マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法
【課題】マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法を提供すること。
【解決手段】（ａ）マウスを生後５週目まで集団飼育をした後、集団飼育する群と個別飼育する群とに分けるステップ；（ｂ）集団飼育群と個別飼育群とを並行して３週間継続飼育するステップ；（ｃ）３週間継続飼育した集団飼育群と個別飼育群におけるマウスの生体情報、例えば、体重、体脂肪量、血糖値、血中インスリン濃度等を、同週齢で比較評価するステップ；を備えることにより、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する。
【解決手段】（ａ）マウスを生後５週目まで集団飼育をした後、集団飼育する群と個別飼育する群とに分けるステップ；（ｂ）集団飼育群と個別飼育群とを並行して３週間継続飼育するステップ；（ｃ）３週間継続飼育した集団飼育群と個別飼育群におけるマウスの生体情報、例えば、体重、体脂肪量、血糖値、血中インスリン濃度等を、同週齢で比較評価するステップ；を備えることにより、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、我が国においても、欧米型の食事形態や過食による摂取エネルギーの増加と運動不足による消費エネルギーの減少との格差が増大し、肥満体形が増えており、肥満は生活習慣病の発症要因として注目されている。肥満状態が慢性化すると糖尿病、動脈硬化症、高血圧症、脂肪肝、胆石症、腎臓障害等の疾患を合併症として起こしやすくなるといわれている。
【０００３】
他方、近年の分子遺伝学の進歩により、肥満等の体重調節に関連する重要な分子として、レプチン（例えば、非特許文献１参照）、レプチンレセプター（タータグリア（例えば、非特許文献２参照）、プロオピオメラノコルチコトロピン（ＰＯＭＣ）（例えば、特許文献１参照特表２００３−５２００１５）、コカイン−アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）（例えば、特許文献２参照）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）とも呼ばれるコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）（例えば、特許文献３参照）、NEFA/nucleobindin2（ＮＵＣＢ２）、メラノコルチン−４レセプター（ＭＣ４Ｒ）、セロトニン５−ＨＴ２Ｃレセプター（５−ＨＴ２ＣＲ）、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）、サイトカインシグナル伝達抑制因子−３（ＳＯＣＳ−３）（例えば、非特許文献３参照）を含むシグナル伝達のサイトカイン誘導性阻害因子の新しいファミリーが同定されている。
【０００４】
上記レプチンは、遺伝性の肥満マウス（ｏｂ/ｏｂマウス）が欠失している遺伝子としてポジショナルクローニングされた肥満遺伝子（ｏｂ遺伝子）の産物としてJ．F．Friedmanらにより発見され、マウスｏｂ遺伝子を用いてヒト組織細胞由来のｃＤＮＡライブラリーからヒトｏｂ遺伝子のｃＤＮＡがクローン化されている（例えば、非特許文献１参照）。レプチンは脂肪組織で発現していることが知られており、細胞外に分泌シグナルを持ち、血流中に分泌されるホルモンである。分泌されたレプチンのシグナルは、レプチン受容体を介して血液脳関門から脳の視床下部に作用し、交感神経系の脂肪細胞へのシグナル伝達系を活性化して脂肪分解を促進したり、摂食抑制を来たす。従って、レプチンのシグナル伝達障害は肥満の病態の主因と考えられている。
【０００５】
また、現在までに知られている食欲抑制効果を来たす薬剤やレプチン等のタンパク質は、すべて上記ＰＯＭＣ／ＣＡＲＴニューロンを刺激して食欲抑制効果を奏するといわれており、最もよく知られている食欲抑制経路は、ＰＯＭＣ−ＭＣ４Ｒの経路であるとされている。ＰＯＭＣとＣＡＲＴは視床下部弓状核に存在し、共同的にニューロンが活性化する。ＣＲＨニューロンはＭＣ４Ｒと同様に視床下部室傍核に存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００３−５２００１５号公報
【特許文献２】特表２００２−５４１８４２号公報
【特許文献３】特開２００１−３４８４００号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nature, 372, 425-432 (1994)
【非特許文献２】Cell, 83, 1263-1271 (1995)
【非特許文献３】Nature, 387, 917-921 (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、マウスを生後５週目まで集団飼育をした後、集団飼育する群と個別飼育する群とに分け、集団飼育群と個別飼育群とを並行して３週間継続飼育し、３週間継続飼育した集団飼育群と個別飼育群におけるマウスの生体情報を同週齢で比較評価することにより、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析しうることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、［１］以下の（ａ）〜（ｃ）のステップを備えた、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法に関する。
（ａ）マウスを生後５週目まで集団飼育をした後、集団飼育する群と個別飼育する群とに分けるステップ；
（ｂ）集団飼育群と個別飼育群とを並行して３週間継続飼育するステップ；
（ｃ）３週間継続飼育した集団飼育群と個別飼育群におけるマウスの体重、体脂肪量、血糖値、及び血中インスリン濃度から選ばれる少なくとも１種の生体情報を同週齢で比較評価するステップ；
【００１１】
また本発明は、［２］マウスが、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス、ＫＫマウス、及びＫＫＡｙマウスから選ばれる少なくとも１種のマウスであることを特徴とする上記［１］記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】個別及び集団で飼育されたＣ５７ＢＬ６Ｊマウス（Ａ）、並びに個別及び集団で飼育されたＫＫマウス（Ｂ）の、生後５週間〜生後８週間の３週間にわたる体重の変化や、個別に飼育された生後８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウス及びＫＫマウスの、精巣上体白色脂肪組織（epididymal white adipose）の重量（Ｃ）、並びに褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の重量（Ｄ）を測定した結果を示す図である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝８）として表示。＊Ｐ＜０．０５
【図２】個別及び集団で飼育された生後８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウス、並びに個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスの、血漿レプチン（Ａ）、インスリン（Ｂ）、活性グレリン（Ｃ）、デスアシルグレリン（Ｄ）、コルチコステロン（Ｅ）、アディポネクチン（Ｆ）及び血中グルコース（Ｇ）のレベルを測定した結果を示す図である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝８）として表示。＊Ｐ＜０．０５
【図３】個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスの、精巣上体白色脂肪組織及び褐色脂肪組織における遺伝子発現の変化を示す図である。個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスの、精巣上体白色脂肪組織における５−ＨＴ２Ｃレセプター（Ａ）、β３アドレナリンレセプター（Ｂ）、ＵＣＰ−２（Ｃ）、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒ７７、及びＮＯＲ−１（Ｄ）のｍＲＮＡレベル並びに褐色脂肪組織における５−ＨＴ２Ｃレセプター（Ｅ）、β３−アドレナリンレセプター（Ｆ）、ＵＣＰ−１（Ｇ）、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ−１のｍＲＮＡレベル（Ｈ）を測定した結果である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表示。＊Ｐ＜０．０５
