ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤
本発明は、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための方法を目的とする。本方法は、アルミニウムアジュバント上に吸着された免疫原を含む液体製剤を霧化して、霧化製剤を生成するステップと、霧化製剤を凍結して凍結粒子を生成するステップと、凍結粒子を乾燥させて乾燥粉末粒子を生成するステップとを含む。ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を含む医薬組成物も、本明細書で開示される。本医薬組成物は高温で安定であり、薬学上許容される担体中で再調製して、粒子凝集をほとんど、または全く示さず、免疫原性を保持する再調製された液体ワクチンを生成することができる。特定の免疫原と関連している対象疾患を予防および治療するために、ミョウバン吸着ワクチン組成物を用いる方法が、さらに提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦後援の研究または開発
本発明は、米国の医療研究資材本部（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｃｏｍｍａｎｄ）によって与えられた契約番号ＤＡＭＤ１７−０３−２−００３７の下で、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製する方法、乾燥したワクチン粒子の安定粉末製剤を含む医薬組成物、ならびに疾患の予防および治療にこれらの組成物を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ型肝炎は、感染血液および体液への曝露によって伝染する、重大なウイルス性肝臓感染症である。概算で１２００万人のアメリカ人、および世界中で２０億人の人々がＢ型肝炎に感染している。Ｂ型肝炎に感染するほとんどの健康成人は回復して防御抗体を形成するが、かなり多数の患者、特に幼児および小児は、生命にかかわる肝硬変、肝不全または肝癌をもたらすことのできる慢性Ｂ型肝炎感染症を起こす。毎年、世界中で約１００万人が、Ｂ型肝炎感染症から死に至る。（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
Ｂ型肝炎ウイルスは、内部コアおよび外側のエンベロープを含むＤＮＡウイルスである。ワクチンのエンベロープ外側は、「Ｂ型肝炎表面抗原」または「ＨＢｓＡｇ」と呼ばれるタンパク質を含む。コア内部は、ウイルスＤＮＡおよびウイルスの複製で用いられるＤＮＡポリメラーゼ酵素を含む。コア内部の抗原性因子は、当技術分野でしばしば「ＨＢｃＡｇ」と呼ばれる。Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）およびＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．社）を含むＢ型肝炎のための市販ワクチンが利用可能であるが、これらの液体製剤は冷凍条件下で最適に保存および輸送され、極限条件（例えば、高温、凍結融解サイクル、長期保存など）に耐えるように設計されていない。したがって、そのような極限条件下での保存および輸送に適する、安定粉末製剤としてのＢ型肝炎ワクチンの開発が有益であろう。
【０００５】
Ｂ型肝炎などのより「伝統的な」疾患のための安定粉末ワクチン製剤の有利な特性の認識に加えて、最近の世界情勢では、バイオテロリスト剤としての生物合成物の使用と戦うために、予防的または治療的に使用できる類似したワクチン製剤の開発に対するかなり大きな関心を引き起こした。ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）は、ヒトに最も毒性の強いタンパク質の１つであり、したがって、テロリストによって使用される可能性のある生物兵器を代表する。ボツリヌス中毒は、ＢｏＮＴが運動ニューロンのシナプシスに結合して、神経伝達物質アセチルコリンの放出を阻止する、潜在的に致命的な神経障害である。その結果、ＢｏＮＴへの曝露は視朦、嚥下障害、一般の呼吸麻痺および筋骨格麻痺、ならびに、毒素への曝露から数日以内に呼吸不全または心不全に起因する死をもたらすことができる。細菌ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）の７つの異なる血清型が公知であり、各株は、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧと命名されたＢｏＮＴの異なる形態を形成する。最も広く研究されているＢｏＮＴであるＢｏＮＴ／Ａは、約１５０ｋＤａの一本鎖タンパク質として、特定のボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）株で合成される。この一本鎖タンパク質は、切断されて、ジスルフィド結合によって連結される１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）および５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）を生成する。（例えば、非特許文献２および３を参照）。
【０００６】
炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）は、肺型（すなわち、吸入性）、皮膚型および胃腸型の炭疽病原体である。エアゾール化炭疽胞子の作製の可能性は、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を最適なバイオテロリスト剤にした。この細菌のエアゾール化または兵器化形態から生じる吸入性炭疽は、曝露直後および症状の出現前に処置されないならば、ほぼ１００％の死亡率を有する。吸入性炭疽罹患患者は、初期には一般に高熱および胸痛を訴え、それは、速やかに全身出血病状および心停止もしくは呼吸停止に進行する。約９０株の炭疽菌が公知であり、それらは、良性株から、生物兵器として用いることができそうな非常に強病原性の株まで様々である。病原性の強い炭疽菌株は、それ自身無毒性であるが疾患の侵襲性段階を媒介するポリ−Ｄ−グルタミル莢膜、および多成分毒素を含む。炭疽毒素は、それぞれ約８０ｋＤａの３つの異なる抗原成分を有し、浮腫因子（「ＥＦ」または「第Ｉ因子」）、防御抗原（「ＰＡ」または「第ＩＩ因子」）および致死因子（「ＬＦ」または「第ＩＩＩ因子」）と呼ばれている。防御抗原は炭疽毒素の結合ドメインを含んでいるが、そのように名づけられたのは、ある哺乳動物に投与されたときに、それは防御性の抗毒素抗体を誘導するからである。以前の研究では、炭疽毒素が示す致死作用を生成するのに、致死因子が必要であることが証明された。実験動物では、致死因子および防御抗原のみの組合せが致死性であることがわかっている。炭素菌および炭素の総論については、参考文献を参照（例えば、非特許文献４、５および６を参照）。炭疽菌によるバイオテロリスト攻撃の重大な脅威にもかかわらず、米国では現在ただ１つの炭疽ワクチンだけが用いられ、防御免疫を引き出すために複数の用量を数カ月にわたって投与しなければならない。
【０００７】
ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）は、細菌黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）によって生成される約２８ｋＤａのエンテロトキシンであり、従来から、非冷凍の肉および乳製品から生じる食中毒と関連している。ＳＥＢに起因する食中毒の古典的な徴候は、一般に自己限定的で２４時間以内に解消する胃腸症状の突然の開始である。現在の国際的な政治情勢の中で非常に懸念されているのは、ＳＥＢが潜在的なバイオテロリスト剤であるという事実である。ＳＥＢは安定で、容易にエアゾール化され、全身性の傷害、多臓器不全、敗血性ショック、および、非常に高いレベルで吸入された場合には死さえ引き起こすことができる。ＳＥＢの吸入の症状には、高熱、息切れ、激しい胸痛、および、重度の場合には、肺水腫および成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）が含まれるが、それらに限定されない。したがって、ＳＥＢ、特にエアゾール化ＳＥＢは、重大なバイオテロリスト脅威となる。
【０００８】
グラム陰性細菌ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）は、ペストを引き起こす。ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）は、細菌細胞に食作用阻止特性を与える分画１莢膜抗原（すなわち、「Ｆ１」）、および、宿主の生得的な免疫応答を抑制するＶ抗原を含む。Ｆ１−Ｖと呼ばれる前記２つの抗原を含む融合タンパク質が生成されている。（例えば、非特許文献７を参照）。
【０００９】
ヒトでは、ペストの３つの臨床型、すなわち、腺ペスト、敗血症性ペストおよび肺ペストが存在する。肺ペストは、ペスト菌感染症の最も重大な形態であり、細菌が肺に感染して肺炎を引き起こすときに起こる。一次肺ペストは、ペスト菌細菌の直接吸入から、例えば感染した人から未感染個体への空気伝染により、またはエアゾール化細菌の意図的な放出（例えば、バイオテロリスト攻撃）により生じる。（例えば、非特許文献８を参照）。肺ペストは約１〜６日の潜伏期間を有し、例えば、激しい頭痛、悪寒、倦怠感の急激な開始、および呼吸数および心拍数の増加を特徴とする。（同書）。これらの症状は速やかに肺炎に進行し、未処置のまま放置すると、究極的に呼吸不全および死に至ることがある。（例えば、非特許文献９を参照）。適時に（すなわち、疾患の開始から約２０時間以内に）投与される場合は、適当な抗生物質は死亡率を低下させるが、特に多数の個体を曝露させることができ、抗生物質の国家備蓄を速やかに消耗させることができるバイオテロリスト事件の場合には、肺ペストに起因する致死率は高いままである。
【００１０】
ＣＤＣおよび国家安全保障省（Ｈｏｍｅｌａｎｄ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ）は、ペスト菌を潜在的バイオテロリスト兵器、すなわち、特に危険な脅威をもたらす兵器の当然の選択としての候補とみなしたが、それは次の理由による。１）あらゆる大陸でのその自然発生、２）野生動物および家畜化された動物の保有体、ならびに人工装置からのその伝播の容易さ、３）抗生物質の入手が容易なこの時代における医師の油断と合わさったのかもしれないが、その臨床所見についての現在の経験の不足、４）細菌を量産する能力、５）遺伝子改変された抗生物質耐性株を生成してエアゾール化することができることによる容易さ、ならびに６）一次肺ペストが汚染されたエアゾール液滴の吸入を通して人から人へ広がることができるという事実。（例えば、非特許文献１０〜１６を参照）。
【００１１】
バイオテロリスト剤としてのＢｏＮＴ、炭疽菌の毒性株、ＳＥＢまたはペスト菌（例えば、Ｆ１−Ｖ）の潜在的な使用は、ＢｏＮＴ、炭疽、ＳＥＢおよび／またはペスト菌に対する安定粉末ワクチンの開発を有利にし、そのようなワクチンが医療関係者または非医療関係者によって、最低限の侵襲性の方法を含む様々な技術によって投与され得る場合は特に有利である。安定化されたＢｏＮＴ、炭疽、ＳＥＢおよびペスト菌ワクチン製剤は、バイオテロリスト攻撃の事件または脅威の発生時に、最初の対応者、軍人、および、おそらく一般大衆に対してさえも、予防的免疫感作を可能にするために容易に再調製すること（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）ができよう。複数のバイオテロリスト剤に対して防御免疫を提供する安定した多価ワクチンが、特に有利である。
【００１２】
Ｂ型肝炎ワクチンおよび炭疽ワクチンなどのワクチンは、免疫原に対する対象の免疫応答を高めるために、一般に少なくとも１つのアジュバントを含有する。ワクチンの免疫原性を高めるために、アジュバントとしてアルミニウム塩が多用される。しかし、ミョウバン吸着ワクチンの保存のために液状の生物学的生成物を安定させるための従来の手法の適用は、問題を含んでいる。詳細には、従来の凍結乾燥、凍結およびフリーズ・ドライ工程を適用した場合、ミョウバン吸着ワクチンは一般に凝集、免疫原濃度の低下および免疫原性の喪失を示す。（例えば、その全てが参照により本明細書に組み込まれている、非特許文献１７〜２０を参照）。安定性および免疫原性を喪失させずに再調製することができる、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を生成するために従来の方法を使用することは、ほとんど不成功であった。したがって、凝集、免疫原性の喪失および免疫原濃度の低下の問題に対処するミョウバン吸着ワクチンの安定粉末剤形を含んでいる医薬組成物。生じた安定粉末ワクチンは、粒子凝集または免疫原性または免疫原濃度の減少をほとんどまたは全く示さない有効な液体ワクチンを生成するために、希釈剤中で容易に再調製可能でなければならない。そのような方法は、ミョウバン吸着ワクチンの長期保存を容易にし、これらのワクチンの保存寿命を延長させ、冷蔵保存および輸送が利用できない地域でのそれらの使用を可能にし、様々な技術（例えば、医療関係者を必要としない潜在的に最低限の侵襲性の投与方法）による対象へのワクチン投与を可能にし、かつ、特にバイオテロリスト剤に関しては、ワクチンの備蓄を容易にするであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１８０７５５号明細書
【特許文献２】米国特許第４６０８７６４号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂ型肝炎財団のウェブサイトhepb. org/index.html.
【非特許文献２】Li and Singh (2000) Biochem. 39:6466-6474
【非特許文献３】Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nature Structural Biol. 7:693-699
【非特許文献４】Bravata et al. (2006) Annals Intern. Med. 144(4):270-280
【非特許文献５】Todor's Online Textbook of Bacteriology: Bacillus anthracis and anthrax at textbookofbacteriology.net/Anthrax.html (University of Wisconsin-Madison Department of Microbiology)
【非特許文献６】Brock Biology of Microorganisms (M. Madigan and J. Martinko, eds.; Prentis Hall, 2005)
【非特許文献７】Santi et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:861-866
【非特許文献８】Kool (2005) Healthcare Epidemiology 40:1166-1172
【非特許文献９】Josko (2004) Clin. Lab. Sci. 17:25-29
【非特許文献１０】Finegold et al. (1968) Am. J. Path. 53:99-114
【非特許文献１１】Walker (1968) Curr. Top. Micro. Immun. 41:23-42
【非特許文献１２】Walker (1968) J. Infect. Dis. 118:188-96
【非特許文献１３】Beebe and Pirsch (1958) Appl. Microbiol. 6:127-138
【非特許文献１４】Williams et al. (1994) J. Wildlife Dis. 30:581-585
【非特許文献１５】Watson et al. (2001) Veter. Path. 38:165-172
【非特許文献１６】Green et al. (1999) Med. Micro. 23:107-113
【非特許文献１７】Maa et al. (2003) J. Pharm. Sci. 92:319-332
【非特許文献１８】Diminsky et al. (1999) Vaccine 18:3-17
【非特許文献１９】Alving et al. (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690:265-275
【非特許文献２０】Warren et al. (1986) Ann. Rev. Immunol. 4:369-388
【非特許文献２１】Jiang et al. (2006) J. Pharm. Sci. 95:80-96
【非特許文献２２】Virology 3rd Edition (W. K. Joklik cd. 1988)
【非特許文献２３】Fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. 1991)
【非特許文献２４】J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed. [Pierce Chemical Co., Rockford, III., (1984)]
【非特許文献２５】G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2 [E. Gross and J. Meienhofer, eds., Academic Press, New York (1980)]
【非特許文献２６】M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag Berlin (1984))
【非特許文献２７】The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1 E. Gross and J. Meienhofer, eds.
【非特許文献２８】Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California
【非特許文献２９】Remington 's Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990)
【非特許文献３０】Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)
【非特許文献３１】Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I-III (Ausubel, R. M., ed. (1994))
【非特許文献３２】Cell Biology: A Laboratory Handbook, Volumes I-III (J. E. Celis, ed. (1994))
【非特許文献３３】Current Protocols in Immunology, Volumes I-III (Coligan, J. E., ed. (1994))
【非特許文献３４】Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)
【非特許文献３５】Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985))
【非特許文献３６】Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984))
【非特許文献３７】Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986))
【非特許文献３８】Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986))
【非特許文献３９】B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)
【非特許文献４０】Little et al. (1990) Infect. Immunol. 58(6):1606-1613
【非特許文献４１】Hering et al. (2004) Biologicals 32(l):17-27
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための方法を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本方法は、アルミニウムアジュバント上に吸着された免疫原を含む液体製剤を霧化して霧化製剤を生成するステップと、霧化製剤を凍結させて凍結粒子を生成するステップと、凍結粒子を乾燥させて乾燥粉末粒子を生成するステップとを含む。凍結粒子の乾燥ステップは、特に振動、内部構造物（ｉｎｔｅｒｎａｌｓ）および／または機械的攪拌の存在下では、およそ大気圧で実施することができる。
【００１７】
本発明の医薬組成物には、最適ではない条件（例えば、高温、凍結融解など）に置かれた場合でも安定している、粒子状、粉末状のワクチンが含まれる。本明細書で開示される粉末ワクチン製剤を希釈剤で再調製して、粒子凝集をほとんどまたは全く示さず、免疫原濃度の重大な低下を示さず、免疫原性および／または抗原性のかなり高いレベルを保持し、対象とする疾患または障害に対する防御効能を維持することのできる、再調製液体ワクチンを生成することができる。さらに、本発明の粉末ワクチン製剤および再調製ワクチン製剤は、様々な方法、特に最低限の侵襲性の投与技術を用い、医療関係者または非医療関係者による、投与に適し得る。ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を含んでいる医薬組成物（またはその再調製された液体形態）、ならびに、個々の疾患、障害およびその症状を予防および治療するためにこれらの組成物を用いる方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】様々な液体のおよび噴霧フリーズ・ドライ処理した（ＳＦＤ）Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン製剤で０日目に得られた沈降速度曲線を示す図である。以下の製剤のデータを示す。製剤１（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン）；対照２（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース）；製剤２（ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース）；対照３（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース）；および製剤３（ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース）。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図１Ｂ】４℃で２８日間ワクチンを保存した後の沈降速度を示す図である。以下の製剤のデータを示す。製剤１（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン）；製剤２（ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース）；および製剤３（ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース）。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図２Ａ】５５℃で０、７、１４および２８日間保存した液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンで得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図２Ｂ】５５℃で０、７、１４および２８日間保存したＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロースの沈降速度を示す。対照試料（すなわち、液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース）で得られた沈降データも、比較目的のために図２Ｂに示されている。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図３Ａ】凍結融解サイクルならびに５５℃で０および１４日間の保存の後の液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンで得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図３Ｂ】凍結融解サイクルならびに５５℃で０および１４日間の保存の後のＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロースの沈降速度を示す図である。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図４Ａ】指定された液体またはＳＦＤワクチン製剤で免疫感作されたマウスからの血清中の、免疫感作から２８日目の平均抗ＨＢｓＡｇ抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示す図である。マウスは、０日目および２８日目に免疫感作した。以下の製剤のデータを示す。液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン；液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース；液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース；ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；およびＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（対照Ｂ型肝炎ワクチン；Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．社製）。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図４Ｂ】指定された液体またはＳＦＤワクチン製剤で免疫感作されたマウスからの血清中の、免疫感作から４２日目の平均抗ＨＢｓＡｇ抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示す図である。マウスは、０日目および２８日目に免疫感作した。以下の製剤のデータを示す。液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン；液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース；液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース；ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；およびＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（対照Ｂ型肝炎ワクチン；Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．社製）。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図５Ａ】４℃で０および２８日間保存した後の、液体のＳｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン製剤で得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図５Ｂ】４℃で０および２８日間保存した後の、大気圧噴霧フリーズ・ドライ処理した（ＡＳＦＤ）Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン製剤で得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図６Ａ】５５℃で０、７、１４および２８日間保存した後の、液体のＳｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン製剤で得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図６Ｂ】５５℃で０、７、１４および２８日間保存した後の、ＡＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン製剤で得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図７】凍結融解サイクルおよび５５℃で１４日間の保存の後の、液体およびＡＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン製剤で得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図８】指定された液体またはＡＳＦＤのワクチン製剤で免疫感作されたマウスからの血清中の、免疫感作から２８日目および４２日目の平均抗ＨＢｓＡｇ抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示す図である。マウスは、０日目および２８日目に免疫感作した。以下の製剤のデータを提示する。液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン；液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；ＡＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；およびＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図９Ａ−１】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）投与によって投与した。１４日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ａ−２】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、皮内（ＩＤ）投与によって投与した。１４日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ａ−３】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。１４日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｂ−１】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）投与によって投与した。２８日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｂ−２】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、皮内（ＩＤ）投与によって投与した。２８日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｂ−３】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。２８日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｃ−１】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）投与によって投与した。４２日目について、平均血清抗体力価を示す。４９日目のＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与の後、５４日目に生存していた様々な試験群のマウス個体数も示す。破線は８００の抗体力価を示し、そのレベルでは、対象はＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与から９７％の生存率を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｃ−２】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、皮内（ＩＤ）投与によって投与した。４２日目について、平均血清抗体力価を示す。４９日目のＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与の後、５４日目に生存していた様々な試験群のマウス個体数も示す。破線は８００の抗体力価を示し、そのレベルでは、対象はＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与から９７％の生存率を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｃ−３】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。４２日目について、平均血清抗体力価を示す。４９日目のＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与の後、５４日目に生存していた様々な試験群のマウス個体数も示す。破線は８００の抗体力価を示し、そのレベルでは、対象はＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与から９７％の生存率を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図１０Ａ】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ＢｏＮＴワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）または鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。１４日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で提供する。
【図１０Ｂ】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ＢｏＮＴワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）または鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。２８日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で提供する。
【図１０Ｃ】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ＢｏＮＴワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）または鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。４２日目について、平均血清抗体力価を示す。４９日目のＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与の後、５４日目に生存していた様々な試験群のマウス個体数もに示す。破線は８００の抗体力価を示し、そのレベルでは、対象はＢｏＮＴによる致死性抗原投与から９７％の生存率を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で提供する。
【図１１】様々な炭疽菌ｒＰＡワクチン製剤による免疫感作の後の、炭疽致死毒素中和アッセイによって測定された血清中の中和抗体力価を示す図である。各動物試験群で用いたワクチン製剤の具体的な詳細を、表２０に示す。さらなる実験の詳細は、実施例５で提供する。
【図１２】様々な炭疽菌ｒＰＡワクチン製剤による免疫感作の後の、炭疽致死毒素中和アッセイによって測定された血清中のエンドポイントの中和抗体力価を示す図である。各動物試験群で用いたワクチン製剤の具体的な詳細を、表２１に示す。さらなる実験の詳細は、実施例５で提供する。
【図１３Ａ】１０μｇまたは３．３μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末Ｆ１−Ｖワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。ワクチン製剤は、０および２８日目に、試験マウスに筋内投与した。１４日目について、平均血清抗体力価を示す。図中の円は、個々のマウスの血清抗体力価を表し、バーは全ての試験動物についての平均抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例６で提供する。
