ボロンジピロロメタン誘導体及びそれを用いた過酸化脂質測定試薬
【課題】ジフェニル−１−ピレニルホスフィンの励起波長及び蛍光波長よりも長波長側にシフトさせた蛍光試薬を提供する。
【解決手段】次式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１〜Ｒ７は、水素原子、置換又は非置換の炭化水素基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ８及びＲ９は、それぞれ同一又は異なって、置換又は非置換の芳香族炭化水素基を表し；Ｒ１１及びＲ１２は、ハロゲン原子、置換又は非置換の芳香族炭化水素基、又はアルコキシ基を表し；Ｒ１０は、直接結合、又は２価の置換基を表し、Ｒ１〜Ｒ７のいずれかと結合している。）で示される化合物又はその塩。
【解決手段】次式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１〜Ｒ７は、水素原子、置換又は非置換の炭化水素基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ８及びＲ９は、それぞれ同一又は異なって、置換又は非置換の芳香族炭化水素基を表し；Ｒ１１及びＲ１２は、ハロゲン原子、置換又は非置換の芳香族炭化水素基、又はアルコキシ基を表し；Ｒ１０は、直接結合、又は２価の置換基を表し、Ｒ１〜Ｒ７のいずれかと結合している。）で示される化合物又はその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過酸化脂質測定試薬として有用な化合物、及びその過酸化脂質測定試薬としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、過酸化脂質と疾病との関係が注目されている。過酸化脂質と関係がある、若しくは関係があると考えられている疾病には、癌、動脈硬化、虚血性疾患や肝機能障害等が挙げられる。これらの疾患との関連性を調べるには、生体内での過酸化脂質の種類・蓄積量・分布等を明らかにする必要がある。しかし、過酸化脂質は不安定な化合物であり、また、生体内の過酸化脂質は微量である。
【０００３】
これまでに、過酸化脂質を測定するために用いられてきた方法は、チオバルビツール酸法（非特許文献１，２）、ヨウ素法（非特許文献３）、ＦＯＸ法（非特許文献４）、化学発光法（非特許文献５）、蛍光法（非特許文献６）等がある。
【０００４】
チオバルビツール酸法は、脂質過酸化によって生成する脂質ヒドロペルオキシド、マロンジアルデヒド及びその他のアルデヒド等を総合的に測定する方法である。つまり、過酸化脂質のみを測定していない。また、ヨウ素法は検出感度が低い。ＦＯＸ法は高感度であるが、２価鉄を酸化する物質や鉄などの金属イオンが混入していた場合は、得られた結果の評価が難しい。また、化学発光法による検出は高感度であるが、共存物質の影響を受けたり、また、短時間における発光量を測定するため、分析条件により応答が異なる。
【０００５】
蛍光法にはジフェニル−１−ピレニルホスフィンを用いた方法（非特許文献６、特許文献１）があるが、励起波長・蛍光波長が共に短波長側（励起波長３５２ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍ）にあるため、生体試料測定時は生体試料へのダメージや生体試料由来の自己蛍光の影響等の問題や、また、測定装置の小型化が困難等の問題点がある。また、特許文献２には、ジフェニル−１−ピレニルホスフィンの蛍光基であるピレンをペリレン誘導体に置き換えた過酸化脂質測定試薬が開示されているが、前記蛍光基をジピロロメタン誘導体に置き換えた化合物はこれまで報告されていない。
【特許文献１】特開２００２−１２２５９３号公報
【特許文献２】特開２００６−３４２１３５号公報
【非特許文献１】David R. J., Free Radical Biology & Medicine, 9, 515-540(1990)
【非特許文献２】J.I.Gray., Journal of the American Oil Chemists’society, 55, 539-546(1978)
【非特許文献３】D.H.Wheeler., Oil and Soap, 9, 89-97(1932)
【非特許文献４】Anna Grau et al., Journal of agricultural and food chemistry, 48, 4136-4143(2000)
【非特許文献５】Teiki Iwaoka et al., Free Radical Biology & Medicine, 3, 329-333(1987)
【非特許文献６】Kazuaki Akasaka et al., Analytical Letters, 20, 731-745(1987)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の過酸化脂質測定用蛍光試薬（ジフェニル−１−ピレニルホスフィン）では、波長が短いため、生体試料へのダメージ（細胞など）や生体試料由来の自己蛍光の影響や測定装置の小型化が困難などの問題があった。
【０００７】
本発明の課題は、ジフェニル−１−ピレニルホスフィンの励起波長及び蛍光波長よりも長波長側にシフトさせた蛍光試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、前記課題を解決するために、ボロンジピロロメタン骨格と、ジフェニルホスフィノ基等の過酸化脂質と反応して酸化される官能基を含む、非又は弱蛍光性の化合物が過酸化脂質と選択的に反応して蛍光性の化合物を生じる性質を利用するものである。
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）次式（Ｉ）：
【００１０】
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ同一又は異なって、水素原子、置換又は非置換の炭化水素基、又はハロゲン原子を表すか、あるいはＲ１０が結合しており；Ｒ８及びＲ９は、それぞれ同一又は異なって、置換又は非置換の芳香族炭化水素基を表し；Ｒ１１及びＲ１２は、ハロゲン原子、置換又は非置換の芳香族炭化水素基、又はアルコキシ基を表し；Ｒ１０は、直接結合、又は置換又は非置換の炭化水素基及びアミド基から選ばれる少なくとも１つの基を含む２価の置換基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７のいずれかの位置で、直接又はＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７で表される置換又は非置換の炭化水素基を介して結合している。）
で示される化合物又はその塩。
