ポリシアル酸におけるエンドトキシンの低減
本発明は、ポリシアル酸及びエンドトキシンを含む発酵ブロス試料のエンドトキシン含有量を低減させる方法であって、（ｉ）ｐＫａが少なくとも１２である塩基を該試料に添加し、ｐＨが少なくとも１２である塩基性溶液を形成すると共に、該溶液を所定の温度で所定の時間インキュベーションする工程と、（ｉｉ）ＰＳＡの回収工程であって適切には（ｉｉｉ）陰イオン交換カラムに上記試料を通過させることによりイオン交換樹脂にポリシアル酸を吸収させること、（ｉｖ）該カラムを１種類の洗浄緩衝液で洗浄することにより該イオン交換樹脂にポリシアル酸が吸収されたままにすること、及び（ｖ）溶出緩衝液を使用して上記カラムから上記ポリシアル酸を溶出させることであって、エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸の生成物溶液を提供する、溶出させることによる（ｉｉ）ＰＳＡの回収工程との連続する工程を含む、方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強塩基でインキュベーションした後に通常陰イオン交換カラムからの吸着及び溶出によりポリシアル酸（ＰＳＡ）を回収することによる、ＰＳＡとその複合体におけるエンドトキシンの低減に関する。エンドトキシン含有量が低減した精製ＰＳＡは、タンパク質薬剤及びペプチド薬剤を含む薬剤送達系、生物学的分子を誘導体化するために使用することができ、それにより薬剤の薬物動態及び薬力学的特性が向上する。
【背景技術】
【０００２】
ポリシアル酸は、或る細菌株により産生される、また、哺乳動物では或る細胞において産生される、シアル酸の天然の非分枝ポリマーである（非特許文献１）。ポリシアル酸は、上記ポリマーの天然形態、細菌由来の形態の、限定的酸加水分解、ノイラミニダーゼでの消化、又は分画により、ｎ＝約８０以上から少なくはｎ＝２までのシアル酸残基のさまざまな重合度で産生される場合がある。異なるポリシアル酸の組成も変化し、ホモポリマー形態、すなわち、大腸菌Ｋ１株及びグループＢ髄膜炎菌（meningococci）の莢膜多糖を含むα−２，８−結合ポリシアル酸が存在し、該ポリシアル酸は胎仔型の神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）にも見出される。大腸菌Ｋ９２株のα−２，８ α−２，９−交互結合ポリシアル酸（alternating alpha-2,8 alpha-2,9 polysialic acid）と、ナイセリア・メニンギティディス（N. meningitidis）のグループＣ多糖とのようなヘテロポリマー形態も存在する。シアル酸は、ナイセリア・メニンギティディスのグループＷ１３５又はグループＹのような、シアル酸以外のモノマーとの交互結合コポリマーで見出される場合もある。ポリシアル酸は、病原菌による免疫系及び補体系の回避と、胎児発達中における未成熟ニューロンのグリア粘着性の調節（ここで、該ポリマーは抗粘着機能を有する）とを含む重要な生物学的機能を有する（非特許文献２）が、哺乳動物ではポリシアル酸に対する既知のレセプターは存在しない。大腸菌Ｋ１株のα−２，８−結合ポリシアル酸は「コロミン酸（ＣＡ）」としても知られており、本発明を例示するために（さまざまな長さで）使用される。
【０００３】
細菌性多糖の中でもポリシアル酸のα−２，８−結合形態は免疫原性を有さず（免疫原性キャリアタンパク質と複合体を形成したときでさえも、被験哺乳動物においてＴ細胞応答又は抗体応答のいずれも誘発しない）、（細菌性ポリマーと同様に）哺乳動物性ポリマーとしての状態を反映し得る。ポリマーの（ｎ＝４までの）より短い形態は、細胞表面のガングリオシドに見出され、身体に広く分布しており、ポリシアル酸に対する免疫寛容を効果的に付与し且つ維持すると考えられている。近年、ポリシアル酸の生物学的特性、特にα−２，８−結合ポリシアル酸ホモポリマーの生物学的特性が、タンパク質薬剤分子及び低分子量薬剤分子の薬物動態学的特性を改変するために活用されている（非特許文献３及び非特許文献４、特許文献１及び特許文献２）。ポリシアル酸による誘導体化は、カタラーゼ及びアスパラギナーゼを含む多数の治療用タンパク質に対する循環半減期の劇的な改善をもたらし、また、該治療用タンパク質への事前曝露の望ましくない（またときには回避不可能な）結果として先在性抗体が産生される局面でかかるタンパク質を使用することを可能にする。多くの観点で、ポリシアル酸化タンパク質の改変された特性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化されたタンパク質に匹敵する。例えば各々の場合において半減期は増加し、タンパク質及びペプチドはタンパク質消化に対してより安定であるが、生物学的活性の保持率は、ＰＥＧで誘導体化された場合よりもＰＳＡで誘導体化された場合の方が大きくなるようである（非特許文献５）。また、ＰＥＧは非常に緩慢にしか生分解されず（非特許文献６）、高分子量の形態は組織中に蓄積される傾向がある（非特許文献７及び非特許文献８）ので、長期間投与しなければならない治療薬と共にＰＥＧを使用することについては疑問が残る。ＰＥＧ化された（PEGylated）タンパク質は、血液循環中の複合体の滞留時間に影響を与える場合もある抗ＰＥＧ抗体を産生することが見出されている（非特許文献９）。治療薬と複合体を形成する、非経口投与されるポリマーとしてのＰＥＧの歴史が確立されているにも関わらず、その免疫毒性、薬理及び代謝についてのより良い理解が求められよう（非特許文献１０）。同様に、ＰＥＧの蓄積は毒性を引き起こす場合があるので、高投与量を必要とする可能性がある治療薬におけるＰＥＧの有用性についての関心が存在する。したがって、α−２，８−結合ポリシアル酸は、生来人体の一部であり且つ組織ノイラミニダーゼにより毒性のない糖であるシアル酸まで分解する、免疫学的に見分けのつかない生分解性ポリマーであり、ＰＥＧに対する魅力的な代替物質を提供する。しかし粗精製のＰＳＡは、ＰＳＡの治療上の有用性を制限する高濃度のエンドトキシンで汚染される。
【０００４】
本発明者らのグループは、過去の学術論文と取得特許とにおいて、ＰＳＡの精製及び分画と、タンパク質治療薬の薬物動態学的特性を向上させるＰＳＡの有用性とを説明した（非特許文献３及び非特許文献１１、特許文献１及び特許文献２）。ここで本発明者らは、ＰＳＡ誘導体化タンパク質と他の治療薬とを製造するために使用することができる、エンドトキシン含有量が低減した精製ＰＳＡの調製を説明する。これらの新しい材料及び方法は、ヒト及び動物における使用が意図されるＰＳＡ誘導体化治療薬の製造に特に適し、その製造の際には、医療倫理と、ＦＤＡ及びＥＭＥＡのような行政当局の安全要件とのために、薬剤分子（drug entities）の化学的定義及び分子的定義が主として重要である。
【０００５】
（リポ多糖である）エンドトキシンは、１８９２年に初めてRichard Pfeifferにより、微生物の外被破損の際に放出される熱安定性毒性物質と定義された。感染した宿主における炎症反応は毒性の生成をもたらすが、該毒性はたいていの局所感染の排除のために最適に順応されると考えられる。しかし、敗血症ショック及び死を引き起こす炎症反応が、重度の感染の全身への分布があるときに発生する場合もある。
【０００６】
このリポ多糖（ＬＰＳ）は、免疫系の骨髄細胞へのエンドトキシンの提示と炎症性サイトカインの産生との間に起こる工程のほとんどにおいて利用される。ＬＰＳの最も強力な成分はリピドＡであり、この成分はエンドトキシンと同義となる。ペプチドグリカン様の細菌由来の炎症性メディエーターと、細菌性リポタンパク質のジアシルグリセリルシステイン部分と、細菌性核酸シグネチャーとは、エンドトキシンとも呼ばれる。最近、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ４）がリピドＡ炎症性シグナル伝達物質であることが発見された。加えて、さまざまな炎症性メディエーターに対するシグナル伝達物質が同定された。エンドトキシンの構造は、それを解明することがエンドトキシンがどのようにして除去され得るのかについての理解を促すので、重要である。
【０００７】
ＬＰＳは、外膜（ＯＭ）の外葉にＬＰＳをつなぎとめる、基部の疎水性リピドＡ領域と、水性媒体中に伸びる、先端部の親水性Ｏ−抗原の繰り返しと、相互接続コアオリゴ糖との３つの部分から構成される。Ｏ−抗原及びコア糖は、生存に必須ではないが、洗剤を含むさまざまな抗菌剤と血清補体の膜侵襲複合体とに対する細菌の抵抗性を提供する。
【０００８】
Ｏ−抗原を産生する野生型細胞はそのつやのあるコロニーから「Ｓ型（smooth）」として知られ、Ｏ−抗原を有しない野生型細胞は「Ｒ型（rough）」として知られる。Ｏ−抗原多糖を含む分子は通常ＬＰＳと呼ばれ、ナイセリア（Neisseria）属等においてＯ−抗原を欠く分子はリポオリゴ糖又はＬＯＳと呼ばれる。リピドＡは生存に必須であり強力な炎症性メディエーターでもあるので、リピドＡは現在、抗生物質及び抗炎症剤の開発のための標的である。
【０００９】
ＬＰＳに加えて、ペプチドグリカンと、細菌性リポタンパク質のジアシルグリセリルシステイン部分と、細菌性核酸シグネチャーと、（エンドトキシン変異株により産生される）不活性型エンドトキシンとを含む多くの炎症性メディエーターが、エンドトキシンとみなされ得る。
【００１０】
新規なエンドトキシンアンタゴニスト及び免疫アジュバント剤を開発するために、改変されたリピドＡ構造が使用されてきた（非特許文献１２）。リピドＡの構造及び機能の生化学的な詳細の決定は、細菌性の発病におけるリピドＡの役割を理解すること、及び感染に対し新規治療を介入させることを助ける（非特許文献１３）。
【００１１】
流体のエンドトキシン含有量を低減させる方法が開発されている。例えば特許文献３は、固相支持体上に固定化されたポリミキシンＢを使用する、血液のようなエンドトキシンを含む流体からのエンドトキシンの除去を説明する。
【００１２】
特許文献４は、タンパク質溶液から細菌性エンドトキシンを除去しタンパク質を回収する方法を説明する。本特許では、固定化金属アフィニティークロマトグラフィが使用される。
【００１３】
特許文献５は、塩基性タンパク質を含む溶液からエンドトキシンを除去する方法に関する。上記方法は、溶液に界面活性剤を添加すること、及び得られた溶液を陽イオン交換カラムにローディングし、その後カラムから塩基性タンパク質を回収することを含む。
【００１４】
特許文献６は、核酸を回収すべき材料からエンドトキシンを除去する方法を説明する。エンドトキシンは、塩を含まない洗剤溶液中で核酸をプレインキュベーションすること、及びその後の触手状陰イオン交換体（tentacle anion exchanger）での陰イオン交換クロマトグラフィにより除去される。
【００１５】
特許文献７は、タンパク質及びエンドトキシンを含む溶液からエンドトキシンを除去する方法を説明するが、この方法において溶液のｐＨは（該タンパク質の等電点である）ｐＨ９以下に調整され、溶液は架橋した顆粒状キトサンが充填されたカラムを通過する。エンドトキシンは吸収され、タンパク質は通過する。
【００１６】
特許文献８は、治療用のタンパク質、血漿画分、及びアルブミン溶液等の生物学的生成物からのエンドトキシンの除去のためのプロセスを説明する。この方法は、生物学的生成物中に存在するエンドトキシンを、アリルデキストランとＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドとのコポリマーから構成される架橋した親水性マトリクスに結合することを含み、エンドトキシンは或る程度の特異性で該マトリクスに結合する。このプロセスは、アフィニティークロマトグラフィ法の分類に属する。
【００１７】
特許文献９は、遺伝子工学及び／又は生命工学により天然の供給源から抽出された通常は核酸である治療用の活性物質を含む組成物からエンドトキシンを低減又は除去するためのプロセスを開示する。その目的のために、例えば、発酵ブロスから回収される組成物は、クロマトグラフィ用の材料で処理される。得られた大腸菌発酵ブロスのような天然の供給源の画分は、遠心分離され、２００ｍＭのＮａＯＨ、１％のドデシル硫酸ナトリウムを使用して溶解され、濾過され、その後、核酸が（エンドトキシンと比較して）優先的に吸収される陰イオン交換カラムを通過する。核酸は溶出緩衝液で溶出され、回収される。別の実施例では、陰イオン交換カラムの前に、エンドトキシンに対する金属アフィニティー吸収剤が使用される。
【００１８】
特許文献１０は、エンドトキシンを選択的に吸収する高い能力を有する吸収剤と、タンパク質溶液からエンドトキシンを吸着する方法とを提供する。上記吸着剤は、架橋剤により塩基材料に結合した塩基性物質を含む。
【００１９】
特許文献１１は、治療上の敗血症ショック処理のために体外吸着により血液又は血漿由来のエンドトキシン及びサイトカイン誘導性の物質を選択的に除去する能力を有する血液処理材料を説明する。上記発明は、被験者又は被験動物の血液からエンドトキシンを除去するために、固体支持媒体に固定化された本発明の多分散性オリゴペプチドを有する吸着剤を使用する方法及び装置も提供した。
【００２０】
多糖試料からのエンドトキシンの除去のための方法も説明されている。
【００２１】
特許文献１２は、サイズ分離手法、好ましくは限外濾過を使用して、実質的にエンドトキシンを含まない多糖組成物を製造するプロセスを開示する。上記方法は、その植物性供給源から回収されたマンナン、アラビアゴム及びアラビノガラクタンからエンドトキシンを除去するのに適する。
【００２２】
特許文献１３は、リン酸ポリリボシルリビトール（polyribosylribitol phosphate）のようなグラム陰性多糖からエンドトキシンを除去するプロセスを説明する。エンドトキシンに対する二価の対イオンを提供するために、グラム陰性細菌発酵ブロス由来の多糖含有粉末が可溶化される。リポ多糖の沈降を誘発するためにアルコールが徐々に添加され、得られた材料は非イオン性樹脂、洗剤及びキレート剤と共に混合される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第５，８４６，９５１号明細書
【特許文献２】国際公開第０１８７９２２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第８７／０７５３１号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６，９４２，８０２号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７１３，６１１号明細書
【特許文献６】米国特許第６，６１７，４４３号明細書
【特許文献７】米国特許第５，１６９，５３５号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９１７，０２２号明細書
【特許文献９】米国特許第７，１０９，３２２号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，６９９，３８６号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，７７４，１０２号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，５８９，５９１号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，０３９，６１０号明細書
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Roth et. al., 1993
【非特許文献２】Muhlenhoff et. al., 1998
【非特許文献３】Gregoriadis, 2006
【非特許文献４】Jain et. al., 2003
【非特許文献５】Hreczuk-Hirst et. al., 2002
【非特許文献６】Beranova et. al., 2000
【非特許文献７】Bendele et. al., 1998
【非特許文献８】Convers et. al., 1997
【非特許文献９】Cheng et. al., 1999
【非特許文献１０】Hunter and Moghimi, 2002
【非特許文献１１】Jain et. al., 2004
【非特許文献１２】Christ et al., 1995
【非特許文献１３】Bishop 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
しかし現在まで、ポリシアル酸試料のエンドトキシン含有量を、医薬品への使用に許容可能なレベルまで低減するための挑戦の余地が残っている。発酵ブロス由来の多糖の陰イオン含有量及び分子量はエンドトキシンに非常に類似する。上記天然の化合物はリポ多糖でもある。これらの理由のために、たいていの精製手法はＰＳＡ及びエンドトキシンの或る程度の同時精製をもたらす。本発明は、これらの問題を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の第１の態様によれば、本発明者らはポリシアル酸及びエンドトキシンを含む試料のエンドトキシン含有量を低減する方法であって、
（ｉ）ｐＫａが少なくとも１２である塩基を該試料に添加し、ｐＨが少なくとも１２である塩基性溶液を形成し、該溶液を所定の温度で所定の時間インキュベーションする工程と、それから
（ｉｉ）エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸を上記溶液から回収する工程と
の連続する工程を含む、方法を提供する。
【００２７】
一実施の形態において、溶液からのＰＳＡの回収は、
（ｉｉｉ）陰イオン交換カラムに塩基処理溶液を通過させることにより、イオン交換樹脂にポリシアル酸を吸収させる工程と、
（ｉｖ）カラムを１種類の洗浄緩衝液で洗浄することにより、イオン交換樹脂にポリシアル酸を吸収させたままにする工程と、
（ｖ）溶出緩衝液を使用してカラムからポリシアル酸を溶出させて、エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸の生成物溶液を提供する工程
を含む。塩基処理されたエンドトキシン生成物のうち少なくともいくらかは、イオン交換カラムの空隙部を通過すると考えられる。
【００２８】
別の実施の形態では、回収工程（ｉｉ）は、塩除去処理工程、すなわち、塩を含まない多糖のような高分子量材料が回収されるサイズ排除クロマトグラフィに基づく工程を含む。本発明は、微生物発酵ブロスの処理に対し特に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の方法の塩基処理に供されるポリシアル酸及びエンドトキシンを含む溶液は好ましくは発酵ブロスであり、通常は遠心分離後の上清、又は栄養素、脂質、タンパク質及び核酸のような不要な汚染物質の除去のための予備的な処理工程の生成物である。しかし、試料は最終生成物において不要なタンパク質を含む場合があり、このため試料が塩基により分解され、分解生成物が上記ＰＳＡ回収工程の間に容易に除去されることが予期される。
【００３０】
この方法は、エンドトキシン含有量が低減しており、医薬品の調製における使用に適するＰＳＡ試料をもたらす。当業者にとっては驚くべきことであるが、強塩基の使用は、ＰＳＡの分解（分子量の減少）又は脱アセチル化をもたらさない。当業者は、ＰＳＡの脱アセチル化を回避するべきであるときには、ＰＳＡをＮａＯＨのような強塩基と接触させることを回避してきた。例えばMoe et al.を参照されたい。しかし本発明者らは、塩基と共にインキュベーションした後に、例えば陰イオン交換カラムでの溶出により、ＰＳＡの回収を行うことが、（例えば脱アセチル化のような）化学的修飾も分子量の減少も引き起こすことなくＰＳＡのエンドトキシン含有量を低減するために特に効果的な方法であることを示した。
【００３１】
本発明の第２の態様によれば、上記の方法により取得することができるエンドトキシン含有量が低減したＰＳＡ材料の試料が提供される。
【００３２】
エンドトキシン含有量は、医薬品として許容されるレベルまで低減されるべきである。好ましくは試料のエンドトキシン含有量は、本発明の方法の後には、ＰＳＡ材料１ｍｇ当たり２５ＥＵ未満である。したがって本発明の第３の態様は、ＬＡＬ試験を使用して測定したときの含有量がＰＳＡ材料１ｍｇ当たり２５ＥＵ以下のエンドトキシンを含むＰＳＡ試料を提供する。好ましくは上記エンドトキシン含有量は、ＰＳＡ材料１ｍｇ当たり０．０５ＥＵ〜２５ＥＵの範囲である。本発明は、エンドトキシン含有量が低いＰＳＡ自体及び（例えば生物学的分子又は薬剤送達系との複合体のような）ＰＳＡ複合体（以下ＰＳＡ材料と呼ぶ）を提供する。
