ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質
本発明は、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質と呼ばれる、ミセルカゼインの酸性化及び沈殿カゼインからの分離によって得られるミルク画分に関する。前記ミルク画分及び特にそれらのある種の亜画分は、生物活性を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＧＬＰ−１遊離を促進することが発見された。これらの結果に基づいて、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、ＩＩ型糖尿病、肥満の治療及び予防に有用であり得、胃腸管に対するその他の目的で調製乳にさらに添加しうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質を得る方法、該蛋白質の画分、薬剤として使用するための該蛋白質及び薬剤又は消耗品の製造における該蛋白質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、世界中で最も蔓延している疾患の１つである。糖尿病には、主に２種類の型、Ｉ型とＩＩ型がある。Ｉ型糖尿病患者の特徴は、インシュリン分泌型膵臓ベータ細胞の自己免疫破壊である。糖尿病患者全体の９０〜９５％に相当するＩＩ型糖尿病患者の特徴は、（主に、肝臓及び筋肉の）末梢組織におけるインシュリン耐性の発生及び不適切なインシュリン分泌能である。
【０００３】
ＩＩ型糖尿病の患者は、重篤な長期合併症を起こす危険性が高い。これらは本質的には心臓血管疾患であるが、網膜障害、腎障害及び神経障害もある。
【０００４】
ＩＩ型糖尿病の実際の治療には、まだ産生されているインシュリンの量に応じて、単独又はインシュリンと組み合わせて使用することができる数種類の薬剤が含まれる（例えば、スルホニルウレア、チアゾリジンジオン）。最終的に、インシュリンがそれ以上産生されないときは、薬剤による治療の代わりにインシュリンの単独注射を行ってよい。
【０００５】
インシュリンの生合成及びプロインシュリンの遺伝子発現は、腸内分泌細胞にほぼ限られて発現するグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）によって誘発される。この分泌促進ホルモンの重要な役割は、文書を本明細書に参照として援用した「グルカゴン様ペプチド−１、膵臓ｂ細胞機能の主要な調節物質（Ｇｌｕｃａｇｏｎｅ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１：ａ ｍａｊｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂ−ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」Ｒ．Ｐｅｒｆｅｔｔｉ ａｎｄ Ｐ．Ｍｅｒｋｅｌ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０００）、１４３、７１７〜７２５に十分に要約されている。
【０００６】
例えば、ＧＬＰ−１を静脈内投与後、ＩＩ型糖尿病のインシュリン分泌応答は正常な患者の応答まで回復したことが示された。
【０００７】
さらに、ＧＬＰ−１は胃運動性、胃酸分泌、胃内容排出を阻害し、栄養素の酵素的分解及び吸収を遅延させる。これらの影響は、Ｉ型及びＩＩ型両方の糖尿病患者にたいてい保持されている。
【０００８】
さらに、ＧＬＰ−１は、満腹感に影響を及ぼし、食物摂取減少に関与するらしいことが示された。
【０００９】
したがって、ＧＬＰ−１は、糖尿病治療の理想的な候補であると考えられる。
【００１０】
さらに、ＧＬＰ−１の１分子が遊離すると、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）１分子もまた遊離する。哺乳動物のプログルカゴンの転写物、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２は、単一のｍＲＮＡから生じており、したがって消化管で一緒に分泌される。
【００１１】
ＧＬＰ−２は、胃の分泌及び胃運動性を阻害する。ＧＬＰ−２による長期の治療は、少し記述するだけでも、組織質量及び粘膜の厚みの増大、腸細胞アポトーシスの減少など、腸に有益な栄養的効果を有する。ＧＬＰ−１合成、分泌及び生物学的活性の大要は、「グルカゴン様ペプチド２（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ２）」Ｄ．Ｊ．Ｄｒｕｃｋｅｒ、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２００１、８６、１７５９〜６４によって掴むことができる。
【００１２】
ＷＯ０１／３７８５０（Ｓｏｃｉｅｔｅ ｄｅｓ Ｐｒｏｄｕｉｔｓ Ｎｅｓｔｌｅ）において初めて、プログルカゴン遺伝子発現及びＧＬＰ−１分泌を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞モデルが記載された。該細胞系は、ＮＣＩ−Ｈ７１６と称され、例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２５０として寄託されている。よって、ある種のミルク蛋白質加水分解物は、ＧＬＰ−１分泌を刺激する。
【００１３】
ＷＯ９８／３１３２９は、少なくとも１個の他の蛋白質構成物の存在下で、カゼインを選択的に加水分解する方法を記載している。このように得られた調製物は、糖尿病に関して有益であると述べられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、プログルカゴン由来ホルモンの分泌を刺激する１個又はいくつかの分子である。
【００１５】
本発明の他の目的は、例えば、特定の食品源に天然に存在するがために栄養学的に安全と考えられる生物活性分子を発見することである。
【００１６】
本発明の更なる目的は、ＩＩ型糖尿病を予防又は治療すること、血清中のグルコース濃度を制御すること、腸粘膜上皮の傷害及び／又は機能障害を特徴とする腸障害を治療又は予防すること、腸粘膜の厚さ及び表面領域を増大させること、及び／又は食欲及び食物摂取を減少させることである。
【００１７】
本発明の目的はまた、ヒト及び哺乳動物におけるＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２送達を高めることである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
驚くべきことに、通常ミセルカゼインと関連があるか、又は密接に相互作用するミルクの蛋白質画分は、ＧＬＰ−１の分泌を刺激することができる。正に当該蛋白質画分は、完全なカゼイン又は酵素処理したカゼインを酸性条件に曝露することによって遊離することが可能である。この画分に含まれるいくつかの蛋白質は、いまだ特性決定されていない。
【００１９】
したがって、第１の態様では、本発明は、
− ミセル又は酵素処理カゼイン及びホエイ蛋白質を分離する段階、
− ミセルカゼイン又は酵素処理カゼインをｐＨ６未満に酸性化する段階、
− 酸可溶性蛋白質をカゼインから分離する段階、及び
− 酸可溶性蛋白質の様々な画分を分離する段階
を含む、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の画分を得る方法を提供する。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得ることができ、アセトニトリル２６．４体積％から３６体積％を含む移動相によって疎水性固定相から溶出することを特徴とする、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の亜画分を提供する。
【００２１】
第３の態様では、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得ることができ、アセトニトリル４３．２体積％から４６．４体積％を含む移動相によって疎水性固定相から溶出することを特徴とする、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の亜画分を提供する。
【００２２】
第４の態様では、本発明は、医薬品として、又はヒト若しくは動物の体の予防的若しくは治療的処置として使用するミセルカゼインの酸可溶性蛋白質を提供する。
【００２３】
第５の態様では、本発明は、インシュリン分泌及び／又はプロインシュリン遺伝子発現を増強する消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００２４】
第６の態様では、本発明は、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病の予防又は治療のための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００２５】
第７の態様では、本発明は、ＧＬＰ−１及び／又はＧＬＰ−２の分泌の増加及び／又は血中グルコース濃度の制御のための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００２６】
他の態様では、本発明は、胃内容排出及び胃酸分泌を減少させるための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００２７】
さらに他の態様では、本発明は、食欲を制御し、食物摂取を減少させ、且つ／又は満腹感を高めるための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００２８】
他の態様では、本発明は、本発明による任意の蛋白質画分又は亜画分を含む消耗品を提供する。
【００２９】
他の態様では、本発明は、傷害又は機能障害を特徴とする腸障害を治療するため、且つ／或いは腸粘膜の厚さ及び／又は表面領域を増大するための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００３０】
本発明の利点は、ＧＬＰ−１の分泌を刺激することができる天然に生じる活性成分を提供することである。
【００３１】
本発明の他の利点は、問題とする蛋白質画分が容易に単離され、十分な量でいかなる食品にも供給することができることである。
【００３２】
本発明の他の利点は、Ｉ型及び／又はＩＩ型の糖尿病、クローン病、短小腸症候群の治療又は予防、血中グルコース濃度の制御、及び／又は満腹感の増強及び食物摂取の減少に有用であり得る栄養的に安全な成分を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
この明細書の場合は、「含む」という用語は「とりわけ、〜を含む」という意味である。「のみから構成する」と解釈されるものではない。
【００３４】
本発明の文脈において、消耗品という用語は、栄養学的に完全な、又は補助的ないかなる消耗品も包含するものとする。したがって、該組成物は、ヒト、ペット、例えば、ネコ及びイヌ、及び／又はその他の動物によって消費されることができる。バー、スナック、栄養調製乳、例えば、液体又は粉末及び再構成可能な調製乳、幼児用又は乳児用調製乳、アイスクリーム、乳製品、菓子製品であってよく、場合によって、他の食品、例えば、前記に挙げたものに添加することが可能な補助物又は医薬品であってよい。液体製品であってもよい。