【図１３Ｂ】１０μｇまたは３．３μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末Ｆ１−Ｖワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。ワクチン製剤は、０および２８日目に、試験マウスに筋内投与した。２８日目について、平均血清抗体力価を示す。図中の円は、個々のマウスの血清抗体力価を表し、バーは全ての試験動物についての平均抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例６で提供する。
【図１３Ｃ】１０μｇまたは３．３μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末Ｆ１−Ｖワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。ワクチン製剤は、０および２８日目に、試験マウスに筋内投与した。４２日目について、平均血清抗体力価を示す。図中の円は、個々のマウスの血清抗体力価を表し、バーは全ての試験動物についての平均抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例６で提供する。
【図１４Ａ】水酸化アルミニウムアジュバントに前吸着された多価の液体ワクチン（「液体Ｐｏｌｙ」）、水酸化アルミニウムに前吸着された再調製されたＳＦＤ粉末ワクチン（「前吸着されたＳＦＤ Ｐｏｌｙ」）、または一価の液体ワクチン対照（「液体Ｍｏｎｏ」）のいずれかで免疫感作されたマウスからの、幾何平均血清抗体力価を示す図である。血清試料を、多価ワクチンの構成抗原、すなわち炭疽菌からの組換え防御抗原（ｒＰＡ）に対する抗体についてスクリーニングした。矢印によって示すように、マウスを０および２８日目に免疫感作し、抗体分析のために血液を０、２８および４２日目に得た。さらなる実験の詳細は、実施例７で提供する。
【図１４Ｂ】水酸化アルミニウムアジュバントに前吸着された多価の液体ワクチン（「液体Ｐｏｌｙ」）、水酸化アルミニウムに前吸着された再調製されたＳＦＤ粉末ワクチン（「前吸着されたＳＦＤ Ｐｏｌｙ」）、または一価の液体ワクチン対照（「液体Ｍｏｎｏ」）のいずれかで免疫感作されたマウスからの、幾何平均血清抗体力価を示す図である。血清試料を、黄色ブドウ球菌からのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）に対する抗体についてスクリーニングした。矢印によって示すように、マウスを０および２８日目に免疫感作し、抗体分析のために血液を０、２８および４２日目に得た。さらなる実験の詳細は、実施例７で提供する。
【図１４Ｃ】水酸化アルミニウムアジュバントに前吸着された多価の液体ワクチン（「液体Ｐｏｌｙ」）、水酸化アルミニウムに前吸着された再調製されたＳＦＤ粉末ワクチン（「前吸着されたＳＦＤ Ｐｏｌｙ」）、または一価の液体ワクチン対照（「液体Ｍｏｎｏ」）のいずれかで免疫感作されたマウスからの、幾何平均血清抗体力価を示す図である。血清試料を、ボツリヌス菌からのボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）に対する抗体についてスクリーニングした。矢印によって示すように、マウスを０および２８日目に免疫感作し、抗体分析のために血液を０、２８および４２日目に得た。さらなる実験の詳細は、実施例７で提供する。
【図１４Ｄ】水酸化アルミニウムアジュバントに前吸着された多価の液体ワクチン（「液体Ｐｏｌｙ」）、水酸化アルミニウムに前吸着された再調製されたＳＦＤ粉末ワクチン（「前吸着されたＳＦＤ Ｐｏｌｙ」）、または一価の液体ワクチン対照（「液体Ｍｏｎｏ」）のいずれかで免疫感作されたマウスからの、幾何平均血清抗体力価を示す図である。血清試料を、ペスト菌からのＦ１−Ｖ融合タンパク質（図１４Ｄ）に対する抗体についてスクリーニングした。矢印によって示すように、マウスを０および２８日目に免疫感作し、抗体分析のために血液を０、２８および４２日目に得た。さらなる実験の詳細は、実施例７で提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ミョウバン吸着ワクチン、例えばＢ型肝炎、ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）、炭疽（すなわち、炭疽菌）、ペスト（すなわち、ペスト菌）またはブドウ球菌エンテロトキシン［すなわち、黄色ブドウ球菌からのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）］ワクチンの、安定粉末製剤を調製するための方法を目的とする。本明細書で開示される安定したミョウバン吸着ワクチンの粉末製剤の製法は、一般に噴霧フリーズ・ドライ（ＳＦＤ）または大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）技術、例えば、その両方は参照によりその全体が組み込まれている、特許文献１および非特許文献２１に記載のものを含む。医薬用ワクチンの粉末組成物およびこれらの組成物の使用方法も、本発明に包含される。
【００２０】
本明細書で用いるように、用語「ミョウバン吸着ワクチン」は、免疫原およびアルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物、特に免疫原がアルミニウムアジュバントに吸着されているものを指す。アルミニウムアジュバントは当技術分野で公知であり、例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよび硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が含まれる。用語「ミョウバン」は、任意のアルミニウムアジュバントを包含する。特定の実施形態では、アルミニウムアジュバントは水酸化アルミニウム［例えば、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）］である。
【００２１】
開示されるミョウバン吸着ワクチンの粉末製剤は、高温［すなわち、従来の冷蔵温度より上の温度］で保存されても、および／または凍結融解を受けても安定である。ミョウバン吸着ワクチンの粉末製剤は、希釈剤中で容易に再調製して、ほとんどまたは全く粒子凝集を示さず、免疫原濃度の実質的な低下を示さず、実質的なレベルの免疫原性および／または抗原性を保持し、対象とする病因病原体または毒素に対する実質的なレベルの防御（すなわち、「予防効果」または「防御免疫」）を示す、再調製液体ワクチンを生成することができる。再調製液体ミョウバン吸着ワクチンを調製するための方法も、開示される。特定の病因病原体または毒素への曝露と関連する特定の疾患、障害または症状の予防または治療において、ミョウバン吸着ワクチンの粉末組成物（またはその再調製液体製剤）を用いる方法が、さらに提供される。さらに、本明細書で開示される安定粉末ワクチン製剤の容易に再調製可能な性質は、様々な方法による再調製ワクチンの投与を可能にし得る。本発明のある態様では、再調製ワクチンは、医学的に訓練された人員の支援の有る無しに関係なく、最低限の侵襲性の技術によって投与することができる。例えば、本発明の再調製ワクチン、特にＢ型肝炎、炭疽、ＢｏＮＴワクチン、特にＢｏＮＴ／Ａワクチン、ペストワクチン、特にＦ１−Ｖペストワクチン、またはブドウ球菌エンテロトキシンワクチン、特にＳＥＢワクチンは、顕微針によって皮内に投与することができる。
【００２２】
ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための方法は、アルミニウムアジュバント上に吸着された免疫原を含む液体製剤を霧化して霧化製剤を生成するステップと、霧化製剤を凍結させて凍結粒子を生成するステップと、凍結粒子を乾燥させて乾燥粉末粒子を生成するステップとを含む。そのような方法は、本明細書で「噴霧フリーズ・ドライ（ＳＦＤ）」と称することができる。例えば、その全ては参照により本明細書に組み込まれている、非特許文献２１、同１７、および特許文献１を参照のこと。本発明の特定の態様では、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための、特許請求に係る方法は、アルミニウムアジュバント上に吸着された免疫原を含む液体製剤を霧化して霧化製剤を生成するステップと、霧化製剤を凍結させて凍結粒子を生成するステップと、凍結粒子をおよそ大気圧の下で乾燥させて乾燥粉末粒子を生成するステップとを含む。乾燥ステップは、振動、内部構造物、機械的攪拌またはそれらの組合せの存在下で実施することができる。粉末製剤を生成するこの方法は、「大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）」と称すことができる。（例えば、特許文献１を参照）。
【００２３】
ミョウバン吸着ワクチンの従来の液体製剤は、長期保存を容易にするために用いられる従来の凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、凍結およびフリーズ・ドライ（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）技術を適用すると、免疫原性を失い、凝集することが示された。例えば、その全ては参照により本明細書に組み込まれている、非特許文献１７〜２０を参照されたい。その結果、ミョウバン吸着ワクチンは、一般に冷蔵条件（例えば、約２℃から約８℃）の下で、液体製剤として保存および輸送されなければならない。しかし、本発明の方法は、Ｂ型肝炎、ＢｏＮＴ、炭疽、ペスト（例えば、Ｆ１−Ｖ）またはブドウ球菌エンテロトキシン（例えば、ＳＥＢ）ワクチンなどの、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤の生成を可能にし、該安定粉末製剤は非最適条件（例えば、非冷蔵条件）下で保存することができ、適する担体で再調製して、粒子凝集をほとんどまたは全く示さず、免疫原性／免疫原性を保持し、疾患、毒素またはそれらと関連する症状に対する防御効能を維持することができる。本明細書で用いる「非最適条件」または「非最適保存条件」は、一般にワクチン組成物を高温で保存すること、ワクチン製剤に１回または複数回の凍結融解サイクルを適用すること、およびワクチン組成物を長期間保存することなどの条件を指す。「高温」は、液体ワクチン製剤の保存のために従来推奨されている冷蔵条件を越える温度を意図し、例えば、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、５５℃またはそれ以上の温度を含めることができる。
【００２４】
「粉末」または「粉末製剤」または「粉末製剤を含む医薬組成物」は、実質的に固体の、易流動性の粒子からなる組成物を意図する。本発明の「安定粉末製剤」または「ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を含む医薬組成物」は、実質的な構造的完全性を維持し（例えば、凝集をほとんどまたは全く示さないこと、実質的な量の元の免疫原濃度を維持することなど）、元の液体製剤のそれと比較して、実質的なレベルの免疫原性、抗原性および／または防御効能を保持する。本発明の特定の態様では、ミョウバン吸着ワクチンの粉末製剤は、非最適条件（例えば、高温、凍結融解サイクル、長期保存など）下での保存に対してさえも安定している。例えば、本発明の安定粉末製剤は、非最適条件下で保存し、再調製により液体ワクチン製剤を生成することができ、その場合、再調製された液体ワクチンは粒子凝集をほとんどまたは全く示さず、元の免疫原濃度の実質的な量を維持し、さらに、実質的なレベルの免疫原性および／または抗原性を保持するが、これについては本明細書の以下でさらに記載する。ミョウバン吸着ワクチン組成物の安定性は、例えば、粒子凝集の程度に対応する沈降速度の測定、および再調製液体ワクチンに存在する免疫原の濃度測定によって評価することができる。詳細には、再調製液体ワクチンの沈降速度および免疫原の濃度は、元の液体製剤（すなわち、霧化の前にアルミニウムアジュバントに吸着された免疫原を含む液体製剤）のそれと比較することができる。沈降速度、免疫原の濃度、免疫原性および抗原性を測定するための標準のアッセイは当技術分野で公知であり、実施例２および３で記載される。防御効能は、例えば、対象とする特定の免疫原と関連する病因病原体または毒素による誘発の後に、免疫感作された対象およびされていない対象の生存率を評価することによって評価することができる。本発明の炭疽ワクチンに関して、防御免疫は、例えば、炭疽致死毒素中和アッセイを通して分析することができる。
【００２５】
本発明の方法に従って霧化される液体製剤は、アルミニウムアジュバントに吸着される少なくとも１つの免疫原を含む。「免疫原」は、対象において免疫応答を誘導する任意の天然または合成の物質である。１つを超える免疫原を含む液体製剤は、本発明の実施で用いることができ、一般に「多価」（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）または「複数価」（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）ミョウバン吸着ワクチンと呼ばれる。本明細書で用いるように、用語「免疫原性」は、対象に投与された場合に免疫応答（例えば、細胞の免疫原特異免疫応答または体液性抗体応答）を誘導する物質の能力を指す。本発明の免疫原は、対象とする任意の病原体と関連するかそれに由来することができ、例として、例えば、細胞全体、ウイルス粒子（例えば、部分的または完全に不活性化されたウイルス）、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、リポタンパク、糖タンパク質および多糖が含まれる。本発明の特定の態様では、免疫原はＢ型肝炎抗原、例えば表面（ＨＢｓＡｇ）またはコアのＢ型肝炎抗原（ＨＢｃＡｇ）を含む。他の実施形態では、免疫原はボツリヌス免疫原であり、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのようなボツリヌス神経毒を含む。本発明のＢｏＮＴ免疫原は、一般的にＢｏＮＴ/Ａ抗原、特にＢｏＮＴ/Ａ重鎖（ＨＣ）である。本発明の免疫原は、炭疽菌抗原、特に炭疽菌の毒素またはその成分、特に炭疽菌防御抗原（ＰＡ）も含む。ある実施形態では、免疫原は組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）である。本発明のペスト菌抗原には、例えば、Ｆ１抗原、Ｖ抗原および、特に、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質抗原が含まれる。免疫原には、さらにブドウ球菌エンテロトキシンの抗原、例えばＳＥＢ、特に組換えＳＥＢ（ｒＳＥＢ）が含まれる。本発明の一部の態様では、多価または複数価のワクチンを生成するために、複数の免疫原を用いることができる。そのような多価ワクチンは、例えば、炭疽抗原（例えば、ｒＰＡ）、ブドウ球菌エンテロトキシン抗原（例えば、ｒＳＥＢ）、ＢｏＮＴ抗原（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）およびペスト菌抗原（例えば、ｒＦ１−Ｖ）を含むことができる。本明細書の下記で定義される、対象とする免疫原の組換えで生成された免疫原、および変異体もしくは断片を、本発明の実施で用いることができる。
【００２６】
本明細書で定義される任意の適する免疫原を使用することができる。免疫原は、ウイルスの免疫原であることができる。したがって免疫原は、なかでも、ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルスなど）；カリチウイルス科；トガウイルス（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラプドウイルス科（例えば狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えばおたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；オルソミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型およびＣ型など）；ビニヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例えばＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のメンバーに由来することができる。
【００２７】
あるいは、ウイルスの免疫原は、乳頭腫ウイルス（例えばＨＰＶ）；ヘルペスウイルス；肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）またはＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）；およびダニ媒介性脳炎ウイルスに由来してもよい。これらのウイルスの記載については、例えば、非特許文献２２および２３を参照のこと。
【００２８】
本発明で用いるための細菌性免疫原は、炭疽、ボツリヌス中毒、ペスト、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎および他の病原状態を引き起こす生物体、例えば、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）Ａ、ＢおよびＣ、ヘモフィルス・インフルエンザＢ型（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（ＨＩＢ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の種、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の種、ボツリヌス菌、炭疽菌およびペスト菌に由来してもよい。細菌性免疫原の組合せは、例えば、ジフテリア、百日咳および破傷風の免疫原を含む、単一の組成物で提供することができる。適する百日咳免疫原は、百日咳毒素および／または線維状の赤血球凝集素および／または、Ｐ６９とも呼ばれるペルタクチン（pertactin）である。抗寄生虫性免疫原は、マラリアおよびライム病を引き起こす生物体に由来することができる。本発明のある態様では、細菌性免疫原は、組換えブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ｒＳＥＢ）、炭疽菌組換え防御抗原（ｒＰＡ）、組換えボツリヌス菌神経毒およびペスト菌Ｆ１−Ｖ融合タンパク質からなる群から選択される。特定の実施形態では、多価ワクチンを生成するために、上記の免疫原の組合せを本発明の実施で利用する。
【００２９】
本発明で用いるための免疫原は、当分野の技術者に公知である様々な方法を用いて生成することができる。詳細には、免疫原は、標準の精製技術を用いて天然源から直接単離することができる。あるいは、全部死菌の、弱毒化または不活性化させた細菌、ウイルス、寄生虫または他の微生物の全体を使用することができる。さらに、免疫原は、既知の技術を用いて組換えで生成することができる。
【００３０】
本明細書で用いる免疫原は、記載されているアミノ酸配列に基づいて、固相ペプチド合成などの化学重合体合成により合成することもできる。そのような方法は、当業技術者には公知である。固相ペプチド合成手法に関しては、例えば、非特許文献２４および２５を、古典的溶液合成に関しては、非特許文献２６および２７を参照されたい。
【００３１】
本発明のある態様では、アルミニウムアジュバントに吸着された免疫原を含む液体製剤は、安定乾燥粉末として製剤化されるべき、市販のミョウバン吸着ワクチンであってよい。任意のミョウバン吸着ワクチンの液体製剤を、本発明に実施で用いることができる。そのようなワクチンには、それらに限定されないが、Ｉｎｆａｎｒｉｘ（ジフテリア、破傷風および百日咳）、Ｈａｖｒｉｘ（小児のＡ型肝炎）、Ｖａｑｔａ（小児のＡ型肝炎）、Ｅｎｇｅｒｉｘ Ｂ（Ｂ型肝炎）、ＰｅｄＶａｘＨｉｂ（ヘモフィルス・インフルエンザＢ型）、Ｔｗｉｎｒｉｘ（Ａ型肝炎／Ｂ型肝炎）、Ｐｅｄｉａｒｉｘ（ジフテリア、破傷風および百日咳−ポリオウイルス−Ｂ型肝炎）、Ｐｒｅｖｎａｒ（肺炎球菌複合体）、Ｄａｐｔａｃｅｌ（ジフテリア、破傷風および百日咳）、Ｔｒｉｐｅｄｉａ（ジフテリア、破傷風および百日咳）、Ｃｏｍｖａｘ（ヘモフィルス・インフルエンザＢ型−Ｂ型肝炎）、Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ（Ｂ型肝炎）、Ｔｅｔｒａｍｍｕｎｅ（ジフテリア、破傷風および百日咳−ヘモフィルス・インフルエンザＢ型）、Ｃｅｒｔｉｖａ（ジフテリア、破傷風および百日咳）ならびにＳｈａｎｖａｃ−Ｂ（Ｂ型肝炎）が含まれる。特定の実施形態では、液体製剤は、Ｂ型肝炎のミョウバン吸着ワクチン、より具体的にはＨＢｓＡｇ抗原を含むワクチンを含む。さらに、リン酸アルミニウムに吸着され、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに特異的である五価のボツリヌス・トキソイド・ワクチンが、治験薬として疾病管理センターのために生成された。このミョウバン吸着ＢｏＮＴワクチンも、本発明の実施で用いることができる。炭疽菌の無毒性、非被包性の株由来の防御抗原を含む炭疽ワクチンは、米国では入手可能であるが、一般的に限定された集団（例えば、軍人、炭疽菌を研究している者など）だけに投与される。この液体炭疽ワクチンは、本方法および組成物で用いることができた。
【００３２】
用語「ポリヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド配列」の使用は、本発明を、ＤＮＡを含んでいるポリヌクレオチドに限定することを意図するものではない。当分野の技術者は、ポリヌクレオチド分子は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの組合せを含むことができることを理解する。「ＤＮＡ」は、その一本鎖形または二本鎖らせんのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）重合形態を指す。この用語は分子の一次および二次の構造だけを指し、それを任意の特定の三次形態に限定しない。したがって、この用語は、とりわけ、線形ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体で見られる、二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の議論では、本明細書で配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同の配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列だけを与える通常の規則に従って記載することができる。用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書で互換的に用いることができる。
【００３３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基の重合体を指す。これらの用語は、天然のアミノ酸重合体と同様に、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸重合体に適用される。
【００３４】
本発明の実施で用いられるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、天然のものであるか、または、通常の分子生物学技術に従って組換えで生成することができる。ポリペプチド（例えば、ＨＢｓＡｇ、ＢｏＮＴ／Ａ、炭疽菌ｒＰＡ、ｒＳＥＢもしくはｒＦ１−Ｖ）またはポリヌクレオチドを含む免疫原の変異体および断片も、本発明に包含される。「変異体」は、実質的に類似した配列を指す。本発明のアミノ酸またはヌクレオチド配列の変異体は、一般に参照配列と少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。特定の実施形態では、本発明の免疫原性ポリペプチドの変異体は、完全長ポリペプチドの生物活性を保持し、したがって、免疫原性である。変異体配列を生成する方法は当技術分野で公知であり、同様に、ＢＬＡＳＴなど、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の同一割合を判定する方法も公知である。
【００３５】
用語「断片」は、特定数の連続したアミノ酸またはヌクレオチド残基を含む、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部を指す。特定の実施形態では、本発明の免疫原性ポリペプチドの断片は、完全長ポリペプチドの生物活性を保持することができ、したがって、免疫原性であることができる。ポリヌクレオチドの断片は、そのタンパク質の生物活性を保持するタンパク質断片をコードすることができ、したがって、免疫原性であることができる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの断片は、それらが所望の属性（例えば、免疫原性）を有する限り、任意の長さであり得る。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの断片の生成方法は、当技術分野で公知である。
【００３６】
本発明の液体製剤は、免疫原およびアルミニウムアジュバントを含む。アルミニウムアジュバントに加え、他のアジュバント剤も本発明の実施で用いることができる。用語「アジュバント」は、免疫原に対する免疫応答を高める化合物または混合物を指す。アジュバントは、免疫原を徐々に放出する組織貯蔵所（ｔｉｓｓｕｅ ｄｅｐｏｔ）として、および免疫応答を非特異的に高めるリンパ系活性化剤としての役目も果たすことができる（例えば、非特許文献２８を参照）。一般に、本発明の実施で用いられるアジュバントは、薬学上許容される。そのような薬学上許容されるアジュバントは、当技術分野においては公知である。
【００３７】
例示的なアジュバントには、それらに限定されないが、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン（およびその誘導体）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素の乳濁液、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒト・アジュバントが含まれる。対象とする他のアジュバントには、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、モノリン酸化リピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｑ−デスアシル−４’−モノリン酸化リピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）、ＩＬ−１β １６３−１７１ペプチド（Ｓｃｌａｖｏペプチド）、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、カルシトニン遺伝子調節ペプチド、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン（ＧＭＤＰ）、ジメチルジオクタデシラ（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａ）またはジステアリ（ｄｉｓｔｅａｒｙ）臭化アンモニウム（ＤＤＡ）、亜鉛Ｌ−プロリン、ホルミル化−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（スレオニル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシ−ホスホリルオキシ）エチルアミド・モノナトリウム塩（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−イソＧｌｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル、１−（２−メチプロピル）−ＩＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン、４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミテート（ＤＴＰ−ＧＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチリヌラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）、７−アリル−８−オキソグアノシン、ポリアデニル酸−ポリ−ウリジル酸複合体、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−３ａ、フタル酸ジブチル、フタル酸ジブチル類似体およびＣ５ａが含まれる。
【００３８】
本発明の実施で用いられるアルミニウムアジュバント上への吸着免疫原を含む液体製剤は、霧化に適する任意の形態、例えば、溶液、懸濁液、スラリーまたはコロイドでよい。液体製剤は、１つまたは複数の薬学上許容される賦形剤、保護剤、溶媒、塩、界面活性剤および緩衝剤をさらに含むことができる。そのような賦形剤は当技術分野で公知であり、本発明のミョウバン吸着ワクチンの安定化に資することができる。適する賦形剤は、免疫原およびアルミニウムアジュバントと適合し、例には、水、生理食塩水、炭水化物、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せが含まれる。特に興味がある炭水化物賦形剤には、トレハロース、マンニトール、デキストラン、シクロデキストリン、イヌリンＵＳＰおよびそれらの組合せが含まれる。ある実施形態では、液体製剤は、免疫原、アルミニウムアジュバント、およびデキストラン／トレハロースまたはマンニトール／トレハロースを含む。さらに、所望により、液体製剤は、湿潤剤または乳化剤およびｐＨ緩衝剤などの補助物質を含むことができる。
【００３９】
適する賦形剤には、水との接触に増粘したり重合したりせず、個体に投与された場合に無害であり、その薬剤活性を変化させる方法で医薬用薬剤と著しく相互作用することのない、易流動性の粒子状固体を含めることができる。通常使用される賦形剤の例には、それらに限定されないが、ヒトおよびウシの血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、グルコース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、Ｄ−マンノースまたはソルボースなどの単糖、ラクトース、マルトース、サッカロース、トレハロースまたはショ糖などの二糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、エリスリトールまたはアラビトールなどの糖アルコール、デキストラン、デンプン、セルロースまたは高分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの重合体、アミノ酸またはそれらの塩、例えばグリシン、アラニン、グルタミン、アルギニン、リジンもしくはヒスチジン、または、ナトリウム、カリウムもしくはマグネシウム塩などの、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属とのそれらの塩、あるいは、リン酸ナトリウムもしくはカルシウム、炭酸カルシウム、亜硫酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酒石酸、プルロニック、界面活性剤およびそれらの組合せが含まれる。適する溶媒には、それらに限定されないが、塩化メチレン、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよび水が含まれる。薬学上許容される塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩、および、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩が含まれる。特にワクチン粉末製剤が吸入による投与を目的とする場合、キトサン、デルマタン硫酸、コンドロイチン、ペクチンおよび他の粘膜付着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）を本発明の実施で用いることもできる。適する界面活性剤には、トゥイーン８０、プルロニックなどが含まれるが、これらに限定されない。薬学上許容される賦形剤および補助剤に関する詳細な解説は、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献２９で入手可能である。
【００４０】
ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための本発明の方法は、霧化、凍結および乾燥ステップを含む。本発明の方法に従って、霧化、凍結および乾燥ステップは、単一のチャンバーまたは装置内で実施することができ、それによって試料汚染および収量減の可能性が消失する。例えば、液体製剤は、チャンバー内へ霧化（すなわち、噴霧）することができ、その中では、霧化製剤の凍結および凍結粒子の乾燥も起こる。単一のチャンバー内で霧化、凍結および乾燥させるための例示的な装置は、特許文献１で提供されている。
【００４１】
アルミニウムアジュバント上に吸着されている免疫原を含む液体製剤は、当技術分野で公知である様々な方法および装置を用いて霧化することができる。例えば、液体製剤は２流体ノズル、加圧ノズルもしくは遠心回転ディスクノズルを通して噴霧すること、または、超音波噴霧器、インクジェットプリンタ型ノズルもしくは振動オリフィスエアゾール発生器（ＶＯＡＧ）で霧化することができる。本発明の一部の態様では、液体製剤は、ＢＤ Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルなどの加圧ノズルで霧化される。霧化の気体流量および気体圧力、液体流速ならびにノズルの口径および種類を含む霧化条件は、特に霧化製剤中の液滴の径および生じた乾燥粉末製剤の粒径を最適化するために、変更させることができる。
【００４２】
液体製剤の霧化の後、液滴を速やかに凍結させて固体の凍結粒子を生成する。特定の実施形態では、液滴は、霧化ステップの後、直ちに凍結させる。液滴は、霧化された製剤を、液体製剤の凝固点未満の温度を有する任意の冷媒に導入することによって凍結させることができる。本明細書で用いるように、「霧化された製剤を冷媒に導入する」ことは、霧化された製剤の液滴を冷媒と接触させるための任意の方法、例えば、それに限定されないが、液滴を冷液中に浸すこと、または液滴を冷たいガス中を通過させることを含む。用語「冷媒」は、液体製剤の凝固点未満の温度を有する任意の適する冷たい液体または気体を含むと、広義に定義される。例示的な冷たい液体は当技術分野で公知であり、例には、液体窒素、アルゴンおよびヒドロフルオロエーテルが含まれる。圧縮液体、例えば圧縮流体二酸化炭素、ヘリウム、プロパン、エタンまたは同等の不活性液体を、本発明の実施で用いることもできる。凍結ステップの間に用いられる冷たい液体の温度は、一般的に約−２００℃から約−８０℃の間、詳細には約−２００℃から約−１００℃の間、より詳細には約−２００℃である。凍結ステップで用いられる代表的な気体には、それらに限定されないが、冷空気、窒素、ヘリウムおよびアルゴンが含まれ、一般に約−５℃から約−６０℃の間、より詳細には−２０℃から約−４０℃の間の温度で用いられる。所望の温度の冷媒を得るための従来の手順は、当技術分野で公知である。一実施形態では、免疫原およびアルミニウムアジュバントを含む液体製剤は、液体窒素を含んでいる容器［例えば、金属製の受け皿（ｍｅｔａｌ ｐａｎ）］より上に位置する噴霧ノズルを通して霧化される。霧化された製剤中の液滴は、一般に冷たい液体との接触により直ちに凍結し、それらは収集、乾燥させられる。
【００４３】
特許請求に係る方法の凍結ステップの間に生成される固体の凍結粒子を乾燥させて、ミョウバン吸着ワクチンの粉末粒子を生成する。本明細書で用語「乾燥」は、凍結粒子から液体を除去して、水分含有量が重量比で一般に２０％、１５％、１０％、５％または１％未満である粉末粒子を生成することを指すために用いられる。
【００４４】
上記の、および当技術分野で公知である噴霧フリーズ・ドライ（ＳＦＤ）技術を含むものなどの一部の実施形態では、当技術分野で公知である方法および装置に従って、凍結粒子を凍結乾燥（真空下）によって乾燥させる。例えば、実施例１で記載されているように、凍結粒子を収集して凍結乾燥器へ移し、過剰な液体を蒸発させて乾燥粉末粒子を生成することができる。ＳＦＤ法および装置は、例えば、非特許文献２１および同１７、ならびに特許文献１に記載されている。
【００４５】
本発明の他の態様、特に上記の大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）を含むものでは、凍結粒子は、大気圧前後の冷たい、乾燥気体（例えば、空気、窒素またはヘリウム）の気流中での昇華によって乾燥させる。本明細書で用いるように、「大気圧前後」は、約０．５から５気圧、詳細には１から３気圧、より詳細には約１気圧を意味するものとする。大気圧で粒子を乾燥させるための方法および装置は、特許文献１および２に記載されている。
【００４６】
