マイクロＲＮＡ及びそれを阻害する方法
【課題】マイクロＲＮＡのような膵島細胞の調節因子の機能を解明する一助となり得る材料及び方法の提供。更に標的ｍＲＮＡの膵臓マイクロＲＮＡによって誘発された裂開又は翻訳抑制を阻止する新規な分子の提供。
【解決手段】本発明は、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ膵島マイクロＲＮＡ分子、更に本発明は、修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子又は単離された一本鎖アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子に関する。また本発明は、細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害するための手段を提供する。
【解決手段】本発明は、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ膵島マイクロＲＮＡ分子、更に本発明は、修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子又は単離された一本鎖アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子に関する。また本発明は、細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害するための手段を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵島マイクロＲＮＡ及びそれを阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡは、典型的には小さいＲＮＡ分子、すなわち一般に長さ約１９から２５ヌクレオチド長のＲＮＡ分子である。これらのマイクロＲＮＡは、ヘアピン前駆体が分裂して生じるノンコーディングＲＮＡである。幾つかのマイクロＲＮＡは、広範囲にわたる多細胞生物のゲノムにおいて同定されている。
【０００３】
多くのマイクロＲＮＡは、近縁でない生物種間でもその配列が保存されており、組織特異的又は発生の各段階において特徴的な発現を呈する。生物種間の配列の保存は、マイクロＲＮＡが生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことを示唆する。
【０００４】
マイクロＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの３’側のノンコーディング領域に部分的にハイブリダイズした後に翻訳をブロックすることが報告されている。前記マイクロＲＮＡの標的となる遺伝子は未だ解明すべき部分が残されている。
【０００５】
しかしながら、マイクロＲＮＡは多様な疾病や症状を発症させることを示唆する証拠が揃いつつある。例えば、ショウジョウバエのマイクロＲＮＡは、アポトーシスに関連する遺伝子を標的としていることが明らかとされ、またＢ細胞慢性リンパ性白血病は、二つのマイクロＲＮＡの欠失が関与していることが明らかとされている。
【０００６】
膵島細胞（また、ランゲルハンス島とも称される）は、ホルモン類の産生、分泌に特化した細胞の群である。また、次の５種類の細胞：α、β、δ、ＰＰ及びＤ１細胞が存在すると報告されている。
【０００７】
これらの細胞は、グルコースの調節に関与していると言われている。例えば、α細胞は、血液のグルコースのレベルを増やすことに関係するホルモン類であるグルカゴンを分泌する。またβ細胞は、生体がグルコースをエネルギー生成のために利用するのを補助するホルモンであるインスリンを分泌する。
【０００８】
グルコース利用の調節の妨害は、特にインスリン分泌β細胞において、例えば糖尿病などの疾患につながり得る。したがって、グルコースホメオスタシスの調節において役割を果たす遺伝子の調節機構を解明することは重要である。例えば、仮にマイクロＲＮＡがグルコース利用を調節するとしても、そのような事実は従来技術において公知でない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記に鑑み、例えばマイクロＲＮＡのような膵島細胞の調節因子の機能を解明する一助となり得る材料及び方法が求められている。
【００１０】
更に、マイクロＲＮＡはＲＮＡ分解を誘発するか又は重要なタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制する能力を有するため、標的ｍＲＮＡの膵臓マイクロＲＮＡによって誘発された裂開又は翻訳抑制を阻止する新規な分子が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一つの実施態様において、本発明は、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。前記分子は、配列番号：１−２０に示される膵島マイクロＲＮＡに含まれる塩基配列のうち、少なくとも１０の隣接する塩基配列をを含む。但し、前記塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、また前記隣接する塩基の最高１０％が非相補的でもよい。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は、修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子に関する。前記分子は、基本分子上に最低１０の部分及び最高５０の部分を含み、前記基本分子はから基本単位を含み、各々の部分は基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基が配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列を含む。但し、前記塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対であり、また隣接する塩基の最高１０％がそれについて付加、欠失、変異又はその組合せであってもよい。また、隣接する部分の５０％以上はデオキシリボ核酸の基本単位を含まず、少なくとも一つの部分が、未修飾のデオキシリボヌクレオチド部分若しくは未修飾のリボヌクレオチド部分でない。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、単離された一本鎖アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子に関する。前記分子は、基本分子上に最低１０の部分及び最高５０の部分を含み、基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各々の塩基が相補的な塩基との間でワトソン−クリック塩基対を形成しており、少なくとも１０の隣接する塩基が、配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡ分子のいずれか一つの隣接する塩基配列と相補的な配列を含む。ただし、その塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対であり、また隣接する塩基の最高１０％がそれについて付加、欠失、変異又はその組合せであってもよい。また、隣接する部分の５０％以上はデオキシリボ核酸の基本単位を含まず、少なくとも一つの部分が、未修飾のデオキシリボヌクレオチド部分若しくは未修飾のリボヌクレオチド部分でない。また、前記分子は、マイクロＲＮＰ活性を阻害することができる。
【００１４】
更に別の実施形態では、本発明は、細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法に関する。マイクロＲＮＰは、膵島マイクロＲＮＡ分子を含む。前記方法は、一本鎖アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子を細胞に導入することを含む。そこにおいて、前記アンチ−膵島マイクロＲＮＡは、膵島マイクロＲＮＡ分子と相補的である。
【００１５】
更なる実施態様において、本発明は、哺乳類の患者の糖尿病を治療する方法に関する。前記方法は、配列番号：４１又は５１に示す配列を有する少なくとも１０の隣接する塩基を有するアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の有効量を、哺乳類に導入することを含む。
【００１６】
他の実施形態では、本発明は、本発明に従って単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子からを含む単離されたマイクロＲＮＰに関する。更に他の実施形態では、本発明は、本発明に従って単離された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子を含む単離されたマイクロＲＮＰに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
膵島マイクロＲＮＡ分子
発明者は、新規な膵島マイクロＲＮＡ分子を発見した。これらの分子は、配列番号：１から２０を有する。したがって、一つの実施態様において、本発明は、単離された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００１８】
マイクロＲＮＡ分子は、従来技術において周知である（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ，２００４，１１６，２８１−２９７）。ＢａｒｔｅｌによるマイクロＲＮＡ分子に関する定義及び特徴は、本願明細書に援用される。この種の分子は、ゲノムの染色体位置に由来し、特定のマイクロＲＮＡ遺伝子から生じる。
【００１９】
成熟したマイクロＲＮＡ分子は、部分的にヘアピン構造を形成する前駆体転写物からプロセシングされる。前記ヘアピン構造はＤｉｃｅｒとして公知の酵素によって適当に切断される。それにより一つのマイクロＲＮＡデュプレックスを生成する。Ｂａｒｔｅｌの上記文献を参照のこと。
【００２０】
通常、マイクロＲＮＡデュプレックスの２本鎖のうちの１本は、マイクロＲＮＡリボ核タンパク複合体（マイクロＲＮＰ）で包まれる。例えば、ヒトのマイクロＲＮＰはタンパク質ｅＩＦ２Ｃ２、ヘリカーゼＧｅｍｉｎ３及びＧｅｍｉｎ４を含む。
【００２１】
一つの実施態様において、本発明は、配列番号：１から２０に示される配列及びそれの均等物を有する少なくとも１０の隣接する塩基から成る、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。望ましくは、前記の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、一連の塩基を有する少なくとも１３、より好ましくは、少なくとも１５及び更により好ましくは少なくとも２０の隣接する塩基であり、配列番号：１−２０に示される膵島マイクロＲＮＡ中の配列を有する。
【００２２】
（表１及び２）：膵島マイクロＲＮＡ及びヘアピン前駆体配列。接頭辞「ｈｓａ」を有するマイクロＲＮＡの名前はヒトの配列、接頭辞「ｒｎｍｕ」はマウスの配列を示す。ヘアピン前駆体の膵島マイクロＲＮＡ配列部を太字で示す。
【表１】
【表２】
【００２３】
本願明細書において、塩基とは、天然のＤＮＡ又はＲＮＡで見られるヌクレオチドの塩基のいずれか一つのことを指す。前記塩基は、プリン又はピリミジンである。前記プリン塩基の例としては、アデニン（Ａ）と、グアニン（Ｇ）が含まれる。前記ピリミジン塩基の例としては、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。アデニンは、２，６−ジアミノプリンと置換されてもよい。
【００２４】
本願明細書において開示される未修飾の核酸分子の配列は、ウラシル塩基を有して示される。ウラシル塩基は、未修飾のＲＮＡ分子中で生じる。本発明には、未修飾のＤＮＡ分子も含まれる。未修飾のＤＮＡ分子の塩基の配列は、未修飾のＲＮＡ分子と同様である。但し、未修飾のＤＮＡ分子では、ウラシル塩基はチミン塩基と交換される点で例外的である。
【００２５】
配列中の各々の塩基は、ワトソン−クリック塩基対を相補的な塩基により形成することができる。本願明細書におけるワトソン−クリック塩基対は、例えば以下の塩基間の水素結合による相互作用である。すなわち：アデニン及びチミン（Ａ−Ｔ）、アデニン及びウラシル（Ａ−Ｕ）、シトシン及びグアニン（Ｃ−Ｇ）。
【００２６】
均等物とは、少なくとも１０の隣接する塩基のうち、最高３０％がゆらぎ塩基であり、また最高１０％、更に望ましくは最高５％までの隣接する塩基が非相補的である状態の分子を指す。
【００２７】
本発明において、ゆらぎ塩基とは、分子の配列における
１）ウラシルによるシトシンの置換、又は
２）グアニンによるアデニンの置換
のいずれの場合も含まれる。これらのゆらぎ塩基置換は一般に、ＵＧ又はＧＵゆらぎと呼ばれる。表３は、隣接する塩基の数及び分子のゆらぎ塩基の最大数を示す。
【００２８】
（表３）：隣接する塩基の数及び分子のゆらぎ塩基の最大数を示す。
【表３】
【００２９】
本願明細書において「非相補的である」とは、付加、欠失、変異又はそれらの組合せを指す。付加とは、何らかの塩基が上記隣接する配列に挿入されることを指す。欠失とは、隣接する配列に存在する何らかの部分が除去されることを指す。変異とは、隣接する配列の塩基のうちの一つが異なる塩基に置換されることを指す。
【００３０】
付加、欠失又は変異は、例えば隣接する配列のいずれの端部又は分子中の隣接する配列の部分で生じてもよい。典型的には、例えば、隣接する配列が約１０から約１５の塩基長さのまでの比較的短い場合、付加、欠失又は変異は、隣接する配列の末端付近にて生じる。隣接する配列が比較的長い場合、例えば、最低１６塩基の隣接する配列である場合は、付加、欠失又は変異は、隣接する配列のどこでも生じ得る。
【００３１】
例えば、隣接する塩基数が１０〜１９であるときは、いずれも又は隣接する塩基のうちのゼロ又は一つにおいて付加、欠失又は変異が生じ、また隣接する塩基数が２０〜２３であるときは、最高一つか二つの塩基の付加、欠失又は変異が許容範囲である。
【００３２】
膵島マイクロＲＮＡの少なくとも１０の隣接するヌクレオチドに加えて、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子はまた、一つ以上のヌクレオチドを付加することができる。なお、前記の付加するヌクレオチド数に、上限はない。典型的には、５００のヌクレオチドまで、好ましくは３００ヌクレオチドまでを、膵島マイクロＲＮＡの少なくとも１０の隣接する塩基に付加することができる。
【００３３】
いかなるヌクレオチドも付加できる。前記のヌクレオチド付加は、上記のいずれの塩基も適用可能である。したがって、例えば付加的なヌクレオチドはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵのいずれか一つ又は二つ以上でもよい。
【００３４】
一つの実施態様において、膵島マイクロＲＮＡはヘアピン前駆体配列又はそのフラグメントの一部である。例えば、適切なヘアピン前駆体配列は、配列番号：２１から４０に示される。前記フラグメントは、その５’末端及び／又は３’末端にて、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは最低２０のヌクレオチド含む、ヘアピン前駆体配列のいかなるフラグメントが適用可能である。好ましくは、前記ヌクレオチドの配列は、膵島マイクロＲＮＡが存在するヘアピン前駆体に存在する。
【００３５】
膵島マイクロＲＮＡ又はヘアピン前駆体は、例えば組換えベクターなどに挿入することができる。典型的には、膵島マイクロＲＮＡを含んでいる組換えベクターを構築するために、膵島マイクロＲＮＡ配列を含むヘアピン前駆体配列をベクターに組み込む。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４，３０３：８３−８６を参照。
【００３６】
組換えベクターは、例えばプラスミド、コスミド又はファージ等のいかなる組換えベクターでもよい。組換えベクターは、一般に複製開始点を有する。ベクターは、例えばアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）等のウイルスベクターが使用可能である。例えばＬｅｄｌｅｙ １９９６，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１３：１５９５−１６１４、Ｖｅｒｍａら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７，３８７：２３９−２４２を参照。
【００３７】
ベクターに、選択可能なマーカーを更に含めてもよい。適切な選択マーカーには、例えばテトラサイクリン又はゲンタマイシンなどの薬剤耐性マーカー、又は例えばβ−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼのような検出可能な遺伝子マーカーが使用可能である。
【００３８】
好ましい実施態様において、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、実質的に配列番号：１から４０に示される膵島マイクロＲＮＡ配列又はヘアピン前駆体配列のいずれか一つからなる。
【００３９】
本願明細書において、「単離された」とは、分子が他の核酸を本質的に含まないことを指す。他の核酸を本質的に含まない、とは、分子が少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは最低約９８％の純度で、他の核酸を含まないことを指す。
【００４０】
望ましくは、分子は実質的に純粋である。なお、それは前記分子が他の核酸を含まないという意味の他に、前記分子の合成及び単離において使用する他の材料を含まないという意味も含まれる。合成において使用する材料とは、例えば酵素である。単離において使用する材料とは、例えばゲル類（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ用）である。前記分子は、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは最低約９８％の純度で、これらの材料を含まない。
【００４１】
膵島細胞は、従来技術において当業者に公知のいかなる膵島細胞でもよい。膵島細胞の例としては、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞及びＤ１細胞が挙げられる。望ましくは、前記細胞はβ細胞である。
【００４２】
マイクロＲＮＡ又はヘアピン前駆体の塩基の配列は、非常に良く保存されている。そのため、いかなる哺乳類の膵臓細胞の配列でも使用可能である。哺乳類の例としては、イヌ及びネコなどのペットの動物、ウシ、ウマ及びヒツジなどの家畜、ネズミ、マウス及びウサギのような実験動物、サル及びヒトのような霊長類が挙げられる。望ましくは、前記哺乳類はヒト又はマウスである。
【００４３】
修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子：
他の実施態様において、本発明は、修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子に関する。修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子は、上記の膵臓マイクロＲＮＡ分子、ヘアピン前駆体分子又は、それの均等物のいずれかである。但し、修飾された分子が少なくとも一つの修飾された部分（すなわち、少なくとも一つの部分が修飾されていないデオキシリボヌクレオチド部分又は修飾されていないリボヌクレオチド部分でない）を含まない場合を除く。この実施態様において、前記の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１３、より好ましくは少なくとも１５、更により好ましくは少なくとも１８、最も好ましくは少なくとも２１の部分を含む。
【００４４】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、多くとも５０、好ましくは多くとも４０、より好ましくは多くとも３０、更に好ましくは多くとも２５、最も好ましくは多くとも２３の部分を含む。前記部分の最小数及び最大数の適切な範囲は、上記のいずれかの最小数及びいずれかの最大数を結合することによって得ることができる。
【００４５】
各々の修飾された部分は、基本単位に結合する塩基を含む。前記基本単位は、安定して塩基と結合して、オリゴマーの鎖を形成することが可能ないかなる分子単位でもあってもよい。本願明細書において、修飾された部分の基本単位には、天然のＤＮＡ又はＲＮＡ分子に通常存在する基本単位は含まれない。
【００４６】
このように修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼ耐性を増加させる。したがって、前記分子のヌクレアーゼ耐性は、修飾されていないリボヌクレオチド部分のみ、修飾されていないデオキシリボヌクレオチド部分のみ又は両方を含んでいる配列と比較し、増加する。このような修飾された部分は、例えばＫｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，１６２８−１６４４（２００３）により公知技術である。
【００４７】
耐性が得られるヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ又はその両方である。エキソヌクレアーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ又は５’→３’エキソヌクレアーゼのいずれでもよい。３’→５’ヒトエキソヌクレアーゼの例としては、ＰＮＰＴ１、ワーナー症候群ヘリカーゼ、ＲＲＰ４０、ＲＲＰ４１、ＲＲＰ４２、ＲＲＰ４５、ＲＲＰ４６が挙げられる。５’→３’エキソヌクレアーゼの例としては、ＸＲＮ２及びＦＥＮ１が挙げられる。エンドヌクレアーゼの例としては、Ｄｉｃｅｒ、Ｄｒｏｓｈａ、ＲＮＡｅ４、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐ、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈ１、ＤＨＰ１、ＥＲＣＣ−１及びＯＧＧ１が挙げられる。エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼとして機能するヌクレアーゼの例としては、ＡＰＥ１及びＥＸＯ１が挙げられる。
【００４８】
修飾された部分は、膵島マイクロＲＮＡ分子のいかなる位置に設置することができる。例えば、膵島マイクロＲＮＡ分子を３’→５’エキソヌクレアーゼから保護するために、分子が、３’末端に少なくとも一つの修飾された部分を、好ましくは３’末端に少なくとも二つの修飾された部分を有することができる。分子を５’→３’エキソヌクレアーゼから保護するには、望ましくは、膵島マイクロＲＮＡ分子の５’末端で、少なくとも一つの修飾された部分、好ましくは少なくとも二つの修飾された部分で有することである。膵島マイクロＲＮＡ分子はまた、５’末端と３’末端の間にの少なくとも一つの好ましくは少なくとも二つの修飾された部分を有することができ、それによりエンドヌクレアーゼ耐性を増加させることができる。好ましくは、少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、更により好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは、少なくとも約９５％の部分が修飾される。一つの実施態様において、部分の全てが修飾された（例えばヌクレアーゼ耐性）分子である。
【００４９】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の一つの実施例において、前記分子は、少なくとも一つの修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分を含む。適切な修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分は、従来技術において公知である。この種の修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分は、例えば、基本単位としてチオリン酸デオキシリボース基を含む（図１の構造式１を参照）。チオリン酸デオキシリボヌクレオチド部分を含む修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、一般にホスホロチオネート（ＰＳ）ＤＮＡと呼ばれる（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１０，１１７−１２１（２０００）を参照）。
【００５０】
修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分の他の適用可能な例としては、Ｎ’３−Ｎ’５ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分が挙げられる。そこにおいて、Ｎ’３−Ｎ’５ホスホロアミダートデオキシリボース基が基本単位に含まれる。図１中の構造式２を参照のこと。ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド分子は、一般にホスホロアミダート（ＮＰ）ＤＮＡと呼ばれている。それに関しては、例えば、Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，３１４３−３１４４（１９９４）を参照のこと。