【図４】個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスのヒラメ筋における遺伝子発現の変化を示す図である。個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスのヒラメ筋におけるＵＣＰ−２（Ａ）、ＵＣＰ−３（Ｂ）、ＰＰＡＲ−δ（Ｃ）、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒ７７並びにＮＯＲ−１のｍＲＮＡレベル（Ｄ）を測定した結果である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜６）として表示。＊Ｐ＜０．０５
【図５】個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスの肝臓における遺伝子発現の変化を示す図である。個別及び集団で飼育されたＫＫマウスの肝臓におけるＮＲ４Ａレセプターファミリー（例えば、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ−１）のｍＲＮＡレベル（Ａ）、並びにＧＰ６アーゼ、Ｆｂｐ１、及びＦｂｐ２のｍＲＮＡレベル（Ｂ）を測定した結果である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜６）として表示。＊Ｐ＜０．０５
【図６】個別及び集団で飼育されたＫＫＡｙマウスの生後５週間〜生後８週間の３週間にわたる体重の変化（Ａ）、個別及び集団で飼育されたＫＫＡｙマウスの精巣上体白色組織の重量（Ｂ）及び褐色脂肪組織の重量（Ｃ）、血中グルコースレベル（Ｄ）、血漿レプチンレベル（Ｅ）、インスリンレベル（Ｆ）、活性なグレリンレベル（Ｇ）、デスアシルグレリンレベル（Ｈ）、及びアディポネクチンレベル（Ｉ）、Ｎｕｒｒ１のｍＲＮＡのレベル、Ｎｕｒ７７のｍＲＮＡのレベル及びＮＯＲ−１のｍＲＮＡのレベル（Ｊ）、並びに肝臓中のＧＰ６ａｓｅ、Ｆｂｐ１、及びＦｂｐ２のｍＲＮＡのレベル（Ｋ）を測定した結果を示す図である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６〜８）として表示。＊Ｐ＜０．０５を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のマウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法としては、（ａ）マウスを生後５週目まで集団飼育をした後、集団飼育する群と個別飼育する群とに分けるステップ；（ｂ）集団飼育群と個別飼育群とを並行して３週間継続飼育するステップ；（ｃ）３週間継続飼育した集団飼育群と個別飼育群におけるマウスの体重、体脂肪量、血糖値、及び血中インスリン濃度から選ばれる少なくとも１種の生体情報を同週齢で比較評価するステップ；を備えた方法であれば特に制限されず、上記マウスとしては、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス、ＫＫマウス、ＫＫＡｙマウス等を例示することができる。
【００１５】
上記３週間個別飼育によって得られるマウスは、３週間集団飼育によるマウスに比べて、脂肪細胞のＮＯＲ−１の発現が低下している、好ましくは、脂肪細胞のＮＯＲ−１の発現が低下し、かつＮｕｒ７７の発現は低下していないマウスであり、これらの中でも、さらに、セロトニンシグナル伝達障害を有するマウスを好適に例示することができる。なお、個別（単独）飼育に対する集団（グループ）とは、少なくとも３匹〜４匹を同じケージ等で集団飼育することを意味する。
【００１６】
セロトニンもレプチンもポストレセプターレベルでは、同じように、視床下部ＰＯＭＣ、ＣＡＲＴ、ＣＲＨにシグナル伝達され、摂食抑制効果を生じることが知られており、３週間個別飼育によって得られるマウスでは、脂肪細胞でセロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体の発現が低下することでセロトニンの脂肪分解シグナル伝達が障害されているが、視床下部ではセロトニンのシグナル伝達は障害されていない。３週間個別飼育によって得られる、３週間集団飼育に比べて肝Ｎｕｒｒ１の発現が低下しているＫＫＡｙマウスは、インスリン非依存性糖尿病モデル動物として好適に使用することができる。
【００１７】
上記３週間個別飼育によって得られるマウスを、レプチンシグナル伝達障害モデル動物として使用する方法としては、かかるマウス（例えば、肥満型インスリン非依存性糖尿病の疾患モデルマウス）に被検物資を投与し、被検物資を投与した前記マウスの脂肪細胞におけるＮＯＲ−１遺伝子の発現量を測定し、被検物資を投与していない対照における場合と比較・評価して、対照に比べてＮＯＲ−１遺伝子の発現の程度が上昇したとき、前記被検物資を抗肥満剤と判定する抗肥満剤のスクリーニングに使用する方法を例示することができる。上記のＮＯＲ−１遺伝子の発現量を測定する方法としては、ＮＯＲ−１のｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにより測定する方法や、ＮＯＲ−１タンパク質の発現量をＥＬＩＳＡにより測定する方法を挙げることができる。
【００１８】
上記３週間個別飼育によって得られるマウスを、レプチンシグナル伝達障害モデル動物として使用する他の方法としては、かかるマウス（例えば、肥満型インスリン非依存性糖尿病の疾患モデルマウス）の脂肪細胞に被検物資を接触させ、被検物資を接触させた脂肪細胞におけるＮＯＲ−１遺伝子の発現量を測定し、被検物資を接触させていない対照における場合と比較・評価して、対照に比べてＮＯＲ−１遺伝子の発現の程度が上昇したとき、前記被検物資を抗肥満剤と判定する抗肥満剤のスクリーニングに使用する方法を例示することができる。上記の脂肪細胞としては、精巣上体白色組織又は褐色脂肪組織由来の脂肪細胞を挙げることができ、また、ＮＯＲ−１遺伝子の発現量を測定する方法としては、ＮＯＲ−１のｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにより測定する方法や、ＮＯＲ−１タンパク質の発現量をＥＬＩＳＡにより測定する方法を挙げることができる。
【００１９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、供試マウスは、動物実験のための制度上のガイドラインに従ったプロトコールのもとで東北大学医学研究科にて実験に用いられた。また、データを、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜８）として表示し、Two-tailed unpaired Student's t-test検定を用いて、２群間の比較を行った。２群以上の群間の比較は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を用いた偏差の分析により行った。０．０５未満のＰ値を統計的に有為であるとみなした。
【実施例１】
【００２０】
［社会的隔離はマウスにおいて肥満及び２型糖尿病の発達に影響する］
Ａ．材料と方法
（全体的な手順）
Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス、ＫＫマウス、及びＫＫＡｙマウスのオスを、Ｊａｐａｎ ＣＬＥＡ（東京）より購入した。動物が配送された後、全てのマウスを集団で飼育し、そしてコロニーに１週間順応させ、その後実験を行った。本実験の前に、これらを全て飼育し（１ケージあたり３匹〜４匹のマウス）、光制御（１２時間オン／１２時間オフ；２０００時間光オフ）かつ温度制御（２０℃〜２２℃）の環境の下で、水及び食物のペレットに自由に接近可能にした。１週間後、１匹ずつ個別ケージで飼育（個別飼育）する条件に動物をランダムに移した。マウスを、１ケージ（２１．５ｘ３２ｘ１４ｃｍ）あたり３匹〜４匹の集団で飼育（集団飼育）するか、又は個別に３週間飼育し、その後、屠殺した。３週間にわたって７日ごとに、午前中にこれらの体重を測定した。
【００２１】
（血液化学）
血漿グレリン及びアディポネクチンのレベルを、酵素免疫抗体法（（ＥＬＩＳＡ）；活性グレリンＥＬＩＳＡキット及びデスアシルグレリンＥＬＩＳＡキット、Mitsubishi Kagaku Iatron Inc., Tokyo,Japan及びmouse adiponectin ＥＬＩＳＡキット、Ootsuka Inc.,Tokyo,Japan）により測定した。活性グレリンのＥＬＩＳＡについて、塩酸（１Ｎ）を最終濃度が０．１Ｎになるように、血漿の分離の直後に添加した。血漿レプチン、インスリン及びコルチコステロンのレベルを、それぞれマウスのレプチン（Linco,St.Louis,Missouri）、ラットのインスリン（Linco,St.Louis,Missuouri）及びラットのコルチコステロン（ICN Biomedicals,Costa Mesa,California）のラジオイムノアッセイのキットを用いて測定した。血中グルコースレベルを、グルコースのｓｔｒｉｐｓ（Blood glucose monitoring system;FreeStyle,KISSEI,Tokyo,Japan）を用いて測定した。
【００２２】
（リアルタイムでの定量的な逆転写連鎖反応）
