マルチパラメータデータ解析の方法及び装置
一態様では、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別する方法（２００）に関する。方法（２００）は、マルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対の間での相関を測定するステップ（２０２）と、解析パラメータセットを形成するために、所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正するステップ（２０４）と、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、解析パラメータセットを用いてマルチパラメータデータセットを解析するステップ（２０６）とを含んでいる。本発明の様々な実施形態を、例えば生物学的細胞解析のための自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）装置（１００）に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には、マルチパラメータデータの解析の方法及び装置に関する。さらに具体的には、本発明は、１以上の表現型を識別するためのマルチパラメータデータの解析に関する。かかる表現型を用いて、本発明の様々な実施形態を、例えば生物学的細胞画像解析を用いる自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＳ、すなわち自動細胞内イメージング及び画像解析の細胞信号伝達経路及びプロセスの研究への応用［１］は、極めて情報量の多い生物学的データを生成する高速で対費用効果の高い手段として産学で広く採用されている。ＨＣＳは研究者に対し、インサイツ及び状況での細胞生物学の詳細な研究のための強力な技術及び応用を提供し、結果として、大規模なマルチパラメータデータセットを例えば様々なそれぞれの画像に対応して生成する。
【０００３】
多くの研究において、このデータの完全な可能性は十分に開発され又は活用されるに至っていない。平均及び標準偏差の利用のような標準的なデータ解析及び比較方法がハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）で常用されているが、これらの方法は細胞群応答を平均することによりＨＣＳデータにおける潜在的なパターン及び傾向を不明確にする。
【０００４】
この不明確化の単純な例が化学的阻害剤又はＲＮＡｉ研究において生じており、例えばＨＴＳ尺度によって平均応答として測定された５０％の低下が、全ての細胞における５０％阻害を表わしている場合もあれば、或いは細胞の５０％で１００％阻害であり残りは影響を受けていないことを表わしている場合もある。
【０００５】
この状況は、細胞の強度データ又は空間的データの典型的な分布（正規分布している場合もあるが稀である）によってさらに悪化し、このように平均及び標準偏差はデータ分布の記述子としては不十分になっている。
【０００６】
結果的に、平均化された応答に基づく標本間でのＨＣＳデータの比較は、データを十分に活用しないばかりか多くの場合に不正確である可能性が高い。
【０００７】
標準的なデータ平均化手法の制限から、ＨＣＳデータにおいて細胞群のデータ及び分布を比較するために、コルモゴロフ−スミルノフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ）（ＫＳ）距離［２］の利用のような様々なノンパラメトリック解析方法が採用されるようになってきた［３，４］。
【０００８】
例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ等は、画像処理ソフトウェアからの自動データ収集及びこのデータの統計解析に基づく細胞の解析のための方法及びシステムを記載している［５］。記載されている方法は、標本内ＫＳ距離を群差の計量として利用すること、及び群内での記述子のばらつきの計量（例えば標準偏差）によって除算することによりＫＳ距離を正規化する手段を含んでいる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１５４２３６号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】S. A. Haney, P. LaPan, J. Pan and J. Zhang, “High-content screening moves to the front of the line,” Drug Discovery Today, Vol. 11, No. 19-20, pp. 889-894, October 2006
【非特許文献２】S. Siegel and N. J. Castellan, Non-Parametric Statistics for the Behavioural Sciences, McGraw-Hill, New York, USA, 2nd Edition, 1988
【非特許文献３】Z. E. Perlman, M. D. Slack, Y. Feng, T. J. Mitchison, L. F. Wu and S. J. Altschuler, “Multidimensional drug profiling by automated microscopy,” Science, Vol. 306, pp. 1194-1198, 12 November 2004
【非特許文献４】B. Zhang, X. Gu, U. Uppalapati, M. A. Ashwell, D. S. Leggett and C. J. Li, “High-content fluorescent-based assay for screening activators of DNA damage checkpoint pathways,” Journal of Biomolecular Screening, Vol. 13, No. 6, pp. 538-543, 19 June 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、かかるノンパラメトリックデータ解析方法の利用は従来の手法の改善ではあるが、特にＨＣＳ／ＨＴＳによって典型的に生成される極めて大規模なマルチパラメータデータセットを解析するためにはさらに高速でさらに正確なデータ解析手法に対する必要性が依然存在している。
【００１２】
従って、本発明は、従来のデータ解析方法に関連する以上に述べた欠点に鑑みて考案されたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第一の態様では、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別する方法が提供される。この方法は、マルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対の間での相関を測定するステップと、解析パラメータセットを形成するために、所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正するステップと、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、上述の解析パラメータセットを用いてマルチパラメータデータセットを解析するステップとを含んでいる。
【００１４】
本発明の第二の態様では、１以上のマルチパラメータデータセットの自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）のための装置が提供される。この装置は、マルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対の間での相関を測定するように動作可能なプロセッサを含んでいる。プロセッサはまた、解析パラメータセットを形成するために、マルチパラメータデータセットについて所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正し、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、上述の解析パラメータセットを用いてマルチパラメータデータセットを解析するように動作可能である。
【００１５】
所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部での相関のあるパラメータ値の修正は、例えばパラメータ値のゼロへの修正、又はさらに詳細な解析からのパラメータ除去を含めて、相関測定から導かれる１以上の因子を用いたパラメータ値の乗算又は他の演算による修正を含み得る。
【００１６】
独立なパラメータすなわち実質的に相関のないパラメータで形成される解析パラメータセットから表現型を決定することにより、全体的なデータ処理時間が短縮される。
【００１７】
また、この手法は加えて、表現型のさらに正確な測定を提供し、これにより、例えばＨＣＳ／ＨＴＳシステムにおいて改善された特徴認識を高速で自動的に行なうことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
以下、本発明の様々な態様及び実施形態を添付図面に関連して記載する。
【図１】本発明の一実施形態に係る１以上のマルチパラメータデータセットの自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）のための装置を示す図である。
【図２】本発明の様々な態様によるマルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別する方法を示す図である。
【図３】本発明の様々な実施形態に係る二つのデータ群の間でのコルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離を決定する原理を示す図である。
【図４】本発明の様々な実施形態に用いられる標本内及び標本間でのＫＳ距離決定の図である。
【図５】本発明の一実施形態でのデータパラメータと表現型マップ次元との間の関係を示す図である。
【図６】本発明の一態様による解析のためのデータを導くのに用いられるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングからの典型的な画像を示す図である。
【図７】本発明の一態様による解析のためのデータを導くのに用いられるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる核面積データを示す図である。
【図８】本発明の一態様による解析のためのデータを導くのに用いられるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる核周長データを示す図である。
【図９】本発明の一態様による解析のためのデータを導くのに用いられるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる核加重付き相対慣性モーメントデータを示す図である。
【図１０】本発明の一態様による解析のためのデータを導くのに用いられるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる核長さデータを示す図である。
【図１１】本発明の一態様によるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる標本内ＫＳ距離計量データを示す図である。
【図１２】本発明の一態様によるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる標本間ＫＳ距離計量データを示す図である。
【図１３】本発明の一態様による標本内及び標本間のＫＳ距離測定から導かれる表現型マップを示す図である。
【図１４】本発明の一態様による表現型マップの小成分への分解を示す図である。
【図１５】本発明の一態様によるＭＭＣの濃度を高めながら処理された細胞の表現型マップから導かれる表現型スコアを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図１は、本発明の一実施形態に係る１以上のマルチパラメータデータセットの自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）の装置１００を示す。装置１００は分かり易くするために概略図示されており、光１２０ａを発生する光源１０２を含んでいる。
【００２０】
光１２０ａは集光装置１０４によって集束させられて鏡検プレート１０８に入射する。鏡検プレート１０８は、撮影されるウェル又はスポット１０９のアレイを含み得る。集光装置１０４は、光１２０ｂを鏡検プレート１０８において焦平面に集束させることができる。鏡検プレート１０８は消耗品として提供されることができ、スポット１０９は幾つかの形式の細胞（例えば哺乳動物細胞）と相互作用することが可能な様々な物質を含み得る。
【００２１】
様々な実施形態では、鏡検プレート１０８は、装置１００の内部で当該鏡検プレート１０８を整列させる助けとなるように設けられた少なくとも一つの基準目印（図示されていない）を含み得る。例えば、１以上の着色染料をスポット１０９の内部に設けることができる。かかる着色染料は、装置１００の内部での鏡検プレート１０８の相対的な位置決めに関するデータを導くために、様々なイメージングシステムによって識別され得る。例えば、装置１００は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（英国バッキンガムシャー州リトルチャルフォント）から市販のＧＥ Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）であってよく、この装置は四つの色チャネルを用いて画像鏡検プレート１０８を撮影することができる。従って、装置１００の内部での鏡検プレート１０８の配置に関するデータを得るために、一つの色チャネルを様々なスポット１０９に設けられている色付きの基準目印を撮影するための専用にすることができる。
【００２２】
装置１００はまた、検出器システム１１２及び並進機構（図示されていない）を含んでいる。並進機構は、光１２０ｂの焦点を鏡検プレート１０８に対して移動させる（例えば鏡検プレート１０８をｘｙ平面において移動させることにより）ように構成されている。これにより、複数の画像を個々のスポット１０９のそれぞれから取得することが可能になる。加えて、並進機構はまた、例えばスポット１０９に焦点を合わせるために図１に示すｚ方向において鏡検プレート１０８を移動させるように動作可能であってもよい。
【００２３】
幾つかの実施形態については、一度に１個のスポットのみが撮影される。取得される画像は、細胞及び細胞レベル以下の形態を分解するのに十分な拡大率を有する。現状のＧＥ Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）では、このために単一のスポットよりも僅かに小さい視野を有する２０倍の対物レンズを利用する場合がある。しかしながら、本発明の様々な方法は、例えばＧＥ Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）において４倍の対物レンズを用いて４個〜６個スポット／画像で撮影する相対的に低倍率での拡大撮影にも対応する。
【００２４】