【００３５】
例えば、該食品が栄養調製乳の場合、専用調製乳又は補助調製乳であってよい。専用調製乳は通常、成人では１．８Ｌから２．２Ｌの量で、幼児では０．６Ｌから１．４Ｌの量で消費される。
【００３６】
該調製乳を補助的に使用する場合、１日の量は、例えば、専用調製乳の量の約１／８から約１／２である。
【００３７】
しかし、本発明による消耗品は、いかなる製品にも制限されない。食品自体、又は任意の食品の成分若しくは構成要素であってよい。
【００３８】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の方法に関しては、ホエイ蛋白質からの天然カゼイン又はミセルカゼインの分離、或いはホエイ蛋白質からの酵素処理カゼインの分離は、例えば、超遠心又は精密濾過などの多くの方法で実施することができる。ホエイ蛋白質はまた、例えば、疎水性特性によって、特定のホエイ蛋白質を選択的に除去することによってカゼインから分離することができる。
【００３９】
ミセルカゼイン又は酵素処理カゼインの酸性化は、ｐＨを６未満、好ましくは５未満、より好ましくは４．８未満、例えば、４．６に調節することによって行われる。食品等級であれば、任意の酸、例えば、ＨＣｌ、酢酸などの任意の酸が適し得る。
【００４０】
ミセルカゼインからの酸可溶性カゼインの分離はまた、超遠心、濾過、傾瀉及びその他の適切な任意の方法によって実施することができる。
【００４１】
酸可溶性蛋白質の様々な亜画分の分離は、疎水性特性によって、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、疎水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩ−ＨＰＬＣ）及び同様の原理に基づいた方法によって実施することができる。その他の方法、例えば、異なる画分の大きさ又は電荷特性を利用した分離などはまた、適している可能性がある。
【００４２】
本発明による酸可溶性蛋白質の亜画分に関しては、表１に挙げたような溶出特性によって定義することができる。表１は、アセトニトリル濃度２６．４体積％から３６体積％の範囲で溶出する画分は、以下の表１で定義したような緩衝液Ａ及びＢから成る混合物における緩衝液Ｂの３３体積％から４５体積％の範囲に対応することを示す。
【００４３】
前記の緩衝液Ｂ及び緩衝液Ａの濃度の範囲は、溶出した蛋白質画分を特性決定するために十分である（表１）。前記の溶出範囲では、ポリスチレン−ジビニルベンゼンビーズを固定相として使用することが好ましい。Ａｍｅｒｓｈａｍのカタログ番号１５ ＲＰＣ ＴＮ １７−０７２７−０２の製品を固定相として使用することが好ましい。
【００４４】
特に、前記の特性による溶出のｐＨは、一般的に、１．８から２．２の範囲で、好ましくは約２である。このｐＨは主に、トリフルオロ酢酸ＴＦＡの量によって限定される）。
【００４５】
おそらく未知の物質に加えて、亜画分６、７及び８はＰＰ８（プロテオースペプトン）を含み、画分８及び９はＰＰ８及びＰＰ５（プロテオースペプトン）を含み、画分１０はラクトフェリンを含み、画分１１はβ−ラクトグロブリンを含むようである。
【００４６】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明の亜画分は、特定の緩衝液又はアセトニトリル濃度範囲での溶出によって表１で特性決定された亜画分５、６、７、８、１０及び１１である。いくつかの細胞毒性が疑われるので、具体的に、亜画分５は、さらに再試験することができる。
【００４７】
本発明を実施する可能性のある方法は、本明細書で報告した特定のミルク蛋白質画分をまず単離することである。これは、任意の適切な方法で実施することが可能で、少なくともいくつかの方法が適している。
【００４８】
例えば、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、超遠心によってミルク又はスキムミルク（又は誘導体）からカゼインを単離することによって得ることができる。したがって、例えば、スキムミルクを３０，０００ｇから９０，０００ｇ又は１１０，０００ｇまで、４５分間から９０分間超遠心する。ミセルカゼイン（又は、不溶性蛋白質）を構成する沈降物を回収することが可能である。
【００４９】
該ミセルカゼインは、ＣａＣｌ２ ２ｍＭ／ＮａＣｌ ０．９％に分散させて、前記のように超遠心することによって洗浄することができる。
【００５０】
次に、前述のように洗浄したミセルカゼインを酸性化することによって、カゼインから酸可溶性蛋白質を得ることができる。例えば、ミセルカゼイン（不溶性蛋白質）を酢酸ナトリウム緩衝液２０ｍＭ ｐＨ４．６に分散させることができる。カゼインの緩衝作用のため、酢酸（又はその他の適切な酸）の添加によって、ｐＨ約４．６を実現することができる。
【００５１】
次に、該溶液を遠心して（例えば、９，０００ｇから１５，０００ｇ、２０分から５０分）、上清をミセルカゼインの酸可溶性蛋白質として収集することができる。
【００５２】
ミセルカゼインから酸可溶性蛋白質を得る他の方法は、「スキムミルクのクロスフロー精密濾過によって得られたミセルカゼインの蛋白質組成物（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｃａｓｅｉｎ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ ｍｉｃｒｏ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｉｍｍｅｄ ｍｉｌｋ）」、Ｒ．Ｊｏｓｔ、Ｒ．Ｂｒａｎｄｓｍａ、Ｓ．Ｒｉｚｖｉ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｉｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ９（１９９９）３８９〜９０から入手することができる。
【００５３】
したがって、天然のカゼインは、超遠心の代わりに精密濾過によって得られる。したがって、孔径０．１〜０．２μｍの範囲の精密濾過膜を使用して、完全に物理的な方法によって乳清相からミルクのミセル相を分離する。
【００５４】
例えば、５０℃まで温めたスキムミルクを１Ｐ１９−４０Ｔｅｔｒａ−Ｌａｖａｌ １．４μｍ Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ（登録商標）モジュールで濾過して、細菌混入を抑えることができる。次に５５℃まで温めて、Ｃａｒｂｏｓｅｐ（登録商標）Ｍ１４（孔径０．１４μｍ）膜を備えたＴｅｃｈ−Ｓｅｐ １Ｓ １５１精密濾過装置で分離することができる。したがって、ミルクは濃縮様式で操作して、保持液及び透過液流に分画することができる。濃縮係数３（ｃｆ３）に達した後で、脱塩した水を添加することによって透析濾過を開始することができる。最初の６倍の体積の水で透析濾過した後に得られた保持液（ｃｆ３／ｄｆ６）は、ミセルカゼインから構成される。
【００５５】
次に、ミセルカゼインの酸可溶性部分は、再希釈した保持液を塩化水素酸（又は、酢酸などのその他のもの）でｐＨ４．６まで酸性化し、次に遠心によってカード（凝乳）を分離することによって得ることができる。結果として、全Ｎの３〜５％をミセルカゼインの酸可溶性画分としてカード（凝乳）から分離することができる。
【００５６】
そのようにすると、特に、ラクトフェリン、血清アルブミン、イムノグロブリンＨ鎖及びＬ鎖並びにβ−ラクトグロブリンと同様の電気泳動移動度を示す蛋白質を含む蛋白質画分を得ることができる。さらに、該画分はプロテオースペプトン成分５（β−カゼイン１−１０５／１−１０７）及びプロテオースペプトン成分８ｆａｓｔを含むことができる。
【００５７】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質のその他の成分は、本発明によって定義される。
【００５８】
もちろん、前記の方法は、ミセルカゼインからの酸可溶性蛋白質の単離又は精製の一例に過ぎない。当業者は、それらを得るその他の方法を容易に考えることができよう。
【００５９】
例えば、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、酵素（例えば、レンネット）処理後、少なくとも一部はカゼインに結合したままである。この場合、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、ミルクを酵素的に処理し、その後凝固したカゼインによって形成されたカード（凝乳）を回収することによって得ることが可能である。次に、ミセルカゼインの酸可溶性画分は、例えば、前述のような酸性化によってカード（凝乳）から少なくとも部分的に単離することができる。
【００６０】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質が主に、切断されたカゼイン画分に結合したままである限り、このような方法の代わりに遠心又は超遠心によってミセルカゼインを単離できるだろう。
【００６１】
ミルク又はスキムミルクの酸性化によってミセルカゼインの酸可溶性蛋白質を回収することはまた、可能であり得る。次に、本発明による蛋白質は、酸ホエイから分離しなければならない。後者の酸ホエイにはさらにその他の可溶性ミルク成分（主に、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン）を含んでいる。これは、前述のホエイ画分の選択的除去に適した任意の適切な分離技術、例えば、ＨＩＣ又はイオン交換クロマトグラフィーによって実施することができる。
【００６２】
本発明は、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質がＧＬＰ−１及び（それと連動した）ＧＬＰ−２遊離を促進するために適した生物活性成分を含むという驚くべき認識に基づいている。
【００６３】
しかし、ミセルカゼインから酸可溶性蛋白質をさらに亜分画して、スクリーニングしたところ、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質のいくつかの亜画分が好ましいことが明らかになった。
【００６４】
より有効な亜画分のさらなる分離及び単離は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、又は疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩ−ＨＰＬＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）などによって実施することができ、いずれも例えば、同一の分離原理をベースとしている。
【００６５】
ＨＩＣの原理は、当業者には公知である。一般的に、試料を保持する疎水性物質を含む平衡化カラム（固定相）に試料を添加する。該疎水性物質は、例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ Ｘａｄ１６（Ｒｏｈｍ ａｎｄ ＨａｓｓのＸＡＤ１６）として市販されている多孔性架橋結合ポリスチレンである。Ａｍｅｒｓｈａｍ製の１５ＲＰＣ ＴＮ１７−０７２７−０２（ポリスチレン−ジビニルベンゼン）又は同等物もまた、使用することができる。
【００６６】
本発明による蛋白質画分を該カラムに添加する前に、カラムを緩衝液で平衡化してよい。該画分を添加した後、緩衝液又は緩衝液の混合物（移動相）をカラムに流し、それによって緩衝液の混合物が変化し、カラムからの各画分の疎水性によって蛋白質亜画分の溶出特性が変化しうる。