全ＲＮＡを、酸単離−グアニジウム・チオシアネート−フェノール−クロロホルム法により、精巣上体白色組織、ＢＡＴ、ヒラメ骨格筋（soleus skeletal muscle）より抽出し、そしてマウスの肝組織及び視床下部組織より、RNeasy Midiキット（Qiagen,Hilden,Germany）を用いて、製造業者の指示に従って、全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡの合成を、全ＲＮＡ１μｇを用いて、Super Script III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit（Invitgrogen,Rockville,MD）を用いて行った。全ＲＮＡより合成したｃＤＮＡを、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量システム（Light Cycler Quick System 350S;Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）で評価した。使用したプライマーを表１（配列番号１〜４６）に列挙した。また、β−アクチンのｍＲＮＡをインバリアントなコントロールとして使用し、ｍＲＮＡの相対的な量を算出した。このデータを、コントロール群の平均値の倍数変化として示す。上記コントロール群には、生理食塩水を投与した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
Ｂ．結果
（社会的隔離により誘導される肥満）
１匹ずつ個別ケージで３週間飼育された生後６週間〜８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウス（個別飼育マウス）と、集団で３週間飼育された生後６週間〜８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウス（集団飼育マウス）との間では、体重の変化に有為差はなかった（図１Ａ）が、その一方でＫＫマウスにおける体重の増加は、１匹ずつ個別ケージで飼育された生後６週間のマウスが、集団で飼育された生後６週間のものよりも有為に大きかった（図１Ｂ）。生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウスの精巣上体白色組織（epididymal white adipose tissue）及び褐色脂肪組織（brown adipose tissue；ＢＡＴ）の重量は、集団で飼育されたものと比較して有為に増加したが、個別に飼育されたＣ５７ＢＬ６Ｊマウスと集団で飼育されたＣ５７ＢＬ６Ｊマウスとの間には、これらの有為差はなかった（図１Ｃ及び図１Ｄ）。これらの知見は、慢性的な隔離はＫＫマウスにおいて体重の増加及び肥満症に拍車をかけるが、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスにおいてはそうではないことを示唆している。
【００２５】
（社会的隔離により誘導された血液化学変化）
個別に飼育された生後８週間のＫＫマウスの血漿レプチンのレベルは、集団で飼育されたものと比較して、有為に増加した（図２Ａ）。個別に飼育された生後８週間のＫＫマウスと、集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスとの間では、血漿インスリンレベルに有為差がなかったが、生後８週間のＫＫマウスの血漿インスリンレベルは、生後８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウスのそれよりも有為に高かった（図２Ｂ）。個別に飼育された生後８週間のＫＫマウスの血漿コルチコステロン及び活性型グレリンのレベルは、集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスと比較して有為に減少した（図２Ｅ及び図２Ｃ）が、デスアシルグレリンは減少しなかった（図２Ｄ）。しかし、生後８週間のＫＫマウスの血漿デスアシルグレリンのレベルは、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスのそれよりも有為に低かった（図２Ｄ）。血漿アディポネクチンレベルと血中グルコースレベルに関しては、個別に飼育された生後８週間のＫＫマウスと集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスとの間には有為差はなかったが、生後８週間のＫＫマウスの血漿アディポネクチンレベルは、生後８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウスよりも有為に低かった（図２Ｆ及び図２Ｇ）。ＫＫマウスにおいて社会的隔離により誘導されるこれらのホルモン上の変化及び代謝上の変化は、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスにおいては見出されなかった。これらの知見は、慢性的な社会的隔離が誘導する肥満は、高インスリン血症（hyperinsulinemia）及び高コルチステロン血症（hypercorticosteronemia）によるものではなく、血漿アディポネクチンレベル及びデスアシルグレリンレベルの低下を伴っていないことを示す。
【００２６】
（社会的隔離により誘導される遺伝子発現の変化）
精巣上体白色組織におけるセロトニン５−ＨＴ２Ｃレセプター、β３−アドレナリンレセプター、非共役型タンパク質（ＵＣＰ）−２、及びＮＲ４Ａオーファン核内レセプターファミリーであるＮＯＲ−１のｍＲＮＡレベルもまた、集団飼育された生後８週間のＫＫマウスと比較して、生後８週間の個別飼育されたＫＫマウスにおいて有為に減少したが、その一方で、精巣上体白色組織におけるＮｕｒｒ１及びＮｕｒ７７のｍＲＮＡに関しては有為差がなかった（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄ）。
【００２７】
ＢＡＴにおける５−ＨＴ２Ｃレセプター、β３−アドレナリンレセプター、及びＮＯＲ−１のｍＲＮＡレベルもまた、集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスと比較して、生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウスにおいて有為に減少した（図３Ｆ、図３Ｇ及び図３Ｈ）が、ＢＡＴにおけるＵＣＰ−１のｍＲＮＡレベルに関しては、生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウスと集団で飼育されたものとの間に有為差はなかった（図３Ｅ）。ヒラメ筋におけるＰＰＡＲδ、ＵＣＰ−２及びＵＣＰ−３のｍＲＮＡのレベルに関しては、生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウスと集団で飼育されたものとの間に有為差はなかった（図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃ）が、ＮＲ４Ａオーファン核内レセプターファミリーであるＮＯＲ−１やＮｕｒ７７のｍＲＮＡレベルは、生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウスにおいて有意に上昇していた（図４Ｄ）。
【００２８】
肝臓におけるＰＰＡＲγのｍＲＮＡレベルは、集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスと比較して、個別に飼育されたＫＫマウスにおいて有為に増加した（図５Ａ）が、肝臓におけるＵＣＰ−２のｍＲＮＡのレベルは、個別に飼育されたＫＫマウスと集団で飼育されたＫＫマウスとの間で有意差がなかった（図５Ｂ）。ＮＡ４Ｒオーファン核内レセプター（例えば、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ−１）、並びに糖新生遺伝子（例えば、Ｇ６Ｐａｓｅ、Ｆｂｐ１及びＦｂｐ２）の肝臓における発現には、個別に飼育されたＫＫマウスと集団で飼育されたＫＫマウスとの間に有意差がなかった（図５Ｃ及び図５Ｄ）。これらの遺伝子発現の変化は、個別に飼育されたＣ５７ＢＬ６Ｊマウスと集団で飼育されたＣ５７ＢＬ６Ｊマウスとの間においても見出されなかった（データは示さず）。
【００２９】