【００３３】
本発明の方法は、ＰＳＡの有用な収率を提供する条件下で実施される。エンドトキシンを除去するために設計されたアフィニティー吸着剤に慣用されるポリミキシンＢのようなアフィニティーリガンド又はポリ−Ｄ−リジンのようなポリカチオンでＰＳＡが汚染されることを回避することが、かかる材料の使用を完全に省略すること又はマトリクスの分解が起こらない条件下（この条件下ではエンドトキシンの除去が最適化され得ない）でそれらを使用することのいずれかにより可能である。この「精製」ＰＳＡは、タンパク質のような治療薬を誘導体化するために使用することができ、エンドトキシンの毒性のリスクなしに人体で使用することができる。
【００３４】
上記エンドトキシンのレベルは、欧州薬局方５．０附則ＸＩＶＣ（European Pharmacopoeia 5.0, Appendix XIVC）に記載のＬＡＬ試験を使用して測定される。
【００３５】
上記方法の工程（ｉ）では、試料はｐＫａが少なくとも１２である塩基に添加される。理論に拘束されるものではないが、塩基はエンドトキシンのおそらくエステル結合であろう結合を切断し、エンドトキシンを不活性の状態にする、及び／又は反応生成物の除去を可能にすると考えられる。本発明の方法における有用性を有するために、したがって塩基は、エンドトキシンを反応及び加水分解するのに十分に強いものでなければならない。例えばＮ−アセチル基を脱アセチル化すること、又はポリシアル酸鎖を切断することによりポリシアル酸を実質的に破壊することなく、エンドトキシン濃度が低減することは、驚くべきことである。
【００３６】
好ましくは塩基のｐＫａは少なくとも１３、より好ましくは少なくとも１４である。塩基は、好ましくはｐＨが少なくとも１３、より好ましくはｐＨが少なくとも１４の塩基性溶液を形成する。試料は典型的には、塩基を含む例えばＨＥＰＥＳ緩衝液のような適切な緩衝液、又は塩基を含む水中で、インキュベーションされる。
【００３７】
本発明における使用に適する塩基は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２及びＬｉＯＨである。特に好ましいものはＮａＯＨである。２Ｎの濃度のＮａＯＨが適切である。
【００３８】
工程（ｉ）は、典型的には５分間から２４時間の、好ましくは３０分間から６時間までの範囲の所定の時間実施される。所定の温度は、典型的には０℃又は６０℃の範囲であり、好ましくは２℃〜４０℃である。より高い温度、及び／又はより長い時間は、ＰＳＡ自体の望ましくない分解を引き起こす場合がある。
【００３９】
本発明の或る実施形態では、工程（ｉ）におけるインキュベーションは、一定の撹拌を続けながら２０℃で２時間実施される。工程（ｉ）の直後に、試料が中和される付加的な工程が行われる場合がある。中和は例えばＨＣｌで行われ、最終的な溶液のｐＨがおよそ７．４に達し得る。
【００４０】
工程（ｉｖ）及び工程（ｖ）の基礎となり得るイオン交換クロマトグラフィを使用する適切な方法が、本発明者らの先の特許出願、国際公開第２００６／０１６１６１号パンフレットで説明される。この方法は本発明での使用に適合させることができるが、その際、この段階では、ＰＳＡを異なる平均分子量の画分に分離する必要はない。その先行技術の方法では、ポリシアル酸は異なる平均分子量の画分に分離される。ＰＳＡの水溶液は、ＰＳＡを吸着するカラム内で陰イオン交換樹脂と接触する。ＰＳＡはその後水性溶出緩衝液による選択的溶出に供され、ＰＳＡは溶出画分から回収される。選択的溶出は、少なくとも１種類の溶出緩衝液でカラム中の樹脂を洗浄することを含む。２種類以上の溶出緩衝液が使用される場合、各溶出緩衝液は異なるイオン強度及び／又はｐＨを有する場合があり、第２の緩衝液とそれ以後の緩衝液とはその直前の工程の緩衝液よりも高いイオン強度及び／又はｐＨを有する。イオン交換を使用する分画プロセスは、エンドトキシン含有量の少しの低減をもたらす。
【００４１】
本発明の方法の好ましい実施形態では、試料は、塩基で処理された後で陰イオン交換カラムを通過する。試料はカラムにローディングする前に調製する必要がある場合があり、例えば、希釈する必要がある場合がある。少なくともいくらかのエンドトキシンはカラムを通過し、好ましくは、ローディング緩衝液（loading buffer）はＰＳＡが十分に吸着され、少なくともいくらかのエンドトキシンが吸着されないように選択される。ローディング緩衝液の例は以下で説明される。
【００４２】
上記方法の工程（ｉｖ）は洗浄工程であり、該工程で低イオン濃度の溶出緩衝液がカラムから洗い流される。例えばかかる初期の洗浄工程は、塩濃度が１００ｍＭ以下の緩衝液を用いて実施される場合がある。典型的には、洗浄緩衝液はトリエタノールアミンを含み、そのｐＨはおよそ７．４である。この初期の工程は、低分子量の汚染物質を洗い出す場合がある。上記洗浄工程は、イオン交換樹脂カラムの体積ベースで、カラム体積の少なくとも１倍、好ましくは少なくとも１．５倍の洗浄緩衝液を用いることを含む場合がある。この工程の間、実質的に全てのポリシアル酸がイオン交換樹脂に残存する。２回以上の洗浄工程が行われる場合がある。第２の洗浄緩衝液は、第１の洗浄緩衝液と同一である場合か、又は代替的にアルコール及び／又は界面活性剤を含む場合がある。界面活性剤の適切な例は、ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０、並びにＴｒｉｔｏｎのような非イオン性界面活性剤である。洗浄工程は、カラムからエンドトキシンをさらに除去し得る。
【００４３】
陰イオン交換樹脂のカラムの断面の直径が高さより大きい場合があること、又は従来のカラムがそうであるように、カラムの高さが断面の直径より大きい場合があることに留意すべきである。体積は、１ｍＬ〜５０００ｍＬの範囲の場合がある。カラムの高さは、１ｃｍ〜５０００ｃｍの範囲の場合がある。断面積は、１ｃｍ〜５０００ｃｍ２の範囲の場合がある。断面はどんな形状でもよいが、好ましくは円形である。
【００４４】
陰イオン交換樹脂の洗浄工程の後、ＰＳＡは溶出緩衝液を使用して溶出される。カラムからＰＳＡを除去するため、工程（ｖ）で使用される溶出緩衝液は、一般的には洗浄緩衝液よりも相対的に高いイオン強度を有する。典型的には、溶出緩衝液は、少なくとも０．４Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。
【００４５】
本発明者らは、好ましい実施形態の溶出工程で、カラム体積の少なくとも１．０倍、好ましくは少なくとも１．２５倍、及び最も好ましくは１．５倍のそれぞれの溶出緩衝液を使用することが好ましいことを見出した。好ましくはカラム体積の３倍以下（no more than）の体積の溶出緩衝液が使用される。７５ｍＬのマトリクスに対する流量は、好ましくは１分間当たり７ｍＬである。
【００４６】
上記方法の好ましい実施形態は、２個以上の、例えば少なくとも５個の、例えば２０個もの、又は一般的には６個〜１２個の範囲の連続する溶出工程であって、順次イオン強度が増大する溶出緩衝液を用いる溶出工程を含む場合がある。これらの重要な工程の最初の工程におけるイオン強度は、一般的には１ｍＭ〜１Ｍの範囲である。この方法で、溶出されるポリシアル酸を、さまざまな平均分子量の試料に分画することができる。
【００４７】
好ましくは溶出緩衝液のイオン強度は、強鉱酸と強鉱塩基との塩、好ましくは塩化ナトリウムの濃度を変化させることにより変化する。
【００４８】
工程（ｖ）が行われ生成物溶液が取得された後、工程（ｉ）及び工程（ｉｉｉ）〜工程（ｖ）が繰り返される場合がある。好ましくは工程（ｉｉｉ）〜工程（ｖ）が繰り返される。
【００４９】
ＰＳＡがさらに処理される場合がある。その後の工程は、さらなる精製工程及び／又は濃縮工程を含む場合がある。さらなる工程に関して、これらは一般的に、例えば膜、例えば限外濾過膜を使用することにより、多糖がいずれかの塩から単離される工程を含む。かかる工程が、ＰＳＡを濃縮し、より高度に濃縮された溶液を形成することを付加的に可能とし得る。かかる溶液が、例えば順次的な限外濾過工程又はその他の濾過工程のような、付加的な膜処理工程に供される場合がある。
【００５０】
陰イオン交換溶出緩衝液は揮発性酸又は揮発性塩基を含む場合があり、この場合上記さらなる工程は、溶出画分から揮発性塩基を揮発させることを含み得る。例えばＰＳＡに対して非溶剤を含む沈降手法により水溶液からＰＳＡを回収することは可能であるが、それぞれの溶剤からの最終的なＰＳＡの単離がより困難となる場合があるので、かかる溶剤は利用しないことが好ましい。したがって好ましくは回収の最終工程は、水と、溶出工程から残存する任意の残存揮発性緩衝液成分とを蒸発させることを含む。トリエタノールアミンが存在する好ましい場合には、トリエタノールアミン陽イオンと酢酸陰イオンとの両方が揮発性であり、真空下で容易に除去することができる。
【００５１】
ＰＳＡは、好ましくは減圧下で、乾燥により最終的に溶液から単離される場合がある。これは好ましくは凍結乾燥により実施される。
【００５２】
沈降は、好ましくは非溶剤を使用して、予備工程として実施し、分画して分子集団（population）の一部を除去し、より高分子量画分の多分散性を減少させる場合がある。好ましくは示差エタノール沈降（differential ethanol precipitation）が使用される。
【００５３】
上記方法は、工程（ｉ）の前、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間、又は工程（ｉｉ）の後のいずれかに、付加的な工程を含み得る。これは、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）のようなアフィニティークロマトグラフィ、又はサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を含む場合がある。
【００５４】
適切なＨＩＣカラムは、Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦのような、エンドトキシンは吸着されるがＰＳＡは吸着しないカラムである。ローディング緩衝液は典型的には、脱イオン水中又はｐＨ７．４に調整した脱イオン水中における硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム等である。
【００５５】
ＨＩＣは、好ましくは工程（ｉ）の前に実施される。実際には、これがＰＳＡ試料からのエンドトキシンの除去のためのＨＩＣの使用に関する最初の開示であると考えられている。例えばＰＳＡ材料を複合体化し、それをエンドトキシンよりも疎水性の高い状態としたときには、発酵ブロスから回収されるようなポリシアル酸を同時除去することなくエンドトキシンをすなわちリポ多糖の形態で除去するためにＨＩＣを使用することができること、又は逆もまた成立する（vice versa）ことは、驚くべきことである。カラム及び条件の適当な選択により、（ローディング緩衝液で）空隙カラム中に、又は適切な溶出緩衝液で溶出することにより、ＰＳＡ材料がカラムを通過する一方でエンドトキシンはカラムに吸着し、又は逆もまた成立するだろう。したがって、本発明のさらなる態様によれば、本発明者らは、ポリシアル酸及びエンドトキシンを含む試料のエンドトキシン含有量を低減するための新規方法であって、エンドトキシンが吸着される疎水性相互作用カラムに試料を通過させ、それによりＰＳＡはカラムを通過し収集され、エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸の生成物溶液を提供することを含む、新規方法を提供する。本発明のまたさらなる態様によれば、本発明者らは、ポリシアル酸及びエンドトキシンを含む試料のエンドトキシン含有量を低減するための新規方法であって、ＰＳＡ材料が吸着される疎水性相互作用カラムに試料を通過させ、それによりエンドトキシンはカラムを通過しＰＳＡ材料は吸着され、その後ＰＳＡ材料が溶出及び収集され、エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸の生成物溶液を提供することを含む、新規方法を提供する。フェニルカラムはＰＳＡを通過させるがエンドトキシンに結合するので、フェニルカラムの使用が好ましい。第１の実施形態では、エンドトキシンを含む空隙体積の通過後に、カラムが洗浄緩衝液で洗浄されて、ＰＳＡを含む場合もある洗浄画分が収集される。第２の実施形態は、比較的疎水的なタンパク質のようなタンパク質とＰＳＡとの複合体を精製するために特に有用である。
【００５６】
本発明の方法において、アフィニティー濾過媒体が、通常工程（ｉｉ）の後で使用される場合がある。アフィニティーマトリクスは、エンドトキシンを特異的に捕捉するものが選択される。条件は、溶液がローディングされるときにはＰＳＡが吸着されないように選択される。マトリクスの分解生成物による汚染を回避するために、エンドトキシン特異的アフィニティークロマトグラフィの使用を回避することが好まれる場合が多い。好ましくは、いずれかのかかる方法の工程が含まれるときに、かかる分解を回避するために、上記条件が選択される。エンドトキシン除去の最適化を犠牲にしてかかる条件が選択される場合があるが、複数の工程を有する方法において本発明の方法の重要な工程と組み合わせたときに、エンドトキシンのレベルを許容可能なレベルまで低減することができる。
【００５７】
本発明の或る実施形態では、固定化エンドトキシン結合剤を含むアフィニティーマトリクスが、ＰＳＡ試料を精製するために使用される。適切な結合剤はポリミキシンＢゲル、特にデトキシ−ゲル（商標）である。
【００５８】
デトキシ−ゲル（商標）エンドトキシン除去ゲル（Endotoxin Removing Gel）は、溶液から発熱物質を結合及び除去するために、固定化ポリミキシンＢを使用する。ポリミキシンは、脂肪酸鎖を有する陽イオン性環状ペプチドを含む抗生物質のファミリーである。ポリミキシンＢは、細菌性リポ多糖のリピドＡ部分に結合することにより、エンドトキシンの生物学的活性を中和する。Kluger et al.により行われた研究（1985）は、固定化ポリミキシンＢが、全てではないがいくつかのエンドトキシンを不活性化することを示す。
【００５９】
固定化ポリミキシンＢゲルは、貴重な調製物中へのリガンドの浸出に対する抵抗性を有する、安定なアフィニティーマトリクスである。アフィニティー支持体の使用は、緩衝液と、細胞培養培地と、タンパク質のようなマクロ分子を含む溶液と、薬理的に重要な成分との容易な清浄化を可能にする。デトキシ−ゲル（商標）エンドトキシン除去ゲルは、核酸（ＤＮＡ）試料からエンドトキシンを除去するためにも使用されている(Wicks et. al., 1995)。
【００６０】
典型的には、ポリミキシンＢゲルを使用する前に、最初にゲルを脱気しなければならない。典型的には例えばデオキシコール酸ナトリウムのような洗剤で洗浄し、その後洗剤を除去するために洗浄することにより、ゲルは再生され得る。ゲルを洗浄するための適切な剤は、発熱物質を含まない水である。ゲルが再生したら、ゲルはカラムに適用され、発熱物質を含まない水又は水が添加される。カラムのインキュベーション時間は典型的には１時間である。試料が収集された後、典型的には試料は、細菌による汚染を防止するために凍結乾燥する。
【００６１】
セルファイン（商標）カラムは、ＰＳＡ試料のエンドトキシン含有量を低減するために使用し得る別タイプのアフィニティークロマトグラフィカラムである。かかるカラムは典型的には、カラム体積の２倍〜８倍、例えば５倍の、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）のようなエンドトキシンを含まない緩衝液を用いて平衡化される。ＨＥＰＥＳは、ローディング緩衝液として使用してもよい。セルファインはＰＳＡの非特異的な結合剤の含有量が低いので、使用するに特に適切な材料である。
【００６２】
他の市販のエンドトキシン選択性アフィニティークロマトグラフィカラムは、ＥｎｄｏＴｒａｐカラムである。ＥｎｄｏＴｒａｐ Ｒｅｄ（商標）カラムも、ＰＳＡ試料のエンドトキシン含有量を低減するために使用することができる。かかるカラムは典型的には、例えばＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒｅｄ（商標）及び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、又は脱イオン水（ｐＨ７．４）のような、カラム体積の５倍〜１０倍、例えば５倍の、エンドトキシンを含まない緩衝液を用いて平衡化される。ＨＥＰＥＳ又は脱イオン水（ｐＨ７．４）は、ローディング緩衝液として使用してもよい。
【００６３】
ＥｎｄｏＴｒａｐ Ｂｌｕｅ（商標）カラムを、ＰＳＡ試料のエンドトキシン含有量を低減するために使用してもよい。かかるカラムは典型的には、カラム体積の５倍〜１０倍、例えば５倍の、５０μＭ〜１００μＭのＣａ＋２を添加した脱イオン水（ｐＨ７．４）を用いて平衡化される。
【００６４】
本発明の第１の態様による方法では、試料は付加的な精製手段に供してもよい。例えば試料は、工程（ｉ）の前、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間、又は工程（ｉｉ）の後に、界面活性剤、キレート剤、塩基、有機溶媒、酸化剤又はペルオキシダーゼと共にインキュベーションされる１つ又は複数の予備工程に供してもよい。
【００６５】
好ましくは界面活性剤は陰イオン性界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。代替的に界面活性剤は、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １１４、又は１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００若しくは１１４の場合がある。代替的に、例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウムのような殺菌力を有する界面活性化合物のような陽イオン性界面活性剤を使用してもよい。適切なインキュベーション時間は１時間である。０℃〜５０℃の範囲の温度が適切であるが、３５℃〜３７℃の範囲の温度が好ましい。
【００６６】
非イオン性界面活性剤が使用されるときには、非イオン性界面活性剤の除去のために陰イオン交換カラム上に溶液がローディングされる。ここでは２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液を使用することができる。
【００６７】
本発明の或る実施形態では、ＰＳＡ試料は、１％のＳＤＳと２ＮのＮａＯＨとを含むＨＥＰＥＳ緩衝液と共に１時間インキュベーションされ、その後この溶液は、塩及び陰イオン性界面活性剤を除去するために、例えばＧＰＣカラムのようなカラム上にローディングされ、典型的にはＨＥＰＥＳ緩衝液のような適切な緩衝液で分画される。ｐｄ１０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ２５カラムを使用してもよい。
【００６８】
代替的に、Ｔｒｉｔｏｎに対して異なる曇点を有する、Ｔｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０のような他の非イオン性界面活性剤を、ＰＳＡ試料のエンドトキシン含有量を低減するために使用してもよい。ＰＳＡ試料は、室温で３０分間、０．１％のＴｗｅｅｎ８０中でインキュベーションされる。その後この溶液は、界面活性剤の除去のために適切な緩衝液又は脱イオン水（ｐＨ７．４）と共に陰イオン交換カラム上にローディングされる。カラムは、界面活性剤を除去するために水及び緩衝液（ｐＨ７．４）で広範に洗浄する。
【００６９】
複数の実施形態で、上記方法は酸化工程を含む。この工程は、ポリシアル酸の末端単位（end unit）を酸化し、例えばタンパク質又はペプチドと反応できる状態にすることが意図される。酸化工程は、同時にエンドトキシン含有量の低減をもたらす場合があるので、エンドトキシン低減という全体的な目的を達成するために有用な工程であり得る。適切な酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウム、スーパーオキシド、次亜塩素酸塩及びペルオキシダーゼである。