【００６７】
この方法によるホエイ蛋白質の分離は、「ポリスチレン−ジビニルベンゼンの逆相高速液体クロマトグラフィーによるプロテオースペプトン及びカゼインマクロペプチドを含む主要なウシホエイ蛋白質の同時分離及び定量（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｂｏｖｉｎｅ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｏｓｅ ｐｅｐｔｏｎｅ ａｎｄ ｃａｓｅｉｎｏｍａｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ−ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ）」Ｄ．Ｆ．Ｅｌｇａｒ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ８７８（２０００）１８３〜１９６に記載されている。
【００６８】
カラムから溶出した蛋白質亜画分は、緩衝液混合物の組成又は固定相からの溶出に影響を与えるアセトニトリル含量によって正確に表現することができる。
【００６９】
例えば、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、ポリスチレン−ジビニルベンゼンビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製１５ ＲＰＣ ＴＮ１７−０７２７−０２）を充填したカラムに添加することができ、緩衝液Ａは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１体積％が含まれる水として定義することができ、緩衝液Ｂはアセトニトリル８０体積％及びＴＦＡ０．８５体積％が含まれる水と定義することができる。
【００７０】
次に、緩衝液Ａ及びＢの混合及び移動は、特定の系、例えば、ＦＰＬＣ（中高圧液体クロマトグラフィー）ＵＮＩＣＯＲＮステーション（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって制御し、カラムを通過させることができる。
【００７１】
溶出した蛋白質亜画分は、前述の緩衝液Ａ及びＢの混合比の溶出範囲によって定義することができる。特定の緩衝液組成物を使用して、本発明による蛋白質画分の溶出時に存在するアセトニトリルの相対量によって蛋白質亜画分の溶出時間又は間隔を簡単に説明することができる。しかし、溶出順番はｐＨ依存性であることに注意されたい。
【００７２】
以下の表１は、緩衝液Ｂの体積−パーセント範囲又はアセトニトリルにおける範囲によって本発明によるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の１４個の酸可溶性蛋白質亜画分を定義し、その中で本発明の好ましい実施形態による亜画分が溶出する。
【００７３】
【表１】
【００７４】
所望ならば、該亜画分は留去、超遠心、又は透析によって濃縮するか、又は乾燥前に真空、凍結、噴霧、流動床、乾燥機若しくはその他の任意の適切な乾燥方法によって有機溶媒を排除することができる。
【００７５】
亜画分５、６、７、８、９、１０及び１１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＬＰ−１遊離の促進に特に効果的で、本発明の意味において好ましい実施形態を構成する。亜画分５、７、８及び１１は、さらにより好ましい実施形態を構成する。
【００７６】
亜画分５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞モデルにおいて毒効果を有することが示されたので、この画分はヒト又は動物における適用性は損なわれたことを証明した可能性がある。
【００７７】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいてＧＬＰ−１分泌を促進する生物学的に活性のある成分を含む。
【００７８】
したがって、該画分又は選択された亜画分は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２又はインシュリンによって左右される、又は制御される任意のプロセスを調節するために使用することができる。Ｉ型又はＩＩ型糖尿病の予防又は治療、血中グルコース濃度の調節、胃運動性及び分泌の阻害、液体及び固形物の胃内容排出の減少、小腸通過の減少、平滑筋活性の阻害、食事誘導性グルコース変動の減少、腸における栄養素の酵素的分解及び吸収の遅延、食欲の低下、食物摂取減少などが例である。
【００７９】
例えば、該画分を使用して、ヒト又は動物の全体的な消化吸収活性を減少させることができる。
【００８０】
該蛋白質画分は、消耗品又は医薬品に添加することができる。消耗品の例は、栄養調製乳、乳児用調製乳又は臨床用調製乳である。その他の例は、飲料、例えば、貯蔵安定飲料、冷蔵飲料又はすぐに飲める飲料である。該画分は、その他の食品、例えば、チョコレート、バー、シリアル、乳製品、アイスクリーム、冷凍食品、ペットフード、コーヒー、カプセル、錠剤などに添加することができる。
【００８１】
以下の実施例は、本発明の主題内容となるものを例示するためにだけに挙げたものであり、けっして本題内容を限定するものではない。パーセント及び部は、他に指示がなければ、重量による。
【実施例１】
【００８２】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の単離
牛乳は、地元の市場（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｔｏｎｉ ｌａｉｔ、２０００−０２−０１）で購入した。
【００８３】
クリームは、１，０００ｇと４，５００ｇとの間で遠心することによって全乳から抽出した。この段階の選択性は、固定角ロータＳｏｒｖａｌｌ ＧＳ３を使用して１３，６００ｇまで加速することによって（３０分間は９，０００ｒｐｍ）向上した。全乳２２００ｍｌから開始すると、クリーム９０ｇが上層に回収された。
【００８４】
次に、ＣａＣｌ２ ２００ｍＭ、２５０μｌをスキムミルク２５０ｍｌに添加して、最終濃度を２ｍＭにした。このミルクを固定角ロータ４５ ＴＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ８−６０Ｍ超遠心機、遠心管中央部での１００，０００ｇに対応する３２，０００ｒｐｍ）で、１時間超遠心して（遠心管６本にスキムミルク４２．１ｇずつ含まれる）、不溶性ミセルカゼインからホエイを分離した。
【００８５】
ミセルカゼイン（２４ｇ）は、ＣａＣｌ２ ２ｍＭ／ＮａＣｌ ０．９％、２２０ｍｌに分散させて、前記のように超遠心した。回収した洗浄ミセルカゼイン２２ｇをＣａＣｌ２ ２ｍＭ／ＮａＣｌ ０．９％に分散させて、量を２５０ｍｌに調節した。分取して、不溶性蛋白質（ミセルカゼイン）と明示して、凍結した。
【００８６】
全乳１９０ｇから開始して、洗浄した不溶性蛋白質の沈殿物（１７ｇ）を酢酸ナトリウム２０ｍＭ ｐＨ４．６、４０ｍｌに分散させた（Ｐｏｔｔｅｒ）。
【００８７】
カゼインの緩衝作用のため、ｐＨ（６．５）は酢酸を添加することによって４．６に調節し、量は酢酸緩衝液を添加することによって初期ミルク量の半分（９０ｍｌ）に調節した。次に、溶液を遠心して（１２，０００ｇ、３０分）、上清（７７ｇ）はミセルカゼインの酸可溶性蛋白質と明示した。
【００８８】
以下の実施例３のために、試料を液体窒素に浸漬することによって凍結し、−２０℃で保存した。
【実施例２】
【００８９】
様々なミルク画分によって促進されたＧＬＰ−１遊離
材料及び方法
ＭＨ（肉加水分解物）及びＥＡＨ（卵アルブミン加水分解物）は、Ｓｉｇｍａから購入した。マトリゲルはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。ＣＧＭＰは、ＷＯ９８５３７０２に記載されたように得た。
【００９０】
スキムミルク、スイートホエイ、酸ホエイ、酸カゼイン、可溶性蛋白質、不溶性蛋白質（ミセルカゼイン）を得るための分画段階は、従来のミルク工程（Ａｌａｉｓ Ｃ．１９８４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｕ ｌａｉｔ、Ｐｒｉｎｃｉｐｅ ｄｅｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｌａｉｔｉｅｒｅｓ、４版、ＳＥＰＡＩＣ、Ｐａｒｉｓ、２９〜３５、１５９〜１７８）を応用した。遠心は高加速で実施し、不溶性画分を洗浄して、選択性及び分離効率を高めた。
【００９１】
酸カゼインは、スキムミルクを酸処理した後の沈殿物から収集されたカゼインである。可溶性蛋白質は、スキムミルクを１００，０００ｇ（実施例１も参照のこと）で１時間超遠心した後、水溶液中に回収された蛋白質で、不溶性蛋白質（ミセルカゼイン）は、その後沈降物に回収された部分である。
【００９２】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、実施例１から得られ、基本的に前段落で生じた酸カゼインを酸性化し遠心することによって得られた。
【００９３】
ＮＣＩ−Ｈ７１６ヒト腸細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２５１）は、５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベータ内で３７℃で培養した。増殖のために、細胞は１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及びＬ−グルタミン２ｍＭを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）に懸濁して増殖させた。分泌研究では、細胞はマトリゲルコーティングプレートに入れ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及びＬ−グルタミン２ｍＭを添加したＤＭＥＭ（低グルコース）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）中で２日間インキュベートした。
【００９４】
実験の２日前に、細胞を１２ウェルプレートに細胞１００万個／ウェルで入れた。実験日に、細胞をＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）で１回洗浄し、様々な蛋白質溶液の存在下で３７℃で２時間インキュベートした。試験蛋白質は、０．２％ＢＳＡ（画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ）を含有するＫＲＢＢ（クレブス−リンガー平衡緩衝液）ｐＨ７．４、１ｍｌに溶解した。インキュベート終了時に、上清をＰＭＳＦ ２００ｍＭ、１００μｌに回収し、すぐに−８０℃で凍結した。
【００９５】
蛋白質溶液は、培地１ｍｌ当たり蛋白質０．５ｍｇ及び５ｍｇの２種類の濃度で添加した。
【００９６】
結果
図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＬＰ−１遊離に対する異なる濃度（０．５及び５ｍｇ／ｍｌ）のミルク蛋白質画分の様々な効果を示す。実施例１によって得られたミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、低濃度でも（０．５ｍｇ／ｍｌ）ＧＬＰ−１遊離に対して最も強い影響を及ぼす。