視床下部副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、オレキシン及びレプチン受容体（ＬｅｐＲ）のｍＲＮＡレベルは、集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスと比較して、個別に飼育された生後８週間のＫＫマウスにおいて有為に減少したが、視床下部ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）、コカイン−アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）−３、メラノコルチン（ＭＣ）−４レセプター、５−ＨＴ２Ｃレセプター、並びに血清及びグルココルチコイド誘導可能キナーゼ（ＳＧＫ−１）のｍＲＮＡのレベルは、個別に飼育された生後８週間のマウスと集団で飼育された生後８週間のマウスとの間で有為差はなかった（表２）。このことから、個別飼育したＫＫマウスでは、レプチン受容体レベルでのシグナル伝達障害を伴う肥満を呈することが判明した。表２は、個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスの、食物の取り込みの調節及びエネルギーのホメオスタシスに関与する視床下部の遺伝子の発現の結果を示している。データを、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５−６）として算出した。また、表２中、Ｉ：生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウス、Ｇ：生後８週間の集団で飼育されたＫＫマウスを示し、ＰＯＭＣ；プロオピオメラノコルチン、ＣＡＲＴ；コカイン及びアンフェタミン制御転写産物、ＮＰＹ；ニューロペプチドＹ、ＳＯＣＳ３；サイトカインシグナル伝達のサプレッサー３、ＣＲＨ；副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ＳＧＫ−１；血清及びグルココルチコイド誘導可能キナーゼ−１、５−ＨＴ２ＣＲ；セロトニン５−ＨＴ２Ｃレセプター、ＭＣ４Ｒ；メラノコルチンレセプター４を示す。＊Ｐ＜０．０５
【００３０】
【表２】
【００３１】
（社会的隔離により誘導されるインスリン非依存性糖尿病）
個別に飼育された生後８週間のＫＫＡｙマウスは、集団で飼育されたＫＫＡｙマウスと比較して、体重の増加及び精巣上体の脂肪の増加に関連して高血糖を、並びに血漿レプチンの増加を示したが（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ）、その一方で、血漿インスリンレベル及びアディポネクチンレベルに関しては、個別に飼育されたＫＫＡｙマウスと集団で飼育されたＫＫＡｙマウスとの間で有為差はなかった（図６Ｆ及び図６Ｉ）。血漿活性グレリンレベルは顕著に減少し（図６Ｇ）、そしてデスアシルグレリンレベルは、個別に飼育されたＫＫＡｙマウスの方が集団で飼育されたＫＫＡｙマウスと比較して僅かに減少した（図６Ｈ）。
【００３２】
ＮＲ４Ａオーファン核内レセプターは、肝糖新生のｃＡＭＰ依存性レギュレーターの新規なブランチである。個別に飼育された生後８週間のＫＫＡｙマウスでは、肝Ｎｕｒｒ１のｍＲＮＡレベルが増加したが、肝Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ１のｍＲＮＡレベルに対しては有意な効果はなかった（図６Ｊ）。さらに、個別に飼育した生後８週間のＫＫＡｙマウスは、糖新生に関与する肝グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、フルクトースビスホスフェート１（Ｆｂｐ１）及びＦｂｐ２遺伝子の発現が有意に増加したが、その一方で、これは肝ピルピン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）のｍＲＮＡレベルに有意な効果を有していなかった（図６Ｋ）。上記のように、このＫＫＡｙマウスの個別飼育によって生じる高血糖は、インスリン非依存性に肝臓での糖新生の増加による高血糖であり、肝臓でのＮｕｒｒ１遺伝子発現の増加が関与していることを示している。この原因は過食による高血糖であることから、Ｎｕｒｒ１遺伝子の発現を抑制することは過食によって誘発される高血糖の治療になりうる。
【００３３】
Ｃ．考察
５−ＨＴ２Ｃレセプターは、中枢神経系において発現され、そして５−ＨＴ２Ｃレセプター欠損マウスは、代謝における変化よりもむしろ、過食や身体活動の増加といった行動の変化を引き起こす。慢性的な過食は、部分的なレプチン抵抗性及び白色脂肪組織におけるβ３アドレナリン受容体遺伝子の発現の低下を伴う中年期肥満を発症させる。身体活動量が多いにもかかわらず、活動時のエネルギー消費の低下がこの肥満の機序に関与している。しかし、上記実施例では、５−ＨＴ２Ｃレセプターが中枢神経系のみならず、脂肪組織においても発現していることを示し、脂肪組織において５−ＨＴ２Ｃ受容体のシグナル伝達の低下が、内臓脂肪蓄積に寄与することを示唆している。セロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体の刺激薬であるｍＣＰＰ（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与すると１時間後から急速な脂肪分解を生じる。その際に白色脂肪細胞ではＮｕｒ７７の遺伝子発現が低下しているが、ＮＯＲ−１とＮｕｒｒ１の遺伝子発現は変化が認められなかった。５週齢のＣ５７ＢＬ６Ｊマウスにレプチン（５ｍｇ／ｋｇ）投与後１時間で５−ＨＴ２Ｃ受容体発現の低下を起こすことより、この個別飼育によって生じる肥満に伴う白色脂肪細胞の５−ＨＴ２Ｃ受容体遺伝子発現の低下は、血中に増加したレプチンの作用によるものである。つまり、レプチンはセロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体による脂肪分解作用を抑制することが示唆される。
【００３４】
社会的隔離が誘導する肥満症は、エネルギー取り込みが増加したためというよりもむしろ、エネルギー消費が減少したためである可能性がある。第一の理由は、より活性の低いグレリンにもかかわらず、血漿デスアシルグレリンレベルに関しては、個別に飼育されたＫＫマウスと集団で飼育されたＫＫマウスとの間に差はなかったという結果に基づく。本発明者は、以前に、マウスにおいて、摂食亢進が血漿デスアシルグレリンレベルを減少させるが、活性なグレリンレベルを減少させるわけではないことを報告している。第二の理由は、肥満にもかかわらず、視床下部ＳＧＫ−１のｍＲＮＡが個別に飼育されたＫＫマウスにおいて増加しなかったという結果に基づく。摂食亢進マウス及び肥満のマウスにおいて、視床下部ＳＧＫ−１遺伝子の発現が増加し、そして血漿デスアシルグレリンレベルと相関しているからである。第三の理由は、肝ＵＣＰ−２遺伝子の発現が、個別に飼育されたＫＫマウスにおいて増加しなかったという結果に基づく。肝臓におけるＵＣＰ−２遺伝子の発現は、摂食亢進５−ＨＴ２Ｃレセプターの変異体マウスにおいて増加する。第四の理由は、視床下部ＳＯＣＳ−３遺伝子の発現の結果に基づく。視床下部ＳＯＣＳ−３が、規定食の誘導する肥満において抑制的な役割を果たすからである。従って、社会的隔離が誘導する肥満は、規定食の誘導する肥満とは異なる特徴を有する。
【００３５】
リガンド非依存性オーファン核内レセプター、Ｎｕｒ７７、Ｎｕｒｒ１及びＮＯＲ−１のＮＲ４Ａファミリーのメンバーは、転写因子である。Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ−１は、報告通り、骨格筋におけるβアドレナリンレセプターシグナル伝達の標的である。従って、Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ−１の骨格筋における発現の増加は、骨格筋におけるβアドレナリン刺激の増強を反映し得る（これは、活動亢進を示唆している）。我々の以前の結果及び今回の結果により、ＫＫマウスでは、骨格筋においてβアドレナリン刺激が増強されたにも関わらず、慢性的に社会的に隔離することによりβ３−アドレナリンのシグナル伝達が、肥満症と関係した脂肪組織において低減したことが示唆された。脂肪組織におけるＮＯＲ−１は、従って、エネルギー消費の調節に関与し得る。肝の糖新生は、２型糖尿病の高血糖に寄与し得る。肝Ｎｕｒ７７、Ｎｕｒｒ１及びＮＯＲ１の発現は全て、ＳＴＺ誘導糖尿病マウス及びｄｂ／ｄｂマウスにおいて増加する。Ｎｕｒｒ１によるアデノウイルスにより、Ｇ６Ｐアーゼ、Ｆｂｐ１、及びＦｂｐ２遺伝子（これらは、糖新生に関与している）が誘導され、そして血中グルコースレベルを上昇させるグルコースの産生を刺激する。しかし、上記結果を考慮すると、Ｎｕｒｒ１は、ＫＫＡｙマウスにおいて、社会的隔離の誘導する肝糖新生及び高血糖に具体的に関連している。
【００３６】
要するに、これらの結果により、ＫＫマウスにおいて、社会的な隔離が肥満症（これは、恐らくは、エネルギー消費が低減したためと考えられる）を促進し、そしてＫＫＡｙマウスにおいて、肝糖新生遺伝子の発現の増加と関連するインスリン非依存性の糖尿病を発症させることが示唆される。脂肪組織及び肝臓における特異的なＮＲ４Ａレセプターは、インスリン非依存性の肥満症及び糖尿病の発症に寄与し得る。従って、社会的隔離は、肥満及び２型糖尿病を発症させる環境因子として特徴付けられ得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、我が国においても、欧米型の食事形態や過食による摂取エネルギーの増加と運動不足による消費エネルギーの減少との格差が増大し、肥満体形が増えており、肥満は生活習慣病の発症要因として注目されている。肥満状態が慢性化すると糖尿病、動脈硬化症、高血圧症、脂肪肝、胆石症、腎臓障害等の疾患を合併症として起こしやすくなるといわれている。
【０００３】