開口絞り１０６が光源１０２と検出器システム１１２との間に選択随意で設けられ、開口絞り１０６の寸法は可変であってよい。例えば、様々な異なる寸法の可動式開口を所定位置まで回転させてもよいし、連続可変式のアイリス型ダイヤフラムを設けてもよい。画像コントラストは、開口絞り１０６の開口設定を変化させることにより制御され得る。
【００２５】
開口絞り１０６を通過した集束光１２０ｂは、透過撮影モードでは標本鏡検プレート１０８を通過する。個々のスポット１０９に隣接する物質に関係する画像情報と共に変調を受けた発散光１２０ｃが対物レンズ１１０によって収集され、集束させられて１２０ｄ検出器システム１１２に入射し、この光を用いて該当スポット１０９についての原画像を形成する。
【００２６】
本発明の方法の様々な実施形態は用いられる撮影モダリティに独立であり、例えば透過型の幾何学的構成でも反射型の幾何学的構成でも作用し得る。ＧＥ Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）での撮影の場合には、落射型蛍光モードを用いることができ、基準目印スポット及び細胞からのアッセイ信号の両方が異なる励起波長及び放出波長において撮影される。しかしながら、干渉し合わない限り混成撮影モードを展開することを妨げるものは原則として存在しない。例えば、基準目印を付けるために非蛍光染料を用い、落射蛍光によってアッセイ信号を検出しながら反射型又は透過型の幾何学的構成において吸光度によって基準目印を検出することも可能である。
【００２７】
検出器システム１１２は、鏡検プレート１０８から複数の画像を取得するように動作可能であり、各々の画像がそれぞれのマルチパラメータデータセットとして電子形態で表わされ得る。例えば、それぞれの異なるスポット１０９又は異なる時間点での同じスポット１０９の画像を各々表わす幾つかのマルチパラメータデータセットを得ることができる。このようにして、隣り合ったスポット１０９の間の差又は同じスポット１０９の範囲内で生ずる時間的変化を解析することができる。
【００２８】
また、検出器システム１１２は、プロセッサ１１４に結合されて動作可能であり、次にプロセッサ１１４はマルチパラメータデータセットを処理するように動作可能である。プロセッサ１１４は、一つのマルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対（ペア）の間での相関を測定するように動作可能である。例えば、細胞の周長、径及び楕円率等のようなパラメータを対単位の態様で評価して、両者の間の定量化された相関度を決定することができる。
【００２９】
次いで、プロセッサ１１４は、解析パラメータセットを形成するために、マルチパラメータデータセットについて所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正するように動作可能である。所定のマルチパラメータデータ解析セットは、例えば特定の細胞画像について測定され得る全てのパラメータのリストを含み得る。次いで、かかるリストを、例えば所定の値よりも大きい相関閾値を有する一対のパラメータの一方を除去するようにプロセッサ１１４によって整理することができる。例えば、プロセッサ１１４は、細胞特徴の周長及び径が９５％を上回る相関を有すると決定することができ、このようにしてマルチパラメータデータセットから、決定されるべきパラメータとしては周長を除去する。適当に改訂された決定されるべきパラメータのリストが解析パラメータセットとして記憶される。
【００３０】
プロセッサ１１４はまた、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、解析パラメータセットを用いてマルチパラメータデータセットを解析するように動作可能である。例えば、プロセッサ１１４は、各々の適当な細胞特徴毎に、解析パラメータセットにおいて各々のパラメータの値を逐次決定することができる。かかる細胞特徴がマルチパラメータデータセットによって画定される画像において多数回にわたり生ずる場合には、元の所定のマルチパラメータデータ解析セットを整理すれば、データ処理のオーバヘッドが確実に減少する。これにより、マルチパラメータデータセットの解析が高速化する。加えて、様々な特徴の識別も、最終的なマルチパラメータデータセット解析からのあらゆる相関のあるパラメータの除去によって統計学的に改善される。また、かかる手法はまた、必ずしも予め決められているのではなく解析されているデータに適応させることができるように、データ解析に用いられるパラメータの動的／自動修正を提供する。
【００３１】
さらに、プロセッサ１１４は、複数のマルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別して、表現型同士の間の変動を識別するためにマルチパラメータデータセットからのそれぞれの表現型を比較するように動作可能であり得る。例えば、プロセッサ１１４を用いて、一つの画像からの表現型をもう一つの画像の表現型と比較することができる。かかる手法は、スポット１０９に与えられている細胞の統制（対照）標本を、スポット１０９の他のものに与えられている類似しているが処理済みの細胞と比較することを可能にする。
【００３２】
装置１００についての有利なオプションは、複数のマルチパラメータデータセットについて１以上のそれぞれの解析パラメータセットを形成し、相関関係がマルチパラメータデータセットの間で保たれているか否かを決定するためにこれらの解析パラメータセットを比較するようにさらに動作可能なプロセッサ１１４を設けるものである。様々なパラメータの間で相関に空間的な変動（例えばスポット１０９のアレイにわたる）及び／又は時間的な変動が生じているか否かを決定することにより、従来は利用可能でない追加情報を得ることができる。
【００３３】
例えば、細胞核が死んで（例えばアポトーシスを介して）、小断片に分割される場合がある。これらの断片は一般的には、同じ全体的形状（例えば円形及び卵形等）を有し得る。この場合には、撮影された径及び周長に関係するパラメータは、当初の細胞核及び断片の両方について相対的に高い相関度を有する。しかしながら、アポトーシスのプロセスで、核が形状を変化させて放射状（星形）の形態になる場合があり、この後者の形態では、径及び周長に関係するパラメータの間での相関の測定値は低下する。故に、様々な表現型の間での相関のレベルを監視することにより、様々な生物学的プロセスに関する潜在的に有用な追加情報を得ることができる。
【００３４】
様々な実施形態では、相関は、所定のマルチパラメータデータ解析セットにおける表現型同士の間で行なわれるノンパラメトリックの統計学的な対単位の測定を用いることにより決定され得る。例えば、後にあらためて詳述されるコルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離測定解析を用いることができる。ＫＳ距離測定解析手法の利用は、比較的高速であるため幾つかの実施形態ではは好ましい。しかしながら、当業者は、他の様々な相関測定手法を代用し得ることを認められよう。
【００３５】
加えて、プロセッサ１１４は、並進機構（図示されていない）を制御して光源１０２のスポットプレート１０８に対する焦点位置を移動させるように構成され得る。プロセッサ１１４は例えば、かかるタスクを実行するように適当にプログラムされている従来のコンピュータシステムの一部として設けられてもよいし、ディジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、専用の特定応用向け集積回路（ＡＳＩＣ）、及び適当に構成されたファームウェア等によって設けられてもよい。
【００３６】
本発明の様々な実施形態の装置１００は、１以上のカメラを備える顕微鏡と、ハイコンテントスクリーニング装置として用いられ得るプロセッサ１１４とを含み得る。１以上のマルチパラメータデータセットによって表わされる画像は、自動解析のために装置１００によって形成されてもよいし、記憶装置から与えられてもよいし、プロセッサ１１４に送信等されてもよい。かかる自動解析を提供する様々な方法について、以下、非限定的な実例によってさらに詳細に説明する。
【００３７】
図２は、本発明の様々な態様によるマルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別する方法２００を示す。マルチパラメータデータセットは、例えば上の図１に関連して記載されている形式の装置１００を用いて与えられる画像に対応するデータを含み得る。
【００３８】
方法２００は、マルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対の間での相関を測定するステップ２０２を含んでいる。次いで、ステップ２０４において、解析パラメータセットを形成するために、所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部からの相関のあるパラメータを修正する。
【００３９】
相関のあるパラメータ値の修正は、例えばパラメータ値のゼロへの修正、又はさらに詳細な解析からのパラメータの完全除去を含めて、相関測定から導かれる１以上の因子を用いたパラメータ値の乗算又は他の演算による修正を含み得る。
【００４０】
ステップ２０６では、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、解析パラメータセットを用いてマルチパラメータデータセットを解析する。方法２００の作用範囲を提供する様々な手法については、後にあらためて詳述する。
【００４１】
方法２００を用いて、マルチパラメータデータ解析セット同士の間に変化が生じているか否かを決定することができる。例えば、方法２００を用いて、薬物誘発効果を経時的に検出することができる。これらの効果は定性化及び定量化を行なうことが可能なものであって、寸法パラメータの変化、ネクローシス、及びミトーシス（細胞分裂）等のような現象及びプロセスを含み得る。
【００４２】
方法２００は、自動画像解析例えば薬物アッセイ等でのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に用いられ得る。マルチパラメータデータセットは、顕微鏡画像のような細胞データを含み得る。本発明の様々な態様では、従来の方法とは対照的に、データ検定は、データセット内（intra-data set）方式よりも寧ろデータセット間（inter-data set）方式で実行され得る。
【００４３】
方法２００は、事前に記憶及び送信等されている画像に対して適用されてもよいし、「オンザフライ（on-the-fly）」で取得されて処理されてもよい。方法２００は、ハードウェア、ファームウェア及びソフトウェアの１又は複数を含むプロセッサを用いて具現化され得る。例えば、プロセッサは、従来のパーソナルコンピュータ（ＰＣ）、ＡＳＩＣ及びＤＳＰ等を用いていてもよいし、且つ／又は装置は方法２００を具現化するようにアップグレードされたＧＥ社のIn-Cell Miner（商標）ソフトウェアパッケージを用いたＧＥ Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）を含んでいてもよい。また、本書に記載するような付加的な作用範囲も、方法２００を具現化する様々な実施形態によって提供され得る。
【００４４】
本発明の様々な実施形態では、方法２００は、様々なソフトウェア構成要素を用いた装置によって具現化され得る。かかるソフトウェア構成要素は、例えばインターネットを介して装置に送信されるアップグレードの形態で装置に提供され得る。
【００４５】
図３は、本発明の様々な実施形態に係る二つのデータ群の間のコルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離を決定する原理を示す。
【００４６】
例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ等の方法［５］を用いることができるが、この方法自体は、パラメータ同士の間の相関を検出するために標本間ＫＳ距離を利用することも、一定範囲のパラメータにわたる表現型変化を検出するためにサマリスコアを生成する目的で標本内距離計量と組み合わせて標本間ＫＳ距離計量を利用することも教示している訳ではない。
【００４７】
ＫＳ距離測定値は、図３で分かるように二つのデータセットの内部でのデータの度数分布の比較によって容易に生成される。標準的な分布のヒストグラム（所与のデータ値についてのデータ点（すなわち細胞）の個数又は度数としてグラフ化されたデータ）の累積度数分布曲線（所与のデータ値についてのデータの累積割合（cumulative fraction）としてグラフ化されたデータ）への変換によって、複雑な分布を有する二つのデータ群を類似した関数として比較して、分布の差を累積度数関数同士の間の最大垂直距離すなわちＫＳ距離として表わすことが可能になる。
【００４８】
ＫＳ距離測定は、一つの細胞群にわたる解析パラメータの分布における正規性又は非正規性についての事前知識なしに用いることができ、不等の大きさを有するデータセット、例えば様々な数の細胞を含む二つの細胞群からのデータを比較するのに用いることができるため、ＫＳ距離を利用することにより、二つの細胞群から導かれるデータの差についての偏りのない比較計量が得られ、この計量の利用によってＨＣＳアッセイからのデータの品質が著しく向上することが判明している。
【００４９】
ＫＳ距離又は他のノンパラメトリック比較計量を利用することにより、多くの異なるパラメータを含む極めて複雑なＨＣＳデータセットを解析することが可能になり、例えば細胞に対する化合物の投与量及び／又は曝露時間の効果を、距離計量を利用して二つの群からのデータ例えば統制細胞及び薬物処理済み細胞が著しく異なっているか否かを決定することにより正確に測定することが可能になる。
【００５０】
ＨＣＳでのマルチパラメータデータの取得において生ずる一般的な問題は、画像解析によって抽出された多くの定量的なパラメータから、何れのパラメータが独立パラメータ（すなわち異なる細胞現象に関係しておりかかる現象の計量となるパラメータ）であり、何れのパラメータが相関のあるパラメータ（すなわち同じ細胞現象に関係しておりかかる現象の計量となるパラメータ）であるかを決定することにある。例えば細胞核の形態学的測定では、幾つかのパラメータは相関しているものと期待される。すなわち核の面積、長さ及び周長の測定値は全て単一の対象に関係しており幾何学的に関係付けられる。稍複雑な例では、パラメータの対又はグループが、研究者側にとっては明らかでない異なる手段によって同じ細胞現象の計量となり、故に直接的に又は間接的に相関している場合がある。従って、数学的に相関している測定パラメータと生物学的に相関している測定パラメータとの間を見分ける必要がある。
【００５１】
検出されないデータ相関は、ＨＣＡにおいて標準になりつつある多パラメータ型アッセイでの重要な問題点である。すなわち、細胞表現型は統制群に対する様々なパラメータにおける一連のＫＳ距離計量を含む表現型シグネチャーを用いて記述され画定され得るが、データ深さが大きくなると表現型差を画定するために多数のＫＳ距離計量を要求する。このような場合に、表現型変化はパラメータ同士の間の潜在的な相関の知見なしに多数のパラメータにおいて検出され得るため、データの解釈に問題が生ずる場合がある。これにより、表現型変化の過大推定が生じたり、表現型同士の間を見分けられなくなったりする場合があり、表現型のクラスタ生成又は他の順位決定に、相関のあるパラメータによる偏りが生ずる（すなわち別個のパラメータを介して同じ細胞現象を２回測定する）。
【００５２】
