ポリヌクレオチド剤を含む細胞標的化ナノ粒子およびその使用
標的細胞にポリヌクレオチドを送達するための粒子を生成する方法が開示される。該方法は、（ａ）ポリヌクレオチドを、カチオン性分子を含む組成物と接触させるステップであって、カチオン性分子は静電的相互作用によりポリヌクレオチドを凝縮して複合体を生成し、カチオン性分子はリポソームに含まれないステップと；（ｂ）約４．５以下のｐＨで、複合体を標的化部分に共有結合させて、標的細胞にポリヌクレオチド剤を送達するための粒子を生成するステップとを含む。該粒子および同粒子を含む組成物の使用も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態で、ポリヌクレオチド剤を含む細胞標的化ナノ粒子およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
大半のがんは均一ではなく、化学／放射線療法に比較的耐性の細胞の亜集団を含む。これらの細胞は、治療によって排除することができず、がん再発の原因となり得る。１つの有力な理論は、腫瘍は、正常な組織幹細胞と特性を共有する、がん幹細胞または腫瘍開始細胞（Ｔ−ＩＣ）と呼ばれる、腫瘍内のこのような珍しい薬剤耐性細胞により開始されるというものである。これらの細胞は自己再生し、試験管内および生体内の両方で無限に継代培養することができ、複数の細胞系統に分化することができる。重要なことに、これらは免疫不全マウス中の腫瘍細胞のバルクよりもはるかに悪性であり、より少ない細胞で腫瘍を形成し、この腫瘍はしばしばより転移性である。
【０００３】
全てのＴ−ＩＣの１つの共通の特徴は、ＣＤ４４の発現が高いことであり、（ＣＤ４４ｈｉｇｈ）と呼ばれる。いくつかの他のマーカー（ＣＤ１３３、ＣＤ２４ｌｏｗまたはＣＤ２４＋、ＣＤ１６６およびＥｐＣＡＭ）を有するまたは有さないＣＤ４４ｈｉｇｈは、血液および固形腫瘍、その中でも乳房腫瘍、膵腫瘍、白血病、脳腫瘍およびメラノーマ中に見られる。
【０００４】
大半のがん幹細胞は、比較的薬剤耐性で、腫瘍細胞のバルクよりも悪性である。そのため、異なる種類のがん幹細胞をうまく治療するために、この亜集団に対処する治療を開発することが不可避である。
【０００５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が哺乳類で示されたのはつい最近であるが、ヒト治療にＲＮＡｉを利用する見通しは急速に発展してきた。黄斑変性および呼吸器合胞体ウイルス感染症を治療するためのｓｉＲＮＡを使用した第１相および第２相臨床試験が促進されてきている。
【０００６】
しかしながら、これらの有望な治療の多くは、ｓｉＲＮＡを異種移植腫瘍中に局所的に注入することにより行われた。がん治療にＲＮＡｉを利用する最も大きな障害は、原発腫瘍だけでなく、潜在性転移および散在性疾患における遺伝子発現もサイレンシングするためにｓｉＲＮＡを全身送達することである。
【０００７】
全身的に白血球を標的化する粒子が開発されてきた。このような粒子は、ｓｉＲＮＡを、細胞標的化部分（抗体断片または内部移行する白血球インテグリンに対する細胞表面受容体リガンド）およびプロタミンなどのＲＮＡ結合ペプチドから構成される融合タンパク質と混合することにより形成された［Ｐｅｅｒ等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０４、４０９５〜４１００（２００７）］。ｓｉＲＮＡ融合タンパク質ナノ粒子の静脈内注射は、肺造血細胞腫瘍を特異的に標的化し、抑制する。さらに、抗インテグリン抗体で修飾した脂質ナノ粒子が、ｓｉＲＮＡを腸の炎症に関与する白血球に選択的に送達することができることが示された［Ｐｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９、６２７〜６３０（２００８）］。このプラットフォームを使用して、粒子の表面を修飾する抗体を変えることにより、異なる細胞表面受容体を標的化することができる。しかしながら、これは、がん幹細胞を標的化する能力に対処することができない極めて複雑な戦略である。
【０００８】
国際特許出願第ＷＯ２００９／０２０２７０号およびＪｉａｎｇ等［Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、第８９巻、第７号、２００８］は、ポリエチレンイミンおよびヒアルロン酸を含む組成物を使用した核酸の送達システムを教示している。この組成物は、４．５より上のｐＨで生成される。生成した粒子は、２１ｎｍの大きさで、３．６、１３．２および２４．９のゼータ電位を有していた。
【０００９】
Ｔａｅｔｚ等［Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、第１９巻、第２号、Ｅｐｕｂ Ａｐｒ ２００９］は、ヒアルロン酸に予め付着させたリポソームをｓｉＲＮＡと反応させて、がんを治療するためのリポプレックスを作成することを教示している。リポプレックスの大きさは、１００〜２００ｎｍであり、約−４０ｍＶのゼータ電位を有していた。
【００１０】
Ｓｕｒａｃｅ等［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第６巻、第４号、１０６２〜７３頁］は、ヒアルロン酸に予め付着させたリポソームを使用して、プラスミドＤＮＡと共にリポプレックスを形成することを教示している。リポプレックスは、負のゼータ電位を示し、平均直径は２５０〜３００ｎｍであった。
【００１１】
Ｈａｎ Ｓｕ−Ｅｕｎ等［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、第１７巻、第２号、２００９年２月］は、ポリエチレンイミンおよびヒアルロン酸を含む組成物を使用した核酸の送達システムを教示している。この組成物は、４．５より上のｐＨで生成される。生成した粒子は、４５〜７０ｍＶのゼータ電位を有しており、直径が約１８５ｎｍである。
【００１２】
Ｈｅｒｒｉｎｇｓｏｎ等［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、第１３９巻、第３号、２２９〜２３８頁］は、ｓｉＲＮＡの、中性ステルスリポソーム中へのカプセル化およびＣＤ４リガンドによる生着を教示している。このリポソームは、２４３ｎｍの平均直径、ならびに−１１．５ｍＶおよび−１．５ｍＶのゼータ電位を有していた。
【００１３】
Ｃｈｏｎｏ等［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、第１３１巻、第１号、２００８年１０月６日、６４〜６９頁］は、ｓｉＲＮＡを腫瘍へ全身送達するための、リポソーム、プロタミンおよびヒアルロン酸を含むナノ粒子製剤を教示している。
【００１４】
追加の背景技術としては、遺伝子送達物質としての脂質化グリコサミノグリカンの粒子の不均一集団を教示している米国特許第７５４４３７４号および米国特許出願第２００９０１５５１７８号が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際特許出願第ＷＯ２００９／０２０２７０号
【特許文献２】米国特許第７５４４３７４号
【特許文献３】米国特許出願第２００９０１５５１７８号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｐｅｅｒ等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０４、４０９５〜４１００（２００７）
【非特許文献２】Ｐｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９、６２７〜６３０（２００８）
【非特許文献３】Ｊｉａｎｇ等、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、第８９巻、第７号、２００８
【非特許文献４】Ｔａｅｔｚ等、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、第１９巻、第２号、Ｅｐｕｂ Ａｐｒ ２００９
【非特許文献５】Ｓｕｒａｃｅ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第６巻、第４号、１０６２〜７３頁
【非特許文献６】Ｈａｎ Ｓｕ−Ｅｕｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、第１７巻、第２号、２００９年２月
【非特許文献７】Ｈｅｒｒｉｎｇｓｏｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、第１３９巻、第３号、２２９〜２３８頁
【非特許文献８】Ｃｈｏｎｏ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、第１３１巻、第１号、２００８年１０月６日、６４〜６９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、
（ａ）ポリヌクレオチドを、カチオン性分子を含む組成物と接触させるステップであって、カチオン性分子は静電的相互作用によりポリヌクレオチドを凝縮して複合体を生成し、カチオン性分子はリポソームに含まれないステップと、
（ｂ）約４．５以下のｐＨで、複合体を標的化部分に共有結合させて、標的細胞にポリヌクレオチド剤を送達するための粒子を生成するステップと
を含む、標的細胞にポリヌクレオチドを送達するための粒子を生成する方法が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、本発明の方法のいずれかに従って生成される粒子が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、複数の本発明の粒子を含む組成物が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、ｓｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分を含む殻を含む粒子の実質的に均一な集団を含む組成物が提供され、粒子の集団の粒子の各々は、約−４０ｍＶのゼータ電位を含み、粒子の集団の粒子の各々は、溶液中の場合、直径が約１００〜３００ｎｍである。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、ｍｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分を含む殻を含む粒子の実質的に均一な集団を含む組成物が提供され、粒子の集団の粒子の各々は、溶液中の場合、直径が約３０〜５０ｎｍである。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、本発明の方法に従って生成される粒子を、ＣＤ４４を発現している標的細胞と接触させ、それにより標的細胞内の目的の遺伝子を下方制御するステップを含む、標的細胞内の目的の遺伝子を下方制御する方法が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、被験体に治療上有効量の本発明の方法に従って生成される粒子を投与し、それによりがんを治療するステップを含む、それを必要とする被験体のがんを治療する方法が提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチドはＤＮＡを含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチドはＲＮＡを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチドは一本鎖である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチドは二本鎖である。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチドはＲＮＡサイレンシング剤を含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群から選択される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によると、カチオン性分子は、カチオン性ポリペプチド、カチオン性脂質、カチオン性界面活性剤および合成ポリマーからなる群から選択される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によると、カチオン性脂質は、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）、ジオレオイル−１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ、１８：１；１４：０；１６：０；１８：０）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＰＣ、１２：０；１４：０；１６：０；１８：０；１８：１；１６：０〜１８：１）；１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−ジメチルアンモニウム−プロパンおよび３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロール）からなる群から選択される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、中性脂質をさらに含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によると、中性脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、アニオン性リン脂質をさらに含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によると、アニオン性リン脂質は、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールからなる群から選択される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、コレステロールをさらに含む。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によると、合成ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジンを含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によると、標的化部分は、ポリペプチド標的化部分を含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によると、標的化部分は、抗体、抗体断片、アプタマーおよび受容体リガンドからなる群から選択される。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によると、標的化部分は、グリコサミノグリカンを含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によると、グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマチン硫酸、これらの塩および混合物からなる群から選択される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によると、グリコサミノグリカンは、ＨＡを含む。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によると、本方法は、ステップ（ｂ）の前にグリコサミノグリカンを活性化するステップをさらに含む。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によると、活性化は、酸性緩衝液中でグリコサミノグリカンをインキュベートすることにより行われる。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロールおよびジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）を含む。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によると、標的化部分はＨＡを含み、ポリヌクレオチド剤はｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によると、複合体は、ステップ（ｂ）の前に押し出し成形されない。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、シリコン表面上で乾燥させると直径が約１００ｎｍである。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、シリコン表面上で乾燥させると直径が約３０ｎｍである。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、溶液中で直径が約３０〜３００ｎｍである。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、形が丸い。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、約−４０ｍＶのゼータ電位を含む。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、帯電している。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、中性である。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、ナノ粒子である。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によると、標的化部分は、ＨＡを含む。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、抗体、抗体断片、受容体リガンドおよびアプタマーからなる群から選択される少なくとも１つの追加の標的化部分をさらに含む。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、約６０００個を超えるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子を含む。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、実質的に均一である。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態によると、投与は、生体内で行われる。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によると、投与は生体外で行われる。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、発がん遺伝子の発現を下方制御するよう選択される。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、生存率と関連する遺伝子の発現を下方制御するよう選択される。
【００６６】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての専門用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および物質と類似のまたは同等のものを本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、代表的な方法および／または物質を以下に記載する。矛盾する場合には、定義を含む、特許明細書が規制する。さらに、物質、方法および例は例示的なものに過ぎず、必ずしも限定することを意図していない。
【００６７】
添付の図面および画像を参照して、単なる例として、本発明のいくつかの実施形態を本明細書に記載する。ここで、詳細に図面を具体的に参照して、示される事項は、例としてのものであり、本発明の実施形態の例示的議論を目的とするものであることを強調する。この点について、図面を伴う記載は、本発明の実施形態をどのようにして実施することができるかを当業者に明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】本発明の実施形態の粒子の表面トポグラフィーを説明する写真である。図１Ａ：酢酸緩衝液（ＡＢ）中、ＨＡとＤＯＴＡＰから作られた粒子の表面トポグラフィー。Ｈ−ｍｅｒトポグラフィーは、環境制御形走査電子顕微鏡法（Ｅ−ＳＥＭ）によりイメージ化された。粒子は、シリコン表面上で乾燥させると、個別的な球状形状であり、直径が約１００ｎｍである。
【図１Ｂ】本発明の実施形態の粒子の表面トポグラフィーを説明する写真である。図１Ｂ：ＤＤＷ（再蒸留水）中、ＨＡとＤＯＴＡＰから作られた粒子は、不定構造を有し、個別的な形状を有さない。繊維のシートにより囲まれた核粒子が存在する。
【図２Ａ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図２Ｂ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図２Ｃ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図２Ｄ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図２Ｅ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図２Ｆ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図３】本発明の実施形態の粒子を使用した白血病幹細胞におけるＣｙＤ１の選択的ノックダウンを説明する棒グラフである。
【図４】本発明の実施形態の粒子によって送達される、発がん遺伝子に対するｓｉＲＮＡの混合物を使用したがん幹細胞の根絶を説明する棒グラフである。
【図５】ｓｉＲＮＡを封入する本発明の実施形態の粒子がインターフェロン応答を誘導しないことを説明する棒グラフである。
【図６】ｍｉＲＮＡを封入する本発明の実施形態による粒子の画像である。
【図７】環境制御形走査電子顕微鏡（Ｅ−ＳＥＭ）によりイメージ化された、本発明の実施形態の粒子の表面トポグラフィーを説明する写真である。粒子は、シリコン表面上で乾燥させると、球状形状であり、直径が約１００ｎｍである。
【図８Ａ】本発明の粒子を使用した、ヒト白血病幹細胞への選択的ｓｉＲＮＡ送達を説明する写真である。図８Ａ−ｓｉＲＮＡ単独
【図８Ｂ】本発明の粒子を使用した、ヒト白血病幹細胞への選択的ｓｉＲＮＡ送達を説明する写真である。図８Ｂ−オリゴフェクトアミン（商標）
【図８Ｃ】本発明の粒子を使用した、ヒト白血病幹細胞への選択的ｓｉＲＮＡ送達を説明する写真である。図８Ｃ−本発明の実施形態による粒子。
【図９Ａ】本発明の実施形態による粒子が、ヒトＡＭＬ初代細胞にｓｉＲＮＡを送達することができることを説明する画像である。
【図９Ｂ】本発明の実施形態による粒子が、ヒトＡＭＬ初代細胞にｓｉＲＮＡを送達することができることを説明する画像である。
【図９Ｃ】本発明の実施形態による粒子が、ヒトＡＭＬ初代細胞にｓｉＲＮＡを送達することができることを説明する画像である。
【図１０】本発明の実施形態による粒子によって送達されるＣｙｃｌｉｎ Ｄ１−ｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）が、ヒト初代ＡＭＬ細胞で強力な遺伝子サイレンシングを誘導したことを説明する棒グラフである。
【図１１】ヒト卵巣腺癌細胞系（ＮＣＩ−ＡＤＲ／ＲＥＳ）中のＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）発現の減少を示すフローサイトメトリー分析の結果を説明するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本発明は、そのいくつかの実施形態で、ポリヌクレオチド剤を含む細胞標的化ナノ粒子、同粒子を生成する方法、およびその使用に関する。
【００７０】
少なくとも１つの本発明の実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明で示されるまたは実施例により例示される詳細への適用に必ずしも限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の実施形態が可能である、または種々の方法で実施もしくは実行することが可能である。
【００７１】
表面受容体ＣＤ４４を高く発現している腫瘍開始細胞（Ｔ−ＩＣ）またはがん幹細胞は、がん再発の主な原因であると考えられており、非常に化学療法耐性および放射線耐性である。全ての種類のがん細胞（がん幹細胞を含む）を選択的に標的化することができる薬物（その中でも、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ模倣体などの新規クラスの阻害剤）を送達する戦略を開発する必要がある。本発明者等は、ナノ粒子（ヒアルマー（ｈｙａｌｕｍｅｒ）またはＨ−ｍｅｒとも呼ぶ）を生成することにより、ＣＤ４４とそのリガンド、ヒアルロナン（ＨＡ）の間の相互作用を利用する戦略を発明し、それらを使用してｓｉＲＮＡをＴ−ＩＣ中に選択的に送達し、これらの細胞の根絶をもたらすことができる強力な遺伝子サイレンシングを誘導することができることを示している。
【００７２】
ナノ粒子は、電荷−電荷相互作用によりポリヌクレオチドを凝縮することができるのであれば、いかなるカチオン性分子から構成されていてもよい。
【００７３】
本発明者等は、約４．５未満のｐＨでの標的化部分（例えば、ヒアルロナン；ＨＡ）のカチオン性分子との架橋が、架橋がより高いｐＨで行われる場合によりもより均一で、より大量のポリヌクレオチド剤を封入することができるナノ粒子を生成することを発見した。この粒子を生成する方法は、本質的に１つのステップで−すなわち、ポリヌクレオチド剤の添加後、標的化部分との架橋前に粒子を小型化するためのさらなるエネルギーを必要とせずに−例えば、リポソームの生成なしに、行われた。
【００７４】
従って、本発明者等により生成されたポリヌクレオチド剤カプセル化ナノ粒子の集団は、非常に均一であることが示された（図１Ａ、６および７）。本発明の粒子はまた、ポリヌクレオチドの積荷を、ＣＤ４４表面受容体を有する細胞に選択的に送達することが示された（図３および４）。本発明の粒子は、血清分解から保護されるので、生体内治療に有用である。さらに、本発明者等は、ポリヌクレオチド剤カプセル化ナノ粒子が、インターフェロン応答を誘導しないこと−全身性ｓｉＲＮＡ適用のための安全で効率的な送達媒体の必要条件を示した（図５）。
【００７５】
従って、本発明の一態様によると、
（ａ）ポリヌクレオチド剤を、カチオン性分子を含む組成物と接触させるステップであって、カチオン性分子は静電的相互作用によりポリヌクレオチド剤を凝縮して複合体を生成し、カチオン性分子はリポソームに含まれないステップと、
（ｂ）約４．５未満のｐＨで、複合体を標的化部分に共有結合させて、標的細胞にポリヌクレオチド剤を送達するためのナノ粒子を生成するステップと
を含む、標的細胞にポリヌクレオチドを送達するためのナノ粒子を生成する方法が提供される。
【００７６】
一実施形態によると、共有結合が行われる酸性ｐＨは、約４．５、４、３．５、３、２．５またはそれより下である。
【００７７】
本明細書で使用する「カチオン性分子」という句は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性界面活性剤およびカチオン性ポリペプチドを指す。本発明のこの態様によると、カチオン性分子は、リポソームの形ではない。
【００７８】
代表的なカチオン性脂質としては、それだけに限定されないが、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）、ジオレオイル−１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ、１８：１；１４：０；１６：０；１８：０）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＰＣ、１２：０；１４：０；１６：０；１８：０；１８：１；１６：０〜１８：１）；１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−ジメチルアンモニウム−プロパンおよび３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロール）が挙げられる。
【００７９】
代表的なカチオン性ポリマーとしては、それだけに限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリ−Ｌ−リジンが挙げられる。
【００８０】
本発明のナノ粒子を生成するために使用するカチオン性分子は、本明細書中以下に記載する他の非カチオン性成分を含んでもよい。
【００８１】
特に対象となるのは、コレステロールと組み合わせて使用するカチオン性脂質である。このような化合物、特に、好ましくはコレステロールと共に１：１で使用する、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）またはＤＯＴＩＭを、ポリヌクレオチドと製剤化して、生体内毒性が比較的低い複合体を得ることができる。このように、カチオン基と適当に混合された、またはカチオン基に誘導体化されたコレステロール基は、本記載の発明の実施に特によく適している。
【００８２】
適当なコレステロール脂質のカチオン性成分は、それだけに限定されないが、アミノ基（またはオリゴもしくはポリアミン）、例えばスペルミン、スペルミジン、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）、ジエチレントリアミン、ペンタメチレンヘキサミン、ペンタプロピレンヘキサミン等、アミド基、アミジン基、正電荷のアミノ酸（例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）、イミダゾール基、グアニジウム基、またはこれらの混合物および誘導体を含む、ｐＨ５〜ｐＨ８で正電荷を保持する種々の化学基のいずれかを含むことができる。さらに、上記基のいずれかのカチオン性ポリマー（多糖類または他の化学リンカーにより結合されている）はまた、遺伝子送達で有用であると判明し、本記載の脂質複合体中に組み込むことができる。このようなポリマーを調製するために使用する架橋剤は、好ましくは生体適合性または生物学的許容性（ｂｉｏｔｏｌｅｒａｂｌｅ）であり、それぞれカチオン上で適当な化学基と結合を形成することができる少なくとも２個の化学基を一般的に含む（すなわち、架橋剤は二官能性である）。本開示のために、生体適合性という用語は、化合物が意図した用量で有意な毒性または有害な免疫学的効果を示さないことを意味し、生物学的許容性という用語は、所与の化合物に関連した有害な生物学的結果を適当な投与計画またはカウンター治療（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｔｈｅｒａｐｙ）により管理することができることを意味するだろう。リンカー基は、ホモ二官能性（同じ化学基）であっても、ヘテロ二官能性（異なる化学基）であってもよい。任意選択で、複合体からのベクターの放出を促進するために、結合基とカチオン性部分との間に形成される化学結合は、好ましくは生理的条件下で加水分解性である（すなわち、ｐＨ不安定性である、あるいは標的細胞中で切断を受けやすい）。さらに、架橋剤は、結合基間において生理的条件下で加水分解性の結合を含むことができる。
【００８３】
任意選択で、架橋剤は、分枝ポリマーの形成を可能にする追加の架橋剤と組み合わせることができる。分枝結合分子と重合架橋剤の比を変えることにより、種々の化学的特性を有するカチオン性ポリマーが製造される。
【００８４】
適当な場合には、必要に応じて、任意のまたは種々の（すなわち、混合物の）他の「ヘルパー」脂質部分を、本記載の脂質またはポリマー／ポリヌクレオチド送達媒体に添加して、複合体に所望の特性を与えることができる。このように、それだけに限定されないが、ジステアロイルホスファチジル−グリセロール（ＤＳＰＧ）、水素添加大豆、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、モノ−、ジ−およびトリアシルグリセロール、セラミド、セレブロシド、ホスファチジルグリセロール（ＨＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジラウロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＬＰＥ）、カルジオリピンなどを含むいくつかの周知のリン脂質のいずれかを添加することができる。典型的には、ヘルパーあるいは中性脂質は、ポリヌクレオチド送達複合体の脂質成分の約１５％〜約７０％、好ましくは約１５〜約６０％、より好ましくは約３０〜約６０％、およびより典型的には少なくとも約６０％、特に少なくとも約５０％を含むだろう。逆に、カチオン性脂質の割合は、好ましくは複合体の正味の脂質成分の約３０〜約７０％、より好ましくは約４０〜約６０％、特に約５０％を構成するだろう。
【００８５】
カチオン性分子を含む代表的な組成物としては、水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロールおよびジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）が挙げられる。カチオン性分子を含む別の代表的な組成物としては、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）が挙げられる。
【００８６】
組み立て中、カチオン性分子は、一般的に、所与の用途のために最適化されたカチオン／リン酸塩比でポリヌクレオチド剤と組み合わせられる。通常、ＤＮＡリン酸塩：カチオン比は、約１：８（．ｍｕ．ｇ ＤＮＡ：ｎｍｏｌ カチオン性脂質）、静脈内投与については好ましくは約２：１〜約１：１６、およびｉ．ｐ．またはエアロゾル適用については約１：１などである。
【００８７】