【００７０】
本発明の方法は、工程（ｉ）の前又は工程（ｉｉ）の後に、相抽出、透析濾過、沈降、及び／又は乾熱の使用を含む場合がある。乾熱が使用されるときは、典型的にはＰＳＡ試料はバイアル中において、１００℃〜２００℃の範囲、最も好ましくはおよそ１５０℃の温度で、１時間〜６時間、典型的にはおよそ４時間、加熱される。これらの条件は、ＰＳＡを非活性化（deactivate）又は分解しない。
【００７１】
透析濾過は、ＰＳＡ試料を界面活性剤と共にインキュベーションした後で使用されるか、又は代替的に界面活性剤処理とは独立して使用され得る。フィルターは、エンドトキシンは通過させるが少なくとも高分子量のＰＳＡは保持するために、十分に小さい必要がある。球状タンパク質のために５ｋＤａのカットオフを有する典型的な限外濾過装置は十分に大きい濾過孔を有しており、約２００００Ｄａ以上のＰＳＡを保持する一方でエンドトキシン（約１００００Ｄａ）を通過させる。透析濾過工程は、好ましくは塩基処理の後で、例えば回収工程（ｉｉ）の一部として、使用される。
【００７２】
本発明の方法は、ヒト又は動物への使用に適した、エンドトキシン含有量が医薬品として許容可能なレベルまで低減したＰＳＡを提供する。理想的にはＰＳＡ生成物のエンドトキシン含有量は、ＰＳＡ １ｍｇ当たり２５ＥＵ未満である。好ましくはＰＳＡのエンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり０．０５ＥＵ〜２５ＥＵの範囲である。
【００７３】
本発明は、エンドトキシン含有量の低いＰＳＡ複合体を製造するために有用な場合がある。ＰＳＡ複合体においては好ましくは、複合体化部分は、好ましくは生物学的分子、より好ましくはタンパク質である。ＰＳＡ−タンパク質複合体はさまざまな方法により製造される場合があるが、特には、本発明者らの過去の特許出願である国際公開第０１８７９２２号パンフレット及び国際公開第９２／２２３３１号パンフレットを参照されたい。本発明の第１の態様による方法は、塩基が典型的には生物学的部分を損傷し、すなわちいずれかの複合体形成が工程（ｉ）の前に実施されないので、ＰＳＡ−生物学的分子複合体には一般的に不適である。本発明の第４の態様では、
（ｖ）ＰＳＡ複合体−エンドトキシン混合物を、所定の温度で所定の時間非イオン性界面活性剤と接触させる工程と、
（ｖｉ）界面活性剤で処理した試料を陰イオン交換カラムに通過させることによりカラムにＰＳＡ複合体を吸着させる工程と、
（ｖｉｉ）ＰＳＡ複合体を溶出緩衝液を使用してカラムから溶出させて、エンドトキシン含有量が低減したＰＳＡ複合体溶液を生成する工程と
の連続する工程を含む方法が提供される。
【００７４】
この態様で使用される非イオン性界面活性剤の例は、例えばＰＥＧ化合物、モノオレイン酸ソルビタンＴｗｅｅｎ２０／８０、又はＴｒｉｔｏｎシリーズのうちの製品である。再び、理論に拘束されることを望むものではないが、界面活性剤は、エンドトキシンのミセル形成を妨害すること、又はエンドトキシンを溶解することにより、エンドトキシンレベルを低減すると考えられる。
【００７５】
本発明の第４又は第１の態様の生成物は医薬品組成物の場合があり、この場合エンドトキシン含有量は、組成物がヒト又は動物に投与された場合に毒性の副作用を回避するために十分に低い必要がある。組成物は、ヒト又は動物用の医薬組成物であってもよい。
【００７６】
典型的には精製前のＰＳＡ試料、すなわち第１の態様の工程（ｉ）と第４の態様の工程（ｖ）とのための出発材料のエンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり１０００ＥＵ〜２０００００ＥＵである。薬学的に許容されるために、試料の最終的なエンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり２５ＥＵ以下でなければならない。許容可能なエンドトキシン含有量は、ＰＳＡの使用目的に依存する。ＰＳＡが薬物として使用するタンパク質を誘導体化するのに使用されるためのものの場合には、許容可能なエンドトキシン含有量は、薬物として使用するためのタンパク質の用量に応じて変化し、より高用量の場合には典型的にはエンドトキシンのより厳密な除去が要求される。
【００７７】
ヒト（動物）に対する用量が１０ｍｇ〜５００ｍｇの医薬組成物に使用されるＰＳＡ−タンパク質複合体に対しては、エンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり０．５ＥＵ以下であるべきであり、好ましくは１ｍｇ当たり０．０５ＥＵ〜０．５ＥＵの範囲である。ヒトに対する用量が１ｍｇ〜１０ｍｇのＰＳＡ−タンパク質複合体に対しては、エンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり５ＥＵ以下であるべきであり、好ましくは１ｍｇ当たり０．５ＥＵ〜５ＥＵの範囲である。ヒトに対する用量が１０００μｇまでのＰＳＡ−タンパク質複合体に対しては、エンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり２５ＥＵ以下であるべきであり、好ましくは１ｍｇ当たり５ＥＵ〜２５ＥＵの範囲である。
【００７８】
本発明ではエンドトキシン及びＰＳＡを含む試料は、便宜上発酵ブロスである。発酵ブロスは、組換えにより得られるか、又は天然のＰＳＡ産生微生物のブロス、それらの加水分解生成物、若しくはこれらのいずれかの分画された誘導体の場合がある。微生物は、大腸菌Ｋ１、ナイセリア・メニンギティディス又はモラキセラ・リクファシエンス（Moraxella liquefaciens）であってもよい。典型的には本発明の第１の態様による方法は、発酵ブロスを生成するために微生物を発酵させる予備工程を含む。ＰＳＡは、ポリ（２，８−結合シアル酸）、ポリ（２，９−結合シアル酸）、又は２，８−２，９−交互結合ＰＳＡであってもよい。好ましくはＰＳＡは、コロミン酸（ＣＡ）、又はその酸化誘導体、還元誘導体、アミノ化誘導体及び／又はヒドラジド誘導体であってもよい。
【００７９】
ＰＳＡは典型的には、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、例えば少なくとも５０個の糖単位を有する。典型的には最も有用なＰＳＡは、１００ｋＤａまでの重量平均分子量を有する。
【００８０】
ＰＳＡは、いずれかの供給源、好ましくは例えば大腸菌Ｋ１株若しくは大腸菌Ｋ９２株又はグループＢ髄膜炎菌のような細菌性供給源、又はさらに牛乳又はＮ−ＣＡＭのような天然の供給源から得ることができる。シアル酸ポリマーは、ナイセリア・メニンギティディスのグループ１３５又はグループＶのようなヘテロポリマーの場合か、又は例えば酵素的に合成される場合がある。ＰＳＡは、別の天然又は合成のポリマーのブロックとホモポリ（シアル酸）との複合体のようなブロックコポリマーの場合がある。ＰＳＡは、塩又は遊離酸の形態の場合がある。ＰＳＡは、加水分解された形態の場合があり、その場合細菌性供給源からの回収後には分子量は低減している。本発明の方法のための出発材料中のＰＳＡは、１．３より大きい、例えば２以上もの多分散性を有するような広範な分子量を有する材料の場合がある。好ましくは分子量の多分散性は１．２未満であり、より好ましくは１．１未満であり、例えば１．０１程度に低い。
【００８１】
精製ＰＳＡでのタンパク質及び薬剤送達系の誘導体化は、半減期の増加、安定性の向上、免疫原性の低減、及び／又は溶解性の制御をもたらし、したがってバイオアベイラビリティ及び薬理動態特性の向上をもたらす場合か、又は活性部分の溶解性若しくは誘導体化された活性部分を含む溶液の粘性を増強する場合がある。
【００８２】
好ましくは本発明の方法態様の最終生成物であり、新たな生成物であるＰＳＡは、２個〜１０００個のシアル酸単位、例えば１０個〜５００個、より好ましくは１０個〜５０個のシアル酸単位を有する。好ましくはＰＳＡの多分散性は、２未満、理想的には１．２未満、及び理想的には１．０１〜１．１０の範囲であろう。
【００８３】
本発明で使用される精製方法は、エンドトキシン含有量を低減するのに加えて、ＰＳＡの多分散性を有利に低減する。
【００８４】
ＰＳＡ試料のエンドトキシン含有量は、本発明の方法により、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも１００倍、２００倍、５００倍、及びいくつかの実施形態では１０００倍まで、１００００倍まで、１０００００倍まで又はさらに１００００００倍まで、低減する。好ましくは塩基処理及び回収は、エンドトキシン含有量を少なくとも５倍低減する。予備工程と複数のＰＳＡ回収工程とによる全体的な低減は、少なくとも１０５倍の低減をもたらす場合がある。一般的には、エンドトキシン画分除去の観点からお互いに対し相補的な工程の使用によりＰＳＡの回収が最大化する一方でエンドトキシンの低減が最大化するように、回収工程の組合せが選択される。
【００８５】
実施例の「エンドトキシンについてのアッセイ」（ＬＡＬ試験）の節は、どのようにしてエンドトキシン含有量を測定し得るかを説明する。
【実施例】
【００８６】
エンドトキシンについてのリファレンスアッセイ
エンドトキシンについてのアッセイを実施するために、Charles River Laboratoriesから入手されるＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ（Portable Test System）を使用した。これは、ＬＡＬ（カブトガニアメーバ様細胞可溶化液（Limulus Amoebocyte Lysate））アッセイに基づく。
【００８７】
機器操作
必要とされる全ての情報をリーダーに入力した。全ての試験情報を入力した後、リーダーには「試料を添加し入力キーを押して下さい（add sample; press enter）」と表示された。ＰＳＡ試料は、他に特に説明がなければ、ｐＨ７．４で２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液中で１ｍＬ当たり１ｍｇとなるように調製した。４個の試料容器全てに２５μＬの試料をピペットを用いて注入し、リーダーの入力キーを押した。ポンプが一定分量の試料を試験チャネルに引き込み、１５分〜２０分で結果が得られた。試験が完了したとき、機器のスクリーンに、エンドトキシンの測定値と、アッセイの判定基準とが表示された。機器は、以下の特性値を示した。試料（ＥＵ／ｍＬ）、試料ＣＶ（％）、スパイク（spike）（ＥＵ／ｍＬ）、スパイクＣＶ（％）、スパイク回収率（％）。
【００８８】
実施例１−水酸化ナトリウムを使用するエンドトキシンの低減
０．５ＭのＮａＯＨを含むＨｅｐｅｓ緩衝液中における（酸化されていない３１ｋＤａの）エンドトキシンで汚染されたコロミン酸の６ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、室温で１０分間インキュベーションした。その後０．５ｍＬの溶液を、サイズ排除クロマトグラフィ脱塩カラム上にローディングし、収集した画分を廃棄した。カラムはその後２．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、画分を収集した後ＨＥＰＥＳ緩衝液で別の２ｍＬの画分として収集した。収集した溶出画分は、その後レゾルシノールアッセイによりコロミン酸含有量について分析した。コロミン酸を含む画分は、その後共にプールし、エンドトキシン含有量について分析した。試料は、ＰＳＡの脱アセチル化度について試験した。図１は、０．５ＭのＮａＯＨと１％のＳＤＳとを含むＨＥＰＥＳ緩衝溶液におけるコロミン酸のＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥの結果を示す。
【００８９】
ＮａＯＨを使用するとエンドトキシン含有量に５３倍の低減があり、脱アセチル化度は検出できなかった。ＮａＯＨ及びＳＤＳを使用するＰＡＧＥにおいてはいずれも、ＣＡの分解は全く観察されなかった。
【００９０】
実施例２−塩基後の陰イオン交換によるエンドトキシンの低減
２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液（ｐＨ７．４）中の、大腸菌Ｋ１株の発酵槽から直接採取した試料（１ｍｇ／ｍＬ）を測定し、１ｍｇ当たり１０５ＥＵを超えることが見出された。その後ＮａＯＨをＰＳＡ溶液に添加し、ＰＳＡ試料溶液中の最終的なＮａＯＨの規定度を２Ｎとし、その後穏やかに混合しながら室温で２時間インキュベーションした。上記溶液のｐＨを記録した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラム（１ｍＬ）をカラム体積の１０倍の脱イオン水（ｐＨ７．４）で洗浄し、カラムはその後カラム体積の１０倍の２０ｍＭのＴＥＡを使用して平衡化した。試料溶液の伝導率を測定し、２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液で適当に希釈することにより緩衝溶液の伝導率と一致させた。試料溶液は、その後１分間当たり１ｍＬの速度でＱＦＦ（１ｍＬのカラム）にローディングし、空隙体積分（カラム体積の約１／３）を別々に収集した。１ｍＬの画分を収集した。カラムはその後２０ｍＭのＴＥＡで洗浄し、各１ｍＬの洗浄画分を収集した。試料はその後１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴＥＡ中で溶出し、上記画分を収集した。溶出試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。生成物のエンドトキシンレベルは１ｍｇ当たり１４０７ＥＵ、すなわち約７１倍を超えて低減していることが見出された。ＰＳＡの回収率は９１％であった。
【００９１】
上記の生成物を採取して塩基処理と陰イオン交換による回収とを繰り返し、３００以下まで、すなわちさらに５倍の低減がされたところまで低下し、エンドトキシン含有量のさらなる低減が見られた。
【００９２】
実施例３−非イオン性界面活性剤処理（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）後の陰イオン交換によるエンドトキシンの低減
元の試料（１ｍｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液（ｐＨ７．４）のエンドトキシン含有量を測定した。（エンドトキシンで汚染されている、３５ｍｇ／ｍＬの）コロミン酸溶液を、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００中に調製し、室温で２時間インキュベーションした。溶液のｐＨを測定した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラムを実施例２で記載のように調製し、試料を実施例２のように調製及びローディングした。カラムはその後２０ｍＭのＴＥＡで洗浄し、各１ｍＬの洗浄画分を収集した。試料はその後１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴＥＡ中で溶出し、画分を収集した。試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。コロミン酸のローディング量が７．２８ｍｇのとき、出発材料のエンドトキシン含有量は１ｍｇ当たり４０２３ＥＵから１５１１ＥＵまで、すなわち約３倍低減した。回収率は９７％であった。
【００９３】
実施例４−非イオン性界面活性剤処理（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １１４）及び陰イオン交換によるエンドトキシンの低減
１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １１４溶液を調製し、標準的な遠心分離、溶解、透析濾過及び限外濾過により発酵ブロスから得られたＰＳＡ溶液に適当量添加し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １１４の最終濃度を０．５％とし、室温で２時間インキュベーションした。溶液のｐＨを測定した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラムを実施例３のように調製、ローディング、洗浄及び溶出し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。１ｍｇ当たり１０５ＥＵを超えていた出発エンドトキシンレベルは、１ｍｇ当たりおよそ２．３×１０４ＥＵに、すなわちおよそ４倍低減された。
【００９４】
実施例５−塩基／陰イオン交換の後に非イオン性界面活性剤処理及び陰イオン交換を行うことによるエンドトキシンの低減
さまざまな発酵ブロスのコロミン酸溶液生成物を、実施例２に記載の方法により塩基で処理し、その後下記のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １１４で処理し、その後陰イオン交換に供した。
【００９５】
１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １１４溶液を調製し、ＰＳＡ溶液に適当量添加し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １１４の最終濃度を０．５％とした。溶液は、室温（２５℃）では濁っていた。溶液を清澄にするために、溶液は氷中で１０分間〜１５分間維持した。再び溶液を室温で２０分間維持し、溶液を濁らせた。濁った溶液は遠心分離し、ＰＳＡを含む上層と、エンドトキシンを含むＴｒｉｔｏｎ Ｘ １１４の下層との２つの層に分離した。上層は、ＱＦＦカラム上にローディングするために維持した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラムは実施例４のように調製、ローディング、洗浄及び溶出した。
【００９６】
この場合エンドトキシンのレベルは、第１の塩基処理工程で１ｍｇ当たり１０５ＥＵ超から１ｍｇ当たりおよそ４．４ＥＵ〜１０３ＥＵまで低減し、第２の界面活性剤処理工程と陰イオン交換との後ではさらに１ｍｇ当たり８．２×１０２ＥＵまで低減した。
【００９７】
実施例６−非イオン性界面活性剤処理（Ｔｗｅｅｎ ８０）及び陰イオン交換によるエンドトキシンの低減
０．１％のＴｗｅｅｎ ８０中の（エンドトキシンで汚染された１００ｍｇ／ｍＬ；２．５ｇバッチ）コロミン酸溶液を調製し、ｐＨは７．４に調整した。溶液は室温で３０分間インキュベーションし、ｐＨ７．４の水で５００ｍＬまで希釈した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラム（７５ｍＬ）は、カラム体積の１０倍の脱イオン水（ｐＨ７．４）で洗浄し、カラムはその後カラム体積の１０倍の水（ｐＨ７．４）を使用して平衡化した。試料溶液は、その後室温で１分間当たり７ｍＬの流速でローディングした。ローディング画分は、５０ｍＬのファルコンの画分中で、又は適当に（as appropriate）収集した。最初の２５ｍＬの溶出液（loading out）は別々に収集し、カラムの空隙体積を占めていた。カラムはその後、０．０１％のＴｗｅｅｎ ８０を含むｐＨ７．４の水で洗浄し（７ｍＬ／分、４ＣＶ）、各７５ｍＬの洗浄画分を収集した。カラムはその後、ｐＨ７．４の水で洗浄し（７ｍＬ／分、４ＣＶ）、７５ｍＬの洗浄画分として、又は適当に収集した。カラムはその後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の水で洗浄し（７ｍＬ／分、８ＣＶ）、７５ｍＬの画分として、又は適当に収集した。試料はその後、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の水で溶出し、７５ｍＬの溶出画分として、又は適当に収集した。試料を室温で収集した。試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。
【００９８】
実施例７−疎水性相互作用クロマトグラフィによるエンドトキシンの除去
２Ｍの硫酸アンモニウムを含む脱イオン水／脱イオン水を、ローディング緩衝液として使用した。５００μｇの（参考実施例１で生成する、７ｋＤａの）コロミン酸を５００μＬのローディング緩衝液中に溶解し、該溶液を、下表で特定されるＨＩＣカラムにローディングした。カラムはその後、１時間インキュベーションした。溶出試料は収集し、レゾルシノールアッセイを実施し、溶出試料中のコロミン酸の量を推定した。コロミン酸を含む溶出試料をプールし、エンドトキシン含有量について分析した。