【００９７】
結論として、実施例１による方法によって得ることができるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は生物活性成分を含む。これらは、ヒト又は動物の体の疾患の予防又は治療に使用することができる。ＧＬＰ−１が遊離することから、例えば、糖尿病及び肥満の予防及び治療におけるこれらの成分の有用性及び産業上の利用性が示唆される。
【実施例３】
【００９８】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の亜分画
疎水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、以下のように実施した。Ｓｏｕｒｃｅ１５ ＲＰＣ ＴＮ １７−０７２７−０２（ポリスチレン−ジビニルベンゼン）１００ｍｌを充填したＨＲ１６ｘ５０カラムをＵＮＩＣＯＲＮステーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって制御されたＦＰＬＣ系に連結した。ＨＣＩ酸可溶性画分（実施例１参照）１５ｍｌは３７℃の水浴で２０分かけて解凍し、ボルテックスによって混合し、５４１５ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機で１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。ミリポアフィルター０．４５μｍ（３０６／ＧＳＷＰ０４７００．ＧＳ）で濾過した後、この調製物１０ｍｌを注入した。
【００９９】
クロマトグラフィーの条件は、Ａ緩衝液：ＴＦＡ０．１％が含まれる水（０．４５μｍミリポアシステムで濾過したｍｉｌｉＱ水２０００ｍｌ及びＴＦＡ ２ｍｌ（Ｓｉｇｍａ９１６９９、１００ｍｌ）、Ｂ緩衝液：アセトニトリル８０％、ＴＦＡ ０．８５％（０．４５μｍミリポアシステムで濾過したｍｉｌｉＱ水４００ｍｌ及びアセトニトリル １６００ｍｌを超音波槽で１５分間脱気し、最終的にＴＦＡ １．７ｍｌを添加する）であった。
【０１００】
カラムは、Ｂ緩衝液２０％で平衡化した。次に、１カラム体積（ＣＶ）後、試料を注入して、Ｂ緩衝液を１５ＣＶで７５％に、２．５ＣＶで１００％に増加させた。最終的に、勾配は０．４ＣＶでＢ緩衝液２０％に減少させた。流速は、３ｍｌ／分に固定した。
【０１０１】
１８ｍｌずつ９６画分をプラスティック管に収集した。画分は−２０℃に維持した。ＨＰＬＣ分析後、収集した管９６本をＨＰＬＣプロフィールに対応させることによって１４個の画分に集め、その後のスクリーニングのために、留去することによって濃縮してから凍結乾燥した。
【０１０２】
２１５ｎｍでのＵＶ吸収を記録して、対応するＨＩＣプロフィールを図３に示す。
【０１０３】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の１４個の亜画分は、カラムからの溶出時点及び記載した表１の対応するアセトニトリル濃度（疎水性）によって特性決定する。
【実施例４】
【０１０４】
実施例３の亜画分によって促進されるＧＬＰ−１遊離
実施例３で得られた亜画分は、実施例２で説明したような実験計画に従ってＧＬＰ−１遊離促進能をスクリーニングした。亜画分はすべて、５００μｇ／ｍｌで試験した全亜画分を含む「全体」以外は、３０μｇ／ｍｌ培地で試験した。
【０１０５】
この実験で、疎水性クロマトグラフィープールは、実施例２のミセルカゼインの最初の酸可溶性蛋白質の濃度より１６〜１７倍低い濃度で試験した（５００μｇ／ｍｌに対して３０μｇ／ｍｌ）ことが記載されている。
【０１０６】
結果を図２に示す。ほとんどすべての画分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＬＰ−１遊離の増加を引き起こした。並はずれて強い増加が非常に低い蛋白質濃度で（蛋白質３０μｇ／ｍｌ培地）亜画分５、７、８で認められ、９、１０及び１１でもまた認められた。
【０１０７】
しかし、亜画分５は細胞系に毒作用を有することが見いだされた。
【０１０８】
結論として、亜画分７、８、９、１０及び１１は、生物活性分子又は成分を含む。これらは、特にＩＩ型糖尿病、おそらくまたＩ型糖尿病又は肥満の治療に薬剤として役立つ可能性がある。ヒト又は動物の体におけるＧＬＰ−１の様々なその他の作用によって、特許請求の範囲に挙げたような亜画分の他の適用が説明される。
【実施例５】
【０１０９】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質を含む栄養調製乳
推奨値（３１５ｋＪ／ｄｌ）にしたがって、乾燥物質の重量の割合で、蛋白質１４％、炭水化物６２％、脂肪１８％並びに無機質及びビタミン３．２％を含む栄養調製乳は、実施例１によるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質によって完成する。
【０１１０】
該酸可溶性蛋白質は、生理学的有効量で添加する。完全な専用調製乳（予定使用量は１日当たり２ｌである）では、最終濃度は調製乳の０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌに調節した。その他の食物への補給剤として有用な調製乳（予定使用量は１日当たり２ｄｌである）では、濃度は調製乳の１〜５ｍｇ／ｍｌに調節した。状況及び個々の必要性によってより高い用量を使用する。
【実施例６】
【０１１１】
ミセルカゼインの亜画分酸可溶性蛋白質を含む栄養調製乳
実施例５の調製乳は、実施例１による蛋白質の代わりに実施例３で得られた亜画分７及び８の蛋白質に富んでいる。
【０１１２】
栄養調製乳における亜画分の乾燥物質の量は、完全な調製乳に対しては５〜２５μｇ／液体調製乳１ｍｌであり（実施例５参照）、２ｄｌ（補給剤）の１日用量に対しては５０〜２５０μｇ／ｍｌに調節する。
【０１１３】
亜画分を含む高用量調製乳もまた調製した（前述の２ｄｌの補給剤に対して１０倍に濃縮）。本発明の蛋白質の濃度は、２ｄｌにおいて０．５〜２．５ｍｇ／ｍｌであった。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】牛乳の様々な蛋白質画分によって刺激されたｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＬＰ−１遊離を比較した図である。蛋白質類は、低濃度でも最高のＧＬＰ−１遊離効果を示した本発明によるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質（斜線の棒）以外は、０．５ｍｇ／ｍｌ（斜線の棒）及び５ｍｇ／ｍｌ（黒い棒）で投与した。ミルク抽出物は、０．２％ＢＳＡを含むクレブスリンガー平衡緩衝液（ＫＲＢＢ）、ｐＨ７．４中で調製した。対照は、緩衝液（ＫＲＢＢ）及びＢＳＡ（０．２％）のみから構成される。
【図２】ミセルカゼインの酸溶出蛋白質の様々な画分によって刺激されたｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＬＰ−１遊離を比較した図である。異なる亜画分を同一濃度（３０μｇ／ｍｌ）で投与したところ、特に亜画分５、７、８、１０及び１１がＧＬＰ−１分泌に顕著な効果を示すことが発見された。１４画分すべての元の混合物を含む全体は、より高い濃度（５μｇ／ｍｌ）で投与した。
【図３】ミセル蛋白質の酸可溶性蛋白質の１４画分のＨＩ−ＨＰＬＣ（疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー）のクロマトグラムを示した図である。水平軸は、前記１４個の異なる亜画分に分画したミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の疎水性の増加を示す。垂直軸は、２１４ｎｍのＵＶで測定した、カラムから溶出した蛋白質量を示す。 図の更なる詳細は実施例により説明されうる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質を得る方法、該蛋白質の画分、薬剤として使用するための該蛋白質及び薬剤又は消耗品の製造における該蛋白質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、世界中で最も蔓延している疾患の１つである。糖尿病には、主に２種類の型、Ｉ型とＩＩ型がある。Ｉ型糖尿病患者の特徴は、インシュリン分泌型膵臓ベータ細胞の自己免疫破壊である。糖尿病患者全体の９０〜９５％に相当するＩＩ型糖尿病患者の特徴は、（主に、肝臓及び筋肉の）末梢組織におけるインシュリン耐性の発生及び不適切なインシュリン分泌能である。
【０００３】
ＩＩ型糖尿病の患者は、重篤な長期合併症を起こす危険性が高い。これらは本質的には心臓血管疾患であるが、網膜障害、腎障害及び神経障害もある。
【０００４】
ＩＩ型糖尿病の実際の治療には、まだ産生されているインシュリンの量に応じて、単独又はインシュリンと組み合わせて使用することができる数種類の薬剤が含まれる（例えば、スルホニルウレア、チアゾリジンジオン）。最終的に、インシュリンがそれ以上産生されないときは、薬剤による治療の代わりにインシュリンの単独注射を行ってよい。
【０００５】
インシュリンの生合成及びプロインシュリンの遺伝子発現は、腸内分泌細胞にほぼ限られて発現するグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）によって誘発される。この分泌促進ホルモンの重要な役割は、文書を本明細書に参照として援用した「グルカゴン様ペプチド−１、膵臓ｂ細胞機能の主要な調節物質（Ｇｌｕｃａｇｏｎｅ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１：ａ ｍａｊｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂ−ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」Ｒ．Ｐｅｒｆｅｔｔｉ ａｎｄ Ｐ．Ｍｅｒｋｅｌ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０００）、１４３、７１７〜７２５に十分に要約されている。
【０００６】
例えば、ＧＬＰ−１を静脈内投与後、ＩＩ型糖尿病のインシュリン分泌応答は正常な患者の応答まで回復したことが示された。
【０００７】
さらに、ＧＬＰ−１は胃運動性、胃酸分泌、胃内容排出を阻害し、栄養素の酵素的分解及び吸収を遅延させる。これらの影響は、Ｉ型及びＩＩ型両方の糖尿病患者にたいてい保持されている。
【０００８】
さらに、ＧＬＰ−１は、満腹感に影響を及ぼし、食物摂取減少に関与するらしいことが示された。
【０００９】
したがって、ＧＬＰ−１は、糖尿病治療の理想的な候補であると考えられる。
【００１０】
さらに、ＧＬＰ−１の１分子が遊離すると、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）１分子もまた遊離する。哺乳動物のプログルカゴンの転写物、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２は、単一のｍＲＮＡから生じており、したがって消化管で一緒に分泌される。
【００１１】
