ホスフィチル化方法
活性化物質の存在下におけるホスフィチル化剤でのアルコールまたはチオールのホスフィチル化方法を提供する。該活性化物質は、式１（式中、ｐは、０または１〜４の整数であり、各々の場合のＲは置換基である）を有する。好ましくは、Ｘ7はＯであり、ｐは０である。該活性化物質を、一般的には、有機塩基との塩錯体として用いる。好ましいアルコールまたはチオールには、ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドが含まれる。該方法は、特に、ホスホロアミダイトの合成に適している。
【化１】
【化１】
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アルコールまたはチオールのホスフィチル化（phosphitylation）、特に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを形成するためのヌクレオシドのホスフィチル化の方法に関する。
【０００２】
合成オリゴヌクレオチドは、遺伝的疾患およびウイルス疾患の検出に重要な診断用手段である。更に、オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現またはタンパク質機能を阻害する治療的候補として興味がもたれている。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の処置用のオリゴヌクレオチド類似体のＦＤＡ承認、およびいくつか他のオリゴヌクレオチド類似体が現在臨床試験中であるので、治療的候補として用いるためのオリゴヌクレオチドの大規模合成は、ますます重要になってきている。各々の臨床試験には、キログラム量の精製オリゴヌクレオチド類似体が必要である。
【０００３】
オリゴヌクレオチドの製造に現在用いられている主な方法は、ホスホロアミダイトアプローチである。一層多量のオリゴヌクレオチドへの増加する需要は、対応して、ホスホロアミダイト化合物への需要を増加させている。ホスホロアミダイト化合物は、一般的には、活性化物質の存在下におけるホスフィチル化剤でのヌクレオシドのホスフィチル化によって製造される。最も一般的に用いられる活性化物質は、求核的活性化物質１Ｈ−テトラゾールである。しかしながら、１Ｈ−テトラゾールは爆発性であるので、大規模合成で用いるには危険でありうる。
【０００４】
オリゴヌクレオチドを診断的および治療的使用に一層容易に利用可能にするためには、ホスフィチル化を促進し、副生成物を増加させることなく用いることができる非爆発性活性化物質が必要である。
【０００５】
本発明により、活性化物質の存在下におけるホスフィチル化剤でのアルコールまたはチオールのホスフィチル化方法であって、該活性化物質が式１を有することを特徴とする方法を提供する。
【０００６】
【化１】
【０００７】
式１において、ｐは、０または１〜４の整数である。各々の場合のＲは、置換基、好ましくは、各々独立して、ハロ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、−ＮＲ1Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ3、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ3、シアノ、置換されたまたは未置換のアリール、置換されたまたは未置換のヘテロ環、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ3、−ＮＨＣＯＲ3、置換されたまたは未置換のアラルキル、ハロゲン化アルキル（例えば、トリフルオロメチルおよびトリクロロメチル）または−ＳＲ3である。好ましくは、Ｒは、ハロ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、−ＮＲ1Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ3、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ3またはシアノである。或いは、２個の隣接したＲ基は、それらが結合している炭素原子と一緒に、６員の飽和環または不飽和環、好ましくは、芳香環を形成する。Ｒ1およびＲ2は、各々独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアリール基、置換されたまたは未置換のアラルキル基であり；またはそれらが結合している窒素と一緒に、ヘテロ環基を形成する。Ｒ3は、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアリール基、または置換されたまたは未置換のアラルキル基である。Ｘは、ＯまたはＳである。好ましくは、ＸはＯである。ＸがＯであり、ｐが０であるのが、特に好適である。
【０００８】
好ましくは、式１の化合物は、有機塩基との塩錯体として用いられる。
多くの態様において、アルコールまたはチオールは、フリーのヒドロキシ基またはチオール基を含むヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドであり、それには、ヘキソースのような、天然のヌクレオシドペントース類および非天然のヌクレオシド糖類を含むヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドが含まれる。アルコールまたはチオールが、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドである場合、それは、しばしば、保護されたデオキシリボヌクレオシド、保護されたリボヌクレオシド、保護されたオリゴデオキシリボヌクレオチド、保護されたオリゴリボヌクレオチド、または、デオキシリボヌクレオチド部分とリボヌクレオチド部分の混合体を有する保護されたオリゴヌクレオチドであり、そして、各々は、フリーの３’−または５’−、好ましくは３’−ヒドロキシ基またはチオール基、特に好ましくは３’−ヒドロキシ基を、有している。
【０００９】
本発明の方法によってホスフィチル化することができるアルコールおよびチオールには、式２
【００１０】
【化２】
【００１１】
を有する化合物が含まる。ここで、Ａは、
【００１２】
【化３】
【００１３】
であり、ここにおいて、各々の場合のＸ1は、独立して、−Ｏ−または−Ｓ−である。好ましくは、Ｘ1は、全ての場合に−Ｏ−である。各々の場合のＸ2は、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2−または−（ＣＨ2）2−である。好ましくは、Ｘ2は、全ての場合に−Ｏ−である。各々の場合のＸ3は、独立して、ＯまたはＳである。より好ましい態様において、Ｘ1およびＸ2は各々、全ての場合に−Ｏ−である。Ｒ4は、アルコール保護基またはチオール保護基である。好ましくは、Ｒ4は、酸に不安定な保護基である。各々の場合のＲ5は、独立して、−Ｈ、−Ｆ、−ＯＲ6、−ＮＲ7Ｒ8、−ＳＲ9、またはメチルまたはアリルなどの置換されたまたは未置換の脂肪族基である。各々の場合のＲ10は、独立して、リン保護基、一般的には、オリゴヌクレオチド合成に用いられる開裂可能なリン保護基、好ましくは、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアリール基、または置換されたまたは未置換のアラルキル基であって、式−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3または−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2のような基である。各々の場合のＲ6は、独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基（例えば、メチル、エチル、メトキシエチルまたはアリル）、置換されたまたは未置換のアリール基、置換されたまたは未置換のアラルキル基、アルコール保護基、特に、塩基に不安定な基またはシリル保護基、または−（ＣＨ2）q−ＮＲ11Ｒ12である。各々の場合のＲ7およびＲ8は、各々独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、またはアミン保護基である。或いは、それらが結合している窒素と一緒になったＲ7およびＲ8は、ヘテロ環基である。各々の場合のＲ9は、独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、またはチオール保護基である。Ｒ11およびＲ12は、各々独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換のアリール基、置換されたまたは未置換のヘテロアリール基、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアラルキル基、置換されたまたは未置換のヘテロアラルキル基、またはアミン保護基である。或いは、それらが結合している窒素と一緒になったＲ11およびＲ12は、ヘテロ環基を形成する。ｑは、１〜約６の整数である。ｓは、０または正の整数である。好ましくは、ｓは、０、１または２、最も好ましくは、０である。Ｂは、各々独立して、−Ｈ、天然のまたは非天然の核酸塩基、保護された核酸塩基、保護された天然のまたは非天然の核酸塩基、ヘテロ環または保護されたヘテロ環である。