【００１１】
（２）前記式（Ｉ）で示される化合物が、次式（II）：
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ同一又は異なって、水素原子、置換又は非置換の炭化水素基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ１１及びＲ１２は、ハロゲン原子、置換又は非置換の芳香族炭化水素基、又はアルコキシ基を表し；Ｒ１０’は、直接結合、又は置換又は非置換のアルキレン基、置換又は非置換のフェニレン基及びアミド基から選ばれる少なくとも１つの基を含む２価の置換基を表す。）
で示される化合物である前記（１）に記載の化合物又はその塩。
【００１２】
（３）非又は弱蛍光性であり、過酸化脂質と反応して蛍光性の化合物を生じる前記（１）又は（２）に記載の化合物又はその塩。
（４）過酸化脂質と反応して、励起波長４００〜７００ｎｍ、蛍光波長４００〜７５０ｎｍの蛍光性の化合物を生じる前記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物又はその塩。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む蛍光試薬。
（６）前記（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む過酸化脂質測定試薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、照射する光による生体試料へのダメージ及び生体試料由来の自己蛍光の影響を軽減した過酸化脂質の蛍光検出も可能になる。また、本発明は、測定装置を小型化した場合にも用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
前記式（Ｉ）及び（II）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７で表される炭化水素基は、通常、Ｃ１−２１−炭化水素基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基等の直鎖状又は分岐状のＣ１−２１−アルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等のＣ３−２１−シクロアルキル基；ビニル基、１−プロペニル基、アリル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オレイル基等のＣ２−２１−アルケニル基；エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル（プロパルギル）基、３−ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等のＣ２−２１−アルキニル基；フェニル基、トリル基、ナフチル基、ピレニル等の芳香族炭化水素基；ベンジル基、フェネチル基等のアラルキル基；アダマンチル基等の橋かけ環炭化水素基；スピロ環炭化水素基；縮合多環式炭化水素基等が挙げられる。前記炭化水素基は、例えばハロゲン原子で置換されていてもよい。本発明において、ハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。また、好ましくは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はメチル基、Ｒ６及びＲ７ は水素原子である。
【００１５】
前記式（Ｉ）及び（II）において、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１又はＲ１２で表される芳香族炭化水素基は、通常、単環性ないし２環性の芳香族炭化水素基であり、例えばフェニル基、トリル基、ナフチル基が挙げられる。前記芳香族炭化水素基は、例えばハロゲン原子で置換されていてもよい。
【００１６】
前記式（Ｉ）及び（II）において、Ｒ１１又はＲ１２で表されるアルコキシ基は、通常、Ｃ１−４−アルコキシ基であり、例えばメトキシ基、エトキシ基が挙げられる。好ましくは、Ｒ８及びＲ９はフェニル基、Ｒ１１及びＲ１２はフッ素原子である。
【００１７】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１０で表される２価の置換基を構成する２価炭化水素基としては、例えばＣ１−８−アルキレン基（例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基）、Ｃ２−８−アルケニレン基（例えば、ビニレン基、プロペニレン基）、Ｃ２−８−アルキニレン基、フェニレン基、ナフチレン基、シクロヘキシレン基が挙げられ、これらの炭化水素基は、例えばハロゲン原子で置換されていてもよい。
【００１８】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１０で表される２価の置換基としては、例えば、前記２価炭化水素基、アミド基、及び１以上の前記２価炭化水素基とアミド基とが連結した２価の置換基（例えば、−Ｃ６Ｈ４−ＣＯＮＨ−Ｃ１−８−アルキレン−、−Ｃ６Ｈ４−ＣＯＮＨ−Ｃ６Ｈ４−）が挙げられる。これらの２価の置換基が非対称の場合には、結合方向はいずれでもよい。
【００１９】
前記式（II）において、Ｒ１０’で表される２価の置換基を構成するＣ１−８−アルキレン基としては、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基が挙げられる。
【００２０】
前記式（II）において、Ｒ１０’で表される２価の置換基としては、例えば、前記Ｃ１−８−アルキレン基、アミド基、及び１以上の前記Ｃ１−８−アルキレン基とアミド基とが連結した２価の置換基（例えば、−ＣＯＮＨ−Ｃ１−８−アルキレン−、−Ｃ１−８−アルキレン−ＣＯＮＨ−Ｃ１−８−アルキレン−）、前記Ｃ１−８−アルキレン基とフェニレン基とアミド基とが連結した２価の置換基（例えば、−ＣＯＮＨ−フェニレン−）が挙げられる。これらの２価の置換基が非対称の場合には、結合方向はいずれでもよい。Ｒ１０’としては、直接結合、−ＣＯＮＨ−メチレン−又は−ＣＯＮＨ−エチレン−が好ましい。
【００２１】
前記式（Ｉ）又は（II）で示される化合物の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。
【００２２】
本発明のジピロロメタン構造を有する過酸化脂質測定試薬は、窒素原子が−ＢＲ１１Ｒ１２で置換されたジピロロメタン骨格を有し、かつカップリング可能な官能基を有する化合物と、Ｒ８Ｒ９Ｐ−Ｒ１０−骨格を有し、かつ前記官能基とカップリング可能な官能基を有する化合物とをカップリングさせることにより製造することができる。
