マイクロチャンバープレート及びその製造方法
【課題】リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、定温酵素反応、又はＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）に要求される多数個のマイクロチャンバー内部に溶液が蒸発されることを防止し、溶液を容易に注入して注入段階にかかる時間を画期的に減らすことができ、前記マイクロチャンバー間に溶液が混入されないようにして、溶液内部の微細気泡が排出されるようにすることによって光学値を最も正確に測定することができて少量の試料を用いながらも分析の正確度を高めることができるマイクロチャンバープレート、その製造方法を提供する。
【解決手段】本発明のマイクロチャンバープレートは一側面に光学測定ができるように光学測定部が形成され、他側面に試料の注入ができるように中空された注入部が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバーが形成された胴体；前記胴体の一側面に前記光学測定部を密閉する透明層；及び前記胴体の他側面に前記注入部を遮断し、試料を含む共通試薬がマイクロチャンバーの内部に注入されるようにする注入層；とを含めて形成されることを特徴とし、一方、本発明のマイクロプレートの製造方法はａ）一側面に光学測定ができる光学測定部が形成され、他側面に試料の注入が可能である注入部が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバーが形成された胴体が用意される段階；ｂ）前記胴体の光学測定部に透明層が形成される段階；ｃ）前記胴体の注入部に特異成分が分注されて、それぞれのマイクロチャンバープレートに合い異なる特異成分が内蔵される段階；及びｄ）前記マイクロチャンバープレートの他側面に注入層が形成される段階；とを含めて製造されることを特徴とする。
【解決手段】本発明のマイクロチャンバープレートは一側面に光学測定ができるように光学測定部が形成され、他側面に試料の注入ができるように中空された注入部が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバーが形成された胴体；前記胴体の一側面に前記光学測定部を密閉する透明層；及び前記胴体の他側面に前記注入部を遮断し、試料を含む共通試薬がマイクロチャンバーの内部に注入されるようにする注入層；とを含めて形成されることを特徴とし、一方、本発明のマイクロプレートの製造方法はａ）一側面に光学測定ができる光学測定部が形成され、他側面に試料の注入が可能である注入部が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバーが形成された胴体が用意される段階；ｂ）前記胴体の光学測定部に透明層が形成される段階；ｃ）前記胴体の注入部に特異成分が分注されて、それぞれのマイクロチャンバープレートに合い異なる特異成分が内蔵される段階；及びｄ）前記マイクロチャンバープレートの他側面に注入層が形成される段階；とを含めて製造されることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチャンバープレート及びその製造方法に関するものであり、より詳しくは多数の遺伝子を含んでいる生物学的試料溶液を分析するためにそれぞれの遺伝子に選択的に反応するプライマー又はプローブを含む多数の反応液が交差汚染無く反応して蛍光値をリアルタイムで測定及び分析することができるように行うマイクロチャンバープレート及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マイクロチャンバーとは数マイクロリットル以下の微細な反応が起きる容器であって、シリコンウエハー、ガラス、金属、又はプラスチックなどで形成でき、前記マイクロチャンバープレートとは前記マイクロチャンバーが２次元的に配列されてなるプレートであって、一般として一側面は試料が注入される注入口が、他側面は前記マイクロチャンバーの内部の反応を観測するための透明な材質からなる。
【０００３】
一方、遺伝子の量を測定する方法としてポリメラーゼ連鎖反応（PCR、Polymerase Chain Reaction）を行いながらリアルタイムで遺伝子の量に比例して増加される蛍光値を測定することができるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Real-Time PCR）方法が開発された。
【０００４】
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応方法はポリメラーゼ連鎖反応を行うことによりポリメラーゼ連鎖反応の産物から生じられる蛍光値を各サイクル毎に測定し、一定量以上の蛍光値が生じられるサイクルを確認することにより試料の特定遺伝子の初期濃度を定量的に分析することができる。
【０００５】
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応方法は前記ポリメラーゼ連鎖反応後に電気泳動過程が必要でなく、ポリメラーゼ連鎖反応を行う共に反応された産物を定量的に測定して試料の内部のそれぞれの特定塩基配列を有する遺伝子の濃度を１０9以上の範囲において決定することができるという利点がある（"A-Z of Quantitative PCR" edited by Stephen A. Bustin 2004-2006 International University, "Realtime PCR" edited by M. Tevfik Dorak 2006 Taylor & Francis Group）。
【０００６】
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応方法を行うリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応機器は多様な形態が提案されたことがあり、多数の試料を分析することができるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応機器として標準９６ｗｅｌｌ、３８４ｗｅｌｌプレートを使用して９６個又は３８４個の遺伝子を分析することができる機器が提案されたことがある（Roche社のLight cycler 480, ABI 7500, 7900）。
【０００７】
前記Roche社のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応機器は反応試料の量が１０乃至５０μｌのものであって、割と多量の試料が必要となる問題点がある。
【０００８】
前記問題点を解決するためにＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）技術を用いて反応試料の量を減らすことにより短時間内に多い試料を同時に分析するための多様な方法が提示され、これによってマイクロチャンバーアレイプレートを用いた方法もやはり提案されたことがある。
【０００９】
マイクロチャンバーアレイプレートを使用する方法は、大きく前記マイクロチャンバーに反応試料を注入する段階、マイクロチャンバー間の反応溶液を密封させる段階、反応及び分析段階の３段階で構成され、初番目に、個別的に前記マイクロチャンバーに試料溶液を加える方法として、透明な細胞培養用マイクロチャンバープレートに半透過性膜を覆ってマイクロチャンバーを隔離させてそれぞれのマイクロチャンバーに一つの細胞を培養して培養液を除去した後、タクマン（Taqman）反応溶液を加えて蒸発防止のために透明オイルで密封して温度サイクルをしながらプレートの底で蛍光値を測定するマイクロチャンバーアレイプレートが提案されたことがある（YASUDA, Kenji EP 1,541,678 A1, JP 2002245900 NUCLEIC ACID ANALYSIS CHIP AND NUCLEIC ACID ANALYZER）。
【００１０】
前記方式はそれぞれのマイクロチャンバーに合い異なる溶液をマイクロピペットで吸入し加えるため時間がたくさんかかり、特に１５３６個以上のマイクロチャンバーに試料を注入するために微細自動分注器を使用しなければならないが、それぞれ異なる溶液を加える前に洗滌する過程に長時間がかかって現実的に３８４プレート以上は使用が難しいという問題点がある。
【００１１】
第二番目に、初番目の方法を解決するためにシリコンウエハーをフォトリソグラフィと化学エッチング方式でマイクロチャンバーアレイを構成した反応機がE. Tamiy教授グループのHidenori Nagaiなどによって提示されたことがある（Anal. Chem. 2001 73, 1043-1047, Development of a Micro-chamber Array for Picoliter PCR）。
【００１２】
前記反応機はポリメラーゼ連鎖反応溶液の蒸発を防止するために顕微鏡スライドカバーガラスを用いるが、前記カバーガラスを離すときに反応液の交差汚染が誘発されることにつれて撥水性膜をカバーガラスとウエハーとの間に差し込んで、先ず前記カバーガラスを除去してから反応溶液を乾燥させた後に撥水性膜を除去して分析しなければならないという厄介があり、リアルタイムの遺伝子定量増幅に使用できないという問題点があった。
【００１３】
第三番目に、定量増幅の問題点を解決するために、同じ研究室でY. Matsubaraなどはウエハー上の凹んだマイクロチャンバーにそれぞれのプライマーをマイクロアレイ装備を用いて加えた後に乾燥させたマイクロチャンバーアレイを開発した（7th International Conference on Miniaturized Chemical and Biochemical Analysis Systems October 5-9, 2003, Squaw Valley California USA）。
【００１４】
前記マイクロチャンバーアレイはチップの上部にミネラルオイルを加えてマイクロチャンバーを完全に覆った後、ここにポリメラーゼ連鎖反応の反応液をナノジェット分注器を用いて反応機のミネラルオイル上で点滴する方法を使用した。この方法は１インチ×３インチのシリコンウエハーをフォトリソグラフィと化学エッチング方式で５０ナノリットルの体積（０．６５×０．６５×０．２ｍｍ）を有する１，２４８個のマイクロチャンバーアレイチップを製造した後、マイクロチャンバーにプライマーとタクマン（Taqman）プローブ溶液をナノリットル分注器で点滴してこれを乾燥させ、全体をミネラルオイルでコーティングしてそれぞれのマイクロチャンバーを隔離密封した。
【００１５】
前記第三番目の方法を用いて製造されたマイクロチャンバーアレイはナノリットル分注器を用いてＴａｑ ＤＮＡ重合酵素と試料ＤＮＡの混合液をミネラルオイルの上層部から噴射してそれぞれのマイクロチャンバーに分注することによって成功にマイクロチャンバーでそれぞれの反応成分が交差汚染無くポリメラーゼ連鎖反応を行うことができるという長所がある。
【００１６】
しかし、前記方法は溶液を注入するときに別途のマイクロアレイ用ナノリットル分注装備が必要となり、分注をするための時間が長く所要され、プレートの移動時にミネラルオイルの流動で反応液の相互間の交差汚染の危険性が高いという問題点がある。また、温度サイクル反応時に、高温でバブルが発生され、オイルと水溶液の疎水性効果によって水溶液が球形形態となってレンズ効果を起こすことにつれて光学測定時に励起光と発光が散乱、分散されて測定誤差を大きくする問題点がある。
【００１７】
第四番目に、前記第三番目のような化学的なエッチング方式によって製造されたマイクロチャンバーであるが、前記第三番目の方式より最も多い数の反応をさせることができるものとしてPicoTiterPlateが開発されたことがある（John H. Leamon et al., A massively parallel PicoTiterPlate based platform for discrete pico-liter-scale polymerase chain reactions. Electrophoresis 2003, 24, 3769-3777）。
【００１８】
前記第四番目の方式は３９．５ｐｌの量で３００，０００個の独立なポリメラーゼ連鎖反応をさせることができる形態があるが、プライマー／プローブを固定化した担体が無ければならないため、均一な光学特性が要求されるリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応に提供することができない。
【００１９】
第五番目に、微量試料を反応させるために、米国特許第５９４８６７３号には‘フィルム反応機（又はＤＮＡカード）’という反応機が提示されたことがある。
【００２０】
前記フィルム反応機は３層の非常に薄いフィルムからなっており、具体的に下層フィルムは反応機の底面を形成し、中層フィルムは反応機の側面を形成し、上層フィルムは試料注入口を形成する。前記フィルム反応機にピペットを通じて微量の試料溶液を注入した後に反応のためには反応注入口を完全に密封しなければならないが、完璧に密封されていない場合はポリメラーゼ連鎖反応時に反応溶液が全て蒸発する問題点があり、前記フィルム反応機は数千個の試料を扱うためには構造的にあまりにも複雑であるため、現実的に製造が不可能である。
【００２１】
第六番目に、標準ＥＬＩＳＡプレートサイズで１，５３６蛍光分析反応を行うことができる反応プレートがＷＯ ０２／４０１５８とＵＳ ６，２３２，１１４に開示されたことがある。
【００２２】
前記第六番目の方法はプレートに多数の貫通された孔を形成し、蛍光量が少ない透明なフィルムを融着して多数の反応容器を形成し、ここに試薬を入れた後に透明フィルムで密封して反応を行う容器を用いる方法である。前記反応プレートは上面及び下面が透明に形成され、一側面において励起光を加えて他の一側において蛍光を測定することができる長所がある。
【００２３】
しかし、前記第六番目の方法も、多数の遺伝子を分析するためには各々のマイクロチャンバー毎にそれぞれ合い異なるプライマーとプローブが入らなければならないが、多数の試料を分析するプレートは数千個の異なる溶液を微細なマイクロチャンバーに入れなければならないため、このために従来のナノリットル分注器のような特殊な分注装備が必要であり、長時間がかかる作業でありながらも試料注入時に不良が生じる問題点をそのまま有しているようになる。また、マイクロチャンバー内に溶液を完全に満たすことができないという問題によって、加温される場合、マイクロチャンバーの上部に水蒸気がくすぶるようになって光学測定を妨害する問題点もある。