パラメータの相関は、相関の存在が既知であればかかるパラメータの利用価値を下落させたり無効化したりするものでは必ずしもない。例えば、上述のように、核形態に関連するパラメータは相関を呈し得ることが期待され、例えば核の径又は長さは核周長に相関する。核形状が不変である場合には２個のパラメータの間の相関も不変であるし、一つの細胞群の内部で生ずる表現型変化についての情報を与える際にはこれらのパラメータの一方の測定値は冗長となる。しかしながら、核形状が特定の処理によって変化したとすると、パラメータ同士の間の相関度は変化する可能性が高い。例えば、核が大多数円形であった形態から星形へ変化すると、星形の核は径又は長さに対して遥かに大きい周長を有するため径又は長さと周長との間の緊密な相関は著しく変化する。故に、パラメータ同士の間の相関の知見及びかかる相関の変化の検出は、ＨＣＳデータから細胞表現型の変化を正確に特性決定するために利用可能なデータを増加させる。
【００５３】
本発明の幾つかの態様による一つの方法は、標本同士の間（標本内）及び付加的に標本の内部（標本間）でのＫＳ距離、又は他の適用可能な群比較計量の測定計算を実行することにより、多パラメータ型ＨＣＡデータにおけるパラメータ相関の問題を扱うことを図る。標本間解析を新規に利用することにより、
ｉ）２以上のパラメータが相関を有しているか否かを確定する手段、
ｉｉ）標本内距離計量と標本間距離計量との組み合わせを利用して、マルチパラメータデータに基づいて表現型シグネチャーを図形的に表わす表現型マップを生成する手段、
ｉｉｉ）標本間測定を利用して、標本内測定から生成されるデータに加重して順位を決定し、一定範囲の測定パラメータにわたり二つの細胞群の間の累積差を要約する単一の表現型スコア計量を生成する手段、及び
ｉｖ）標本間距離計量を用いてパラメータ相関の変化の測定によって付加的な表現型特性決定データを与える手段
を提供する。
【００５４】
図４は、本発明の様々な実施形態では用いられる標本内ＫＳ距離決定及び標本間ＫＳ距離決定の図を示す。
【００５５】
ＫＳ距離又は他のノンパラメトリック群比較計量を用いるときに、検定標本と統制標本との間のＫＳ距離、例えば薬物に曝露された細胞群から導かれるデータと薬物を存在させない場合の等価な細胞群から導かれるデータとの間のＫＳ距離を算出することは標準的な作業である。典型的な研究では、この作業は、細胞群を検定物質に濃度を高めながら曝露して、統制群に対する各々の処理済み群について一連のＫＳ距離を別個に算出することを含み得る。
【００５６】
かかるアプローチを図４に示し、同図では、２種類の条件（Ｃ1及びＣ2）の下にある細胞群を２個のパラメータ（Ｐ1及びＰ2）について解析し、これら２個のパラメータについての標本内ＫＳ距離（ＫＳ1及びＫＳ2）を算出している。条件Ｃ1と条件Ｃ2との間で標本に生ずる表現型変化の性質に依存して、各パラメータについての標本内ＫＳ値も呼応して変化する。パラメータの分布がＣ1及びＣ2との間で著しく変化するシナリオＡでは、ＫＳ1及びＫＳ2は両方とも大きくなる。Ｃ1とＣ2との間でＰ1の分布が著しく変化するが、Ｐ2の分布は余り変化しないシナリオＢでは、ＫＳ1は大きくなりＫＳ2は小さくなる。かかる測定は標準的な作業を反映しており、複数の検定条件の下で細胞群に生ずる細胞パラメータの変化の定量的な測定を可能にする。
【００５７】
従来の解析方法について頻繁に遭遇する問題は、標本内ＫＳ距離（ＫＳ1及びＫＳ2）は検定標本と統制標本との間での個々のパラメータの分布の差についての情報を提供するが、２個のパラメータが相関を示しているか否かの指標を与えず、故に同じ現象を測定して解析に冗長性を招き得ることである。この事例がシナリオＡに示されており、ＫＳ1及びＫＳ2の両方が大きい値を与えているが、このことだけでは二つの距離計量が同じ細胞現象に関係しているのか異なる細胞現象に関係しているのかの指標を与えない。
【００５８】
本発明の幾つかの態様の方法では、ＫＳ距離又は他の適当なノンパラメトリック距離計量を含み得る標本内距離計量（すなわち異なる処理条件の下での同じパラメータの分布の比較）の利用が、同じ標本における異なるパラメータの分布を比較する付加的な標本間距離計量（すなわち同じ処理条件の下での異なるパラメータの分布の比較）の利用によって強化される。
【００５９】
これらの標本間測定が図４ではＫＳ3及びＫＳ4として示されており、これらの測定は、条件Ｃ1及びＣ2の下での測定パラメータＰ1とパラメータＰ2との間の相関度を決定する手段を提供する。シナリオＡでは、パラメータＰ1及びＰ2の両方の分布がＣ1とＣ2との間で変化しているが、両パラメータともＣ1及びＣ2において一定の相関度を示唆する類似した分布を有し、かかるシナリオＡでは標本間ＫＳ距離ＫＳ3及びＫＳ4の測定が、かかる相関を検定する手段を提供する。このシナリオでは、標本内ＫＳ距離値と標本間ＫＳ距離値との間の関係は、
【００６０】
【数１】
【００６１】
となり、標本内測定についてはＫＳ1及びＫＳ2の値が大きいのでＣ1とＣ2との間での両パラメータにおける変化が著しいことを示し、標本間測定についてはＫＳ3値及びＫＳ4値が小さいのでＣ1及びＣ2の両方での２個のパラメータの分布の間の差が類似していることを示し、Ｐ1とＰ2との間の高い相関度を示す。
【００６２】
対照的に、シナリオＢでは、Ｐ1の分布のみがＣ1とＣ2との間で著しく変化し、Ｐ2は実質的に同じ分布のままである。このシナリオでは、標本内ＫＳ距離値と標本間ＫＳ距離値との間の関係は、
【００６３】
【数２】
【００６４】
となり、標本内測定についてはＫＳ1の値が大きいのでＰ1の分布の変化がＣ1とＣ2との間で著しいことを示し、ＫＳ2の値が小さいのでＰ2の分布がＣ1及びＣ2との間で保存されていることを示し、標本間測定については、ＫＳ3値が小さいのでＰ1及びＰ2の分布が類似していることを示して、Ｃ1ではこれらのパラメータに相関があることを示すことができ、ＫＳ4の値が大きいのでＣ2ではＰ1とＰ2との間に相関が存在しないことを示す。
【００６５】
結果的に、本発明の様々な態様での方法による標本内距離計量と標本間の距離計量との組み合わせは、
ｉ）パラメータ同士の間の相関についての検定（全ての条件において小さい標本間ＫＳ距離の検出）、及び
ｉｉ）諸条件の間でのパラメータ相関の変化の強調（条件間にわたって変化する標本間ＫＳ距離の検出）
のための新たな方法を提供する。
【００６６】
第一の態様はＨＣＳでのデータ収集を最適化するときに重要なものであり、すなわち相関のあるデータ（すなわち同じ現象を異なる手段によって記述するデータ）の収集は冗長な作業であってデータ記憶及び処理時間の無駄になる。第二の態様はＨＣＳデータの情報量を最大化するときに重要なものであり、すなわち２個のパラメータが相関を変化させているとの情報は、既存のパラメータから付加的な情報を与え得る（例えば対象の寸法パラメータの相関の変動は、個々のパラメータからは自明でない対象の形態の変化に関係する情報を与え得る）。
【００６７】
当業者には、上述のような二つの条件の下であれ、また大規模ＨＣＳスクリーニングプログラムにおいて見受けられ得るように、様々な条件が異なる物質や物質の濃度に異なる時間にわたり細胞群を曝露すること又は単独で若しくは組み合わせた他の変化する条件に相当し得るようなさらに大規模な条件系列の下であれ、２個のパラメータが分布及び相関において様々な変化の程度を呈する場合に、かかる２個のパラメータの間での様々な挙動を含むさらに他のシナリオが可能であることが明らかとなろう。さらにまた、当業者には、標本内解析と標本間解析とを組み合わせたときに本発明の各態様において具現化される同じ原理を２よりも多いパラメータに対し適用することができ、但し標本間距離計算については対単位の比較の数が幾何級数的に増大する可能性があることが明らかとなろう。
【００６８】
図５は、本発明の一実施形態におけるデータパラメータと表現型マップ次元との間の関係を示す。
【００６９】
本発明の一実施形態に係る一つの方法をさらに大きいデータセットに適用したものについて図５に示す。パラメータの個数がＰである任意のＨＣＳパラメータセットについて、利用可能な対単位の標本間距離測定の数は、次の通りである。
【００７０】
【数３】
【００７１】
全Ｐ個のパラメータについてこれらの標本間距離測定（すなわち所与の処理条件における各々のパラメータの分布の間での全ての距離）を標本内距離測定（すなわち所与の処理条件における個々のパラメータの分布と統制条件の下での同じパラメータの分布との間の全ての距離）と組み合わせると、距離測定の合計数Ｍが得られる。
【００７２】
【数４】
【００７３】
式中、Ｍは、パラメータＰのセットについて全ての利用可能な距離計量を表わす表現型距離マップとしてのデータの図形的表現の次元の数であって、図５に示すようにＰの幾何学的関数として増加する。
【００７４】
典型的な表現型距離マップを４個のパラメータＰ1、Ｐ2、Ｐ3及びＰ4について図５に示す。マップの各々の軸は、ＫＳ距離測定について利用可能な範囲に対応して０から１まで目盛られており、各々の軸は、標本内計量（Ｐ1、Ｐ2、Ｐ3及びＰ4）についてのＫＳ距離値、及び６個の利用可能な標本間距離計量（Ｐ1−Ｐ2、Ｐ1−Ｐ3、Ｐ1−Ｐ4、Ｐ2−Ｐ3、Ｐ2−Ｐ4及びＰ3−Ｐ4）についてのＫＳ距離値を示す。
【実施例１】
【００７５】
多パラメータ型細胞データの生成及び解析
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５％ＦＢＳを加えたハムＦ１２培地において細胞６０００個／ウェルとしてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ９６ ｗｅｌｌ ＭａｔｒｉＰｌａｔｅに接種し、標準的な組織培養条件の下で２４時間にわたりインキュベートした。マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）溶液を培地に加えてアッセイにおける最終的な濃度を０ｍＭ〜１０ｍＭとし、細胞をさらに４８時間にわたりインキュベートした。培地をウェルから取り出して、細胞２００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、続いて室温において３０分間にわたりエタノールにおいて固定した。核を室温において１５分間にわたり５ｍＭのＨｏｅｃｈｓｔ（商標）３３３４２（Ｓｉｇｍａ社）によって染色し、細胞を２００ｍＬのＰＢＳで洗浄した。
【００７６】
細胞は、２０倍対物レンズでのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）によってｖ３．５取得ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から市販）を用いて撮影された。画像はオンライン細胞計数を用いて取得されて、最小で細胞１０００個／ウェルを取得した。画像を核の面積、長さ、周長及び加重付き慣性モーメント（ＷＭＯＩ）についてＧＥ ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ（商標）ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から市販）を用いて解析した。
【００７７】
図６は、マイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングからの典型的な画像を示す。
【００７８】
ＤＮＡ鎖切断を生ずる周知の染色体異常誘発剤であるＭＭＣによる細胞の処理は、細胞周期のＧ２期での細胞周期中断に関連する核面積の増大、ミトーシスにおける損傷を受けた染色体の誤った分離を通じた小核の形成、並びに高濃度では核断片化及び分解に関連する核の形状及び組織構造の変化等を含め、核形態に著しい変化を起こす。核の寸法、形状及び形態の変化は、図６に示すＨＣＳ画像取得からの典型的な画像において明瞭に見える。画像Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ０μＭ、０．１６μＭ及び２．５μＭのＭＭＣによって処理された細胞の典型的な核形態を示しており、画像Ｂ（０．１６μＭのＭＭＣ）の嵌め込み画像はさらに拡大した核の像であって、関連する小核が染色体異常誘発ＤＮＡ損傷から生じていることを示している。
【００７９】
４個の核形態パラメータが自動画像解析を用いて画像から抽出され、同じ濃度のＭＭＣに曝露された再現標本からのデータを組み合わせて、図７〜図１０に示すような４個のパラメータの各々についての群分布ヒストグラムを得た。図７〜図１０の各々において、１コマ目のデータは統制細胞からのものであり、２コマ目〜１２コマ目のデータはＭＭＣ０．０１μＭ〜１０μＭの範囲にわたるＭＭＣ処理細胞からのものである。
【００８０】
標本内測定を用いたデータのＫＳ距離解析（すなわちＭＭＣが存在しない場合の細胞データと、０．０１μＭ〜１０μＭの範囲にわたるＭＭＣの所与の濃度での細胞データとの間でのＫＳ距離の計算）を行ない、得られたデータを図１１に示す。このデータは、全４個の測定パラメータについてＫＳ距離の明らかな投与量依存型増大を示しており、無処理細胞に対するこれらのパラメータの著しい投与量依存型変化を示す。核の面積、長さ及び周長の３個のパラメータは、全ＭＭＣ濃度範囲にわたり殆ど同等の無処理細胞からのＫＳ距離を示した。また、ＷＭＯＩ（核の内部でのＤＮＡ染色ピクセル強度値の分布の計量）も投与量依存型変化を示したが、程度は他の３個の測定パラメータとは異なっていた。
【００８１】
全６個の可能なパラメータ対（面積−長さ、面積−ＷＭＯＩ、長さ−ＷＭＯＩ、面積−周長、長さ−周長、周長−ＷＭＯＩ）について、同じＭＭＣ濃度における２個のパラメータについてのデータ分布の間でのＫＳ距離の計算によって標本間ＫＳ距離を算出した。異種の次元を有する様々なパラメータに対してＫＳ距離計量を実行するために、下式の関数を用いてパラメータ値を０〜１の範囲に正規化した（Ｐnorm）。
【００８２】
【数５】
【００８３】
標本間ＫＳ測定の結果を図１２に示す（対単位の距離計量は次のように示す。Ａ−Ｌ：面積−長さ、Ａ−Ｗ：面積−ＷＭＯＩ、Ｌ−Ｗ：長さ−ＷＭＯＩ、Ａ−Ｐ：面積−周長、Ｌ−Ｐ：長さ−周長、Ｐ−Ｗ：周長−ＷＭＯＩ）。データは、パラメータ同士の間の関係において、限定しないが下記を含めて標本間ＫＳ距離計算によって明らかにされる多くの明瞭なパターンを示す。
ｉ）面積及び長さ（Ａ−Ｌ）は、全ＭＭＣ濃度範囲にわたって一定の小さいＫＳ距離を示し、これら２個のパラメータが高い相関度を有する類似した分布を示していることを示す。これら二つの形態学的計量は両方とも核寸法によって直接影響されるため、このデータは、核はＭＭＣ処理後に寸法が増大しているが、面積と長さとの間の関係を変化させる形態学的変化（例えば円形から卵形への変化）を蒙っていないことを示す。
ｉｉ）長さ及びＷＭＯＩ（Ｌ−Ｗ）は、ＭＭＣ濃度範囲の殆どにわたって一定の高いＫＳ距離を示し、これら２個のパラメータが低い相関度を有すること、すなわち核の内部でのＤＮＡ強度分布が核長さには関係していないことを示す。
ｉｉｉ）周長及びＷＭＯＩ（Ｐ−Ｗ）は、これらのパラメータについて標本内ＫＳ距離の場合に観察されたものと反対の態様でのＫＳ距離の投与量依存型の変化を示し、すなわち周長分布とＷＭＯＩ分布との間での標本間ＫＳ距離がＭＭＣ濃度と共に減少しており、これら２個のパラメータが、低投与量においては相関していないが高投与量においては相関するようになり、増加する核周長とＤＮＡ分布との間の何らかの形態の関係性が絡んだ表現型の変化を示唆している。