【００５１】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の他の実施態様において、前記分子は一つ以上の修飾されたリボヌクレオチド部分を含む。修飾されたリボヌクレオチド部分の適用可能な例は、その２’位置で置換されたリボヌクレオチド部分である。前記２’位置における置換基は、例えば、炭素数Ｃ１からＣ４のアルキル基であってもよい。前記Ｃ１からＣ４のアルキル基は、飽和又は不飽和であっても良く、また直鎖状又は分岐型であってもよい。Ｃ１からＣ４のアルキル基の幾つかの例としては、エチル、イソプロピル及びアリール基が挙げられる。前記の望ましいＣ１のＣ４アルキル基は、メチル基である。図１中の構造式３を参照のこと。その２’位置をＣ１からＣ４のアルキル基で置換されたリボヌクレオチド部分を含むオリゴリボヌクレオチド分子は、一般には２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）ＲＮＡ例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡ（ＯＭｅＲＮＡ）と呼ばれる。
【００５２】
修飾されたリボヌクレオチド部分の２’位置における置換基の他の適用可能な例は、（炭素数Ｃ１からＣ４のアルコキシ）−（炭素数Ｃ１からＣ４のアルキル基）である。前記Ｃ１からＣ４のアルコキシ（アルキルオキシ）及びＣ１からＣ４のアルキル基は、上記のアルキル基のいかなるものを含めてもよい。前記の望ましいＣ１からＣ４のアルコキシ−Ｃ１からＣ４のアルキル基は、メトキシエチル基である。図１中の構造式４を参照のこと。一つ以上のリボヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド分子であり、その２’位置をＣ１からＣ４のアルコキシ−Ｃ１からＣ４のアルキル基で置換された分子は、２’−Ｏ−（Ｃ１からＣ４のアルコキシ−Ｃ１からＣ４のアルキル基）ＲＮＡ、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ ＲＮＡ）と呼ばれる。
【００５３】
修飾されたリボヌクレオチド部分の他の適用可能な例は、２’−酸素原子と４’−炭素原子との間でメチレン架橋を有するリボヌクレオチドである。図１中の構造式５を参照のこと。リボヌクレオチド部分を含むオリゴリボヌクレオチド分子であり、２’−酸素原子と４’−炭素原子との間でメチレン架橋を有する分子は、一般にロックされた核酸（ＬＮＡ）と呼ばれる。それに関しては、例えば、Ｋｕｒｒｅｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３０，１９１１−１９１８（２００２）；Ｅｌａｙａｄｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ２，５５８−５６１（２００１）；Ｏｒｕｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ＭｏＩ．Ｔｈｅｒ．３，２３９−２４３（２００１）；Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４，３６０７−３６３０（１９９８）；Ｏｂｉｋａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．ｉＰ，５４０１−５４０４（１９９８）を参照のこと。ロックされた核酸は、Ｐｒｏｌｉｇｏ社（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ ａｎｄ Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００５４】
修飾されたリボヌクレオチド部分の他の適用可能な例は、フルオロ基により２’位置を置換されたリボヌクレオチドである。そのような２’−フルオロリボヌクレオチド部分は、当業者に公知である。２’−フルオロリボヌクレオチド部分を含む分子は一般に、本発明において２’−フルオロリボ核酸（ＦＡＮＡ）と呼ばれる。図１の構造式７、またＤａｍｈａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，１２９７６−１２９７７（１９９８）を参照のこと。
【００５５】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の他の実施態様において、前記分子は、アミノ酸残基に結合する一つ以上の塩基を含む。アミノ酸残基に結合する一つ以上の塩基を含む部分は、本発明において以下ペプチド核酸（ＰＮＡ）部分と記す。そのような部分はヌクレアーゼ耐性であり、当業者に公知である。ＰＮＡ部分を有する分子は一般にペプチド核酸と呼ばれる。図１中の構造式６、またＮｉｅｌｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３，１５６−１６４（１９９９）；Ｅｌａｙａｄｉら、ｉｄ．；Ｂｒａａｓｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１，４５０３−４５０９（２００２）；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９７−１５００（１９９１）を参照のこと。
【００５６】
アミノ酸はいかなるアミノ酸であってもよい。また、天然及び人工のアミノ酸を含む。天然アミノ酸はすなわち、通常タンパク質中に存在する２０の一般のアミノ酸、例えばアラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）を含む。
【００５７】
上記の人工のアミノ酸としては、例えば、アルキル、アリール又はアルキルアリール基を含むアミノ酸である。アルキルアミノ酸の若干の実施例として、α−アミノブチル酸、β−アミノブチル酸、γ−アミノブチル酸、δ−アミノバレリン酸及びε−アミノカプロン酸が挙げられる。アリールアミノ酸の若干の実施例としては、オルト−、メタ−、パラ−アミノ安息香酸が挙げられる。アルキルアリールアミノ酸の若干の実施例としては、オルト−、メタ−、パラ−アミノフェニル酢酸及びγ−フェニルβ−アミノブチル酸が挙げられる。
【００５８】
人工アミノ酸にはまた、天然アミノ酸の派生物も含まれる。前記天然アミノ酸の派生物には、例えば、一つ又は複数の化学基の付加した天然アミノ酸を含めることができる。
【００５９】
例えば、一つ又は複数の化学基は、フェニルアラニン又はチロシン残基の芳香環の２’、３’、４’、５’若しくは６’の位置、又はトリプトファン残基のベンゼン環の４’、５’、６’若しくは７’の位置の一つ又は複数に付加させることができる。前記基は、芳香族環に付加することができるいかなる化学基も使用することができる。そのような基の例としては、ヒドロキシル、炭素数Ｃ１−Ｃ４のアルコキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ニトロ、ハロ（すなわちフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）又は分岐若しくは直鎖状の炭素数Ｃ１−Ｃ４のアルキル（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル又はｔ−ブチル）が挙げられる。
【００６０】
人工アミノ酸の他の例としては、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）及びヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）などを含む天然アミノ酸の派生物が挙げられる。
【００６１】
前記アミノ酸は、同一であっても、又はそれぞれ異なる種類であってもよい。塩基は前記アミノ酸単位に、分子結合により付着する。前記分子結合の例としては、メチレンカルボニル、エチレンカルボニル及びエチル結合が挙げられる（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｕｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ−Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ １−１９；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００）を参照。ＰＮＡ部分のアミノ酸残基の一例としては、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンが挙げられる。
【００６２】
更に、ＰＮＡ部分の例としては、シクロヘキシルＰＮＡ、レトロ−インベルソＰＮＡ、フォスフォンＰＮＡ、プロピオニルＰＮＡ及びアミノプロリンＰＮＡが挙げられる。これらのＰＮＡ部分の詳細については、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｕｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ −Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ１−１９の図５を参照のこと。前記Ｎｉｅｌｓｅｎらの文献の７ページの図５は本発明において援用されている。
【００６３】
ＰＮＡは、公知の方法、例えば修飾Ｆｍｏｃ又はｔＢｏｃペプチド合成プロトコルにより化学的に合成することができる。前記ＰＮＡは多くの望ましい特性、例えば高い溶融温度（Ｔｍ）、核酸及び非荷電の基本分子との高い塩基対の特異性を有する。更に、前記ＰＮＡは前記標的ＲＮＡにＲＮＡａｓｅＨ感受性を与えず、また一般に良好な代謝安定性を有する。
【００６４】
ペプチド核酸はまた、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００６５】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の他の例において、前記分子は一つ以上のモルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分を含む。モルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分を含む分子は一般にモルフォリノ（ＭＦ）核酸と呼ばれている。図１中の構造式８、及びＨｅａｓｍａｎ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４３，２０９−２１４（２００２）を参照のこと。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣ（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００６６】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の更なる例において、前記分子は、一つ以上のシクロヘキセンヌクレオチド部分を含む。シクロヘキセンヌクレオチド部分を含む分子は、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれる。図１の構造式１０、及びＷａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，８５９５−８６０２（２０００）、Ｖｅｒｂｅｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９，４９４１−４９４７（２００１）を参照のこと。
【００６７】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の最終的な例において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は一つ以上のトリシクロヌクレオチド部分を含む。トリシクロヌクレオチド部分を含む分子は一般的にトリシクロ核酸（ｔｃＤＮＡ）と呼ばれる。図１中の構造式９、及びＳｔｅｆｆｅｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９，１１５４８−１１５４９（１９９７）、Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４，５９９３−６００２（２００２）を参照のこと。
【００６８】
分子は、キメラ修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子であってもよい。前記部分のいずれかの混成物を含むキメラ分子はまた公知であり、公知の方法によって調製することができる。上記の文献及びＷａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，１３９８９−１３９９４（１９９９），Ｌｉａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．ｉｏｃｈｅｍ． ２６９，５７５３−５７５８（２００２），Ｌｏｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１，３４５７−３４６７（２００２）及びＤａｍｈａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，１２９７６−１２９７７（２００２）を参照のこと。
【００６９】
本発明の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、配列番号：１から２０に示される天然の膵島マイクロＲＮＡ分子の隣接する塩基配列のいずれかを有する、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１３、より好ましくは、少なくとも１５、更により好ましくは少なくとも２０の隣接する塩基を含む。好ましい実施例において、前記修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡ分子のいずれかの配列の完全な配列を含む。
【００７０】
分子の部分の総数が５０を上回らない限り、いかなる塩基配列も有するいかなる数の付加的な部分（最高４０の部分）をも、隣接する塩基配列を含む部分に加えることができる。前記の付加的な部分は、隣接する配列の５’末端、３’末端又はその両方の端に付加することができる。前記の付加的な部分は、膵島マイクロＲＮＡが誘導されるヘアピン前駆体又はそのフラグメントに存在する３’末端及び／又は５’末端の塩基配列を含むことができる。分子中の前記付加的な部分は、存在するときは、上記のいかなる修飾又は未修飾の部分であってもよい。
【００７１】
前記の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子には、その均等物も含まれる。均等物には、上記のようなゆらぎ塩基及び非相補的な塩基が含まれる。
【００７２】
更に、隣接する部分の中で、デオキシリボヌクレオチドの基本単位を含むものが５０％、好ましくは３０％を超えないのが望ましい。表４及び５は、各々の数の隣接する塩基におけるデオキシリボヌクレオチド基本単位の最大数を示す。
【００７３】
もう一つの実施例では、上記のゆらぎ塩基対及び非相補的な塩基に加えて、天然の膵島マイクロＲＮＡ配列の位置１１に対応する部分も付加、欠失又は変異であってよい。
【００７４】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、上記の通り単離、更には精製されているのが望ましい。
【００７５】
（表４）：デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む隣接する部分の５０％の数：
【表４】
（表５）：デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む隣接する部分の３０％の数：
【表５】
【００７６】
更に別の実施形態では、キャップは分子の一端に、両方の端に、及び／又は端との間に取り付けられ、それにより本発明に係る上記の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子又は修飾されていない単離されたＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増加させることができる。例えば、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ耐性を増加させるのが望ましい。ヌクレアーゼ耐性を増加させるのに通常用いられる公知のいかなるキャップも使用することができる。
【００７７】
この種のキャップの例としては、逆向きヌクレオチドキャップ及び化学修飾キャップが挙げられる。逆向きヌクレオチドキャップは、５’及び／又は３’端で取り付けることができる。化学修飾キャップは、分子の一端、両端及び／又は両末端の間に取り付けることができる。
【００７８】
逆向きヌクレオチドキャップとは、修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子又は修飾されていないＤＮＡ又はＲＮＡ分子の５’及び／又は３’末端に付着する、３’→５’の核酸配列を指す。その標的ｍＲＮＡに膵島マイクロＲＮＡ分子又は単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子の結合に干渉しない限り、前記逆向きキャップのヌクレオチドの数には特に上限がない。いかなるヌクレオチドも、逆向きヌクレオチドキャップに使用することができる。通常、前記ヌクレオチドキャップは、約４０未満のヌクレオチド長、好ましくは約３０未満のヌクレオチド長、より好ましくは約２０未満のヌクレオチド長、更に好ましくは約１０未満のヌクレオチド長である。典型的には、逆向きヌクレオチドキャップは、１ヌクレオチド長である。逆向きキャップ構造に用いられるヌクレオチドは通常チミンであるが、他のいかなるヌクレオチド（例えばアデニン、グアニン、ウラシル又はシトシン）でもよい。
【００７９】
化学修飾キャップは、核酸のヌクレアーゼ耐性を増加させるための、いかなる公知の化学基のことを指す。そのような化学修飾キャップの例としては、ヒドロキシアルキル基（アルキルヒドロキシド）又はアミノアルキル基（アルキルアミン）が挙げられる。ヒドロキシアルキル基はしばしばアルキルグリコシル基（例えばエチレングリコール）と呼ばれる。アミノアルキル基はしばしばアミノリンカーと呼ばれる。
【００８０】
ヒドロキシアルキル基又はアミノアルキル基中の前記アルキル鎖は直鎖型又は分岐型のいずれでもよい。前記アルキル鎖中に存在する最小の炭素原子数は、１であり、望ましくは少なくとも２であり、またより望ましくは少なくとも約３である。
【００８１】
前記アルキル鎖に存在する最大炭素原子数は、約１８、望ましくは約１６、より望ましくは１２である。典型的な前記アルキル基は、メチル、エチル及びプロピル基とを含む。前記アルキル基は、一つ以上の水酸基及び／又はアミノ基によって更に置換されることができる。
【００８２】
アミノリンカーの幾つかを、表６に示す。表６にリストとして挙げられている前記アミノリンカーは、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）から購入可能である。
【００８３】
単離されたマイクロＲＮＰ：
別の態様において、本発明は、上記の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子、又は上記の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子のいずれかを含む、単離されたマイクロＲＮＰを提供する。
【００８４】
アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子：
別の態様において、本発明は、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子を提供する。アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、上記の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子、又は上記の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子のいずれかであってよい。ただし、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基配列が、単離されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又は修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基配列と相補的である場合を除く。
【００８５】
アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の配列の実施例は、表７及び８に示される。
【００８６】
（表６）：ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のアミノリンカー
【表６】
【００８７】
（表７及び８）：アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基配列
【表７】
【表８】
【００８８】
アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子への使用のために、上記のように修飾されてもよい。一つの例において、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の隣接する部分は、それに対応する膵島マイクロＲＮＡ分子と相補的である。前記アンチ−膵島マイクロＲＮＡの相補性の程度は、付加、欠失及び変異に関する規定と同様に、ゆらぎ塩基対に関する規定を含め、上記の修飾した膵島マイクロＲＮＡ分子に対する規定と同じ規定に従う。
【００８９】
好ましい実施態様において、アンチ−膵臓マイクロＲＮＡ分子が未修飾の部分のみを含む場合、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は少なくとも１０の隣接する塩基中に少なくとも一つの塩基（それは膵島マイクロＲＮＡと非相補的）及び／又は、化学キャップを含む。
【００９０】
他の好ましい実施態様において、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子に存在する隣接する少なくとも１０の塩基が、膵島マイクロＲＮＡ分子と完全に相補的である（すなわち１００％）場合は、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、少なくとも１０の隣接する塩基当たり少なくとも一つの修飾された部分、及び／又は、化学キャップを含む。
【００９１】
更に別の実施態様では、天然の膵島マイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置の、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子における部分は、非相補的である。天然の膵島マイクロＲＮＡの位置１１に対応するアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の部分は、上記の通り付加、欠失又は変異の導入によって非相補的にすることができる。
【００９２】
用途：
本発明の膵島マイクロＲＮＡ分子及びアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、非常に多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏの用途に使用可能である。
【００９３】
例えば、本発明のマイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡの機能を解析するために、細胞に導入することができる。前述のいかなる膵島マイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチ−膵島マイクロＲＮＡも、それらの機能を解明するために細胞に導入することができる。
【００９４】
一つの実施態様において、細胞のマイクロＲＮＡは、適切なアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子によって阻害される。あるいは、細胞の膵島マイクロＲＮＡ分子の活性は、一つ以上の添加されたマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入することによって強化することもできる。マイクロＲＮＡの機能は、細胞のマイクロＲＮＡの活性の抑制及び／又は強化に関連する変化を観察することにより推定することができる。
【００９５】
本発明の一態様において、本発明は、細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法に関する。細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法は、細胞内に一本鎖のアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子を導入する工程を含む。マイクロＲＮＰは、膵臓マイクロＲＮＡ分子を含む。上記の規定を前提として、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＰに存在する膵島マイクロＲＮＡに相補的である限り、いかなるアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子も、細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法に用いることができる。
【００９６】
本発明のアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、宿主細胞のマイクロＲＮＰの膵島マイクロＲＮＡと結合することによって、マイクロＲＮＰ活性を阻害することができる。なお、マイクロＲＮＰ活性とは、標的配列の裂開又は翻訳の抑制を指す。前記標的配列は、膵島マイクロＲＮＡの塩基配列と部分的に又は完全に相補的であるいかなる配列でもよい。前記標的配列は、例えばグルコース代謝を制御する遺伝子であってもよい。
【００９７】
例えば、膵島細胞は、グルコースによって誘発されたインスリン分泌に関係する遺伝子と相補的であるマイクロＲＮＡを生産することができる。マイクロＲＮＰで包まれたマイクロＲＮＡ分子は、グルコースによって誘発されたインスリン分泌の効果を顕著に阻害する。したがって、アンチ−マイクロＲＮＡ分子の導入は、マイクロＲＮＰ活性を阻害し、その結果、遺伝子の機能を復元することによって、危害を減らす。