【００２４】
従って、多数のマイクロチャンバーに均一に試料を注入し、各反応液間の交差汚染が生じなく、気泡が発生しなく、水蒸気が光学測定部面に凝縮されなくて反応時に反応物から生成される光をリアルタイムで正確に測定することができるマイクロチャンバープレートが要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は上述したような問題点を解決するために、本発明の目的はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、定温酵素反応、又はＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）に要求される多数個のマイクロチャンバー内部に溶液が蒸発されることを防止し、溶液を容易に注入して注入段階にかかる時間を画期的に減らすことができ、前記マイクロチャンバー間に溶液が混入されないようにして、溶液内部の微細気泡が排出されるようにすることによって光学値を最も正確に測定することができて少量の試料を用いながらも分析の正確度を高めることができるマイクロチャンバープレート、その製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明のマイクロチャンバープレートは一側面に光学測定ができるように光学測定部が形成され、他側面に試料の注入ができるように中空された注入部が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバーが形成された胴体；前記胴体の一側面に前記光学測定部を密閉する透明層；及び前記胴体の他側面に前記注入部を遮断し、試料を含む共通試薬がマイクロチャンバーの内部に注入されるようにする注入層；とを含めて形成されることを特徴とする。
【００２７】
また、前記マイクロチャンバーは前記注入層の形成以前にプライマー又はプローブなどの特異成分Ａが含まれた核酸分析のための分析試薬が内蔵されることを特徴とし、前記マイクロチャンバーは核酸増幅酵素、ＤＮＡ構成化合物（ｄＮＴＰ）、又はバッファーがさらに内蔵されることを特徴とする。
【００２８】
同時に、前記注入層１３０は試料を含む共通試薬の注入が完了された後、接着性フィルム、水分によって皮膜を形成する成分、オイル、または常温で固体である固形成分を用いてシール（sealing）されることを特徴とする。
【００２９】
また、前記注入層は穿孔できるフィルムからなり、前記マイクロチャンバーのそれぞれと連通されるように前記注入層は穿孔されることを特徴とし、伴って、前記マイクロチャンバー当たり穿孔された個数がそれぞれ１乃至１０個で形成されることを特徴とする。
【００３０】
同時に、前記注入層は多孔性材質で形成されることを特徴とする。
【００３１】
また、前記透明層は０℃乃至１００℃において変形が生じない材質で形成されることを特徴とし、前記透明層は特定波長の光のみを通過させたり遮断することができる。
【００３２】
なお、前記マイクロチャンバープレートは、前記胴体の注入部が形成された面の縁周が突出されて上側が開口された空間部が形成され、前記マイクロチャンバーの内部に注入される共用試薬又は試料が前記注入層の上部に形成された空間部に直接供給されることを特徴とする。
【００３３】
同時に、前記マイクロチャンバープレートは、一側に試料を含む共通試薬が供給される供給部が形成され、前記空間部を遮断して気体は排出できる試料供給層がさらに形成されることを特徴とする。
【００３４】
また、前記マイクロチャンバーは円筒形又は直方体の形態であるものが望ましいが、これに限られない。前記マイクロチャンバーのサイズは０．３乃至３ｍｍの幅で形成されることを特徴とし、０．５乃至５ｍｍの深さで形成されることを特徴とする。
【００３５】
また、 前記マイクロチャンバープレートは、試料を含む共通試薬が含まれた別途の容器にマイクロチャンバープレートを漬けて前記試料を含む共通試薬が前記マイクロチャンバーの内部に注入されるように行うことを特徴とする。
【００３６】
同時に、前記マイクロチャンバープレートは前記透明層を保護する第１保護部、又は前記注入層を保護する第２保護部とが形成されることを特徴とし、前記第１保護部又は第２保護部は剥離可能な接着性フィルム又は脱・付着可能な部材が用いられることを特徴とする。
【００３７】
また、前記マイクロチャンバープレートは、複数個が一体で形成されることを特徴とする。
【００３８】
一方、本発明のマイクロプレートの製造方法は、ａ）一側面に光学測定ができる光学測定部が形成され、他側面に試料の注入が可能である注入部が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバーが形成された胴体が用意される段階（Ｓａ）；ｂ）前記胴体の光学測定部に透明層が形成される段階（Ｓｂ）；ｃ）前記胴体の注入部に特異成分が分注されて、それぞれのマイクロチャンバープレートに合い異なる特異成分が内蔵される段階（Ｓｃ）；及びｄ）前記マイクロチャンバープレートの他側面に注入層が形成される段階（Ｓｄ）；とを含めて製造されることを特徴とする。
【００３９】
また、前記マイクロチャンバープレートの製造方法は、前記ｄ）注入層形成段階（Ｓｄ）の以後に、ｅ）前記注入層を保護する第１保護部又は前記透明層を保護する第２保護部を形成する段階（Ｓｅ）がさらに含まれることを特徴とする。
【００４０】
一方、本発明のマイクロチャンバープレートを用いた試料分析方法は上述したようなマイクロチャンバープレートの製造方法によって製造されたマイクロチャンバープレートを用いて、イ）製造されたマイクロチャンバープレートの注入層を通じて前記マイクロチャンバーの内部に試料を含む共通試薬を注入する段階（Ｓイ）；ロ）前記試料を含む共通試薬の注入が完了されると、前記注入層の上層面をシールする段階（Ｓロ）；及びハ）前記特異成分と試料を含む共通試薬を反応させる段階（Ｓハ）；とを含むことを特徴とする。注入層の上層面をシールする段階は注入層の材質によって除外され得る。
【００４１】
また、前記試料を含む共通試薬注入段階（Ｓイ）は前記マイクロチャンバーの内部に試料を含む共通試薬が円滑に注入できるように遠心力、減圧又は加圧が作用されることを特徴とする。
【００４２】
なお、ニ）前記試料を含む共通試薬注入段階（Ｓイ）において複数個の試料又は試薬が順次に注入される場合、一つの注入が完了された後、前記マイクロチャンバープレートの圧力が調節される段階（Ｓニ）がさらに含まれることを特徴とする。
【００４３】
同時に、前記圧力調節段階（Ｓニ）は前記マイクロチャンバーの内部の残留気体が排気できるように減圧−解除、又は加圧されることを特徴とする。
【００４４】
また、前記シールする段階（Ｓロ）は試料を含む共通試薬の注入が完了された後、接着性フィルム、水分によって皮膜を形成する成分、オイル、または常温で固体である固形成分を用いて注入層をシールすることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明によるマイクロチャンバープレートの斜視図である。
【図２】前記図１に示したマイクロチャンバープレートの断面図である。
【図３】本発明によるマイクロチャンバープレートの他の断面図である。
【図４】本発明によるマイクロチャンバープレートの他の斜視図である。
【図５】前記図４に示したマイクロチャンバープレートの断面図である。
【図６】本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図である。
【図７】本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図である。
【図８】本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図である。
【図９】前記図８に示したマイクロチャンバープレートの断面図である。
【図１０】本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの断面図である。
【図１１】本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図である。
【図１２】本発明によるリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応用分析装置の構成図である。
【図１３ａ】本発明のマイクロチャンバープレートの製造方法による段階図である。
【図１３ｂ】本発明のマイクロチャンバープレートの製造方法による段階図である。
【図１４ａ】本発明のマイクロチャンバープレートを用いた分析方法によるもう一つの段階図である。
【図１４ｂ】本発明のマイクロチャンバープレートを用いた分析方法によるもう一つの段階図である。
【図１４ｃ】本発明のマイクロチャンバープレートを用いた分析方法によるもう一つの段階図である。
【符号の説明】
【００４６】
１０００：本発明のリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応用分析装置
１００：マイクロチャンバープレート
１１０：胴体
１１１：マイクロチャンバー
Ｌ１１１：マイクロチャンバーの幅
Ｄ１１１：マイクロチャンバーの深さ
１１２：注入部
１１３：光学測定部
１１４：空間部
１１５：隔壁部
１２０：透明層
１３０：注入層
１４０：試料供給層
１４１：供給部
１５０：第１保護部
１６０：第２保護部
１７０：胴体連結部
２００：圧力調節手段
３００：温度調節手段
４００：回転手段
Ａ：特異成分
Ｓａ〜Ｓｅ：本発明によるマイクロチャンバープレートの製造方法の各段階
Ｓイ〜Ｓニ：本発明によるマイクロチャンバープレートを用いた分析方法
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明のマイクロチャンバープレート１００、その製造方法を添付された図面を参照して詳細に説明する。
【００４８】
図１は本発明によるマイクロチャンバープレート１００の斜視図であり、図２は前記図１に示したマイクロチャンバープレート１００の断面図であり、図３は本発明によるマイクロチャンバープレート１００の他の断面図であり、図４は本発明によるマイクロチャンバープレート１００の他の斜視図であり、図５は前記図４に示したマイクロチャンバープレート１００の断面図であり、図６と図７は本発明によるマイクロチャンバープレート１００のもう一つの斜視図であり、図８は本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図であり、図９は前記図８に示したマイクロチャンバープレートの断面図であり、図１０は本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの断面図であり、図１１は本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図である。
【００４９】
前記図１乃至図６は本発明のマイクロチャンバープレート１００を示した図面であって、本発明のマイクロチャンバープレート１００は大きく光学測定部１１３及び注入部１１２が形成されたマイクロチャンバー１１１が複数個形成された胴体１１０；前記胴体１１０の両側面にそれぞれ形成される透明層１２０及び注入層１３０とを含めて形成される。
【００５０】
前記胴体１１０は本発明のマイクロチャンバープレート１００をなす基本構成であって、内部に試料、反応溶液、又は溶媒などが内蔵される空間であるマイクロチャンバー１１１が複数個備えられる。
【００５１】
前記胴体１１０はシリコンウエハー、ガラス、金属、又はプラスチックで形成でき、前記マイクロチャンバー１１１は一側面に光学測定ができるように光学測定部１１３が形成され、他側面には分析に必要な物質が注入される注入部１１２が形成される。
【００５２】
前記透明層１２０は前記光学測定部１１３が形成された胴体１１０の一側面を密閉しながらも、光学測定ができるように透明な材料を用いて形成される。
【００５３】
この際、前記マイクロチャンバープレート１００は分析過程において加熱されるため、熱によって耐久性を有する材料であるものが望ましく、さらに望ましくは前記透明層１２０は０℃乃至１００℃において変形が生じない材料で構成される。
【００５４】
また、前記透明層１２０は光学測定のために特定波長の光を遮断したり、特定波長の光のみを通過せしめて最も正確な光学測定値を得るようにすることができる。
【００５５】
前記注入層１３０は前記胴体１１０の注入部１１２が形成された他側面に前記注入部１１２を遮断するように形成し、試料を含む共通試薬が前記注入層１３０を通過してマイクロチャンバー１１１の内部に注入させる。
【００５６】
前記注入層１３０は前記注入部１１２を遮断して内部に注入された物質の蒸発を防止しながらも、前記マイクロチャンバー１１１の内部に共通的に加える物質が注入されるように穿孔可能な物質又は多孔性物質で形成される。
【００５７】
前記穿孔可能な物質はフィルム形態の材料が用いられ、前記フィルム形態の注入層１３０は前記マイクロチャンバー１１１とそれぞれ連通するように穿孔される。
【００５８】
この際、前記穿孔された個数は前記マイクロチャンバー１１１の一つ当たり１乃至１０個で形成でき、前記フィルム材料としてはテフロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ＰＶＣ、又はＰＥＴなどが用いられ、前記穿孔された部分の幅は１０μｍ乃至１ｍｍ以内、さらに望ましくは１００乃至５００μｍ以内で形成せしめる。
【００５９】
前記注入層１３０を通じて注入時に圧力などが調節されて注入が容易に行われるようにすることが望ましい。
【００６０】
また、前記注入層１３０は多孔性材質を用いて穿孔の作業無しでそのまま利用可能にすることができ、前記多孔性材質としてはミクロ細孔（Micropore）、メッシュ（mesh）型物質、不織布などを用いることができ、前記多孔性材質の細孔のサイズは０.１乃至１００μｍ以内のものが望ましい。
【００６１】
前記注入層１３０を通じて試料注入が完了された後、注入された試料の流出や蒸発を防止し、マイクロチャンバー１１１間の試料混入を防止するための目的で注入層１３０の上に接着性フィルムを付着したり水分によって皮膜を形成する成分、オイル、又は常温で固体である固形成分が用いられる。注入層１３０が穿孔フィルムの材質である場合、前記注入層１３０の上部にビニルテープなどの接着性フィルムテープを付着する方法を使用することができ、前記注入層１３０が多孔性材質である場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用で開発されて市販されているミネラルオイル（Mineral Oil, Sigmaなど）を注入層１３０の上に塗布して前記注入層１３０の内に前記オイル成分を浸透させる方法が用いられる。