ｉｖ）面積及び周長（Ａ−Ｗ）は、低ＭＭＣ濃度及び高ＭＭＣ濃度において小さいＫＳ標本間距離を示し、中間的な濃度ではＫＳ距離の増大を示し、低いＭＭＣ濃度、中間的なＭＭＣ濃度及び高いＭＭＣ濃度において２種又は３種の表現型クラスが生じている可能性を示す。
【００８４】
ＤＮＡ損傷を誘発するＭＭＣのような薬剤による細胞の処理が、細胞の内部で生じる複雑な事象系列を導いてＭＭＣ濃度に関係付けられる一定範囲の表現型を帰結することは周知である。低濃度では、細胞はＤＮＡ損傷を修復することができ、細胞周期の進行には殆ど又は全く影響を与えず、核形態及び小核形成には小さい変動しか生じない。高いＭＭＣ濃度では、結果的にさらに高レベルのＤＮＡ損傷が生じており、この損傷が細胞に対してさらに大きいＤＮＡ修復負担を課し、著しい細胞周期遅延及び小核形成の増大、並びに核構造の他の変化を帰結する。さらに一層高いＭＭＣ投与量ではＤＮＡ損傷の範囲が十分に高くなるためこのことをきっかけとして細胞がアポトーシスを経て、核形態の甚だしい変化及び核分解を伴う。
【００８５】
これらの相互に関係するプロセスの全てがＭＭＣ処理された細胞に極めて複雑な事象の系列を生じさせ、ＭＭＣの様々な濃度において観察される表現型に対して直接的に又は間接的に影響する。細胞の大規模な群の内部で生ずる事象の複雑さは、標本内群データ分布のような従来の解析的アプローチでは十分に明らかではない（図１１）。付加的な標本間群データ分布比較計量を用いた本発明の各態様による方法の適用（図１２）によって、従来の解析では明らかでない表現型変化を示すデータのパターンが明らかになる。
【００８６】
標本内距離計量と標本間距離計量との組み合わせを用いて、様々な処理条件での測定パラメータの変動及び相互関係を要約する表現型マップ（図１３）を生成することができる。かかるマップによって、投与量−応答プロットのような従来の図形的表現では十分に明らかでなかったＨＣＳ解析データの傾向及び相互関係の速やかな視覚的同化が可能になる。
【００８７】
前述で図５に示すように、表現型距離マップの複雑さは解析されるパラメータの個数と共に幾何級数的に増大するが、これらの複雑なマップを図１４に示すように一連のより単純な要素に分解してさらに詳細な解析を支援することができる。
【００８８】
最も単純な場合（図１４のＡ）では、３個のパラメータから導かれる表現型マップが３本の軸を有し、パラメータ（Ｐ1及びＰ2）の各々について標本内距離計量に１本ずつであり、１本は利用可能な対単位の標本間距離計量（Ｐ1−Ｐ2）のみについてのものである。解析されるパラメータの個数が３まで増大すると、マップの複雑さが少し増大して（図１４のＢ）６本の軸となり、パラメータ（Ｐ1、Ｐ2及びＰ3）の各々について標本内距離計量に１本ずつであり、３本は対単位の標本間距離計量（Ｐ1−Ｐ2、Ｐ1−Ｐ3及びＰ2−Ｐ3）についてのものである。解析されるパラメータの個数がさらに増大すると、距離マップ軸の本数は増大して、前述のように軸の本数Ｍは式４によってパラメータＰの数に関係付けられる。
【００８９】
パラメータの個数及び結果的な表現型距離マップの複雑さのレベルを問わず、任意のかかるマップを分解して、各々が単一の対単位の比較を表わす一定数の単純な成分にすることができる。故に、図１４に示すように、３個のパラメータの解析から導かれるＭ＝６（図１４のＢ）であるマップを分解して、一連の成分要素Ｂ1、Ｂ2及びＢ3にすることができる。次元Ｍの任意の所与の表現型マップについて、成分要素の個数は式３によって定義されるようなものとなる。
【００９０】
表現型マップを対単位の比較に基づく成分に分解すると、個々の対に対し、当該パラメータ対についての標本内距離スコア（Ｄ）及び標本間距離スコア（ｄ）に基づく表現型変化スコア（Ｓ）を与えることが可能になる。
【００９１】
【数６】
【００９２】
式中、スコアは当該対について算出される標本間距離に基づく加重を施され、すなわち大きい標本間距離を有して相関の欠如を示す２個のパラメータは、低い標本間距離スコアを付けられた同じパラメータ値よりも高いスコアを生成する。
【００９３】
１よりも多い成分を含む複雑なマップでは、これらのスコアを各々の成分について算出することができ、個々のスコアを加算してＨＣＳ解析において測定される全てのパラメータを考慮に入れた累積スコアを求めることにより、全体的な表現型変化スコアを算出することができる。一定範囲のＭＭＣ濃度によって処理されて四つの核形態パラメータについて解析された細胞の累積表現型スコアを図１５に示す。
【００９４】
当業者には、本発明の各態様による方法に記載されているように標本内ＫＳ距離計量と標本間ＫＳ距離計量とを組み合わせる原理に基づいて、さらに他の形式のデータ比較及び累積スコア決定が可能であることが容易に理解されよう。例えば、パラメータ同士の間の相関度を確定するために、異なるパラメータ同士の間でのＫＳ距離計量を統制群において求めた基準標本間距離計量を付加的に含めると、さらに詳細な対単位の比較及び表現型スコア決定を施すことが可能になる。
【００９５】
この統制群標本間距離計量という付加的な因子を用いると、パラメータの個々の対に対し、統制群の標本間距離スコア（ｄc）及び処理済み群の標本間距離スコア（ｄt）の両方と組み合わせた両パラメータについての標本内距離スコア（Ｄ）に基づいて下式の表現型変化スコア（Ｓ）を与えることが可能になり、ここでのスコアは２種の条件の下でのパラメータの相関度を考慮に入れたものとなる。
【００９６】
【数７】
【００９７】
このアプローチは、一定範囲の条件にわたる相関変化を考慮に入れることを可能にする。例えば、２個のパラメータが統制標本でも検定標本でも相関していない（ｄc及びｄtが両方とも高い）ようなシナリオでは得られるスコアが最大になり、２個のパラメータが統制標本及び検定標本の何れでも相関している場合（ｄc及びｄtが両方とも低い）に得られるスコアが最小になることと対照的である。
【００９８】
全てのパラメータ対についてこの演算を実行し、加算して累積スコアを生成すると、測定された全てのＨＣＳパラメータに基づいてデータを要約する方法が与えられる。
【００９９】
以上の方法、及び本発明の他の関係する実施形態は、標本間の群分布距離計量及び標本内の群分布距離計量の両方の利用を包含しており、極めて複雑なＨＣＳデータセットを、大規模スクリーニングプログラムにわたり容易に比較され得る計量として統合して要約することができる。本発明の様々な態様及び実施形態の方法は、薬物、ＲＮＡｉ又は他の大規模スクリーニングプログラムの評価に有用であり、かかる方法によるマルチパラメータデータの統合によって、組み合わされた表現型パラメータに基づいてスクリーニングヒットを識別することが可能になり、また異なる表現型クラスを生成する異なる処理効果を異なる累積表現型スコアによって識別して分離することが可能になる。
【０１００】
最終的な解析パラメータセットから相関のあるパラメータを除去することにより、本発明の様々な態様及び実施形態は、例えば小規模な解析を実行し、相関のあるパラメータを決定し、次いで相関のあるパラメータを、より大規模な解析のために後に用いられる解析パラメータセットから省くことにより、解析効率を高めることができる。
【０１０１】
本発明の様々な態様及び実施形態はまた、又は代替的に、測定された相関に関してパラメータ値を修正する際に、相関のあるパラメータが表現型スコア（１又は複数）に過大な影響を及ぼさないように表現型スコアが記述パラメータの加重付き集計を含むようにして、修正されるパラメータを保ったまま修正することを可能にする。
【０１０２】
本発明を様々な実施形態に関して記載したが、当業者は、多くの異なる実施形態及び変形が可能であることを認められよう。かかる全ての変形及び実施形態は、特許請求の範囲によって画定される本発明の範囲内に含まれるものとする。
【０１０３】
参考文献
1. S. A. Haney, P. LaPan, J. Pan and J. Zhang, “High-content screening moves to the front of the line,” Drug Discovery Today, Vol. 11, No. 19-20, pp. 889-894, October 2006
2. S. Siegel and N. J. Castellan, Non-Parametric Statistics for the Behavioural Sciences, McGraw-Hill, New York, USA, 2nd Edition, 1988
3. Z. E. Perlman, M. D. Slack, Y. Feng, T. J. Mitchison, L. F. Wu and S. J. Altschuler, “Multidimensional drug profiling by automated microscopy,” Science, Vol. 306, pp. 1194-1198, 12 November 2004
4. B. Zhang, X. Gu, U. Uppalapati, M. A. Ashwell, D. S. Leggett and C. J. Li, “High-content fluorescent-based assay for screening activators of DNA damage checkpoint pathways,” Journal of Biomolecular Screening, Vol. 13, No. 6, pp. 538-543, 19 June 2008
5. US 2006/0154236 (Altschuler et al)
認められる場合には以上の参考文献の内容を参照により全体として本出願に援用する。
【符号の説明】
【０１０４】
１００：自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）装置
１０２：光源
１０４：集光装置
１０６：開口絞り
１０８：鏡検プレート
１０９：ウェル（スポット）
１１０：対物レンズ
１１２：検出器システム
１１４：プロセッサ
１２０ａ、１２０ｂ：光
１２０ｃ：発散光
１２０ｄ：集束光
２００：マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別する方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には、マルチパラメータデータの解析の方法及び装置に関する。さらに具体的には、本発明は、１以上の表現型を識別するためのマルチパラメータデータの解析に関する。かかる表現型を用いて、本発明の様々な実施形態を、例えば生物学的細胞画像解析を用いる自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＳ、すなわち自動細胞内イメージング及び画像解析の細胞信号伝達経路及びプロセスの研究への応用［１］は、極めて情報量の多い生物学的データを生成する高速で対費用効果の高い手段として産学で広く採用されている。ＨＣＳは研究者に対し、インサイツ及び状況での細胞生物学の詳細な研究のための強力な技術及び応用を提供し、結果として、大規模なマルチパラメータデータセットを例えば様々なそれぞれの画像に対応して生成する。
【０００３】
多くの研究において、このデータの完全な可能性は十分に開発され又は活用されるに至っていない。平均及び標準偏差の利用のような標準的なデータ解析及び比較方法がハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）で常用されているが、これらの方法は細胞群応答を平均することによりＨＣＳデータにおける潜在的なパターン及び傾向を不明確にする。
【０００４】
この不明確化の単純な例が化学的阻害剤又はＲＮＡｉ研究において生じており、例えばＨＴＳ尺度によって平均応答として測定された５０％の低下が、全ての細胞における５０％阻害を表わしている場合もあれば、或いは細胞の５０％で１００％阻害であり残りは影響を受けていないことを表わしている場合もある。
【０００５】
この状況は、細胞の強度データ又は空間的データの典型的な分布（正規分布している場合もあるが稀である）によってさらに悪化し、このように平均及び標準偏差はデータ分布の記述子としては不十分になっている。
【０００６】
結果的に、平均化された応答に基づく標本間でのＨＣＳデータの比較は、データを十分に活用しないばかりか多くの場合に不正確である可能性が高い。
【０００７】
標準的なデータ平均化手法の制限から、ＨＣＳデータにおいて細胞群のデータ及び分布を比較するために、コルモゴロフ−スミルノフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ）（ＫＳ）距離［２］の利用のような様々なノンパラメトリック解析方法が採用されるようになってきた［３，４］。
【０００８】
例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ等は、画像処理ソフトウェアからの自動データ収集及びこのデータの統計解析に基づく細胞の解析のための方法及びシステムを記載している［５］。記載されている方法は、標本内ＫＳ距離を群差の計量として利用すること、及び群内での記述子のばらつきの計量（例えば標準偏差）によって除算することによりＫＳ距離を正規化する手段を含んでいる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１５４２３６号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】S. A. Haney, P. LaPan, J. Pan and J. Zhang, “High-content screening moves to the front of the line,” Drug Discovery Today, Vol. 11, No. 19-20, pp. 889-894, October 2006
【非特許文献２】S. Siegel and N. J. Castellan, Non-Parametric Statistics for the Behavioural Sciences, McGraw-Hill, New York, USA, 2nd Edition, 1988
【非特許文献３】Z. E. Perlman, M. D. Slack, Y. Feng, T. J. Mitchison, L. F. Wu and S. J. Altschuler, “Multidimensional drug profiling by automated microscopy,” Science, Vol. 306, pp. 1194-1198, 12 November 2004
【非特許文献４】B. Zhang, X. Gu, U. Uppalapati, M. A. Ashwell, D. S. Leggett and C. J. Li, “High-content fluorescent-based assay for screening activators of DNA damage checkpoint pathways,” Journal of Biomolecular Screening, Vol. 13, No. 6, pp. 538-543, 19 June 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、かかるノンパラメトリックデータ解析方法の利用は従来の手法の改善ではあるが、特にＨＣＳ／ＨＴＳによって典型的に生成される極めて大規模なマルチパラメータデータセットを解析するためにはさらに高速でさらに正確なデータ解析手法に対する必要性が依然存在している。
【００１２】
