ポリペプチド
本発明は、ＥＧＦＲファミリーの受容体に結合するポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドの医薬、獣医薬、診断、イメージングにおける利用に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合するポリペプチドに関する。このポリペプチドは、医薬、獣医薬、イメージング、分離技術、および診断における産業上の利用性を有する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体ファミリー（ＥＧＦＲファミリー；ＥｒｂＢ受容体ファミリーとも呼ばれる）の受容体の発現異常は、しばしば、肺、胸、前立腺、結腸、卵巣、頭頸部における様々な悪性腫瘍に関連する。この受容体と患者の予後および処置の関係についての理解を深めようというこの受容体の研究に注目が集まっている。このファミリーは、４つの膜貫通型受容体である、上皮成長因子受容体、ＥＧＦＲ、（ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２／ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）からなる（Ｇｕｌｌｉｃｋ ＷＪ．Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌ Ｃａｎｃ ２００１；８：７５−８２；Ｗｉｔｔｏｎ ＣＪ．ｅｔ ａｌ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００３；２００：２９０−２９７）。各受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内チロシンキナーゼドメインを有する（機能的なチロシンキナーゼドメインを欠くＨＥＲ３を除く）（Ｃｉｔｒｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００３；２８４（１）：５４−６５；Ｈａｒａｒｉ Ｄ ａｎｄ Ｙａｒｄｅｎ Ｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００２；１９：６１０２−６１１４）。ＥＣＤをほとんど有さないＥＧＦＲバリアント−ＥＧＦＲｖＩＩＩが一つ存在する（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ＣＪ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：３１４０−３１４８，１９９５；Ｈｕａｎｇ ＨＳ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９２７−２９３５，１９９７；Ｋｕａｎ ＣＴ，ｅｔ ａｌ Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ ８：８３−９６，２００１）。
【０００３】
リガンドがＥＧＦＲファミリーの受容体に結合すると、この受容体は刺激されて、別の同一の受容体（ホモ二量体化）またはこのファミリー内の別の受容体（ヘテロ二量体化）のいずれかと二量体化する（Ｏｌａｙｉｏｙｅ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．Ｅｍｂｏ Ｊ．２０００；１９：３１５９−６７；Ｙａｒｄｅｎ Ｙ，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ ＭＸ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；２：１２７−３７）。受容体の二量体化は細胞内チロシンキナーゼドメインを活性化し、増殖、移動、アポトーシス、分化、またはその他の細胞プロセスを誘導する（Ｙａｒｄｅｎ Ｙ，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ ＭＸ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；２：１２７−３７；Ｗｅｌｌｓ Ａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９９；３１：６３７−６４３；Ｖｅｒｍｅｅｒ ＰＤ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３；４２２：３２２−６）。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は、このファミリーの４つの受容体の中で最もよく研究されている受容体であり、多くの悪性腫瘍において過剰発現される（Ｎｏｒｄｂｅｒｇ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．２００５ Ｊｕｌ；３２（７）：７７１−７）。これらの個々の受容体の高発現は、しばしば予後の乏しさと関係する（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ ＢＳ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８：２３３４３−２３３５１；Ａｒｔｅａｇａ ＣＬ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ２００２；７ Ｓｕｐｐｌ ４：３１−９；Ｅａｒｐ ＨＳ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ １９９５；３５：１１５−３２；Ｗｅｓｔｅｒ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ ２００２；４１：２８２−８．Ｌｏｒｅｎｚｏ ＧＤ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ２００３；２（１）：５０−７）。
【０００４】
いくつかのリガンドが、ＥＧＦＲ受容体ファミリーのメンバーに結合する。天然リガンドが知られていない唯一の受容体がＨＥＲ２である（Ｃｉｔｒｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００３；２８４（１）：５４−６５；Ｙａｒｄｅｎ Ｙ，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ ＭＸ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；２：１２７−３７；Ｌｅｎｆｅｒｉｎｋ ＡＥＧ，ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ １９９８；１７：３３８５−３３９７）。その細胞外ドメインに結合する抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）は、ＨＥＲ２受容体、特に乳癌におけるＨＥＲ２発現腫瘍を標的化するのに使用され得る。トラスツズマブの結合は成長刺激性の細胞内シグナル伝達をブロックし、化学療法および放射線療法後の細胞修復能を減弱させ、そしておそらくはアポトーシスの能力を向上させることもできる（Ｂｏｏｋｍａｎ ＭＡ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３；２１：２８３−２９０；Ｐｅｇｒａｍ ＭＤ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｓ ２０００；１０３：７４７−７５；ＭｃＫｅａｇｅ Ｋ，Ｐｅｒｒｙ ＣＭ．Ｄｒｕｇｓ ２００２；６２：２０９−４３）。ＷＯ２００５／００３１５６に開示されるアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子もまたＨＥＲ２を標的化するのに使用され得る。
【０００５】
ＥＧＦＲの機能は、セツキシマブ（エルビタックス、ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）（Ｂａｓｅｌｇａ Ｊ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３７：Ｓｕｐｐｌ ４，Ｓ１６−２２，２００１，ＡＢＸ−ＥＧＦ Ｒａｎｓｏｎ Ｍ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ５：５４１−５４６，２００３）またはｍａｂ４２５／ＥＭＤ５５９００（Ｍｅｒｃｋ）もしくは抗体フラグメント（Ｂｏｓｋｏｖｉｔｚ Ａ ｅｔ ａｌ：Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ４：１４５３−１４７１，２００４）等の抗体を用いて受容体の細胞外部分に対するリガンドの結合をブロックすることによって阻害できる。この受容体の機能はまた、全てではないが一部の患者においては、この受容体の細胞内部分に結合する低分子量チロシンキナーゼ阻害剤、例えばイレッサ（ゲフィチニブ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ＡＬ ｅｔ ａｌ：Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ３０：１３４８−１３５６，２００３；Ｈｅｒｂｓｔ ＲＳ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４：９５６−９６５，２００４）またはターセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）（Ｋｒｏｚｅｌｙ Ｐ．Ｃｌｉｎ Ｊ Ｏｎｃｏｌ Ｎｕｒｓ ８：１６３−１６８，２００４）によってもブロックされ得る。両方の場合とも、その目的は、成長刺激シグナルをブロックし、それによって腫瘍細胞の増殖を阻害することである（Ｒｉｃｈ ＪＮ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ：Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ３：４３０−４４６，２００４）。しかし、改善の余地もある。例えば、イレッサは、ＥＧＦＲを過剰発現する一部の患者にしか作用しないという欠点を有することが分かっている。セツキシマブについては、未だに、処置の治療効果を高める最良の化学療法併用処置様式の模索が続けられている。これらの治療は、腫瘍細胞を死滅させる放射性核種ベースのアプローチと併用でき（Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ：Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６６（２），１０７−１１７，２００３）、一つの興味深い例は、最近の、放射能標識（アスタチン化）ＥＧＦの取り込みおよび治療効果を改善するためのゲフィチニブの適用である（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ＡＬ ｅｔ ａｌ：Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ３０：１３４８−１３５６，２００３）。これまでにＨＥＲ−２について例証されたように、ポリペプチド性の抗ＥＧＦＲ標的化剤を開発することで、診断（イメージング）および治療の両方の目的で放射性核種を送達するための、天然のアゴニスト性（腫瘍刺激性）の生物学的ＥＧＦリガンドの魅力的な代替物が得られる（Ｗｉｋｍａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（ＰＥＤＳ），１７（５），４５５−４６２，２００４；Ｓｔｅｆｆｅｎ ＡＣ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２０，２３９−２４８，２００５；Ｓｔｅｆｆｅｎ ＡＣ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｉｎ ｐｒｅｓｓ，２００５）。このようなポリペプチドはまた、放射活性を有さずとも、治療上魅力的な生物学的効果を示し得る。例えばＷＯ２００５／０００３１５６に開示されるような「アフィボディ（登録商標）分子」とも呼ばれるＺバリアントは、中程度の分子量（６〜１５ｋＤａ）であり、従って抗体（１５０ｋＤａ）よりも腫瘍組織への浸透性が良いと同時に腎臓による排泄を通じて迅速に消滅してしまうイレッサおよびターセバ（約１ｋＤａ）等の低分子物質よりも全身循環性が良いポリペプチドである。実際、Ｚバリアントは、典型的には、インビボイメージング用途に適した範囲の半減期を有し、治療またはその他の用途において必要とされる場合は、遺伝子融合技術によってその半減期を劇的に延長させることができる（例えばＷＯ２００５／０９７２０２Ａを参照のこと）。
【０００６】
ＥＧＦＲの過剰発現は、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に共通する（Ｒｉｋｉｍａｒｕ，Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ，１９９２．１４（１）：ｐ．８−１３；Ｓａｎｔｉｎｉ，Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ，１９９１．１３（２）：ｐ．１３２−９．Ｅｋｂｅｒｇ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２６（５），１１７７−１１８５，２００５）。ＨＥＲ２のレベルの上昇は、いくつかのＨＮＳＣＣの研究において示唆されており（Ｃｒａｖｅｎ，Ｊ．Ｍ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９２．１２（６Ｂ）：ｐ．２２７３−６）、口腔扁平上皮癌（ＳＣＣ）において予後的な価値が見出され得る（Ｗｅｒｋｍｅｉｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ，２０００．３６（１）：ｐ．１００−５；Ｗｅｒｋｍｅｉｓｔｅｒ，Ｒ．Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ，１９９６．１７２（６）：ｐ．６８１−３；Ｘｉａ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９７．３（１）：ｐ．３−９；Ｘｉａ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９９．５（１２）：ｐ．４１６４−７４）。ＨＥＲ３は、ＨＮＳＣＣ細胞株において過剰発現され、臨床的悪性化に関連すること（Ｘｉａ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９９．５（１２）：ｐ．４１６４−７４；Ｓｈｉｎｔａｎｉ，Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，１９９５．９５（１−２）：ｐ．７９−８３）および他のタイプの悪性腫瘍においても過剰発現されること（Ｇｕｌｌｉｃｋ，Ｗ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ，１９９６．２７：ｐ．３３９−４９）が示されている。いくつかのヒト乳癌細胞株は、ＨＥＲ４転写物を有する（Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９３．９０（５）：ｐ．１７４６−５０）が、癌におけるＨＥＲ４の役割は不透明である（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０００．６０（６）：ｐ．１４８３−７）。４つの受容体の共発現パターンが悪性の表現型に関連する可能性があることが示唆されているため（Ｘｉａ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９９．５（１２）：ｐ．４１６４−７４；Ｂｅｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００１．１９５（３）：ｐ．３４３−８；Ｋｒａｈｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００１．３７（２）：ｐ．２５１−９）、その共発現の研究が注目されている。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の免疫組織化学染色は、顕著な膜の染色を示した。一方、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の染色は主として細胞質性であった（Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９３．９０（５）：ｐ．１７４６−５０；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０００．６０（６）：ｐ．１４８３−７）。さらに、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は腫瘍および転移物の両方において高レベルで発現されることが報告されている。従って、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は、高分子およびペプチドベースのインビボイメージングおよび治療用途における潜在的標的であるが、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４はそうではないと考えられる。ＥＧＦＲタンパク質のレベルの上昇はまた、膀胱癌においても見出されており、その過剰発現は腫瘍の段階および悪性度に関連付けられている（Ｈａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｕｒｏｌ，１４６，２２７−３１．（１９９１）；Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｅ．Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５０，２５３０−７．（１９９０）；Ｎｅａｌ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ，６５，１６１９−２５．（１９９０）；Ｓａｕｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，５７，５０８−１４．（１９９４）；Ｇａｒｄｍａｒｋ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ（ＢＪＵ），９５，９８２−９８６，２００５）。
【０００７】
最も悪性の形態の神経膠腫であり、代表的な中枢神経系原発性腫瘍である多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）においては、分析した全腫瘍の少なくとも半数においてＥＧＦＲの過剰発現が検出されている（Ｂｏｓｋｏｖｉｔｚ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ４：１４５３−１４７１，２００４；Ｓｈｉｎｏｊｉｍａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：６９６２−６９７０，２００３；Ｅｋｓｔｒａｎｄ ＡＪ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５１：２１６４−２１７２，１９９１；Ｒａｉｎｏｖ ＮＧ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３５ １３−２８（１９９７）；Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．２００５ Ｓｅｐ ８；［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］）。この過剰発現は、遺伝子の増幅および／または転写率の増加に起因するものであり、腫瘍細胞あたり１０6個の受容体数が報告されている（Ｒｉｃｈ ＪＮ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ：Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ３：４３０−４４６，２００４；Ｂｉｇｎｅｒ ＳＨ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ４７，１９１−２０５（１９９８）；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ Ｇ．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５６，８８１−９１４（１９８７）；Ｃｏｌｌｉｎｓ ＶＰ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４，２７−３２（１９９３）；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ ＴＡ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３１３，１４４−１４７，（１９８５）；Ｋｌｅｉｈｕｅｓ Ｐ，Ｏｈｇａｋｉ Ｈ．Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌ １，４４−５１，（１９９９）；Ｋｌｅｉｈｕｅｓ Ｐ，Ｏｈｇａｋｉ Ｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ２８，１６４−１７０，（２０００）；Ｂｏｓｋｏｖｉｔｚ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ４，１４５３−１４７１，（２００４））。ＥＧＦＲの過剰発現は、神経膠腫の成長速度の増加および生存率の減少と相関し（Ｒｉｃｈ ＪＮ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ：Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ３，４３０−４４６，（２００４）；Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．２００５ Ｓｅｐ ８；［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５６，７２−７７，（１９９４）；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ＣＪ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９０，７９９−８０１，（１９９８）；Ｓｈｉｎｏｊｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３，６９６２−６９７０，（２００３））、ＥＧＦＲの過剰発現は腫瘍細胞の浸潤縁（ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｄｉｎｇ ｅｄｇｅｓ）において最も顕著であることが示されている（Ｏｋａｄａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３，４１３−４１６，）（２００３））。ＥＧＦＲに特異的に結合するポリペプチドは、例えば術後腔（ｐｏｓｔｏｐｅｒａｌ ｃａｖｉｔｙ）への局所投与によって、神経膠腫治療における治療用途で利用できる可能性がある。
【０００８】
肺および胸において見出されるようないくつかの他の上皮由来の悪性腫瘍もまた、ＥＧＦＲの高発現を伴う（Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９（３）：１８３−２３２，（１９９５））。ＥＧＦＲ受容体はまた、様々な正常組織の間でも分布しており、特に肝臓の肝細胞および皮膚上皮においてはむしろ高レベルで発現される（Ｇｕｓｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ Ｒｅｐ，８，６４９−５８．（１９８４）；Ｄａｍｊａｎｏｖ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，５５，５８８−９２．（１９８６））。これは、治療用途、特に放射線療法において問題を引き起こす可能性があるが、ＥＧＦＲ受容体に結合する診断またはイメージングマーカーが少量しか投与されない診断およびイメージング用途においてはそれほど重要なことではないであろう。そうであっても、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドには、局所投与が企図される特定の癌における用途が見出され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、診断、インビトロまたはインビボイメージング、および治療用途に使用できる新規のＥＧＦＲ結合剤を提供することである。さらに、このようなＥＧＦＲ結合ポリペプチドには、病期分類および標的受容体をダウンレギュレートすることを目的とするＳＭＥベースの治療の直接的評価としての用途が見出され得る。
【００１０】
販売用の分子イメージング剤の開発に加えて、その用途には、インビボモデルおよびその後の臨床開発における処置結果を測定するための特異的なイメージング剤が求められる医薬開発およびスクリーニング手順における使用が含まれる。分子イメージングは、成長因子受容体をダウンレギュレートすることを目的とする医薬の効果の直接的な読み取りおよび抗腫瘍効果の評価を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
その一つの局面によれば、本発明は、
ｉ）ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＮＸ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25ＳＬＸ28Ｄ
［配列中、相互に独立して、
Ｘ2はＭ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、およびＳから選択され；
Ｘ3はＷ、Ｄ、Ｅ、およびＬから選択され；
Ｘ4はＩ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、およびＷから選択され；
Ｘ6はＷ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、およびＳから選択され；
Ｘ7はＤ、Ｅ、Ｎ、およびＫから選択され；
Ｘ10はＲ、Ｇ、Ｈ、およびＫから選択され；
Ｘ11はＤ、Ｎ、Ｅ、Ｙ、およびＳから選択され；
Ｘ17はＧ、Ｗ、およびＡから選択され；
Ｘ18はＷ、Ｇ、およびＡから選択され；
Ｘ20はＭ、Ｌ、Ｆ、Ａ、およびＥから選択され；
Ｘ21はＴ、Ｄ、Ｎ、Ａ、およびＱから選択され；
Ｘ25はＡ、Ｓ、Ｎ、Ｇ、およびＬから選択され；ならびに
Ｘ28はＬ、Ｗ、Ｖ、Ｆ、およびＡから選択される］
ならびに
ｉｉ）ｉ）において規定される配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる上皮成長因子受容体結合モチーフ、ＥＢＭを含み、最大１０μＭの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ポリペプチドを提供する。
【００１２】
上記の関連する配列クラスの定義、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、いくつかの異なる選択実験においてＥＧＦＲとの相互作用について選択された、基本骨格（ｐａｒｅｎｔ ｓｃａｆｆｏｌｄ）の多数のランダムポリペプチドバリアントの統計分析に基づく。同定されたＥＧＦＲ結合モチーフすなわち「ＥＢＭ」は、その基本骨格の、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で二つのアルファヘリックスを構成する標的結合領域に対応する。その二つのＥＢＭヘリックスの中の変化に富むアミノ酸残基は、その基本骨格においては、抗体の定常Ｆｃ部分との相互作用のための結合表面を構成する。本発明においては、結合表面残基のランダムバリエーションおよびその後のバリアントの選択により、Ｆｃ相互作用能をＥＧＦＲ相互作用能で置き換えている。
【００１３】
当業者に理解されていることであろうが、任意のポリペプチドの機能、例えば本発明に従うポリペプチドのＥＧＦＲ結合能は、そのポリペプチドの三次構造に依存する。従って、あるポリペプチドにおいて、その機能に影響を及ぼさずにそのアミノ酸配列に小さな変化を加えることが可能である。従って、本発明は、得られる配列がｉ）によって規定されるクラスに属する配列と少なくとも８５％同一である、ｉ）のＥＢＭの修飾型バリアントを包含する。例えば、アミノ酸残基の特定の機能グループ（例えば疎水性、親水性、極性等）に属するアミノ酸残基を、同じ機能グループの別のアミノ酸残基と交換することが可能である。
【００１４】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ2はＭである。
【００１５】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ3はＷである。
【００１６】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ4はＩ、Ｖ、Ｇ、およびＳから選択される。
【００１７】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ6はＶおよびＷから選択される。
【００１８】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ10はＲおよびＧから選択される。
【００１９】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ11はＤ、Ｎ、およびＥから選択される。
【００２０】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ17はＷおよびＧから選択される。
【００２１】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ18はＷおよびＧから選択され、特にＷであり得る。
【００２２】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ20はＭである。
【００２３】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ21はＴおよびＤから選択され、特にＴであり得る。
【００２４】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ25はＡ、Ｓ、およびＮから選択される。
【００２５】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ28はＬおよびＷから選択される。
【００２６】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ18はＷであり、Ｘ21がＴである。
【００２７】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ18はＷであり、Ｘ20がＭである。
【００２８】
本発明に従うポリペプチドのサブクラスのより具体的な定義において、ｉ）のアミノ酸配列は、以下の９つの条件：Ｘ2がＭである；Ｘ3がＷである；Ｘ6がＷである；Ｘ10がＲである；Ｘ17がＧである；Ｘ18がＷである；Ｘ20がＭである；Ｘ21がＴである；Ｘ28がＬである、の少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または９つ全てを満たす。
【００２９】
これらの条件の９つ全てを満たす場合、ｉ）の配列は
ＥＭＷＸ4ＡＷＸ7ＥＩＲ Ｘ11ＬＰＮＬＮＧＷＱＭ ＴＡＦＩＸ25ＳＬＬＤ
となる。
【００３０】
本発明に従うポリペプチドのサブクラスの代替の具体的な定義において、ｉ）のアミノ酸配列は、以下の５つの条件：Ｘ17がＧである；Ｘ18がＷである；Ｘ20がＭである；Ｘ21がＴである；Ｘ25がＡである、の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つ全てを満たす。
【００３１】
これらの条件の５つ全てを満たす場合、ｉ）の配列は
ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＮＧＷＱＭ ＴＡＦＩＡＳＬＸ28Ｄ
となる。
【００３２】
さらに代替のサブクラスにおいて、ｉ）の配列は、ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＧ Ｘ11ＬＰＮＬＮＷＧＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25ＳＬＷＤ、例えば、ＥＸ2Ｘ3ＩＡＶＸ7ＥＩＧ ＥＬＰＮＬＮＷＧＱＸ20 ＤＡＦＩＮＳＬＷＤである。
【００３３】
後述の実験の節に詳細に記載されるように、ＥＧＦＲ結合バリアントの選択から、多数の別個のＥＧＦＲ結合モチーフ（ＥＢＭ）配列の同定がなされた。これらの配列は、本発明のこの局面に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの定義におけるＥＢＭ配列ｉ）の個別の実施態様を構成する。個別のＥＧＦＲ結合モチーフの配列は図１におよび配列番号１〜１６３として示されている。本発明のこの局面の実施態様において、ＥＢＭ配列ｉ）は、特に、配列番号３３、配列番号４８、配列番号５７、配列番号８７、配列番号８８、および配列番号１４７から選択され得る。
【００３４】
本発明の実施態様において、ＥＢＭは３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成し得る。例えば、ＥＢＭは、主として、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内の二つのアルファヘリックスおよびそれらを結ぶループの一部を形成し得る。
【００３５】
本発明の個々の実施態様において、このような３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、細菌受容体タンパク質のドメインから選択される。このようなドメインの非限定的な例は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡの５つの異なる３ヘリックスドメイン、およびその誘導体である。従って、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドは：
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＡ内のＥＢＭ）；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢ内のＥＢＭ）；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＣ内のＥＢＭ）；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＤ内のＥＢＭ）；
ＡＱＨＤＥ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＥ内のＥＢＭ）；および
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体内のＥＢＭ）；
から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００３６】
配列中の［ＥＢＭ］は先に定義したＥＧＦＲ結合モチーフである。
【００３７】
本発明の別の局面によれば、配列番号３２７のアミノ酸配列：
ＶＤＮＫＦＮＫ ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨ ＬＰＮＬＮＥ ＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤ ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡ ＱＡＰＫ
の９〜１１、１３〜１４、１７〜１８、２４〜２５、２７〜２８、３２、および３５位、またはこれらの位置に対応する位置のいずれかまたは全てにおいて、非修飾型アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してＥＧＦＲに対するそのポリペプチドの結合性を向上させるアミノ酸置換を加えることによって得られるアミノ酸配列を含み、最大１０μＭの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドが提供される。
【００３８】
その別の代替の局面によれば、本発明は、そのアミノ酸配列が、以下：ｉｉｉ）配列番号１６４〜３２６から選択される；およびｉｖ）配列番号１６４〜３２６から選択される配列に対して８５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列である、から選択される定義の一つを満たす配列を含む、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。本発明のこの局面の実施態様において、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは特に、配列番号１９６、配列番号２１１、配列番号２２０、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号３１０から選択される配列およびそれらに対して８５％またはそれ以上の同一性を有する配列を含み得る。
【００３９】
本発明の任意の局面に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、最大１×１０-6Ｍ、例えば最大１×１０-7Ｍの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合し得る。
【００４０】
本明細書中で、異なるポリペプチドのアミノ酸配列間の同一性の程度についての言及がなされる場合、本明細書中に開示される配列に対して８５％の同一性という下限が設定される。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載される配列に対して少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を有し得る。この比較は、比較される配列のうちの最小配列に対応する枠（ｗｉｎｄｏｗ）で、または比較される配列のうちの少なくとも一つにおけるＥＧＦＲ結合モチーフに対応する枠で行われ得る。
【００４１】
このポリペプチドは、ＥＧＦＲに対する結合性が良いことが利点である。典型的には、このポリペプチドは比較的短く、そのサイズの小ささゆえに抗体よりも腫瘍組織への浸透性が良いと同時に従来的な低分子量ＥＧＦＲ結合物質（半減期が短すぎる場合が多い）およびモノクローナル抗体（循環時間が長過ぎる場合が多い）よりも全身循環性がよい。
【００４２】
本発明に従うポリペプチドは、約５３〜５８アミノ酸長であり得る。しかし、その長さはそれより長くも短くもできる。ポリペプチドの長さは、例えば、そのＮ末端で４アミノ酸まで減らすことができる。
【００４３】
用語「位置」の用法は相対的なものである。上記の非修飾型ポリペプチドと同様に５３アミノ酸長である本発明に従うポリペプチドにおいては、このポリペプチド上のアミノ酸位置は、非修飾型ポリペプチド上のアミノ酸位置に正確に対応し、例えば非修飾型ポリペプチドと比較してＮ末端が伸長されている状況では、非修飾型ペプチドに対応する修飾型ペプチド上のアミノ酸残基が同じ位置番号を有する。例えば、修飾型ポリペプチドにおいて６アミノ酸残基が伸長されている場合、Ｎ末端から数えて、その修飾型ポリペプチドのアミノ酸番号７は、非修飾型ポリペプチドの位置番号１のアミノ酸に対応する。
【００４４】
従って、本発明のポリペプチドは、様々な医学、獣医学、診断、およびイメージング用途において、従来的な抗体または低分子量物質の代替物として使用され得る。例えば、本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＥＧＦＲに関連する癌、例えば、上記のＥＧＦＲの過剰発現によって引き起こされる癌、特に局所分布が適用される場合は、例えば神経膠腫の処置において使用され得る。本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドはまた、細胞表面上のＥＧＦＲに結合することによって細胞のシグナル伝達を阻害するために、癌の診断において、薬剤をＥＧＦＲ発現細胞、特にＥＧＦＲ過剰発現細胞に対して標的化するのにインビボおよびインビトロの両方で、ＥＧＦＲの検出のための組織化学法において、分離法において、ならびにその他の用途において使用され得る。臨床用の分子イメージング剤の開発に加えて、インビボモデルおよびその後の臨床開発における処置結果を測定するための特異的な前臨床用イメージング剤としての用途もある。分子イメージングは、成長因子受容体、例えばＨＥＲ２またはＥＧＦＲをダウンレギュレートすることを目的とする医薬の効果の直接的な読み取りおよび抗腫瘍効果の評価を可能にする。本発明のポリペプチドは、ある試薬のＥＧＦＲに対する親和性に基づく任意の方法において有用であり得る。従って、このポリペプチドは、このような方法において、検出試薬として、捕捉試薬として、または分離試薬として使用されるだけでなく、それらの独自能力（ｔｈｅｉｒ ｏｗｎ ｒｉｇｈｔ）による治療剤としてまたは直接的（例えば毒性分子、毒素）もしくは間接的な治療効果（例えば癌ワクチン、免疫賦活分子）を有する他の治療剤をＥＧＦＲタンパク質に対して標的化するための手段として使用され得る。
【００４５】
本発明に従うポリペプチドをインビトロで利用する方法は、例えばマイクロタイタープレート、タンパク質アレイで、バイオセンサー表面上で、ビーズ上で、フローサイトメトリーで、組織切片上で、等の異なる形式で行われ得る。
【００４６】
当業者は、本発明に従うポリペプチドを本発明の範囲から逸脱することなく個別の用途に合わせるために、このポリペプチドに対して様々な修飾および／または付加をなすことができることを理解するであろう。これらの修飾および付加については以下により詳細に記載されており、これらには同じポリペプチド鎖における追加のアミノ酸、または本発明のポリペプチドに化学的に結合もしくはそれ以外の方法で結合された標識および／もしくは治療剤が含まれ得る。
【００４７】
さらに、本発明はまた、ＥＧＦＲ結合性を保持するプロテインＡ由来のＥＧＦＲ結合ポリペプチドのフラグメントを包含する。結合特異性を保持する野生型ＳＰＡドメインのフラグメントを作製する可能性については、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：５６８８−５６９２（１９９６）のＢｒａｉｓｔｅｄ ＡＣ ｅｔ ａｌに示されている。この論文に記載される実験においては、構造ベースの設計およびファージディスプレイ法を用いることで、５９残基の３ヘリックスバンドルの結合ドメインを、得られた３３残基の２ヘリックス誘導体に小型化させている。これは、異なる領域の無作為変異の段階的な選択によって安定性および結合親和性を反復的に向上させることで達成された。同じ論法で、当業者は、本発明のポリペプチドを用いることで、その「親」のＥＧＦＲ結合ポリペプチドと同一の結合特性を有する「最小化型」ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを獲得できるであろう。従って、本発明に従うポリペプチドのフラグメントを構成するポリペプチドは、本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、用語「ＥＧＦＲ結合」および「ＥＧＦＲに対する結合親和性」は、例えば表面プラズモン共鳴技術を、例えばＢｉａｃｏｒｅ機器において使用することによって試験され得るポリペプチドの特性を意味する。例えば、以下の実施例に記載されるように、ＥＧＦＲ結合親和性は、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲのフラグメント、例えばその細胞外ドメインをこの機器のセンサーチップに固定し、試験ポリペプチドを含むサンプルをそのチップに通す実験において試験され得る。あるいは、試験ポリペプチドをこの機器のセンサーチップに固定し、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲのフラグメント、例えばその細胞外ドメインを含むサンプルそのチップに通すこともある。これに関して、ＥＧＦＲは、配列番号３２８のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得、その細胞外ドメインは、配列番号３２９のアミノ酸を含むポリペプチドであり得る。当業者は、その後、このような実験から得られた結果を解析し、少なくともＥＧＦＲに対するそのポリペプチドの結合親和性の質的指標を獲得し得る。質的指標が望ましい場合、例えば、相互作用のＫD値を決定するために、表面プラズモン共鳴法も使用され得る。結合値は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）において規定され得る。ＥＧＦＲはこの機器のセンサーチップに固定され、その親和性を測定したいポリペプチドのサンプルが連続希釈によって調製され、無作為順で注入される。次いで、例えばその機器の製造元（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）から提供されるＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアの１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、その結果からＫD値が算出され得る。
【００４９】
アミノ酸置換が導入される場合は、これらがそのポリペプチドの基本構造に影響するものであってはならない。例えば、ポリペプチドのＣα骨格の全体的なフォールディングは、関連するＺ「野生型」ドメインのそれと本質的に同一である、すなわち同じ二次構造のエレメントを同じ順で有するものであり得る。従って、この基本構造を有するポリペプチドは、Ｚ「野生型」ドメインと類似のＣＤスペクトルを有するであろう。当業者は、関連性のある他のパラメータを認識しているであろう。この基本構造の保存に関する要件は、置換に供され得るアミノ酸配列位置に制限を課す。例えば、ポリペプチド表面に位置するアミノ酸残基が置換され、ポリペプチドの「３ヘリックスバンドル」のコアの中に埋もれたアミノ酸残基はその分子の構造的特性を保存するために維持されるのが好ましい。同じ論法が、本発明のポリペプチドのフラグメントにも適用される。
【００５０】
本発明はまた、上記のＥＧＦＲ結合ポリペプチドが、いずれかの末端に追加のアミノ酸が付加されたＥＧＦＲ結合ドメインとして存在するポリペプチドを包含する。これらの追加のアミノ酸残基は、そのポリペプチドによるＥＧＦＲの結合において役割を果たし得るが、同様に他の目的、例えばそのポリペプチドの生成、精製、安定化、結合、または検出の一つまたはそれ以上に関連する目的もまた果たし得る。このような追加のアミノ酸残基は、化学的な結合の目的で付加される一つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含み得る。この一例は、ポリペプチド鎖の最初および最後の位置、すなわちＮまたはＣ末端におけるシステイン残基の付加である。このような追加のアミノ酸残基はまた、そのポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えばそのタグに対して特異的な抗体との相互作用のためのＨｉｓ6タグまたは「ｍｙｃ」タグまたは「ｆｌａｇ」タグを提供し得る。
【００５１】
本発明はまた、上記のＥＧＦＲ結合ポリペプチドが、追加のペプチドもしくはタンパク質または他の官能基が（公知の有機化学法を用いる）化学的結合により（特異的にまたは非特異的に）Ｎ末端もしくはＣ末端にまたは任意の他の残基に結合されたＥＧＦＲ結合ドメインとして存在するＥＧＦＲ結合ポリペプチドを包含する。
【００５２】
上述の「追加のアミノ酸残基」はまた、任意の所望の機能、例えば第一のＥＧＦＲ結合ドメインと同じ結合機能もしくは別の結合機能、もしくは酵素機能、毒性機能（例えば免疫毒素）、もしくは蛍光シグナル機能、またはこれらの組み合わせを有する一つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを提供し得る。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、単量体形態の場合も多量体形態の場合もある。ポリペプチドの多量体形態は、結合特性が増強され得る点で有利な場合がある。好ましい多量体形態には、二量体形態および三量体形態が含まれる。ポリペプチドの多量体形態は、適当な数の本発明のポリペプチドを含み得る。これらのポリペプチドは、本質的に、その多量体内でドメインを形成する。これらのドメインは全て、同じアミノ酸配列を有し得るが、代替的にそれらが異なるアミノ酸配列を有する場合もある。ポリペプチドは、公知の有機化学法を用いる共有結合性結合により接続されるか、またはポリペプチドの組換え発現系において一つもしくはそれ以上の融合ポリペプチドとして発現されるか、または任意の他の様式で、直接的にもしくはリンカー、例えばアミノ酸リンカーを通じてのいずれかで接続され得る。
【００５４】
さらに、本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドが第一ドメインまたは部分を提供し、第二またはさらなる部分がＥＧＦＲ結合以外の機能を有する融合ポリペプチドもまた企図され、これらも本発明の範囲に含まれる。このような融合ポリペプチドの第二またはさらなる部分は、ＥＧＦＲ以外の標的分子に対する親和性を有する結合ドメインを含み得る。このような結合ドメインは、別の、類似のポリペプチドバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）であり得る。例えば、ポリペプチドバインダーは、Ｚバリアントであり得る。これにより、様々なタイプの用途、例えば医薬、獣医薬、診断、分離、およびイメージングにおいて使用され得る多特異的試薬（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ）を作製することが可能になる。このような多特異的融合ポリペプチドの調製は、先に概説したようにして行われ得る。
【００５５】
本発明の他の実施態様において、第二またはさらなる部分は、標的に対する結合親和性を有する無関係の天然タンパク質または組換えタンパク質（またはその天然タンパク質もしくは組換えタンパク質の結合またはその他の能力を保持するそれらのフラグメント）を含み得る。例えば、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、治療用途における使用のためにＥＧＦＲ結合ポリペプチドの半減期を向上させるため、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたは血清タンパク質に対する親和性を有する任意の他のタンパク質／ペプチドに接続され得る。
【００５６】
本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、他の融合ポリペプチドの形態で提供され得る。例えば、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたはそのフラグメントは、標的への結合に加えてまたはその代わりに他の機能を発揮する第二またはさらなる部分または部分群に共有結合により結合され得る。一つの例は、一つまたはそれ以上のＥＧＦＲ結合ポリペプチドと、レポーターまたはエフェクター部分として機能する酵素活性を有するポリペプチドとの融合であろう。融合タンパク質の形成のためにＥＧＦＲ結合ポリペプチドに結合され得るレポーター酵素の例は、当業者に周知であり、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等の酵素が含まれる。本発明に従う融合ポリペプチドの第二およびさらなる部分または部分群についての他の選択肢には、蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、およびそれらのバリアントが含まれる。
【００５７】