【００６２】
本発明のマイクロチャンバープレート１００は前記マイクロチャンバー１１１に前記注入層１３０を形成する以前にプライマー又はプローブが含まれた核酸分析のための蛍光分析試薬のような特異成分Ａが内蔵され、必要に応じて核酸増幅酵素、ＤＮＡ構成化合物（ｄＮＴＰ）、バッファー又は安定化剤（反応溶液、プライマー、酵素などと分子的によく混合されてこれらを安定化させ、容器内の吸着を減らしてくれる役割を果たす物質として、ポリオール、炭水化物、ウシアルブミン、ＰＥＧなどが例で挙げられる）がさらに含まれ、前記特異成分Ａはその組成によって乾燥、半乾燥、又は液状の状態で用いられる。
【００６３】
つまり、透明層１２０が形成されて一側が閉鎖されたマイクロチャンバー１１１の内部に、試料に合い異なる特性を有する特異成分Ａ、即ちそれぞれ固有の機能を付与する物質が予め内蔵され、前記注入層１３０が形成されると、マイクロチャンバープレートが形成される。その後、前記マイクロチャンバープレートを用いて試料を分析するためにはマイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬を遠心力、減圧又は加圧によって一時に注入する（下記の分析方法でさらに詳細に説明する）。
【００６４】
先ず、図面を通じて本発明のマイクロチャンバープレート１００の例を調べてみる。
【００６５】
図１及び図２は胴体１１０に同一な幅（Ｌ１１１）で円形断面を有するマイクロチャンバー１１１が複数個備えられた形態で、前記注入層１３０及び透明層１２０が前記胴体１１０と別途の構成で付着された形態を図示した。
【００６６】
前記マイクロチャンバー１１１は０．３乃至３ｍｍの幅（Ｌ１１１）を有して、０．５乃至５ｍｍの深さ（Ｄ１１１）を有するように形成されるため、本発明のマイクロチャンバープレート１００は最も多い数のマイクロチャンバー１１１を形成することができて同時に分析作業がなされ、深さ（Ｄ１１１）が浅くて熱伝導性能がよく、分析時間を縮め、分析の正確度を高めることができる。
【００６７】
実際に、標準８０×１２５ｍｍの胴体１１０に幅（Ｌ１１１）が０．３乃至２．２５ｍｍであるマイクロチャンバー１１１を２４，５７６個を形成することができ、０．１乃至５μｍ以下の微量試料の反応に適合して本発明のマイクロチャンバープレート１００は微量の反応溶液を使用して多数の遺伝子を同時に定量的に分析することができるという長所がある。
【００６８】
図３は本発明のマイクロチャンバープレート１００の他の例を示した断面図であって、前記図３（ａ）に図示したマイクロチャンバープレート１００は前記胴体１１０と透明層１２０が一体化された形態で、別途の透明層１２０を形成する段階を減らすことができる形態であって、前記透明層１２０と胴体１１０が一体化されて形成されるとしても、前記透明層１２０は光学測定が可能であるように形成しなければならない。
【００６９】
前記図３（ｂ）に図示した形態は前記胴体１１０の光学測定部１１３が形成された面に段差が形成され、前記段差された領域に透明層１２０が形成されて、前記透明層１２０を形成することによって突出される部分が存在しないように形成された例を図示した。
【００７０】
本発明のマイクロチャンバープレート１００は前記マイクロチャンバー１１１が前記図面から図示された円形の形態の他にも四角形、五角形などその断面が多様に形成されることができ、上・下方向に行くほどその幅（Ｌ１１１）が変形されるようにすることもできる。
【００７１】
前記注入層１３０が形成されたマイクロちゃんバープレート１００は試料を含む共通試薬を前記マイクロチャンバー１１１の内部に注入する多様な方法として先ず、前記マイクロチャンバープレート１００、その自体を前記試料を含む共通試薬が漬けられた容器に入れて注入せしめることができる。
【００７２】
二番目に、本発明のマイクロチャンバープレート１００は前記胴体１１０の注入部１１２が形成された面の周縁が突出されて上側が開口された空間部１１４が形成され、前記空間部１１４に試料を含む共通試薬を直接供給することができる。
【００７３】
三番目に、前記図４及び図５に示したように、一側に試料を含む共通試薬が供給される供給部１４１が形成され、前記空間部１１４を遮断する試料供給層１４０がさらに形成され、前記試料供給層１４０を形成した後、前記供給部１４１を通じて試料を含む共通試薬を前記注入層１３０の上部に供給してそれぞれのマイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬が供給されるようにする。
【００７４】
四番目に、前記図６に図示されたように、前記三番目の方法と同一に試料供給層１４０がさらに形成されるが、前記供給部１４１が前記胴体１１０の一側に形成された例を示した。
【００７５】
前記試料供給層１４０がさらに形成された場合に、前記試料を含む共通試薬を保護し、供給された量を正確に制御することができ、前記注入層１３０を保護することができる効果が得られる。
【００７６】
この際、前記試料供給層１４０は供給される試料を含む共通試薬は外部に排出されなく、内部の気体は排出可能な材料で形成されて試料を含む共通試薬の流出は防止し、前記マイクロチャンバー１１１の内部に残存する気体は外部に排出できるようにする。
【００７７】
前記マイクロチャンバー１１１の内部に気体が残留する場合に、前記気体によって光が分散されて光学測定の正確度を低下させる原因となるため、本発明のマイクロチャンバープレート１００は前記マイクロチャンバー１１１の内部の気体が排出されるように行って、前記の問題点を未然に防止することができるようにする長所がある。
【００７８】
前記マイクロチャンバープレート１００はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の他にも定温酵素反応、又はＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）のような反応に用いられ、内部に内蔵される特異成分Ａなどを変形することによってこの他にも多様に用いることことができる。
【００７９】
図７は本発明によるマイクロチャンバープレート１００のもう一つの例であって、本発明のマイクロチャンバー１１１は必要に応じて移送できるため、前記透明層１２０を保護する第１保護部１５０、又は前記注入層１３０を保護する第２保護部１６０がさらに形成されることができる。
【００８０】
前記第１保護部１５０、及び第２保護部１６０は必要に応じてそれぞれ複数個が形成でき、前記試料供給層１４０がさらに形成された場合に前記第２保護部１６０は前記注入層１３０又は試料供給層１４０の上側に形成される。
【００８１】
前記第１保護部１５０は光学測定のために剥離可能な接着性フィルム又は脱・付着可能な部材が用いられ、前記第２保護部１６０は内部溶液の流出を防止して外部からの汚染を遮断するように接着性フィルムが用いられる。保護用フィルムで取り扱い中に物理的な損傷から基底の膜を保護することができる強度を有しながらも剥離が容易であって除去過程中に基底の膜を損傷させないで付着面に異物質が残らない粘着性フィルムなどを使用することができ、脱・付着可能な部材としてはプレート用蓋を使用することができる。
【００８２】
図８乃至図１１は上述したような特徴を有する本発明のマイクロチャンバープレート１００が複数個形成された例を図示した例であって、前記マイクロチャンバープレート１００が複数個形成された例もやはり本発明のマイクロチャンバープレート１００の範疇に属するが、円滑な説明のために一つの単位を形成するマイクロチャンバープレート１００が複数個形成されたものをマルチマイクロチャンバープレート１００′及び図面符号１００′で示して説明する。
【００８３】
前記図８及び図９に示したように、本発明のマルチマイクロチャンバープレート１００′は光学測定部１１３及び注入部１１２が形成されたマイクロチャンバー１１１が複数個形成された胴体１１０；前記胴体１１０の両側面にそれぞれ形成される透明層１２０；及び注入層１３０を含めて形成されたマイクロチャンバープレート１００が複数個形成される。
【００８４】
前記マイクロチャンバープレート１００が複数個形成されたマルチマイクロチャンバープレート１００′も上述したようなマイクロチャンバープレート１００の特徴を有し、図面を参照してその例を説明する。
【００８５】
前記図８及び図９に示したマルチマイクロチャンバープレート１００′は前記胴体１１０の注入層１３０が形成される側に隣り合うマイクロチャンバープレート１００を連結する胴体連結部１７０が形成され、前記透明層１２０が前記胴体１１０と一体で形成された例を図示したが、前記胴体連結部１７０は隣り合うマイクロチャンバープレート１００を連結する如何なる形態でも形成することができる。
【００８６】
つまり、前記マルチマイクロチャンバープレート１００′は上述したようなマイクロチャンバープレート１００が一つの単位体を形成し、これが複数個連結されて一体で形成された例であって、前記マルチマイクロチャンバープレート１００′は一つのマイクロチャンバープレート１００に４乃至１６個のマイクロチャンバー１１１を形成し、前記マイクロチャンバープレート１００が８乃至９６個を含むように構成されることができる。
【００８７】
この際、前記マルチマイクロチャンバープレート１００′を形成するそれぞれのマイクロチャンバープレート１００は内部に他の特異成分Ａが内蔵されており、前記注入層１３０を通じて注入される共通試薬の種類も異なるため、前記マルチマイクロチャンバープレート１００′はそれぞれのマイクロチャンバープレート１００に前記胴体１１０の注入部１１２が形成された面の周縁が突出されて上側が開口された空間部１１４が形成され、前期マイクロチャンバー１１１の内部に注入される共用試薬又は試料が前記注入層１３０の上部に形成された空間部１１４に直接供給されるようにすることが望ましい。
【００８８】
前記空間部１１４を形成するために、前記図８及び図９に示したように、前記胴体１１０の注入部１１２が形成された側に上部に突出される隔壁部１１５が形成されることができる。
【００８９】
前記図８及び図９は前記隔壁部１１５が胴体１１０と一体で形成され、それぞれのマイクロチャンバープレート１００毎に同一な特異成分Ａが内蔵されたマイクロチャンバー１１１を含むように形成された例を図示したが、隣り合うマイクロチャンバープレート１００間を区画する一つの隔壁部１１５が存在するように行うことができ、この他にもそれぞれのマイクロチャンバープレート１００に試薬が注入できる空間を形成することができる形態であれば多様に形成できる。
【００９０】
つまり、本発明のマルチマイクロチャンバープレート１００′は前記胴体１１０のマイクロチャンバー１１１の内部には特異成分Ａが内蔵され、それぞれのマイクロチャンバープレート１００に相異なる特異成分Ａが内蔵せしめ、それぞれの特異成分Ａに要求される相異なる試薬を注入するように行うことによって同時に様々な種類の試料分析ができる長所がある。
【００９１】
前記図１０に図示した本発明のマルチマイクロチャンバープレート１００′は前記胴体１１０に特異成分Ａが内蔵されるマイクロチャンバー１１１が複数個形成され、両側が開放された形態で前記開放された一側面に透明層１２０が形成され、他側面に注入層１３０が形成される。
【００９２】
また、一つの前記マイクロチャンバープレート１００の注入部１１２が形成された面には前記マイクロチャンバー１１１の周縁が突出されて上側が開口された空間部１１４を形成するようにし、前記空間部１１４に共通試薬を供給するようにし、前記空間部１１４を遮断する試料供給層１４０がさらに形成されることができる。
【００９３】
前記試料供給層１４０には試料が供給される供給部１４１が形成され、前記空間部１１４は前記胴体連結部１７０の一側面が突出されて形成される。
【００９４】
前記図１０は前記透明層１２０を保護する第１保護部１５０及び前記注入層１３０及び試料供給層１４０を保護する第２保護部１６０が形成された例を図示した。
【００９５】
前記図８乃至図１０は前記マイクロチャンバープレート１００が一列で連結された例を図示したが、前記図１１に示しように、本発明のマルチマイクロチャンバープレート１００′は前記マイクロチャンバープレート１００が多列を形成するように複数個が連結できる。
【００９６】
また、前記マルチマイクロチャンバープレート１００′はそれぞれのマイクロチャンバープレート１００に独立な試薬を注入することができるように前記胴体１１０の注入部１１２が形成された面の周縁が突出されて上側が開口された空間部１１４が形成され、前記マイクロチャンバー１１１の内部に注入される共用試薬又は試料が前記注入層１３０の上部に形成された空間部１１４に直接供給するようにすることによって一回の実験で多様な種類の試料を実験することができるように行う。
【００９７】
一方、本発明のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応用分析装置１０００は上述したような特徴を有するマイクロチャンバープレート１００を用いることを特徴とする。
【００９８】
図１２は本発明によるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応用分析装置１０００の構成図であって、前記図１２に示したように、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応用分析装置１０００は圧力調節手段２００又は回転手段４００が備えられ、同時に温度調節手段３００又は光学測定手段５００がさらに備えられる。
【００９９】
次に、図１３ａは本発明のマイクロチャンバープレート１００の製造方法に従う段階図であって、本発明のマイクロチャンバープレート１００の製造方法はａ）胴体１１０用意段階（Ｓａ）；ｂ）透明層１２０形成段階（Ｓｂ）；ｃ）特異成分Ａの分注段階（Ｓｃ）；及びｄ）注入層１３０形成段階（Ｓｄ）；とを含めて製造されることを特徴とする。
【０１００】
前記ａ）胴体１１０用意段階（Ｓａ）は一側面に光学測定が可能な光学測定部１１３が形成され、多側面に試料の注入が可能な注入部１１２が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバー１１１が形成された胴体１１０が用意される段階である。
【０１０１】
前記ｂ）透明層１２０形成段階（Ｓｂ）は前記用意された胴体１１０の光学測定部１１３が形成された面を遮断する透明層１２０を形成する段階であって、製造環境によって前記胴体１１０用意段階と透明層１２０形成段階（Ｓｂ）は前記胴体１１０と透明層１２０を一体化して一回の工程で形成されることもできる。