【００９８】
あるいは、前述のアンチ−マイクロＲＮＡ分子を導入する代わりに、マイクロＲＮＡ分子を膵島細胞に添加してもよい。それにより、グルコースにより誘発されるインスリン分泌のための遺伝子の発現が阻害される。その結果、細胞がグルコースに反応してインスリンを分泌する能力を減少させることができる。マイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子は、いかなる公知の方法によっても細胞に導入することができる。例えば、マイクロインジェクションのような方法により、マイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子を直接細胞に注射注入することができる。あるいは、好ましくは輸送システムの補助を伴いながら、前記分子を細胞と接触させることができる。
【００９９】
使用可能な輸送システムは、例えば、リポソーム及び荷電した脂質が挙げられる。リポソームは、典型的には、それらの中心の水相中にオリゴヌクレオチド分子を封じ込める。荷電した脂質は、反対の電荷を持つ結果として、一般に脂質−オリゴヌクレオチド分子複合体を形成する。
【０１００】
これらのリポソーム−オリゴヌクレオチド分子複合体又は脂質−オリゴヌクレオチド分子複合体は、通常エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。リポソーム又は荷電した脂質は、一般に、エンドソームの膜を崩壊し、オリゴヌクレオチド分子を放出するヘルパー脂質を含む。
【０１０１】
マイクロＲＮＡ分子又はアンチ−マイクロＲＮＡを細胞に導入する他の方法には、例えばデンドリマー、生分解性ポリマー、アミノ酸ポリマー、糖ポリマー及びオリゴヌクレオチド結合性ナノ粒子などの輸送手段の使用法が含まれる。加えて、貯蔵手段としてプルロニック（登録商標）のゲルを用い、長期間にわたるアンチ−マイクロＲＮＡのオリゴヌクレオチド分子の輸送を可能にすることができる。上記方法は、例えば、Ｈｕｇｈｅｓら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ６，３０３−３１５（２００１）；Ｌｉａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９ ５７５３−５７５８（２００２）；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｓｌｉｅ，Ｒ．Ａ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ａ．Ｊ．＆Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｈ．Ａ．，ｅｄｓ），ｐｐ．１４７−１５７，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【０１０２】
特定の細胞に対するマイクロＲＮＡ分子又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子のターゲティングは、いかなる公知の方法によっても行うことができる。例えば、マイクロＲＮＡ分子又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子は、細胞上のレセプタによって特に認識される抗体又はリガンドとコンジュゲートことができる。例えば、リガンドを、膵臓ベータ細胞にて発現するＧＬＰ−レセプタと結合するＧＬＰ−Ｉ（グルカゴン様ペプチド）とすることができる。あるいは、ＧＬＰ−Ｉに対する抗体も使用可能である。
【０１０３】
他の実施形態では、本発明は、哺乳類の患者の糖尿病を治療する方法を提供する。前記方法は、配列番号４１又は５１に示される配列を有する少なくとも１０の隣接するベースを有するアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の有効量を哺乳類に導入する工程を含む。前記有効量を、医師及び臨床医に公知の方法によって、臨床前及び臨床試験中に決定することができる。
【０１０４】
アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、当業者に公知のいかなる方法によっても、哺乳類に導入することができる。例えば、アンチ−膵島分子を細胞にもたらす上記の方法を、前記分子を哺乳類に導入するために用いることができる。
【０１０５】
分子は、いかなる公知の方法によっても哺乳類に投与することができる。適切な投与方法の若干の例としては、経口投与と全身投与とが挙げられる。全身投与としては、腸内又は非経口的な投与方法が可能である。液体又は固体状（例えば錠剤、ゼラチン・カプセル）の製剤を使用することができる。
【０１０６】
分子の非経口投与は、例えば静脈、筋肉、又は皮下への注射を含む。例えば、公知のように分子は、徐放出性投与によって哺乳類に投与されることができる。徐放出性投与は、一定期間にわたる薬の一定レベルを維持させる薬剤輸送の方法である。
【０１０７】
他の投与のルートとしては、口頭、局在、気管支内、又は鼻腔内への投与が含まれる。経口投与のために、液体又は固体状の製剤が使用可能である。経口投与に適している製剤の若干の例として、錠剤、ゼラチン・カプセル、ピル、トローチ、エリキシル、サスペンション、シロップ及びウェーハが挙げられる。気管支内投与では、吸入器スプレーを使用することができる。また、鼻腔内投与による本発明の分子の投与は、ネビュライザ又は液霧によっ行うことができる。
【０１０８】
本発明の分子は、適切な薬剤担体中に含有させることができる。本発明における薬剤担体とは、従来技術において当業者によって理解されているように、賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ又はｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）と同義であると解される。担体の例としては、澱粉、牛乳、糖、特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸若しくはその塩、ステアリン酸のマグネシウム又はカルシウムによる塩、タルク、植物性脂肪若しくは油、ガム及びグリコールが挙げられる。
【０１０９】
薬剤担体は、また、以下の一つ又は二つ以上を含むことができる：安定化剤、界面活性剤（好ましくは非イオン系界面活性剤）、また任意に塩及び／又はバッファー。安定化剤は、例えばグリシンなどのアミノ酸、例えば蔗糖、テトラロース、ラクトース又はデキストランなどのオリゴ糖類が使用可能である。あるいは、前記安定化剤は糖アルコールであっても良く、例えばマンニトール又はその組合せがよい。好ましくは、安定化剤の重量は、分子の重量に対して約０．１から約１０重量％である。
【０１１０】
界面活性剤は、好ましくは非イオン系界面活性剤（例えばポリソルベート）である。適切な界面活性剤の若干の例としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０；ポリエチレングリコール又はプルロニックＦ−６８などのポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールを約０．００１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）含有させるのが望ましい。
【０１１１】
塩又はバッファー試薬はそれぞれ、例えば塩化ナトリウム又はナトリウム／リン酸カリウムのようないかなる塩又はバッファー試薬も使用可能である。望ましくは、バッファー試薬は、本発明の分子のｐＨを約５．５から約７．５の範囲でを維持するものが望ましい。塩及び／又はバッファー試薬はまた、浸透圧のレベルを哺乳類への投与に適する形に保つのに役立つ。前記塩又はバッファー試薬は、約１５０ｍＭから約３００ｍＭの範囲でほぼ等張である形で存在するのが望ましい。
【０１１２】
前記薬剤担体は、一つ又は二つ以上の従来公知の添加剤を追加的に含有させることができる。このような添加剤の若干の例としては、例えばグリセロールのような可溶化剤；例えば塩化ベンザルコニウム（第四アンモニウム化合物の混合物で、「クォート」として公知）、ベンジルアルコール、クロレトン又はクロロブタノールなどの酸化防止剤；例えばモルヒネ誘導体などの麻酔の薬品；又は上記のような等張な試薬が挙げられる。酸化又は他の損傷に対する更なる予防措置として、分子は、非浸透性のストッパーでシールしたバイアル中で、窒素ガス充填下で格納するのが望ましい。
【実施例１】
【０１１３】
材料及び方法
マイクロＲＮＡのクローニング及びノーザンブロッティング分析：
ＭＩＮ６細胞培養から６００μｇの全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して抽出し、前述した方法（ラゴス−キンタナ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ．））によりｍｉＲＮＡクローニングを行った。アンチセンスプローブを、クローニングされたｍｉＲＮＡ配列と相補的になるように設計し、前述（ラゴス−キンタナ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ．））のとおり、ノーザンブロット分析に使用した。
【０１１４】
細胞培養：
ＭＩＮ６細胞を、２５ｍＭのグルコース、１５％の胎児のウシ血清及び５．５のμＭ ２−メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ培地で培養した。Ｎ２Ａ細胞を、２５ｍＭのグルコース及び１０％の胎児のウシ血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。
【０１１５】
インスリン分泌の解析：
ＭＩＮ６細胞を、２日間２４−ウェルプレートで培養し、分析の前に修飾されたクレブス−リンゲル緩衝液（ＫＲＢＨ）（０．９ｍＭのＣａＣｌ２、２．６８ｍＭのＫＣｌ、１．４６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、１３５ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ及び０．２％のＢＳＡ）で洗浄した。５．５ｍＭのグルコースを含むＫＲＢＨにて３０分予備培養の後、細胞をリンスし、２．８ｍＭのグルコース、２５ｍＭのグルコース、３０ｍＭのＫＣｌ、５００ｍＭのトルブタミド又は５ｍＭのメチルピルビン酸塩を含有するＫＲＢＨにて６０分間インキュベートした。上澄み中のインスリン濃度は、ＲＩＡ（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて測定した。
【０１１６】
組換えアデノウイルスの生成：
ｍｉＲ−３７５の過剰発現に使用する組換えアデノウイルスを、次のプライマーを用いたｍｉＲＮＡ前駆体配列のＰＣＲにより増幅した：５’−ＣＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＣＣ−３’及び５−ＧＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＣ−３’。得られた断片をｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ処理の後、Ａｄ５ＣＭＶ−Ｋ ＮｐＡシャトルベクターに挿入した。アデノウイルスの増幅は、Ｖｉｒａｑｕｅｓｔ社（Ｎｏｒｔｈ Ｌｉｂｅｒｔｙ、ＩＡ）にて行われた。トランス遺伝子を含まないＡｄ−ＧＦＰ（ＶｉｒａＱｕｅｓｔ社）をコントロールとして使用した。
【０１１７】
電気生理学的特性及びＣａ２＋測定：
エキソサイトーシス及び内部のＣａ２＋電流の測定は、単層状に分散した、コントロールＧＦＰ−又はｍｉＲＮＡ２０８−ＧＦＰを含むアデノウイルスへの感染後２４時間経過したＢ細胞を用い、標準のパッチクランプ法により行われた。エキソサイトーシスを、Ｐｕｌｓｅ（Ｈｅｋａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ／Ｐｆａｌｚ（ドイツ））のソフトウェアに基づくｌｏｃｋ−ｉｎの実施により、細胞静電容量の変化として検出した。印加正弦波は、５００Ｈｚの周波数及び２０ｍＶのピーク振幅であった。Ｃａ２＋電流は、ｐ４のプロトコルに基づき、電流リーク及び容量過渡をデジタル的に除去した後の数値を測定した。細胞外溶液は、１１８ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのテトラエチルアンモニウム塩酸塩（ＴＥＡＣｌ）、５．６ｍＭのＫＣｌ、２．６ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコースを有する５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）を含有する溶液とした。電位固定脱分極によってエキソサイトーシスを生じさせる実験において、細胞内液は、１２５ｍＭのＣｓ−グルタミン酸塩、１０ｍＭの塩化セシウム、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨを有するｐＨ＝７．１５）、０．０５ｍＭのＥＧＴＡ、３ｍＭのマグネシウム−ＡＴＰ及び０．１ｍＭのサイクリックＡＭＰを含有する溶液とした。一連の実験において、エキソサイトーシスは、１２５ｍＭのＣｓ−グルタミン酸塩、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのマグネシウム−ＡＴＰ、０．１ｍＭのｃＡＭＰ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＥＧＴＡ及び９ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶媒により細胞内部を透析して行った。細胞フリーな溶液のＣａ２＋濃度を１．５μＭ．と推定した。機能的にα−及びβ−細胞と識別され多細胞にて実験を行った。その細胞の識別は、公知の方法により決定した。
【０１１８】
細胞内のフリーのＣａ２＋の濃度（［Ｃａ２＋］）を、他で記載されている通り、二重励起波長による蛍光分光測定により測定した。トランスフェクションする膵島細胞は、３７°Ｃで、４０分の間、０．００７％のｗ／ｖのプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）酸（分子プローブ）の存在下、３μＭのｆｕｒａ−２と共に散布した。色素を３５０ｎｍ及び３６５ｎｍで励起した。後者の波長が３８０ｎｍでないのは、ＧＦＰの励起を回避するためである。発光を５１０ｎｍにて集光した。実験中、膵島細胞は、保持ピペットによって適当な状態に保たれて、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３．６ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、２．６ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨによるｐＨ＝７．４ｍＭ）及び５ｍＭのグルコースを含有する溶媒で、連続的に灌流した。グルコース濃度は１５ｍＭまで増加し、スルフォニル尿素トルブタミド濃度が０．１ｍＭになるまで上記のように添加した。膵島細胞が高い細胞外Ｋ＋（ＫＣｌが加えた３０ｍＭ）によって脱分極するときは、等浸透性を維持するため、ＮａＣｌの濃度をそれ対応して減少させた。電子生理的実験及びＣａ２＋測定は全て３２から３４℃にて行った。
【０１１９】
膵島細胞の感染及びＣａ２＋インジケータを伴うローディングを、共焦顕微鏡検査により、ｆｕｒａ−２ではなくｆｌｕｏ−３を使用して評価した。ｅＧＦＰ及びｆｌｕｏ−３の励起は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、イェナ、ドイツ）の４８８ｎｍの種類の機器を使用して行った。共焦顕微鏡のＭＥＴＡ機能を用いて分光し、水浸にて４０倍で顕微鏡観察した。
【０１２０】
ルシフェラーゼ活性の分析：
野生型マウスのミオトロフィンの３’ＵＴＲ標的部位を、以下のプライマー：
５’ＴＣＣＡＴＣＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＴＡＴＣ３’及び
５’ＴＣＡＴＡＴＣＧＴＴＡＡＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＡ３’
を使用してＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした。得られた断片をＳｐｅＩ及びＸｂａＩ処理により単離し、ｐＲＬ−ＴＫ（プロメガ社）の停止コドンのすぐ下流にサブクローニングした。このコンストラクトは、プロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従い、以下のプライマー：
５’ＡＡＧＴＴＴＣＧＴＧＴＴＧＣＡＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＴＧＴＧＣ３’、及び
５’ＧＣＡＣＡＡＴＴＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＧＣＴＴＧＣＡＡＣＡＣＧＡＡＡＣＴＴ３’
を使用した、変異体マウスミオトロフィンプラスミドの調製に使用した。下線は、突然変異するヌクレオチドを示す。ＭＩＮ６細胞を２日間、２４ウェルプレートで培養し、Ｒｒ−ｈｘｃをコードしているｐＲＬ−ＴＫリポーターベクター０．４μｇ、及び０．１μｇのＰｐ−ｌｕｃ（プロメガ社）をコードしているｐＧＬ３コントロールベクターによってトランスフェクションした。細胞をトランスフェクション後３０−３６時間にて回収し、試験に使用した。
【０１２１】
ｍｉＲ−３７５の標的の同定：
ｍｉＲ−３７５の標的を同定するために、最近開発されたアルゴリズム（Ｎ．Ｒａｊｅｗｓｋｙ及びＮ．Ｄ．Ｓｏｃｃｉ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６７、５２９−５３５の（２００４））を使用した。前記アルゴリズムは以下の二つのステップを含む。
（ａ）ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおける、マイクロＲＮＡ及び推定の標的配列の間で保存されているＧＣリッチな連続的な相補的基礎配列（「核」）の検索、及び
（ｂ）予測されたマイクロＲＮＡ：ｍＲＮＡデュプレックスの自由エネルギーのｉｎ ｓｉｌｉｃｏによる評価。
アルゴリズムをＲｅｆｓｅｑデータセットに適用した。３’ＵＴＲは、Ｒｅｆｓｅｑアノテーションから抽出した。このデータセットは、１８１９９のヒト、及び１３３７１のマウスの３’ＵＴＲであり、少なくとも３０のヌクレオチド長を有するものを含む。「Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂ ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ ｔａｂｌｅ ｏｆ ９６１２ ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ」を使用し、一組のオルトログの３’ＵＴＲを構築した。Ｌｅｗｉｓ ＢＰ，Ｓｈｉｈ ＩＨ，Ｊｏｎｅｓ−Ｒｈｏａｄｅｓ ＭＷ，Ｂａｒｒｅｌ ＤＰ，Ｂｕｒｇｅ ＣＢ，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｃｅｌｌ ７８７−９８（２００３）に従い、核の位置を、マイクロＲＮＡの５’末端から２塩基内部に制限した。ヒットした上位８％を保持しながら、上記（ａ）による核スコアを決定した。これらのヒットは、その後ＭＦＯＬＤ（Ｚｕｋｅｒ，ＮＡＲ ３４０６−１５，２００３、Ｒａｊｅｗｓｋｙ ａｎｄ Ｓｏｃｃｉ ｆｏｒ ｄｅｔａｉｌｓ）を用い、予測されたｍＲＮＡ：ｍｉＲＮＡデュプレックスの自由エネルギーによって記録された。
【０１２２】
ｓｉＲＮＡ及び２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド：
合成マイクロＲＮＡ及びｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ社）によって合成された。ｓｉＲＮＡ ＳＭＡＲＰＯＯＬｓは、マウスミオトロフィン（ＮＭ＿００８０９８）及びマウスＶｔｉ１Ａ（ＮＭ＿０１６８６２）の配列から設計した。全ての２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドは、公知技術（Ｍｅｉｓｔｅｒら、ＲＮＡ）の方法により合成した。全ての試薬は、２００ｎＭの濃度でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してＭＩＮ６細胞にトランスフェクションした。
【０１２３】
抗体：
ウエスタンブロット法のための抗体を、幾つかの異なる供給源から得た：α−ｍｙｏｔｒｏｐｈｉｎ（マサト・タオカ氏による寄付）、α−Ｖｔｉ１（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより）、α−ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇより）、α−ＭＣＴ８（Ａｎｄｒｅｗ Ｈａｌｅｓｔｒａｐによる寄付）、α−ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（Ｒ．Ｒｏｅｄｅｒ氏による寄付）。
【０１２４】
ノーザンブロット法：
全ＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して抽出され、１５％のポリアクリルアミン又はアガロースゲルにローディングされた。電気泳動後、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ膜（アマシャム社）に転写し、プローブと反応させた。マウスミオトロフィンと反応するＤＮＡプローブは、以下のプライマー：
５’ＧＴＧＧＧＣＣＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＡＣＴＴＧ３’、及び
５’ＣＣＣＴＴＴＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣＧＣ３’
を使用して調製した。
【実施例２】
【０１２５】
膵島細胞マイクロＲＮＡ：
マイクロＲＮＡを、ＭＩＮ６細胞（グルコース応答性ネズミ膵臓β細胞系）からクローニングした。合計３０１のマイクロＲＮＡクローンを得たが、そのうち５５は異なるマイクロＲＮＡであった。前記の５５の異なるマイクロＲＮＡの中で、既に公表されているマイクロＲＮＡは９２％を占め、残りの８％は未確認のマイクロＲＮＡであった。公知の及び新規のｍｉＲＮＡは、Ｂｌａｓｔ配列分析によってさまざまなゲノム・データベースにおいて同定され、種間ホモロジー及び典型的ヘアピン前駆体構造を形成する能力によって確認された。
【０１２６】
合計９つの新規なマイクロＲＮＡを同定した結果、単一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−３７５）が全ての新規なクローンの５０％以上を占めていた（図２Ａ）。次に、ノーザンブロット分析によって新規なマイクロＲＮＡの発現を解析した。マイクロＲＮＡ３７５及び３７６のみ、ＭＩＮ６細胞及び膵島のノーザンブロット分析によって検出された（図２Ｂ）。両方のマイクロＲＮＡの発現は、ＭＩＮ６細胞及び膵島に限定されており、肝臓、肺、腸、脳、腎臓及び精巣等の他の組織では検出されなかった。（図２Ｂ、Ｃ）これらのデータは、新規な膵島マイクロＲＮＡの同定を示唆するものである。
【実施例３】
【０１２７】
ｍｉＲ−３７５による分泌阻害活性：
高い表現レベル及び膵臓β−細胞における組織特異性を有するマイクロＲＮＡの機能を解析するため、マイクロＲＮＡ−３７５及び−３７６に相同な配列を有する合成ｓｉＲＮＡを用いて、ＭＩＮ６細胞をトランスフェクションした後の、グルコース誘導によるインスリン分泌を解析した。ｓｉＲＮＡに加えて、ＣＭＶプロモータの制御下でヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子を発現するベクター（ＣＭＶ−ｈＧＨ）をコトランスフェクションした。追加的に発現したｈＧＨは、膵臓β−細胞系の分泌顆粒の標的とされ、エキソサイトーシスの起動後にインスリンと共放出されることが開示されている。この方法によって、一過性にトランスフェクションするＭＩＮ６細胞（トランスフェクション効率２０−３０％）から選択的にエキソサイトーシスをモニターすることが可能となる。ポジティブ及びネガティブのコントロールとして、グルコキナーゼ遺伝子（Ｇｃｋ）又はアポリポタンパク質Ｍ（ａｐｏＭ）（膵臓β−細胞において発現しない遺伝子）を標的とするｓｉＲＮＡを、ＭＩＮ６細胞にＣＭＶ−ｈＧＨによってコトランスフェクションした。
【０１２８】
２５ｍＭのグルコース刺激に応答する成長ホルモン分泌は、ｓｉ−Ｇｃｋ及びｓｉ−３７５によってトランスフェクションした細胞において顕著に減少した（図３）。ａｐｏＭ又はｓｉＲＮＡに向けられた、ｍｉＲ−３７６、ｍｉＲ−１２４、−１２９、−１３０及び２１０等の幾つかの他のマイクロＲＮＡに相同な合成ｓｉＲＮＡのトランスフェクションによっては、基礎的、又はグルコース刺激によるインスリン分泌に影響を及ぼさなかった（図３、データ示さず）。
【０１２９】
アンチセンスベースの戦略は、特に培養細胞におけるｍｉＲＮＡ機能を阻害することが近年開示されている。ヌクレアーゼ耐性の、ｍｉＲ−３７５に対する２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴリボヌクレオチドをＣＭＶ−ｈＧＨベクターとコトランスフェクションし、グルコースによる刺激に応答したインスリン分泌を解析した。コントロールのアンチ−ＧＦＰ ２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド（図３Ｂ）と比較して、アンチ−ｍｉＲ−３７５によってトランスフェクションした細胞においてグルコースを刺激によるインスリン分泌の増加が見られた。以上のデータより、ｍｉＲ−３７５がインスリン分泌の抑制剤であることが示された。
【０１３０】