イオン対形成は、カチオン／ポリヌクレオチド複合体の形成で役割を果たすので、複合体形成中のｐＨは、特定の成分の相互作用を最適化または安定化するよう変えることができる。例えば、非ｐＨ感受性カチオン性脂質を使用する場合、所与のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）またはポリヌクレオチドと共に組み込む（ｃｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）ことができる他の化学薬剤を複合体形成させるために約５のような低いｐＨが好ましいだろう。さらに、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が、実質的に塩基加水分解に感受性でない場合、状況は複合体形成中に約１０までのｐＨを使用することを要求することができる。一般に、複合体形成および形質移入中、約５〜約９の範囲内のｐＨ、好ましくは約７を維持する。
【００８８】
同様に、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２等）の濃度は、複合体形成を最適化する、またはポリヌクレオチド剤送達および発現の効率を高めるよう変えることができる。さらに、カチオン性脂質がポリヌクレオチド剤と複合体形成する温度などの因子は、得られる複合体の構造的および機能的属性を最適化するよう変えることができる。さらに、複合体が形成される溶液のモル浸透圧濃度は、塩または他の賦形剤濃度を調整することにより変えることができる。
【００８９】
中程度の塩濃度は複合体形成を妨害し得るので、それだけに限定されないが、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、トレハロース、麦芽糖、マンノースなどの適当な添加剤を添加または置換することにより、モル浸透圧濃度を調整することもできる。複合体形成中に存在させることができる糖（右旋糖、ショ糖等）の量は、一般的に、約２％〜約１５％、好ましくは約３％〜約８％、より好ましくは約５％と変化するだろう。
【００９０】
あるいは、溶液のモル浸透圧濃度は、塩と糖、またはデキストラン４０、アルブミン、血清、リポタンパク質などを含む他の賦形剤の混合物により調整することもできる。当業者は、遺伝子送達の効率を最適化するためにどのように適当に塩および糖の濃度を変えたらよいか明確に分かるだろう。さらなる最適化のための出発点となり得る塩および糖の典型的な濃度は、約２５０ｍＭ（ブドウ糖）および約２５ｍＭ塩（ＮａＣｌ）である。複合体形成の追加の特徴は、温度調節である。典型的には、カチオン性脂質は、約４℃〜約６５℃、より典型的には約１０℃〜約４２℃、好ましくは約１５℃〜約３７℃、より好ましくはほぼ室温でポリヌクレオチドと複合体形成する。多くの例では、生成物のばらつきを最小化するために、複合体形成中の温度の正確な調節（例えば、＋／−１℃）が重要である。
【００９１】
「ポリヌクレオチドを凝縮する」という句は、ポリヌクレオチドによって占められる容積を減少させることを指す。本発明者等は、本発明の実施形態に従って生成される単一ナノ粒子が、６０００個までのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子を取り込むことができることを示した。
【００９２】
一実施形態によると、ポリヌクレオチドは、元の容積の２０％、元の容積の３０％、元の容積の４０％、元の容積の５０％、元の容積の６０％、元の容積の７０％、元の容積の８０％または元の容積の９０％を占めるように凝縮される。
【００９３】
複合体中のポリヌクレオチド剤としては、ＤＮＡ剤またはＲＮＡ剤が挙げられる。ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００９４】
開示の方法を使用して、抗腫瘍剤をコードする遺伝子を患者に送達することができる。例えば、免疫刺激剤、腫瘍抑制遺伝子、または腫瘍細胞の増殖、局所伸展もしくは転移拡散を妨げる遺伝子を、腫瘍細胞、ならびにそれだけに限定されないが、血管内皮細胞および免疫作動因子、および後に腫瘍に損傷を与える遺伝子を発現する調節細胞を含む、他の標的細胞に送達することができる。このような遺伝子の特定の例としては、それだけに限定されないが、アンギオスタチン、ｐ５３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、エンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ等、１９９７、Ｃｅｌｌ、８８（２）：２７７〜２８５）、ＴＩＭＰ １、ＴＩＭＰ−２、Ｂｃｌ−２およびＢＡＸが挙げられる。さらに、同様の方法論を使用して、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５６３７４８３号、Ｄｒａｎｏｆｆ等発行中に開示のものと類似のがんワクチンを生成することができる。
【００９５】
別の実施形態によると、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡサイレンシング剤を含む。本文脈では、ポリヌクレオチド剤は、標的細胞中で下方制御したい目的の遺伝子に応じて選択されることが認識されよう。
【００９６】
一実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、発がん遺伝子の発現を下方制御するよう選択される。別の実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、生存率に関連する遺伝子の発現を下方制御するよう選択される。
【００９７】
本明細書で使用する「ＲＮＡサイレンシング」という用語は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の抑制または「サイレンシング」をもたらす、ＲＮＡ分子により媒介される配列特異的調節機構のグループ（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング、コサプレッションおよび翻訳抑制）を指す。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物および真菌を含む多くの種類の生物で観察されてきた。
【００９８】
本明細書で使用する「ＲＮＡサイレンシング剤」という用語は、標的遺伝子の発現を抑制または「サイレンシング」することができるＲＮＡを指す。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後サイレンシング機構を通して、ｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（例えば、完全な翻訳および／または発現）を阻止することができる。ＲＮＡサイレンシング剤としては、非コードＲＮＡ分子、例えば対鎖を含むＲＮＡ二重鎖、ならびにこのような小さな非コードＲＮＡを生成させることができるＲＮＡ前駆体が挙げられる。代表的なＲＮＡサイレンシング剤としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなどのｄｓＲＮＡが挙げられる。一実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、翻訳抑制を媒介することができる。
【００９９】
ＲＮＡ干渉は、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。植物において対応するプロセスは、一般的に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、真菌ではクエリングとも呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を阻止するために使用される進化的に保存された細胞防御機構であると考えられており、多様な植物相および門により一般的に共有されている。このような外来遺伝子発現からの防御は、ウイルス感染、または相同性の一本鎖ＲＮＡもしくはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を通したトランスポゾン要素の宿主ゲノムへの無作為の組込みから得られる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に応じて進化したかもしれない。
【０１００】
細胞中の長鎖ｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活動を刺激する。ダイサーは、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い断片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する。ダイサーの活動により得られる短鎖干渉性ＲＮＡは、典型的には長さが約２１〜約２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対の二重鎖を含む。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する、一般的にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な領域の中央で起こる。
【０１０１】
従って、本発明は、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡの使用を意図する。
【０１０２】
一実施形態によると、ｄｓＲＮＡは、３０ｂｐを超える。長鎖ｄｓＲＮＡ（すなわち、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡ）の使用は、これらの長い領域の二本鎖ＲＮＡがインターフェロンおよびＰＫＲ応答の誘導をもたらすと考えられているために非常に制限されてきた。しかしながら、長鎖ｄｓＲＮＡの使用は、多数のｓｉＲＮＡを試験する必要性を軽減する最適なサイレンシング配列を細胞が選択することができるという点で、多数の利点をもたらすことができる；長鎖ｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに必要とされるよりも複雑性が少ないサイレンシングライブラリーを可能にするだろう；そして、おそらく最も重要なことに、長鎖ｄｓＲＮＡは、治療として使用する場合、ウイルスの逃避変異を阻止することができるだろう。
【０１０３】
種々の研究により、長鎖ｄｓＲＮＡを使用して、ストレス応答を誘導せず、または有意なオフターゲット効果を引き起こさずに遺伝子発現をサイレンシングすることができることが示されている−例えば、［Ｓｔｒａｔ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６、第３４巻、第１３号 ３８０３〜３８１０；Ｂｈａｒｇａｗａ Ａ等、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５〜１２５；Ｄｉａｌｌｏ Ｍ．等、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１〜３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３〜１４４８；Ｔｒａｎ Ｎ．等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７〜１３４］を参照されたい。
【０１０４】
特に、本発明はまた、インターフェロン経路が活性化されていない細胞（例えば、胚細胞および卵母細胞）における遺伝子サイレンシングへの長鎖ｄｓＲＮＡ（３０塩基転写産物を超える）の導入を意図する。例えば、Ｂｉｌｌｙ等、ＰＮＡＳ ２００１、第９８巻、１４４２８〜１４４３３頁およびＤｉａｌｌｏ等、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００３年１０月１日、１３（５）：３８１〜３９２．ｄｏｉ：１０．１０８９／１５４５４５７０３３２２６１７０６９を参照されたい。
【０１０５】
本発明はまた、遺伝子発現を下方制御するための、インターフェロンおよびＰＫＲ経路を誘導しないよう特異的に設計された長鎖ｄｓＲＮＡの導入を意図する。例えば、ＳｈｉｎａｇｗａおよびＩｓｈｉｉ［Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１７（１１）：１３４０〜１３４５、２００３］は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターから長鎖二本鎖ＲＮＡを発現するための、ｐＤＥＣＡＰと名付けられたベクターを開発した。ｐＤＥＣＡＰからの転写産物は、ｄｓＲＮＡの細胞質への搬出を促進する５’−キャップ構造および３’−ポリ（Ａ）テールの両方を欠くので、ｐＤＥＣＡＰからの長鎖ｄｓ−ＲＮＡは、インターフェロン応答を誘導しない。
【０１０６】
哺乳類系においてインターフェロンおよびＰＫＲ経路を避ける別の方法は、形質移入または内因性発現のいずれかを通した阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入によるものである。
【０１０７】
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する阻害的低分子ＲＮＡ二重鎖（一般的に１８〜３０塩基対）を指す。２５〜３０塩基長の化学的に合成されたＲＮＡ二重鎖は、同じ場所の２１ｍｅｒと比較して効力が１００倍も増加し得ることが最近記載されたが、典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央の１０ｂｐの二重鎖領域および末端上の対称的な２塩基の３’−オーバーハングを含む２１ｍｅｒとして化学的に合成される。ＲＮＡｉの誘引においてより長鎖のＲＮＡを使用して得られる観察される効力の増加は、産物（２１ｍｅｒ）の代わりに基質（２７ｍｅｒ）をダイサーに提供することから得られ、これがｓｉＲＮＡ二重鎖のＲＩＳＣへの侵入の速度または効率を向上させると理論づけられている。
【０１０８】
３’−オーバーハングの位置は、ｓｉＲＮＡの効力に影響し、アンチセンス鎖上に３’−オーバーハングを有する非対称的な二重鎖は、センス鎖上に３’−オーバーハングを有するものよりも一般的に強力であることが分かってきた（Ｒｏｓｅ等、２００５）。アンチセンス転写産物を標的化すると、反対の効果パターンが観察されるので、これは、ＲＩＳＣに積み込まれている非対称鎖に起因し得る。
【０１０９】
二本鎖干渉性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖を連結して、ヘアピンまたはステム−ループ構造を形成することができる（例えば、ｓｈＲＮＡ）。従って、上記のように、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。
【０１１０】
本明細書で使用する「ｓｈＲＮＡ」という用語は、相補的配列の第１および第２領域を含み、該領域の相補性および配向性の程度は該領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１および第２領域はループ領域により連結され、該ループは該ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如から生じる、ステム−ループ構造を有するＲＮＡ剤を指す。ループ中のヌクレオチドの数は、３〜２３または５〜１５または７〜１３または４〜９または９〜１１の間でありこれを含む数である。ループ中のヌクレオチドのいくつかは、ループ中の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例としては、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．等（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．等（２００２）ＲＮＡ ８：１４５４）が挙げられる。得られる単鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステム−ループまたはヘアピン構造を形成することが当業者により認識されよう。
【０１１１】
別の実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｍｉＲＮＡであり得る。「ｍｉＲＮＡ」という用語はまた、修飾ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ模倣体（アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ））を包含することが認識されよう。
【０１１２】
ｍｉＲＮＡは、種々の大きさの一次転写産物をコードする遺伝子から作られる低分子ＲＮＡである。これらは、動物および植物の両方で同定された。一次転写産物（「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」と呼ばれる）は、種々の核酸分解ステップを通してより短いｍｉＲＮＡ前駆体または「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」へプロセシングされる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、折り畳み形で存在し、その結果最終（成熟）ｍｉＲＮＡは二重鎖で存在し、この２本鎖がｍｉＲＮＡ（最終的に標的と塩基対形成する鎖）と呼ばれる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、前駆体からｍｉＲＮＡ二重鎖を取り出すダイサーの形のための基質であり、その後、ｓｉＲＮＡと同様に、二重鎖はＲＩＳＣ複合体中に取り込まれ得る。ｍｉＲＮＡは遺伝子導入で発現させることができ、一次形態全体よりもむしろ前駆体形態の発現によるのが有効であることが示された（Ｐａｒｉｚｏｔｔｏ等（２００４）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １８：２２３７〜２２４２およびＧｕｏ等（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １７：１３７６〜１３８６）。
【０１１３】
ｓｉＲＮＡとは異なり、ｍｉＲＮＡは、部分的相補性のみを有する転写産物配列と結合し（Ｚｅｎｇ等、２００２、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ ９：１３２７〜１３３３）、定常状態のＲＮＡレベルに影響を与えずに翻訳を抑制する（Ｌｅｅ等、１９９３、Ｃｅｌｌ ７５：８４３〜８５４；Ｗｉｇｈｔｍａｎ等、１９９３、Ｃｅｌｌ ７５：８５５〜８６２）。ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの両者は、ダイサーによりプロセシングされて、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体の成分と会合する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ等、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：８３４〜８３８；Ｇｒｉｓｈｏｋ等、２００１、Ｃｅｌｌ １０６：２３〜３４；Ｋｅｔｔｉｎｇ等、２００１、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：２６５４〜２６５９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ等、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：６８８９〜６８９４；Ｈａｍｍｏｎｄ等、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１１４６〜１１５０；Ｍｏｕｒｌａｔｏｓ等、２００２、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：７２０〜７２８）。最近の報告（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ等、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ ２９７：２０５６〜２０６０）は、ｍｉＲＮＡ経路対ｓｉＲＮＡ経路を通した遺伝子調節が、標的転写産物との相補性の程度によってのみ決定されるという仮説を立てている。ｍＲＮＡ標的と部分的同一性のみを有するｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ分解を誘引するよりもむしろ、ｍｉＲＮＡと同様に、翻訳抑制において機能すると推測される。
【０１１４】
本発明と共に使用するのに適したＲＮＡサイレンシング剤の合成は、以下のように行うことができる。最初に、ＡＵＧ開始コドンの下流のｍＲＮＡ配列を調査して、ＡＡジヌクレオチド配列を探す。各々のＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの出現を、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は調節タンパク質結合部位がより豊富であるので、好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位はオープンリーディングフレームから選択される。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げ得る［Ｔｕｓｃｈｌ ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９〜２４５］。しかし、５’ＵＴＲを向いたｓｉＲＮＡが細胞のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの約９０％の減少を媒介し、タンパク質レベルを完全に無効にするＧＡＰＤＨで示されているように、非翻訳領域を向いたｓｉＲＮＡも有効であることが認識されよう（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）。
【０１１５】
第２に、ＮＣＢＩサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェアなどの任意の配列アラインメントソフトウェアを使用して、潜在的な標的部位を、適当なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラット等）と比較する。他のコード配列と有意な相同性を示す推定上の標的部位を取り除く。
【０１１６】
限定的な標的配列を、ｓｉＲＮＡ合成のための鋳型として選択する。Ｇ／Ｃ含量が低い配列は、５５％より高いＧ／Ｃ含量を有する配列と比較して遺伝子サイレンシングの媒介においてより有効であると判明したので、好ましい配列は、Ｇ／Ｃ含量が低い配列である。好ましくは、いくつかの標的部位を、評価のために標的遺伝子の長さに沿って選択する。選択されたｓｉＲＮＡをより良く評価するために、好ましくは陰性対照を組み合わせて使用する。陰性対照ｓｉＲＮＡは、好ましくはｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムとの有意な相同性を欠く。従って、他の任意の遺伝子と有意な相同性を示さないのであれば、好ましくはスクランブルヌクレオチド配列のｓｉＲＮＡを使用する。
【０１１７】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡのみを含む分子に限定する必要はなく、化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含することが認識されよう。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するＲＮＡサイレンシング剤は、「細胞透過性ペプチド」と機能的に関連し得る。本明細書で使用する「細胞透過性ペプチド」は、細胞の形質膜および／または核膜を横切る膜透過性複合体の輸送に関連するエネルギー非依存的（すなわち、非エンドサイトーシスの）移行特性を与える、短い（約１２〜３０個の残基）アミノ酸配列または機能モチーフを含むペプチドである。本発明の膜透過性複合体に使用する細胞透過性ペプチドは、好ましくは、遊離の、またはジスルフィド結合のために修飾された二本鎖リボ核酸とジスルフィド結合を形成するよう誘導体化された、少なくとも１個の非機能的システイン残基を含む。このような特性を与える代表的なアミノ酸モチーフは、その内容が参照により本明細書に特別に組み込まれる、米国特許第６３４８１８５号に列挙される。本発明の細胞透過性ペプチドとしては、好ましくは、それだけに限定されないが、ペネトラチン、トランスポータン、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８〜６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳおよびＭＡＰが挙げられる。
【０１１９】
ＲＮＡサイレンシング剤を使用して標的化されるｍＲＮＡとしては、それだけに限定されないが、その発現が望ましくない表現型形質と相関するものが挙げられる。標的化することができる代表的なｍＲＮＡは、切断型タンパク質をコードするものである、すなわち欠失を含む。従って、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、欠失のいずれかの側の架橋領域を標的化することができる。このようなＲＮＡサイレンシング剤の細胞への導入は、変異タンパク質の下方制御をもたらす一方で、非変異タンパク質は影響されないままにしておく。
【０１２０】
従って、がん、リウマチ性関節炎およびウイルスに関連する遺伝子が標的化され得る。がん関連遺伝子としては、発がん遺伝子（例えば、Ｋ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−ｆｏｓおよびｃｅｒｂ−Ｂ）、増殖因子遺伝子（例えば、上皮増殖因子およびその受容体、繊維芽細胞増殖因子結合タンパク質をコードする遺伝子）、マトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子（例えば、ＭＭＰ−９をコードする遺伝子）、接着分子遺伝子（例えば、ＶＬＡ−６インテグリンをコードする遺伝子）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｂｃｌ−２およびｂｃｌ−Ｘ１）、血管新生遺伝子ならびに転移遺伝子が挙げられる。リウマチ性関節炎関連遺伝子としては、例えば、ストロメリシンおよび腫瘍壊死因子をコードする遺伝子が挙げられる。ウイルス遺伝子としては、ヒトパピローマウイルス遺伝子（例えば、子宮頸がんに関連する）、Ｂ型およびＣ型肝炎遺伝子、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）遺伝子（例えば、網膜炎に関連する）が挙げられる。これらの疾患に関連する多数の他の遺伝子またはその他の遺伝子も標的化することができるだろう。
【０１２１】
目的の遺伝子を効率的に下方制御するために使用することができるアンチセンス分子の設計は、アンチセンスアプローチに重要な２つの側面を考慮しながら行わなければならない。第１の側面は、適当な細胞の細胞質中へのオリゴヌクレオチドの送達であり、第２の側面は、その翻訳を抑制する方法で細胞中の所定のｍＲＮＡと特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
【０１２２】
従来技術は、多種多様な細胞型中にオリゴヌクレオチドを効率的に送達するために使用することができるいくつかの送達戦略を教示している［例えば、Ｌｕｆｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６：７５〜６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ等、Ｂｌｏｏｄ ９１：８５２〜６２（１９９８）；Ｒａｊｕｒ等、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ８：９３５〜４０（１９９７）；Ｌａｖｉｇｎｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３７：５６６〜７１（１９９７）；Ａｏｋｉ等（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３１：５４０〜５（１９９７）およびＰｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８、３１９（５８６３）：６２７〜３０参照］。
【０１２３】
さらに、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方における構造的変化のエネルギー性を説明する熱力学サイクルに基づく、その標的ｍＲＮＡに対する最も高い予測結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムも利用可能である［例えば、Ｗａｌｔｏｎ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：１〜９（１９９９）参照］。
【０１２４】
このようなアルゴリズムは、細胞におけるアンチセンスアプローチを実施するためにうまく使用されてきた。例えば、Ｗａｌｔｏｎ等により開発されたアルゴリズムは、科学者がウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）およびマウス腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）転写産物のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドをうまく設計することを可能にした。同じ研究グループは、動力学的ＰＣＲ技術により評価される、細胞培養における３種のモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸脱水素酵素ＡおよびＢ、ならびにラットｇｐ１３０）に対して合理的に選択されるオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性が、リン酸ジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化学を含む２種の細胞型における３種の異なる標的に対する試験を含むほぼ全ての場合で有効であると判明したとさらに最近報告した。
【０１２５】
さらに、試験管内系を使用する特定のオリゴヌクレオチドの効率を設計および予測するためのいくつかのアプローチも公開された［Ｍａｔｖｅｅｖａ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１３７４〜１３７５（１９９８）］。
【０１２６】
本記載のカチオン性脂質／ポリヌクレオチドまたはカチオン性ポリマー／ポリヌクレオチド複合体は、特定の範囲の大きさを有する安定な小胞に製剤化することができるので、複合体を特定の細胞および／または組織に向けるために、標的化剤を複合体に付着させる（共有結合させる）ことができる。従って、標的化部分または標的化部分の組み合わせを複合体上に付着させることができる。
【０１２７】
本発明のこの態様によると、標的化部分は、酸性条件下で、複合体形成または単離後、複合体と共有結合する。このように、標的化剤が細胞表面上の分子を認識する、または細胞表面上の分子により認識されることが可能である程度まで、標的化剤は、複合体を細胞表面と効果的に密接に接触させるブリッジ分子として働くことができる。
【０１２８】
本発明者等は、４．５未満のｐＨでの標的化部分（例えば、ヒアルロナン；ＨＡ）のカチオン性分子への添加が、より高ｐＨで架橋が行われる場合よりも、均一であり、大量のポリヌクレオチド剤を封入することができるナノ粒子を生成することを発見した。一態様によると、共有結合が行われる酸性ｐＨは、約４．５、４、３．５、３、２．５またはそれより下である。
【０１２９】
本開示のために、「標的化部分」という用語は、複合体に組み込むことができる任意のおよび全てのリガンドまたはリガンド受容体を指す。このようなリガンドとしては、それだけに限定されないが、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤなどの抗体、またはその任意の部分もしくはサブセット、細胞因子、インテグリン、プロテオグリカン、シアル酸残基等などの細胞表面受容体およびそのリガンド、ＭＨＣもしくはＨＬＡマーカー、ウイルス外被タンパク質、ペプチドもしくは小さな有機リガンド、これらの誘導体などが挙げられる。
【０１３０】
標的遺伝子送達用途のために特に対象となるのは、種々の細胞表面マーカーおよび受容体をコードするタンパク質である。このようなタンパク質の代表的なものである簡単な一覧としては、それだけに限定されないが、ＣＤ１（ａ〜ｃ）、ＣＤ４、ＣＤ８〜１１（ａ〜ｃ）、ＣＤ１５、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ２１〜２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０〜４５（Ｒ（Ｏ、Ａ、およびＢ））、ＣＤ４６〜４８、ＣＤｗ４９（ｂ、ｄ、ｆ）、ＣＤｗ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５３〜５４、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１〜６４、ＣＤｗ６５、ＣＤ６６〜６９、ＣＤｗ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３〜７４、ＣＤｗ７５、ＣＤ７６〜７７、ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２、ならびにＴ−細胞受容体、インテグリン受容体、増殖性内皮のエンドグリン、またはこれに対する抗体が挙げられる。
【０１３１】
特定の実施形態によると、標的化部分は、それだけに限定されないが、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマチン硫酸、これらの塩および混合物を含むグリコサミノグリカンである。
【０１３２】
グリコサミノグリカンの場合、典型的には、これらの分子は、本発明のナノ粒子への組込みの前に活性化している。グリコサミノグリカンを活性化する代表的な方法は、実施例１および２に記載のように、酸性緩衝液中でこれらをインキュベートすることによる。