【００１４】
ヌクレオシド塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルのような天然に存在する塩基、および７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、３−デアザアデノシン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、４−オキソ−５−メチルピリミジン、２−アミノプリン、５−フルオロウラシル、２，６−ジアミノプリン、８−アミノプリン、４−トリアゾロ−５−メチルチミン、４−トリアゾロ−５−メチルウラシルおよびヒポキサンチンのような修飾塩基が含まれる。
【００１５】
保護されたヌクレオシド塩基は、その塩基の反応性官能基が保護されているヌクレオシド塩基である。同様に、保護されたヘテロ環は、そのヘテロ環の反応性置換基が保護されているヘテロ環である。典型的には、ヌクレオシド塩基またはヘテロ環は、アミドまたはカルバメートのようなアミン保護基で保護することができるアミン基を有する。例えば、アデニンおよびシトシンのアミン基は、典型的には、ベンゾイル保護基で保護され、そしてグアニンのアミン基は、典型的には、イソブチリル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基またはｔ−ブチルフェノキシアセチル基で保護される。しかしながら、ホルムアミジンのような他の保護スキームを用いてもよい。例えば、速い脱保護には、アデニンおよびグアニンのアミン基は、フェノキシアセチル基で保護され、そしてシトシンのアミン基は、イソブチリル基またはアセチル基で保護される。核酸塩基またはヘテロ環の保護基の除去条件は、用いられる保護基に依存するであろう。アミド保護基が用いられる場合、それは、濃水酸化アンモニウム溶液、ｎ−メチルアミン溶液、または水酸化アンモニウム中のｔ−ブチルアミン溶液などの塩基溶液でオリゴヌクレオチドを処理することによって除去することができる。
【００１６】
アミン、ヒドロキシおよびチオールの保護基は、当業者に知られている。アミン保護基の例については、その内容が本明細書中にそのまま援用される、Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, Inc. の３０９〜４０５頁を参照されたい。好ましくは、アミンは、アミドまたはカルバメートとして保護される。ヒドロキシ保護基の例については、その内容が本明細書中にそのまま援用される同上の１０〜１４２頁を参照されたい。用いることができる保護基の例には、シリル基、特に、トリアルキル、例えば、トリ（Ｃ1-4アルキル）シリル基が含まれる。好ましいシリル保護基は、ｔ−ブチルジメチルシリル基である。好ましいヒドロキシ保護基は、ｔ−ブチルジメチルシリル基である。チオール保護基の例については、その内容が本明細書中にそのまま援用される同上の２７７〜３０８頁を参照されたい。
【００１７】
酸に不安定な保護基は、ブレンステッド酸またはルイス酸とその基を接触させることによって除去することができる保護基である。酸に不安定な保護基は、当業者に知られている。一般的な酸に不安定な保護基の例には、置換されたまたは未置換のトリチル基（同上の６０〜６２頁）、置換されたまたは未置換のテトラヒドロピラニル基（同上の３１〜３４頁）、置換されたまたは未置換のテトラヒドロフラニル基（同上の３６〜３７頁）またはピキシル基（同上の６５頁）が含まれる。トリチル基は、一般的には、アルコキシ基などの電子供与性置換基によって置換されている。好ましい酸に不安定な保護基は、置換されたまたは未置換のトリチル、例えば、４，４’−ジメトキシトリチル（以下、「ＤＭＴ」）である。
【００１８】
塩基に不安定な保護基は、ブレンステッド塩基またはルイス塩基とその基を接触させることによって除去することができる保護基である。塩基に不安定な保護基は、当業者に知られている。一般的な塩基に不安定な保護基の例には、アセチル基、ベンゾイル基およびピバロイル基のようなカルボニル化合物が含まれる。
【００１９】
式２は、天然の形、すなわち与えられたアルコールのヌクレオシド立体配置（Ｄ−異性体）によって表されているが、本発明が、対応する合成のまたは非天然のアルコールの立体配置（Ｌ−異性体）、および双方の立体配置の混合物に等しく適用できるということは理解されるであろう。
【００２０】
本発明の方法で用いることができるホスフィチル化剤は、一般的には、一般化学式
Ｒ13−Ｘ6−ＰＸ4Ｘ5
を有し、式中、Ｒ13は、リン保護基、一般的には、オリゴヌクレオチド合成に用いられる開裂可能なリン保護基、例えば、置換されたまたは未置換の脂肪族基またはアラルキル基であって、メチル基、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2のようなもの、好ましくは、式−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮの基；置換されたまたは未置換の芳香族基であって、フェニルまたは置換フェニルのようなもの、例えば、４−クロロフェニル基、２−クロロフェニル基、２−ニトロフェニル基または４−ニトロフェニル基であり；Ｘ6は、ＯまたはＳ、好ましくは、Ｏであり；Ｘ4およびＸ5は、同じであってよいしまたは異なっていてよくハロ（一般的にはブロモまたはクロロ）等の脱離基、または−ＮＲ14Ｒ15であり、ここにおいて、Ｒ14およびＲ15は、各々独立して、アルキル基、好ましくは、Ｃ1-6アルキル基であり、またはＲ14およびＲ15は接合し、それらが結合しているＮと一緒に５〜７員環を形成する。一般的には、Ｘ4およびＸ5の少なくとも一つは、式−ＮＲ14Ｒ15の基である。最も好ましくは、Ｘ4およびＸ5は同じであり、Ｘ4およびＸ5双方が−Ｎ［ＣＨ（ＣＨ3）2］2基であるのが特に好適である。特に、Ｘ6がＯであり、そしてＲ13が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮであるのが好適である。
【００２１】
本発明の方法は、特に、ホスホロアミダイト、特に、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドのホスホロアミダイトの製造に適している。
好ましいホスフィチル化剤の例には、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（一般的には、「テトラホス（tetraphos）」として知られる）、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダイト、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルホスホロジアミダイト、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−メチルトリフルオロアセチルアミノエトキシホスフィン、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−ジフェニルメチルシリルエトキシホスフィンおよびＯ−β−シアノエチル−ビス（Ｎ−モルホリノ）ホスホロジアミダイトが含まれる。
【００２２】
本発明による方法は、しばしば、０℃〜約５０℃の範囲内の温度で、好ましくは、約１５℃〜約３０℃のような周囲温度で行われる。
好都合には、実質的に無水の反応条件を用いる。
【００２３】
多数の態様において、本発明の方法は、窒素またはアルゴンの雰囲気のような不活性雰囲気下で行われる。
本発明による方法は、好都合には、ヌクレオシドホスホロアミダイトを生成するために用いられる。したがって、本発明の好ましい側面は、式
【００２４】
【化４】
【００２５】
を有する化合物の製造方法であって、式
【００２６】
【化５】
【００２７】
（式中、Ｒ4は、前に定義の通りであり、好ましくは、ジメトキシトリチル基であり、そしてＲ5は、前に定義の通りである）
を有する化合物と、式
ＮＣＣＨ2ＣＨ2Ｏ−Ｐ（Ｎ（Ｒ16）2）2
（式中、Ｒ16は、Ｃ1-6アルキル基、好ましくは、イソプロピル基である）
を有する化合物とを、活性化物質であって、式
【００２８】
【化６】
【００２９】
を有する化合物を含む活性化物質および有機塩基の存在下において反応させることを含む方法を含む。
多数の態様において、活性化物質は、アルコールに対して化学量論的モル比または化学量論より少ないモル比で用いられ、約０．４：１〜１：１、特に、約０．５：１〜０．７５：１の活性化物質対アルコールのモル比が好適である。
【００３０】
ホスフィチル化剤は、しばしば、アルコールに対して化学量論的モル比でまたは過剰に用いられ、約１：１〜３：１、特に、約１：１〜１．５：１のホスフィチル化剤対アルコールのモル比が好適である。
【００３１】
有機塩基の存在下において、本発明で用いられる活性化物質は、特に、ホスフィチル化に典型的に用いられる有機溶媒に充分な溶解度を有する。活性化物質および有機塩基の濃度は、関係する溶媒中の活性化物質の溶解度まででありうる。好ましい態様において、活性化物質および有機塩基は、約０．０１Ｍ〜約２Ｍ、例えば、約０．０５Ｍ〜約０．５Ｍの濃度範囲で存在する。一般的には、活性化物質および有機塩基は、約０．１Ｍ〜約０．２５Ｍのような、０．２５Ｍまでの濃度で存在する。より好ましい態様において、活性化物質および有機塩基は、同じモル濃度で存在する。若干の態様において、有機溶媒は、ジクロロメタンのような塩化炭素である。好ましい態様において、有機溶媒はアセトニトリルを含む。別の好ましい態様において、有機溶媒は、ジメチルホルムアミド、１−メチル−２−ピロリジノンまたは１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンのような有機アミドを含む。