特定の実施形態では、凍結粒子は、粒子の流動化を促進する条件下で、大気圧前後の冷たい気体中で乾燥させる。乾燥工程での粒子流動化は、チャンネリング（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）および凝集を阻止し、より速く、より完全な粒子乾燥を可能にする。乾燥ステップでの粒子の流動化を高める任意の方法を、本発明の実施で用いることができる。例えば、乾燥ステップは、振動、内部構造物、機械的攪拌またはそれらの組合せの存在下で実施することができる。用語「内部構造物」は、工業プロセス化学の分野で通常用いられ、本明細書では、ＳＦＤまたはＡＳＦＤのための装置またはチャンバー内に置かれる任意の物理的障壁（例えば、ブレード、プレート、パドルまたは他の障壁）を指すために用いられ、該物理的障壁は、乾燥工程で粒子の流動化を促進するために用いられる。（例えば、特許文献１を参照）。
【００４７】
本発明のある態様では、凍結粒子を工程の組合せによって、例えば大気圧前後の冷たい乾燥気体の流れの中での昇華と、続く従来の凍結乾燥によって乾燥させる。例えば、凍結粒子を冷たい気体との接触によって部分的に乾燥させ、フィルターまたは他の収集装置で収集し、その後、凍結乾燥にかけて粒子をさらに乾燥させることができる。本発明の方法に従い、乾燥工程は、例えば、凍結粒子の沈着および収集の後にくることができ、あるいは、凍結および乾燥が事実上同時に起きてもよい。凍結し、乾燥または部分的に乾燥した粉末粒子の収集のための任意の方法および容器もしくは装置を、本発明で用いることができる。一実施形態では、乾燥させた粒子をフィルター上に収集し、さらなる用途のために、または凍結乾燥による乾燥の場合のように、受け皿内にそこから粒子を取り出すことができる。収集したならば、乾燥粉末粒子を、医療用組成物の保存に適する滅菌容器へ移すことができる。
【００４８】
特許請求に係る医薬組成物の乾燥粉末粒子は、いくつかのパラメータ、例えば、それらに限定されないが、平均粒径（別称、平均幾何粒径または体積平均径）、粒径範囲、平均空気力学的径（別称、体積平均空気力学的径）、粒子表面積、ならびに粒子形態（例えば、粒子空気力学的形状および粒子表面特性）に基づいて特徴づけることができる。これらのパラメータを評価する方法は、当技術分野で公知である。例えば、粒径は、それらに限定されないが、走査電子顕微鏡およびレーザー回折を含む従来の技術によって評価することができる。粉末の平均粒径は、カスケード・インパクション（ｃａｓｃａｄｅ ｉｍｐａｃｔｉｏｎ）などの従来の技術を用いて、質量平均空気力学的径（ＭＭＡＤ）として測定することもできる。本明細書の下記で、また当技術分野で定義されるように、空気力学的径は、実際の粒径と粒子絶対密度の平方根との積と定義される。所望により、平均粒径を確認するために、自動粒径カウンター（例えば、Ａｅｒｏｓｉｚｅｒカウンター、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター、ＨＩＡＣカウンターまたはＧｅｌｍａｎ自動粒子カウンター）を用いることができる。粒子形態を質的に評価するために、走査電子顕微鏡検査を利用することができる。
【００４９】
同様に、本発明の粉末粒子は、密度または粒子密度の範囲に基づいて特徴づけることができる。実際の粒子密度または「絶対密度」は、ヘリウム・ピクノメトリー(ｈｅｌｉｕｍ ｐｙｃｎｏｍｅｔｒｙ)などの既知の定量技術を用いて、容易に確認することができる。あるいは、本発明によって粉末の密度を調査するために、「タップ」（ｔａｐ）密度測定を用いることができる。タップ密度は、指定された方法で詰め込む際に、指定体積まで容器を満たす物質の質量を、容器体積で割ったものとして定義される。タップ密度を測定するために適する装置が利用可能であり、例としては、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社から入手可能であるＧｅｏＰｙｃ（商標）モデル１３６０がある。粉末組成物の絶対密度とタップ密度との間の差は、その組成物の全空隙率および比孔隙量に関する情報を提供する。
【００５０】
本方法に従って作製される粉末製剤の平均粒径は、一般に約３５μｍから約３００μｍ、詳細には約８０μｍから約２５０μｍ、より詳細には約８０μｍから約１００μｍである。本発明の一部の実施形態では、平均粒径は少なくとも８０μｍである。本発明の粉末粒子の平均タップ密度は、一般的に約０．０１から約０．７ｇ／ｃｍ3、詳細には約０．０１から約０．６ｇ／ｃｍ3、より詳細には約０．０２から約０．４ｇ／ｃｍ3である。
【００５１】
ミョウバン吸着ワクチン、特にミョウバン吸着Ｂ型肝炎、ボツリヌス中毒（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）、炭疽（すなわち、炭疽菌）、ｒＳＥＢ（すなわち、ブドウ球菌エンテロトキシン）またはペスト（ペスト菌）のワクチンの安定粉末製剤を含んでいる医薬組成物も、本発明に包含される。ある実施形態では、医薬組成物は、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）に吸着されている、Ｂ型肝炎抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）、ＢｏＮＴ免疫原（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、特にＢｏＮＴ／Ａ ＨＣ）、炭疽菌抗原（例えば、炭疽菌ＰＡ、特に炭疽菌ｒＰＡ）、ブドウ球菌エンテロトキシン抗原（例えば、ＳＥＢ、特にｒＳＥＢ）、またはペスト菌抗原（例えば、Ｆ１−Ｖ）の安定粉末製剤を含む。本発明を特定の製剤に限定するものではないが、ある実施形態では、乾燥粉末は（重量パーセントで）約０．０００１％から約１０％の免疫原、約０．２から約２５％のミョウバンアジュバント（元素アルミニウム含有量に基づく）、および約７０から約９９％の炭水化物賦形剤（例えば、マンニトール、トレハロースまたはデキストラン）を含む。本発明の医薬組成物は、希釈剤で再調製して対象への投与のための液体ワクチンを形成した、安定したミョウバン吸着ワクチン粉末製剤をさらに含む。再調製液体ミョウバン吸着ワクチンを生成するための方法は、本発明にさらに包含される。ある実施形態では、本方法は、本発明のミョウバン吸着ワクチンの乾燥粉末製剤を、本明細書の下記で定義される薬学上許容される担体中で再調製することを含む。
【００５２】
先に述べたように、ミョウバン吸着ワクチンの「安定」粉末製剤は、乾燥した粉末粒子を希釈剤中で再調製して、再調製された液体ワクチンを生成することができる製剤であリ、該ワクチンは、ほとんどもしくは全く粒子凝集を示さず、免疫原濃度の実質的な低下を示さず、免疫原性を保持し、抗原性を維持し、かつ／または防御効力を示し、このことは特にＳＦＤおよびＡＳＦＤがなされておらず、その後対象への投与前に再調製されたワクチンの液体製剤と比較した場合に妥当する。これらのパラメータは、当技術分野で公知であり、下記の実験の実施例に記載されている様々な技術（例えば、沈降アッセイ、ＡＵＳＹＭＥアッセイ、血清抗体濃度の分析、ＢｏＮＴ／Ａまたはペスト菌などの病因病原体または毒素による致死性抗原投与の後の生存率、および炭疽致死毒素中和アッセイ）を用いて評価することができる。再調製された液体ワクチンで得られる結果は、アルミニウムアジュバントに吸着されている免疫原を含む元の液体製剤（すなわち、噴霧前の元の液体製剤）を用いて得られる結果と比較することができる。
【００５３】
一部の実施形態では、再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、特に元の液体製剤のそれと比較して、ほとんどまたは全く粒子凝集を示さない。粒子凝集は、鏡検または沈降速度分析などの方法を用いて評価することができる。「液体製剤のそれと比較してほとんどまたは全くない粒子凝集」とは、例えば、元の液体製剤の沈降速度と比較して、再調製された液体ワクチンで沈降速度の実質的な増加が観察されないことを表す。さらに、本発明のある態様では、再調製された液体ワクチンは、霧化前の液体製剤の免疫原濃度と比較して、免疫原濃度の実質的な低下を示さない。「免疫原濃度の実質的な低下がない」とは、再調製された液体ワクチンが、元の免疫原濃度の少なくとも約５０、６０または７０％、より好ましくは元の免疫原濃度の少なくとも約８０、８５または９０％、最も好ましくは元の液体製剤中に存在する免疫原濃度の少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上を保持することを意味するものとする。免疫原濃度は、例えば、ＥＬＩＳＡに基づく方法（例えば、ＡＵＳＺＹＭＥ）で測定することができる。
【００５４】
本明細書で用いられ、および当技術分野で定義されているように、「抗原性」は、タンパク質（例えば、免疫原）を認識して結合する抗体の能力である。「免疫原性」は、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、ヒトまたはヒト以外の対象中で）免疫応答を引き起こす、タンパク質（すなわち、免疫原）の能力を指す。本発明の再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、一般に、元の液体製剤のそれと比較して、実質的なレベルの抗原性および免疫原性を保持する。「実質的なレベルの抗原性」は、元の液体ワクチン製剤のそれと比較した場合に、液体再調製ワクチンに存在する免疫原が、少なくとも約５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９９％またはそれ以上の抗原性を保持することを意味するものとする。抗原性は、例えば、ＡＵＳＺＹＭＥなどのＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定することができる。本発明のある態様では、再調製液体ワクチンは相当高いレベルの免疫原性を保持し、したがって、対象において免疫応答を、特に霧化前の元の液体製剤で得られるものと実質的に同じである免疫応答を促進することができる。すなわち、再調製液体ワクチンによる対象の免疫感作によって達成される免疫応答は、液体製剤で得られる免疫応答レベルの少なくとも約５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９９％以上、またはそれらと同等以上であることができる。対象における免疫応答は、それに限定されないが免疫感作後の血清抗体レベルの測定を含む、当技術分野で公知である様々な方法によって判定することができる。さらに、本発明のワクチン、特にＢｏＮＴ／Ａ、ｒＰＡ、ｒＳＥＢ、Ｆ１−Ｖ、その任意の組合せを含んでいるワクチンで得られる「保護レベル」または「予防効果」は、対象とする免疫原（例えば、ＢｏＮＴ／ＡなどのＢｏＮＴ）の致死用量への曝露後に生存する免疫化対象の割合によって評価することができる。本発明の炭疽ワクチン、特に炭疽菌ｒＰＡワクチンで得られる保護レベルは、例えば、当技術分野で公知である、実施例５に記載の方法に従って、血清試料の中和抗体力価を定量することによって判定することができる。
【００５５】
本明細書の粉末組成物に適用される用語「安定」は、粉末を高温、長期保存または凍結融解サイクルにさらしても、なお、上記の凝集、免疫原濃度、免疫原性、抗原性および／または防御効力に関して所望の特性を保持することができることをさらに表す。
【００５６】
上記のように、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤は、対象への投与に適する液体ワクチン製剤を生成するために、薬学上許容される担体で再調製することができる。「薬学上許容される担体」は、有効成分の保存、投与または治療効果を促進するために当技術分野で従来用いられる担体を指す。医薬組成物およびワクチンを製剤化するための薬学上許容される担体および方法は、一般に当技術分野で公知である。薬学上許容される担体、安定剤およびイソモライト（ｉｓｏｍｏｌｙｔｅ）の製剤化および選択に関する詳細な解説は、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献２９で見られる。ワクチン粉末製剤の再調製のための例示的な薬学上許容される担体には、生理的食塩水、緩衝液および塩などの様々な希釈剤が含まれる。本明細書で用語「再調製液体ワクチン」または「再調製ミョウバン吸着液体ワクチン」は、液体担体で再調製して再調製液体ワクチンを生成した、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を含んでいる医薬組成物を指すために、互換的に用いられる。本発明の方法は、安定し、かつ容易に再調製することができる乾燥粉末ワクチン製剤の調製を可能にする。特定の実施形態では、本発明の再調製液体ワクチンは、粒子凝集をほとんどまたは全く示さず、免疫原濃度の実質的な低下を示さず、実質的なレベルの免疫原性、抗原性および／または防御効能を保持する。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、特定の免疫原と関連する疾患、障害、状態または症状を予防または治療する方法で有用である。用語「疾患」、「障害」および「状態」は、本明細書で互換的に用いられる。具体的には、予防および治療の方法は、対象への医薬組成物の治療有効量の投与を含む。特定の実施形態では、Ｂ型肝炎を予防または治療する方法が提供される。本発明の他の態様では、ボツリヌス中毒、またはＢｏＮＴへの曝露と関連する症状の発生を阻止する方法がさらに提供される。炭疽を予防または治療する方法も、開示される。本明細書で用いるように、疾患または障害を「予防する」ことは、免疫原と関連する特定の疾患もしくは障害、またはその症状の発生から対象を防御するための、再調製液体ワクチンなどの本発明の医薬組成物の治療有効量の対象への投与を意味する。一部の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、疾患またはその症状、特にＢ型肝炎、ボツリヌス中毒または炭疽を起こす危険があるヒトなどの対象に投与される。ＢｏＮＴへの曝露と関連する症状（例えば、視朦、嚥下障害、呼吸麻痺、筋骨格麻痺、心停止または呼吸停止など）の発生を予防する方法も、開示される。炭疽または炭疽菌への曝露と関連する症状（例えば、高熱、胸痛、酸素枯渇、二次ショック、血管透過性の増加、全身出血病状、心停止または呼吸停止など）の発生を予防する方法も、本発明にさらに包含される。ブドウ球菌エンテロトキシンへの曝露、特に吸入性曝露と関連する症状の発生を予防する方法、および、この作用剤に曝露した対象を治療する方法も開示される。対象でペストまたはペスト菌への曝露と関連する症状の発生を予防する方法、ならびに、ペストを有するかペスト菌に曝露した対象を治療する方法も、さらに本発明で想定される。それらに限定されないがＢｏＮＴ、炭疽菌、ペスト菌およびブドウ球菌エンテロトキシンを含む潜在的なバイオテロリスト剤を目的とする本発明のワクチンは、例えば、多価ワクチンとして調製することができ、あるいは、バイオテロリスト事象またはバイオテロリスト事象の脅威に応じて第一対応者および軍人に、もしくは一般集団にさえ予防的に投与することができる。
【００５８】
「疾患または障害を治療する」とは、疾患に罹患したか、または、疾患を引き起こす病原体に曝露した対象に対する本発明の医薬組成物の治療有効量の投与を意味し、その目的は、その疾患の状態または症状を治療、治癒、軽減、緩和、変更、矯正、改善、向上させるかまたはそれに影響を及ぼすことである。
【００５９】
「治療有効量」は、所与の状態に対する治療効果および投与計画を提供する量を指す。本発明の特定の態様では、「治療有効量」は、対象に投与された場合に、ある疾患に対する対象の予防または治療に関して正の治療応答をもたらす、本発明の医薬組成物の量を指す。疾患を予防することに関する正の治療応答には、例えば、免疫応答を引き出すこと（例えば、対象による、疾患の発生または進行から防御するのに十分な量の抗体の生産）が含まれる。同様に、疾患を治療することに関する正の治療応答には、疾患の症状の治療または改善が含まれる。
【００６０】
治療有効量は、患者の特徴（年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患など）に基づいて、通常技術の医療従事者が判定することができる。さらに、さらなる日々の研究が実施されるにつれて、様々な患者の様々な状態の治療に適当な投薬量レベルに関してより具体的な情報が現れ、通常技術の従事者は、レシピエントの治療状況、年齢および健康状態を考慮することにより、適切用量を確認することができる。治療有効量は、医薬組成物の投与経路によってさらに影響される。一般に、静脈内の注射または注入、特に皮内投与については、治療有効量は、腹腔内、筋肉内、鼻腔内または他の投与経路に必要とされる量よりも低くてよい。投薬スケジュールは、循環半減期および用いる製剤によって変更することができる。投与が必要な医薬組成物の正確な量は、診療医の判断によって決まり、各個人に特有である。
【００６１】
本発明のワクチンは、投薬製剤と適合する方法で、および治療的に有効で免疫原性である量（すなわち、所望の抗体誘導量または防御的な量）で投与される。投与される量は、治療する対象、対象の免疫系の抗体を合成する能力、および所望の防御の程度に依存する。投与が必要な免疫原の正確な量は、診療医の判断によって決まり、各個人に特有である。タンパク質ワクチンでは、各ワクチン用量中のタンパク質の量は、一般的なワクチンのかなり大きな有害副作用を起こさずに免疫防御応答を誘導する量となるように選択される。そのような量は、どの特定の免疫原が使用されてそれがどのように提示されるかによって異なる。特定のワクチンのための成分の最適量は、対象における適当な免疫応答の観察を含む標準の研究によって確認することができる。最初のワクチン接種の後、対象は、適切な間隔をあけた１つまたはいくつかのブースター免疫感作を受けることができる。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知である様々な方法によって、対象に投与することができる。対象に組成物を投与するための任意の方法を、本発明の実施で用いることができる。可能な投与経路の例には、肺吸入、非経口投与（例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、腹腔内（ＩＰ）、皮下（ＳＣ）注射または注入）、経口、鼻腔内、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が含まれる。先に述べたように、ミョウバン吸着ワクチンを含む医薬組成物は、安定粉末として（例えば、肺吸入、鼻腔内送達もしくは経皮注射によって）、または、再調製された粉末ワクチン製剤として（例えば、皮内、筋肉内もしくは静脈内の注射によって）投与することができる。詳細には、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を含む医薬組成物は、例えば鼻腔内送達、肺吸入または経皮注射によって、粉末の形で対象に投与するのに適し得る。あるいは、再調製された液体ワクチンは、例えば、皮内、静脈内、筋内、皮下、腹腔内または鼻腔内に投与することができる。本発明のある実施形態では、ワクチンは最低限に侵襲性の方法、例えば顕微針を通しての皮内注射または鼻腔内吸入によって投与される。本明細書で用いるように、「顕微針」には、一般的に、３０ゲージ以下の針、特に３４ゲージの針が含まれる。そのような最低限に侵襲性のワクチン投与方法は、非医療関係者による一般集団への広範囲にわたるワクチン投与を可能にし、そのことは、ＢｏＮＴ、炭疽菌、ペスト菌またはブドウ球菌エンテロトキシン（例えば、ｒＳＥＢ）などの生物兵器によるバイオテロリスト攻撃の事件または脅威において特に有利となる。
【００６３】
本発明の予防および治療の方法は、特定の対象に限定されるものではない。様々な対象、特に哺乳動物が企図される。対象とする対象には、それらに限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシおよび齧歯動物が含まれる。特定の実施形態では、対象はヒトであり、より詳細には、特定の抗原と関連する疾患を起こす危険があるヒトの患者である。
【００６４】
本発明に従って、当技術分野の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。そのような手法は、文献に詳しく説明されている。（例えば、非特許文献３０〜３９を参照）。
【００６５】
本明細書で冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法上の目的を指すために用いられる。例として、「要素」は、１つまたは複数の要素を意味する。
【００６６】
明細書全体を通して、単語「含んでいる」または変形形態の「含む」もしくは「含んでいる」などは、明示された要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群が含まれることを意味するが、いかなる他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の除外を意味するものではないと理解される。
【００６７】
以下の実施例は例示のために提供され、限定するものではない。
実験
【実施例１】
【００６８】
ミョウバン吸着Ｂ型肝炎ワクチンの粉末製剤の調製
噴霧フリーズ・ドライ法（ＳＦＤ）
Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン（Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ、Ｓｈａｎｔｈａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ、Ｈｙｄｅｒａｂａｄ、Ｉｎｄｉａ）の粉末製剤を、基本的に、炭素菌（ｒＰＡ）炭疽ワクチンの組換え防御抗原について非特許文献２１に記載されているように、ＳＦＤによって生成した。Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンは、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されている組換えＨＢｓＡｇを含む。簡潔には、Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンおよびデキストラン／トレハロースもしくはマンニトール／トレハロースを含む液体製剤を調製して、５ｍｌ注射器に付けたＢＤ Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルを用いて噴霧した。５ｍｌの一定量を、液体窒素を含む金属製受け皿内に噴霧し、該受け皿を、−４０℃に前冷却した棚凍結乾燥器に移した。液体窒素を完全に蒸発させ、次に、下の表１に記載のように粉末を乾燥させた。
【００６９】
【表１】
【００７０】
粉末ワクチン試料を凍結乾燥器から取り出し、乾燥グローブボックス［５％相対湿度（「ＲＨ」）］に入れ、次にガラス容器に移して密封した。
【００７１】
大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）
Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン（Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ、Ｓｈａｎｔｈａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ、Ｈｙｄｅｒａｂａｄ、Ｉｎｄｉａ）の粉末製剤を、基本的に特許文献１に記載のように、ＡＳＦＤによって生成した。具体的には、Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンおよびマンニトール／トレハロースを含む液体製剤を調製した。注射器にこの製剤を充填し、超音波ノズル（Ｓｏｎｏ−Ｔｅｋモデル８７００−２５；４．５ワットおよび６ｍｌ／分の液体流速で操作）を用いて液体窒素を詰めたＡＳＦＤチャンバーに噴霧した。噴霧が完了したとき、チャンバーの底に乾燥窒素気体流を１５Ｌ／分の速度で流し始めた。液体窒素の全てが蒸発するまで、乾燥窒素気体流を継続した。次に、乾燥前に粉末を−３０℃でアニールする（ａｎｎｅａｌ）ために、２．５時間の間注入気体流量を１００Ｌ／分に増加した。次に、−１４℃の所望の乾燥温度を達成するために、気体流量を３８Ｌ／分に低下させた。測定したＲＨパーセントが１％未満に低下したとき、冷却機を切り、気体流量を３８Ｌ／分に維持した。チャンバーが２０℃まで徐々に温まるまで放置し、その時点で、気体流を遮断して粉末を収集した。粉末収率（重量測定による判定）は、８７．７％であった。
【実施例２】
【００７２】
ＳＦＤ Ｂ型肝炎ワクチンの分析
安定性分析
実施例１で上記したように調製されたＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンおよび液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンの元の液体製剤を、様々な条件下で粒子凝集について分析した。具体的には、各ワクチン製剤（液体または粉末）を４℃（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンの製造業者の推奨温度）で保存するか、５５℃で保存するか、または、−２０℃で凍結融解させた後に５５℃で保存した。次に、Ｂ型肝炎ワクチンのＳＦＤ粉末製剤を水で再調製して、それをさらなる分析にかけた。詳細には、様々な保存条件の後のワクチン製剤の安定性を、下記のように、沈降アッセイおよびＡＵＳＹＭＥアッセイを用いて評価した。
【００７３】
沈降アッセイ
約２５０μｌの試料をガラス毛細管に吸い上げ、ＣＲＩＴＯＳＥＡＬで密封し、立てたまま室温（２４℃）で放置した。濁った沈殿分画の高さおよび液体の全高を、毛細管を立ててからの以下の時点で測定、記録した：０分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間および５時間。実験の正確度および再現性を確保するために、試料条件につき計３回分を反復実施した。
沈降速度は、以下の通りに計算した：
沈降率＝｛（液体全高−記録した沈殿高）／液体全高）｝×１００
【００７４】
沈降アッセイで得られた結果を、図１〜３に示す。マンニトール／トレハロースまたはデキストラン／トレハロースによるＳＦＤ処理と４℃および５５℃での１カ月の保存後、試料で沈降速度の有意な増加（すなわち、沈降曲線の左へのシフト）は観察されなかった（図１および２）。おそらく粘度の上昇のために、沈降速度はデキストランの添加によって低下した（図１）。さらに、マンニトール／トレハロースを有するＳＦＤ製剤は、凍結融解および５５℃で１４日間の保存の後、凝集の証拠を示さなかった（図３）。
【００７５】
ＳＦＤワクチン製剤と対照的に、ワクチンの元の液体製剤は、凍結融解および５５℃で１４日間の保存の後により速い沈降速度を示し、そのことは粒子凝集と合致している（図３）。したがって、ＳＦＤ処理は、アルミニウムアジュバントを含有するＨＢｓＡｇワクチンを、粒子凝集から保護するようである。
【００７６】
図１〜３で提示する沈降データの概要を、下の表２〜７で提供する。
【００７７】
【表２】
【００７８】
【表３】
【００７９】
【表４】
【００８０】
【表５】
【００８１】
【表６】
【００８２】
【表７】
【００８３】
ＡＵＳＺＹＭＥアッセイ
各試料のＨＢｓＡｇ濃度（［ＨＢｓＡｇ］）を、製造業者の説明書に従ってＡＵＳＺＹＭＥアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によって定量した。簡潔には、各試料を、１０ｎｇ／ｍｌの［ＨＢｓＡｇ］まで水で１／２０００に希釈し、その後、提供されたマルチウェルプレートのウェルに２反復で加えた。標準曲線は、Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンを２０ｎｇ／ｍｌから０．６２５ｎｇ／ｍｌまでの２倍希釈で希釈することによって構築した。モノクローナル複合体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を各ウェルに加え、その後、抗ＨＢｓＡｇモノクローナル被覆ビーズ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｃｏａｔｅｄ ｂｅａｄ）を加えた。３７℃で７５分間のインキュベーションの後、ビーズを含む各ウェルを５ｍｌの水で３回洗浄した。次にＯＰＤ基質（ｏ−フェニレンジアミン・２ＨＣｌ）を各ビーズに加えて、室温で３０分間インキュベートした。反応を１Ｎ Ｈ2ＳＯ4で停止させ、プレート読取機により上清の吸光度をＯＤ492で読み取った。ＳＦＤ加工ワクチンおよび元の液体ワクチンの試料中の［ＨＢｓＡｇ］は、標準曲線との比較によって判定した。
【００８４】
ＡＵＳＹＭＥアッセイの結果を、下の表８で要約する。
【００８５】
【表８】
【００８６】
ＡＵＳＺＹＭＥアッセイの結果は、液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンは４℃で安定であるが、５５℃で１４日後に［ＨＢｓＡｇ］の低下を示し、２８日目には抗原濃度がさらに低下することを示した。対照的に、マンニトール／トレハロース賦形剤を含むＳＦＤ処理Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンは、４℃および５５℃で２８日間保存した場合、ほぼ同じ［ＨＢｓＡｇ］を保持した。ＳＦＤデキストラン／トレハロース製剤は、５５℃で２８日間の保存の後、［ＨＢｓＡｇ］の低下を示した。しかし、この低下は、同じ保存条件下の液体ワクチンの低下よりも小さかった。凍結融解サイクルおよびその後の５５℃で２８日間の保存にさらした場合、液体および粉末の製剤は［ＨＢｓＡｇ］を保持した。沈降アッセイによる測定で液体製剤がこの保存条件で凝集を起こしたこと、および、液体ワクチンの［ＨＢｓＡｇ］が５５℃で２８日間の保存後著しく低下したことを考えると、この結果は驚くべきことである。
【００８７】
免疫原性研究
ＳＦＤ Ｂ型肝炎ワクチン製剤がそれらの免疫原性を保持したかどうかを評価するために、マウスを様々な製剤の液体または再調製されたＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンで免疫感作した。下記で詳述するように、免疫応答は、血清ＨＢｓＡｇ特異抗体の応答を定量することによって測定した。具体的には、０日目および２８日目に、以下のワクチン製剤の１つの０．４または２マイクログラム用量による筋肉内注射により雌のＢａｌｂ／ｃマウス（１群１０匹）を免疫感作した。
１．Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン（液体）
２．Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース（液体）
３．Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース（液体）
４．ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ＋デキストラン／トレハロース（再調製）
５．ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ＋マンニトール／トレハロース（再調製）
６．Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂワクチン（液体）
【００８８】
０、２８および４２日目に、マウスから血を取った。ＥＬＩＳＡにより、ＨＢｓＡｇに対する抗体について血清を定量した。ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０／１％脱脂乾燥乳（ｐＨ ７．２）中で希釈した血清試料を、事前にリン酸コーティング緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌ ＨＢｓＡｇでコーティングした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅｎｅ ＮＵＮＣ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）のウェルに加えた。モノクローナル抗ＨＢｓＡｇ抗体の既知の濃度を用いて、標準曲線を作成した。室温で１時間のインキュベーションの後、ＰＢＳ＋０．０５％トゥイーン２０（ＰＢＳＴ）でプレートを３回洗浄した。ＰＢＳＴ中で１：８０００に希釈した抗マウスＩｇＧ複合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａｂａｍａ）を加え、室温で３０分間プレートをインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで再び３回洗浄した。ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質）を加え、室温で１０分間プレートをインキュベートした。１Ｎ Ｈ2ＳＯ4の添加により反応を停止させ、ＯＤ492でプレートを読み取った。
【００８９】
免疫原性試験の結果は、図４および下の表９および１０で要約する。試験した全ての群で、ＩｇＧ応答は用量依存的であった。液体ワクチン製剤への賦形剤の添加は、ＩｇＧ応答に著しく影響を及ぼさなかった。再調製されたワクチン粉末製剤によるマウスの免疫感作は、従来の液体ワクチンによる免疫感作の後に得られるものと類似したレベルの抗体を生成した（図４）。２回目の免疫感作の後、ＳＦＤ製剤によって生成された抗体レベルは、液体製剤による免疫感作の後に得られたものと有意に異なることはなかった（ｐ＞０．０５）。これらの結果は、ＳＦＤ工程がＳｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンの免疫原性に影響を及ぼさないことを証明する。したがって、希釈剤での再調製の際に免疫原性を保持する安定したミョウバン吸着Ｂ型肝炎ワクチン粉末製剤を生成するために、ＳＦＤを用いることができる。
【００９０】
【表９】
【００９１】
【表１０】
【実施例３】
【００９２】
ＡＳＦＤ Ｂ型肝炎ワクチンの分析
安定性分析
実施例１で上記したように調製されたＡＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンおよび液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンの元の液体製剤を、様々な条件下で粒子凝集について分析した。具体的には、各ワクチン製剤（液体または粉末）を４℃（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンの製造業者の推奨温度）で保存するか、５５℃で保存するか、または、−２０℃で凍結融解させた後に５５℃で保存した。次に、Ｂ型肝炎ワクチンのＡＳＦＤ粉末製剤を水で再調製して、それをさらなる分析にかけた。詳細には、様々な保存条件の後のワクチン製剤の安定性を、上の実施例２に記載のように、沈降アッセイおよびＡＵＳＹＭＥアッセイを用いて評価した。
【００９３】
沈降アッセイ
沈降アッセイは、液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンおよび再調製したＡＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン製剤を用いて、実施例２に記載されているように実施した。沈降アッセイで得られた結果を、図５〜７に示す。４℃で１カ月間の保存後、沈降速度の変化は液体製剤でもＡＳＦＤ製剤でも観察されなかった（図５）。５５℃での保存後、凝集から生じる沈降速度の増加（すなわち、沈降曲線の左へのシフト）は、液体製剤でもＡＳＦＤ製剤でも観察されなかった（図６）。実際、ＡＳＦＤ製剤で得られた沈降曲線は右へのシフトを示し、５５℃での保存後のより遅い沈降速度が示唆された。凍結融解および５５℃で１４日間の保存の後、液体製剤はかなり速い沈降速度を示した（図７）。製剤中の凝集物は、明らかに目で確認することができた。しかし、沈降速度の変化がなかったことが示すように、同じ凍結融解および保存条件下のＡＳＦＤ処理ワクチンでは、凝集は観察されなかった。さらに、光学顕微鏡検査による粒子の視覚的分析は、ＡＳＦＤワクチンが、小さな、非凝集水酸化アルミニウム粒子構造を保持することを示した。したがって、ＡＳＦＤ処理は、ミョウバン吸着ＨＢｓＡｇワクチンを、粒子凝集から保護するようである。
【００９４】
図５および図６で提示する沈降データの概要を、下の表１１〜１５で提供する。
【００９５】
【表１１】
【００９６】
【表１２】
【００９７】
【表１３】
【００９８】
【表１４】
【００９９】
【表１５】
【０１００】
ＡＵＳＺＹＭＥアッセイ
ＡＵＳＺＹＭＥアッセイは、液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンおよび再調製したＡＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン製剤を用いて、実施例２に記載されているように実施した。ＡＵＳＹＭＥアッセイでは、ＨＢｓＡｇの濃度をＥＬＩＳＡに基づく方法で測定する。このアッセイは、ＨＢｓＡｇに対する抗体を、標準参照曲線との比較によるＨＢｓＡｇの濃度の判定のために、抗原を捕捉する手段として用いる。このアッセイでＨＢｓＡｇに結合することができる抗体の能力は、それを、免疫原濃度およびＨＢｓＡｇの抗原性の測定に適するものにする。本明細書の上記で記載するように、「抗原性」は、タンパク質（すなわち、免疫原）を認識して結合する抗体の能力と定義される。他方、「免疫原性」は、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、ヒトまたはヒト以外の対象で）免疫応答を引き起こす、タンパク質（すなわち、免疫原）の能力を指す。ＡＵＳＺＹＭＥアッセイの結果を、下の表１６に示す。
【０１０１】