ＧＬＰ−２は、胃の分泌及び胃運動性を阻害する。ＧＬＰ−２による長期の治療は、少し記述するだけでも、組織質量及び粘膜の厚みの増大、腸細胞アポトーシスの減少など、腸に有益な栄養的効果を有する。ＧＬＰ−１合成、分泌及び生物学的活性の大要は、「グルカゴン様ペプチド２（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ２）」Ｄ．Ｊ．Ｄｒｕｃｋｅｒ、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２００１、８６、１７５９〜６４によって掴むことができる。
【００１２】
ＷＯ０１／３７８５０（Ｓｏｃｉｅｔｅ ｄｅｓ Ｐｒｏｄｕｉｔｓ Ｎｅｓｔｌｅ）において初めて、プログルカゴン遺伝子発現及びＧＬＰ−１分泌を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞モデルが記載された。該細胞系は、ＮＣＩ−Ｈ７１６と称され、例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２５０として寄託されている。よって、ある種のミルク蛋白質加水分解物は、ＧＬＰ−１分泌を刺激する。
【００１３】
ＷＯ９８／３１３２９は、少なくとも１個の他の蛋白質構成物の存在下で、カゼインを選択的に加水分解する方法を記載している。このように得られた調製物は、糖尿病に関して有益であると述べられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、プログルカゴン由来ホルモンの分泌を刺激する１個又はいくつかの分子である。
【００１５】
本発明の他の目的は、例えば、特定の食品源に天然に存在するがために栄養学的に安全と考えられる生物活性分子を発見することである。
【００１６】
本発明の更なる目的は、ＩＩ型糖尿病を予防又は治療すること、血清中のグルコース濃度を制御すること、腸粘膜上皮の傷害及び／又は機能障害を特徴とする腸障害を治療又は予防すること、腸粘膜の厚さ及び表面領域を増大させること、及び／又は食欲及び食物摂取を減少させることである。
【００１７】
本発明の目的はまた、ヒト及び哺乳動物におけるＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２送達を高めることである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
驚くべきことに、通常ミセルカゼインと関連があるか、又は密接に相互作用するミルクの蛋白質画分は、ＧＬＰ−１の分泌を刺激することができる。正に当該蛋白質画分は、完全なカゼイン又は酵素処理したカゼインを酸性条件に曝露することによって遊離することが可能である。この画分に含まれるいくつかの蛋白質は、いまだ特性決定されていない。
【００１９】
したがって、第１の態様では、本発明は、
− ミセル又は酵素処理カゼイン及びホエイ蛋白質を分離する段階、
− ミセルカゼイン又は酵素処理カゼインをｐＨ６未満に酸性化する段階、
− 酸可溶性蛋白質をカゼインから分離する段階、及び
− 酸可溶性蛋白質の様々な画分を分離する段階
を含む、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の画分を得る方法を提供する。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得ることができ、アセトニトリル２６．４体積％から３６体積％を含む移動相によって疎水性固定相から溶出することを特徴とする、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の亜画分を提供する。
【００２１】
第３の態様では、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得ることができ、アセトニトリル４３．２体積％から４６．４体積％を含む移動相によって疎水性固定相から溶出することを特徴とする、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の亜画分を提供する。
【００２２】
第４の態様では、本発明は、医薬品として、又はヒト若しくは動物の体の予防的若しくは治療的処置として使用するミセルカゼインの酸可溶性蛋白質を提供する。
【００２３】
第５の態様では、本発明は、インシュリン分泌及び／又はプロインシュリン遺伝子発現を増強する消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００２４】
第６の態様では、本発明は、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病の予防又は治療のための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００２５】
第７の態様では、本発明は、ＧＬＰ−１及び／又はＧＬＰ−２の分泌の増加及び／又は血中グルコース濃度の制御のための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００２６】
他の態様では、本発明は、胃内容排出及び胃酸分泌を減少させるための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００２７】
さらに他の態様では、本発明は、食欲を制御し、食物摂取を減少させ、且つ／又は満腹感を高めるための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００２８】
他の態様では、本発明は、本発明による任意の蛋白質画分又は亜画分を含む消耗品を提供する。
【００２９】
他の態様では、本発明は、傷害又は機能障害を特徴とする腸障害を治療するため、且つ／或いは腸粘膜の厚さ及び／又は表面領域を増大するための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用を提供する。
【００３０】
本発明の利点は、ＧＬＰ−１の分泌を刺激することができる天然に生じる活性成分を提供することである。
【００３１】
本発明の他の利点は、問題とする蛋白質画分が容易に単離され、十分な量でいかなる食品にも供給することができることである。
【００３２】
本発明の他の利点は、Ｉ型及び／又はＩＩ型の糖尿病、クローン病、短小腸症候群の治療又は予防、血中グルコース濃度の制御、及び／又は満腹感の増強及び食物摂取の減少に有用であり得る栄養的に安全な成分を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
この明細書の場合は、「含む」という用語は「とりわけ、〜を含む」という意味である。「のみから構成する」と解釈されるものではない。
【００３４】
本発明の文脈において、消耗品という用語は、栄養学的に完全な、又は補助的ないかなる消耗品も包含するものとする。したがって、該組成物は、ヒト、ペット、例えば、ネコ及びイヌ、及び／又はその他の動物によって消費されることができる。バー、スナック、栄養調製乳、例えば、液体又は粉末及び再構成可能な調製乳、幼児用又は乳児用調製乳、アイスクリーム、乳製品、菓子製品であってよく、場合によって、他の食品、例えば、前記に挙げたものに添加することが可能な補助物又は医薬品であってよい。液体製品であってもよい。
【００３５】
例えば、該食品が栄養調製乳の場合、専用調製乳又は補助調製乳であってよい。専用調製乳は通常、成人では１．８Ｌから２．２Ｌの量で、幼児では０．６Ｌから１．４Ｌの量で消費される。
【００３６】
該調製乳を補助的に使用する場合、１日の量は、例えば、専用調製乳の量の約１／８から約１／２である。
【００３７】
しかし、本発明による消耗品は、いかなる製品にも制限されない。食品自体、又は任意の食品の成分若しくは構成要素であってよい。
【００３８】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の方法に関しては、ホエイ蛋白質からの天然カゼイン又はミセルカゼインの分離、或いはホエイ蛋白質からの酵素処理カゼインの分離は、例えば、超遠心又は精密濾過などの多くの方法で実施することができる。ホエイ蛋白質はまた、例えば、疎水性特性によって、特定のホエイ蛋白質を選択的に除去することによってカゼインから分離することができる。
【００３９】
ミセルカゼイン又は酵素処理カゼインの酸性化は、ｐＨを６未満、好ましくは５未満、より好ましくは４．８未満、例えば、４．６に調節することによって行われる。食品等級であれば、任意の酸、例えば、ＨＣｌ、酢酸などの任意の酸が適し得る。
【００４０】
ミセルカゼインからの酸可溶性カゼインの分離はまた、超遠心、濾過、傾瀉及びその他の適切な任意の方法によって実施することができる。
【００４１】
酸可溶性蛋白質の様々な亜画分の分離は、疎水性特性によって、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、疎水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩ−ＨＰＬＣ）及び同様の原理に基づいた方法によって実施することができる。その他の方法、例えば、異なる画分の大きさ又は電荷特性を利用した分離などはまた、適している可能性がある。
【００４２】
本発明による酸可溶性蛋白質の亜画分に関しては、表１に挙げたような溶出特性によって定義することができる。表１は、アセトニトリル濃度２６．４体積％から３６体積％の範囲で溶出する画分は、以下の表１で定義したような緩衝液Ａ及びＢから成る混合物における緩衝液Ｂの３３体積％から４５体積％の範囲に対応することを示す。
【００４３】
前記の緩衝液Ｂ及び緩衝液Ａの濃度の範囲は、溶出した蛋白質画分を特性決定するために十分である（表１）。前記の溶出範囲では、ポリスチレン−ジビニルベンゼンビーズを固定相として使用することが好ましい。Ａｍｅｒｓｈａｍのカタログ番号１５ ＲＰＣ ＴＮ １７−０７２７−０２の製品を固定相として使用することが好ましい。
【００４４】
特に、前記の特性による溶出のｐＨは、一般的に、１．８から２．２の範囲で、好ましくは約２である。このｐＨは主に、トリフルオロ酢酸ＴＦＡの量によって限定される）。
【００４５】
おそらく未知の物質に加えて、亜画分６、７及び８はＰＰ８（プロテオースペプトン）を含み、画分８及び９はＰＰ８及びＰＰ５（プロテオースペプトン）を含み、画分１０はラクトフェリンを含み、画分１１はβ−ラクトグロブリンを含むようである。
【００４６】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明の亜画分は、特定の緩衝液又はアセトニトリル濃度範囲での溶出によって表１で特性決定された亜画分５、６、７、８、１０及び１１である。いくつかの細胞毒性が疑われるので、具体的に、亜画分５は、さらに再試験することができる。
【００４７】
本発明を実施する可能性のある方法は、本明細書で報告した特定のミルク蛋白質画分をまず単離することである。これは、任意の適切な方法で実施することが可能で、少なくともいくつかの方法が適している。
【００４８】
例えば、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、超遠心によってミルク又はスキムミルク（又は誘導体）からカゼインを単離することによって得ることができる。したがって、例えば、スキムミルクを３０，０００ｇから９０，０００ｇ又は１１０，０００ｇまで、４５分間から９０分間超遠心する。ミセルカゼイン（又は、不溶性蛋白質）を構成する沈降物を回収することが可能である。
【００４９】