次に、ＣＭＶ５プロモータの管理下で、前駆体配列を含む１２３ｂｐ断片のクローニングによって、ｍｉＲ−３７５を発現する組換えアデノウイルスを調製した。ＨＥＫ細胞をコントロールのｅＧＦＰ（Ａｄ−ＧＦＰ）を発現するアデノウイルスに感染させ、そこにおいてＡｄ−３７５分子の濃度の増加による、ｍｉＲ−３７５の発現のドーズディペンデントな増加を示した。同様に、アデノウイルスによる感染技術を使用し、ＭＩＮ６細胞にてｍｉＲ−３７５を発現させた。ｍｉＲ−３７５を発現しているＭＩＮ６細胞は、コントロールのアデノウイルスに感染した細胞と比較して、グルコースによって誘発されるインスリン分泌の４０％の減少が見られた（図４）。このインスリン分泌の減少は、不完全なインスリン生産によるようには見られなかった。なぜなら、Ａｄ−３７５及びＡｄ−ｅＧＦＰに感染したＭＩＮ６細胞、並びに膵島細胞におけるインスリン含有量が同じであったためである。
【実施例４】
【０１３１】
細胞内カルシウムシグナリング及び全細胞のカルシウム電流：
解糖系の流れ及びミトコンドリア酸化的リン酸化の増加は、サイトゾル中のＡＴＰ／ＡＤＰ比率の増加を経たＡＴＰ−感受性カリウムチャネル（ＫＡＴＰ）の遮断を誘導し、グルコース誘発によるインスリン分泌への第２のシグナルを発生させるために必要となる。これにより、膜脱分極及び電位依存的なＣａ２＋チャネルを通したＣａ２＋の流入が生じる。［Ｃａ２＋］の上昇が、インスリン顆粒エキソサイトーシスには必要である。グリベンクラミドのようなスルフォニルウレアは、直接ＫＡＴＰを遮断することによって、インスリン分泌を促進する。ＫＣｌにより膵臓β−細胞の直接的な脱分極が生じ、インスリン顆粒の脱顆粒が最大となる。トルブタミド及びＫＣｌの刺激による、Ａｄ−３７５感染ＭＩＮ６細胞のインスリン分泌を測定した。これらの分泌促進物質を用いた膵臓β−細胞の刺激は、Ａｄ−ｅＧＦＰ感染細胞と比較したＡｄ−３７５感染細胞におけるインスリン分泌の障害を示した。更にＡｄ−３７５の発現により、Ａｄ−ｅＧＦＰ感染ＭＩＮ６細胞と比較した、ＧＬＰ−１（キャンプの起動によるインスリン分泌の強力なグルコースに依存する刺激）に応答したインスリン分泌が阻害されることが確認された。これらのデータは、ｍｉＲ−３７５の過剰発現がインスリン分泌の末梢部のステップを含む欠陥につながることを示唆するものである。そこにおいて、膵臓β−細胞の細胞質のＣａ２＋濃度の上昇に影響を及ぼすか、エキソサイトーシスに対して干渉することが考えられる。
【０１３２】
ｍｉＲ−３７５がインスリンエキソサイトーシスを起動させるのに必要となる第２のシグナルの発生を阻害するか否かを解析するため、Ａｄ−３７５又はコントロールのＡｄ−ｅＧＦＰに感染した膵島細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度［Ｃａ２＋］ｉを測定した。各々の膵島細胞は刺激され、３つの異なる刺激によって細胞内Ｃａ−濃度を増加させた。グルコース濃度を５ｍＭから１５ｍＭまで増加させ、コントロール及びＡｄ−３７５を発現する膵島細胞のＣａ２＋濃度の変化を観察した。トルブタミドによる刺激において、同様の変動が観察された。静止状態での［Ｃａ２＋］ｉは、コントロール及びＡｄ−３７５を発現している膵島細胞でそれぞれ０．１３＋０．０１μＭ及び０．１２±０．０１μＭ（平均）であった。１５ｍＭのグルコースが存在する場合には、［Ｃａ２＋］ｉの時間平均は、コントロールの膵島細胞における０．４２±０．１２μＭに対し、Ａｄ−３７５を発現する膵島細胞では０．３９＋０．０５μＭに達した。トルブタミドが存在する場合には、対応する値は、コントロールの膵島細胞において０．５３＋０．１１μＭ、及びＡｄ−３７５感染膵島細胞において０．５５±０．１１μＭであった。最後に、高い細胞外Ｋ＋による脱分極は、コントロール及びＡｄ−３７５感染膵島細胞において同様に増加し［Ｃａ２＋］ｉのピークの平均はそれぞれ０．８５＋０．２４μＭ及び１．０１＋０．３１μＭであった（データ示さず）。質的に類似した結果が、非定量的な染料であるｆｌｕｏ−３を使用した実験により得られた（上記参照）。更に、ｅＧＦＰを発現している単離された細胞を測定したときには、同様のグルコースに対する反応の違いが観察されなかった（感染していない下層の細胞層による数値は除外される（データ示さず））。膵島細胞周辺部は、非β−細胞において肥大していた。しかしながら、変動が５ｍＭのグルコースで観察されず、１５ｍＭにて［Ｃａ２＋］ｉが増加したという事実は、δ−細胞が低い濃度で既に活性であり、またα−細胞は高い濃度で阻害されるゆえに、β−細胞の豊富なゾーンを選択するに至ったことを示唆するものである。
【０１３３】
ＭＩＮ６細胞及び単離された膵島細胞からの調整されたインスリン分泌の制御は、ｍｉＲ−３７５の発現が［Ｃａ＋２］ｉシグナリングの下流（おそらくはエキソサイトーシスのレベル）におけるインスリン分泌に影響を及ぼすことを示唆する。この仮説を検討するために、機能が同定されたβ−細胞に静電容量測定を適用した。エキソサイトーシスは、０ｍＶから−７０ｍＶまでの脱分極を１Ｈｚ、５００ｍｓにて１０回行った（図３Ａ）。左記操作により、β細胞において、一定条件の下で８３７±２４４ｆＦ（ｎ＝９）の膜静電容量の増加を誘発した。Ａｄ−３７５感染細胞においては、それに対応する増加は９４±２７ｆＦ（８５％減少）に留まった（ｎ＝１０；Ｐ＜０．０１）。同様の結果が、一旦エキソサイトーシスがその代わりに１．５のμＭ（図２ＤからＥ）のフリーなＣａ２＋濃度を有するＣａ２＋／ＥＧＴＡ−バッファーによって誘発された場合に得られた。また、これらの実験で、Ａｄ−３７５感染細胞は、コントロールの細胞と比較し静電容量の増加率が６３％減少した（Ｐ＜０．００１；ｎ＝１５〜１７）。
【実施例５】
【０１３４】
標的遺伝子の同定：
多数のゲノム全体に保存されているマイクロＲＮＡの標的を予測するために、ＲＮＡ：ＲＮＡデュプレックス相互作用の熱力学に基づくモデリングを、配列の比較分析と結合するアルゴリズムを適用した。ｍｉＲ−３７５標的遺伝子の６４の推定のリストの中から、インスリン分泌／膵島分化におけるそれらの潜在的役割に基づいて６つの遺伝子を選択し、試験に用いた。
【０１３５】
それらの遺伝子は、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ−４（Ｆｚｄ４）、ｔ−ＳＮＡＲＥｓ酵母ホモログＩＡ（Ｖｔｉ−１ａ）と相互作用する小胞輸送に係るタンパク質、Ｖ−１／ミオトロフィン（Ｖ−１／Ｍｔｐｎ）、ｐ３８有糸分裂促進プロテインキナーゼ（Ｍａｐｋ１１）、モノカルボン酸輸送体８（Ｓｌｃ１６Ａ２）及び対状のボックスタンパク質Ｐａｘ−６の遺伝子であった。これらの遺伝子の発現を、Ａｄ−３７５又はＡｄ−ｅＧＦＰに感染したＭＩＮ６及びＮ２Ａ細胞において、イムノブロッティングにより解析した。内在性ｍｉＲ−３７５を発現しないＮ２Ａ細胞におけるｍｉＲ−３７５の発現は、Ｍｔｐｎ及びＶｔｉ−１ａの発現レベルの減少につながった（図４Ａ、Ｂ）。
【０１３６】
対照的に、Ｆｚｄ４、Ｍａｐｋ１１及びＳｌｃ１６Ａ２の遺伝子発現はＡｄ−３７５及びＡｄ−ｅＧＦＰに感染した細胞において同様であった。組換えアデノウイルスＡｄ−３７５によるＭＩＮ６細胞におけるｍｉＲ−３７５の過剰発現は、Ｍｔｐｎのタンパク質レベルを低下させたが、Ｖｔｉ−１ａ、Ｆｚｄ４、Ｍａｐｋ１１及びＳｌｃ１６Ａ２の発現には影響を及ぼさなかった。
【０１３７】
Ｍｔｐｎ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおける予測されたｍｉＲ−３７５目的部位が、ｍｉＲ−３７５によるＭｔｐｎ発現のサイレンシングに関与するか否かを解析するため、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼＯＲＦ（ｐＲＬ−Ｍｔｐｎ）の下流に推定３’ＵＴＲ標的部位を含む２８９ｎｔの３’ＵＴＲ部分をクローニングし、このレポーターベクターを、コントロールのアンチセンス２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド、又はｍｉＲ−３７５のアンチセンスの２’−Ｏ−メチル・オリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−ｍｉＲ−３７５）と共に、ＭＩＮ６細胞へコトランスフェクションした。２’−Ｏ−ｍｉＲ−３７５によってトランスフェクションした細胞のルシフェラーゼ活性は、コントロールの２’−Ｏ−ｍｉＲＮＡ及びｐＲＬ−Ｍｔｐｎによってコトランスフェクションした細胞と比較して２倍増加していた。更に、ｍｉＲ−３７５標的部位の中心に点変異を導入することにより、内在性ｍｉＲ−３７５及びＶ−１／ミオトロフィン標的部位間の相補性が減少し、２’−Ｏ−ｍｉＲ−３７５によるルシフェラーゼ活性の刺激効果が損なわれた（図５）。以上より、Ｍｔｐｎは膵臓β−細胞ｍｉＲ−３７５の標的であり、Ｍｔｐｎ遺伝子発現の抑制は、Ｍｔｐｎ遺伝子の３’ＵＴＲの単一のｍｉＲ−３７５目的部位によって調節されることが明らかとなった。
【０１３８】
ＭＩＮ６細胞のＭｔｐｎの発現減少が、Ａｄ−３７５感染細胞において観察されるグルコース誘発によるインスリン分泌の減少に関与するか否かを解析するために、ＭＩＮ６細胞をアポリポタンパク質Ｍ（コントロール）及びＭｔｐｎを標的とするｓｉＲＮＡによりトランスフェクションし、タンパク質表現レベルをウェスタンブロッティングにより解析した。Ｍｔｐｎ及びＶｔｉ１ａを標的としているｓｉＲＮＡは、これらの遺伝子の発現を５０％以上減少させた（図４Ｃ）。グルコース誘発によるインスリン分泌におけるこれらの遺伝子のサイレンシングの効果を、それぞれのｓｉＲＮＡ及びプラスミドｐＣＭＶ−ｈＧＨのコトランスフェクションにより解析した。２５ｍＭのグルコース添加に応答するインスリン分泌を、トランスフェクションの２日後に測定した。コントロールのｓｉＲＮＡによってトランスフェクションした細胞と比較して、Ｍｔｐｎを標的とするｓｉＲＮＡによってトランスフェクションした細胞のインスリン分泌は、３０％減少していた（図４Ｄ）。なお、Ｖｔｉ１ａのＲＮＡサイレンシングは、グルコース誘発によるインスリン分泌に影響を及ぼさなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は、本願明細書で言及する修飾されたヌクレオチド単位を示す。Ｂは、次の核酸塩基のいずれか一つを意味する：アデノシン、シチジン、グアノシン、チミン又はウリジン。
【図２Ａ】図２は、マウスｍｉＲ−３７５の前駆体の構造予測及び組織発現を示す。ＲＮＡの二次構造予測は、Ｍｆｏｌｄ ｖｅｒｓｉｏｎ３．１を使用して行った。下線部はｍｉＲＮＡ配列である。完全なホモロジーが、マウス及びヒト配列の間に見られた。
【図２Ｂ】ｍｉＲ−３７５及び３７６の組織における発現を示す。マウス組織から全ＲＮＡ（３０μｇ）をノーザンブロットのために単離し、ｍｉＲＮＡのプローブとした。
【図２Ｃ】膵島、ＭＩＮ６細胞及び膵臓全体から全ＲＮＡ（１０μｇ）を精製し、ノーザンブロットを行った。マウス膵島において高い発現レベルが検出された。ｔＲＮＡを、コントロールとしてローディングした。
【図３Ａ】ｍｉＲ−３７５による分泌抑制作用を示すグラフ。ＭＩＮ６細胞をトランジェントにコトランスフェクションした。ＣＭＶ−ｈＧＨ及びβ−ｇａｌをコードする１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ ３７５に相応する配列を有する合成ｓｉＲＮＡ、グルコキナーゼ又はルシフェラーゼ（それぞれｓｉ−３７５、ｓｉＲＮＡ−Ｇｃｋ及びｓｉＲＮＡ−ｌｕｃと表記）を使用。
【図３Ｂ】ｍｉＲ−３７５（２’−Ｏ−メチル−３７５）と相補的な２’−Ｏ−メチル・オリゴリボヌクレオチド又はコントロールの２’−Ｏ−オリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルＧＦＰ）を使用した試験結果のグラフを示す。４８時間後、細胞をグルコース濃度の低い（２．８ｍＭ）及び高い（２５ｍＭ）条件下でインキュベートした。これらの条件下に分泌されるｈＧＨの量をＥＬＩＳＡで測定し、β−ｇａｌ活性により標準化した（＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図４Ａ】ｍｉＲ−３７５の標的遺伝子の同定を示す。ＭＩＮ６細胞は、４８時間、Ａｄ−ｍｉＲ−３７５の感染を受けた。溶解後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子し、α−Ｍｔｐｎ、α−Ｖｔｉ１ａ又はａ−ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（Ｔｂｐ）（コントロール）によってイムノブロットした。
【図４Ｂ】ｍｉＲ−３７５の標的遺伝子の同定を示す。試験はＮ２Ａ細胞を使用して再度行われた。
【図４Ｃ】ＭＩＮ６細胞を４８時間、Ｍｔｐｎ（ｓｉＲＮＡ−Ｍｔｐｎ）又はＶｔｉ１ａ（ｓｉＶｔｉ１ａ）に対して作用するよう設計したｓｉＲＮＡによってトランジェントにトランスフェクションし、溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の後、サンプルをＭｔｐｎ又はＶｔｉ１ａを用いてイムノブロッティングした。
【図４Ｄ】ＭＩＮ６細胞を、ｓｉ−３７５、ｓｉ−Ｍｔｐｎ又はｓｉ−Ｖｔｉ１ａによってトランジェントにトランスフェクションし、４８時間後、細胞をグルコース濃度の低い（２．８ｍＭ）及び高い（２５ｍＭ）条件下でインキュベートした結果のグラフを示す。これらの条件下に分泌されるｈＧＨの量をＥＬＩＳＡで測定し、β−ｇａｌ活性により標準化した（＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図５Ａ】Ｍｔｐｎの３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−３７５標的部位は、ｍｉＲ−３７５によって遺伝子発現の抑制に重要であることを示す。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの３’ＵＴＲの中に挿入される、ミオトロフィンの３’ＵＴＲ中の標的部位の配列。変異体（Ｍｔｐｎ−ＭＵＴ）の配列は、ｍｉＲ−３７５の５’末端の５つの点変異（太字）を除いて、野生型（Ｍｔｐｎ−ＷＴ）と同一である。
【図５Ｂ】ＭＩＮ６細胞を、レポーターコンストラクトであるｍｉＲ−３７５（２’−Ｏ−メチル−３７５）と相補的な２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド、又はコントロールの２’−Ｏ−オリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルＧＦＰ）によってトランジェントにトランスフェクションした。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵島マイクロＲＮＡ及びそれを阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡは、典型的には小さいＲＮＡ分子、すなわち一般に長さ約１９から２５ヌクレオチド長のＲＮＡ分子である。これらのマイクロＲＮＡは、ヘアピン前駆体が分裂して生じるノンコーディングＲＮＡである。幾つかのマイクロＲＮＡは、広範囲にわたる多細胞生物のゲノムにおいて同定されている。
【０００３】
多くのマイクロＲＮＡは、近縁でない生物種間でもその配列が保存されており、組織特異的又は発生の各段階において特徴的な発現を呈する。生物種間の配列の保存は、マイクロＲＮＡが生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことを示唆する。
【０００４】
マイクロＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの３’側のノンコーディング領域に部分的にハイブリダイズした後に翻訳をブロックすることが報告されている。前記マイクロＲＮＡの標的となる遺伝子は未だ解明すべき部分が残されている。
【０００５】
しかしながら、マイクロＲＮＡは多様な疾病や症状を発症させることを示唆する証拠が揃いつつある。例えば、ショウジョウバエのマイクロＲＮＡは、アポトーシスに関連する遺伝子を標的としていることが明らかとされ、またＢ細胞慢性リンパ性白血病は、二つのマイクロＲＮＡの欠失が関与していることが明らかとされている。
【０００６】
膵島細胞（また、ランゲルハンス島とも称される）は、ホルモン類の産生、分泌に特化した細胞の群である。また、次の５種類の細胞：α、β、δ、ＰＰ及びＤ１細胞が存在すると報告されている。
【０００７】
これらの細胞は、グルコースの調節に関与していると言われている。例えば、α細胞は、血液のグルコースのレベルを増やすことに関係するホルモン類であるグルカゴンを分泌する。またβ細胞は、生体がグルコースをエネルギー生成のために利用するのを補助するホルモンであるインスリンを分泌する。
【０００８】
グルコース利用の調節の妨害は、特にインスリン分泌β細胞において、例えば糖尿病などの疾患につながり得る。したがって、グルコースホメオスタシスの調節において役割を果たす遺伝子の調節機構を解明することは重要である。例えば、仮にマイクロＲＮＡがグルコース利用を調節するとしても、そのような事実は従来技術において公知でない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記に鑑み、例えばマイクロＲＮＡのような膵島細胞の調節因子の機能を解明する一助となり得る材料及び方法が求められている。
【００１０】
更に、マイクロＲＮＡはＲＮＡ分解を誘発するか又は重要なタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制する能力を有するため、標的ｍＲＮＡの膵臓マイクロＲＮＡによって誘発された裂開又は翻訳抑制を阻止する新規な分子が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一つの実施態様において、本発明は、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。前記分子は、配列番号：１−２０に示される膵島マイクロＲＮＡに含まれる塩基配列のうち、少なくとも１０の隣接する塩基配列をを含む。但し、前記塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、また前記隣接する塩基の最高１０％が非相補的でもよい。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は、修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子に関する。前記分子は、基本分子上に最低１０の部分及び最高５０の部分を含み、前記基本分子はから基本単位を含み、各々の部分は基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基が配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列を含む。但し、前記塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対であり、また隣接する塩基の最高１０％がそれについて付加、欠失、変異又はその組合せであってもよい。また、隣接する部分の５０％以上はデオキシリボ核酸の基本単位を含まず、少なくとも一つの部分が、未修飾のデオキシリボヌクレオチド部分若しくは未修飾のリボヌクレオチド部分でない。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、単離された一本鎖アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子に関する。前記分子は、基本分子上に最低１０の部分及び最高５０の部分を含み、基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各々の塩基が相補的な塩基との間でワトソン−クリック塩基対を形成しており、少なくとも１０の隣接する塩基が、配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡ分子のいずれか一つの隣接する塩基配列と相補的な配列を含む。ただし、その塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対であり、また隣接する塩基の最高１０％がそれについて付加、欠失、変異又はその組合せであってもよい。また、隣接する部分の５０％以上はデオキシリボ核酸の基本単位を含まず、少なくとも一つの部分が、未修飾のデオキシリボヌクレオチド部分若しくは未修飾のリボヌクレオチド部分でない。また、前記分子は、マイクロＲＮＰ活性を阻害することができる。
【００１４】
更に別の実施形態では、本発明は、細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法に関する。マイクロＲＮＰは、膵島マイクロＲＮＡ分子を含む。前記方法は、一本鎖アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子を細胞に導入することを含む。そこにおいて、前記アンチ−膵島マイクロＲＮＡは、膵島マイクロＲＮＡ分子と相補的である。
【００１５】
更なる実施態様において、本発明は、哺乳類の患者の糖尿病を治療する方法に関する。前記方法は、配列番号：４１又は５１に示す配列を有する少なくとも１０の隣接する塩基を有するアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の有効量を、哺乳類に導入することを含む。
【００１６】
他の実施形態では、本発明は、本発明に従って単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子からを含む単離されたマイクロＲＮＰに関する。更に他の実施形態では、本発明は、本発明に従って単離された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子を含む単離されたマイクロＲＮＰに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
膵島マイクロＲＮＡ分子
発明者は、新規な膵島マイクロＲＮＡ分子を発見した。これらの分子は、配列番号：１から２０を有する。したがって、一つの実施態様において、本発明は、単離された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００１８】
マイクロＲＮＡ分子は、従来技術において周知である（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ，２００４，１１６，２８１−２９７）。ＢａｒｔｅｌによるマイクロＲＮＡ分子に関する定義及び特徴は、本願明細書に援用される。この種の分子は、ゲノムの染色体位置に由来し、特定のマイクロＲＮＡ遺伝子から生じる。
【００１９】
成熟したマイクロＲＮＡ分子は、部分的にヘアピン構造を形成する前駆体転写物からプロセシングされる。前記ヘアピン構造はＤｉｃｅｒとして公知の酵素によって適当に切断される。それにより一つのマイクロＲＮＡデュプレックスを生成する。Ｂａｒｔｅｌの上記文献を参照のこと。
【００２０】
通常、マイクロＲＮＡデュプレックスの２本鎖のうちの１本は、マイクロＲＮＡリボ核タンパク複合体（マイクロＲＮＰ）で包まれる。例えば、ヒトのマイクロＲＮＰはタンパク質ｅＩＦ２Ｃ２、ヘリカーゼＧｅｍｉｎ３及びＧｅｍｉｎ４を含む。
【００２１】
一つの実施態様において、本発明は、配列番号：１から２０に示される配列及びそれの均等物を有する少なくとも１０の隣接する塩基から成る、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。望ましくは、前記の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、一連の塩基を有する少なくとも１３、より好ましくは、少なくとも１５及び更により好ましくは少なくとも２０の隣接する塩基であり、配列番号：１−２０に示される膵島マイクロＲＮＡ中の配列を有する。
【００２２】
（表１及び２）：膵島マイクロＲＮＡ及びヘアピン前駆体配列。接頭辞「ｈｓａ」を有するマイクロＲＮＡの名前はヒトの配列、接頭辞「ｒｎｍｕ」はマウスの配列を示す。ヘアピン前駆体の膵島マイクロＲＮＡ配列部を太字で示す。
【表１】
【表２】
【００２３】
本願明細書において、塩基とは、天然のＤＮＡ又はＲＮＡで見られるヌクレオチドの塩基のいずれか一つのことを指す。前記塩基は、プリン又はピリミジンである。前記プリン塩基の例としては、アデニン（Ａ）と、グアニン（Ｇ）が含まれる。前記ピリミジン塩基の例としては、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。アデニンは、２，６−ジアミノプリンと置換されてもよい。
【００２４】
本願明細書において開示される未修飾の核酸分子の配列は、ウラシル塩基を有して示される。ウラシル塩基は、未修飾のＲＮＡ分子中で生じる。本発明には、未修飾のＤＮＡ分子も含まれる。未修飾のＤＮＡ分子の塩基の配列は、未修飾のＲＮＡ分子と同様である。但し、未修飾のＤＮＡ分子では、ウラシル塩基はチミン塩基と交換される点で例外的である。
【００２５】
配列中の各々の塩基は、ワトソン−クリック塩基対を相補的な塩基により形成することができる。本願明細書におけるワトソン−クリック塩基対は、例えば以下の塩基間の水素結合による相互作用である。すなわち：アデニン及びチミン（Ａ−Ｔ）、アデニン及びウラシル（Ａ−Ｕ）、シトシン及びグアニン（Ｃ−Ｇ）。
【００２６】
均等物とは、少なくとも１０の隣接する塩基のうち、最高３０％がゆらぎ塩基であり、また最高１０％、更に望ましくは最高５％までの隣接する塩基が非相補的である状態の分子を指す。
【００２７】
本発明において、ゆらぎ塩基とは、分子の配列における
１）ウラシルによるシトシンの置換、又は
２）グアニンによるアデニンの置換
のいずれの場合も含まれる。これらのゆらぎ塩基置換は一般に、ＵＧ又はＧＵゆらぎと呼ばれる。表３は、隣接する塩基の数及び分子のゆらぎ塩基の最大数を示す。
【００２８】
（表３）：隣接する塩基の数及び分子のゆらぎ塩基の最大数を示す。
【表３】
【００２９】