従って、本発明は、従来のデータ解析方法に関連する以上に述べた欠点に鑑みて考案されたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第一の態様では、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別する方法が提供される。この方法は、マルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対の間での相関を測定するステップと、解析パラメータセットを形成するために、所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正するステップと、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、上述の解析パラメータセットを用いてマルチパラメータデータセットを解析するステップとを含んでいる。
【００１４】
本発明の第二の態様では、１以上のマルチパラメータデータセットの自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）のための装置が提供される。この装置は、マルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対の間での相関を測定するように動作可能なプロセッサを含んでいる。プロセッサはまた、解析パラメータセットを形成するために、マルチパラメータデータセットについて所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正し、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、上述の解析パラメータセットを用いてマルチパラメータデータセットを解析するように動作可能である。
【００１５】
所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部での相関のあるパラメータ値の修正は、例えばパラメータ値のゼロへの修正、又はさらに詳細な解析からのパラメータ除去を含めて、相関測定から導かれる１以上の因子を用いたパラメータ値の乗算又は他の演算による修正を含み得る。
【００１６】
独立なパラメータすなわち実質的に相関のないパラメータで形成される解析パラメータセットから表現型を決定することにより、全体的なデータ処理時間が短縮される。
【００１７】
また、この手法は加えて、表現型のさらに正確な測定を提供し、これにより、例えばＨＣＳ／ＨＴＳシステムにおいて改善された特徴認識を高速で自動的に行なうことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
以下、本発明の様々な態様及び実施形態を添付図面に関連して記載する。
【図１】本発明の一実施形態に係る１以上のマルチパラメータデータセットの自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）のための装置を示す図である。
【図２】本発明の様々な態様によるマルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別する方法を示す図である。
【図３】本発明の様々な実施形態に係る二つのデータ群の間でのコルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離を決定する原理を示す図である。
【図４】本発明の様々な実施形態に用いられる標本内及び標本間でのＫＳ距離決定の図である。
【図５】本発明の一実施形態でのデータパラメータと表現型マップ次元との間の関係を示す図である。
【図６】本発明の一態様による解析のためのデータを導くのに用いられるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングからの典型的な画像を示す図である。
【図７】本発明の一態様による解析のためのデータを導くのに用いられるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる核面積データを示す図である。
【図８】本発明の一態様による解析のためのデータを導くのに用いられるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる核周長データを示す図である。
【図９】本発明の一態様による解析のためのデータを導くのに用いられるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる核加重付き相対慣性モーメントデータを示す図である。
【図１０】本発明の一態様による解析のためのデータを導くのに用いられるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる核長さデータを示す図である。
【図１１】本発明の一態様によるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる標本内ＫＳ距離計量データを示す図である。
【図１２】本発明の一態様によるマイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングから導かれる標本間ＫＳ距離計量データを示す図である。
【図１３】本発明の一態様による標本内及び標本間のＫＳ距離測定から導かれる表現型マップを示す図である。
【図１４】本発明の一態様による表現型マップの小成分への分解を示す図である。
【図１５】本発明の一態様によるＭＭＣの濃度を高めながら処理された細胞の表現型マップから導かれる表現型スコアを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図１は、本発明の一実施形態に係る１以上のマルチパラメータデータセットの自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）の装置１００を示す。装置１００は分かり易くするために概略図示されており、光１２０ａを発生する光源１０２を含んでいる。
【００２０】
光１２０ａは集光装置１０４によって集束させられて鏡検プレート１０８に入射する。鏡検プレート１０８は、撮影されるウェル又はスポット１０９のアレイを含み得る。集光装置１０４は、光１２０ｂを鏡検プレート１０８において焦平面に集束させることができる。鏡検プレート１０８は消耗品として提供されることができ、スポット１０９は幾つかの形式の細胞（例えば哺乳動物細胞）と相互作用することが可能な様々な物質を含み得る。
【００２１】
様々な実施形態では、鏡検プレート１０８は、装置１００の内部で当該鏡検プレート１０８を整列させる助けとなるように設けられた少なくとも一つの基準目印（図示されていない）を含み得る。例えば、１以上の着色染料をスポット１０９の内部に設けることができる。かかる着色染料は、装置１００の内部での鏡検プレート１０８の相対的な位置決めに関するデータを導くために、様々なイメージングシステムによって識別され得る。例えば、装置１００は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（英国バッキンガムシャー州リトルチャルフォント）から市販のＧＥ Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）であってよく、この装置は四つの色チャネルを用いて画像鏡検プレート１０８を撮影することができる。従って、装置１００の内部での鏡検プレート１０８の配置に関するデータを得るために、一つの色チャネルを様々なスポット１０９に設けられている色付きの基準目印を撮影するための専用にすることができる。
【００２２】
装置１００はまた、検出器システム１１２及び並進機構（図示されていない）を含んでいる。並進機構は、光１２０ｂの焦点を鏡検プレート１０８に対して移動させる（例えば鏡検プレート１０８をｘｙ平面において移動させることにより）ように構成されている。これにより、複数の画像を個々のスポット１０９のそれぞれから取得することが可能になる。加えて、並進機構はまた、例えばスポット１０９に焦点を合わせるために図１に示すｚ方向において鏡検プレート１０８を移動させるように動作可能であってもよい。
【００２３】
幾つかの実施形態については、一度に１個のスポットのみが撮影される。取得される画像は、細胞及び細胞レベル以下の形態を分解するのに十分な拡大率を有する。現状のＧＥ Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）では、このために単一のスポットよりも僅かに小さい視野を有する２０倍の対物レンズを利用する場合がある。しかしながら、本発明の様々な方法は、例えばＧＥ Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）において４倍の対物レンズを用いて４個〜６個スポット／画像で撮影する相対的に低倍率での拡大撮影にも対応する。
【００２４】
開口絞り１０６が光源１０２と検出器システム１１２との間に選択随意で設けられ、開口絞り１０６の寸法は可変であってよい。例えば、様々な異なる寸法の可動式開口を所定位置まで回転させてもよいし、連続可変式のアイリス型ダイヤフラムを設けてもよい。画像コントラストは、開口絞り１０６の開口設定を変化させることにより制御され得る。
【００２５】
開口絞り１０６を通過した集束光１２０ｂは、透過撮影モードでは標本鏡検プレート１０８を通過する。個々のスポット１０９に隣接する物質に関係する画像情報と共に変調を受けた発散光１２０ｃが対物レンズ１１０によって収集され、集束させられて１２０ｄ検出器システム１１２に入射し、この光を用いて該当スポット１０９についての原画像を形成する。
【００２６】
本発明の方法の様々な実施形態は用いられる撮影モダリティに独立であり、例えば透過型の幾何学的構成でも反射型の幾何学的構成でも作用し得る。ＧＥ Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）での撮影の場合には、落射型蛍光モードを用いることができ、基準目印スポット及び細胞からのアッセイ信号の両方が異なる励起波長及び放出波長において撮影される。しかしながら、干渉し合わない限り混成撮影モードを展開することを妨げるものは原則として存在しない。例えば、基準目印を付けるために非蛍光染料を用い、落射蛍光によってアッセイ信号を検出しながら反射型又は透過型の幾何学的構成において吸光度によって基準目印を検出することも可能である。
【００２７】
検出器システム１１２は、鏡検プレート１０８から複数の画像を取得するように動作可能であり、各々の画像がそれぞれのマルチパラメータデータセットとして電子形態で表わされ得る。例えば、それぞれの異なるスポット１０９又は異なる時間点での同じスポット１０９の画像を各々表わす幾つかのマルチパラメータデータセットを得ることができる。このようにして、隣り合ったスポット１０９の間の差又は同じスポット１０９の範囲内で生ずる時間的変化を解析することができる。
【００２８】
また、検出器システム１１２は、プロセッサ１１４に結合されて動作可能であり、次にプロセッサ１１４はマルチパラメータデータセットを処理するように動作可能である。プロセッサ１１４は、一つのマルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対（ペア）の間での相関を測定するように動作可能である。例えば、細胞の周長、径及び楕円率等のようなパラメータを対単位の態様で評価して、両者の間の定量化された相関度を決定することができる。
【００２９】
次いで、プロセッサ１１４は、解析パラメータセットを形成するために、マルチパラメータデータセットについて所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正するように動作可能である。所定のマルチパラメータデータ解析セットは、例えば特定の細胞画像について測定され得る全てのパラメータのリストを含み得る。次いで、かかるリストを、例えば所定の値よりも大きい相関閾値を有する一対のパラメータの一方を除去するようにプロセッサ１１４によって整理することができる。例えば、プロセッサ１１４は、細胞特徴の周長及び径が９５％を上回る相関を有すると決定することができ、このようにしてマルチパラメータデータセットから、決定されるべきパラメータとしては周長を除去する。適当に改訂された決定されるべきパラメータのリストが解析パラメータセットとして記憶される。
【００３０】
プロセッサ１１４はまた、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、解析パラメータセットを用いてマルチパラメータデータセットを解析するように動作可能である。例えば、プロセッサ１１４は、各々の適当な細胞特徴毎に、解析パラメータセットにおいて各々のパラメータの値を逐次決定することができる。かかる細胞特徴がマルチパラメータデータセットによって画定される画像において多数回にわたり生ずる場合には、元の所定のマルチパラメータデータ解析セットを整理すれば、データ処理のオーバヘッドが確実に減少する。これにより、マルチパラメータデータセットの解析が高速化する。加えて、様々な特徴の識別も、最終的なマルチパラメータデータセット解析からのあらゆる相関のあるパラメータの除去によって統計学的に改善される。また、かかる手法はまた、必ずしも予め決められているのではなく解析されているデータに適応させることができるように、データ解析に用いられるパラメータの動的／自動修正を提供する。
【００３１】
さらに、プロセッサ１１４は、複数のマルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別して、表現型同士の間の変動を識別するためにマルチパラメータデータセットからのそれぞれの表現型を比較するように動作可能であり得る。例えば、プロセッサ１１４を用いて、一つの画像からの表現型をもう一つの画像の表現型と比較することができる。かかる手法は、スポット１０９に与えられている細胞の統制（対照）標本を、スポット１０９の他のものに与えられている類似しているが処理済みの細胞と比較することを可能にする。
【００３２】
装置１００についての有利なオプションは、複数のマルチパラメータデータセットについて１以上のそれぞれの解析パラメータセットを形成し、相関関係がマルチパラメータデータセットの間で保たれているか否かを決定するためにこれらの解析パラメータセットを比較するようにさらに動作可能なプロセッサ１１４を設けるものである。様々なパラメータの間で相関に空間的な変動（例えばスポット１０９のアレイにわたる）及び／又は時間的な変動が生じているか否かを決定することにより、従来は利用可能でない追加情報を得ることができる。
【００３３】
例えば、細胞核が死んで（例えばアポトーシスを介して）、小断片に分割される場合がある。これらの断片は一般的には、同じ全体的形状（例えば円形及び卵形等）を有し得る。この場合には、撮影された径及び周長に関係するパラメータは、当初の細胞核及び断片の両方について相対的に高い相関度を有する。しかしながら、アポトーシスのプロセスで、核が形状を変化させて放射状（星形）の形態になる場合があり、この後者の形態では、径及び周長に関係するパラメータの間での相関の測定値は低下する。故に、様々な表現型の間での相関のレベルを監視することにより、様々な生物学的プロセスに関する潜在的に有用な追加情報を得ることができる。
【００３４】