本発明に従う融合ポリペプチドの第二およびさらなる部分または部分群についての他の選択肢には、治療用途の部分または部分群が含まれる。治療用途においては、他の分子もまた、他の手段によって、本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に結合され得る。例えば、他の分子、例えば、本発明のポリペプチドをエフェクター酵素（例えばカルボキシペプチダーゼ）またはＲＮａｓｅもしくはＤＮａｓｅ融合物の誘導のために使用する「ＡＤＥＰＴ」（抗体酵素プロドラッグ療法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ））適用のための酵素；エフェクター細胞およびその他の免疫系成分の動員のためのタンパク質；サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＰ−１０；凝血原因子、例えば組織因子、フォン・ビルブラント因子；毒素、例えばリシンＡ、シュードモナス外毒素、カルキアミシン（ｃａｌｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、毒性低分子、例えばオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）アナログ、ドキソルビシン。
【００５８】
上記の追加のアミノ酸（特にヘキサヒスチジン、システイン）は、診断用（例えば68Ｇａ、76Ｂｒ、111Ｉｎ、99Ｔｃ、125Ｉ）または治療用（例えば90Ｙ、131Ｉ、211Ａｔ、177Ｌｕ）の放射性核種を容易に導入するために放射性同位元素のキレート剤をＥＧＦＲ結合ポリペプチドに結合するのに使用できる。
【００５９】
本発明はまた、上記のＥＧＦＲ結合ポリペプチドが、例えばそのポリペプチドの検出の目的で、標識基、例えば少なくとも一つのフルオロフォア、ビオチン、または放射性同位元素と共に提供されるポリペプチドを包含する。
【００６０】
本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドを組み込んだ融合ポリペプチドおよびタンパク質についての上記の説明に関して、第一、第二、およびさらなる部分という表示は、一方のＥＧＦＲ結合部分または部分群と他方の他の機能を発揮する部分とを区別する明確化の目的でなされていることに留意されたい。これらの表示は、その融合タンパク質またはポリペプチドのポリペプチド鎖における異なるドメインの実際の順番を示すことを意図するものではない。従って、例えば、第一部分は、融合タンパク質またはポリペプチドのＮ末端、中間、またはＣ末端に存在し得る。
【００６１】
本発明のさらなる好ましい局面および実施態様は、以下の実施態様のリストおよび添付の特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００６２】
本明細書において引用した全ての科学文献および特許書類は、参照により本明細書に援用する。
【００６３】
１． アミノ酸配列：
ＶＤＮＫＦＮＫ ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨ ＬＰＮＬＮＥ ＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤ ＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡ ＱＡＰＫ
に由来するアミノ酸配列を含み、
その配列の９〜１１、１３〜１４、１７〜１８、２４〜２５、２７〜２８、３２、および３５位、またはこれらの位置に対応する位置のいずれかまたは全てにおいて、非修飾型アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してＥＧＦＲに対するそのポリペプチドの結合性を向上させるアミノ酸置換を含むことによって得られるアミノ酸配列を含み、最大１０μＭの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、ＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２． ９位のアミノ酸置換が疎水性アミノ酸である、実施態様１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３． ９位のアミノ酸置換が非極性アミノ酸である、実施態様１または２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４． ９位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様１〜３のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５． ９位のアミノ酸置換が芳香族Ｒ基を含む、実施態様１〜４のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６． ９位のアミノ酸置換が極性アミノ酸である、実施態様１〜２または４または５のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７． ９位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１〜５のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８． ９位のアミノ酸置換が塩基性アミノ酸である、実施態様１〜７のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９． ９位のアミノ酸置換がＷ、Ｍ、Ｔ、Ｆ、Ｈ、Ｓ、Ｌ、Ａ、およびＶから選択される、実施態様１〜８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０． ９位のアミノ酸置換がＭ、Ｆ、Ｌ、またはＶである、実施態様３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６４】
１１． １０位のアミノ酸置換が疎水性アミノ酸である、実施態様１〜１０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２． １０位のアミノ酸置換が親水性アミノ酸である、実施態様１〜１１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３． １０位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜１１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４． １０位のアミノ酸置換が極性アミノ酸である、実施態様１〜１３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１５． １０位のアミノ酸置換が非極性アミノ酸である、実施態様１〜１３のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１６． １０位のアミノ酸置換が酸性アミノ酸である、実施態様１〜１５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１７． １０位のアミノ酸置換がＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ａ、Ｅ、Ｗ、およびＱから選択される、実施態様１〜１６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１８． １０位のアミノ酸置換がＬ、Ｙ、Ｅ、またはＱである、実施態様１７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１９． １１位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜１８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２０． １１位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜１８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６５】
２１． １１位のアミノ酸置換が親水性である、実施態様１〜１９のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２２． １１位のアミノ酸置換が非極性アミノ酸である、実施態様１〜２１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２３． １１位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様２２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２４． １１位のアミノ酸置換が正に荷電したＲ基を含む、実施態様１〜２３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２５． １１位のアミノ酸置換が塩基性アミノ酸である、実施態様１〜２４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２６． １１位のアミノ酸が極性アミノ酸である、実施態様１〜２１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２７． １１位のアミノ酸が非荷電である、実施態様１〜２３のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２８． １１位のアミノ酸置換がＡ、Ｉ、Ｋ、Ｐ、およびＮから選択される、実施態様１〜２７のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２９． １１位のアミノ酸置換がＡ、Ｉ、またはＫである、実施態様２８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３０． １３位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜２９のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６６】
３１． １３位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜３０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３２． １３位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様１〜３１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３３． １３位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜３０のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３４． １３位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１〜３３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３５． １３位のアミノ酸置換が芳香族Ｒ基を含む、実施態様１〜３４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３６． １３位のアミノ酸置換がＡ、Ｓ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、Ｙ、Ｗ、およびＴから選択される、実施態様１〜３５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３７． １３位のアミノ酸置換がＭ、Ｉ、Ｙ、またはＶである、実施態様８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３８． １４位のアミノ酸置換が親水性である、実施態様１〜３７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３９． １４位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜３７のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４０． １４位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜３９のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６７】
４１． １４位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様４０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４２． １４位のアミノ酸置換が酸性である、実施態様１〜４１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４３． １４位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜４１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４４． １４位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜３９のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４５． １４位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様４４に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４６． １４位のアミノ酸置換が負に荷電したＲ基を含む、実施態様１〜４５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４７． １４位のアミノ酸置換がＳ、Ｅ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、Ｎ、Ｔ、およびＡから選択される、実施態様１〜４６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４８． １４位のアミノ酸置換がＳまたはＴである、実施態様４７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４９． １７位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜４８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５０． １７位のアミノ酸置換が親水性である、実施態様１〜４８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６８】
５１． １７位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜４８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５２． １７位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５３． １７位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様５２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５４． １７位のアミノ酸が正荷電である、実施態様１〜５２のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５５． １７位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜５１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５６． １７位のアミノ酸が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様５５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５７． １７位のアミノ酸が塩基性である、実施態様１〜５６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５８． １７位のアミノ酸置換がＳ、Ｇ、Ｎ、およびＶから選択される、実施態様１〜５７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５９． １７位のアミノ酸置換がＧ、Ｎ、およびＶから選択される、実施態様１２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６０． １８位のアミノ酸が中性である、実施態様に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６９】
６１． １８位のアミノ酸置換が親水性である、実施態様１〜５９のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６２． １８位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜６１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６３． １８位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜６１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６４． １８位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１〜６３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６５． １８位のアミノ酸置換が正荷電である、実施態様１〜６３のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６６． １８位のアミノ酸置換が酸性である、実施態様１〜６５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６７． １８位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜６５のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６８． １８位のアミノ酸置換がＧ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｎ、Ｈ、Ｅ、およびＫから選択される、実施態様１〜６７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６９． １８位のアミノ酸置換がＲまたはＮである、実施態様６８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７０． ２４位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜６９のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７０】
７１． ２４位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜６９のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７２． ２４位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜７１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７３． ２４位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜７２のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７４． ２４位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様７３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７５． ２４位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜７２のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７６． ２４位のアミノ酸が芳香族Ｒ基を含む、実施態様１〜７５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７７． ２４位のアミノ酸置換がＫ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、およびＭから選択される、実施態様１〜７６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７８． ２４位のアミノ酸置換がＶまたはＧである、実施態様７７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７９． ２５位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜７８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８０． ２５位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７１】
８１． ２５位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜８０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８２． ２５位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様８１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８３． ３５位のアミノ酸置換が芳香族Ｒ基を含む、実施態様１〜８２のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８４． ２５位のアミノ酸が極性である、実施態様１〜８０のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８５． ２５位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜８４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８６． ２５位のアミノ酸置換がＬ、Ｇ、Ｗ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、およびＷから選択される、実施態様１〜８５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８７． ２５位のアミノ酸置換がＧまたはＷである、実施態様８６に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８８． ２７位のアミノ酸置換が親水性である、実施態様１〜８７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８９． ２７位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜８８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９０． ２７位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜８８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７２】
９１． ２７位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜９０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９２． ２７位のアミノ酸置換が酸性である、実施態様１〜９１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９３． ２７位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜９０のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９４． ２７位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様９３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９５． ２７位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜９１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９６． ２７位のアミノ酸置換が負に荷電したＲ基を含む、実施態様１〜９３のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９７． ２７位のアミノ酸置換がＡ、Ｅ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｇ、およびＳから選択される、実施態様１〜９６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９８． ２７位のアミノ酸置換がＥ、Ｍ、またはＳである、実施態様９７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９９． ２８位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜９８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１００． ２８位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜９８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７３】
１０１． ２８位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜１００のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０２． ２８位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様１０１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０３． ２８位のアミノ酸置換が極性である、実施態様に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０４． ２８位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１０３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０５． ２８位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜１０４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０６． ２８位のアミノ酸置換がＦ、Ｑ、Ｖ、Ａ、Ｋ、Ｖ、およびＴから選択される、実施態様１〜１０５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０７． ２８位のアミノ酸置換がＴ、Ｑ、またはＶである、実施態様１０６に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０８． ３２位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜１０７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０９． ３２位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜１０８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１０． ３２位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜１０９のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７４】
１１１． ３２位のアミノ酸が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様１１０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１２． ３２位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜１０９のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１３． ３２位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１１２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１４． ３２位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜１１３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１５． ３２位のアミノ酸置換がＶ、Ｌ、Ｓ、Ｆ、Ａ、およびＲから選択される、実施態様１〜１１４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１６． ３２位のアミノ酸置換がＬ、Ｓ、またはＡである、実施態様１１５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１７． ３５位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜１１６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１８． ３５位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜１１６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１９． ３５位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜１１８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２０． ３５位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様１１９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７５】
１２１． ３５位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜１１８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２２． ３５位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１２１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２３． ３５位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜１２２のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２４． ３５位のアミノ酸置換が芳香族Ｒ基を含む、実施態様１〜１２３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２５． ３５位のアミノ酸置換がＶ、Ｗ、Ｓ、Ｒ、Ｍ、Ｈ、およびＬから選択される、実施態様１〜１２４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２６． ３５位のアミノ酸置換がＷ、Ｓ、またはＶである、実施態様１２５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２７． ポリペプチド表面に位置するアミノ酸残基が置換されている、実施態様１〜１２６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２８． ポリペプチドの三次元構造のコア内のアミノ酸残基が置換されていない、実施態様１〜１２７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２９． Ｃ末端および／またはＮ末端のアミノ酸伸長により伸長された、実施態様１〜１２８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３０． アミノ酸伸長または各アミノ酸伸長がこのポリペプチドによるＥＧＦＲの結合を増強する、実施態様１２９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７６】
１３１． アミノ酸伸長または各アミノ酸伸長が、ポリペプチドの生成、精製、インビボもしくはインビトロでの安定性、結合、または検出を向上させる、実施態様１２９または１３０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３２． アミノ酸伸長または各アミノ酸伸長が、ポリペプチドのアミノ酸配列の最初または最後の位置にシステイン残基を含む、実施態様１３１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３３． アミノ酸残基の伸長部が、Ｈｉｓ6タグ、または「ｍｙｃ」もしくは「ｆｌａｇ」タグを含む、実施態様１３１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３４． 伸長部分が、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体ドメインを含み、治療用途におけるＥＧＦＲ結合ポリペプチドの半減期を向上させる、実施態様１３１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３５． 約５３アミノ酸を含む、実施態様１〜１３４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３６． 最大１×１０-6Ｍの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、実施態様１〜１３５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３７． 最大１×１０-7Ｍの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、実施態様１３６に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３８． ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する、実施態様１〜１３７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３９． 成熟型ＥＧＦＲ（配列番号３２８）のヌクレオチド２５９〜２１２７に対応するＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）の一部に結合する、実施態様１３８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４０． 実施態様１〜１３９のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドのフラグメントを含む、ＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７７】
１４１． フラグメントが実施態様１〜１３９のいずれか一つに記載のポリペプチドからのＮ末端短縮を含む、実施態様１４０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４２． Ｎ末端短縮が４アミノ酸以下である、実施態様１４１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４３． ＥＧＦＲ結合ポリペプチド単位を含む多量体形態の、実施態様１〜１４２のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４４． ＥＧＦＲ結合ポリペプチド単量体単位が共有結合により結合されている、実施態様１４３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４５． ＥＧＦＲ結合ポリペプチド単量体単位が融合タンパク質として発現される、実施態様１４３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４６ 二量体形態の、実施態様１４３〜１４５のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４７． 実施態様１〜１４６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド。
１４８． 実施態様１４７に記載のヌクレオチドを発現することを含む、実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のポリペプチドの製造方法。
１４９． 実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび検出剤の組み合わせ。
１５０． 検出剤が、放射線イメージングにおいて使用するための放射性物質である、実施態様１４９に記載の組み合わせ。
【００７８】
１５１． 放射性物質が放射性核種である、実施態様１５０に記載の組み合わせ。
１５２． 検出剤が酵素である、実施態様１４９に記載の組み合わせ。
１５３． 酵素がβ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびカルボキシペプチダーゼから選択される、実施態様１５２に記載の組み合わせ。
１５４． 検出剤が蛍光ポリペプチドである、実施態様１４９に記載の組み合わせ。
１５５． 実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび治療剤の組み合わせ。
１５６． ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび検出剤または治療剤が共有結合により結合されている、実施態様１４９〜１５５のいずれか一つに記載の組み合わせ。
１５７． ＥＧＦＲポリペプチドおよび検出剤または治療剤が融合タンパク質として発現される、実施態様１４９〜１５５のいずれか一つに記載の組み合わせ。
１５８． 実施態様１５０〜１５１のいずれか一つに記載の組み合わせを放射線イメージング剤として使用する、放射線イメージング方法。
１５９． ＥＧＦＲを含む疑いのあるサンプルを提供し、実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは実施態様１４９〜１５４のいずれか一つに記載の組み合わせとサンプルを接触させ、サンプル中のＥＧＦＲの存在を示すポリペプチドまたは組み合わせへの結合を検出することを含む、ＥＧＦＲの検出方法。
１６０． 二つ以上のＥＧＦＲが検出される、実施態様１５９に記載の検出方法。
【００７９】
１６１． 実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは実施態様１４９〜１５４のいずれか一つに記載の組み合わせとサンプルを接触させることを含み、それによってＥＧＦＲがポリペプチドに結合し、これをサンプルから除去することができる、サンプルからのＥＧＦＲの分離または捕捉方法。
１６２． 被検体または被検体由来のサンプルを、実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは実施態様１４９〜１５４のいずれか一つに記載の組み合わせと接触させ、ポリペプチドまたは組み合わせへの結合を検出することを含む、被検体におけるＥＧＦＲの存在を決定するための診断方法。
１６３． 被検体がヒトまたは動物である、実施態様１６２に記載の方法。
１６４． インビボで行われる、実施態様１６２に記載の方法。
１６５． サンプルに対してインビトロで行われる、実施態様１６２または１６３に記載の方法。
１６６． 被検体または被検体由来の物質を実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは実施態様１５５〜１５７のいずれか一つに記載の組み合わせで処置することである、被検体または被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに関連する状態の処置方法。
１６７． 被検体のまたは被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに対する実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは実施態様１５５〜１５７のいずれか一つに記載の組み合わせの結合が、受容体の活性化を阻害または刺激する、実施態様１６６に記載の処置方法。
１６８． 被検体のまたは被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ結合ポリペプチドの結合が、細胞のシグナル伝達を阻害する、実施態様１６６または１６７に記載の処置方法。
１６９． ＥＧＦＲに関連する状態が癌である、実施態様１６６〜１６８のいずれか一つに記載の処置方法。
１７０． 癌が、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、頭頸部癌から選択される、実施態様１６９に記載の処置方法。
１７１． 被検体がヒトまたは動物である、実施態様１６６〜１７０のいずれか一つに記載の方法。
【００８０】
ここからは、本発明に従うポリペプチドおよびそれらの使用法は、例示のみの目的で、添付図面、図１〜１２を参照しつつ描写されよう。
【００８１】
以下の実験においては、黄色ブドウ球菌プロテインＡのＢドメイン由来のプロテインＺのＥＧＦＲ結合性のバリアントを選択するのにファージディスプレイを使用した。ＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントは、集合的にＺEGFRと表示されることもある。各個別のＺバリアントには固有の識別番号＃＃＃＃＃が付与されており、個々のバリアントは互換的にＺ＃＃＃＃＃およびＺEGFR:#####と称される。
【実施例】
【００８２】
実施例１
本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの一次選択
材料および方法
ポリペプチドバインダー、菌株、ベクター、およびファージミドライブラリの作製
アンバーサブレッサー大腸菌ＲＲＩΔＭ１５株（Ｒｕｅｔｈｅｒ，Ｕ．（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０，５７６５−５７７２．）を、ファージの産生およびクローニング手順のための細菌宿主として使用した。本研究において使用したファージミドベクターｐＡｆｆｉ１およびファージミドライブラリＺｌｉｂ２００２（３×１０9メンバー）の構築については、Ｇｒｏｅｎｗａｌｌ Ｃ，Ｊｏｎｓｓｏｎ Ａ，Ｌｉｎｄｓｔｒｏｅｍ Ｓ，Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ Ｅ，Ｓｔａｈｌ Ｓ，Ｈｅｒｎｅ Ｎ：“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｆｆｉｂｏｄｙ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６） ｉｎ ｐｒｅｓｓ，Ｅｐｕｂ ２７ Ｓｅｐ ２００６に開示されている。選択されたクローンのファージミドインサートは、カナマイシン耐性を付与する遺伝子と共に、Ｔ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５，６０−８９）、ヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ6）タグをコードするＤＮＡフラグメント、およびマルチクローニングサイトを含む、さらにはｐＡＹ４３０については直接標識のためにＣ末端に追加のシステインを含む、発現ベクターｐＡＹ４４２およびｐＡＹ４３０にサブクローニングした。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、発現ベクターからのタンパク質産生に使用した。
【００８３】
ファージストックの調製
ライブラリ（Ｚｌｉｂ２００２の一部）からのおよび選択間でのファージストックの調製は、以前に記載された手順（Ｎｏｒｄ，Ｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，７７２−７７７；Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，２３７−２５２）に従い、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて行った。ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降により、約１０13ｐｆｕ／ｍｌのファージ価を得た。
【００８４】
ファージの選択
ヌクレオチド２５９〜２１２７に対応する６２３アミノ酸を含むＥＧＦＲの約１００ｋＤａの組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、選択において標的タンパク質として使用した（配列番号３２９）。このタンパク質を、ＥＺ−ＬｉｎｋＴＭ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてインビトロでビオチニル化させた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中のＥＧＦＲ−ＥＣＤに２０倍過剰のビオチンを加え、その混合物を室温で１時間インキュベートした後、４℃でＰＢＳに対して十分な透析を行い余分なビオチンを除去した。
【００８５】
次いで、ビオチニル化した標的タンパク質を、ストレプトアビジンコートした常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ．，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）に固定した。各選択ラウンドにつき、ビーズを、０.１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を補充したＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で二回洗浄した。非特異的なバインダーを回避するため、この手順に使用した全てのチューブは、０.１％ゼラチンを補充したＰＢＳＴで事前に処理しておいた。さらに常磁性ビーズ上に存在するストレプトアビジンに対するバインダーを回避するため、０.１％ゼラチンを補充したＰＢＳＴ中のファージストックを、第１ラウンドおよび第２ラウンドにおいて０.２ｍｇのビーズ（予めＰＢＳＴで二回洗浄しておいた）と共にプレインキュベートした。次いで、結合していないファージストックを、連続的に上下逆さ回転させる条件下（ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ ｒｏｔａｔｉｏｎ）、室温で１時間４５分の、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ標的タンパク質に対するバイオパニングに供し、その後にストレプトアビジンコートした常磁性ビーズと共に１５分間（室温、連続的に上下逆さ回転）インキュベートした。各パニングラウンドにおいて各々２つの異なる漸減標的濃度を使用した２つの別個の選択を、以下の通りに行った。第１ラウンドにおいては；１２および１.２μｇの標的タンパク質を、それぞれ６および０.６ｍｇのビーズと共にインキュベートし、第２ラウンドにおいては；５、２.５、０.５、および０.３５μｇの標的タンパク質をそれぞれ２.５、１.２５、０.２５、０.１２５ｍｇのビーズと共にインキュベートし、第三および第４ラウンドにおいては；５、１、０.５、および０.１μｇの標的タンパク質をそれぞれ１、０.５、０.１、０.０５ｍｇのビーズと共にインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による測定によれば、この手順により、ビーズ１ｍｇあたり約２μｇの標的タンパク質が固定された。４ラウンドのバイオパニングは以下の通りに行った。ビーズは、第１ラウンドにおいて２回、第２ラウンドにおいて５回、第３ラウンドにおいて７回、および第４ラウンドにおいて１０回、ＰＢＳＴで洗浄した。その後、結合したファージを５００μｌの５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２.１を用いて室温で１０分間溶出させ、次いで直ちに５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０および４５０μｌ ＰＢＳで中性にした。
【００８６】
溶出したファージを使用して、３７℃で３０分間、対数増殖期のＲＲＩΔＭ１５細胞を感染させた。感染細胞懸濁物を、２％グルコースおよび１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補充したＴＹＥ寒天プレート（１５ｇ／ｌ寒天、８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌトリプトン、および６ｇ／ｌ酵母エキス）上に塗布し、次いで３７℃で一晩インキュベートした。成長したコロニーを、５ｇ／ｌ酵母エキス、２％グルコース、および１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したトリプティックソイブロス（ＴＳＢ、３０ｇ／ｌ；Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）への再懸濁により回収し、フラクション（溶出後のファージ価と比較して約５００倍過剰の細胞）を接種に使用し、次の世代のファージストックを得た。選択プロセスは、選択前および溶出後のファージストックを滴定することによって監視した。室温で５分間、ファージの連続希釈物で対数増殖期のＲＲＩΔＭ１５細胞を感染させた後、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＴＹＥ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８７】
ストレプトアビジンＥＬＩＳＡ
４ラウンドのバイオパニング後、４つ全ての選択から無作為抽出した３７２個のコロニーに対してＥＬＩＳＡを行い、ストレプトアビジン結合能を有するファージミド（ｐＡｆｆｉ１）インサートを排除した。無作為抽出したコロニー由来の細胞溶解産物を、事前にブロッキングした（２％粉乳を補充したＰＢＳＴ）９６ウェルストレプトアビジンコートプレート（Ｎｕｎｃ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ，ｃ９６，２３６００１）において室温で１.５時間インキュベートした。一次抗体としてウサギＩｇＧ全抗ポリペプチド特異的（ｐａｎ−ａｎｔｉ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）バインダー（１.５時間、室温、絶えず震盪）を、二次抗体としてウサギ免疫グロブリン−ＨＲＰを使用した（Ｐ０４４８ Ｄａｃｏ Ｃｙｔｏｍａｔａｔｉｏｎ；１時間、室温、絶えず震盪）。基質溶液（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）の添加後に、Ｔｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅ分光光度計を用いてＡ405nmの吸光度を測定した。
【００８８】
ＤＮＡ配列決定
ファージミド（ｐＡｆｆｉ１）インサートのＤＮＡ配列決定を、第４ラウンドのパニング由来の非ストレプトアビジン結合クローン（６４クローンは第１選択および第２選択由来であり３２クローンは第３選択および第４選択由来であった）に対して行った。特異的なプライマーおよびＢｉｇ Ｄｙｅターミネーター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、ＳａｎｇｅｒフラグメントをＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３７００ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において分析した。サブクローニングしたＤＮＡフラグメントを同じ手順で検証した。