該ミセルカゼインは、ＣａＣｌ２ ２ｍＭ／ＮａＣｌ ０．９％に分散させて、前記のように超遠心することによって洗浄することができる。
【００５０】
次に、前述のように洗浄したミセルカゼインを酸性化することによって、カゼインから酸可溶性蛋白質を得ることができる。例えば、ミセルカゼイン（不溶性蛋白質）を酢酸ナトリウム緩衝液２０ｍＭ ｐＨ４．６に分散させることができる。カゼインの緩衝作用のため、酢酸（又はその他の適切な酸）の添加によって、ｐＨ約４．６を実現することができる。
【００５１】
次に、該溶液を遠心して（例えば、９，０００ｇから１５，０００ｇ、２０分から５０分）、上清をミセルカゼインの酸可溶性蛋白質として収集することができる。
【００５２】
ミセルカゼインから酸可溶性蛋白質を得る他の方法は、「スキムミルクのクロスフロー精密濾過によって得られたミセルカゼインの蛋白質組成物（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｃａｓｅｉｎ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ ｍｉｃｒｏ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｉｍｍｅｄ ｍｉｌｋ）」、Ｒ．Ｊｏｓｔ、Ｒ．Ｂｒａｎｄｓｍａ、Ｓ．Ｒｉｚｖｉ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｉｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ９（１９９９）３８９〜９０から入手することができる。
【００５３】
したがって、天然のカゼインは、超遠心の代わりに精密濾過によって得られる。したがって、孔径０．１〜０．２μｍの範囲の精密濾過膜を使用して、完全に物理的な方法によって乳清相からミルクのミセル相を分離する。
【００５４】
例えば、５０℃まで温めたスキムミルクを１Ｐ１９−４０Ｔｅｔｒａ−Ｌａｖａｌ １．４μｍ Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ（登録商標）モジュールで濾過して、細菌混入を抑えることができる。次に５５℃まで温めて、Ｃａｒｂｏｓｅｐ（登録商標）Ｍ１４（孔径０．１４μｍ）膜を備えたＴｅｃｈ−Ｓｅｐ １Ｓ １５１精密濾過装置で分離することができる。したがって、ミルクは濃縮様式で操作して、保持液及び透過液流に分画することができる。濃縮係数３（ｃｆ３）に達した後で、脱塩した水を添加することによって透析濾過を開始することができる。最初の６倍の体積の水で透析濾過した後に得られた保持液（ｃｆ３／ｄｆ６）は、ミセルカゼインから構成される。
【００５５】
次に、ミセルカゼインの酸可溶性部分は、再希釈した保持液を塩化水素酸（又は、酢酸などのその他のもの）でｐＨ４．６まで酸性化し、次に遠心によってカード（凝乳）を分離することによって得ることができる。結果として、全Ｎの３〜５％をミセルカゼインの酸可溶性画分としてカード（凝乳）から分離することができる。
【００５６】
そのようにすると、特に、ラクトフェリン、血清アルブミン、イムノグロブリンＨ鎖及びＬ鎖並びにβ−ラクトグロブリンと同様の電気泳動移動度を示す蛋白質を含む蛋白質画分を得ることができる。さらに、該画分はプロテオースペプトン成分５（β−カゼイン１−１０５／１−１０７）及びプロテオースペプトン成分８ｆａｓｔを含むことができる。
【００５７】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質のその他の成分は、本発明によって定義される。
【００５８】
もちろん、前記の方法は、ミセルカゼインからの酸可溶性蛋白質の単離又は精製の一例に過ぎない。当業者は、それらを得るその他の方法を容易に考えることができよう。
【００５９】
例えば、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、酵素（例えば、レンネット）処理後、少なくとも一部はカゼインに結合したままである。この場合、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、ミルクを酵素的に処理し、その後凝固したカゼインによって形成されたカード（凝乳）を回収することによって得ることが可能である。次に、ミセルカゼインの酸可溶性画分は、例えば、前述のような酸性化によってカード（凝乳）から少なくとも部分的に単離することができる。
【００６０】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質が主に、切断されたカゼイン画分に結合したままである限り、このような方法の代わりに遠心又は超遠心によってミセルカゼインを単離できるだろう。
【００６１】
ミルク又はスキムミルクの酸性化によってミセルカゼインの酸可溶性蛋白質を回収することはまた、可能であり得る。次に、本発明による蛋白質は、酸ホエイから分離しなければならない。後者の酸ホエイにはさらにその他の可溶性ミルク成分（主に、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン）を含んでいる。これは、前述のホエイ画分の選択的除去に適した任意の適切な分離技術、例えば、ＨＩＣ又はイオン交換クロマトグラフィーによって実施することができる。
【００６２】
本発明は、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質がＧＬＰ−１及び（それと連動した）ＧＬＰ−２遊離を促進するために適した生物活性成分を含むという驚くべき認識に基づいている。
【００６３】
しかし、ミセルカゼインから酸可溶性蛋白質をさらに亜分画して、スクリーニングしたところ、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質のいくつかの亜画分が好ましいことが明らかになった。
【００６４】
より有効な亜画分のさらなる分離及び単離は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、又は疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩ−ＨＰＬＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）などによって実施することができ、いずれも例えば、同一の分離原理をベースとしている。
【００６５】
ＨＩＣの原理は、当業者には公知である。一般的に、試料を保持する疎水性物質を含む平衡化カラム（固定相）に試料を添加する。該疎水性物質は、例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ Ｘａｄ１６（Ｒｏｈｍ ａｎｄ ＨａｓｓのＸＡＤ１６）として市販されている多孔性架橋結合ポリスチレンである。Ａｍｅｒｓｈａｍ製の１５ＲＰＣ ＴＮ１７−０７２７−０２（ポリスチレン−ジビニルベンゼン）又は同等物もまた、使用することができる。
【００６６】
本発明による蛋白質画分を該カラムに添加する前に、カラムを緩衝液で平衡化してよい。該画分を添加した後、緩衝液又は緩衝液の混合物（移動相）をカラムに流し、それによって緩衝液の混合物が変化し、カラムからの各画分の疎水性によって蛋白質亜画分の溶出特性が変化しうる。
【００６７】
この方法によるホエイ蛋白質の分離は、「ポリスチレン−ジビニルベンゼンの逆相高速液体クロマトグラフィーによるプロテオースペプトン及びカゼインマクロペプチドを含む主要なウシホエイ蛋白質の同時分離及び定量（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｂｏｖｉｎｅ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｏｓｅ ｐｅｐｔｏｎｅ ａｎｄ ｃａｓｅｉｎｏｍａｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ−ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ）」Ｄ．Ｆ．Ｅｌｇａｒ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ８７８（２０００）１８３〜１９６に記載されている。
【００６８】
カラムから溶出した蛋白質亜画分は、緩衝液混合物の組成又は固定相からの溶出に影響を与えるアセトニトリル含量によって正確に表現することができる。
【００６９】
例えば、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、ポリスチレン−ジビニルベンゼンビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製１５ ＲＰＣ ＴＮ１７−０７２７−０２）を充填したカラムに添加することができ、緩衝液Ａは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１体積％が含まれる水として定義することができ、緩衝液Ｂはアセトニトリル８０体積％及びＴＦＡ０．８５体積％が含まれる水と定義することができる。
【００７０】
次に、緩衝液Ａ及びＢの混合及び移動は、特定の系、例えば、ＦＰＬＣ（中高圧液体クロマトグラフィー）ＵＮＩＣＯＲＮステーション（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって制御し、カラムを通過させることができる。
【００７１】
溶出した蛋白質亜画分は、前述の緩衝液Ａ及びＢの混合比の溶出範囲によって定義することができる。特定の緩衝液組成物を使用して、本発明による蛋白質画分の溶出時に存在するアセトニトリルの相対量によって蛋白質亜画分の溶出時間又は間隔を簡単に説明することができる。しかし、溶出順番はｐＨ依存性であることに注意されたい。
【００７２】
以下の表１は、緩衝液Ｂの体積−パーセント範囲又はアセトニトリルにおける範囲によって本発明によるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の１４個の酸可溶性蛋白質亜画分を定義し、その中で本発明の好ましい実施形態による亜画分が溶出する。
【００７３】
【表１】
【００７４】
所望ならば、該亜画分は留去、超遠心、又は透析によって濃縮するか、又は乾燥前に真空、凍結、噴霧、流動床、乾燥機若しくはその他の任意の適切な乾燥方法によって有機溶媒を排除することができる。
【００７５】
亜画分５、６、７、８、９、１０及び１１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＬＰ−１遊離の促進に特に効果的で、本発明の意味において好ましい実施形態を構成する。亜画分５、７、８及び１１は、さらにより好ましい実施形態を構成する。
【００７６】
亜画分５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞モデルにおいて毒効果を有することが示されたので、この画分はヒト又は動物における適用性は損なわれたことを証明した可能性がある。
【００７７】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいてＧＬＰ−１分泌を促進する生物学的に活性のある成分を含む。
【００７８】