【００２３】
例えば前記式（Ｉ）において、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝ＣＨ３、Ｒ６＝Ｒ７＝Ｈ、Ｒ８＝Ｒ９＝Ｃ６Ｈ５、Ｒ１１＝Ｒ１２＝Ｆ、Ｒ１０＝Ｃ６Ｈ４−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｒ１０がＲ２の位置で直接結合している化合物については、以下のようにして製造することができる。
【００２４】
【化３】
【００２５】
本発明のジピロロメタン誘導体は、過酸化脂質、特にヒドロペルオキシド類と反応して蛍光性の化合物（酸化物）を生じる、蛍光試薬又は過酸化脂質測定試薬として有用である。この蛍光性化合物は、特に制限されないが、励起波長４００〜７００ｎｍ、蛍光波長４００〜７５０ｎｍの蛍光特性を有していることが好ましい。このように励起波長及び蛍光波長が長波長領域にあると、細胞内成分由来の自己蛍光が測定系に与える影響を抑制しながら、かつ生きた細胞を用いる測定系においては励起光の照射が細胞に与えるダメージを抑制しながら蛍光検出を行うことができる。
【００２６】
本発明の試薬は、前記ジピロロメタン誘導体を含むことを特徴とする。本発明の試薬は、ジピロロメタン誘導体のほか、必要に応じて溶媒や添加剤を含むこともできる。使用できる溶媒としては、前記ジピロロメタン誘導体及び過酸化脂質に不活性なものであれば特に制限はなく、例えばメタノール、エタノールなどのアルコール類、アセトニトリル、クロロホルムなどが挙げられる。
【００２７】
本発明の試薬の対象となる試料としては、例えば、溶液試料、生体試料が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１）ボロンジピロロメタン誘導体及びその酸化体の合成
（１）化合物３の合成
【００３０】
【化４】
【００３１】
テレフタルアルデヒド酸メチル４．３１ｇ（２６．２５ｍｍｏｌ）と２，４−ジメチルピロール５ｇ（５２．５５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（脱水）１００ｍｌに溶解し、窒素雰囲気下３０分間、室温で攪拌後、トリフルオロ酢酸を数滴添加し、更に窒素雰囲気下１５時間、室温で攪拌した。
【００３２】
テトラヒドロフラン２５ｍｌ（脱水）とジクロロメタン２５ｍｌ（脱水）の混合溶液に２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノンを５．９７ｇ（２６．２６ｍｍｏｌ）溶解し、前記反応混合物中に１５分間で滴下した。薄層クロマトグラフィーにより、反応が終了したことを確認後（反応時間４時間）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、更に飽和塩化ナトリウム水溶液で、ジクロロメタン相を洗浄後、ジクロロメタン相を減圧濃縮した。
【００３３】
アミノプロピル化処理したシリカゲルカラム（溶媒；ヘキサン／酢酸エチル＝１５／１）にて精製を行った。
【００３４】
ＭＳとＮＭＲにより生成物の確認を行った。
収量１．７１ｇ（収率１９．５％）
1H-NMR(400 MHz, TMS, CDCl3): 1.27(s, 6H, CH3), 2.34(s, 6H, CH3), 3.96(s, 3H, CH3), 5.89(s, 2H, CH), 7.40-7.42(d, 2H, benzene), 8.11-8.13(d, 2H, benzene)
MS m/z 335.20 (M+H)+
【００３５】
（２）化合物４の合成
【化５】
【００３６】
化合物３を１．６ｇ（４．７８ｍｍｏｌ）と、ボロントリフルオリド−エチルエーテルコンプレックス９．２ｍｌと、トリエチルアミン９．２ｍｌをトルエン（脱水）６５ｍｌに溶解し、室温で３時間攪拌し、薄層クロマトグラフィーにより化合物３がなくなり反応が終了したことを確認後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、更に飽和塩化ナトリウム水溶液でジクロロメタン相を洗浄後、ジクロロメタン相を減圧濃縮した。
【００３７】
アミノプロピル化処理したシリカゲルカラム（溶媒；ヘキサン／酢酸エチル＝７／１）にて精製を行った。
【００３８】
ＭＳとＮＭＲにより生成物の確認を行った。
収量１．７６ｇ（収率９６．２％）
1H-NMR(400 MHz, TMS, CDCl3): 1.36(s, 6H, CH3), 2.56(s, 6H, CH3), 3.97(s, 3H, CH3), 5.99(s, 2H, CH), 7.40-7.42 (d, 2H, benzene), 8.17-8.19(d, 2H, benzene)
MS m/z 405.21 (M+Na)+
【００３９】
（３）化合物５の合成
【化６】
【００４０】
化合物４を０．５ｇ（１．３１ｍｍｏｌ）と、炭酸カリウム３００ｍｇ（２．１７ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン６０ｍｌと純水６０ｍｌの混合溶液に溶解し、５０℃で１０時間、室温１４時間攪拌し、ジエチルエーテルを加え水相を抽出し、その後水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン相を減圧濃縮した。
【００４１】
ＭＳにより生成物の確認を行った。
粗収量０．４８ｇ
MS m/z 367.23 (M-H)-
【００４２】
（４）化合物６の合成
【化７】
【００４３】
化合物５を０．４８ｇと、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩０．８９ｇ（４．６４ｍｍｏｌ）と、４−ジメチルアミノピリジン０．３１ｇ（２．５４ｍｍｏｌ）と、２−（ジフェニルホスフィノ）エチルアミン１ｇ（４．３６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（脱水）７５ｍｌ中、窒素雰囲気下、０℃で３０分間攪拌後、室温で４日間攪拌した。その後、純水を加えジクロロメタンで抽出し、減圧濃縮した。シリカゲルカラム（溶媒；クロロホルム）にて精製し、ジエチルエーテルから再結晶した。
収量１６０．２６ｇ（収率２１．１％）（化合物４からの収率）
1H-NMR(400 MHz, TMS, CDCl3): 1.34(s, 6H, CH3), 2.46-2.50(t, 2H, CH2), 2.56(s, 6H, CH3), 3.67-3.75(m, 2H, CH2), 5.98(s, 2H, CH), 6.30(s, 1H, NH), 7.32-7.38(m, 8H, benzene), 7.47-7.52(m, 4H, benzene), 7.70-7.72(d, 2H, benzene)