【００８９】
アンバー終止コドンを有する配列（３個）、一つ以上のシステインを有する配列（１個）、および他の標的に対する選択において見出された配列（３個）を排除した後、さらなる調査のために１０個の配列を選択した。これらのポリペプチドバインダーの各アミノ鎖配列を図１に示し、配列番号１６４〜１７３として配列表に開示する。これらのバリアントの推定ＥＧＦＲ結合モチーフを配列番号１〜１０に示す。選択されたバリアントの配列は図２Ａにも示してある。特に、図２Ａにおいては、「野生型」Ｚドメインに対応するアミノ酸配列を、ＥＧＦＲ−ＥＣＤに対して選択された１０個の異なるポリペプチドバインダーの推定アミノ酸配列に整列させており、その図および本明細書中の他所において使用した破線は、「野生型」配列内の対応するアミノ酸と同一のアミノ酸を表す。１３個の無作為化されたアミノ酸残基（Ｑ９、Ｑ１０、Ｎ１１、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｈ１８、Ｅ２４、Ｅ２５、Ｒ２７、Ｎ２８、Ｑ３２、Ｋ３５）が示されている。１つ以上のバリアントにおいて同じ位置に現われたアミノ酸残基を太字で示す。水平線は、アミノ酸の一致を示す。図右側には、３７２個のコロニーのＤＮＡ配列決定において各ポリペプチドバインダーが検出された回数を示してある。野生型Ｚドメインにおける３つのα−ヘリックスを囲んでいる。
【００９０】
図２Ｂおよび図２Ｃはさらに、本発明のポリペプチドバインダーにおけるアミノ酸置換の特徴を示す。疎水性／親水性との関係での「中性」は、相対的に疎水性でも親水性でもないアミノ酸を意味する。
【００９１】
図２Ｄは、最初に決定したポリペプチドバインダーの改善のための成熟ストラテジーを示す。これに関連して、９、１０、１１、１３、および１４位の残基は重要性が低いため置換に供し、一方１７および１８位についてはアスパラギンおよびアルギニンが特に好ましいが、技術的理由で好まれ得るセリンおよびヒスチジンもまた、コドンの類似性の結果として生成され結合に使用され得る。３５位においては、バリンおよびセリンが好ましいが、技術的な理由ではロイシンおよびアラニンもまた特に選択され得る。２４、２５、２７、２８、および３２位については、それぞれアミノ酸Ｇ、Ｗ、Ｍ、Ｔ、およびＡが企図されるが、この分子のＥＧＦＲ結合能を保持する単一置換もまた、これらの部位のいずれかにおいて可能であり得る。
【００９２】
ＤＮＡ構築物
異なるＥＧＦＲポリペプチドバインダーをコードするＤＮＡフラグメントを発現ベクターｐＡＹ４４２およびｐＡＹ４３０にサブクローニングした。このフラグメントを、３'および５'の両方にＡｃｃＩ部位を導入する特異的プライマーを用いてｐＡｆｆｉ１ベクターから増幅し、予め同じ酵素で切断しておいたｐＡＹ４４２およびｐＡＹ４３０ベクターにライゲートし、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて脱リン酸化した。増幅したＤＮＡフラグメントをＱＩＡｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるライゲーションの前にハイブリダイズさせた。このライゲーションにより、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）による精製のためにＮ末端Ｈｉｓ6タグに融合された異なるポリペプチドバインダーをコードするｐＡＹ４４２−ＺEGFR:noおよびｐＡＹ４３０−ＺEGFR:noと命名された発現ベクターを得た。全てのプラスミドの調製は、形質転換した大腸菌細胞を一晩培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を製造元の指示に従い用いて行った。
【００９３】
タンパク質の生成および精製
選択されたポリペプチドバインダーを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株においてｐＡＹ４４２およびｐＡＹ４３０プラスミドからＨｉｓ6−タグ融合タンパク質として発現させた。
【００９４】
５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＴＳＢ培地（３０ｇ／ｌトリプティックソイブロス）５ｍｌに細胞を接種し、ディープウェルプレート中、約１５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。５ｇ／ｌ酵母エキスおよび５０ｍｇ／ｌカナマイシンを補充した新鮮なＴＳＢ（５ｍｌ）に、オーバーナイトカルチャー２０μｌを接種して細胞を３７℃で４時間培養し、終濃度が１ｍＭになるまでイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって遺伝子の発現を誘導した。２５℃で一晩培養した後、細胞を遠心分離（１００００ｇ、１０分間）により収集し、凍結解凍法（−８０℃、４０分間）により溶解させた。次いで、細胞ペレットを尿素緩衝液（８Ｍ、ｐＨ８.０）に再懸濁させた。Ｈｉｓ6−ＺEGFR融合タンパク質は、ＢＲ３０００ロボットを用いて、変性条件下のＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｑｉａｇｅｎ）におけるＩＭＡＣ精製により回収した。結合したタンパク質を低ｐＨ尿素緩衝液（８Ｍ、ｐＨ４.５）で溶出させ、精製した融合タンパク質の再生は、ＮＡＰ（商標）−５サイズ排除クロマトグラフィカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において緩衝液をＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３.４ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７.４）に交換することによって行った。そのポリペプチドのタンパク質濃度は、各タンパク質に適した消衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度測定値から算出した。この精製されたポリペプチドをさらに、Ｐｈａｓｔ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いるＰｈａｓｔｇｅｌ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ２０％ゲルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析した。選択されたＺEGFRバリアントのタンパク質濃度もまた、アミノ酸分析により決定した（Ａｍｉｎｏｓｙｒａａｎａｌｙｓｃｅｎｔｒａｌｅｎ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。
【００９５】
図３は、発現されＩＭＡＣ精製されたＥＧＦＲ結合ポリペプチドＨｉｓ6−ＺEGFR:942（レーン１）、Ｈｉｓ6−ＺEGFR:948（レーン２）、Ｈｉｓ6−ＺEGFR:955（レーン３）、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:942）2（レーン４）、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2（レーン５）、およびＨｉｓ6−（ＺEGFR:955）2（レーン６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーンＭはマーカータンパク質であり、分子量はキロダルトンで示す。
【００９６】
バイオセンサー分析
選択されたポリペプチドバインダーと標的タンパク質の間のリアルタイム生体分子間特異的相互作用（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（ＢＩＡ）に関しては、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４.５に希釈）を、製造元の指示に従い、アミンカップリングによって、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）の一つのフローセル表面のカルボキシル化デキストラン層に固定（約２６００ＲＵ）した。別のフローセル表面を、参照表面として使用するために活性化および不活性化し、ＨＥＲ２−ＥＣＤおよびヒトＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、ネガティブコントロールとして使用するため、別のＣＭ５センサーチップのフローセル表面に固定した。試験中の全てのポリペプチドバインダーのサンプルを、泳動緩衝液ＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３.４ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７.４）に希釈し、濾過（０.４５μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）した後に２５℃で結合アッセイを行った。第一実験においては、試験中の各ポリペプチドバインダー約１μＭ（ＨＢＳに希釈）を、全ての表面に対して２０μｌ／分の流速で注入した。ＥＧＦＲに対する親和性を有さない無関係の５３アミノ酸ポリペプチドバインダーをネガティブコントロールとして使用し、ポジティブコントロールとして天然リガンドｈＥＧＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）および市販のモノクローナル抗体セツキシマブ（ＭＥＲＣＫ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）も注入した。第二実験においては、単量体Ｈｉｓ6−ＺEGFRおよび二量体Ｈｉｓ6−（ＺEGFR）2ポリペプチドバインダーを速度分析に供し、このタンパク質を０.００６２５μＭ〜１２.８μＭの範囲の濃度、３０μｌ／分の流速でＥＧＦＲ−ＥＣＤ表面に注入した。解離平衡定数（ＫD）、結合速度定数（ｋa）、および解離速度定数（ｋD）は、１対１の結合を前提としてＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．２ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて算出した。第二実験については、サンプルを無作為順に二連で泳動し、各々の注入後に１０ｍＭ ＨＣｌを注入することによってフローセルを再生させた。バイオセンサーランキング分析の結果を表１および図４に示す。表１では、ＢＩＡｃｏｒｅにおけるバイオセンサー分析による、一価および二価のＥＧＦＲ−ＥＣＤ結合ポリペプチドバインダーの速度パラメータの比較を行っている。二量体ＥＧＦＲ結合ポリペプチド構築物は、以前にＳｔｅｆｆｅｎ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２０，２３９−２４８に記載されたように遺伝子複製ストラテジーを通じて作製し、生成および親和性精製を行った。追加のポリペプチド、ＺEGFR:1239（ＺEGFR:955の配列類縁体として同定した）は、追加のクローンの配列決定後に加え、その単量体としての能力に関するデータを開示している。４つのＨｉｓ6−ＺEGFRポリペプチドバインダーは、解離平衡定数から、以下のような親和性ランクになった：Ｈｉｓ6−ＺEGFR:1239 ＜ Ｈｉｓ6−ＺEGFR:955 ＜ Ｈｉｓ6−ＺEGFR:948 ＜ Ｈｉｓ6−ＺEGFR:942。
【００９７】
【表１】
【００９８】
このインビトロ結合分析からは、４つ全てのＥＧＦＲ結合ポリペプチドがかなり高い親和性でＥＧＦＲに結合したこと、およびそれらは結合速度論的特性において程度相違することが確認できる。
【００９９】
図４Ａは、精製されたＨｉｓ6−（ＺEGFR:942）2（四角）、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2（三角）、およびＨｉｓ6（ＺEGFR:955）2（丸）バリアントをアミン結合型ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（黒塗りの四角／三角／丸）またはＨＥＲ２−ＥＣＤ（白塗りの四角／三角／丸）を含むセンサーチップフローセル表面に注入した後に得られたセンサーグラムの結果を示す。これは、三つのＨｉｓ6−ＺEGFRバリアント（Ｈｉｓ6−ＺEGFR:942、Ｈｉｓ6−ＺEGFR:948、およびＨｉｓ6−ＺEGFR:955）がＥＧＦＲ−ＥＣＤを固定したフローセル表面に特異的に結合するが、ＨＥＲ２−ＥＣＤを固定したフローセル表面に対する結合は見られないことを示している。
【０１００】
図４Ｂは、一価（薄い線）および二価（濃い線）のＥＧＦＲ結合ポリペプチドをＥＧＦＲ−ＥＣＤフローセル表面に注入した後に得られたセンサーグラムの結果を示す。このダイアグラムは、一価と二価のＥＧＦＲ結合ポリペプチドの間でオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の違いが示された三つの候補バインダーを示しており、アビディティ効果による見かけ上の親和性の向上が主に第二世代クローンにおいてより遅いオフレートを獲得することによって達成されたことを証明している。
【０１０１】
細胞培養
以下のフルオロフォア標識ＦＡＣＳおよび共焦点顕微鏡研究のために、細胞あたり約２×１０6のＥＧＦＲを発現することが公知のヒト上皮癌細胞Ａ４３１（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、および１％抗生剤−抗真菌剤、全てＧｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＢ）製、を補充したＥＭＥＭ培地を含む補完培地（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）中で培養した。この細胞を、５％ ＣＯ2を含む加湿空気下、３７℃で培養した。
【０１０２】
フルオロフォア標識
Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:942）2、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2、およびＨｉｓ6−（ＺEGFR:955）2ポリペプチドバインダーを、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８マレイミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、（Ｃ末端に）導入したシステインに対して直接標識した。およそ１ｍｇのＨｉｓ6−（ＺEGFR）2ポリペプチドバインダーをＰＢＳに再懸濁し、３７℃で４５分間、２０ｍＭ ＤＴＴで還元した。余分なＤＴＴは、ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ（商標）−５サイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって除去した。Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８マレイミドの１０ｍＭ溶液を２０倍モル過剰加え、室温で２時間、暗所にて継続的に震盪させた。ＰＢＳに対して十分な透析を行い過剰なフルオロフォアを除去した。試験中のフルオロフォア標識ポリペプチドバインダーの濃度および標識率を、製造元のプロトコルに従い２８０および４９６ｎｍにおける吸光度測定値を用いる計算により確認した。標識ポリペプチドバインダーは、Ｐｈａｓｔ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｐｈａｓｔｇｅｌ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ２０％ゲルによっても分析した。
【０１０３】
ＦＡＣＳ
ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥストリーム−イン−エアフローサイトメトリー機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。レーザーは、４８８ｎｍ用フローサイトメトリーアラインメントビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてアラインメントを行った。サンプルには、空冷アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）を照射した。１００００細胞からの蛍光、前方散乱光、および側方散乱光をおよそ３００イベント ｓ-1の速度で検出した。フローサイトメトリーデータは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。フローサイトメトリー分析の前に、およそ実験３日前にペトリ皿に播種した細胞をトリプシン処理した（０.２５％トリプシン、３７℃、１０分間）。この細胞を遠心分離（５８２ｇ、３分間）し、そのペレットをＰＢＳ＋１％ ＢＳＡに再懸濁し、９６ウェルプレートにて１ウェルあたり約３０００００細胞のアリコートに分けた。この細胞を、１０μｇ／ｍｌフルオロフォア標識Ｈｉｓ6−（ＺEGFR）2ポリペプチドバインダーと共に氷上で約３０分間インキュベートした。遠心分離およびＰＢＳ＋１％ ＢＳＡによる洗浄後、細胞ペレットを３００μｌ ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡに再懸濁し、フローサイトメトリー分析に供した。ＥＧＦＲに対する結合能を有さない類似の（Ｈｉｓ6タグ型二量体構築物）ポリペプチドをネガティブコントロールとして使用した。
【０１０４】
これらの研究の結果を図５に示す。具体的には、図５は、Ａ４３１細胞上のネイティブＥＧＦＲに対する３つの候補バインダー（Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:942）2、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:955）2）に対する親和性のランキングを示すフローサイトメトリー分析を示す。ネガティブコントロールとして使用した無関係のＺバリアント分子（白色）はヒストグラムの最も左に位置した。次に３つのＺEGFRバインダーは、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:942）2（薄灰色）＜Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2（灰色）＜Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:955）2（黒色）の順で位置した。これらのデータは、ＺEGFR:955が、ＢＩＡｃｏｒｅにおいては幾分乏しい親和性であったにも関わらず、このアッセイは細胞上のネイティブＥＧＦＲへの結合に基づくものであるために、３つの中で最良の候補であり得ることを示唆している。
【０１０５】
共焦点顕微鏡
実験前日に、３０ｍｍペトリ皿あたりおよそ３０００００個のＡ４３１細胞を播種した。試験中のＨｉｓ6−（ＺEGFR:942）2、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2、およびＨｉｓ6−（ＺEGFR:955）2ポリペプチドバインダーを、完全ＥＭＥＭ培地中およそ１０μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、別のペトリ皿に入れ、３７℃で２時間、暗所にてインキュベートした。試験中の３つのポリペプチドバインダーはまた、上記と同様に無血清ＥＭＥＭ培地に希釈し、別のペトリ皿に入れ、氷上で１時間、暗所にてインキュベートした。インキュベーション後、細胞を通常の培地で一回洗浄し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ５ Ｐａｓｃａｌ；Ｚｅｉｓｓ）を用いる画像分析のために少量の培地を加えた。細胞の厚みを網羅するよう連続スキャンを行い、細胞の中央に対応するスキャンを選択した。ネガティブコントロールとして、ＥＧＦＲに対する親和性を有さない類似ポリペプチドを同じ方法で分析した。
【０１０６】
共焦点顕微鏡の結果を図６に示す。具体的には、図６は、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ標識Ｈｉｓ6−ＺEGFRポリペプチドに、Ａ）氷上で１時間およびＢ）３７℃で２時間暴露したＡ４３１細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。左から右に向かって、Ｈｉｓ6-（ＺEGFR:942）2、Ｈｉｓ6-（ＺEGFR:948）2、およびＨｉｓ6-（ＺEFGR:955）2で、（Ａ）においては細胞膜に結合したものおよび（Ｂ）においては細胞内に取り込まれたものが見られる。この結果は、３つのＥＧＦＲ結合ポリペプチドが、予想通り、細胞膜に結合するようであること、および３７℃においては細胞内取込みが起こるようであることを実証している。
【０１０７】
細胞培養
以下の放射能標識、特異性および飽和研究のために、細胞を、７５ｃｍ2培養ボトルおよび２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）において培養した。標識法には、125Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、酢酸（Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、クロラミン−Ｔ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、およびＮ−スクシニミジル−４−［トリ−メチルスタンニル］ベンゾエート（当研究室にて合成）を使用した。ＮＡＰ−５カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）をゲル濾過に利用した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（０.２５／０.０２％）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｋｇ）によって引き離し、セルカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｚ２，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）で計数した。放射活性は、ガンマカウンター（１４８０ Ｗｉｚａｒｄ，Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。ＥＧＦＲリッチな扁平上皮癌細胞Ａ４３１株（ＡＴＣＣ，ＣＬＲ １５５５，Ｒｏｃｋｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用した。細胞を、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｋｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＥＳＴ（ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）、および１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｋｇ）を補充したＨａｍ'ｓ Ｆ−１０培地（「完全培地」）中で培養した。細胞を、５％ ＣＯ2で平衡化した加湿空気を含む３７℃のインキュベーター内で培養した。
【０１０８】
放射能標識
ポリペプチドバインダーＺEGFR:942、ＺEGFR:948、およびＺEFGR:955の二量体を、Ｎ−スクシニミジル基を通じて間接的に125Ｉ標識した。酢酸（２μｌ、ｍｉｌｌｉ−Ｑ中０.１％酢酸）およびＮ−スクシニミジル−４−［トリ−メチルスタンニル］ベンゾエート（５μｌ、メタノール中５％酢酸）を125Ｉ（１５ ＭＢｑ）に加えた。１０μｌクロラミン−Ｔを加えることによってＮ−スクシニミジル−４−［トリ−メチルスタンニル］ベンゾエートにヨウ素を結合させた。次いで、この溶液を３０秒間再懸濁し、室温で５分間さらにインキュベートした。反応を停止するため、メタ重亜硫酸ナトリウム１５μｌを添加した。このポリペプチドバインダーをホウ酸緩衝液に希釈し、ヨウ素溶液を加え、追加のホウ酸緩衝液を加えて総量１５０μｌとし、この溶液を３０分間インキュベートした。標識ポリペプチドバインダーバインダーを低分子量化合物から分離するため、ＰＢＳで平衡化させたＮＡＰ−５カラムを使用した。
【０１０９】
特異性試験
Ａ４３１細胞を２４ウェルプレートで培養し、無血清Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１０培地で一回洗浄した。試験する３つの二量体ポリペプチドバインダーを125Ｉで標識し、利用可能な受容体数に関しておよそ１０：１のモル過剰で細胞に加え、３７℃で４時間インキュベートした。いくつかのウェルにおいては、非特異的結合を測定するため、無関係のポリペプチドバインダー（およそ５００：１モル過剰）を、［125Ｉ］ポリペプチドバインダーと共に加えた。ＥＧＦ（およそ２００：１モル過剰）およびセツキシマブ（５００：１モル過剰）も、このポリペプチドバインダーがＥＧＦおよびセツキシマブと同じ結合部位を有するかどうかを調査するためであるが、同じ方法で使用した。次いで細胞を無血清Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１０培地で６回洗浄し、０.５ｍｌトリプシン−ＥＤＴＡを加えることによって引き離し、３７℃で３０分間または細胞が引き離されるまでインキュベートした。Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１０完全培地１ｍｌを加え、細胞を再懸濁した。いくつかのウェルにおいては、０.５ｍｌ懸濁物を使用して細胞を計数した。放射活性（計数した細胞について、それぞれ、１.５ｍｌおよび１ｍｌ）はガンマカウンターで測定した。
【０１１０】
その結果を図７に示す。具体的には、図７には、［125Ｉ］（Ｚ００９４２）2（４２*）、［125Ｉ］（Ｚ００９４８）2（４８*）、および［125Ｉ］（Ｚ００９５５）2（５５*）の細胞結合が示されている。これらのデータは、ＢＩＡｃｏｒｅ分析においては（ＺEGFR:942）2が最高の親和性を示すという事実があるにも関わらず、ＺEFGR:955が細胞上のネイティブＥＧＦＲの最良のバインダーのようであり、ＺEGFR:948およびＺEGFR:942がそれに続くということを示した、これらのバインダーの以前のＦＡＣＳランキングからの予想外の結果を支持するものである。さらに、３つのＥＧＦＲ結合ポリペプチド構築物は、重複するエピトープに結合するようである。さらに、これらは全て、天然リガンドＥＦＧおよびモノクローナル抗体セツキシマブと同じ結合部位で競合するようである。
【０１１１】
飽和アッセイ
親和性定数を決定するため、ポリペプチドバインダーの結合の飽和を測定した。ＥＧＦＲリッチな細胞株であるＡ４３１を２４ウェルプレートにて培養した。細胞を氷上で維持し、冷やした無血清Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１０培地で一回洗浄した。125Ｉ標識ポリペプチド二量体バインダーの連続希釈物を調製し、およそ１０：１モル過剰で細胞に加えた。この細胞を、インキュベーターからの空気を細胞プレートと共にプラスチックバッグ内に捕捉する環境下、氷上でゆっくり動かしながら４時間インキュベートした。非特異的結合の概算のために、各濃度ごとに、およそ３００：１モル過剰で非標識ポリペプチドバインダーを含むブロックコントロールを作製した。次いで、細胞を冷やしたＨａｍ'ｓ Ｆ１０無血清培地で６回洗浄し、０.５ｍｌトリプシン−ＥＤＴＡを加えることによって細胞を引き離し、３７℃で３０分間または細胞が引き離されるまでインキュベートした。Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１０完全培地１ｍｌを加え、細胞を再懸濁した。いくつかのウェルにおいては、０.５ｍｌ懸濁物を使用して細胞を計数した。放射活性はガンマカウンターで測定した。これらのデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４で分析した。
【０１１２】
その結果を図８に示す。具体的には、図８には、［125Ｉ］Ｚ００９４２（Ａ）、［125Ｉ］Ｚ００９４８（Ｂ）、および［125Ｉ］Ｚ００９５５（Ｃ）の飽和研究の結果が示されている。３つの値の平均値および標準偏差が示されている。
【０１１３】
実施例２
本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの二次選択
材料および方法
菌株およびベクター
アンバーサブレッサー大腸菌ＲＲＩΔＭ１５株（Ｒｕｅｔｈｅｒ，Ｕ．（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，５７６５−７２）を、ライブラリの構築のために、ファージの産生およびクローニング手順のための宿主細胞として使用した。ファージミドベクターｐＡｆｆｉ１をライブラリの構築に使用し、これについては他の文献に記載されている（Ｇｒｏｅｎｗａｌｌ Ｃ，Ｊｏｎｓｓｏｎ Ａ，Ｌｉｎｄｓｔｒｏｅｍ Ｓ，Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ Ｅ，Ｓｔａｈｌ Ｓ，Ｈｅｒｎｅ Ｎ：“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｆｆｉｂｏｄｙ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６）ｉｎ ｐｒｅｓｓ，Ｅｐｕｂ ２７ Ｓｅｐ ２００６）。選択されたクローンのファージミドインサートは、カナマイシン耐性を付与する遺伝子と共に、Ｔ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，６０−８９）、ヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ6）タグをコードするＤＮＡフラグメント、およびマルチクローニングサイトを含む発現ベクターｐＡＹ４４２にサブクローニングした。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、発現ベクターからのタンパク質産生に使用した。
【０１１４】
二次ファージミドライブラリの構築
親和性成熟のストラテジーは、ＥＧＦＲ結合分子の一次選択からの４つの配列のアラインメント（実施例１、図２）に基づき決定した。二次ライブラリは、プロテインＺのヘリックス１および２をコードする、特定の縮重コドンを含む単一の１２９ヌクレオチドテンプレートオリゴヌクレオチド（５' ｃｔｃ ｇａｇ ｇｔａ ｇａｃ ａａｃ ａａａ ｔｔｃ ａａｃ ａａａ ｇａａ ｎｎｋ ｎｎｋ ｎｎｋ ｇｃｇ ｎｎｋ ｎｎｋ ｇａｇ ａｔｃ ｍｒｙ ｍｒｙ ｔｔａ ｃｃｔ ａａｃ ｔｔａ ａａｃ ｇｇｔ ｔｇｇ ｃａａ ａｔｇ ａｃｃ ｇｃｃ ｔｔｃ ａｔｃ ｇｃｇ ａｇｔ ｔｔａ ｋｙｔ ｇａｔ ｇａｃ ｃｃａ ａｇｃ ｃａａ ａｇｃ ３'）からのＰＣＲ増幅により作製した。この遺伝子フラグメントを、９５の並行して行う反応の各々についてのテンプレートオリゴヌクレオチド１ｐｍｏｌと共に、フォワードプライマー５'−ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｔｃｇａｇｇｔａｇａｃａａｃａａａｔｔｃａａ−３'（下線はＸｈｏＩ部位）およびリバースプライマー５'−ｃｃｃｃｃｃｔｇｃｔａｇｃａａｇｔｔａｇｃｇｃｔｔｔｇｇｃｔｔｇｇｇｔｃａｔｃ−３'（下線はＮｈｅＩ部位）を用いて増幅した。増幅は、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、１５サイクル（９６℃で１５秒、６０℃で１５秒、および７２℃で１分）で行い、これをプールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、ＸｈｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、そしてプロテインＺの第三の非異型（ｎｏｎｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）のαヘリックスをコードするＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ消化したファージミドベクターｐＡｆｆｉ１にライゲートした。ライゲートしたライブラリベクターを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：２１ ｖ／ｖ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出した。２５００Ｖ、１２５Ω、および５０μＦのＥＣＭ ６３０セット（ＢＴＸ，Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）において、０.２ｃｍギャップサイズのキュベットを用いて、エレクトロコンピテントな大腸菌ＲＲＩΔＭ１５細胞を、３０アリコートのライゲート物質により形質転換した。細胞を、ＳＯＣ培地（１％グルコース、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＳＯ4、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、および２.５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌを補充したトリプトンソイブロス（ＴＳＢ）＋酵母エキス（ＹＥ））中、３７℃で約１時間培養し、各々２％グルコースおよび２５μｇ／ｍｌカルベニシリンを補充したＴＳＢ １ｌを含む６つのエルレンマイヤーフラスコに移し、３７℃で一晩培養した。この細胞を６０００ｇで遠心分離（１５分間、４℃）し、およそ２０％グリセロールの終濃度になるようＰＢＳ／グリセロール溶液に再懸濁し、アリコートに分け、そして−８０℃で保存した。
【０１１５】
ファージ選択手順
約１００ｋＤａのＥＧＦＲの組換え細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤと表記する）を、選択時の標的タンパク質として使用した（１０９５−ＥＲ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。ＥＧＦＲ−ＥＣＤを、ＥＺ−ＬｉｎｋＴＭ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いてインビトロでビオチニル化した。２０倍モル過剰のビオチンを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.２）中のＥＧＦＲ−ＥＣＤに加え、この混合物を室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした後、ＰＢＳに対して４℃で一晩（ＯＮ）十分な透析を行い、余分なビオチンを除去した。
【０１１６】
ライブラリからのおよび選択間のファージストックの調製は、以前に記載された手順（Ｎｏｒｄ，Ｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，７７２−７７７；Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，２３７−２５２）に従い、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降により、約１０13ファージ形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌのファージ価を得た。選択は溶液中で行い、結合したファージをストレプトアビジンコートした常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）で捕捉した。非特異的なバインダーを回避するため、全てのチューブを、５％ウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０.１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）（ＰＢＳＴ−５％ ＢＳＡ）で事前に処理しておいた。さらにストレプトアビジンコートした常磁性ビーズ上に存在するストレプトアビジンに対するバインダーを回避するため、選択の最初の２ラウンドにおいてファージストックを含むＰＢＳＴ−３％ ＢＳＡ約１ｍｌを、０.２ｍｇのビーズと共にプレインキュベートした（３０分、上下逆さ回転）。
【０１１７】
標的濃度１００ｎＭから始める４ラウンドのバイオパニングは以下の通りに行った。第１ラウンドにおいて、およそ１０12 ｐｆｕを含むライブラリのアリコートを、ＰＢＳＴ−３％ ＢＳＡ中１００ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤ １ｍｌ中、継続的に回転させながらＲＴで１時間、その後に４℃で約７２時間インキュベートした。第２ラウンドについては５０ｎＭ、および第３ラウンドについては１ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤをそれぞれ含むＰＢＳＴ−３％ ＢＳＡ １ｍｌを、前のラウンドからのファージストックの一部と共にインキュベートした（１時間、ＲＴ、連続的に上下逆さ回転）。結合したファージを、ストレプトアビジンコートしたＭ−２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓと共に１５分間インキュベート（ＲＴ、連続的に上下逆さ回転）することによって捕捉した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって予め決定した（データは示さず）、ビーズ１ｍｇあたり約２μｇの標的タンパク質を固定できる量のビーズを加えた。第４ラウンドにおいては、以下の表２に詳述されるような、６つの若干異なる選択プロトコルを行った。プロトコル４−Ａおよび４−Ｂにおいては、それぞれ、０.０１ｎＭおよび０.１ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤを、前のラウンドからのファージストックの一部と共にＲＴで２時間インキュベートした後、１００倍過剰のＥＧＦＲ−ＥＣＤと共にＲＴで１時間インキュベートし、ストレプトアビジンコートビーズと共に１５分間インキュベートすることによって結合したファージを捕捉し、１８回洗浄し、１００倍過剰の第一世代ＥＧＦＲバインダーＺ００９４２、Ｚ００９４８、およびＺ００９５５（実施例１）と共にＲＴで１時間インキュベートし、最後に２回洗浄した。プトロコル４−Ｃにおいては、０.５ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤを、前のラウンドからのファージストックの一部と共にＲＴで２時間インキュベートした後、ストレプトアビジンコートビーズと共に１５分間インキュベートすることによって結合したファージを捕捉し、１８回洗浄し、１００倍過剰の第一世代ＥＧＦＲバインダーと共にＲＴで１時間インキュベートし、最後に２回洗浄した。プトロコル４−Ｄおよび４−Ｅにおいては、それぞれ、０.１および０.５ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤを、前のラウンドからのファージストックの一部と共に３７℃で２時間インキュベートした後、１００倍過剰のＥＧＦＲ−ＥＣＤと共に３７℃で１時間インキュベートし、ストレプトアビジンコートビーズと共に１５分間インキュベートすることによって結合したファージを捕捉し、１８回洗浄し、１００倍過剰の第一世代ＥＧＦＲバインダーと共に３７℃で１時間インキュベートし、最後に２回洗浄した。プトロコル４−Ｆにおいては、０.１ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤを、前のラウンドからのファージストックの一部と共にＲＴで２時間インキュベートした後、ストレプトアビジンコートビーズと共に１５分間インキュベートすることによって結合したファージを捕捉し、２０回洗浄した。洗浄工程の回数は、選択手順の間２０回洗浄で固定し、ＰＢＳＴを用いた最後の洗浄を除く全ての洗浄工程において、ＰＢＳＴ−３％ ＢＳＡ中で行った。ファージを５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２.１）５００μｌを用いて１０分間溶出させ、次いで直ちに５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０および４５０μｌ ＰＢＳを加えることによって中性にした。溶出したファージを使用して、３７℃で３０分間、対数増殖期のＲＲＩΔＭ１５細胞を感染させた。感染細胞懸濁物を、２％グルコースおよび１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補充したＴＹＥ寒天プレート（１５ｇ／ｌ寒天、３ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌトリプトン、および５ｇ／ｌ酵母エキス）に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。成長したコロニーを、５ｇ／ｌ酵母エキス、２％グルコース、および１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補充したトリプティックソイブロス（ＴＳＢ、３０ｇ／ｌ；Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）への再懸濁により回収し、フラクション（溶出後のファージ価と比較して約５００倍過剰の細胞）を接種に使用し、次世代のファージストックを得た。ファージミド粒子を、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を用いて感染細胞から回収し、精製し、ＰＧＥ沈降によって濃縮した。選択プロセスは、各選択前および溶出後のファージストックを滴定することによって監視した。ＲＴで５分間、ファージの連続希釈物で対数増殖期のＲＲＩΔＭ１５細胞を感染させた後、２％グルコースおよび１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補充したＴＹＥ寒天プレートにプレーティングし、３７℃でＯＮした。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
第二世代バインダーのＥＬＩＳＡベースのランキング
単一のコロニーを、ディープウェルプレート（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｄｅｎｍａｒｋ）中の、１００μｍｏｌ／ｌイソプロピル−Ｌ−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した１ｍｌ ＴＳＢ−ＹＥ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。３０００ｇで１０分間の遠心分離により細胞をペレット化した。このペレットを３００μｌ ＰＢＳＴに再懸濁し、−８０℃で一晩凍結させた。このサンプルを解凍し、３５００ｇで２０分間遠心分離した。ＡＢＤタグが付加されたＺバリアント分子を含む上清（１００μｌ）を、４℃でＯＮ、１５ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ2ＣＯ3および３５ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９.６）中６μｇ／ｍｌのＨＡＳ（Ａ−３７８２；Ｓｉｇｍａ）で予めコーティングしておいたマイクロタイターウェルに移し、ＲＴで１時間、ＰＢＳＴ中２％脱脂粉乳でブロッキングした（絶えず震盪）。このプレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、ウェルあたり８.４μｇ／ｍｌビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤ ５０μｌを加え、１.５時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した後、ウェルあたり５０μｌのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（１：５０００，ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を加え、１時間インキュベートした。このウェルを４回洗浄し、各ウェルに現像溶液ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＴＭＢ基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ）５０μｌを加えた。３０分後、各ウェルに反応停止溶液（２Ｍ Ｈ2ＳＯ4）１００μｌを加えた。Ｔｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１２０】
ＤＮＡ配列決定および配列クラスタリング
ファージミド（ｐＡｆｆｉ１）インサートのＤＮＡ配列決定は、第４ラウンドのパニング由来の１８７個のＥＧＦＲ結合クローンにおいて行った。特異的なプライマーおよびＢｉｇ Ｄｙｅターミネーター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、Ｓａｎｇｅｒフラグメントを、ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）において分析した。サブクローニングしたＤＮＡフラグメントを同じ手順で検証した。ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの配列は、Ｏｒｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６，４３３９−４８（２００６））によりより詳細に記載されているいわゆる平均連結階層クラスター法（ａｖｅｒａｇｅ−ｌｉｎｋ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いてクラスター化した。
【０１２１】
前節に記載されたＥＬＩＳＡスクリーンにおいてＥＧＦＲに対する結合性を示した候補ポリペプチドの推定アミノ酸配列は、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例である。これらを図１においておよび配列表において配列番号１７４〜３０９として示す。各々のこのような結合ポリペプチドの対応するＥＧＦＲ結合モチーフの配列は、図１においておよび配列表において配列番号１１〜１４６として示す。
【０１２２】
ＢｉａｃｏｒｅによるＥＧＦＲ結合ポリペプチドのスクリーニング
ＥＬＩＳＡ用に調製したファージｐＡｆｆｉベクターから生成されたＡＢＤタグが付加されたＺバリアントを含む細胞上清を、バイオセンサー分析にも供した。ＥＬＩＳＡにより良好な結合性が示された５４個のクローン由来の上清を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器におけるリアルタイム生体分子間特異的相互作用により分析した。標的タンパク質ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４.５に希釈）を、製造元の指示に従い、アミンカップリングによって、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）の一つのフローセル表面のカルボキシル化デキストラン層に固定（約１２００ＲＵ）した。別のフローセル表面を、参照表面として使用するために活性化および不活性化し、ＨＳＡを、発現されたＡＢＤタグＺバリアントの量のコントロールとして使用するため、別のＣＭ５センサーチップのフローセル表面に固定した。実施例１の第一世代ＥＧＦＲバインダー（Ｚ００９５５）2も、コントロールとして泳動した。
【０１２３】
ＤＮＡ構築物
異なる第二世代ＥＧＦＲ結合性Ｚバリアント（ＺEGFR）のバリアントをコードするＤＮＡフラグメントを発現ベクターｐＡＹ４４２にサブクローニングした。このフラグメントを、３'および５'の両方にＡｃｃＩオーバーハングを導入する特異的プライマーを用いてｐＡｆｆｉ１ベクターから増幅し、予め同じ酵素で切断しておいたｐＡＹ４４２ベクターにライゲートし、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて脱リン酸化した。増幅したＤＮＡフラグメントをＱＩＡｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いるライゲーションの前にハイブリダイズさせた。このライゲーションにより、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）による精製のためにＮ末端Ｈｉｓ6タグに融合された異なるＺバリアントを、Ｔ７プロモーターの制御下でコードする発現ベクターを得た。両方のベクターから、第二のＺバリアントの遺伝子フラグメントをｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌで導入したＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントの二量体構築物を構築し、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR）2バリアントを得た。全てのプラスミドの調製は、形質転換した大腸菌細胞を一晩培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を製造元の指示に従い用いて行った。
【０１２４】
タンパク質の発現および精製
選択されたＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株においてｐＡＹ４４２プラスミドからＨｉｓ6−タグ融合タンパク質として発現させた。５ｇ／ｌ酵母（ＴＳＢ＋ＹＥ）および５０ｍｇ／ｌカナマイシンを補充したＴＳＢ培地（３０ｇ／ｌトリプティックソイブロス）２５ｍｌに細胞を接種し、震盪フラスコ中、３７℃で培養した。５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む新鮮なＴＳＢ＋ＹＥにプレカルチャーを接種してＯＤ600を約０.０６とし、バッチ発酵槽中、３７℃で３時間培養し、終濃度が０.５ｍＭになるまでイソプロピル−Ｌ−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ａｐｏｌｌｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ，Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ＵＫ）を加えることによって遺伝子の発現を誘導した。５時間の培養後、細胞を遠心分離（１５０００ｇ、２０分間）により収集した。細胞ペレットを一晩凍結し、解凍し、変性緩衝液（７Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０）に再懸濁した。ＲＴで３０分間インキュベートした後、細胞を２５０００ｇで１５分間遠心分離し、上清由来の変性タンパク質を変性緩衝液（７Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６.３）に希釈し、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。結合したタンパク質を、尿素緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ４.５）で溶出させた。このタンパク質をＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）で溶出させた。この単量体タンパク質を、以降、ＺEGFR:no（ｐＡＹ４４２ベクター）と称し、二量体タンパク質を（ＺEGFR:no）2（ｐＡＹ４４２ベクター）と称する。タンパク質濃度は、各タンパク質に適した消衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度測定値から算出した。このタンパク質の純度および正確な分子量を確認するため、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＨＰＬＣ−ＭＳ（ＨＰＬＣ−ＭＳ １１００；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて泳動させた。この精製タンパク質をＣＤによりさらに分析し、１６個のＥＧＦＲ結合性ＺバリアントのＣＤスペクトルをＪａｓｃｏ−８１０分光偏光計を用いて記録した。全ての構築物をＰＢＳで希釈して終濃度を０.５ｍｇ／ｍｌとし、各サンプル２００μｌを１ｍｍキュベットに入れ、２０℃、１９５〜２５０ｎｍでスキャンした。熱安定性は、２２０ｎｍの固定波長で、２０〜９０℃の温度勾配を適用することによって試験した。融点を、タンパク質の５０％がアンフォールドする温度と定義し、熱アンフォールディングスペクトルから解析した。選択されたＺEGFRバリアントのタンパク質濃度はまた、アミノ酸分析（Ａｍｉｎｏｓｙｒａａｎａｌｙｓｃｅｎｔｒａｌｅｎ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によっても決定した。