【００３２】
有機塩基は、ｐＨ７においてプロトンを受容する性質を有する有機化合物である。好ましい有機塩基は、第二級アミン類、第三級アミン類またはアザヘテロ環化合物であり、それらは各々、一つ以上の置換基で置換されていてよいしまたは未置換であってよい。非プロトン性有機塩基は、プロトンを受容する前のその化学構造中に、水素結合プロトンを有していない有機塩基である。第三級アミン類および非プロトン性アザヘテロ環化合物などの非プロトン性有機塩基は、好ましくは、本明細書中に記載の式１の化合物と共に用いられて、ホスフィチル化反応を促進する。
【００３３】
本明細書中で用いられるアザヘテロ環化合物は、芳香環中に１個以上の窒素原子を有するヘテロアリール基、および非芳香環系中に少なくとも１個の窒素原子を有するヘテロ脂環基を含む。好ましくは、アザヘテロアリール化合物は、芳香環中に１〜３個の窒素を含む５員または６員の芳香環を有する。好ましくは、アザヘテロ脂環化合物は、一般的には、環中に１個または２個の窒素を含む、５員環または６員環である。好ましいアザヘテロ環化合物は、有機塩基である。有機塩基であるアザヘテロ環化合物の例には、ピリミジン類、１−アルキルピラゾール類、特に、１−（Ｃ1-4アルキル）ピラゾール類、１−アリールピラゾール類、１−ベンジルピラゾール類、ピラジン類、Ｎ−アルキルプリン類、特に、Ｎ−（Ｃ1-4アルキル）プリン類、Ｎ−アリールプリン類、Ｎ−ベンジルプリン類、Ｎ−アルキルピロール類、特に、Ｎ−（Ｃ1-4アルキル）ピロール類、Ｎ−アリールピロール類、Ｎ−ベンジルピロール類、ピリジン類、Ｎ−アルキルイミダゾール類、特に、Ｎ−（Ｃ1-4アルキル）イミダゾール類、Ｎ−アリールイミダゾール類、特に、Ｎ−フェニルイミダゾール類、Ｎ−ベンジルイミダゾール類、キノリン類、イソキノリン類、キノキサリン類、キナゾリン類、Ｎ−アルキルインドール類、特に、Ｎ−（Ｃ1-4アルキル）インドール類、Ｎ−アリールインドール類、Ｎ−ベンジルインドール類、Ｎ−アルキルベンズイミダゾール類、特に、Ｎ−（Ｃ1-4アルキル）ベンズイミダゾール類、Ｎ−アリールベンズイミダゾール類、Ｎ−ベンジルベンズイミダゾール類、トリアジン、チアゾール、１−アルキル−７−アザインドール類、特に、１−（Ｃ1-4アルキル）−７−アザインドール類、１−アリール−７−アザインドール類、１−ベンジル−７−アザインドール類、ピロリジン類、モルホリン類、ピペリジン類およびピペラジン類が含まれる。特に好ましいアザヘテロ環化合物は、ピリジンおよび３−メチルピリジンなどのピリジン類、およびＮ−メチルイミダゾールなどのＮ−（Ｃ1-4アルキル）イミダゾール類である。
【００３４】
第三級アミン類は、３個の炭素原子に、しばしば、３個のアリール基、一般的には、フェニル基および／またはアルキル基に、一般的には、３個のアルキル基に結合している窒素原子を有する有機塩基であって、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類を含めたものである。更に、第三級アミン類は、窒素原子が非プロトン性であるアザヘテロ環基でありうる。アザヘテロ環基である第三級アミン類は、好適である。アザヘテロ環第三級アミン類の例は、Ｎ−アルキルピロリジン類、Ｎ−アリールピロリジン類、Ｎ−アルキルピロール類、Ｎ−アリールピロール類、Ｎ−アルキルモルホリン類、Ｎ−アリールモルホリン類、Ｎ−アルキルピペリジン類、Ｎ−アリールピペリジン類、Ｎ，Ｎ−ジアルキルピペラジン類、Ｎ，Ｎ−ジアリールピペラジン類、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールピペラジン類、キヌクリジン類、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン類および１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン類である。第三級アミン類は、アザヘテロアリール化合物またはアザヘテロ脂環化合物でもありうる。
【００３５】
第二級アミン類は、１個の水素におよび２個の炭素原子に結合した窒素を含む有機塩基である。一般的には、その窒素原子は、２個のアルキル基またはアリール基に結合しているか、またはアザヘテロ環式基の一部分を形成している。第二級アミン化合物の例には、ジエチルアミンおよびジイソプロピルアミンが含まれる。
【００３６】
特に好ましい有機塩基には、ピリジン、３−メチルピリジンおよびＮ−メチルイミダゾールが含まれる。
脂肪族基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、アザヘテロアリール基およびヘテロ脂環基に対する適した置換基には、アリール基、ハロゲン化アリール基、アルキル基、ハロゲン化アルキル（例えば、トリフルオロメチルおよびトリクロロメチル）、脂肪族エーテル類、芳香族エーテル類、ベンジル、置換ベンジル、ハロゲン類、特に、クロロ基およびフルオロ基、シアノ、ニトロ、−Ｓ−（脂肪族基または置換脂肪族基）および−Ｓ−（芳香族または置換芳香族）が含まれる。
【００３７】
本明細書中で用いられる脂肪族基は、完全に飽和しているか、または１個以上の非共役二重結合を含有している直鎖または分岐状のＣ1−Ｃ18炭化水素；または完全に飽和しているまたは１個以上の非共役二重結合を含有している環状Ｃ3−Ｃ18炭化水素を含む。アルキル基は、完全に飽和している直鎖または分岐状のＣ1−Ｃ8炭化水素またはＣ3−Ｃ8環状炭化水素である。好ましくは、脂肪族基はアルキル基である。
【００３８】
アリール基は、炭素環式芳香環系（例えば、フェニル）、および１個以上の炭素環式芳香族炭化水素に縮合した炭素環式芳香環系（例えば、ナフチルおよびアントラセニル）または１個以上の非芳香環に縮合した芳香環系（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル）を含む。
【００３９】
本明細書中で用いられるヘテロ環式基は、ヘテロアリール基およびヘテロ脂環基を含む。本明細書中で用いられるヘテロアリール基は、硫黄、窒素または酸素より選択される１個以上のヘテロ原子を芳香環中に有する芳香環系を含む。好ましくは、ヘテロアリール基は、１〜４個のヘテロ原子を有する５員または６員の環系である。本明細書中で用いられるヘテロ脂環基は、好ましくは、５〜６個の原子を有し且つ窒素、酸素および硫黄より選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む非芳香環系である。ヘテロ環式基の例には、モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロチエニル、アゼチジニル、テトラヒドロフリル、ジオキサニルおよびジオキセパニル、チエニル、ピリジル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、インダゾリル、フラン類、ピロール類、イミダゾール類、ピラゾール類、トリアゾール類、ピリミジン類、ピラジン類、チアゾール類、イソオキサゾール類、イソチアゾール類、テトラゾール類、オキサジアゾール類、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンズイミダゾール、インドール、テトラヒドロインドール、アザインドール、インダゾール、キノリン、イミダゾピリジン、プリン、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンおよびピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンが含まれる。
【００４０】
本明細書中で用いられるアラルキル基は、アルキル基によってある部分に連結している芳香族置換基である。好ましいアラルキル基には、ベンジル基が含まれる。
本明細書中で用いられるヘテロアラルキル基は、アルキル基によってある部分に連結しているヘテロアリール置換基である。
【００４１】
本発明を、次の実施例により、制限されることなく詳しく説明する。
実施例１
サッカリンのＮ−メチルイミダゾール塩を、次の手順によって製造した。サッカリンを、アセトニトリル中に懸濁させ、そしてその懸濁液に、サッカリンに対して１．１当量のＮ−メチルイミダゾールを滴下した。反応混合物を減圧下で濃縮して、結晶性塩を形成させ、それを、エーテルかまたはヘキサンで洗浄して、Ｎ−メチルイミダゾールおよびアセトニトリルの痕跡を除去した。
【００４２】
実施例２
一連のヌクレオシドを、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイトと、活性化物質としてのサッカリンのＮ−メチルイミダゾール塩を用いてホスフィチル化した。
【００４３】
一般的な方法：