【０１３３】
このように、内皮細胞、幹細胞、がん幹細胞、生殖系細胞、上皮細胞、島、ニューロンまたは神経組織、中皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要な腺または器官（例えば、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、皮膚等）の細胞、外分泌および／または内分泌細胞などの種々の細胞のいずれかを遺伝子送達のために標的化することができる。
【０１３４】
標的化部分の付着後、適当なリガンドもしくは抗体、またはこれらの混合物を、適当な固体担体、すなわちラテックスビーズ、マイクロキャリアビーズ、膜またはフィルターなどに付着させ、調製物の残部から標的化受容体もしくはリガンドを組み込むナノ粒子を選択的に結合および単離するために使用することができる。従って、使用前に所望のポリヌクレオチド複合体を単離する方法が提供される。
【０１３５】
本明細書で使用する「ナノ粒子」という用語は、個々の原子と巨視的なバルク固体との間の中間の大きさを有する粒子（単数または複数）を指す。一般に、ナノ粒子は、μｍ未満の範囲の、例えば、約１ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、または１０ｎｍ程度、例えば約１ｎｍ〜約１００ｎｍの特有の大きさ（例えば、概して球状のナノ粒子については直径、または概して細長いナノ粒子については長さ）を有する。他の代表的な大きさとしては、約３０ｎｍ〜２５０ｎｍまたは約５０ｎｍ〜３００ｎｍが挙げられる。
【０１３６】
粒子の大きさを測定する方法は、当技術分野で既知であり、本明細書の以下の実施例の節でさらに記載する。
【０１３７】
ナノ粒子は、それだけに限定されないが、ナノワイヤーなどの細長い粒子形状、または概して球状、六角形および立方体のナノ粒子などのより規則的な形状に加えて、不規則な形状を含む任意の形状であってよい。一実施形態によると、ナノ粒子は、概して球状である。
【０１３８】
丸い形の粒子は、典型的には、特定の幾何学的形状の完全な球形からの偏差を一般的に定量化する真球度として知られる幾何学量により定量的に特徴づけられる。
【０１３９】
理想的には、三次元物体の真球度は、物体の容積を物体に外接する球の容積で割ることにより計算される。しかしながら、いくつかの物体については、容積の決定が困難であり、しばしば不可能である。そのため、実用的な理由で、真球度の代替「二次元」定義を使用する。この代替法によると、真球度は、ある基準面上の物体の投影の面積と投影に外接する円の面積との間の比と定義される。例えば、平面ディスプレイ上に物体の像を表示すると考えると、平面ディスプレイを基準面とみなすことができ、物体の像を基準面上の物体の投影とみなすことができる。
【０１４０】
従って、像の面積をＡ、像の周囲長をＰで表すと、真球度、ｓは、ｓ＝４πＡ／Ｐ２と定義することができる。当業者により認識されるように、像が完全な円である場合、Ａ＝π（Ｐ／２π）２＝Ｐ２／４πでｓ＝１である。像の面積が０である（すなわち、像が線または曲線である）場合、ｓ＝０である。
【０１４１】
特に定義しない限り、本明細書で使用する「真球度」は、二次元真球度を指す。
【０１４２】
多くの粒子（例えば１０以上）または多くの異なる基準面に対して計算し、平均すれば、「二次元」真球度は、良い近似で、「三次元」真球度（容積の比）に相当すると認識される。このような事象では、「二次元」真球度、ｓから始めて、「三次元」真球度をｓ２の立方根と定義することができる。
【０１４３】
本発明の好ましい実施形態によると、粒子の真球度は、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％である。
【０１４４】
本発明のナノ粒子のゼータ電位は、−１０〜−７５ｍＶ、より好ましくは−２５〜−５０ｍＶに及び得る。従って、本発明のナノ粒子は、負に帯電し得る。
【０１４５】
本発明の方法に従って生成される粒子は、実質的に均一である、すなわち、全て均一な形状および大きさである。一実施形態によると、ナノ粒子集団は、集団の平均的なナノ粒子の大きさから５％、１０％、２０％または３０％超異なるナノ粒子を含まない。
【０１４６】
本発明により意図される代表的な粒子の均一集団は、以下の通りである：
ｓｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分（例えば、ＨＡ）を含む殻を含む粒子であって、
粒子の集団の粒子の各々は、約−４０ｍＶのゼータ電位を含み、粒子の集団の粒子の各々は、溶液中の場合、直径が約１００〜３００ｎｍである。
【０１４７】
本発明により意図される別の代表的な粒子の均一集団は、以下の通りである：
ｍｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分（例えば、ＨＡ）を含む殻を含む粒子であって、
粒子の集団の粒子の各々は、溶液中の場合、直径が約３０〜５０ｎｍである。
【０１４８】
上記のように、本発明の粒子は、標的がん細胞および／またはがん幹細胞を標的化するように、設計することができる。
【０１４９】
従って、本発明の別の態様によると、被験体に治療上有効量の本明細書に記載の方法に従って生成される粒子を投与し、それによりがんを治療するステップを含む、それを必要とする被験体のがんを治療する方法が提供される。
【０１５０】
本明細書で使用する「がん」という用語は、発がん性形質転換細胞の増殖から生じる疾患または障害を指す。
【０１５１】
本発明により治療することができる代表的ながんとしては、それだけに限定されないが、消化管の腫瘍（結腸がん、直腸がん、肛門がん、直腸結腸がん、小および／または大腸がん、食道がん、胃がん、膵がん、胃がん、小腸がん、小腸に生じる腺がん、小腸に生じるカルチノイド腫瘍、小腸に生じるリンパ腫、小腸に生じる間葉腫、消化管間質腫瘍）、胆嚢癌、胆道腫瘍、前立腺がん、腎臓（腎）がん（例えば、ウィルムス腫瘍）、肝がん（例えば、肝芽腫、肝細胞癌）、肝胆道がん、胆樹がん、胆嚢の腫瘍、膀胱がん、胎児性横紋筋肉腫、胚細胞腫瘍、絨毛性腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣の未熟奇形腫、子宮腫瘍、上皮性卵巣腫瘍、仙尾骨腫瘍、絨毛癌、胎盤部トロホブラスト腫瘍、上皮成人型腫瘍、卵巣がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、肺がん（例えば、小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、鼻咽頭がん、乳がん、扁平上皮癌（例えば、頭頸部中）、神経原性腫瘍、星細胞腫、神経節芽腫、神経芽細胞腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胸腺リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫）、神経膠腫、甲状腺髄様癌、精巣がん、脳および頭／頸部がん、婦人科がん、子宮内膜がん、胚細胞腫瘍、間葉腫、神経原性腫瘍、膀胱がん、尿管がん、腎盂がん、尿道がん、陰茎がん、精巣がん、子宮体がん、子宮内膜癌、子宮肉腫、腹膜癌および卵管癌、卵巣の胚細胞腫瘍、性索間質腫瘍、内分泌系がん、甲状腺腫瘍、甲状腺髄様癌、甲状腺リンパ腫、副甲状腺腫瘍、副腎腫瘍、膵内分泌腫瘍、軟組織および骨の肉腫、良性および悪性中皮腫、悪性腹膜中皮腫、精巣鞘膜の悪性中皮腫、心膜の悪性中皮腫、皮膚がん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、中枢神経系の新生物、髄芽腫、髄膜腫、末梢神経腫瘍、松果体領域の腫瘍、下垂体腺腫、頭蓋咽頭腫、聴神経腫、頸静脈グロムス腫瘍、脊索腫および軟骨肉腫、血管芽腫、脈絡叢乳頭腫および癌、脊髄軸腫瘍、白血病、ならびに慢性白血病が挙げられる。
【０１５２】
「被験体」という用語は、動物、典型的にはヒトを含む哺乳類を指す。
【０１５３】
本発明の粒子は、それ自体で、または適当な担体もしくは添加剤と混合した医薬組成物で被験体に投与することができる。
【０１５４】
本明細書で使用する「医薬組成物」は、生理学的に適当な担体および添加剤などの他の化学成分を含む、本明細書に記載の１つまたは複数の有効成分の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を促進することである。
【０１５５】
本明細書で、「有効成分」という用語は、生物学的効果を説明できるポリヌクレオチド剤を含む粒子を指す。
【０１５６】
以降、互換的に使用することができる「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という句は、生物に対する有意な刺激をもたらさず、投与する化合物の生物活性および特性を抑止しない担体または賦形剤を指す。アジュバントはこれらの句に含まれる。
【０１５７】
本明細書で、「添加剤」という用語は、有効成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加する不活性物質を指す。それだけに限定されないが、添加剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々の種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１５８】
薬物の処方および投与についての技術は、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版中に見つけることができる。
【０１５９】
投与の適当な経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸または非経口送達、例えば筋肉内、皮下および髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射が挙げられる。
【０１６０】
あるいは、例えば、医薬組成物を患者の組織領域中へ直接注射することにより、全身的というよりもむしろ局所的に医薬組成物を投与することができる。
【０１６１】
従って、本発明による使用のための医薬組成物は、薬学的に使用することができる製剤中への有効成分の加工を促進する添加剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用する従来の方法で製剤化することができる。適当な処方は、選択する投与経路に依存する。
【０１６２】
注射のために、医薬組成物の有効成分を、水溶液、好ましくはハンクス液、リンガー液または生理的塩緩衝液などの生理的適合性緩衝液中で製剤化することができる。経粘膜投与のために、透過する障壁に適した透過剤を製剤中に使用する。このような透過剤は当技術分野で既知である。
【０１６３】
経口投与のために、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と結合させることにより、医薬組成物を容易に製剤化することができる。このような担体は、医薬組成物が、患者による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに製剤化されることを可能にする。経口的に使用するための医薬調製物は、固体添加剤を使用して、必要に応じて、所望であれば適当な補助剤を加えた後に、その結果得られる混合物をすりつぶし、この顆粒の混合物を加工することによって、錠剤または糖衣錠の核を得ることにより作ることができる。適当な添加剤は、特に、乳糖、ショ糖、マンニトールもしくはソルビトールを含む糖；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマーなどの増量剤である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天もしくはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのこれらの塩などの崩壊剤を添加してもよい。
【０１６４】
経口的に使用することができる医薬組成物としては、ゼラチンで作られた硬カプセル剤（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ ｃａｐｓｕｌｅ）ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から作られた軟カプセル剤（ｓｏｆｔ，ｓｅａｌｅｄ ｃａｐｓｕｌｅ）が挙げられる。硬カプセル剤は、乳糖などの増量剤、デンプンなどの結合剤、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意で安定剤と混合した有効成分を含み得る。軟カプセル剤では、有効成分は、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与のための全ての製剤は、選択する投与経路に適した投与量とすべきである。
【０１６５】
頬側投与のために、組成物は、従来の方法で製剤化される錠剤またはロゼンジ剤の形をとってもよい。
【０１６６】
鼻吸入による投与のために、本発明による使用のための有効成分は、適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を使用して、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するバルブを供給することにより、決定することができる。ディスペンサーで使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物および乳糖もしくはデンプンなどの適当な粉末基剤を含んで製剤化することができる。
【０１６７】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えばボーラス注射または持続点滴による、非経口投与のために製剤化することができる。注射のための製剤は、任意で追加の保存剤を含む、例えばアンプル中の単位剤形で、または多用量容器で提供され得る。組成物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性媒体中のエマルジョンであってよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。
【０１６８】
あるいは、有効成分は、使用前に、適当な媒体、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水をベースとする溶液により構成するための粉末形態であってもよい。
【０１６９】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使用して、坐剤または保持浣腸剤などの直腸用組成物に製剤化することもできる。
【０１７０】
本発明の文脈中での使用に適した医薬組成物は、有効成分が所期の目的を達成するために有効な量含まれている組成物を含む。より具体的には、治療上有効量とは、障害（例えば、がん）の症状を予防、軽減もしくは寛解させる、または治療されている被験体の生存を延長するのに有効な有効成分（粒子組成物）の量を意味する。
【０１７１】
治療上有効量の決定は、特に、本明細書で提供される詳細な開示に照らして、十分当業者の能力の範囲内にある。
【０１７２】
本発明の方法で使用される任意の調製物のために、治療上有効量または用量を、最初に試験管内および細胞培養試験から推定することができる。例えば、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルで用量を策定することができる。このような情報を使用して、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１７３】
本明細書に記載の有効成分の毒性および治療効果は、試験管内、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順により決定することができる。これらの試験管内および細胞培養試験ならびに動物研究から得られるデータを、ヒトに使用するための投与量の範囲を策定するのに使用することができる。投与量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じて変化し得る。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ等、１９７５、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、１章、１頁中参照）。
【０１７４】
投与量および投与間隔は、生物学的効果を誘導するもしくは抑制するのに十分な有効成分の血漿または脳レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）をもたらすよう個々に調整することができる。ＭＥＣは各々の調製物について変化するが、試験管内データから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個体形質および投与経路に依存する。検出試験を使用して、血漿濃度を決定することができる。
【０１７５】
治療する状態の重症度および応答性に応じて、投与は単回投与または複数回投与とすることができ、治療クールは数日間から数週間、または治癒がもたらされるまでもしくは疾患状態の減少が達成されるまで続く。
【０１７６】
投与する組成物の量は、当然、治療する被験体、苦痛の重症度、投与方法、処方する医師の判断等に依存する。
【０１７７】
本発明の組成物は、所望であれば、有効成分を含む単一または複数単位剤形を含み得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサー装置で提供され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含んでよい。パックまたはディスペンサー装置は、投与説明書を伴ってよい。パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形態の容器と付随した通知を収容してもよく、この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の機関による承認を反映している。例えば、このような通知は、処方薬についての米国食品医薬品局により承認されたラベリングまたは承認された製品添付文書であり得る。適合性の医薬担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物はまた、適当な容器中に調製し、配置し、上でさらに詳述したように、示された状態の治療についてラベルされ得る。
【０１７８】
本明細書で使用する「方法」という用語は、それだけに限定されないが、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の専門家に知られている、またはこれらの専門家により既知の様式、手段、技術および手順から容易に発展される様式、手段、技術および手順を含む、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を指す。
【０１７９】
本明細書で使用する「治療する」という用語は、状態の進行を抑止する、実質的に抑制する、遅らせる、もしくは逆行させる、状態の臨床的もしくは審美的症状を実質的に寛解させる、または状態の臨床的もしくは審美的症状の出現を実質的に予防することを含む。
【０１８０】
本明細書で使用する「約」という用語は、±５％を指す。
【０１８１】
本出願の至る所で、本発明の種々の実施形態は範囲形式で与えられ得る。範囲形式の記載は単なる便宜上および簡潔のためのものであることを理解すべきであり、本発明の範囲に対する変更できない制限と解釈すべきではない。従って、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値を含むと考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等などの具体的に開示される部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５および６を含むと考えるべきである。範囲の幅にかかわらずこれを適用する。
【０１８２】
本明細書で数値範囲を示す場合はいつでも、示される範囲内の任意の言及された数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１指示数と第２指示数「の間に及ぶ」および第１指示数「から」第２指示数「まで及ぶ」という句は、本明細書で互換的に使用され、第１および第２指示数、ならびにその間の全ての分数および整数を含むことになっている。明確にするために、別の実施形態の文脈中で記載されている本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態中で、組み合わせで提供され得ることが認識される。逆に、簡潔のために単一の実施形態の文脈中で記載されている本発明の種々の特徴はまた、本発明の他の任意の記載された実施形態中で、別々に、または任意の適当な部分的組み合わせで、または適当に提供され得る。種々の実施形態の文脈中で記載される特定の特徴は、実施形態がこれらの要素なしで実施不能でない限り、これらの実施形態の必須の特徴であると考えるべきではない。
【０１８３】
上で叙述され、以下の特許請求の範囲の節で請求される、本発明の種々の実施形態および態様は、以下の実施例中に実験的裏付けを見出す。
実施例
【０１８４】
ここで、上記記載と共に非限定的な様式で本発明のいくつかの実施形態を説明する以下の実施例を参照する。
【０１８５】
一般に、本明細書で使用する命名法および本発明で利用する実験手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編、（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ等、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ等、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ等（編）「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４６６６８２８号；第４６８３２０２号；第４８０１５３１号；第５１９２６５９号および第５２７２０５７号に示される方法論；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｉｔｅｓ等（編）、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能な免疫学的測定法は、特許および科学文献に広範に記載されており、例えば、米国特許第３７９１９３２号；第３８３９１５３号；第３８５０７５２号；第３８５０５７８号；第３８５３９８７号；第３８６７５１７号；第３８７９２６２号；第３９０１６５４号；第３９３５０７４号；第３９８４５３３号；第３９９６３４５号；第４０３４０７４号；第４０９８８７６号；第４８７９２１９号；第５０１１７７１号および第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ等、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；を参照されたい。これらの全ては、本明細書に完全に示されるように、参照により組み込まれている。他の一般的な参考文献は、本文書の至る所で提供される。これらの文献中の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。これらの文献に含まれる全ての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１
ＤＯＴＡＰをベースとする粒子
材料および方法
【０１８６】
脂質（ＤＯＴＡＰおよびコレステロール）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、米国）から購入し；ＨＳＰＣはＬＩＰＯＩＤ、Ｇｅｒｍａｎｙ Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）から購入し；ヒト組換えプロタミン（Ａｂｎｏｖａ製）；直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）はＳｉｇｍａから購入した。ヒアルロナン、Ｍｗ７５１ＫＤａ、固有粘度：１６ｄＬ／ｇ（Ｇｅｎｚｙｍｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）；ＦＩＴＣ−ＨＡはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ドイツ）から入手した。Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡはＱｉａｇｅｎから入手し；非標識（サイクリンＤ１、ＲＡＳ、ＨＭＧＡもしくはＭＹＣに対して標的特異的なまたはスクランブル）ｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎから入手した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）；ホウ酸およびホウ砂（四ホウ酸ナトリウム十水和物）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から購入した。３Ｈ−ＨＡはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から購入した。細胞培養プレートはＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）から入手した。細胞培養のための材料は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃｏ．（Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ）から入手した。透析管（１２０００〜１４０００の分子量カットオフ）は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｓ、ＣＡ）から購入した。ポリカーボネート膜はＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）から購入した。他の全ての試薬は、分析用とした。
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ模倣体（アンタゴｍｉｒ）の調製：
【０１８７】
Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡスクランブル配列は、Ｑｉａｇｅｎ製とした。サイクリンＤ１ｓｉＲＮＡおよび陰性対照ｓｉＲＮＡ（スクランブル配列）は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入し、以前に報告された［Ｐｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９、６２７〜６３０（２００８）］。ＲＡＳ、ＨＭＧＡ２またはＭＹＣ ｓｉＲＮＡは、以前公開されたものであり［Ｙｕ等、Ｃｅｌｌ １３１、１１０９〜１１２３（２００７）］、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。
ｓｉＲＮＡをカプセル化したＨ−ｍｅｒ（ヒアルロン酸被覆ナノ粒子）の調製−方法１
【０１８８】
ＤＯＴＡＰをベースとする粒子の調製：５ｍｇ／ｍＬの脂質濃度で４５：３３：２２のモル比の水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロールおよびジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を、伝統的な脂質−フィルム法により調製した［Ｐｅｅｒ，Ｄ．等 Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １６１２、７６〜８２（２００３）；Ｐｅｅｒ，Ｄ．＆Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｒ． Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３８３、１８５〜１９０（２０００）］。手短に言えば、脂質を６０℃で２０分間エタノールに溶解し、次いで、ロータリーエバポレーター（Ｂｕｃｈｉ、スイス）中減圧下で蒸発乾固した。次いで、薄い脂質フィルムを、ｐＨ７．４で、緩衝液のみ（ＰＢＳ）からなる膨潤溶液により水和した。この後、ボルテックス装置を使用して大規模に攪拌し、３７℃の振盪恒温槽中で２時間インキュベートした。小単層小胞（ＳＵＶ）を、６０℃で２００〜５００ｐｓｉの窒素圧下、Ｌｉｐｅｘ押出装置を操作して、ＭＬＶの押し出し成形により得た。押し出し成形は、最終的な大きさが直径３０ｎｍになるまで、１孔径当たり数サイクルを使用して、次第により小さい孔径膜を使用する段階で行った。ストックの１：１０００希釈（すなわち、５μｇ／ｍＬ）の粒度分布は、直径２５±４ｎｍでゼータ電位＋７２．３±６．１ｍＶであった。
【０１８９】
オリゴフェクトアミン（商標）、ＰＥＩ（商標）およびプロタミン複合体の調製：オリゴフェクトアミンまたはＰＥＩ複合体の調製を、これらの製造業者により推奨されるように行った。手短に言えば、ｓｉＲＮＡ６０ｐｍｏｌを、血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）血清使用量低減培地５０μｌ中に希釈し、穏やかに混合した。分枝ＰＥＩまたはオリゴフェクトアミンを希釈した（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地１２μｌ中に３μｌ）。これを穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。希釈ｓｉＲＮＡを希釈オリゴフェクトアミン（商標）と合わせて（総容積は６８μｌである）、穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートして、ｓｉＲＮＡ：オリゴフェクトアミン複合体を形成させた。プロタミン（ヒト組換え体）については、同じプロトコルを使用したが、プロタミンとｓｉＲＮＡの比は５：１のモル比とした。（プロタミンの管をｓｉＲＮＡの管に添加して複合体を生成した）。
【０１９０】
活性化ヒアルロン酸（ＨＡ）酢酸塩の調製：活性化ＨＡ８ｍｇをガラスバイアルに量り入れ、０．１Ｍ ｐＨ４．０（１ｍｇ／ｍｌ）酢酸緩衝液８ｍｌに溶解した。ＨＡが完全に溶解するまで、混合物を３７℃で数分間攪拌した。ＥＤＣを過剰に４０ｍｇ添加した（５ｍｇ ＥＤＣ／ｍｇ ＨＡ）。溶液を３７℃で２時間攪拌した。
【０１９１】
脂質−ｓｉＲＮＡ懸濁液の調製：粒子（５μｌ／ｍＬ）３μｌを、ＤＭＥＭ１２μｌに添加した。懸濁液を穏やかに攪拌し、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ（１００μＭ、３００ｐｍｏｌ）３μｌをＤＭＥＭ５０μｌに添加した。溶液を穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。粒子溶液をｓｉＲＮＡ溶液に添加し、穏やかに攪拌しながら室温で２０分間インキュベートした。
【０１９２】
ヒアルマーの組み立て（２４ウェルプレートの１ウェル当たり）：活性化ＨＡ（１：５ｖ／ｖ（ＨＡ：複合体）の比）１３．６μｌを、脂質−ｓｉＲＮＡ複合体６８μｌに添加し、穏やかに攪拌しながら３７℃で２時間インキュベートした。ＤＭＥＭ１８．３μｌを添加して最終容積１００μｌ（１ウェル当たり）とした。ｐＨをｐＨ７．０〜７．４に修正した。
【０１９３】
５ｍｇ／ｍｌ粒子および０．３μｍｏｌまでを使用して、この系を１０００倍スケールアップした。
ｓｉＲＮＡをカプセル化したＨ−ｍｅｒ（ヒアルロン酸被覆ナノ粒子）の調製−方法２
【０１９４】
ＤＯＴＡＰをベースとする粒子の調製：本明細書上記の通りである。
【０１９５】
ＤＤＷ活性化ＨＡの調製：ＨＡ８ｍｇをガラスバイアルに量り入れ、ＤＤＷ（１ｍｇ／ｍｌ）８ｍｌに溶解した。ＨＡが完全に溶解するまで、これを３７℃で数分間攪拌した。ＥＤＣを過剰に４０ｍｇ添加した（５ｍｇ ＥＤＣ／ｍｇ ＨＡ）。溶液を３７℃で２時間攪拌した。
【０１９６】
脂質−ｓｉＲＮＡ懸濁液の調製：本明細書上記の通りである。
【０１９７】
ヒアルマーの組み立て（２４ウェルプレートの１ウェル当たり）：本明細書上記の通りである。
【０１９８】
この系を、１０倍を超えてスケールアップすることはできなかった、すなわち粒子濃度は５０μｇ／ｍＬおよびｓｉＲＮＡは３ｎｍｏｌに過ぎない。
【０１９９】
粒子の表面トポロジー：粒子の表面トポロジーの測定を、タッピングモード（ｔａｐｐｉｎｇ ｍｏｄｅ）で操作したＤｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（米国）のＮａｎｏＳｃｏｐｅ ＩＩＩａ ＭｕｌｔｉＭｏｄｅ ＡＦＭにより行った。ＡＦＭ測定の少し前に、Ｈ−ｍｅｒサンプルを、１：１０に希釈し、小滴（約５０μｌ）を酸化シリコン上に載せた。数分後、サンプルを窒素のファインビーム下で乾燥させ、スクリーニングのために採取した。Ｈ−ｍｅｒの測定は、非接触法および三角形シリコンチップ（Ｒ＜２０ｎｍ）を使用して、１Ｈｚのスキャン速度で、室温および大気圧で行った。チップとサンプルとの間の間隙は１０〜１００Åであった。サンプル面積上、２つのセグメント中、５１２のラインをスキャンして、二次元範囲を形成した。
【０２００】
Ｅ−ＳＥＭ（環境制御形走査電子顕微鏡法）も行った。
【０２０１】
粒子の流体力学的直径およびゼータ電位測定：Ｈ−ｍｅｒの直径を、自動アルゴリズムモードを使用して、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳ Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）で測定し、ＰＣＳ１．３２ａで解析した。全測定は、０．０１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７中、室温で行った。
【０２０２】