【０１２５】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析
選択されたＺバリアントと標的タンパク質の間のリアルタイム生体分子間特異的相互作用（ＢＩＡ）のためにＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４.５に希釈）を、製造元の指示に従い、アミンカップリングによって、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）の一つのフローセル表面のカルボキシル化デキストラン層に固定（約２４００ＲＵ）した。別のフローセル表面を、参照表面として使用するために活性化および不活性化し、ＨＥＲ２−ＥＣＤ（Ｈｏｒａｋ ｅｔ ａｌ，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０，６０３−１３）（Ｇｒｅｇ Ａｄａｍｓ氏，Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，ＰＡの御好意により拝受した）およびＥｒｂＢ３／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，３４８−ＲＢ）を、ネガティブコントロールとして使用するため、別のＣＭ５センサーチップのフローセル表面に固定した。全てのＺバリアントサンプルを、泳動緩衝液ＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３.４ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７.４）に希釈した後に２５℃で結合アッセイを行った。第一実験においては、各Ｚバリアント５００ｎＭ（ＨＢＳに希釈）を、全ての表面に対して３０μｌ／分の流速で注入した。第一世代ＥＧＦＲ結合分子（（ＺEGFR:955）2；実施例１）もまた、コントロールとして注入した。各々の注入後、１０μｌの１０ｍＭ ＨＣｌの注入によってフローセルを再生した。
【０１２６】
第二実験においては、５つの選択された単量体ＺEGFRバリアントをさらに速度分析に供し、このタンパク質を６.２５ｎＭ〜５００ｎＭの範囲の濃度、５０μｌ／分の流速でＥＧＦＲ−ＥＣＤ表面に注入した。解離平衡定数（ＫD）、結合速度定数（ｋa）、および解離速度定数（ｋd）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．２ソフトウェア（Ｂｉａｃｏ
ｒｅ）を用いて算出した。サンプルは二連で泳動し、各々の注入後に１０μｌの１０ｍＭ ＨＣｌを注入することによってフローセルを再生させた。
【０１２７】
免疫蛍光染色
Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｗｗｗ．ｅｃａｃｃ．ｏｒｇ．ｕｋ）から入手したＡ４３１細胞株を、提供元により推奨された培地中、５％ＣＯ2環境下、３７℃で培養した。この培地は、この細胞株の提供元により推奨された濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むものであった（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）。サブコンフルエントな細胞をＰＢＳで一回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｃａｍｂｒｅｘ）で引き離し、完全成長培地に再懸濁した。８ウェルのマルチウェルスライド（Ｈｉｓｔｏｌａｂ）の各ウェルあたりおよそ１００００細胞を含む２０μｌを加え、一晩インキュベートした。翌朝に、細胞を、新しく調製したＰＢＳ中３％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳで二回洗浄した。この細胞を２０μｌ／ウェルのＺバリアントＨｉｓ6−Ｚ０１８５９、Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６５、Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６４、Ｈｉｓ6−Ｚ０１８７７、Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６８、Ｈｉｓ6−Ｚ０１９１３、Ｈｉｓ6−Ｚ０１８３６、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１９０７）2−Ｃｙｓ、およびＨｉｓ6−（Ｚ０１９５３）2−Ｃｙｓ（２〜１０μｇ／ｍｌ）で１時間、または１μｇ／ｍｌマウス抗ＥＧＦＲ抗体（Ａｂｃａｍ，ｎｏ．ａｂ３０）で染色した。Ｚバリアントで染色したスライドをＰＢＳで洗浄し、５μｇ／ｍｌ抗ヤギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と混合したＺに対するヤギ抗体（当研究室にて調製）と共に１時間インキュベートした。抗体で染色したスライドはＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に１時間インキュベートした。この第二インキュベーション工程の後、スライドを再度ＰＢＳで洗浄した。この抗体スライドを、１μｇ／ｍｌの濃度のＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）２０μｌで１０〜２０秒間対比染色し、再度洗浄した。全てのスライドを乾燥させて、退色防止試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をマウントし、膜の蛍光を、Ｌｅｉｃａ ＤＣカメラ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を装備したＤＭ−ＬＡ顕微鏡を用いて分析した。画像は、ＩＭ１０００ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて獲得した。
【０１２８】
免疫組織化学染色
Ａ４３１異種移植組織を、以下に記載される生体内分布研究から獲得した。腫瘍を液体窒素中で瞬間凍結させ、Ｌｊｕｎｇ ＣＭ３０００全自動クリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて６μｍ厚の凍結切片を作製した。この切片を新しく調製したＰＢＳ中３％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳで二回洗浄した。この切片を、５μｇ／ｍｌの濃度のＨｉｓ6−（Ｚ０１８６４）2−ＣｙｓまたはＨｉｓ6−Ｚ０１８７７で、１／４０希釈、およそ６μｇ／ｍｌのＨｉｓ6−（Ｚ０１９０７）2−ＨＲＰまたはＨｉｓ6−（Ｚ０１８５３）2−ＨＲＰで１時間染色した。Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８６４）2−ＣｙｓおよびＨｉｓ6−Ｚ０１８７７を、Ｚに対するヤギ抗体（当研究室で調製）およびそれに続く５μｇ／ｍｌウサギ抗ヤギＨＲＰで検出した。ポジティブコントロールとして、一つのスライドを３μｇ／ｍｌ抗ＥＧＦＲ抗体（Ａｂｃａｍ，ｎｏ．ａｂ２４３０）で染色し、洗浄し、ウサギＥｎｖｉｓｉｏｎ ＨＲＰ（Ｄａｋｏ，ｎｏ．Ｋ４００２）で検出した。ＨＲＰ染色サンプルをＰＢＳで一回洗浄した後、ＤＡＢ色素原基質（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と共に７分間インキュベートし、その後にＰＢＳで洗浄し、Ｍａｙｅｒｓ ＨＴＸ（Ｈｉｓｔｏｌａｂ）で２０秒間対比染色した。スライドにＭｏｕｎｔ−ｑｕｉｃｋ（Ｈｉｓｔｏｌａｂ）をマウントした。このスライドを、Ｌｅｉｃａ ＤＣカメラ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を装備したＤＭＬＡ顕微鏡で分析した。画像は、ＩＭ１０００ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて獲得した。
【０１２９】
111Ｉｎ標識ＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントの結合特異性および生体内分布
放射活性測定
放射活性は、３インチＮａＩ（Ｔｌ）検出器を備える全自動ガンマカウンター（１４８０ ＷＩＺＡＲＤ，Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて測定した。ＩＴＬＣストリップ上の放射活性の分布は、Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｙｓｔｅｍにおいて測定し、ＯｐｔｉＱｕａｎｔ（商標）画像分析ソフトウェアを用いて分析した。
【０１３０】
ｐ−ＳＣＮ−ベンジル−ＤＴＰＡとＺバリアントの結合および複合体の111Ｉｎ標識
イソチオシアネート−ベンジル−ＤＴＰＡとＺEGFRバリアントの結合は、Ｍｉｒｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．１９９０；１：５９−６５）により記載された方法に従い、１：１のキレート剤 対 タンパク質のモル比を用いて行った。簡単に説明すると、ＺバリアントのＰＢＳ溶液３００μｌを新しく調製した０.０７Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９.２中イソチオシアネート−ベンジル−ＤＴＰＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）４３μｌと混合した。その総量を０.０７Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８.５〜９.０）により５００μｌになるよう調整した後、その混合物を約３０秒間ボルテックスし、次いで３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を、製造元の指示に従い０.２Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５.３で予め平衡化させておいたＮＡＰ−５サイズ排除カラムにおいて精製した（高分子量フラクションは０.９ｍｌであった）。その溶出液をボルテックスした後、Ｚバリアント複合体５０μｇを含むフラクションをさらなる標識のために取り置き、残りの溶液を凍結させた。
【０１３１】
標識のために、複合体５０μｇを既定量の111Ｉｎ（１８ＭＢｑ）と混合し、室温で６０分間インキュベートした。ベンジル−ＤＴＰＡ−Ｚ０１９０８複合体に対しては、このＺバリアントの濃度の高さとのバランスをとるため、酢酸緩衝液３７μｌを加えた。
【０１３２】
標識の品質管理のために、０.２Ｍクエン酸で溶離させるＩＴＬＣを使用した。この系において、放射能標識Ｚバリアントは出発点から動かず、遊離のインジウムは溶媒の先頭と共に移動し、111Ｉｎ−イソチオシアネート−ＤＴＰＡ複合体は、Ｒfが０.４であった。標識複合体はＮＡＰ−５カラムにおいて精製し（高分子フラクションは０.９ｍｌであった）、その獲得物をＩＴＬＣにおいて純度検査した。
【０１３３】
111Ｉｎ標識複合体のＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞に対する結合特異性
標識複合体を、１つのＥＧＦＲ受容体（１つのＡ４３１細胞あたり１.５×１０6個の受容体）あたり１つの標識複合体の比となるよう計算して、２つのペトリ皿グループ（１グループあたり３皿）に加えた。一方のグループの皿は、標識複合体を加える１０分前に、１００倍過剰の非標識Ｚバリアントで事前に飽和させておいた。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、インキュベーション培地を回収した。細胞皿を冷やしておいた無血清培地で６回洗浄し、３７℃で１０分間、トリプシン−ＥＤＴＡ ０.５ｍｌで処理した。細胞が引き離されたら、全ての皿に完全培地０.５ｍｌを加え、細胞を再懸濁した。細胞懸濁物を放射活性測定のために回収した。細胞に結合した放射活性（Ｃ）は、全自動ガンマカウンターにおいて、対応するインキュベーション培地（Ｍ）１ｍｌと並行して測定した。細胞に結合した添加放射活性のフラクションを、％結合放射活性＝Ｃ×１００％／（Ｃ＋Ｍ）として算出した。
【０１３４】
動物腫瘍モデル
本動物研究は、動物研究に関する内部倫理委員会の承認を受けた。雌の非近交Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（到着時１０〜１２週齢）をインビボ実験に使用した。この動物を１週間の間、標準的な食事、睡眠、および環境を与えてＲｕｄｂｅｃｋ研究所の動物飼育施設に順応させた後、腫瘍移植を行った。マウスには、食物および飲料水を自由に与えた。Ａ４３１腫瘍は、右後肢から約１０7細胞の皮下（ｓ．ｃ．）注射により移植した。異種移植片を２週間の間成長させた。
【０１３５】
生体内分布研究
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの生体内分布は、インジウム−１１１標識ＥＧＦＲ Ｚバリアント複合体の４ｈ ｐｉ（ｓｃ）のＡ４３１腫瘍保有Ｂａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）系マウスにおいて評価した。マウスは、全ての生体内分布実験において、注射後（ｐｉ）４時間時点でのケタミンＨＣｌ（Ｋｅｔａｌａｒ，Ｐｆｉｚｅｒ）およびキシラジンＨＣｌ（Ｒｏｍｐｕｎ；Ｂａｙｅｒ）の混合物（体重１グラムあたり溶液２０μｌ；Ｋｅｔａｌａｒ−１０ｍｇ／ｍｌ，Ｒｏｍｐｕｎ−１ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内注射により麻酔した。その後、希釈したヘパリン（５０００ ＩＥ／ｍｌ，Ｌｅｏ Ｐｈａｒｍａ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ製）でリンスした１ｍｌシリンジで心臓を穿刺することにより、マウスを安楽死させた。血液、肺、肝臓、脾臓、結腸、腎臓、子宮、唾液腺、筋肉、皮膚、骨、および腫瘍の器官サンプルを収集し、秤量し、ガンマカウンターで放射活性を測定した。腸（内容物含む）は総器官として測定し、秤量しなかった。器官の取り込み値を、組織１グラムあたりのパーセント注入活性（％ ＩＡ／ｇ）として算出した。全ての実験において、マウスを、各グループあたり４匹の動物となるよう無作為にグループ分けした。
【０１３６】
結果
第一世代ＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントの親和性成熟
ＥＧＦＲ結合分子の初期セットに基づく親和性成熟ライブラリ（実施例１）を設計および構築した。３つの最良のバインダーの配列および実施例１におけるさらなる配列分析からの第４の配列のアラインメントを行った。５箇所（２４、２５、２７、２８、および３２）を固定すること、ならびに１７および１８位においてはＮおよびＲに、３５位においてはＳおよびＶに一定のバイアスをかけることが合理的であると判断した（図２Ｄ）。従って、９、１０、１１、１３、および１４位を、ＮＮＧ／Ｔ縮重コドンを用いる無作為化の標的とした（図２Ｄ）。プロテインＺはサイズが小さいので、二次ライブラリを構築するために、Ｚドメインのヘリックス１および２をコードする、縮重コドンを有する単一の１２９ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用することが可能であった。このオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅し、その後にプロテインＺの第三αヘリックスをコードするファージミドベクターにライゲートした。得られたライブラリは、約１×１０9のメンバーからなるものであり、理論上のバリアントの大部分を十分含んでいたと考えられる。ファージストックを調製し、基本的に以前に記載されたように、漸減濃度の標的タンパク質の使用および十分な洗浄、ならびに過剰な非ビオチニル化標的タンパク質による速いオフレートを有するバインダーの再結合のブロックおよび第一世代バインダー（実施例１）と生成された第二世代バインダーの競合により、ライブラリの中で最強のＥＧＦＲ結合バリアントを選択するための選択を行った。
【０１３７】
４ラウンドの選択後に獲得したクローンを９６ウェルプレートにて培養し、凍結−解凍により周辺質内容物を遊離させ、ＥＧＦＲ結合活性についてのＥＬＩＳＡスクリーニング手順に供した。３７２個の無作為抽出したクローンをＥＬＩＳＡスクリーニングに供したところ、大部分のクローンが、標的タンパク質との結合の良さを示す高い吸光値を示した。最も高い吸光値を有するクローンの中から１８６個のクローンをＤＮＡ配列決定に供し、配列決定したクローンのクラスタリングによって、選択されたクローン間の関係を可視化した。
【０１３８】
さらに、ＥＧＦＲに対する最高の結合性および最も遅いオフレートを有するクローンを選択するため、５４個のクローンについて、ＡＢＤタグを付加したＺタンパク質を含む周辺質内容物のバイオセンサー分析スクリーニングを行った（データは示さず）。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡスクリーニングにおける値、ＤＮＡ配列決定からのクラスタリングの結果、およびバイオセンサー分析スクリーニングに基づき、１６個のクローン、すなわち、Ｚ０１８３６、Ｚ０１８４８、Ｚ０１８５３、Ｚ０１８５９、Ｚ０１８６４、Ｚ０１８６５、Ｚ０１８６８、Ｚ０１８７７、Ｚ０１８８７、Ｚ０１８８８、Ｚ０１９０５、Ｚ０１９０７、Ｚ０１９０８、Ｚ０１９１３、Ｚ０１９１７、およびＺ０１９６０をさらなる特徴付けのために選択した（図１および配列表を参照のこと）。実質的に全てのバインダーが≧１.０ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶性であることが示され、かつ２０７および２２０ｎｍでの最大吸収と共に、遠紫外スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）での特徴的なα−ヘリックス形のＣＤスペクトルを示した。融点は、熱アンフォールドスペクトルから解析し、実質的に全てのバインダーについて５０℃またはそれ以上であることを決定した。熱変性後に記録されたスペクトルは、α−ヘリックス構造への完全な再フォールディングを示した。
【０１４０】
バイオセンサースクリーニング
結合親和性の初期ランキングを獲得するため、１６個の選択されたＺバリアントならびに単量体および二量体ＺEGFR:955（実施例１）を発現させ、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を用いてそれらのＥＧＦＲ結合性について分析した。様々なＺEGFRバリアントを、標的タンパク質ＥＧＦＲ−ＥＣＤならびにコントロールタンパク質ＨＥＲ２−ＥＣＤおよびＦｃ融合型ＨＥＲ３をそれぞれ固定したセンサーチップフローセル表面に個別に注入した。１６個全てのバインダーについて、低ナノモル範囲の結合親和性を観察した（データは示さず）。ほとんどのバインダーはＨＥＲ２−ＥＣＤおよびＦｃ融合型ＨＥＲ３に対する非特異的結合を示さなかった。最高の親和性およびバイオセンサー分析からのオフレンジ（ｏｆｆ−ｒａｎｇｅ）を有する５個のバインダー、すなわち、Ｚ０１８５３、Ｚ０１８６８、Ｚ０１８７７、Ｚ０１９０７、およびＺ０１９０８をさらなる特徴付けのために選択した。
【０１４１】
インビトロでの第一世代バインダーと第二世代バインダーの比較
親和性成熟を行ったＺ０１８５３、Ｚ０１８６８、Ｚ０１８７７、Ｚ０１９０７、およびＺ０１９０８（ＫD 約１０ｎＭ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて、単量体（ＫD 約１８５ｎＭ）および二量体（ＫD 約５０ｎＭ）形態のＺ００９５５と比較した（図９）。親和性成熟を行ったＺバリアントの結合速度は、単量体および二量体の第一世代バインダーとほぼ同じであった。しかし、解離速度は約２０倍改善された。
【０１４２】
蛍光および免疫組織化学分析
図１０にその結果を示す。図１０Ａは、ＥＧＦＲに特異的な以下のＺバリアント：ａ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８５９、ｂ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６５、ｃ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６４、ｄ）、Ｈｉｓ6−Ｚ０１９１３、ｅ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８７７、ｆ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６８、ｇ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８３６、ｈ）Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８５３）2−ｃｙｓ、およびｉ）Ｈｉｓ6−（Ｚ０１９０７）2−ｃｙｓにより染色されたＡ４３１細胞を示す。単量体Ｚバリアントは、Ｚに対するヤギ抗体およびそれに続くＡｌｅｘａ ４８８結合型抗ヤギ抗体による検出により検出した。二量体ＺバリアントはＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎで染色した。ポジティブコントロールとして、Ａ４３１を抗ＥＧＦＲ抗体で染色した（ｊ）。
【０１４３】
図１０Ｂは、ａ）Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８６４）2−Ｃｙｓ、ｂ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８７７、ｃ）Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８５３）2−Ｃｙｓ、およびｄ）Ｈｉｓ6−（Ｚ０１９０７）2−Ｃｙｓで染色したＡ４３１異種移植片の凍結切片を示す。Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８６４）2−ＣｙｓおよびＨｉｓ6−Ｚ０１８７７（ａおよびｂ）は、Ｚに対するヤギ抗体およびそれに続くＨＲＰ結合型抗ヤギ抗体による検出により検出した。Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８５３）2−Ｃｙｓ （ｃ）およびＨｉｓ6−（Ｚ０１９０７）2−Ｃｙｓ （ｄ）分子は、直接ＨＰＲに結合した。ポジティブコントロールとして、Ａ４３１を抗ＥＧＦＲ抗体で染色した（ｅ）。
【０１４４】
111Ｉｎ標識ＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントの特異性および生体内分布
全てのＺバリアント複合体において、９０％超の標識率でインジウム−１１１標識することに成功し、ＮＡＰ−５精製の後の全ての複合体は９５％超の純度を有していた。
【０１４５】
標識複合体の結合特異性は、ＥＧＦＲを発現する類表皮癌細胞Ａ４３１株において評価した。その結果を図１１に示す。この図における全てのデータ点は３つの測定の平均値であり、エラーバーはＳＥＭを表す。全ての複合体の結合は、１００倍過剰の非標識ＺEGFRの添加によりその取り込みをブロックすることが可能であった（ｐ＜０.０００１）ことから、ＥＧＦＲ特異的であることが見出された（図１１を参照のこと）。
【０１４６】
Ａ４３１腫瘍保有マウスにおける４ｈ ｐｉのインジウム−１１１標識Ｚバリアント複合体の生体内分布の結果を図１２にまとめた。この図における各データ点は４匹の動物の平均±標準偏差を表し、器官または組織１グラムあたりの注射した放射活性の割合で表す。111Ｉｎ−ＣＨＸ−ＤＴＰＡ−（ＺEGFR:955）2についてのデータは、Ａｆｆｉｂｏｄｙ
ＡＢ（ＶＩＮＮＯＶＡ）とのコラボレーションによりＥｒｉｋａ Ｎｏｒｄｂｅｒｇ氏（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が獲得したものであり、これを比較のために加えた。
【０１４７】
インビボでの腫瘍標的化は成功し、５つ全ての新規のＺバリアントは４〜６％ＩＡ／ｇのレベルにあったが、非成熟型二量体（４％ＩＡ／ｇ）との比較では改善が見られなかった。
【０１４８】
第一世代の二量体（Ｚ００９５５）2と全ての成熟型単量体との間の主な違いは、血液クリアランス、肝臓取込み、および腎臓蓄積において観察することができ：成熟実験において選択された新規単量体は、（Ｚ００９５５）2よりも、放射活性の血液クリアランスが高く、肝臓取込みが低く、腎臓蓄積が高かった。これらの観察は：新規単量体が、マウス受容体に対する交差反応性の低さおよび／または受容体への一価的な結合に起因して、肝臓のＥＧＦＲ受容体に対する結合性が弱く、これにより細胞内取込みが誘発されず、結合が可逆的であることと関係がある可能性が高い。
【０１４９】
実施例３
本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの第三選択
実施例２からの選択結果の統計学的分析に基づき、推定ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの第三ライブラリを、本質的に上記と同様に調製した。標的としてＥＧＦＲを用いるファージディスプレイ選択および選択されたバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニングにより、１７個の追加のＥＧＦＲ結合性Ｚバリアント配列を同定した。これらのアミノ酸配列を図１および配列表において配列番号３１０〜３２６として示す。これらのＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントの推定ＥＧＦＲ結合モチーフは、図１および配列表において配列番号１４７〜１６３として示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１−１】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−２】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−３】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−４】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−５】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−６】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−７】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−８】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−９】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−１０】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−１１】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図２Ａ】実施例１において選択された本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドのアミノ酸配列をプロテインＺ配列と比較して示す。この図は、塩基性、酸性、非極性、および極性のアミノ酸残基を示す。
【図２Ｂ】図２Ａの中の４つのポリペプチドのアミノ酸配列を示しかつ疎水性、中性、および親水性のアミノ酸残基を示す。
【図２Ｃ】図２Ｂのポリペプチドのアミノ酸配列を、その他の特徴を強調して示す。
【図２Ｄ】本発明に従うポリペプチドを生成するための親和性成熟ストラテジーを示す。
【図３】ＥＧＦＲ結合ポリペプチドＨｉｓ6−ＺEGFR:942（レーン１）、Ｈｉｓ6−ＺEGFR:948（レーン２）、Ｈｉｓ6−ＺEGFR:955（レーン３）、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:942）2（レーン４）、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2（レーン５）、およびＨｉｓ6−（ＺEGFR:955）2（レーン６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーンＭはマーカータンパク質を含む。右側には分子量をキロダルトンで付記してある。
【図４Ａ】本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いて行ったバイオセンサー結合研究の結果を示す。
【図４Ｂ】本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いて行ったバイオセンサー結合研究の結果を示す。
【図５】本発明に従う３つのＥＧＦＲ結合ポリペプチドのネイティブＥＧＦＲに対する親和性のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図６】フルオロフォア標識した本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドに暴露した細胞の共焦点顕微鏡画像集である。
【図７】放射能標識した本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いた細胞結合研究の結果を示すダイアグラムである。
【図８Ａ】放射能標識した本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いた飽和および研究の結果を示すグラフ集である。
【図８Ｂ】放射能標識した本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いた飽和および研究の結果を示すグラフ集である。
【図８Ｃ】放射能標識した本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いた飽和および研究の結果を示すグラフ集である。
【図９Ａ】本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いて行ったバイオセンサー結合研究の結果を示す。
【図９Ｂ】本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いて行ったバイオセンサー結合研究の結果を示す。
【図１０Ａ】蛍光検出を用いた、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドに暴露した細胞の画像集である。
【図１０Ｂ】酵素検出を用いた、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドに暴露した細胞の画像集である。
【図１１】Ａ４３１細胞における、本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドのインジウム−１１１標識ベンジル−ＤＴＰＡ複合体のインビトロ特異性試験の結果を示すダイアグラムである。全てのデータ点は３つの測定値の平均値であり、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図１２】Ａ４３１異種移植片を保有するマウスにおける111Ｉｎ−ベンジル−ＤＴＰＡ−ＥＧＦＲ結合性複合体の生体内分布および腫瘍対正常組織比を示すダイアグラム集である。各データ点は４匹の動物からの平均±標準偏差であり、器官または組織１グラムあたりの注射した放射活性のパーセントで表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合するポリペプチドに関する。このポリペプチドは、医薬、獣医薬、イメージング、分離技術、および診断における産業上の利用性を有する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体ファミリー（ＥＧＦＲファミリー；ＥｒｂＢ受容体ファミリーとも呼ばれる）の受容体の発現異常は、しばしば、肺、胸、前立腺、結腸、卵巣、頭頸部における様々な悪性腫瘍に関連する。この受容体と患者の予後および処置の関係についての理解を深めようというこの受容体の研究に注目が集まっている。このファミリーは、４つの膜貫通型受容体である、上皮成長因子受容体、ＥＧＦＲ、（ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２／ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）からなる（Ｇｕｌｌｉｃｋ ＷＪ．Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌ Ｃａｎｃ ２００１；８：７５−８２；Ｗｉｔｔｏｎ ＣＪ．ｅｔ ａｌ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００３；２００：２９０−２９７）。各受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内チロシンキナーゼドメインを有する（機能的なチロシンキナーゼドメインを欠くＨＥＲ３を除く）（Ｃｉｔｒｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００３；２８４（１）：５４−６５；Ｈａｒａｒｉ Ｄ ａｎｄ Ｙａｒｄｅｎ Ｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００２；１９：６１０２−６１１４）。ＥＣＤをほとんど有さないＥＧＦＲバリアント−ＥＧＦＲｖＩＩＩが一つ存在する（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ＣＪ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：３１４０−３１４８，１９９５；Ｈｕａｎｇ ＨＳ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９２７−２９３５，１９９７；Ｋｕａｎ ＣＴ，ｅｔ ａｌ Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ ８：８３−９６，２００１）。
【０００３】
リガンドがＥＧＦＲファミリーの受容体に結合すると、この受容体は刺激されて、別の同一の受容体（ホモ二量体化）またはこのファミリー内の別の受容体（ヘテロ二量体化）のいずれかと二量体化する（Ｏｌａｙｉｏｙｅ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．Ｅｍｂｏ Ｊ．２０００；１９：３１５９−６７；Ｙａｒｄｅｎ Ｙ，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ ＭＸ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；２：１２７−３７）。受容体の二量体化は細胞内チロシンキナーゼドメインを活性化し、増殖、移動、アポトーシス、分化、またはその他の細胞プロセスを誘導する（Ｙａｒｄｅｎ Ｙ，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ ＭＸ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；２：１２７−３７；Ｗｅｌｌｓ Ａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９９；３１：６３７−６４３；Ｖｅｒｍｅｅｒ ＰＤ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３；４２２：３２２−６）。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は、このファミリーの４つの受容体の中で最もよく研究されている受容体であり、多くの悪性腫瘍において過剰発現される（Ｎｏｒｄｂｅｒｇ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．２００５ Ｊｕｌ；３２（７）：７７１−７）。これらの個々の受容体の高発現は、しばしば予後の乏しさと関係する（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ ＢＳ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８：２３３４３−２３３５１；Ａｒｔｅａｇａ ＣＬ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ２００２；７ Ｓｕｐｐｌ ４：３１−９；Ｅａｒｐ ＨＳ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ １９９５；３５：１１５−３２；Ｗｅｓｔｅｒ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ ２００２；４１：２８２−８．Ｌｏｒｅｎｚｏ ＧＤ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ２００３；２（１）：５０−７）。
【０００４】
いくつかのリガンドが、ＥＧＦＲ受容体ファミリーのメンバーに結合する。天然リガンドが知られていない唯一の受容体がＨＥＲ２である（Ｃｉｔｒｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００３；２８４（１）：５４−６５；Ｙａｒｄｅｎ Ｙ，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ ＭＸ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；２：１２７−３７；Ｌｅｎｆｅｒｉｎｋ ＡＥＧ，ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ １９９８；１７：３３８５−３３９７）。その細胞外ドメインに結合する抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）は、ＨＥＲ２受容体、特に乳癌におけるＨＥＲ２発現腫瘍を標的化するのに使用され得る。トラスツズマブの結合は成長刺激性の細胞内シグナル伝達をブロックし、化学療法および放射線療法後の細胞修復能を減弱させ、そしておそらくはアポトーシスの能力を向上させることもできる（Ｂｏｏｋｍａｎ ＭＡ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３；２１：２８３−２９０；Ｐｅｇｒａｍ ＭＤ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｓ ２０００；１０３：７４７−７５；ＭｃＫｅａｇｅ Ｋ，Ｐｅｒｒｙ ＣＭ．Ｄｒｕｇｓ ２００２；６２：２０９−４３）。ＷＯ２００５／００３１５６に開示されるアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子もまたＨＥＲ２を標的化するのに使用され得る。
【０００５】
ＥＧＦＲの機能は、セツキシマブ（エルビタックス、ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）（Ｂａｓｅｌｇａ Ｊ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３７：Ｓｕｐｐｌ ４，Ｓ１６−２２，２００１，ＡＢＸ−ＥＧＦ Ｒａｎｓｏｎ Ｍ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ５：５４１−５４６，２００３）またはｍａｂ４２５／ＥＭＤ５５９００（Ｍｅｒｃｋ）もしくは抗体フラグメント（Ｂｏｓｋｏｖｉｔｚ Ａ ｅｔ ａｌ：Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ４：１４５３−１４７１，２００４）等の抗体を用いて受容体の細胞外部分に対するリガンドの結合をブロックすることによって阻害できる。この受容体の機能はまた、全てではないが一部の患者においては、この受容体の細胞内部分に結合する低分子量チロシンキナーゼ阻害剤、例えばイレッサ（ゲフィチニブ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ＡＬ ｅｔ ａｌ：Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ３０：１３４８−１３５６，２００３；Ｈｅｒｂｓｔ ＲＳ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４：９５６−９６５，２００４）またはターセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）（Ｋｒｏｚｅｌｙ Ｐ．Ｃｌｉｎ Ｊ Ｏｎｃｏｌ Ｎｕｒｓ ８：１６３−１６８，２００４）によってもブロックされ得る。両方の場合とも、その目的は、成長刺激シグナルをブロックし、それによって腫瘍細胞の増殖を阻害することである（Ｒｉｃｈ ＪＮ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ：Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ３：４３０−４４６，２００４）。しかし、改善の余地もある。例えば、イレッサは、ＥＧＦＲを過剰発現する一部の患者にしか作用しないという欠点を有することが分かっている。セツキシマブについては、未だに、処置の治療効果を高める最良の化学療法併用処置様式の模索が続けられている。これらの治療は、腫瘍細胞を死滅させる放射性核種ベースのアプローチと併用でき（Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ：Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６６（２），１０７−１１７，２００３）、一つの興味深い例は、最近の、放射能標識（アスタチン化）ＥＧＦの取り込みおよび治療効果を改善するためのゲフィチニブの適用である（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ＡＬ ｅｔ ａｌ：Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ３０：１３４８−１３５６，２００３）。これまでにＨＥＲ−２について例証されたように、ポリペプチド性の抗ＥＧＦＲ標的化剤を開発することで、診断（イメージング）および治療の両方の目的で放射性核種を送達するための、天然のアゴニスト性（腫瘍刺激性）の生物学的ＥＧＦリガンドの魅力的な代替物が得られる（Ｗｉｋｍａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（ＰＥＤＳ），１７（５），４５５−４６２，２００４；Ｓｔｅｆｆｅｎ ＡＣ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２０，２３９−２４８，２００５；Ｓｔｅｆｆｅｎ ＡＣ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｉｎ ｐｒｅｓｓ，２００５）。このようなポリペプチドはまた、放射活性を有さずとも、治療上魅力的な生物学的効果を示し得る。例えばＷＯ２００５／０００３１５６に開示されるような「アフィボディ（登録商標）分子」とも呼ばれるＺバリアントは、中程度の分子量（６〜１５ｋＤａ）であり、従って抗体（１５０ｋＤａ）よりも腫瘍組織への浸透性が良いと同時に腎臓による排泄を通じて迅速に消滅してしまうイレッサおよびターセバ（約１ｋＤａ）等の低分子物質よりも全身循環性が良いポリペプチドである。実際、Ｚバリアントは、典型的には、インビボイメージング用途に適した範囲の半減期を有し、治療またはその他の用途において必要とされる場合は、遺伝子融合技術によってその半減期を劇的に延長させることができる（例えばＷＯ２００５／０９７２０２Ａを参照のこと）。
【０００６】
ＥＧＦＲの過剰発現は、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に共通する（Ｒｉｋｉｍａｒｕ，Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ，１９９２．１４（１）：ｐ．８−１３；Ｓａｎｔｉｎｉ，Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ，１９９１．１３（２）：ｐ．１３２−９．Ｅｋｂｅｒｇ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２６（５），１１７７−１１８５，２００５）。ＨＥＲ２のレベルの上昇は、いくつかのＨＮＳＣＣの研究において示唆されており（Ｃｒａｖｅｎ，Ｊ．Ｍ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９２．１２（６Ｂ）：ｐ．２２７３−６）、口腔扁平上皮癌（ＳＣＣ）において予後的な価値が見出され得る（Ｗｅｒｋｍｅｉｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ，２０００．３６（１）：ｐ．１００−５；Ｗｅｒｋｍｅｉｓｔｅｒ，Ｒ．Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ，１９９６．１７２（６）：ｐ．６８１−３；Ｘｉａ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９７．３（１）：ｐ．３−９；Ｘｉａ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９９．５（１２）：ｐ．４１６４−７４）。ＨＥＲ３は、ＨＮＳＣＣ細胞株において過剰発現され、臨床的悪性化に関連すること（Ｘｉａ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９９．５（１２）：ｐ．４１６４−７４；Ｓｈｉｎｔａｎｉ，Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，１９９５．９５（１−２）：ｐ．７９−８３）および他のタイプの悪性腫瘍においても過剰発現されること（Ｇｕｌｌｉｃｋ，Ｗ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ，１９９６．２７：ｐ．３３９−４９）が示されている。いくつかのヒト乳癌細胞株は、ＨＥＲ４転写物を有する（Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９３．９０（５）：ｐ．１７４６−５０）が、癌におけるＨＥＲ４の役割は不透明である（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０００．６０（６）：ｐ．１４８３−７）。４つの受容体の共発現パターンが悪性の表現型に関連する可能性があることが示唆されているため（Ｘｉａ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９９．５（１２）：ｐ．４１６４−７４；Ｂｅｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００１．１９５（３）：ｐ．３４３−８；Ｋｒａｈｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００１．３７（２）：ｐ．２５１−９）、その共発現の研究が注目されている。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の免疫組織化学染色は、顕著な膜の染色を示した。一方、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の染色は主として細胞質性であった（Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９３．９０（５）：ｐ．１７４６−５０；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０００．６０（６）：ｐ．１４８３−７）。さらに、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は腫瘍および転移物の両方において高レベルで発現されることが報告されている。従って、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は、高分子およびペプチドベースのインビボイメージングおよび治療用途における潜在的標的であるが、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４はそうではないと考えられる。ＥＧＦＲタンパク質のレベルの上昇はまた、膀胱癌においても見出されており、その過剰発現は腫瘍の段階および悪性度に関連付けられている（Ｈａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｕｒｏｌ，１４６，２２７−３１．（１９９１）；Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｅ．Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５０，２５３０−７．（１９９０）；Ｎｅａｌ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ，６５，１６１９−２５．（１９９０）；Ｓａｕｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，５７，５０８−１４．（１９９４）；Ｇａｒｄｍａｒｋ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ（ＢＪＵ），９５，９８２−９８６，２００５）。
【０００７】
最も悪性の形態の神経膠腫であり、代表的な中枢神経系原発性腫瘍である多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）においては、分析した全腫瘍の少なくとも半数においてＥＧＦＲの過剰発現が検出されている（Ｂｏｓｋｏｖｉｔｚ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ４：１４５３−１４７１，２００４；Ｓｈｉｎｏｊｉｍａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：６９６２−６９７０，２００３；Ｅｋｓｔｒａｎｄ ＡＪ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５１：２１６４−２１７２，１９９１；Ｒａｉｎｏｖ ＮＧ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３５ １３−２８（１９９７）；Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．２００５ Ｓｅｐ ８；［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］）。この過剰発現は、遺伝子の増幅および／または転写率の増加に起因するものであり、腫瘍細胞あたり１０6個の受容体数が報告されている（Ｒｉｃｈ ＪＮ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ：Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ３：４３０−４４６，２００４；Ｂｉｇｎｅｒ ＳＨ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ４７，１９１−２０５（１９９８）；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ Ｇ．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５６，８８１−９１４（１９８７）；Ｃｏｌｌｉｎｓ ＶＰ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４，２７−３２（１９９３）；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ ＴＡ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３１３，１４４−１４７，（１９８５）；Ｋｌｅｉｈｕｅｓ Ｐ，Ｏｈｇａｋｉ Ｈ．Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌ １，４４−５１，（１９９９）；Ｋｌｅｉｈｕｅｓ Ｐ，Ｏｈｇａｋｉ Ｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ２８，１６４−１７０，（２０００）；Ｂｏｓｋｏｖｉｔｚ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ４，１４５３−１４７１，（２００４））。ＥＧＦＲの過剰発現は、神経膠腫の成長速度の増加および生存率の減少と相関し（Ｒｉｃｈ ＪＮ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ：Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ３，４３０−４４６，（２００４）；Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．２００５ Ｓｅｐ ８；［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５６，７２−７７，（１９９４）；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ＣＪ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９０，７９９−８０１，（１９９８）；Ｓｈｉｎｏｊｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３，６９６２−６９７０，（２００３））、ＥＧＦＲの過剰発現は腫瘍細胞の浸潤縁（ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｄｉｎｇ ｅｄｇｅｓ）において最も顕著であることが示されている（Ｏｋａｄａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３，４１３−４１６，）（２００３））。ＥＧＦＲに特異的に結合するポリペプチドは、例えば術後腔（ｐｏｓｔｏｐｅｒａｌ ｃａｖｉｔｙ）への局所投与によって、神経膠腫治療における治療用途で利用できる可能性がある。