したがって、該画分又は選択された亜画分は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２又はインシュリンによって左右される、又は制御される任意のプロセスを調節するために使用することができる。Ｉ型又はＩＩ型糖尿病の予防又は治療、血中グルコース濃度の調節、胃運動性及び分泌の阻害、液体及び固形物の胃内容排出の減少、小腸通過の減少、平滑筋活性の阻害、食事誘導性グルコース変動の減少、腸における栄養素の酵素的分解及び吸収の遅延、食欲の低下、食物摂取減少などが例である。
【００７９】
例えば、該画分を使用して、ヒト又は動物の全体的な消化吸収活性を減少させることができる。
【００８０】
該蛋白質画分は、消耗品又は医薬品に添加することができる。消耗品の例は、栄養調製乳、乳児用調製乳又は臨床用調製乳である。その他の例は、飲料、例えば、貯蔵安定飲料、冷蔵飲料又はすぐに飲める飲料である。該画分は、その他の食品、例えば、チョコレート、バー、シリアル、乳製品、アイスクリーム、冷凍食品、ペットフード、コーヒー、カプセル、錠剤などに添加することができる。
【００８１】
以下の実施例は、本発明の主題内容となるものを例示するためにだけに挙げたものであり、けっして本題内容を限定するものではない。パーセント及び部は、他に指示がなければ、重量による。
【実施例１】
【００８２】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の単離
牛乳は、地元の市場（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｔｏｎｉ ｌａｉｔ、２０００−０２−０１）で購入した。
【００８３】
クリームは、１，０００ｇと４，５００ｇとの間で遠心することによって全乳から抽出した。この段階の選択性は、固定角ロータＳｏｒｖａｌｌ ＧＳ３を使用して１３，６００ｇまで加速することによって（３０分間は９，０００ｒｐｍ）向上した。全乳２２００ｍｌから開始すると、クリーム９０ｇが上層に回収された。
【００８４】
次に、ＣａＣｌ２ ２００ｍＭ、２５０μｌをスキムミルク２５０ｍｌに添加して、最終濃度を２ｍＭにした。このミルクを固定角ロータ４５ ＴＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ８−６０Ｍ超遠心機、遠心管中央部での１００，０００ｇに対応する３２，０００ｒｐｍ）で、１時間超遠心して（遠心管６本にスキムミルク４２．１ｇずつ含まれる）、不溶性ミセルカゼインからホエイを分離した。
【００８５】
ミセルカゼイン（２４ｇ）は、ＣａＣｌ２ ２ｍＭ／ＮａＣｌ ０．９％、２２０ｍｌに分散させて、前記のように超遠心した。回収した洗浄ミセルカゼイン２２ｇをＣａＣｌ２ ２ｍＭ／ＮａＣｌ ０．９％に分散させて、量を２５０ｍｌに調節した。分取して、不溶性蛋白質（ミセルカゼイン）と明示して、凍結した。
【００８６】
全乳１９０ｇから開始して、洗浄した不溶性蛋白質の沈殿物（１７ｇ）を酢酸ナトリウム２０ｍＭ ｐＨ４．６、４０ｍｌに分散させた（Ｐｏｔｔｅｒ）。
【００８７】
カゼインの緩衝作用のため、ｐＨ（６．５）は酢酸を添加することによって４．６に調節し、量は酢酸緩衝液を添加することによって初期ミルク量の半分（９０ｍｌ）に調節した。次に、溶液を遠心して（１２，０００ｇ、３０分）、上清（７７ｇ）はミセルカゼインの酸可溶性蛋白質と明示した。
【００８８】
以下の実施例３のために、試料を液体窒素に浸漬することによって凍結し、−２０℃で保存した。
【実施例２】
【００８９】
様々なミルク画分によって促進されたＧＬＰ−１遊離
材料及び方法
ＭＨ（肉加水分解物）及びＥＡＨ（卵アルブミン加水分解物）は、Ｓｉｇｍａから購入した。マトリゲルはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。ＣＧＭＰは、ＷＯ９８５３７０２に記載されたように得た。
【００９０】
スキムミルク、スイートホエイ、酸ホエイ、酸カゼイン、可溶性蛋白質、不溶性蛋白質（ミセルカゼイン）を得るための分画段階は、従来のミルク工程（Ａｌａｉｓ Ｃ．１９８４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｕ ｌａｉｔ、Ｐｒｉｎｃｉｐｅ ｄｅｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｌａｉｔｉｅｒｅｓ、４版、ＳＥＰＡＩＣ、Ｐａｒｉｓ、２９〜３５、１５９〜１７８）を応用した。遠心は高加速で実施し、不溶性画分を洗浄して、選択性及び分離効率を高めた。
【００９１】
酸カゼインは、スキムミルクを酸処理した後の沈殿物から収集されたカゼインである。可溶性蛋白質は、スキムミルクを１００，０００ｇ（実施例１も参照のこと）で１時間超遠心した後、水溶液中に回収された蛋白質で、不溶性蛋白質（ミセルカゼイン）は、その後沈降物に回収された部分である。
【００９２】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、実施例１から得られ、基本的に前段落で生じた酸カゼインを酸性化し遠心することによって得られた。
【００９３】
ＮＣＩ−Ｈ７１６ヒト腸細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２５１）は、５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベータ内で３７℃で培養した。増殖のために、細胞は１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及びＬ−グルタミン２ｍＭを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）に懸濁して増殖させた。分泌研究では、細胞はマトリゲルコーティングプレートに入れ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及びＬ−グルタミン２ｍＭを添加したＤＭＥＭ（低グルコース）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）中で２日間インキュベートした。
【００９４】
実験の２日前に、細胞を１２ウェルプレートに細胞１００万個／ウェルで入れた。実験日に、細胞をＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）で１回洗浄し、様々な蛋白質溶液の存在下で３７℃で２時間インキュベートした。試験蛋白質は、０．２％ＢＳＡ（画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ）を含有するＫＲＢＢ（クレブス−リンガー平衡緩衝液）ｐＨ７．４、１ｍｌに溶解した。インキュベート終了時に、上清をＰＭＳＦ ２００ｍＭ、１００μｌに回収し、すぐに−８０℃で凍結した。
【００９５】
蛋白質溶液は、培地１ｍｌ当たり蛋白質０．５ｍｇ及び５ｍｇの２種類の濃度で添加した。
【００９６】
結果
図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＬＰ−１遊離に対する異なる濃度（０．５及び５ｍｇ／ｍｌ）のミルク蛋白質画分の様々な効果を示す。実施例１によって得られたミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は、低濃度でも（０．５ｍｇ／ｍｌ）ＧＬＰ−１遊離に対して最も強い影響を及ぼす。
【００９７】
結論として、実施例１による方法によって得ることができるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質は生物活性成分を含む。これらは、ヒト又は動物の体の疾患の予防又は治療に使用することができる。ＧＬＰ−１が遊離することから、例えば、糖尿病及び肥満の予防及び治療におけるこれらの成分の有用性及び産業上の利用性が示唆される。
【実施例３】
【００９８】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の亜分画
疎水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、以下のように実施した。Ｓｏｕｒｃｅ１５ ＲＰＣ ＴＮ １７−０７２７−０２（ポリスチレン−ジビニルベンゼン）１００ｍｌを充填したＨＲ１６ｘ５０カラムをＵＮＩＣＯＲＮステーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって制御されたＦＰＬＣ系に連結した。ＨＣＩ酸可溶性画分（実施例１参照）１５ｍｌは３７℃の水浴で２０分かけて解凍し、ボルテックスによって混合し、５４１５ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機で１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。ミリポアフィルター０．４５μｍ（３０６／ＧＳＷＰ０４７００．ＧＳ）で濾過した後、この調製物１０ｍｌを注入した。
【００９９】
クロマトグラフィーの条件は、Ａ緩衝液：ＴＦＡ０．１％が含まれる水（０．４５μｍミリポアシステムで濾過したｍｉｌｉＱ水２０００ｍｌ及びＴＦＡ ２ｍｌ（Ｓｉｇｍａ９１６９９、１００ｍｌ）、Ｂ緩衝液：アセトニトリル８０％、ＴＦＡ ０．８５％（０．４５μｍミリポアシステムで濾過したｍｉｌｉＱ水４００ｍｌ及びアセトニトリル １６００ｍｌを超音波槽で１５分間脱気し、最終的にＴＦＡ １．７ｍｌを添加する）であった。
【０１００】
カラムは、Ｂ緩衝液２０％で平衡化した。次に、１カラム体積（ＣＶ）後、試料を注入して、Ｂ緩衝液を１５ＣＶで７５％に、２．５ＣＶで１００％に増加させた。最終的に、勾配は０．４ＣＶでＢ緩衝液２０％に減少させた。流速は、３ｍｌ／分に固定した。
【０１０１】
１８ｍｌずつ９６画分をプラスティック管に収集した。画分は−２０℃に維持した。ＨＰＬＣ分析後、収集した管９６本をＨＰＬＣプロフィールに対応させることによって１４個の画分に集め、その後のスクリーニングのために、留去することによって濃縮してから凍結乾燥した。
【０１０２】
２１５ｎｍでのＵＶ吸収を記録して、対応するＨＩＣプロフィールを図３に示す。
【０１０３】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の１４個の亜画分は、カラムからの溶出時点及び記載した表１の対応するアセトニトリル濃度（疎水性）によって特性決定する。
【実施例４】
【０１０４】
実施例３の亜画分によって促進されるＧＬＰ−１遊離
実施例３で得られた亜画分は、実施例２で説明したような実験計画に従ってＧＬＰ−１遊離促進能をスクリーニングした。亜画分はすべて、５００μｇ／ｍｌで試験した全亜画分を含む「全体」以外は、３０μｇ／ｍｌ培地で試験した。
【０１０５】
この実験で、疎水性クロマトグラフィープールは、実施例２のミセルカゼインの最初の酸可溶性蛋白質の濃度より１６〜１７倍低い濃度で試験した（５００μｇ／ｍｌに対して３０μｇ／ｍｌ）ことが記載されている。
【０１０６】
結果を図２に示す。ほとんどすべての画分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＬＰ−１遊離の増加を引き起こした。並はずれて強い増加が非常に低い蛋白質濃度で（蛋白質３０μｇ／ｍｌ培地）亜画分５、７、８で認められ、９、１０及び１１でもまた認められた。
【０１０７】
しかし、亜画分５は細胞系に毒作用を有することが見いだされた。
【０１０８】
結論として、亜画分７、８、９、１０及び１１は、生物活性分子又は成分を含む。これらは、特にＩＩ型糖尿病、おそらくまたＩ型糖尿病又は肥満の治療に薬剤として役立つ可能性がある。ヒト又は動物の体におけるＧＬＰ−１の様々なその他の作用によって、特許請求の範囲に挙げたような亜画分の他の適用が説明される。