様々な実施形態では、相関は、所定のマルチパラメータデータ解析セットにおける表現型同士の間で行なわれるノンパラメトリックの統計学的な対単位の測定を用いることにより決定され得る。例えば、後にあらためて詳述されるコルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離測定解析を用いることができる。ＫＳ距離測定解析手法の利用は、比較的高速であるため幾つかの実施形態ではは好ましい。しかしながら、当業者は、他の様々な相関測定手法を代用し得ることを認められよう。
【００３５】
加えて、プロセッサ１１４は、並進機構（図示されていない）を制御して光源１０２のスポットプレート１０８に対する焦点位置を移動させるように構成され得る。プロセッサ１１４は例えば、かかるタスクを実行するように適当にプログラムされている従来のコンピュータシステムの一部として設けられてもよいし、ディジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、専用の特定応用向け集積回路（ＡＳＩＣ）、及び適当に構成されたファームウェア等によって設けられてもよい。
【００３６】
本発明の様々な実施形態の装置１００は、１以上のカメラを備える顕微鏡と、ハイコンテントスクリーニング装置として用いられ得るプロセッサ１１４とを含み得る。１以上のマルチパラメータデータセットによって表わされる画像は、自動解析のために装置１００によって形成されてもよいし、記憶装置から与えられてもよいし、プロセッサ１１４に送信等されてもよい。かかる自動解析を提供する様々な方法について、以下、非限定的な実例によってさらに詳細に説明する。
【００３７】
図２は、本発明の様々な態様によるマルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別する方法２００を示す。マルチパラメータデータセットは、例えば上の図１に関連して記載されている形式の装置１００を用いて与えられる画像に対応するデータを含み得る。
【００３８】
方法２００は、マルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対の間での相関を測定するステップ２０２を含んでいる。次いで、ステップ２０４において、解析パラメータセットを形成するために、所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部からの相関のあるパラメータを修正する。
【００３９】
相関のあるパラメータ値の修正は、例えばパラメータ値のゼロへの修正、又はさらに詳細な解析からのパラメータの完全除去を含めて、相関測定から導かれる１以上の因子を用いたパラメータ値の乗算又は他の演算による修正を含み得る。
【００４０】
ステップ２０６では、マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、解析パラメータセットを用いてマルチパラメータデータセットを解析する。方法２００の作用範囲を提供する様々な手法については、後にあらためて詳述する。
【００４１】
方法２００を用いて、マルチパラメータデータ解析セット同士の間に変化が生じているか否かを決定することができる。例えば、方法２００を用いて、薬物誘発効果を経時的に検出することができる。これらの効果は定性化及び定量化を行なうことが可能なものであって、寸法パラメータの変化、ネクローシス、及びミトーシス（細胞分裂）等のような現象及びプロセスを含み得る。
【００４２】
方法２００は、自動画像解析例えば薬物アッセイ等でのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に用いられ得る。マルチパラメータデータセットは、顕微鏡画像のような細胞データを含み得る。本発明の様々な態様では、従来の方法とは対照的に、データ検定は、データセット内（intra-data set）方式よりも寧ろデータセット間（inter-data set）方式で実行され得る。
【００４３】
方法２００は、事前に記憶及び送信等されている画像に対して適用されてもよいし、「オンザフライ（on-the-fly）」で取得されて処理されてもよい。方法２００は、ハードウェア、ファームウェア及びソフトウェアの１又は複数を含むプロセッサを用いて具現化され得る。例えば、プロセッサは、従来のパーソナルコンピュータ（ＰＣ）、ＡＳＩＣ及びＤＳＰ等を用いていてもよいし、且つ／又は装置は方法２００を具現化するようにアップグレードされたＧＥ社のIn-Cell Miner（商標）ソフトウェアパッケージを用いたＧＥ Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）を含んでいてもよい。また、本書に記載するような付加的な作用範囲も、方法２００を具現化する様々な実施形態によって提供され得る。
【００４４】
本発明の様々な実施形態では、方法２００は、様々なソフトウェア構成要素を用いた装置によって具現化され得る。かかるソフトウェア構成要素は、例えばインターネットを介して装置に送信されるアップグレードの形態で装置に提供され得る。
【００４５】
図３は、本発明の様々な実施形態に係る二つのデータ群の間のコルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離を決定する原理を示す。
【００４６】
例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ等の方法［５］を用いることができるが、この方法自体は、パラメータ同士の間の相関を検出するために標本間ＫＳ距離を利用することも、一定範囲のパラメータにわたる表現型変化を検出するためにサマリスコアを生成する目的で標本内距離計量と組み合わせて標本間ＫＳ距離計量を利用することも教示している訳ではない。
【００４７】
ＫＳ距離測定値は、図３で分かるように二つのデータセットの内部でのデータの度数分布の比較によって容易に生成される。標準的な分布のヒストグラム（所与のデータ値についてのデータ点（すなわち細胞）の個数又は度数としてグラフ化されたデータ）の累積度数分布曲線（所与のデータ値についてのデータの累積割合（cumulative fraction）としてグラフ化されたデータ）への変換によって、複雑な分布を有する二つのデータ群を類似した関数として比較して、分布の差を累積度数関数同士の間の最大垂直距離すなわちＫＳ距離として表わすことが可能になる。
【００４８】
ＫＳ距離測定は、一つの細胞群にわたる解析パラメータの分布における正規性又は非正規性についての事前知識なしに用いることができ、不等の大きさを有するデータセット、例えば様々な数の細胞を含む二つの細胞群からのデータを比較するのに用いることができるため、ＫＳ距離を利用することにより、二つの細胞群から導かれるデータの差についての偏りのない比較計量が得られ、この計量の利用によってＨＣＳアッセイからのデータの品質が著しく向上することが判明している。
【００４９】
ＫＳ距離又は他のノンパラメトリック比較計量を利用することにより、多くの異なるパラメータを含む極めて複雑なＨＣＳデータセットを解析することが可能になり、例えば細胞に対する化合物の投与量及び／又は曝露時間の効果を、距離計量を利用して二つの群からのデータ例えば統制細胞及び薬物処理済み細胞が著しく異なっているか否かを決定することにより正確に測定することが可能になる。
【００５０】
ＨＣＳでのマルチパラメータデータの取得において生ずる一般的な問題は、画像解析によって抽出された多くの定量的なパラメータから、何れのパラメータが独立パラメータ（すなわち異なる細胞現象に関係しておりかかる現象の計量となるパラメータ）であり、何れのパラメータが相関のあるパラメータ（すなわち同じ細胞現象に関係しておりかかる現象の計量となるパラメータ）であるかを決定することにある。例えば細胞核の形態学的測定では、幾つかのパラメータは相関しているものと期待される。すなわち核の面積、長さ及び周長の測定値は全て単一の対象に関係しており幾何学的に関係付けられる。稍複雑な例では、パラメータの対又はグループが、研究者側にとっては明らかでない異なる手段によって同じ細胞現象の計量となり、故に直接的に又は間接的に相関している場合がある。従って、数学的に相関している測定パラメータと生物学的に相関している測定パラメータとの間を見分ける必要がある。
【００５１】
検出されないデータ相関は、ＨＣＡにおいて標準になりつつある多パラメータ型アッセイでの重要な問題点である。すなわち、細胞表現型は統制群に対する様々なパラメータにおける一連のＫＳ距離計量を含む表現型シグネチャーを用いて記述され画定され得るが、データ深さが大きくなると表現型差を画定するために多数のＫＳ距離計量を要求する。このような場合に、表現型変化はパラメータ同士の間の潜在的な相関の知見なしに多数のパラメータにおいて検出され得るため、データの解釈に問題が生ずる場合がある。これにより、表現型変化の過大推定が生じたり、表現型同士の間を見分けられなくなったりする場合があり、表現型のクラスタ生成又は他の順位決定に、相関のあるパラメータによる偏りが生ずる（すなわち別個のパラメータを介して同じ細胞現象を２回測定する）。
【００５２】
パラメータの相関は、相関の存在が既知であればかかるパラメータの利用価値を下落させたり無効化したりするものでは必ずしもない。例えば、上述のように、核形態に関連するパラメータは相関を呈し得ることが期待され、例えば核の径又は長さは核周長に相関する。核形状が不変である場合には２個のパラメータの間の相関も不変であるし、一つの細胞群の内部で生ずる表現型変化についての情報を与える際にはこれらのパラメータの一方の測定値は冗長となる。しかしながら、核形状が特定の処理によって変化したとすると、パラメータ同士の間の相関度は変化する可能性が高い。例えば、核が大多数円形であった形態から星形へ変化すると、星形の核は径又は長さに対して遥かに大きい周長を有するため径又は長さと周長との間の緊密な相関は著しく変化する。故に、パラメータ同士の間の相関の知見及びかかる相関の変化の検出は、ＨＣＳデータから細胞表現型の変化を正確に特性決定するために利用可能なデータを増加させる。
【００５３】
本発明の幾つかの態様による一つの方法は、標本同士の間（標本内）及び付加的に標本の内部（標本間）でのＫＳ距離、又は他の適用可能な群比較計量の測定計算を実行することにより、多パラメータ型ＨＣＡデータにおけるパラメータ相関の問題を扱うことを図る。標本間解析を新規に利用することにより、
ｉ）２以上のパラメータが相関を有しているか否かを確定する手段、
ｉｉ）標本内距離計量と標本間距離計量との組み合わせを利用して、マルチパラメータデータに基づいて表現型シグネチャーを図形的に表わす表現型マップを生成する手段、
ｉｉｉ）標本間測定を利用して、標本内測定から生成されるデータに加重して順位を決定し、一定範囲の測定パラメータにわたり二つの細胞群の間の累積差を要約する単一の表現型スコア計量を生成する手段、及び
ｉｖ）標本間距離計量を用いてパラメータ相関の変化の測定によって付加的な表現型特性決定データを与える手段
を提供する。
【００５４】
図４は、本発明の様々な実施形態では用いられる標本内ＫＳ距離決定及び標本間ＫＳ距離決定の図を示す。
【００５５】
ＫＳ距離又は他のノンパラメトリック群比較計量を用いるときに、検定標本と統制標本との間のＫＳ距離、例えば薬物に曝露された細胞群から導かれるデータと薬物を存在させない場合の等価な細胞群から導かれるデータとの間のＫＳ距離を算出することは標準的な作業である。典型的な研究では、この作業は、細胞群を検定物質に濃度を高めながら曝露して、統制群に対する各々の処理済み群について一連のＫＳ距離を別個に算出することを含み得る。
【００５６】
かかるアプローチを図４に示し、同図では、２種類の条件（Ｃ1及びＣ2）の下にある細胞群を２個のパラメータ（Ｐ1及びＰ2）について解析し、これら２個のパラメータについての標本内ＫＳ距離（ＫＳ1及びＫＳ2）を算出している。条件Ｃ1と条件Ｃ2との間で標本に生ずる表現型変化の性質に依存して、各パラメータについての標本内ＫＳ値も呼応して変化する。パラメータの分布がＣ1及びＣ2との間で著しく変化するシナリオＡでは、ＫＳ1及びＫＳ2は両方とも大きくなる。Ｃ1とＣ2との間でＰ1の分布が著しく変化するが、Ｐ2の分布は余り変化しないシナリオＢでは、ＫＳ1は大きくなりＫＳ2は小さくなる。かかる測定は標準的な作業を反映しており、複数の検定条件の下で細胞群に生ずる細胞パラメータの変化の定量的な測定を可能にする。
【００５７】
従来の解析方法について頻繁に遭遇する問題は、標本内ＫＳ距離（ＫＳ1及びＫＳ2）は検定標本と統制標本との間での個々のパラメータの分布の差についての情報を提供するが、２個のパラメータが相関を示しているか否かの指標を与えず、故に同じ現象を測定して解析に冗長性を招き得ることである。この事例がシナリオＡに示されており、ＫＳ1及びＫＳ2の両方が大きい値を与えているが、このことだけでは二つの距離計量が同じ細胞現象に関係しているのか異なる細胞現象に関係しているのかの指標を与えない。
【００５８】
本発明の幾つかの態様の方法では、ＫＳ距離又は他の適当なノンパラメトリック距離計量を含み得る標本内距離計量（すなわち異なる処理条件の下での同じパラメータの分布の比較）の利用が、同じ標本における異なるパラメータの分布を比較する付加的な標本間距離計量（すなわち同じ処理条件の下での異なるパラメータの分布の比較）の利用によって強化される。
【００５９】
これらの標本間測定が図４ではＫＳ3及びＫＳ4として示されており、これらの測定は、条件Ｃ1及びＣ2の下での測定パラメータＰ1とパラメータＰ2との間の相関度を決定する手段を提供する。シナリオＡでは、パラメータＰ1及びＰ2の両方の分布がＣ1とＣ2との間で変化しているが、両パラメータともＣ1及びＣ2において一定の相関度を示唆する類似した分布を有し、かかるシナリオＡでは標本間ＫＳ距離ＫＳ3及びＫＳ4の測定が、かかる相関を検定する手段を提供する。このシナリオでは、標本内ＫＳ距離値と標本間ＫＳ距離値との間の関係は、
【００６０】
【数１】
【００６１】
となり、標本内測定についてはＫＳ1及びＫＳ2の値が大きいのでＣ1とＣ2との間での両パラメータにおける変化が著しいことを示し、標本間測定についてはＫＳ3値及びＫＳ4値が小さいのでＣ1及びＣ2の両方での２個のパラメータの分布の間の差が類似していることを示し、Ｐ1とＰ2との間の高い相関度を示す。
【００６２】
対照的に、シナリオＢでは、Ｐ1の分布のみがＣ1とＣ2との間で著しく変化し、Ｐ2は実質的に同じ分布のままである。このシナリオでは、標本内ＫＳ距離値と標本間ＫＳ距離値との間の関係は、
【００６３】
【数２】
【００６４】
となり、標本内測定についてはＫＳ1の値が大きいのでＰ1の分布の変化がＣ1とＣ2との間で著しいことを示し、ＫＳ2の値が小さいのでＰ2の分布がＣ1及びＣ2との間で保存されていることを示し、標本間測定については、ＫＳ3値が小さいのでＰ1及びＰ2の分布が類似していることを示して、Ｃ1ではこれらのパラメータに相関があることを示すことができ、ＫＳ4の値が大きいのでＣ2ではＰ1とＰ2との間に相関が存在しないことを示す。
【００６５】
結果的に、本発明の様々な態様での方法による標本内距離計量と標本間の距離計量との組み合わせは、
ｉ）パラメータ同士の間の相関についての検定（全ての条件において小さい標本間ＫＳ距離の検出）、及び
ｉｉ）諸条件の間でのパラメータ相関の変化の強調（条件間にわたって変化する標本間ＫＳ距離の検出）
のための新たな方法を提供する。
【００６６】