【表１６】
【０１０２】
ＡＵＳＺＹＭＥアッセイの結果は、４℃で２８日間保存した場合、液体およびＡＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン製剤はそれらの元のＨＢｓＡｇ濃度（［ＨＢｓＡｇ］）を保持していたことを証明する。しかし、液体Ｓｈａｎｖａｃワクチンを５５℃で保存した場合、［ＨＢｓＡｇ］は７日後に低下し始め、その後、１４および２８日間の保存の後にかなり大きく低下した。対照的に、ＡＳＦＤ処理ワクチンで観察された［ＨＢｓＡｇ］は、５５℃で２８日間保存した場合でも低下しなかった。したがって、ＡＳＦＤ処理は、高温での保存から生じる［ＨＢｓＡｇ］の低下を阻止した。
【０１０３】
上のＳＦＤ処理ワクチン製剤の分析で記載したように、ＡＳＦＤと液体のＳｈａｎｖａｃ−Ｂ製剤の両方は、凍結融解した後に５５℃で１４日間保存した場合でも［ＨＢｓＡｇ］の低下を示さなかった。沈降アッセイによる測定で液体製剤がこの保存条件で凝集を示したこと、および、液体ワクチンの［ＨＢｓＡｇ］が５５℃で２８日間の保存後著しく低下したことを考えると、このことは驚くべきことである。凍結融解サイクルの間に液体製剤中で凝集物が形成され、それによってＨＢｓＡｇを封入して、以降の５５℃での保存の間の分解に対してそれを保護するのを助けると推測される。
【０１０４】
免疫原性試験
ＡＳＦＤ Ｂ型肝炎ワクチン製剤が免疫原性を保持したかどうかを評価するために、マウスを様々な製剤の液体または再調製されたＡＳＦＤもしくはＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンで免疫感作した。上の実施例２で詳述するように、免疫応答は、血清ＨＢｓＡｇ特異抗体の応答を定量することによって測定した。具体的には、０日目および２８日目に、以下のワクチン製剤の１つの２マイクログラム用量による筋肉内注射により、雌のＢａｌｂ／ｃマウス（１群１０匹）を免疫感作した。
１．Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン（液体）
２．Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース（液体）
３．ＡＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ＋マンニトール／トレハロース（再調製）
４．ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ＋マンニトール／トレハロース（再調製）
【０１０５】
ＡＳＦＤワクチンの免疫原性試験の結果は、図８および下の表１７および１８で要約する。再調製されたＡＳＦＤワクチン粉末製剤によるマウスの免疫感作は、従来の液体ワクチンによる免疫感作の後に得られるものと類似したレベルの抗体生成をもたらした（図８）。２回目の免疫感作の後、ＡＳＦＤ製剤によって生成された抗体レベルは、液体製剤またはＳＦＤ製剤による免疫感作の後に得られたものと有意に異なることはなかった（ｐ＞０．０５）。これらの結果は、ＡＳＦＤ工程がＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンの免疫原性に負の影響を及ぼさないことを証明する。
【０１０６】
【表１７】
【０１０７】
【表１８】
【実施例４】
【０１０８】
ＳＦＤ ＢｏＮＴ／Ａミョウバン吸着ワクチンの分析
ＳＦＤ ＢｏＮＴ/Ａミョウバン吸着ワクチンの調製
組換えＢｏＮＴ／Ａ ＨＣ免疫原（提供元Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ；Ｆｏｒｔ Ｄｅｔｒｉｃｋ、ＭＤ）を、筋肉内注射（ＩＭ）もしくは皮内（ＩＤ）注射のためにアルミニウムヒドロゲル上（すなわち、水酸化アルミニウム）に、または、鼻腔内（ＩＮ）送達のためにリポポリサッカライド（ＬＰＳ）上に吸着させた。本明細書で記載される方法に従って、ＢｏＮＴ／Ａワクチンを従来の液体ワクチンとして、または、ＳＦＤにより乾燥粉末ワクチン製剤として製剤化した。一般的には、実施例１を参照。ＳＦＤ ＢｏＮＴ／Ａワクチン粉末製剤は、対象に投与する直前に水で再調製した。
【０１０９】
ＢｏＮＴ/Ａによる免疫感作および誘発
液体のおよび再調製された粉末ＢｏＮＴ／Ａワクチン製剤の分析のために、６〜８週齢の雌ＣＤ−１／ＩＣＲマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）を使用した。具体的には、０日目および２８日目に試験群につき１０匹のマウスに、液体のまたは再調製されたＢｏＮＴ粉末ワクチン製剤を５０μｌ（片側ずつ２５μｌ）の量でＩＭ注射または顕微針に基づくＩＤ注射として投与し、あるいは、３０μｌの製剤（鼻孔につき１５μｌ）のＩＮ投与によって投与した。陰性対照として、マウスの特定の群をワクチン未接種のままにするか、または、ＩＭもしくはＩＮ投与により、アジュバントだけを含む液体製剤を投与した。当技術分野で標準の技術に従って、血液を０、１４、２８および４２日目に収集した。４９日目に全てのマウスに致死用量のＢｏＮＴ／Ａ（マウスのＢｏＮＴ／ＡのＬＤ50値の１００，０００倍）を用いて誘発し、その後、さらなる５日間観察した。様々な試験群のマウスの生存率を５４日目に評価し、それを下の表１９に示す。
【０１１０】
【表１９】
【０１１１】
再調製されたＳＦＤ ＢｏＮＴ／Ａ粉末ワクチンによるＩＭおよびＩＤ免疫感作は、液体ＢｏＮＴ／Ａワクチン製剤で観察されたものに類似した生存率（最高約１００％）をもたらした。再調製されたＳＦＤまたは液体のＢｏＮＴ／ＡワクチンのＩＮ送達は、同じＢｏＮＴ／ＡワクチンによるＩＭまたはＩＤ免疫感作で観察されたものより低いが、類似した生存率（最高約５０％）をもたらした。
【０１１２】
抗体血清力価分析および統計分析
様々な試験群の対象からの血液血清試料を、標準のＥＬＩＳＡ技術によってＢｏＮＴ／Ａ特異ＩｇＧ力価について分析した。結果を図９および１０に要約する。ＢｏＮＴ／Ａによる致死性誘発で観察された血清抗体力価および生存率の統計分析を、ＡＮＯＶＡおよび受信者動作特性曲線「Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）曲線」解析によって実施した。ＢｏＮＴ／Ａによる致死性誘発から対象が９７％の生存率を有する抗体力価８００は、図９Ｃおよび１０Ｃにおいて点線で示す。
【０１１３】
再調製されたＳＦＤ ＢｏＮＴ／Ａ粉末ワクチンによるＩＭおよびＩＤ免疫感作は強力な抗体応答を引き起こし、平均血清ＢｏＮＴ／Ａ抗体レベルは、液体ＢｏＮＴ／Ａワクチン製剤で観察されたものに類似していた。再調製されたＳＦＤまたは液体のＢｏＮＴ／ＡワクチンのＩＮ送達は、同じＢｏＮＴ／Ａワクチン製剤によるＩＭまたはＩＤ免疫感作で観察されたものよりも低い抗体応答を起こした。
【実施例５】
【０１１４】
ＳＦＤおよびＡＳＦＤの炭疽菌ｒＰＡミョウバン吸着ワクチンの分析
ＳＦＤおよびＡＳＦＤの炭疽菌ｒＰＡミョウバン吸着ワクチンの調製
炭疽菌ｒＰＡワクチンの乾燥粉末製剤を、下記のように、ＳＦＤまたはＡＳＦＤ（液体または気体の窒素による処理）によって調製し、マウスの免疫感作の前に、薬学上許容される担体中で再調製した。次に、以下に詳細に概説するように、再調製されたＳＦＤおよびＡＳＦＤの炭疽菌ｒＰＡワクチンの効能を、免疫感作動物の血清中の炭疽致死毒素中和抗体力価を定量することによって評価した。
【０１１５】
噴霧フリーズ・ドライ（ＳＦＤ）
炭疽菌ｒＰＡワクチンの粉末製剤は、基本的に、上の実施例１および非特許文献２１に記載のようにＳＦＤによって作製した。簡潔には、炭疽菌ｒＰＡ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびマンニトール／トレハロースを含む液体製剤を調製し、５ｍｌ注射器に付けたＢＤ Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルを用いて噴霧した。５ｍｌの一定量を、液体窒素を含む金属製受け皿内に噴霧し、該受け皿を、−４０℃に前冷却した棚凍結乾燥器に移した。液体窒素を完全に蒸発させ、次に、上の表１に記載のように粉末を乾燥させた。
【０１１６】
粉末ワクチン試料を凍結乾燥器から取り出し、乾燥グローブボックス［５％相対湿度（「ＲＨ」）］に入れ、次にガラス容器に移して密封した。最終ＳＦＤワクチン粉末は、０．５％の炭疽菌ｒＰＡおよび１％のアルミニウムを含有した。
【０１１７】
大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）−液体窒素（ＬＮ2）処理
炭疽菌ｒＰＡワクチンの粉末製剤を、基本的に特許文献１に記載のように、ＡＳＦＤによって生成した。具体的には、炭疽菌ｒＰＡ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびマンニトール／トレハロースを含む液体製剤を調製した。注射器にこの製剤を注入し、５ｍｌ注射器に付けたＢＤ Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルを用いて、液体窒素を充填したＡＳＦＤチャンバー内に噴霧した。噴霧が完了したとき、チャンバーの底に乾燥窒素気体流を４０Ｌ／分の速度で流し始めた。液体窒素の全てが蒸発するまで、乾燥窒素気体流を流し続けた。次に、−３５℃の出口気体温度を得るために、注入口気流温度を上昇させ、乾燥前に１時間、粉末をアニールするために、気体流速を１４０Ｌ／分に設定した。次に、出口で−２０℃の所望の一次乾燥温度を得るために、気体流量を６０Ｌ／分に低下させて暖めた。２４時間後、測定したＲＨパーセントが０．０１５％未満に低下したとき、０℃の出口温度を得て二次乾燥を始めるために気体温度を再び上げ、気体流量を６０Ｌ／分に保った。７時間後、測定したＲＨパーセントが０．０１５％未満に低下したとき、２３℃の出口温度を得るために注入口気体を暖め、その時点で気体流を遮断して粉末を収集した。最終ＡＳＦＤワクチン粉末は、０．５％の炭疽菌ｒＰＡおよび１％のアルミニウムを含有した。
【０１１８】
大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）−気体窒素（ＧＮ2）処理
炭疽菌ｒＰＡワクチンの粉末製剤を、基本的に特許文献１に記載のように、ＡＳＦＤによって生成した。具体的には、炭疽菌ｒＰＡ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびマンニトール／トレハロースを含む液体製剤を調製した。注射器にこの製剤を注入し、Ｓｏｎｏ−Ｔｅｋ社モデル８７００−２５超音波ノズルを用いて、流速４０Ｌ／分の気体窒素を用いて、−８０℃に前冷却したＡＳＦＤチャンバー内に噴霧した。噴霧の完了後、−３５℃の出口気体温度を得るために注入口気体流温度を上昇させ、乾燥前に１時間、粉末をアニールするために、気体流速を１４０Ｌ／分に設定した。次に、出口で−２０℃の所望の一次乾燥温度を得るために、気体流量を６０Ｌ／分に低下させて暖めた。２４時間後、測定したＲＨパーセントが０．０１５％未満に低下したとき、０℃の出口温度を得て二次乾燥を始めるために気体温度を再び上げ、気体流量を６０Ｌ／分に保った。３時間後、測定したＲＨパーセントが０．０１５％未満に低下したとき、２３℃の出口温度を得るために注入口気体を暖め、その時点で気体流を遮断して粉末を収集した。最終ＡＳＦＤワクチン粉末は、０．５％の炭疽菌ｒＰＡおよび１％のアルミニウムを含有した。
【０１１９】
免疫感作
マウスを、様々な製剤の液体または再調製されたＳＦＤもしくはＡＳＦＤの炭疽菌ｒＰＡワクチンで免疫感作した。各試験群のマウスを、表２０または表２１に記載されているワクチン製剤の１つによる筋肉内注射によって、０日目および２８日目に免疫感作した。マウスは、０日目（採血番号１または「前採血」）、１４日目（採血番号２または「ｂ２」）、２８日目（採血番号３または「ｂ３」）および４２日目（採血番号４または「ｂ４」）に血を採取した。次に、下記に記載される炭疽致死毒素中和アッセイを用いて、血清試料を分析した。
【０１２０】
【表２０】
【０１２１】
【表２１】
【０１２２】
炭疽致死毒素中和アッセイ
様々な試験群からのマウスの血清中の炭疽致死毒素中和抗体力価を、判定した。炭疽致死毒素中和アッセイは、当技術分野において公知である。例えば、非特許文献４０および４１を参照。本実施例では、血清試料の希釈溶液を、炭疽菌ｒＰＡおよび炭疽毒素致死因子と混合した。混合液をインキュベートして、細胞単層に加えた。次に、炭疽毒素と血清との混合液を細胞とともにインキュベートした。炭疽毒素と血清との混合液の存在下での細胞生存能力を、細胞の染色および光学濃度の測定によって評価した。中和抗体力価は、炭疽毒素が中和された、血清の最も高い希釈を表していた。
【０１２３】
結果
セット１および２の炭疽菌ｒＰＡワクチン製剤で得られた炭疽致死毒素中和アッセイからの結果（上の表２０および２１を参照）を、それぞれ図１１および１２に示す。図１１に示すデータは、Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルで生成されたＳＦＤ粉末（セット１、群４）が、未処理の液体ワクチン（群１；セット１）で得られたレベルと同等のレベルの毒素中和抗体を誘導する能力を保持することを証明する。さらに図１２に示すデータは、Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルで生成されたＳＦＤ粉末（セット２、群４）、およびＧＮ2工程により生成されたＡＳＦＤ粉末（セット２、群５）の両方が、未処理の液体ワクチンで得られたレベルと同等のレベルの毒素中和抗体を誘導する能力を保持することを証明する。
【実施例６】
【０１２４】
ＳＦＤペスト菌ミョウバン吸着ワクチン製剤の分析
ＳＦＤペスト菌Ｆ１−Ｖミョウバン吸着ワクチン製剤の調製
Ｆ１−Ｖタンパク質は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓによって提供され、それを、様々な賦形剤およびアジュバントで液体懸濁液（すなわち、ＳＦＤ処理なしで）として、または、基本的に本明細書の上の実施例１に記載のように、ＳＦＤ処理により乾燥粉末として製剤化した。２０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2および２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有する緩衝液で、４．５ｍｌのＦ１−Ｖ溶液を調製するために、圧ダイアフィルトレーションを用いた（ｐＨ７．４）。この緩衝液中のＦ１−Ｖの濃度は、０．６０９ｍｇ／ｍｌであった。
【０１２５】
ＳＦＤ工程の前にＦ１−Ｖ免疫原をＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着させ、下記のように、ペスト菌ミョウバン吸着ワクチンの製剤を調製した。ＳＦＤワクチン粉末製剤を、マウスの免疫感作の前に注射用水で再調製した。
【０１２６】
群１：２ｍｌバイアル内で、均一な懸濁液が形成されるまで、０．１３３ｍｌのＦ１−Ｖタンパク質（１．５ｍｇ／ｍｌの濃度）、０．１ｍｌのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）および０．７６７ｍｌの緩衝液（すなわち、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭアルギニンおよび１ｍＭシスチン、ｐＨ９．９）を混合した。
【０１２７】
群２および３：１０ｍｌバイアル内で、均一な懸濁液が形成されるまで、１１４．２ｍｇのマンニトール、１２．６ｍｇのトレハロース、０．４６６ｍｌのＦ１−Ｖ、０．３５ｍｌのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）および２．６８５ｍｌの緩衝液（すなわち、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭアルギニンおよび１ｍＭシスチン、ｐＨ９．９）を混合した。１．０ｍｌの一定量を取り出し、そのまま液体状態で用いた（すなわち、群２）。懸濁液の残りは、１ｍｌの注射器に付けたＡｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルを用いて、液体窒素中に噴霧した。この凍結試料を、−４５℃に前冷却した棚凍結乾燥器に入れ、真空下で乾燥させた（すなわち、群３）。
【０１２８】
群４：２ｍｌバイアル内で、均一な懸濁液が形成されるまで、０．２８４ｍｌの緩衝液交換Ｆ１−Ｖ（０．７０３ｍｇ／ｍｌの濃度）、０．１ｍｌのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）および０．６１６ｍｌの緩衝液（すなわち、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭアルギニン、１ｍＭシスチン、ｐＨ９．９）を混合した。
【０１２９】
群５および６：１０ｍｌバイアル内で、均一な懸濁液が形成されるまで、１２５．８ｍｇのマンニトール、１３．９ｍｇのトレハロース、０．９９４ｍｌのＦ１−Ｖ、０．３５ｍｌのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）および２．１５６ｍｌの緩衝液（１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭアルギニン、１ｍＭシスチン、ｐＨ９．９）を混合した。１．０ｍｌの一定量を取り出し、そのまま液体状態で用いた（すなわち、群５）。懸濁液の残りは、１ｍｌの注射器に付けたＡｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルを用いて、液体窒素中に噴霧した。この凍結試料を、−４５℃に前冷却した棚凍結乾燥器に入れ、真空下で乾燥させた（すなわち、群６）。
【０１３０】
【表２２】
【０１３１】
免疫感作
６〜８週齢の雌のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを収容し、ペスト菌の致死性誘引の前に上記のワクチン製剤で免疫感作した。各試験群につき、１０匹のマウスを用いた。各マウスは、０および２８日目に、Ｆ１−Ｖ用量３．３μｇまたは１０μｇで、指定されたワクチン製剤の５０μｌ（１部位につき２５μｌ）の筋内注射により免疫感作した。抗体力価を調査するために、血液を０、１４、２８および４２日目に収集した。
【０１３２】
結果
群１〜６のペスト菌Ｆ１−Ｖワクチン製剤で得られた結果を、図１３に示す。この図に示すデータは、再調製されたＳＦＤ Ｆ１−Ｖ粉末ワクチンが、液体ワクチン懸濁液による免疫感作の後に得られたものと類似したレベルの抗体産生をもたらすことを証明する。
【実施例７】
【０１３３】
ＳＦＤ多価ミョウバン吸着ワクチン製剤の分析
ＳＦＤ多価ミョウバン吸着ワクチン製剤の調製
単一の製剤中に４つの抗原（すなわち、ｒＰＡ、ｒＳＥＢ、ＢｏＮＴ／ＡおよびＦ１−Ｖ）を含む、多価ワクチンを調製した。詳細には、緩衝液／賦形剤を２０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2および２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ｐＨ７．４）に交換するために、Ｆ１−Ｖ溶液（ｐＨ９．０）を先ず圧ダイアフィルトレーションで処理した。対象とする他の３つの抗原（すなわち、ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／ＡおよびｒＳＥＢ）の溶液をこの溶液に加えて、多価溶液を作製した。マンニトールおよびトレハロース賦形剤とともに、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）をこの多価溶液に加えて、ミョウバン吸着液体懸濁液を生成し、次に、基本的に実施例１に記載のように、懸濁液を噴霧フリーズ・ドライさせて乾燥粉末を生成した。生じたＳＦＤ粉末は、使用時に注射用水で再調製した。
【０１３４】
各抗原の初期濃度および最終濃度を、下記に記載する：
【０１３５】
初期抗原濃度（ベンダーからの受領時）：
ｒＰＡ：２．５ｍｇ／ｍＬ ｒＰＡ
ｒＳＥＢ：３．４ｍｇ／ｍＬ
ＢｏＮＴ／Ａ：０．１８ｍｇ／ｍＬ
Ｆ１−Ｖ：６００μｇ／ｍＬ
【０１３６】
最終抗原濃度（投与された液体および再調製されたＳＦＤワクチン粉末製剤中の）：
ｒＰＡ：２００μｇ／ｍＬ
ｒＳＥＢ：４００μｇ／ｍＬ
ＢｏＮＴ／Ａ：２０μｇ／ｍＬ
Ｆ１−Ｖ：２００μｇ／ｍＬ
【０１３７】
免疫感作
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、液体または再調製されたＳＦＤ多価ワクチン製剤で免疫感作した。液体一価ワクチン製剤（すなわち、ｒＰＡ、ｒＳＥＢ、ＢｏＮＴ／ＡまたはＦ１−Ｖ抗原の１つだけを含む）を、対照として用いた。各試験群で１０匹のマウスを用い、各マウスは、０および２８日目に、指定されたワクチン製剤の５０μｌ（１部位につき２５μｌ）の筋内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）注射により免疫感作した。試験群の詳細を、下の表２３に要約する。前採血試料を、未実験でワクチン未接種のマウスから収集した。全ての試験群から１４、２８および４２日目に採血し、各抗原（すなわち、ｒＰＡ、ｒＳＥＢ、ＢｏＮＴ−ＡおよびＦ１−Ｖ）の抗体力価を判定するために、血清試料を標準のＥＬＩＳＡ方法によって分析した。
【０１３８】
【表２３】
【０１３９】
結果
１４、２８および４２日目に群１〜９の様々なワクチン製剤で免疫感作されたマウスからプールされた血清試料で得られた抗体力価の結果を、それぞれ下の表２４〜２６に示す。ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／Ａ、ｒＳＥＢおよびＦ１−Ｖ抗原を含む液体または再調製されたＳＦＤ多価ワクチン製剤で免疫感作したマウス（すなわち、試験群１、２、８および９）は、４つの抗原全てに対して免疫応答を起こした。多価ワクチン製剤で免疫感作したマウスで各抗原について測定した抗体力価は、一価の対照ワクチン製剤で免疫感作したマウス（すなわち、試験群３〜６）で各抗原について測定した抗体力価に類似し、多価ワクチンでの４つの抗原の組合せは各抗原の免疫原性に悪影響を与えないことが示された。さらに、再調製されたＳＦＤ多価ワクチンで免疫感作したマウス（すなわち、試験群２）は、対応する液体多価ワクチンで免疫感作したマウス（すなわち、試験群１）で観察されたものと類似したプール血清力価の上昇を示し、ＳＦＤ工程が様々な抗原の免疫原性を低減させないことが示された。個々の動物の抗体力価を分析した場合にも、類似した抗体力価結果が得られた。図１４を参照。
【０１４０】
ＩＭ（すなわち、試験群９）または顕微針によるＩＤ投与（すなわち、試験群１０）による液体多価ワクチン製剤の送達は類似した抗体力価を生み、本ワクチンが複数の投与方法に適合することが示された。Ａｌｈｙｒｄｏｇｅｌ（登録商標）の濃度の０．５％から０．２５％への低下（すなわち、試験群８および９）も多価ワクチンの免疫原性に影響を及ぼさず、そのことは、多価ワクチンで用いられた水酸化アルミニウムの両濃度（すなわち、５％および０．２５％）で得られた類似した抗体力価が証明する。
【０１４１】
測定した抗体力価が免疫抗原に特異的であることを確認するために、一価ワクチン対照で免疫感作したマウスを、一価ワクチンに存在していなかった抗原に対する抗体についてもスクリーニングした。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ一価ワクチンによる免疫感作の後に、ｒＳＥＢ、ｒＰＡおよびＦ１−Ｖを分析した。一価ワクチンによって生成した抗体力価は、各時点で抗原特異的であることが見出され、特定の一価ワクチンに含まれていなかった他の抗原については、有意な抗体レベルは観察されなかった。さらに、ワクチン未接種の未実験のマウス（群７）からのプールされた群血清は、４つの多価ワクチン抗原全てに対してスクリーニングしたとき、検出可能な抗体力価を生成することができず、本研究のマウスのいずれも既存の免疫を有していなかったことが示され、さらに、免疫感作された群で生成された力価が免疫抗原に特異的であったことが証明された。
【０１４２】
【表２４】
【０１４３】
【表２５】
【０１４４】
【表２６】
【０１４５】
本明細書中に挙げた全ての刊行物および特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者のレベルを示すものである。全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的におよび個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１４６】
上記発明は理解の明快さの目的のために例示および実施例としてある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある変更および修正を加えることができることは明らかであろう。
【技術分野】
【０００１】
連邦後援の研究または開発
本発明は、米国の医療研究資材本部（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｃｏｍｍａｎｄ）によって与えられた契約番号ＤＡＭＤ１７−０３−２−００３７の下で、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製する方法、乾燥したワクチン粒子の安定粉末製剤を含む医薬組成物、ならびに疾患の予防および治療にこれらの組成物を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ型肝炎は、感染血液および体液への曝露によって伝染する、重大なウイルス性肝臓感染症である。概算で１２００万人のアメリカ人、および世界中で２０億人の人々がＢ型肝炎に感染している。Ｂ型肝炎に感染するほとんどの健康成人は回復して防御抗体を形成するが、かなり多数の患者、特に幼児および小児は、生命にかかわる肝硬変、肝不全または肝癌をもたらすことのできる慢性Ｂ型肝炎感染症を起こす。毎年、世界中で約１００万人が、Ｂ型肝炎感染症から死に至る。（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
Ｂ型肝炎ウイルスは、内部コアおよび外側のエンベロープを含むＤＮＡウイルスである。ワクチンのエンベロープ外側は、「Ｂ型肝炎表面抗原」または「ＨＢｓＡｇ」と呼ばれるタンパク質を含む。コア内部は、ウイルスＤＮＡおよびウイルスの複製で用いられるＤＮＡポリメラーゼ酵素を含む。コア内部の抗原性因子は、当技術分野でしばしば「ＨＢｃＡｇ」と呼ばれる。Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）およびＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．社）を含むＢ型肝炎のための市販ワクチンが利用可能であるが、これらの液体製剤は冷凍条件下で最適に保存および輸送され、極限条件（例えば、高温、凍結融解サイクル、長期保存など）に耐えるように設計されていない。したがって、そのような極限条件下での保存および輸送に適する、安定粉末製剤としてのＢ型肝炎ワクチンの開発が有益であろう。
【０００５】
Ｂ型肝炎などのより「伝統的な」疾患のための安定粉末ワクチン製剤の有利な特性の認識に加えて、最近の世界情勢では、バイオテロリスト剤としての生物合成物の使用と戦うために、予防的または治療的に使用できる類似したワクチン製剤の開発に対するかなり大きな関心を引き起こした。ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）は、ヒトに最も毒性の強いタンパク質の１つであり、したがって、テロリストによって使用される可能性のある生物兵器を代表する。ボツリヌス中毒は、ＢｏＮＴが運動ニューロンのシナプシスに結合して、神経伝達物質アセチルコリンの放出を阻止する、潜在的に致命的な神経障害である。その結果、ＢｏＮＴへの曝露は視朦、嚥下障害、一般の呼吸麻痺および筋骨格麻痺、ならびに、毒素への曝露から数日以内に呼吸不全または心不全に起因する死をもたらすことができる。細菌ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）の７つの異なる血清型が公知であり、各株は、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧと命名されたＢｏＮＴの異なる形態を形成する。最も広く研究されているＢｏＮＴであるＢｏＮＴ／Ａは、約１５０ｋＤａの一本鎖タンパク質として、特定のボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）株で合成される。この一本鎖タンパク質は、切断されて、ジスルフィド結合によって連結される１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）および５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）を生成する。（例えば、非特許文献２および３を参照）。
【０００６】
炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）は、肺型（すなわち、吸入性）、皮膚型および胃腸型の炭疽病原体である。エアゾール化炭疽胞子の作製の可能性は、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を最適なバイオテロリスト剤にした。この細菌のエアゾール化または兵器化形態から生じる吸入性炭疽は、曝露直後および症状の出現前に処置されないならば、ほぼ１００％の死亡率を有する。吸入性炭疽罹患患者は、初期には一般に高熱および胸痛を訴え、それは、速やかに全身出血病状および心停止もしくは呼吸停止に進行する。約９０株の炭疽菌が公知であり、それらは、良性株から、生物兵器として用いることができそうな非常に強病原性の株まで様々である。病原性の強い炭疽菌株は、それ自身無毒性であるが疾患の侵襲性段階を媒介するポリ−Ｄ−グルタミル莢膜、および多成分毒素を含む。炭疽毒素は、それぞれ約８０ｋＤａの３つの異なる抗原成分を有し、浮腫因子（「ＥＦ」または「第Ｉ因子」）、防御抗原（「ＰＡ」または「第ＩＩ因子」）および致死因子（「ＬＦ」または「第ＩＩＩ因子」）と呼ばれている。防御抗原は炭疽毒素の結合ドメインを含んでいるが、そのように名づけられたのは、ある哺乳動物に投与されたときに、それは防御性の抗毒素抗体を誘導するからである。以前の研究では、炭疽毒素が示す致死作用を生成するのに、致死因子が必要であることが証明された。実験動物では、致死因子および防御抗原のみの組合せが致死性であることがわかっている。炭素菌および炭素の総論については、参考文献を参照（例えば、非特許文献４、５および６を参照）。炭疽菌によるバイオテロリスト攻撃の重大な脅威にもかかわらず、米国では現在ただ１つの炭疽ワクチンだけが用いられ、防御免疫を引き出すために複数の用量を数カ月にわたって投与しなければならない。
【０００７】
ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）は、細菌黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）によって生成される約２８ｋＤａのエンテロトキシンであり、従来から、非冷凍の肉および乳製品から生じる食中毒と関連している。ＳＥＢに起因する食中毒の古典的な徴候は、一般に自己限定的で２４時間以内に解消する胃腸症状の突然の開始である。現在の国際的な政治情勢の中で非常に懸念されているのは、ＳＥＢが潜在的なバイオテロリスト剤であるという事実である。ＳＥＢは安定で、容易にエアゾール化され、全身性の傷害、多臓器不全、敗血性ショック、および、非常に高いレベルで吸入された場合には死さえ引き起こすことができる。ＳＥＢの吸入の症状には、高熱、息切れ、激しい胸痛、および、重度の場合には、肺水腫および成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）が含まれるが、それらに限定されない。したがって、ＳＥＢ、特にエアゾール化ＳＥＢは、重大なバイオテロリスト脅威となる。
【０００８】
グラム陰性細菌ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）は、ペストを引き起こす。ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）は、細菌細胞に食作用阻止特性を与える分画１莢膜抗原（すなわち、「Ｆ１」）、および、宿主の生得的な免疫応答を抑制するＶ抗原を含む。Ｆ１−Ｖと呼ばれる前記２つの抗原を含む融合タンパク質が生成されている。（例えば、非特許文献７を参照）。
【０００９】
ヒトでは、ペストの３つの臨床型、すなわち、腺ペスト、敗血症性ペストおよび肺ペストが存在する。肺ペストは、ペスト菌感染症の最も重大な形態であり、細菌が肺に感染して肺炎を引き起こすときに起こる。一次肺ペストは、ペスト菌細菌の直接吸入から、例えば感染した人から未感染個体への空気伝染により、またはエアゾール化細菌の意図的な放出（例えば、バイオテロリスト攻撃）により生じる。（例えば、非特許文献８を参照）。肺ペストは約１〜６日の潜伏期間を有し、例えば、激しい頭痛、悪寒、倦怠感の急激な開始、および呼吸数および心拍数の増加を特徴とする。（同書）。これらの症状は速やかに肺炎に進行し、未処置のまま放置すると、究極的に呼吸不全および死に至ることがある。（例えば、非特許文献９を参照）。適時に（すなわち、疾患の開始から約２０時間以内に）投与される場合は、適当な抗生物質は死亡率を低下させるが、特に多数の個体を曝露させることができ、抗生物質の国家備蓄を速やかに消耗させることができるバイオテロリスト事件の場合には、肺ペストに起因する致死率は高いままである。
【００１０】
ＣＤＣおよび国家安全保障省（Ｈｏｍｅｌａｎｄ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ）は、ペスト菌を潜在的バイオテロリスト兵器、すなわち、特に危険な脅威をもたらす兵器の当然の選択としての候補とみなしたが、それは次の理由による。１）あらゆる大陸でのその自然発生、２）野生動物および家畜化された動物の保有体、ならびに人工装置からのその伝播の容易さ、３）抗生物質の入手が容易なこの時代における医師の油断と合わさったのかもしれないが、その臨床所見についての現在の経験の不足、４）細菌を量産する能力、５）遺伝子改変された抗生物質耐性株を生成してエアゾール化することができることによる容易さ、ならびに６）一次肺ペストが汚染されたエアゾール液滴の吸入を通して人から人へ広がることができるという事実。（例えば、非特許文献１０〜１６を参照）。
【００１１】
バイオテロリスト剤としてのＢｏＮＴ、炭疽菌の毒性株、ＳＥＢまたはペスト菌（例えば、Ｆ１−Ｖ）の潜在的な使用は、ＢｏＮＴ、炭疽、ＳＥＢおよび／またはペスト菌に対する安定粉末ワクチンの開発を有利にし、そのようなワクチンが医療関係者または非医療関係者によって、最低限の侵襲性の方法を含む様々な技術によって投与され得る場合は特に有利である。安定化されたＢｏＮＴ、炭疽、ＳＥＢおよびペスト菌ワクチン製剤は、バイオテロリスト攻撃の事件または脅威の発生時に、最初の対応者、軍人、および、おそらく一般大衆に対してさえも、予防的免疫感作を可能にするために容易に再調製すること（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）ができよう。複数のバイオテロリスト剤に対して防御免疫を提供する安定した多価ワクチンが、特に有利である。
【００１２】
Ｂ型肝炎ワクチンおよび炭疽ワクチンなどのワクチンは、免疫原に対する対象の免疫応答を高めるために、一般に少なくとも１つのアジュバントを含有する。ワクチンの免疫原性を高めるために、アジュバントとしてアルミニウム塩が多用される。しかし、ミョウバン吸着ワクチンの保存のために液状の生物学的生成物を安定させるための従来の手法の適用は、問題を含んでいる。詳細には、従来の凍結乾燥、凍結およびフリーズ・ドライ工程を適用した場合、ミョウバン吸着ワクチンは一般に凝集、免疫原濃度の低下および免疫原性の喪失を示す。（例えば、その全てが参照により本明細書に組み込まれている、非特許文献１７〜２０を参照）。安定性および免疫原性を喪失させずに再調製することができる、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を生成するために従来の方法を使用することは、ほとんど不成功であった。したがって、凝集、免疫原性の喪失および免疫原濃度の低下の問題に対処するミョウバン吸着ワクチンの安定粉末剤形を含んでいる医薬組成物。生じた安定粉末ワクチンは、粒子凝集または免疫原性または免疫原濃度の減少をほとんどまたは全く示さない有効な液体ワクチンを生成するために、希釈剤中で容易に再調製可能でなければならない。そのような方法は、ミョウバン吸着ワクチンの長期保存を容易にし、これらのワクチンの保存寿命を延長させ、冷蔵保存および輸送が利用できない地域でのそれらの使用を可能にし、様々な技術（例えば、医療関係者を必要としない潜在的に最低限の侵襲性の投与方法）による対象へのワクチン投与を可能にし、かつ、特にバイオテロリスト剤に関しては、ワクチンの備蓄を容易にするであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１８０７５５号明細書
【特許文献２】米国特許第４６０８７６４号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂ型肝炎財団のウェブサイトhepb. org/index.html.