本願明細書において「非相補的である」とは、付加、欠失、変異又はそれらの組合せを指す。付加とは、何らかの塩基が上記隣接する配列に挿入されることを指す。欠失とは、隣接する配列に存在する何らかの部分が除去されることを指す。変異とは、隣接する配列の塩基のうちの一つが異なる塩基に置換されることを指す。
【００３０】
付加、欠失又は変異は、例えば隣接する配列のいずれの端部又は分子中の隣接する配列の部分で生じてもよい。典型的には、例えば、隣接する配列が約１０から約１５の塩基長さのまでの比較的短い場合、付加、欠失又は変異は、隣接する配列の末端付近にて生じる。隣接する配列が比較的長い場合、例えば、最低１６塩基の隣接する配列である場合は、付加、欠失又は変異は、隣接する配列のどこでも生じ得る。
【００３１】
例えば、隣接する塩基数が１０〜１９であるときは、いずれも又は隣接する塩基のうちのゼロ又は一つにおいて付加、欠失又は変異が生じ、また隣接する塩基数が２０〜２３であるときは、最高一つか二つの塩基の付加、欠失又は変異が許容範囲である。
【００３２】
膵島マイクロＲＮＡの少なくとも１０の隣接するヌクレオチドに加えて、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子はまた、一つ以上のヌクレオチドを付加することができる。なお、前記の付加するヌクレオチド数に、上限はない。典型的には、５００のヌクレオチドまで、好ましくは３００ヌクレオチドまでを、膵島マイクロＲＮＡの少なくとも１０の隣接する塩基に付加することができる。
【００３３】
いかなるヌクレオチドも付加できる。前記のヌクレオチド付加は、上記のいずれの塩基も適用可能である。したがって、例えば付加的なヌクレオチドはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵのいずれか一つ又は二つ以上でもよい。
【００３４】
一つの実施態様において、膵島マイクロＲＮＡはヘアピン前駆体配列又はそのフラグメントの一部である。例えば、適切なヘアピン前駆体配列は、配列番号：２１から４０に示される。前記フラグメントは、その５’末端及び／又は３’末端にて、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは最低２０のヌクレオチド含む、ヘアピン前駆体配列のいかなるフラグメントが適用可能である。好ましくは、前記ヌクレオチドの配列は、膵島マイクロＲＮＡが存在するヘアピン前駆体に存在する。
【００３５】
膵島マイクロＲＮＡ又はヘアピン前駆体は、例えば組換えベクターなどに挿入することができる。典型的には、膵島マイクロＲＮＡを含んでいる組換えベクターを構築するために、膵島マイクロＲＮＡ配列を含むヘアピン前駆体配列をベクターに組み込む。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４，３０３：８３−８６を参照。
【００３６】
組換えベクターは、例えばプラスミド、コスミド又はファージ等のいかなる組換えベクターでもよい。組換えベクターは、一般に複製開始点を有する。ベクターは、例えばアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）等のウイルスベクターが使用可能である。例えばＬｅｄｌｅｙ １９９６，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１３：１５９５−１６１４、Ｖｅｒｍａら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７，３８７：２３９−２４２を参照。
【００３７】
ベクターに、選択可能なマーカーを更に含めてもよい。適切な選択マーカーには、例えばテトラサイクリン又はゲンタマイシンなどの薬剤耐性マーカー、又は例えばβ−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼのような検出可能な遺伝子マーカーが使用可能である。
【００３８】
好ましい実施態様において、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、実質的に配列番号：１から４０に示される膵島マイクロＲＮＡ配列又はヘアピン前駆体配列のいずれか一つからなる。
【００３９】
本願明細書において、「単離された」とは、分子が他の核酸を本質的に含まないことを指す。他の核酸を本質的に含まない、とは、分子が少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは最低約９８％の純度で、他の核酸を含まないことを指す。
【００４０】
望ましくは、分子は実質的に純粋である。なお、それは前記分子が他の核酸を含まないという意味の他に、前記分子の合成及び単離において使用する他の材料を含まないという意味も含まれる。合成において使用する材料とは、例えば酵素である。単離において使用する材料とは、例えばゲル類（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ用）である。前記分子は、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは最低約９８％の純度で、これらの材料を含まない。
【００４１】
膵島細胞は、従来技術において当業者に公知のいかなる膵島細胞でもよい。膵島細胞の例としては、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞及びＤ１細胞が挙げられる。望ましくは、前記細胞はβ細胞である。
【００４２】
マイクロＲＮＡ又はヘアピン前駆体の塩基の配列は、非常に良く保存されている。そのため、いかなる哺乳類の膵臓細胞の配列でも使用可能である。哺乳類の例としては、イヌ及びネコなどのペットの動物、ウシ、ウマ及びヒツジなどの家畜、ネズミ、マウス及びウサギのような実験動物、サル及びヒトのような霊長類が挙げられる。望ましくは、前記哺乳類はヒト又はマウスである。
【００４３】
修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子：
他の実施態様において、本発明は、修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子に関する。修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子は、上記の膵臓マイクロＲＮＡ分子、ヘアピン前駆体分子又は、それの均等物のいずれかである。但し、修飾された分子が少なくとも一つの修飾された部分（すなわち、少なくとも一つの部分が修飾されていないデオキシリボヌクレオチド部分又は修飾されていないリボヌクレオチド部分でない）を含まない場合を除く。この実施態様において、前記の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１３、より好ましくは少なくとも１５、更により好ましくは少なくとも１８、最も好ましくは少なくとも２１の部分を含む。
【００４４】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、多くとも５０、好ましくは多くとも４０、より好ましくは多くとも３０、更に好ましくは多くとも２５、最も好ましくは多くとも２３の部分を含む。前記部分の最小数及び最大数の適切な範囲は、上記のいずれかの最小数及びいずれかの最大数を結合することによって得ることができる。
【００４５】
各々の修飾された部分は、基本単位に結合する塩基を含む。前記基本単位は、安定して塩基と結合して、オリゴマーの鎖を形成することが可能ないかなる分子単位でもあってもよい。本願明細書において、修飾された部分の基本単位には、天然のＤＮＡ又はＲＮＡ分子に通常存在する基本単位は含まれない。
【００４６】
このように修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼ耐性を増加させる。したがって、前記分子のヌクレアーゼ耐性は、修飾されていないリボヌクレオチド部分のみ、修飾されていないデオキシリボヌクレオチド部分のみ又は両方を含んでいる配列と比較し、増加する。このような修飾された部分は、例えばＫｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，１６２８−１６４４（２００３）により公知技術である。
【００４７】
耐性が得られるヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ又はその両方である。エキソヌクレアーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ又は５’→３’エキソヌクレアーゼのいずれでもよい。３’→５’ヒトエキソヌクレアーゼの例としては、ＰＮＰＴ１、ワーナー症候群ヘリカーゼ、ＲＲＰ４０、ＲＲＰ４１、ＲＲＰ４２、ＲＲＰ４５、ＲＲＰ４６が挙げられる。５’→３’エキソヌクレアーゼの例としては、ＸＲＮ２及びＦＥＮ１が挙げられる。エンドヌクレアーゼの例としては、Ｄｉｃｅｒ、Ｄｒｏｓｈａ、ＲＮＡｅ４、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐ、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈ１、ＤＨＰ１、ＥＲＣＣ−１及びＯＧＧ１が挙げられる。エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼとして機能するヌクレアーゼの例としては、ＡＰＥ１及びＥＸＯ１が挙げられる。
【００４８】
修飾された部分は、膵島マイクロＲＮＡ分子のいかなる位置に設置することができる。例えば、膵島マイクロＲＮＡ分子を３’→５’エキソヌクレアーゼから保護するために、分子が、３’末端に少なくとも一つの修飾された部分を、好ましくは３’末端に少なくとも二つの修飾された部分を有することができる。分子を５’→３’エキソヌクレアーゼから保護するには、望ましくは、膵島マイクロＲＮＡ分子の５’末端で、少なくとも一つの修飾された部分、好ましくは少なくとも二つの修飾された部分で有することである。膵島マイクロＲＮＡ分子はまた、５’末端と３’末端の間にの少なくとも一つの好ましくは少なくとも二つの修飾された部分を有することができ、それによりエンドヌクレアーゼ耐性を増加させることができる。好ましくは、少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、更により好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは、少なくとも約９５％の部分が修飾される。一つの実施態様において、部分の全てが修飾された（例えばヌクレアーゼ耐性）分子である。
【００４９】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の一つの実施例において、前記分子は、少なくとも一つの修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分を含む。適切な修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分は、従来技術において公知である。この種の修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分は、例えば、基本単位としてチオリン酸デオキシリボース基を含む（図１の構造式１を参照）。チオリン酸デオキシリボヌクレオチド部分を含む修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、一般にホスホロチオネート（ＰＳ）ＤＮＡと呼ばれる（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１０，１１７−１２１（２０００）を参照）。
【００５０】
修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分の他の適用可能な例としては、Ｎ’３−Ｎ’５ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分が挙げられる。そこにおいて、Ｎ’３−Ｎ’５ホスホロアミダートデオキシリボース基が基本単位に含まれる。図１中の構造式２を参照のこと。ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド分子は、一般にホスホロアミダート（ＮＰ）ＤＮＡと呼ばれている。それに関しては、例えば、Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，３１４３−３１４４（１９９４）を参照のこと。
【００５１】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の他の実施態様において、前記分子は一つ以上の修飾されたリボヌクレオチド部分を含む。修飾されたリボヌクレオチド部分の適用可能な例は、その２’位置で置換されたリボヌクレオチド部分である。前記２’位置における置換基は、例えば、炭素数Ｃ１からＣ４のアルキル基であってもよい。前記Ｃ１からＣ４のアルキル基は、飽和又は不飽和であっても良く、また直鎖状又は分岐型であってもよい。Ｃ１からＣ４のアルキル基の幾つかの例としては、エチル、イソプロピル及びアリール基が挙げられる。前記の望ましいＣ１のＣ４アルキル基は、メチル基である。図１中の構造式３を参照のこと。その２’位置をＣ１からＣ４のアルキル基で置換されたリボヌクレオチド部分を含むオリゴリボヌクレオチド分子は、一般には２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）ＲＮＡ例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡ（ＯＭｅＲＮＡ）と呼ばれる。
【００５２】
修飾されたリボヌクレオチド部分の２’位置における置換基の他の適用可能な例は、（炭素数Ｃ１からＣ４のアルコキシ）−（炭素数Ｃ１からＣ４のアルキル基）である。前記Ｃ１からＣ４のアルコキシ（アルキルオキシ）及びＣ１からＣ４のアルキル基は、上記のアルキル基のいかなるものを含めてもよい。前記の望ましいＣ１からＣ４のアルコキシ−Ｃ１からＣ４のアルキル基は、メトキシエチル基である。図１中の構造式４を参照のこと。一つ以上のリボヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド分子であり、その２’位置をＣ１からＣ４のアルコキシ−Ｃ１からＣ４のアルキル基で置換された分子は、２’−Ｏ−（Ｃ１からＣ４のアルコキシ−Ｃ１からＣ４のアルキル基）ＲＮＡ、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ ＲＮＡ）と呼ばれる。
【００５３】
修飾されたリボヌクレオチド部分の他の適用可能な例は、２’−酸素原子と４’−炭素原子との間でメチレン架橋を有するリボヌクレオチドである。図１中の構造式５を参照のこと。リボヌクレオチド部分を含むオリゴリボヌクレオチド分子であり、２’−酸素原子と４’−炭素原子との間でメチレン架橋を有する分子は、一般にロックされた核酸（ＬＮＡ）と呼ばれる。それに関しては、例えば、Ｋｕｒｒｅｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３０，１９１１−１９１８（２００２）；Ｅｌａｙａｄｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ２，５５８−５６１（２００１）；Ｏｒｕｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ＭｏＩ．Ｔｈｅｒ．３，２３９−２４３（２００１）；Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４，３６０７−３６３０（１９９８）；Ｏｂｉｋａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．ｉＰ，５４０１−５４０４（１９９８）を参照のこと。ロックされた核酸は、Ｐｒｏｌｉｇｏ社（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ ａｎｄ Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００５４】
修飾されたリボヌクレオチド部分の他の適用可能な例は、フルオロ基により２’位置を置換されたリボヌクレオチドである。そのような２’−フルオロリボヌクレオチド部分は、当業者に公知である。２’−フルオロリボヌクレオチド部分を含む分子は一般に、本発明において２’−フルオロリボ核酸（ＦＡＮＡ）と呼ばれる。図１の構造式７、またＤａｍｈａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，１２９７６−１２９７７（１９９８）を参照のこと。
【００５５】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の他の実施態様において、前記分子は、アミノ酸残基に結合する一つ以上の塩基を含む。アミノ酸残基に結合する一つ以上の塩基を含む部分は、本発明において以下ペプチド核酸（ＰＮＡ）部分と記す。そのような部分はヌクレアーゼ耐性であり、当業者に公知である。ＰＮＡ部分を有する分子は一般にペプチド核酸と呼ばれる。図１中の構造式６、またＮｉｅｌｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３，１５６−１６４（１９９９）；Ｅｌａｙａｄｉら、ｉｄ．；Ｂｒａａｓｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１，４５０３−４５０９（２００２）；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９７−１５００（１９９１）を参照のこと。
【００５６】
アミノ酸はいかなるアミノ酸であってもよい。また、天然及び人工のアミノ酸を含む。天然アミノ酸はすなわち、通常タンパク質中に存在する２０の一般のアミノ酸、例えばアラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）を含む。
【００５７】
上記の人工のアミノ酸としては、例えば、アルキル、アリール又はアルキルアリール基を含むアミノ酸である。アルキルアミノ酸の若干の実施例として、α−アミノブチル酸、β−アミノブチル酸、γ−アミノブチル酸、δ−アミノバレリン酸及びε−アミノカプロン酸が挙げられる。アリールアミノ酸の若干の実施例としては、オルト−、メタ−、パラ−アミノ安息香酸が挙げられる。アルキルアリールアミノ酸の若干の実施例としては、オルト−、メタ−、パラ−アミノフェニル酢酸及びγ−フェニルβ−アミノブチル酸が挙げられる。
【００５８】
人工アミノ酸にはまた、天然アミノ酸の派生物も含まれる。前記天然アミノ酸の派生物には、例えば、一つ又は複数の化学基の付加した天然アミノ酸を含めることができる。
【００５９】
例えば、一つ又は複数の化学基は、フェニルアラニン又はチロシン残基の芳香環の２’、３’、４’、５’若しくは６’の位置、又はトリプトファン残基のベンゼン環の４’、５’、６’若しくは７’の位置の一つ又は複数に付加させることができる。前記基は、芳香族環に付加することができるいかなる化学基も使用することができる。そのような基の例としては、ヒドロキシル、炭素数Ｃ１−Ｃ４のアルコキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ニトロ、ハロ（すなわちフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）又は分岐若しくは直鎖状の炭素数Ｃ１−Ｃ４のアルキル（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル又はｔ−ブチル）が挙げられる。
【００６０】
人工アミノ酸の他の例としては、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）及びヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）などを含む天然アミノ酸の派生物が挙げられる。
【００６１】
前記アミノ酸は、同一であっても、又はそれぞれ異なる種類であってもよい。塩基は前記アミノ酸単位に、分子結合により付着する。前記分子結合の例としては、メチレンカルボニル、エチレンカルボニル及びエチル結合が挙げられる（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｕｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ−Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ １−１９；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００）を参照。ＰＮＡ部分のアミノ酸残基の一例としては、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンが挙げられる。
【００６２】
更に、ＰＮＡ部分の例としては、シクロヘキシルＰＮＡ、レトロ−インベルソＰＮＡ、フォスフォンＰＮＡ、プロピオニルＰＮＡ及びアミノプロリンＰＮＡが挙げられる。これらのＰＮＡ部分の詳細については、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｕｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ −Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ１−１９の図５を参照のこと。前記Ｎｉｅｌｓｅｎらの文献の７ページの図５は本発明において援用されている。
【００６３】
ＰＮＡは、公知の方法、例えば修飾Ｆｍｏｃ又はｔＢｏｃペプチド合成プロトコルにより化学的に合成することができる。前記ＰＮＡは多くの望ましい特性、例えば高い溶融温度（Ｔｍ）、核酸及び非荷電の基本分子との高い塩基対の特異性を有する。更に、前記ＰＮＡは前記標的ＲＮＡにＲＮＡａｓｅＨ感受性を与えず、また一般に良好な代謝安定性を有する。
【００６４】
ペプチド核酸はまた、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００６５】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の他の例において、前記分子は一つ以上のモルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分を含む。モルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分を含む分子は一般にモルフォリノ（ＭＦ）核酸と呼ばれている。図１中の構造式８、及びＨｅａｓｍａｎ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４３，２０９−２１４（２００２）を参照のこと。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣ（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００６６】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の更なる例において、前記分子は、一つ以上のシクロヘキセンヌクレオチド部分を含む。シクロヘキセンヌクレオチド部分を含む分子は、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれる。図１の構造式１０、及びＷａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，８５９５−８６０２（２０００）、Ｖｅｒｂｅｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９，４９４１−４９４７（２００１）を参照のこと。
【００６７】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の最終的な例において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は一つ以上のトリシクロヌクレオチド部分を含む。トリシクロヌクレオチド部分を含む分子は一般的にトリシクロ核酸（ｔｃＤＮＡ）と呼ばれる。図１中の構造式９、及びＳｔｅｆｆｅｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９，１１５４８−１１５４９（１９９７）、Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４，５９９３−６００２（２００２）を参照のこと。
【００６８】
分子は、キメラ修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子であってもよい。前記部分のいずれかの混成物を含むキメラ分子はまた公知であり、公知の方法によって調製することができる。上記の文献及びＷａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，１３９８９−１３９９４（１９９９），Ｌｉａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．ｉｏｃｈｅｍ． ２６９，５７５３−５７５８（２００２），Ｌｏｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１，３４５７−３４６７（２００２）及びＤａｍｈａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，１２９７６−１２９７７（２００２）を参照のこと。
【００６９】
本発明の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、配列番号：１から２０に示される天然の膵島マイクロＲＮＡ分子の隣接する塩基配列のいずれかを有する、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１３、より好ましくは、少なくとも１５、更により好ましくは少なくとも２０の隣接する塩基を含む。好ましい実施例において、前記修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡ分子のいずれかの配列の完全な配列を含む。