適当なサイズのフラスコ中に、ヌクレオシド（１．５ｍｍｏｌ）を加え、その固体を、２０ｍＬのピリジンで２回蒸留すること（ロータリーエバポレーター）によって共沸乾燥させた。そのフラスコをＡｒでパージし、そして１５ｍＬのアセトニトリルをフラスコに加えた。その混合物を、室温で、透明な溶液が得られるまで撹拌した。混合物に、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（Tetraphos）を加えた後、サッカリンのＮ−メチルイミダゾール塩を加えた。混合物を室温で撹拌し、同時に、反応の終点について、ＨＰＬＣによって反応を監視した。反応の終了後、混合物を３０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、そして有機混合物を、２ｘ２５ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム水溶液および２５ｍＬの飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。懸濁液を濾過し、そしてロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。残留物を真空下で乾燥させて、泡状物を生じた。
【００４４】
【表１】
【００４５】
実施例２
５００ｍＬ丸底フラスコ中に、５’−ＤＭＴ−Ｎ−Ｂｚ−２’−デオキシアデノシン（１８．００ｇ，２７．３７ｍｍｏｌ）を加え、その固体を、２ｘ２００ｍＬのトルエンの添加および蒸発（ロータリーエバポレーター）によって共沸乾燥させた。残留物を真空下で１６時間乾燥させた。その残留物を、アルゴン雰囲気下においてアセトニトリル（１８０ｍＬ）中に溶解させ、そしてＯ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（９．９０ｇ，３２．８４ｍｍｏｌ）を加えた。その混合物を５分間撹拌し、そしてサッカリンのＮ−メチルイミダゾール塩固体（３．６３ｇ，１３．６９ｍｍｏｌ）を加えた。その混合物を室温で撹拌し、同時に、ＨＰＬＣによって反応を監視した。１８時間後、それ以上の反応は認められなくなった。反応混合物に、酢酸エチル（２００ｍＬ）を加え、そして有機溶液を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ１５０ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。懸濁液を濾過し、そしてロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。残留物を真空下で１６時間乾燥させて、白色泡状物を生じた。
【００４６】
粗製収量：２３．７０ｇ
ＨＰＬＣ：９２．５％
その粗生成物（２３．７０ｇ）を、シリカゲル（２３０ｇ）カラムを用いたクロマトグラフィーによって処理した。カラムは、０．５％トリエチルアミンを含有する３０％酢酸エチル／ヘキサンを用いて充填された。そのカラムを、２カラム容量の３０％酢酸エチル／ヘキサンで洗浄した。粗生成物を充填し、そしてそのカラムを、２カラム容量の３０％酢酸エチル／ヘキサン、２カラム容量の４０％酢酸エチル／ヘキサン、２カラム容量の５０％酢酸エチル／ヘキサン、そして最後に、３カラム容量の７０％酢酸エチル／ヘキサンを用いて溶離した。ＴＬＣ（８：３の酢酸エチル：ヘキサン）によって生成物が検出された場合、画分を集めた。所望の生成物を含有する画分を一緒に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。残留物を真空下で１６時間乾燥させて、白色泡状物を生じた。
【００４７】
収量：１７．５５ｇ（７５％）
ＨＰＬＣ：９７．５％
31Ｐ ＮＭＲ：９９．３％
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アルコールまたはチオールのホスフィチル化（phosphitylation）、特に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを形成するためのヌクレオシドのホスフィチル化の方法に関する。
【０００２】
合成オリゴヌクレオチドは、遺伝的疾患およびウイルス疾患の検出に重要な診断用手段である。更に、オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現またはタンパク質機能を阻害する治療的候補として興味がもたれている。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の処置用のオリゴヌクレオチド類似体のＦＤＡ承認、およびいくつか他のオリゴヌクレオチド類似体が現在臨床試験中であるので、治療的候補として用いるためのオリゴヌクレオチドの大規模合成は、ますます重要になってきている。各々の臨床試験には、キログラム量の精製オリゴヌクレオチド類似体が必要である。
【０００３】
オリゴヌクレオチドの製造に現在用いられている主な方法は、ホスホロアミダイトアプローチである。一層多量のオリゴヌクレオチドへの増加する需要は、対応して、ホスホロアミダイト化合物への需要を増加させている。ホスホロアミダイト化合物は、一般的には、活性化物質の存在下におけるホスフィチル化剤でのヌクレオシドのホスフィチル化によって製造される。最も一般的に用いられる活性化物質は、求核的活性化物質１Ｈ−テトラゾールである。しかしながら、１Ｈ−テトラゾールは爆発性であるので、大規模合成で用いるには危険でありうる。
【０００４】
オリゴヌクレオチドを診断的および治療的使用に一層容易に利用可能にするためには、ホスフィチル化を促進し、副生成物を増加させることなく用いることができる非爆発性活性化物質が必要である。
【０００５】
本発明により、活性化物質の存在下におけるホスフィチル化剤でのアルコールまたはチオールのホスフィチル化方法であって、該活性化物質が式１を有することを特徴とする方法を提供する。
【０００６】
【化１】
【０００７】
式１において、ｐは、０または１〜４の整数である。各々の場合のＲは、置換基、好ましくは、各々独立して、ハロ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、−ＮＲ1Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ3、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ3、シアノ、置換されたまたは未置換のアリール、置換されたまたは未置換のヘテロ環、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ3、−ＮＨＣＯＲ3、置換されたまたは未置換のアラルキル、ハロゲン化アルキル（例えば、トリフルオロメチルおよびトリクロロメチル）または−ＳＲ3である。好ましくは、Ｒは、ハロ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、−ＮＲ1Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ3、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ3またはシアノである。或いは、２個の隣接したＲ基は、それらが結合している炭素原子と一緒に、６員の飽和環または不飽和環、好ましくは、芳香環を形成する。Ｒ1およびＲ2は、各々独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアリール基、置換されたまたは未置換のアラルキル基であり；またはそれらが結合している窒素と一緒に、ヘテロ環基を形成する。Ｒ3は、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアリール基、または置換されたまたは未置換のアラルキル基である。Ｘは、ＯまたはＳである。好ましくは、ＸはＯである。ＸがＯであり、ｐが０であるのが、特に好適である。
【０００８】
好ましくは、式１の化合物は、有機塩基との塩錯体として用いられる。
多くの態様において、アルコールまたはチオールは、フリーのヒドロキシ基またはチオール基を含むヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドであり、それには、ヘキソースのような、天然のヌクレオシドペントース類および非天然のヌクレオシド糖類を含むヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドが含まれる。アルコールまたはチオールが、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドである場合、それは、しばしば、保護されたデオキシリボヌクレオシド、保護されたリボヌクレオシド、保護されたオリゴデオキシリボヌクレオチド、保護されたオリゴリボヌクレオチド、または、デオキシリボヌクレオチド部分とリボヌクレオチド部分の混合体を有する保護されたオリゴヌクレオチドであり、そして、各々は、フリーの３’−または５’−、好ましくは３’−ヒドロキシ基またはチオール基、特に好ましくは３’−ヒドロキシ基を、有している。
【０００９】
本発明の方法によってホスフィチル化することができるアルコールおよびチオールには、式２
【００１０】
【化２】
【００１１】
を有する化合物が含まる。ここで、Ａは、
【００１２】
【化３】
【００１３】