【非特許文献２】Li and Singh (2000) Biochem. 39:6466-6474
【非特許文献３】Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nature Structural Biol. 7:693-699
【非特許文献４】Bravata et al. (2006) Annals Intern. Med. 144(4):270-280
【非特許文献５】Todor's Online Textbook of Bacteriology: Bacillus anthracis and anthrax at textbookofbacteriology.net/Anthrax.html (University of Wisconsin-Madison Department of Microbiology)
【非特許文献６】Brock Biology of Microorganisms (M. Madigan and J. Martinko, eds.; Prentis Hall, 2005)
【非特許文献７】Santi et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:861-866
【非特許文献８】Kool (2005) Healthcare Epidemiology 40:1166-1172
【非特許文献９】Josko (2004) Clin. Lab. Sci. 17:25-29
【非特許文献１０】Finegold et al. (1968) Am. J. Path. 53:99-114
【非特許文献１１】Walker (1968) Curr. Top. Micro. Immun. 41:23-42
【非特許文献１２】Walker (1968) J. Infect. Dis. 118:188-96
【非特許文献１３】Beebe and Pirsch (1958) Appl. Microbiol. 6:127-138
【非特許文献１４】Williams et al. (1994) J. Wildlife Dis. 30:581-585
【非特許文献１５】Watson et al. (2001) Veter. Path. 38:165-172
【非特許文献１６】Green et al. (1999) Med. Micro. 23:107-113
【非特許文献１７】Maa et al. (2003) J. Pharm. Sci. 92:319-332
【非特許文献１８】Diminsky et al. (1999) Vaccine 18:3-17
【非特許文献１９】Alving et al. (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690:265-275
【非特許文献２０】Warren et al. (1986) Ann. Rev. Immunol. 4:369-388
【非特許文献２１】Jiang et al. (2006) J. Pharm. Sci. 95:80-96
【非特許文献２２】Virology 3rd Edition (W. K. Joklik cd. 1988)
【非特許文献２３】Fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. 1991)
【非特許文献２４】J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed. [Pierce Chemical Co., Rockford, III., (1984)]
【非特許文献２５】G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2 [E. Gross and J. Meienhofer, eds., Academic Press, New York (1980)]
【非特許文献２６】M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag Berlin (1984))
【非特許文献２７】The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1 E. Gross and J. Meienhofer, eds.
【非特許文献２８】Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California
【非特許文献２９】Remington 's Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990)
【非特許文献３０】Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)
【非特許文献３１】Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I-III (Ausubel, R. M., ed. (1994))
【非特許文献３２】Cell Biology: A Laboratory Handbook, Volumes I-III (J. E. Celis, ed. (1994))
【非特許文献３３】Current Protocols in Immunology, Volumes I-III (Coligan, J. E., ed. (1994))
【非特許文献３４】Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)
【非特許文献３５】Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985))
【非特許文献３６】Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984))
【非特許文献３７】Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986))
【非特許文献３８】Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986))
【非特許文献３９】B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)
【非特許文献４０】Little et al. (1990) Infect. Immunol. 58(6):1606-1613
【非特許文献４１】Hering et al. (2004) Biologicals 32(l):17-27
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための方法を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本方法は、アルミニウムアジュバント上に吸着された免疫原を含む液体製剤を霧化して霧化製剤を生成するステップと、霧化製剤を凍結させて凍結粒子を生成するステップと、凍結粒子を乾燥させて乾燥粉末粒子を生成するステップとを含む。凍結粒子の乾燥ステップは、特に振動、内部構造物（ｉｎｔｅｒｎａｌｓ）および／または機械的攪拌の存在下では、およそ大気圧で実施することができる。
【００１７】
本発明の医薬組成物には、最適ではない条件（例えば、高温、凍結融解など）に置かれた場合でも安定している、粒子状、粉末状のワクチンが含まれる。本明細書で開示される粉末ワクチン製剤を希釈剤で再調製して、粒子凝集をほとんどまたは全く示さず、免疫原濃度の重大な低下を示さず、免疫原性および／または抗原性のかなり高いレベルを保持し、対象とする疾患または障害に対する防御効能を維持することのできる、再調製液体ワクチンを生成することができる。さらに、本発明の粉末ワクチン製剤および再調製ワクチン製剤は、様々な方法、特に最低限の侵襲性の投与技術を用い、医療関係者または非医療関係者による、投与に適し得る。ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を含んでいる医薬組成物（またはその再調製された液体形態）、ならびに、個々の疾患、障害およびその症状を予防および治療するためにこれらの組成物を用いる方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】様々な液体のおよび噴霧フリーズ・ドライ処理した（ＳＦＤ）Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン製剤で０日目に得られた沈降速度曲線を示す図である。以下の製剤のデータを示す。製剤１（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン）；対照２（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース）；製剤２（ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース）；対照３（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース）；および製剤３（ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース）。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図１Ｂ】４℃で２８日間ワクチンを保存した後の沈降速度を示す図である。以下の製剤のデータを示す。製剤１（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン）；製剤２（ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース）；および製剤３（ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース）。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図２Ａ】５５℃で０、７、１４および２８日間保存した液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンで得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図２Ｂ】５５℃で０、７、１４および２８日間保存したＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロースの沈降速度を示す。対照試料（すなわち、液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース）で得られた沈降データも、比較目的のために図２Ｂに示されている。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図３Ａ】凍結融解サイクルならびに５５℃で０および１４日間の保存の後の液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンで得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図３Ｂ】凍結融解サイクルならびに５５℃で０および１４日間の保存の後のＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロースの沈降速度を示す図である。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図４Ａ】指定された液体またはＳＦＤワクチン製剤で免疫感作されたマウスからの血清中の、免疫感作から２８日目の平均抗ＨＢｓＡｇ抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示す図である。マウスは、０日目および２８日目に免疫感作した。以下の製剤のデータを示す。液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン；液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース；液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース；ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；およびＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（対照Ｂ型肝炎ワクチン；Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．社製）。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図４Ｂ】指定された液体またはＳＦＤワクチン製剤で免疫感作されたマウスからの血清中の、免疫感作から４２日目の平均抗ＨＢｓＡｇ抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示す図である。マウスは、０日目および２８日目に免疫感作した。以下の製剤のデータを示す。液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン；液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース；液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース；ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；およびＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（対照Ｂ型肝炎ワクチン；Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．社製）。実験の詳細は、実施例２で提供する。
【図５Ａ】４℃で０および２８日間保存した後の、液体のＳｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン製剤で得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図５Ｂ】４℃で０および２８日間保存した後の、大気圧噴霧フリーズ・ドライ処理した（ＡＳＦＤ）Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン製剤で得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図６Ａ】５５℃で０、７、１４および２８日間保存した後の、液体のＳｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン製剤で得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図６Ｂ】５５℃で０、７、１４および２８日間保存した後の、ＡＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン製剤で得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図７】凍結融解サイクルおよび５５℃で１４日間の保存の後の、液体およびＡＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン製剤で得られた沈降速度曲線を示す図である。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図８】指定された液体またはＡＳＦＤのワクチン製剤で免疫感作されたマウスからの血清中の、免疫感作から２８日目および４２日目の平均抗ＨＢｓＡｇ抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示す図である。マウスは、０日目および２８日目に免疫感作した。以下の製剤のデータを提示する。液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン；液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；ＡＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース；およびＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース。実験の詳細は、実施例３で提供する。
【図９Ａ−１】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）投与によって投与した。１４日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ａ−２】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、皮内（ＩＤ）投与によって投与した。１４日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ａ−３】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。１４日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｂ−１】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）投与によって投与した。２８日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｂ−２】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、皮内（ＩＤ）投与によって投与した。２８日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｂ−３】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。２８日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｃ−１】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）投与によって投与した。４２日目について、平均血清抗体力価を示す。４９日目のＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与の後、５４日目に生存していた様々な試験群のマウス個体数も示す。破線は８００の抗体力価を示し、そのレベルでは、対象はＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与から９７％の生存率を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｃ−２】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、皮内（ＩＤ）投与によって投与した。４２日目について、平均血清抗体力価を示す。４９日目のＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与の後、５４日目に生存していた様々な試験群のマウス個体数も示す。破線は８００の抗体力価を示し、そのレベルでは、対象はＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与から９７％の生存率を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図９Ｃ−３】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ/Ａ）ワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。４２日目について、平均血清抗体力価を示す。４９日目のＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与の後、５４日目に生存していた様々な試験群のマウス個体数も示す。破線は８００の抗体力価を示し、そのレベルでは、対象はＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与から９７％の生存率を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で示す。
【図１０Ａ】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ＢｏＮＴワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）または鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。１４日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で提供する。
【図１０Ｂ】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ＢｏＮＴワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）または鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。２８日目について、平均血清抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で提供する。
【図１０Ｃ】１．０μｇまたは０．１μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末ＢｏＮＴワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。図に示すように、ワクチン製剤は、０および２８日目に、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）または鼻腔内（ＩＮ）投与によって投与した。４２日目について、平均血清抗体力価を示す。４９日目のＢｏＮＴ／Ａによる致死性抗原投与の後、５４日目に生存していた様々な試験群のマウス個体数もに示す。破線は８００の抗体力価を示し、そのレベルでは、対象はＢｏＮＴによる致死性抗原投与から９７％の生存率を示す。さらなる実験の詳細は、実施例４で提供する。
【図１１】様々な炭疽菌ｒＰＡワクチン製剤による免疫感作の後の、炭疽致死毒素中和アッセイによって測定された血清中の中和抗体力価を示す図である。各動物試験群で用いたワクチン製剤の具体的な詳細を、表２０に示す。さらなる実験の詳細は、実施例５で提供する。
【図１２】様々な炭疽菌ｒＰＡワクチン製剤による免疫感作の後の、炭疽致死毒素中和アッセイによって測定された血清中のエンドポイントの中和抗体力価を示す図である。各動物試験群で用いたワクチン製剤の具体的な詳細を、表２１に示す。さらなる実験の詳細は、実施例５で提供する。
【図１３Ａ】１０μｇまたは３．３μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末Ｆ１−Ｖワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。ワクチン製剤は、０および２８日目に、試験マウスに筋内投与した。１４日目について、平均血清抗体力価を示す。図中の円は、個々のマウスの血清抗体力価を表し、バーは全ての試験動物についての平均抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例６で提供する。
【図１３Ｂ】１０μｇまたは３．３μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末Ｆ１−Ｖワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。ワクチン製剤は、０および２８日目に、試験マウスに筋内投与した。２８日目について、平均血清抗体力価を示す。図中の円は、個々のマウスの血清抗体力価を表し、バーは全ての試験動物についての平均抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例６で提供する。
【図１３Ｃ】１０μｇまたは３．３μｇの液体のまたは再調製されたＳＦＤの粉末Ｆ１−Ｖワクチンによる免疫感作の後の、平均血清抗体力価を示す図である。ワクチン製剤は、０および２８日目に、試験マウスに筋内投与した。４２日目について、平均血清抗体力価を示す。図中の円は、個々のマウスの血清抗体力価を表し、バーは全ての試験動物についての平均抗体力価を示す。さらなる実験の詳細は、実施例６で提供する。
【図１４Ａ】水酸化アルミニウムアジュバントに前吸着された多価の液体ワクチン（「液体Ｐｏｌｙ」）、水酸化アルミニウムに前吸着された再調製されたＳＦＤ粉末ワクチン（「前吸着されたＳＦＤ Ｐｏｌｙ」）、または一価の液体ワクチン対照（「液体Ｍｏｎｏ」）のいずれかで免疫感作されたマウスからの、幾何平均血清抗体力価を示す図である。血清試料を、多価ワクチンの構成抗原、すなわち炭疽菌からの組換え防御抗原（ｒＰＡ）に対する抗体についてスクリーニングした。矢印によって示すように、マウスを０および２８日目に免疫感作し、抗体分析のために血液を０、２８および４２日目に得た。さらなる実験の詳細は、実施例７で提供する。
【図１４Ｂ】水酸化アルミニウムアジュバントに前吸着された多価の液体ワクチン（「液体Ｐｏｌｙ」）、水酸化アルミニウムに前吸着された再調製されたＳＦＤ粉末ワクチン（「前吸着されたＳＦＤ Ｐｏｌｙ」）、または一価の液体ワクチン対照（「液体Ｍｏｎｏ」）のいずれかで免疫感作されたマウスからの、幾何平均血清抗体力価を示す図である。血清試料を、黄色ブドウ球菌からのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）に対する抗体についてスクリーニングした。矢印によって示すように、マウスを０および２８日目に免疫感作し、抗体分析のために血液を０、２８および４２日目に得た。さらなる実験の詳細は、実施例７で提供する。
【図１４Ｃ】水酸化アルミニウムアジュバントに前吸着された多価の液体ワクチン（「液体Ｐｏｌｙ」）、水酸化アルミニウムに前吸着された再調製されたＳＦＤ粉末ワクチン（「前吸着されたＳＦＤ Ｐｏｌｙ」）、または一価の液体ワクチン対照（「液体Ｍｏｎｏ」）のいずれかで免疫感作されたマウスからの、幾何平均血清抗体力価を示す図である。血清試料を、ボツリヌス菌からのボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）に対する抗体についてスクリーニングした。矢印によって示すように、マウスを０および２８日目に免疫感作し、抗体分析のために血液を０、２８および４２日目に得た。さらなる実験の詳細は、実施例７で提供する。
【図１４Ｄ】水酸化アルミニウムアジュバントに前吸着された多価の液体ワクチン（「液体Ｐｏｌｙ」）、水酸化アルミニウムに前吸着された再調製されたＳＦＤ粉末ワクチン（「前吸着されたＳＦＤ Ｐｏｌｙ」）、または一価の液体ワクチン対照（「液体Ｍｏｎｏ」）のいずれかで免疫感作されたマウスからの、幾何平均血清抗体力価を示す図である。血清試料を、ペスト菌からのＦ１−Ｖ融合タンパク質（図１４Ｄ）に対する抗体についてスクリーニングした。矢印によって示すように、マウスを０および２８日目に免疫感作し、抗体分析のために血液を０、２８および４２日目に得た。さらなる実験の詳細は、実施例７で提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ミョウバン吸着ワクチン、例えばＢ型肝炎、ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）、炭疽（すなわち、炭疽菌）、ペスト（すなわち、ペスト菌）またはブドウ球菌エンテロトキシン［すなわち、黄色ブドウ球菌からのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）］ワクチンの、安定粉末製剤を調製するための方法を目的とする。本明細書で開示される安定したミョウバン吸着ワクチンの粉末製剤の製法は、一般に噴霧フリーズ・ドライ（ＳＦＤ）または大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）技術、例えば、その両方は参照によりその全体が組み込まれている、特許文献１および非特許文献２１に記載のものを含む。医薬用ワクチンの粉末組成物およびこれらの組成物の使用方法も、本発明に包含される。
【００２０】
本明細書で用いるように、用語「ミョウバン吸着ワクチン」は、免疫原およびアルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物、特に免疫原がアルミニウムアジュバントに吸着されているものを指す。アルミニウムアジュバントは当技術分野で公知であり、例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよび硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が含まれる。用語「ミョウバン」は、任意のアルミニウムアジュバントを包含する。特定の実施形態では、アルミニウムアジュバントは水酸化アルミニウム［例えば、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）］である。
【００２１】
開示されるミョウバン吸着ワクチンの粉末製剤は、高温［すなわち、従来の冷蔵温度より上の温度］で保存されても、および／または凍結融解を受けても安定である。ミョウバン吸着ワクチンの粉末製剤は、希釈剤中で容易に再調製して、ほとんどまたは全く粒子凝集を示さず、免疫原濃度の実質的な低下を示さず、実質的なレベルの免疫原性および／または抗原性を保持し、対象とする病因病原体または毒素に対する実質的なレベルの防御（すなわち、「予防効果」または「防御免疫」）を示す、再調製液体ワクチンを生成することができる。再調製液体ミョウバン吸着ワクチンを調製するための方法も、開示される。特定の病因病原体または毒素への曝露と関連する特定の疾患、障害または症状の予防または治療において、ミョウバン吸着ワクチンの粉末組成物（またはその再調製液体製剤）を用いる方法が、さらに提供される。さらに、本明細書で開示される安定粉末ワクチン製剤の容易に再調製可能な性質は、様々な方法による再調製ワクチンの投与を可能にし得る。本発明のある態様では、再調製ワクチンは、医学的に訓練された人員の支援の有る無しに関係なく、最低限の侵襲性の技術によって投与することができる。例えば、本発明の再調製ワクチン、特にＢ型肝炎、炭疽、ＢｏＮＴワクチン、特にＢｏＮＴ／Ａワクチン、ペストワクチン、特にＦ１−Ｖペストワクチン、またはブドウ球菌エンテロトキシンワクチン、特にＳＥＢワクチンは、顕微針によって皮内に投与することができる。
【００２２】
ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための方法は、アルミニウムアジュバント上に吸着された免疫原を含む液体製剤を霧化して霧化製剤を生成するステップと、霧化製剤を凍結させて凍結粒子を生成するステップと、凍結粒子を乾燥させて乾燥粉末粒子を生成するステップとを含む。そのような方法は、本明細書で「噴霧フリーズ・ドライ（ＳＦＤ）」と称することができる。例えば、その全ては参照により本明細書に組み込まれている、非特許文献２１、同１７、および特許文献１を参照のこと。本発明の特定の態様では、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための、特許請求に係る方法は、アルミニウムアジュバント上に吸着された免疫原を含む液体製剤を霧化して霧化製剤を生成するステップと、霧化製剤を凍結させて凍結粒子を生成するステップと、凍結粒子をおよそ大気圧の下で乾燥させて乾燥粉末粒子を生成するステップとを含む。乾燥ステップは、振動、内部構造物、機械的攪拌またはそれらの組合せの存在下で実施することができる。粉末製剤を生成するこの方法は、「大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）」と称すことができる。（例えば、特許文献１を参照）。
【００２３】
ミョウバン吸着ワクチンの従来の液体製剤は、長期保存を容易にするために用いられる従来の凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、凍結およびフリーズ・ドライ（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）技術を適用すると、免疫原性を失い、凝集することが示された。例えば、その全ては参照により本明細書に組み込まれている、非特許文献１７〜２０を参照されたい。その結果、ミョウバン吸着ワクチンは、一般に冷蔵条件（例えば、約２℃から約８℃）の下で、液体製剤として保存および輸送されなければならない。しかし、本発明の方法は、Ｂ型肝炎、ＢｏＮＴ、炭疽、ペスト（例えば、Ｆ１−Ｖ）またはブドウ球菌エンテロトキシン（例えば、ＳＥＢ）ワクチンなどの、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤の生成を可能にし、該安定粉末製剤は非最適条件（例えば、非冷蔵条件）下で保存することができ、適する担体で再調製して、粒子凝集をほとんどまたは全く示さず、免疫原性／免疫原性を保持し、疾患、毒素またはそれらと関連する症状に対する防御効能を維持することができる。本明細書で用いる「非最適条件」または「非最適保存条件」は、一般にワクチン組成物を高温で保存すること、ワクチン製剤に１回または複数回の凍結融解サイクルを適用すること、およびワクチン組成物を長期間保存することなどの条件を指す。「高温」は、液体ワクチン製剤の保存のために従来推奨されている冷蔵条件を越える温度を意図し、例えば、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、５５℃またはそれ以上の温度を含めることができる。
【００２４】
「粉末」または「粉末製剤」または「粉末製剤を含む医薬組成物」は、実質的に固体の、易流動性の粒子からなる組成物を意図する。本発明の「安定粉末製剤」または「ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を含む医薬組成物」は、実質的な構造的完全性を維持し（例えば、凝集をほとんどまたは全く示さないこと、実質的な量の元の免疫原濃度を維持することなど）、元の液体製剤のそれと比較して、実質的なレベルの免疫原性、抗原性および／または防御効能を保持する。本発明の特定の態様では、ミョウバン吸着ワクチンの粉末製剤は、非最適条件（例えば、高温、凍結融解サイクル、長期保存など）下での保存に対してさえも安定している。例えば、本発明の安定粉末製剤は、非最適条件下で保存し、再調製により液体ワクチン製剤を生成することができ、その場合、再調製された液体ワクチンは粒子凝集をほとんどまたは全く示さず、元の免疫原濃度の実質的な量を維持し、さらに、実質的なレベルの免疫原性および／または抗原性を保持するが、これについては本明細書の以下でさらに記載する。ミョウバン吸着ワクチン組成物の安定性は、例えば、粒子凝集の程度に対応する沈降速度の測定、および再調製液体ワクチンに存在する免疫原の濃度測定によって評価することができる。詳細には、再調製液体ワクチンの沈降速度および免疫原の濃度は、元の液体製剤（すなわち、霧化の前にアルミニウムアジュバントに吸着された免疫原を含む液体製剤）のそれと比較することができる。沈降速度、免疫原の濃度、免疫原性および抗原性を測定するための標準のアッセイは当技術分野で公知であり、実施例２および３で記載される。防御効能は、例えば、対象とする特定の免疫原と関連する病因病原体または毒素による誘発の後に、免疫感作された対象およびされていない対象の生存率を評価することによって評価することができる。本発明の炭疽ワクチンに関して、防御免疫は、例えば、炭疽致死毒素中和アッセイを通して分析することができる。
【００２５】