【０００８】
肺および胸において見出されるようないくつかの他の上皮由来の悪性腫瘍もまた、ＥＧＦＲの高発現を伴う（Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９（３）：１８３−２３２，（１９９５））。ＥＧＦＲ受容体はまた、様々な正常組織の間でも分布しており、特に肝臓の肝細胞および皮膚上皮においてはむしろ高レベルで発現される（Ｇｕｓｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ Ｒｅｐ，８，６４９−５８．（１９８４）；Ｄａｍｊａｎｏｖ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，５５，５８８−９２．（１９８６））。これは、治療用途、特に放射線療法において問題を引き起こす可能性があるが、ＥＧＦＲ受容体に結合する診断またはイメージングマーカーが少量しか投与されない診断およびイメージング用途においてはそれほど重要なことではないであろう。そうであっても、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドには、局所投与が企図される特定の癌における用途が見出され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、診断、インビトロまたはインビボイメージング、および治療用途に使用できる新規のＥＧＦＲ結合剤を提供することである。さらに、このようなＥＧＦＲ結合ポリペプチドには、病期分類および標的受容体をダウンレギュレートすることを目的とするＳＭＥベースの治療の直接的評価としての用途が見出され得る。
【００１０】
販売用の分子イメージング剤の開発に加えて、その用途には、インビボモデルおよびその後の臨床開発における処置結果を測定するための特異的なイメージング剤が求められる医薬開発およびスクリーニング手順における使用が含まれる。分子イメージングは、成長因子受容体をダウンレギュレートすることを目的とする医薬の効果の直接的な読み取りおよび抗腫瘍効果の評価を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
その一つの局面によれば、本発明は、
ｉ）ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＮＸ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25ＳＬＸ28Ｄ
［配列中、相互に独立して、
Ｘ2はＭ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、およびＳから選択され；
Ｘ3はＷ、Ｄ、Ｅ、およびＬから選択され；
Ｘ4はＩ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、およびＷから選択され；
Ｘ6はＷ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、およびＳから選択され；
Ｘ7はＤ、Ｅ、Ｎ、およびＫから選択され；
Ｘ10はＲ、Ｇ、Ｈ、およびＫから選択され；
Ｘ11はＤ、Ｎ、Ｅ、Ｙ、およびＳから選択され；
Ｘ17はＧ、Ｗ、およびＡから選択され；
Ｘ18はＷ、Ｇ、およびＡから選択され；
Ｘ20はＭ、Ｌ、Ｆ、Ａ、およびＥから選択され；
Ｘ21はＴ、Ｄ、Ｎ、Ａ、およびＱから選択され；
Ｘ25はＡ、Ｓ、Ｎ、Ｇ、およびＬから選択され；ならびに
Ｘ28はＬ、Ｗ、Ｖ、Ｆ、およびＡから選択される］
ならびに
ｉｉ）ｉ）において規定される配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる上皮成長因子受容体結合モチーフ、ＥＢＭを含み、最大１０μＭの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ポリペプチドを提供する。
【００１２】
上記の関連する配列クラスの定義、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、いくつかの異なる選択実験においてＥＧＦＲとの相互作用について選択された、基本骨格（ｐａｒｅｎｔ ｓｃａｆｆｏｌｄ）の多数のランダムポリペプチドバリアントの統計分析に基づく。同定されたＥＧＦＲ結合モチーフすなわち「ＥＢＭ」は、その基本骨格の、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で二つのアルファヘリックスを構成する標的結合領域に対応する。その二つのＥＢＭヘリックスの中の変化に富むアミノ酸残基は、その基本骨格においては、抗体の定常Ｆｃ部分との相互作用のための結合表面を構成する。本発明においては、結合表面残基のランダムバリエーションおよびその後のバリアントの選択により、Ｆｃ相互作用能をＥＧＦＲ相互作用能で置き換えている。
【００１３】
当業者に理解されていることであろうが、任意のポリペプチドの機能、例えば本発明に従うポリペプチドのＥＧＦＲ結合能は、そのポリペプチドの三次構造に依存する。従って、あるポリペプチドにおいて、その機能に影響を及ぼさずにそのアミノ酸配列に小さな変化を加えることが可能である。従って、本発明は、得られる配列がｉ）によって規定されるクラスに属する配列と少なくとも８５％同一である、ｉ）のＥＢＭの修飾型バリアントを包含する。例えば、アミノ酸残基の特定の機能グループ（例えば疎水性、親水性、極性等）に属するアミノ酸残基を、同じ機能グループの別のアミノ酸残基と交換することが可能である。
【００１４】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ2はＭである。
【００１５】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ3はＷである。
【００１６】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ4はＩ、Ｖ、Ｇ、およびＳから選択される。
【００１７】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ6はＶおよびＷから選択される。
【００１８】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ10はＲおよびＧから選択される。
【００１９】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ11はＤ、Ｎ、およびＥから選択される。
【００２０】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ17はＷおよびＧから選択される。
【００２１】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ18はＷおよびＧから選択され、特にＷであり得る。
【００２２】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ20はＭである。
【００２３】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ21はＴおよびＤから選択され、特にＴであり得る。
【００２４】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ25はＡ、Ｓ、およびＮから選択される。
【００２５】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ28はＬおよびＷから選択される。
【００２６】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ18はＷであり、Ｘ21がＴである。
【００２７】
本発明に従うポリペプチドの一つの実施態様において、Ｘ18はＷであり、Ｘ20がＭである。
【００２８】
本発明に従うポリペプチドのサブクラスのより具体的な定義において、ｉ）のアミノ酸配列は、以下の９つの条件：Ｘ2がＭである；Ｘ3がＷである；Ｘ6がＷである；Ｘ10がＲである；Ｘ17がＧである；Ｘ18がＷである；Ｘ20がＭである；Ｘ21がＴである；Ｘ28がＬである、の少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または９つ全てを満たす。
【００２９】
これらの条件の９つ全てを満たす場合、ｉ）の配列は
ＥＭＷＸ4ＡＷＸ7ＥＩＲ Ｘ11ＬＰＮＬＮＧＷＱＭ ＴＡＦＩＸ25ＳＬＬＤ
となる。
【００３０】
本発明に従うポリペプチドのサブクラスの代替の具体的な定義において、ｉ）のアミノ酸配列は、以下の５つの条件：Ｘ17がＧである；Ｘ18がＷである；Ｘ20がＭである；Ｘ21がＴである；Ｘ25がＡである、の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つ全てを満たす。
【００３１】
これらの条件の５つ全てを満たす場合、ｉ）の配列は
ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＮＧＷＱＭ ＴＡＦＩＡＳＬＸ28Ｄ
となる。
【００３２】
さらに代替のサブクラスにおいて、ｉ）の配列は、ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＧ Ｘ11ＬＰＮＬＮＷＧＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25ＳＬＷＤ、例えば、ＥＸ2Ｘ3ＩＡＶＸ7ＥＩＧ ＥＬＰＮＬＮＷＧＱＸ20 ＤＡＦＩＮＳＬＷＤである。
【００３３】
後述の実験の節に詳細に記載されるように、ＥＧＦＲ結合バリアントの選択から、多数の別個のＥＧＦＲ結合モチーフ（ＥＢＭ）配列の同定がなされた。これらの配列は、本発明のこの局面に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの定義におけるＥＢＭ配列ｉ）の個別の実施態様を構成する。個別のＥＧＦＲ結合モチーフの配列は図１におよび配列番号１〜１６３として示されている。本発明のこの局面の実施態様において、ＥＢＭ配列ｉ）は、特に、配列番号３３、配列番号４８、配列番号５７、配列番号８７、配列番号８８、および配列番号１４７から選択され得る。
【００３４】
本発明の実施態様において、ＥＢＭは３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成し得る。例えば、ＥＢＭは、主として、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内の二つのアルファヘリックスおよびそれらを結ぶループの一部を形成し得る。
【００３５】
本発明の個々の実施態様において、このような３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、細菌受容体タンパク質のドメインから選択される。このようなドメインの非限定的な例は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡの５つの異なる３ヘリックスドメイン、およびその誘導体である。従って、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドは：
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＡ内のＥＢＭ）；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢ内のＥＢＭ）；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＣ内のＥＢＭ）；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＤ内のＥＢＭ）；
ＡＱＨＤＥ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＥ内のＥＢＭ）；および
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体内のＥＢＭ）；
から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００３６】
配列中の［ＥＢＭ］は先に定義したＥＧＦＲ結合モチーフである。
【００３７】
本発明の別の局面によれば、配列番号３２７のアミノ酸配列：
ＶＤＮＫＦＮＫ ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨ ＬＰＮＬＮＥ ＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤ ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡ ＱＡＰＫ
の９〜１１、１３〜１４、１７〜１８、２４〜２５、２７〜２８、３２、および３５位、またはこれらの位置に対応する位置のいずれかまたは全てにおいて、非修飾型アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してＥＧＦＲに対するそのポリペプチドの結合性を向上させるアミノ酸置換を加えることによって得られるアミノ酸配列を含み、最大１０μＭの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドが提供される。
【００３８】
その別の代替の局面によれば、本発明は、そのアミノ酸配列が、以下：ｉｉｉ）配列番号１６４〜３２６から選択される；およびｉｖ）配列番号１６４〜３２６から選択される配列に対して８５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列である、から選択される定義の一つを満たす配列を含む、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。本発明のこの局面の実施態様において、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは特に、配列番号１９６、配列番号２１１、配列番号２２０、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号３１０から選択される配列およびそれらに対して８５％またはそれ以上の同一性を有する配列を含み得る。
【００３９】
本発明の任意の局面に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、最大１×１０-6Ｍ、例えば最大１×１０-7Ｍの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合し得る。
【００４０】
本明細書中で、異なるポリペプチドのアミノ酸配列間の同一性の程度についての言及がなされる場合、本明細書中に開示される配列に対して８５％の同一性という下限が設定される。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載される配列に対して少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を有し得る。この比較は、比較される配列のうちの最小配列に対応する枠（ｗｉｎｄｏｗ）で、または比較される配列のうちの少なくとも一つにおけるＥＧＦＲ結合モチーフに対応する枠で行われ得る。
【００４１】
このポリペプチドは、ＥＧＦＲに対する結合性が良いことが利点である。典型的には、このポリペプチドは比較的短く、そのサイズの小ささゆえに抗体よりも腫瘍組織への浸透性が良いと同時に従来的な低分子量ＥＧＦＲ結合物質（半減期が短すぎる場合が多い）およびモノクローナル抗体（循環時間が長過ぎる場合が多い）よりも全身循環性がよい。
【００４２】
本発明に従うポリペプチドは、約５３〜５８アミノ酸長であり得る。しかし、その長さはそれより長くも短くもできる。ポリペプチドの長さは、例えば、そのＮ末端で４アミノ酸まで減らすことができる。
【００４３】
用語「位置」の用法は相対的なものである。上記の非修飾型ポリペプチドと同様に５３アミノ酸長である本発明に従うポリペプチドにおいては、このポリペプチド上のアミノ酸位置は、非修飾型ポリペプチド上のアミノ酸位置に正確に対応し、例えば非修飾型ポリペプチドと比較してＮ末端が伸長されている状況では、非修飾型ペプチドに対応する修飾型ペプチド上のアミノ酸残基が同じ位置番号を有する。例えば、修飾型ポリペプチドにおいて６アミノ酸残基が伸長されている場合、Ｎ末端から数えて、その修飾型ポリペプチドのアミノ酸番号７は、非修飾型ポリペプチドの位置番号１のアミノ酸に対応する。
【００４４】
従って、本発明のポリペプチドは、様々な医学、獣医学、診断、およびイメージング用途において、従来的な抗体または低分子量物質の代替物として使用され得る。例えば、本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＥＧＦＲに関連する癌、例えば、上記のＥＧＦＲの過剰発現によって引き起こされる癌、特に局所分布が適用される場合は、例えば神経膠腫の処置において使用され得る。本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドはまた、細胞表面上のＥＧＦＲに結合することによって細胞のシグナル伝達を阻害するために、癌の診断において、薬剤をＥＧＦＲ発現細胞、特にＥＧＦＲ過剰発現細胞に対して標的化するのにインビボおよびインビトロの両方で、ＥＧＦＲの検出のための組織化学法において、分離法において、ならびにその他の用途において使用され得る。臨床用の分子イメージング剤の開発に加えて、インビボモデルおよびその後の臨床開発における処置結果を測定するための特異的な前臨床用イメージング剤としての用途もある。分子イメージングは、成長因子受容体、例えばＨＥＲ２またはＥＧＦＲをダウンレギュレートすることを目的とする医薬の効果の直接的な読み取りおよび抗腫瘍効果の評価を可能にする。本発明のポリペプチドは、ある試薬のＥＧＦＲに対する親和性に基づく任意の方法において有用であり得る。従って、このポリペプチドは、このような方法において、検出試薬として、捕捉試薬として、または分離試薬として使用されるだけでなく、それらの独自能力（ｔｈｅｉｒ ｏｗｎ ｒｉｇｈｔ）による治療剤としてまたは直接的（例えば毒性分子、毒素）もしくは間接的な治療効果（例えば癌ワクチン、免疫賦活分子）を有する他の治療剤をＥＧＦＲタンパク質に対して標的化するための手段として使用され得る。
【００４５】
本発明に従うポリペプチドをインビトロで利用する方法は、例えばマイクロタイタープレート、タンパク質アレイで、バイオセンサー表面上で、ビーズ上で、フローサイトメトリーで、組織切片上で、等の異なる形式で行われ得る。
【００４６】
当業者は、本発明に従うポリペプチドを本発明の範囲から逸脱することなく個別の用途に合わせるために、このポリペプチドに対して様々な修飾および／または付加をなすことができることを理解するであろう。これらの修飾および付加については以下により詳細に記載されており、これらには同じポリペプチド鎖における追加のアミノ酸、または本発明のポリペプチドに化学的に結合もしくはそれ以外の方法で結合された標識および／もしくは治療剤が含まれ得る。
【００４７】
さらに、本発明はまた、ＥＧＦＲ結合性を保持するプロテインＡ由来のＥＧＦＲ結合ポリペプチドのフラグメントを包含する。結合特異性を保持する野生型ＳＰＡドメインのフラグメントを作製する可能性については、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：５６８８−５６９２（１９９６）のＢｒａｉｓｔｅｄ ＡＣ ｅｔ ａｌに示されている。この論文に記載される実験においては、構造ベースの設計およびファージディスプレイ法を用いることで、５９残基の３ヘリックスバンドルの結合ドメインを、得られた３３残基の２ヘリックス誘導体に小型化させている。これは、異なる領域の無作為変異の段階的な選択によって安定性および結合親和性を反復的に向上させることで達成された。同じ論法で、当業者は、本発明のポリペプチドを用いることで、その「親」のＥＧＦＲ結合ポリペプチドと同一の結合特性を有する「最小化型」ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを獲得できるであろう。従って、本発明に従うポリペプチドのフラグメントを構成するポリペプチドは、本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、用語「ＥＧＦＲ結合」および「ＥＧＦＲに対する結合親和性」は、例えば表面プラズモン共鳴技術を、例えばＢｉａｃｏｒｅ機器において使用することによって試験され得るポリペプチドの特性を意味する。例えば、以下の実施例に記載されるように、ＥＧＦＲ結合親和性は、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲのフラグメント、例えばその細胞外ドメインをこの機器のセンサーチップに固定し、試験ポリペプチドを含むサンプルをそのチップに通す実験において試験され得る。あるいは、試験ポリペプチドをこの機器のセンサーチップに固定し、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲのフラグメント、例えばその細胞外ドメインを含むサンプルそのチップに通すこともある。これに関して、ＥＧＦＲは、配列番号３２８のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得、その細胞外ドメインは、配列番号３２９のアミノ酸を含むポリペプチドであり得る。当業者は、その後、このような実験から得られた結果を解析し、少なくともＥＧＦＲに対するそのポリペプチドの結合親和性の質的指標を獲得し得る。質的指標が望ましい場合、例えば、相互作用のＫD値を決定するために、表面プラズモン共鳴法も使用され得る。結合値は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）において規定され得る。ＥＧＦＲはこの機器のセンサーチップに固定され、その親和性を測定したいポリペプチドのサンプルが連続希釈によって調製され、無作為順で注入される。次いで、例えばその機器の製造元（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）から提供されるＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアの１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、その結果からＫD値が算出され得る。
【００４９】
アミノ酸置換が導入される場合は、これらがそのポリペプチドの基本構造に影響するものであってはならない。例えば、ポリペプチドのＣα骨格の全体的なフォールディングは、関連するＺ「野生型」ドメインのそれと本質的に同一である、すなわち同じ二次構造のエレメントを同じ順で有するものであり得る。従って、この基本構造を有するポリペプチドは、Ｚ「野生型」ドメインと類似のＣＤスペクトルを有するであろう。当業者は、関連性のある他のパラメータを認識しているであろう。この基本構造の保存に関する要件は、置換に供され得るアミノ酸配列位置に制限を課す。例えば、ポリペプチド表面に位置するアミノ酸残基が置換され、ポリペプチドの「３ヘリックスバンドル」のコアの中に埋もれたアミノ酸残基はその分子の構造的特性を保存するために維持されるのが好ましい。同じ論法が、本発明のポリペプチドのフラグメントにも適用される。
【００５０】
本発明はまた、上記のＥＧＦＲ結合ポリペプチドが、いずれかの末端に追加のアミノ酸が付加されたＥＧＦＲ結合ドメインとして存在するポリペプチドを包含する。これらの追加のアミノ酸残基は、そのポリペプチドによるＥＧＦＲの結合において役割を果たし得るが、同様に他の目的、例えばそのポリペプチドの生成、精製、安定化、結合、または検出の一つまたはそれ以上に関連する目的もまた果たし得る。このような追加のアミノ酸残基は、化学的な結合の目的で付加される一つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含み得る。この一例は、ポリペプチド鎖の最初および最後の位置、すなわちＮまたはＣ末端におけるシステイン残基の付加である。このような追加のアミノ酸残基はまた、そのポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えばそのタグに対して特異的な抗体との相互作用のためのＨｉｓ6タグまたは「ｍｙｃ」タグまたは「ｆｌａｇ」タグを提供し得る。
【００５１】
本発明はまた、上記のＥＧＦＲ結合ポリペプチドが、追加のペプチドもしくはタンパク質または他の官能基が（公知の有機化学法を用いる）化学的結合により（特異的にまたは非特異的に）Ｎ末端もしくはＣ末端にまたは任意の他の残基に結合されたＥＧＦＲ結合ドメインとして存在するＥＧＦＲ結合ポリペプチドを包含する。
【００５２】
上述の「追加のアミノ酸残基」はまた、任意の所望の機能、例えば第一のＥＧＦＲ結合ドメインと同じ結合機能もしくは別の結合機能、もしくは酵素機能、毒性機能（例えば免疫毒素）、もしくは蛍光シグナル機能、またはこれらの組み合わせを有する一つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを提供し得る。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、単量体形態の場合も多量体形態の場合もある。ポリペプチドの多量体形態は、結合特性が増強され得る点で有利な場合がある。好ましい多量体形態には、二量体形態および三量体形態が含まれる。ポリペプチドの多量体形態は、適当な数の本発明のポリペプチドを含み得る。これらのポリペプチドは、本質的に、その多量体内でドメインを形成する。これらのドメインは全て、同じアミノ酸配列を有し得るが、代替的にそれらが異なるアミノ酸配列を有する場合もある。ポリペプチドは、公知の有機化学法を用いる共有結合性結合により接続されるか、またはポリペプチドの組換え発現系において一つもしくはそれ以上の融合ポリペプチドとして発現されるか、または任意の他の様式で、直接的にもしくはリンカー、例えばアミノ酸リンカーを通じてのいずれかで接続され得る。
【００５４】
さらに、本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドが第一ドメインまたは部分を提供し、第二またはさらなる部分がＥＧＦＲ結合以外の機能を有する融合ポリペプチドもまた企図され、これらも本発明の範囲に含まれる。このような融合ポリペプチドの第二またはさらなる部分は、ＥＧＦＲ以外の標的分子に対する親和性を有する結合ドメインを含み得る。このような結合ドメインは、別の、類似のポリペプチドバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）であり得る。例えば、ポリペプチドバインダーは、Ｚバリアントであり得る。これにより、様々なタイプの用途、例えば医薬、獣医薬、診断、分離、およびイメージングにおいて使用され得る多特異的試薬（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ）を作製することが可能になる。このような多特異的融合ポリペプチドの調製は、先に概説したようにして行われ得る。
【００５５】
本発明の他の実施態様において、第二またはさらなる部分は、標的に対する結合親和性を有する無関係の天然タンパク質または組換えタンパク質（またはその天然タンパク質もしくは組換えタンパク質の結合またはその他の能力を保持するそれらのフラグメント）を含み得る。例えば、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、治療用途における使用のためにＥＧＦＲ結合ポリペプチドの半減期を向上させるため、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたは血清タンパク質に対する親和性を有する任意の他のタンパク質／ペプチドに接続され得る。
【００５６】
本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、他の融合ポリペプチドの形態で提供され得る。例えば、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたはそのフラグメントは、標的への結合に加えてまたはその代わりに他の機能を発揮する第二またはさらなる部分または部分群に共有結合により結合され得る。一つの例は、一つまたはそれ以上のＥＧＦＲ結合ポリペプチドと、レポーターまたはエフェクター部分として機能する酵素活性を有するポリペプチドとの融合であろう。融合タンパク質の形成のためにＥＧＦＲ結合ポリペプチドに結合され得るレポーター酵素の例は、当業者に周知であり、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等の酵素が含まれる。本発明に従う融合ポリペプチドの第二およびさらなる部分または部分群についての他の選択肢には、蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、およびそれらのバリアントが含まれる。
【００５７】
本発明に従う融合ポリペプチドの第二およびさらなる部分または部分群についての他の選択肢には、治療用途の部分または部分群が含まれる。治療用途においては、他の分子もまた、他の手段によって、本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に結合され得る。例えば、他の分子、例えば、本発明のポリペプチドをエフェクター酵素（例えばカルボキシペプチダーゼ）またはＲＮａｓｅもしくはＤＮａｓｅ融合物の誘導のために使用する「ＡＤＥＰＴ」（抗体酵素プロドラッグ療法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ））適用のための酵素；エフェクター細胞およびその他の免疫系成分の動員のためのタンパク質；サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＰ−１０；凝血原因子、例えば組織因子、フォン・ビルブラント因子；毒素、例えばリシンＡ、シュードモナス外毒素、カルキアミシン（ｃａｌｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、毒性低分子、例えばオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）アナログ、ドキソルビシン。
【００５８】
上記の追加のアミノ酸（特にヘキサヒスチジン、システイン）は、診断用（例えば68Ｇａ、76Ｂｒ、111Ｉｎ、99Ｔｃ、125Ｉ）または治療用（例えば90Ｙ、131Ｉ、211Ａｔ、177Ｌｕ）の放射性核種を容易に導入するために放射性同位元素のキレート剤をＥＧＦＲ結合ポリペプチドに結合するのに使用できる。
【００５９】
本発明はまた、上記のＥＧＦＲ結合ポリペプチドが、例えばそのポリペプチドの検出の目的で、標識基、例えば少なくとも一つのフルオロフォア、ビオチン、または放射性同位元素と共に提供されるポリペプチドを包含する。
【００６０】
本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドを組み込んだ融合ポリペプチドおよびタンパク質についての上記の説明に関して、第一、第二、およびさらなる部分という表示は、一方のＥＧＦＲ結合部分または部分群と他方の他の機能を発揮する部分とを区別する明確化の目的でなされていることに留意されたい。これらの表示は、その融合タンパク質またはポリペプチドのポリペプチド鎖における異なるドメインの実際の順番を示すことを意図するものではない。従って、例えば、第一部分は、融合タンパク質またはポリペプチドのＮ末端、中間、またはＣ末端に存在し得る。
【００６１】
本発明のさらなる好ましい局面および実施態様は、以下の実施態様のリストおよび添付の特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００６２】
本明細書において引用した全ての科学文献および特許書類は、参照により本明細書に援用する。
【００６３】
１． アミノ酸配列：
ＶＤＮＫＦＮＫ ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨ ＬＰＮＬＮＥ ＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤ ＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡ ＱＡＰＫ
に由来するアミノ酸配列を含み、
その配列の９〜１１、１３〜１４、１７〜１８、２４〜２５、２７〜２８、３２、および３５位、またはこれらの位置に対応する位置のいずれかまたは全てにおいて、非修飾型アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してＥＧＦＲに対するそのポリペプチドの結合性を向上させるアミノ酸置換を含むことによって得られるアミノ酸配列を含み、最大１０μＭの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、ＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２． ９位のアミノ酸置換が疎水性アミノ酸である、実施態様１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３． ９位のアミノ酸置換が非極性アミノ酸である、実施態様１または２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４． ９位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様１〜３のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５． ９位のアミノ酸置換が芳香族Ｒ基を含む、実施態様１〜４のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６． ９位のアミノ酸置換が極性アミノ酸である、実施態様１〜２または４または５のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７． ９位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１〜５のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８． ９位のアミノ酸置換が塩基性アミノ酸である、実施態様１〜７のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９． ９位のアミノ酸置換がＷ、Ｍ、Ｔ、Ｆ、Ｈ、Ｓ、Ｌ、Ａ、およびＶから選択される、実施態様１〜８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０． ９位のアミノ酸置換がＭ、Ｆ、Ｌ、またはＶである、実施態様３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６４】
１１． １０位のアミノ酸置換が疎水性アミノ酸である、実施態様１〜１０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２． １０位のアミノ酸置換が親水性アミノ酸である、実施態様１〜１１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３． １０位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜１１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４． １０位のアミノ酸置換が極性アミノ酸である、実施態様１〜１３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１５． １０位のアミノ酸置換が非極性アミノ酸である、実施態様１〜１３のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１６． １０位のアミノ酸置換が酸性アミノ酸である、実施態様１〜１５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１７． １０位のアミノ酸置換がＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ａ、Ｅ、Ｗ、およびＱから選択される、実施態様１〜１６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１８． １０位のアミノ酸置換がＬ、Ｙ、Ｅ、またはＱである、実施態様１７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１９． １１位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜１８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２０． １１位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜１８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６５】
２１． １１位のアミノ酸置換が親水性である、実施態様１〜１９のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２２． １１位のアミノ酸置換が非極性アミノ酸である、実施態様１〜２１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２３． １１位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様２２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２４． １１位のアミノ酸置換が正に荷電したＲ基を含む、実施態様１〜２３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２５． １１位のアミノ酸置換が塩基性アミノ酸である、実施態様１〜２４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２６． １１位のアミノ酸が極性アミノ酸である、実施態様１〜２１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２７． １１位のアミノ酸が非荷電である、実施態様１〜２３のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２８． １１位のアミノ酸置換がＡ、Ｉ、Ｋ、Ｐ、およびＮから選択される、実施態様１〜２７のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
２９． １１位のアミノ酸置換がＡ、Ｉ、またはＫである、実施態様２８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３０． １３位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜２９のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６６】
３１． １３位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜３０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３２． １３位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様１〜３１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３３． １３位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜３０のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３４． １３位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１〜３３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３５． １３位のアミノ酸置換が芳香族Ｒ基を含む、実施態様１〜３４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３６． １３位のアミノ酸置換がＡ、Ｓ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、Ｙ、Ｗ、およびＴから選択される、実施態様１〜３５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３７． １３位のアミノ酸置換がＭ、Ｉ、Ｙ、またはＶである、実施態様８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３８． １４位のアミノ酸置換が親水性である、実施態様１〜３７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
３９． １４位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜３７のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４０． １４位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜３９のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６７】
４１． １４位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様４０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４２． １４位のアミノ酸置換が酸性である、実施態様１〜４１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４３． １４位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜４１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４４． １４位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜３９のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４５． １４位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様４４に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４６． １４位のアミノ酸置換が負に荷電したＲ基を含む、実施態様１〜４５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４７． １４位のアミノ酸置換がＳ、Ｅ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、Ｖ、Ｎ、Ｔ、およびＡから選択される、実施態様１〜４６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４８． １４位のアミノ酸置換がＳまたはＴである、実施態様４７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
４９． １７位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜４８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５０． １７位のアミノ酸置換が親水性である、実施態様１〜４８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６８】
５１． １７位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜４８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５２． １７位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５３． １７位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様５２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５４． １７位のアミノ酸が正荷電である、実施態様１〜５２のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５５． １７位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜５１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５６． １７位のアミノ酸が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様５５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５７． １７位のアミノ酸が塩基性である、実施態様１〜５６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５８． １７位のアミノ酸置換がＳ、Ｇ、Ｎ、およびＶから選択される、実施態様１〜５７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
５９． １７位のアミノ酸置換がＧ、Ｎ、およびＶから選択される、実施態様１２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６０． １８位のアミノ酸が中性である、実施態様に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００６９】
６１． １８位のアミノ酸置換が親水性である、実施態様１〜５９のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６２． １８位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜６１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６３． １８位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜６１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６４． １８位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１〜６３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６５． １８位のアミノ酸置換が正荷電である、実施態様１〜６３のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６６． １８位のアミノ酸置換が酸性である、実施態様１〜６５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６７． １８位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜６５のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６８． １８位のアミノ酸置換がＧ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｎ、Ｈ、Ｅ、およびＫから選択される、実施態様１〜６７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
６９． １８位のアミノ酸置換がＲまたはＮである、実施態様６８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７０． ２４位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜６９のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７０】
７１． ２４位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜６９のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７２． ２４位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜７１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７３． ２４位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜７２のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７４． ２４位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様７３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７５． ２４位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜７２のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７６． ２４位のアミノ酸が芳香族Ｒ基を含む、実施態様１〜７５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７７． ２４位のアミノ酸置換がＫ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、およびＭから選択される、実施態様１〜７６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７８． ２４位のアミノ酸置換がＶまたはＧである、実施態様７７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