【００７０】
分子の部分の総数が５０を上回らない限り、いかなる塩基配列も有するいかなる数の付加的な部分（最高４０の部分）をも、隣接する塩基配列を含む部分に加えることができる。前記の付加的な部分は、隣接する配列の５’末端、３’末端又はその両方の端に付加することができる。前記の付加的な部分は、膵島マイクロＲＮＡが誘導されるヘアピン前駆体又はそのフラグメントに存在する３’末端及び／又は５’末端の塩基配列を含むことができる。分子中の前記付加的な部分は、存在するときは、上記のいかなる修飾又は未修飾の部分であってもよい。
【００７１】
前記の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子には、その均等物も含まれる。均等物には、上記のようなゆらぎ塩基及び非相補的な塩基が含まれる。
【００７２】
更に、隣接する部分の中で、デオキシリボヌクレオチドの基本単位を含むものが５０％、好ましくは３０％を超えないのが望ましい。表４及び５は、各々の数の隣接する塩基におけるデオキシリボヌクレオチド基本単位の最大数を示す。
【００７３】
もう一つの実施例では、上記のゆらぎ塩基対及び非相補的な塩基に加えて、天然の膵島マイクロＲＮＡ配列の位置１１に対応する部分も付加、欠失又は変異であってよい。
【００７４】
修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子は、上記の通り単離、更には精製されているのが望ましい。
【００７５】
（表４）：デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む隣接する部分の５０％の数：
【表４】
（表５）：デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む隣接する部分の３０％の数：
【表５】
【００７６】
更に別の実施形態では、キャップは分子の一端に、両方の端に、及び／又は端との間に取り付けられ、それにより本発明に係る上記の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子又は修飾されていない単離されたＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増加させることができる。例えば、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ耐性を増加させるのが望ましい。ヌクレアーゼ耐性を増加させるのに通常用いられる公知のいかなるキャップも使用することができる。
【００７７】
この種のキャップの例としては、逆向きヌクレオチドキャップ及び化学修飾キャップが挙げられる。逆向きヌクレオチドキャップは、５’及び／又は３’端で取り付けることができる。化学修飾キャップは、分子の一端、両端及び／又は両末端の間に取り付けることができる。
【００７８】
逆向きヌクレオチドキャップとは、修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子又は修飾されていないＤＮＡ又はＲＮＡ分子の５’及び／又は３’末端に付着する、３’→５’の核酸配列を指す。その標的ｍＲＮＡに膵島マイクロＲＮＡ分子又は単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子の結合に干渉しない限り、前記逆向きキャップのヌクレオチドの数には特に上限がない。いかなるヌクレオチドも、逆向きヌクレオチドキャップに使用することができる。通常、前記ヌクレオチドキャップは、約４０未満のヌクレオチド長、好ましくは約３０未満のヌクレオチド長、より好ましくは約２０未満のヌクレオチド長、更に好ましくは約１０未満のヌクレオチド長である。典型的には、逆向きヌクレオチドキャップは、１ヌクレオチド長である。逆向きキャップ構造に用いられるヌクレオチドは通常チミンであるが、他のいかなるヌクレオチド（例えばアデニン、グアニン、ウラシル又はシトシン）でもよい。
【００７９】
化学修飾キャップは、核酸のヌクレアーゼ耐性を増加させるための、いかなる公知の化学基のことを指す。そのような化学修飾キャップの例としては、ヒドロキシアルキル基（アルキルヒドロキシド）又はアミノアルキル基（アルキルアミン）が挙げられる。ヒドロキシアルキル基はしばしばアルキルグリコシル基（例えばエチレングリコール）と呼ばれる。アミノアルキル基はしばしばアミノリンカーと呼ばれる。
【００８０】
ヒドロキシアルキル基又はアミノアルキル基中の前記アルキル鎖は直鎖型又は分岐型のいずれでもよい。前記アルキル鎖中に存在する最小の炭素原子数は、１であり、望ましくは少なくとも２であり、またより望ましくは少なくとも約３である。
【００８１】
前記アルキル鎖に存在する最大炭素原子数は、約１８、望ましくは約１６、より望ましくは１２である。典型的な前記アルキル基は、メチル、エチル及びプロピル基とを含む。前記アルキル基は、一つ以上の水酸基及び／又はアミノ基によって更に置換されることができる。
【００８２】
アミノリンカーの幾つかを、表６に示す。表６にリストとして挙げられている前記アミノリンカーは、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）から購入可能である。
【００８３】
単離されたマイクロＲＮＰ：
別の態様において、本発明は、上記の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子、又は上記の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子のいずれかを含む、単離されたマイクロＲＮＰを提供する。
【００８４】
アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子：
別の態様において、本発明は、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子を提供する。アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、上記の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子、又は上記の修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子のいずれかであってよい。ただし、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基配列が、単離されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又は修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基配列と相補的である場合を除く。
【００８５】
アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の配列の実施例は、表７及び８に示される。
【００８６】
（表６）：ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のアミノリンカー
【表６】
【００８７】
（表７及び８）：アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基配列
【表７】
【表８】
【００８８】
アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、修飾された膵島マイクロＲＮＡ分子への使用のために、上記のように修飾されてもよい。一つの例において、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の隣接する部分は、それに対応する膵島マイクロＲＮＡ分子と相補的である。前記アンチ−膵島マイクロＲＮＡの相補性の程度は、付加、欠失及び変異に関する規定と同様に、ゆらぎ塩基対に関する規定を含め、上記の修飾した膵島マイクロＲＮＡ分子に対する規定と同じ規定に従う。
【００８９】
好ましい実施態様において、アンチ−膵臓マイクロＲＮＡ分子が未修飾の部分のみを含む場合、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は少なくとも１０の隣接する塩基中に少なくとも一つの塩基（それは膵島マイクロＲＮＡと非相補的）及び／又は、化学キャップを含む。
【００９０】
他の好ましい実施態様において、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子に存在する隣接する少なくとも１０の塩基が、膵島マイクロＲＮＡ分子と完全に相補的である（すなわち１００％）場合は、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、少なくとも１０の隣接する塩基当たり少なくとも一つの修飾された部分、及び／又は、化学キャップを含む。
【００９１】
更に別の実施態様では、天然の膵島マイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置の、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子における部分は、非相補的である。天然の膵島マイクロＲＮＡの位置１１に対応するアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の部分は、上記の通り付加、欠失又は変異の導入によって非相補的にすることができる。
【００９２】
用途：
本発明の膵島マイクロＲＮＡ分子及びアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、非常に多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏの用途に使用可能である。
【００９３】
例えば、本発明のマイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡの機能を解析するために、細胞に導入することができる。前述のいかなる膵島マイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチ−膵島マイクロＲＮＡも、それらの機能を解明するために細胞に導入することができる。
【００９４】
一つの実施態様において、細胞のマイクロＲＮＡは、適切なアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子によって阻害される。あるいは、細胞の膵島マイクロＲＮＡ分子の活性は、一つ以上の添加されたマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入することによって強化することもできる。マイクロＲＮＡの機能は、細胞のマイクロＲＮＡの活性の抑制及び／又は強化に関連する変化を観察することにより推定することができる。
【００９５】
本発明の一態様において、本発明は、細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法に関する。細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法は、細胞内に一本鎖のアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子を導入する工程を含む。マイクロＲＮＰは、膵臓マイクロＲＮＡ分子を含む。上記の規定を前提として、アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＰに存在する膵島マイクロＲＮＡに相補的である限り、いかなるアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子も、細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法に用いることができる。
【００９６】
本発明のアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、宿主細胞のマイクロＲＮＰの膵島マイクロＲＮＡと結合することによって、マイクロＲＮＰ活性を阻害することができる。なお、マイクロＲＮＰ活性とは、標的配列の裂開又は翻訳の抑制を指す。前記標的配列は、膵島マイクロＲＮＡの塩基配列と部分的に又は完全に相補的であるいかなる配列でもよい。前記標的配列は、例えばグルコース代謝を制御する遺伝子であってもよい。
【００９７】
例えば、膵島細胞は、グルコースによって誘発されたインスリン分泌に関係する遺伝子と相補的であるマイクロＲＮＡを生産することができる。マイクロＲＮＰで包まれたマイクロＲＮＡ分子は、グルコースによって誘発されたインスリン分泌の効果を顕著に阻害する。したがって、アンチ−マイクロＲＮＡ分子の導入は、マイクロＲＮＰ活性を阻害し、その結果、遺伝子の機能を復元することによって、危害を減らす。
【００９８】
あるいは、前述のアンチ−マイクロＲＮＡ分子を導入する代わりに、マイクロＲＮＡ分子を膵島細胞に添加してもよい。それにより、グルコースにより誘発されるインスリン分泌のための遺伝子の発現が阻害される。その結果、細胞がグルコースに反応してインスリンを分泌する能力を減少させることができる。マイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子は、いかなる公知の方法によっても細胞に導入することができる。例えば、マイクロインジェクションのような方法により、マイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子を直接細胞に注射注入することができる。あるいは、好ましくは輸送システムの補助を伴いながら、前記分子を細胞と接触させることができる。
【００９９】
使用可能な輸送システムは、例えば、リポソーム及び荷電した脂質が挙げられる。リポソームは、典型的には、それらの中心の水相中にオリゴヌクレオチド分子を封じ込める。荷電した脂質は、反対の電荷を持つ結果として、一般に脂質−オリゴヌクレオチド分子複合体を形成する。
【０１００】
これらのリポソーム−オリゴヌクレオチド分子複合体又は脂質−オリゴヌクレオチド分子複合体は、通常エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。リポソーム又は荷電した脂質は、一般に、エンドソームの膜を崩壊し、オリゴヌクレオチド分子を放出するヘルパー脂質を含む。
【０１０１】
マイクロＲＮＡ分子又はアンチ−マイクロＲＮＡを細胞に導入する他の方法には、例えばデンドリマー、生分解性ポリマー、アミノ酸ポリマー、糖ポリマー及びオリゴヌクレオチド結合性ナノ粒子などの輸送手段の使用法が含まれる。加えて、貯蔵手段としてプルロニック（登録商標）のゲルを用い、長期間にわたるアンチ−マイクロＲＮＡのオリゴヌクレオチド分子の輸送を可能にすることができる。上記方法は、例えば、Ｈｕｇｈｅｓら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ６，３０３−３１５（２００１）；Ｌｉａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９ ５７５３−５７５８（２００２）；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｓｌｉｅ，Ｒ．Ａ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ａ．Ｊ．＆Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｈ．Ａ．，ｅｄｓ），ｐｐ．１４７−１５７，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【０１０２】
特定の細胞に対するマイクロＲＮＡ分子又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子のターゲティングは、いかなる公知の方法によっても行うことができる。例えば、マイクロＲＮＡ分子又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子は、細胞上のレセプタによって特に認識される抗体又はリガンドとコンジュゲートことができる。例えば、リガンドを、膵臓ベータ細胞にて発現するＧＬＰ−レセプタと結合するＧＬＰ−Ｉ（グルカゴン様ペプチド）とすることができる。あるいは、ＧＬＰ−Ｉに対する抗体も使用可能である。
【０１０３】
他の実施形態では、本発明は、哺乳類の患者の糖尿病を治療する方法を提供する。前記方法は、配列番号４１又は５１に示される配列を有する少なくとも１０の隣接するベースを有するアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の有効量を哺乳類に導入する工程を含む。前記有効量を、医師及び臨床医に公知の方法によって、臨床前及び臨床試験中に決定することができる。
【０１０４】
アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子は、当業者に公知のいかなる方法によっても、哺乳類に導入することができる。例えば、アンチ−膵島分子を細胞にもたらす上記の方法を、前記分子を哺乳類に導入するために用いることができる。
【０１０５】
分子は、いかなる公知の方法によっても哺乳類に投与することができる。適切な投与方法の若干の例としては、経口投与と全身投与とが挙げられる。全身投与としては、腸内又は非経口的な投与方法が可能である。液体又は固体状（例えば錠剤、ゼラチン・カプセル）の製剤を使用することができる。
【０１０６】
分子の非経口投与は、例えば静脈、筋肉、又は皮下への注射を含む。例えば、公知のように分子は、徐放出性投与によって哺乳類に投与されることができる。徐放出性投与は、一定期間にわたる薬の一定レベルを維持させる薬剤輸送の方法である。
【０１０７】
他の投与のルートとしては、口頭、局在、気管支内、又は鼻腔内への投与が含まれる。経口投与のために、液体又は固体状の製剤が使用可能である。経口投与に適している製剤の若干の例として、錠剤、ゼラチン・カプセル、ピル、トローチ、エリキシル、サスペンション、シロップ及びウェーハが挙げられる。気管支内投与では、吸入器スプレーを使用することができる。また、鼻腔内投与による本発明の分子の投与は、ネビュライザ又は液霧によっ行うことができる。
【０１０８】
本発明の分子は、適切な薬剤担体中に含有させることができる。本発明における薬剤担体とは、従来技術において当業者によって理解されているように、賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ又はｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）と同義であると解される。担体の例としては、澱粉、牛乳、糖、特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸若しくはその塩、ステアリン酸のマグネシウム又はカルシウムによる塩、タルク、植物性脂肪若しくは油、ガム及びグリコールが挙げられる。
【０１０９】
薬剤担体は、また、以下の一つ又は二つ以上を含むことができる：安定化剤、界面活性剤（好ましくは非イオン系界面活性剤）、また任意に塩及び／又はバッファー。安定化剤は、例えばグリシンなどのアミノ酸、例えば蔗糖、テトラロース、ラクトース又はデキストランなどのオリゴ糖類が使用可能である。あるいは、前記安定化剤は糖アルコールであっても良く、例えばマンニトール又はその組合せがよい。好ましくは、安定化剤の重量は、分子の重量に対して約０．１から約１０重量％である。
【０１１０】
界面活性剤は、好ましくは非イオン系界面活性剤（例えばポリソルベート）である。適切な界面活性剤の若干の例としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０；ポリエチレングリコール又はプルロニックＦ−６８などのポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールを約０．００１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）含有させるのが望ましい。
【０１１１】
塩又はバッファー試薬はそれぞれ、例えば塩化ナトリウム又はナトリウム／リン酸カリウムのようないかなる塩又はバッファー試薬も使用可能である。望ましくは、バッファー試薬は、本発明の分子のｐＨを約５．５から約７．５の範囲でを維持するものが望ましい。塩及び／又はバッファー試薬はまた、浸透圧のレベルを哺乳類への投与に適する形に保つのに役立つ。前記塩又はバッファー試薬は、約１５０ｍＭから約３００ｍＭの範囲でほぼ等張である形で存在するのが望ましい。
【０１１２】
前記薬剤担体は、一つ又は二つ以上の従来公知の添加剤を追加的に含有させることができる。このような添加剤の若干の例としては、例えばグリセロールのような可溶化剤；例えば塩化ベンザルコニウム（第四アンモニウム化合物の混合物で、「クォート」として公知）、ベンジルアルコール、クロレトン又はクロロブタノールなどの酸化防止剤；例えばモルヒネ誘導体などの麻酔の薬品；又は上記のような等張な試薬が挙げられる。酸化又は他の損傷に対する更なる予防措置として、分子は、非浸透性のストッパーでシールしたバイアル中で、窒素ガス充填下で格納するのが望ましい。
【実施例１】
【０１１３】
材料及び方法
マイクロＲＮＡのクローニング及びノーザンブロッティング分析：
ＭＩＮ６細胞培養から６００μｇの全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して抽出し、前述した方法（ラゴス−キンタナ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ．））によりｍｉＲＮＡクローニングを行った。アンチセンスプローブを、クローニングされたｍｉＲＮＡ配列と相補的になるように設計し、前述（ラゴス−キンタナ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ．））のとおり、ノーザンブロット分析に使用した。
【０１１４】
細胞培養：
ＭＩＮ６細胞を、２５ｍＭのグルコース、１５％の胎児のウシ血清及び５．５のμＭ ２−メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ培地で培養した。Ｎ２Ａ細胞を、２５ｍＭのグルコース及び１０％の胎児のウシ血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。
【０１１５】
インスリン分泌の解析：
ＭＩＮ６細胞を、２日間２４−ウェルプレートで培養し、分析の前に修飾されたクレブス−リンゲル緩衝液（ＫＲＢＨ）（０．９ｍＭのＣａＣｌ２、２．６８ｍＭのＫＣｌ、１．４６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、１３５ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ及び０．２％のＢＳＡ）で洗浄した。５．５ｍＭのグルコースを含むＫＲＢＨにて３０分予備培養の後、細胞をリンスし、２．８ｍＭのグルコース、２５ｍＭのグルコース、３０ｍＭのＫＣｌ、５００ｍＭのトルブタミド又は５ｍＭのメチルピルビン酸塩を含有するＫＲＢＨにて６０分間インキュベートした。上澄み中のインスリン濃度は、ＲＩＡ（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて測定した。
【０１１６】
組換えアデノウイルスの生成：
ｍｉＲ−３７５の過剰発現に使用する組換えアデノウイルスを、次のプライマーを用いたｍｉＲＮＡ前駆体配列のＰＣＲにより増幅した：５’−ＣＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＣＣ−３’及び５−ＧＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＣ−３’。得られた断片をｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ処理の後、Ａｄ５ＣＭＶ−Ｋ ＮｐＡシャトルベクターに挿入した。アデノウイルスの増幅は、Ｖｉｒａｑｕｅｓｔ社（Ｎｏｒｔｈ Ｌｉｂｅｒｔｙ、ＩＡ）にて行われた。トランス遺伝子を含まないＡｄ−ＧＦＰ（ＶｉｒａＱｕｅｓｔ社）をコントロールとして使用した。
【０１１７】
電気生理学的特性及びＣａ２＋測定：
エキソサイトーシス及び内部のＣａ２＋電流の測定は、単層状に分散した、コントロールＧＦＰ−又はｍｉＲＮＡ２０８−ＧＦＰを含むアデノウイルスへの感染後２４時間経過したＢ細胞を用い、標準のパッチクランプ法により行われた。エキソサイトーシスを、Ｐｕｌｓｅ（Ｈｅｋａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ／Ｐｆａｌｚ（ドイツ））のソフトウェアに基づくｌｏｃｋ−ｉｎの実施により、細胞静電容量の変化として検出した。印加正弦波は、５００Ｈｚの周波数及び２０ｍＶのピーク振幅であった。Ｃａ２＋電流は、ｐ４のプロトコルに基づき、電流リーク及び容量過渡をデジタル的に除去した後の数値を測定した。細胞外溶液は、１１８ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのテトラエチルアンモニウム塩酸塩（ＴＥＡＣｌ）、５．６ｍＭのＫＣｌ、２．６ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコースを有する５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）を含有する溶液とした。電位固定脱分極によってエキソサイトーシスを生じさせる実験において、細胞内液は、１２５ｍＭのＣｓ−グルタミン酸塩、１０ｍＭの塩化セシウム、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨを有するｐＨ＝７．１５）、０．０５ｍＭのＥＧＴＡ、３ｍＭのマグネシウム−ＡＴＰ及び０．１ｍＭのサイクリックＡＭＰを含有する溶液とした。一連の実験において、エキソサイトーシスは、１２５ｍＭのＣｓ−グルタミン酸塩、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのマグネシウム−ＡＴＰ、０．１ｍＭのｃＡＭＰ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＥＧＴＡ及び９ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶媒により細胞内部を透析して行った。細胞フリーな溶液のＣａ２＋濃度を１．５μＭ．と推定した。機能的にα−及びβ−細胞と識別され多細胞にて実験を行った。その細胞の識別は、公知の方法により決定した。