MS m/z 602.11(M+Na)+
【００４４】
（５）化合物６の酸化体（化合物７）の合成
【化８】
【００４５】
化合物６を３４．６ｍｇ（５９．７１μｍｏｌ）と濃度３０％の過酸化水素水０．４ｍｌを、クロロホルム１０ｍｌとメタノール１０ｍｌの混合溶液中、室温で一昼夜攪拌した。その後、純水を加えジクロロメタンで抽出し、減圧濃縮した。シリカゲルＴＬＣ（溶媒；酢酸エチル）にて精製し、アセトン／ヘキサンにより再結晶を行った。
収量１７．２ｍｇ（収率４８．４％）
1H-NMR(400 MHz, TMS, CDCl3): 1.35(s, 6H, CH3), 2.56(s, 6H, CH3), 2.63-2.68(m, 2H, CH2), 3.87-3.95(m, 2H, CH2), 5.98(s, 2H, CH), 7.35-7.37(d, 2H, benzene), 7.48-7.57(m, 6H, benzene), 7.75-7.80(m, 4H, benzene), 7.93-7.95(d, 2H, benzene), 8.12(s, 1H, NH)
MS m/z 618.15(M+Na)+
【００４６】
（実施例２）励起スペクトル及び蛍光スペクトル測定
実施例１で得た化合物６及び化合物７の励起及び蛍光スペクトル測定を行うため、抗酸化剤２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）を含むクロロホルム溶液（３ｍｇ ＢＨＴ／１０ｍｌ ＣＨＣｌ３）で、化合物６及び化合物７の６２．５μＭ溶液を調製し、さらにクロロホルムでそれぞれを希釈し、１μＭの溶液にした。励起及び蛍光スペクトルの測定は、λｅｘ／λｅｍ＝５０２ｎｍ／５１５ｎｍ、バンド幅（励起／蛍光）＝３ｎｍ／１ｎｍで行った。図１は１μＭの濃度の化合物６（細線）及び化合物７（太線）の励起スペクトルと蛍光スペクトルを測定したものであり、化合物６の酸化体である化合物７は、化合物６より蛍光強度が高かった。
【００４７】
（実施例３）過酸化脂質の測定
実施例１で得た化合物６の過酸化脂質測定能の評価を行うため、抗酸化剤２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）を含むクロロホルム溶液（３ｍｇ ＢＨＴ／１０ｍｌ ＣＨＣｌ３）に化合物６を溶解し、酸化したリノール酸メチルを化合物６と同様に、抗酸化剤を溶解したクロロホルム溶液に溶解し過酸化脂質の試料として用い測定した。
【００４８】
測定条件は、５５．２３μＭの化合物６の溶液５０μｌに、０−６１．７６μＭの濃度の過酸化脂質溶液１００μｌを加えて密栓し、暗所で３７℃で６０分間反応させ、反応後、氷冷した。この反応溶液をクロロホルムを３ｍｌ加えてλｅｘ／λｅｍ＝５０２ｎｍ／５１５ｎｍ、バンド幅（励起／蛍光）＝３ｎｍ／１ｎｍで蛍光測定した。図２は過酸化脂質と化合物６の反応後の過酸化脂質量と蛍光強度との関係を示したものである。過酸化脂質量の増加に伴い蛍光強度は上昇し、過酸化脂質量０−２．７６ｎｍｏｌの間では直線関係が成り立つ。実施例２の結果から、過酸化脂質との反応により蛍光強度の高い酸化体（化合物７）が生成していることが示唆された。
【００４９】
また、５２．９３μＭの化合物６の溶液５０μｌを、０μＭ及び２７．６μＭの過酸化脂質溶液１００μｌと同様に反応させて、反応溶液中の化合物６及び化合物７の分子量を測定した。その結果、０μＭの過酸化脂質溶液の反応溶液では、反応前と比べて、殆ど化合物６が残っていたが、２７．６μＭの過酸化脂質溶液の反応溶液では、化合物６の分子量ピークは観察されず、化合物７の分子量のみが観察された。以上の結果から、化合物６は過酸化脂質の測定を定量的に行える試薬であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、過酸化脂質の高感度分析法として利用できる。また、定量分析だけでなく、細胞と本発明の試薬をインキュベーションすることにより細胞内に取り込ませ、細胞内の過酸化脂質のイメージングを行うことや、本発明の試薬をガラスやプラスチックなどの基板に固定化し、過酸化脂質センサーとして用いたり、また、医療分野においては、口腔や鼻腔などから挿入できる器具の先端に過酸化脂質センサーを取り付けた、患部の正確な過酸化脂質量を把握可能な過酸化脂質診断機器などへも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】化合物６及び化合物７の励起スペクトルと蛍光スペクトルを示す図である。
【図２】過酸化脂質量と過酸化脂質測定試薬との反応から生じる蛍光強度を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過酸化脂質測定試薬として有用な化合物、及びその過酸化脂質測定試薬としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、過酸化脂質と疾病との関係が注目されている。過酸化脂質と関係がある、若しくは関係があると考えられている疾病には、癌、動脈硬化、虚血性疾患や肝機能障害等が挙げられる。これらの疾患との関連性を調べるには、生体内での過酸化脂質の種類・蓄積量・分布等を明らかにする必要がある。しかし、過酸化脂質は不安定な化合物であり、また、生体内の過酸化脂質は微量である。
【０００３】
これまでに、過酸化脂質を測定するために用いられてきた方法は、チオバルビツール酸法（非特許文献１，２）、ヨウ素法（非特許文献３）、ＦＯＸ法（非特許文献４）、化学発光法（非特許文献５）、蛍光法（非特許文献６）等がある。
【０００４】
チオバルビツール酸法は、脂質過酸化によって生成する脂質ヒドロペルオキシド、マロンジアルデヒド及びその他のアルデヒド等を総合的に測定する方法である。つまり、過酸化脂質のみを測定していない。また、ヨウ素法は検出感度が低い。ＦＯＸ法は高感度であるが、２価鉄を酸化する物質や鉄などの金属イオンが混入していた場合は、得られた結果の評価が難しい。また、化学発光法による検出は高感度であるが、共存物質の影響を受けたり、また、短時間における発光量を測定するため、分析条件により応答が異なる。
【０００５】
蛍光法にはジフェニル−１−ピレニルホスフィンを用いた方法（非特許文献６、特許文献１）があるが、励起波長・蛍光波長が共に短波長側（励起波長３５２ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍ）にあるため、生体試料測定時は生体試料へのダメージや生体試料由来の自己蛍光の影響等の問題や、また、測定装置の小型化が困難等の問題点がある。また、特許文献２には、ジフェニル−１−ピレニルホスフィンの蛍光基であるピレンをペリレン誘導体に置き換えた過酸化脂質測定試薬が開示されているが、前記蛍光基をジピロロメタン誘導体に置き換えた化合物はこれまで報告されていない。