本発明の方法に従って霧化される液体製剤は、アルミニウムアジュバントに吸着される少なくとも１つの免疫原を含む。「免疫原」は、対象において免疫応答を誘導する任意の天然または合成の物質である。１つを超える免疫原を含む液体製剤は、本発明の実施で用いることができ、一般に「多価」（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）または「複数価」（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）ミョウバン吸着ワクチンと呼ばれる。本明細書で用いるように、用語「免疫原性」は、対象に投与された場合に免疫応答（例えば、細胞の免疫原特異免疫応答または体液性抗体応答）を誘導する物質の能力を指す。本発明の免疫原は、対象とする任意の病原体と関連するかそれに由来することができ、例として、例えば、細胞全体、ウイルス粒子（例えば、部分的または完全に不活性化されたウイルス）、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、リポタンパク、糖タンパク質および多糖が含まれる。本発明の特定の態様では、免疫原はＢ型肝炎抗原、例えば表面（ＨＢｓＡｇ）またはコアのＢ型肝炎抗原（ＨＢｃＡｇ）を含む。他の実施形態では、免疫原はボツリヌス免疫原であり、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのようなボツリヌス神経毒を含む。本発明のＢｏＮＴ免疫原は、一般的にＢｏＮＴ/Ａ抗原、特にＢｏＮＴ/Ａ重鎖（ＨＣ）である。本発明の免疫原は、炭疽菌抗原、特に炭疽菌の毒素またはその成分、特に炭疽菌防御抗原（ＰＡ）も含む。ある実施形態では、免疫原は組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）である。本発明のペスト菌抗原には、例えば、Ｆ１抗原、Ｖ抗原および、特に、Ｆ１−Ｖ融合タンパク質抗原が含まれる。免疫原には、さらにブドウ球菌エンテロトキシンの抗原、例えばＳＥＢ、特に組換えＳＥＢ（ｒＳＥＢ）が含まれる。本発明の一部の態様では、多価または複数価のワクチンを生成するために、複数の免疫原を用いることができる。そのような多価ワクチンは、例えば、炭疽抗原（例えば、ｒＰＡ）、ブドウ球菌エンテロトキシン抗原（例えば、ｒＳＥＢ）、ＢｏＮＴ抗原（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）およびペスト菌抗原（例えば、ｒＦ１−Ｖ）を含むことができる。本明細書の下記で定義される、対象とする免疫原の組換えで生成された免疫原、および変異体もしくは断片を、本発明の実施で用いることができる。
【００２６】
本明細書で定義される任意の適する免疫原を使用することができる。免疫原は、ウイルスの免疫原であることができる。したがって免疫原は、なかでも、ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルスなど）；カリチウイルス科；トガウイルス（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラプドウイルス科（例えば狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えばおたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；オルソミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型およびＣ型など）；ビニヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例えばＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のメンバーに由来することができる。
【００２７】
あるいは、ウイルスの免疫原は、乳頭腫ウイルス（例えばＨＰＶ）；ヘルペスウイルス；肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）またはＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）；およびダニ媒介性脳炎ウイルスに由来してもよい。これらのウイルスの記載については、例えば、非特許文献２２および２３を参照のこと。
【００２８】
本発明で用いるための細菌性免疫原は、炭疽、ボツリヌス中毒、ペスト、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎および他の病原状態を引き起こす生物体、例えば、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）Ａ、ＢおよびＣ、ヘモフィルス・インフルエンザＢ型（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（ＨＩＢ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の種、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の種、ボツリヌス菌、炭疽菌およびペスト菌に由来してもよい。細菌性免疫原の組合せは、例えば、ジフテリア、百日咳および破傷風の免疫原を含む、単一の組成物で提供することができる。適する百日咳免疫原は、百日咳毒素および／または線維状の赤血球凝集素および／または、Ｐ６９とも呼ばれるペルタクチン（pertactin）である。抗寄生虫性免疫原は、マラリアおよびライム病を引き起こす生物体に由来することができる。本発明のある態様では、細菌性免疫原は、組換えブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ｒＳＥＢ）、炭疽菌組換え防御抗原（ｒＰＡ）、組換えボツリヌス菌神経毒およびペスト菌Ｆ１−Ｖ融合タンパク質からなる群から選択される。特定の実施形態では、多価ワクチンを生成するために、上記の免疫原の組合せを本発明の実施で利用する。
【００２９】
本発明で用いるための免疫原は、当分野の技術者に公知である様々な方法を用いて生成することができる。詳細には、免疫原は、標準の精製技術を用いて天然源から直接単離することができる。あるいは、全部死菌の、弱毒化または不活性化させた細菌、ウイルス、寄生虫または他の微生物の全体を使用することができる。さらに、免疫原は、既知の技術を用いて組換えで生成することができる。
【００３０】
本明細書で用いる免疫原は、記載されているアミノ酸配列に基づいて、固相ペプチド合成などの化学重合体合成により合成することもできる。そのような方法は、当業技術者には公知である。固相ペプチド合成手法に関しては、例えば、非特許文献２４および２５を、古典的溶液合成に関しては、非特許文献２６および２７を参照されたい。
【００３１】
本発明のある態様では、アルミニウムアジュバントに吸着された免疫原を含む液体製剤は、安定乾燥粉末として製剤化されるべき、市販のミョウバン吸着ワクチンであってよい。任意のミョウバン吸着ワクチンの液体製剤を、本発明に実施で用いることができる。そのようなワクチンには、それらに限定されないが、Ｉｎｆａｎｒｉｘ（ジフテリア、破傷風および百日咳）、Ｈａｖｒｉｘ（小児のＡ型肝炎）、Ｖａｑｔａ（小児のＡ型肝炎）、Ｅｎｇｅｒｉｘ Ｂ（Ｂ型肝炎）、ＰｅｄＶａｘＨｉｂ（ヘモフィルス・インフルエンザＢ型）、Ｔｗｉｎｒｉｘ（Ａ型肝炎／Ｂ型肝炎）、Ｐｅｄｉａｒｉｘ（ジフテリア、破傷風および百日咳−ポリオウイルス−Ｂ型肝炎）、Ｐｒｅｖｎａｒ（肺炎球菌複合体）、Ｄａｐｔａｃｅｌ（ジフテリア、破傷風および百日咳）、Ｔｒｉｐｅｄｉａ（ジフテリア、破傷風および百日咳）、Ｃｏｍｖａｘ（ヘモフィルス・インフルエンザＢ型−Ｂ型肝炎）、Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ（Ｂ型肝炎）、Ｔｅｔｒａｍｍｕｎｅ（ジフテリア、破傷風および百日咳−ヘモフィルス・インフルエンザＢ型）、Ｃｅｒｔｉｖａ（ジフテリア、破傷風および百日咳）ならびにＳｈａｎｖａｃ−Ｂ（Ｂ型肝炎）が含まれる。特定の実施形態では、液体製剤は、Ｂ型肝炎のミョウバン吸着ワクチン、より具体的にはＨＢｓＡｇ抗原を含むワクチンを含む。さらに、リン酸アルミニウムに吸着され、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに特異的である五価のボツリヌス・トキソイド・ワクチンが、治験薬として疾病管理センターのために生成された。このミョウバン吸着ＢｏＮＴワクチンも、本発明の実施で用いることができる。炭疽菌の無毒性、非被包性の株由来の防御抗原を含む炭疽ワクチンは、米国では入手可能であるが、一般的に限定された集団（例えば、軍人、炭疽菌を研究している者など）だけに投与される。この液体炭疽ワクチンは、本方法および組成物で用いることができた。
【００３２】
用語「ポリヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド配列」の使用は、本発明を、ＤＮＡを含んでいるポリヌクレオチドに限定することを意図するものではない。当分野の技術者は、ポリヌクレオチド分子は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの組合せを含むことができることを理解する。「ＤＮＡ」は、その一本鎖形または二本鎖らせんのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）重合形態を指す。この用語は分子の一次および二次の構造だけを指し、それを任意の特定の三次形態に限定しない。したがって、この用語は、とりわけ、線形ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体で見られる、二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の議論では、本明細書で配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同の配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列だけを与える通常の規則に従って記載することができる。用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書で互換的に用いることができる。
【００３３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基の重合体を指す。これらの用語は、天然のアミノ酸重合体と同様に、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸重合体に適用される。
【００３４】
本発明の実施で用いられるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、天然のものであるか、または、通常の分子生物学技術に従って組換えで生成することができる。ポリペプチド（例えば、ＨＢｓＡｇ、ＢｏＮＴ／Ａ、炭疽菌ｒＰＡ、ｒＳＥＢもしくはｒＦ１−Ｖ）またはポリヌクレオチドを含む免疫原の変異体および断片も、本発明に包含される。「変異体」は、実質的に類似した配列を指す。本発明のアミノ酸またはヌクレオチド配列の変異体は、一般に参照配列と少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。特定の実施形態では、本発明の免疫原性ポリペプチドの変異体は、完全長ポリペプチドの生物活性を保持し、したがって、免疫原性である。変異体配列を生成する方法は当技術分野で公知であり、同様に、ＢＬＡＳＴなど、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の同一割合を判定する方法も公知である。
【００３５】
用語「断片」は、特定数の連続したアミノ酸またはヌクレオチド残基を含む、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部を指す。特定の実施形態では、本発明の免疫原性ポリペプチドの断片は、完全長ポリペプチドの生物活性を保持することができ、したがって、免疫原性であることができる。ポリヌクレオチドの断片は、そのタンパク質の生物活性を保持するタンパク質断片をコードすることができ、したがって、免疫原性であることができる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの断片は、それらが所望の属性（例えば、免疫原性）を有する限り、任意の長さであり得る。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの断片の生成方法は、当技術分野で公知である。
【００３６】
本発明の液体製剤は、免疫原およびアルミニウムアジュバントを含む。アルミニウムアジュバントに加え、他のアジュバント剤も本発明の実施で用いることができる。用語「アジュバント」は、免疫原に対する免疫応答を高める化合物または混合物を指す。アジュバントは、免疫原を徐々に放出する組織貯蔵所（ｔｉｓｓｕｅ ｄｅｐｏｔ）として、および免疫応答を非特異的に高めるリンパ系活性化剤としての役目も果たすことができる（例えば、非特許文献２８を参照）。一般に、本発明の実施で用いられるアジュバントは、薬学上許容される。そのような薬学上許容されるアジュバントは、当技術分野においては公知である。
【００３７】
例示的なアジュバントには、それらに限定されないが、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン（およびその誘導体）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素の乳濁液、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒト・アジュバントが含まれる。対象とする他のアジュバントには、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、モノリン酸化リピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｑ−デスアシル−４’−モノリン酸化リピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）、ＩＬ−１β １６３−１７１ペプチド（Ｓｃｌａｖｏペプチド）、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、カルシトニン遺伝子調節ペプチド、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン（ＧＭＤＰ）、ジメチルジオクタデシラ（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａ）またはジステアリ（ｄｉｓｔｅａｒｙ）臭化アンモニウム（ＤＤＡ）、亜鉛Ｌ−プロリン、ホルミル化−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（スレオニル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシ−ホスホリルオキシ）エチルアミド・モノナトリウム塩（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−イソＧｌｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル、１−（２−メチプロピル）−ＩＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン、４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミテート（ＤＴＰ−ＧＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチリヌラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）、７−アリル−８−オキソグアノシン、ポリアデニル酸−ポリ−ウリジル酸複合体、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−３ａ、フタル酸ジブチル、フタル酸ジブチル類似体およびＣ５ａが含まれる。
【００３８】
本発明の実施で用いられるアルミニウムアジュバント上への吸着免疫原を含む液体製剤は、霧化に適する任意の形態、例えば、溶液、懸濁液、スラリーまたはコロイドでよい。液体製剤は、１つまたは複数の薬学上許容される賦形剤、保護剤、溶媒、塩、界面活性剤および緩衝剤をさらに含むことができる。そのような賦形剤は当技術分野で公知であり、本発明のミョウバン吸着ワクチンの安定化に資することができる。適する賦形剤は、免疫原およびアルミニウムアジュバントと適合し、例には、水、生理食塩水、炭水化物、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せが含まれる。特に興味がある炭水化物賦形剤には、トレハロース、マンニトール、デキストラン、シクロデキストリン、イヌリンＵＳＰおよびそれらの組合せが含まれる。ある実施形態では、液体製剤は、免疫原、アルミニウムアジュバント、およびデキストラン／トレハロースまたはマンニトール／トレハロースを含む。さらに、所望により、液体製剤は、湿潤剤または乳化剤およびｐＨ緩衝剤などの補助物質を含むことができる。
【００３９】
適する賦形剤には、水との接触に増粘したり重合したりせず、個体に投与された場合に無害であり、その薬剤活性を変化させる方法で医薬用薬剤と著しく相互作用することのない、易流動性の粒子状固体を含めることができる。通常使用される賦形剤の例には、それらに限定されないが、ヒトおよびウシの血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、グルコース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、Ｄ−マンノースまたはソルボースなどの単糖、ラクトース、マルトース、サッカロース、トレハロースまたはショ糖などの二糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、エリスリトールまたはアラビトールなどの糖アルコール、デキストラン、デンプン、セルロースまたは高分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの重合体、アミノ酸またはそれらの塩、例えばグリシン、アラニン、グルタミン、アルギニン、リジンもしくはヒスチジン、または、ナトリウム、カリウムもしくはマグネシウム塩などの、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属とのそれらの塩、あるいは、リン酸ナトリウムもしくはカルシウム、炭酸カルシウム、亜硫酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酒石酸、プルロニック、界面活性剤およびそれらの組合せが含まれる。適する溶媒には、それらに限定されないが、塩化メチレン、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよび水が含まれる。薬学上許容される塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩、および、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩が含まれる。特にワクチン粉末製剤が吸入による投与を目的とする場合、キトサン、デルマタン硫酸、コンドロイチン、ペクチンおよび他の粘膜付着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）を本発明の実施で用いることもできる。適する界面活性剤には、トゥイーン８０、プルロニックなどが含まれるが、これらに限定されない。薬学上許容される賦形剤および補助剤に関する詳細な解説は、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献２９で入手可能である。
【００４０】
ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための本発明の方法は、霧化、凍結および乾燥ステップを含む。本発明の方法に従って、霧化、凍結および乾燥ステップは、単一のチャンバーまたは装置内で実施することができ、それによって試料汚染および収量減の可能性が消失する。例えば、液体製剤は、チャンバー内へ霧化（すなわち、噴霧）することができ、その中では、霧化製剤の凍結および凍結粒子の乾燥も起こる。単一のチャンバー内で霧化、凍結および乾燥させるための例示的な装置は、特許文献１で提供されている。
【００４１】
アルミニウムアジュバント上に吸着されている免疫原を含む液体製剤は、当技術分野で公知である様々な方法および装置を用いて霧化することができる。例えば、液体製剤は２流体ノズル、加圧ノズルもしくは遠心回転ディスクノズルを通して噴霧すること、または、超音波噴霧器、インクジェットプリンタ型ノズルもしくは振動オリフィスエアゾール発生器（ＶＯＡＧ）で霧化することができる。本発明の一部の態様では、液体製剤は、ＢＤ Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルなどの加圧ノズルで霧化される。霧化の気体流量および気体圧力、液体流速ならびにノズルの口径および種類を含む霧化条件は、特に霧化製剤中の液滴の径および生じた乾燥粉末製剤の粒径を最適化するために、変更させることができる。
【００４２】
液体製剤の霧化の後、液滴を速やかに凍結させて固体の凍結粒子を生成する。特定の実施形態では、液滴は、霧化ステップの後、直ちに凍結させる。液滴は、霧化された製剤を、液体製剤の凝固点未満の温度を有する任意の冷媒に導入することによって凍結させることができる。本明細書で用いるように、「霧化された製剤を冷媒に導入する」ことは、霧化された製剤の液滴を冷媒と接触させるための任意の方法、例えば、それに限定されないが、液滴を冷液中に浸すこと、または液滴を冷たいガス中を通過させることを含む。用語「冷媒」は、液体製剤の凝固点未満の温度を有する任意の適する冷たい液体または気体を含むと、広義に定義される。例示的な冷たい液体は当技術分野で公知であり、例には、液体窒素、アルゴンおよびヒドロフルオロエーテルが含まれる。圧縮液体、例えば圧縮流体二酸化炭素、ヘリウム、プロパン、エタンまたは同等の不活性液体を、本発明の実施で用いることもできる。凍結ステップの間に用いられる冷たい液体の温度は、一般的に約−２００℃から約−８０℃の間、詳細には約−２００℃から約−１００℃の間、より詳細には約−２００℃である。凍結ステップで用いられる代表的な気体には、それらに限定されないが、冷空気、窒素、ヘリウムおよびアルゴンが含まれ、一般に約−５℃から約−６０℃の間、より詳細には−２０℃から約−４０℃の間の温度で用いられる。所望の温度の冷媒を得るための従来の手順は、当技術分野で公知である。一実施形態では、免疫原およびアルミニウムアジュバントを含む液体製剤は、液体窒素を含んでいる容器［例えば、金属製の受け皿（ｍｅｔａｌ ｐａｎ）］より上に位置する噴霧ノズルを通して霧化される。霧化された製剤中の液滴は、一般に冷たい液体との接触により直ちに凍結し、それらは収集、乾燥させられる。
【００４３】
特許請求に係る方法の凍結ステップの間に生成される固体の凍結粒子を乾燥させて、ミョウバン吸着ワクチンの粉末粒子を生成する。本明細書で用語「乾燥」は、凍結粒子から液体を除去して、水分含有量が重量比で一般に２０％、１５％、１０％、５％または１％未満である粉末粒子を生成することを指すために用いられる。
【００４４】
上記の、および当技術分野で公知である噴霧フリーズ・ドライ（ＳＦＤ）技術を含むものなどの一部の実施形態では、当技術分野で公知である方法および装置に従って、凍結粒子を凍結乾燥（真空下）によって乾燥させる。例えば、実施例１で記載されているように、凍結粒子を収集して凍結乾燥器へ移し、過剰な液体を蒸発させて乾燥粉末粒子を生成することができる。ＳＦＤ法および装置は、例えば、非特許文献２１および同１７、ならびに特許文献１に記載されている。
【００４５】
本発明の他の態様、特に上記の大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）を含むものでは、凍結粒子は、大気圧前後の冷たい、乾燥気体（例えば、空気、窒素またはヘリウム）の気流中での昇華によって乾燥させる。本明細書で用いるように、「大気圧前後」は、約０．５から５気圧、詳細には１から３気圧、より詳細には約１気圧を意味するものとする。大気圧で粒子を乾燥させるための方法および装置は、特許文献１および２に記載されている。
【００４６】
特定の実施形態では、凍結粒子は、粒子の流動化を促進する条件下で、大気圧前後の冷たい気体中で乾燥させる。乾燥工程での粒子流動化は、チャンネリング（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）および凝集を阻止し、より速く、より完全な粒子乾燥を可能にする。乾燥ステップでの粒子の流動化を高める任意の方法を、本発明の実施で用いることができる。例えば、乾燥ステップは、振動、内部構造物、機械的攪拌またはそれらの組合せの存在下で実施することができる。用語「内部構造物」は、工業プロセス化学の分野で通常用いられ、本明細書では、ＳＦＤまたはＡＳＦＤのための装置またはチャンバー内に置かれる任意の物理的障壁（例えば、ブレード、プレート、パドルまたは他の障壁）を指すために用いられ、該物理的障壁は、乾燥工程で粒子の流動化を促進するために用いられる。（例えば、特許文献１を参照）。
【００４７】
本発明のある態様では、凍結粒子を工程の組合せによって、例えば大気圧前後の冷たい乾燥気体の流れの中での昇華と、続く従来の凍結乾燥によって乾燥させる。例えば、凍結粒子を冷たい気体との接触によって部分的に乾燥させ、フィルターまたは他の収集装置で収集し、その後、凍結乾燥にかけて粒子をさらに乾燥させることができる。本発明の方法に従い、乾燥工程は、例えば、凍結粒子の沈着および収集の後にくることができ、あるいは、凍結および乾燥が事実上同時に起きてもよい。凍結し、乾燥または部分的に乾燥した粉末粒子の収集のための任意の方法および容器もしくは装置を、本発明で用いることができる。一実施形態では、乾燥させた粒子をフィルター上に収集し、さらなる用途のために、または凍結乾燥による乾燥の場合のように、受け皿内にそこから粒子を取り出すことができる。収集したならば、乾燥粉末粒子を、医療用組成物の保存に適する滅菌容器へ移すことができる。
【００４８】
特許請求に係る医薬組成物の乾燥粉末粒子は、いくつかのパラメータ、例えば、それらに限定されないが、平均粒径（別称、平均幾何粒径または体積平均径）、粒径範囲、平均空気力学的径（別称、体積平均空気力学的径）、粒子表面積、ならびに粒子形態（例えば、粒子空気力学的形状および粒子表面特性）に基づいて特徴づけることができる。これらのパラメータを評価する方法は、当技術分野で公知である。例えば、粒径は、それらに限定されないが、走査電子顕微鏡およびレーザー回折を含む従来の技術によって評価することができる。粉末の平均粒径は、カスケード・インパクション（ｃａｓｃａｄｅ ｉｍｐａｃｔｉｏｎ）などの従来の技術を用いて、質量平均空気力学的径（ＭＭＡＤ）として測定することもできる。本明細書の下記で、また当技術分野で定義されるように、空気力学的径は、実際の粒径と粒子絶対密度の平方根との積と定義される。所望により、平均粒径を確認するために、自動粒径カウンター（例えば、Ａｅｒｏｓｉｚｅｒカウンター、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター、ＨＩＡＣカウンターまたはＧｅｌｍａｎ自動粒子カウンター）を用いることができる。粒子形態を質的に評価するために、走査電子顕微鏡検査を利用することができる。
【００４９】
同様に、本発明の粉末粒子は、密度または粒子密度の範囲に基づいて特徴づけることができる。実際の粒子密度または「絶対密度」は、ヘリウム・ピクノメトリー(ｈｅｌｉｕｍ ｐｙｃｎｏｍｅｔｒｙ)などの既知の定量技術を用いて、容易に確認することができる。あるいは、本発明によって粉末の密度を調査するために、「タップ」（ｔａｐ）密度測定を用いることができる。タップ密度は、指定された方法で詰め込む際に、指定体積まで容器を満たす物質の質量を、容器体積で割ったものとして定義される。タップ密度を測定するために適する装置が利用可能であり、例としては、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社から入手可能であるＧｅｏＰｙｃ（商標）モデル１３６０がある。粉末組成物の絶対密度とタップ密度との間の差は、その組成物の全空隙率および比孔隙量に関する情報を提供する。
【００５０】
本方法に従って作製される粉末製剤の平均粒径は、一般に約３５μｍから約３００μｍ、詳細には約８０μｍから約２５０μｍ、より詳細には約８０μｍから約１００μｍである。本発明の一部の実施形態では、平均粒径は少なくとも８０μｍである。本発明の粉末粒子の平均タップ密度は、一般的に約０．０１から約０．７ｇ／ｃｍ3、詳細には約０．０１から約０．６ｇ／ｃｍ3、より詳細には約０．０２から約０．４ｇ／ｃｍ3である。
【００５１】
ミョウバン吸着ワクチン、特にミョウバン吸着Ｂ型肝炎、ボツリヌス中毒（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）、炭疽（すなわち、炭疽菌）、ｒＳＥＢ（すなわち、ブドウ球菌エンテロトキシン）またはペスト（ペスト菌）のワクチンの安定粉末製剤を含んでいる医薬組成物も、本発明に包含される。ある実施形態では、医薬組成物は、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）に吸着されている、Ｂ型肝炎抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）、ＢｏＮＴ免疫原（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、特にＢｏＮＴ／Ａ ＨＣ）、炭疽菌抗原（例えば、炭疽菌ＰＡ、特に炭疽菌ｒＰＡ）、ブドウ球菌エンテロトキシン抗原（例えば、ＳＥＢ、特にｒＳＥＢ）、またはペスト菌抗原（例えば、Ｆ１−Ｖ）の安定粉末製剤を含む。本発明を特定の製剤に限定するものではないが、ある実施形態では、乾燥粉末は（重量パーセントで）約０．０００１％から約１０％の免疫原、約０．２から約２５％のミョウバンアジュバント（元素アルミニウム含有量に基づく）、および約７０から約９９％の炭水化物賦形剤（例えば、マンニトール、トレハロースまたはデキストラン）を含む。本発明の医薬組成物は、希釈剤で再調製して対象への投与のための液体ワクチンを形成した、安定したミョウバン吸着ワクチン粉末製剤をさらに含む。再調製液体ミョウバン吸着ワクチンを生成するための方法は、本発明にさらに包含される。ある実施形態では、本方法は、本発明のミョウバン吸着ワクチンの乾燥粉末製剤を、本明細書の下記で定義される薬学上許容される担体中で再調製することを含む。
【００５２】
先に述べたように、ミョウバン吸着ワクチンの「安定」粉末製剤は、乾燥した粉末粒子を希釈剤中で再調製して、再調製された液体ワクチンを生成することができる製剤であリ、該ワクチンは、ほとんどもしくは全く粒子凝集を示さず、免疫原濃度の実質的な低下を示さず、免疫原性を保持し、抗原性を維持し、かつ／または防御効力を示し、このことは特にＳＦＤおよびＡＳＦＤがなされておらず、その後対象への投与前に再調製されたワクチンの液体製剤と比較した場合に妥当する。これらのパラメータは、当技術分野で公知であり、下記の実験の実施例に記載されている様々な技術（例えば、沈降アッセイ、ＡＵＳＹＭＥアッセイ、血清抗体濃度の分析、ＢｏＮＴ／Ａまたはペスト菌などの病因病原体または毒素による致死性抗原投与の後の生存率、および炭疽致死毒素中和アッセイ）を用いて評価することができる。再調製された液体ワクチンで得られる結果は、アルミニウムアジュバントに吸着されている免疫原を含む元の液体製剤（すなわち、噴霧前の元の液体製剤）を用いて得られる結果と比較することができる。
【００５３】
一部の実施形態では、再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、特に元の液体製剤のそれと比較して、ほとんどまたは全く粒子凝集を示さない。粒子凝集は、鏡検または沈降速度分析などの方法を用いて評価することができる。「液体製剤のそれと比較してほとんどまたは全くない粒子凝集」とは、例えば、元の液体製剤の沈降速度と比較して、再調製された液体ワクチンで沈降速度の実質的な増加が観察されないことを表す。さらに、本発明のある態様では、再調製された液体ワクチンは、霧化前の液体製剤の免疫原濃度と比較して、免疫原濃度の実質的な低下を示さない。「免疫原濃度の実質的な低下がない」とは、再調製された液体ワクチンが、元の免疫原濃度の少なくとも約５０、６０または７０％、より好ましくは元の免疫原濃度の少なくとも約８０、８５または９０％、最も好ましくは元の液体製剤中に存在する免疫原濃度の少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上を保持することを意味するものとする。免疫原濃度は、例えば、ＥＬＩＳＡに基づく方法（例えば、ＡＵＳＺＹＭＥ）で測定することができる。
【００５４】
本明細書で用いられ、および当技術分野で定義されているように、「抗原性」は、タンパク質（例えば、免疫原）を認識して結合する抗体の能力である。「免疫原性」は、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、ヒトまたはヒト以外の対象中で）免疫応答を引き起こす、タンパク質（すなわち、免疫原）の能力を指す。本発明の再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、一般に、元の液体製剤のそれと比較して、実質的なレベルの抗原性および免疫原性を保持する。「実質的なレベルの抗原性」は、元の液体ワクチン製剤のそれと比較した場合に、液体再調製ワクチンに存在する免疫原が、少なくとも約５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９９％またはそれ以上の抗原性を保持することを意味するものとする。抗原性は、例えば、ＡＵＳＺＹＭＥなどのＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定することができる。本発明のある態様では、再調製液体ワクチンは相当高いレベルの免疫原性を保持し、したがって、対象において免疫応答を、特に霧化前の元の液体製剤で得られるものと実質的に同じである免疫応答を促進することができる。すなわち、再調製液体ワクチンによる対象の免疫感作によって達成される免疫応答は、液体製剤で得られる免疫応答レベルの少なくとも約５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９９％以上、またはそれらと同等以上であることができる。対象における免疫応答は、それに限定されないが免疫感作後の血清抗体レベルの測定を含む、当技術分野で公知である様々な方法によって判定することができる。さらに、本発明のワクチン、特にＢｏＮＴ／Ａ、ｒＰＡ、ｒＳＥＢ、Ｆ１−Ｖ、その任意の組合せを含んでいるワクチンで得られる「保護レベル」または「予防効果」は、対象とする免疫原（例えば、ＢｏＮＴ／ＡなどのＢｏＮＴ）の致死用量への曝露後に生存する免疫化対象の割合によって評価することができる。本発明の炭疽ワクチン、特に炭疽菌ｒＰＡワクチンで得られる保護レベルは、例えば、当技術分野で公知である、実施例５に記載の方法に従って、血清試料の中和抗体力価を定量することによって判定することができる。
【００５５】
本明細書の粉末組成物に適用される用語「安定」は、粉末を高温、長期保存または凍結融解サイクルにさらしても、なお、上記の凝集、免疫原濃度、免疫原性、抗原性および／または防御効力に関して所望の特性を保持することができることをさらに表す。
【００５６】