【０１１８】
細胞内のフリーのＣａ２＋の濃度（［Ｃａ２＋］）を、他で記載されている通り、二重励起波長による蛍光分光測定により測定した。トランスフェクションする膵島細胞は、３７°Ｃで、４０分の間、０．００７％のｗ／ｖのプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）酸（分子プローブ）の存在下、３μＭのｆｕｒａ−２と共に散布した。色素を３５０ｎｍ及び３６５ｎｍで励起した。後者の波長が３８０ｎｍでないのは、ＧＦＰの励起を回避するためである。発光を５１０ｎｍにて集光した。実験中、膵島細胞は、保持ピペットによって適当な状態に保たれて、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３．６ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、２．６ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨによるｐＨ＝７．４ｍＭ）及び５ｍＭのグルコースを含有する溶媒で、連続的に灌流した。グルコース濃度は１５ｍＭまで増加し、スルフォニル尿素トルブタミド濃度が０．１ｍＭになるまで上記のように添加した。膵島細胞が高い細胞外Ｋ＋（ＫＣｌが加えた３０ｍＭ）によって脱分極するときは、等浸透性を維持するため、ＮａＣｌの濃度をそれ対応して減少させた。電子生理的実験及びＣａ２＋測定は全て３２から３４℃にて行った。
【０１１９】
膵島細胞の感染及びＣａ２＋インジケータを伴うローディングを、共焦顕微鏡検査により、ｆｕｒａ−２ではなくｆｌｕｏ−３を使用して評価した。ｅＧＦＰ及びｆｌｕｏ−３の励起は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、イェナ、ドイツ）の４８８ｎｍの種類の機器を使用して行った。共焦顕微鏡のＭＥＴＡ機能を用いて分光し、水浸にて４０倍で顕微鏡観察した。
【０１２０】
ルシフェラーゼ活性の分析：
野生型マウスのミオトロフィンの３’ＵＴＲ標的部位を、以下のプライマー：
５’ＴＣＣＡＴＣＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＴＡＴＣ３’及び
５’ＴＣＡＴＡＴＣＧＴＴＡＡＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＡ３’
を使用してＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした。得られた断片をＳｐｅＩ及びＸｂａＩ処理により単離し、ｐＲＬ−ＴＫ（プロメガ社）の停止コドンのすぐ下流にサブクローニングした。このコンストラクトは、プロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従い、以下のプライマー：
５’ＡＡＧＴＴＴＣＧＴＧＴＴＧＣＡＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＴＧＴＧＣ３’、及び
５’ＧＣＡＣＡＡＴＴＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＧＣＴＴＧＣＡＡＣＡＣＧＡＡＡＣＴＴ３’
を使用した、変異体マウスミオトロフィンプラスミドの調製に使用した。下線は、突然変異するヌクレオチドを示す。ＭＩＮ６細胞を２日間、２４ウェルプレートで培養し、Ｒｒ−ｈｘｃをコードしているｐＲＬ−ＴＫリポーターベクター０．４μｇ、及び０．１μｇのＰｐ−ｌｕｃ（プロメガ社）をコードしているｐＧＬ３コントロールベクターによってトランスフェクションした。細胞をトランスフェクション後３０−３６時間にて回収し、試験に使用した。
【０１２１】
ｍｉＲ−３７５の標的の同定：
ｍｉＲ−３７５の標的を同定するために、最近開発されたアルゴリズム（Ｎ．Ｒａｊｅｗｓｋｙ及びＮ．Ｄ．Ｓｏｃｃｉ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６７、５２９−５３５の（２００４））を使用した。前記アルゴリズムは以下の二つのステップを含む。
（ａ）ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおける、マイクロＲＮＡ及び推定の標的配列の間で保存されているＧＣリッチな連続的な相補的基礎配列（「核」）の検索、及び
（ｂ）予測されたマイクロＲＮＡ：ｍＲＮＡデュプレックスの自由エネルギーのｉｎ ｓｉｌｉｃｏによる評価。
アルゴリズムをＲｅｆｓｅｑデータセットに適用した。３’ＵＴＲは、Ｒｅｆｓｅｑアノテーションから抽出した。このデータセットは、１８１９９のヒト、及び１３３７１のマウスの３’ＵＴＲであり、少なくとも３０のヌクレオチド長を有するものを含む。「Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂ ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ ｔａｂｌｅ ｏｆ ９６１２ ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ」を使用し、一組のオルトログの３’ＵＴＲを構築した。Ｌｅｗｉｓ ＢＰ，Ｓｈｉｈ ＩＨ，Ｊｏｎｅｓ−Ｒｈｏａｄｅｓ ＭＷ，Ｂａｒｒｅｌ ＤＰ，Ｂｕｒｇｅ ＣＢ，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｃｅｌｌ ７８７−９８（２００３）に従い、核の位置を、マイクロＲＮＡの５’末端から２塩基内部に制限した。ヒットした上位８％を保持しながら、上記（ａ）による核スコアを決定した。これらのヒットは、その後ＭＦＯＬＤ（Ｚｕｋｅｒ，ＮＡＲ ３４０６−１５，２００３、Ｒａｊｅｗｓｋｙ ａｎｄ Ｓｏｃｃｉ ｆｏｒ ｄｅｔａｉｌｓ）を用い、予測されたｍＲＮＡ：ｍｉＲＮＡデュプレックスの自由エネルギーによって記録された。
【０１２２】
ｓｉＲＮＡ及び２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド：
合成マイクロＲＮＡ及びｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ社）によって合成された。ｓｉＲＮＡ ＳＭＡＲＰＯＯＬｓは、マウスミオトロフィン（ＮＭ＿００８０９８）及びマウスＶｔｉ１Ａ（ＮＭ＿０１６８６２）の配列から設計した。全ての２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドは、公知技術（Ｍｅｉｓｔｅｒら、ＲＮＡ）の方法により合成した。全ての試薬は、２００ｎＭの濃度でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してＭＩＮ６細胞にトランスフェクションした。
【０１２３】
抗体：
ウエスタンブロット法のための抗体を、幾つかの異なる供給源から得た：α−ｍｙｏｔｒｏｐｈｉｎ（マサト・タオカ氏による寄付）、α−Ｖｔｉ１（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより）、α−ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇより）、α−ＭＣＴ８（Ａｎｄｒｅｗ Ｈａｌｅｓｔｒａｐによる寄付）、α−ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（Ｒ．Ｒｏｅｄｅｒ氏による寄付）。
【０１２４】
ノーザンブロット法：
全ＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して抽出され、１５％のポリアクリルアミン又はアガロースゲルにローディングされた。電気泳動後、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ膜（アマシャム社）に転写し、プローブと反応させた。マウスミオトロフィンと反応するＤＮＡプローブは、以下のプライマー：
５’ＧＴＧＧＧＣＣＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＡＣＴＴＧ３’、及び
５’ＣＣＣＴＴＴＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣＧＣ３’
を使用して調製した。
【実施例２】
【０１２５】
膵島細胞マイクロＲＮＡ：
マイクロＲＮＡを、ＭＩＮ６細胞（グルコース応答性ネズミ膵臓β細胞系）からクローニングした。合計３０１のマイクロＲＮＡクローンを得たが、そのうち５５は異なるマイクロＲＮＡであった。前記の５５の異なるマイクロＲＮＡの中で、既に公表されているマイクロＲＮＡは９２％を占め、残りの８％は未確認のマイクロＲＮＡであった。公知の及び新規のｍｉＲＮＡは、Ｂｌａｓｔ配列分析によってさまざまなゲノム・データベースにおいて同定され、種間ホモロジー及び典型的ヘアピン前駆体構造を形成する能力によって確認された。
【０１２６】
合計９つの新規なマイクロＲＮＡを同定した結果、単一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−３７５）が全ての新規なクローンの５０％以上を占めていた（図２Ａ）。次に、ノーザンブロット分析によって新規なマイクロＲＮＡの発現を解析した。マイクロＲＮＡ３７５及び３７６のみ、ＭＩＮ６細胞及び膵島のノーザンブロット分析によって検出された（図２Ｂ）。両方のマイクロＲＮＡの発現は、ＭＩＮ６細胞及び膵島に限定されており、肝臓、肺、腸、脳、腎臓及び精巣等の他の組織では検出されなかった。（図２Ｂ、Ｃ）これらのデータは、新規な膵島マイクロＲＮＡの同定を示唆するものである。
【実施例３】
【０１２７】
ｍｉＲ−３７５による分泌阻害活性：
高い表現レベル及び膵臓β−細胞における組織特異性を有するマイクロＲＮＡの機能を解析するため、マイクロＲＮＡ−３７５及び−３７６に相同な配列を有する合成ｓｉＲＮＡを用いて、ＭＩＮ６細胞をトランスフェクションした後の、グルコース誘導によるインスリン分泌を解析した。ｓｉＲＮＡに加えて、ＣＭＶプロモータの制御下でヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子を発現するベクター（ＣＭＶ−ｈＧＨ）をコトランスフェクションした。追加的に発現したｈＧＨは、膵臓β−細胞系の分泌顆粒の標的とされ、エキソサイトーシスの起動後にインスリンと共放出されることが開示されている。この方法によって、一過性にトランスフェクションするＭＩＮ６細胞（トランスフェクション効率２０−３０％）から選択的にエキソサイトーシスをモニターすることが可能となる。ポジティブ及びネガティブのコントロールとして、グルコキナーゼ遺伝子（Ｇｃｋ）又はアポリポタンパク質Ｍ（ａｐｏＭ）（膵臓β−細胞において発現しない遺伝子）を標的とするｓｉＲＮＡを、ＭＩＮ６細胞にＣＭＶ−ｈＧＨによってコトランスフェクションした。
【０１２８】
２５ｍＭのグルコース刺激に応答する成長ホルモン分泌は、ｓｉ−Ｇｃｋ及びｓｉ−３７５によってトランスフェクションした細胞において顕著に減少した（図３）。ａｐｏＭ又はｓｉＲＮＡに向けられた、ｍｉＲ−３７６、ｍｉＲ−１２４、−１２９、−１３０及び２１０等の幾つかの他のマイクロＲＮＡに相同な合成ｓｉＲＮＡのトランスフェクションによっては、基礎的、又はグルコース刺激によるインスリン分泌に影響を及ぼさなかった（図３、データ示さず）。
【０１２９】
アンチセンスベースの戦略は、特に培養細胞におけるｍｉＲＮＡ機能を阻害することが近年開示されている。ヌクレアーゼ耐性の、ｍｉＲ−３７５に対する２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴリボヌクレオチドをＣＭＶ−ｈＧＨベクターとコトランスフェクションし、グルコースによる刺激に応答したインスリン分泌を解析した。コントロールのアンチ−ＧＦＰ ２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド（図３Ｂ）と比較して、アンチ−ｍｉＲ−３７５によってトランスフェクションした細胞においてグルコースを刺激によるインスリン分泌の増加が見られた。以上のデータより、ｍｉＲ−３７５がインスリン分泌の抑制剤であることが示された。
【０１３０】
次に、ＣＭＶ５プロモータの管理下で、前駆体配列を含む１２３ｂｐ断片のクローニングによって、ｍｉＲ−３７５を発現する組換えアデノウイルスを調製した。ＨＥＫ細胞をコントロールのｅＧＦＰ（Ａｄ−ＧＦＰ）を発現するアデノウイルスに感染させ、そこにおいてＡｄ−３７５分子の濃度の増加による、ｍｉＲ−３７５の発現のドーズディペンデントな増加を示した。同様に、アデノウイルスによる感染技術を使用し、ＭＩＮ６細胞にてｍｉＲ−３７５を発現させた。ｍｉＲ−３７５を発現しているＭＩＮ６細胞は、コントロールのアデノウイルスに感染した細胞と比較して、グルコースによって誘発されるインスリン分泌の４０％の減少が見られた（図４）。このインスリン分泌の減少は、不完全なインスリン生産によるようには見られなかった。なぜなら、Ａｄ−３７５及びＡｄ−ｅＧＦＰに感染したＭＩＮ６細胞、並びに膵島細胞におけるインスリン含有量が同じであったためである。
【実施例４】
【０１３１】
細胞内カルシウムシグナリング及び全細胞のカルシウム電流：
解糖系の流れ及びミトコンドリア酸化的リン酸化の増加は、サイトゾル中のＡＴＰ／ＡＤＰ比率の増加を経たＡＴＰ−感受性カリウムチャネル（ＫＡＴＰ）の遮断を誘導し、グルコース誘発によるインスリン分泌への第２のシグナルを発生させるために必要となる。これにより、膜脱分極及び電位依存的なＣａ２＋チャネルを通したＣａ２＋の流入が生じる。［Ｃａ２＋］の上昇が、インスリン顆粒エキソサイトーシスには必要である。グリベンクラミドのようなスルフォニルウレアは、直接ＫＡＴＰを遮断することによって、インスリン分泌を促進する。ＫＣｌにより膵臓β−細胞の直接的な脱分極が生じ、インスリン顆粒の脱顆粒が最大となる。トルブタミド及びＫＣｌの刺激による、Ａｄ−３７５感染ＭＩＮ６細胞のインスリン分泌を測定した。これらの分泌促進物質を用いた膵臓β−細胞の刺激は、Ａｄ−ｅＧＦＰ感染細胞と比較したＡｄ−３７５感染細胞におけるインスリン分泌の障害を示した。更にＡｄ−３７５の発現により、Ａｄ−ｅＧＦＰ感染ＭＩＮ６細胞と比較した、ＧＬＰ−１（キャンプの起動によるインスリン分泌の強力なグルコースに依存する刺激）に応答したインスリン分泌が阻害されることが確認された。これらのデータは、ｍｉＲ−３７５の過剰発現がインスリン分泌の末梢部のステップを含む欠陥につながることを示唆するものである。そこにおいて、膵臓β−細胞の細胞質のＣａ２＋濃度の上昇に影響を及ぼすか、エキソサイトーシスに対して干渉することが考えられる。
【０１３２】
ｍｉＲ−３７５がインスリンエキソサイトーシスを起動させるのに必要となる第２のシグナルの発生を阻害するか否かを解析するため、Ａｄ−３７５又はコントロールのＡｄ−ｅＧＦＰに感染した膵島細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度［Ｃａ２＋］ｉを測定した。各々の膵島細胞は刺激され、３つの異なる刺激によって細胞内Ｃａ−濃度を増加させた。グルコース濃度を５ｍＭから１５ｍＭまで増加させ、コントロール及びＡｄ−３７５を発現する膵島細胞のＣａ２＋濃度の変化を観察した。トルブタミドによる刺激において、同様の変動が観察された。静止状態での［Ｃａ２＋］ｉは、コントロール及びＡｄ−３７５を発現している膵島細胞でそれぞれ０．１３＋０．０１μＭ及び０．１２±０．０１μＭ（平均）であった。１５ｍＭのグルコースが存在する場合には、［Ｃａ２＋］ｉの時間平均は、コントロールの膵島細胞における０．４２±０．１２μＭに対し、Ａｄ−３７５を発現する膵島細胞では０．３９＋０．０５μＭに達した。トルブタミドが存在する場合には、対応する値は、コントロールの膵島細胞において０．５３＋０．１１μＭ、及びＡｄ−３７５感染膵島細胞において０．５５±０．１１μＭであった。最後に、高い細胞外Ｋ＋による脱分極は、コントロール及びＡｄ−３７５感染膵島細胞において同様に増加し［Ｃａ２＋］ｉのピークの平均はそれぞれ０．８５＋０．２４μＭ及び１．０１＋０．３１μＭであった（データ示さず）。質的に類似した結果が、非定量的な染料であるｆｌｕｏ−３を使用した実験により得られた（上記参照）。更に、ｅＧＦＰを発現している単離された細胞を測定したときには、同様のグルコースに対する反応の違いが観察されなかった（感染していない下層の細胞層による数値は除外される（データ示さず））。膵島細胞周辺部は、非β−細胞において肥大していた。しかしながら、変動が５ｍＭのグルコースで観察されず、１５ｍＭにて［Ｃａ２＋］ｉが増加したという事実は、δ−細胞が低い濃度で既に活性であり、またα−細胞は高い濃度で阻害されるゆえに、β−細胞の豊富なゾーンを選択するに至ったことを示唆するものである。
【０１３３】
ＭＩＮ６細胞及び単離された膵島細胞からの調整されたインスリン分泌の制御は、ｍｉＲ−３７５の発現が［Ｃａ＋２］ｉシグナリングの下流（おそらくはエキソサイトーシスのレベル）におけるインスリン分泌に影響を及ぼすことを示唆する。この仮説を検討するために、機能が同定されたβ−細胞に静電容量測定を適用した。エキソサイトーシスは、０ｍＶから−７０ｍＶまでの脱分極を１Ｈｚ、５００ｍｓにて１０回行った（図３Ａ）。左記操作により、β細胞において、一定条件の下で８３７±２４４ｆＦ（ｎ＝９）の膜静電容量の増加を誘発した。Ａｄ−３７５感染細胞においては、それに対応する増加は９４±２７ｆＦ（８５％減少）に留まった（ｎ＝１０；Ｐ＜０．０１）。同様の結果が、一旦エキソサイトーシスがその代わりに１．５のμＭ（図２ＤからＥ）のフリーなＣａ２＋濃度を有するＣａ２＋／ＥＧＴＡ−バッファーによって誘発された場合に得られた。また、これらの実験で、Ａｄ−３７５感染細胞は、コントロールの細胞と比較し静電容量の増加率が６３％減少した（Ｐ＜０．００１；ｎ＝１５〜１７）。
【実施例５】
【０１３４】
標的遺伝子の同定：
多数のゲノム全体に保存されているマイクロＲＮＡの標的を予測するために、ＲＮＡ：ＲＮＡデュプレックス相互作用の熱力学に基づくモデリングを、配列の比較分析と結合するアルゴリズムを適用した。ｍｉＲ−３７５標的遺伝子の６４の推定のリストの中から、インスリン分泌／膵島分化におけるそれらの潜在的役割に基づいて６つの遺伝子を選択し、試験に用いた。
【０１３５】
それらの遺伝子は、ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ−４（Ｆｚｄ４）、ｔ−ＳＮＡＲＥｓ酵母ホモログＩＡ（Ｖｔｉ−１ａ）と相互作用する小胞輸送に係るタンパク質、Ｖ−１／ミオトロフィン（Ｖ−１／Ｍｔｐｎ）、ｐ３８有糸分裂促進プロテインキナーゼ（Ｍａｐｋ１１）、モノカルボン酸輸送体８（Ｓｌｃ１６Ａ２）及び対状のボックスタンパク質Ｐａｘ−６の遺伝子であった。これらの遺伝子の発現を、Ａｄ−３７５又はＡｄ−ｅＧＦＰに感染したＭＩＮ６及びＮ２Ａ細胞において、イムノブロッティングにより解析した。内在性ｍｉＲ−３７５を発現しないＮ２Ａ細胞におけるｍｉＲ−３７５の発現は、Ｍｔｐｎ及びＶｔｉ−１ａの発現レベルの減少につながった（図４Ａ、Ｂ）。
【０１３６】
対照的に、Ｆｚｄ４、Ｍａｐｋ１１及びＳｌｃ１６Ａ２の遺伝子発現はＡｄ−３７５及びＡｄ−ｅＧＦＰに感染した細胞において同様であった。組換えアデノウイルスＡｄ−３７５によるＭＩＮ６細胞におけるｍｉＲ−３７５の過剰発現は、Ｍｔｐｎのタンパク質レベルを低下させたが、Ｖｔｉ−１ａ、Ｆｚｄ４、Ｍａｐｋ１１及びＳｌｃ１６Ａ２の発現には影響を及ぼさなかった。
【０１３７】
Ｍｔｐｎ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおける予測されたｍｉＲ−３７５目的部位が、ｍｉＲ−３７５によるＭｔｐｎ発現のサイレンシングに関与するか否かを解析するため、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼＯＲＦ（ｐＲＬ−Ｍｔｐｎ）の下流に推定３’ＵＴＲ標的部位を含む２８９ｎｔの３’ＵＴＲ部分をクローニングし、このレポーターベクターを、コントロールのアンチセンス２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド、又はｍｉＲ−３７５のアンチセンスの２’−Ｏ−メチル・オリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−ｍｉＲ−３７５）と共に、ＭＩＮ６細胞へコトランスフェクションした。２’−Ｏ−ｍｉＲ−３７５によってトランスフェクションした細胞のルシフェラーゼ活性は、コントロールの２’−Ｏ−ｍｉＲＮＡ及びｐＲＬ−Ｍｔｐｎによってコトランスフェクションした細胞と比較して２倍増加していた。更に、ｍｉＲ−３７５標的部位の中心に点変異を導入することにより、内在性ｍｉＲ−３７５及びＶ−１／ミオトロフィン標的部位間の相補性が減少し、２’−Ｏ−ｍｉＲ−３７５によるルシフェラーゼ活性の刺激効果が損なわれた（図５）。以上より、Ｍｔｐｎは膵臓β−細胞ｍｉＲ−３７５の標的であり、Ｍｔｐｎ遺伝子発現の抑制は、Ｍｔｐｎ遺伝子の３’ＵＴＲの単一のｍｉＲ−３７５目的部位によって調節されることが明らかとなった。
【０１３８】
ＭＩＮ６細胞のＭｔｐｎの発現減少が、Ａｄ−３７５感染細胞において観察されるグルコース誘発によるインスリン分泌の減少に関与するか否かを解析するために、ＭＩＮ６細胞をアポリポタンパク質Ｍ（コントロール）及びＭｔｐｎを標的とするｓｉＲＮＡによりトランスフェクションし、タンパク質表現レベルをウェスタンブロッティングにより解析した。Ｍｔｐｎ及びＶｔｉ１ａを標的としているｓｉＲＮＡは、これらの遺伝子の発現を５０％以上減少させた（図４Ｃ）。グルコース誘発によるインスリン分泌におけるこれらの遺伝子のサイレンシングの効果を、それぞれのｓｉＲＮＡ及びプラスミドｐＣＭＶ−ｈＧＨのコトランスフェクションにより解析した。２５ｍＭのグルコース添加に応答するインスリン分泌を、トランスフェクションの２日後に測定した。コントロールのｓｉＲＮＡによってトランスフェクションした細胞と比較して、Ｍｔｐｎを標的とするｓｉＲＮＡによってトランスフェクションした細胞のインスリン分泌は、３０％減少していた（図４Ｄ）。なお、Ｖｔｉ１ａのＲＮＡサイレンシングは、グルコース誘発によるインスリン分泌に影響を及ぼさなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は、本願明細書で言及する修飾されたヌクレオチド単位を示す。Ｂは、次の核酸塩基のいずれか一つを意味する：アデノシン、シチジン、グアノシン、チミン又はウリジン。
【図２Ａ】図２は、マウスｍｉＲ−３７５の前駆体の構造予測及び組織発現を示す。ＲＮＡの二次構造予測は、Ｍｆｏｌｄ ｖｅｒｓｉｏｎ３．１を使用して行った。下線部はｍｉＲＮＡ配列である。完全なホモロジーが、マウス及びヒト配列の間に見られた。
【図２Ｂ】ｍｉＲ−３７５及び３７６の組織における発現を示す。マウス組織から全ＲＮＡ（３０μｇ）をノーザンブロットのために単離し、ｍｉＲＮＡのプローブとした。
【図２Ｃ】膵島、ＭＩＮ６細胞及び膵臓全体から全ＲＮＡ（１０μｇ）を精製し、ノーザンブロットを行った。マウス膵島において高い発現レベルが検出された。ｔＲＮＡを、コントロールとしてローディングした。
【図３Ａ】ｍｉＲ−３７５による分泌抑制作用を示すグラフ。ＭＩＮ６細胞をトランジェントにコトランスフェクションした。ＣＭＶ−ｈＧＨ及びβ−ｇａｌをコードする１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ ３７５に相応する配列を有する合成ｓｉＲＮＡ、グルコキナーゼ又はルシフェラーゼ（それぞれｓｉ−３７５、ｓｉＲＮＡ−Ｇｃｋ及びｓｉＲＮＡ−ｌｕｃと表記）を使用。
【図３Ｂ】ｍｉＲ−３７５（２’−Ｏ−メチル−３７５）と相補的な２’−Ｏ−メチル・オリゴリボヌクレオチド又はコントロールの２’−Ｏ−オリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルＧＦＰ）を使用した試験結果のグラフを示す。４８時間後、細胞をグルコース濃度の低い（２．８ｍＭ）及び高い（２５ｍＭ）条件下でインキュベートした。これらの条件下に分泌されるｈＧＨの量をＥＬＩＳＡで測定し、β−ｇａｌ活性により標準化した（＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図４Ａ】ｍｉＲ−３７５の標的遺伝子の同定を示す。ＭＩＮ６細胞は、４８時間、Ａｄ−ｍｉＲ−３７５の感染を受けた。溶解後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子し、α−Ｍｔｐｎ、α−Ｖｔｉ１ａ又はａ−ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（Ｔｂｐ）（コントロール）によってイムノブロットした。
【図４Ｂ】ｍｉＲ−３７５の標的遺伝子の同定を示す。試験はＮ２Ａ細胞を使用して再度行われた。
【図４Ｃ】ＭＩＮ６細胞を４８時間、Ｍｔｐｎ（ｓｉＲＮＡ−Ｍｔｐｎ）又はＶｔｉ１ａ（ｓｉＶｔｉ１ａ）に対して作用するよう設計したｓｉＲＮＡによってトランジェントにトランスフェクションし、溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の後、サンプルをＭｔｐｎ又はＶｔｉ１ａを用いてイムノブロッティングした。