であり、ここにおいて、各々の場合のＸ1は、独立して、−Ｏ−または−Ｓ−である。好ましくは、Ｘ1は、全ての場合に−Ｏ−である。各々の場合のＸ2は、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2−または−（ＣＨ2）2−である。好ましくは、Ｘ2は、全ての場合に−Ｏ−である。各々の場合のＸ3は、独立して、ＯまたはＳである。より好ましい態様において、Ｘ1およびＸ2は各々、全ての場合に−Ｏ−である。Ｒ4は、アルコール保護基またはチオール保護基である。好ましくは、Ｒ4は、酸に不安定な保護基である。各々の場合のＲ5は、独立して、−Ｈ、−Ｆ、−ＯＲ6、−ＮＲ7Ｒ8、−ＳＲ9、またはメチルまたはアリルなどの置換されたまたは未置換の脂肪族基である。各々の場合のＲ10は、独立して、リン保護基、一般的には、オリゴヌクレオチド合成に用いられる開裂可能なリン保護基、好ましくは、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアリール基、または置換されたまたは未置換のアラルキル基であって、式−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3または−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2のような基である。各々の場合のＲ6は、独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基（例えば、メチル、エチル、メトキシエチルまたはアリル）、置換されたまたは未置換のアリール基、置換されたまたは未置換のアラルキル基、アルコール保護基、特に、塩基に不安定な基またはシリル保護基、または−（ＣＨ2）q−ＮＲ11Ｒ12である。各々の場合のＲ7およびＲ8は、各々独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、またはアミン保護基である。或いは、それらが結合している窒素と一緒になったＲ7およびＲ8は、ヘテロ環基である。各々の場合のＲ9は、独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、またはチオール保護基である。Ｒ11およびＲ12は、各々独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換のアリール基、置換されたまたは未置換のヘテロアリール基、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアラルキル基、置換されたまたは未置換のヘテロアラルキル基、またはアミン保護基である。或いは、それらが結合している窒素と一緒になったＲ11およびＲ12は、ヘテロ環基を形成する。ｑは、１〜約６の整数である。ｓは、０または正の整数である。好ましくは、ｓは、０、１または２、最も好ましくは、０である。Ｂは、各々独立して、−Ｈ、天然のまたは非天然の核酸塩基、保護された核酸塩基、保護された天然のまたは非天然の核酸塩基、ヘテロ環または保護されたヘテロ環である。
【００１４】
ヌクレオシド塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルのような天然に存在する塩基、および７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、３−デアザアデノシン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、４−オキソ−５−メチルピリミジン、２−アミノプリン、５−フルオロウラシル、２，６−ジアミノプリン、８−アミノプリン、４−トリアゾロ−５−メチルチミン、４−トリアゾロ−５−メチルウラシルおよびヒポキサンチンのような修飾塩基が含まれる。
【００１５】
保護されたヌクレオシド塩基は、その塩基の反応性官能基が保護されているヌクレオシド塩基である。同様に、保護されたヘテロ環は、そのヘテロ環の反応性置換基が保護されているヘテロ環である。典型的には、ヌクレオシド塩基またはヘテロ環は、アミドまたはカルバメートのようなアミン保護基で保護することができるアミン基を有する。例えば、アデニンおよびシトシンのアミン基は、典型的には、ベンゾイル保護基で保護され、そしてグアニンのアミン基は、典型的には、イソブチリル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基またはｔ−ブチルフェノキシアセチル基で保護される。しかしながら、ホルムアミジンのような他の保護スキームを用いてもよい。例えば、速い脱保護には、アデニンおよびグアニンのアミン基は、フェノキシアセチル基で保護され、そしてシトシンのアミン基は、イソブチリル基またはアセチル基で保護される。核酸塩基またはヘテロ環の保護基の除去条件は、用いられる保護基に依存するであろう。アミド保護基が用いられる場合、それは、濃水酸化アンモニウム溶液、ｎ−メチルアミン溶液、または水酸化アンモニウム中のｔ−ブチルアミン溶液などの塩基溶液でオリゴヌクレオチドを処理することによって除去することができる。
【００１６】
アミン、ヒドロキシおよびチオールの保護基は、当業者に知られている。アミン保護基の例については、その内容が本明細書中にそのまま援用される、Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, Inc. の３０９〜４０５頁を参照されたい。好ましくは、アミンは、アミドまたはカルバメートとして保護される。ヒドロキシ保護基の例については、その内容が本明細書中にそのまま援用される同上の１０〜１４２頁を参照されたい。用いることができる保護基の例には、シリル基、特に、トリアルキル、例えば、トリ（Ｃ1-4アルキル）シリル基が含まれる。好ましいシリル保護基は、ｔ−ブチルジメチルシリル基である。好ましいヒドロキシ保護基は、ｔ−ブチルジメチルシリル基である。チオール保護基の例については、その内容が本明細書中にそのまま援用される同上の２７７〜３０８頁を参照されたい。
【００１７】
酸に不安定な保護基は、ブレンステッド酸またはルイス酸とその基を接触させることによって除去することができる保護基である。酸に不安定な保護基は、当業者に知られている。一般的な酸に不安定な保護基の例には、置換されたまたは未置換のトリチル基（同上の６０〜６２頁）、置換されたまたは未置換のテトラヒドロピラニル基（同上の３１〜３４頁）、置換されたまたは未置換のテトラヒドロフラニル基（同上の３６〜３７頁）またはピキシル基（同上の６５頁）が含まれる。トリチル基は、一般的には、アルコキシ基などの電子供与性置換基によって置換されている。好ましい酸に不安定な保護基は、置換されたまたは未置換のトリチル、例えば、４，４’−ジメトキシトリチル（以下、「ＤＭＴ」）である。
【００１８】
塩基に不安定な保護基は、ブレンステッド塩基またはルイス塩基とその基を接触させることによって除去することができる保護基である。塩基に不安定な保護基は、当業者に知られている。一般的な塩基に不安定な保護基の例には、アセチル基、ベンゾイル基およびピバロイル基のようなカルボニル化合物が含まれる。
【００１９】
式２は、天然の形、すなわち与えられたアルコールのヌクレオシド立体配置（Ｄ−異性体）によって表されているが、本発明が、対応する合成のまたは非天然のアルコールの立体配置（Ｌ−異性体）、および双方の立体配置の混合物に等しく適用できるということは理解されるであろう。
【００２０】
本発明の方法で用いることができるホスフィチル化剤は、一般的には、一般化学式
Ｒ13−Ｘ6−ＰＸ4Ｘ5
を有し、式中、Ｒ13は、リン保護基、一般的には、オリゴヌクレオチド合成に用いられる開裂可能なリン保護基、例えば、置換されたまたは未置換の脂肪族基またはアラルキル基であって、メチル基、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2のようなもの、好ましくは、式−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮの基；置換されたまたは未置換の芳香族基であって、フェニルまたは置換フェニルのようなもの、例えば、４−クロロフェニル基、２−クロロフェニル基、２−ニトロフェニル基または４−ニトロフェニル基であり；Ｘ6は、ＯまたはＳ、好ましくは、Ｏであり；Ｘ4およびＸ5は、同じであってよいしまたは異なっていてよくハロ（一般的にはブロモまたはクロロ）等の脱離基、または−ＮＲ14Ｒ15であり、ここにおいて、Ｒ14およびＲ15は、各々独立して、アルキル基、好ましくは、Ｃ1-6アルキル基であり、またはＲ14およびＲ15は接合し、それらが結合しているＮと一緒に５〜７員環を形成する。一般的には、Ｘ4およびＸ5の少なくとも一つは、式−ＮＲ14Ｒ15の基である。最も好ましくは、Ｘ4およびＸ5は同じであり、Ｘ4およびＸ5双方が−Ｎ［ＣＨ（ＣＨ3）2］2基であるのが特に好適である。特に、Ｘ6がＯであり、そしてＲ13が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮであるのが好適である。
【００２１】
本発明の方法は、特に、ホスホロアミダイト、特に、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドのホスホロアミダイトの製造に適している。