上記のように、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤は、対象への投与に適する液体ワクチン製剤を生成するために、薬学上許容される担体で再調製することができる。「薬学上許容される担体」は、有効成分の保存、投与または治療効果を促進するために当技術分野で従来用いられる担体を指す。医薬組成物およびワクチンを製剤化するための薬学上許容される担体および方法は、一般に当技術分野で公知である。薬学上許容される担体、安定剤およびイソモライト（ｉｓｏｍｏｌｙｔｅ）の製剤化および選択に関する詳細な解説は、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献２９で見られる。ワクチン粉末製剤の再調製のための例示的な薬学上許容される担体には、生理的食塩水、緩衝液および塩などの様々な希釈剤が含まれる。本明細書で用語「再調製液体ワクチン」または「再調製ミョウバン吸着液体ワクチン」は、液体担体で再調製して再調製液体ワクチンを生成した、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を含んでいる医薬組成物を指すために、互換的に用いられる。本発明の方法は、安定し、かつ容易に再調製することができる乾燥粉末ワクチン製剤の調製を可能にする。特定の実施形態では、本発明の再調製液体ワクチンは、粒子凝集をほとんどまたは全く示さず、免疫原濃度の実質的な低下を示さず、実質的なレベルの免疫原性、抗原性および／または防御効能を保持する。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、特定の免疫原と関連する疾患、障害、状態または症状を予防または治療する方法で有用である。用語「疾患」、「障害」および「状態」は、本明細書で互換的に用いられる。具体的には、予防および治療の方法は、対象への医薬組成物の治療有効量の投与を含む。特定の実施形態では、Ｂ型肝炎を予防または治療する方法が提供される。本発明の他の態様では、ボツリヌス中毒、またはＢｏＮＴへの曝露と関連する症状の発生を阻止する方法がさらに提供される。炭疽を予防または治療する方法も、開示される。本明細書で用いるように、疾患または障害を「予防する」ことは、免疫原と関連する特定の疾患もしくは障害、またはその症状の発生から対象を防御するための、再調製液体ワクチンなどの本発明の医薬組成物の治療有効量の対象への投与を意味する。一部の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、疾患またはその症状、特にＢ型肝炎、ボツリヌス中毒または炭疽を起こす危険があるヒトなどの対象に投与される。ＢｏＮＴへの曝露と関連する症状（例えば、視朦、嚥下障害、呼吸麻痺、筋骨格麻痺、心停止または呼吸停止など）の発生を予防する方法も、開示される。炭疽または炭疽菌への曝露と関連する症状（例えば、高熱、胸痛、酸素枯渇、二次ショック、血管透過性の増加、全身出血病状、心停止または呼吸停止など）の発生を予防する方法も、本発明にさらに包含される。ブドウ球菌エンテロトキシンへの曝露、特に吸入性曝露と関連する症状の発生を予防する方法、および、この作用剤に曝露した対象を治療する方法も開示される。対象でペストまたはペスト菌への曝露と関連する症状の発生を予防する方法、ならびに、ペストを有するかペスト菌に曝露した対象を治療する方法も、さらに本発明で想定される。それらに限定されないがＢｏＮＴ、炭疽菌、ペスト菌およびブドウ球菌エンテロトキシンを含む潜在的なバイオテロリスト剤を目的とする本発明のワクチンは、例えば、多価ワクチンとして調製することができ、あるいは、バイオテロリスト事象またはバイオテロリスト事象の脅威に応じて第一対応者および軍人に、もしくは一般集団にさえ予防的に投与することができる。
【００５８】
「疾患または障害を治療する」とは、疾患に罹患したか、または、疾患を引き起こす病原体に曝露した対象に対する本発明の医薬組成物の治療有効量の投与を意味し、その目的は、その疾患の状態または症状を治療、治癒、軽減、緩和、変更、矯正、改善、向上させるかまたはそれに影響を及ぼすことである。
【００５９】
「治療有効量」は、所与の状態に対する治療効果および投与計画を提供する量を指す。本発明の特定の態様では、「治療有効量」は、対象に投与された場合に、ある疾患に対する対象の予防または治療に関して正の治療応答をもたらす、本発明の医薬組成物の量を指す。疾患を予防することに関する正の治療応答には、例えば、免疫応答を引き出すこと（例えば、対象による、疾患の発生または進行から防御するのに十分な量の抗体の生産）が含まれる。同様に、疾患を治療することに関する正の治療応答には、疾患の症状の治療または改善が含まれる。
【００６０】
治療有効量は、患者の特徴（年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患など）に基づいて、通常技術の医療従事者が判定することができる。さらに、さらなる日々の研究が実施されるにつれて、様々な患者の様々な状態の治療に適当な投薬量レベルに関してより具体的な情報が現れ、通常技術の従事者は、レシピエントの治療状況、年齢および健康状態を考慮することにより、適切用量を確認することができる。治療有効量は、医薬組成物の投与経路によってさらに影響される。一般に、静脈内の注射または注入、特に皮内投与については、治療有効量は、腹腔内、筋肉内、鼻腔内または他の投与経路に必要とされる量よりも低くてよい。投薬スケジュールは、循環半減期および用いる製剤によって変更することができる。投与が必要な医薬組成物の正確な量は、診療医の判断によって決まり、各個人に特有である。
【００６１】
本発明のワクチンは、投薬製剤と適合する方法で、および治療的に有効で免疫原性である量（すなわち、所望の抗体誘導量または防御的な量）で投与される。投与される量は、治療する対象、対象の免疫系の抗体を合成する能力、および所望の防御の程度に依存する。投与が必要な免疫原の正確な量は、診療医の判断によって決まり、各個人に特有である。タンパク質ワクチンでは、各ワクチン用量中のタンパク質の量は、一般的なワクチンのかなり大きな有害副作用を起こさずに免疫防御応答を誘導する量となるように選択される。そのような量は、どの特定の免疫原が使用されてそれがどのように提示されるかによって異なる。特定のワクチンのための成分の最適量は、対象における適当な免疫応答の観察を含む標準の研究によって確認することができる。最初のワクチン接種の後、対象は、適切な間隔をあけた１つまたはいくつかのブースター免疫感作を受けることができる。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知である様々な方法によって、対象に投与することができる。対象に組成物を投与するための任意の方法を、本発明の実施で用いることができる。可能な投与経路の例には、肺吸入、非経口投与（例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、腹腔内（ＩＰ）、皮下（ＳＣ）注射または注入）、経口、鼻腔内、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が含まれる。先に述べたように、ミョウバン吸着ワクチンを含む医薬組成物は、安定粉末として（例えば、肺吸入、鼻腔内送達もしくは経皮注射によって）、または、再調製された粉末ワクチン製剤として（例えば、皮内、筋肉内もしくは静脈内の注射によって）投与することができる。詳細には、ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を含む医薬組成物は、例えば鼻腔内送達、肺吸入または経皮注射によって、粉末の形で対象に投与するのに適し得る。あるいは、再調製された液体ワクチンは、例えば、皮内、静脈内、筋内、皮下、腹腔内または鼻腔内に投与することができる。本発明のある実施形態では、ワクチンは最低限に侵襲性の方法、例えば顕微針を通しての皮内注射または鼻腔内吸入によって投与される。本明細書で用いるように、「顕微針」には、一般的に、３０ゲージ以下の針、特に３４ゲージの針が含まれる。そのような最低限に侵襲性のワクチン投与方法は、非医療関係者による一般集団への広範囲にわたるワクチン投与を可能にし、そのことは、ＢｏＮＴ、炭疽菌、ペスト菌またはブドウ球菌エンテロトキシン（例えば、ｒＳＥＢ）などの生物兵器によるバイオテロリスト攻撃の事件または脅威において特に有利となる。
【００６３】
本発明の予防および治療の方法は、特定の対象に限定されるものではない。様々な対象、特に哺乳動物が企図される。対象とする対象には、それらに限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシおよび齧歯動物が含まれる。特定の実施形態では、対象はヒトであり、より詳細には、特定の抗原と関連する疾患を起こす危険があるヒトの患者である。
【００６４】
本発明に従って、当技術分野の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。そのような手法は、文献に詳しく説明されている。（例えば、非特許文献３０〜３９を参照）。
【００６５】
本明細書で冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法上の目的を指すために用いられる。例として、「要素」は、１つまたは複数の要素を意味する。
【００６６】
明細書全体を通して、単語「含んでいる」または変形形態の「含む」もしくは「含んでいる」などは、明示された要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群が含まれることを意味するが、いかなる他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の除外を意味するものではないと理解される。
【００６７】
以下の実施例は例示のために提供され、限定するものではない。
実験
【実施例１】
【００６８】
ミョウバン吸着Ｂ型肝炎ワクチンの粉末製剤の調製
噴霧フリーズ・ドライ法（ＳＦＤ）
Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン（Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ、Ｓｈａｎｔｈａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ、Ｈｙｄｅｒａｂａｄ、Ｉｎｄｉａ）の粉末製剤を、基本的に、炭素菌（ｒＰＡ）炭疽ワクチンの組換え防御抗原について非特許文献２１に記載されているように、ＳＦＤによって生成した。Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンは、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されている組換えＨＢｓＡｇを含む。簡潔には、Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンおよびデキストラン／トレハロースもしくはマンニトール／トレハロースを含む液体製剤を調製して、５ｍｌ注射器に付けたＢＤ Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルを用いて噴霧した。５ｍｌの一定量を、液体窒素を含む金属製受け皿内に噴霧し、該受け皿を、−４０℃に前冷却した棚凍結乾燥器に移した。液体窒素を完全に蒸発させ、次に、下の表１に記載のように粉末を乾燥させた。
【００６９】
【表１】
【００７０】
粉末ワクチン試料を凍結乾燥器から取り出し、乾燥グローブボックス［５％相対湿度（「ＲＨ」）］に入れ、次にガラス容器に移して密封した。
【００７１】
大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）
Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチン（Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ、Ｓｈａｎｔｈａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ、Ｈｙｄｅｒａｂａｄ、Ｉｎｄｉａ）の粉末製剤を、基本的に特許文献１に記載のように、ＡＳＦＤによって生成した。具体的には、Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンおよびマンニトール／トレハロースを含む液体製剤を調製した。注射器にこの製剤を充填し、超音波ノズル（Ｓｏｎｏ−Ｔｅｋモデル８７００−２５；４．５ワットおよび６ｍｌ／分の液体流速で操作）を用いて液体窒素を詰めたＡＳＦＤチャンバーに噴霧した。噴霧が完了したとき、チャンバーの底に乾燥窒素気体流を１５Ｌ／分の速度で流し始めた。液体窒素の全てが蒸発するまで、乾燥窒素気体流を継続した。次に、乾燥前に粉末を−３０℃でアニールする（ａｎｎｅａｌ）ために、２．５時間の間注入気体流量を１００Ｌ／分に増加した。次に、−１４℃の所望の乾燥温度を達成するために、気体流量を３８Ｌ／分に低下させた。測定したＲＨパーセントが１％未満に低下したとき、冷却機を切り、気体流量を３８Ｌ／分に維持した。チャンバーが２０℃まで徐々に温まるまで放置し、その時点で、気体流を遮断して粉末を収集した。粉末収率（重量測定による判定）は、８７．７％であった。
【実施例２】
【００７２】
ＳＦＤ Ｂ型肝炎ワクチンの分析
安定性分析
実施例１で上記したように調製されたＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンおよび液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンの元の液体製剤を、様々な条件下で粒子凝集について分析した。具体的には、各ワクチン製剤（液体または粉末）を４℃（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンの製造業者の推奨温度）で保存するか、５５℃で保存するか、または、−２０℃で凍結融解させた後に５５℃で保存した。次に、Ｂ型肝炎ワクチンのＳＦＤ粉末製剤を水で再調製して、それをさらなる分析にかけた。詳細には、様々な保存条件の後のワクチン製剤の安定性を、下記のように、沈降アッセイおよびＡＵＳＹＭＥアッセイを用いて評価した。
【００７３】
沈降アッセイ
約２５０μｌの試料をガラス毛細管に吸い上げ、ＣＲＩＴＯＳＥＡＬで密封し、立てたまま室温（２４℃）で放置した。濁った沈殿分画の高さおよび液体の全高を、毛細管を立ててからの以下の時点で測定、記録した：０分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間および５時間。実験の正確度および再現性を確保するために、試料条件につき計３回分を反復実施した。
沈降速度は、以下の通りに計算した：
沈降率＝｛（液体全高−記録した沈殿高）／液体全高）｝×１００
【００７４】
沈降アッセイで得られた結果を、図１〜３に示す。マンニトール／トレハロースまたはデキストラン／トレハロースによるＳＦＤ処理と４℃および５５℃での１カ月の保存後、試料で沈降速度の有意な増加（すなわち、沈降曲線の左へのシフト）は観察されなかった（図１および２）。おそらく粘度の上昇のために、沈降速度はデキストランの添加によって低下した（図１）。さらに、マンニトール／トレハロースを有するＳＦＤ製剤は、凍結融解および５５℃で１４日間の保存の後、凝集の証拠を示さなかった（図３）。
【００７５】
ＳＦＤワクチン製剤と対照的に、ワクチンの元の液体製剤は、凍結融解および５５℃で１４日間の保存の後により速い沈降速度を示し、そのことは粒子凝集と合致している（図３）。したがって、ＳＦＤ処理は、アルミニウムアジュバントを含有するＨＢｓＡｇワクチンを、粒子凝集から保護するようである。
【００７６】
図１〜３で提示する沈降データの概要を、下の表２〜７で提供する。
【００７７】
【表２】
【００７８】
【表３】
【００７９】
【表４】
【００８０】
【表５】
【００８１】
【表６】
【００８２】
【表７】
【００８３】
ＡＵＳＺＹＭＥアッセイ
各試料のＨＢｓＡｇ濃度（［ＨＢｓＡｇ］）を、製造業者の説明書に従ってＡＵＳＺＹＭＥアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によって定量した。簡潔には、各試料を、１０ｎｇ／ｍｌの［ＨＢｓＡｇ］まで水で１／２０００に希釈し、その後、提供されたマルチウェルプレートのウェルに２反復で加えた。標準曲線は、Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンを２０ｎｇ／ｍｌから０．６２５ｎｇ／ｍｌまでの２倍希釈で希釈することによって構築した。モノクローナル複合体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を各ウェルに加え、その後、抗ＨＢｓＡｇモノクローナル被覆ビーズ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｃｏａｔｅｄ ｂｅａｄ）を加えた。３７℃で７５分間のインキュベーションの後、ビーズを含む各ウェルを５ｍｌの水で３回洗浄した。次にＯＰＤ基質（ｏ−フェニレンジアミン・２ＨＣｌ）を各ビーズに加えて、室温で３０分間インキュベートした。反応を１Ｎ Ｈ2ＳＯ4で停止させ、プレート読取機により上清の吸光度をＯＤ492で読み取った。ＳＦＤ加工ワクチンおよび元の液体ワクチンの試料中の［ＨＢｓＡｇ］は、標準曲線との比較によって判定した。
【００８４】
ＡＵＳＹＭＥアッセイの結果を、下の表８で要約する。
【００８５】
【表８】
【００８６】
ＡＵＳＺＹＭＥアッセイの結果は、液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンは４℃で安定であるが、５５℃で１４日後に［ＨＢｓＡｇ］の低下を示し、２８日目には抗原濃度がさらに低下することを示した。対照的に、マンニトール／トレハロース賦形剤を含むＳＦＤ処理Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンは、４℃および５５℃で２８日間保存した場合、ほぼ同じ［ＨＢｓＡｇ］を保持した。ＳＦＤデキストラン／トレハロース製剤は、５５℃で２８日間の保存の後、［ＨＢｓＡｇ］の低下を示した。しかし、この低下は、同じ保存条件下の液体ワクチンの低下よりも小さかった。凍結融解サイクルおよびその後の５５℃で２８日間の保存にさらした場合、液体および粉末の製剤は［ＨＢｓＡｇ］を保持した。沈降アッセイによる測定で液体製剤がこの保存条件で凝集を起こしたこと、および、液体ワクチンの［ＨＢｓＡｇ］が５５℃で２８日間の保存後著しく低下したことを考えると、この結果は驚くべきことである。
【００８７】
免疫原性研究
ＳＦＤ Ｂ型肝炎ワクチン製剤がそれらの免疫原性を保持したかどうかを評価するために、マウスを様々な製剤の液体または再調製されたＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンで免疫感作した。下記で詳述するように、免疫応答は、血清ＨＢｓＡｇ特異抗体の応答を定量することによって測定した。具体的には、０日目および２８日目に、以下のワクチン製剤の１つの０．４または２マイクログラム用量による筋肉内注射により雌のＢａｌｂ／ｃマウス（１群１０匹）を免疫感作した。
１．Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン（液体）
２．Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋デキストラン／トレハロース（液体）
３．Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース（液体）
４．ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ＋デキストラン／トレハロース（再調製）
５．ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ＋マンニトール／トレハロース（再調製）
６．Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂワクチン（液体）
【００８８】
０、２８および４２日目に、マウスから血を取った。ＥＬＩＳＡにより、ＨＢｓＡｇに対する抗体について血清を定量した。ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０／１％脱脂乾燥乳（ｐＨ ７．２）中で希釈した血清試料を、事前にリン酸コーティング緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌ ＨＢｓＡｇでコーティングした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅｎｅ ＮＵＮＣ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）のウェルに加えた。モノクローナル抗ＨＢｓＡｇ抗体の既知の濃度を用いて、標準曲線を作成した。室温で１時間のインキュベーションの後、ＰＢＳ＋０．０５％トゥイーン２０（ＰＢＳＴ）でプレートを３回洗浄した。ＰＢＳＴ中で１：８０００に希釈した抗マウスＩｇＧ複合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａｂａｍａ）を加え、室温で３０分間プレートをインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで再び３回洗浄した。ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質）を加え、室温で１０分間プレートをインキュベートした。１Ｎ Ｈ2ＳＯ4の添加により反応を停止させ、ＯＤ492でプレートを読み取った。
【００８９】
免疫原性試験の結果は、図４および下の表９および１０で要約する。試験した全ての群で、ＩｇＧ応答は用量依存的であった。液体ワクチン製剤への賦形剤の添加は、ＩｇＧ応答に著しく影響を及ぼさなかった。再調製されたワクチン粉末製剤によるマウスの免疫感作は、従来の液体ワクチンによる免疫感作の後に得られるものと類似したレベルの抗体を生成した（図４）。２回目の免疫感作の後、ＳＦＤ製剤によって生成された抗体レベルは、液体製剤による免疫感作の後に得られたものと有意に異なることはなかった（ｐ＞０．０５）。これらの結果は、ＳＦＤ工程がＳｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンの免疫原性に影響を及ぼさないことを証明する。したがって、希釈剤での再調製の際に免疫原性を保持する安定したミョウバン吸着Ｂ型肝炎ワクチン粉末製剤を生成するために、ＳＦＤを用いることができる。
【００９０】
【表９】
【００９１】
【表１０】
【実施例３】
【００９２】
ＡＳＦＤ Ｂ型肝炎ワクチンの分析
安定性分析
実施例１で上記したように調製されたＡＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ Ｂ型肝炎ワクチンおよび液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンの元の液体製剤を、様々な条件下で粒子凝集について分析した。具体的には、各ワクチン製剤（液体または粉末）を４℃（液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンの製造業者の推奨温度）で保存するか、５５℃で保存するか、または、−２０℃で凍結融解させた後に５５℃で保存した。次に、Ｂ型肝炎ワクチンのＡＳＦＤ粉末製剤を水で再調製して、それをさらなる分析にかけた。詳細には、様々な保存条件の後のワクチン製剤の安定性を、上の実施例２に記載のように、沈降アッセイおよびＡＵＳＹＭＥアッセイを用いて評価した。
【００９３】
沈降アッセイ
沈降アッセイは、液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンおよび再調製したＡＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン製剤を用いて、実施例２に記載されているように実施した。沈降アッセイで得られた結果を、図５〜７に示す。４℃で１カ月間の保存後、沈降速度の変化は液体製剤でもＡＳＦＤ製剤でも観察されなかった（図５）。５５℃での保存後、凝集から生じる沈降速度の増加（すなわち、沈降曲線の左へのシフト）は、液体製剤でもＡＳＦＤ製剤でも観察されなかった（図６）。実際、ＡＳＦＤ製剤で得られた沈降曲線は右へのシフトを示し、５５℃での保存後のより遅い沈降速度が示唆された。凍結融解および５５℃で１４日間の保存の後、液体製剤はかなり速い沈降速度を示した（図７）。製剤中の凝集物は、明らかに目で確認することができた。しかし、沈降速度の変化がなかったことが示すように、同じ凍結融解および保存条件下のＡＳＦＤ処理ワクチンでは、凝集は観察されなかった。さらに、光学顕微鏡検査による粒子の視覚的分析は、ＡＳＦＤワクチンが、小さな、非凝集水酸化アルミニウム粒子構造を保持することを示した。したがって、ＡＳＦＤ処理は、ミョウバン吸着ＨＢｓＡｇワクチンを、粒子凝集から保護するようである。
【００９４】
図５および図６で提示する沈降データの概要を、下の表１１〜１５で提供する。
【００９５】
【表１１】
【００９６】
【表１２】
【００９７】
【表１３】
【００９８】
【表１４】
【００９９】
【表１５】
【０１００】
ＡＵＳＺＹＭＥアッセイ
ＡＵＳＺＹＭＥアッセイは、液体Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンおよび再調製したＡＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン製剤を用いて、実施例２に記載されているように実施した。ＡＵＳＹＭＥアッセイでは、ＨＢｓＡｇの濃度をＥＬＩＳＡに基づく方法で測定する。このアッセイは、ＨＢｓＡｇに対する抗体を、標準参照曲線との比較によるＨＢｓＡｇの濃度の判定のために、抗原を捕捉する手段として用いる。このアッセイでＨＢｓＡｇに結合することができる抗体の能力は、それを、免疫原濃度およびＨＢｓＡｇの抗原性の測定に適するものにする。本明細書の上記で記載するように、「抗原性」は、タンパク質（すなわち、免疫原）を認識して結合する抗体の能力と定義される。他方、「免疫原性」は、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、ヒトまたはヒト以外の対象で）免疫応答を引き起こす、タンパク質（すなわち、免疫原）の能力を指す。ＡＵＳＺＹＭＥアッセイの結果を、下の表１６に示す。
【０１０１】
【表１６】
【０１０２】
ＡＵＳＺＹＭＥアッセイの結果は、４℃で２８日間保存した場合、液体およびＡＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン製剤はそれらの元のＨＢｓＡｇ濃度（［ＨＢｓＡｇ］）を保持していたことを証明する。しかし、液体Ｓｈａｎｖａｃワクチンを５５℃で保存した場合、［ＨＢｓＡｇ］は７日後に低下し始め、その後、１４および２８日間の保存の後にかなり大きく低下した。対照的に、ＡＳＦＤ処理ワクチンで観察された［ＨＢｓＡｇ］は、５５℃で２８日間保存した場合でも低下しなかった。したがって、ＡＳＦＤ処理は、高温での保存から生じる［ＨＢｓＡｇ］の低下を阻止した。
【０１０３】
上のＳＦＤ処理ワクチン製剤の分析で記載したように、ＡＳＦＤと液体のＳｈａｎｖａｃ−Ｂ製剤の両方は、凍結融解した後に５５℃で１４日間保存した場合でも［ＨＢｓＡｇ］の低下を示さなかった。沈降アッセイによる測定で液体製剤がこの保存条件で凝集を示したこと、および、液体ワクチンの［ＨＢｓＡｇ］が５５℃で２８日間の保存後著しく低下したことを考えると、このことは驚くべきことである。凍結融解サイクルの間に液体製剤中で凝集物が形成され、それによってＨＢｓＡｇを封入して、以降の５５℃での保存の間の分解に対してそれを保護するのを助けると推測される。
【０１０４】
免疫原性試験
ＡＳＦＤ Ｂ型肝炎ワクチン製剤が免疫原性を保持したかどうかを評価するために、マウスを様々な製剤の液体または再調製されたＡＳＦＤもしくはＳＦＤのＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンで免疫感作した。上の実施例２で詳述するように、免疫応答は、血清ＨＢｓＡｇ特異抗体の応答を定量することによって測定した。具体的には、０日目および２８日目に、以下のワクチン製剤の１つの２マイクログラム用量による筋肉内注射により、雌のＢａｌｂ／ｃマウス（１群１０匹）を免疫感作した。
１．Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン（液体）
２．Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂワクチン＋マンニトール／トレハロース（液体）
３．ＡＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ＋マンニトール／トレハロース（再調製）
４．ＳＦＤ Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ＋マンニトール／トレハロース（再調製）
【０１０５】
ＡＳＦＤワクチンの免疫原性試験の結果は、図８および下の表１７および１８で要約する。再調製されたＡＳＦＤワクチン粉末製剤によるマウスの免疫感作は、従来の液体ワクチンによる免疫感作の後に得られるものと類似したレベルの抗体生成をもたらした（図８）。２回目の免疫感作の後、ＡＳＦＤ製剤によって生成された抗体レベルは、液体製剤またはＳＦＤ製剤による免疫感作の後に得られたものと有意に異なることはなかった（ｐ＞０．０５）。これらの結果は、ＡＳＦＤ工程がＳｈａｎｖａｃ−Ｂワクチンの免疫原性に負の影響を及ぼさないことを証明する。
【０１０６】
【表１７】
【０１０７】
【表１８】
【実施例４】
【０１０８】
ＳＦＤ ＢｏＮＴ／Ａミョウバン吸着ワクチンの分析
ＳＦＤ ＢｏＮＴ/Ａミョウバン吸着ワクチンの調製
組換えＢｏＮＴ／Ａ ＨＣ免疫原（提供元Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ；Ｆｏｒｔ Ｄｅｔｒｉｃｋ、ＭＤ）を、筋肉内注射（ＩＭ）もしくは皮内（ＩＤ）注射のためにアルミニウムヒドロゲル上（すなわち、水酸化アルミニウム）に、または、鼻腔内（ＩＮ）送達のためにリポポリサッカライド（ＬＰＳ）上に吸着させた。本明細書で記載される方法に従って、ＢｏＮＴ／Ａワクチンを従来の液体ワクチンとして、または、ＳＦＤにより乾燥粉末ワクチン製剤として製剤化した。一般的には、実施例１を参照。ＳＦＤ ＢｏＮＴ／Ａワクチン粉末製剤は、対象に投与する直前に水で再調製した。
【０１０９】
ＢｏＮＴ/Ａによる免疫感作および誘発
液体のおよび再調製された粉末ＢｏＮＴ／Ａワクチン製剤の分析のために、６〜８週齢の雌ＣＤ−１／ＩＣＲマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）を使用した。具体的には、０日目および２８日目に試験群につき１０匹のマウスに、液体のまたは再調製されたＢｏＮＴ粉末ワクチン製剤を５０μｌ（片側ずつ２５μｌ）の量でＩＭ注射または顕微針に基づくＩＤ注射として投与し、あるいは、３０μｌの製剤（鼻孔につき１５μｌ）のＩＮ投与によって投与した。陰性対照として、マウスの特定の群をワクチン未接種のままにするか、または、ＩＭもしくはＩＮ投与により、アジュバントだけを含む液体製剤を投与した。当技術分野で標準の技術に従って、血液を０、１４、２８および４２日目に収集した。４９日目に全てのマウスに致死用量のＢｏＮＴ／Ａ（マウスのＢｏＮＴ／ＡのＬＤ50値の１００，０００倍）を用いて誘発し、その後、さらなる５日間観察した。様々な試験群のマウスの生存率を５４日目に評価し、それを下の表１９に示す。
【０１１０】
【表１９】
【０１１１】
再調製されたＳＦＤ ＢｏＮＴ／Ａ粉末ワクチンによるＩＭおよびＩＤ免疫感作は、液体ＢｏＮＴ／Ａワクチン製剤で観察されたものに類似した生存率（最高約１００％）をもたらした。再調製されたＳＦＤまたは液体のＢｏＮＴ／ＡワクチンのＩＮ送達は、同じＢｏＮＴ／ＡワクチンによるＩＭまたはＩＤ免疫感作で観察されたものより低いが、類似した生存率（最高約５０％）をもたらした。
【０１１２】
抗体血清力価分析および統計分析
様々な試験群の対象からの血液血清試料を、標準のＥＬＩＳＡ技術によってＢｏＮＴ／Ａ特異ＩｇＧ力価について分析した。結果を図９および１０に要約する。ＢｏＮＴ／Ａによる致死性誘発で観察された血清抗体力価および生存率の統計分析を、ＡＮＯＶＡおよび受信者動作特性曲線「Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）曲線」解析によって実施した。ＢｏＮＴ／Ａによる致死性誘発から対象が９７％の生存率を有する抗体力価８００は、図９Ｃおよび１０Ｃにおいて点線で示す。
【０１１３】
再調製されたＳＦＤ ＢｏＮＴ／Ａ粉末ワクチンによるＩＭおよびＩＤ免疫感作は強力な抗体応答を引き起こし、平均血清ＢｏＮＴ／Ａ抗体レベルは、液体ＢｏＮＴ／Ａワクチン製剤で観察されたものに類似していた。再調製されたＳＦＤまたは液体のＢｏＮＴ／ＡワクチンのＩＮ送達は、同じＢｏＮＴ／Ａワクチン製剤によるＩＭまたはＩＤ免疫感作で観察されたものよりも低い抗体応答を起こした。
【実施例５】
【０１１４】
ＳＦＤおよびＡＳＦＤの炭疽菌ｒＰＡミョウバン吸着ワクチンの分析
ＳＦＤおよびＡＳＦＤの炭疽菌ｒＰＡミョウバン吸着ワクチンの調製
炭疽菌ｒＰＡワクチンの乾燥粉末製剤を、下記のように、ＳＦＤまたはＡＳＦＤ（液体または気体の窒素による処理）によって調製し、マウスの免疫感作の前に、薬学上許容される担体中で再調製した。次に、以下に詳細に概説するように、再調製されたＳＦＤおよびＡＳＦＤの炭疽菌ｒＰＡワクチンの効能を、免疫感作動物の血清中の炭疽致死毒素中和抗体力価を定量することによって評価した。
【０１１５】
噴霧フリーズ・ドライ（ＳＦＤ）
炭疽菌ｒＰＡワクチンの粉末製剤は、基本的に、上の実施例１および非特許文献２１に記載のようにＳＦＤによって作製した。簡潔には、炭疽菌ｒＰＡ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびマンニトール／トレハロースを含む液体製剤を調製し、５ｍｌ注射器に付けたＢＤ Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルを用いて噴霧した。５ｍｌの一定量を、液体窒素を含む金属製受け皿内に噴霧し、該受け皿を、−４０℃に前冷却した棚凍結乾燥器に移した。液体窒素を完全に蒸発させ、次に、上の表１に記載のように粉末を乾燥させた。
【０１１６】
粉末ワクチン試料を凍結乾燥器から取り出し、乾燥グローブボックス［５％相対湿度（「ＲＨ」）］に入れ、次にガラス容器に移して密封した。最終ＳＦＤワクチン粉末は、０．５％の炭疽菌ｒＰＡおよび１％のアルミニウムを含有した。
【０１１７】
大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）−液体窒素（ＬＮ2）処理
炭疽菌ｒＰＡワクチンの粉末製剤を、基本的に特許文献１に記載のように、ＡＳＦＤによって生成した。具体的には、炭疽菌ｒＰＡ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびマンニトール／トレハロースを含む液体製剤を調製した。注射器にこの製剤を注入し、５ｍｌ注射器に付けたＢＤ Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルを用いて、液体窒素を充填したＡＳＦＤチャンバー内に噴霧した。噴霧が完了したとき、チャンバーの底に乾燥窒素気体流を４０Ｌ／分の速度で流し始めた。液体窒素の全てが蒸発するまで、乾燥窒素気体流を流し続けた。次に、−３５℃の出口気体温度を得るために、注入口気流温度を上昇させ、乾燥前に１時間、粉末をアニールするために、気体流速を１４０Ｌ／分に設定した。次に、出口で−２０℃の所望の一次乾燥温度を得るために、気体流量を６０Ｌ／分に低下させて暖めた。２４時間後、測定したＲＨパーセントが０．０１５％未満に低下したとき、０℃の出口温度を得て二次乾燥を始めるために気体温度を再び上げ、気体流量を６０Ｌ／分に保った。７時間後、測定したＲＨパーセントが０．０１５％未満に低下したとき、２３℃の出口温度を得るために注入口気体を暖め、その時点で気体流を遮断して粉末を収集した。最終ＡＳＦＤワクチン粉末は、０．５％の炭疽菌ｒＰＡおよび１％のアルミニウムを含有した。
【０１１８】
大気圧噴霧フリーズ・ドライ（ＡＳＦＤ）−気体窒素（ＧＮ2）処理