【０１０２】
前記ｃ）特異成分Ａの分注段階（Ｓｃ）は前記透明層１２０によって一側が密閉されたマイクロチャンバー１１１の内部に特異成分Ａが内蔵されるようにする段階であって、前記特異成分Ａはプレイマー又はプローブの他にも核酸増幅酵素、ＤＮＡ構成化合物（ｄＮＴＰ）、バッファー、又は安定化剤が含まれる。
【０１０３】
前記ｄ）注入層１３０形成段階（Ｓｄ）は前記特異成分Ａが内蔵されたマイクロチャンバー１１１の注入部１１２を遮断する注入層１３０を形成する段階であって、前記注入層１３０は前記注入部１１２を遮断して内部物質の流出を防止することにより前記特異物質が交差汚染されないようにする役割を担当し、共通的に加える試料を含む共通試薬が一回に前記マイクロチャンバー１１１の内部に供給できるように多孔性材質又は穿孔可能な材質を用いて形成する。
【０１０４】
同時に、本発明のマイクロチャンバープレート１００の製図方法は図１３ｂに示したように、ｅ）前記ｄ）注入層１３０形成段階（Ｓｄ）の以後に、ｅ）前記注入層１３０を保護する第１保護部１５０又は前記透明層１２０を保護する第２保護部１６０を形成する段階（Ｓｅ）が追加される。
【０１０５】
このように、本発明のマイクロチャンバープレート１００の製造方法は前記注入層１３０を形成してナノジェット分注器のような特殊な分注装備を必要にせず、共通成分を汚染無く速く供給することができて短時間内に分析に必要なマイクロチャンバープレート１００を製造することができ、それで分析の効率性を高めることができ、圧力調節手段２００又は回転手段４００が備えられる場合に、前記マイクロチャンバープレート１００の製造時間を縮めることができる。
【０１０６】
図１４ａは本発明のマイクロチャンバープレート１００の分析方法による他の段階図であって、本発明のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法は上述したようなマイクロチャンバープレート１００を用い、イ）製造されたマイクロチャンバープレート１００の注入層１３０を通じて前記マイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬を注入する段階（Ｓイ）；及びロ）前記特異成分Ａと試料を含む共通試薬が反応される段階（Ｓロ）；とを含むことを特徴とする。
【０１０７】
前記試料を含む共通試薬を注入する段階（Ｓイ）は前記マイクロチャンバープレート１００のマイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬を注入する段階であって、場合によって前記試料を含む共通試薬を注入する段階（Ｓイ）が繰り返して行うことができる。
【０１０８】
また、前記試料を含む共通試薬注入段階（Ｓイ）において前記マイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬が円滑に注入できるように遠心力、減圧又は加圧が作用されて最も速く注入できるように行うことができ、前記注入層１３０の上部に前記注入層１３０を保護する第１保護部１５０が形成された場合に、前記第１保護部１５０を除去した後、前記注入層１３０を通じて試料を含む共通試薬を注入することは当然である。
【０１０９】
なお、前記試料を含む共通試薬反応段階（Ｓロ）は前記特異成分Ａと試料を含む共通試薬が反応される段階であって、前記試料を含む共通試薬反応段階（Ｓロ）はポリメラーゼ連鎖反応（PCR, polymerase chain reaction）ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）、又はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR, Real time-PCR）から選ばれるいずれかの反応が行われる。
【０１１０】
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は一般的なポリメラーゼ連鎖反応と比べて増幅課程中に各反応のサイクル別に光学測定がさらに必要であるため、本発明のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法においてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を通じて分析するようになる場合に、光学測定（蛍光分析）段階がサイクル別に行わなければならなく、本発明はこれのみならず各反応に適当な追加的な段階がさらに行うことができる。
【０１１１】
また、図１４ｂに示したように、本発明のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法はハ）前記試料を含む共通試薬の注入が完了されると、注入層の材質によって選択的に前記注入層１３０の上層面をシールする段階（Ｓハ）；がさらに含まれる。
【０１１２】
前記注入層１３０シール段階（Ｓハ）は前記試料を含む共通試薬の注入が完了された後、前記注入層１３０の上層面をシールする段階である。試料を含む共通試薬の注入が完了された後、接着性フィルム、水分によって皮膜を形成する成分、オイル、又は常温で固体である固形成分を用いて注入層１３０をシールしてマイクロチャンバー内の状態（プライマー又はプローブなどの特異成分と試料を含む共通試薬が混合された状態）を保持するようにすることができる。
【０１１３】
また、図１４ｃに示したように、本発明のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法は前記マイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬の注入時に前記マイクロチャンバー１１１の内部に残存した気体が排出できなく残っている場合、前記残留気体は光学測定時に光を散乱する要素で作用して分析の正確度を阻害するようになる。従って、ニ）前記試料を含む共通試薬の注入段階（Ｓイ）において複数個の試料が順次に注入される場合、一つの試料又は試薬の注入が完了された後、前記マイクロチャンバープレート１００の圧力が調節される段階（Ｓニ）；がさらに含まれる。
【０１１４】
同時に、前記圧力調節段階（Ｓニ）は前記マイクロチャンバー１１１の内部の残留気体が排気できるように減圧−解除又は加圧され、必要に応じて前記過程が繰り返して行われる。
【０１１５】
前記から減圧−解除、又は加圧とは、減圧−解除過程、加圧過程、減圧−解除−加圧の過程を全て含む。
【０１１６】
本発明は前記した実施例に限られなく、適用範囲が多様であることは勿論、請求範囲から請求する本発明の要旨を外れなく多様な変形実施ができることは当然である。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
従って、本発明のマイクロチャンバープレート、その製造方法は要求される試料の量が少なくて反応溶液の使用量を減らすことができ、前記マイクロチャンバープレートの厚さが薄くて温度調節が容易であることによって分析にかかる時間を画期的に縮めることができ、マイクロチャンバー間の溶液が混入されることに伴って発生される汚染問題及びマイクロチャンバーの内部の残留気体によって光学測定値が正しく測定されない問題を未然に防止することで分析の正確度を高めることができるという長所がある。
【０１１８】
また、本発明のマイクロチャンバープレート、その製造方法はマイクロチャンバーの内部に溶液の注入が容易であって大量の試料を一回に処理することができながらもその使用及び処理が簡単で分析工程を簡素化することができるという長所がある。
【０１１９】
共に、本発明は複数個のマイクロチャンバープレートが一体で形成できてそれぞれのマイクロチャンバープレートに合い異なる共通試薬が内蔵されるようにして様々な種類の試料を同時に分析及び比較することによって分析にかかる時間を画期的に短縮することができるという長所がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチャンバープレート及びその製造方法に関するものであり、より詳しくは多数の遺伝子を含んでいる生物学的試料溶液を分析するためにそれぞれの遺伝子に選択的に反応するプライマー又はプローブを含む多数の反応液が交差汚染無く反応して蛍光値をリアルタイムで測定及び分析することができるように行うマイクロチャンバープレート及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マイクロチャンバーとは数マイクロリットル以下の微細な反応が起きる容器であって、シリコンウエハー、ガラス、金属、又はプラスチックなどで形成でき、前記マイクロチャンバープレートとは前記マイクロチャンバーが２次元的に配列されてなるプレートであって、一般として一側面は試料が注入される注入口が、他側面は前記マイクロチャンバーの内部の反応を観測するための透明な材質からなる。
【０００３】
一方、遺伝子の量を測定する方法としてポリメラーゼ連鎖反応（PCR、Polymerase Chain Reaction）を行いながらリアルタイムで遺伝子の量に比例して増加される蛍光値を測定することができるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Real-Time PCR）方法が開発された。
【０００４】
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応方法はポリメラーゼ連鎖反応を行うことによりポリメラーゼ連鎖反応の産物から生じられる蛍光値を各サイクル毎に測定し、一定量以上の蛍光値が生じられるサイクルを確認することにより試料の特定遺伝子の初期濃度を定量的に分析することができる。
【０００５】
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応方法は前記ポリメラーゼ連鎖反応後に電気泳動過程が必要でなく、ポリメラーゼ連鎖反応を行う共に反応された産物を定量的に測定して試料の内部のそれぞれの特定塩基配列を有する遺伝子の濃度を１０9以上の範囲において決定することができるという利点がある（"A-Z of Quantitative PCR" edited by Stephen A. Bustin 2004-2006 International University, "Realtime PCR" edited by M. Tevfik Dorak 2006 Taylor & Francis Group）。
【０００６】
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応方法を行うリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応機器は多様な形態が提案されたことがあり、多数の試料を分析することができるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応機器として標準９６ｗｅｌｌ、３８４ｗｅｌｌプレートを使用して９６個又は３８４個の遺伝子を分析することができる機器が提案されたことがある（Roche社のLight cycler 480, ABI 7500, 7900）。
【０００７】
前記Roche社のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応機器は反応試料の量が１０乃至５０μｌのものであって、割と多量の試料が必要となる問題点がある。
【０００８】
前記問題点を解決するためにＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）技術を用いて反応試料の量を減らすことにより短時間内に多い試料を同時に分析するための多様な方法が提示され、これによってマイクロチャンバーアレイプレートを用いた方法もやはり提案されたことがある。
【０００９】
マイクロチャンバーアレイプレートを使用する方法は、大きく前記マイクロチャンバーに反応試料を注入する段階、マイクロチャンバー間の反応溶液を密封させる段階、反応及び分析段階の３段階で構成され、初番目に、個別的に前記マイクロチャンバーに試料溶液を加える方法として、透明な細胞培養用マイクロチャンバープレートに半透過性膜を覆ってマイクロチャンバーを隔離させてそれぞれのマイクロチャンバーに一つの細胞を培養して培養液を除去した後、タクマン（Taqman）反応溶液を加えて蒸発防止のために透明オイルで密封して温度サイクルをしながらプレートの底で蛍光値を測定するマイクロチャンバーアレイプレートが提案されたことがある（YASUDA, Kenji EP 1,541,678 A1, JP 2002245900 NUCLEIC ACID ANALYSIS CHIP AND NUCLEIC ACID ANALYZER）。
【００１０】
前記方式はそれぞれのマイクロチャンバーに合い異なる溶液をマイクロピペットで吸入し加えるため時間がたくさんかかり、特に１５３６個以上のマイクロチャンバーに試料を注入するために微細自動分注器を使用しなければならないが、それぞれ異なる溶液を加える前に洗滌する過程に長時間がかかって現実的に３８４プレート以上は使用が難しいという問題点がある。
【００１１】
第二番目に、初番目の方法を解決するためにシリコンウエハーをフォトリソグラフィと化学エッチング方式でマイクロチャンバーアレイを構成した反応機がE. Tamiy教授グループのHidenori Nagaiなどによって提示されたことがある（Anal. Chem. 2001 73, 1043-1047, Development of a Micro-chamber Array for Picoliter PCR）。
【００１２】
前記反応機はポリメラーゼ連鎖反応溶液の蒸発を防止するために顕微鏡スライドカバーガラスを用いるが、前記カバーガラスを離すときに反応液の交差汚染が誘発されることにつれて撥水性膜をカバーガラスとウエハーとの間に差し込んで、先ず前記カバーガラスを除去してから反応溶液を乾燥させた後に撥水性膜を除去して分析しなければならないという厄介があり、リアルタイムの遺伝子定量増幅に使用できないという問題点があった。
【００１３】
第三番目に、定量増幅の問題点を解決するために、同じ研究室でY. Matsubaraなどはウエハー上の凹んだマイクロチャンバーにそれぞれのプライマーをマイクロアレイ装備を用いて加えた後に乾燥させたマイクロチャンバーアレイを開発した（7th International Conference on Miniaturized Chemical and Biochemical Analysis Systems October 5-9, 2003, Squaw Valley California USA）。