他方、近年の分子遺伝学の進歩により、肥満等の体重調節に関連する重要な分子として、レプチン（例えば、非特許文献１参照）、レプチンレセプター（タータグリア（例えば、非特許文献２参照）、プロオピオメラノコルチコトロピン（ＰＯＭＣ）（例えば、特許文献１参照特表２００３−５２００１５）、コカイン−アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）（例えば、特許文献２参照）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）とも呼ばれるコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）（例えば、特許文献３参照）、NEFA/nucleobindin2（ＮＵＣＢ２）、メラノコルチン−４レセプター（ＭＣ４Ｒ）、セロトニン５−ＨＴ２Ｃレセプター（５−ＨＴ２ＣＲ）、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）、サイトカインシグナル伝達抑制因子−３（ＳＯＣＳ−３）（例えば、非特許文献３参照）を含むシグナル伝達のサイトカイン誘導性阻害因子の新しいファミリーが同定されている。
【０００４】
上記レプチンは、遺伝性の肥満マウス（ｏｂ/ｏｂマウス）が欠失している遺伝子としてポジショナルクローニングされた肥満遺伝子（ｏｂ遺伝子）の産物としてJ．F．Friedmanらにより発見され、マウスｏｂ遺伝子を用いてヒト組織細胞由来のｃＤＮＡライブラリーからヒトｏｂ遺伝子のｃＤＮＡがクローン化されている（例えば、非特許文献１参照）。レプチンは脂肪組織で発現していることが知られており、細胞外に分泌シグナルを持ち、血流中に分泌されるホルモンである。分泌されたレプチンのシグナルは、レプチン受容体を介して血液脳関門から脳の視床下部に作用し、交感神経系の脂肪細胞へのシグナル伝達系を活性化して脂肪分解を促進したり、摂食抑制を来たす。従って、レプチンのシグナル伝達障害は肥満の病態の主因と考えられている。
【０００５】
また、現在までに知られている食欲抑制効果を来たす薬剤やレプチン等のタンパク質は、すべて上記ＰＯＭＣ／ＣＡＲＴニューロンを刺激して食欲抑制効果を奏するといわれており、最もよく知られている食欲抑制経路は、ＰＯＭＣ−ＭＣ４Ｒの経路であるとされている。ＰＯＭＣとＣＡＲＴは視床下部弓状核に存在し、共同的にニューロンが活性化する。ＣＲＨニューロンはＭＣ４Ｒと同様に視床下部室傍核に存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００３−５２００１５号公報
【特許文献２】特表２００２−５４１８４２号公報
【特許文献３】特開２００１−３４８４００号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nature, 372, 425-432 (1994)
【非特許文献２】Cell, 83, 1263-1271 (1995)
【非特許文献３】Nature, 387, 917-921 (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、マウスを生後５週目まで集団飼育をした後、集団飼育する群と個別飼育する群とに分け、集団飼育群と個別飼育群とを並行して３週間継続飼育し、３週間継続飼育した集団飼育群と個別飼育群におけるマウスの生体情報を同週齢で比較評価することにより、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析しうることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、［１］以下の（ａ）〜（ｃ）のステップを備えた、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法に関する。
（ａ）マウスを生後５週目まで集団飼育をした後、集団飼育する群と個別飼育する群とに分けるステップ；
（ｂ）集団飼育群と個別飼育群とを並行して３週間継続飼育するステップ；
（ｃ）３週間継続飼育した集団飼育群と個別飼育群におけるマウスの体重、体脂肪量、血糖値、及び血中インスリン濃度から選ばれる少なくとも１種の生体情報を同週齢で比較評価するステップ；
【００１１】
また本発明は、［２］マウスが、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス、ＫＫマウス、及びＫＫＡｙマウスから選ばれる少なくとも１種のマウスであることを特徴とする上記［１］記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】個別及び集団で飼育されたＣ５７ＢＬ６Ｊマウス（Ａ）、並びに個別及び集団で飼育されたＫＫマウス（Ｂ）の、生後５週間〜生後８週間の３週間にわたる体重の変化や、個別に飼育された生後８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウス及びＫＫマウスの、精巣上体白色脂肪組織（epididymal white adipose）の重量（Ｃ）、並びに褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の重量（Ｄ）を測定した結果を示す図である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝８）として表示。＊Ｐ＜０．０５
【図２】個別及び集団で飼育された生後８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウス、並びに個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスの、血漿レプチン（Ａ）、インスリン（Ｂ）、活性グレリン（Ｃ）、デスアシルグレリン（Ｄ）、コルチコステロン（Ｅ）、アディポネクチン（Ｆ）及び血中グルコース（Ｇ）のレベルを測定した結果を示す図である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝８）として表示。＊Ｐ＜０．０５
【図３】個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスの、精巣上体白色脂肪組織及び褐色脂肪組織における遺伝子発現の変化を示す図である。個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスの、精巣上体白色脂肪組織における５−ＨＴ２Ｃレセプター（Ａ）、β３アドレナリンレセプター（Ｂ）、ＵＣＰ−２（Ｃ）、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒ７７、及びＮＯＲ−１（Ｄ）のｍＲＮＡレベル並びに褐色脂肪組織における５−ＨＴ２Ｃレセプター（Ｅ）、β３−アドレナリンレセプター（Ｆ）、ＵＣＰ−１（Ｇ）、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ−１のｍＲＮＡレベル（Ｈ）を測定した結果である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表示。＊Ｐ＜０．０５
【図４】個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスのヒラメ筋における遺伝子発現の変化を示す図である。個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスのヒラメ筋におけるＵＣＰ−２（Ａ）、ＵＣＰ−３（Ｂ）、ＰＰＡＲ−δ（Ｃ）、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒ７７並びにＮＯＲ−１のｍＲＮＡレベル（Ｄ）を測定した結果である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜６）として表示。＊Ｐ＜０．０５
【図５】個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスの肝臓における遺伝子発現の変化を示す図である。個別及び集団で飼育されたＫＫマウスの肝臓におけるＮＲ４Ａレセプターファミリー（例えば、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ−１）のｍＲＮＡレベル（Ａ）、並びにＧＰ６アーゼ、Ｆｂｐ１、及びＦｂｐ２のｍＲＮＡレベル（Ｂ）を測定した結果である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜６）として表示。＊Ｐ＜０．０５