【００９９】
【表１】
【０１００】
エンドトキシン含有量は、１４．５倍まで低減した。異なるカラムによるエンドトキシン低減の順序は、Ｐｈｅｎｙｌ＞Ｂｕｔｙｌ≧Ｏｃｔｙｌの順序であった。
【０１０１】
実施例８−陰イオン性界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム）を使用するエンドトキシンの除去
１％のＳＤＳを含むＨＥＰＥＳ緩衝液中における（エンドトキシンで汚染された、３１ｋＤａの）コロミン酸の６ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、３７℃で１時間インキュベーションした。その後０．５ｍＬの溶液を、Ｐｄ１０カラム上にローディングし、収集した画分を廃棄した。カラムはその後２．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、画分を収集した。その後カラムを２ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出した。収集した溶出画分は、その後レゾルシノールアッセイによりコロミン酸含有量について分析した。コロミン酸を含む画分は、その後共にプールされ、エンドトキシン含有量について分析した。
【０１０２】
エンドトキシン含有量は、>10exp6 EU/mgから７４１．６ＥＵ／ｍｇまで低減した。ＰＳＡの回収率は８４％であった。
【０１０３】
参考実施例１−陰イオン交換を使用する分画
新しいプレパックドカラム（１０００ｍＬ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、GE Healthcare）を調製し、保存料は、１分間当たり５０ｍＬの流量で、カラム体積の３倍の脱イオン水と、その後カラム体積の３倍の洗浄緩衝液とで洗浄した。ポンプのチューブは出発緩衝液（トリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．４、２０ｍＭ）で満たされ、上記カラムは該ポンプに接続され、カラム内に空気が入り込むのを回避するために数滴の出発緩衝液を該カラムの最上部にローディングした。エンドトキシンで汚染された大腸菌発酵ブロス由来のコロミン酸溶液を、トリエタノールアミン緩衝液中で調製し、溶液のｐＨを７．４に調整した。洗浄緩衝液中の試料（コロミン酸（ＣＡ）はマルキン（日本）から取得した。）７５０ｍＬは、その後１分間当たり５０ｍＬの流量でカラムに適用し、その後別の７５０ｍＬの洗浄緩衝液でカラムの洗浄を行った。カラムは、その後１５００ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄した。結合したＣＡは、１００ｍＭから４７５ｍＭまでのＮａＣｌを含む異なる溶出緩衝液１５００ｍＬで溶出し、溶出ごとに洗い出された緩衝液を収集し、それぞれの容器中に該緩衝液を移した。全ての残留ＣＡと他の残留物とを、１ＭのＮａＣｌ １５００ｍＬで除去し、洗い出された溶液を収集した。カラムはその後、カラム体積の３倍の洗浄緩衝液で再生した。カラムはその後、２０％のエタノール中において室温で保存した。（塩濃度の高い溶出液により除去された）鎖長の大きな試料はその後、４℃、４バールの圧力下で２５０ｍＬ容の濃縮器（Vivacell、Vivascience）中で最小体積まで濃縮した。濃縮物は、（ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した）蒸留水で４回洗浄した。鎖長の小さな試料も、４℃、加圧下で５０ｍＬ容の濃縮器（Vivaflow、 Vivascience）中で濃縮した。濃縮物は蒸留水で４回洗浄した。試料は、レゾルシノールアッセイによりコロミン酸含有量について分析した。試料はその後、エンドトキシン含有量について分析した。
【０１０４】
その結果は、エンドトキシンレベルが１ｍｇ当たり1.6 x 10exp5 EU/mgの値から３０７０ＥＵ／ｍｇまで低減したことを示す。エンドトキシン含有量にほぼ５倍の低減があった。
【０１０５】
参考実施例２−アフィニティークロマトグラフィ−デトキシゲルカラム精製
デトキシゲルカラムは、いずれかのエンドトキシンが試料中に入り込むのを防ぐために、発熱物質を含まない溶液を使用して再生した。全ての溶液は、気泡がカラムを詰まらせ、流れが悪化するのを防ぐために、カラムに適用する前に脱気した。デトキシ−ゲルエンドトキシン除去ゲルは、活性の損失なしに少なくとも１０回使用することができる。全ての溶液及びゲルは、使用前に室温に平衡化した。
【０１０６】
ゲルは、マグネチックスターラーの入った吸引濾過フラスコの底部にスラリーを置くことにより脱気した。スラリーを撹拌した状態で、フラスコ内に真空を作り出すためにアスピレーターを使用した。ゲルは、約１５分間脱気した。適当なサイズのカラムは脱気されたスラリーで充填され、ゲルを３０分間沈降させた。カラム体積の５倍の１％のデオキシコール酸ナトリウムで洗浄し、その後カラム体積の３倍〜５倍の発熱物質を含まない水を用いて過剰のデオキシコール酸ナトリウムを除去することにより、ゲルを再生した。ゲルは、同じ手順に従い、各々の使用の前に再生した。試料を、その後カラムに適用した。一定分量の、発熱物質を含まない緩衝液又は水を添加し、流出液を収集した。空隙体積分（ベッド体積の９４％）の収集が完了した後、カラムから試料が流出した。効率向上のために、試料がゲルベッドに入った後で、底部及び最上部のキャップを交換した。カラムは少なくとも１時間インキュベーションし、最上部及び底部のキャップを順番に除去した。試料を収集するために、発熱物質を含まない緩衝液又は水をその後添加した。これら全ての実験において、エンドトキシン除去の後、粉塵又は汚れたガラス器具からの試料汚染を防ぐために注意が払われた。試料はその後凍結及び保存した。カラムは、いずれかの結合したエンドトキシンを除去するために上述の同じ手順に従い再生し、２５％エタノール中において２℃〜８℃で保存した。
【０１０７】
第１の実施例において、試料は、国際公開第２００８／０１２５２５号パンフレットに記載の実施例３に開示される方法の生成物であって、国際公開第２００６／０１６１６１号パンフレットで説明される手法により分画された、ＧＣＳＦと複合体を形成したコロミン酸の生成物である。アフィニティーゲル処理の前には複合体のエンドトキシンレベルは１ｍｇ当たり４３８ＥＵであり、処理後にはレベルは１ｍｇ当たり１０．５ＥＵに低減した。ＰＳＡ−タンパク質複合体のエンドトキシン含有量は、このアフィニティークロマトグラフィ材料を使用して３５倍まで低減した。
【０１０８】
第２の実施例において、試料は、以下の条件下で使用される適切なコロミン酸であった。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
エンドトキシン含有量は、元の値である１ｍｇ当たり１６０００ＥＵから１ｍｇ当たり４．２ＥＵまで低減した。回収率は９０％を超えた。
【０１１１】
第３の実施例では、出発材料は、参考実施例１において以下の条件下で生成された溶液であった。結果は以下に示される。
【０１１２】
【表３】
【０１１３】
試料における元のエンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり３０７０ＥＵであった。エンドトキシン含有量の低減は、最大４７倍であった。
【０１１４】
結論
エンドトキシン特異的アフィニティークロマトグラフィは、ポリシアル酸とその複合体とからエンドトキシンを除去するために使用することができる。すなわち本発明者らは、ＰＳＡはカラムに結合せず、それどころか便利な形態で且つ非常に低いエンドトキシンレベルとしてＰＳＡを回収することができる一方で、エンドトキシンがカラムに結合する条件を選択することが可能であることを示した。したがってこの工程は、塩基（又は界面活性剤）処理されたＰＳＡ生成物を処理するのに有用であり得る。
【０１１５】
参考実施例３−アフィニティーカラム（セルファイン）を使用するエンドトキシン除去
この実施例は参考実施例２に類似するが、異なるエンドトキシン−除去用アフィニティーカラムを使用する。セルファインＥＴクリーンカラム（Ｓビーズ）を、カラム体積の５倍の０．２Ｍ ＮａＯＨ、２Ｍ ＮａＣｌと、その後エンドトキシンを含まない水とで洗浄することにより再生した。カラムはその後、カラム体積の５倍のエンドトキシンを含まない適切な緩衝液（ＨＥＰＥＳ緩衝液）で平衡化した。参考実施例１で生成された、ＨＥＰＥＳ緩衝液におけるコロミン酸溶液（１ｍｇ／ｍＬ）は、その後、２１℃で、１分間当たり０．１ｍＬ〜０．２ｍＬの流量でカラムに適用した。ローディングした総量は２１８μｇであった。カラムはその後１時間インキュベーションした後、溶出液をＨＥＰＥＳ緩衝液で収集した。試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。
【０１１６】
エンドトキシンレベルは、１ｍｇ当たり３０７０ＥＵから７５ＥＵまで、すなわち４０倍の量が低減した。
【０１１７】
方法は、参考実施例２パート１のために出発材料として使用したＧＣＳＦ−ＰＳＡ複合体を使用して繰り返し、エンドトキシンレベルを１ｍｇ当たり４３８ＥＵから１２．４ＥＵまで低減した。
【０１１８】
本発明者らは、セルファインカラムがＰＳＡからエンドトキシンを除去するために適切であると結論する。
【０１１９】
参考実施例４−アフィニティーカラム（ＥｎｄｏＴｒａｐ Ｒｅｄ）を使用するエンドトキシンの除去
この実施例は、エンドトキシン吸着のために別のアフィニティーカラムを使用する。ＥｎｄｏＴｒａｐ Ｒｅｄカラムを、ｐＨ７．４の脱イオン水を使用して再生及び平衡化した。エンドトキシンで汚染された、５０ｍｇ／ｍＬのコロミン酸溶液１０ｍＬを調製した。２本のカラムを直列に連結した。試料溶液をカラムにローディングし、空隙体積分（カラム体積の約１／３）を収集した。その後残存するローディング溶液を収集した。その後カラムはカラム体積の６倍の脱イオン水（ｐＨ７．４）で洗浄し、各１ｍＬの画分を収集した。コロミン酸の存在量を算出するために全ての画分についてのレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含む試料のエンドトキシン含有量を決定した。
【０１２０】
１６ｋＤａのコロミン酸についての結果は、１ｍｇ当たり５６４ＥＵから６ＥＵまでのエンドトキシンレベルの低減、すなわちおよそ９０倍の低減を示す。
【０１２１】
この手順は、国際公開第２００８／０１２５２８号パンフレットで説明される方法により製造される、エンドトキシンで汚染されたインスリン−ＰＳＡ複合体に対しても使用した。エンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり１１１ＥＵから１２．５ＥＵまで、すなわち９倍低減した。
【０１２２】
これらの実施例は、別のカラムがＰＳＡとその複合体とからのエンドトキシンの除去に有用であることを示す。
【０１２３】
参考実施例５−ＨＥＰＥＳ緩衝液を使用するアフィニティーカラムによるエンドトキシンの除去
Ｅｎｄｏｔｒａｐ Ｒｅｄカラム（カラム体積１ｍＬ）は、カラムと共に提供されるｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒｅｄで再生した。カラムはその後、カラム体積の５倍の、エンドトキシンを含まない適切な２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を使用して平衡化した。エンドトキシンで汚染された、ＨＥＰＥＳ緩衝液におけるＰＳＡ溶液（７５０μｇ／ｍＬ）はその後、２１℃において、１分間当たり０．１ｍＬ〜０．２ｍＬの流量で上記カラムに適用した。その後カラムは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液０．３ｍＬを使用して溶出した。試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノール／タンパク質アッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。結果は、エンドトキシンレベルがおよそ２倍〜７倍低減する場合があること、及びこれは１００％のＰＳＡ回収率が達成されるローディングレベルで使用されるＰＳＡのローディングにより影響される（カラムへのローディングレベルが低いとエンドトキシン低減はより良好になる）ことを示す。
【０１２４】
参考実施例−３０％のＩＰＡを使用する陰イオン交換カラムによるエンドトキシン、タンパク質、ＤＮＡ及び細胞片の除去
遠心分離、上清回収、透析濾過及び限外濾過により回収された、１ｍＬ当たり３５ｍｇの濃度のコロミン酸を有する発酵ブロスを調製し、そのｐＨを測定した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラムはカラム体積の１０倍の脱イオン水（ｐＨ７．４）で洗浄し、カラムはカラム体積の１０倍の２０ｍＭのＴＥＡを使用して平衡化した。試料溶液の伝導率を測定し、２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液で適当に希釈することにより緩衝溶液の伝導率と一致させた。試料溶液はその後１分間当たり１ｍＬの流速でローディングし、画分を別々に収集した。その後１ｍＬの画分を収集した。カラムはその後３０％のＩＰＡで洗浄し、各１ｍＬの洗浄画分を収集した。試料はその後１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴＥＡで溶出し、画分を収集した。試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。初期のエンドトキシン含有量又はブロス抽出物は１ｍｇ当たり３．２×１０４ＥＵであったが最終的な含有量は１ｍｇ当たり１．８×１０３ＥＵであり、すなわちエンドトキシン含有量は１８倍低減した。
参照文献
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強塩基でインキュベーションした後に通常陰イオン交換カラムからの吸着及び溶出によりポリシアル酸（ＰＳＡ）を回収することによる、ＰＳＡとその複合体におけるエンドトキシンの低減に関する。エンドトキシン含有量が低減した精製ＰＳＡは、タンパク質薬剤及びペプチド薬剤を含む薬剤送達系、生物学的分子を誘導体化するために使用することができ、それにより薬剤の薬物動態及び薬力学的特性が向上する。
【背景技術】
【０００２】
ポリシアル酸は、或る細菌株により産生される、また、哺乳動物では或る細胞において産生される、シアル酸の天然の非分枝ポリマーである（非特許文献１）。ポリシアル酸は、上記ポリマーの天然形態、細菌由来の形態の、限定的酸加水分解、ノイラミニダーゼでの消化、又は分画により、ｎ＝約８０以上から少なくはｎ＝２までのシアル酸残基のさまざまな重合度で産生される場合がある。異なるポリシアル酸の組成も変化し、ホモポリマー形態、すなわち、大腸菌Ｋ１株及びグループＢ髄膜炎菌（meningococci）の莢膜多糖を含むα−２，８−結合ポリシアル酸が存在し、該ポリシアル酸は胎仔型の神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）にも見出される。大腸菌Ｋ９２株のα−２，８ α−２，９−交互結合ポリシアル酸（alternating alpha-2,8 alpha-2,9 polysialic acid）と、ナイセリア・メニンギティディス（N. meningitidis）のグループＣ多糖とのようなヘテロポリマー形態も存在する。シアル酸は、ナイセリア・メニンギティディスのグループＷ１３５又はグループＹのような、シアル酸以外のモノマーとの交互結合コポリマーで見出される場合もある。ポリシアル酸は、病原菌による免疫系及び補体系の回避と、胎児発達中における未成熟ニューロンのグリア粘着性の調節（ここで、該ポリマーは抗粘着機能を有する）とを含む重要な生物学的機能を有する（非特許文献２）が、哺乳動物ではポリシアル酸に対する既知のレセプターは存在しない。大腸菌Ｋ１株のα−２，８−結合ポリシアル酸は「コロミン酸（ＣＡ）」としても知られており、本発明を例示するために（さまざまな長さで）使用される。
【０００３】
細菌性多糖の中でもポリシアル酸のα−２，８−結合形態は免疫原性を有さず（免疫原性キャリアタンパク質と複合体を形成したときでさえも、被験哺乳動物においてＴ細胞応答又は抗体応答のいずれも誘発しない）、（細菌性ポリマーと同様に）哺乳動物性ポリマーとしての状態を反映し得る。ポリマーの（ｎ＝４までの）より短い形態は、細胞表面のガングリオシドに見出され、身体に広く分布しており、ポリシアル酸に対する免疫寛容を効果的に付与し且つ維持すると考えられている。近年、ポリシアル酸の生物学的特性、特にα−２，８−結合ポリシアル酸ホモポリマーの生物学的特性が、タンパク質薬剤分子及び低分子量薬剤分子の薬物動態学的特性を改変するために活用されている（非特許文献３及び非特許文献４、特許文献１及び特許文献２）。ポリシアル酸による誘導体化は、カタラーゼ及びアスパラギナーゼを含む多数の治療用タンパク質に対する循環半減期の劇的な改善をもたらし、また、該治療用タンパク質への事前曝露の望ましくない（またときには回避不可能な）結果として先在性抗体が産生される局面でかかるタンパク質を使用することを可能にする。多くの観点で、ポリシアル酸化タンパク質の改変された特性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化されたタンパク質に匹敵する。例えば各々の場合において半減期は増加し、タンパク質及びペプチドはタンパク質消化に対してより安定であるが、生物学的活性の保持率は、ＰＥＧで誘導体化された場合よりもＰＳＡで誘導体化された場合の方が大きくなるようである（非特許文献５）。また、ＰＥＧは非常に緩慢にしか生分解されず（非特許文献６）、高分子量の形態は組織中に蓄積される傾向がある（非特許文献７及び非特許文献８）ので、長期間投与しなければならない治療薬と共にＰＥＧを使用することについては疑問が残る。ＰＥＧ化された（PEGylated）タンパク質は、血液循環中の複合体の滞留時間に影響を与える場合もある抗ＰＥＧ抗体を産生することが見出されている（非特許文献９）。治療薬と複合体を形成する、非経口投与されるポリマーとしてのＰＥＧの歴史が確立されているにも関わらず、その免疫毒性、薬理及び代謝についてのより良い理解が求められよう（非特許文献１０）。同様に、ＰＥＧの蓄積は毒性を引き起こす場合があるので、高投与量を必要とする可能性がある治療薬におけるＰＥＧの有用性についての関心が存在する。したがって、α−２，８−結合ポリシアル酸は、生来人体の一部であり且つ組織ノイラミニダーゼにより毒性のない糖であるシアル酸まで分解する、免疫学的に見分けのつかない生分解性ポリマーであり、ＰＥＧに対する魅力的な代替物質を提供する。しかし粗精製のＰＳＡは、ＰＳＡの治療上の有用性を制限する高濃度のエンドトキシンで汚染される。
【０００４】
本発明者らのグループは、過去の学術論文と取得特許とにおいて、ＰＳＡの精製及び分画と、タンパク質治療薬の薬物動態学的特性を向上させるＰＳＡの有用性とを説明した（非特許文献３及び非特許文献１１、特許文献１及び特許文献２）。ここで本発明者らは、ＰＳＡ誘導体化タンパク質と他の治療薬とを製造するために使用することができる、エンドトキシン含有量が低減した精製ＰＳＡの調製を説明する。これらの新しい材料及び方法は、ヒト及び動物における使用が意図されるＰＳＡ誘導体化治療薬の製造に特に適し、その製造の際には、医療倫理と、ＦＤＡ及びＥＭＥＡのような行政当局の安全要件とのために、薬剤分子（drug entities）の化学的定義及び分子的定義が主として重要である。
【０００５】
（リポ多糖である）エンドトキシンは、１８９２年に初めてRichard Pfeifferにより、微生物の外被破損の際に放出される熱安定性毒性物質と定義された。感染した宿主における炎症反応は毒性の生成をもたらすが、該毒性はたいていの局所感染の排除のために最適に順応されると考えられる。しかし、敗血症ショック及び死を引き起こす炎症反応が、重度の感染の全身への分布があるときに発生する場合もある。
【０００６】