【００１４】
前記マイクロチャンバーアレイはチップの上部にミネラルオイルを加えてマイクロチャンバーを完全に覆った後、ここにポリメラーゼ連鎖反応の反応液をナノジェット分注器を用いて反応機のミネラルオイル上で点滴する方法を使用した。この方法は１インチ×３インチのシリコンウエハーをフォトリソグラフィと化学エッチング方式で５０ナノリットルの体積（０．６５×０．６５×０．２ｍｍ）を有する１，２４８個のマイクロチャンバーアレイチップを製造した後、マイクロチャンバーにプライマーとタクマン（Taqman）プローブ溶液をナノリットル分注器で点滴してこれを乾燥させ、全体をミネラルオイルでコーティングしてそれぞれのマイクロチャンバーを隔離密封した。
【００１５】
前記第三番目の方法を用いて製造されたマイクロチャンバーアレイはナノリットル分注器を用いてＴａｑ ＤＮＡ重合酵素と試料ＤＮＡの混合液をミネラルオイルの上層部から噴射してそれぞれのマイクロチャンバーに分注することによって成功にマイクロチャンバーでそれぞれの反応成分が交差汚染無くポリメラーゼ連鎖反応を行うことができるという長所がある。
【００１６】
しかし、前記方法は溶液を注入するときに別途のマイクロアレイ用ナノリットル分注装備が必要となり、分注をするための時間が長く所要され、プレートの移動時にミネラルオイルの流動で反応液の相互間の交差汚染の危険性が高いという問題点がある。また、温度サイクル反応時に、高温でバブルが発生され、オイルと水溶液の疎水性効果によって水溶液が球形形態となってレンズ効果を起こすことにつれて光学測定時に励起光と発光が散乱、分散されて測定誤差を大きくする問題点がある。
【００１７】
第四番目に、前記第三番目のような化学的なエッチング方式によって製造されたマイクロチャンバーであるが、前記第三番目の方式より最も多い数の反応をさせることができるものとしてPicoTiterPlateが開発されたことがある（John H. Leamon et al., A massively parallel PicoTiterPlate based platform for discrete pico-liter-scale polymerase chain reactions. Electrophoresis 2003, 24, 3769-3777）。
【００１８】
前記第四番目の方式は３９．５ｐｌの量で３００，０００個の独立なポリメラーゼ連鎖反応をさせることができる形態があるが、プライマー／プローブを固定化した担体が無ければならないため、均一な光学特性が要求されるリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応に提供することができない。
【００１９】
第五番目に、微量試料を反応させるために、米国特許第５９４８６７３号には‘フィルム反応機（又はＤＮＡカード）’という反応機が提示されたことがある。
【００２０】
前記フィルム反応機は３層の非常に薄いフィルムからなっており、具体的に下層フィルムは反応機の底面を形成し、中層フィルムは反応機の側面を形成し、上層フィルムは試料注入口を形成する。前記フィルム反応機にピペットを通じて微量の試料溶液を注入した後に反応のためには反応注入口を完全に密封しなければならないが、完璧に密封されていない場合はポリメラーゼ連鎖反応時に反応溶液が全て蒸発する問題点があり、前記フィルム反応機は数千個の試料を扱うためには構造的にあまりにも複雑であるため、現実的に製造が不可能である。
【００２１】
第六番目に、標準ＥＬＩＳＡプレートサイズで１，５３６蛍光分析反応を行うことができる反応プレートがＷＯ ０２／４０１５８とＵＳ ６，２３２，１１４に開示されたことがある。
【００２２】
前記第六番目の方法はプレートに多数の貫通された孔を形成し、蛍光量が少ない透明なフィルムを融着して多数の反応容器を形成し、ここに試薬を入れた後に透明フィルムで密封して反応を行う容器を用いる方法である。前記反応プレートは上面及び下面が透明に形成され、一側面において励起光を加えて他の一側において蛍光を測定することができる長所がある。
【００２３】
しかし、前記第六番目の方法も、多数の遺伝子を分析するためには各々のマイクロチャンバー毎にそれぞれ合い異なるプライマーとプローブが入らなければならないが、多数の試料を分析するプレートは数千個の異なる溶液を微細なマイクロチャンバーに入れなければならないため、このために従来のナノリットル分注器のような特殊な分注装備が必要であり、長時間がかかる作業でありながらも試料注入時に不良が生じる問題点をそのまま有しているようになる。また、マイクロチャンバー内に溶液を完全に満たすことができないという問題によって、加温される場合、マイクロチャンバーの上部に水蒸気がくすぶるようになって光学測定を妨害する問題点もある。
【００２４】
従って、多数のマイクロチャンバーに均一に試料を注入し、各反応液間の交差汚染が生じなく、気泡が発生しなく、水蒸気が光学測定部面に凝縮されなくて反応時に反応物から生成される光をリアルタイムで正確に測定することができるマイクロチャンバープレートが要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は上述したような問題点を解決するために、本発明の目的はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、定温酵素反応、又はＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）に要求される多数個のマイクロチャンバー内部に溶液が蒸発されることを防止し、溶液を容易に注入して注入段階にかかる時間を画期的に減らすことができ、前記マイクロチャンバー間に溶液が混入されないようにして、溶液内部の微細気泡が排出されるようにすることによって光学値を最も正確に測定することができて少量の試料を用いながらも分析の正確度を高めることができるマイクロチャンバープレート、その製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明のマイクロチャンバープレートは一側面に光学測定ができるように光学測定部が形成され、他側面に試料の注入ができるように中空された注入部が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバーが形成された胴体；前記胴体の一側面に前記光学測定部を密閉する透明層；及び前記胴体の他側面に前記注入部を遮断し、試料を含む共通試薬がマイクロチャンバーの内部に注入されるようにする注入層；とを含めて形成されることを特徴とする。
【００２７】
また、前記マイクロチャンバーは前記注入層の形成以前にプライマー又はプローブなどの特異成分Ａが含まれた核酸分析のための分析試薬が内蔵されることを特徴とし、前記マイクロチャンバーは核酸増幅酵素、ＤＮＡ構成化合物（ｄＮＴＰ）、又はバッファーがさらに内蔵されることを特徴とする。
【００２８】
同時に、前記注入層１３０は試料を含む共通試薬の注入が完了された後、接着性フィルム、水分によって皮膜を形成する成分、オイル、または常温で固体である固形成分を用いてシール（sealing）されることを特徴とする。
【００２９】
また、前記注入層は穿孔できるフィルムからなり、前記マイクロチャンバーのそれぞれと連通されるように前記注入層は穿孔されることを特徴とし、伴って、前記マイクロチャンバー当たり穿孔された個数がそれぞれ１乃至１０個で形成されることを特徴とする。
【００３０】
同時に、前記注入層は多孔性材質で形成されることを特徴とする。
【００３１】
また、前記透明層は０℃乃至１００℃において変形が生じない材質で形成されることを特徴とし、前記透明層は特定波長の光のみを通過させたり遮断することができる。
【００３２】
なお、前記マイクロチャンバープレートは、前記胴体の注入部が形成された面の縁周が突出されて上側が開口された空間部が形成され、前記マイクロチャンバーの内部に注入される共用試薬又は試料が前記注入層の上部に形成された空間部に直接供給されることを特徴とする。
【００３３】
同時に、前記マイクロチャンバープレートは、一側に試料を含む共通試薬が供給される供給部が形成され、前記空間部を遮断して気体は排出できる試料供給層がさらに形成されることを特徴とする。
【００３４】
また、前記マイクロチャンバーは円筒形又は直方体の形態であるものが望ましいが、これに限られない。前記マイクロチャンバーのサイズは０．３乃至３ｍｍの幅で形成されることを特徴とし、０．５乃至５ｍｍの深さで形成されることを特徴とする。
【００３５】
また、 前記マイクロチャンバープレートは、試料を含む共通試薬が含まれた別途の容器にマイクロチャンバープレートを漬けて前記試料を含む共通試薬が前記マイクロチャンバーの内部に注入されるように行うことを特徴とする。
【００３６】
同時に、前記マイクロチャンバープレートは前記透明層を保護する第１保護部、又は前記注入層を保護する第２保護部とが形成されることを特徴とし、前記第１保護部又は第２保護部は剥離可能な接着性フィルム又は脱・付着可能な部材が用いられることを特徴とする。
【００３７】
また、前記マイクロチャンバープレートは、複数個が一体で形成されることを特徴とする。
【００３８】
一方、本発明のマイクロプレートの製造方法は、ａ）一側面に光学測定ができる光学測定部が形成され、他側面に試料の注入が可能である注入部が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバーが形成された胴体が用意される段階（Ｓａ）；ｂ）前記胴体の光学測定部に透明層が形成される段階（Ｓｂ）；ｃ）前記胴体の注入部に特異成分が分注されて、それぞれのマイクロチャンバープレートに合い異なる特異成分が内蔵される段階（Ｓｃ）；及びｄ）前記マイクロチャンバープレートの他側面に注入層が形成される段階（Ｓｄ）；とを含めて製造されることを特徴とする。
【００３９】
また、前記マイクロチャンバープレートの製造方法は、前記ｄ）注入層形成段階（Ｓｄ）の以後に、ｅ）前記注入層を保護する第１保護部又は前記透明層を保護する第２保護部を形成する段階（Ｓｅ）がさらに含まれることを特徴とする。
【００４０】
一方、本発明のマイクロチャンバープレートを用いた試料分析方法は上述したようなマイクロチャンバープレートの製造方法によって製造されたマイクロチャンバープレートを用いて、イ）製造されたマイクロチャンバープレートの注入層を通じて前記マイクロチャンバーの内部に試料を含む共通試薬を注入する段階（Ｓイ）；ロ）前記試料を含む共通試薬の注入が完了されると、前記注入層の上層面をシールする段階（Ｓロ）；及びハ）前記特異成分と試料を含む共通試薬を反応させる段階（Ｓハ）；とを含むことを特徴とする。注入層の上層面をシールする段階は注入層の材質によって除外され得る。
【００４１】
また、前記試料を含む共通試薬注入段階（Ｓイ）は前記マイクロチャンバーの内部に試料を含む共通試薬が円滑に注入できるように遠心力、減圧又は加圧が作用されることを特徴とする。
【００４２】
なお、ニ）前記試料を含む共通試薬注入段階（Ｓイ）において複数個の試料又は試薬が順次に注入される場合、一つの注入が完了された後、前記マイクロチャンバープレートの圧力が調節される段階（Ｓニ）がさらに含まれることを特徴とする。
【００４３】
同時に、前記圧力調節段階（Ｓニ）は前記マイクロチャンバーの内部の残留気体が排気できるように減圧−解除、又は加圧されることを特徴とする。
【００４４】
また、前記シールする段階（Ｓロ）は試料を含む共通試薬の注入が完了された後、接着性フィルム、水分によって皮膜を形成する成分、オイル、または常温で固体である固形成分を用いて注入層をシールすることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明によるマイクロチャンバープレートの斜視図である。
【図２】前記図１に示したマイクロチャンバープレートの断面図である。
【図３】本発明によるマイクロチャンバープレートの他の断面図である。
【図４】本発明によるマイクロチャンバープレートの他の斜視図である。
【図５】前記図４に示したマイクロチャンバープレートの断面図である。
【図６】本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図である。
【図７】本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図である。
【図８】本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図である。
【図９】前記図８に示したマイクロチャンバープレートの断面図である。
【図１０】本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの断面図である。
【図１１】本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図である。
【図１２】本発明によるリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応用分析装置の構成図である。
【図１３ａ】本発明のマイクロチャンバープレートの製造方法による段階図である。
【図１３ｂ】本発明のマイクロチャンバープレートの製造方法による段階図である。
【図１４ａ】本発明のマイクロチャンバープレートを用いた分析方法によるもう一つの段階図である。
【図１４ｂ】本発明のマイクロチャンバープレートを用いた分析方法によるもう一つの段階図である。
【図１４ｃ】本発明のマイクロチャンバープレートを用いた分析方法によるもう一つの段階図である。
【符号の説明】
【００４６】
１０００：本発明のリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応用分析装置
１００：マイクロチャンバープレート
１１０：胴体
１１１：マイクロチャンバー
Ｌ１１１：マイクロチャンバーの幅
Ｄ１１１：マイクロチャンバーの深さ
１１２：注入部
１１３：光学測定部
１１４：空間部
１１５：隔壁部
１２０：透明層
１３０：注入層
１４０：試料供給層
１４１：供給部
１５０：第１保護部
１６０：第２保護部
１７０：胴体連結部
２００：圧力調節手段
３００：温度調節手段
４００：回転手段
Ａ：特異成分
Ｓａ〜Ｓｅ：本発明によるマイクロチャンバープレートの製造方法の各段階
Ｓイ〜Ｓニ：本発明によるマイクロチャンバープレートを用いた分析方法