カプセル化効率：系中の総ｓｉＲＮＡに対する封入されたｓｉＲＮＡの比として定義されるカプセル化効率を、遠心分離により測定することができる。全部のＨ−ｍｅｒ調製物（すなわち、カプセル化および非カプセル化ｓｉＲＮＡの両方を含む）のサンプルを、小型超遠心分離（Ｓｏｒｖａｌ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １５０Ｍ）で遠心分離した。非カプセル化ｓｉＲＮＡを含む上清を除去し、カプセル化ｓｉＲＮＡを含む粒子を含むペレットを、ｓｉＲＮＡを含まない緩衝液に再懸濁した。上清中およびペレット中、ならびに全部の調製物中のｓｉＲＮＡをリボグリーンアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により分析し、そこからカプセル化効率および物質の保存を以前記載したように計算することができる［Ｐｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９、６２７〜６３０（２００８）］。
【０２０３】
試験管内試験用の細胞系：乳房Ｔ−ＩＣ（ＢＴ−ＩＣ）は、無血清培地中の非接着性球（「マンモスフェア（ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ）」）として繰り返して継代培養することができ、分化マーカー（サイトケラチン、平滑筋アクチンおよびムチン−１）の発現を欠き、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−である。しかしながら、これらのマーカーは、ＢＴ−ＩＣを初期前駆細胞（ＥＰＣ）と区別することができない。ＢＴ−ＩＣが化学療法に比較的耐性である理由は、おそらく多因子的であるが、まだ大部分は未決定である。１つの機構は、増強された薬物排出である（フローサイトメトリーによる薬物排出副集団ＳＰとして測定される）。ＢＴ−ＩＣおよびＥＰＣは、ＡＢＣＧ多剤輸送体の発現を増強し、メラノーマ幹細胞は別の多剤輸送体、ＡＢＣＢ５を過剰発現する。
【０２０４】
エピルビシンの選択圧下でのＳＫＢＲ３細胞の生体内継代培養により、ＢＴ−ＩＣに非常に富んだヒト乳がん細胞系（ＳＫ−３ｒｄ）を生成した。これらの細胞は、幹細胞の特性（自己再生、多分化能）を安定的に維持し、球形成条件下、試験管内で無限に拡大し、さらなる研究用の無限の数の細胞を提供することができる。ＳＫ−３ｒｄ細胞は、ＳＫＢＲ３よりも１００倍少ない細胞を使用してＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで腫瘍を形成し、ＳＫＢＲ３とは異なり、その腫瘍は転移性である。さらに、これらの細胞は化学療法に比較的耐性である。
【０２０５】
ＨＬ６０ヒト急性骨随性白血病（ＡＭＬ）細胞も白血病幹細胞のモデルとして使用した。
【０２０６】
フローサイトメトリー研究：蛍光標識したｓｉＲＮＡを使用する際、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎシステムを使用してＣｙ３＋細胞の量を定量化した。
【０２０７】
画像取得および処理：Ｏｌｙｍｐｕｓ １００Ｘ ＬＵＭＰｌａｎＦＬ１．０水浸対物を取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０ＢＷＩ顕微鏡を組み込んだＢｉｏｒａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２０００ Ｌａｓｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して共焦点イメージングを行った。画像取得は、Ｌａｓｅｒｓｃａｎ ２０００ソフトウェアを使用して行い、画像処理はＯｐｅｎｌａｂ ３．１．５ソフトウェアを使用して行った（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）。
【０２０８】
インターフェロンアッセイ：ＨＬ６０細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）をモック処理、または１０００ｐｍｏｌ対照（陰性）−ｓｉＲＮＡもしくは５μｇ／ｍｌポリ（Ｉ：Ｃ）を封入したＨ−ｍｅｒで４８時間処理した。ＩＦＮまたはインターフェロン応答遺伝子の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより調査した。
【０２０９】
ｓｉＲＮＡの試験管内形質移入：２４ウェルマイクロタイタープレート（２００μｌ培地中２．５×１０５細胞／ウェル）中、３７℃、５％ＣＯ２で一晩前培養した細胞（ＳＫＢＲ３、ＳＫ−３ｒｄまたはＨＬ−６０）を、ｓｉＲＮＡまたは適当な対照を封入した一定分量（５０μｌ／ウェル）のＨ−ｍｅｒに与えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で６〜７２時間培養し、フローサイトメトリーおよび／またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析に供した。
【０２１０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ：ＡＢＩ１ステップと装置を使用した定量的ＲＴ−ＰＣＲを、以前記載したように行った。以前記載したように、ヒトＯＡＳ１用プライマーおよびＩＦＮ−βを使用した［Ｐｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８、３１９（５８６３）：６２７〜３０］。プライマー配列は以下の通りとした：
ヒトサイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）
順方向：ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＴ（配列番号１）
逆方向：ＴＧＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＴ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ
順方向：ＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＡＣ（配列番号３）
逆方向：ＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡ（配列番号４）
ＳＴＡＴ１
順方向：ＧＴＧＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡ（配列番号５）
逆方向：ＴＡＧＧＧＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡ（配列番号６）
結果
ｓｉＲＮＡを封入したヒアルロン酸被覆ナノ粒子（Ｈ−ｍｅｒ）の調製および構造評価
【０２１１】
ｓｉＲＮＡを封入したＨ−ｍｅｒを実験節で詳述したように調製した。ＤＯＴＡＰ、ＰＥＩ、オリゴフェトアミン（商標）およびヒト組換えプロタミンなどの、いくつかの正に帯電した物質を、ｓｉＲＮＡとの自己組立過程に使用した。
【０２１２】
トポグラフィー（図１Ａ）および流体力学的直径（表１）により示されるように、酢酸緩衝液で生成したＤＯＴＡＰ Ｈ−ｍｅｒは均一な球状ナノ粒子形状を形成した。ゼータ電位の測定（表１）は、（これらの条件で凝集体を形成しないことにより）生理的ｐＨでの安定性を示している。さらに、Ｈ−ｍｅｒは、大量のＲＮＡｉペイロードを封入した（表１）。
【表１】
【０２１３】
全測定は室温で行った。凍結乾燥したｓｉＲＮＡを封入しているＨ−ｍｅｒを、０．０１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７に再懸濁した。以前報告したように２１、リボグリーンアッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｓｉＲＮＡを定量化した。データは、３バッチの平均値±ＳＤを表す。
【０２１４】
これらの測定から、酢酸緩衝液中でのＨ−ｍｅｒの調製がその構造を安定化することが明らかである。酢酸緩衝液中で作成したＨ−ｍｅｒの粒度分布は、ＤＤＷ中で作成したＨ−ｍｅｒよりもはるかに小さい。
【０２１５】
粒子への組立プロセスを駆動する低ｐＨが、アミン型の正に帯電した物質の、活性化ＨＡのカルボン酸基との結合を増加させるのに不可欠であると結論づけることができる。
最良の製剤をスクリーニングするためのＣＤ４４発現細胞への形質移入
【０２１６】
ＣＤ４４ｈｉｇｈを発現しているヒト膵臓腺癌（ＰＡＮＣ−１）細胞を使用して、異なる製剤の形質移入効率を決定した（全て、製剤中のカチオン性実体としてＤＯＴＡＰを使用して作成した）。代表的な画像を図２Ａ〜Ｆおよび表２に示す。
【０２１７】
データは、独立した実験の平均値±ＳＤである。
【表２】
酢酸緩衝液中で生成した、カチオン性実体としてのＤＯＴＡＰから生成した粒子（Ｈ−ｍｅｒ）を使用した腫瘍開始細胞（Ｔ−ＩＣ、がん幹細胞）へのｓｉＲＮＡの選択的送達
【０２１８】
がん幹細胞へのｓｉＲＮＡの選択的送達を調査するために（そのため、特異性を扱う）、３種類の細胞を使用した：ＳＫＢＲ３に由来するＳＫ−３ｒｄ乳がん幹細胞、これは大量のＣＤ４４を発現している（ＣＤ４４ｈｉｇｈ）；ＣＤ４４を発現しているＳＫＢＲ３細胞（ＣＤ４４＋）およびＣＤ４４を発現していないＣＶ−１細胞（ＣＤ４４−）。生体内条件を刺激するために、細胞をＨ−ｍｅｒまたは対照（オリゴフェクトアミン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、細胞に非選択的な形質移入試薬として使用する市販のカチオン性リポソーム）に短時間（３時間）曝露した。次いで、細胞を２度洗浄し、フローサイトメトリー分析の前にさらに６時間インキュベートした。
【０２１９】
オリゴフェクトアミン（商標）を製造ガイドラインに従って５０ｎＭ Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡと混合、またはＨ−ｍｅｒを同じｓｉＲＮＡ量（５０ｎＭ）封入させた。
【０２２０】
結果を、本明細書以下の表３に要約する。
【表３】
【０２２１】
表３に明確に示されるように、Ｈ−ｍｅｒは、オリゴフェクトアミン（商標）よりも多くのｓｉＲＮＡを乳がん開始（ＳＫ−３ｒｄ）細胞に送達した。ＳＫＢＲ３細胞（これもまた大量のＣＤ４４を発現しているが、ＳＫ−３ｒｄ細胞よりログの半分少ない）では、高いｓｉＲＮＡ取り込みが示された。しかしながら、ＣＤ４４を発現していない（ＣＤ４４に対する標識化ｍＡｂを使用したフローサイトメトリーに基づく、クローン：１Ｍ７）ＣＶ−１細胞では、Ｈ−ｍｅｒを使用したｓｉＲＮＡの取り込みはバックグラウンドレベルであった。
【０２２２】
ＨＬ６０細胞（ヒト白血病がん幹細胞）を使用した場合、同様の結果が得られた（データ不掲載）。
Ｈ−ｍｅｒは、Ｔ−ＩＣ中のリファレンス遺伝子を選択的にノックダウンすることができる。
【０２２３】
Ｈ−ｍｅｒがリファレンス遺伝子のサイレンシングを選択的に誘導することができるかどうかを試験するために、本発明者等は、サイクリンＤ１（ＣｙＤ１）ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡをＨ−ｍｅｒに組み込み、材料および方法の節で記載したようにＨＬ６０細胞を形質導入した。結果を図３に要約する。図３は、８０％を超える白血病幹細胞中のＣｙＤ１の選択的ノックダウンを示し、その一方で、Ｈ−ｍｅｒにより送達された対照ｓｉＲＮＡはＣｙＤ１ ｍＲＮＡレベルに影響しなかったことを示している。さらに、ＣＶ−１細胞を使用した場合、ＣｙＤ１ ｍＲＮＡレベルに有意な変化は観察されず、これは、Ｈ−ｍｅｒがＣＤ４４依存的に作用するという事実を裏付けている。
いくつかの発がん遺伝子に対するｓｉＲＮＡの混合物を封入したＨ−ｍｅｒは、Ｔ−ＩＣを選択的に根絶する。
【０２２４】
Ｈ−ｍｅｒに封入されたｓｉＲＮＡを使用したＴ−ＩＣを根絶する能力を試験するために、プロトコルを、生体内環境を刺激するよう適合させた。すなわち、細胞を異なる製剤に短時間曝露させ（４時間）、引き続いて、大規模に洗浄し、薬物を含まない培地をさらに７２時間追加でインキュベートした。ＸＴＴアッセイを使用して、細胞生存を監視した。
【０２２５】
図４は、Ｈ−ｍｅｒに封入されたｓｉＲＮＡ（ＲＡＳ、ＨＭＧＡ２もしくはＭＹＣ）または対照（非選択的形質移入試薬としてのオリゴフェクトアミン（商標）およびＨ−ｍｅｒにより送達される対照ｓｉＲＮＡ）の組み合わせを使用した、異なる細胞（ＳＫ−３ｒｄ、ＣＤ４４ｈｉｇｈ、ＳＫＢＲ３ ＣＤ４４＋およびＣＶ−１（ＣＤ４４−））の生存を表す。
【０２２６】
オリゴフェクトアミン（商標）形質移入細胞の結果は、全ての試験した細胞種が、形質移入が可能であることを示している。Ｈ−ｍｅｒは、ＣＤ４４発現細胞（ＳＫ−３ｒｄ、がん幹細胞を含む）において細胞死をもたらすｓｉＲＮＡ混合物を選択的に送達するが、ＣＶ−１細胞の場合のようなＣＤ４４発現を欠く細胞においては送達しない。
【０２２７】
さらに、Ｈ−ｍｅｒ自体の使用は、この生存試験により観察されるいかなる毒性も引き起こさない（図４、灰色列）。
ｓｉＲＮＡを封入したＨ−ｍｅｒは、望まない免疫応答を誘導しない。
【０２２８】
Ｈ−ｍｅｒがインターフェロン応答を引き起こしたかどうかを試験するために、ヒト白血病幹細胞由来のＨＬ６０細胞のインターフェロン応答について分析した。結果を図５に示す。
【０２２９】
ＨＬ６０細胞の存在下で４８時間まで培養した場合、対照ｓｉＲＮＡ１ｎｍｏｌを封入したＨ−ｍｅｒはインターフェロン応答を誘導しなかった（図５）。対照的に、ｓｉＲＮＡ凝縮体としてのオリゴフェクトアミン（商標）の使用は、望まない免疫応答を誘導し、非カプセル化ｓｉＲＮＡも同様であった。ポリＩ：Ｃを陽性対照として使用した。
ｍｉＲＮＡを封入したＨ−ｍｅｒ
【０２３０】
一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣体（アンタゴｍｉｒ）を含むＤＯＴＡＰ含有粒子も製剤化した。得られたアンタゴｍｉｒを封入したＨ−ｍｅｒは、本明細書以下の表４に要約され、図６に説明されるように、直径３５ｎｍの範囲のより小さい粒子を示す（対して、ｓｉＲＮＡを使用すると約１００ｎｍである）。
【表４】
各々の値は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ ＺＳ ゼータサイザーにおける３つの独立した測定の平均値±ＳＤを表す。
アンタゴｍｉｒは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。アンタゴｍｉｒ分子の数は、リボグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。
実施例２
ＤＬＰＥ：ＤＬＰＧをベースとする粒子
材料および方法
【０２３１】
材料：脂質（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ））は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、米国）から購入した。ヒアルロナン、Ｍｗ７５１ＫＤａ、固有粘度：１６ｄＬ／ｇ（Ｇｅｎｚｙｍｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）；ＦＩＴＣ−ＨＡは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）（ドイツ）から入手した。Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡは、Ｑｕｉａｇｅｎから購入し；非標識化ｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎから購入した。パクリタキセル、Ｔａｘｕｓ種からの半合成、最小９７％；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）；ホウ酸およびホウ砂（四ホウ酸ナトリウム十水和物）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から購入した。３Ｈ−パクリタキセルホスファチジルエタノールアミン（ａｒａｃｈ−１−１４Ｃ）および３Ｈ−ＨＡは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から購入した。細胞培養プレートはＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）から入手した。細胞培養のための材料は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃｏ．（Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）から入手した。透析管（１２０００〜１４０００の分子量カットオフ）は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｓ、ＣＡ）から購入した。ポリカーボネート膜はＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）から購入した。他の全ての試薬は、分析用とした。
【０２３２】
ｓｉＲＮＡをカプセル化したヒアルマーの調製：１０：１（モル／モル）ＤＬＰＥ：ＤＬＰＧ、１：１０（ｗ／ｗ）ＨＡ：脂質および１：１００〜１：１０ｓｉＲＮＡ：脂質（モル／モル）の比で粒子を調製した。他の意図した範囲には、１：８５０（モル／モル）ｓｉＲＮＡ：脂質が含まれる。
【０２３３】
活性化ＨＡ：ＨＡ１．３３ｍｇをｐＨ４．５ １００ｍＭ（０．３３ｍｇ／ｍｌ）酢酸緩衝液４ｍｌに溶解した。ＥＤＣを過剰に２６．６７ｍｇ添加し（２０ｍｇ ＥＤＣ／ｍｇ ＨＡ）、混合物を３７℃で２時間振盪した。
【０２３４】
脂質−ｓｉＲＮＡ懸濁液の調製：ＤＬＰＥ４．５ｍｇおよびＤＬＰＧ０．５ｍｇを量り、５０ｍｌプラスチック管に注入した。０．１Ｍ ｐＨ＝９．０ホウ酸緩衝液３．５ｍｌを乾燥した脂質に添加した。懸濁液をＴｍ（約７０℃）より上の温度で少なくとも２時間加熱し、その後、プローブソニケーター中、１分×５回超音波処理した。次いで、懸濁液を、７０℃に加熱したジャケットを備えたＬｉｐｅｘ押出機で、０．１μｍポリカーボネートフィルターを通して１０回押し出し成形した。ｓｉＲＮＡ溶液（１００μＭ）１００μｌを活性化ＨＡ１．５ｍｌと共に添加した。振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした後、ＭＷＣＯ１２〜１４０００膜を使用して透析を行った。
【０２３５】
粒子の表面トポロジー：実施例１について記載の通りである。
【０２３６】
粒子の流体力学的直径およびゼータ電位測定：実施例１に記載の通りである。
【０２３７】
カプセル化効率：実施例１に記載の通りである。
【０２３８】
ｓｉＲＮＡの調製：本明細書上記の通りである。
【０２３９】
試験管内試験：本明細書上記の通りである。
【０２４０】
フローサイトメトリー研究：本明細書上記の通りである。
【０２４１】
画像取得および処理：本明細書上記の通りである。
【０２４２】
ｓｉＲＮＡの試験管内形質移入：本明細書上記の通りである。
結果
ｓｉＲＮＡを封入したヒアルマーの調製および構造評価
【０２４３】
ｓｉＲＮＡを封入したヒアルマーを実験の節で詳述のように調製した。トポグラフィー（図７）および流体力学的直径（表１）により示されるように、これらは均一な球状ナノ粒子形状を形成した。ゼータ電位の測定（表５）は、（これらの条件で凝集体を形成しないことにより）生理的ｐＨでの安定性を示している。さらに、ヒアルマーは、大量のＲＮＡｉペイロードを封入した（表５）。バッチ間の高い一貫性は、３つの独立した調製物における再現性により反映されている（表５）。
【表５】
【０２４４】
全測定は室温で行った。凍結乾燥したｓｉＲＮＡを封入したヒアルマーを、０．０１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７に再懸濁した。リボグリーンアッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｓｉＲＮＡを定量化した。
【０２４５】
図８Ａ〜Ｃで分かるように、ヒアルマー（ＦＩＴＣ−ＨＡを組み込むよう生成された）は、ｓｉＲＮＡをＨＬ６０細胞（白血病幹細胞）に送達することが示された。
【０２４６】
図８Ａ〜Ｃから明確に分かるように、ヒアルマーのみがｓｉＲＮＡを白血病幹細胞中に送達することができ、同様に使用した市販の試薬オリゴフェクトアミン（商標）またはｓｉＲＮＡ単独では送達することができない。
実施例３
本発明の実施形態の粒子は、ＡＭＬ初代細胞およびヒト卵巣腺癌細胞を標的化することができる。
材料および方法
【０２４７】
ＡＭＬ初代細胞を標的化する粒子：粒子を実施例１に記載のように生成し、サイクリンＤ１、Ｃｙ３標識化ｓｉＲＮＡを担持させた。
【０２４８】
ヒト卵巣腺癌細胞を標的化する粒子：１０ｍｇ／ｍＬの６０％ＤＯＴＡＰ、３０％コレステロール、１０％ＤＬＰＥをエタノールに溶解し、透明な溶液が得られるまで加熱した。その後、脂質をビュッヒエバポレーター中で乾燥させ、ホウ酸緩衝液中で再水和した。次いで、溶液を激しくボルテックスし、３７℃で２時間振盪機に入れた。
【０２４９】
脂質を、異なるフィルターを有する押出機中に通すことにより（４００ｎｍ２回、２００ｎｍ２回、１００ｎｍ２回、５０ｎｍ１０回）、脂質粒子を形成させ、最終的な粒子の大きさは約８０ｎｍとなった。実験の日までＵＬＶを４℃に保った。
【０２５０】
組立のために、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１１２μｌを、ｓｉＲＮＡ７μｌと共に小ガラスバイアルに添加し、ヒトＰ糖タンパク質（Ｐｇｐ）に添加した（２０μＭストック）。５分のインキュベーション後、希釈した脂質（１ｍｇ／ｍｌ）１８．５μｌを添加した。室温でさらに２０分後、実施例１に記載のように酸性条件下で前もって予め活性化した希釈したＨＡ（０．２ｍｇ／ｍｌ）１８．５μｌを添加した。混合物を室温で１６時間インキュベートした。
【０２５１】
ＡＭＬ初代細胞の形質移入：ＡＭＬ患者から新しく単離した血液を、フィコール勾配密度で分離した（ＰＢＭＣ）。氷上でＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターを使用して、細胞をさらに選別した（ＣＤ３−ＣＤ１９−／ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）。次いで、細胞（２．５×１０５個の細胞）を、６ウェルプレート中２．５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０完全培地（１０％血清含有）に播種した。１５０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ（総濃度５０ｎＭ）を使用して実施例１に詳述のように粒子を調製し、無血清ＲＰＭＩ培地５００μｌに再懸濁し、細胞上に配置した。総容積は３ｍＬであった。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、未処理および処理ＡＭＬ細胞のｍＲＮＡの量を決定した。
【０２５２】
ヒト卵巣腺癌細胞の形質移入：ヒト卵巣腺癌細胞を、抗生物質を含まない完全培地中、０．１×１０６細胞／ウェルの濃度で、２４ウェルプレートで培養した。２４時間後、培地を除去し、無血清ＲＰＭＩ培地に交換した。次いで、細胞をヒアルマー溶液１１０μｌで処理した。抗生物質を含まない無血清ＲＰＭＩによるインキュベーションの５時間後、血清を含む完全培地を添加した（最終血清濃度１０％）。一晩のインキュベーション後、培地を完全ＲＰＭＩ培地に交換した。７２時間後、Ｐｇｐタンパク質レベルをフローサイトメトリーにより分析した。
結果
【０２５３】
ＡＭＬ初代細胞へのヒアルマー送達：図９Ａ〜Ｃおよび図１０に示されるように、本発明の実施形態による粒子は、ｓｉＲＮＡをＡＭＬ初代細胞に送達し、強力な遺伝子サイレンシングを誘導することができる。
【０２５４】
ヒト卵巣腺癌細胞へのヒアルマー送達：図１１に示されるように、本発明の実施形態による粒子は、ｓｉＲＮＡをヒト卵巣腺癌初代細胞に送達し、強力な遺伝子サイレンシングを誘導することができる。
【０２５５】
本発明はその特定の実施形態と組み合わせて記載されてきたが、多くの代替、修正および変形が当業者に明白であることが明らかである。従って、添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲に入るこのような全ての代替、修正および変形を包含することが意図されている。
【０２５６】
本明細書中で言及する全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の刊行物、特許および特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。さらに、本出願中の任意の参考文献の引用および同定は、このような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認と解釈すべきではない。節の見出しが使用される範囲において、それらを必ずしも限定的なものと解釈すべきてはない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態で、ポリヌクレオチド剤を含む細胞標的化ナノ粒子およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
大半のがんは均一ではなく、化学／放射線療法に比較的耐性の細胞の亜集団を含む。これらの細胞は、治療によって排除することができず、がん再発の原因となり得る。１つの有力な理論は、腫瘍は、正常な組織幹細胞と特性を共有する、がん幹細胞または腫瘍開始細胞（Ｔ−ＩＣ）と呼ばれる、腫瘍内のこのような珍しい薬剤耐性細胞により開始されるというものである。これらの細胞は自己再生し、試験管内および生体内の両方で無限に継代培養することができ、複数の細胞系統に分化することができる。重要なことに、これらは免疫不全マウス中の腫瘍細胞のバルクよりもはるかに悪性であり、より少ない細胞で腫瘍を形成し、この腫瘍はしばしばより転移性である。
【０００３】
全てのＴ−ＩＣの１つの共通の特徴は、ＣＤ４４の発現が高いことであり、（ＣＤ４４ｈｉｇｈ）と呼ばれる。いくつかの他のマーカー（ＣＤ１３３、ＣＤ２４ｌｏｗまたはＣＤ２４＋、ＣＤ１６６およびＥｐＣＡＭ）を有するまたは有さないＣＤ４４ｈｉｇｈは、血液および固形腫瘍、その中でも乳房腫瘍、膵腫瘍、白血病、脳腫瘍およびメラノーマ中に見られる。
【０００４】
大半のがん幹細胞は、比較的薬剤耐性で、腫瘍細胞のバルクよりも悪性である。そのため、異なる種類のがん幹細胞をうまく治療するために、この亜集団に対処する治療を開発することが不可避である。
【０００５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が哺乳類で示されたのはつい最近であるが、ヒト治療にＲＮＡｉを利用する見通しは急速に発展してきた。黄斑変性および呼吸器合胞体ウイルス感染症を治療するためのｓｉＲＮＡを使用した第１相および第２相臨床試験が促進されてきている。
【０００６】
しかしながら、これらの有望な治療の多くは、ｓｉＲＮＡを異種移植腫瘍中に局所的に注入することにより行われた。がん治療にＲＮＡｉを利用する最も大きな障害は、原発腫瘍だけでなく、潜在性転移および散在性疾患における遺伝子発現もサイレンシングするためにｓｉＲＮＡを全身送達することである。
【０００７】
全身的に白血球を標的化する粒子が開発されてきた。このような粒子は、ｓｉＲＮＡを、細胞標的化部分（抗体断片または内部移行する白血球インテグリンに対する細胞表面受容体リガンド）およびプロタミンなどのＲＮＡ結合ペプチドから構成される融合タンパク質と混合することにより形成された［Ｐｅｅｒ等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０４、４０９５〜４１００（２００７）］。ｓｉＲＮＡ融合タンパク質ナノ粒子の静脈内注射は、肺造血細胞腫瘍を特異的に標的化し、抑制する。さらに、抗インテグリン抗体で修飾した脂質ナノ粒子が、ｓｉＲＮＡを腸の炎症に関与する白血球に選択的に送達することができることが示された［Ｐｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９、６２７〜６３０（２００８）］。このプラットフォームを使用して、粒子の表面を修飾する抗体を変えることにより、異なる細胞表面受容体を標的化することができる。しかしながら、これは、がん幹細胞を標的化する能力に対処することができない極めて複雑な戦略である。
【０００８】
国際特許出願第ＷＯ２００９／０２０２７０号およびＪｉａｎｇ等［Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、第８９巻、第７号、２００８］は、ポリエチレンイミンおよびヒアルロン酸を含む組成物を使用した核酸の送達システムを教示している。この組成物は、４．５より上のｐＨで生成される。生成した粒子は、２１ｎｍの大きさで、３．６、１３．２および２４．９のゼータ電位を有していた。
【０００９】
Ｔａｅｔｚ等［Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、第１９巻、第２号、Ｅｐｕｂ Ａｐｒ ２００９］は、ヒアルロン酸に予め付着させたリポソームをｓｉＲＮＡと反応させて、がんを治療するためのリポプレックスを作成することを教示している。リポプレックスの大きさは、１００〜２００ｎｍであり、約−４０ｍＶのゼータ電位を有していた。
【００１０】
Ｓｕｒａｃｅ等［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第６巻、第４号、１０６２〜７３頁］は、ヒアルロン酸に予め付着させたリポソームを使用して、プラスミドＤＮＡと共にリポプレックスを形成することを教示している。リポプレックスは、負のゼータ電位を示し、平均直径は２５０〜３００ｎｍであった。
【００１１】
Ｈａｎ Ｓｕ−Ｅｕｎ等［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、第１７巻、第２号、２００９年２月］は、ポリエチレンイミンおよびヒアルロン酸を含む組成物を使用した核酸の送達システムを教示している。この組成物は、４．５より上のｐＨで生成される。生成した粒子は、４５〜７０ｍＶのゼータ電位を有しており、直径が約１８５ｎｍである。
【００１２】
Ｈｅｒｒｉｎｇｓｏｎ等［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、第１３９巻、第３号、２２９〜２３８頁］は、ｓｉＲＮＡの、中性ステルスリポソーム中へのカプセル化およびＣＤ４リガンドによる生着を教示している。このリポソームは、２４３ｎｍの平均直径、ならびに−１１．５ｍＶおよび−１．５ｍＶのゼータ電位を有していた。
【００１３】
Ｃｈｏｎｏ等［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、第１３１巻、第１号、２００８年１０月６日、６４〜６９頁］は、ｓｉＲＮＡを腫瘍へ全身送達するための、リポソーム、プロタミンおよびヒアルロン酸を含むナノ粒子製剤を教示している。
【００１４】
追加の背景技術としては、遺伝子送達物質としての脂質化グリコサミノグリカンの粒子の不均一集団を教示している米国特許第７５４４３７４号および米国特許出願第２００９０１５５１７８号が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際特許出願第ＷＯ２００９／０２０２７０号
【特許文献２】米国特許第７５４４３７４号
【特許文献３】米国特許出願第２００９０１５５１７８号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｐｅｅｒ等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０４、４０９５〜４１００（２００７）
【非特許文献２】Ｐｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９、６２７〜６３０（２００８）
【非特許文献３】Ｊｉａｎｇ等、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、第８９巻、第７号、２００８
【非特許文献４】Ｔａｅｔｚ等、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、第１９巻、第２号、Ｅｐｕｂ Ａｐｒ ２００９
【非特許文献５】Ｓｕｒａｃｅ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第６巻、第４号、１０６２〜７３頁
【非特許文献６】Ｈａｎ Ｓｕ−Ｅｕｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、第１７巻、第２号、２００９年２月
【非特許文献７】Ｈｅｒｒｉｎｇｓｏｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、第１３９巻、第３号、２２９〜２３８頁
【非特許文献８】Ｃｈｏｎｏ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、第１３１巻、第１号、２００８年１０月６日、６４〜６９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、
（ａ）ポリヌクレオチドを、カチオン性分子を含む組成物と接触させるステップであって、カチオン性分子は静電的相互作用によりポリヌクレオチドを凝縮して複合体を生成し、カチオン性分子はリポソームに含まれないステップと、
（ｂ）約４．５以下のｐＨで、複合体を標的化部分に共有結合させて、標的細胞にポリヌクレオチド剤を送達するための粒子を生成するステップと