このリポ多糖（ＬＰＳ）は、免疫系の骨髄細胞へのエンドトキシンの提示と炎症性サイトカインの産生との間に起こる工程のほとんどにおいて利用される。ＬＰＳの最も強力な成分はリピドＡであり、この成分はエンドトキシンと同義となる。ペプチドグリカン様の細菌由来の炎症性メディエーターと、細菌性リポタンパク質のジアシルグリセリルシステイン部分と、細菌性核酸シグネチャーとは、エンドトキシンとも呼ばれる。最近、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ４）がリピドＡ炎症性シグナル伝達物質であることが発見された。加えて、さまざまな炎症性メディエーターに対するシグナル伝達物質が同定された。エンドトキシンの構造は、それを解明することがエンドトキシンがどのようにして除去され得るのかについての理解を促すので、重要である。
【０００７】
ＬＰＳは、外膜（ＯＭ）の外葉にＬＰＳをつなぎとめる、基部の疎水性リピドＡ領域と、水性媒体中に伸びる、先端部の親水性Ｏ−抗原の繰り返しと、相互接続コアオリゴ糖との３つの部分から構成される。Ｏ−抗原及びコア糖は、生存に必須ではないが、洗剤を含むさまざまな抗菌剤と血清補体の膜侵襲複合体とに対する細菌の抵抗性を提供する。
【０００８】
Ｏ−抗原を産生する野生型細胞はそのつやのあるコロニーから「Ｓ型（smooth）」として知られ、Ｏ−抗原を有しない野生型細胞は「Ｒ型（rough）」として知られる。Ｏ−抗原多糖を含む分子は通常ＬＰＳと呼ばれ、ナイセリア（Neisseria）属等においてＯ−抗原を欠く分子はリポオリゴ糖又はＬＯＳと呼ばれる。リピドＡは生存に必須であり強力な炎症性メディエーターでもあるので、リピドＡは現在、抗生物質及び抗炎症剤の開発のための標的である。
【０００９】
ＬＰＳに加えて、ペプチドグリカンと、細菌性リポタンパク質のジアシルグリセリルシステイン部分と、細菌性核酸シグネチャーと、（エンドトキシン変異株により産生される）不活性型エンドトキシンとを含む多くの炎症性メディエーターが、エンドトキシンとみなされ得る。
【００１０】
新規なエンドトキシンアンタゴニスト及び免疫アジュバント剤を開発するために、改変されたリピドＡ構造が使用されてきた（非特許文献１２）。リピドＡの構造及び機能の生化学的な詳細の決定は、細菌性の発病におけるリピドＡの役割を理解すること、及び感染に対し新規治療を介入させることを助ける（非特許文献１３）。
【００１１】
流体のエンドトキシン含有量を低減させる方法が開発されている。例えば特許文献３は、固相支持体上に固定化されたポリミキシンＢを使用する、血液のようなエンドトキシンを含む流体からのエンドトキシンの除去を説明する。
【００１２】
特許文献４は、タンパク質溶液から細菌性エンドトキシンを除去しタンパク質を回収する方法を説明する。本特許では、固定化金属アフィニティークロマトグラフィが使用される。
【００１３】
特許文献５は、塩基性タンパク質を含む溶液からエンドトキシンを除去する方法に関する。上記方法は、溶液に界面活性剤を添加すること、及び得られた溶液を陽イオン交換カラムにローディングし、その後カラムから塩基性タンパク質を回収することを含む。
【００１４】
特許文献６は、核酸を回収すべき材料からエンドトキシンを除去する方法を説明する。エンドトキシンは、塩を含まない洗剤溶液中で核酸をプレインキュベーションすること、及びその後の触手状陰イオン交換体（tentacle anion exchanger）での陰イオン交換クロマトグラフィにより除去される。
【００１５】
特許文献７は、タンパク質及びエンドトキシンを含む溶液からエンドトキシンを除去する方法を説明するが、この方法において溶液のｐＨは（該タンパク質の等電点である）ｐＨ９以下に調整され、溶液は架橋した顆粒状キトサンが充填されたカラムを通過する。エンドトキシンは吸収され、タンパク質は通過する。
【００１６】
特許文献８は、治療用のタンパク質、血漿画分、及びアルブミン溶液等の生物学的生成物からのエンドトキシンの除去のためのプロセスを説明する。この方法は、生物学的生成物中に存在するエンドトキシンを、アリルデキストランとＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドとのコポリマーから構成される架橋した親水性マトリクスに結合することを含み、エンドトキシンは或る程度の特異性で該マトリクスに結合する。このプロセスは、アフィニティークロマトグラフィ法の分類に属する。
【００１７】
特許文献９は、遺伝子工学及び／又は生命工学により天然の供給源から抽出された通常は核酸である治療用の活性物質を含む組成物からエンドトキシンを低減又は除去するためのプロセスを開示する。その目的のために、例えば、発酵ブロスから回収される組成物は、クロマトグラフィ用の材料で処理される。得られた大腸菌発酵ブロスのような天然の供給源の画分は、遠心分離され、２００ｍＭのＮａＯＨ、１％のドデシル硫酸ナトリウムを使用して溶解され、濾過され、その後、核酸が（エンドトキシンと比較して）優先的に吸収される陰イオン交換カラムを通過する。核酸は溶出緩衝液で溶出され、回収される。別の実施例では、陰イオン交換カラムの前に、エンドトキシンに対する金属アフィニティー吸収剤が使用される。
【００１８】
特許文献１０は、エンドトキシンを選択的に吸収する高い能力を有する吸収剤と、タンパク質溶液からエンドトキシンを吸着する方法とを提供する。上記吸着剤は、架橋剤により塩基材料に結合した塩基性物質を含む。
【００１９】
特許文献１１は、治療上の敗血症ショック処理のために体外吸着により血液又は血漿由来のエンドトキシン及びサイトカイン誘導性の物質を選択的に除去する能力を有する血液処理材料を説明する。上記発明は、被験者又は被験動物の血液からエンドトキシンを除去するために、固体支持媒体に固定化された本発明の多分散性オリゴペプチドを有する吸着剤を使用する方法及び装置も提供した。
【００２０】
多糖試料からのエンドトキシンの除去のための方法も説明されている。
【００２１】
特許文献１２は、サイズ分離手法、好ましくは限外濾過を使用して、実質的にエンドトキシンを含まない多糖組成物を製造するプロセスを開示する。上記方法は、その植物性供給源から回収されたマンナン、アラビアゴム及びアラビノガラクタンからエンドトキシンを除去するのに適する。
【００２２】
特許文献１３は、リン酸ポリリボシルリビトール（polyribosylribitol phosphate）のようなグラム陰性多糖からエンドトキシンを除去するプロセスを説明する。エンドトキシンに対する二価の対イオンを提供するために、グラム陰性細菌発酵ブロス由来の多糖含有粉末が可溶化される。リポ多糖の沈降を誘発するためにアルコールが徐々に添加され、得られた材料は非イオン性樹脂、洗剤及びキレート剤と共に混合される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第５，８４６，９５１号明細書
【特許文献２】国際公開第０１８７９２２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第８７／０７５３１号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６，９４２，８０２号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７１３，６１１号明細書
【特許文献６】米国特許第６，６１７，４４３号明細書
【特許文献７】米国特許第５，１６９，５３５号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９１７，０２２号明細書
【特許文献９】米国特許第７，１０９，３２２号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，６９９，３８６号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，７７４，１０２号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，５８９，５９１号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，０３９，６１０号明細書
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Roth et. al., 1993
【非特許文献２】Muhlenhoff et. al., 1998
【非特許文献３】Gregoriadis, 2006
【非特許文献４】Jain et. al., 2003
【非特許文献５】Hreczuk-Hirst et. al., 2002
【非特許文献６】Beranova et. al., 2000
【非特許文献７】Bendele et. al., 1998
【非特許文献８】Convers et. al., 1997
【非特許文献９】Cheng et. al., 1999
【非特許文献１０】Hunter and Moghimi, 2002
【非特許文献１１】Jain et. al., 2004
【非特許文献１２】Christ et al., 1995
【非特許文献１３】Bishop 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
しかし現在まで、ポリシアル酸試料のエンドトキシン含有量を、医薬品への使用に許容可能なレベルまで低減するための挑戦の余地が残っている。発酵ブロス由来の多糖の陰イオン含有量及び分子量はエンドトキシンに非常に類似する。上記天然の化合物はリポ多糖でもある。これらの理由のために、たいていの精製手法はＰＳＡ及びエンドトキシンの或る程度の同時精製をもたらす。本発明は、これらの問題を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の第１の態様によれば、本発明者らはポリシアル酸及びエンドトキシンを含む試料のエンドトキシン含有量を低減する方法であって、
（ｉ）ｐＫａが少なくとも１２である塩基を該試料に添加し、ｐＨが少なくとも１２である塩基性溶液を形成し、該溶液を所定の温度で所定の時間インキュベーションする工程と、それから
（ｉｉ）エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸を上記溶液から回収する工程と
の連続する工程を含む、方法を提供する。
【００２７】
一実施の形態において、溶液からのＰＳＡの回収は、
（ｉｉｉ）陰イオン交換カラムに塩基処理溶液を通過させることにより、イオン交換樹脂にポリシアル酸を吸収させる工程と、
（ｉｖ）カラムを１種類の洗浄緩衝液で洗浄することにより、イオン交換樹脂にポリシアル酸を吸収させたままにする工程と、
（ｖ）溶出緩衝液を使用してカラムからポリシアル酸を溶出させて、エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸の生成物溶液を提供する工程
を含む。塩基処理されたエンドトキシン生成物のうち少なくともいくらかは、イオン交換カラムの空隙部を通過すると考えられる。
【００２８】
別の実施の形態では、回収工程（ｉｉ）は、塩除去処理工程、すなわち、塩を含まない多糖のような高分子量材料が回収されるサイズ排除クロマトグラフィに基づく工程を含む。本発明は、微生物発酵ブロスの処理に対し特に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の方法の塩基処理に供されるポリシアル酸及びエンドトキシンを含む溶液は好ましくは発酵ブロスであり、通常は遠心分離後の上清、又は栄養素、脂質、タンパク質及び核酸のような不要な汚染物質の除去のための予備的な処理工程の生成物である。しかし、試料は最終生成物において不要なタンパク質を含む場合があり、このため試料が塩基により分解され、分解生成物が上記ＰＳＡ回収工程の間に容易に除去されることが予期される。
【００３０】
この方法は、エンドトキシン含有量が低減しており、医薬品の調製における使用に適するＰＳＡ試料をもたらす。当業者にとっては驚くべきことであるが、強塩基の使用は、ＰＳＡの分解（分子量の減少）又は脱アセチル化をもたらさない。当業者は、ＰＳＡの脱アセチル化を回避するべきであるときには、ＰＳＡをＮａＯＨのような強塩基と接触させることを回避してきた。例えばMoe et al.を参照されたい。しかし本発明者らは、塩基と共にインキュベーションした後に、例えば陰イオン交換カラムでの溶出により、ＰＳＡの回収を行うことが、（例えば脱アセチル化のような）化学的修飾も分子量の減少も引き起こすことなくＰＳＡのエンドトキシン含有量を低減するために特に効果的な方法であることを示した。
【００３１】
本発明の第２の態様によれば、上記の方法により取得することができるエンドトキシン含有量が低減したＰＳＡ材料の試料が提供される。
【００３２】
エンドトキシン含有量は、医薬品として許容されるレベルまで低減されるべきである。好ましくは試料のエンドトキシン含有量は、本発明の方法の後には、ＰＳＡ材料１ｍｇ当たり２５ＥＵ未満である。したがって本発明の第３の態様は、ＬＡＬ試験を使用して測定したときの含有量がＰＳＡ材料１ｍｇ当たり２５ＥＵ以下のエンドトキシンを含むＰＳＡ試料を提供する。好ましくは上記エンドトキシン含有量は、ＰＳＡ材料１ｍｇ当たり０．０５ＥＵ〜２５ＥＵの範囲である。本発明は、エンドトキシン含有量が低いＰＳＡ自体及び（例えば生物学的分子又は薬剤送達系との複合体のような）ＰＳＡ複合体（以下ＰＳＡ材料と呼ぶ）を提供する。
【００３３】
本発明の方法は、ＰＳＡの有用な収率を提供する条件下で実施される。エンドトキシンを除去するために設計されたアフィニティー吸着剤に慣用されるポリミキシンＢのようなアフィニティーリガンド又はポリ−Ｄ−リジンのようなポリカチオンでＰＳＡが汚染されることを回避することが、かかる材料の使用を完全に省略すること又はマトリクスの分解が起こらない条件下（この条件下ではエンドトキシンの除去が最適化され得ない）でそれらを使用することのいずれかにより可能である。この「精製」ＰＳＡは、タンパク質のような治療薬を誘導体化するために使用することができ、エンドトキシンの毒性のリスクなしに人体で使用することができる。
【００３４】
上記エンドトキシンのレベルは、欧州薬局方５．０附則ＸＩＶＣ（European Pharmacopoeia 5.0, Appendix XIVC）に記載のＬＡＬ試験を使用して測定される。
【００３５】
上記方法の工程（ｉ）では、試料はｐＫａが少なくとも１２である塩基に添加される。理論に拘束されるものではないが、塩基はエンドトキシンのおそらくエステル結合であろう結合を切断し、エンドトキシンを不活性の状態にする、及び／又は反応生成物の除去を可能にすると考えられる。本発明の方法における有用性を有するために、したがって塩基は、エンドトキシンを反応及び加水分解するのに十分に強いものでなければならない。例えばＮ−アセチル基を脱アセチル化すること、又はポリシアル酸鎖を切断することによりポリシアル酸を実質的に破壊することなく、エンドトキシン濃度が低減することは、驚くべきことである。
【００３６】
好ましくは塩基のｐＫａは少なくとも１３、より好ましくは少なくとも１４である。塩基は、好ましくはｐＨが少なくとも１３、より好ましくはｐＨが少なくとも１４の塩基性溶液を形成する。試料は典型的には、塩基を含む例えばＨＥＰＥＳ緩衝液のような適切な緩衝液、又は塩基を含む水中で、インキュベーションされる。
【００３７】
本発明における使用に適する塩基は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２及びＬｉＯＨである。特に好ましいものはＮａＯＨである。２Ｎの濃度のＮａＯＨが適切である。
【００３８】
工程（ｉ）は、典型的には５分間から２４時間の、好ましくは３０分間から６時間までの範囲の所定の時間実施される。所定の温度は、典型的には０℃又は６０℃の範囲であり、好ましくは２℃〜４０℃である。より高い温度、及び／又はより長い時間は、ＰＳＡ自体の望ましくない分解を引き起こす場合がある。
【００３９】
本発明の或る実施形態では、工程（ｉ）におけるインキュベーションは、一定の撹拌を続けながら２０℃で２時間実施される。工程（ｉ）の直後に、試料が中和される付加的な工程が行われる場合がある。中和は例えばＨＣｌで行われ、最終的な溶液のｐＨがおよそ７．４に達し得る。
【００４０】
工程（ｉｖ）及び工程（ｖ）の基礎となり得るイオン交換クロマトグラフィを使用する適切な方法が、本発明者らの先の特許出願、国際公開第２００６／０１６１６１号パンフレットで説明される。この方法は本発明での使用に適合させることができるが、その際、この段階では、ＰＳＡを異なる平均分子量の画分に分離する必要はない。その先行技術の方法では、ポリシアル酸は異なる平均分子量の画分に分離される。ＰＳＡの水溶液は、ＰＳＡを吸着するカラム内で陰イオン交換樹脂と接触する。ＰＳＡはその後水性溶出緩衝液による選択的溶出に供され、ＰＳＡは溶出画分から回収される。選択的溶出は、少なくとも１種類の溶出緩衝液でカラム中の樹脂を洗浄することを含む。２種類以上の溶出緩衝液が使用される場合、各溶出緩衝液は異なるイオン強度及び／又はｐＨを有する場合があり、第２の緩衝液とそれ以後の緩衝液とはその直前の工程の緩衝液よりも高いイオン強度及び／又はｐＨを有する。イオン交換を使用する分画プロセスは、エンドトキシン含有量の少しの低減をもたらす。
【００４１】
本発明の方法の好ましい実施形態では、試料は、塩基で処理された後で陰イオン交換カラムを通過する。試料はカラムにローディングする前に調製する必要がある場合があり、例えば、希釈する必要がある場合がある。少なくともいくらかのエンドトキシンはカラムを通過し、好ましくは、ローディング緩衝液（loading buffer）はＰＳＡが十分に吸着され、少なくともいくらかのエンドトキシンが吸着されないように選択される。ローディング緩衝液の例は以下で説明される。
【００４２】
上記方法の工程（ｉｖ）は洗浄工程であり、該工程で低イオン濃度の溶出緩衝液がカラムから洗い流される。例えばかかる初期の洗浄工程は、塩濃度が１００ｍＭ以下の緩衝液を用いて実施される場合がある。典型的には、洗浄緩衝液はトリエタノールアミンを含み、そのｐＨはおよそ７．４である。この初期の工程は、低分子量の汚染物質を洗い出す場合がある。上記洗浄工程は、イオン交換樹脂カラムの体積ベースで、カラム体積の少なくとも１倍、好ましくは少なくとも１．５倍の洗浄緩衝液を用いることを含む場合がある。この工程の間、実質的に全てのポリシアル酸がイオン交換樹脂に残存する。２回以上の洗浄工程が行われる場合がある。第２の洗浄緩衝液は、第１の洗浄緩衝液と同一である場合か、又は代替的にアルコール及び／又は界面活性剤を含む場合がある。界面活性剤の適切な例は、ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０、並びにＴｒｉｔｏｎのような非イオン性界面活性剤である。洗浄工程は、カラムからエンドトキシンをさらに除去し得る。
【００４３】
陰イオン交換樹脂のカラムの断面の直径が高さより大きい場合があること、又は従来のカラムがそうであるように、カラムの高さが断面の直径より大きい場合があることに留意すべきである。体積は、１ｍＬ〜５０００ｍＬの範囲の場合がある。カラムの高さは、１ｃｍ〜５０００ｃｍの範囲の場合がある。断面積は、１ｃｍ〜５０００ｃｍ２の範囲の場合がある。断面はどんな形状でもよいが、好ましくは円形である。
【００４４】
陰イオン交換樹脂の洗浄工程の後、ＰＳＡは溶出緩衝液を使用して溶出される。カラムからＰＳＡを除去するため、工程（ｖ）で使用される溶出緩衝液は、一般的には洗浄緩衝液よりも相対的に高いイオン強度を有する。典型的には、溶出緩衝液は、少なくとも０．４Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。
【００４５】
本発明者らは、好ましい実施形態の溶出工程で、カラム体積の少なくとも１．０倍、好ましくは少なくとも１．２５倍、及び最も好ましくは１．５倍のそれぞれの溶出緩衝液を使用することが好ましいことを見出した。好ましくはカラム体積の３倍以下（no more than）の体積の溶出緩衝液が使用される。７５ｍＬのマトリクスに対する流量は、好ましくは１分間当たり７ｍＬである。
【００４６】
上記方法の好ましい実施形態は、２個以上の、例えば少なくとも５個の、例えば２０個もの、又は一般的には６個〜１２個の範囲の連続する溶出工程であって、順次イオン強度が増大する溶出緩衝液を用いる溶出工程を含む場合がある。これらの重要な工程の最初の工程におけるイオン強度は、一般的には１ｍＭ〜１Ｍの範囲である。この方法で、溶出されるポリシアル酸を、さまざまな平均分子量の試料に分画することができる。
【００４７】