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明のマイクロチャンバープレート１００、その製造方法を添付された図面を参照して詳細に説明する。
【００４８】
図１は本発明によるマイクロチャンバープレート１００の斜視図であり、図２は前記図１に示したマイクロチャンバープレート１００の断面図であり、図３は本発明によるマイクロチャンバープレート１００の他の断面図であり、図４は本発明によるマイクロチャンバープレート１００の他の斜視図であり、図５は前記図４に示したマイクロチャンバープレート１００の断面図であり、図６と図７は本発明によるマイクロチャンバープレート１００のもう一つの斜視図であり、図８は本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図であり、図９は前記図８に示したマイクロチャンバープレートの断面図であり、図１０は本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの断面図であり、図１１は本発明によるマイクロチャンバープレートのもう一つの斜視図である。
【００４９】
前記図１乃至図６は本発明のマイクロチャンバープレート１００を示した図面であって、本発明のマイクロチャンバープレート１００は大きく光学測定部１１３及び注入部１１２が形成されたマイクロチャンバー１１１が複数個形成された胴体１１０；前記胴体１１０の両側面にそれぞれ形成される透明層１２０及び注入層１３０とを含めて形成される。
【００５０】
前記胴体１１０は本発明のマイクロチャンバープレート１００をなす基本構成であって、内部に試料、反応溶液、又は溶媒などが内蔵される空間であるマイクロチャンバー１１１が複数個備えられる。
【００５１】
前記胴体１１０はシリコンウエハー、ガラス、金属、又はプラスチックで形成でき、前記マイクロチャンバー１１１は一側面に光学測定ができるように光学測定部１１３が形成され、他側面には分析に必要な物質が注入される注入部１１２が形成される。
【００５２】
前記透明層１２０は前記光学測定部１１３が形成された胴体１１０の一側面を密閉しながらも、光学測定ができるように透明な材料を用いて形成される。
【００５３】
この際、前記マイクロチャンバープレート１００は分析過程において加熱されるため、熱によって耐久性を有する材料であるものが望ましく、さらに望ましくは前記透明層１２０は０℃乃至１００℃において変形が生じない材料で構成される。
【００５４】
また、前記透明層１２０は光学測定のために特定波長の光を遮断したり、特定波長の光のみを通過せしめて最も正確な光学測定値を得るようにすることができる。
【００５５】
前記注入層１３０は前記胴体１１０の注入部１１２が形成された他側面に前記注入部１１２を遮断するように形成し、試料を含む共通試薬が前記注入層１３０を通過してマイクロチャンバー１１１の内部に注入させる。
【００５６】
前記注入層１３０は前記注入部１１２を遮断して内部に注入された物質の蒸発を防止しながらも、前記マイクロチャンバー１１１の内部に共通的に加える物質が注入されるように穿孔可能な物質又は多孔性物質で形成される。
【００５７】
前記穿孔可能な物質はフィルム形態の材料が用いられ、前記フィルム形態の注入層１３０は前記マイクロチャンバー１１１とそれぞれ連通するように穿孔される。
【００５８】
この際、前記穿孔された個数は前記マイクロチャンバー１１１の一つ当たり１乃至１０個で形成でき、前記フィルム材料としてはテフロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ＰＶＣ、又はＰＥＴなどが用いられ、前記穿孔された部分の幅は１０μｍ乃至１ｍｍ以内、さらに望ましくは１００乃至５００μｍ以内で形成せしめる。
【００５９】
前記注入層１３０を通じて注入時に圧力などが調節されて注入が容易に行われるようにすることが望ましい。
【００６０】
また、前記注入層１３０は多孔性材質を用いて穿孔の作業無しでそのまま利用可能にすることができ、前記多孔性材質としてはミクロ細孔（Micropore）、メッシュ（mesh）型物質、不織布などを用いることができ、前記多孔性材質の細孔のサイズは０.１乃至１００μｍ以内のものが望ましい。
【００６１】
前記注入層１３０を通じて試料注入が完了された後、注入された試料の流出や蒸発を防止し、マイクロチャンバー１１１間の試料混入を防止するための目的で注入層１３０の上に接着性フィルムを付着したり水分によって皮膜を形成する成分、オイル、又は常温で固体である固形成分が用いられる。注入層１３０が穿孔フィルムの材質である場合、前記注入層１３０の上部にビニルテープなどの接着性フィルムテープを付着する方法を使用することができ、前記注入層１３０が多孔性材質である場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用で開発されて市販されているミネラルオイル（Mineral Oil, Sigmaなど）を注入層１３０の上に塗布して前記注入層１３０の内に前記オイル成分を浸透させる方法が用いられる。
【００６２】
本発明のマイクロチャンバープレート１００は前記マイクロチャンバー１１１に前記注入層１３０を形成する以前にプライマー又はプローブが含まれた核酸分析のための蛍光分析試薬のような特異成分Ａが内蔵され、必要に応じて核酸増幅酵素、ＤＮＡ構成化合物（ｄＮＴＰ）、バッファー又は安定化剤（反応溶液、プライマー、酵素などと分子的によく混合されてこれらを安定化させ、容器内の吸着を減らしてくれる役割を果たす物質として、ポリオール、炭水化物、ウシアルブミン、ＰＥＧなどが例で挙げられる）がさらに含まれ、前記特異成分Ａはその組成によって乾燥、半乾燥、又は液状の状態で用いられる。
【００６３】
つまり、透明層１２０が形成されて一側が閉鎖されたマイクロチャンバー１１１の内部に、試料に合い異なる特性を有する特異成分Ａ、即ちそれぞれ固有の機能を付与する物質が予め内蔵され、前記注入層１３０が形成されると、マイクロチャンバープレートが形成される。その後、前記マイクロチャンバープレートを用いて試料を分析するためにはマイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬を遠心力、減圧又は加圧によって一時に注入する（下記の分析方法でさらに詳細に説明する）。
【００６４】
先ず、図面を通じて本発明のマイクロチャンバープレート１００の例を調べてみる。
【００６５】
図１及び図２は胴体１１０に同一な幅（Ｌ１１１）で円形断面を有するマイクロチャンバー１１１が複数個備えられた形態で、前記注入層１３０及び透明層１２０が前記胴体１１０と別途の構成で付着された形態を図示した。
【００６６】
前記マイクロチャンバー１１１は０．３乃至３ｍｍの幅（Ｌ１１１）を有して、０．５乃至５ｍｍの深さ（Ｄ１１１）を有するように形成されるため、本発明のマイクロチャンバープレート１００は最も多い数のマイクロチャンバー１１１を形成することができて同時に分析作業がなされ、深さ（Ｄ１１１）が浅くて熱伝導性能がよく、分析時間を縮め、分析の正確度を高めることができる。
【００６７】
実際に、標準８０×１２５ｍｍの胴体１１０に幅（Ｌ１１１）が０．３乃至２．２５ｍｍであるマイクロチャンバー１１１を２４，５７６個を形成することができ、０．１乃至５μｍ以下の微量試料の反応に適合して本発明のマイクロチャンバープレート１００は微量の反応溶液を使用して多数の遺伝子を同時に定量的に分析することができるという長所がある。
【００６８】
図３は本発明のマイクロチャンバープレート１００の他の例を示した断面図であって、前記図３（ａ）に図示したマイクロチャンバープレート１００は前記胴体１１０と透明層１２０が一体化された形態で、別途の透明層１２０を形成する段階を減らすことができる形態であって、前記透明層１２０と胴体１１０が一体化されて形成されるとしても、前記透明層１２０は光学測定が可能であるように形成しなければならない。
【００６９】
前記図３（ｂ）に図示した形態は前記胴体１１０の光学測定部１１３が形成された面に段差が形成され、前記段差された領域に透明層１２０が形成されて、前記透明層１２０を形成することによって突出される部分が存在しないように形成された例を図示した。
【００７０】
本発明のマイクロチャンバープレート１００は前記マイクロチャンバー１１１が前記図面から図示された円形の形態の他にも四角形、五角形などその断面が多様に形成されることができ、上・下方向に行くほどその幅（Ｌ１１１）が変形されるようにすることもできる。
【００７１】
前記注入層１３０が形成されたマイクロちゃんバープレート１００は試料を含む共通試薬を前記マイクロチャンバー１１１の内部に注入する多様な方法として先ず、前記マイクロチャンバープレート１００、その自体を前記試料を含む共通試薬が漬けられた容器に入れて注入せしめることができる。
【００７２】
二番目に、本発明のマイクロチャンバープレート１００は前記胴体１１０の注入部１１２が形成された面の周縁が突出されて上側が開口された空間部１１４が形成され、前記空間部１１４に試料を含む共通試薬を直接供給することができる。
【００７３】
三番目に、前記図４及び図５に示したように、一側に試料を含む共通試薬が供給される供給部１４１が形成され、前記空間部１１４を遮断する試料供給層１４０がさらに形成され、前記試料供給層１４０を形成した後、前記供給部１４１を通じて試料を含む共通試薬を前記注入層１３０の上部に供給してそれぞれのマイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬が供給されるようにする。
【００７４】
四番目に、前記図６に図示されたように、前記三番目の方法と同一に試料供給層１４０がさらに形成されるが、前記供給部１４１が前記胴体１１０の一側に形成された例を示した。
【００７５】
前記試料供給層１４０がさらに形成された場合に、前記試料を含む共通試薬を保護し、供給された量を正確に制御することができ、前記注入層１３０を保護することができる効果が得られる。
【００７６】
この際、前記試料供給層１４０は供給される試料を含む共通試薬は外部に排出されなく、内部の気体は排出可能な材料で形成されて試料を含む共通試薬の流出は防止し、前記マイクロチャンバー１１１の内部に残存する気体は外部に排出できるようにする。
【００７７】
前記マイクロチャンバー１１１の内部に気体が残留する場合に、前記気体によって光が分散されて光学測定の正確度を低下させる原因となるため、本発明のマイクロチャンバープレート１００は前記マイクロチャンバー１１１の内部の気体が排出されるように行って、前記の問題点を未然に防止することができるようにする長所がある。
【００７８】
前記マイクロチャンバープレート１００はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の他にも定温酵素反応、又はＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）のような反応に用いられ、内部に内蔵される特異成分Ａなどを変形することによってこの他にも多様に用いることことができる。
【００７９】
図７は本発明によるマイクロチャンバープレート１００のもう一つの例であって、本発明のマイクロチャンバー１１１は必要に応じて移送できるため、前記透明層１２０を保護する第１保護部１５０、又は前記注入層１３０を保護する第２保護部１６０がさらに形成されることができる。
【００８０】
前記第１保護部１５０、及び第２保護部１６０は必要に応じてそれぞれ複数個が形成でき、前記試料供給層１４０がさらに形成された場合に前記第２保護部１６０は前記注入層１３０又は試料供給層１４０の上側に形成される。
【００８１】
前記第１保護部１５０は光学測定のために剥離可能な接着性フィルム又は脱・付着可能な部材が用いられ、前記第２保護部１６０は内部溶液の流出を防止して外部からの汚染を遮断するように接着性フィルムが用いられる。保護用フィルムで取り扱い中に物理的な損傷から基底の膜を保護することができる強度を有しながらも剥離が容易であって除去過程中に基底の膜を損傷させないで付着面に異物質が残らない粘着性フィルムなどを使用することができ、脱・付着可能な部材としてはプレート用蓋を使用することができる。
【００８２】
図８乃至図１１は上述したような特徴を有する本発明のマイクロチャンバープレート１００が複数個形成された例を図示した例であって、前記マイクロチャンバープレート１００が複数個形成された例もやはり本発明のマイクロチャンバープレート１００の範疇に属するが、円滑な説明のために一つの単位を形成するマイクロチャンバープレート１００が複数個形成されたものをマルチマイクロチャンバープレート１００′及び図面符号１００′で示して説明する。
【００８３】
前記図８及び図９に示したように、本発明のマルチマイクロチャンバープレート１００′は光学測定部１１３及び注入部１１２が形成されたマイクロチャンバー１１１が複数個形成された胴体１１０；前記胴体１１０の両側面にそれぞれ形成される透明層１２０；及び注入層１３０を含めて形成されたマイクロチャンバープレート１００が複数個形成される。
【００８４】
前記マイクロチャンバープレート１００が複数個形成されたマルチマイクロチャンバープレート１００′も上述したようなマイクロチャンバープレート１００の特徴を有し、図面を参照してその例を説明する。
【００８５】
前記図８及び図９に示したマルチマイクロチャンバープレート１００′は前記胴体１１０の注入層１３０が形成される側に隣り合うマイクロチャンバープレート１００を連結する胴体連結部１７０が形成され、前記透明層１２０が前記胴体１１０と一体で形成された例を図示したが、前記胴体連結部１７０は隣り合うマイクロチャンバープレート１００を連結する如何なる形態でも形成することができる。
【００８６】
つまり、前記マルチマイクロチャンバープレート１００′は上述したようなマイクロチャンバープレート１００が一つの単位体を形成し、これが複数個連結されて一体で形成された例であって、前記マルチマイクロチャンバープレート１００′は一つのマイクロチャンバープレート１００に４乃至１６個のマイクロチャンバー１１１を形成し、前記マイクロチャンバープレート１００が８乃至９６個を含むように構成されることができる。
【００８７】
この際、前記マルチマイクロチャンバープレート１００′を形成するそれぞれのマイクロチャンバープレート１００は内部に他の特異成分Ａが内蔵されており、前記注入層１３０を通じて注入される共通試薬の種類も異なるため、前記マルチマイクロチャンバープレート１００′はそれぞれのマイクロチャンバープレート１００に前記胴体１１０の注入部１１２が形成された面の周縁が突出されて上側が開口された空間部１１４が形成され、前期マイクロチャンバー１１１の内部に注入される共用試薬又は試料が前記注入層１３０の上部に形成された空間部１１４に直接供給されるようにすることが望ましい。