【特許文献１】特開２００２−１２２５９３号公報
【特許文献２】特開２００６−３４２１３５号公報
【非特許文献１】David R. J., Free Radical Biology & Medicine, 9, 515-540(1990)
【非特許文献２】J.I.Gray., Journal of the American Oil Chemists’society, 55, 539-546(1978)
【非特許文献３】D.H.Wheeler., Oil and Soap, 9, 89-97(1932)
【非特許文献４】Anna Grau et al., Journal of agricultural and food chemistry, 48, 4136-4143(2000)
【非特許文献５】Teiki Iwaoka et al., Free Radical Biology & Medicine, 3, 329-333(1987)
【非特許文献６】Kazuaki Akasaka et al., Analytical Letters, 20, 731-745(1987)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の過酸化脂質測定用蛍光試薬（ジフェニル−１−ピレニルホスフィン）では、波長が短いため、生体試料へのダメージ（細胞など）や生体試料由来の自己蛍光の影響や測定装置の小型化が困難などの問題があった。
【０００７】
本発明の課題は、ジフェニル−１−ピレニルホスフィンの励起波長及び蛍光波長よりも長波長側にシフトさせた蛍光試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、前記課題を解決するために、ボロンジピロロメタン骨格と、ジフェニルホスフィノ基等の過酸化脂質と反応して酸化される官能基を含む、非又は弱蛍光性の化合物が過酸化脂質と選択的に反応して蛍光性の化合物を生じる性質を利用するものである。
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）次式（Ｉ）：
【００１０】
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ同一又は異なって、水素原子、置換又は非置換の炭化水素基、又はハロゲン原子を表すか、あるいはＲ１０が結合しており；Ｒ８及びＲ９は、それぞれ同一又は異なって、置換又は非置換の芳香族炭化水素基を表し；Ｒ１１及びＲ１２は、ハロゲン原子、置換又は非置換の芳香族炭化水素基、又はアルコキシ基を表し；Ｒ１０は、直接結合、又は置換又は非置換の炭化水素基及びアミド基から選ばれる少なくとも１つの基を含む２価の置換基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７のいずれかの位置で、直接又はＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７で表される置換又は非置換の炭化水素基を介して結合している。）
で示される化合物又はその塩。
【００１１】
（２）前記式（Ｉ）で示される化合物が、次式（II）：
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ同一又は異なって、水素原子、置換又は非置換の炭化水素基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ１１及びＲ１２は、ハロゲン原子、置換又は非置換の芳香族炭化水素基、又はアルコキシ基を表し；Ｒ１０’は、直接結合、又は置換又は非置換のアルキレン基、置換又は非置換のフェニレン基及びアミド基から選ばれる少なくとも１つの基を含む２価の置換基を表す。）
で示される化合物である前記（１）に記載の化合物又はその塩。
【００１２】
（３）非又は弱蛍光性であり、過酸化脂質と反応して蛍光性の化合物を生じる前記（１）又は（２）に記載の化合物又はその塩。
（４）過酸化脂質と反応して、励起波長４００〜７００ｎｍ、蛍光波長４００〜７５０ｎｍの蛍光性の化合物を生じる前記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物又はその塩。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む蛍光試薬。
（６）前記（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む過酸化脂質測定試薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、照射する光による生体試料へのダメージ及び生体試料由来の自己蛍光の影響を軽減した過酸化脂質の蛍光検出も可能になる。また、本発明は、測定装置を小型化した場合にも用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
前記式（Ｉ）及び（II）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７で表される炭化水素基は、通常、Ｃ１−２１−炭化水素基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基等の直鎖状又は分岐状のＣ１−２１−アルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等のＣ３−２１−シクロアルキル基；ビニル基、１−プロペニル基、アリル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オレイル基等のＣ２−２１−アルケニル基；エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル（プロパルギル）基、３−ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等のＣ２−２１−アルキニル基；フェニル基、トリル基、ナフチル基、ピレニル等の芳香族炭化水素基；ベンジル基、フェネチル基等のアラルキル基；アダマンチル基等の橋かけ環炭化水素基；スピロ環炭化水素基；縮合多環式炭化水素基等が挙げられる。前記炭化水素基は、例えばハロゲン原子で置換されていてもよい。本発明において、ハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。また、好ましくは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はメチル基、Ｒ６及びＲ７ は水素原子である。
【００１５】