好ましいホスフィチル化剤の例には、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（一般的には、「テトラホス（tetraphos）」として知られる）、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダイト、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルホスホロジアミダイト、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−メチルトリフルオロアセチルアミノエトキシホスフィン、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−ジフェニルメチルシリルエトキシホスフィンおよびＯ−β−シアノエチル−ビス（Ｎ−モルホリノ）ホスホロジアミダイトが含まれる。
【００２２】
本発明による方法は、しばしば、０℃〜約５０℃の範囲内の温度で、好ましくは、約１５℃〜約３０℃のような周囲温度で行われる。
好都合には、実質的に無水の反応条件を用いる。
【００２３】
多数の態様において、本発明の方法は、窒素またはアルゴンの雰囲気のような不活性雰囲気下で行われる。
本発明による方法は、好都合には、ヌクレオシドホスホロアミダイトを生成するために用いられる。したがって、本発明の好ましい側面は、式
【００２４】
【化４】
【００２５】
を有する化合物の製造方法であって、式
【００２６】
【化５】
【００２７】
（式中、Ｒ4は、前に定義の通りであり、好ましくは、ジメトキシトリチル基であり、そしてＲ5は、前に定義の通りである）
を有する化合物と、式
ＮＣＣＨ2ＣＨ2Ｏ−Ｐ（Ｎ（Ｒ16）2）2
（式中、Ｒ16は、Ｃ1-6アルキル基、好ましくは、イソプロピル基である）
を有する化合物とを、活性化物質であって、式
【００２８】
【化６】
【００２９】
を有する化合物を含む活性化物質および有機塩基の存在下において反応させることを含む方法を含む。
多数の態様において、活性化物質は、アルコールに対して化学量論的モル比または化学量論より少ないモル比で用いられ、約０．４：１〜１：１、特に、約０．５：１〜０．７５：１の活性化物質対アルコールのモル比が好適である。
【００３０】
ホスフィチル化剤は、しばしば、アルコールに対して化学量論的モル比でまたは過剰に用いられ、約１：１〜３：１、特に、約１：１〜１．５：１のホスフィチル化剤対アルコールのモル比が好適である。
【００３１】
有機塩基の存在下において、本発明で用いられる活性化物質は、特に、ホスフィチル化に典型的に用いられる有機溶媒に充分な溶解度を有する。活性化物質および有機塩基の濃度は、関係する溶媒中の活性化物質の溶解度まででありうる。好ましい態様において、活性化物質および有機塩基は、約０．０１Ｍ〜約２Ｍ、例えば、約０．０５Ｍ〜約０．５Ｍの濃度範囲で存在する。一般的には、活性化物質および有機塩基は、約０．１Ｍ〜約０．２５Ｍのような、０．２５Ｍまでの濃度で存在する。より好ましい態様において、活性化物質および有機塩基は、同じモル濃度で存在する。若干の態様において、有機溶媒は、ジクロロメタンのような塩化炭素である。好ましい態様において、有機溶媒はアセトニトリルを含む。別の好ましい態様において、有機溶媒は、ジメチルホルムアミド、１−メチル−２−ピロリジノンまたは１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンのような有機アミドを含む。
【００３２】
有機塩基は、ｐＨ７においてプロトンを受容する性質を有する有機化合物である。好ましい有機塩基は、第二級アミン類、第三級アミン類またはアザヘテロ環化合物であり、それらは各々、一つ以上の置換基で置換されていてよいしまたは未置換であってよい。非プロトン性有機塩基は、プロトンを受容する前のその化学構造中に、水素結合プロトンを有していない有機塩基である。第三級アミン類および非プロトン性アザヘテロ環化合物などの非プロトン性有機塩基は、好ましくは、本明細書中に記載の式１の化合物と共に用いられて、ホスフィチル化反応を促進する。
【００３３】
本明細書中で用いられるアザヘテロ環化合物は、芳香環中に１個以上の窒素原子を有するヘテロアリール基、および非芳香環系中に少なくとも１個の窒素原子を有するヘテロ脂環基を含む。好ましくは、アザヘテロアリール化合物は、芳香環中に１〜３個の窒素を含む５員または６員の芳香環を有する。好ましくは、アザヘテロ脂環化合物は、一般的には、環中に１個または２個の窒素を含む、５員環または６員環である。好ましいアザヘテロ環化合物は、有機塩基である。有機塩基であるアザヘテロ環化合物の例には、ピリミジン類、１−アルキルピラゾール類、特に、１−（Ｃ1-4アルキル）ピラゾール類、１−アリールピラゾール類、１−ベンジルピラゾール類、ピラジン類、Ｎ−アルキルプリン類、特に、Ｎ−（Ｃ1-4アルキル）プリン類、Ｎ−アリールプリン類、Ｎ−ベンジルプリン類、Ｎ−アルキルピロール類、特に、Ｎ−（Ｃ1-4アルキル）ピロール類、Ｎ−アリールピロール類、Ｎ−ベンジルピロール類、ピリジン類、Ｎ−アルキルイミダゾール類、特に、Ｎ−（Ｃ1-4アルキル）イミダゾール類、Ｎ−アリールイミダゾール類、特に、Ｎ−フェニルイミダゾール類、Ｎ−ベンジルイミダゾール類、キノリン類、イソキノリン類、キノキサリン類、キナゾリン類、Ｎ−アルキルインドール類、特に、Ｎ−（Ｃ1-4アルキル）インドール類、Ｎ−アリールインドール類、Ｎ−ベンジルインドール類、Ｎ−アルキルベンズイミダゾール類、特に、Ｎ−（Ｃ1-4アルキル）ベンズイミダゾール類、Ｎ−アリールベンズイミダゾール類、Ｎ−ベンジルベンズイミダゾール類、トリアジン、チアゾール、１−アルキル−７−アザインドール類、特に、１−（Ｃ1-4アルキル）−７−アザインドール類、１−アリール−７−アザインドール類、１−ベンジル−７−アザインドール類、ピロリジン類、モルホリン類、ピペリジン類およびピペラジン類が含まれる。特に好ましいアザヘテロ環化合物は、ピリジンおよび３−メチルピリジンなどのピリジン類、およびＮ−メチルイミダゾールなどのＮ−（Ｃ1-4アルキル）イミダゾール類である。
【００３４】
第三級アミン類は、３個の炭素原子に、しばしば、３個のアリール基、一般的には、フェニル基および／またはアルキル基に、一般的には、３個のアルキル基に結合している窒素原子を有する有機塩基であって、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類を含めたものである。更に、第三級アミン類は、窒素原子が非プロトン性であるアザヘテロ環基でありうる。アザヘテロ環基である第三級アミン類は、好適である。アザヘテロ環第三級アミン類の例は、Ｎ−アルキルピロリジン類、Ｎ−アリールピロリジン類、Ｎ−アルキルピロール類、Ｎ−アリールピロール類、Ｎ−アルキルモルホリン類、Ｎ−アリールモルホリン類、Ｎ−アルキルピペリジン類、Ｎ−アリールピペリジン類、Ｎ，Ｎ−ジアルキルピペラジン類、Ｎ，Ｎ−ジアリールピペラジン類、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールピペラジン類、キヌクリジン類、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン類および１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン類である。第三級アミン類は、アザヘテロアリール化合物またはアザヘテロ脂環化合物でもありうる。
【００３５】
第二級アミン類は、１個の水素におよび２個の炭素原子に結合した窒素を含む有機塩基である。一般的には、その窒素原子は、２個のアルキル基またはアリール基に結合しているか、またはアザヘテロ環式基の一部分を形成している。第二級アミン化合物の例には、ジエチルアミンおよびジイソプロピルアミンが含まれる。
【００３６】
特に好ましい有機塩基には、ピリジン、３−メチルピリジンおよびＮ−メチルイミダゾールが含まれる。
脂肪族基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、アザヘテロアリール基およびヘテロ脂環基に対する適した置換基には、アリール基、ハロゲン化アリール基、アルキル基、ハロゲン化アルキル（例えば、トリフルオロメチルおよびトリクロロメチル）、脂肪族エーテル類、芳香族エーテル類、ベンジル、置換ベンジル、ハロゲン類、特に、クロロ基およびフルオロ基、シアノ、ニトロ、−Ｓ−（脂肪族基または置換脂肪族基）および−Ｓ−（芳香族または置換芳香族）が含まれる。
【００３７】
本明細書中で用いられる脂肪族基は、完全に飽和しているか、または１個以上の非共役二重結合を含有している直鎖または分岐状のＣ1−Ｃ18炭化水素；または完全に飽和しているまたは１個以上の非共役二重結合を含有している環状Ｃ3−Ｃ18炭化水素を含む。アルキル基は、完全に飽和している直鎖または分岐状のＣ1−Ｃ8炭化水素またはＣ3−Ｃ8環状炭化水素である。好ましくは、脂肪族基はアルキル基である。
【００３８】
アリール基は、炭素環式芳香環系（例えば、フェニル）、および１個以上の炭素環式芳香族炭化水素に縮合した炭素環式芳香環系（例えば、ナフチルおよびアントラセニル）または１個以上の非芳香環に縮合した芳香環系（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル）を含む。
【００３９】