を含む、標的細胞にポリヌクレオチドを送達するための粒子を生成する方法が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、本発明の方法のいずれかに従って生成される粒子が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、複数の本発明の粒子を含む組成物が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、ｓｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分を含む殻を含む粒子の実質的に均一な集団を含む組成物が提供され、粒子の集団の粒子の各々は、約−４０ｍＶのゼータ電位を含み、粒子の集団の粒子の各々は、溶液中の場合、直径が約１００〜３００ｎｍである。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、ｍｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分を含む殻を含む粒子の実質的に均一な集団を含む組成物が提供され、粒子の集団の粒子の各々は、溶液中の場合、直径が約３０〜５０ｎｍである。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、本発明の方法に従って生成される粒子を、ＣＤ４４を発現している標的細胞と接触させ、それにより標的細胞内の目的の遺伝子を下方制御するステップを含む、標的細胞内の目的の遺伝子を下方制御する方法が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、被験体に治療上有効量の本発明の方法に従って生成される粒子を投与し、それによりがんを治療するステップを含む、それを必要とする被験体のがんを治療する方法が提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチドはＤＮＡを含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチドはＲＮＡを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチドは一本鎖である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチドは二本鎖である。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチドはＲＮＡサイレンシング剤を含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群から選択される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によると、カチオン性分子は、カチオン性ポリペプチド、カチオン性脂質、カチオン性界面活性剤および合成ポリマーからなる群から選択される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によると、カチオン性脂質は、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）、ジオレオイル−１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ、１８：１；１４：０；１６：０；１８：０）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＰＣ、１２：０；１４：０；１６：０；１８：０；１８：１；１６：０〜１８：１）；１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−ジメチルアンモニウム−プロパンおよび３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロール）からなる群から選択される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、中性脂質をさらに含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によると、中性脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、アニオン性リン脂質をさらに含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によると、アニオン性リン脂質は、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールからなる群から選択される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、コレステロールをさらに含む。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によると、合成ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジンを含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によると、標的化部分は、ポリペプチド標的化部分を含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によると、標的化部分は、抗体、抗体断片、アプタマーおよび受容体リガンドからなる群から選択される。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によると、標的化部分は、グリコサミノグリカンを含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によると、グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマチン硫酸、これらの塩および混合物からなる群から選択される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によると、グリコサミノグリカンは、ＨＡを含む。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によると、本方法は、ステップ（ｂ）の前にグリコサミノグリカンを活性化するステップをさらに含む。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によると、活性化は、酸性緩衝液中でグリコサミノグリカンをインキュベートすることにより行われる。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロールおよびジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）を含む。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によると、標的化部分はＨＡを含み、ポリヌクレオチド剤はｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によると、複合体は、ステップ（ｂ）の前に押し出し成形されない。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、シリコン表面上で乾燥させると直径が約１００ｎｍである。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、シリコン表面上で乾燥させると直径が約３０ｎｍである。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、溶液中で直径が約３０〜３００ｎｍである。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、形が丸い。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、約−４０ｍＶのゼータ電位を含む。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、帯電している。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、中性である。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、ナノ粒子である。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によると、標的化部分は、ＨＡを含む。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、抗体、抗体断片、受容体リガンドおよびアプタマーからなる群から選択される少なくとも１つの追加の標的化部分をさらに含む。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によると、粒子は、約６０００個を超えるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子を含む。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、実質的に均一である。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態によると、投与は、生体内で行われる。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によると、投与は生体外で行われる。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、発がん遺伝子の発現を下方制御するよう選択される。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、生存率と関連する遺伝子の発現を下方制御するよう選択される。
【００６６】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての専門用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および物質と類似のまたは同等のものを本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、代表的な方法および／または物質を以下に記載する。矛盾する場合には、定義を含む、特許明細書が規制する。さらに、物質、方法および例は例示的なものに過ぎず、必ずしも限定することを意図していない。
【００６７】
添付の図面および画像を参照して、単なる例として、本発明のいくつかの実施形態を本明細書に記載する。ここで、詳細に図面を具体的に参照して、示される事項は、例としてのものであり、本発明の実施形態の例示的議論を目的とするものであることを強調する。この点について、図面を伴う記載は、本発明の実施形態をどのようにして実施することができるかを当業者に明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】本発明の実施形態の粒子の表面トポグラフィーを説明する写真である。図１Ａ：酢酸緩衝液（ＡＢ）中、ＨＡとＤＯＴＡＰから作られた粒子の表面トポグラフィー。Ｈ−ｍｅｒトポグラフィーは、環境制御形走査電子顕微鏡法（Ｅ−ＳＥＭ）によりイメージ化された。粒子は、シリコン表面上で乾燥させると、個別的な球状形状であり、直径が約１００ｎｍである。
【図１Ｂ】本発明の実施形態の粒子の表面トポグラフィーを説明する写真である。図１Ｂ：ＤＤＷ（再蒸留水）中、ＨＡとＤＯＴＡＰから作られた粒子は、不定構造を有し、個別的な形状を有さない。繊維のシートにより囲まれた核粒子が存在する。
【図２Ａ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図２Ｂ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図２Ｃ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図２Ｄ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図２Ｅ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図２Ｆ】ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓腺癌）における、ＡＢ（図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆ）またはＤＤＷ（図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅ）中で本発明の実施形態に従って生成した粒子によるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの形質移入を説明する写真である。
【図３】本発明の実施形態の粒子を使用した白血病幹細胞におけるＣｙＤ１の選択的ノックダウンを説明する棒グラフである。
【図４】本発明の実施形態の粒子によって送達される、発がん遺伝子に対するｓｉＲＮＡの混合物を使用したがん幹細胞の根絶を説明する棒グラフである。
【図５】ｓｉＲＮＡを封入する本発明の実施形態の粒子がインターフェロン応答を誘導しないことを説明する棒グラフである。
【図６】ｍｉＲＮＡを封入する本発明の実施形態による粒子の画像である。
【図７】環境制御形走査電子顕微鏡（Ｅ−ＳＥＭ）によりイメージ化された、本発明の実施形態の粒子の表面トポグラフィーを説明する写真である。粒子は、シリコン表面上で乾燥させると、球状形状であり、直径が約１００ｎｍである。
【図８Ａ】本発明の粒子を使用した、ヒト白血病幹細胞への選択的ｓｉＲＮＡ送達を説明する写真である。図８Ａ−ｓｉＲＮＡ単独
【図８Ｂ】本発明の粒子を使用した、ヒト白血病幹細胞への選択的ｓｉＲＮＡ送達を説明する写真である。図８Ｂ−オリゴフェクトアミン（商標）
【図８Ｃ】本発明の粒子を使用した、ヒト白血病幹細胞への選択的ｓｉＲＮＡ送達を説明する写真である。図８Ｃ−本発明の実施形態による粒子。
【図９Ａ】本発明の実施形態による粒子が、ヒトＡＭＬ初代細胞にｓｉＲＮＡを送達することができることを説明する画像である。
【図９Ｂ】本発明の実施形態による粒子が、ヒトＡＭＬ初代細胞にｓｉＲＮＡを送達することができることを説明する画像である。
【図９Ｃ】本発明の実施形態による粒子が、ヒトＡＭＬ初代細胞にｓｉＲＮＡを送達することができることを説明する画像である。
【図１０】本発明の実施形態による粒子によって送達されるＣｙｃｌｉｎ Ｄ１−ｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）が、ヒト初代ＡＭＬ細胞で強力な遺伝子サイレンシングを誘導したことを説明する棒グラフである。
【図１１】ヒト卵巣腺癌細胞系（ＮＣＩ−ＡＤＲ／ＲＥＳ）中のＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）発現の減少を示すフローサイトメトリー分析の結果を説明するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本発明は、そのいくつかの実施形態で、ポリヌクレオチド剤を含む細胞標的化ナノ粒子、同粒子を生成する方法、およびその使用に関する。
【００７０】
少なくとも１つの本発明の実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明で示されるまたは実施例により例示される詳細への適用に必ずしも限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の実施形態が可能である、または種々の方法で実施もしくは実行することが可能である。
【００７１】
表面受容体ＣＤ４４を高く発現している腫瘍開始細胞（Ｔ−ＩＣ）またはがん幹細胞は、がん再発の主な原因であると考えられており、非常に化学療法耐性および放射線耐性である。全ての種類のがん細胞（がん幹細胞を含む）を選択的に標的化することができる薬物（その中でも、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ模倣体などの新規クラスの阻害剤）を送達する戦略を開発する必要がある。本発明者等は、ナノ粒子（ヒアルマー（ｈｙａｌｕｍｅｒ）またはＨ−ｍｅｒとも呼ぶ）を生成することにより、ＣＤ４４とそのリガンド、ヒアルロナン（ＨＡ）の間の相互作用を利用する戦略を発明し、それらを使用してｓｉＲＮＡをＴ−ＩＣ中に選択的に送達し、これらの細胞の根絶をもたらすことができる強力な遺伝子サイレンシングを誘導することができることを示している。
【００７２】
ナノ粒子は、電荷−電荷相互作用によりポリヌクレオチドを凝縮することができるのであれば、いかなるカチオン性分子から構成されていてもよい。
【００７３】
本発明者等は、約４．５未満のｐＨでの標的化部分（例えば、ヒアルロナン；ＨＡ）のカチオン性分子との架橋が、架橋がより高いｐＨで行われる場合によりもより均一で、より大量のポリヌクレオチド剤を封入することができるナノ粒子を生成することを発見した。この粒子を生成する方法は、本質的に１つのステップで−すなわち、ポリヌクレオチド剤の添加後、標的化部分との架橋前に粒子を小型化するためのさらなるエネルギーを必要とせずに−例えば、リポソームの生成なしに、行われた。
【００７４】
従って、本発明者等により生成されたポリヌクレオチド剤カプセル化ナノ粒子の集団は、非常に均一であることが示された（図１Ａ、６および７）。本発明の粒子はまた、ポリヌクレオチドの積荷を、ＣＤ４４表面受容体を有する細胞に選択的に送達することが示された（図３および４）。本発明の粒子は、血清分解から保護されるので、生体内治療に有用である。さらに、本発明者等は、ポリヌクレオチド剤カプセル化ナノ粒子が、インターフェロン応答を誘導しないこと−全身性ｓｉＲＮＡ適用のための安全で効率的な送達媒体の必要条件を示した（図５）。
【００７５】
従って、本発明の一態様によると、
（ａ）ポリヌクレオチド剤を、カチオン性分子を含む組成物と接触させるステップであって、カチオン性分子は静電的相互作用によりポリヌクレオチド剤を凝縮して複合体を生成し、カチオン性分子はリポソームに含まれないステップと、
（ｂ）約４．５未満のｐＨで、複合体を標的化部分に共有結合させて、標的細胞にポリヌクレオチド剤を送達するためのナノ粒子を生成するステップと
を含む、標的細胞にポリヌクレオチドを送達するためのナノ粒子を生成する方法が提供される。
【００７６】
一実施形態によると、共有結合が行われる酸性ｐＨは、約４．５、４、３．５、３、２．５またはそれより下である。
【００７７】
本明細書で使用する「カチオン性分子」という句は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性界面活性剤およびカチオン性ポリペプチドを指す。本発明のこの態様によると、カチオン性分子は、リポソームの形ではない。
【００７８】
代表的なカチオン性脂質としては、それだけに限定されないが、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）、ジオレオイル−１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ、１８：１；１４：０；１６：０；１８：０）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＰＣ、１２：０；１４：０；１６：０；１８：０；１８：１；１６：０〜１８：１）；１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−ジメチルアンモニウム−プロパンおよび３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロール）が挙げられる。
【００７９】
代表的なカチオン性ポリマーとしては、それだけに限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリ−Ｌ−リジンが挙げられる。
【００８０】
本発明のナノ粒子を生成するために使用するカチオン性分子は、本明細書中以下に記載する他の非カチオン性成分を含んでもよい。
【００８１】
特に対象となるのは、コレステロールと組み合わせて使用するカチオン性脂質である。このような化合物、特に、好ましくはコレステロールと共に１：１で使用する、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）またはＤＯＴＩＭを、ポリヌクレオチドと製剤化して、生体内毒性が比較的低い複合体を得ることができる。このように、カチオン基と適当に混合された、またはカチオン基に誘導体化されたコレステロール基は、本記載の発明の実施に特によく適している。
【００８２】
適当なコレステロール脂質のカチオン性成分は、それだけに限定されないが、アミノ基（またはオリゴもしくはポリアミン）、例えばスペルミン、スペルミジン、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）、ジエチレントリアミン、ペンタメチレンヘキサミン、ペンタプロピレンヘキサミン等、アミド基、アミジン基、正電荷のアミノ酸（例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）、イミダゾール基、グアニジウム基、またはこれらの混合物および誘導体を含む、ｐＨ５〜ｐＨ８で正電荷を保持する種々の化学基のいずれかを含むことができる。さらに、上記基のいずれかのカチオン性ポリマー（多糖類または他の化学リンカーにより結合されている）はまた、遺伝子送達で有用であると判明し、本記載の脂質複合体中に組み込むことができる。このようなポリマーを調製するために使用する架橋剤は、好ましくは生体適合性または生物学的許容性（ｂｉｏｔｏｌｅｒａｂｌｅ）であり、それぞれカチオン上で適当な化学基と結合を形成することができる少なくとも２個の化学基を一般的に含む（すなわち、架橋剤は二官能性である）。本開示のために、生体適合性という用語は、化合物が意図した用量で有意な毒性または有害な免疫学的効果を示さないことを意味し、生物学的許容性という用語は、所与の化合物に関連した有害な生物学的結果を適当な投与計画またはカウンター治療（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｔｈｅｒａｐｙ）により管理することができることを意味するだろう。リンカー基は、ホモ二官能性（同じ化学基）であっても、ヘテロ二官能性（異なる化学基）であってもよい。任意選択で、複合体からのベクターの放出を促進するために、結合基とカチオン性部分との間に形成される化学結合は、好ましくは生理的条件下で加水分解性である（すなわち、ｐＨ不安定性である、あるいは標的細胞中で切断を受けやすい）。さらに、架橋剤は、結合基間において生理的条件下で加水分解性の結合を含むことができる。
【００８３】
任意選択で、架橋剤は、分枝ポリマーの形成を可能にする追加の架橋剤と組み合わせることができる。分枝結合分子と重合架橋剤の比を変えることにより、種々の化学的特性を有するカチオン性ポリマーが製造される。
【００８４】
適当な場合には、必要に応じて、任意のまたは種々の（すなわち、混合物の）他の「ヘルパー」脂質部分を、本記載の脂質またはポリマー／ポリヌクレオチド送達媒体に添加して、複合体に所望の特性を与えることができる。このように、それだけに限定されないが、ジステアロイルホスファチジル−グリセロール（ＤＳＰＧ）、水素添加大豆、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、モノ−、ジ−およびトリアシルグリセロール、セラミド、セレブロシド、ホスファチジルグリセロール（ＨＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジラウロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＬＰＥ）、カルジオリピンなどを含むいくつかの周知のリン脂質のいずれかを添加することができる。典型的には、ヘルパーあるいは中性脂質は、ポリヌクレオチド送達複合体の脂質成分の約１５％〜約７０％、好ましくは約１５〜約６０％、より好ましくは約３０〜約６０％、およびより典型的には少なくとも約６０％、特に少なくとも約５０％を含むだろう。逆に、カチオン性脂質の割合は、好ましくは複合体の正味の脂質成分の約３０〜約７０％、より好ましくは約４０〜約６０％、特に約５０％を構成するだろう。
【００８５】
カチオン性分子を含む代表的な組成物としては、水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロールおよびジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）が挙げられる。カチオン性分子を含む別の代表的な組成物としては、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）が挙げられる。
【００８６】
組み立て中、カチオン性分子は、一般的に、所与の用途のために最適化されたカチオン／リン酸塩比でポリヌクレオチド剤と組み合わせられる。通常、ＤＮＡリン酸塩：カチオン比は、約１：８（．ｍｕ．ｇ ＤＮＡ：ｎｍｏｌ カチオン性脂質）、静脈内投与については好ましくは約２：１〜約１：１６、およびｉ．ｐ．またはエアロゾル適用については約１：１などである。
【００８７】
イオン対形成は、カチオン／ポリヌクレオチド複合体の形成で役割を果たすので、複合体形成中のｐＨは、特定の成分の相互作用を最適化または安定化するよう変えることができる。例えば、非ｐＨ感受性カチオン性脂質を使用する場合、所与のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）またはポリヌクレオチドと共に組み込む（ｃｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）ことができる他の化学薬剤を複合体形成させるために約５のような低いｐＨが好ましいだろう。さらに、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が、実質的に塩基加水分解に感受性でない場合、状況は複合体形成中に約１０までのｐＨを使用することを要求することができる。一般に、複合体形成および形質移入中、約５〜約９の範囲内のｐＨ、好ましくは約７を維持する。
【００８８】
同様に、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２等）の濃度は、複合体形成を最適化する、またはポリヌクレオチド剤送達および発現の効率を高めるよう変えることができる。さらに、カチオン性脂質がポリヌクレオチド剤と複合体形成する温度などの因子は、得られる複合体の構造的および機能的属性を最適化するよう変えることができる。さらに、複合体が形成される溶液のモル浸透圧濃度は、塩または他の賦形剤濃度を調整することにより変えることができる。
【００８９】
中程度の塩濃度は複合体形成を妨害し得るので、それだけに限定されないが、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、トレハロース、麦芽糖、マンノースなどの適当な添加剤を添加または置換することにより、モル浸透圧濃度を調整することもできる。複合体形成中に存在させることができる糖（右旋糖、ショ糖等）の量は、一般的に、約２％〜約１５％、好ましくは約３％〜約８％、より好ましくは約５％と変化するだろう。
【００９０】
あるいは、溶液のモル浸透圧濃度は、塩と糖、またはデキストラン４０、アルブミン、血清、リポタンパク質などを含む他の賦形剤の混合物により調整することもできる。当業者は、遺伝子送達の効率を最適化するためにどのように適当に塩および糖の濃度を変えたらよいか明確に分かるだろう。さらなる最適化のための出発点となり得る塩および糖の典型的な濃度は、約２５０ｍＭ（ブドウ糖）および約２５ｍＭ塩（ＮａＣｌ）である。複合体形成の追加の特徴は、温度調節である。典型的には、カチオン性脂質は、約４℃〜約６５℃、より典型的には約１０℃〜約４２℃、好ましくは約１５℃〜約３７℃、より好ましくはほぼ室温でポリヌクレオチドと複合体形成する。多くの例では、生成物のばらつきを最小化するために、複合体形成中の温度の正確な調節（例えば、＋／−１℃）が重要である。
【００９１】
「ポリヌクレオチドを凝縮する」という句は、ポリヌクレオチドによって占められる容積を減少させることを指す。本発明者等は、本発明の実施形態に従って生成される単一ナノ粒子が、６０００個までのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子を取り込むことができることを示した。
【００９２】
一実施形態によると、ポリヌクレオチドは、元の容積の２０％、元の容積の３０％、元の容積の４０％、元の容積の５０％、元の容積の６０％、元の容積の７０％、元の容積の８０％または元の容積の９０％を占めるように凝縮される。
【００９３】
複合体中のポリヌクレオチド剤としては、ＤＮＡ剤またはＲＮＡ剤が挙げられる。ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００９４】
開示の方法を使用して、抗腫瘍剤をコードする遺伝子を患者に送達することができる。例えば、免疫刺激剤、腫瘍抑制遺伝子、または腫瘍細胞の増殖、局所伸展もしくは転移拡散を妨げる遺伝子を、腫瘍細胞、ならびにそれだけに限定されないが、血管内皮細胞および免疫作動因子、および後に腫瘍に損傷を与える遺伝子を発現する調節細胞を含む、他の標的細胞に送達することができる。このような遺伝子の特定の例としては、それだけに限定されないが、アンギオスタチン、ｐ５３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、エンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ等、１９９７、Ｃｅｌｌ、８８（２）：２７７〜２８５）、ＴＩＭＰ １、ＴＩＭＰ−２、Ｂｃｌ−２およびＢＡＸが挙げられる。さらに、同様の方法論を使用して、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５６３７４８３号、Ｄｒａｎｏｆｆ等発行中に開示のものと類似のがんワクチンを生成することができる。
【００９５】
別の実施形態によると、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡサイレンシング剤を含む。本文脈では、ポリヌクレオチド剤は、標的細胞中で下方制御したい目的の遺伝子に応じて選択されることが認識されよう。
【００９６】
一実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、発がん遺伝子の発現を下方制御するよう選択される。別の実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、生存率に関連する遺伝子の発現を下方制御するよう選択される。
【００９７】
本明細書で使用する「ＲＮＡサイレンシング」という用語は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の抑制または「サイレンシング」をもたらす、ＲＮＡ分子により媒介される配列特異的調節機構のグループ（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング、コサプレッションおよび翻訳抑制）を指す。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物および真菌を含む多くの種類の生物で観察されてきた。
【００９８】
本明細書で使用する「ＲＮＡサイレンシング剤」という用語は、標的遺伝子の発現を抑制または「サイレンシング」することができるＲＮＡを指す。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後サイレンシング機構を通して、ｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（例えば、完全な翻訳および／または発現）を阻止することができる。ＲＮＡサイレンシング剤としては、非コードＲＮＡ分子、例えば対鎖を含むＲＮＡ二重鎖、ならびにこのような小さな非コードＲＮＡを生成させることができるＲＮＡ前駆体が挙げられる。代表的なＲＮＡサイレンシング剤としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなどのｄｓＲＮＡが挙げられる。一実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、翻訳抑制を媒介することができる。
【００９９】
ＲＮＡ干渉は、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。植物において対応するプロセスは、一般的に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、真菌ではクエリングとも呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を阻止するために使用される進化的に保存された細胞防御機構であると考えられており、多様な植物相および門により一般的に共有されている。このような外来遺伝子発現からの防御は、ウイルス感染、または相同性の一本鎖ＲＮＡもしくはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を通したトランスポゾン要素の宿主ゲノムへの無作為の組込みから得られる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に応じて進化したかもしれない。
【０１００】
細胞中の長鎖ｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活動を刺激する。ダイサーは、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い断片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する。ダイサーの活動により得られる短鎖干渉性ＲＮＡは、典型的には長さが約２１〜約２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対の二重鎖を含む。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する、一般的にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な領域の中央で起こる。
【０１０１】
従って、本発明は、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡの使用を意図する。
【０１０２】