第一の態様はＨＣＳでのデータ収集を最適化するときに重要なものであり、すなわち相関のあるデータ（すなわち同じ現象を異なる手段によって記述するデータ）の収集は冗長な作業であってデータ記憶及び処理時間の無駄になる。第二の態様はＨＣＳデータの情報量を最大化するときに重要なものであり、すなわち２個のパラメータが相関を変化させているとの情報は、既存のパラメータから付加的な情報を与え得る（例えば対象の寸法パラメータの相関の変動は、個々のパラメータからは自明でない対象の形態の変化に関係する情報を与え得る）。
【００６７】
当業者には、上述のような二つの条件の下であれ、また大規模ＨＣＳスクリーニングプログラムにおいて見受けられ得るように、様々な条件が異なる物質や物質の濃度に異なる時間にわたり細胞群を曝露すること又は単独で若しくは組み合わせた他の変化する条件に相当し得るようなさらに大規模な条件系列の下であれ、２個のパラメータが分布及び相関において様々な変化の程度を呈する場合に、かかる２個のパラメータの間での様々な挙動を含むさらに他のシナリオが可能であることが明らかとなろう。さらにまた、当業者には、標本内解析と標本間解析とを組み合わせたときに本発明の各態様において具現化される同じ原理を２よりも多いパラメータに対し適用することができ、但し標本間距離計算については対単位の比較の数が幾何級数的に増大する可能性があることが明らかとなろう。
【００６８】
図５は、本発明の一実施形態におけるデータパラメータと表現型マップ次元との間の関係を示す。
【００６９】
本発明の一実施形態に係る一つの方法をさらに大きいデータセットに適用したものについて図５に示す。パラメータの個数がＰである任意のＨＣＳパラメータセットについて、利用可能な対単位の標本間距離測定の数は、次の通りである。
【００７０】
【数３】
【００７１】
全Ｐ個のパラメータについてこれらの標本間距離測定（すなわち所与の処理条件における各々のパラメータの分布の間での全ての距離）を標本内距離測定（すなわち所与の処理条件における個々のパラメータの分布と統制条件の下での同じパラメータの分布との間の全ての距離）と組み合わせると、距離測定の合計数Ｍが得られる。
【００７２】
【数４】
【００７３】
式中、Ｍは、パラメータＰのセットについて全ての利用可能な距離計量を表わす表現型距離マップとしてのデータの図形的表現の次元の数であって、図５に示すようにＰの幾何学的関数として増加する。
【００７４】
典型的な表現型距離マップを４個のパラメータＰ1、Ｐ2、Ｐ3及びＰ4について図５に示す。マップの各々の軸は、ＫＳ距離測定について利用可能な範囲に対応して０から１まで目盛られており、各々の軸は、標本内計量（Ｐ1、Ｐ2、Ｐ3及びＰ4）についてのＫＳ距離値、及び６個の利用可能な標本間距離計量（Ｐ1−Ｐ2、Ｐ1−Ｐ3、Ｐ1−Ｐ4、Ｐ2−Ｐ3、Ｐ2−Ｐ4及びＰ3−Ｐ4）についてのＫＳ距離値を示す。
【実施例１】
【００７５】
多パラメータ型細胞データの生成及び解析
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５％ＦＢＳを加えたハムＦ１２培地において細胞６０００個／ウェルとしてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ９６ ｗｅｌｌ ＭａｔｒｉＰｌａｔｅに接種し、標準的な組織培養条件の下で２４時間にわたりインキュベートした。マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）溶液を培地に加えてアッセイにおける最終的な濃度を０ｍＭ〜１０ｍＭとし、細胞をさらに４８時間にわたりインキュベートした。培地をウェルから取り出して、細胞２００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、続いて室温において３０分間にわたりエタノールにおいて固定した。核を室温において１５分間にわたり５ｍＭのＨｏｅｃｈｓｔ（商標）３３３４２（Ｓｉｇｍａ社）によって染色し、細胞を２００ｍＬのＰＢＳで洗浄した。
【００７６】
細胞は、２０倍対物レンズでのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（商標）によってｖ３．５取得ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から市販）を用いて撮影された。画像はオンライン細胞計数を用いて取得されて、最小で細胞１０００個／ウェルを取得した。画像を核の面積、長さ、周長及び加重付き慣性モーメント（ＷＭＯＩ）についてＧＥ ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ（商標）ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から市販）を用いて解析した。
【００７７】
図６は、マイトマイシンＣの濃度を高めながら処理された細胞のハイコンテントスクリーニングからの典型的な画像を示す。
【００７８】
ＤＮＡ鎖切断を生ずる周知の染色体異常誘発剤であるＭＭＣによる細胞の処理は、細胞周期のＧ２期での細胞周期中断に関連する核面積の増大、ミトーシスにおける損傷を受けた染色体の誤った分離を通じた小核の形成、並びに高濃度では核断片化及び分解に関連する核の形状及び組織構造の変化等を含め、核形態に著しい変化を起こす。核の寸法、形状及び形態の変化は、図６に示すＨＣＳ画像取得からの典型的な画像において明瞭に見える。画像Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ０μＭ、０．１６μＭ及び２．５μＭのＭＭＣによって処理された細胞の典型的な核形態を示しており、画像Ｂ（０．１６μＭのＭＭＣ）の嵌め込み画像はさらに拡大した核の像であって、関連する小核が染色体異常誘発ＤＮＡ損傷から生じていることを示している。
【００７９】
４個の核形態パラメータが自動画像解析を用いて画像から抽出され、同じ濃度のＭＭＣに曝露された再現標本からのデータを組み合わせて、図７〜図１０に示すような４個のパラメータの各々についての群分布ヒストグラムを得た。図７〜図１０の各々において、１コマ目のデータは統制細胞からのものであり、２コマ目〜１２コマ目のデータはＭＭＣ０．０１μＭ〜１０μＭの範囲にわたるＭＭＣ処理細胞からのものである。
【００８０】
標本内測定を用いたデータのＫＳ距離解析（すなわちＭＭＣが存在しない場合の細胞データと、０．０１μＭ〜１０μＭの範囲にわたるＭＭＣの所与の濃度での細胞データとの間でのＫＳ距離の計算）を行ない、得られたデータを図１１に示す。このデータは、全４個の測定パラメータについてＫＳ距離の明らかな投与量依存型増大を示しており、無処理細胞に対するこれらのパラメータの著しい投与量依存型変化を示す。核の面積、長さ及び周長の３個のパラメータは、全ＭＭＣ濃度範囲にわたり殆ど同等の無処理細胞からのＫＳ距離を示した。また、ＷＭＯＩ（核の内部でのＤＮＡ染色ピクセル強度値の分布の計量）も投与量依存型変化を示したが、程度は他の３個の測定パラメータとは異なっていた。
【００８１】
全６個の可能なパラメータ対（面積−長さ、面積−ＷＭＯＩ、長さ−ＷＭＯＩ、面積−周長、長さ−周長、周長−ＷＭＯＩ）について、同じＭＭＣ濃度における２個のパラメータについてのデータ分布の間でのＫＳ距離の計算によって標本間ＫＳ距離を算出した。異種の次元を有する様々なパラメータに対してＫＳ距離計量を実行するために、下式の関数を用いてパラメータ値を０〜１の範囲に正規化した（Ｐnorm）。
【００８２】
【数５】
【００８３】
標本間ＫＳ測定の結果を図１２に示す（対単位の距離計量は次のように示す。Ａ−Ｌ：面積−長さ、Ａ−Ｗ：面積−ＷＭＯＩ、Ｌ−Ｗ：長さ−ＷＭＯＩ、Ａ−Ｐ：面積−周長、Ｌ−Ｐ：長さ−周長、Ｐ−Ｗ：周長−ＷＭＯＩ）。データは、パラメータ同士の間の関係において、限定しないが下記を含めて標本間ＫＳ距離計算によって明らかにされる多くの明瞭なパターンを示す。
ｉ）面積及び長さ（Ａ−Ｌ）は、全ＭＭＣ濃度範囲にわたって一定の小さいＫＳ距離を示し、これら２個のパラメータが高い相関度を有する類似した分布を示していることを示す。これら二つの形態学的計量は両方とも核寸法によって直接影響されるため、このデータは、核はＭＭＣ処理後に寸法が増大しているが、面積と長さとの間の関係を変化させる形態学的変化（例えば円形から卵形への変化）を蒙っていないことを示す。
ｉｉ）長さ及びＷＭＯＩ（Ｌ−Ｗ）は、ＭＭＣ濃度範囲の殆どにわたって一定の高いＫＳ距離を示し、これら２個のパラメータが低い相関度を有すること、すなわち核の内部でのＤＮＡ強度分布が核長さには関係していないことを示す。
ｉｉｉ）周長及びＷＭＯＩ（Ｐ−Ｗ）は、これらのパラメータについて標本内ＫＳ距離の場合に観察されたものと反対の態様でのＫＳ距離の投与量依存型の変化を示し、すなわち周長分布とＷＭＯＩ分布との間での標本間ＫＳ距離がＭＭＣ濃度と共に減少しており、これら２個のパラメータが、低投与量においては相関していないが高投与量においては相関するようになり、増加する核周長とＤＮＡ分布との間の何らかの形態の関係性が絡んだ表現型の変化を示唆している。
ｉｖ）面積及び周長（Ａ−Ｗ）は、低ＭＭＣ濃度及び高ＭＭＣ濃度において小さいＫＳ標本間距離を示し、中間的な濃度ではＫＳ距離の増大を示し、低いＭＭＣ濃度、中間的なＭＭＣ濃度及び高いＭＭＣ濃度において２種又は３種の表現型クラスが生じている可能性を示す。
【００８４】
ＤＮＡ損傷を誘発するＭＭＣのような薬剤による細胞の処理が、細胞の内部で生じる複雑な事象系列を導いてＭＭＣ濃度に関係付けられる一定範囲の表現型を帰結することは周知である。低濃度では、細胞はＤＮＡ損傷を修復することができ、細胞周期の進行には殆ど又は全く影響を与えず、核形態及び小核形成には小さい変動しか生じない。高いＭＭＣ濃度では、結果的にさらに高レベルのＤＮＡ損傷が生じており、この損傷が細胞に対してさらに大きいＤＮＡ修復負担を課し、著しい細胞周期遅延及び小核形成の増大、並びに核構造の他の変化を帰結する。さらに一層高いＭＭＣ投与量ではＤＮＡ損傷の範囲が十分に高くなるためこのことをきっかけとして細胞がアポトーシスを経て、核形態の甚だしい変化及び核分解を伴う。
【００８５】
これらの相互に関係するプロセスの全てがＭＭＣ処理された細胞に極めて複雑な事象の系列を生じさせ、ＭＭＣの様々な濃度において観察される表現型に対して直接的に又は間接的に影響する。細胞の大規模な群の内部で生ずる事象の複雑さは、標本内群データ分布のような従来の解析的アプローチでは十分に明らかではない（図１１）。付加的な標本間群データ分布比較計量を用いた本発明の各態様による方法の適用（図１２）によって、従来の解析では明らかでない表現型変化を示すデータのパターンが明らかになる。
【００８６】
標本内距離計量と標本間距離計量との組み合わせを用いて、様々な処理条件での測定パラメータの変動及び相互関係を要約する表現型マップ（図１３）を生成することができる。かかるマップによって、投与量−応答プロットのような従来の図形的表現では十分に明らかでなかったＨＣＳ解析データの傾向及び相互関係の速やかな視覚的同化が可能になる。
【００８７】
前述で図５に示すように、表現型距離マップの複雑さは解析されるパラメータの個数と共に幾何級数的に増大するが、これらの複雑なマップを図１４に示すように一連のより単純な要素に分解してさらに詳細な解析を支援することができる。
【００８８】
最も単純な場合（図１４のＡ）では、３個のパラメータから導かれる表現型マップが３本の軸を有し、パラメータ（Ｐ1及びＰ2）の各々について標本内距離計量に１本ずつであり、１本は利用可能な対単位の標本間距離計量（Ｐ1−Ｐ2）のみについてのものである。解析されるパラメータの個数が３まで増大すると、マップの複雑さが少し増大して（図１４のＢ）６本の軸となり、パラメータ（Ｐ1、Ｐ2及びＰ3）の各々について標本内距離計量に１本ずつであり、３本は対単位の標本間距離計量（Ｐ1−Ｐ2、Ｐ1−Ｐ3及びＰ2−Ｐ3）についてのものである。解析されるパラメータの個数がさらに増大すると、距離マップ軸の本数は増大して、前述のように軸の本数Ｍは式４によってパラメータＰの数に関係付けられる。
【００８９】
パラメータの個数及び結果的な表現型距離マップの複雑さのレベルを問わず、任意のかかるマップを分解して、各々が単一の対単位の比較を表わす一定数の単純な成分にすることができる。故に、図１４に示すように、３個のパラメータの解析から導かれるＭ＝６（図１４のＢ）であるマップを分解して、一連の成分要素Ｂ1、Ｂ2及びＢ3にすることができる。次元Ｍの任意の所与の表現型マップについて、成分要素の個数は式３によって定義されるようなものとなる。
【００９０】
表現型マップを対単位の比較に基づく成分に分解すると、個々の対に対し、当該パラメータ対についての標本内距離スコア（Ｄ）及び標本間距離スコア（ｄ）に基づく表現型変化スコア（Ｓ）を与えることが可能になる。
【００９１】
【数６】
【００９２】
式中、スコアは当該対について算出される標本間距離に基づく加重を施され、すなわち大きい標本間距離を有して相関の欠如を示す２個のパラメータは、低い標本間距離スコアを付けられた同じパラメータ値よりも高いスコアを生成する。
【００９３】
１よりも多い成分を含む複雑なマップでは、これらのスコアを各々の成分について算出することができ、個々のスコアを加算してＨＣＳ解析において測定される全てのパラメータを考慮に入れた累積スコアを求めることにより、全体的な表現型変化スコアを算出することができる。一定範囲のＭＭＣ濃度によって処理されて四つの核形態パラメータについて解析された細胞の累積表現型スコアを図１５に示す。
【００９４】
当業者には、本発明の各態様による方法に記載されているように標本内ＫＳ距離計量と標本間ＫＳ距離計量とを組み合わせる原理に基づいて、さらに他の形式のデータ比較及び累積スコア決定が可能であることが容易に理解されよう。例えば、パラメータ同士の間の相関度を確定するために、異なるパラメータ同士の間でのＫＳ距離計量を統制群において求めた基準標本間距離計量を付加的に含めると、さらに詳細な対単位の比較及び表現型スコア決定を施すことが可能になる。
【００９５】
この統制群標本間距離計量という付加的な因子を用いると、パラメータの個々の対に対し、統制群の標本間距離スコア（ｄc）及び処理済み群の標本間距離スコア（ｄt）の両方と組み合わせた両パラメータについての標本内距離スコア（Ｄ）に基づいて下式の表現型変化スコア（Ｓ）を与えることが可能になり、ここでのスコアは２種の条件の下でのパラメータの相関度を考慮に入れたものとなる。
【００９６】
【数７】
【００９７】
このアプローチは、一定範囲の条件にわたる相関変化を考慮に入れることを可能にする。例えば、２個のパラメータが統制標本でも検定標本でも相関していない（ｄc及びｄtが両方とも高い）ようなシナリオでは得られるスコアが最大になり、２個のパラメータが統制標本及び検定標本の何れでも相関している場合（ｄc及びｄtが両方とも低い）に得られるスコアが最小になることと対照的である。
【００９８】
全てのパラメータ対についてこの演算を実行し、加算して累積スコアを生成すると、測定された全てのＨＣＳパラメータに基づいてデータを要約する方法が与えられる。
【００９９】
以上の方法、及び本発明の他の関係する実施形態は、標本間の群分布距離計量及び標本内の群分布距離計量の両方の利用を包含しており、極めて複雑なＨＣＳデータセットを、大規模スクリーニングプログラムにわたり容易に比較され得る計量として統合して要約することができる。本発明の様々な態様及び実施形態の方法は、薬物、ＲＮＡｉ又は他の大規模スクリーニングプログラムの評価に有用であり、かかる方法によるマルチパラメータデータの統合によって、組み合わされた表現型パラメータに基づいてスクリーニングヒットを識別することが可能になり、また異なる表現型クラスを生成する異なる処理効果を異なる累積表現型スコアによって識別して分離することが可能になる。