前記式（Ｉ）及び（II）において、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１又はＲ１２で表される芳香族炭化水素基は、通常、単環性ないし２環性の芳香族炭化水素基であり、例えばフェニル基、トリル基、ナフチル基が挙げられる。前記芳香族炭化水素基は、例えばハロゲン原子で置換されていてもよい。
【００１６】
前記式（Ｉ）及び（II）において、Ｒ１１又はＲ１２で表されるアルコキシ基は、通常、Ｃ１−４−アルコキシ基であり、例えばメトキシ基、エトキシ基が挙げられる。好ましくは、Ｒ８及びＲ９はフェニル基、Ｒ１１及びＲ１２はフッ素原子である。
【００１７】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１０で表される２価の置換基を構成する２価炭化水素基としては、例えばＣ１−８−アルキレン基（例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基）、Ｃ２−８−アルケニレン基（例えば、ビニレン基、プロペニレン基）、Ｃ２−８−アルキニレン基、フェニレン基、ナフチレン基、シクロヘキシレン基が挙げられ、これらの炭化水素基は、例えばハロゲン原子で置換されていてもよい。
【００１８】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１０で表される２価の置換基としては、例えば、前記２価炭化水素基、アミド基、及び１以上の前記２価炭化水素基とアミド基とが連結した２価の置換基（例えば、−Ｃ６Ｈ４−ＣＯＮＨ−Ｃ１−８−アルキレン−、−Ｃ６Ｈ４−ＣＯＮＨ−Ｃ６Ｈ４−）が挙げられる。これらの２価の置換基が非対称の場合には、結合方向はいずれでもよい。
【００１９】
前記式（II）において、Ｒ１０’で表される２価の置換基を構成するＣ１−８−アルキレン基としては、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基が挙げられる。
【００２０】
前記式（II）において、Ｒ１０’で表される２価の置換基としては、例えば、前記Ｃ１−８−アルキレン基、アミド基、及び１以上の前記Ｃ１−８−アルキレン基とアミド基とが連結した２価の置換基（例えば、−ＣＯＮＨ−Ｃ１−８−アルキレン−、−Ｃ１−８−アルキレン−ＣＯＮＨ−Ｃ１−８−アルキレン−）、前記Ｃ１−８−アルキレン基とフェニレン基とアミド基とが連結した２価の置換基（例えば、−ＣＯＮＨ−フェニレン−）が挙げられる。これらの２価の置換基が非対称の場合には、結合方向はいずれでもよい。Ｒ１０’としては、直接結合、−ＣＯＮＨ−メチレン−又は−ＣＯＮＨ−エチレン−が好ましい。
【００２１】
前記式（Ｉ）又は（II）で示される化合物の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。
【００２２】
本発明のジピロロメタン構造を有する過酸化脂質測定試薬は、窒素原子が−ＢＲ１１Ｒ１２で置換されたジピロロメタン骨格を有し、かつカップリング可能な官能基を有する化合物と、Ｒ８Ｒ９Ｐ−Ｒ１０−骨格を有し、かつ前記官能基とカップリング可能な官能基を有する化合物とをカップリングさせることにより製造することができる。
【００２３】
例えば前記式（Ｉ）において、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝ＣＨ３、Ｒ６＝Ｒ７＝Ｈ、Ｒ８＝Ｒ９＝Ｃ６Ｈ５、Ｒ１１＝Ｒ１２＝Ｆ、Ｒ１０＝Ｃ６Ｈ４−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｒ１０がＲ２の位置で直接結合している化合物については、以下のようにして製造することができる。
【００２４】
【化３】
【００２５】
本発明のジピロロメタン誘導体は、過酸化脂質、特にヒドロペルオキシド類と反応して蛍光性の化合物（酸化物）を生じる、蛍光試薬又は過酸化脂質測定試薬として有用である。この蛍光性化合物は、特に制限されないが、励起波長４００〜７００ｎｍ、蛍光波長４００〜７５０ｎｍの蛍光特性を有していることが好ましい。このように励起波長及び蛍光波長が長波長領域にあると、細胞内成分由来の自己蛍光が測定系に与える影響を抑制しながら、かつ生きた細胞を用いる測定系においては励起光の照射が細胞に与えるダメージを抑制しながら蛍光検出を行うことができる。
【００２６】
本発明の試薬は、前記ジピロロメタン誘導体を含むことを特徴とする。本発明の試薬は、ジピロロメタン誘導体のほか、必要に応じて溶媒や添加剤を含むこともできる。使用できる溶媒としては、前記ジピロロメタン誘導体及び過酸化脂質に不活性なものであれば特に制限はなく、例えばメタノール、エタノールなどのアルコール類、アセトニトリル、クロロホルムなどが挙げられる。
【００２７】
本発明の試薬の対象となる試料としては、例えば、溶液試料、生体試料が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１）ボロンジピロロメタン誘導体及びその酸化体の合成
（１）化合物３の合成
【００３０】
【化４】
【００３１】
テレフタルアルデヒド酸メチル４．３１ｇ（２６．２５ｍｍｏｌ）と２，４−ジメチルピロール５ｇ（５２．５５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（脱水）１００ｍｌに溶解し、窒素雰囲気下３０分間、室温で攪拌後、トリフルオロ酢酸を数滴添加し、更に窒素雰囲気下１５時間、室温で攪拌した。
【００３２】
テトラヒドロフラン２５ｍｌ（脱水）とジクロロメタン２５ｍｌ（脱水）の混合溶液に２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノンを５．９７ｇ（２６．２６ｍｍｏｌ）溶解し、前記反応混合物中に１５分間で滴下した。薄層クロマトグラフィーにより、反応が終了したことを確認後（反応時間４時間）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、更に飽和塩化ナトリウム水溶液で、ジクロロメタン相を洗浄後、ジクロロメタン相を減圧濃縮した。
【００３３】
アミノプロピル化処理したシリカゲルカラム（溶媒；ヘキサン／酢酸エチル＝１５／１）にて精製を行った。
【００３４】
ＭＳとＮＭＲにより生成物の確認を行った。
収量１．７１ｇ（収率１９．５％）
1H-NMR(400 MHz, TMS, CDCl3): 1.27(s, 6H, CH3), 2.34(s, 6H, CH3), 3.96(s, 3H, CH3), 5.89(s, 2H, CH), 7.40-7.42(d, 2H, benzene), 8.11-8.13(d, 2H, benzene)
MS m/z 335.20 (M+H)+
【００３５】
（２）化合物４の合成
【化５】
【００３６】