一実施形態によると、ｄｓＲＮＡは、３０ｂｐを超える。長鎖ｄｓＲＮＡ（すなわち、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡ）の使用は、これらの長い領域の二本鎖ＲＮＡがインターフェロンおよびＰＫＲ応答の誘導をもたらすと考えられているために非常に制限されてきた。しかしながら、長鎖ｄｓＲＮＡの使用は、多数のｓｉＲＮＡを試験する必要性を軽減する最適なサイレンシング配列を細胞が選択することができるという点で、多数の利点をもたらすことができる；長鎖ｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに必要とされるよりも複雑性が少ないサイレンシングライブラリーを可能にするだろう；そして、おそらく最も重要なことに、長鎖ｄｓＲＮＡは、治療として使用する場合、ウイルスの逃避変異を阻止することができるだろう。
【０１０３】
種々の研究により、長鎖ｄｓＲＮＡを使用して、ストレス応答を誘導せず、または有意なオフターゲット効果を引き起こさずに遺伝子発現をサイレンシングすることができることが示されている−例えば、［Ｓｔｒａｔ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６、第３４巻、第１３号 ３８０３〜３８１０；Ｂｈａｒｇａｗａ Ａ等、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５〜１２５；Ｄｉａｌｌｏ Ｍ．等、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１〜３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３〜１４４８；Ｔｒａｎ Ｎ．等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７〜１３４］を参照されたい。
【０１０４】
特に、本発明はまた、インターフェロン経路が活性化されていない細胞（例えば、胚細胞および卵母細胞）における遺伝子サイレンシングへの長鎖ｄｓＲＮＡ（３０塩基転写産物を超える）の導入を意図する。例えば、Ｂｉｌｌｙ等、ＰＮＡＳ ２００１、第９８巻、１４４２８〜１４４３３頁およびＤｉａｌｌｏ等、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００３年１０月１日、１３（５）：３８１〜３９２．ｄｏｉ：１０．１０８９／１５４５４５７０３３２２６１７０６９を参照されたい。
【０１０５】
本発明はまた、遺伝子発現を下方制御するための、インターフェロンおよびＰＫＲ経路を誘導しないよう特異的に設計された長鎖ｄｓＲＮＡの導入を意図する。例えば、ＳｈｉｎａｇｗａおよびＩｓｈｉｉ［Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１７（１１）：１３４０〜１３４５、２００３］は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターから長鎖二本鎖ＲＮＡを発現するための、ｐＤＥＣＡＰと名付けられたベクターを開発した。ｐＤＥＣＡＰからの転写産物は、ｄｓＲＮＡの細胞質への搬出を促進する５’−キャップ構造および３’−ポリ（Ａ）テールの両方を欠くので、ｐＤＥＣＡＰからの長鎖ｄｓ−ＲＮＡは、インターフェロン応答を誘導しない。
【０１０６】
哺乳類系においてインターフェロンおよびＰＫＲ経路を避ける別の方法は、形質移入または内因性発現のいずれかを通した阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入によるものである。
【０１０７】
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する阻害的低分子ＲＮＡ二重鎖（一般的に１８〜３０塩基対）を指す。２５〜３０塩基長の化学的に合成されたＲＮＡ二重鎖は、同じ場所の２１ｍｅｒと比較して効力が１００倍も増加し得ることが最近記載されたが、典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央の１０ｂｐの二重鎖領域および末端上の対称的な２塩基の３’−オーバーハングを含む２１ｍｅｒとして化学的に合成される。ＲＮＡｉの誘引においてより長鎖のＲＮＡを使用して得られる観察される効力の増加は、産物（２１ｍｅｒ）の代わりに基質（２７ｍｅｒ）をダイサーに提供することから得られ、これがｓｉＲＮＡ二重鎖のＲＩＳＣへの侵入の速度または効率を向上させると理論づけられている。
【０１０８】
３’−オーバーハングの位置は、ｓｉＲＮＡの効力に影響し、アンチセンス鎖上に３’−オーバーハングを有する非対称的な二重鎖は、センス鎖上に３’−オーバーハングを有するものよりも一般的に強力であることが分かってきた（Ｒｏｓｅ等、２００５）。アンチセンス転写産物を標的化すると、反対の効果パターンが観察されるので、これは、ＲＩＳＣに積み込まれている非対称鎖に起因し得る。
【０１０９】
二本鎖干渉性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖を連結して、ヘアピンまたはステム−ループ構造を形成することができる（例えば、ｓｈＲＮＡ）。従って、上記のように、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。
【０１１０】
本明細書で使用する「ｓｈＲＮＡ」という用語は、相補的配列の第１および第２領域を含み、該領域の相補性および配向性の程度は該領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１および第２領域はループ領域により連結され、該ループは該ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如から生じる、ステム−ループ構造を有するＲＮＡ剤を指す。ループ中のヌクレオチドの数は、３〜２３または５〜１５または７〜１３または４〜９または９〜１１の間でありこれを含む数である。ループ中のヌクレオチドのいくつかは、ループ中の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例としては、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．等（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．等（２００２）ＲＮＡ ８：１４５４）が挙げられる。得られる単鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステム−ループまたはヘアピン構造を形成することが当業者により認識されよう。
【０１１１】
別の実施形態によると、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｍｉＲＮＡであり得る。「ｍｉＲＮＡ」という用語はまた、修飾ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ模倣体（アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ））を包含することが認識されよう。
【０１１２】
ｍｉＲＮＡは、種々の大きさの一次転写産物をコードする遺伝子から作られる低分子ＲＮＡである。これらは、動物および植物の両方で同定された。一次転写産物（「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」と呼ばれる）は、種々の核酸分解ステップを通してより短いｍｉＲＮＡ前駆体または「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」へプロセシングされる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、折り畳み形で存在し、その結果最終（成熟）ｍｉＲＮＡは二重鎖で存在し、この２本鎖がｍｉＲＮＡ（最終的に標的と塩基対形成する鎖）と呼ばれる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、前駆体からｍｉＲＮＡ二重鎖を取り出すダイサーの形のための基質であり、その後、ｓｉＲＮＡと同様に、二重鎖はＲＩＳＣ複合体中に取り込まれ得る。ｍｉＲＮＡは遺伝子導入で発現させることができ、一次形態全体よりもむしろ前駆体形態の発現によるのが有効であることが示された（Ｐａｒｉｚｏｔｔｏ等（２００４）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １８：２２３７〜２２４２およびＧｕｏ等（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １７：１３７６〜１３８６）。
【０１１３】
ｓｉＲＮＡとは異なり、ｍｉＲＮＡは、部分的相補性のみを有する転写産物配列と結合し（Ｚｅｎｇ等、２００２、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ ９：１３２７〜１３３３）、定常状態のＲＮＡレベルに影響を与えずに翻訳を抑制する（Ｌｅｅ等、１９９３、Ｃｅｌｌ ７５：８４３〜８５４；Ｗｉｇｈｔｍａｎ等、１９９３、Ｃｅｌｌ ７５：８５５〜８６２）。ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの両者は、ダイサーによりプロセシングされて、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体の成分と会合する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ等、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：８３４〜８３８；Ｇｒｉｓｈｏｋ等、２００１、Ｃｅｌｌ １０６：２３〜３４；Ｋｅｔｔｉｎｇ等、２００１、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：２６５４〜２６５９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ等、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：６８８９〜６８９４；Ｈａｍｍｏｎｄ等、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１１４６〜１１５０；Ｍｏｕｒｌａｔｏｓ等、２００２、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：７２０〜７２８）。最近の報告（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ等、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ ２９７：２０５６〜２０６０）は、ｍｉＲＮＡ経路対ｓｉＲＮＡ経路を通した遺伝子調節が、標的転写産物との相補性の程度によってのみ決定されるという仮説を立てている。ｍＲＮＡ標的と部分的同一性のみを有するｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ分解を誘引するよりもむしろ、ｍｉＲＮＡと同様に、翻訳抑制において機能すると推測される。
【０１１４】
本発明と共に使用するのに適したＲＮＡサイレンシング剤の合成は、以下のように行うことができる。最初に、ＡＵＧ開始コドンの下流のｍＲＮＡ配列を調査して、ＡＡジヌクレオチド配列を探す。各々のＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの出現を、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は調節タンパク質結合部位がより豊富であるので、好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位はオープンリーディングフレームから選択される。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げ得る［Ｔｕｓｃｈｌ ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９〜２４５］。しかし、５’ＵＴＲを向いたｓｉＲＮＡが細胞のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの約９０％の減少を媒介し、タンパク質レベルを完全に無効にするＧＡＰＤＨで示されているように、非翻訳領域を向いたｓｉＲＮＡも有効であることが認識されよう（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）。
【０１１５】
第２に、ＮＣＢＩサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェアなどの任意の配列アラインメントソフトウェアを使用して、潜在的な標的部位を、適当なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラット等）と比較する。他のコード配列と有意な相同性を示す推定上の標的部位を取り除く。
【０１１６】
限定的な標的配列を、ｓｉＲＮＡ合成のための鋳型として選択する。Ｇ／Ｃ含量が低い配列は、５５％より高いＧ／Ｃ含量を有する配列と比較して遺伝子サイレンシングの媒介においてより有効であると判明したので、好ましい配列は、Ｇ／Ｃ含量が低い配列である。好ましくは、いくつかの標的部位を、評価のために標的遺伝子の長さに沿って選択する。選択されたｓｉＲＮＡをより良く評価するために、好ましくは陰性対照を組み合わせて使用する。陰性対照ｓｉＲＮＡは、好ましくはｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムとの有意な相同性を欠く。従って、他の任意の遺伝子と有意な相同性を示さないのであれば、好ましくはスクランブルヌクレオチド配列のｓｉＲＮＡを使用する。
【０１１７】
本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡのみを含む分子に限定する必要はなく、化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含することが認識されよう。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するＲＮＡサイレンシング剤は、「細胞透過性ペプチド」と機能的に関連し得る。本明細書で使用する「細胞透過性ペプチド」は、細胞の形質膜および／または核膜を横切る膜透過性複合体の輸送に関連するエネルギー非依存的（すなわち、非エンドサイトーシスの）移行特性を与える、短い（約１２〜３０個の残基）アミノ酸配列または機能モチーフを含むペプチドである。本発明の膜透過性複合体に使用する細胞透過性ペプチドは、好ましくは、遊離の、またはジスルフィド結合のために修飾された二本鎖リボ核酸とジスルフィド結合を形成するよう誘導体化された、少なくとも１個の非機能的システイン残基を含む。このような特性を与える代表的なアミノ酸モチーフは、その内容が参照により本明細書に特別に組み込まれる、米国特許第６３４８１８５号に列挙される。本発明の細胞透過性ペプチドとしては、好ましくは、それだけに限定されないが、ペネトラチン、トランスポータン、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８〜６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳおよびＭＡＰが挙げられる。
【０１１９】
ＲＮＡサイレンシング剤を使用して標的化されるｍＲＮＡとしては、それだけに限定されないが、その発現が望ましくない表現型形質と相関するものが挙げられる。標的化することができる代表的なｍＲＮＡは、切断型タンパク質をコードするものである、すなわち欠失を含む。従って、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、欠失のいずれかの側の架橋領域を標的化することができる。このようなＲＮＡサイレンシング剤の細胞への導入は、変異タンパク質の下方制御をもたらす一方で、非変異タンパク質は影響されないままにしておく。
【０１２０】
従って、がん、リウマチ性関節炎およびウイルスに関連する遺伝子が標的化され得る。がん関連遺伝子としては、発がん遺伝子（例えば、Ｋ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−ｆｏｓおよびｃｅｒｂ−Ｂ）、増殖因子遺伝子（例えば、上皮増殖因子およびその受容体、繊維芽細胞増殖因子結合タンパク質をコードする遺伝子）、マトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子（例えば、ＭＭＰ−９をコードする遺伝子）、接着分子遺伝子（例えば、ＶＬＡ−６インテグリンをコードする遺伝子）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｂｃｌ−２およびｂｃｌ−Ｘ１）、血管新生遺伝子ならびに転移遺伝子が挙げられる。リウマチ性関節炎関連遺伝子としては、例えば、ストロメリシンおよび腫瘍壊死因子をコードする遺伝子が挙げられる。ウイルス遺伝子としては、ヒトパピローマウイルス遺伝子（例えば、子宮頸がんに関連する）、Ｂ型およびＣ型肝炎遺伝子、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）遺伝子（例えば、網膜炎に関連する）が挙げられる。これらの疾患に関連する多数の他の遺伝子またはその他の遺伝子も標的化することができるだろう。
【０１２１】
目的の遺伝子を効率的に下方制御するために使用することができるアンチセンス分子の設計は、アンチセンスアプローチに重要な２つの側面を考慮しながら行わなければならない。第１の側面は、適当な細胞の細胞質中へのオリゴヌクレオチドの送達であり、第２の側面は、その翻訳を抑制する方法で細胞中の所定のｍＲＮＡと特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
【０１２２】
従来技術は、多種多様な細胞型中にオリゴヌクレオチドを効率的に送達するために使用することができるいくつかの送達戦略を教示している［例えば、Ｌｕｆｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６：７５〜６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ等、Ｂｌｏｏｄ ９１：８５２〜６２（１９９８）；Ｒａｊｕｒ等、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ８：９３５〜４０（１９９７）；Ｌａｖｉｇｎｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３７：５６６〜７１（１９９７）；Ａｏｋｉ等（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３１：５４０〜５（１９９７）およびＰｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８、３１９（５８６３）：６２７〜３０参照］。
【０１２３】
さらに、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方における構造的変化のエネルギー性を説明する熱力学サイクルに基づく、その標的ｍＲＮＡに対する最も高い予測結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムも利用可能である［例えば、Ｗａｌｔｏｎ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：１〜９（１９９９）参照］。
【０１２４】
このようなアルゴリズムは、細胞におけるアンチセンスアプローチを実施するためにうまく使用されてきた。例えば、Ｗａｌｔｏｎ等により開発されたアルゴリズムは、科学者がウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）およびマウス腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）転写産物のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドをうまく設計することを可能にした。同じ研究グループは、動力学的ＰＣＲ技術により評価される、細胞培養における３種のモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸脱水素酵素ＡおよびＢ、ならびにラットｇｐ１３０）に対して合理的に選択されるオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性が、リン酸ジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化学を含む２種の細胞型における３種の異なる標的に対する試験を含むほぼ全ての場合で有効であると判明したとさらに最近報告した。
【０１２５】
さらに、試験管内系を使用する特定のオリゴヌクレオチドの効率を設計および予測するためのいくつかのアプローチも公開された［Ｍａｔｖｅｅｖａ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１３７４〜１３７５（１９９８）］。
【０１２６】
本記載のカチオン性脂質／ポリヌクレオチドまたはカチオン性ポリマー／ポリヌクレオチド複合体は、特定の範囲の大きさを有する安定な小胞に製剤化することができるので、複合体を特定の細胞および／または組織に向けるために、標的化剤を複合体に付着させる（共有結合させる）ことができる。従って、標的化部分または標的化部分の組み合わせを複合体上に付着させることができる。
【０１２７】
本発明のこの態様によると、標的化部分は、酸性条件下で、複合体形成または単離後、複合体と共有結合する。このように、標的化剤が細胞表面上の分子を認識する、または細胞表面上の分子により認識されることが可能である程度まで、標的化剤は、複合体を細胞表面と効果的に密接に接触させるブリッジ分子として働くことができる。
【０１２８】
本発明者等は、４．５未満のｐＨでの標的化部分（例えば、ヒアルロナン；ＨＡ）のカチオン性分子への添加が、より高ｐＨで架橋が行われる場合よりも、均一であり、大量のポリヌクレオチド剤を封入することができるナノ粒子を生成することを発見した。一態様によると、共有結合が行われる酸性ｐＨは、約４．５、４、３．５、３、２．５またはそれより下である。
【０１２９】
本開示のために、「標的化部分」という用語は、複合体に組み込むことができる任意のおよび全てのリガンドまたはリガンド受容体を指す。このようなリガンドとしては、それだけに限定されないが、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤなどの抗体、またはその任意の部分もしくはサブセット、細胞因子、インテグリン、プロテオグリカン、シアル酸残基等などの細胞表面受容体およびそのリガンド、ＭＨＣもしくはＨＬＡマーカー、ウイルス外被タンパク質、ペプチドもしくは小さな有機リガンド、これらの誘導体などが挙げられる。
【０１３０】
標的遺伝子送達用途のために特に対象となるのは、種々の細胞表面マーカーおよび受容体をコードするタンパク質である。このようなタンパク質の代表的なものである簡単な一覧としては、それだけに限定されないが、ＣＤ１（ａ〜ｃ）、ＣＤ４、ＣＤ８〜１１（ａ〜ｃ）、ＣＤ１５、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ２１〜２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０〜４５（Ｒ（Ｏ、Ａ、およびＢ））、ＣＤ４６〜４８、ＣＤｗ４９（ｂ、ｄ、ｆ）、ＣＤｗ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５３〜５４、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１〜６４、ＣＤｗ６５、ＣＤ６６〜６９、ＣＤｗ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３〜７４、ＣＤｗ７５、ＣＤ７６〜７７、ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２、ならびにＴ−細胞受容体、インテグリン受容体、増殖性内皮のエンドグリン、またはこれに対する抗体が挙げられる。
【０１３１】
特定の実施形態によると、標的化部分は、それだけに限定されないが、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマチン硫酸、これらの塩および混合物を含むグリコサミノグリカンである。
【０１３２】
グリコサミノグリカンの場合、典型的には、これらの分子は、本発明のナノ粒子への組込みの前に活性化している。グリコサミノグリカンを活性化する代表的な方法は、実施例１および２に記載のように、酸性緩衝液中でこれらをインキュベートすることによる。
【０１３３】
このように、内皮細胞、幹細胞、がん幹細胞、生殖系細胞、上皮細胞、島、ニューロンまたは神経組織、中皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要な腺または器官（例えば、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、皮膚等）の細胞、外分泌および／または内分泌細胞などの種々の細胞のいずれかを遺伝子送達のために標的化することができる。
【０１３４】
標的化部分の付着後、適当なリガンドもしくは抗体、またはこれらの混合物を、適当な固体担体、すなわちラテックスビーズ、マイクロキャリアビーズ、膜またはフィルターなどに付着させ、調製物の残部から標的化受容体もしくはリガンドを組み込むナノ粒子を選択的に結合および単離するために使用することができる。従って、使用前に所望のポリヌクレオチド複合体を単離する方法が提供される。
【０１３５】
本明細書で使用する「ナノ粒子」という用語は、個々の原子と巨視的なバルク固体との間の中間の大きさを有する粒子（単数または複数）を指す。一般に、ナノ粒子は、μｍ未満の範囲の、例えば、約１ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、または１０ｎｍ程度、例えば約１ｎｍ〜約１００ｎｍの特有の大きさ（例えば、概して球状のナノ粒子については直径、または概して細長いナノ粒子については長さ）を有する。他の代表的な大きさとしては、約３０ｎｍ〜２５０ｎｍまたは約５０ｎｍ〜３００ｎｍが挙げられる。
【０１３６】
粒子の大きさを測定する方法は、当技術分野で既知であり、本明細書の以下の実施例の節でさらに記載する。
【０１３７】
ナノ粒子は、それだけに限定されないが、ナノワイヤーなどの細長い粒子形状、または概して球状、六角形および立方体のナノ粒子などのより規則的な形状に加えて、不規則な形状を含む任意の形状であってよい。一実施形態によると、ナノ粒子は、概して球状である。
【０１３８】
丸い形の粒子は、典型的には、特定の幾何学的形状の完全な球形からの偏差を一般的に定量化する真球度として知られる幾何学量により定量的に特徴づけられる。
【０１３９】
理想的には、三次元物体の真球度は、物体の容積を物体に外接する球の容積で割ることにより計算される。しかしながら、いくつかの物体については、容積の決定が困難であり、しばしば不可能である。そのため、実用的な理由で、真球度の代替「二次元」定義を使用する。この代替法によると、真球度は、ある基準面上の物体の投影の面積と投影に外接する円の面積との間の比と定義される。例えば、平面ディスプレイ上に物体の像を表示すると考えると、平面ディスプレイを基準面とみなすことができ、物体の像を基準面上の物体の投影とみなすことができる。
【０１４０】
従って、像の面積をＡ、像の周囲長をＰで表すと、真球度、ｓは、ｓ＝４πＡ／Ｐ２と定義することができる。当業者により認識されるように、像が完全な円である場合、Ａ＝π（Ｐ／２π）２＝Ｐ２／４πでｓ＝１である。像の面積が０である（すなわち、像が線または曲線である）場合、ｓ＝０である。
【０１４１】
特に定義しない限り、本明細書で使用する「真球度」は、二次元真球度を指す。
【０１４２】
多くの粒子（例えば１０以上）または多くの異なる基準面に対して計算し、平均すれば、「二次元」真球度は、良い近似で、「三次元」真球度（容積の比）に相当すると認識される。このような事象では、「二次元」真球度、ｓから始めて、「三次元」真球度をｓ２の立方根と定義することができる。
【０１４３】
本発明の好ましい実施形態によると、粒子の真球度は、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％である。
【０１４４】
本発明のナノ粒子のゼータ電位は、−１０〜−７５ｍＶ、より好ましくは−２５〜−５０ｍＶに及び得る。従って、本発明のナノ粒子は、負に帯電し得る。
【０１４５】
本発明の方法に従って生成される粒子は、実質的に均一である、すなわち、全て均一な形状および大きさである。一実施形態によると、ナノ粒子集団は、集団の平均的なナノ粒子の大きさから５％、１０％、２０％または３０％超異なるナノ粒子を含まない。
【０１４６】
本発明により意図される代表的な粒子の均一集団は、以下の通りである：
ｓｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分（例えば、ＨＡ）を含む殻を含む粒子であって、
粒子の集団の粒子の各々は、約−４０ｍＶのゼータ電位を含み、粒子の集団の粒子の各々は、溶液中の場合、直径が約１００〜３００ｎｍである。
【０１４７】
本発明により意図される別の代表的な粒子の均一集団は、以下の通りである：
ｍｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分（例えば、ＨＡ）を含む殻を含む粒子であって、
粒子の集団の粒子の各々は、溶液中の場合、直径が約３０〜５０ｎｍである。
【０１４８】
上記のように、本発明の粒子は、標的がん細胞および／またはがん幹細胞を標的化するように、設計することができる。
【０１４９】
従って、本発明の別の態様によると、被験体に治療上有効量の本明細書に記載の方法に従って生成される粒子を投与し、それによりがんを治療するステップを含む、それを必要とする被験体のがんを治療する方法が提供される。
【０１５０】
本明細書で使用する「がん」という用語は、発がん性形質転換細胞の増殖から生じる疾患または障害を指す。
【０１５１】
本発明により治療することができる代表的ながんとしては、それだけに限定されないが、消化管の腫瘍（結腸がん、直腸がん、肛門がん、直腸結腸がん、小および／または大腸がん、食道がん、胃がん、膵がん、胃がん、小腸がん、小腸に生じる腺がん、小腸に生じるカルチノイド腫瘍、小腸に生じるリンパ腫、小腸に生じる間葉腫、消化管間質腫瘍）、胆嚢癌、胆道腫瘍、前立腺がん、腎臓（腎）がん（例えば、ウィルムス腫瘍）、肝がん（例えば、肝芽腫、肝細胞癌）、肝胆道がん、胆樹がん、胆嚢の腫瘍、膀胱がん、胎児性横紋筋肉腫、胚細胞腫瘍、絨毛性腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣の未熟奇形腫、子宮腫瘍、上皮性卵巣腫瘍、仙尾骨腫瘍、絨毛癌、胎盤部トロホブラスト腫瘍、上皮成人型腫瘍、卵巣がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、肺がん（例えば、小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、鼻咽頭がん、乳がん、扁平上皮癌（例えば、頭頸部中）、神経原性腫瘍、星細胞腫、神経節芽腫、神経芽細胞腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胸腺リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫）、神経膠腫、甲状腺髄様癌、精巣がん、脳および頭／頸部がん、婦人科がん、子宮内膜がん、胚細胞腫瘍、間葉腫、神経原性腫瘍、膀胱がん、尿管がん、腎盂がん、尿道がん、陰茎がん、精巣がん、子宮体がん、子宮内膜癌、子宮肉腫、腹膜癌および卵管癌、卵巣の胚細胞腫瘍、性索間質腫瘍、内分泌系がん、甲状腺腫瘍、甲状腺髄様癌、甲状腺リンパ腫、副甲状腺腫瘍、副腎腫瘍、膵内分泌腫瘍、軟組織および骨の肉腫、良性および悪性中皮腫、悪性腹膜中皮腫、精巣鞘膜の悪性中皮腫、心膜の悪性中皮腫、皮膚がん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、中枢神経系の新生物、髄芽腫、髄膜腫、末梢神経腫瘍、松果体領域の腫瘍、下垂体腺腫、頭蓋咽頭腫、聴神経腫、頸静脈グロムス腫瘍、脊索腫および軟骨肉腫、血管芽腫、脈絡叢乳頭腫および癌、脊髄軸腫瘍、白血病、ならびに慢性白血病が挙げられる。
【０１５２】
「被験体」という用語は、動物、典型的にはヒトを含む哺乳類を指す。
【０１５３】
本発明の粒子は、それ自体で、または適当な担体もしくは添加剤と混合した医薬組成物で被験体に投与することができる。
【０１５４】
本明細書で使用する「医薬組成物」は、生理学的に適当な担体および添加剤などの他の化学成分を含む、本明細書に記載の１つまたは複数の有効成分の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を促進することである。
【０１５５】
本明細書で、「有効成分」という用語は、生物学的効果を説明できるポリヌクレオチド剤を含む粒子を指す。
【０１５６】
以降、互換的に使用することができる「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という句は、生物に対する有意な刺激をもたらさず、投与する化合物の生物活性および特性を抑止しない担体または賦形剤を指す。アジュバントはこれらの句に含まれる。
【０１５７】
本明細書で、「添加剤」という用語は、有効成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加する不活性物質を指す。それだけに限定されないが、添加剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々の種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１５８】