【図６】個別及び集団で飼育されたＫＫＡｙマウスの生後５週間〜生後８週間の３週間にわたる体重の変化（Ａ）、個別及び集団で飼育されたＫＫＡｙマウスの精巣上体白色組織の重量（Ｂ）及び褐色脂肪組織の重量（Ｃ）、血中グルコースレベル（Ｄ）、血漿レプチンレベル（Ｅ）、インスリンレベル（Ｆ）、活性なグレリンレベル（Ｇ）、デスアシルグレリンレベル（Ｈ）、及びアディポネクチンレベル（Ｉ）、Ｎｕｒｒ１のｍＲＮＡのレベル、Ｎｕｒ７７のｍＲＮＡのレベル及びＮＯＲ−１のｍＲＮＡのレベル（Ｊ）、並びに肝臓中のＧＰ６ａｓｅ、Ｆｂｐ１、及びＦｂｐ２のｍＲＮＡのレベル（Ｋ）を測定した結果を示す図である。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６〜８）として表示。＊Ｐ＜０．０５を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のマウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法としては、（ａ）マウスを生後５週目まで集団飼育をした後、集団飼育する群と個別飼育する群とに分けるステップ；（ｂ）集団飼育群と個別飼育群とを並行して３週間継続飼育するステップ；（ｃ）３週間継続飼育した集団飼育群と個別飼育群におけるマウスの体重、体脂肪量、血糖値、及び血中インスリン濃度から選ばれる少なくとも１種の生体情報を同週齢で比較評価するステップ；を備えた方法であれば特に制限されず、上記マウスとしては、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス、ＫＫマウス、ＫＫＡｙマウス等を例示することができる。
【００１５】
上記３週間個別飼育によって得られるマウスは、３週間集団飼育によるマウスに比べて、脂肪細胞のＮＯＲ−１の発現が低下している、好ましくは、脂肪細胞のＮＯＲ−１の発現が低下し、かつＮｕｒ７７の発現は低下していないマウスであり、これらの中でも、さらに、セロトニンシグナル伝達障害を有するマウスを好適に例示することができる。なお、個別（単独）飼育に対する集団（グループ）とは、少なくとも３匹〜４匹を同じケージ等で集団飼育することを意味する。
【００１６】
セロトニンもレプチンもポストレセプターレベルでは、同じように、視床下部ＰＯＭＣ、ＣＡＲＴ、ＣＲＨにシグナル伝達され、摂食抑制効果を生じることが知られており、３週間個別飼育によって得られるマウスでは、脂肪細胞でセロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体の発現が低下することでセロトニンの脂肪分解シグナル伝達が障害されているが、視床下部ではセロトニンのシグナル伝達は障害されていない。３週間個別飼育によって得られる、３週間集団飼育に比べて肝Ｎｕｒｒ１の発現が低下しているＫＫＡｙマウスは、インスリン非依存性糖尿病モデル動物として好適に使用することができる。
【００１７】
上記３週間個別飼育によって得られるマウスを、レプチンシグナル伝達障害モデル動物として使用する方法としては、かかるマウス（例えば、肥満型インスリン非依存性糖尿病の疾患モデルマウス）に被検物資を投与し、被検物資を投与した前記マウスの脂肪細胞におけるＮＯＲ−１遺伝子の発現量を測定し、被検物資を投与していない対照における場合と比較・評価して、対照に比べてＮＯＲ−１遺伝子の発現の程度が上昇したとき、前記被検物資を抗肥満剤と判定する抗肥満剤のスクリーニングに使用する方法を例示することができる。上記のＮＯＲ−１遺伝子の発現量を測定する方法としては、ＮＯＲ−１のｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにより測定する方法や、ＮＯＲ−１タンパク質の発現量をＥＬＩＳＡにより測定する方法を挙げることができる。
【００１８】
上記３週間個別飼育によって得られるマウスを、レプチンシグナル伝達障害モデル動物として使用する他の方法としては、かかるマウス（例えば、肥満型インスリン非依存性糖尿病の疾患モデルマウス）の脂肪細胞に被検物資を接触させ、被検物資を接触させた脂肪細胞におけるＮＯＲ−１遺伝子の発現量を測定し、被検物資を接触させていない対照における場合と比較・評価して、対照に比べてＮＯＲ−１遺伝子の発現の程度が上昇したとき、前記被検物資を抗肥満剤と判定する抗肥満剤のスクリーニングに使用する方法を例示することができる。上記の脂肪細胞としては、精巣上体白色組織又は褐色脂肪組織由来の脂肪細胞を挙げることができ、また、ＮＯＲ−１遺伝子の発現量を測定する方法としては、ＮＯＲ−１のｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにより測定する方法や、ＮＯＲ−１タンパク質の発現量をＥＬＩＳＡにより測定する方法を挙げることができる。
【００１９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、供試マウスは、動物実験のための制度上のガイドラインに従ったプロトコールのもとで東北大学医学研究科にて実験に用いられた。また、データを、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜８）として表示し、Two-tailed unpaired Student's t-test検定を用いて、２群間の比較を行った。２群以上の群間の比較は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を用いた偏差の分析により行った。０．０５未満のＰ値を統計的に有為であるとみなした。
【実施例１】
【００２０】
［社会的隔離はマウスにおいて肥満及び２型糖尿病の発達に影響する］
Ａ．材料と方法
（全体的な手順）
Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス、ＫＫマウス、及びＫＫＡｙマウスのオスを、Ｊａｐａｎ ＣＬＥＡ（東京）より購入した。動物が配送された後、全てのマウスを集団で飼育し、そしてコロニーに１週間順応させ、その後実験を行った。本実験の前に、これらを全て飼育し（１ケージあたり３匹〜４匹のマウス）、光制御（１２時間オン／１２時間オフ；２０００時間光オフ）かつ温度制御（２０℃〜２２℃）の環境の下で、水及び食物のペレットに自由に接近可能にした。１週間後、１匹ずつ個別ケージで飼育（個別飼育）する条件に動物をランダムに移した。マウスを、１ケージ（２１．５ｘ３２ｘ１４ｃｍ）あたり３匹〜４匹の集団で飼育（集団飼育）するか、又は個別に３週間飼育し、その後、屠殺した。３週間にわたって７日ごとに、午前中にこれらの体重を測定した。
【００２１】
（血液化学）
血漿グレリン及びアディポネクチンのレベルを、酵素免疫抗体法（（ＥＬＩＳＡ）；活性グレリンＥＬＩＳＡキット及びデスアシルグレリンＥＬＩＳＡキット、Mitsubishi Kagaku Iatron Inc., Tokyo,Japan及びmouse adiponectin ＥＬＩＳＡキット、Ootsuka Inc.,Tokyo,Japan）により測定した。活性グレリンのＥＬＩＳＡについて、塩酸（１Ｎ）を最終濃度が０．１Ｎになるように、血漿の分離の直後に添加した。血漿レプチン、インスリン及びコルチコステロンのレベルを、それぞれマウスのレプチン（Linco,St.Louis,Missouri）、ラットのインスリン（Linco,St.Louis,Missuouri）及びラットのコルチコステロン（ICN Biomedicals,Costa Mesa,California）のラジオイムノアッセイのキットを用いて測定した。血中グルコースレベルを、グルコースのｓｔｒｉｐｓ（Blood glucose monitoring system;FreeStyle,KISSEI,Tokyo,Japan）を用いて測定した。
【００２２】
（リアルタイムでの定量的な逆転写連鎖反応）
全ＲＮＡを、酸単離−グアニジウム・チオシアネート−フェノール−クロロホルム法により、精巣上体白色組織、ＢＡＴ、ヒラメ骨格筋（soleus skeletal muscle）より抽出し、そしてマウスの肝組織及び視床下部組織より、RNeasy Midiキット（Qiagen,Hilden,Germany）を用いて、製造業者の指示に従って、全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡの合成を、全ＲＮＡ１μｇを用いて、Super Script III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit（Invitgrogen,Rockville,MD）を用いて行った。全ＲＮＡより合成したｃＤＮＡを、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量システム（Light Cycler Quick System 350S;Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）で評価した。使用したプライマーを表１（配列番号１〜４６）に列挙した。また、β−アクチンのｍＲＮＡをインバリアントなコントロールとして使用し、ｍＲＮＡの相対的な量を算出した。このデータを、コントロール群の平均値の倍数変化として示す。上記コントロール群には、生理食塩水を投与した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
Ｂ．結果
（社会的隔離により誘導される肥満）