化合物３を１．６ｇ（４．７８ｍｍｏｌ）と、ボロントリフルオリド−エチルエーテルコンプレックス９．２ｍｌと、トリエチルアミン９．２ｍｌをトルエン（脱水）６５ｍｌに溶解し、室温で３時間攪拌し、薄層クロマトグラフィーにより化合物３がなくなり反応が終了したことを確認後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、更に飽和塩化ナトリウム水溶液でジクロロメタン相を洗浄後、ジクロロメタン相を減圧濃縮した。
【００３７】
アミノプロピル化処理したシリカゲルカラム（溶媒；ヘキサン／酢酸エチル＝７／１）にて精製を行った。
【００３８】
ＭＳとＮＭＲにより生成物の確認を行った。
収量１．７６ｇ（収率９６．２％）
1H-NMR(400 MHz, TMS, CDCl3): 1.36(s, 6H, CH3), 2.56(s, 6H, CH3), 3.97(s, 3H, CH3), 5.99(s, 2H, CH), 7.40-7.42 (d, 2H, benzene), 8.17-8.19(d, 2H, benzene)
MS m/z 405.21 (M+Na)+
【００３９】
（３）化合物５の合成
【化６】
【００４０】
化合物４を０．５ｇ（１．３１ｍｍｏｌ）と、炭酸カリウム３００ｍｇ（２．１７ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン６０ｍｌと純水６０ｍｌの混合溶液に溶解し、５０℃で１０時間、室温１４時間攪拌し、ジエチルエーテルを加え水相を抽出し、その後水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン相を減圧濃縮した。
【００４１】
ＭＳにより生成物の確認を行った。
粗収量０．４８ｇ
MS m/z 367.23 (M-H)-
【００４２】
（４）化合物６の合成
【化７】
【００４３】
化合物５を０．４８ｇと、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩０．８９ｇ（４．６４ｍｍｏｌ）と、４−ジメチルアミノピリジン０．３１ｇ（２．５４ｍｍｏｌ）と、２−（ジフェニルホスフィノ）エチルアミン１ｇ（４．３６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（脱水）７５ｍｌ中、窒素雰囲気下、０℃で３０分間攪拌後、室温で４日間攪拌した。その後、純水を加えジクロロメタンで抽出し、減圧濃縮した。シリカゲルカラム（溶媒；クロロホルム）にて精製し、ジエチルエーテルから再結晶した。
収量１６０．２６ｇ（収率２１．１％）（化合物４からの収率）
1H-NMR(400 MHz, TMS, CDCl3): 1.34(s, 6H, CH3), 2.46-2.50(t, 2H, CH2), 2.56(s, 6H, CH3), 3.67-3.75(m, 2H, CH2), 5.98(s, 2H, CH), 6.30(s, 1H, NH), 7.32-7.38(m, 8H, benzene), 7.47-7.52(m, 4H, benzene), 7.70-7.72(d, 2H, benzene)
MS m/z 602.11(M+Na)+
【００４４】
（５）化合物６の酸化体（化合物７）の合成
【化８】
【００４５】
化合物６を３４．６ｍｇ（５９．７１μｍｏｌ）と濃度３０％の過酸化水素水０．４ｍｌを、クロロホルム１０ｍｌとメタノール１０ｍｌの混合溶液中、室温で一昼夜攪拌した。その後、純水を加えジクロロメタンで抽出し、減圧濃縮した。シリカゲルＴＬＣ（溶媒；酢酸エチル）にて精製し、アセトン／ヘキサンにより再結晶を行った。
収量１７．２ｍｇ（収率４８．４％）
1H-NMR(400 MHz, TMS, CDCl3): 1.35(s, 6H, CH3), 2.56(s, 6H, CH3), 2.63-2.68(m, 2H, CH2), 3.87-3.95(m, 2H, CH2), 5.98(s, 2H, CH), 7.35-7.37(d, 2H, benzene), 7.48-7.57(m, 6H, benzene), 7.75-7.80(m, 4H, benzene), 7.93-7.95(d, 2H, benzene), 8.12(s, 1H, NH)
MS m/z 618.15(M+Na)+
【００４６】
（実施例２）励起スペクトル及び蛍光スペクトル測定
実施例１で得た化合物６及び化合物７の励起及び蛍光スペクトル測定を行うため、抗酸化剤２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）を含むクロロホルム溶液（３ｍｇ ＢＨＴ／１０ｍｌ ＣＨＣｌ３）で、化合物６及び化合物７の６２．５μＭ溶液を調製し、さらにクロロホルムでそれぞれを希釈し、１μＭの溶液にした。励起及び蛍光スペクトルの測定は、λｅｘ／λｅｍ＝５０２ｎｍ／５１５ｎｍ、バンド幅（励起／蛍光）＝３ｎｍ／１ｎｍで行った。図１は１μＭの濃度の化合物６（細線）及び化合物７（太線）の励起スペクトルと蛍光スペクトルを測定したものであり、化合物６の酸化体である化合物７は、化合物６より蛍光強度が高かった。
【００４７】
（実施例３）過酸化脂質の測定
実施例１で得た化合物６の過酸化脂質測定能の評価を行うため、抗酸化剤２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）を含むクロロホルム溶液（３ｍｇ ＢＨＴ／１０ｍｌ ＣＨＣｌ３）に化合物６を溶解し、酸化したリノール酸メチルを化合物６と同様に、抗酸化剤を溶解したクロロホルム溶液に溶解し過酸化脂質の試料として用い測定した。
【００４８】
測定条件は、５５．２３μＭの化合物６の溶液５０μｌに、０−６１．７６μＭの濃度の過酸化脂質溶液１００μｌを加えて密栓し、暗所で３７℃で６０分間反応させ、反応後、氷冷した。この反応溶液をクロロホルムを３ｍｌ加えてλｅｘ／λｅｍ＝５０２ｎｍ／５１５ｎｍ、バンド幅（励起／蛍光）＝３ｎｍ／１ｎｍで蛍光測定した。図２は過酸化脂質と化合物６の反応後の過酸化脂質量と蛍光強度との関係を示したものである。過酸化脂質量の増加に伴い蛍光強度は上昇し、過酸化脂質量０−２．７６ｎｍｏｌの間では直線関係が成り立つ。実施例２の結果から、過酸化脂質との反応により蛍光強度の高い酸化体（化合物７）が生成していることが示唆された。
【００４９】