【００８８】
前記空間部１１４を形成するために、前記図８及び図９に示したように、前記胴体１１０の注入部１１２が形成された側に上部に突出される隔壁部１１５が形成されることができる。
【００８９】
前記図８及び図９は前記隔壁部１１５が胴体１１０と一体で形成され、それぞれのマイクロチャンバープレート１００毎に同一な特異成分Ａが内蔵されたマイクロチャンバー１１１を含むように形成された例を図示したが、隣り合うマイクロチャンバープレート１００間を区画する一つの隔壁部１１５が存在するように行うことができ、この他にもそれぞれのマイクロチャンバープレート１００に試薬が注入できる空間を形成することができる形態であれば多様に形成できる。
【００９０】
つまり、本発明のマルチマイクロチャンバープレート１００′は前記胴体１１０のマイクロチャンバー１１１の内部には特異成分Ａが内蔵され、それぞれのマイクロチャンバープレート１００に相異なる特異成分Ａが内蔵せしめ、それぞれの特異成分Ａに要求される相異なる試薬を注入するように行うことによって同時に様々な種類の試料分析ができる長所がある。
【００９１】
前記図１０に図示した本発明のマルチマイクロチャンバープレート１００′は前記胴体１１０に特異成分Ａが内蔵されるマイクロチャンバー１１１が複数個形成され、両側が開放された形態で前記開放された一側面に透明層１２０が形成され、他側面に注入層１３０が形成される。
【００９２】
また、一つの前記マイクロチャンバープレート１００の注入部１１２が形成された面には前記マイクロチャンバー１１１の周縁が突出されて上側が開口された空間部１１４を形成するようにし、前記空間部１１４に共通試薬を供給するようにし、前記空間部１１４を遮断する試料供給層１４０がさらに形成されることができる。
【００９３】
前記試料供給層１４０には試料が供給される供給部１４１が形成され、前記空間部１１４は前記胴体連結部１７０の一側面が突出されて形成される。
【００９４】
前記図１０は前記透明層１２０を保護する第１保護部１５０及び前記注入層１３０及び試料供給層１４０を保護する第２保護部１６０が形成された例を図示した。
【００９５】
前記図８乃至図１０は前記マイクロチャンバープレート１００が一列で連結された例を図示したが、前記図１１に示しように、本発明のマルチマイクロチャンバープレート１００′は前記マイクロチャンバープレート１００が多列を形成するように複数個が連結できる。
【００９６】
また、前記マルチマイクロチャンバープレート１００′はそれぞれのマイクロチャンバープレート１００に独立な試薬を注入することができるように前記胴体１１０の注入部１１２が形成された面の周縁が突出されて上側が開口された空間部１１４が形成され、前記マイクロチャンバー１１１の内部に注入される共用試薬又は試料が前記注入層１３０の上部に形成された空間部１１４に直接供給するようにすることによって一回の実験で多様な種類の試料を実験することができるように行う。
【００９７】
一方、本発明のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応用分析装置１０００は上述したような特徴を有するマイクロチャンバープレート１００を用いることを特徴とする。
【００９８】
図１２は本発明によるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応用分析装置１０００の構成図であって、前記図１２に示したように、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応用分析装置１０００は圧力調節手段２００又は回転手段４００が備えられ、同時に温度調節手段３００又は光学測定手段５００がさらに備えられる。
【００９９】
次に、図１３ａは本発明のマイクロチャンバープレート１００の製造方法に従う段階図であって、本発明のマイクロチャンバープレート１００の製造方法はａ）胴体１１０用意段階（Ｓａ）；ｂ）透明層１２０形成段階（Ｓｂ）；ｃ）特異成分Ａの分注段階（Ｓｃ）；及びｄ）注入層１３０形成段階（Ｓｄ）；とを含めて製造されることを特徴とする。
【０１００】
前記ａ）胴体１１０用意段階（Ｓａ）は一側面に光学測定が可能な光学測定部１１３が形成され、多側面に試料の注入が可能な注入部１１２が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバー１１１が形成された胴体１１０が用意される段階である。
【０１０１】
前記ｂ）透明層１２０形成段階（Ｓｂ）は前記用意された胴体１１０の光学測定部１１３が形成された面を遮断する透明層１２０を形成する段階であって、製造環境によって前記胴体１１０用意段階と透明層１２０形成段階（Ｓｂ）は前記胴体１１０と透明層１２０を一体化して一回の工程で形成されることもできる。
【０１０２】
前記ｃ）特異成分Ａの分注段階（Ｓｃ）は前記透明層１２０によって一側が密閉されたマイクロチャンバー１１１の内部に特異成分Ａが内蔵されるようにする段階であって、前記特異成分Ａはプレイマー又はプローブの他にも核酸増幅酵素、ＤＮＡ構成化合物（ｄＮＴＰ）、バッファー、又は安定化剤が含まれる。
【０１０３】
前記ｄ）注入層１３０形成段階（Ｓｄ）は前記特異成分Ａが内蔵されたマイクロチャンバー１１１の注入部１１２を遮断する注入層１３０を形成する段階であって、前記注入層１３０は前記注入部１１２を遮断して内部物質の流出を防止することにより前記特異物質が交差汚染されないようにする役割を担当し、共通的に加える試料を含む共通試薬が一回に前記マイクロチャンバー１１１の内部に供給できるように多孔性材質又は穿孔可能な材質を用いて形成する。
【０１０４】
同時に、本発明のマイクロチャンバープレート１００の製図方法は図１３ｂに示したように、ｅ）前記ｄ）注入層１３０形成段階（Ｓｄ）の以後に、ｅ）前記注入層１３０を保護する第１保護部１５０又は前記透明層１２０を保護する第２保護部１６０を形成する段階（Ｓｅ）が追加される。
【０１０５】
このように、本発明のマイクロチャンバープレート１００の製造方法は前記注入層１３０を形成してナノジェット分注器のような特殊な分注装備を必要にせず、共通成分を汚染無く速く供給することができて短時間内に分析に必要なマイクロチャンバープレート１００を製造することができ、それで分析の効率性を高めることができ、圧力調節手段２００又は回転手段４００が備えられる場合に、前記マイクロチャンバープレート１００の製造時間を縮めることができる。
【０１０６】
図１４ａは本発明のマイクロチャンバープレート１００の分析方法による他の段階図であって、本発明のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法は上述したようなマイクロチャンバープレート１００を用い、イ）製造されたマイクロチャンバープレート１００の注入層１３０を通じて前記マイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬を注入する段階（Ｓイ）；及びロ）前記特異成分Ａと試料を含む共通試薬が反応される段階（Ｓロ）；とを含むことを特徴とする。
【０１０７】
前記試料を含む共通試薬を注入する段階（Ｓイ）は前記マイクロチャンバープレート１００のマイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬を注入する段階であって、場合によって前記試料を含む共通試薬を注入する段階（Ｓイ）が繰り返して行うことができる。
【０１０８】
また、前記試料を含む共通試薬注入段階（Ｓイ）において前記マイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬が円滑に注入できるように遠心力、減圧又は加圧が作用されて最も速く注入できるように行うことができ、前記注入層１３０の上部に前記注入層１３０を保護する第１保護部１５０が形成された場合に、前記第１保護部１５０を除去した後、前記注入層１３０を通じて試料を含む共通試薬を注入することは当然である。
【０１０９】
なお、前記試料を含む共通試薬反応段階（Ｓロ）は前記特異成分Ａと試料を含む共通試薬が反応される段階であって、前記試料を含む共通試薬反応段階（Ｓロ）はポリメラーゼ連鎖反応（PCR, polymerase chain reaction）ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）、又はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR, Real time-PCR）から選ばれるいずれかの反応が行われる。
【０１１０】
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は一般的なポリメラーゼ連鎖反応と比べて増幅課程中に各反応のサイクル別に光学測定がさらに必要であるため、本発明のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法においてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を通じて分析するようになる場合に、光学測定（蛍光分析）段階がサイクル別に行わなければならなく、本発明はこれのみならず各反応に適当な追加的な段階がさらに行うことができる。
【０１１１】
また、図１４ｂに示したように、本発明のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法はハ）前記試料を含む共通試薬の注入が完了されると、注入層の材質によって選択的に前記注入層１３０の上層面をシールする段階（Ｓハ）；がさらに含まれる。
【０１１２】
前記注入層１３０シール段階（Ｓハ）は前記試料を含む共通試薬の注入が完了された後、前記注入層１３０の上層面をシールする段階である。試料を含む共通試薬の注入が完了された後、接着性フィルム、水分によって皮膜を形成する成分、オイル、又は常温で固体である固形成分を用いて注入層１３０をシールしてマイクロチャンバー内の状態（プライマー又はプローブなどの特異成分と試料を含む共通試薬が混合された状態）を保持するようにすることができる。
【０１１３】
また、図１４ｃに示したように、本発明のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法は前記マイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬の注入時に前記マイクロチャンバー１１１の内部に残存した気体が排出できなく残っている場合、前記残留気体は光学測定時に光を散乱する要素で作用して分析の正確度を阻害するようになる。従って、ニ）前記試料を含む共通試薬の注入段階（Ｓイ）において複数個の試料が順次に注入される場合、一つの試料又は試薬の注入が完了された後、前記マイクロチャンバープレート１００の圧力が調節される段階（Ｓニ）；がさらに含まれる。
【０１１４】
同時に、前記圧力調節段階（Ｓニ）は前記マイクロチャンバー１１１の内部の残留気体が排気できるように減圧−解除又は加圧され、必要に応じて前記過程が繰り返して行われる。
【０１１５】
前記から減圧−解除、又は加圧とは、減圧−解除過程、加圧過程、減圧−解除−加圧の過程を全て含む。
【０１１６】
本発明は前記した実施例に限られなく、適用範囲が多様であることは勿論、請求範囲から請求する本発明の要旨を外れなく多様な変形実施ができることは当然である。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
従って、本発明のマイクロチャンバープレート、その製造方法は要求される試料の量が少なくて反応溶液の使用量を減らすことができ、前記マイクロチャンバープレートの厚さが薄くて温度調節が容易であることによって分析にかかる時間を画期的に縮めることができ、マイクロチャンバー間の溶液が混入されることに伴って発生される汚染問題及びマイクロチャンバーの内部の残留気体によって光学測定値が正しく測定されない問題を未然に防止することで分析の正確度を高めることができるという長所がある。
【０１１８】
また、本発明のマイクロチャンバープレート、その製造方法はマイクロチャンバーの内部に溶液の注入が容易であって大量の試料を一回に処理することができながらもその使用及び処理が簡単で分析工程を簡素化することができるという長所がある。
【０１１９】
共に、本発明は複数個のマイクロチャンバープレートが一体で形成できてそれぞれのマイクロチャンバープレートに合い異なる共通試薬が内蔵されるようにして様々な種類の試料を同時に分析及び比較することによって分析にかかる時間を画期的に短縮することができるという長所がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一側面に光学測定ができるように光学測定部１１３が形成され、他側面に試料の注入ができるように中空された注入部１１２が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバー１１１が形成された胴体１１０；
前記胴体１１０の一側面に前記光学測定部１１３を密閉する透明層１２０；及び
前記胴体１１０の他側面に前記注入部１１２を遮断し、試料を含む共通試薬がマイクロチャンバー１１１の内部に注入されるようにする注入層１３０；とを含めて形成されることを特徴とするマイクロチャンバープレート。
【請求項２】
前記マイクロチャンバー１１１は前記注入層１３０の形成以前にプライマー又はプローブが含まれた核酸分析のための特異成分Ａが内蔵されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項３】
前記注入層１３０は試料を含む共通試薬の注入が完了された後、接着性フィルム、水分によって皮膜を形成する成分、オイル、または常温で固体である固形成分を用いてシールされることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項４】
前記マイクロチャンバー１１１は核酸増幅酵素、ＤＮＡ構成化合物（ｄＮＴＰ）、又はバッファーがさらに内蔵されることを特徴とする請求項２に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項５】
前記注入層１３０は穿孔できるフィルムからなり、前記マイクロチャンバー１１１のそれぞれと連通されるように穿孔されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項６】
