝液層に満たし、親和電気泳動用ゲルを設置した。分析試料２μｌに２％ブロムフェノールブルー１μｌを加えた溶液をゲルのウェルに添加し、電気泳動をおこなった。
【００８５】
（転写）
予め緩衝液Ａに浸した抗ＡＦＰ膜にゲルを乗せ、その上に濾紙、アクリル板、重しを乗せ、３０分間放置し、転写をおこなった。
【００８６】
（免疫染色）
転写した抗ＡＦＰ膜を洗浄後、抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体溶液に抗ＡＦＰ膜を浸し、室温で30分間静置した。洗浄液に浸して、洗浄した。西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体溶液に抗ＡＦＰ膜を浸した。洗浄後、ＰＯＤイムノステインセット（和光純薬工業社製）で発色させ、蒸留水でよく洗浄後、乾燥させた。
【００８７】
図１にLCAゲル、図２に対照のペプチド、図３に実施例９のペプチド、そして図４に実施例６のペプチドを用いた場合のそれぞれのＡＦＰ分離結果を示す。
【００８８】
図２に示す対照のペプチドでは、等電点が４．６７と低いために、ＡＦＰ−Ｌ１とＡＦＰ−Ｌ３との分離が若干不十分である。これでは、肝臓がんの診断法に適用し難い。一方、本発明に従う実施例９のペプチド（等電点６．７７）及び実施例６のペプチド（等電点８．０１）では、図３及び４に示すように、非常に良好な分離を得ることができた。これらの結果から、腫瘍マーカーであるＡＦＰの糖鎖変化を、本発明のペプチドドで分離及び検出できる可能性が示された。
【００８９】
実施例９及び実施例６のペプチドの場合、ＬＣＡよりも熱安定性に優れることから、親和電気泳動用ゲル作製時の加温による活性低下の恐れが極めて低い。本発明のように等電点の異なるアガロースを作製できることは、その他の腫瘍マーカーの分離や検出にも有効であると予測される。
【００９０】
（患者検体のＡＦＰの親和電気泳動法による検出試験）
実施例６のペプチドを使用し、ヒト血清の分析をレクチン親和電気泳動法でおこなった。分析試料には、健常人血清、肝臓がん患者血清（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ社より購入）を使用した。使用した患者のクリニカルデータを以下の表８に示す。
【００９１】
【表８】
【００９２】
癌患者血清（３検体）について、実施例６のペプチドを用いたＡＦＰ分析結果を図５に示す。患者１と患者３は、ＡＦＰ値が５ｎｇ/ｍｌ以上であり、かつ、癌化の指標であるＡＦＰ−Ｌ３の出現を明確に分析できている。また、同法を用いて健常人血清（３検体）のＡＦＰ分析をおこなったところ、ＡＦＰは検出されなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸がリジン及び／又はアルギニンで置換されかつ糖結合活性を有するペプチド。
【請求項２】
リジン及び／又はアルギニンにより置換されるアミノ酸は、アラニン、プロリン、バリン、トレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
リジン又はアルギニンで置換されるアミノ酸は、アミノ酸配列Ｃ末端のトレオニン及びグリシンである請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
さらに、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンが付加されかつ糖結合活性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号１に示すアミノ酸配列に１又は数個のリジン及び／又はアルギニンが付加されかつ糖結合活性を有するペプチド。
【請求項６】
さらに、リジン及びアルギニン以外のアミノ酸が欠失されかつ糖結合活性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
欠失するアミノ酸が、トレオニン及びグリシンの少なくとも一種である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記糖結合活性が、フコースα１→６糖鎖への結合活性である、請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド。
【請求項９】
等電点が４．６７よりも高い、請求項１〜８のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１０】
標識されている、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の同一又は異なるペプチド同士が複数会合しかつ糖結合活性を有するペプチド。
【請求項１２】
配列番号２〜１４のいずれかで示されるペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチドを含む診断薬又はキット。
【請求項１４】
フコースα１→６糖鎖を検出するための請求項１３に記載の診断薬又はキット。
【請求項１５】
配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで置換することを含む、糖結合活性を有するペプチドの改変方法。
【請求項１６】
さらに、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンを付加することを含む、請求項１５に記載の糖結合活性を有するペプチドの改変方法。
【請求項１７】
配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで付加することを含む、糖結合活性を有するペプチドの改変方法。
【請求項１８】
さらに、リジン及び／又はアルギニン以外の１又は数個のアミノ酸を欠失させることを含む、請求項１５〜１７に記載の糖結合活性を有するペプチドの改変方法。
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸がリジン及び／又はアルギニンで置換されかつ糖結合活性を有するペプチド。
【請求項２】
リジン及び／又はアルギニンにより置換されるアミノ酸は、アラニン、プロリン、バリン、トレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
リジン又はアルギニンで置換されるアミノ酸は、アミノ酸配列Ｃ末端のトレオニン及びグリシンである請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
さらに、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンが付加されかつ糖結合活性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号１に示すアミノ酸配列に１又は数個のリジン及び／又はアルギニンが付加されかつ糖結合活性を有するペプチド。
【請求項６】
さらに、リジン及びアルギニン以外のアミノ酸が欠失されかつ糖結合活性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
欠失するアミノ酸が、トレオニン及びグリシンの少なくとも一種である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記糖結合活性が、フコースα１→６糖鎖への結合活性である、請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド。
【請求項９】
等電点が４．６７よりも高い、請求項１〜８のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１０】
標識されている、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の同一又は異なるペプチド同士が複数会合しかつ糖結合活性を有するペプチド。
【請求項１２】
配列番号２〜１４のいずれかで示されるペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチドを含む診断薬又はキット。
【請求項１４】
フコースα１→６糖鎖を検出するための請求項１３に記載の診断薬又はキット。
【請求項１５】
配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで置換することを含む、糖結合活性を有するペプチドの改変方法。
【請求項１６】
さらに、１又は数個のリジン及び／又はアルギニンを付加することを含む、請求項１５に記載の糖結合活性を有するペプチドの改変方法。
【請求項１７】
配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸をリジン及び／又はアルギニンで付加することを含む、糖結合活性を有するペプチドの改変方法。
【請求項１８】
さらに、リジン及び／又はアルギニン以外の１又は数個のアミノ酸を欠失させることを含む、請求項１５〜１７に記載の糖結合活性を有するペプチドの改変方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−１４８７３６（Ｐ２０１１−１４８７３６Ａ）
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１４４９（Ｐ２０１０−１１４４９）
【出願日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（３０２０４２６７８）株式会社Ｊ−オイルミルズ (75)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（３０２０４２６７８）株式会社Ｊ−オイルミルズ (75)
【Ｆターム（参考）】
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