好ましくは溶出緩衝液のイオン強度は、強鉱酸と強鉱塩基との塩、好ましくは塩化ナトリウムの濃度を変化させることにより変化する。
【００４８】
工程（ｖ）が行われ生成物溶液が取得された後、工程（ｉ）及び工程（ｉｉｉ）〜工程（ｖ）が繰り返される場合がある。好ましくは工程（ｉｉｉ）〜工程（ｖ）が繰り返される。
【００４９】
ＰＳＡがさらに処理される場合がある。その後の工程は、さらなる精製工程及び／又は濃縮工程を含む場合がある。さらなる工程に関して、これらは一般的に、例えば膜、例えば限外濾過膜を使用することにより、多糖がいずれかの塩から単離される工程を含む。かかる工程が、ＰＳＡを濃縮し、より高度に濃縮された溶液を形成することを付加的に可能とし得る。かかる溶液が、例えば順次的な限外濾過工程又はその他の濾過工程のような、付加的な膜処理工程に供される場合がある。
【００５０】
陰イオン交換溶出緩衝液は揮発性酸又は揮発性塩基を含む場合があり、この場合上記さらなる工程は、溶出画分から揮発性塩基を揮発させることを含み得る。例えばＰＳＡに対して非溶剤を含む沈降手法により水溶液からＰＳＡを回収することは可能であるが、それぞれの溶剤からの最終的なＰＳＡの単離がより困難となる場合があるので、かかる溶剤は利用しないことが好ましい。したがって好ましくは回収の最終工程は、水と、溶出工程から残存する任意の残存揮発性緩衝液成分とを蒸発させることを含む。トリエタノールアミンが存在する好ましい場合には、トリエタノールアミン陽イオンと酢酸陰イオンとの両方が揮発性であり、真空下で容易に除去することができる。
【００５１】
ＰＳＡは、好ましくは減圧下で、乾燥により最終的に溶液から単離される場合がある。これは好ましくは凍結乾燥により実施される。
【００５２】
沈降は、好ましくは非溶剤を使用して、予備工程として実施し、分画して分子集団（population）の一部を除去し、より高分子量画分の多分散性を減少させる場合がある。好ましくは示差エタノール沈降（differential ethanol precipitation）が使用される。
【００５３】
上記方法は、工程（ｉ）の前、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間、又は工程（ｉｉ）の後のいずれかに、付加的な工程を含み得る。これは、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）のようなアフィニティークロマトグラフィ、又はサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を含む場合がある。
【００５４】
適切なＨＩＣカラムは、Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦのような、エンドトキシンは吸着されるがＰＳＡは吸着しないカラムである。ローディング緩衝液は典型的には、脱イオン水中又はｐＨ７．４に調整した脱イオン水中における硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム等である。
【００５５】
ＨＩＣは、好ましくは工程（ｉ）の前に実施される。実際には、これがＰＳＡ試料からのエンドトキシンの除去のためのＨＩＣの使用に関する最初の開示であると考えられている。例えばＰＳＡ材料を複合体化し、それをエンドトキシンよりも疎水性の高い状態としたときには、発酵ブロスから回収されるようなポリシアル酸を同時除去することなくエンドトキシンをすなわちリポ多糖の形態で除去するためにＨＩＣを使用することができること、又は逆もまた成立する（vice versa）ことは、驚くべきことである。カラム及び条件の適当な選択により、（ローディング緩衝液で）空隙カラム中に、又は適切な溶出緩衝液で溶出することにより、ＰＳＡ材料がカラムを通過する一方でエンドトキシンはカラムに吸着し、又は逆もまた成立するだろう。したがって、本発明のさらなる態様によれば、本発明者らは、ポリシアル酸及びエンドトキシンを含む試料のエンドトキシン含有量を低減するための新規方法であって、エンドトキシンが吸着される疎水性相互作用カラムに試料を通過させ、それによりＰＳＡはカラムを通過し収集され、エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸の生成物溶液を提供することを含む、新規方法を提供する。本発明のまたさらなる態様によれば、本発明者らは、ポリシアル酸及びエンドトキシンを含む試料のエンドトキシン含有量を低減するための新規方法であって、ＰＳＡ材料が吸着される疎水性相互作用カラムに試料を通過させ、それによりエンドトキシンはカラムを通過しＰＳＡ材料は吸着され、その後ＰＳＡ材料が溶出及び収集され、エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸の生成物溶液を提供することを含む、新規方法を提供する。フェニルカラムはＰＳＡを通過させるがエンドトキシンに結合するので、フェニルカラムの使用が好ましい。第１の実施形態では、エンドトキシンを含む空隙体積の通過後に、カラムが洗浄緩衝液で洗浄されて、ＰＳＡを含む場合もある洗浄画分が収集される。第２の実施形態は、比較的疎水的なタンパク質のようなタンパク質とＰＳＡとの複合体を精製するために特に有用である。
【００５６】
本発明の方法において、アフィニティー濾過媒体が、通常工程（ｉｉ）の後で使用される場合がある。アフィニティーマトリクスは、エンドトキシンを特異的に捕捉するものが選択される。条件は、溶液がローディングされるときにはＰＳＡが吸着されないように選択される。マトリクスの分解生成物による汚染を回避するために、エンドトキシン特異的アフィニティークロマトグラフィの使用を回避することが好まれる場合が多い。好ましくは、いずれかのかかる方法の工程が含まれるときに、かかる分解を回避するために、上記条件が選択される。エンドトキシン除去の最適化を犠牲にしてかかる条件が選択される場合があるが、複数の工程を有する方法において本発明の方法の重要な工程と組み合わせたときに、エンドトキシンのレベルを許容可能なレベルまで低減することができる。
【００５７】
本発明の或る実施形態では、固定化エンドトキシン結合剤を含むアフィニティーマトリクスが、ＰＳＡ試料を精製するために使用される。適切な結合剤はポリミキシンＢゲル、特にデトキシ−ゲル（商標）である。
【００５８】
デトキシ−ゲル（商標）エンドトキシン除去ゲル（Endotoxin Removing Gel）は、溶液から発熱物質を結合及び除去するために、固定化ポリミキシンＢを使用する。ポリミキシンは、脂肪酸鎖を有する陽イオン性環状ペプチドを含む抗生物質のファミリーである。ポリミキシンＢは、細菌性リポ多糖のリピドＡ部分に結合することにより、エンドトキシンの生物学的活性を中和する。Kluger et al.により行われた研究（1985）は、固定化ポリミキシンＢが、全てではないがいくつかのエンドトキシンを不活性化することを示す。
【００５９】
固定化ポリミキシンＢゲルは、貴重な調製物中へのリガンドの浸出に対する抵抗性を有する、安定なアフィニティーマトリクスである。アフィニティー支持体の使用は、緩衝液と、細胞培養培地と、タンパク質のようなマクロ分子を含む溶液と、薬理的に重要な成分との容易な清浄化を可能にする。デトキシ−ゲル（商標）エンドトキシン除去ゲルは、核酸（ＤＮＡ）試料からエンドトキシンを除去するためにも使用されている(Wicks et. al., 1995)。
【００６０】
典型的には、ポリミキシンＢゲルを使用する前に、最初にゲルを脱気しなければならない。典型的には例えばデオキシコール酸ナトリウムのような洗剤で洗浄し、その後洗剤を除去するために洗浄することにより、ゲルは再生され得る。ゲルを洗浄するための適切な剤は、発熱物質を含まない水である。ゲルが再生したら、ゲルはカラムに適用され、発熱物質を含まない水又は水が添加される。カラムのインキュベーション時間は典型的には１時間である。試料が収集された後、典型的には試料は、細菌による汚染を防止するために凍結乾燥する。
【００６１】
セルファイン（商標）カラムは、ＰＳＡ試料のエンドトキシン含有量を低減するために使用し得る別タイプのアフィニティークロマトグラフィカラムである。かかるカラムは典型的には、カラム体積の２倍〜８倍、例えば５倍の、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）のようなエンドトキシンを含まない緩衝液を用いて平衡化される。ＨＥＰＥＳは、ローディング緩衝液として使用してもよい。セルファインはＰＳＡの非特異的な結合剤の含有量が低いので、使用するに特に適切な材料である。
【００６２】
他の市販のエンドトキシン選択性アフィニティークロマトグラフィカラムは、ＥｎｄｏＴｒａｐカラムである。ＥｎｄｏＴｒａｐ Ｒｅｄ（商標）カラムも、ＰＳＡ試料のエンドトキシン含有量を低減するために使用することができる。かかるカラムは典型的には、例えばＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒｅｄ（商標）及び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、又は脱イオン水（ｐＨ７．４）のような、カラム体積の５倍〜１０倍、例えば５倍の、エンドトキシンを含まない緩衝液を用いて平衡化される。ＨＥＰＥＳ又は脱イオン水（ｐＨ７．４）は、ローディング緩衝液として使用してもよい。
【００６３】
ＥｎｄｏＴｒａｐ Ｂｌｕｅ（商標）カラムを、ＰＳＡ試料のエンドトキシン含有量を低減するために使用してもよい。かかるカラムは典型的には、カラム体積の５倍〜１０倍、例えば５倍の、５０μＭ〜１００μＭのＣａ＋２を添加した脱イオン水（ｐＨ７．４）を用いて平衡化される。
【００６４】
本発明の第１の態様による方法では、試料は付加的な精製手段に供してもよい。例えば試料は、工程（ｉ）の前、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間、又は工程（ｉｉ）の後に、界面活性剤、キレート剤、塩基、有機溶媒、酸化剤又はペルオキシダーゼと共にインキュベーションされる１つ又は複数の予備工程に供してもよい。
【００６５】
好ましくは界面活性剤は陰イオン性界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。代替的に界面活性剤は、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １１４、又は１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００若しくは１１４の場合がある。代替的に、例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウムのような殺菌力を有する界面活性化合物のような陽イオン性界面活性剤を使用してもよい。適切なインキュベーション時間は１時間である。０℃〜５０℃の範囲の温度が適切であるが、３５℃〜３７℃の範囲の温度が好ましい。
【００６６】
非イオン性界面活性剤が使用されるときには、非イオン性界面活性剤の除去のために陰イオン交換カラム上に溶液がローディングされる。ここでは２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液を使用することができる。
【００６７】
本発明の或る実施形態では、ＰＳＡ試料は、１％のＳＤＳと２ＮのＮａＯＨとを含むＨＥＰＥＳ緩衝液と共に１時間インキュベーションされ、その後この溶液は、塩及び陰イオン性界面活性剤を除去するために、例えばＧＰＣカラムのようなカラム上にローディングされ、典型的にはＨＥＰＥＳ緩衝液のような適切な緩衝液で分画される。ｐｄ１０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ２５カラムを使用してもよい。
【００６８】
代替的に、Ｔｒｉｔｏｎに対して異なる曇点を有する、Ｔｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０のような他の非イオン性界面活性剤を、ＰＳＡ試料のエンドトキシン含有量を低減するために使用してもよい。ＰＳＡ試料は、室温で３０分間、０．１％のＴｗｅｅｎ８０中でインキュベーションされる。その後この溶液は、界面活性剤の除去のために適切な緩衝液又は脱イオン水（ｐＨ７．４）と共に陰イオン交換カラム上にローディングされる。カラムは、界面活性剤を除去するために水及び緩衝液（ｐＨ７．４）で広範に洗浄する。
【００６９】
複数の実施形態で、上記方法は酸化工程を含む。この工程は、ポリシアル酸の末端単位（end unit）を酸化し、例えばタンパク質又はペプチドと反応できる状態にすることが意図される。酸化工程は、同時にエンドトキシン含有量の低減をもたらす場合があるので、エンドトキシン低減という全体的な目的を達成するために有用な工程であり得る。適切な酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウム、スーパーオキシド、次亜塩素酸塩及びペルオキシダーゼである。
【００７０】
本発明の方法は、工程（ｉ）の前又は工程（ｉｉ）の後に、相抽出、透析濾過、沈降、及び／又は乾熱の使用を含む場合がある。乾熱が使用されるときは、典型的にはＰＳＡ試料はバイアル中において、１００℃〜２００℃の範囲、最も好ましくはおよそ１５０℃の温度で、１時間〜６時間、典型的にはおよそ４時間、加熱される。これらの条件は、ＰＳＡを非活性化（deactivate）又は分解しない。
【００７１】
透析濾過は、ＰＳＡ試料を界面活性剤と共にインキュベーションした後で使用されるか、又は代替的に界面活性剤処理とは独立して使用され得る。フィルターは、エンドトキシンは通過させるが少なくとも高分子量のＰＳＡは保持するために、十分に小さい必要がある。球状タンパク質のために５ｋＤａのカットオフを有する典型的な限外濾過装置は十分に大きい濾過孔を有しており、約２００００Ｄａ以上のＰＳＡを保持する一方でエンドトキシン（約１００００Ｄａ）を通過させる。透析濾過工程は、好ましくは塩基処理の後で、例えば回収工程（ｉｉ）の一部として、使用される。
【００７２】
本発明の方法は、ヒト又は動物への使用に適した、エンドトキシン含有量が医薬品として許容可能なレベルまで低減したＰＳＡを提供する。理想的にはＰＳＡ生成物のエンドトキシン含有量は、ＰＳＡ １ｍｇ当たり２５ＥＵ未満である。好ましくはＰＳＡのエンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり０．０５ＥＵ〜２５ＥＵの範囲である。
【００７３】
本発明は、エンドトキシン含有量の低いＰＳＡ複合体を製造するために有用な場合がある。ＰＳＡ複合体においては好ましくは、複合体化部分は、好ましくは生物学的分子、より好ましくはタンパク質である。ＰＳＡ−タンパク質複合体はさまざまな方法により製造される場合があるが、特には、本発明者らの過去の特許出願である国際公開第０１８７９２２号パンフレット及び国際公開第９２／２２３３１号パンフレットを参照されたい。本発明の第１の態様による方法は、塩基が典型的には生物学的部分を損傷し、すなわちいずれかの複合体形成が工程（ｉ）の前に実施されないので、ＰＳＡ−生物学的分子複合体には一般的に不適である。本発明の第４の態様では、
（ｖ）ＰＳＡ複合体−エンドトキシン混合物を、所定の温度で所定の時間非イオン性界面活性剤と接触させる工程と、
（ｖｉ）界面活性剤で処理した試料を陰イオン交換カラムに通過させることによりカラムにＰＳＡ複合体を吸着させる工程と、
（ｖｉｉ）ＰＳＡ複合体を溶出緩衝液を使用してカラムから溶出させて、エンドトキシン含有量が低減したＰＳＡ複合体溶液を生成する工程と
の連続する工程を含む方法が提供される。
【００７４】
この態様で使用される非イオン性界面活性剤の例は、例えばＰＥＧ化合物、モノオレイン酸ソルビタンＴｗｅｅｎ２０／８０、又はＴｒｉｔｏｎシリーズのうちの製品である。再び、理論に拘束されることを望むものではないが、界面活性剤は、エンドトキシンのミセル形成を妨害すること、又はエンドトキシンを溶解することにより、エンドトキシンレベルを低減すると考えられる。
【００７５】
本発明の第４又は第１の態様の生成物は医薬品組成物の場合があり、この場合エンドトキシン含有量は、組成物がヒト又は動物に投与された場合に毒性の副作用を回避するために十分に低い必要がある。組成物は、ヒト又は動物用の医薬組成物であってもよい。
【００７６】
典型的には精製前のＰＳＡ試料、すなわち第１の態様の工程（ｉ）と第４の態様の工程（ｖ）とのための出発材料のエンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり１０００ＥＵ〜２０００００ＥＵである。薬学的に許容されるために、試料の最終的なエンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり２５ＥＵ以下でなければならない。許容可能なエンドトキシン含有量は、ＰＳＡの使用目的に依存する。ＰＳＡが薬物として使用するタンパク質を誘導体化するのに使用されるためのものの場合には、許容可能なエンドトキシン含有量は、薬物として使用するためのタンパク質の用量に応じて変化し、より高用量の場合には典型的にはエンドトキシンのより厳密な除去が要求される。
【００７７】
ヒト（動物）に対する用量が１０ｍｇ〜５００ｍｇの医薬組成物に使用されるＰＳＡ−タンパク質複合体に対しては、エンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり０．５ＥＵ以下であるべきであり、好ましくは１ｍｇ当たり０．０５ＥＵ〜０．５ＥＵの範囲である。ヒトに対する用量が１ｍｇ〜１０ｍｇのＰＳＡ−タンパク質複合体に対しては、エンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり５ＥＵ以下であるべきであり、好ましくは１ｍｇ当たり０．５ＥＵ〜５ＥＵの範囲である。ヒトに対する用量が１０００μｇまでのＰＳＡ−タンパク質複合体に対しては、エンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり２５ＥＵ以下であるべきであり、好ましくは１ｍｇ当たり５ＥＵ〜２５ＥＵの範囲である。
【００７８】
本発明ではエンドトキシン及びＰＳＡを含む試料は、便宜上発酵ブロスである。発酵ブロスは、組換えにより得られるか、又は天然のＰＳＡ産生微生物のブロス、それらの加水分解生成物、若しくはこれらのいずれかの分画された誘導体の場合がある。微生物は、大腸菌Ｋ１、ナイセリア・メニンギティディス又はモラキセラ・リクファシエンス（Moraxella liquefaciens）であってもよい。典型的には本発明の第１の態様による方法は、発酵ブロスを生成するために微生物を発酵させる予備工程を含む。ＰＳＡは、ポリ（２，８−結合シアル酸）、ポリ（２，９−結合シアル酸）、又は２，８−２，９−交互結合ＰＳＡであってもよい。好ましくはＰＳＡは、コロミン酸（ＣＡ）、又はその酸化誘導体、還元誘導体、アミノ化誘導体及び／又はヒドラジド誘導体であってもよい。
【００７９】
ＰＳＡは典型的には、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、例えば少なくとも５０個の糖単位を有する。典型的には最も有用なＰＳＡは、１００ｋＤａまでの重量平均分子量を有する。
【００８０】
ＰＳＡは、いずれかの供給源、好ましくは例えば大腸菌Ｋ１株若しくは大腸菌Ｋ９２株又はグループＢ髄膜炎菌のような細菌性供給源、又はさらに牛乳又はＮ−ＣＡＭのような天然の供給源から得ることができる。シアル酸ポリマーは、ナイセリア・メニンギティディスのグループ１３５又はグループＶのようなヘテロポリマーの場合か、又は例えば酵素的に合成される場合がある。ＰＳＡは、別の天然又は合成のポリマーのブロックとホモポリ（シアル酸）との複合体のようなブロックコポリマーの場合がある。ＰＳＡは、塩又は遊離酸の形態の場合がある。ＰＳＡは、加水分解された形態の場合があり、その場合細菌性供給源からの回収後には分子量は低減している。本発明の方法のための出発材料中のＰＳＡは、１．３より大きい、例えば２以上もの多分散性を有するような広範な分子量を有する材料の場合がある。好ましくは分子量の多分散性は１．２未満であり、より好ましくは１．１未満であり、例えば１．０１程度に低い。
【００８１】
精製ＰＳＡでのタンパク質及び薬剤送達系の誘導体化は、半減期の増加、安定性の向上、免疫原性の低減、及び／又は溶解性の制御をもたらし、したがってバイオアベイラビリティ及び薬理動態特性の向上をもたらす場合か、又は活性部分の溶解性若しくは誘導体化された活性部分を含む溶液の粘性を増強する場合がある。