７９． ２５位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜７８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８０． ２５位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７１】
８１． ２５位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜８０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８２． ２５位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様８１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８３． ３５位のアミノ酸置換が芳香族Ｒ基を含む、実施態様１〜８２のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８４． ２５位のアミノ酸が極性である、実施態様１〜８０のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８５． ２５位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜８４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８６． ２５位のアミノ酸置換がＬ、Ｇ、Ｗ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、およびＷから選択される、実施態様１〜８５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８７． ２５位のアミノ酸置換がＧまたはＷである、実施態様８６に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８８． ２７位のアミノ酸置換が親水性である、実施態様１〜８７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
８９． ２７位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜８８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９０． ２７位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜８８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７２】
９１． ２７位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜９０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９２． ２７位のアミノ酸置換が酸性である、実施態様１〜９１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９３． ２７位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜９０のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９４． ２７位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様９３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９５． ２７位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜９１のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９６． ２７位のアミノ酸置換が負に荷電したＲ基を含む、実施態様１〜９３のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９７． ２７位のアミノ酸置換がＡ、Ｅ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｇ、およびＳから選択される、実施態様１〜９６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９８． ２７位のアミノ酸置換がＥ、Ｍ、またはＳである、実施態様９７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
９９． ２８位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜９８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１００． ２８位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜９８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７３】
１０１． ２８位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜１００のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０２． ２８位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様１０１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０３． ２８位のアミノ酸置換が極性である、実施態様に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０４． ２８位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１０３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０５． ２８位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜１０４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０６． ２８位のアミノ酸置換がＦ、Ｑ、Ｖ、Ａ、Ｋ、Ｖ、およびＴから選択される、実施態様１〜１０５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０７． ２８位のアミノ酸置換がＴ、Ｑ、またはＶである、実施態様１０６に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０８． ３２位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜１０７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１０９． ３２位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜１０８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１０． ３２位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜１０９のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７４】
１１１． ３２位のアミノ酸が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様１１０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１２． ３２位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜１０９のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１３． ３２位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１１２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１４． ３２位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜１１３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１５． ３２位のアミノ酸置換がＶ、Ｌ、Ｓ、Ｆ、Ａ、およびＲから選択される、実施態様１〜１１４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１６． ３２位のアミノ酸置換がＬ、Ｓ、またはＡである、実施態様１１５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１７． ３５位のアミノ酸置換が疎水性である、実施態様１〜１１６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１８． ３５位のアミノ酸置換が中性である、実施態様１〜１１６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１１９． ３５位のアミノ酸置換が非極性である、実施態様１〜１１８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２０． ３５位のアミノ酸置換が脂肪族Ｒ基を含む、実施態様１１９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７５】
１２１． ３５位のアミノ酸置換が極性である、実施態様１〜１１８のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２２． ３５位のアミノ酸置換が非荷電である、実施態様１２１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２３． ３５位のアミノ酸置換が塩基性である、実施態様１〜１２２のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２４． ３５位のアミノ酸置換が芳香族Ｒ基を含む、実施態様１〜１２３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２５． ３５位のアミノ酸置換がＶ、Ｗ、Ｓ、Ｒ、Ｍ、Ｈ、およびＬから選択される、実施態様１〜１２４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２６． ３５位のアミノ酸置換がＷ、Ｓ、またはＶである、実施態様１２５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２７． ポリペプチド表面に位置するアミノ酸残基が置換されている、実施態様１〜１２６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２８． ポリペプチドの三次元構造のコア内のアミノ酸残基が置換されていない、実施態様１〜１２７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１２９． Ｃ末端および／またはＮ末端のアミノ酸伸長により伸長された、実施態様１〜１２８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３０． アミノ酸伸長または各アミノ酸伸長がこのポリペプチドによるＥＧＦＲの結合を増強する、実施態様１２９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７６】
１３１． アミノ酸伸長または各アミノ酸伸長が、ポリペプチドの生成、精製、インビボもしくはインビトロでの安定性、結合、または検出を向上させる、実施態様１２９または１３０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３２． アミノ酸伸長または各アミノ酸伸長が、ポリペプチドのアミノ酸配列の最初または最後の位置にシステイン残基を含む、実施態様１３１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３３． アミノ酸残基の伸長部が、Ｈｉｓ6タグ、または「ｍｙｃ」もしくは「ｆｌａｇ」タグを含む、実施態様１３１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３４． 伸長部分が、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体ドメインを含み、治療用途におけるＥＧＦＲ結合ポリペプチドの半減期を向上させる、実施態様１３１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３５． 約５３アミノ酸を含む、実施態様１〜１３４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３６． 最大１×１０-6Ｍの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、実施態様１〜１３５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３７． 最大１×１０-7Ｍの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、実施態様１３６に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３８． ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する、実施態様１〜１３７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１３９． 成熟型ＥＧＦＲ（配列番号３２８）のヌクレオチド２５９〜２１２７に対応するＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）の一部に結合する、実施態様１３８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４０． 実施態様１〜１３９のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドのフラグメントを含む、ＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【００７７】
１４１． フラグメントが実施態様１〜１３９のいずれか一つに記載のポリペプチドからのＮ末端短縮を含む、実施態様１４０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４２． Ｎ末端短縮が４アミノ酸以下である、実施態様１４１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４３． ＥＧＦＲ結合ポリペプチド単位を含む多量体形態の、実施態様１〜１４２のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４４． ＥＧＦＲ結合ポリペプチド単量体単位が共有結合により結合されている、実施態様１４３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４５． ＥＧＦＲ結合ポリペプチド単量体単位が融合タンパク質として発現される、実施態様１４３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４６ 二量体形態の、実施態様１４３〜１４５のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
１４７． 実施態様１〜１４６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド。
１４８． 実施態様１４７に記載のヌクレオチドを発現することを含む、実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のポリペプチドの製造方法。
１４９． 実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび検出剤の組み合わせ。
１５０． 検出剤が、放射線イメージングにおいて使用するための放射性物質である、実施態様１４９に記載の組み合わせ。
【００７８】
１５１． 放射性物質が放射性核種である、実施態様１５０に記載の組み合わせ。
１５２． 検出剤が酵素である、実施態様１４９に記載の組み合わせ。
１５３． 酵素がβ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびカルボキシペプチダーゼから選択される、実施態様１５２に記載の組み合わせ。
１５４． 検出剤が蛍光ポリペプチドである、実施態様１４９に記載の組み合わせ。
１５５． 実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび治療剤の組み合わせ。
１５６． ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび検出剤または治療剤が共有結合により結合されている、実施態様１４９〜１５５のいずれか一つに記載の組み合わせ。
１５７． ＥＧＦＲポリペプチドおよび検出剤または治療剤が融合タンパク質として発現される、実施態様１４９〜１５５のいずれか一つに記載の組み合わせ。
１５８． 実施態様１５０〜１５１のいずれか一つに記載の組み合わせを放射線イメージング剤として使用する、放射線イメージング方法。
１５９． ＥＧＦＲを含む疑いのあるサンプルを提供し、実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは実施態様１４９〜１５４のいずれか一つに記載の組み合わせとサンプルを接触させ、サンプル中のＥＧＦＲの存在を示すポリペプチドまたは組み合わせへの結合を検出することを含む、ＥＧＦＲの検出方法。
１６０． 二つ以上のＥＧＦＲが検出される、実施態様１５９に記載の検出方法。
【００７９】
１６１． 実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは実施態様１４９〜１５４のいずれか一つに記載の組み合わせとサンプルを接触させることを含み、それによってＥＧＦＲがポリペプチドに結合し、これをサンプルから除去することができる、サンプルからのＥＧＦＲの分離または捕捉方法。
１６２． 被検体または被検体由来のサンプルを、実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは実施態様１４９〜１５４のいずれか一つに記載の組み合わせと接触させ、ポリペプチドまたは組み合わせへの結合を検出することを含む、被検体におけるＥＧＦＲの存在を決定するための診断方法。
１６３． 被検体がヒトまたは動物である、実施態様１６２に記載の方法。
１６４． インビボで行われる、実施態様１６２に記載の方法。
１６５． サンプルに対してインビトロで行われる、実施態様１６２または１６３に記載の方法。
１６６． 被検体または被検体由来の物質を実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは実施態様１５５〜１５７のいずれか一つに記載の組み合わせで処置することである、被検体または被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに関連する状態の処置方法。
１６７． 被検体のまたは被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに対する実施態様１〜１４６のいずれか一つに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは実施態様１５５〜１５７のいずれか一つに記載の組み合わせの結合が、受容体の活性化を阻害または刺激する、実施態様１６６に記載の処置方法。
１６８． 被検体のまたは被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ結合ポリペプチドの結合が、細胞のシグナル伝達を阻害する、実施態様１６６または１６７に記載の処置方法。
１６９． ＥＧＦＲに関連する状態が癌である、実施態様１６６〜１６８のいずれか一つに記載の処置方法。
１７０． 癌が、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、頭頸部癌から選択される、実施態様１６９に記載の処置方法。
１７１． 被検体がヒトまたは動物である、実施態様１６６〜１７０のいずれか一つに記載の方法。
【００８０】
ここからは、本発明に従うポリペプチドおよびそれらの使用法は、例示のみの目的で、添付図面、図１〜１２を参照しつつ描写されよう。
【００８１】
以下の実験においては、黄色ブドウ球菌プロテインＡのＢドメイン由来のプロテインＺのＥＧＦＲ結合性のバリアントを選択するのにファージディスプレイを使用した。ＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントは、集合的にＺEGFRと表示されることもある。各個別のＺバリアントには固有の識別番号＃＃＃＃＃が付与されており、個々のバリアントは互換的にＺ＃＃＃＃＃およびＺEGFR:#####と称される。
【実施例】
【００８２】
実施例１
本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの一次選択
材料および方法
ポリペプチドバインダー、菌株、ベクター、およびファージミドライブラリの作製
アンバーサブレッサー大腸菌ＲＲＩΔＭ１５株（Ｒｕｅｔｈｅｒ，Ｕ．（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０，５７６５−５７７２．）を、ファージの産生およびクローニング手順のための細菌宿主として使用した。本研究において使用したファージミドベクターｐＡｆｆｉ１およびファージミドライブラリＺｌｉｂ２００２（３×１０9メンバー）の構築については、Ｇｒｏｅｎｗａｌｌ Ｃ，Ｊｏｎｓｓｏｎ Ａ，Ｌｉｎｄｓｔｒｏｅｍ Ｓ，Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ Ｅ，Ｓｔａｈｌ Ｓ，Ｈｅｒｎｅ Ｎ：“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｆｆｉｂｏｄｙ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６） ｉｎ ｐｒｅｓｓ，Ｅｐｕｂ ２７ Ｓｅｐ ２００６に開示されている。選択されたクローンのファージミドインサートは、カナマイシン耐性を付与する遺伝子と共に、Ｔ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５，６０−８９）、ヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ6）タグをコードするＤＮＡフラグメント、およびマルチクローニングサイトを含む、さらにはｐＡＹ４３０については直接標識のためにＣ末端に追加のシステインを含む、発現ベクターｐＡＹ４４２およびｐＡＹ４３０にサブクローニングした。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、発現ベクターからのタンパク質産生に使用した。
【００８３】
ファージストックの調製
ライブラリ（Ｚｌｉｂ２００２の一部）からのおよび選択間でのファージストックの調製は、以前に記載された手順（Ｎｏｒｄ，Ｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，７７２−７７７；Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，２３７−２５２）に従い、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて行った。ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降により、約１０13ｐｆｕ／ｍｌのファージ価を得た。
【００８４】
ファージの選択
ヌクレオチド２５９〜２１２７に対応する６２３アミノ酸を含むＥＧＦＲの約１００ｋＤａの組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、選択において標的タンパク質として使用した（配列番号３２９）。このタンパク質を、ＥＺ−ＬｉｎｋＴＭ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてインビトロでビオチニル化させた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中のＥＧＦＲ−ＥＣＤに２０倍過剰のビオチンを加え、その混合物を室温で１時間インキュベートした後、４℃でＰＢＳに対して十分な透析を行い余分なビオチンを除去した。
【００８５】
次いで、ビオチニル化した標的タンパク質を、ストレプトアビジンコートした常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ．，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）に固定した。各選択ラウンドにつき、ビーズを、０.１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を補充したＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で二回洗浄した。非特異的なバインダーを回避するため、この手順に使用した全てのチューブは、０.１％ゼラチンを補充したＰＢＳＴで事前に処理しておいた。さらに常磁性ビーズ上に存在するストレプトアビジンに対するバインダーを回避するため、０.１％ゼラチンを補充したＰＢＳＴ中のファージストックを、第１ラウンドおよび第２ラウンドにおいて０.２ｍｇのビーズ（予めＰＢＳＴで二回洗浄しておいた）と共にプレインキュベートした。次いで、結合していないファージストックを、連続的に上下逆さ回転させる条件下（ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ ｒｏｔａｔｉｏｎ）、室温で１時間４５分の、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ標的タンパク質に対するバイオパニングに供し、その後にストレプトアビジンコートした常磁性ビーズと共に１５分間（室温、連続的に上下逆さ回転）インキュベートした。各パニングラウンドにおいて各々２つの異なる漸減標的濃度を使用した２つの別個の選択を、以下の通りに行った。第１ラウンドにおいては；１２および１.２μｇの標的タンパク質を、それぞれ６および０.６ｍｇのビーズと共にインキュベートし、第２ラウンドにおいては；５、２.５、０.５、および０.３５μｇの標的タンパク質をそれぞれ２.５、１.２５、０.２５、０.１２５ｍｇのビーズと共にインキュベートし、第三および第４ラウンドにおいては；５、１、０.５、および０.１μｇの標的タンパク質をそれぞれ１、０.５、０.１、０.０５ｍｇのビーズと共にインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による測定によれば、この手順により、ビーズ１ｍｇあたり約２μｇの標的タンパク質が固定された。４ラウンドのバイオパニングは以下の通りに行った。ビーズは、第１ラウンドにおいて２回、第２ラウンドにおいて５回、第３ラウンドにおいて７回、および第４ラウンドにおいて１０回、ＰＢＳＴで洗浄した。その後、結合したファージを５００μｌの５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２.１を用いて室温で１０分間溶出させ、次いで直ちに５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０および４５０μｌ ＰＢＳで中性にした。
【００８６】
溶出したファージを使用して、３７℃で３０分間、対数増殖期のＲＲＩΔＭ１５細胞を感染させた。感染細胞懸濁物を、２％グルコースおよび１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補充したＴＹＥ寒天プレート（１５ｇ／ｌ寒天、８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌトリプトン、および６ｇ／ｌ酵母エキス）上に塗布し、次いで３７℃で一晩インキュベートした。成長したコロニーを、５ｇ／ｌ酵母エキス、２％グルコース、および１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したトリプティックソイブロス（ＴＳＢ、３０ｇ／ｌ；Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）への再懸濁により回収し、フラクション（溶出後のファージ価と比較して約５００倍過剰の細胞）を接種に使用し、次の世代のファージストックを得た。選択プロセスは、選択前および溶出後のファージストックを滴定することによって監視した。室温で５分間、ファージの連続希釈物で対数増殖期のＲＲＩΔＭ１５細胞を感染させた後、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＴＹＥ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８７】
ストレプトアビジンＥＬＩＳＡ
４ラウンドのバイオパニング後、４つ全ての選択から無作為抽出した３７２個のコロニーに対してＥＬＩＳＡを行い、ストレプトアビジン結合能を有するファージミド（ｐＡｆｆｉ１）インサートを排除した。無作為抽出したコロニー由来の細胞溶解産物を、事前にブロッキングした（２％粉乳を補充したＰＢＳＴ）９６ウェルストレプトアビジンコートプレート（Ｎｕｎｃ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ，ｃ９６，２３６００１）において室温で１.５時間インキュベートした。一次抗体としてウサギＩｇＧ全抗ポリペプチド特異的（ｐａｎ−ａｎｔｉ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）バインダー（１.５時間、室温、絶えず震盪）を、二次抗体としてウサギ免疫グロブリン−ＨＲＰを使用した（Ｐ０４４８ Ｄａｃｏ Ｃｙｔｏｍａｔａｔｉｏｎ；１時間、室温、絶えず震盪）。基質溶液（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）の添加後に、Ｔｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅ分光光度計を用いてＡ405nmの吸光度を測定した。
【００８８】
ＤＮＡ配列決定
ファージミド（ｐＡｆｆｉ１）インサートのＤＮＡ配列決定を、第４ラウンドのパニング由来の非ストレプトアビジン結合クローン（６４クローンは第１選択および第２選択由来であり３２クローンは第３選択および第４選択由来であった）に対して行った。特異的なプライマーおよびＢｉｇ Ｄｙｅターミネーター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、ＳａｎｇｅｒフラグメントをＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３７００ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において分析した。サブクローニングしたＤＮＡフラグメントを同じ手順で検証した。
【００８９】
アンバー終止コドンを有する配列（３個）、一つ以上のシステインを有する配列（１個）、および他の標的に対する選択において見出された配列（３個）を排除した後、さらなる調査のために１０個の配列を選択した。これらのポリペプチドバインダーの各アミノ鎖配列を図１に示し、配列番号１６４〜１７３として配列表に開示する。これらのバリアントの推定ＥＧＦＲ結合モチーフを配列番号１〜１０に示す。選択されたバリアントの配列は図２Ａにも示してある。特に、図２Ａにおいては、「野生型」Ｚドメインに対応するアミノ酸配列を、ＥＧＦＲ−ＥＣＤに対して選択された１０個の異なるポリペプチドバインダーの推定アミノ酸配列に整列させており、その図および本明細書中の他所において使用した破線は、「野生型」配列内の対応するアミノ酸と同一のアミノ酸を表す。１３個の無作為化されたアミノ酸残基（Ｑ９、Ｑ１０、Ｎ１１、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｈ１８、Ｅ２４、Ｅ２５、Ｒ２７、Ｎ２８、Ｑ３２、Ｋ３５）が示されている。１つ以上のバリアントにおいて同じ位置に現われたアミノ酸残基を太字で示す。水平線は、アミノ酸の一致を示す。図右側には、３７２個のコロニーのＤＮＡ配列決定において各ポリペプチドバインダーが検出された回数を示してある。野生型Ｚドメインにおける３つのα−ヘリックスを囲んでいる。
【００９０】
図２Ｂおよび図２Ｃはさらに、本発明のポリペプチドバインダーにおけるアミノ酸置換の特徴を示す。疎水性／親水性との関係での「中性」は、相対的に疎水性でも親水性でもないアミノ酸を意味する。
【００９１】
図２Ｄは、最初に決定したポリペプチドバインダーの改善のための成熟ストラテジーを示す。これに関連して、９、１０、１１、１３、および１４位の残基は重要性が低いため置換に供し、一方１７および１８位についてはアスパラギンおよびアルギニンが特に好ましいが、技術的理由で好まれ得るセリンおよびヒスチジンもまた、コドンの類似性の結果として生成され結合に使用され得る。３５位においては、バリンおよびセリンが好ましいが、技術的な理由ではロイシンおよびアラニンもまた特に選択され得る。２４、２５、２７、２８、および３２位については、それぞれアミノ酸Ｇ、Ｗ、Ｍ、Ｔ、およびＡが企図されるが、この分子のＥＧＦＲ結合能を保持する単一置換もまた、これらの部位のいずれかにおいて可能であり得る。
【００９２】
ＤＮＡ構築物
異なるＥＧＦＲポリペプチドバインダーをコードするＤＮＡフラグメントを発現ベクターｐＡＹ４４２およびｐＡＹ４３０にサブクローニングした。このフラグメントを、３'および５'の両方にＡｃｃＩ部位を導入する特異的プライマーを用いてｐＡｆｆｉ１ベクターから増幅し、予め同じ酵素で切断しておいたｐＡＹ４４２およびｐＡＹ４３０ベクターにライゲートし、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて脱リン酸化した。増幅したＤＮＡフラグメントをＱＩＡｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるライゲーションの前にハイブリダイズさせた。このライゲーションにより、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）による精製のためにＮ末端Ｈｉｓ6タグに融合された異なるポリペプチドバインダーをコードするｐＡＹ４４２−ＺEGFR:noおよびｐＡＹ４３０−ＺEGFR:noと命名された発現ベクターを得た。全てのプラスミドの調製は、形質転換した大腸菌細胞を一晩培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を製造元の指示に従い用いて行った。
【００９３】
タンパク質の生成および精製
選択されたポリペプチドバインダーを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株においてｐＡＹ４４２およびｐＡＹ４３０プラスミドからＨｉｓ6−タグ融合タンパク質として発現させた。
【００９４】
５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＴＳＢ培地（３０ｇ／ｌトリプティックソイブロス）５ｍｌに細胞を接種し、ディープウェルプレート中、約１５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。５ｇ／ｌ酵母エキスおよび５０ｍｇ／ｌカナマイシンを補充した新鮮なＴＳＢ（５ｍｌ）に、オーバーナイトカルチャー２０μｌを接種して細胞を３７℃で４時間培養し、終濃度が１ｍＭになるまでイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって遺伝子の発現を誘導した。２５℃で一晩培養した後、細胞を遠心分離（１００００ｇ、１０分間）により収集し、凍結解凍法（−８０℃、４０分間）により溶解させた。次いで、細胞ペレットを尿素緩衝液（８Ｍ、ｐＨ８.０）に再懸濁させた。Ｈｉｓ6−ＺEGFR融合タンパク質は、ＢＲ３０００ロボットを用いて、変性条件下のＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｑｉａｇｅｎ）におけるＩＭＡＣ精製により回収した。結合したタンパク質を低ｐＨ尿素緩衝液（８Ｍ、ｐＨ４.５）で溶出させ、精製した融合タンパク質の再生は、ＮＡＰ（商標）−５サイズ排除クロマトグラフィカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において緩衝液をＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３.４ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７.４）に交換することによって行った。そのポリペプチドのタンパク質濃度は、各タンパク質に適した消衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度測定値から算出した。この精製されたポリペプチドをさらに、Ｐｈａｓｔ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いるＰｈａｓｔｇｅｌ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ２０％ゲルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析した。選択されたＺEGFRバリアントのタンパク質濃度もまた、アミノ酸分析により決定した（Ａｍｉｎｏｓｙｒａａｎａｌｙｓｃｅｎｔｒａｌｅｎ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。
【００９５】
図３は、発現されＩＭＡＣ精製されたＥＧＦＲ結合ポリペプチドＨｉｓ6−ＺEGFR:942（レーン１）、Ｈｉｓ6−ＺEGFR:948（レーン２）、Ｈｉｓ6−ＺEGFR:955（レーン３）、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:942）2（レーン４）、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2（レーン５）、およびＨｉｓ6−（ＺEGFR:955）2（レーン６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーンＭはマーカータンパク質であり、分子量はキロダルトンで示す。
【００９６】
バイオセンサー分析
選択されたポリペプチドバインダーと標的タンパク質の間のリアルタイム生体分子間特異的相互作用（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（ＢＩＡ）に関しては、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４.５に希釈）を、製造元の指示に従い、アミンカップリングによって、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）の一つのフローセル表面のカルボキシル化デキストラン層に固定（約２６００ＲＵ）した。別のフローセル表面を、参照表面として使用するために活性化および不活性化し、ＨＥＲ２−ＥＣＤおよびヒトＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、ネガティブコントロールとして使用するため、別のＣＭ５センサーチップのフローセル表面に固定した。試験中の全てのポリペプチドバインダーのサンプルを、泳動緩衝液ＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３.４ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７.４）に希釈し、濾過（０.４５μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）した後に２５℃で結合アッセイを行った。第一実験においては、試験中の各ポリペプチドバインダー約１μＭ（ＨＢＳに希釈）を、全ての表面に対して２０μｌ／分の流速で注入した。ＥＧＦＲに対する親和性を有さない無関係の５３アミノ酸ポリペプチドバインダーをネガティブコントロールとして使用し、ポジティブコントロールとして天然リガンドｈＥＧＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）および市販のモノクローナル抗体セツキシマブ（ＭＥＲＣＫ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）も注入した。第二実験においては、単量体Ｈｉｓ6−ＺEGFRおよび二量体Ｈｉｓ6−（ＺEGFR）2ポリペプチドバインダーを速度分析に供し、このタンパク質を０.００６２５μＭ〜１２.８μＭの範囲の濃度、３０μｌ／分の流速でＥＧＦＲ−ＥＣＤ表面に注入した。解離平衡定数（ＫD）、結合速度定数（ｋa）、および解離速度定数（ｋD）は、１対１の結合を前提としてＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．２ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて算出した。第二実験については、サンプルを無作為順に二連で泳動し、各々の注入後に１０ｍＭ ＨＣｌを注入することによってフローセルを再生させた。バイオセンサーランキング分析の結果を表１および図４に示す。表１では、ＢＩＡｃｏｒｅにおけるバイオセンサー分析による、一価および二価のＥＧＦＲ−ＥＣＤ結合ポリペプチドバインダーの速度パラメータの比較を行っている。二量体ＥＧＦＲ結合ポリペプチド構築物は、以前にＳｔｅｆｆｅｎ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２０，２３９−２４８に記載されたように遺伝子複製ストラテジーを通じて作製し、生成および親和性精製を行った。追加のポリペプチド、ＺEGFR:1239（ＺEGFR:955の配列類縁体として同定した）は、追加のクローンの配列決定後に加え、その単量体としての能力に関するデータを開示している。４つのＨｉｓ6−ＺEGFRポリペプチドバインダーは、解離平衡定数から、以下のような親和性ランクになった：Ｈｉｓ6−ＺEGFR:1239 ＜ Ｈｉｓ6−ＺEGFR:955 ＜ Ｈｉｓ6−ＺEGFR:948 ＜ Ｈｉｓ6−ＺEGFR:942。
【００９７】
【表１】
【００９８】
このインビトロ結合分析からは、４つ全てのＥＧＦＲ結合ポリペプチドがかなり高い親和性でＥＧＦＲに結合したこと、およびそれらは結合速度論的特性において程度相違することが確認できる。
【００９９】
図４Ａは、精製されたＨｉｓ6−（ＺEGFR:942）2（四角）、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2（三角）、およびＨｉｓ6（ＺEGFR:955）2（丸）バリアントをアミン結合型ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（黒塗りの四角／三角／丸）またはＨＥＲ２−ＥＣＤ（白塗りの四角／三角／丸）を含むセンサーチップフローセル表面に注入した後に得られたセンサーグラムの結果を示す。これは、三つのＨｉｓ6−ＺEGFRバリアント（Ｈｉｓ6−ＺEGFR:942、Ｈｉｓ6−ＺEGFR:948、およびＨｉｓ6−ＺEGFR:955）がＥＧＦＲ−ＥＣＤを固定したフローセル表面に特異的に結合するが、ＨＥＲ２−ＥＣＤを固定したフローセル表面に対する結合は見られないことを示している。
【０１００】
図４Ｂは、一価（薄い線）および二価（濃い線）のＥＧＦＲ結合ポリペプチドをＥＧＦＲ−ＥＣＤフローセル表面に注入した後に得られたセンサーグラムの結果を示す。このダイアグラムは、一価と二価のＥＧＦＲ結合ポリペプチドの間でオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の違いが示された三つの候補バインダーを示しており、アビディティ効果による見かけ上の親和性の向上が主に第二世代クローンにおいてより遅いオフレートを獲得することによって達成されたことを証明している。
【０１０１】
細胞培養
以下のフルオロフォア標識ＦＡＣＳおよび共焦点顕微鏡研究のために、細胞あたり約２×１０6のＥＧＦＲを発現することが公知のヒト上皮癌細胞Ａ４３１（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、および１％抗生剤−抗真菌剤、全てＧｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＢ）製、を補充したＥＭＥＭ培地を含む補完培地（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）中で培養した。この細胞を、５％ ＣＯ2を含む加湿空気下、３７℃で培養した。
【０１０２】
フルオロフォア標識
Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:942）2、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2、およびＨｉｓ6−（ＺEGFR:955）2ポリペプチドバインダーを、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８マレイミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、（Ｃ末端に）導入したシステインに対して直接標識した。およそ１ｍｇのＨｉｓ6−（ＺEGFR）2ポリペプチドバインダーをＰＢＳに再懸濁し、３７℃で４５分間、２０ｍＭ ＤＴＴで還元した。余分なＤＴＴは、ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ（商標）−５サイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって除去した。Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８マレイミドの１０ｍＭ溶液を２０倍モル過剰加え、室温で２時間、暗所にて継続的に震盪させた。ＰＢＳに対して十分な透析を行い過剰なフルオロフォアを除去した。試験中のフルオロフォア標識ポリペプチドバインダーの濃度および標識率を、製造元のプロトコルに従い２８０および４９６ｎｍにおける吸光度測定値を用いる計算により確認した。標識ポリペプチドバインダーは、Ｐｈａｓｔ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｐｈａｓｔｇｅｌ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ２０％ゲルによっても分析した。
【０１０３】
ＦＡＣＳ
ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥストリーム−イン−エアフローサイトメトリー機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。レーザーは、４８８ｎｍ用フローサイトメトリーアラインメントビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてアラインメントを行った。サンプルには、空冷アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）を照射した。１００００細胞からの蛍光、前方散乱光、および側方散乱光をおよそ３００イベント ｓ-1の速度で検出した。フローサイトメトリーデータは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。フローサイトメトリー分析の前に、およそ実験３日前にペトリ皿に播種した細胞をトリプシン処理した（０.２５％トリプシン、３７℃、１０分間）。この細胞を遠心分離（５８２ｇ、３分間）し、そのペレットをＰＢＳ＋１％ ＢＳＡに再懸濁し、９６ウェルプレートにて１ウェルあたり約３０００００細胞のアリコートに分けた。この細胞を、１０μｇ／ｍｌフルオロフォア標識Ｈｉｓ6−（ＺEGFR）2ポリペプチドバインダーと共に氷上で約３０分間インキュベートした。遠心分離およびＰＢＳ＋１％ ＢＳＡによる洗浄後、細胞ペレットを３００μｌ ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡに再懸濁し、フローサイトメトリー分析に供した。ＥＧＦＲに対する結合能を有さない類似の（Ｈｉｓ6タグ型二量体構築物）ポリペプチドをネガティブコントロールとして使用した。
【０１０４】
これらの研究の結果を図５に示す。具体的には、図５は、Ａ４３１細胞上のネイティブＥＧＦＲに対する３つの候補バインダー（Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:942）2、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:955）2）に対する親和性のランキングを示すフローサイトメトリー分析を示す。ネガティブコントロールとして使用した無関係のＺバリアント分子（白色）はヒストグラムの最も左に位置した。次に３つのＺEGFRバインダーは、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:942）2（薄灰色）＜Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2（灰色）＜Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:955）2（黒色）の順で位置した。これらのデータは、ＺEGFR:955が、ＢＩＡｃｏｒｅにおいては幾分乏しい親和性であったにも関わらず、このアッセイは細胞上のネイティブＥＧＦＲへの結合に基づくものであるために、３つの中で最良の候補であり得ることを示唆している。
【０１０５】
共焦点顕微鏡
実験前日に、３０ｍｍペトリ皿あたりおよそ３０００００個のＡ４３１細胞を播種した。試験中のＨｉｓ6−（ＺEGFR:942）2、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2、およびＨｉｓ6−（ＺEGFR:955）2ポリペプチドバインダーを、完全ＥＭＥＭ培地中およそ１０μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、別のペトリ皿に入れ、３７℃で２時間、暗所にてインキュベートした。試験中の３つのポリペプチドバインダーはまた、上記と同様に無血清ＥＭＥＭ培地に希釈し、別のペトリ皿に入れ、氷上で１時間、暗所にてインキュベートした。インキュベーション後、細胞を通常の培地で一回洗浄し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ５ Ｐａｓｃａｌ；Ｚｅｉｓｓ）を用いる画像分析のために少量の培地を加えた。細胞の厚みを網羅するよう連続スキャンを行い、細胞の中央に対応するスキャンを選択した。ネガティブコントロールとして、ＥＧＦＲに対する親和性を有さない類似ポリペプチドを同じ方法で分析した。
【０１０６】
共焦点顕微鏡の結果を図６に示す。具体的には、図６は、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ標識Ｈｉｓ6−ＺEGFRポリペプチドに、Ａ）氷上で１時間およびＢ）３７℃で２時間暴露したＡ４３１細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。左から右に向かって、Ｈｉｓ6-（ＺEGFR:942）2、Ｈｉｓ6-（ＺEGFR:948）2、およびＨｉｓ6-（ＺEFGR:955）2で、（Ａ）においては細胞膜に結合したものおよび（Ｂ）においては細胞内に取り込まれたものが見られる。この結果は、３つのＥＧＦＲ結合ポリペプチドが、予想通り、細胞膜に結合するようであること、および３７℃においては細胞内取込みが起こるようであることを実証している。
【０１０７】
細胞培養