【図４Ｄ】ＭＩＮ６細胞を、ｓｉ−３７５、ｓｉ−Ｍｔｐｎ又はｓｉ−Ｖｔｉ１ａによってトランジェントにトランスフェクションし、４８時間後、細胞をグルコース濃度の低い（２．８ｍＭ）及び高い（２５ｍＭ）条件下でインキュベートした結果のグラフを示す。これらの条件下に分泌されるｈＧＨの量をＥＬＩＳＡで測定し、β−ｇａｌ活性により標準化した（＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図５Ａ】Ｍｔｐｎの３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−３７５標的部位は、ｍｉＲ−３７５によって遺伝子発現の抑制に重要であることを示す。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの３’ＵＴＲの中に挿入される、ミオトロフィンの３’ＵＴＲ中の標的部位の配列。変異体（Ｍｔｐｎ−ＭＵＴ）の配列は、ｍｉＲ−３７５の５’末端の５つの点変異（太字）を除いて、野生型（Ｍｔｐｎ−ＷＴ）と同一である。
【図５Ｂ】ＭＩＮ６細胞を、レポーターコンストラクトであるｍｉＲ−３７５（２’−Ｏ−メチル−３７５）と相補的な２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド、又はコントロールの２’−Ｏ−オリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルＧＦＰ）によってトランジェントにトランスフェクションした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１から２０のいずれかに示される膵島マイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の３０％までがゆらぎ塩基であり、塩基の１０％までが非相補的である場合を除く）を有する、少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子。
【請求項２】
更に５’末端に及び／又は３’末端に、配列番号：２１から４０に示されるヘアピン前駆体配列のいずれか一つ又はそのフラグメントに存在する塩基配列を含む、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項３】
ヘアピン前駆体の配列が、膵島マイクロＲＮＡに存在する配列である、請求項２に記載の単離された分子。
【請求項４】
膵島マイクロＲＮＡがベクターに組み込まれている、請求項３に記載の単離された分子。
【請求項５】
単離された分子がＤＮＡ分子である、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項６】
単離された分子がＲＮＡ分子である、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項７】
単離された分子が更にキャップを含む、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項８】
キャップが逆向きのヌクレオチドキャップである請求項７に記載の単離された分子。
【請求項９】
キャップが化学キャップである請求項７に記載の単離された分子。
【請求項１０】
単離された分子が実質的に、配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡの配列のいずれか一つを含む、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項１１】
単離された分子が実質的に、配列番号：２１から４０に示される膵島マイクロＲＮＡの配列のいずれか一つを含む、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項１２】
修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子であり、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、そこにおいて：
少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、変異又はその組合せであってもよい）を有し、
デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、
少なくとも一つの部分が修飾されていないデオキシリボヌクレオチド部分又は修飾されていないリボヌクレオチド部分でない、
修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子。
【請求項１３】
更に、配列番号：２１から４０に示されるヘアピン前駆体配列のいずれか一つ又はそのフラグメントに存在する塩基配列を、その５’末端及び／又は３’末端に含む、請求項１２に記載の分子。
【請求項１４】
ヘアピン前駆体配列が膵島マイクロＲＮＡがある配列である、請求項１３に記載の分子。
【請求項１５】
膵島が哺乳類の膵島である、請求項１２に記載の分子。
【請求項１６】
哺乳類がヒトである、請求項１５に記載の分子。
【請求項１７】
ヌクレアーゼ耐性を増加させるために分子が修飾された、請求項１２に記載の分子。
【請求項１８】
修飾された一本鎖アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子であり、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、そこにおいて：
少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、変異又はその組合せであってもよい）を有し、
デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、
マイクロＲＮＰ活性を阻害することができる、
修飾された一本鎖アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子。
【請求項１９】
マイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置の部分が非相補的である、請求項１８に記載の分子。
【請求項２０】
隣接する部分の最高５％が膵島マイクロＲＮＡの塩基の隣接する配列と非相補的でもよい、請求項１８に記載の分子。
【請求項２１】
非相補的な部分が付加、欠失、変異又はそれらの組合せである、請求項２０に記載の分子。
【請求項２２】
配列番号：４１から６０に示されるアンチ−膵島マイクロＲＮＡ配列のいずれか一つを有する、請求項１８に記載の分子。
【請求項２３】
部分のうちの少なくとも一つが、修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項２４】
修飾されたデオキシリボヌクレオチドが、ホスホロチオネートデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項２３に記載の分子。
【請求項２５】
修飾されたデオキシリボヌクレオチドが、Ｎ’３−Ｎ’５ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項２３に記載の分子。
【請求項２６】
部分のうちの少なくとも一つが、修飾されたリボヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項２７】
前記修飾されたリボヌクレオチドが２’の位置で置換されている、請求項２６に記載の分子。
【請求項２８】
２’の位置の置換基が、炭素数１から４のアルキル基である、請求項２７に記載の分子。
【請求項２９】
アルキル基がメチル基である、請求項２８に記載の分子。
【請求項３０】
アルキル基がアリル基である、請求項２８に記載の分子。
【請求項３１】
２’の位置の置換基が、（炭素数１から４のアルコキシ基）−（炭素数１から４のアルキル）基である、請求項２７に記載の分子。
【請求項３２】
前記（炭素数１から４のアルコキシ基）−（炭素数１から４のアルキル）基が、メトキシエチル基である、請求項３１に記載の分子。
【請求項３３】
修飾されたリボヌクレオチドが、２’−酸素原子及び４’−炭素原子の間のメチレン架橋を有する、請求項２６に記載の分子。
【請求項３４】
部分のうちの少なくとも一つが、ペプチド核酸部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項３５】
部分のうちの少なくとも一つが、２’−フルオロリボヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項３６】
部分のうちの少なくとも一つが、モルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項３７】
部分のうちの少なくとも一つが、トリシクロヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項３８】
部分のうちの少なくとも一つが、シクロヘキセンヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項３９】
分子がキメラ分子である、請求項１８に記載の分子。
【請求項４０】
分子が、ヌクレアーゼ耐性を増加させるために少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項１８に記載の分子。
【請求項４１】
ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項４０に記載の分子。
【請求項４２】
分子が５’末端に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４３】
分子が５’末端に少なくとも二つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４４】
分子が３’末端に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４５】
分子が３’末端に少なくとも二つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４６】
分子が５’末端に少なくとも一つの修飾された部分、及び３’末端に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４７】
分子が５’末端に少なくとも二つの修飾された部分、及び３’末端に少なくとも二つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４８】
分子が５’末端、３’末端又はその両末端にキャップを含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４９】
分子が化学キャップを含む、請求項４８に記載の分子。
【請求項５０】
分子が逆向きのヌクレオチドキャップを含む、請求項４８に記載の分子。
【請求項５１】
ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項１８に記載の分子。
【請求項５２】
分子が５’末端と３’末端の間に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項５１に記載の分子。
【請求項５３】
分子が５’末端と３’末端の間に化学キャップを含む、請求項５１に記載の分子。
【請求項５４】
部分の全てがヌクレアーゼ耐性である、請求項１８に記載の分子。
【請求項５５】
細胞内で膵島マイクロＲＮＡの活性を阻害する方法であり、前記膵島マイクロＲＮＡは膵島マイクロＲＮＡ分子を含み、前記方法は請求項１８の一本鎖のアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含み、前記アンチ−膵島マイクロＲＮＡが前記膵島マイクロＲＮＡと相補的である、方法。
【請求項５６】
マイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置のアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の部分が非相補的である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
膵島が哺乳類の膵島である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
哺乳類がヒトである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
配列番号：４１又は５１に示される配列を有する、少なくとも１０の隣接する塩基を有するアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の有効量を、哺乳類に導入する工程を含む、哺乳類の患者の糖尿病を治療する方法。
【請求項６０】
請求項１に記載の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項６１】
請求項１２に記載の単離された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項１】
配列番号：１から２０のいずれかに示される膵島マイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の３０％までがゆらぎ塩基であり、塩基の１０％までが非相補的である場合を除く）を有する、少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子。
【請求項２】
更に５’末端に及び／又は３’末端に、配列番号：２１から４０に示されるヘアピン前駆体配列のいずれか一つ又はそのフラグメントに存在する塩基配列を含む、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項３】
ヘアピン前駆体の配列が、膵島マイクロＲＮＡに存在する配列である、請求項２に記載の単離された分子。
【請求項４】
膵島マイクロＲＮＡがベクターに組み込まれている、請求項３に記載の単離された分子。
【請求項５】
単離された分子がＤＮＡ分子である、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項６】
単離された分子がＲＮＡ分子である、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項７】
単離された分子が更にキャップを含む、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項８】
キャップが逆向きのヌクレオチドキャップである請求項７に記載の単離された分子。
【請求項９】
キャップが化学キャップである請求項７に記載の単離された分子。
【請求項１０】
単離された分子が実質的に、配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡの配列のいずれか一つを含む、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項１１】
単離された分子が実質的に、配列番号：２１から４０に示される膵島マイクロＲＮＡの配列のいずれか一つを含む、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項１２】
修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子であり、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、そこにおいて：
少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、変異又はその組合せであってもよい）を有し、
デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、
少なくとも一つの部分が修飾されていないデオキシリボヌクレオチド部分又は修飾されていないリボヌクレオチド部分でない、
修飾された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子。
【請求項１３】
更に、配列番号：２１から４０に示されるヘアピン前駆体配列のいずれか一つ又はそのフラグメントに存在する塩基配列を、その５’末端及び／又は３’末端に含む、請求項１２に記載の分子。
【請求項１４】
ヘアピン前駆体配列が膵島マイクロＲＮＡがある配列である、請求項１３に記載の分子。
【請求項１５】
膵島が哺乳類の膵島である、請求項１２に記載の分子。
【請求項１６】
哺乳類がヒトである、請求項１５に記載の分子。
【請求項１７】
ヌクレアーゼ耐性を増加させるために分子が修飾された、請求項１２に記載の分子。
【請求項１８】
修飾された一本鎖アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子であり、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、そこにおいて：
少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号：１から２０に示される膵島マイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、変異又はその組合せであってもよい）を有し、
デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、
マイクロＲＮＰ活性を阻害することができる、
修飾された一本鎖アンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子。
【請求項１９】
マイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置の部分が非相補的である、請求項１８に記載の分子。
【請求項２０】
隣接する部分の最高５％が膵島マイクロＲＮＡの塩基の隣接する配列と非相補的でもよい、請求項１８に記載の分子。
【請求項２１】
非相補的な部分が付加、欠失、変異又はそれらの組合せである、請求項２０に記載の分子。
【請求項２２】
配列番号：４１から６０に示されるアンチ−膵島マイクロＲＮＡ配列のいずれか一つを有する、請求項１８に記載の分子。
【請求項２３】
部分のうちの少なくとも一つが、修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項２４】
修飾されたデオキシリボヌクレオチドが、ホスホロチオネートデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項２３に記載の分子。
【請求項２５】
修飾されたデオキシリボヌクレオチドが、Ｎ’３−Ｎ’５ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項２３に記載の分子。
【請求項２６】
部分のうちの少なくとも一つが、修飾されたリボヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項２７】
前記修飾されたリボヌクレオチドが２’の位置で置換されている、請求項２６に記載の分子。
【請求項２８】
２’の位置の置換基が、炭素数１から４のアルキル基である、請求項２７に記載の分子。
【請求項２９】
アルキル基がメチル基である、請求項２８に記載の分子。
【請求項３０】
アルキル基がアリル基である、請求項２８に記載の分子。
【請求項３１】
２’の位置の置換基が、（炭素数１から４のアルコキシ基）−（炭素数１から４のアルキル）基である、請求項２７に記載の分子。
【請求項３２】
前記（炭素数１から４のアルコキシ基）−（炭素数１から４のアルキル）基が、メトキシエチル基である、請求項３１に記載の分子。
【請求項３３】
修飾されたリボヌクレオチドが、２’−酸素原子及び４’−炭素原子の間のメチレン架橋を有する、請求項２６に記載の分子。
【請求項３４】
部分のうちの少なくとも一つが、ペプチド核酸部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項３５】
部分のうちの少なくとも一つが、２’−フルオロリボヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項３６】
部分のうちの少なくとも一つが、モルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項３７】
部分のうちの少なくとも一つが、トリシクロヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項３８】
部分のうちの少なくとも一つが、シクロヘキセンヌクレオチド部分である、請求項１８に記載の分子。
【請求項３９】
分子がキメラ分子である、請求項１８に記載の分子。
【請求項４０】
分子が、ヌクレアーゼ耐性を増加させるために少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項１８に記載の分子。
【請求項４１】
ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項４０に記載の分子。
【請求項４２】
分子が５’末端に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４３】
分子が５’末端に少なくとも二つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４４】
分子が３’末端に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４５】
分子が３’末端に少なくとも二つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４６】
分子が５’末端に少なくとも一つの修飾された部分、及び３’末端に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４７】
分子が５’末端に少なくとも二つの修飾された部分、及び３’末端に少なくとも二つの修飾された部分を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４８】
分子が５’末端、３’末端又はその両末端にキャップを含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４９】
分子が化学キャップを含む、請求項４８に記載の分子。
【請求項５０】
分子が逆向きのヌクレオチドキャップを含む、請求項４８に記載の分子。
【請求項５１】
ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項１８に記載の分子。
【請求項５２】
分子が５’末端と３’末端の間に少なくとも一つの修飾された部分を含む、請求項５１に記載の分子。
【請求項５３】
分子が５’末端と３’末端の間に化学キャップを含む、請求項５１に記載の分子。
【請求項５４】
部分の全てがヌクレアーゼ耐性である、請求項１８に記載の分子。
【請求項５５】
細胞内で膵島マイクロＲＮＡの活性を阻害する方法であり、前記膵島マイクロＲＮＡは膵島マイクロＲＮＡ分子を含み、前記方法は請求項１８の一本鎖のアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含み、前記アンチ−膵島マイクロＲＮＡが前記膵島マイクロＲＮＡと相補的である、方法。
【請求項５６】
マイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置のアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の部分が非相補的である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
膵島が哺乳類の膵島である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
哺乳類がヒトである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
配列番号：４１又は５１に示される配列を有する、少なくとも１０の隣接する塩基を有するアンチ−膵島マイクロＲＮＡ分子の有効量を、哺乳類に導入する工程を含む、哺乳類の患者の糖尿病を治療する方法。
【請求項６０】
請求項１に記載の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項６１】
請求項１２に記載の単離された一本鎖膵島マイクロＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５３２１３０（Ｐ２００７−５３２１３０Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０８３７３（Ｐ２００７−５０８３７３）
【出願日】平成１７年３月３０日（２００５．３．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１０６６７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９９７７０
【国際公開日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【出願人】（５９１１９７３３４）ザ ロックフェラー ユニバーシティ (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月３０日（２００５．３．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１０６６７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９９７７０
【国際公開日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【出願人】（５９１１９７３３４）ザ ロックフェラー ユニバーシティ (9)
【Ｆターム（参考）】
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