前記注入層１３０は多孔性材質で形成されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項７】
前記透明層１２０は０℃乃至１００℃において変形が生じない材質で形成されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項８】
前記マイクロチャンバープレート１００は、
前記胴体１１０の注入部１１２が形成された面の縁周が突出されて上側が開口された空間部１１４が形成され、前記マイクロチャンバー１１１の内部に注入される共用試薬又は試料が前記注入層１３０の上部に形成された空間部１１４に直接供給されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項９】
前記マイクロチャンバープレート１００は、
一側に試料を含む共通試薬が供給される供給部１４１が形成され、前記空間部１１４を遮断して気体は排出できる試料供給層１４０がさらに形成されることを特徴とする請求項８に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１０】
前記マイクロチャンバープレート１００は、
試料を含む共通試薬が含まれた別途の容器にマイクロチャンバープレート１００を漬けて前記試料を含む共通試薬が前記マイクロチャンバー１１１の内部に注入されるように行うことを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１１】
前記マイクロチャンバー１１１は０．３乃至３ｍｍの幅（Ｌ１１１）で形成されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１２】
前記マイクロチャンバー１１１は０．５乃至５ｍｍの深さ（Ｄ１１１）で形成されることを特徴とする請求項１１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１３】
前記マイクロチャンバープレート１００は前記透明層１２０を保護する第１保護部１５０、又は前記注入層１３０を保護する第２保護部１６０とが形成されることを特徴とする請求項３に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１４】
前記第１保護部１５０又は第２保護部１６０は剥離可能な接着性フィルム又は脱・付着可能な部材が用いられることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１５】
前記マイクロチャンバープレート１００は、
複数個が一体で形成されることを特徴とする請求項１乃至請求項１４のいずれかに記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１６】
ａ）一側面に光学測定ができる光学測定部１１３が形成され、他側面に試料の注入ができる注入部１１２が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバー１１１が形成された胴体１１０が用意される段階（Ｓａ）；
ｂ）前記胴体１１０の光学測定部１１３に透明層１２０が形成される段階（Ｓｂ）；
ｃ）前記胴体１１０の注入部１１２に特異成分Ａが分注されて、それぞれのマイクロチャンバープレート１００に合い異なる特異成分Ａが内蔵される段階（Ｓｃ）；及び
ｄ）前記マイクロチャンバープレート１００の他側面に注入層１３０が形成される段階（Ｓｄ）；とを含めて製造されることを特徴とするマイクロチャンバープレート１００の製造方法。
【請求項１７】
前記請求項１に記載のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法は、
イ）製造されたマイクロチャンバープレート１００の注入層１３０を通じて前記マイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬を注入する段階（Ｓイ）；及び
ロ）前記特異成分Ａと試料を含む共通試薬が反応される段階（Ｓロ）；とを含むことを特徴とするマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法。
【請求項１８】
前記マイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法は、
ハ）前記試料を含む共通試薬の注入が完了されると、前記注入層１３０の上層面がシールされる段階（Ｓハ）がさらに含まれることを特徴とする請求項１７に記載のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法。
【請求項１９】
前記試料を含む共通試薬の注入段階（Ｓイ）は前記マイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬が円滑に注入できるように遠心力、減圧又は加圧が作用されることを特徴とする請求項１７に記載のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法。
【請求項２０】
ニ）前記試料を含む共通試薬の注入段階（Ｓイ）において複数個の試料が順次に注入される場合、一つの試料注入が完了された後、前記マイクロチャンバープレート１００の圧力が調節される段階（Ｓニ）がさらに含まれることを特徴とする請求項１７又は請求項１８に記載のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法。
【請求項２１】
前記圧力調節段階（Ｓニ）は前記マイクロチャンバー１１１の内部の残留気体が排気できるように減圧−解除、又は加圧されることを特徴とする請求項２０に記載のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法。
【請求項１】
一側面に光学測定ができるように光学測定部１１３が形成され、他側面に試料の注入ができるように中空された注入部１１２が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバー１１１が形成された胴体１１０；
前記胴体１１０の一側面に前記光学測定部１１３を密閉する透明層１２０；及び
前記胴体１１０の他側面に前記注入部１１２を遮断し、試料を含む共通試薬がマイクロチャンバー１１１の内部に注入されるようにする注入層１３０；とを含めて形成されることを特徴とするマイクロチャンバープレート。
【請求項２】
前記マイクロチャンバー１１１は前記注入層１３０の形成以前にプライマー又はプローブが含まれた核酸分析のための特異成分Ａが内蔵されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項３】
前記注入層１３０は試料を含む共通試薬の注入が完了された後、接着性フィルム、水分によって皮膜を形成する成分、オイル、または常温で固体である固形成分を用いてシールされることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項４】
前記マイクロチャンバー１１１は核酸増幅酵素、ＤＮＡ構成化合物（ｄＮＴＰ）、又はバッファーがさらに内蔵されることを特徴とする請求項２に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項５】
前記注入層１３０は穿孔できるフィルムからなり、前記マイクロチャンバー１１１のそれぞれと連通されるように穿孔されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項６】
前記注入層１３０は多孔性材質で形成されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項７】
前記透明層１２０は０℃乃至１００℃において変形が生じない材質で形成されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項８】
前記マイクロチャンバープレート１００は、
前記胴体１１０の注入部１１２が形成された面の縁周が突出されて上側が開口された空間部１１４が形成され、前記マイクロチャンバー１１１の内部に注入される共用試薬又は試料が前記注入層１３０の上部に形成された空間部１１４に直接供給されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項９】
前記マイクロチャンバープレート１００は、
一側に試料を含む共通試薬が供給される供給部１４１が形成され、前記空間部１１４を遮断して気体は排出できる試料供給層１４０がさらに形成されることを特徴とする請求項８に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１０】
前記マイクロチャンバープレート１００は、
試料を含む共通試薬が含まれた別途の容器にマイクロチャンバープレート１００を漬けて前記試料を含む共通試薬が前記マイクロチャンバー１１１の内部に注入されるように行うことを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１１】
前記マイクロチャンバー１１１は０．３乃至３ｍｍの幅（Ｌ１１１）で形成されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１２】
前記マイクロチャンバー１１１は０．５乃至５ｍｍの深さ（Ｄ１１１）で形成されることを特徴とする請求項１１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１３】
前記マイクロチャンバープレート１００は前記透明層１２０を保護する第１保護部１５０、又は前記注入層１３０を保護する第２保護部１６０とが形成されることを特徴とする請求項３に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１４】
前記第１保護部１５０又は第２保護部１６０は剥離可能な接着性フィルム又は脱・付着可能な部材が用いられることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１５】
前記マイクロチャンバープレート１００は、
複数個が一体で形成されることを特徴とする請求項１乃至請求項１４のいずれかに記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１６】
ａ）一側面に光学測定ができる光学測定部１１３が形成され、他側面に試料の注入ができる注入部１１２が形成され、複数個の空間で区画されたマイクロチャンバー１１１が形成された胴体１１０が用意される段階（Ｓａ）；
ｂ）前記胴体１１０の光学測定部１１３に透明層１２０が形成される段階（Ｓｂ）；
ｃ）前記胴体１１０の注入部１１２に特異成分Ａが分注されて、それぞれのマイクロチャンバープレート１００に合い異なる特異成分Ａが内蔵される段階（Ｓｃ）；及び
ｄ）前記マイクロチャンバープレート１００の他側面に注入層１３０が形成される段階（Ｓｄ）；とを含めて製造されることを特徴とするマイクロチャンバープレート１００の製造方法。
【請求項１７】
前記請求項１に記載のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法は、
イ）製造されたマイクロチャンバープレート１００の注入層１３０を通じて前記マイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬を注入する段階（Ｓイ）；及び
ロ）前記特異成分Ａと試料を含む共通試薬が反応される段階（Ｓロ）；とを含むことを特徴とするマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法。
【請求項１８】
前記マイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法は、
ハ）前記試料を含む共通試薬の注入が完了されると、前記注入層１３０の上層面がシールされる段階（Ｓハ）がさらに含まれることを特徴とする請求項１７に記載のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法。
【請求項１９】
前記試料を含む共通試薬の注入段階（Ｓイ）は前記マイクロチャンバー１１１の内部に試料を含む共通試薬が円滑に注入できるように遠心力、減圧又は加圧が作用されることを特徴とする請求項１７に記載のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法。
【請求項２０】
ニ）前記試料を含む共通試薬の注入段階（Ｓイ）において複数個の試料が順次に注入される場合、一つの試料注入が完了された後、前記マイクロチャンバープレート１００の圧力が調節される段階（Ｓニ）がさらに含まれることを特徴とする請求項１７又は請求項１８に記載のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法。
【請求項２１】
前記圧力調節段階（Ｓニ）は前記マイクロチャンバー１１１の内部の残留気体が排気できるように減圧−解除、又は加圧されることを特徴とする請求項２０に記載のマイクロチャンバープレート１００を用いた試料分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５０５１３０（Ｐ２０１１−５０５１３０Ａ）
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３５８６８（Ｐ２０１０−５３５８６８）
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００５６３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６９８８６
【国際公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０２２３５７７３）バイオニア コーポレーション (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００５６３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６９８８６
【国際公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０２２３５７７３）バイオニア コーポレーション (14)
【Ｆターム（参考）】
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