薬物の処方および投与についての技術は、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版中に見つけることができる。
【０１５９】
投与の適当な経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸または非経口送達、例えば筋肉内、皮下および髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射が挙げられる。
【０１６０】
あるいは、例えば、医薬組成物を患者の組織領域中へ直接注射することにより、全身的というよりもむしろ局所的に医薬組成物を投与することができる。
【０１６１】
従って、本発明による使用のための医薬組成物は、薬学的に使用することができる製剤中への有効成分の加工を促進する添加剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用する従来の方法で製剤化することができる。適当な処方は、選択する投与経路に依存する。
【０１６２】
注射のために、医薬組成物の有効成分を、水溶液、好ましくはハンクス液、リンガー液または生理的塩緩衝液などの生理的適合性緩衝液中で製剤化することができる。経粘膜投与のために、透過する障壁に適した透過剤を製剤中に使用する。このような透過剤は当技術分野で既知である。
【０１６３】
経口投与のために、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と結合させることにより、医薬組成物を容易に製剤化することができる。このような担体は、医薬組成物が、患者による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに製剤化されることを可能にする。経口的に使用するための医薬調製物は、固体添加剤を使用して、必要に応じて、所望であれば適当な補助剤を加えた後に、その結果得られる混合物をすりつぶし、この顆粒の混合物を加工することによって、錠剤または糖衣錠の核を得ることにより作ることができる。適当な添加剤は、特に、乳糖、ショ糖、マンニトールもしくはソルビトールを含む糖；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマーなどの増量剤である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天もしくはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのこれらの塩などの崩壊剤を添加してもよい。
【０１６４】
経口的に使用することができる医薬組成物としては、ゼラチンで作られた硬カプセル剤（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ ｃａｐｓｕｌｅ）ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から作られた軟カプセル剤（ｓｏｆｔ，ｓｅａｌｅｄ ｃａｐｓｕｌｅ）が挙げられる。硬カプセル剤は、乳糖などの増量剤、デンプンなどの結合剤、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意で安定剤と混合した有効成分を含み得る。軟カプセル剤では、有効成分は、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与のための全ての製剤は、選択する投与経路に適した投与量とすべきである。
【０１６５】
頬側投与のために、組成物は、従来の方法で製剤化される錠剤またはロゼンジ剤の形をとってもよい。
【０１６６】
鼻吸入による投与のために、本発明による使用のための有効成分は、適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を使用して、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するバルブを供給することにより、決定することができる。ディスペンサーで使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物および乳糖もしくはデンプンなどの適当な粉末基剤を含んで製剤化することができる。
【０１６７】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えばボーラス注射または持続点滴による、非経口投与のために製剤化することができる。注射のための製剤は、任意で追加の保存剤を含む、例えばアンプル中の単位剤形で、または多用量容器で提供され得る。組成物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性媒体中のエマルジョンであってよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。
【０１６８】
あるいは、有効成分は、使用前に、適当な媒体、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水をベースとする溶液により構成するための粉末形態であってもよい。
【０１６９】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使用して、坐剤または保持浣腸剤などの直腸用組成物に製剤化することもできる。
【０１７０】
本発明の文脈中での使用に適した医薬組成物は、有効成分が所期の目的を達成するために有効な量含まれている組成物を含む。より具体的には、治療上有効量とは、障害（例えば、がん）の症状を予防、軽減もしくは寛解させる、または治療されている被験体の生存を延長するのに有効な有効成分（粒子組成物）の量を意味する。
【０１７１】
治療上有効量の決定は、特に、本明細書で提供される詳細な開示に照らして、十分当業者の能力の範囲内にある。
【０１７２】
本発明の方法で使用される任意の調製物のために、治療上有効量または用量を、最初に試験管内および細胞培養試験から推定することができる。例えば、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルで用量を策定することができる。このような情報を使用して、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１７３】
本明細書に記載の有効成分の毒性および治療効果は、試験管内、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順により決定することができる。これらの試験管内および細胞培養試験ならびに動物研究から得られるデータを、ヒトに使用するための投与量の範囲を策定するのに使用することができる。投与量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じて変化し得る。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ等、１９７５、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、１章、１頁中参照）。
【０１７４】
投与量および投与間隔は、生物学的効果を誘導するもしくは抑制するのに十分な有効成分の血漿または脳レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）をもたらすよう個々に調整することができる。ＭＥＣは各々の調製物について変化するが、試験管内データから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個体形質および投与経路に依存する。検出試験を使用して、血漿濃度を決定することができる。
【０１７５】
治療する状態の重症度および応答性に応じて、投与は単回投与または複数回投与とすることができ、治療クールは数日間から数週間、または治癒がもたらされるまでもしくは疾患状態の減少が達成されるまで続く。
【０１７６】
投与する組成物の量は、当然、治療する被験体、苦痛の重症度、投与方法、処方する医師の判断等に依存する。
【０１７７】
本発明の組成物は、所望であれば、有効成分を含む単一または複数単位剤形を含み得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサー装置で提供され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含んでよい。パックまたはディスペンサー装置は、投与説明書を伴ってよい。パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形態の容器と付随した通知を収容してもよく、この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の機関による承認を反映している。例えば、このような通知は、処方薬についての米国食品医薬品局により承認されたラベリングまたは承認された製品添付文書であり得る。適合性の医薬担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物はまた、適当な容器中に調製し、配置し、上でさらに詳述したように、示された状態の治療についてラベルされ得る。
【０１７８】
本明細書で使用する「方法」という用語は、それだけに限定されないが、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の専門家に知られている、またはこれらの専門家により既知の様式、手段、技術および手順から容易に発展される様式、手段、技術および手順を含む、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を指す。
【０１７９】
本明細書で使用する「治療する」という用語は、状態の進行を抑止する、実質的に抑制する、遅らせる、もしくは逆行させる、状態の臨床的もしくは審美的症状を実質的に寛解させる、または状態の臨床的もしくは審美的症状の出現を実質的に予防することを含む。
【０１８０】
本明細書で使用する「約」という用語は、±５％を指す。
【０１８１】
本出願の至る所で、本発明の種々の実施形態は範囲形式で与えられ得る。範囲形式の記載は単なる便宜上および簡潔のためのものであることを理解すべきであり、本発明の範囲に対する変更できない制限と解釈すべきではない。従って、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値を含むと考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等などの具体的に開示される部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５および６を含むと考えるべきである。範囲の幅にかかわらずこれを適用する。
【０１８２】
本明細書で数値範囲を示す場合はいつでも、示される範囲内の任意の言及された数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１指示数と第２指示数「の間に及ぶ」および第１指示数「から」第２指示数「まで及ぶ」という句は、本明細書で互換的に使用され、第１および第２指示数、ならびにその間の全ての分数および整数を含むことになっている。明確にするために、別の実施形態の文脈中で記載されている本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態中で、組み合わせで提供され得ることが認識される。逆に、簡潔のために単一の実施形態の文脈中で記載されている本発明の種々の特徴はまた、本発明の他の任意の記載された実施形態中で、別々に、または任意の適当な部分的組み合わせで、または適当に提供され得る。種々の実施形態の文脈中で記載される特定の特徴は、実施形態がこれらの要素なしで実施不能でない限り、これらの実施形態の必須の特徴であると考えるべきではない。
【０１８３】
上で叙述され、以下の特許請求の範囲の節で請求される、本発明の種々の実施形態および態様は、以下の実施例中に実験的裏付けを見出す。
実施例
【０１８４】
ここで、上記記載と共に非限定的な様式で本発明のいくつかの実施形態を説明する以下の実施例を参照する。
【０１８５】
一般に、本明細書で使用する命名法および本発明で利用する実験手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編、（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ等、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ等、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ等（編）「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４６６６８２８号；第４６８３２０２号；第４８０１５３１号；第５１９２６５９号および第５２７２０５７号に示される方法論；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｉｔｅｓ等（編）、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能な免疫学的測定法は、特許および科学文献に広範に記載されており、例えば、米国特許第３７９１９３２号；第３８３９１５３号；第３８５０７５２号；第３８５０５７８号；第３８５３９８７号；第３８６７５１７号；第３８７９２６２号；第３９０１６５４号；第３９３５０７４号；第３９８４５３３号；第３９９６３４５号；第４０３４０７４号；第４０９８８７６号；第４８７９２１９号；第５０１１７７１号および第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ等、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；を参照されたい。これらの全ては、本明細書に完全に示されるように、参照により組み込まれている。他の一般的な参考文献は、本文書の至る所で提供される。これらの文献中の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。これらの文献に含まれる全ての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１
ＤＯＴＡＰをベースとする粒子
材料および方法
【０１８６】
脂質（ＤＯＴＡＰおよびコレステロール）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、米国）から購入し；ＨＳＰＣはＬＩＰＯＩＤ、Ｇｅｒｍａｎｙ Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）から購入し；ヒト組換えプロタミン（Ａｂｎｏｖａ製）；直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）はＳｉｇｍａから購入した。ヒアルロナン、Ｍｗ７５１ＫＤａ、固有粘度：１６ｄＬ／ｇ（Ｇｅｎｚｙｍｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）；ＦＩＴＣ−ＨＡはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ドイツ）から入手した。Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡはＱｉａｇｅｎから入手し；非標識（サイクリンＤ１、ＲＡＳ、ＨＭＧＡもしくはＭＹＣに対して標的特異的なまたはスクランブル）ｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎから入手した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）；ホウ酸およびホウ砂（四ホウ酸ナトリウム十水和物）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から購入した。３Ｈ−ＨＡはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から購入した。細胞培養プレートはＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）から入手した。細胞培養のための材料は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃｏ．（Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ）から入手した。透析管（１２０００〜１４０００の分子量カットオフ）は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｓ、ＣＡ）から購入した。ポリカーボネート膜はＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）から購入した。他の全ての試薬は、分析用とした。
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ模倣体（アンタゴｍｉｒ）の調製：
【０１８７】
Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡスクランブル配列は、Ｑｉａｇｅｎ製とした。サイクリンＤ１ｓｉＲＮＡおよび陰性対照ｓｉＲＮＡ（スクランブル配列）は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入し、以前に報告された［Ｐｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９、６２７〜６３０（２００８）］。ＲＡＳ、ＨＭＧＡ２またはＭＹＣ ｓｉＲＮＡは、以前公開されたものであり［Ｙｕ等、Ｃｅｌｌ １３１、１１０９〜１１２３（２００７）］、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。
ｓｉＲＮＡをカプセル化したＨ−ｍｅｒ（ヒアルロン酸被覆ナノ粒子）の調製−方法１
【０１８８】
ＤＯＴＡＰをベースとする粒子の調製：５ｍｇ／ｍＬの脂質濃度で４５：３３：２２のモル比の水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロールおよびジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を、伝統的な脂質−フィルム法により調製した［Ｐｅｅｒ，Ｄ．等 Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １６１２、７６〜８２（２００３）；Ｐｅｅｒ，Ｄ．＆Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｒ． Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３８３、１８５〜１９０（２０００）］。手短に言えば、脂質を６０℃で２０分間エタノールに溶解し、次いで、ロータリーエバポレーター（Ｂｕｃｈｉ、スイス）中減圧下で蒸発乾固した。次いで、薄い脂質フィルムを、ｐＨ７．４で、緩衝液のみ（ＰＢＳ）からなる膨潤溶液により水和した。この後、ボルテックス装置を使用して大規模に攪拌し、３７℃の振盪恒温槽中で２時間インキュベートした。小単層小胞（ＳＵＶ）を、６０℃で２００〜５００ｐｓｉの窒素圧下、Ｌｉｐｅｘ押出装置を操作して、ＭＬＶの押し出し成形により得た。押し出し成形は、最終的な大きさが直径３０ｎｍになるまで、１孔径当たり数サイクルを使用して、次第により小さい孔径膜を使用する段階で行った。ストックの１：１０００希釈（すなわち、５μｇ／ｍＬ）の粒度分布は、直径２５±４ｎｍでゼータ電位＋７２．３±６．１ｍＶであった。
【０１８９】
オリゴフェクトアミン（商標）、ＰＥＩ（商標）およびプロタミン複合体の調製：オリゴフェクトアミンまたはＰＥＩ複合体の調製を、これらの製造業者により推奨されるように行った。手短に言えば、ｓｉＲＮＡ６０ｐｍｏｌを、血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）血清使用量低減培地５０μｌ中に希釈し、穏やかに混合した。分枝ＰＥＩまたはオリゴフェクトアミンを希釈した（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地１２μｌ中に３μｌ）。これを穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。希釈ｓｉＲＮＡを希釈オリゴフェクトアミン（商標）と合わせて（総容積は６８μｌである）、穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートして、ｓｉＲＮＡ：オリゴフェクトアミン複合体を形成させた。プロタミン（ヒト組換え体）については、同じプロトコルを使用したが、プロタミンとｓｉＲＮＡの比は５：１のモル比とした。（プロタミンの管をｓｉＲＮＡの管に添加して複合体を生成した）。
【０１９０】
活性化ヒアルロン酸（ＨＡ）酢酸塩の調製：活性化ＨＡ８ｍｇをガラスバイアルに量り入れ、０．１Ｍ ｐＨ４．０（１ｍｇ／ｍｌ）酢酸緩衝液８ｍｌに溶解した。ＨＡが完全に溶解するまで、混合物を３７℃で数分間攪拌した。ＥＤＣを過剰に４０ｍｇ添加した（５ｍｇ ＥＤＣ／ｍｇ ＨＡ）。溶液を３７℃で２時間攪拌した。
【０１９１】
脂質−ｓｉＲＮＡ懸濁液の調製：粒子（５μｌ／ｍＬ）３μｌを、ＤＭＥＭ１２μｌに添加した。懸濁液を穏やかに攪拌し、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ（１００μＭ、３００ｐｍｏｌ）３μｌをＤＭＥＭ５０μｌに添加した。溶液を穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。粒子溶液をｓｉＲＮＡ溶液に添加し、穏やかに攪拌しながら室温で２０分間インキュベートした。
【０１９２】
ヒアルマーの組み立て（２４ウェルプレートの１ウェル当たり）：活性化ＨＡ（１：５ｖ／ｖ（ＨＡ：複合体）の比）１３．６μｌを、脂質−ｓｉＲＮＡ複合体６８μｌに添加し、穏やかに攪拌しながら３７℃で２時間インキュベートした。ＤＭＥＭ１８．３μｌを添加して最終容積１００μｌ（１ウェル当たり）とした。ｐＨをｐＨ７．０〜７．４に修正した。
【０１９３】
５ｍｇ／ｍｌ粒子および０．３μｍｏｌまでを使用して、この系を１０００倍スケールアップした。
ｓｉＲＮＡをカプセル化したＨ−ｍｅｒ（ヒアルロン酸被覆ナノ粒子）の調製−方法２
【０１９４】
ＤＯＴＡＰをベースとする粒子の調製：本明細書上記の通りである。
【０１９５】
ＤＤＷ活性化ＨＡの調製：ＨＡ８ｍｇをガラスバイアルに量り入れ、ＤＤＷ（１ｍｇ／ｍｌ）８ｍｌに溶解した。ＨＡが完全に溶解するまで、これを３７℃で数分間攪拌した。ＥＤＣを過剰に４０ｍｇ添加した（５ｍｇ ＥＤＣ／ｍｇ ＨＡ）。溶液を３７℃で２時間攪拌した。
【０１９６】
脂質−ｓｉＲＮＡ懸濁液の調製：本明細書上記の通りである。
【０１９７】
ヒアルマーの組み立て（２４ウェルプレートの１ウェル当たり）：本明細書上記の通りである。
【０１９８】
この系を、１０倍を超えてスケールアップすることはできなかった、すなわち粒子濃度は５０μｇ／ｍＬおよびｓｉＲＮＡは３ｎｍｏｌに過ぎない。
【０１９９】
粒子の表面トポロジー：粒子の表面トポロジーの測定を、タッピングモード（ｔａｐｐｉｎｇ ｍｏｄｅ）で操作したＤｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（米国）のＮａｎｏＳｃｏｐｅ ＩＩＩａ ＭｕｌｔｉＭｏｄｅ ＡＦＭにより行った。ＡＦＭ測定の少し前に、Ｈ−ｍｅｒサンプルを、１：１０に希釈し、小滴（約５０μｌ）を酸化シリコン上に載せた。数分後、サンプルを窒素のファインビーム下で乾燥させ、スクリーニングのために採取した。Ｈ−ｍｅｒの測定は、非接触法および三角形シリコンチップ（Ｒ＜２０ｎｍ）を使用して、１Ｈｚのスキャン速度で、室温および大気圧で行った。チップとサンプルとの間の間隙は１０〜１００Åであった。サンプル面積上、２つのセグメント中、５１２のラインをスキャンして、二次元範囲を形成した。
【０２００】
Ｅ−ＳＥＭ（環境制御形走査電子顕微鏡法）も行った。
【０２０１】
粒子の流体力学的直径およびゼータ電位測定：Ｈ−ｍｅｒの直径を、自動アルゴリズムモードを使用して、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳ Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）で測定し、ＰＣＳ１．３２ａで解析した。全測定は、０．０１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７中、室温で行った。
【０２０２】
カプセル化効率：系中の総ｓｉＲＮＡに対する封入されたｓｉＲＮＡの比として定義されるカプセル化効率を、遠心分離により測定することができる。全部のＨ−ｍｅｒ調製物（すなわち、カプセル化および非カプセル化ｓｉＲＮＡの両方を含む）のサンプルを、小型超遠心分離（Ｓｏｒｖａｌ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １５０Ｍ）で遠心分離した。非カプセル化ｓｉＲＮＡを含む上清を除去し、カプセル化ｓｉＲＮＡを含む粒子を含むペレットを、ｓｉＲＮＡを含まない緩衝液に再懸濁した。上清中およびペレット中、ならびに全部の調製物中のｓｉＲＮＡをリボグリーンアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により分析し、そこからカプセル化効率および物質の保存を以前記載したように計算することができる［Ｐｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９、６２７〜６３０（２００８）］。
【０２０３】
試験管内試験用の細胞系：乳房Ｔ−ＩＣ（ＢＴ−ＩＣ）は、無血清培地中の非接着性球（「マンモスフェア（ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ）」）として繰り返して継代培養することができ、分化マーカー（サイトケラチン、平滑筋アクチンおよびムチン−１）の発現を欠き、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−である。しかしながら、これらのマーカーは、ＢＴ−ＩＣを初期前駆細胞（ＥＰＣ）と区別することができない。ＢＴ−ＩＣが化学療法に比較的耐性である理由は、おそらく多因子的であるが、まだ大部分は未決定である。１つの機構は、増強された薬物排出である（フローサイトメトリーによる薬物排出副集団ＳＰとして測定される）。ＢＴ−ＩＣおよびＥＰＣは、ＡＢＣＧ多剤輸送体の発現を増強し、メラノーマ幹細胞は別の多剤輸送体、ＡＢＣＢ５を過剰発現する。
【０２０４】
エピルビシンの選択圧下でのＳＫＢＲ３細胞の生体内継代培養により、ＢＴ−ＩＣに非常に富んだヒト乳がん細胞系（ＳＫ−３ｒｄ）を生成した。これらの細胞は、幹細胞の特性（自己再生、多分化能）を安定的に維持し、球形成条件下、試験管内で無限に拡大し、さらなる研究用の無限の数の細胞を提供することができる。ＳＫ−３ｒｄ細胞は、ＳＫＢＲ３よりも１００倍少ない細胞を使用してＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで腫瘍を形成し、ＳＫＢＲ３とは異なり、その腫瘍は転移性である。さらに、これらの細胞は化学療法に比較的耐性である。
【０２０５】
ＨＬ６０ヒト急性骨随性白血病（ＡＭＬ）細胞も白血病幹細胞のモデルとして使用した。
【０２０６】
フローサイトメトリー研究：蛍光標識したｓｉＲＮＡを使用する際、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎシステムを使用してＣｙ３＋細胞の量を定量化した。
【０２０７】
画像取得および処理：Ｏｌｙｍｐｕｓ １００Ｘ ＬＵＭＰｌａｎＦＬ１．０水浸対物を取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０ＢＷＩ顕微鏡を組み込んだＢｉｏｒａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２０００ Ｌａｓｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して共焦点イメージングを行った。画像取得は、Ｌａｓｅｒｓｃａｎ ２０００ソフトウェアを使用して行い、画像処理はＯｐｅｎｌａｂ ３．１．５ソフトウェアを使用して行った（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）。
【０２０８】
インターフェロンアッセイ：ＨＬ６０細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）をモック処理、または１０００ｐｍｏｌ対照（陰性）−ｓｉＲＮＡもしくは５μｇ／ｍｌポリ（Ｉ：Ｃ）を封入したＨ−ｍｅｒで４８時間処理した。ＩＦＮまたはインターフェロン応答遺伝子の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより調査した。
【０２０９】
ｓｉＲＮＡの試験管内形質移入：２４ウェルマイクロタイタープレート（２００μｌ培地中２．５×１０５細胞／ウェル）中、３７℃、５％ＣＯ２で一晩前培養した細胞（ＳＫＢＲ３、ＳＫ−３ｒｄまたはＨＬ−６０）を、ｓｉＲＮＡまたは適当な対照を封入した一定分量（５０μｌ／ウェル）のＨ−ｍｅｒに与えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で６〜７２時間培養し、フローサイトメトリーおよび／またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析に供した。
【０２１０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ：ＡＢＩ１ステップと装置を使用した定量的ＲＴ−ＰＣＲを、以前記載したように行った。以前記載したように、ヒトＯＡＳ１用プライマーおよびＩＦＮ−βを使用した［Ｐｅｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８、３１９（５８６３）：６２７〜３０］。プライマー配列は以下の通りとした：
ヒトサイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）
順方向：ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＴ（配列番号１）
逆方向：ＴＧＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＴ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ
順方向：ＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＡＣ（配列番号３）
逆方向：ＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡ（配列番号４）
ＳＴＡＴ１
順方向：ＧＴＧＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡ（配列番号５）
逆方向：ＴＡＧＧＧＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡ（配列番号６）
結果
ｓｉＲＮＡを封入したヒアルロン酸被覆ナノ粒子（Ｈ−ｍｅｒ）の調製および構造評価
【０２１１】
ｓｉＲＮＡを封入したＨ−ｍｅｒを実験節で詳述したように調製した。ＤＯＴＡＰ、ＰＥＩ、オリゴフェトアミン（商標）およびヒト組換えプロタミンなどの、いくつかの正に帯電した物質を、ｓｉＲＮＡとの自己組立過程に使用した。
【０２１２】
トポグラフィー（図１Ａ）および流体力学的直径（表１）により示されるように、酢酸緩衝液で生成したＤＯＴＡＰ Ｈ−ｍｅｒは均一な球状ナノ粒子形状を形成した。ゼータ電位の測定（表１）は、（これらの条件で凝集体を形成しないことにより）生理的ｐＨでの安定性を示している。さらに、Ｈ−ｍｅｒは、大量のＲＮＡｉペイロードを封入した（表１）。
【表１】
【０２１３】
全測定は室温で行った。凍結乾燥したｓｉＲＮＡを封入しているＨ−ｍｅｒを、０．０１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７に再懸濁した。以前報告したように２１、リボグリーンアッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｓｉＲＮＡを定量化した。データは、３バッチの平均値±ＳＤを表す。
【０２１４】
これらの測定から、酢酸緩衝液中でのＨ−ｍｅｒの調製がその構造を安定化することが明らかである。酢酸緩衝液中で作成したＨ−ｍｅｒの粒度分布は、ＤＤＷ中で作成したＨ−ｍｅｒよりもはるかに小さい。
【０２１５】
粒子への組立プロセスを駆動する低ｐＨが、アミン型の正に帯電した物質の、活性化ＨＡのカルボン酸基との結合を増加させるのに不可欠であると結論づけることができる。
最良の製剤をスクリーニングするためのＣＤ４４発現細胞への形質移入
【０２１６】
ＣＤ４４ｈｉｇｈを発現しているヒト膵臓腺癌（ＰＡＮＣ−１）細胞を使用して、異なる製剤の形質移入効率を決定した（全て、製剤中のカチオン性実体としてＤＯＴＡＰを使用して作成した）。代表的な画像を図２Ａ〜Ｆおよび表２に示す。
【０２１７】
データは、独立した実験の平均値±ＳＤである。
【表２】
酢酸緩衝液中で生成した、カチオン性実体としてのＤＯＴＡＰから生成した粒子（Ｈ−ｍｅｒ）を使用した腫瘍開始細胞（Ｔ−ＩＣ、がん幹細胞）へのｓｉＲＮＡの選択的送達
【０２１８】
がん幹細胞へのｓｉＲＮＡの選択的送達を調査するために（そのため、特異性を扱う）、３種類の細胞を使用した：ＳＫＢＲ３に由来するＳＫ−３ｒｄ乳がん幹細胞、これは大量のＣＤ４４を発現している（ＣＤ４４ｈｉｇｈ）；ＣＤ４４を発現しているＳＫＢＲ３細胞（ＣＤ４４＋）およびＣＤ４４を発現していないＣＶ−１細胞（ＣＤ４４−）。生体内条件を刺激するために、細胞をＨ−ｍｅｒまたは対照（オリゴフェクトアミン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、細胞に非選択的な形質移入試薬として使用する市販のカチオン性リポソーム）に短時間（３時間）曝露した。次いで、細胞を２度洗浄し、フローサイトメトリー分析の前にさらに６時間インキュベートした。