本明細書中で用いられるヘテロ環式基は、ヘテロアリール基およびヘテロ脂環基を含む。本明細書中で用いられるヘテロアリール基は、硫黄、窒素または酸素より選択される１個以上のヘテロ原子を芳香環中に有する芳香環系を含む。好ましくは、ヘテロアリール基は、１〜４個のヘテロ原子を有する５員または６員の環系である。本明細書中で用いられるヘテロ脂環基は、好ましくは、５〜６個の原子を有し且つ窒素、酸素および硫黄より選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む非芳香環系である。ヘテロ環式基の例には、モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロチエニル、アゼチジニル、テトラヒドロフリル、ジオキサニルおよびジオキセパニル、チエニル、ピリジル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、インダゾリル、フラン類、ピロール類、イミダゾール類、ピラゾール類、トリアゾール類、ピリミジン類、ピラジン類、チアゾール類、イソオキサゾール類、イソチアゾール類、テトラゾール類、オキサジアゾール類、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンズイミダゾール、インドール、テトラヒドロインドール、アザインドール、インダゾール、キノリン、イミダゾピリジン、プリン、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンおよびピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンが含まれる。
【００４０】
本明細書中で用いられるアラルキル基は、アルキル基によってある部分に連結している芳香族置換基である。好ましいアラルキル基には、ベンジル基が含まれる。
本明細書中で用いられるヘテロアラルキル基は、アルキル基によってある部分に連結しているヘテロアリール置換基である。
【００４１】
本発明を、次の実施例により、制限されることなく詳しく説明する。
実施例１
サッカリンのＮ−メチルイミダゾール塩を、次の手順によって製造した。サッカリンを、アセトニトリル中に懸濁させ、そしてその懸濁液に、サッカリンに対して１．１当量のＮ−メチルイミダゾールを滴下した。反応混合物を減圧下で濃縮して、結晶性塩を形成させ、それを、エーテルかまたはヘキサンで洗浄して、Ｎ−メチルイミダゾールおよびアセトニトリルの痕跡を除去した。
【００４２】
実施例２
一連のヌクレオシドを、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイトと、活性化物質としてのサッカリンのＮ−メチルイミダゾール塩を用いてホスフィチル化した。
【００４３】
一般的な方法：
適当なサイズのフラスコ中に、ヌクレオシド（１．５ｍｍｏｌ）を加え、その固体を、２０ｍＬのピリジンで２回蒸留すること（ロータリーエバポレーター）によって共沸乾燥させた。そのフラスコをＡｒでパージし、そして１５ｍＬのアセトニトリルをフラスコに加えた。その混合物を、室温で、透明な溶液が得られるまで撹拌した。混合物に、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（Tetraphos）を加えた後、サッカリンのＮ−メチルイミダゾール塩を加えた。混合物を室温で撹拌し、同時に、反応の終点について、ＨＰＬＣによって反応を監視した。反応の終了後、混合物を３０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、そして有機混合物を、２ｘ２５ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム水溶液および２５ｍＬの飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。懸濁液を濾過し、そしてロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。残留物を真空下で乾燥させて、泡状物を生じた。
【００４４】
【表１】
【００４５】
実施例２
５００ｍＬ丸底フラスコ中に、５’−ＤＭＴ−Ｎ−Ｂｚ−２’−デオキシアデノシン（１８．００ｇ，２７．３７ｍｍｏｌ）を加え、その固体を、２ｘ２００ｍＬのトルエンの添加および蒸発（ロータリーエバポレーター）によって共沸乾燥させた。残留物を真空下で１６時間乾燥させた。その残留物を、アルゴン雰囲気下においてアセトニトリル（１８０ｍＬ）中に溶解させ、そしてＯ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（９．９０ｇ，３２．８４ｍｍｏｌ）を加えた。その混合物を５分間撹拌し、そしてサッカリンのＮ−メチルイミダゾール塩固体（３．６３ｇ，１３．６９ｍｍｏｌ）を加えた。その混合物を室温で撹拌し、同時に、ＨＰＬＣによって反応を監視した。１８時間後、それ以上の反応は認められなくなった。反応混合物に、酢酸エチル（２００ｍＬ）を加え、そして有機溶液を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ１５０ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。懸濁液を濾過し、そしてロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。残留物を真空下で１６時間乾燥させて、白色泡状物を生じた。
【００４６】
粗製収量：２３．７０ｇ
ＨＰＬＣ：９２．５％
その粗生成物（２３．７０ｇ）を、シリカゲル（２３０ｇ）カラムを用いたクロマトグラフィーによって処理した。カラムは、０．５％トリエチルアミンを含有する３０％酢酸エチル／ヘキサンを用いて充填された。そのカラムを、２カラム容量の３０％酢酸エチル／ヘキサンで洗浄した。粗生成物を充填し、そしてそのカラムを、２カラム容量の３０％酢酸エチル／ヘキサン、２カラム容量の４０％酢酸エチル／ヘキサン、２カラム容量の５０％酢酸エチル／ヘキサン、そして最後に、３カラム容量の７０％酢酸エチル／ヘキサンを用いて溶離した。ＴＬＣ（８：３の酢酸エチル：ヘキサン）によって生成物が検出された場合、画分を集めた。所望の生成物を含有する画分を一緒に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。残留物を真空下で１６時間乾燥させて、白色泡状物を生じた。
【００４７】
収量：１７．５５ｇ（７５％）
ＨＰＬＣ：９７．５％
31Ｐ ＮＭＲ：９９．３％
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化物質の存在下におけるホスフィチル化剤でのアルコールまたはチオールのホスフィチル化方法であって、該活性化物質が、式１
【化１】
（式中、ｐは、０または１〜４の整数であり、各々の場合のＲは置換基であり、そしてＸ7は、ＯまたはＳである）
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｘ7がＯであり、ｐが０である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式１の化合物を、有機塩基との塩錯体として用いる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
有機塩基が、ピリジン、３−メチルピリジンおよびＮ−メチルイミダゾールから成る群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アルコールまたはチオールが、フリーのヒドロキシ基またはチオール基を含むヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
フリーの３’−ヒドロキシ基を含むヌクレオシドをホスフィチル化する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ホスフィチル化剤が、一般化学式
Ｒ13−Ｘ6−ＰＸ4Ｘ5
（式中、Ｒ13はリン保護基であり、Ｘ6は、ＯまたはＳであり、Ｘ4およびＸ5は、同じであってよいしまたは異なっていてよく、脱離基である）
を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
Ｒ13が、置換されたまたは未置換の脂肪族基またはアラルキル基、または置換されたまたは未置換の芳香族基であり、Ｘ6がＯであり、そしてＸ4およびＸ5が、各々独立して、−ＮＲ14Ｒ15であり、ここにおいて、Ｒ14およびＲ15は、各々独立して、Ｃ1-6アルキル基であり、またはＲ14およびＲ15は接合し、それらが結合しているＮと一緒に５〜７員環を形成する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ホスフィチル化剤が、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダイト、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルホスホロジアミダイト、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−メチルトリフルオロアセチルアミノエトキシホスフィン、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−ジフェニルメチルシリルエトキシホスフィンおよびＯ−β−シアノエチル−ビス（Ｎ−モルホリノ）ホスホロジアミダイトから成る群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
式
【化２】
を有する化合物の製造方法であって、式
【化３】
を有する化合物と、式
ＮＣＣＨ2ＣＨ2Ｏ−Ｐ（Ｎ（Ｒ16）2）2
を有する化合物とを、活性化物質であって、式