【００８２】
好ましくは本発明の方法態様の最終生成物であり、新たな生成物であるＰＳＡは、２個〜１０００個のシアル酸単位、例えば１０個〜５００個、より好ましくは１０個〜５０個のシアル酸単位を有する。好ましくはＰＳＡの多分散性は、２未満、理想的には１．２未満、及び理想的には１．０１〜１．１０の範囲であろう。
【００８３】
本発明で使用される精製方法は、エンドトキシン含有量を低減するのに加えて、ＰＳＡの多分散性を有利に低減する。
【００８４】
ＰＳＡ試料のエンドトキシン含有量は、本発明の方法により、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも１００倍、２００倍、５００倍、及びいくつかの実施形態では１０００倍まで、１００００倍まで、１０００００倍まで又はさらに１００００００倍まで、低減する。好ましくは塩基処理及び回収は、エンドトキシン含有量を少なくとも５倍低減する。予備工程と複数のＰＳＡ回収工程とによる全体的な低減は、少なくとも１０５倍の低減をもたらす場合がある。一般的には、エンドトキシン画分除去の観点からお互いに対し相補的な工程の使用によりＰＳＡの回収が最大化する一方でエンドトキシンの低減が最大化するように、回収工程の組合せが選択される。
【００８５】
実施例の「エンドトキシンについてのアッセイ」（ＬＡＬ試験）の節は、どのようにしてエンドトキシン含有量を測定し得るかを説明する。
【実施例】
【００８６】
エンドトキシンについてのリファレンスアッセイ
エンドトキシンについてのアッセイを実施するために、Charles River Laboratoriesから入手されるＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ（Portable Test System）を使用した。これは、ＬＡＬ（カブトガニアメーバ様細胞可溶化液（Limulus Amoebocyte Lysate））アッセイに基づく。
【００８７】
機器操作
必要とされる全ての情報をリーダーに入力した。全ての試験情報を入力した後、リーダーには「試料を添加し入力キーを押して下さい（add sample; press enter）」と表示された。ＰＳＡ試料は、他に特に説明がなければ、ｐＨ７．４で２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液中で１ｍＬ当たり１ｍｇとなるように調製した。４個の試料容器全てに２５μＬの試料をピペットを用いて注入し、リーダーの入力キーを押した。ポンプが一定分量の試料を試験チャネルに引き込み、１５分〜２０分で結果が得られた。試験が完了したとき、機器のスクリーンに、エンドトキシンの測定値と、アッセイの判定基準とが表示された。機器は、以下の特性値を示した。試料（ＥＵ／ｍＬ）、試料ＣＶ（％）、スパイク（spike）（ＥＵ／ｍＬ）、スパイクＣＶ（％）、スパイク回収率（％）。
【００８８】
実施例１−水酸化ナトリウムを使用するエンドトキシンの低減
０．５ＭのＮａＯＨを含むＨｅｐｅｓ緩衝液中における（酸化されていない３１ｋＤａの）エンドトキシンで汚染されたコロミン酸の６ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、室温で１０分間インキュベーションした。その後０．５ｍＬの溶液を、サイズ排除クロマトグラフィ脱塩カラム上にローディングし、収集した画分を廃棄した。カラムはその後２．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、画分を収集した後ＨＥＰＥＳ緩衝液で別の２ｍＬの画分として収集した。収集した溶出画分は、その後レゾルシノールアッセイによりコロミン酸含有量について分析した。コロミン酸を含む画分は、その後共にプールし、エンドトキシン含有量について分析した。試料は、ＰＳＡの脱アセチル化度について試験した。図１は、０．５ＭのＮａＯＨと１％のＳＤＳとを含むＨＥＰＥＳ緩衝溶液におけるコロミン酸のＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥの結果を示す。
【００８９】
ＮａＯＨを使用するとエンドトキシン含有量に５３倍の低減があり、脱アセチル化度は検出できなかった。ＮａＯＨ及びＳＤＳを使用するＰＡＧＥにおいてはいずれも、ＣＡの分解は全く観察されなかった。
【００９０】
実施例２−塩基後の陰イオン交換によるエンドトキシンの低減
２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液（ｐＨ７．４）中の、大腸菌Ｋ１株の発酵槽から直接採取した試料（１ｍｇ／ｍＬ）を測定し、１ｍｇ当たり１０５ＥＵを超えることが見出された。その後ＮａＯＨをＰＳＡ溶液に添加し、ＰＳＡ試料溶液中の最終的なＮａＯＨの規定度を２Ｎとし、その後穏やかに混合しながら室温で２時間インキュベーションした。上記溶液のｐＨを記録した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラム（１ｍＬ）をカラム体積の１０倍の脱イオン水（ｐＨ７．４）で洗浄し、カラムはその後カラム体積の１０倍の２０ｍＭのＴＥＡを使用して平衡化した。試料溶液の伝導率を測定し、２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液で適当に希釈することにより緩衝溶液の伝導率と一致させた。試料溶液は、その後１分間当たり１ｍＬの速度でＱＦＦ（１ｍＬのカラム）にローディングし、空隙体積分（カラム体積の約１／３）を別々に収集した。１ｍＬの画分を収集した。カラムはその後２０ｍＭのＴＥＡで洗浄し、各１ｍＬの洗浄画分を収集した。試料はその後１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴＥＡ中で溶出し、上記画分を収集した。溶出試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。生成物のエンドトキシンレベルは１ｍｇ当たり１４０７ＥＵ、すなわち約７１倍を超えて低減していることが見出された。ＰＳＡの回収率は９１％であった。
【００９１】
上記の生成物を採取して塩基処理と陰イオン交換による回収とを繰り返し、３００以下まで、すなわちさらに５倍の低減がされたところまで低下し、エンドトキシン含有量のさらなる低減が見られた。
【００９２】
実施例３−非イオン性界面活性剤処理（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）後の陰イオン交換によるエンドトキシンの低減
元の試料（１ｍｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液（ｐＨ７．４）のエンドトキシン含有量を測定した。（エンドトキシンで汚染されている、３５ｍｇ／ｍＬの）コロミン酸溶液を、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００中に調製し、室温で２時間インキュベーションした。溶液のｐＨを測定した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラムを実施例２で記載のように調製し、試料を実施例２のように調製及びローディングした。カラムはその後２０ｍＭのＴＥＡで洗浄し、各１ｍＬの洗浄画分を収集した。試料はその後１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴＥＡ中で溶出し、画分を収集した。試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。コロミン酸のローディング量が７．２８ｍｇのとき、出発材料のエンドトキシン含有量は１ｍｇ当たり４０２３ＥＵから１５１１ＥＵまで、すなわち約３倍低減した。回収率は９７％であった。
【００９３】
実施例４−非イオン性界面活性剤処理（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １１４）及び陰イオン交換によるエンドトキシンの低減
１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １１４溶液を調製し、標準的な遠心分離、溶解、透析濾過及び限外濾過により発酵ブロスから得られたＰＳＡ溶液に適当量添加し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １１４の最終濃度を０．５％とし、室温で２時間インキュベーションした。溶液のｐＨを測定した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラムを実施例３のように調製、ローディング、洗浄及び溶出し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。１ｍｇ当たり１０５ＥＵを超えていた出発エンドトキシンレベルは、１ｍｇ当たりおよそ２．３×１０４ＥＵに、すなわちおよそ４倍低減された。
【００９４】
実施例５−塩基／陰イオン交換の後に非イオン性界面活性剤処理及び陰イオン交換を行うことによるエンドトキシンの低減
さまざまな発酵ブロスのコロミン酸溶液生成物を、実施例２に記載の方法により塩基で処理し、その後下記のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １１４で処理し、その後陰イオン交換に供した。
【００９５】
１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １１４溶液を調製し、ＰＳＡ溶液に適当量添加し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １１４の最終濃度を０．５％とした。溶液は、室温（２５℃）では濁っていた。溶液を清澄にするために、溶液は氷中で１０分間〜１５分間維持した。再び溶液を室温で２０分間維持し、溶液を濁らせた。濁った溶液は遠心分離し、ＰＳＡを含む上層と、エンドトキシンを含むＴｒｉｔｏｎ Ｘ １１４の下層との２つの層に分離した。上層は、ＱＦＦカラム上にローディングするために維持した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラムは実施例４のように調製、ローディング、洗浄及び溶出した。
【００９６】
この場合エンドトキシンのレベルは、第１の塩基処理工程で１ｍｇ当たり１０５ＥＵ超から１ｍｇ当たりおよそ４．４ＥＵ〜１０３ＥＵまで低減し、第２の界面活性剤処理工程と陰イオン交換との後ではさらに１ｍｇ当たり８．２×１０２ＥＵまで低減した。
【００９７】
実施例６−非イオン性界面活性剤処理（Ｔｗｅｅｎ ８０）及び陰イオン交換によるエンドトキシンの低減
０．１％のＴｗｅｅｎ ８０中の（エンドトキシンで汚染された１００ｍｇ／ｍＬ；２．５ｇバッチ）コロミン酸溶液を調製し、ｐＨは７．４に調整した。溶液は室温で３０分間インキュベーションし、ｐＨ７．４の水で５００ｍＬまで希釈した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラム（７５ｍＬ）は、カラム体積の１０倍の脱イオン水（ｐＨ７．４）で洗浄し、カラムはその後カラム体積の１０倍の水（ｐＨ７．４）を使用して平衡化した。試料溶液は、その後室温で１分間当たり７ｍＬの流速でローディングした。ローディング画分は、５０ｍＬのファルコンの画分中で、又は適当に（as appropriate）収集した。最初の２５ｍＬの溶出液（loading out）は別々に収集し、カラムの空隙体積を占めていた。カラムはその後、０．０１％のＴｗｅｅｎ ８０を含むｐＨ７．４の水で洗浄し（７ｍＬ／分、４ＣＶ）、各７５ｍＬの洗浄画分を収集した。カラムはその後、ｐＨ７．４の水で洗浄し（７ｍＬ／分、４ＣＶ）、７５ｍＬの洗浄画分として、又は適当に収集した。カラムはその後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の水で洗浄し（７ｍＬ／分、８ＣＶ）、７５ｍＬの画分として、又は適当に収集した。試料はその後、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の水で溶出し、７５ｍＬの溶出画分として、又は適当に収集した。試料を室温で収集した。試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。
【００９８】
実施例７−疎水性相互作用クロマトグラフィによるエンドトキシンの除去
２Ｍの硫酸アンモニウムを含む脱イオン水／脱イオン水を、ローディング緩衝液として使用した。５００μｇの（参考実施例１で生成する、７ｋＤａの）コロミン酸を５００μＬのローディング緩衝液中に溶解し、該溶液を、下表で特定されるＨＩＣカラムにローディングした。カラムはその後、１時間インキュベーションした。溶出試料は収集し、レゾルシノールアッセイを実施し、溶出試料中のコロミン酸の量を推定した。コロミン酸を含む溶出試料をプールし、エンドトキシン含有量について分析した。
【００９９】
【表１】
【０１００】
エンドトキシン含有量は、１４．５倍まで低減した。異なるカラムによるエンドトキシン低減の順序は、Ｐｈｅｎｙｌ＞Ｂｕｔｙｌ≧Ｏｃｔｙｌの順序であった。
【０１０１】
実施例８−陰イオン性界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム）を使用するエンドトキシンの除去
１％のＳＤＳを含むＨＥＰＥＳ緩衝液中における（エンドトキシンで汚染された、３１ｋＤａの）コロミン酸の６ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、３７℃で１時間インキュベーションした。その後０．５ｍＬの溶液を、Ｐｄ１０カラム上にローディングし、収集した画分を廃棄した。カラムはその後２．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、画分を収集した。その後カラムを２ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出した。収集した溶出画分は、その後レゾルシノールアッセイによりコロミン酸含有量について分析した。コロミン酸を含む画分は、その後共にプールされ、エンドトキシン含有量について分析した。
【０１０２】
エンドトキシン含有量は、>10exp6 EU/mgから７４１．６ＥＵ／ｍｇまで低減した。ＰＳＡの回収率は８４％であった。
【０１０３】
参考実施例１−陰イオン交換を使用する分画
新しいプレパックドカラム（１０００ｍＬ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、GE Healthcare）を調製し、保存料は、１分間当たり５０ｍＬの流量で、カラム体積の３倍の脱イオン水と、その後カラム体積の３倍の洗浄緩衝液とで洗浄した。ポンプのチューブは出発緩衝液（トリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．４、２０ｍＭ）で満たされ、上記カラムは該ポンプに接続され、カラム内に空気が入り込むのを回避するために数滴の出発緩衝液を該カラムの最上部にローディングした。エンドトキシンで汚染された大腸菌発酵ブロス由来のコロミン酸溶液を、トリエタノールアミン緩衝液中で調製し、溶液のｐＨを７．４に調整した。洗浄緩衝液中の試料（コロミン酸（ＣＡ）はマルキン（日本）から取得した。）７５０ｍＬは、その後１分間当たり５０ｍＬの流量でカラムに適用し、その後別の７５０ｍＬの洗浄緩衝液でカラムの洗浄を行った。カラムは、その後１５００ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄した。結合したＣＡは、１００ｍＭから４７５ｍＭまでのＮａＣｌを含む異なる溶出緩衝液１５００ｍＬで溶出し、溶出ごとに洗い出された緩衝液を収集し、それぞれの容器中に該緩衝液を移した。全ての残留ＣＡと他の残留物とを、１ＭのＮａＣｌ １５００ｍＬで除去し、洗い出された溶液を収集した。カラムはその後、カラム体積の３倍の洗浄緩衝液で再生した。カラムはその後、２０％のエタノール中において室温で保存した。（塩濃度の高い溶出液により除去された）鎖長の大きな試料はその後、４℃、４バールの圧力下で２５０ｍＬ容の濃縮器（Vivacell、Vivascience）中で最小体積まで濃縮した。濃縮物は、（ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した）蒸留水で４回洗浄した。鎖長の小さな試料も、４℃、加圧下で５０ｍＬ容の濃縮器（Vivaflow、 Vivascience）中で濃縮した。濃縮物は蒸留水で４回洗浄した。試料は、レゾルシノールアッセイによりコロミン酸含有量について分析した。試料はその後、エンドトキシン含有量について分析した。
【０１０４】
その結果は、エンドトキシンレベルが１ｍｇ当たり1.6 x 10exp5 EU/mgの値から３０７０ＥＵ／ｍｇまで低減したことを示す。エンドトキシン含有量にほぼ５倍の低減があった。
【０１０５】
参考実施例２−アフィニティークロマトグラフィ−デトキシゲルカラム精製
デトキシゲルカラムは、いずれかのエンドトキシンが試料中に入り込むのを防ぐために、発熱物質を含まない溶液を使用して再生した。全ての溶液は、気泡がカラムを詰まらせ、流れが悪化するのを防ぐために、カラムに適用する前に脱気した。デトキシ−ゲルエンドトキシン除去ゲルは、活性の損失なしに少なくとも１０回使用することができる。全ての溶液及びゲルは、使用前に室温に平衡化した。
【０１０６】
ゲルは、マグネチックスターラーの入った吸引濾過フラスコの底部にスラリーを置くことにより脱気した。スラリーを撹拌した状態で、フラスコ内に真空を作り出すためにアスピレーターを使用した。ゲルは、約１５分間脱気した。適当なサイズのカラムは脱気されたスラリーで充填され、ゲルを３０分間沈降させた。カラム体積の５倍の１％のデオキシコール酸ナトリウムで洗浄し、その後カラム体積の３倍〜５倍の発熱物質を含まない水を用いて過剰のデオキシコール酸ナトリウムを除去することにより、ゲルを再生した。ゲルは、同じ手順に従い、各々の使用の前に再生した。試料を、その後カラムに適用した。一定分量の、発熱物質を含まない緩衝液又は水を添加し、流出液を収集した。空隙体積分（ベッド体積の９４％）の収集が完了した後、カラムから試料が流出した。効率向上のために、試料がゲルベッドに入った後で、底部及び最上部のキャップを交換した。カラムは少なくとも１時間インキュベーションし、最上部及び底部のキャップを順番に除去した。試料を収集するために、発熱物質を含まない緩衝液又は水をその後添加した。これら全ての実験において、エンドトキシン除去の後、粉塵又は汚れたガラス器具からの試料汚染を防ぐために注意が払われた。試料はその後凍結及び保存した。カラムは、いずれかの結合したエンドトキシンを除去するために上述の同じ手順に従い再生し、２５％エタノール中において２℃〜８℃で保存した。
【０１０７】
第１の実施例において、試料は、国際公開第２００８／０１２５２５号パンフレットに記載の実施例３に開示される方法の生成物であって、国際公開第２００６／０１６１６１号パンフレットで説明される手法により分画された、ＧＣＳＦと複合体を形成したコロミン酸の生成物である。アフィニティーゲル処理の前には複合体のエンドトキシンレベルは１ｍｇ当たり４３８ＥＵであり、処理後にはレベルは１ｍｇ当たり１０．５ＥＵに低減した。ＰＳＡ−タンパク質複合体のエンドトキシン含有量は、このアフィニティークロマトグラフィ材料を使用して３５倍まで低減した。
【０１０８】
第２の実施例において、試料は、以下の条件下で使用される適切なコロミン酸であった。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
エンドトキシン含有量は、元の値である１ｍｇ当たり１６０００ＥＵから１ｍｇ当たり４．２ＥＵまで低減した。回収率は９０％を超えた。
【０１１１】
第３の実施例では、出発材料は、参考実施例１において以下の条件下で生成された溶液であった。結果は以下に示される。
【０１１２】
【表３】
【０１１３】
試料における元のエンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり３０７０ＥＵであった。エンドトキシン含有量の低減は、最大４７倍であった。
【０１１４】
結論