【０２１９】
オリゴフェクトアミン（商標）を製造ガイドラインに従って５０ｎＭ Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡと混合、またはＨ−ｍｅｒを同じｓｉＲＮＡ量（５０ｎＭ）封入させた。
【０２２０】
結果を、本明細書以下の表３に要約する。
【表３】
【０２２１】
表３に明確に示されるように、Ｈ−ｍｅｒは、オリゴフェクトアミン（商標）よりも多くのｓｉＲＮＡを乳がん開始（ＳＫ−３ｒｄ）細胞に送達した。ＳＫＢＲ３細胞（これもまた大量のＣＤ４４を発現しているが、ＳＫ−３ｒｄ細胞よりログの半分少ない）では、高いｓｉＲＮＡ取り込みが示された。しかしながら、ＣＤ４４を発現していない（ＣＤ４４に対する標識化ｍＡｂを使用したフローサイトメトリーに基づく、クローン：１Ｍ７）ＣＶ−１細胞では、Ｈ−ｍｅｒを使用したｓｉＲＮＡの取り込みはバックグラウンドレベルであった。
【０２２２】
ＨＬ６０細胞（ヒト白血病がん幹細胞）を使用した場合、同様の結果が得られた（データ不掲載）。
Ｈ−ｍｅｒは、Ｔ−ＩＣ中のリファレンス遺伝子を選択的にノックダウンすることができる。
【０２２３】
Ｈ−ｍｅｒがリファレンス遺伝子のサイレンシングを選択的に誘導することができるかどうかを試験するために、本発明者等は、サイクリンＤ１（ＣｙＤ１）ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡをＨ−ｍｅｒに組み込み、材料および方法の節で記載したようにＨＬ６０細胞を形質導入した。結果を図３に要約する。図３は、８０％を超える白血病幹細胞中のＣｙＤ１の選択的ノックダウンを示し、その一方で、Ｈ−ｍｅｒにより送達された対照ｓｉＲＮＡはＣｙＤ１ ｍＲＮＡレベルに影響しなかったことを示している。さらに、ＣＶ−１細胞を使用した場合、ＣｙＤ１ ｍＲＮＡレベルに有意な変化は観察されず、これは、Ｈ−ｍｅｒがＣＤ４４依存的に作用するという事実を裏付けている。
いくつかの発がん遺伝子に対するｓｉＲＮＡの混合物を封入したＨ−ｍｅｒは、Ｔ−ＩＣを選択的に根絶する。
【０２２４】
Ｈ−ｍｅｒに封入されたｓｉＲＮＡを使用したＴ−ＩＣを根絶する能力を試験するために、プロトコルを、生体内環境を刺激するよう適合させた。すなわち、細胞を異なる製剤に短時間曝露させ（４時間）、引き続いて、大規模に洗浄し、薬物を含まない培地をさらに７２時間追加でインキュベートした。ＸＴＴアッセイを使用して、細胞生存を監視した。
【０２２５】
図４は、Ｈ−ｍｅｒに封入されたｓｉＲＮＡ（ＲＡＳ、ＨＭＧＡ２もしくはＭＹＣ）または対照（非選択的形質移入試薬としてのオリゴフェクトアミン（商標）およびＨ−ｍｅｒにより送達される対照ｓｉＲＮＡ）の組み合わせを使用した、異なる細胞（ＳＫ−３ｒｄ、ＣＤ４４ｈｉｇｈ、ＳＫＢＲ３ ＣＤ４４＋およびＣＶ−１（ＣＤ４４−））の生存を表す。
【０２２６】
オリゴフェクトアミン（商標）形質移入細胞の結果は、全ての試験した細胞種が、形質移入が可能であることを示している。Ｈ−ｍｅｒは、ＣＤ４４発現細胞（ＳＫ−３ｒｄ、がん幹細胞を含む）において細胞死をもたらすｓｉＲＮＡ混合物を選択的に送達するが、ＣＶ−１細胞の場合のようなＣＤ４４発現を欠く細胞においては送達しない。
【０２２７】
さらに、Ｈ−ｍｅｒ自体の使用は、この生存試験により観察されるいかなる毒性も引き起こさない（図４、灰色列）。
ｓｉＲＮＡを封入したＨ−ｍｅｒは、望まない免疫応答を誘導しない。
【０２２８】
Ｈ−ｍｅｒがインターフェロン応答を引き起こしたかどうかを試験するために、ヒト白血病幹細胞由来のＨＬ６０細胞のインターフェロン応答について分析した。結果を図５に示す。
【０２２９】
ＨＬ６０細胞の存在下で４８時間まで培養した場合、対照ｓｉＲＮＡ１ｎｍｏｌを封入したＨ−ｍｅｒはインターフェロン応答を誘導しなかった（図５）。対照的に、ｓｉＲＮＡ凝縮体としてのオリゴフェクトアミン（商標）の使用は、望まない免疫応答を誘導し、非カプセル化ｓｉＲＮＡも同様であった。ポリＩ：Ｃを陽性対照として使用した。
ｍｉＲＮＡを封入したＨ−ｍｅｒ
【０２３０】
一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣体（アンタゴｍｉｒ）を含むＤＯＴＡＰ含有粒子も製剤化した。得られたアンタゴｍｉｒを封入したＨ−ｍｅｒは、本明細書以下の表４に要約され、図６に説明されるように、直径３５ｎｍの範囲のより小さい粒子を示す（対して、ｓｉＲＮＡを使用すると約１００ｎｍである）。
【表４】
各々の値は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ ＺＳ ゼータサイザーにおける３つの独立した測定の平均値±ＳＤを表す。
アンタゴｍｉｒは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。アンタゴｍｉｒ分子の数は、リボグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。
実施例２
ＤＬＰＥ：ＤＬＰＧをベースとする粒子
材料および方法
【０２３１】
材料：脂質（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ））は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、米国）から購入した。ヒアルロナン、Ｍｗ７５１ＫＤａ、固有粘度：１６ｄＬ／ｇ（Ｇｅｎｚｙｍｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）；ＦＩＴＣ−ＨＡは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）（ドイツ）から入手した。Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡは、Ｑｕｉａｇｅｎから購入し；非標識化ｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎから購入した。パクリタキセル、Ｔａｘｕｓ種からの半合成、最小９７％；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）；ホウ酸およびホウ砂（四ホウ酸ナトリウム十水和物）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から購入した。３Ｈ−パクリタキセルホスファチジルエタノールアミン（ａｒａｃｈ−１−１４Ｃ）および３Ｈ−ＨＡは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から購入した。細胞培養プレートはＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）から入手した。細胞培養のための材料は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃｏ．（Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）から入手した。透析管（１２０００〜１４０００の分子量カットオフ）は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｓ、ＣＡ）から購入した。ポリカーボネート膜はＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）から購入した。他の全ての試薬は、分析用とした。
【０２３２】
ｓｉＲＮＡをカプセル化したヒアルマーの調製：１０：１（モル／モル）ＤＬＰＥ：ＤＬＰＧ、１：１０（ｗ／ｗ）ＨＡ：脂質および１：１００〜１：１０ｓｉＲＮＡ：脂質（モル／モル）の比で粒子を調製した。他の意図した範囲には、１：８５０（モル／モル）ｓｉＲＮＡ：脂質が含まれる。
【０２３３】
活性化ＨＡ：ＨＡ１．３３ｍｇをｐＨ４．５ １００ｍＭ（０．３３ｍｇ／ｍｌ）酢酸緩衝液４ｍｌに溶解した。ＥＤＣを過剰に２６．６７ｍｇ添加し（２０ｍｇ ＥＤＣ／ｍｇ ＨＡ）、混合物を３７℃で２時間振盪した。
【０２３４】
脂質−ｓｉＲＮＡ懸濁液の調製：ＤＬＰＥ４．５ｍｇおよびＤＬＰＧ０．５ｍｇを量り、５０ｍｌプラスチック管に注入した。０．１Ｍ ｐＨ＝９．０ホウ酸緩衝液３．５ｍｌを乾燥した脂質に添加した。懸濁液をＴｍ（約７０℃）より上の温度で少なくとも２時間加熱し、その後、プローブソニケーター中、１分×５回超音波処理した。次いで、懸濁液を、７０℃に加熱したジャケットを備えたＬｉｐｅｘ押出機で、０．１μｍポリカーボネートフィルターを通して１０回押し出し成形した。ｓｉＲＮＡ溶液（１００μＭ）１００μｌを活性化ＨＡ１．５ｍｌと共に添加した。振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした後、ＭＷＣＯ１２〜１４０００膜を使用して透析を行った。
【０２３５】
粒子の表面トポロジー：実施例１について記載の通りである。
【０２３６】
粒子の流体力学的直径およびゼータ電位測定：実施例１に記載の通りである。
【０２３７】
カプセル化効率：実施例１に記載の通りである。
【０２３８】
ｓｉＲＮＡの調製：本明細書上記の通りである。
【０２３９】
試験管内試験：本明細書上記の通りである。
【０２４０】
フローサイトメトリー研究：本明細書上記の通りである。
【０２４１】
画像取得および処理：本明細書上記の通りである。
【０２４２】
ｓｉＲＮＡの試験管内形質移入：本明細書上記の通りである。
結果
ｓｉＲＮＡを封入したヒアルマーの調製および構造評価
【０２４３】
ｓｉＲＮＡを封入したヒアルマーを実験の節で詳述のように調製した。トポグラフィー（図７）および流体力学的直径（表１）により示されるように、これらは均一な球状ナノ粒子形状を形成した。ゼータ電位の測定（表５）は、（これらの条件で凝集体を形成しないことにより）生理的ｐＨでの安定性を示している。さらに、ヒアルマーは、大量のＲＮＡｉペイロードを封入した（表５）。バッチ間の高い一貫性は、３つの独立した調製物における再現性により反映されている（表５）。
【表５】
【０２４４】
全測定は室温で行った。凍結乾燥したｓｉＲＮＡを封入したヒアルマーを、０．０１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７に再懸濁した。リボグリーンアッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｓｉＲＮＡを定量化した。
【０２４５】
図８Ａ〜Ｃで分かるように、ヒアルマー（ＦＩＴＣ−ＨＡを組み込むよう生成された）は、ｓｉＲＮＡをＨＬ６０細胞（白血病幹細胞）に送達することが示された。
【０２４６】
図８Ａ〜Ｃから明確に分かるように、ヒアルマーのみがｓｉＲＮＡを白血病幹細胞中に送達することができ、同様に使用した市販の試薬オリゴフェクトアミン（商標）またはｓｉＲＮＡ単独では送達することができない。
実施例３
本発明の実施形態の粒子は、ＡＭＬ初代細胞およびヒト卵巣腺癌細胞を標的化することができる。
材料および方法
【０２４７】
ＡＭＬ初代細胞を標的化する粒子：粒子を実施例１に記載のように生成し、サイクリンＤ１、Ｃｙ３標識化ｓｉＲＮＡを担持させた。
【０２４８】
ヒト卵巣腺癌細胞を標的化する粒子：１０ｍｇ／ｍＬの６０％ＤＯＴＡＰ、３０％コレステロール、１０％ＤＬＰＥをエタノールに溶解し、透明な溶液が得られるまで加熱した。その後、脂質をビュッヒエバポレーター中で乾燥させ、ホウ酸緩衝液中で再水和した。次いで、溶液を激しくボルテックスし、３７℃で２時間振盪機に入れた。
【０２４９】
脂質を、異なるフィルターを有する押出機中に通すことにより（４００ｎｍ２回、２００ｎｍ２回、１００ｎｍ２回、５０ｎｍ１０回）、脂質粒子を形成させ、最終的な粒子の大きさは約８０ｎｍとなった。実験の日までＵＬＶを４℃に保った。
【０２５０】
組立のために、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１１２μｌを、ｓｉＲＮＡ７μｌと共に小ガラスバイアルに添加し、ヒトＰ糖タンパク質（Ｐｇｐ）に添加した（２０μＭストック）。５分のインキュベーション後、希釈した脂質（１ｍｇ／ｍｌ）１８．５μｌを添加した。室温でさらに２０分後、実施例１に記載のように酸性条件下で前もって予め活性化した希釈したＨＡ（０．２ｍｇ／ｍｌ）１８．５μｌを添加した。混合物を室温で１６時間インキュベートした。
【０２５１】
ＡＭＬ初代細胞の形質移入：ＡＭＬ患者から新しく単離した血液を、フィコール勾配密度で分離した（ＰＢＭＣ）。氷上でＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターを使用して、細胞をさらに選別した（ＣＤ３−ＣＤ１９−／ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）。次いで、細胞（２．５×１０５個の細胞）を、６ウェルプレート中２．５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０完全培地（１０％血清含有）に播種した。１５０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ（総濃度５０ｎＭ）を使用して実施例１に詳述のように粒子を調製し、無血清ＲＰＭＩ培地５００μｌに再懸濁し、細胞上に配置した。総容積は３ｍＬであった。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、未処理および処理ＡＭＬ細胞のｍＲＮＡの量を決定した。
【０２５２】
ヒト卵巣腺癌細胞の形質移入：ヒト卵巣腺癌細胞を、抗生物質を含まない完全培地中、０．１×１０６細胞／ウェルの濃度で、２４ウェルプレートで培養した。２４時間後、培地を除去し、無血清ＲＰＭＩ培地に交換した。次いで、細胞をヒアルマー溶液１１０μｌで処理した。抗生物質を含まない無血清ＲＰＭＩによるインキュベーションの５時間後、血清を含む完全培地を添加した（最終血清濃度１０％）。一晩のインキュベーション後、培地を完全ＲＰＭＩ培地に交換した。７２時間後、Ｐｇｐタンパク質レベルをフローサイトメトリーにより分析した。
結果
【０２５３】
ＡＭＬ初代細胞へのヒアルマー送達：図９Ａ〜Ｃおよび図１０に示されるように、本発明の実施形態による粒子は、ｓｉＲＮＡをＡＭＬ初代細胞に送達し、強力な遺伝子サイレンシングを誘導することができる。
【０２５４】
ヒト卵巣腺癌細胞へのヒアルマー送達：図１１に示されるように、本発明の実施形態による粒子は、ｓｉＲＮＡをヒト卵巣腺癌初代細胞に送達し、強力な遺伝子サイレンシングを誘導することができる。
【０２５５】
本発明はその特定の実施形態と組み合わせて記載されてきたが、多くの代替、修正および変形が当業者に明白であることが明らかである。従って、添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲に入るこのような全ての代替、修正および変形を包含することが意図されている。
【０２５６】
本明細書中で言及する全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の刊行物、特許および特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。さらに、本出願中の任意の参考文献の引用および同定は、このような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認と解釈すべきではない。節の見出しが使用される範囲において、それらを必ずしも限定的なものと解釈すべきてはない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ポリヌクレオチドを、カチオン性分子を含む組成物と接触させるステップであって、前記カチオン性分子は静電的相互作用により前記ポリヌクレオチドを凝縮して複合体を生成し、前記カチオン性分子はリポソームに含まれないステップと、
（ｂ）約４．５以下のｐＨで、前記複合体を標的化部分に共有結合させて、標的細胞にポリヌクレオチド剤を送達するための粒子を生成するステップと
を含む、標的細胞にポリヌクレオチドを送達するための粒子を生成する方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが一本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡサイレンシング剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡサイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡサイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記カチオン性分子が、カチオン性ポリペプチド、カチオン性脂質、カチオン性界面活性剤および合成ポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）、ジオレオイル−１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ、１８：１；１４：０；１６：０；１８：０）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＰＣ、１２：０；１４：０；１６：０；１８：０；１８：１；１６：０〜１８：１）；１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−ジメチルアンモニウム−プロパンおよび３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロール）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、中性脂質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記中性脂質が、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、アニオン性リン脂質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アニオン性リン脂質が、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、コレステロールをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記合成ポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的化部分が、ポリペプチド標的化部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的化部分が、抗体、抗体断片、アプタマーおよび受容体リガンドからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的化部分が、グリコサミノグリカンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマチン硫酸、これらの塩および混合物からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記グリコサミノグリカンが、ＨＡを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）の前に前記グリコサミノグリカンを活性化するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記活性化が、酸性緩衝液中で前記グリコサミノグリカンをインキュベートすることにより行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロールおよびジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的化部分がＨＡを含み、前記ポリヌクレオチド剤がｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記複合体が、ステップ（ｂ）の前に押し出し成形されない、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１から２７に記載の方法のいずれかに従って生成される粒子。
【請求項２９】
シリコン表面上で乾燥させると直径が約１００ｎｍである、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３０】
シリコン表面上で乾燥させると直径が約３０ｎｍである、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３１】
溶液中で直径が約３０〜３００ｎｍである、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３２】
形が丸い、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３３】
約−４０ｍＶのゼータ電位を含む、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３４】
帯電している、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３５】
中性である、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３６】
ナノ粒子である、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３７】
前記標的化部分が、ＨＡを含む、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３８】
抗体、抗体断片、受容体リガンドおよびアプタマーからなる群から選択される少なくとも１つの追加の標的化部分をさらに含む、請求項３７に記載の粒子。
【請求項３９】
約６０００個を超えるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子を含む、請求項２８に記載の粒子。
【請求項４０】
請求項２８から３９のいずれかに記載の複数の粒子を含む組成物。
【請求項４１】
実質的に均一である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
ｓｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分を含む殻を含む粒子の実質的に均一な集団を含む組成物であって、前記粒子の集団の粒子の各々が、約−４０ｍＶのゼータ電位を含み、前記粒子の集団の粒子の各々が、溶液中の場合、直径が約１００〜３００ｎｍである組成物。
【請求項４３】
ｍｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分を含む殻を含む粒子の実質的に均一な集団を含む組成物であって、前記粒子の集団の粒子の各々が、溶液中の場合、直径が約３０〜５０ｎｍである組成物。
【請求項４４】
請求項７に記載の方法に従って生成される粒子を、ＣＤ４４を発現している標的細胞と接触させ、それにより標的細胞内の目的の遺伝子を下方制御するステップを含む、標的細胞内の目的の遺伝子を下方制御する方法。
【請求項４５】
被験体に治療上有効量の請求項７に記載の方法に従って生成される粒子を投与し、それによりがんを治療するステップを含む、それを必要とする被験体のがんを治療する方法。
【請求項４６】
前記投与が生体内で行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記投与が生体外で行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＲＮＡサイレンシング剤が、発がん遺伝子の発現を下方制御するよう選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＲＮＡサイレンシング剤が、生存率と関連する遺伝子の発現を下方制御するよう選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）ポリヌクレオチドを、カチオン性分子を含む組成物と接触させるステップであって、前記カチオン性分子は静電的相互作用により前記ポリヌクレオチドを凝縮して複合体を生成し、前記カチオン性分子はリポソームに含まれないステップと、
（ｂ）約４．５以下のｐＨで、前記複合体を標的化部分に共有結合させて、標的細胞にポリヌクレオチド剤を送達するための粒子を生成するステップと
を含む、標的細胞にポリヌクレオチドを送達するための粒子を生成する方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが一本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡサイレンシング剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡサイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡサイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記カチオン性分子が、カチオン性ポリペプチド、カチオン性脂質、カチオン性界面活性剤および合成ポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）、ジオレオイル−１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ、１８：１；１４：０；１６：０；１８：０）およびＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＰＣ、１２：０；１４：０；１６：０；１８：０；１８：１；１６：０〜１８：１）；１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−ジメチルアンモニウム−プロパンおよび３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロール）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、中性脂質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記中性脂質が、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、アニオン性リン脂質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アニオン性リン脂質が、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、コレステロールをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記合成ポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的化部分が、ポリペプチド標的化部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的化部分が、抗体、抗体断片、アプタマーおよび受容体リガンドからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的化部分が、グリコサミノグリカンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマチン硫酸、これらの塩および混合物からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記グリコサミノグリカンが、ＨＡを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）の前に前記グリコサミノグリカンを活性化するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記活性化が、酸性緩衝液中で前記グリコサミノグリカンをインキュベートすることにより行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、水素化ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロールおよびジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＤＬＰＧ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的化部分がＨＡを含み、前記ポリヌクレオチド剤がｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記複合体が、ステップ（ｂ）の前に押し出し成形されない、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１から２７に記載の方法のいずれかに従って生成される粒子。
【請求項２９】
シリコン表面上で乾燥させると直径が約１００ｎｍである、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３０】
シリコン表面上で乾燥させると直径が約３０ｎｍである、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３１】
溶液中で直径が約３０〜３００ｎｍである、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３２】
形が丸い、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３３】
約−４０ｍＶのゼータ電位を含む、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３４】
帯電している、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３５】
中性である、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３６】
ナノ粒子である、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３７】
前記標的化部分が、ＨＡを含む、請求項２８に記載の粒子。
【請求項３８】
抗体、抗体断片、受容体リガンドおよびアプタマーからなる群から選択される少なくとも１つの追加の標的化部分をさらに含む、請求項３７に記載の粒子。
【請求項３９】
約６０００個を超えるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子を含む、請求項２８に記載の粒子。
【請求項４０】
請求項２８から３９のいずれかに記載の複数の粒子を含む組成物。
【請求項４１】
実質的に均一である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
ｓｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分を含む殻を含む粒子の実質的に均一な集団を含む組成物であって、前記粒子の集団の粒子の各々が、約−４０ｍＶのゼータ電位を含み、前記粒子の集団の粒子の各々が、溶液中の場合、直径が約１００〜３００ｎｍである組成物。
【請求項４３】
ｍｉＲＮＡおよびカチオン性分子の核、ならびに標的化部分を含む殻を含む粒子の実質的に均一な集団を含む組成物であって、前記粒子の集団の粒子の各々が、溶液中の場合、直径が約３０〜５０ｎｍである組成物。
【請求項４４】
請求項７に記載の方法に従って生成される粒子を、ＣＤ４４を発現している標的細胞と接触させ、それにより標的細胞内の目的の遺伝子を下方制御するステップを含む、標的細胞内の目的の遺伝子を下方制御する方法。
【請求項４５】
被験体に治療上有効量の請求項７に記載の方法に従って生成される粒子を投与し、それによりがんを治療するステップを含む、それを必要とする被験体のがんを治療する方法。
【請求項４６】
前記投与が生体内で行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記投与が生体外で行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＲＮＡサイレンシング剤が、発がん遺伝子の発現を下方制御するよう選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＲＮＡサイレンシング剤が、生存率と関連する遺伝子の発現を下方制御するよう選択される、請求項４５に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ−８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ−８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１３−５００９６０（Ｐ２０１３−５００９６０Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２２３３５（Ｐ２０１２−５２２３３５）
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００６１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１３１３０
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５０７２５３７４９）ラモット アット テル アビブ ユニバーシティ， リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００６１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１３１３０
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５０７２５３７４９）ラモット アット テル アビブ ユニバーシティ， リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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