【化４】
を有する化合物を含む活性化物質および有機塩基の存在下において反応させることを含む方法。ここにおいて、Ｒ4はアルコール保護基であり；Ｒ5は、−Ｈ、−Ｆ、−ＯＲ6、−ＮＲ7Ｒ8、−ＳＲ9、またはメチル若しくはアリルのような置換されたまたは未置換の脂肪族基であり；各々の場合のＲ6は、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアリール基、置換されたまたは未置換のアラルキル基、アルコール保護基、または−（ＣＨ2）q−ＮＲ11Ｒ12であり；Ｒ7およびＲ8は、各々独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、またはアミン保護基であり、またはそれらが結合している窒素と一緒になったＲ7およびＲ8はヘテロ環基であり；Ｒ9は、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、またはチオール保護基であり；Ｒ11およびＲ12は、各々独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換のアリール基、置換されたまたは未置換のヘテロアリール基、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアラルキル基、置換されたまたは未置換のヘテロアラルキル基、またはアミン保護基であり、またはそれらが結合している窒素と一緒になったＲ11およびＲ12はヘテロ環基を形成し；ｑは、１〜約６の整数であり；Ｂは、−Ｈ、天然のまたは非天然の核酸塩基、保護された核酸塩基、保護された天然のまたは非天然の核酸塩基、ヘテロ環または保護されたヘテロ環であり；そしてＲ16は、Ｃ1-6アルキル基、好ましくは、イソプロピル基である。
【請求項１１】
有機塩基が、ピリジン、３−メチルピリジンおよびＮ−メチルイミダゾールから成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ5が、Ｈ、ＯＭｅまたはＯＣＨ2ＣＨ2ＯＭｅである、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ4が、酸に不安定な保護基であり、そしてＲ5がＯＲ6であり、ここにおいて、Ｒ6が、塩基に不安定な保護基またはシリル保護基である、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１】
活性化物質の存在下におけるホスフィチル化剤でのアルコールまたはチオールのホスフィチル化方法であって、該活性化物質が、式１
【化１】
（式中、ｐは、０または１〜４の整数であり、各々の場合のＲは置換基であり、そしてＸ7は、ＯまたはＳである）
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｘ7がＯであり、ｐが０である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式１の化合物を、有機塩基との塩錯体として用いる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
有機塩基が、ピリジン、３−メチルピリジンおよびＮ−メチルイミダゾールから成る群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アルコールまたはチオールが、フリーのヒドロキシ基またはチオール基を含むヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
フリーの３’−ヒドロキシ基を含むヌクレオシドをホスフィチル化する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ホスフィチル化剤が、一般化学式
Ｒ13−Ｘ6−ＰＸ4Ｘ5
（式中、Ｒ13はリン保護基であり、Ｘ6は、ＯまたはＳであり、Ｘ4およびＸ5は、同じであってよいしまたは異なっていてよく、脱離基である）
を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
Ｒ13が、置換されたまたは未置換の脂肪族基またはアラルキル基、または置換されたまたは未置換の芳香族基であり、Ｘ6がＯであり、そしてＸ4およびＸ5が、各々独立して、−ＮＲ14Ｒ15であり、ここにおいて、Ｒ14およびＲ15は、各々独立して、Ｃ1-6アルキル基であり、またはＲ14およびＲ15は接合し、それらが結合しているＮと一緒に５〜７員環を形成する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ホスフィチル化剤が、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダイト、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルホスホロジアミダイト、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−メチルトリフルオロアセチルアミノエトキシホスフィン、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−ジフェニルメチルシリルエトキシホスフィンおよびＯ−β−シアノエチル−ビス（Ｎ−モルホリノ）ホスホロジアミダイトから成る群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
式
【化２】
を有する化合物の製造方法であって、式
【化３】
を有する化合物と、式
ＮＣＣＨ2ＣＨ2Ｏ−Ｐ（Ｎ（Ｒ16）2）2
を有する化合物とを、活性化物質であって、式
【化４】
を有する化合物を含む活性化物質および有機塩基の存在下において反応させることを含む方法。ここにおいて、Ｒ4はアルコール保護基であり；Ｒ5は、−Ｈ、−Ｆ、−ＯＲ6、−ＮＲ7Ｒ8、−ＳＲ9、またはメチル若しくはアリルのような置換されたまたは未置換の脂肪族基であり；各々の場合のＲ6は、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアリール基、置換されたまたは未置換のアラルキル基、アルコール保護基、または−（ＣＨ2）q−ＮＲ11Ｒ12であり；Ｒ7およびＲ8は、各々独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、またはアミン保護基であり、またはそれらが結合している窒素と一緒になったＲ7およびＲ8はヘテロ環基であり；Ｒ9は、−Ｈ、置換されたまたは未置換の脂肪族基、またはチオール保護基であり；Ｒ11およびＲ12は、各々独立して、−Ｈ、置換されたまたは未置換のアリール基、置換されたまたは未置換のヘテロアリール基、置換されたまたは未置換の脂肪族基、置換されたまたは未置換のアラルキル基、置換されたまたは未置換のヘテロアラルキル基、またはアミン保護基であり、またはそれらが結合している窒素と一緒になったＲ11およびＲ12はヘテロ環基を形成し；ｑは、１〜約６の整数であり；Ｂは、−Ｈ、天然のまたは非天然の核酸塩基、保護された核酸塩基、保護された天然のまたは非天然の核酸塩基、ヘテロ環または保護されたヘテロ環であり；そしてＲ16は、Ｃ1-6アルキル基、好ましくは、イソプロピル基である。
【請求項１１】
有機塩基が、ピリジン、３−メチルピリジンおよびＮ−メチルイミダゾールから成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ5が、Ｈ、ＯＭｅまたはＯＣＨ2ＣＨ2ＯＭｅである、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ4が、酸に不安定な保護基であり、そしてＲ5がＯＲ6であり、ここにおいて、Ｒ6が、塩基に不安定な保護基またはシリル保護基である、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【公表番号】特表２００６−５０８０８１（Ｐ２００６−５０８０８１Ａ）
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４４４２７（Ｐ２００４−５４４４２７）
【出願日】平成１５年１０月８日（２００３．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００４３１２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５５９９
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５０２４４９２９９）アベシア・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月８日（２００３．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００４３１２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５５９９
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５０２４４９２９９）アベシア・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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