以下の放射能標識、特異性および飽和研究のために、細胞を、７５ｃｍ2培養ボトルおよび２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）において培養した。標識法には、125Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、酢酸（Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、クロラミン−Ｔ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、およびＮ−スクシニミジル−４−［トリ−メチルスタンニル］ベンゾエート（当研究室にて合成）を使用した。ＮＡＰ−５カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）をゲル濾過に利用した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（０.２５／０.０２％）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｋｇ）によって引き離し、セルカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｚ２，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）で計数した。放射活性は、ガンマカウンター（１４８０ Ｗｉｚａｒｄ，Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。ＥＧＦＲリッチな扁平上皮癌細胞Ａ４３１株（ＡＴＣＣ，ＣＬＲ １５５５，Ｒｏｃｋｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用した。細胞を、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｋｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＥＳＴ（ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）、および１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｋｇ）を補充したＨａｍ'ｓ Ｆ−１０培地（「完全培地」）中で培養した。細胞を、５％ ＣＯ2で平衡化した加湿空気を含む３７℃のインキュベーター内で培養した。
【０１０８】
放射能標識
ポリペプチドバインダーＺEGFR:942、ＺEGFR:948、およびＺEFGR:955の二量体を、Ｎ−スクシニミジル基を通じて間接的に125Ｉ標識した。酢酸（２μｌ、ｍｉｌｌｉ−Ｑ中０.１％酢酸）およびＮ−スクシニミジル−４−［トリ−メチルスタンニル］ベンゾエート（５μｌ、メタノール中５％酢酸）を125Ｉ（１５ ＭＢｑ）に加えた。１０μｌクロラミン−Ｔを加えることによってＮ−スクシニミジル−４−［トリ−メチルスタンニル］ベンゾエートにヨウ素を結合させた。次いで、この溶液を３０秒間再懸濁し、室温で５分間さらにインキュベートした。反応を停止するため、メタ重亜硫酸ナトリウム１５μｌを添加した。このポリペプチドバインダーをホウ酸緩衝液に希釈し、ヨウ素溶液を加え、追加のホウ酸緩衝液を加えて総量１５０μｌとし、この溶液を３０分間インキュベートした。標識ポリペプチドバインダーバインダーを低分子量化合物から分離するため、ＰＢＳで平衡化させたＮＡＰ−５カラムを使用した。
【０１０９】
特異性試験
Ａ４３１細胞を２４ウェルプレートで培養し、無血清Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１０培地で一回洗浄した。試験する３つの二量体ポリペプチドバインダーを125Ｉで標識し、利用可能な受容体数に関しておよそ１０：１のモル過剰で細胞に加え、３７℃で４時間インキュベートした。いくつかのウェルにおいては、非特異的結合を測定するため、無関係のポリペプチドバインダー（およそ５００：１モル過剰）を、［125Ｉ］ポリペプチドバインダーと共に加えた。ＥＧＦ（およそ２００：１モル過剰）およびセツキシマブ（５００：１モル過剰）も、このポリペプチドバインダーがＥＧＦおよびセツキシマブと同じ結合部位を有するかどうかを調査するためであるが、同じ方法で使用した。次いで細胞を無血清Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１０培地で６回洗浄し、０.５ｍｌトリプシン−ＥＤＴＡを加えることによって引き離し、３７℃で３０分間または細胞が引き離されるまでインキュベートした。Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１０完全培地１ｍｌを加え、細胞を再懸濁した。いくつかのウェルにおいては、０.５ｍｌ懸濁物を使用して細胞を計数した。放射活性（計数した細胞について、それぞれ、１.５ｍｌおよび１ｍｌ）はガンマカウンターで測定した。
【０１１０】
その結果を図７に示す。具体的には、図７には、［125Ｉ］（Ｚ００９４２）2（４２*）、［125Ｉ］（Ｚ００９４８）2（４８*）、および［125Ｉ］（Ｚ００９５５）2（５５*）の細胞結合が示されている。これらのデータは、ＢＩＡｃｏｒｅ分析においては（ＺEGFR:942）2が最高の親和性を示すという事実があるにも関わらず、ＺEFGR:955が細胞上のネイティブＥＧＦＲの最良のバインダーのようであり、ＺEGFR:948およびＺEGFR:942がそれに続くということを示した、これらのバインダーの以前のＦＡＣＳランキングからの予想外の結果を支持するものである。さらに、３つのＥＧＦＲ結合ポリペプチド構築物は、重複するエピトープに結合するようである。さらに、これらは全て、天然リガンドＥＦＧおよびモノクローナル抗体セツキシマブと同じ結合部位で競合するようである。
【０１１１】
飽和アッセイ
親和性定数を決定するため、ポリペプチドバインダーの結合の飽和を測定した。ＥＧＦＲリッチな細胞株であるＡ４３１を２４ウェルプレートにて培養した。細胞を氷上で維持し、冷やした無血清Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１０培地で一回洗浄した。125Ｉ標識ポリペプチド二量体バインダーの連続希釈物を調製し、およそ１０：１モル過剰で細胞に加えた。この細胞を、インキュベーターからの空気を細胞プレートと共にプラスチックバッグ内に捕捉する環境下、氷上でゆっくり動かしながら４時間インキュベートした。非特異的結合の概算のために、各濃度ごとに、およそ３００：１モル過剰で非標識ポリペプチドバインダーを含むブロックコントロールを作製した。次いで、細胞を冷やしたＨａｍ'ｓ Ｆ１０無血清培地で６回洗浄し、０.５ｍｌトリプシン−ＥＤＴＡを加えることによって細胞を引き離し、３７℃で３０分間または細胞が引き離されるまでインキュベートした。Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１０完全培地１ｍｌを加え、細胞を再懸濁した。いくつかのウェルにおいては、０.５ｍｌ懸濁物を使用して細胞を計数した。放射活性はガンマカウンターで測定した。これらのデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４で分析した。
【０１１２】
その結果を図８に示す。具体的には、図８には、［125Ｉ］Ｚ００９４２（Ａ）、［125Ｉ］Ｚ００９４８（Ｂ）、および［125Ｉ］Ｚ００９５５（Ｃ）の飽和研究の結果が示されている。３つの値の平均値および標準偏差が示されている。
【０１１３】
実施例２
本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの二次選択
材料および方法
菌株およびベクター
アンバーサブレッサー大腸菌ＲＲＩΔＭ１５株（Ｒｕｅｔｈｅｒ，Ｕ．（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，５７６５−７２）を、ライブラリの構築のために、ファージの産生およびクローニング手順のための宿主細胞として使用した。ファージミドベクターｐＡｆｆｉ１をライブラリの構築に使用し、これについては他の文献に記載されている（Ｇｒｏｅｎｗａｌｌ Ｃ，Ｊｏｎｓｓｏｎ Ａ，Ｌｉｎｄｓｔｒｏｅｍ Ｓ，Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ Ｅ，Ｓｔａｈｌ Ｓ，Ｈｅｒｎｅ Ｎ：“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｆｆｉｂｏｄｙ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６）ｉｎ ｐｒｅｓｓ，Ｅｐｕｂ ２７ Ｓｅｐ ２００６）。選択されたクローンのファージミドインサートは、カナマイシン耐性を付与する遺伝子と共に、Ｔ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，６０−８９）、ヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ6）タグをコードするＤＮＡフラグメント、およびマルチクローニングサイトを含む発現ベクターｐＡＹ４４２にサブクローニングした。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、発現ベクターからのタンパク質産生に使用した。
【０１１４】
二次ファージミドライブラリの構築
親和性成熟のストラテジーは、ＥＧＦＲ結合分子の一次選択からの４つの配列のアラインメント（実施例１、図２）に基づき決定した。二次ライブラリは、プロテインＺのヘリックス１および２をコードする、特定の縮重コドンを含む単一の１２９ヌクレオチドテンプレートオリゴヌクレオチド（５' ｃｔｃ ｇａｇ ｇｔａ ｇａｃ ａａｃ ａａａ ｔｔｃ ａａｃ ａａａ ｇａａ ｎｎｋ ｎｎｋ ｎｎｋ ｇｃｇ ｎｎｋ ｎｎｋ ｇａｇ ａｔｃ ｍｒｙ ｍｒｙ ｔｔａ ｃｃｔ ａａｃ ｔｔａ ａａｃ ｇｇｔ ｔｇｇ ｃａａ ａｔｇ ａｃｃ ｇｃｃ ｔｔｃ ａｔｃ ｇｃｇ ａｇｔ ｔｔａ ｋｙｔ ｇａｔ ｇａｃ ｃｃａ ａｇｃ ｃａａ ａｇｃ ３'）からのＰＣＲ増幅により作製した。この遺伝子フラグメントを、９５の並行して行う反応の各々についてのテンプレートオリゴヌクレオチド１ｐｍｏｌと共に、フォワードプライマー５'−ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｔｃｇａｇｇｔａｇａｃａａｃａａａｔｔｃａａ−３'（下線はＸｈｏＩ部位）およびリバースプライマー５'−ｃｃｃｃｃｃｔｇｃｔａｇｃａａｇｔｔａｇｃｇｃｔｔｔｇｇｃｔｔｇｇｇｔｃａｔｃ−３'（下線はＮｈｅＩ部位）を用いて増幅した。増幅は、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、１５サイクル（９６℃で１５秒、６０℃で１５秒、および７２℃で１分）で行い、これをプールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、ＸｈｏＩ／ＮｈｅＩで消化し、そしてプロテインＺの第三の非異型（ｎｏｎｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）のαヘリックスをコードするＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ消化したファージミドベクターｐＡｆｆｉ１にライゲートした。ライゲートしたライブラリベクターを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：２１ ｖ／ｖ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出した。２５００Ｖ、１２５Ω、および５０μＦのＥＣＭ ６３０セット（ＢＴＸ，Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）において、０.２ｃｍギャップサイズのキュベットを用いて、エレクトロコンピテントな大腸菌ＲＲＩΔＭ１５細胞を、３０アリコートのライゲート物質により形質転換した。細胞を、ＳＯＣ培地（１％グルコース、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＳＯ4、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、および２.５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌを補充したトリプトンソイブロス（ＴＳＢ）＋酵母エキス（ＹＥ））中、３７℃で約１時間培養し、各々２％グルコースおよび２５μｇ／ｍｌカルベニシリンを補充したＴＳＢ １ｌを含む６つのエルレンマイヤーフラスコに移し、３７℃で一晩培養した。この細胞を６０００ｇで遠心分離（１５分間、４℃）し、およそ２０％グリセロールの終濃度になるようＰＢＳ／グリセロール溶液に再懸濁し、アリコートに分け、そして−８０℃で保存した。
【０１１５】
ファージ選択手順
約１００ｋＤａのＥＧＦＲの組換え細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤと表記する）を、選択時の標的タンパク質として使用した（１０９５−ＥＲ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。ＥＧＦＲ−ＥＣＤを、ＥＺ−ＬｉｎｋＴＭ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いてインビトロでビオチニル化した。２０倍モル過剰のビオチンを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.２）中のＥＧＦＲ−ＥＣＤに加え、この混合物を室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした後、ＰＢＳに対して４℃で一晩（ＯＮ）十分な透析を行い、余分なビオチンを除去した。
【０１１６】
ライブラリからのおよび選択間のファージストックの調製は、以前に記載された手順（Ｎｏｒｄ，Ｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，７７２−７７７；Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，２３７−２５２）に従い、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降により、約１０13ファージ形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌのファージ価を得た。選択は溶液中で行い、結合したファージをストレプトアビジンコートした常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）で捕捉した。非特異的なバインダーを回避するため、全てのチューブを、５％ウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０.１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）（ＰＢＳＴ−５％ ＢＳＡ）で事前に処理しておいた。さらにストレプトアビジンコートした常磁性ビーズ上に存在するストレプトアビジンに対するバインダーを回避するため、選択の最初の２ラウンドにおいてファージストックを含むＰＢＳＴ−３％ ＢＳＡ約１ｍｌを、０.２ｍｇのビーズと共にプレインキュベートした（３０分、上下逆さ回転）。
【０１１７】
標的濃度１００ｎＭから始める４ラウンドのバイオパニングは以下の通りに行った。第１ラウンドにおいて、およそ１０12 ｐｆｕを含むライブラリのアリコートを、ＰＢＳＴ−３％ ＢＳＡ中１００ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤ １ｍｌ中、継続的に回転させながらＲＴで１時間、その後に４℃で約７２時間インキュベートした。第２ラウンドについては５０ｎＭ、および第３ラウンドについては１ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤをそれぞれ含むＰＢＳＴ−３％ ＢＳＡ １ｍｌを、前のラウンドからのファージストックの一部と共にインキュベートした（１時間、ＲＴ、連続的に上下逆さ回転）。結合したファージを、ストレプトアビジンコートしたＭ−２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓと共に１５分間インキュベート（ＲＴ、連続的に上下逆さ回転）することによって捕捉した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって予め決定した（データは示さず）、ビーズ１ｍｇあたり約２μｇの標的タンパク質を固定できる量のビーズを加えた。第４ラウンドにおいては、以下の表２に詳述されるような、６つの若干異なる選択プロトコルを行った。プロトコル４−Ａおよび４−Ｂにおいては、それぞれ、０.０１ｎＭおよび０.１ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤを、前のラウンドからのファージストックの一部と共にＲＴで２時間インキュベートした後、１００倍過剰のＥＧＦＲ−ＥＣＤと共にＲＴで１時間インキュベートし、ストレプトアビジンコートビーズと共に１５分間インキュベートすることによって結合したファージを捕捉し、１８回洗浄し、１００倍過剰の第一世代ＥＧＦＲバインダーＺ００９４２、Ｚ００９４８、およびＺ００９５５（実施例１）と共にＲＴで１時間インキュベートし、最後に２回洗浄した。プトロコル４−Ｃにおいては、０.５ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤを、前のラウンドからのファージストックの一部と共にＲＴで２時間インキュベートした後、ストレプトアビジンコートビーズと共に１５分間インキュベートすることによって結合したファージを捕捉し、１８回洗浄し、１００倍過剰の第一世代ＥＧＦＲバインダーと共にＲＴで１時間インキュベートし、最後に２回洗浄した。プトロコル４−Ｄおよび４−Ｅにおいては、それぞれ、０.１および０.５ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤを、前のラウンドからのファージストックの一部と共に３７℃で２時間インキュベートした後、１００倍過剰のＥＧＦＲ−ＥＣＤと共に３７℃で１時間インキュベートし、ストレプトアビジンコートビーズと共に１５分間インキュベートすることによって結合したファージを捕捉し、１８回洗浄し、１００倍過剰の第一世代ＥＧＦＲバインダーと共に３７℃で１時間インキュベートし、最後に２回洗浄した。プトロコル４−Ｆにおいては、０.１ｎＭのビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤを、前のラウンドからのファージストックの一部と共にＲＴで２時間インキュベートした後、ストレプトアビジンコートビーズと共に１５分間インキュベートすることによって結合したファージを捕捉し、２０回洗浄した。洗浄工程の回数は、選択手順の間２０回洗浄で固定し、ＰＢＳＴを用いた最後の洗浄を除く全ての洗浄工程において、ＰＢＳＴ−３％ ＢＳＡ中で行った。ファージを５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２.１）５００μｌを用いて１０分間溶出させ、次いで直ちに５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０および４５０μｌ ＰＢＳを加えることによって中性にした。溶出したファージを使用して、３７℃で３０分間、対数増殖期のＲＲＩΔＭ１５細胞を感染させた。感染細胞懸濁物を、２％グルコースおよび１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補充したＴＹＥ寒天プレート（１５ｇ／ｌ寒天、３ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌトリプトン、および５ｇ／ｌ酵母エキス）に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。成長したコロニーを、５ｇ／ｌ酵母エキス、２％グルコース、および１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補充したトリプティックソイブロス（ＴＳＢ、３０ｇ／ｌ；Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）への再懸濁により回収し、フラクション（溶出後のファージ価と比較して約５００倍過剰の細胞）を接種に使用し、次世代のファージストックを得た。ファージミド粒子を、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を用いて感染細胞から回収し、精製し、ＰＧＥ沈降によって濃縮した。選択プロセスは、各選択前および溶出後のファージストックを滴定することによって監視した。ＲＴで５分間、ファージの連続希釈物で対数増殖期のＲＲＩΔＭ１５細胞を感染させた後、２％グルコースおよび１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補充したＴＹＥ寒天プレートにプレーティングし、３７℃でＯＮした。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
第二世代バインダーのＥＬＩＳＡベースのランキング
単一のコロニーを、ディープウェルプレート（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｄｅｎｍａｒｋ）中の、１００μｍｏｌ／ｌイソプロピル−Ｌ−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した１ｍｌ ＴＳＢ−ＹＥ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。３０００ｇで１０分間の遠心分離により細胞をペレット化した。このペレットを３００μｌ ＰＢＳＴに再懸濁し、−８０℃で一晩凍結させた。このサンプルを解凍し、３５００ｇで２０分間遠心分離した。ＡＢＤタグが付加されたＺバリアント分子を含む上清（１００μｌ）を、４℃でＯＮ、１５ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ2ＣＯ3および３５ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９.６）中６μｇ／ｍｌのＨＡＳ（Ａ−３７８２；Ｓｉｇｍａ）で予めコーティングしておいたマイクロタイターウェルに移し、ＲＴで１時間、ＰＢＳＴ中２％脱脂粉乳でブロッキングした（絶えず震盪）。このプレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、ウェルあたり８.４μｇ／ｍｌビオチニル化ＥＧＦＲ−ＥＣＤ ５０μｌを加え、１.５時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した後、ウェルあたり５０μｌのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（１：５０００，ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を加え、１時間インキュベートした。このウェルを４回洗浄し、各ウェルに現像溶液ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＴＭＢ基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ）５０μｌを加えた。３０分後、各ウェルに反応停止溶液（２Ｍ Ｈ2ＳＯ4）１００μｌを加えた。Ｔｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１２０】
ＤＮＡ配列決定および配列クラスタリング
ファージミド（ｐＡｆｆｉ１）インサートのＤＮＡ配列決定は、第４ラウンドのパニング由来の１８７個のＥＧＦＲ結合クローンにおいて行った。特異的なプライマーおよびＢｉｇ Ｄｙｅターミネーター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、Ｓａｎｇｅｒフラグメントを、ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）において分析した。サブクローニングしたＤＮＡフラグメントを同じ手順で検証した。ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの配列は、Ｏｒｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６，４３３９−４８（２００６））によりより詳細に記載されているいわゆる平均連結階層クラスター法（ａｖｅｒａｇｅ−ｌｉｎｋ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いてクラスター化した。
【０１２１】
前節に記載されたＥＬＩＳＡスクリーンにおいてＥＧＦＲに対する結合性を示した候補ポリペプチドの推定アミノ酸配列は、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例である。これらを図１においておよび配列表において配列番号１７４〜３０９として示す。各々のこのような結合ポリペプチドの対応するＥＧＦＲ結合モチーフの配列は、図１においておよび配列表において配列番号１１〜１４６として示す。
【０１２２】
ＢｉａｃｏｒｅによるＥＧＦＲ結合ポリペプチドのスクリーニング
ＥＬＩＳＡ用に調製したファージｐＡｆｆｉベクターから生成されたＡＢＤタグが付加されたＺバリアントを含む細胞上清を、バイオセンサー分析にも供した。ＥＬＩＳＡにより良好な結合性が示された５４個のクローン由来の上清を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器におけるリアルタイム生体分子間特異的相互作用により分析した。標的タンパク質ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４.５に希釈）を、製造元の指示に従い、アミンカップリングによって、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）の一つのフローセル表面のカルボキシル化デキストラン層に固定（約１２００ＲＵ）した。別のフローセル表面を、参照表面として使用するために活性化および不活性化し、ＨＳＡを、発現されたＡＢＤタグＺバリアントの量のコントロールとして使用するため、別のＣＭ５センサーチップのフローセル表面に固定した。実施例１の第一世代ＥＧＦＲバインダー（Ｚ００９５５）2も、コントロールとして泳動した。
【０１２３】
ＤＮＡ構築物
異なる第二世代ＥＧＦＲ結合性Ｚバリアント（ＺEGFR）のバリアントをコードするＤＮＡフラグメントを発現ベクターｐＡＹ４４２にサブクローニングした。このフラグメントを、３'および５'の両方にＡｃｃＩオーバーハングを導入する特異的プライマーを用いてｐＡｆｆｉ１ベクターから増幅し、予め同じ酵素で切断しておいたｐＡＹ４４２ベクターにライゲートし、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて脱リン酸化した。増幅したＤＮＡフラグメントをＱＩＡｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いるライゲーションの前にハイブリダイズさせた。このライゲーションにより、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）による精製のためにＮ末端Ｈｉｓ6タグに融合された異なるＺバリアントを、Ｔ７プロモーターの制御下でコードする発現ベクターを得た。両方のベクターから、第二のＺバリアントの遺伝子フラグメントをｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌで導入したＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントの二量体構築物を構築し、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR）2バリアントを得た。全てのプラスミドの調製は、形質転換した大腸菌細胞を一晩培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を製造元の指示に従い用いて行った。
【０１２４】
タンパク質の発現および精製
選択されたＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株においてｐＡＹ４４２プラスミドからＨｉｓ6−タグ融合タンパク質として発現させた。５ｇ／ｌ酵母（ＴＳＢ＋ＹＥ）および５０ｍｇ／ｌカナマイシンを補充したＴＳＢ培地（３０ｇ／ｌトリプティックソイブロス）２５ｍｌに細胞を接種し、震盪フラスコ中、３７℃で培養した。５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む新鮮なＴＳＢ＋ＹＥにプレカルチャーを接種してＯＤ600を約０.０６とし、バッチ発酵槽中、３７℃で３時間培養し、終濃度が０.５ｍＭになるまでイソプロピル−Ｌ−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ａｐｏｌｌｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ，Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ＵＫ）を加えることによって遺伝子の発現を誘導した。５時間の培養後、細胞を遠心分離（１５０００ｇ、２０分間）により収集した。細胞ペレットを一晩凍結し、解凍し、変性緩衝液（７Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０）に再懸濁した。ＲＴで３０分間インキュベートした後、細胞を２５０００ｇで１５分間遠心分離し、上清由来の変性タンパク質を変性緩衝液（７Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６.３）に希釈し、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。結合したタンパク質を、尿素緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ４.５）で溶出させた。このタンパク質をＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）で溶出させた。この単量体タンパク質を、以降、ＺEGFR:no（ｐＡＹ４４２ベクター）と称し、二量体タンパク質を（ＺEGFR:no）2（ｐＡＹ４４２ベクター）と称する。タンパク質濃度は、各タンパク質に適した消衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度測定値から算出した。このタンパク質の純度および正確な分子量を確認するため、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＨＰＬＣ−ＭＳ（ＨＰＬＣ−ＭＳ １１００；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて泳動させた。この精製タンパク質をＣＤによりさらに分析し、１６個のＥＧＦＲ結合性ＺバリアントのＣＤスペクトルをＪａｓｃｏ−８１０分光偏光計を用いて記録した。全ての構築物をＰＢＳで希釈して終濃度を０.５ｍｇ／ｍｌとし、各サンプル２００μｌを１ｍｍキュベットに入れ、２０℃、１９５〜２５０ｎｍでスキャンした。熱安定性は、２２０ｎｍの固定波長で、２０〜９０℃の温度勾配を適用することによって試験した。融点を、タンパク質の５０％がアンフォールドする温度と定義し、熱アンフォールディングスペクトルから解析した。選択されたＺEGFRバリアントのタンパク質濃度はまた、アミノ酸分析（Ａｍｉｎｏｓｙｒａａｎａｌｙｓｃｅｎｔｒａｌｅｎ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によっても決定した。
【０１２５】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析
選択されたＺバリアントと標的タンパク質の間のリアルタイム生体分子間特異的相互作用（ＢＩＡ）のためにＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４.５に希釈）を、製造元の指示に従い、アミンカップリングによって、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）の一つのフローセル表面のカルボキシル化デキストラン層に固定（約２４００ＲＵ）した。別のフローセル表面を、参照表面として使用するために活性化および不活性化し、ＨＥＲ２−ＥＣＤ（Ｈｏｒａｋ ｅｔ ａｌ，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０，６０３−１３）（Ｇｒｅｇ Ａｄａｍｓ氏，Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，ＰＡの御好意により拝受した）およびＥｒｂＢ３／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，３４８−ＲＢ）を、ネガティブコントロールとして使用するため、別のＣＭ５センサーチップのフローセル表面に固定した。全てのＺバリアントサンプルを、泳動緩衝液ＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３.４ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７.４）に希釈した後に２５℃で結合アッセイを行った。第一実験においては、各Ｚバリアント５００ｎＭ（ＨＢＳに希釈）を、全ての表面に対して３０μｌ／分の流速で注入した。第一世代ＥＧＦＲ結合分子（（ＺEGFR:955）2；実施例１）もまた、コントロールとして注入した。各々の注入後、１０μｌの１０ｍＭ ＨＣｌの注入によってフローセルを再生した。
【０１２６】
第二実験においては、５つの選択された単量体ＺEGFRバリアントをさらに速度分析に供し、このタンパク質を６.２５ｎＭ〜５００ｎＭの範囲の濃度、５０μｌ／分の流速でＥＧＦＲ−ＥＣＤ表面に注入した。解離平衡定数（ＫD）、結合速度定数（ｋa）、および解離速度定数（ｋd）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．２ソフトウェア（Ｂｉａｃｏ
ｒｅ）を用いて算出した。サンプルは二連で泳動し、各々の注入後に１０μｌの１０ｍＭ ＨＣｌを注入することによってフローセルを再生させた。
【０１２７】
免疫蛍光染色
Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｗｗｗ．ｅｃａｃｃ．ｏｒｇ．ｕｋ）から入手したＡ４３１細胞株を、提供元により推奨された培地中、５％ＣＯ2環境下、３７℃で培養した。この培地は、この細胞株の提供元により推奨された濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むものであった（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）。サブコンフルエントな細胞をＰＢＳで一回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｃａｍｂｒｅｘ）で引き離し、完全成長培地に再懸濁した。８ウェルのマルチウェルスライド（Ｈｉｓｔｏｌａｂ）の各ウェルあたりおよそ１００００細胞を含む２０μｌを加え、一晩インキュベートした。翌朝に、細胞を、新しく調製したＰＢＳ中３％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳで二回洗浄した。この細胞を２０μｌ／ウェルのＺバリアントＨｉｓ6−Ｚ０１８５９、Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６５、Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６４、Ｈｉｓ6−Ｚ０１８７７、Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６８、Ｈｉｓ6−Ｚ０１９１３、Ｈｉｓ6−Ｚ０１８３６、Ｈｉｓ6−（Ｚ０１９０７）2−Ｃｙｓ、およびＨｉｓ6−（Ｚ０１９５３）2−Ｃｙｓ（２〜１０μｇ／ｍｌ）で１時間、または１μｇ／ｍｌマウス抗ＥＧＦＲ抗体（Ａｂｃａｍ，ｎｏ．ａｂ３０）で染色した。Ｚバリアントで染色したスライドをＰＢＳで洗浄し、５μｇ／ｍｌ抗ヤギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と混合したＺに対するヤギ抗体（当研究室にて調製）と共に１時間インキュベートした。抗体で染色したスライドはＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に１時間インキュベートした。この第二インキュベーション工程の後、スライドを再度ＰＢＳで洗浄した。この抗体スライドを、１μｇ／ｍｌの濃度のＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）２０μｌで１０〜２０秒間対比染色し、再度洗浄した。全てのスライドを乾燥させて、退色防止試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をマウントし、膜の蛍光を、Ｌｅｉｃａ ＤＣカメラ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を装備したＤＭ−ＬＡ顕微鏡を用いて分析した。画像は、ＩＭ１０００ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて獲得した。
【０１２８】
免疫組織化学染色
Ａ４３１異種移植組織を、以下に記載される生体内分布研究から獲得した。腫瘍を液体窒素中で瞬間凍結させ、Ｌｊｕｎｇ ＣＭ３０００全自動クリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて６μｍ厚の凍結切片を作製した。この切片を新しく調製したＰＢＳ中３％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳで二回洗浄した。この切片を、５μｇ／ｍｌの濃度のＨｉｓ6−（Ｚ０１８６４）2−ＣｙｓまたはＨｉｓ6−Ｚ０１８７７で、１／４０希釈、およそ６μｇ／ｍｌのＨｉｓ6−（Ｚ０１９０７）2−ＨＲＰまたはＨｉｓ6−（Ｚ０１８５３）2−ＨＲＰで１時間染色した。Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８６４）2−ＣｙｓおよびＨｉｓ6−Ｚ０１８７７を、Ｚに対するヤギ抗体（当研究室で調製）およびそれに続く５μｇ／ｍｌウサギ抗ヤギＨＲＰで検出した。ポジティブコントロールとして、一つのスライドを３μｇ／ｍｌ抗ＥＧＦＲ抗体（Ａｂｃａｍ，ｎｏ．ａｂ２４３０）で染色し、洗浄し、ウサギＥｎｖｉｓｉｏｎ ＨＲＰ（Ｄａｋｏ，ｎｏ．Ｋ４００２）で検出した。ＨＲＰ染色サンプルをＰＢＳで一回洗浄した後、ＤＡＢ色素原基質（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と共に７分間インキュベートし、その後にＰＢＳで洗浄し、Ｍａｙｅｒｓ ＨＴＸ（Ｈｉｓｔｏｌａｂ）で２０秒間対比染色した。スライドにＭｏｕｎｔ−ｑｕｉｃｋ（Ｈｉｓｔｏｌａｂ）をマウントした。このスライドを、Ｌｅｉｃａ ＤＣカメラ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を装備したＤＭＬＡ顕微鏡で分析した。画像は、ＩＭ１０００ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて獲得した。
【０１２９】
111Ｉｎ標識ＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントの結合特異性および生体内分布
放射活性測定
放射活性は、３インチＮａＩ（Ｔｌ）検出器を備える全自動ガンマカウンター（１４８０ ＷＩＺＡＲＤ，Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて測定した。ＩＴＬＣストリップ上の放射活性の分布は、Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｙｓｔｅｍにおいて測定し、ＯｐｔｉＱｕａｎｔ（商標）画像分析ソフトウェアを用いて分析した。
【０１３０】
ｐ−ＳＣＮ−ベンジル−ＤＴＰＡとＺバリアントの結合および複合体の111Ｉｎ標識
イソチオシアネート−ベンジル−ＤＴＰＡとＺEGFRバリアントの結合は、Ｍｉｒｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．１９９０；１：５９−６５）により記載された方法に従い、１：１のキレート剤 対 タンパク質のモル比を用いて行った。簡単に説明すると、ＺバリアントのＰＢＳ溶液３００μｌを新しく調製した０.０７Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９.２中イソチオシアネート−ベンジル−ＤＴＰＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）４３μｌと混合した。その総量を０.０７Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８.５〜９.０）により５００μｌになるよう調整した後、その混合物を約３０秒間ボルテックスし、次いで３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を、製造元の指示に従い０.２Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５.３で予め平衡化させておいたＮＡＰ−５サイズ排除カラムにおいて精製した（高分子量フラクションは０.９ｍｌであった）。その溶出液をボルテックスした後、Ｚバリアント複合体５０μｇを含むフラクションをさらなる標識のために取り置き、残りの溶液を凍結させた。
【０１３１】
標識のために、複合体５０μｇを既定量の111Ｉｎ（１８ＭＢｑ）と混合し、室温で６０分間インキュベートした。ベンジル−ＤＴＰＡ−Ｚ０１９０８複合体に対しては、このＺバリアントの濃度の高さとのバランスをとるため、酢酸緩衝液３７μｌを加えた。
【０１３２】
標識の品質管理のために、０.２Ｍクエン酸で溶離させるＩＴＬＣを使用した。この系において、放射能標識Ｚバリアントは出発点から動かず、遊離のインジウムは溶媒の先頭と共に移動し、111Ｉｎ−イソチオシアネート−ＤＴＰＡ複合体は、Ｒfが０.４であった。標識複合体はＮＡＰ−５カラムにおいて精製し（高分子フラクションは０.９ｍｌであった）、その獲得物をＩＴＬＣにおいて純度検査した。
【０１３３】
111Ｉｎ標識複合体のＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞に対する結合特異性
標識複合体を、１つのＥＧＦＲ受容体（１つのＡ４３１細胞あたり１.５×１０6個の受容体）あたり１つの標識複合体の比となるよう計算して、２つのペトリ皿グループ（１グループあたり３皿）に加えた。一方のグループの皿は、標識複合体を加える１０分前に、１００倍過剰の非標識Ｚバリアントで事前に飽和させておいた。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、インキュベーション培地を回収した。細胞皿を冷やしておいた無血清培地で６回洗浄し、３７℃で１０分間、トリプシン−ＥＤＴＡ ０.５ｍｌで処理した。細胞が引き離されたら、全ての皿に完全培地０.５ｍｌを加え、細胞を再懸濁した。細胞懸濁物を放射活性測定のために回収した。細胞に結合した放射活性（Ｃ）は、全自動ガンマカウンターにおいて、対応するインキュベーション培地（Ｍ）１ｍｌと並行して測定した。細胞に結合した添加放射活性のフラクションを、％結合放射活性＝Ｃ×１００％／（Ｃ＋Ｍ）として算出した。
【０１３４】
動物腫瘍モデル
本動物研究は、動物研究に関する内部倫理委員会の承認を受けた。雌の非近交Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（到着時１０〜１２週齢）をインビボ実験に使用した。この動物を１週間の間、標準的な食事、睡眠、および環境を与えてＲｕｄｂｅｃｋ研究所の動物飼育施設に順応させた後、腫瘍移植を行った。マウスには、食物および飲料水を自由に与えた。Ａ４３１腫瘍は、右後肢から約１０7細胞の皮下（ｓ．ｃ．）注射により移植した。異種移植片を２週間の間成長させた。
【０１３５】
生体内分布研究
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの生体内分布は、インジウム−１１１標識ＥＧＦＲ Ｚバリアント複合体の４ｈ ｐｉ（ｓｃ）のＡ４３１腫瘍保有Ｂａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）系マウスにおいて評価した。マウスは、全ての生体内分布実験において、注射後（ｐｉ）４時間時点でのケタミンＨＣｌ（Ｋｅｔａｌａｒ，Ｐｆｉｚｅｒ）およびキシラジンＨＣｌ（Ｒｏｍｐｕｎ；Ｂａｙｅｒ）の混合物（体重１グラムあたり溶液２０μｌ；Ｋｅｔａｌａｒ−１０ｍｇ／ｍｌ，Ｒｏｍｐｕｎ−１ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内注射により麻酔した。その後、希釈したヘパリン（５０００ ＩＥ／ｍｌ，Ｌｅｏ Ｐｈａｒｍａ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ製）でリンスした１ｍｌシリンジで心臓を穿刺することにより、マウスを安楽死させた。血液、肺、肝臓、脾臓、結腸、腎臓、子宮、唾液腺、筋肉、皮膚、骨、および腫瘍の器官サンプルを収集し、秤量し、ガンマカウンターで放射活性を測定した。腸（内容物含む）は総器官として測定し、秤量しなかった。器官の取り込み値を、組織１グラムあたりのパーセント注入活性（％ ＩＡ／ｇ）として算出した。全ての実験において、マウスを、各グループあたり４匹の動物となるよう無作為にグループ分けした。
【０１３６】
結果
第一世代ＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントの親和性成熟
ＥＧＦＲ結合分子の初期セットに基づく親和性成熟ライブラリ（実施例１）を設計および構築した。３つの最良のバインダーの配列および実施例１におけるさらなる配列分析からの第４の配列のアラインメントを行った。５箇所（２４、２５、２７、２８、および３２）を固定すること、ならびに１７および１８位においてはＮおよびＲに、３５位においてはＳおよびＶに一定のバイアスをかけることが合理的であると判断した（図２Ｄ）。従って、９、１０、１１、１３、および１４位を、ＮＮＧ／Ｔ縮重コドンを用いる無作為化の標的とした（図２Ｄ）。プロテインＺはサイズが小さいので、二次ライブラリを構築するために、Ｚドメインのヘリックス１および２をコードする、縮重コドンを有する単一の１２９ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用することが可能であった。このオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅し、その後にプロテインＺの第三αヘリックスをコードするファージミドベクターにライゲートした。得られたライブラリは、約１×１０9のメンバーからなるものであり、理論上のバリアントの大部分を十分含んでいたと考えられる。ファージストックを調製し、基本的に以前に記載されたように、漸減濃度の標的タンパク質の使用および十分な洗浄、ならびに過剰な非ビオチニル化標的タンパク質による速いオフレートを有するバインダーの再結合のブロックおよび第一世代バインダー（実施例１）と生成された第二世代バインダーの競合により、ライブラリの中で最強のＥＧＦＲ結合バリアントを選択するための選択を行った。
【０１３７】
４ラウンドの選択後に獲得したクローンを９６ウェルプレートにて培養し、凍結−解凍により周辺質内容物を遊離させ、ＥＧＦＲ結合活性についてのＥＬＩＳＡスクリーニング手順に供した。３７２個の無作為抽出したクローンをＥＬＩＳＡスクリーニングに供したところ、大部分のクローンが、標的タンパク質との結合の良さを示す高い吸光値を示した。最も高い吸光値を有するクローンの中から１８６個のクローンをＤＮＡ配列決定に供し、配列決定したクローンのクラスタリングによって、選択されたクローン間の関係を可視化した。
【０１３８】
さらに、ＥＧＦＲに対する最高の結合性および最も遅いオフレートを有するクローンを選択するため、５４個のクローンについて、ＡＢＤタグを付加したＺタンパク質を含む周辺質内容物のバイオセンサー分析スクリーニングを行った（データは示さず）。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡスクリーニングにおける値、ＤＮＡ配列決定からのクラスタリングの結果、およびバイオセンサー分析スクリーニングに基づき、１６個のクローン、すなわち、Ｚ０１８３６、Ｚ０１８４８、Ｚ０１８５３、Ｚ０１８５９、Ｚ０１８６４、Ｚ０１８６５、Ｚ０１８６８、Ｚ０１８７７、Ｚ０１８８７、Ｚ０１８８８、Ｚ０１９０５、Ｚ０１９０７、Ｚ０１９０８、Ｚ０１９１３、Ｚ０１９１７、およびＺ０１９６０をさらなる特徴付けのために選択した（図１および配列表を参照のこと）。実質的に全てのバインダーが≧１.０ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶性であることが示され、かつ２０７および２２０ｎｍでの最大吸収と共に、遠紫外スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）での特徴的なα−ヘリックス形のＣＤスペクトルを示した。融点は、熱アンフォールドスペクトルから解析し、実質的に全てのバインダーについて５０℃またはそれ以上であることを決定した。熱変性後に記録されたスペクトルは、α−ヘリックス構造への完全な再フォールディングを示した。
【０１４０】
バイオセンサースクリーニング
結合親和性の初期ランキングを獲得するため、１６個の選択されたＺバリアントならびに単量体および二量体ＺEGFR:955（実施例１）を発現させ、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を用いてそれらのＥＧＦＲ結合性について分析した。様々なＺEGFRバリアントを、標的タンパク質ＥＧＦＲ−ＥＣＤならびにコントロールタンパク質ＨＥＲ２−ＥＣＤおよびＦｃ融合型ＨＥＲ３をそれぞれ固定したセンサーチップフローセル表面に個別に注入した。１６個全てのバインダーについて、低ナノモル範囲の結合親和性を観察した（データは示さず）。ほとんどのバインダーはＨＥＲ２−ＥＣＤおよびＦｃ融合型ＨＥＲ３に対する非特異的結合を示さなかった。最高の親和性およびバイオセンサー分析からのオフレンジ（ｏｆｆ−ｒａｎｇｅ）を有する５個のバインダー、すなわち、Ｚ０１８５３、Ｚ０１８６８、Ｚ０１８７７、Ｚ０１９０７、およびＺ０１９０８をさらなる特徴付けのために選択した。
【０１４１】
インビトロでの第一世代バインダーと第二世代バインダーの比較
親和性成熟を行ったＺ０１８５３、Ｚ０１８６８、Ｚ０１８７７、Ｚ０１９０７、およびＺ０１９０８（ＫD 約１０ｎＭ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて、単量体（ＫD 約１８５ｎＭ）および二量体（ＫD 約５０ｎＭ）形態のＺ００９５５と比較した（図９）。親和性成熟を行ったＺバリアントの結合速度は、単量体および二量体の第一世代バインダーとほぼ同じであった。しかし、解離速度は約２０倍改善された。
【０１４２】
蛍光および免疫組織化学分析
図１０にその結果を示す。図１０Ａは、ＥＧＦＲに特異的な以下のＺバリアント：ａ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８５９、ｂ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６５、ｃ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６４、ｄ）、Ｈｉｓ6−Ｚ０１９１３、ｅ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８７７、ｆ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８６８、ｇ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８３６、ｈ）Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８５３）2−ｃｙｓ、およびｉ）Ｈｉｓ6−（Ｚ０１９０７）2−ｃｙｓにより染色されたＡ４３１細胞を示す。単量体Ｚバリアントは、Ｚに対するヤギ抗体およびそれに続くＡｌｅｘａ ４８８結合型抗ヤギ抗体による検出により検出した。二量体ＺバリアントはＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎで染色した。ポジティブコントロールとして、Ａ４３１を抗ＥＧＦＲ抗体で染色した（ｊ）。