【実施例５】
【０１０９】
ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質を含む栄養調製乳
推奨値（３１５ｋＪ／ｄｌ）にしたがって、乾燥物質の重量の割合で、蛋白質１４％、炭水化物６２％、脂肪１８％並びに無機質及びビタミン３．２％を含む栄養調製乳は、実施例１によるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質によって完成する。
【０１１０】
該酸可溶性蛋白質は、生理学的有効量で添加する。完全な専用調製乳（予定使用量は１日当たり２ｌである）では、最終濃度は調製乳の０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌに調節した。その他の食物への補給剤として有用な調製乳（予定使用量は１日当たり２ｄｌである）では、濃度は調製乳の１〜５ｍｇ／ｍｌに調節した。状況及び個々の必要性によってより高い用量を使用する。
【実施例６】
【０１１１】
ミセルカゼインの亜画分酸可溶性蛋白質を含む栄養調製乳
実施例５の調製乳は、実施例１による蛋白質の代わりに実施例３で得られた亜画分７及び８の蛋白質に富んでいる。
【０１１２】
栄養調製乳における亜画分の乾燥物質の量は、完全な調製乳に対しては５〜２５μｇ／液体調製乳１ｍｌであり（実施例５参照）、２ｄｌ（補給剤）の１日用量に対しては５０〜２５０μｇ／ｍｌに調節する。
【０１１３】
亜画分を含む高用量調製乳もまた調製した（前述の２ｄｌの補給剤に対して１０倍に濃縮）。本発明の蛋白質の濃度は、２ｄｌにおいて０．５〜２．５ｍｇ／ｍｌであった。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】牛乳の様々な蛋白質画分によって刺激されたｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＬＰ−１遊離を比較した図である。蛋白質類は、低濃度でも最高のＧＬＰ−１遊離効果を示した本発明によるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質（斜線の棒）以外は、０．５ｍｇ／ｍｌ（斜線の棒）及び５ｍｇ／ｍｌ（黒い棒）で投与した。ミルク抽出物は、０．２％ＢＳＡを含むクレブスリンガー平衡緩衝液（ＫＲＢＢ）、ｐＨ７．４中で調製した。対照は、緩衝液（ＫＲＢＢ）及びＢＳＡ（０．２％）のみから構成される。
【図２】ミセルカゼインの酸溶出蛋白質の様々な画分によって刺激されたｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＧＬＰ−１遊離を比較した図である。異なる亜画分を同一濃度（３０μｇ／ｍｌ）で投与したところ、特に亜画分５、７、８、１０及び１１がＧＬＰ−１分泌に顕著な効果を示すことが発見された。１４画分すべての元の混合物を含む全体は、より高い濃度（５μｇ／ｍｌ）で投与した。
【図３】ミセル蛋白質の酸可溶性蛋白質の１４画分のＨＩ−ＨＰＬＣ（疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー）のクロマトグラムを示した図である。水平軸は、前記１４個の異なる亜画分に分画したミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の疎水性の増加を示す。垂直軸は、２１４ｎｍのＵＶで測定した、カラムから溶出した蛋白質量を示す。 図の更なる詳細は実施例により説明されうる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミセル又は酵素処理カゼイン及びホエイ蛋白質を分離する段階、
ミセルカゼイン又は酵素処理カゼインをｐＨ６未満に酸性化する段階、
酸可溶性蛋白質をカゼインから分離する段階、及び
酸可溶性蛋白質の様々な亜画分を分離する段階
を含む、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の画分を得る方法。
【請求項２】
疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得ることができ、アセトニトリル２６．４体積％から３６体積％を含む移動相によって疎水性固定相から溶出することを特徴とするミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の亜画分。
【請求項３】
疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得ることができ、アセトニトリル４３．２体積％から４６．４体積％を含む移動相によって疎水性固定相から溶出することを特徴とするミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の亜画分。
【請求項４】
医薬品として、又はヒト若しくは動物の体の予防的若しくは治療的処置として使用するミセルカゼインの酸可溶性蛋白質。
【請求項５】
請求項２に記載の蛋白質、請求項３に記載の蛋白質、プロテオースペプトン５、プロテオースペプトン８、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン、血清アルブミン、イムノグロブリン及びそれらの混合物から成る群から選択された蛋白質を含む請求項２から４までに記載の酸可溶性蛋白質。
【請求項６】
インシュリン分泌及び／又はプロインシュリン遺伝子発現を増強する消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項７】
Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病の予防又は治療のための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項８】
ＧＬＰ−１及び／又はＧＬＰ−２分泌の増加及び／又は血中グルコース濃度の調節のための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項９】
胃内容排出及び胃酸分泌を減少させるための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項１０】
食欲を制御し、食物摂取を減少させ、且つ／又は満腹感を高めるための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項１１】
傷害又は機能障害を特徴とする腸障害を治療するため、且つ／或いは腸粘膜の厚さ及び／又は表面領域を増大するための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項１２】
請求項２から５までのいずれかに記載の蛋白質画分又は亜画分を含む消耗品。
【請求項１】
ミセル又は酵素処理カゼイン及びホエイ蛋白質を分離する段階、
ミセルカゼイン又は酵素処理カゼインをｐＨ６未満に酸性化する段階、
酸可溶性蛋白質をカゼインから分離する段階、及び
酸可溶性蛋白質の様々な亜画分を分離する段階
を含む、ミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の画分を得る方法。
【請求項２】
疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得ることができ、アセトニトリル２６．４体積％から３６体積％を含む移動相によって疎水性固定相から溶出することを特徴とするミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の亜画分。
【請求項３】
疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得ることができ、アセトニトリル４３．２体積％から４６．４体積％を含む移動相によって疎水性固定相から溶出することを特徴とするミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の亜画分。
【請求項４】
医薬品として、又はヒト若しくは動物の体の予防的若しくは治療的処置として使用するミセルカゼインの酸可溶性蛋白質。
【請求項５】
請求項２に記載の蛋白質、請求項３に記載の蛋白質、プロテオースペプトン５、プロテオースペプトン８、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン、血清アルブミン、イムノグロブリン及びそれらの混合物から成る群から選択された蛋白質を含む請求項２から４までに記載の酸可溶性蛋白質。
【請求項６】
インシュリン分泌及び／又はプロインシュリン遺伝子発現を増強する消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項７】
Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病の予防又は治療のための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項８】
ＧＬＰ−１及び／又はＧＬＰ−２分泌の増加及び／又は血中グルコース濃度の調節のための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項９】
胃内容排出及び胃酸分泌を減少させるための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項１０】
食欲を制御し、食物摂取を減少させ、且つ／又は満腹感を高めるための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項１１】
傷害又は機能障害を特徴とする腸障害を治療するため、且つ／或いは腸粘膜の厚さ及び／又は表面領域を増大するための消耗品又は医薬品の調製におけるミセルカゼインの酸可溶性蛋白質の使用。
【請求項１２】
請求項２から５までのいずれかに記載の蛋白質画分又は亜画分を含む消耗品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５２５４０４（Ｐ２００７−５２５４０４Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０８３６０（Ｐ２００５−５０８３６０）
【出願日】平成１５年８月３０日（２００３．８．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００９６６９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１５８９
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月３０日（２００３．８．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００９６６９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１５８９
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５９９１３２９０４）ネステク ソシエテ アノニム (637)
【Ｆターム（参考）】
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