また、５２．９３μＭの化合物６の溶液５０μｌを、０μＭ及び２７．６μＭの過酸化脂質溶液１００μｌと同様に反応させて、反応溶液中の化合物６及び化合物７の分子量を測定した。その結果、０μＭの過酸化脂質溶液の反応溶液では、反応前と比べて、殆ど化合物６が残っていたが、２７．６μＭの過酸化脂質溶液の反応溶液では、化合物６の分子量ピークは観察されず、化合物７の分子量のみが観察された。以上の結果から、化合物６は過酸化脂質の測定を定量的に行える試薬であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、過酸化脂質の高感度分析法として利用できる。また、定量分析だけでなく、細胞と本発明の試薬をインキュベーションすることにより細胞内に取り込ませ、細胞内の過酸化脂質のイメージングを行うことや、本発明の試薬をガラスやプラスチックなどの基板に固定化し、過酸化脂質センサーとして用いたり、また、医療分野においては、口腔や鼻腔などから挿入できる器具の先端に過酸化脂質センサーを取り付けた、患部の正確な過酸化脂質量を把握可能な過酸化脂質診断機器などへも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】化合物６及び化合物７の励起スペクトルと蛍光スペクトルを示す図である。
【図２】過酸化脂質量と過酸化脂質測定試薬との反応から生じる蛍光強度を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ同一又は異なって、水素原子、置換又は非置換の炭化水素基、又はハロゲン原子を表すか、あるいはＲ１０が結合しており；Ｒ８及びＲ９は、それぞれ同一又は異なって、置換又は非置換の芳香族炭化水素基を表し；Ｒ１１及びＲ１２は、ハロゲン原子、置換又は非置換の芳香族炭化水素基、又はアルコキシ基を表し；Ｒ１０は、直接結合、又は置換又は非置換の炭化水素基及びアミド基から選ばれる少なくとも１つの基を含む２価の置換基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７のいずれかの位置で、直接又はＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７で表される置換又は非置換の炭化水素基を介して結合している。）
で示される化合物又はその塩。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で示される化合物が、次式（II）：
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ同一又は異なって、水素原子、置換又は非置換の炭化水素基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ１１及びＲ１２は、ハロゲン原子、置換又は非置換の芳香族炭化水素基、又はアルコキシ基を表し；Ｒ１０’は、直接結合、又は置換又は非置換のアルキレン基、置換又は非置換のフェニレン基及びアミド基から選ばれる少なくとも１つの基を含む２価の置換基を表す。）
で示される化合物である請求項１記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
非又は弱蛍光性であり、過酸化脂質と反応して蛍光性の化合物を生じる請求項１又は２記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
過酸化脂質と反応して、励起波長４００〜７００ｎｍ、蛍光波長４００〜７５０ｎｍの蛍光性の化合物を生じる請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光試薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む過酸化脂質測定試薬。
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ同一又は異なって、水素原子、置換又は非置換の炭化水素基、又はハロゲン原子を表すか、あるいはＲ１０が結合しており；Ｒ８及びＲ９は、それぞれ同一又は異なって、置換又は非置換の芳香族炭化水素基を表し；Ｒ１１及びＲ１２は、ハロゲン原子、置換又は非置換の芳香族炭化水素基、又はアルコキシ基を表し；Ｒ１０は、直接結合、又は置換又は非置換の炭化水素基及びアミド基から選ばれる少なくとも１つの基を含む２価の置換基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７のいずれかの位置で、直接又はＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７で表される置換又は非置換の炭化水素基を介して結合している。）
で示される化合物又はその塩。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で示される化合物が、次式（II）：
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ同一又は異なって、水素原子、置換又は非置換の炭化水素基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ１１及びＲ１２は、ハロゲン原子、置換又は非置換の芳香族炭化水素基、又はアルコキシ基を表し；Ｒ１０’は、直接結合、又は置換又は非置換のアルキレン基、置換又は非置換のフェニレン基及びアミド基から選ばれる少なくとも１つの基を含む２価の置換基を表す。）
で示される化合物である請求項１記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
非又は弱蛍光性であり、過酸化脂質と反応して蛍光性の化合物を生じる請求項１又は２記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
過酸化脂質と反応して、励起波長４００〜７００ｎｍ、蛍光波長４００〜７５０ｎｍの蛍光性の化合物を生じる請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光試薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む過酸化脂質測定試薬。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２９８７２０（Ｐ２００９−２９８７２０Ａ）
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５３９９１（Ｐ２００８−１５３９９１）
【出願日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究「高集積・複合ＭＥＭＳ製造技術開発事業バイオ材料（タンパク質など）の選択的修飾技術」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究「高集積・複合ＭＥＭＳ製造技術開発事業バイオ材料（タンパク質など）の選択的修飾技術」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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