【０１４３】
図１０Ｂは、ａ）Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８６４）2−Ｃｙｓ、ｂ）Ｈｉｓ6−Ｚ０１８７７、ｃ）Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８５３）2−Ｃｙｓ、およびｄ）Ｈｉｓ6−（Ｚ０１９０７）2−Ｃｙｓで染色したＡ４３１異種移植片の凍結切片を示す。Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８６４）2−ＣｙｓおよびＨｉｓ6−Ｚ０１８７７（ａおよびｂ）は、Ｚに対するヤギ抗体およびそれに続くＨＲＰ結合型抗ヤギ抗体による検出により検出した。Ｈｉｓ6−（Ｚ０１８５３）2−Ｃｙｓ （ｃ）およびＨｉｓ6−（Ｚ０１９０７）2−Ｃｙｓ （ｄ）分子は、直接ＨＰＲに結合した。ポジティブコントロールとして、Ａ４３１を抗ＥＧＦＲ抗体で染色した（ｅ）。
【０１４４】
111Ｉｎ標識ＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントの特異性および生体内分布
全てのＺバリアント複合体において、９０％超の標識率でインジウム−１１１標識することに成功し、ＮＡＰ−５精製の後の全ての複合体は９５％超の純度を有していた。
【０１４５】
標識複合体の結合特異性は、ＥＧＦＲを発現する類表皮癌細胞Ａ４３１株において評価した。その結果を図１１に示す。この図における全てのデータ点は３つの測定の平均値であり、エラーバーはＳＥＭを表す。全ての複合体の結合は、１００倍過剰の非標識ＺEGFRの添加によりその取り込みをブロックすることが可能であった（ｐ＜０.０００１）ことから、ＥＧＦＲ特異的であることが見出された（図１１を参照のこと）。
【０１４６】
Ａ４３１腫瘍保有マウスにおける４ｈ ｐｉのインジウム−１１１標識Ｚバリアント複合体の生体内分布の結果を図１２にまとめた。この図における各データ点は４匹の動物の平均±標準偏差を表し、器官または組織１グラムあたりの注射した放射活性の割合で表す。111Ｉｎ−ＣＨＸ−ＤＴＰＡ−（ＺEGFR:955）2についてのデータは、Ａｆｆｉｂｏｄｙ
ＡＢ（ＶＩＮＮＯＶＡ）とのコラボレーションによりＥｒｉｋａ Ｎｏｒｄｂｅｒｇ氏（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が獲得したものであり、これを比較のために加えた。
【０１４７】
インビボでの腫瘍標的化は成功し、５つ全ての新規のＺバリアントは４〜６％ＩＡ／ｇのレベルにあったが、非成熟型二量体（４％ＩＡ／ｇ）との比較では改善が見られなかった。
【０１４８】
第一世代の二量体（Ｚ００９５５）2と全ての成熟型単量体との間の主な違いは、血液クリアランス、肝臓取込み、および腎臓蓄積において観察することができ：成熟実験において選択された新規単量体は、（Ｚ００９５５）2よりも、放射活性の血液クリアランスが高く、肝臓取込みが低く、腎臓蓄積が高かった。これらの観察は：新規単量体が、マウス受容体に対する交差反応性の低さおよび／または受容体への一価的な結合に起因して、肝臓のＥＧＦＲ受容体に対する結合性が弱く、これにより細胞内取込みが誘発されず、結合が可逆的であることと関係がある可能性が高い。
【０１４９】
実施例３
本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの第三選択
実施例２からの選択結果の統計学的分析に基づき、推定ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの第三ライブラリを、本質的に上記と同様に調製した。標的としてＥＧＦＲを用いるファージディスプレイ選択および選択されたバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニングにより、１７個の追加のＥＧＦＲ結合性Ｚバリアント配列を同定した。これらのアミノ酸配列を図１および配列表において配列番号３１０〜３２６として示す。これらのＥＧＦＲ結合性Ｚバリアントの推定ＥＧＦＲ結合モチーフは、図１および配列表において配列番号１４７〜１６３として示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１−１】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−２】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−３】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−４】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−５】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−６】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−７】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−８】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−９】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−１０】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図１−１１】本発明のＥＧＦＲ結合ポリペプチドに含まれるＥＧＦＲ結合モチーフの例（配列番号１〜１６３）、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドの例（配列番号１６４〜３２６）、黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢのプロテインＺ誘導体（配列番号３２７）、ヒトＥＧＦＲ全体（配列番号３２８）、およびヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号３２９）のアミノ酸配列表である。
【図２Ａ】実施例１において選択された本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドのアミノ酸配列をプロテインＺ配列と比較して示す。この図は、塩基性、酸性、非極性、および極性のアミノ酸残基を示す。
【図２Ｂ】図２Ａの中の４つのポリペプチドのアミノ酸配列を示しかつ疎水性、中性、および親水性のアミノ酸残基を示す。
【図２Ｃ】図２Ｂのポリペプチドのアミノ酸配列を、その他の特徴を強調して示す。
【図２Ｄ】本発明に従うポリペプチドを生成するための親和性成熟ストラテジーを示す。
【図３】ＥＧＦＲ結合ポリペプチドＨｉｓ6−ＺEGFR:942（レーン１）、Ｈｉｓ6−ＺEGFR:948（レーン２）、Ｈｉｓ6−ＺEGFR:955（レーン３）、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:942）2（レーン４）、Ｈｉｓ6−（ＺEGFR:948）2（レーン５）、およびＨｉｓ6−（ＺEGFR:955）2（レーン６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーンＭはマーカータンパク質を含む。右側には分子量をキロダルトンで付記してある。
【図４Ａ】本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いて行ったバイオセンサー結合研究の結果を示す。
【図４Ｂ】本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いて行ったバイオセンサー結合研究の結果を示す。
【図５】本発明に従う３つのＥＧＦＲ結合ポリペプチドのネイティブＥＧＦＲに対する親和性のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図６】フルオロフォア標識した本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドに暴露した細胞の共焦点顕微鏡画像集である。
【図７】放射能標識した本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いた細胞結合研究の結果を示すダイアグラムである。
【図８Ａ】放射能標識した本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いた飽和および研究の結果を示すグラフ集である。
【図８Ｂ】放射能標識した本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いた飽和および研究の結果を示すグラフ集である。
【図８Ｃ】放射能標識した本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いた飽和および研究の結果を示すグラフ集である。
【図９Ａ】本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いて行ったバイオセンサー結合研究の結果を示す。
【図９Ｂ】本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドを用いて行ったバイオセンサー結合研究の結果を示す。
【図１０Ａ】蛍光検出を用いた、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドに暴露した細胞の画像集である。
【図１０Ｂ】酵素検出を用いた、本発明に従うＥＧＦＲ結合ポリペプチドに暴露した細胞の画像集である。
【図１１】Ａ４３１細胞における、本発明に従う様々なＥＧＦＲ結合ポリペプチドのインジウム−１１１標識ベンジル−ＤＴＰＡ複合体のインビトロ特異性試験の結果を示すダイアグラムである。全てのデータ点は３つの測定値の平均値であり、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図１２】Ａ４３１異種移植片を保有するマウスにおける111Ｉｎ−ベンジル−ＤＴＰＡ−ＥＧＦＲ結合性複合体の生体内分布および腫瘍対正常組織比を示すダイアグラム集である。各データ点は４匹の動物からの平均±標準偏差であり、器官または組織１グラムあたりの注射した放射活性のパーセントで表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＮＸ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25ＳＬＸ28Ｄ
［配列中、相互に独立して、
Ｘ2はＭ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、およびＳから選択され；
Ｘ3はＷ、Ｄ、Ｅ、およびＬから選択され；
Ｘ4はＩ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、およびＷから選択され；
Ｘ6はＷ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、およびＳから選択され；
Ｘ7はＤ、Ｅ、Ｎ、およびＫから選択され；
Ｘ10はＲ、Ｇ、Ｈ、およびＫから選択され；
Ｘ11はＤ、Ｎ、Ｅ、Ｙ、およびＳから選択され；
Ｘ17はＧ、Ｗ、およびＡから選択され；
Ｘ18はＷ、Ｇ、およびＡから選択され；
Ｘ20はＭ、Ｌ、Ｆ、Ａ、およびＥから選択され；
Ｘ21はＴ、Ｄ、Ｎ、Ａ、およびＱから選択され；
Ｘ25はＡ、Ｓ、Ｎ、Ｇ、およびＬから選択され；そして
Ｘ28はＬ、Ｗ、Ｖ、Ｆ、およびＡから選択される］
ならびに
ｉｉ）ｉ）において規定される配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる上皮成長因子受容体結合モチーフ、ＥＢＭを含み、最大１０μＭの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ2がＭである、請求項１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ3がＷである、請求項１または２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ4がＩ、Ｖ、Ｇ、およびＳから選択される、請求項１〜３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ6がＶおよびＷから選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ10がＲおよびＧから選択される、請求項１〜５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ11がＤ、Ｎ、およびＥから選択される、請求項１〜６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項８】
Ｘ17がＷおよびＧから選択される、請求項１〜７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項９】
Ｘ18がＷおよびＧから選択される、請求項１〜８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｘ18がＷである、請求項９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１１】
Ｘ20がＭである、請求項１〜１０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１２】
Ｘ21がＴおよびＤから選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１３】
Ｘ21がＴである、請求項１２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１４】
Ｘ25がＡ、Ｓ、およびＮから選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１５】
Ｘ28がＬおよびＷから選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１６】
Ｘ18がＷであり、Ｘ21がＴである、請求項１〜１５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｘ18がＷであり、Ｘ20がＭである、請求項１〜１６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１８】
アミノ酸配列ｉ）が以下の９つの条件Ｉ〜ＩＸ：
Ｉ） Ｘ2がＭである；
ＩＩ） Ｘ3がＷである；
ＩＩＩ） Ｘ6がＷである；
ＩＶ） Ｘ10がＲである；
Ｖ） Ｘ17がＧである；
ＶＩ） Ｘ18がＷである；
ＶＩＩ） Ｘ20がＭである；
ＶＩＩＩ） Ｘ21がＴである；
ＩＸ） Ｘ28がＬである、
の少なくとも６つを満たす、請求項１〜１７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列ｉ）が９つの条件Ｉ〜ＩＸの少なくとも７つを満たす、請求項１８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸配列ｉ）が９つの条件Ｉ〜ＩＸの少なくとも８つを満たす、請求項１９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸配列ｉ）が
ＥＭＷＸ4ＡＷＸ7ＥＩＲ Ｘ11ＬＰＮＬＮＧＷＱＭ ＴＡＦＩＸ25ＳＬＬＤ
である、請求項２０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２２】
アミノ酸配列ｉ）が以下の５つの条件Ｖ〜ＶＩＩＩおよびＸ：
Ｖ） Ｘ17がＧである；
ＶＩ） Ｘ18がＷである；
ＶＩＩ） Ｘ20がＭである；
ＶＩＩＩ） Ｘ21がＴである；
Ｘ） Ｘ25がＡである、
の少なくとも３つを満たす、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２３】
アミノ酸配列ｉ）が５つの条件Ｖ〜ＶＩＩＩおよびＸの少なくとも４つを満たす、請求項２２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２４】
アミノ酸配列ｉ）が
ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＮＧＷＱＭ ＴＡＦＩＡＳＬＸ28Ｄ
である、請求項２３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２５】
アミノ酸配列ｉ）が
ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＧ Ｘ11ＬＰＮＬＮＷＧＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25ＳＬＷＤ
である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２６】
アミノ酸配列ｉ）が
ＥＸ2Ｘ3ＩＡＶＸ7ＥＩＧ ＥＬＰＮＬＮＷＧＱＸ20 ＤＡＦＩＮＳＬＷＤ
である、請求項２５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２７】
アミノ酸配列ｉ）が配列番号１〜１６３から選択される、請求項１〜２６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２８】
アミノ酸配列ｉ）が配列番号３３、配列番号４８、配列番号５７、配列番号８７、配列番号８８、および配列番号１４７から選択される、請求項２７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２９】
ＥＧＦＲ結合モチーフが３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、請求項１〜２８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３０】
ＥＧＦＲ結合モチーフが、主として、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内の二つのアルファヘリックスおよびそれらを結ぶループの一部を形成する、請求項２９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３１】
３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、細菌受容体タンパク質のドメインから選択される、請求項３０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３２】
３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのドメインまたはその誘導体のドメインから選択される、請求項３１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３３】
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；および
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
から選択されるアミノ酸配列を含み、［ＥＢＭ］は請求項１〜２８のいずれか一項に規定されるＥＧＦＲ結合モチーフである、請求項３２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号３２７のアミノ酸配列：
ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
に由来するアミノ酸配列を含み、その配列の９〜１１、１３〜１４、１７〜１８、２４〜２５、２７〜２８、３２、および３５位、またはこれらの位置に対応する位置のいずれかまたは全てにおいて、非修飾型アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してＥＧＦＲに対するそのポリペプチドの結合性を向上させるアミノ酸置換を含むことによって得られるアミノ酸配列を含み、最大１０μＭの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、ＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３５】
アミノ酸配列が、以下：
ｉｉｉ） 配列番号１６４〜３２６から選択される；
ｉｖ） 配列番号１６４〜３２６から選択される配列に対して８５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列である、
から選択される定義の一つを満たす配列を含む、ＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３６】
アミノ酸配列が、以下：
ｖ） 配列番号１９６、配列番号２１１、配列番号２２０、配列番号２５０、配列番号２５１、および配列番号３１０から選択される
ｖｉ） 配列番号１９６、配列番号２１１、配列番号２２０、配列番号２５０、配列番号２５１、および配列番号３１０から選択される配列に対して８５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列である、
から選択される定義の一つを満たす配列を含む、請求項３５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３７】
Ｃ末端および／またはＮ末端アミノ酸が伸長された、請求項１〜３６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３８】
アミノ酸伸長または各アミノ酸伸長がこのポリペプチドによるＥＧＦＲへの結合を増強する、請求項３７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３９】
アミノ酸伸長または各アミノ酸伸長が、ポリペプチドの生成、精製、インビボもしくはインビトロでの安定性、結合、または検出を向上させる、請求項３７または３８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４０】
伸長部分が、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体のドメインを含み、治療用途におけるＥＧＦＲ結合ポリペプチドの半減期を向上させる、請求項３９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４１】
最大１×１０-6Ｍの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、請求項１〜４０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４２】
最大１×１０-7Ｍの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、請求項４１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４３】
ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する、請求項１〜４２のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号３２９に対応するＥＧＦＲの細胞外ドメインの一部に結合する、請求項４３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドのフラグメントを含む、ＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４６】
フラグメントが請求項１〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチドのＮ末端短縮を含む、請求項４５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４７】
Ｎ末端短縮が４アミノ酸以下である、請求項４６に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４８】
アミノ酸配列が同一または異なる少なくとも二つのＥＧＦＲ結合ポリペプチド単量体単位を含む、多量体形態の、請求項１〜４７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４９】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチド単量体単位が共有結合により一緒に結合されている、請求項４８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項５０】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチド単量体単位が融合タンパク質として発現される、請求項４９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項５１】
二量体形態の、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５３】
請求項５２に記載のポリヌクレオチドを発現させることを含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項５４】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび検出剤の組み合わせ。
【請求項５５】
検出剤が、放射線イメージングにおいて使用するための放射性物質である、請求項５４に記載の組み合わせ。
【請求項５６】
放射性物質が放射性核種である、請求項５５に記載の組み合わせ。
【請求項５７】
検出剤が酵素である、請求項５４に記載の組み合わせ。
【請求項５８】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび治療剤の組み合わせ。
【請求項５９】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび検出剤または治療剤が共有結合により一緒に結合されている、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項６０】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび検出剤または治療剤が融合タンパク質として発現される、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項６１】
請求項５４〜６０のいずれか一項に記載の組み合わせを放射線イメージング剤として使用する、放射線イメージング方法。
【請求項６２】
ＥＧＦＲを含む疑いのあるサンプルを準備し、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせとサンプルを接触させ、サンプル中のＥＧＦＲの存在を示すポリペプチドまたは組み合わせへの結合を検出することを含む、ＥＧＦＲの検出方法。
【請求項６３】
請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせとサンプルを接触させることを含み、それによってＥＧＦＲがポリペプチドに結合し、これをサンプルから除去することができる、サンプルからのＥＧＦＲの分離または捕捉方法。
【請求項６４】
被検体または被検体由来のサンプルを、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせと接触させ、ポリペプチドまたは組み合わせへの結合を検出することを含む、哺乳動物被検体におけるＥＧＦＲの存在を決定するための診断方法。
【請求項６５】
被検体がヒトである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
インビボで行われる、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
サンプルに対してインビトロで行われる、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６８】
哺乳動物被検体または哺乳動物被検体由来の物質を請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５８〜６０のいずれかに記載の組み合わせで処置する、哺乳動物被検体または哺乳動物被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに関連する状態の処置方法。
【請求項６９】
被検体のまたは被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは組み合わせの結合が、受容体の活性化を阻害または刺激する、請求項６８に記載の処置方法。
【請求項７０】
被検体のまたは被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ結合ポリペプチドの結合が、細胞のシグナル伝達を阻害する、請求項６８または６９に記載の処置方法。
【請求項７１】
ＥＧＦＲに関連する状態が癌である、請求項６８〜７０のいずれかに記載の処置方法。
【請求項７２】
癌が、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、頭頸部癌から選択される、請求項７１に記載の処置方法。
【請求項７３】
被検体がヒトである、請求項６８〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
医薬として使用するための、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項７５】
医薬として使用するための、請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項７６】
診断剤として使用するための、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項７７】
診断剤として使用するための、請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項７８】
癌のインビボ診断のための診断剤の製造のための、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせの使用。
【請求項７９】
癌の処置のための医薬の製造のための、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせの使用。
【請求項１】
ｉ）ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＮＸ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25ＳＬＸ28Ｄ
［配列中、相互に独立して、
Ｘ2はＭ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、およびＳから選択され；
Ｘ3はＷ、Ｄ、Ｅ、およびＬから選択され；
Ｘ4はＩ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｎ、Ｄ、およびＷから選択され；
Ｘ6はＷ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、およびＳから選択され；
Ｘ7はＤ、Ｅ、Ｎ、およびＫから選択され；
Ｘ10はＲ、Ｇ、Ｈ、およびＫから選択され；
Ｘ11はＤ、Ｎ、Ｅ、Ｙ、およびＳから選択され；
Ｘ17はＧ、Ｗ、およびＡから選択され；
Ｘ18はＷ、Ｇ、およびＡから選択され；
Ｘ20はＭ、Ｌ、Ｆ、Ａ、およびＥから選択され；
Ｘ21はＴ、Ｄ、Ｎ、Ａ、およびＱから選択され；
Ｘ25はＡ、Ｓ、Ｎ、Ｇ、およびＬから選択され；そして
Ｘ28はＬ、Ｗ、Ｖ、Ｆ、およびＡから選択される］
ならびに
ｉｉ）ｉ）において規定される配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる上皮成長因子受容体結合モチーフ、ＥＢＭを含み、最大１０μＭの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ2がＭである、請求項１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ3がＷである、請求項１または２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ4がＩ、Ｖ、Ｇ、およびＳから選択される、請求項１〜３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ6がＶおよびＷから選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ10がＲおよびＧから選択される、請求項１〜５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ11がＤ、Ｎ、およびＥから選択される、請求項１〜６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項８】
Ｘ17がＷおよびＧから選択される、請求項１〜７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項９】
Ｘ18がＷおよびＧから選択される、請求項１〜８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｘ18がＷである、請求項９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１１】
Ｘ20がＭである、請求項１〜１０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１２】
Ｘ21がＴおよびＤから選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１３】
Ｘ21がＴである、請求項１２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１４】
Ｘ25がＡ、Ｓ、およびＮから選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１５】
Ｘ28がＬおよびＷから選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１６】
Ｘ18がＷであり、Ｘ21がＴである、請求項１〜１５のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｘ18がＷであり、Ｘ20がＭである、請求項１〜１６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１８】
アミノ酸配列ｉ）が以下の９つの条件Ｉ〜ＩＸ：
Ｉ） Ｘ2がＭである；
ＩＩ） Ｘ3がＷである；
ＩＩＩ） Ｘ6がＷである；
ＩＶ） Ｘ10がＲである；
Ｖ） Ｘ17がＧである；
ＶＩ） Ｘ18がＷである；
ＶＩＩ） Ｘ20がＭである；
ＶＩＩＩ） Ｘ21がＴである；
ＩＸ） Ｘ28がＬである、
の少なくとも６つを満たす、請求項１〜１７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列ｉ）が９つの条件Ｉ〜ＩＸの少なくとも７つを満たす、請求項１８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸配列ｉ）が９つの条件Ｉ〜ＩＸの少なくとも８つを満たす、請求項１９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸配列ｉ）が
ＥＭＷＸ4ＡＷＸ7ＥＩＲ Ｘ11ＬＰＮＬＮＧＷＱＭ ＴＡＦＩＸ25ＳＬＬＤ
である、請求項２０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２２】
アミノ酸配列ｉ）が以下の５つの条件Ｖ〜ＶＩＩＩおよびＸ：
Ｖ） Ｘ17がＧである；
ＶＩ） Ｘ18がＷである；
ＶＩＩ） Ｘ20がＭである；
ＶＩＩＩ） Ｘ21がＴである；
Ｘ） Ｘ25がＡである、
の少なくとも３つを満たす、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２３】
アミノ酸配列ｉ）が５つの条件Ｖ〜ＶＩＩＩおよびＸの少なくとも４つを満たす、請求項２２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２４】
アミノ酸配列ｉ）が
ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＮＧＷＱＭ ＴＡＦＩＡＳＬＸ28Ｄ
である、請求項２３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２５】
アミノ酸配列ｉ）が
ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＧ Ｘ11ＬＰＮＬＮＷＧＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25ＳＬＷＤ
である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２６】
アミノ酸配列ｉ）が
ＥＸ2Ｘ3ＩＡＶＸ7ＥＩＧ ＥＬＰＮＬＮＷＧＱＸ20 ＤＡＦＩＮＳＬＷＤ
である、請求項２５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２７】
アミノ酸配列ｉ）が配列番号１〜１６３から選択される、請求項１〜２６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２８】
アミノ酸配列ｉ）が配列番号３３、配列番号４８、配列番号５７、配列番号８７、配列番号８８、および配列番号１４７から選択される、請求項２７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項２９】
ＥＧＦＲ結合モチーフが３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、請求項１〜２８のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３０】
ＥＧＦＲ結合モチーフが、主として、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内の二つのアルファヘリックスおよびそれらを結ぶループの一部を形成する、請求項２９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３１】
３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、細菌受容体タンパク質のドメインから選択される、請求項３０に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３２】
３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのドメインまたはその誘導体のドメインから選択される、請求項３１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３３】
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；および
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＥＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
から選択されるアミノ酸配列を含み、［ＥＢＭ］は請求項１〜２８のいずれか一項に規定されるＥＧＦＲ結合モチーフである、請求項３２に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号３２７のアミノ酸配列：
ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
に由来するアミノ酸配列を含み、その配列の９〜１１、１３〜１４、１７〜１８、２４〜２５、２７〜２８、３２、および３５位、またはこれらの位置に対応する位置のいずれかまたは全てにおいて、非修飾型アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してＥＧＦＲに対するそのポリペプチドの結合性を向上させるアミノ酸置換を含むことによって得られるアミノ酸配列を含み、最大１０μＭの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、ＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３５】
アミノ酸配列が、以下：
ｉｉｉ） 配列番号１６４〜３２６から選択される；
ｉｖ） 配列番号１６４〜３２６から選択される配列に対して８５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列である、
から選択される定義の一つを満たす配列を含む、ＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３６】
アミノ酸配列が、以下：
ｖ） 配列番号１９６、配列番号２１１、配列番号２２０、配列番号２５０、配列番号２５１、および配列番号３１０から選択される
ｖｉ） 配列番号１９６、配列番号２１１、配列番号２２０、配列番号２５０、配列番号２５１、および配列番号３１０から選択される配列に対して８５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列である、
から選択される定義の一つを満たす配列を含む、請求項３５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３７】
Ｃ末端および／またはＮ末端アミノ酸が伸長された、請求項１〜３６のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３８】
アミノ酸伸長または各アミノ酸伸長がこのポリペプチドによるＥＧＦＲへの結合を増強する、請求項３７に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項３９】
アミノ酸伸長または各アミノ酸伸長が、ポリペプチドの生成、精製、インビボもしくはインビトロでの安定性、結合、または検出を向上させる、請求項３７または３８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４０】
伸長部分が、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体のドメインを含み、治療用途におけるＥＧＦＲ結合ポリペプチドの半減期を向上させる、請求項３９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４１】
最大１×１０-6Ｍの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、請求項１〜４０のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４２】
最大１×１０-7Ｍの相互作用のＫD値でＥＧＦＲに結合する、請求項４１に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４３】
ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する、請求項１〜４２のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号３２９に対応するＥＧＦＲの細胞外ドメインの一部に結合する、請求項４３に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドのフラグメントを含む、ＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４６】
フラグメントが請求項１〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチドのＮ末端短縮を含む、請求項４５に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４７】
Ｎ末端短縮が４アミノ酸以下である、請求項４６に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４８】
アミノ酸配列が同一または異なる少なくとも二つのＥＧＦＲ結合ポリペプチド単量体単位を含む、多量体形態の、請求項１〜４７のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項４９】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチド単量体単位が共有結合により一緒に結合されている、請求項４８に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項５０】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチド単量体単位が融合タンパク質として発現される、請求項４９に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項５１】
二量体形態の、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５３】
請求項５２に記載のポリヌクレオチドを発現させることを含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項５４】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび検出剤の組み合わせ。
【請求項５５】
検出剤が、放射線イメージングにおいて使用するための放射性物質である、請求項５４に記載の組み合わせ。
【請求項５６】
放射性物質が放射性核種である、請求項５５に記載の組み合わせ。
【請求項５７】
検出剤が酵素である、請求項５４に記載の組み合わせ。
【請求項５８】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび治療剤の組み合わせ。
【請求項５９】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび検出剤または治療剤が共有結合により一緒に結合されている、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項６０】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび検出剤または治療剤が融合タンパク質として発現される、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項６１】
請求項５４〜６０のいずれか一項に記載の組み合わせを放射線イメージング剤として使用する、放射線イメージング方法。
【請求項６２】
ＥＧＦＲを含む疑いのあるサンプルを準備し、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせとサンプルを接触させ、サンプル中のＥＧＦＲの存在を示すポリペプチドまたは組み合わせへの結合を検出することを含む、ＥＧＦＲの検出方法。
【請求項６３】
請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせとサンプルを接触させることを含み、それによってＥＧＦＲがポリペプチドに結合し、これをサンプルから除去することができる、サンプルからのＥＧＦＲの分離または捕捉方法。
【請求項６４】
被検体または被検体由来のサンプルを、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせと接触させ、ポリペプチドまたは組み合わせへの結合を検出することを含む、哺乳動物被検体におけるＥＧＦＲの存在を決定するための診断方法。
【請求項６５】
被検体がヒトである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
インビボで行われる、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
サンプルに対してインビトロで行われる、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６８】
哺乳動物被検体または哺乳動物被検体由来の物質を請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５８〜６０のいずれかに記載の組み合わせで処置する、哺乳動物被検体または哺乳動物被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに関連する状態の処置方法。
【請求項６９】
被検体のまたは被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは組み合わせの結合が、受容体の活性化を阻害または刺激する、請求項６８に記載の処置方法。
【請求項７０】
被検体のまたは被検体由来の物質におけるＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ結合ポリペプチドの結合が、細胞のシグナル伝達を阻害する、請求項６８または６９に記載の処置方法。
【請求項７１】
ＥＧＦＲに関連する状態が癌である、請求項６８〜７０のいずれかに記載の処置方法。
【請求項７２】
癌が、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、頭頸部癌から選択される、請求項７１に記載の処置方法。
【請求項７３】
被検体がヒトである、請求項６８〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
医薬として使用するための、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項７５】
医薬として使用するための、請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項７６】
診断剤として使用するための、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチド。
【請求項７７】
診断剤として使用するための、請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項７８】
癌のインビボ診断のための診断剤の製造のための、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせの使用。
【請求項７９】
癌の処置のための医薬の製造のための、請求項１〜５１のいずれかに記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは請求項５４〜６０のいずれかに記載の組み合わせの使用。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図１−７】
【図１−８】
【図１−９】
【図１−１０】
【図１−１１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図１−７】
【図１−８】
【図１−９】
【図１−１０】
【図１−１１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５１９０１３（Ｐ２００９−５１９０１３Ａ）
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３７１４（Ｐ２００８−５４３７１４）
【出願日】平成１８年１２月５日（２００６．１２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１６６９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６５６３５
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（３０７０１５２８６）アフィボディ・アーベー (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月５日（２００６．１２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１６６９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６５６３５
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（３０７０１５２８６）アフィボディ・アーベー (9)
【Ｆターム（参考）】
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