１匹ずつ個別ケージで３週間飼育された生後６週間〜８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウス（個別飼育マウス）と、集団で３週間飼育された生後６週間〜８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウス（集団飼育マウス）との間では、体重の変化に有為差はなかった（図１Ａ）が、その一方でＫＫマウスにおける体重の増加は、１匹ずつ個別ケージで飼育された生後６週間のマウスが、集団で飼育された生後６週間のものよりも有為に大きかった（図１Ｂ）。生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウスの精巣上体白色組織（epididymal white adipose tissue）及び褐色脂肪組織（brown adipose tissue；ＢＡＴ）の重量は、集団で飼育されたものと比較して有為に増加したが、個別に飼育されたＣ５７ＢＬ６Ｊマウスと集団で飼育されたＣ５７ＢＬ６Ｊマウスとの間には、これらの有為差はなかった（図１Ｃ及び図１Ｄ）。これらの知見は、慢性的な隔離はＫＫマウスにおいて体重の増加及び肥満症に拍車をかけるが、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスにおいてはそうではないことを示唆している。
【００２５】
（社会的隔離により誘導された血液化学変化）
個別に飼育された生後８週間のＫＫマウスの血漿レプチンのレベルは、集団で飼育されたものと比較して、有為に増加した（図２Ａ）。個別に飼育された生後８週間のＫＫマウスと、集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスとの間では、血漿インスリンレベルに有為差がなかったが、生後８週間のＫＫマウスの血漿インスリンレベルは、生後８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウスのそれよりも有為に高かった（図２Ｂ）。個別に飼育された生後８週間のＫＫマウスの血漿コルチコステロン及び活性型グレリンのレベルは、集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスと比較して有為に減少した（図２Ｅ及び図２Ｃ）が、デスアシルグレリンは減少しなかった（図２Ｄ）。しかし、生後８週間のＫＫマウスの血漿デスアシルグレリンのレベルは、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスのそれよりも有為に低かった（図２Ｄ）。血漿アディポネクチンレベルと血中グルコースレベルに関しては、個別に飼育された生後８週間のＫＫマウスと集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスとの間には有為差はなかったが、生後８週間のＫＫマウスの血漿アディポネクチンレベルは、生後８週間のＣ５７ＢＬ６Ｊマウスよりも有為に低かった（図２Ｆ及び図２Ｇ）。ＫＫマウスにおいて社会的隔離により誘導されるこれらのホルモン上の変化及び代謝上の変化は、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスにおいては見出されなかった。これらの知見は、慢性的な社会的隔離が誘導する肥満は、高インスリン血症（hyperinsulinemia）及び高コルチステロン血症（hypercorticosteronemia）によるものではなく、血漿アディポネクチンレベル及びデスアシルグレリンレベルの低下を伴っていないことを示す。
【００２６】
（社会的隔離により誘導される遺伝子発現の変化）
精巣上体白色組織におけるセロトニン５−ＨＴ２Ｃレセプター、β３−アドレナリンレセプター、非共役型タンパク質（ＵＣＰ）−２、及びＮＲ４Ａオーファン核内レセプターファミリーであるＮＯＲ−１のｍＲＮＡレベルもまた、集団飼育された生後８週間のＫＫマウスと比較して、生後８週間の個別飼育されたＫＫマウスにおいて有為に減少したが、その一方で、精巣上体白色組織におけるＮｕｒｒ１及びＮｕｒ７７のｍＲＮＡに関しては有為差がなかった（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄ）。
【００２７】
ＢＡＴにおける５−ＨＴ２Ｃレセプター、β３−アドレナリンレセプター、及びＮＯＲ−１のｍＲＮＡレベルもまた、集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスと比較して、生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウスにおいて有為に減少した（図３Ｆ、図３Ｇ及び図３Ｈ）が、ＢＡＴにおけるＵＣＰ−１のｍＲＮＡレベルに関しては、生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウスと集団で飼育されたものとの間に有為差はなかった（図３Ｅ）。ヒラメ筋におけるＰＰＡＲδ、ＵＣＰ−２及びＵＣＰ−３のｍＲＮＡのレベルに関しては、生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウスと集団で飼育されたものとの間に有為差はなかった（図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃ）が、ＮＲ４Ａオーファン核内レセプターファミリーであるＮＯＲ−１やＮｕｒ７７のｍＲＮＡレベルは、生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウスにおいて有意に上昇していた（図４Ｄ）。
【００２８】
肝臓におけるＰＰＡＲγのｍＲＮＡレベルは、集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスと比較して、個別に飼育されたＫＫマウスにおいて有為に増加した（図５Ａ）が、肝臓におけるＵＣＰ−２のｍＲＮＡのレベルは、個別に飼育されたＫＫマウスと集団で飼育されたＫＫマウスとの間で有意差がなかった（図５Ｂ）。ＮＡ４Ｒオーファン核内レセプター（例えば、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ−１）、並びに糖新生遺伝子（例えば、Ｇ６Ｐａｓｅ、Ｆｂｐ１及びＦｂｐ２）の肝臓における発現には、個別に飼育されたＫＫマウスと集団で飼育されたＫＫマウスとの間に有意差がなかった（図５Ｃ及び図５Ｄ）。これらの遺伝子発現の変化は、個別に飼育されたＣ５７ＢＬ６Ｊマウスと集団で飼育されたＣ５７ＢＬ６Ｊマウスとの間においても見出されなかった（データは示さず）。
【００２９】
視床下部副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、オレキシン及びレプチン受容体（ＬｅｐＲ）のｍＲＮＡレベルは、集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスと比較して、個別に飼育された生後８週間のＫＫマウスにおいて有為に減少したが、視床下部ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）、コカイン−アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）−３、メラノコルチン（ＭＣ）−４レセプター、５−ＨＴ２Ｃレセプター、並びに血清及びグルココルチコイド誘導可能キナーゼ（ＳＧＫ−１）のｍＲＮＡのレベルは、個別に飼育された生後８週間のマウスと集団で飼育された生後８週間のマウスとの間で有為差はなかった（表２）。このことから、個別飼育したＫＫマウスでは、レプチン受容体レベルでのシグナル伝達障害を伴う肥満を呈することが判明した。表２は、個別及び集団で飼育された生後８週間のＫＫマウスの、食物の取り込みの調節及びエネルギーのホメオスタシスに関与する視床下部の遺伝子の発現の結果を示している。データを、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５−６）として算出した。また、表２中、Ｉ：生後８週間の個別に飼育されたＫＫマウス、Ｇ：生後８週間の集団で飼育されたＫＫマウスを示し、ＰＯＭＣ；プロオピオメラノコルチン、ＣＡＲＴ；コカイン及びアンフェタミン制御転写産物、ＮＰＹ；ニューロペプチドＹ、ＳＯＣＳ３；サイトカインシグナル伝達のサプレッサー３、ＣＲＨ；副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ＳＧＫ−１；血清及びグルココルチコイド誘導可能キナーゼ−１、５−ＨＴ２ＣＲ；セロトニン５−ＨＴ２Ｃレセプター、ＭＣ４Ｒ；メラノコルチンレセプター４を示す。＊Ｐ＜０．０５
【００３０】
【表２】
【００３１】
（社会的隔離により誘導されるインスリン非依存性糖尿病）
個別に飼育された生後８週間のＫＫＡｙマウスは、集団で飼育されたＫＫＡｙマウスと比較して、体重の増加及び精巣上体の脂肪の増加に関連して高血糖を、並びに血漿レプチンの増加を示したが（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ）、その一方で、血漿インスリンレベル及びアディポネクチンレベルに関しては、個別に飼育されたＫＫＡｙマウスと集団で飼育されたＫＫＡｙマウスとの間で有為差はなかった（図６Ｆ及び図６Ｉ）。血漿活性グレリンレベルは顕著に減少し（図６Ｇ）、そしてデスアシルグレリンレベルは、個別に飼育されたＫＫＡｙマウスの方が集団で飼育されたＫＫＡｙマウスと比較して僅かに減少した（図６Ｈ）。