エンドトキシン特異的アフィニティークロマトグラフィは、ポリシアル酸とその複合体とからエンドトキシンを除去するために使用することができる。すなわち本発明者らは、ＰＳＡはカラムに結合せず、それどころか便利な形態で且つ非常に低いエンドトキシンレベルとしてＰＳＡを回収することができる一方で、エンドトキシンがカラムに結合する条件を選択することが可能であることを示した。したがってこの工程は、塩基（又は界面活性剤）処理されたＰＳＡ生成物を処理するのに有用であり得る。
【０１１５】
参考実施例３−アフィニティーカラム（セルファイン）を使用するエンドトキシン除去
この実施例は参考実施例２に類似するが、異なるエンドトキシン−除去用アフィニティーカラムを使用する。セルファインＥＴクリーンカラム（Ｓビーズ）を、カラム体積の５倍の０．２Ｍ ＮａＯＨ、２Ｍ ＮａＣｌと、その後エンドトキシンを含まない水とで洗浄することにより再生した。カラムはその後、カラム体積の５倍のエンドトキシンを含まない適切な緩衝液（ＨＥＰＥＳ緩衝液）で平衡化した。参考実施例１で生成された、ＨＥＰＥＳ緩衝液におけるコロミン酸溶液（１ｍｇ／ｍＬ）は、その後、２１℃で、１分間当たり０．１ｍＬ〜０．２ｍＬの流量でカラムに適用した。ローディングした総量は２１８μｇであった。カラムはその後１時間インキュベーションした後、溶出液をＨＥＰＥＳ緩衝液で収集した。試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。
【０１１６】
エンドトキシンレベルは、１ｍｇ当たり３０７０ＥＵから７５ＥＵまで、すなわち４０倍の量が低減した。
【０１１７】
方法は、参考実施例２パート１のために出発材料として使用したＧＣＳＦ−ＰＳＡ複合体を使用して繰り返し、エンドトキシンレベルを１ｍｇ当たり４３８ＥＵから１２．４ＥＵまで低減した。
【０１１８】
本発明者らは、セルファインカラムがＰＳＡからエンドトキシンを除去するために適切であると結論する。
【０１１９】
参考実施例４−アフィニティーカラム（ＥｎｄｏＴｒａｐ Ｒｅｄ）を使用するエンドトキシンの除去
この実施例は、エンドトキシン吸着のために別のアフィニティーカラムを使用する。ＥｎｄｏＴｒａｐ Ｒｅｄカラムを、ｐＨ７．４の脱イオン水を使用して再生及び平衡化した。エンドトキシンで汚染された、５０ｍｇ／ｍＬのコロミン酸溶液１０ｍＬを調製した。２本のカラムを直列に連結した。試料溶液をカラムにローディングし、空隙体積分（カラム体積の約１／３）を収集した。その後残存するローディング溶液を収集した。その後カラムはカラム体積の６倍の脱イオン水（ｐＨ７．４）で洗浄し、各１ｍＬの画分を収集した。コロミン酸の存在量を算出するために全ての画分についてのレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含む試料のエンドトキシン含有量を決定した。
【０１２０】
１６ｋＤａのコロミン酸についての結果は、１ｍｇ当たり５６４ＥＵから６ＥＵまでのエンドトキシンレベルの低減、すなわちおよそ９０倍の低減を示す。
【０１２１】
この手順は、国際公開第２００８／０１２５２８号パンフレットで説明される方法により製造される、エンドトキシンで汚染されたインスリン−ＰＳＡ複合体に対しても使用した。エンドトキシン含有量は、１ｍｇ当たり１１１ＥＵから１２．５ＥＵまで、すなわち９倍低減した。
【０１２２】
これらの実施例は、別のカラムがＰＳＡとその複合体とからのエンドトキシンの除去に有用であることを示す。
【０１２３】
参考実施例５−ＨＥＰＥＳ緩衝液を使用するアフィニティーカラムによるエンドトキシンの除去
Ｅｎｄｏｔｒａｐ Ｒｅｄカラム（カラム体積１ｍＬ）は、カラムと共に提供されるｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒｅｄで再生した。カラムはその後、カラム体積の５倍の、エンドトキシンを含まない適切な２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を使用して平衡化した。エンドトキシンで汚染された、ＨＥＰＥＳ緩衝液におけるＰＳＡ溶液（７５０μｇ／ｍＬ）はその後、２１℃において、１分間当たり０．１ｍＬ〜０．２ｍＬの流量で上記カラムに適用した。その後カラムは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液０．３ｍＬを使用して溶出した。試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノール／タンパク質アッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。結果は、エンドトキシンレベルがおよそ２倍〜７倍低減する場合があること、及びこれは１００％のＰＳＡ回収率が達成されるローディングレベルで使用されるＰＳＡのローディングにより影響される（カラムへのローディングレベルが低いとエンドトキシン低減はより良好になる）ことを示す。
【０１２４】
参考実施例−３０％のＩＰＡを使用する陰イオン交換カラムによるエンドトキシン、タンパク質、ＤＮＡ及び細胞片の除去
遠心分離、上清回収、透析濾過及び限外濾過により回収された、１ｍＬ当たり３５ｍｇの濃度のコロミン酸を有する発酵ブロスを調製し、そのｐＨを測定した。ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦカラムはカラム体積の１０倍の脱イオン水（ｐＨ７．４）で洗浄し、カラムはカラム体積の１０倍の２０ｍＭのＴＥＡを使用して平衡化した。試料溶液の伝導率を測定し、２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液で適当に希釈することにより緩衝溶液の伝導率と一致させた。試料溶液はその後１分間当たり１ｍＬの流速でローディングし、画分を別々に収集した。その後１ｍＬの画分を収集した。カラムはその後３０％のＩＰＡで洗浄し、各１ｍＬの洗浄画分を収集した。試料はその後１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴＥＡで溶出し、画分を収集した。試料中に存在するコロミン酸の量を算出するために溶出試料のレゾルシノールアッセイを実施し、コロミン酸を含むプールされた溶出試料のエンドトキシン含有量を決定した。初期のエンドトキシン含有量又はブロス抽出物は１ｍｇ当たり３．２×１０４ＥＵであったが最終的な含有量は１ｍｇ当たり１．８×１０３ＥＵであり、すなわちエンドトキシン含有量は１８倍低減した。
参照文献
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリシアル酸及びエンドトキシンを含有する試料の該エンドトキシン含有量を低減する方法であって、
（ｉ）ｐＫａが少なくとも１２である塩基を該試料に添加し、ｐＨが少なくとも１２である塩基性溶液を形成し、該溶液を所定の温度で所定の時間インキュベーションする工程と、
（ｉｉ）エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸を回収する工程と
の連続する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記塩基のｐＫａは少なくとも１３であり、好ましくは少なくとも１４である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩基性溶液のｐＨは少なくとも１３である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記塩基はＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２又はＬｉＯＨである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記塩基は２Ｎ ＮａＯＨである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記所定の時間は５分間〜２４時間、好ましくは３０分間〜６時間の範囲であり、且つ、前記所定の温度は０℃〜６０℃の範囲、好ましくは２℃〜４０℃の範囲である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉ）は、
（ｉｉｉ）陰イオン交換カラムに前記試料を通過させることにより、該イオン交換樹脂にポリシアル酸を吸収させる下位工程と、
（ｉｖ）前記カラムを１種類の洗浄緩衝液で洗浄することにより、前記イオン交換樹脂にポリシアル酸を吸収させたままにする下位工程と、
（ｖ）溶出緩衝液を使用して前記カラムから前記ポリシアル酸を溶出させて、エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸の生成物溶液を提供する下位工程と
の連続する下位工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）の後、工程（ｉｉ）の前に前記試料を中和する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｖ）では第１の工程においてイオン強度の低い第１の洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄して、前記カラムからエンドトキシンを溶出させ、工程（ｉｖ）で使用する溶出緩衝液は相対的に高いイオン強度を有する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記洗浄緩衝液及び／又は前記溶出緩衝液は揮発性塩基、好ましくはトリエタノールアミンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第２の洗浄緩衝液は、少なくとも０．２Ｍの濃度のＮａＣｌを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｖ）において前記カラムを２回以上洗浄する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉ）及び工程（ｉｉｉ）〜工程（ｖ）を前記生成物溶液に対して繰り返す、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）の前、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間、又は工程（ｉｉ）の後のいずれかに実施する精製であって、イオン交換クロマトグラフィと、疎水性相互作用クロマトグラフィと、アフィニティークロマトグラフィと、サイズ排除クロマトグラフィと、それらの組合せとから選択する精製によりポリシアル酸のエンドトキシンレベルを低減させる少なくとも１個のさらなる工程を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
疎水性相互作用クロマトグラフィを工程（ｉ）の前に実施する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉ）の前、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間、又は工程（ｉｉ）の後のいずれかに、界面活性剤、キレート剤、有機溶媒、酸化剤又はペルオキシダーゼと共にＰＳＡ試料をインキュベーションする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
大腸菌を発酵させて前記ＰＳＡ及びエンドトキシンを含む発酵ブロスを生成する予備工程を含み、タンパク質、脂質、核酸及び／又は栄養素を除去して前記試料を形成する中間工程を必要に応じて含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＬＡＬ試験により測定したときの前記生成物溶液中の前記ＰＳＡのエンドトキシン含有量はＰＳＡ １ｍｇ当たり２５ＥＵ以下である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法により取得することができる、エンドトキシン含有量が低減した発酵ブロス試料。
【請求項２０】
動物又はヒトへの投与に適したエンドトキシン含有量、好ましくは前記ＬＡＬ試験を使用して測定したときにＰＳＡ １ｍｇ当たり２５ＥＵ以下のエンドトキシン含有量を含む、ポリシアル酸（ＰＳＡ）試料。
【請求項２１】
エンドトキシン含有量はＰＳＡ １ｍｇ当たり５ＥＵ以下である又はそれより小さい、請求項２０に記載の試料。
【請求項２２】
前記ＰＳＡは、ポリ（２，８−結合シアル酸）、ポリ（２，９−結合シアル酸）、又は２，８−２，９−交互結合ポリシアル酸、好ましくはポリ（２，８−結合シアル酸）である、請求項２０又は２１に記載の試料。
【請求項２３】
前記ＰＳＡは、コロミン酸（ＣＡ）、又はその酸化誘導体、還元誘導体、アミノ化誘導体及び／又はヒドラジド誘導体である、請求項２２に記載の試料。
【請求項１】
ポリシアル酸及びエンドトキシンを含有する試料の該エンドトキシン含有量を低減する方法であって、
（ｉ）ｐＫａが少なくとも１２である塩基を該試料に添加し、ｐＨが少なくとも１２である塩基性溶液を形成し、該溶液を所定の温度で所定の時間インキュベーションする工程と、
（ｉｉ）エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸を回収する工程と
の連続する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記塩基のｐＫａは少なくとも１３であり、好ましくは少なくとも１４である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩基性溶液のｐＨは少なくとも１３である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記塩基はＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２又はＬｉＯＨである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記塩基は２Ｎ ＮａＯＨである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記所定の時間は５分間〜２４時間、好ましくは３０分間〜６時間の範囲であり、且つ、前記所定の温度は０℃〜６０℃の範囲、好ましくは２℃〜４０℃の範囲である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉ）は、
（ｉｉｉ）陰イオン交換カラムに前記試料を通過させることにより、該イオン交換樹脂にポリシアル酸を吸収させる下位工程と、
（ｉｖ）前記カラムを１種類の洗浄緩衝液で洗浄することにより、前記イオン交換樹脂にポリシアル酸を吸収させたままにする下位工程と、
（ｖ）溶出緩衝液を使用して前記カラムから前記ポリシアル酸を溶出させて、エンドトキシン含有量が低減したポリシアル酸の生成物溶液を提供する下位工程と
の連続する下位工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）の後、工程（ｉｉ）の前に前記試料を中和する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｖ）では第１の工程においてイオン強度の低い第１の洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄して、前記カラムからエンドトキシンを溶出させ、工程（ｉｖ）で使用する溶出緩衝液は相対的に高いイオン強度を有する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記洗浄緩衝液及び／又は前記溶出緩衝液は揮発性塩基、好ましくはトリエタノールアミンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第２の洗浄緩衝液は、少なくとも０．２Ｍの濃度のＮａＣｌを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｖ）において前記カラムを２回以上洗浄する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉ）及び工程（ｉｉｉ）〜工程（ｖ）を前記生成物溶液に対して繰り返す、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）の前、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間、又は工程（ｉｉ）の後のいずれかに実施する精製であって、イオン交換クロマトグラフィと、疎水性相互作用クロマトグラフィと、アフィニティークロマトグラフィと、サイズ排除クロマトグラフィと、それらの組合せとから選択する精製によりポリシアル酸のエンドトキシンレベルを低減させる少なくとも１個のさらなる工程を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
疎水性相互作用クロマトグラフィを工程（ｉ）の前に実施する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉ）の前、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間、又は工程（ｉｉ）の後のいずれかに、界面活性剤、キレート剤、有機溶媒、酸化剤又はペルオキシダーゼと共にＰＳＡ試料をインキュベーションする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
大腸菌を発酵させて前記ＰＳＡ及びエンドトキシンを含む発酵ブロスを生成する予備工程を含み、タンパク質、脂質、核酸及び／又は栄養素を除去して前記試料を形成する中間工程を必要に応じて含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＬＡＬ試験により測定したときの前記生成物溶液中の前記ＰＳＡのエンドトキシン含有量はＰＳＡ １ｍｇ当たり２５ＥＵ以下である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法により取得することができる、エンドトキシン含有量が低減した発酵ブロス試料。
【請求項２０】
動物又はヒトへの投与に適したエンドトキシン含有量、好ましくは前記ＬＡＬ試験を使用して測定したときにＰＳＡ １ｍｇ当たり２５ＥＵ以下のエンドトキシン含有量を含む、ポリシアル酸（ＰＳＡ）試料。
【請求項２１】
エンドトキシン含有量はＰＳＡ １ｍｇ当たり５ＥＵ以下である又はそれより小さい、請求項２０に記載の試料。
【請求項２２】
前記ＰＳＡは、ポリ（２，８−結合シアル酸）、ポリ（２，９−結合シアル酸）、又は２，８−２，９−交互結合ポリシアル酸、好ましくはポリ（２，８−結合シアル酸）である、請求項２０又は２１に記載の試料。
【請求項２３】
前記ＰＳＡは、コロミン酸（ＣＡ）、又はその酸化誘導体、還元誘導体、アミノ化誘導体及び／又はヒドラジド誘導体である、請求項２２に記載の試料。
【公表番号】特表２０１０−５２０３２０（Ｐ２０１０−５２０３２０Ａ）
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５１２７４（Ｐ２００９−５５１２７４）
【出願日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０１３８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０４８１１
【国際公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【出願人】（５０７０４２５４５）リポクセン テクノロジーズ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０１３８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０４８１１
【国際公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【出願人】（５０７０４２５４５）リポクセン テクノロジーズ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
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