【０１００】
最終的な解析パラメータセットから相関のあるパラメータを除去することにより、本発明の様々な態様及び実施形態は、例えば小規模な解析を実行し、相関のあるパラメータを決定し、次いで相関のあるパラメータを、より大規模な解析のために後に用いられる解析パラメータセットから省くことにより、解析効率を高めることができる。
【０１０１】
本発明の様々な態様及び実施形態はまた、又は代替的に、測定された相関に関してパラメータ値を修正する際に、相関のあるパラメータが表現型スコア（１又は複数）に過大な影響を及ぼさないように表現型スコアが記述パラメータの加重付き集計を含むようにして、修正されるパラメータを保ったまま修正することを可能にする。
【０１０２】
本発明を様々な実施形態に関して記載したが、当業者は、多くの異なる実施形態及び変形が可能であることを認められよう。かかる全ての変形及び実施形態は、特許請求の範囲によって画定される本発明の範囲内に含まれるものとする。
【０１０３】
参考文献
1. S. A. Haney, P. LaPan, J. Pan and J. Zhang, “High-content screening moves to the front of the line,” Drug Discovery Today, Vol. 11, No. 19-20, pp. 889-894, October 2006
2. S. Siegel and N. J. Castellan, Non-Parametric Statistics for the Behavioural Sciences, McGraw-Hill, New York, USA, 2nd Edition, 1988
3. Z. E. Perlman, M. D. Slack, Y. Feng, T. J. Mitchison, L. F. Wu and S. J. Altschuler, “Multidimensional drug profiling by automated microscopy,” Science, Vol. 306, pp. 1194-1198, 12 November 2004
4. B. Zhang, X. Gu, U. Uppalapati, M. A. Ashwell, D. S. Leggett and C. J. Li, “High-content fluorescent-based assay for screening activators of DNA damage checkpoint pathways,” Journal of Biomolecular Screening, Vol. 13, No. 6, pp. 538-543, 19 June 2008
5. US 2006/0154236 (Altschuler et al)
認められる場合には以上の参考文献の内容を参照により全体として本出願に援用する。
【符号の説明】
【０１０４】
１００：自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）装置
１０２：光源
１０４：集光装置
１０６：開口絞り
１０８：鏡検プレート
１０９：ウェル（スポット）
１１０：対物レンズ
１１２：検出器システム
１１４：プロセッサ
１２０ａ、１２０ｂ：光
１２０ｃ：発散光
１２０ｄ：集束光
２００：マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別する方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別する方法（２００）であって、
前記マルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対の間での相関を測定するステップ（２０２）と、
解析パラメータセットを形成するために、所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正するステップ（２０４）と、
前記マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、前記解析パラメータセットを用いて前記マルチパラメータデータセットを解析するステップ（２０６）と
を含む方法。
【請求項２】
複数のマルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するステップと、前記マルチパラメータデータセットからのそれぞれの表現型の間の変動を識別するためにそれぞれの表現型を比較するステップとをさらに含む、請求項１記載の方法（２００）。
【請求項３】
複数のマルチパラメータデータセットについて１以上のそれぞれの解析パラメータセットを形成するステップと、相関関係が前記マルチパラメータデータセット同士の間で保たれているか否かを決定するために前記解析パラメータセットを比較するステップとをさらに含む、請求項１又は請求項２記載の方法（２００）。
【請求項４】
相関が、前記所定のマルチパラメータデータ解析セットにおいて前記表現型同士の間で行なわれるノンパラメトリックの統計学的な対単位の測定により決定される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法（２００）。
【請求項５】
前記ノンパラメトリックの統計学的な対単位の測定が、コルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離測定解析を含む、請求項４記載の方法（２００）。
【請求項６】
前記所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正する前記ステップ（２０４）は、前記解析パラメータセットから所定の閾値を超える相関を有する一対のパラメータの一方を除去することを含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法（２００）。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法（２００）を具現化するようにデータ処理装置を構成するように動作可能である機械命令を備えるコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項８】
１以上のマルチパラメータデータセットの自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）のための装置（１００）であって、
マルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対の間での相関を測定し、
解析パラメータセットを形成するために、前記マルチパラメータデータセットについて所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正して、
前記マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、前記解析パラメータセットを用いて前記マルチパラメータデータセットを解析する
ように動作可能であるプロセッサ（１１４）を備える装置（１００）。
【請求項９】
前記プロセッサ（１１４）は、複数のマルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別して、前記マルチパラメータデータセットからのそれぞれの表現型の間の変動を識別するためにそれぞれの表現型を比較するようにさらに動作可能である、請求項８記載の装置（１００）。
【請求項１０】
前記プロセッサ（１１４）は、複数のマルチパラメータデータセットについて１以上のそれぞれの解析パラメータセットを形成して、相関関係が前記マルチパラメータデータセット同士の間で保たれているか否かを決定するために前記解析パラメータセットを比較するようにさらに動作可能である、請求項８又は請求項９記載の装置（１００）。
【請求項１１】
前記プロセッサ（１１４）は、前記所定のマルチパラメータデータ解析セットにおいて前記表現型同士の間で行なわれるノンパラメトリックの統計学的な対単位の測定を用いることにより相関を決定するようにさらに動作可能である、請求項８乃至請求項１０のいずれか１項記載の装置（１００）。
【請求項１２】
前記ノンパラメトリックの統計学的な対単位の測定が、コルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離測定解析の利用を含む、請求項１１記載の装置（１００）。
【請求項１３】
前記プロセッサ（１１４）が、前記解析パラメータセットから所定の閾値を超える相関を有する一対のパラメータの一方を除去することにより、相関のあるパラメータ値を修正するようにさらに動作可能である、請求項８乃至請求項１２のいずれか１項記載の装置（１００）。
【請求項１】
マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別する方法（２００）であって、
前記マルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対の間での相関を測定するステップ（２０２）と、
解析パラメータセットを形成するために、所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正するステップ（２０４）と、
前記マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、前記解析パラメータセットを用いて前記マルチパラメータデータセットを解析するステップ（２０６）と
を含む方法。
【請求項２】
複数のマルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するステップと、前記マルチパラメータデータセットからのそれぞれの表現型の間の変動を識別するためにそれぞれの表現型を比較するステップとをさらに含む、請求項１記載の方法（２００）。
【請求項３】
複数のマルチパラメータデータセットについて１以上のそれぞれの解析パラメータセットを形成するステップと、相関関係が前記マルチパラメータデータセット同士の間で保たれているか否かを決定するために前記解析パラメータセットを比較するステップとをさらに含む、請求項１又は請求項２記載の方法（２００）。
【請求項４】
相関が、前記所定のマルチパラメータデータ解析セットにおいて前記表現型同士の間で行なわれるノンパラメトリックの統計学的な対単位の測定により決定される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法（２００）。
【請求項５】
前記ノンパラメトリックの統計学的な対単位の測定が、コルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離測定解析を含む、請求項４記載の方法（２００）。
【請求項６】
前記所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正する前記ステップ（２０４）は、前記解析パラメータセットから所定の閾値を超える相関を有する一対のパラメータの一方を除去することを含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法（２００）。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法（２００）を具現化するようにデータ処理装置を構成するように動作可能である機械命令を備えるコンピュータプログラムプロダクト。
【請求項８】
１以上のマルチパラメータデータセットの自動ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）のための装置（１００）であって、
マルチパラメータデータセットの内部でパラメータの各対の間での相関を測定し、
解析パラメータセットを形成するために、前記マルチパラメータデータセットについて所定のマルチパラメータデータ解析セットの内部で相関のあるパラメータ値を修正して、
前記マルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別するために、前記解析パラメータセットを用いて前記マルチパラメータデータセットを解析する
ように動作可能であるプロセッサ（１１４）を備える装置（１００）。
【請求項９】
前記プロセッサ（１１４）は、複数のマルチパラメータデータセットから１以上の表現型を識別して、前記マルチパラメータデータセットからのそれぞれの表現型の間の変動を識別するためにそれぞれの表現型を比較するようにさらに動作可能である、請求項８記載の装置（１００）。
【請求項１０】
前記プロセッサ（１１４）は、複数のマルチパラメータデータセットについて１以上のそれぞれの解析パラメータセットを形成して、相関関係が前記マルチパラメータデータセット同士の間で保たれているか否かを決定するために前記解析パラメータセットを比較するようにさらに動作可能である、請求項８又は請求項９記載の装置（１００）。
【請求項１１】
前記プロセッサ（１１４）は、前記所定のマルチパラメータデータ解析セットにおいて前記表現型同士の間で行なわれるノンパラメトリックの統計学的な対単位の測定を用いることにより相関を決定するようにさらに動作可能である、請求項８乃至請求項１０のいずれか１項記載の装置（１００）。
【請求項１２】
前記ノンパラメトリックの統計学的な対単位の測定が、コルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離測定解析の利用を含む、請求項１１記載の装置（１００）。
【請求項１３】
前記プロセッサ（１１４）が、前記解析パラメータセットから所定の閾値を超える相関を有する一対のパラメータの一方を除去することにより、相関のあるパラメータ値を修正するようにさらに動作可能である、請求項８乃至請求項１２のいずれか１項記載の装置（１００）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１２−５２４８９３（Ｐ２０１２−５２４８９３Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０６５２１（Ｐ２０１２−５０６５２１）
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５４３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２２１４７
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（３９８０４８９１４）ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド (30)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５４３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２２１４７
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（３９８０４８９１４）ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド (30)
【Ｆターム（参考）】
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