【００３２】
ＮＲ４Ａオーファン核内レセプターは、肝糖新生のｃＡＭＰ依存性レギュレーターの新規なブランチである。個別に飼育された生後８週間のＫＫＡｙマウスでは、肝Ｎｕｒｒ１のｍＲＮＡレベルが増加したが、肝Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ１のｍＲＮＡレベルに対しては有意な効果はなかった（図６Ｊ）。さらに、個別に飼育した生後８週間のＫＫＡｙマウスは、糖新生に関与する肝グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、フルクトースビスホスフェート１（Ｆｂｐ１）及びＦｂｐ２遺伝子の発現が有意に増加したが、その一方で、これは肝ピルピン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）のｍＲＮＡレベルに有意な効果を有していなかった（図６Ｋ）。上記のように、このＫＫＡｙマウスの個別飼育によって生じる高血糖は、インスリン非依存性に肝臓での糖新生の増加による高血糖であり、肝臓でのＮｕｒｒ１遺伝子発現の増加が関与していることを示している。この原因は過食による高血糖であることから、Ｎｕｒｒ１遺伝子の発現を抑制することは過食によって誘発される高血糖の治療になりうる。
【００３３】
Ｃ．考察
５−ＨＴ２Ｃレセプターは、中枢神経系において発現され、そして５−ＨＴ２Ｃレセプター欠損マウスは、代謝における変化よりもむしろ、過食や身体活動の増加といった行動の変化を引き起こす。慢性的な過食は、部分的なレプチン抵抗性及び白色脂肪組織におけるβ３アドレナリン受容体遺伝子の発現の低下を伴う中年期肥満を発症させる。身体活動量が多いにもかかわらず、活動時のエネルギー消費の低下がこの肥満の機序に関与している。しかし、上記実施例では、５−ＨＴ２Ｃレセプターが中枢神経系のみならず、脂肪組織においても発現していることを示し、脂肪組織において５−ＨＴ２Ｃ受容体のシグナル伝達の低下が、内臓脂肪蓄積に寄与することを示唆している。セロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体の刺激薬であるｍＣＰＰ（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与すると１時間後から急速な脂肪分解を生じる。その際に白色脂肪細胞ではＮｕｒ７７の遺伝子発現が低下しているが、ＮＯＲ−１とＮｕｒｒ１の遺伝子発現は変化が認められなかった。５週齢のＣ５７ＢＬ６Ｊマウスにレプチン（５ｍｇ／ｋｇ）投与後１時間で５−ＨＴ２Ｃ受容体発現の低下を起こすことより、この個別飼育によって生じる肥満に伴う白色脂肪細胞の５−ＨＴ２Ｃ受容体遺伝子発現の低下は、血中に増加したレプチンの作用によるものである。つまり、レプチンはセロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体による脂肪分解作用を抑制することが示唆される。
【００３４】
社会的隔離が誘導する肥満症は、エネルギー取り込みが増加したためというよりもむしろ、エネルギー消費が減少したためである可能性がある。第一の理由は、より活性の低いグレリンにもかかわらず、血漿デスアシルグレリンレベルに関しては、個別に飼育されたＫＫマウスと集団で飼育されたＫＫマウスとの間に差はなかったという結果に基づく。本発明者は、以前に、マウスにおいて、摂食亢進が血漿デスアシルグレリンレベルを減少させるが、活性なグレリンレベルを減少させるわけではないことを報告している。第二の理由は、肥満にもかかわらず、視床下部ＳＧＫ−１のｍＲＮＡが個別に飼育されたＫＫマウスにおいて増加しなかったという結果に基づく。摂食亢進マウス及び肥満のマウスにおいて、視床下部ＳＧＫ−１遺伝子の発現が増加し、そして血漿デスアシルグレリンレベルと相関しているからである。第三の理由は、肝ＵＣＰ−２遺伝子の発現が、個別に飼育されたＫＫマウスにおいて増加しなかったという結果に基づく。肝臓におけるＵＣＰ−２遺伝子の発現は、摂食亢進５−ＨＴ２Ｃレセプターの変異体マウスにおいて増加する。第四の理由は、視床下部ＳＯＣＳ−３遺伝子の発現の結果に基づく。視床下部ＳＯＣＳ−３が、規定食の誘導する肥満において抑制的な役割を果たすからである。従って、社会的隔離が誘導する肥満は、規定食の誘導する肥満とは異なる特徴を有する。
【００３５】
リガンド非依存性オーファン核内レセプター、Ｎｕｒ７７、Ｎｕｒｒ１及びＮＯＲ−１のＮＲ４Ａファミリーのメンバーは、転写因子である。Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ−１は、報告通り、骨格筋におけるβアドレナリンレセプターシグナル伝達の標的である。従って、Ｎｕｒ７７及びＮＯＲ−１の骨格筋における発現の増加は、骨格筋におけるβアドレナリン刺激の増強を反映し得る（これは、活動亢進を示唆している）。我々の以前の結果及び今回の結果により、ＫＫマウスでは、骨格筋においてβアドレナリン刺激が増強されたにも関わらず、慢性的に社会的に隔離することによりβ３−アドレナリンのシグナル伝達が、肥満症と関係した脂肪組織において低減したことが示唆された。脂肪組織におけるＮＯＲ−１は、従って、エネルギー消費の調節に関与し得る。肝の糖新生は、２型糖尿病の高血糖に寄与し得る。肝Ｎｕｒ７７、Ｎｕｒｒ１及びＮＯＲ１の発現は全て、ＳＴＺ誘導糖尿病マウス及びｄｂ／ｄｂマウスにおいて増加する。Ｎｕｒｒ１によるアデノウイルスにより、Ｇ６Ｐアーゼ、Ｆｂｐ１、及びＦｂｐ２遺伝子（これらは、糖新生に関与している）が誘導され、そして血中グルコースレベルを上昇させるグルコースの産生を刺激する。しかし、上記結果を考慮すると、Ｎｕｒｒ１は、ＫＫＡｙマウスにおいて、社会的隔離の誘導する肝糖新生及び高血糖に具体的に関連している。
【００３６】
要するに、これらの結果により、ＫＫマウスにおいて、社会的な隔離が肥満症（これは、恐らくは、エネルギー消費が低減したためと考えられる）を促進し、そしてＫＫＡｙマウスにおいて、肝糖新生遺伝子の発現の増加と関連するインスリン非依存性の糖尿病を発症させることが示唆される。脂肪組織及び肝臓における特異的なＮＲ４Ａレセプターは、インスリン非依存性の肥満症及び糖尿病の発症に寄与し得る。従って、社会的隔離は、肥満及び２型糖尿病を発症させる環境因子として特徴付けられ得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のステップを備えた、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法。
（ａ）マウスを生後５週目まで集団飼育をした後、集団飼育する群と個別飼育する群とに分けるステップ；
（ｂ）集団飼育群と個別飼育群とを並行して３週間継続飼育するステップ；
（ｃ）３週間継続飼育した集団飼育群と個別飼育群におけるマウスの体重、体脂肪量、血糖値、及び血中インスリン濃度から選ばれる少なくとも１種の生体情報を同週齢で比較評価するステップ；
【請求項２】
マウスが、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス、ＫＫマウス、及びＫＫＡｙマウスから選ばれる少なくとも１種のマウスであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のステップを備えた、マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法。
（ａ）マウスを生後５週目まで集団飼育をした後、集団飼育する群と個別飼育する群とに分けるステップ；
（ｂ）集団飼育群と個別飼育群とを並行して３週間継続飼育するステップ；
（ｃ）３週間継続飼育した集団飼育群と個別飼育群におけるマウスの体重、体脂肪量、血糖値、及び血中インスリン濃度から選ばれる少なくとも１種の生体情報を同週齢で比較評価するステップ；
【請求項２】
マウスが、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス、ＫＫマウス、及びＫＫＡｙマウスから選ばれる少なくとも１種のマウスであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−５９３３２（Ｐ２０１３−５９３３２Ａ）
【公開日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２３６２９８（Ｐ２０１２−２３６２９８）
【出願日】平成２４年１０月２６日（２０１２．１０．２６）
【分割の表示】特願２００７−１５６３１（Ｐ２００７−１５６３１）の分割
【原出願日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１０月２６日（２０１２．１０．２６）
【分割の表示】特願２００７−１５６３１（Ｐ２００７−１５６３１）の分割
【原出願日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
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