炭疽菌ｒＰＡワクチンの粉末製剤を、基本的に特許文献１に記載のように、ＡＳＦＤによって生成した。具体的には、炭疽菌ｒＰＡ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびマンニトール／トレハロースを含む液体製剤を調製した。注射器にこの製剤を注入し、Ｓｏｎｏ−Ｔｅｋ社モデル８７００−２５超音波ノズルを用いて、流速４０Ｌ／分の気体窒素を用いて、−８０℃に前冷却したＡＳＦＤチャンバー内に噴霧した。噴霧の完了後、−３５℃の出口気体温度を得るために注入口気体流温度を上昇させ、乾燥前に１時間、粉末をアニールするために、気体流速を１４０Ｌ／分に設定した。次に、出口で−２０℃の所望の一次乾燥温度を得るために、気体流量を６０Ｌ／分に低下させて暖めた。２４時間後、測定したＲＨパーセントが０．０１５％未満に低下したとき、０℃の出口温度を得て二次乾燥を始めるために気体温度を再び上げ、気体流量を６０Ｌ／分に保った。３時間後、測定したＲＨパーセントが０．０１５％未満に低下したとき、２３℃の出口温度を得るために注入口気体を暖め、その時点で気体流を遮断して粉末を収集した。最終ＡＳＦＤワクチン粉末は、０．５％の炭疽菌ｒＰＡおよび１％のアルミニウムを含有した。
【０１１９】
免疫感作
マウスを、様々な製剤の液体または再調製されたＳＦＤもしくはＡＳＦＤの炭疽菌ｒＰＡワクチンで免疫感作した。各試験群のマウスを、表２０または表２１に記載されているワクチン製剤の１つによる筋肉内注射によって、０日目および２８日目に免疫感作した。マウスは、０日目（採血番号１または「前採血」）、１４日目（採血番号２または「ｂ２」）、２８日目（採血番号３または「ｂ３」）および４２日目（採血番号４または「ｂ４」）に血を採取した。次に、下記に記載される炭疽致死毒素中和アッセイを用いて、血清試料を分析した。
【０１２０】
【表２０】
【０１２１】
【表２１】
【０１２２】
炭疽致死毒素中和アッセイ
様々な試験群からのマウスの血清中の炭疽致死毒素中和抗体力価を、判定した。炭疽致死毒素中和アッセイは、当技術分野において公知である。例えば、非特許文献４０および４１を参照。本実施例では、血清試料の希釈溶液を、炭疽菌ｒＰＡおよび炭疽毒素致死因子と混合した。混合液をインキュベートして、細胞単層に加えた。次に、炭疽毒素と血清との混合液を細胞とともにインキュベートした。炭疽毒素と血清との混合液の存在下での細胞生存能力を、細胞の染色および光学濃度の測定によって評価した。中和抗体力価は、炭疽毒素が中和された、血清の最も高い希釈を表していた。
【０１２３】
結果
セット１および２の炭疽菌ｒＰＡワクチン製剤で得られた炭疽致死毒素中和アッセイからの結果（上の表２０および２１を参照）を、それぞれ図１１および１２に示す。図１１に示すデータは、Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルで生成されたＳＦＤ粉末（セット１、群４）が、未処理の液体ワクチン（群１；セット１）で得られたレベルと同等のレベルの毒素中和抗体を誘導する能力を保持することを証明する。さらに図１２に示すデータは、Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルで生成されたＳＦＤ粉末（セット２、群４）、およびＧＮ2工程により生成されたＡＳＦＤ粉末（セット２、群５）の両方が、未処理の液体ワクチンで得られたレベルと同等のレベルの毒素中和抗体を誘導する能力を保持することを証明する。
【実施例６】
【０１２４】
ＳＦＤペスト菌ミョウバン吸着ワクチン製剤の分析
ＳＦＤペスト菌Ｆ１−Ｖミョウバン吸着ワクチン製剤の調製
Ｆ１−Ｖタンパク質は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓによって提供され、それを、様々な賦形剤およびアジュバントで液体懸濁液（すなわち、ＳＦＤ処理なしで）として、または、基本的に本明細書の上の実施例１に記載のように、ＳＦＤ処理により乾燥粉末として製剤化した。２０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2および２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有する緩衝液で、４．５ｍｌのＦ１−Ｖ溶液を調製するために、圧ダイアフィルトレーションを用いた（ｐＨ７．４）。この緩衝液中のＦ１−Ｖの濃度は、０．６０９ｍｇ／ｍｌであった。
【０１２５】
ＳＦＤ工程の前にＦ１−Ｖ免疫原をＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着させ、下記のように、ペスト菌ミョウバン吸着ワクチンの製剤を調製した。ＳＦＤワクチン粉末製剤を、マウスの免疫感作の前に注射用水で再調製した。
【０１２６】
群１：２ｍｌバイアル内で、均一な懸濁液が形成されるまで、０．１３３ｍｌのＦ１−Ｖタンパク質（１．５ｍｇ／ｍｌの濃度）、０．１ｍｌのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）および０．７６７ｍｌの緩衝液（すなわち、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭアルギニンおよび１ｍＭシスチン、ｐＨ９．９）を混合した。
【０１２７】
群２および３：１０ｍｌバイアル内で、均一な懸濁液が形成されるまで、１１４．２ｍｇのマンニトール、１２．６ｍｇのトレハロース、０．４６６ｍｌのＦ１−Ｖ、０．３５ｍｌのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）および２．６８５ｍｌの緩衝液（すなわち、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭアルギニンおよび１ｍＭシスチン、ｐＨ９．９）を混合した。１．０ｍｌの一定量を取り出し、そのまま液体状態で用いた（すなわち、群２）。懸濁液の残りは、１ｍｌの注射器に付けたＡｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルを用いて、液体窒素中に噴霧した。この凍結試料を、−４５℃に前冷却した棚凍結乾燥器に入れ、真空下で乾燥させた（すなわち、群３）。
【０１２８】
群４：２ｍｌバイアル内で、均一な懸濁液が形成されるまで、０．２８４ｍｌの緩衝液交換Ｆ１−Ｖ（０．７０３ｍｇ／ｍｌの濃度）、０．１ｍｌのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）および０．６１６ｍｌの緩衝液（すなわち、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭアルギニン、１ｍＭシスチン、ｐＨ９．９）を混合した。
【０１２９】
群５および６：１０ｍｌバイアル内で、均一な懸濁液が形成されるまで、１２５．８ｍｇのマンニトール、１３．９ｍｇのトレハロース、０．９９４ｍｌのＦ１−Ｖ、０．３５ｍｌのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）および２．１５６ｍｌの緩衝液（１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭアルギニン、１ｍＭシスチン、ｐＨ９．９）を混合した。１．０ｍｌの一定量を取り出し、そのまま液体状態で用いた（すなわち、群５）。懸濁液の残りは、１ｍｌの注射器に付けたＡｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）ノズルを用いて、液体窒素中に噴霧した。この凍結試料を、−４５℃に前冷却した棚凍結乾燥器に入れ、真空下で乾燥させた（すなわち、群６）。
【０１３０】
【表２２】
【０１３１】
免疫感作
６〜８週齢の雌のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを収容し、ペスト菌の致死性誘引の前に上記のワクチン製剤で免疫感作した。各試験群につき、１０匹のマウスを用いた。各マウスは、０および２８日目に、Ｆ１−Ｖ用量３．３μｇまたは１０μｇで、指定されたワクチン製剤の５０μｌ（１部位につき２５μｌ）の筋内注射により免疫感作した。抗体力価を調査するために、血液を０、１４、２８および４２日目に収集した。
【０１３２】
結果
群１〜６のペスト菌Ｆ１−Ｖワクチン製剤で得られた結果を、図１３に示す。この図に示すデータは、再調製されたＳＦＤ Ｆ１−Ｖ粉末ワクチンが、液体ワクチン懸濁液による免疫感作の後に得られたものと類似したレベルの抗体産生をもたらすことを証明する。
【実施例７】
【０１３３】
ＳＦＤ多価ミョウバン吸着ワクチン製剤の分析
ＳＦＤ多価ミョウバン吸着ワクチン製剤の調製
単一の製剤中に４つの抗原（すなわち、ｒＰＡ、ｒＳＥＢ、ＢｏＮＴ／ＡおよびＦ１−Ｖ）を含む、多価ワクチンを調製した。詳細には、緩衝液／賦形剤を２０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2および２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ｐＨ７．４）に交換するために、Ｆ１−Ｖ溶液（ｐＨ９．０）を先ず圧ダイアフィルトレーションで処理した。対象とする他の３つの抗原（すなわち、ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／ＡおよびｒＳＥＢ）の溶液をこの溶液に加えて、多価溶液を作製した。マンニトールおよびトレハロース賦形剤とともに、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）をこの多価溶液に加えて、ミョウバン吸着液体懸濁液を生成し、次に、基本的に実施例１に記載のように、懸濁液を噴霧フリーズ・ドライさせて乾燥粉末を生成した。生じたＳＦＤ粉末は、使用時に注射用水で再調製した。
【０１３４】
各抗原の初期濃度および最終濃度を、下記に記載する：
【０１３５】
初期抗原濃度（ベンダーからの受領時）：
ｒＰＡ：２．５ｍｇ／ｍＬ ｒＰＡ
ｒＳＥＢ：３．４ｍｇ／ｍＬ
ＢｏＮＴ／Ａ：０．１８ｍｇ／ｍＬ
Ｆ１−Ｖ：６００μｇ／ｍＬ
【０１３６】
最終抗原濃度（投与された液体および再調製されたＳＦＤワクチン粉末製剤中の）：
ｒＰＡ：２００μｇ／ｍＬ
ｒＳＥＢ：４００μｇ／ｍＬ
ＢｏＮＴ／Ａ：２０μｇ／ｍＬ
Ｆ１−Ｖ：２００μｇ／ｍＬ
【０１３７】
免疫感作
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、液体または再調製されたＳＦＤ多価ワクチン製剤で免疫感作した。液体一価ワクチン製剤（すなわち、ｒＰＡ、ｒＳＥＢ、ＢｏＮＴ／ＡまたはＦ１−Ｖ抗原の１つだけを含む）を、対照として用いた。各試験群で１０匹のマウスを用い、各マウスは、０および２８日目に、指定されたワクチン製剤の５０μｌ（１部位につき２５μｌ）の筋内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）注射により免疫感作した。試験群の詳細を、下の表２３に要約する。前採血試料を、未実験でワクチン未接種のマウスから収集した。全ての試験群から１４、２８および４２日目に採血し、各抗原（すなわち、ｒＰＡ、ｒＳＥＢ、ＢｏＮＴ−ＡおよびＦ１−Ｖ）の抗体力価を判定するために、血清試料を標準のＥＬＩＳＡ方法によって分析した。
【０１３８】
【表２３】
【０１３９】
結果
１４、２８および４２日目に群１〜９の様々なワクチン製剤で免疫感作されたマウスからプールされた血清試料で得られた抗体力価の結果を、それぞれ下の表２４〜２６に示す。ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／Ａ、ｒＳＥＢおよびＦ１−Ｖ抗原を含む液体または再調製されたＳＦＤ多価ワクチン製剤で免疫感作したマウス（すなわち、試験群１、２、８および９）は、４つの抗原全てに対して免疫応答を起こした。多価ワクチン製剤で免疫感作したマウスで各抗原について測定した抗体力価は、一価の対照ワクチン製剤で免疫感作したマウス（すなわち、試験群３〜６）で各抗原について測定した抗体力価に類似し、多価ワクチンでの４つの抗原の組合せは各抗原の免疫原性に悪影響を与えないことが示された。さらに、再調製されたＳＦＤ多価ワクチンで免疫感作したマウス（すなわち、試験群２）は、対応する液体多価ワクチンで免疫感作したマウス（すなわち、試験群１）で観察されたものと類似したプール血清力価の上昇を示し、ＳＦＤ工程が様々な抗原の免疫原性を低減させないことが示された。個々の動物の抗体力価を分析した場合にも、類似した抗体力価結果が得られた。図１４を参照。
【０１４０】
ＩＭ（すなわち、試験群９）または顕微針によるＩＤ投与（すなわち、試験群１０）による液体多価ワクチン製剤の送達は類似した抗体力価を生み、本ワクチンが複数の投与方法に適合することが示された。Ａｌｈｙｒｄｏｇｅｌ（登録商標）の濃度の０．５％から０．２５％への低下（すなわち、試験群８および９）も多価ワクチンの免疫原性に影響を及ぼさず、そのことは、多価ワクチンで用いられた水酸化アルミニウムの両濃度（すなわち、５％および０．２５％）で得られた類似した抗体力価が証明する。
【０１４１】
測定した抗体力価が免疫抗原に特異的であることを確認するために、一価ワクチン対照で免疫感作したマウスを、一価ワクチンに存在していなかった抗原に対する抗体についてもスクリーニングした。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ一価ワクチンによる免疫感作の後に、ｒＳＥＢ、ｒＰＡおよびＦ１−Ｖを分析した。一価ワクチンによって生成した抗体力価は、各時点で抗原特異的であることが見出され、特定の一価ワクチンに含まれていなかった他の抗原については、有意な抗体レベルは観察されなかった。さらに、ワクチン未接種の未実験のマウス（群７）からのプールされた群血清は、４つの多価ワクチン抗原全てに対してスクリーニングしたとき、検出可能な抗体力価を生成することができず、本研究のマウスのいずれも既存の免疫を有していなかったことが示され、さらに、免疫感作された群で生成された力価が免疫抗原に特異的であったことが証明された。
【０１４２】
【表２４】
【０１４３】
【表２５】
【０１４４】
【表２６】
【０１４５】
本明細書中に挙げた全ての刊行物および特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者のレベルを示すものである。全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的におよび個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１４６】
上記発明は理解の明快さの目的のために例示および実施例としてある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある変更および修正を加えることができることは明らかであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミョウバン吸着ワクチン粒子の安定粉末製剤を含む医薬組成物であって、ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）、炭疽菌抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ペスト菌抗原およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの免疫原を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記ＢｏＮＴはＢｏＮＴ／Ａであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記炭疽菌抗原は炭疽菌ｒＰＡであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ブドウ球菌エンテロトキシン抗原はｒＳＥＢであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ペスト菌免疫原はＦ１−Ｖであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ワクチン粒子は少なくとも８０μｍから３００μｍの範囲の平均粒径を有することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのＢ型肝炎免疫原を含むミョウバン吸着ワクチン粒子の安定粉末製剤を含む医薬組成物であって、前記ワクチン粒子は少なくとも８０μｍから３００μｍの範囲の平均粒径を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
前記平均粒径は８０μｍから１００μｍの範囲であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記Ｂ型肝炎抗原はＨＢｓＡｇを含むことを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記乾燥粉末粒子は約０．０１ｇ／ｃｍ3から約０．７ｇ／ｃｍ3の範囲の平均タップ密度を有することを特徴とする請求項１または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記平均タップ密度は約０．０１ｇ／ｃｍ3から約０．６ｇ／ｃｍ3の範囲であることを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記平均タップ密度は約０．０２ｇ／ｃｍ3から約０．４ｇ／ｃｍ3の範囲であることを特徴とする請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）、炭疽菌抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ペスト菌抗原およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの免疫原をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ミョウバン吸着乾燥ワクチン粉末粒子は、薬学上許容される担体中で再調製されることを特徴とする請求項１または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記免疫原は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムアジュバントに吸着されることを特徴とする請求項１または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記液体製剤は少なくとも１つの賦形剤をさらに含み、前記少なくとも１つの賦形剤はマンニトール、トレハロース、デキストランまたはそれらの任意の組合せであることを特徴とする請求項１または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
少なくとも１つの追加のアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項１または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、元の液体製剤の免疫原性と比較して実質的なレベルの免疫原性を保持することを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、液体製剤のそれと比較してほとんどまたは全く凝集を示さないことを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、液体製剤の免疫原濃度と比較して免疫原濃度の実質的な低下を示さないことを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、元の液体製剤の抗原性と比較して実質的なレベルの抗原性を保持することを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための方法であって、
ａ）アルミニウムアジュバント上に吸着された少なくとも１つのＢ型肝炎免疫原を含む液体製剤を霧化して、霧化製剤を生成するステップと、
ｂ）霧化製剤を凍結させて凍結粒子を生成するステップと、
ｃ）凍結粒子をおよそ大気圧の下で乾燥させて乾燥粉末粒子を生成するステップであって、前記乾燥粉末粒子は少なくとも８０μｍから３００μｍの範囲の平均粒径を有するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記乾燥粉末粒子は少なくとも８０μｍから１００μｍの範囲の平均粒径を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記乾燥ステップは、振動、内部構造物、機械的攪拌またはそれらの組合せの存在下で実施することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｂ型肝炎抗原はＨＢｓＡｇを含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記液体製剤は、ＢｏＮＴ、炭疽菌抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン抗原、ペスト菌抗原およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの追加の免疫原をさらに含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための方法であって、
ａ）アルミニウムアジュバント上に吸着された少なくとも１つの免疫原を含む液体製剤を霧化して霧化製剤を生成するステップであって、霧化製剤を生成するために、前記免疫原は、ＢｏＮＴ、炭疽菌抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン抗原、ペスト菌抗原およびそれらの組合せからなる群から選択されるステップと、
ｂ）霧化製剤を凍結させて凍結粒子を生成するステップと、
ｃ）凍結粒子を乾燥させて乾燥粉末粒子を生成するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記ＢｏＮＴはＢｏＮＴ／Ａであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記炭疽菌抗原は炭疽菌の組換え防御抗原（ｒＰＡ）であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ブドウ球菌エンテロトキシンは組換えブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ｒＳＥＢ）であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペスト菌免疫原はＦ１−Ｖ融合タンパク質（Ｆ１−Ｖ）であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記液体製剤は複数の免疫原を含み、前記複数の免疫原は炭疽菌ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／Ａ、ｒＳＥＢおよびＦ１−Ｖを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記液体製剤はＨＢｓＡｇをさらに含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記乾燥粉末粒子は少なくとも８０μｍから３００μｍの範囲の平均粒径を有することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記液体製剤は少なくとも１つの追加のアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記免疫原は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムアジュバントに吸着されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記液体製剤は少なくとも１つの賦形剤をさらに含むことを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの賦形剤は、マンニトール、トレハロース、デキストランまたはそれらの任意の組合せであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記液体製剤はマンニトールおよびトレハロースを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記液体製剤はデキストランおよびトレハロースを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記霧化、凍結および乾燥ステップは単一のチャンバー内で実施されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
前記凍結ステップは、霧化製剤を、液体製剤の凝固点未満の温度を有する冷媒に導入することによって実施されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
前記冷媒は気体であることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
前記冷媒は液体であることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４５】
前記乾燥ステップは凍結粒子を気体と接触させることによって実施されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４６】
前記乾燥ステップは冷たい乾燥気体中での昇華によって実施されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４７】
前記凍結粒子は凍結乾燥によってさらに乾燥されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４８】
前記乾燥粒子はフィルター上に収集されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４９】
前記凍結粒子は、乾燥ステップの間、流動状態であることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項５０】
請求項７に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象のＢ型肝炎を予防することを含むことを特徴とする、対象のＢ型肝炎を予防する方法。
【請求項５１】
請求項７に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎に感染したかまたは曝露した対象を治療する方法。
【請求項５２】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象のＢｏＮＴに関連するボツリヌス中毒または症状の発生を予防することを含むことを特徴とする、対象のＢｏＮＴ曝露に関連するボツリヌス中毒または症状の発生を予防する方法。
【請求項５３】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、ＢｏＮＴに曝露した対象を治療する方法。
【請求項５４】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象の炭疽菌曝露に関連する炭疽または症状の発生を予防することを含むことを特徴とする、対象の炭疽菌曝露に関連する炭疽または症状の発生を予防する方法。
【請求項５５】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、炭疽菌に曝露した対象を治療する方法。
【請求項５６】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象のブドウ球菌エンテロトキシン曝露に関連する症状の発生を予防することを含むことを特徴とする、対象のブドウ球菌エンテロトキシン曝露に関連する症状の発生を予防する方法。
【請求項５７】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、ブドウ球菌エンテロトキシンに曝露した対象を治療する方法。
【請求項５８】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象のペスト菌曝露に関連するペストまたは症状の発生を予防することを含むことを特徴とする、対象のペスト菌曝露に関連するペストまたは症状の発生を予防する方法。
【請求項５９】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、ペスト菌に曝露した対象を治療する方法。
【請求項６０】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象の炭疽菌ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｆ１−ＶまたはｒＳＥＢへの曝露に関連する疾患または症状の発生を予防することを含むことを特徴とする、対象の炭疽菌ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｆ１−ＶまたはｒＳＥＢへの曝露に関連する疾患または症状の発生を予防する方法。
【請求項６１】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、炭疽菌ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｆ１−ＶまたはｒＳＥＢに曝露した対象を治療する方法。
【請求項６２】
対象はヒト患者であることを特徴とする請求項５０から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
請求項１または請求項７に記載のミョウバン吸着ワクチン粒子の安定粉末製剤を、薬学上許容される担体中で再調製することを含むことを特徴とする、再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンを生成するための方法。
【請求項１】
ミョウバン吸着ワクチン粒子の安定粉末製剤を含む医薬組成物であって、ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）、炭疽菌抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ペスト菌抗原およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの免疫原を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記ＢｏＮＴはＢｏＮＴ／Ａであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記炭疽菌抗原は炭疽菌ｒＰＡであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ブドウ球菌エンテロトキシン抗原はｒＳＥＢであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ペスト菌免疫原はＦ１−Ｖであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ワクチン粒子は少なくとも８０μｍから３００μｍの範囲の平均粒径を有することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのＢ型肝炎免疫原を含むミョウバン吸着ワクチン粒子の安定粉末製剤を含む医薬組成物であって、前記ワクチン粒子は少なくとも８０μｍから３００μｍの範囲の平均粒径を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
前記平均粒径は８０μｍから１００μｍの範囲であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記Ｂ型肝炎抗原はＨＢｓＡｇを含むことを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記乾燥粉末粒子は約０．０１ｇ／ｃｍ3から約０．７ｇ／ｃｍ3の範囲の平均タップ密度を有することを特徴とする請求項１または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記平均タップ密度は約０．０１ｇ／ｃｍ3から約０．６ｇ／ｃｍ3の範囲であることを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記平均タップ密度は約０．０２ｇ／ｃｍ3から約０．４ｇ／ｃｍ3の範囲であることを特徴とする請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）、炭疽菌抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ペスト菌抗原およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの免疫原をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ミョウバン吸着乾燥ワクチン粉末粒子は、薬学上許容される担体中で再調製されることを特徴とする請求項１または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記免疫原は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムアジュバントに吸着されることを特徴とする請求項１または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記液体製剤は少なくとも１つの賦形剤をさらに含み、前記少なくとも１つの賦形剤はマンニトール、トレハロース、デキストランまたはそれらの任意の組合せであることを特徴とする請求項１または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
少なくとも１つの追加のアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項１または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、元の液体製剤の免疫原性と比較して実質的なレベルの免疫原性を保持することを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、液体製剤のそれと比較してほとんどまたは全く凝集を示さないことを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、液体製剤の免疫原濃度と比較して免疫原濃度の実質的な低下を示さないことを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンは、元の液体製剤の抗原性と比較して実質的なレベルの抗原性を保持することを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための方法であって、
ａ）アルミニウムアジュバント上に吸着された少なくとも１つのＢ型肝炎免疫原を含む液体製剤を霧化して、霧化製剤を生成するステップと、
ｂ）霧化製剤を凍結させて凍結粒子を生成するステップと、
ｃ）凍結粒子をおよそ大気圧の下で乾燥させて乾燥粉末粒子を生成するステップであって、前記乾燥粉末粒子は少なくとも８０μｍから３００μｍの範囲の平均粒径を有するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記乾燥粉末粒子は少なくとも８０μｍから１００μｍの範囲の平均粒径を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記乾燥ステップは、振動、内部構造物、機械的攪拌またはそれらの組合せの存在下で実施することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｂ型肝炎抗原はＨＢｓＡｇを含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記液体製剤は、ＢｏＮＴ、炭疽菌抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン抗原、ペスト菌抗原およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの追加の免疫原をさらに含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ミョウバン吸着ワクチンの安定粉末製剤を調製するための方法であって、
ａ）アルミニウムアジュバント上に吸着された少なくとも１つの免疫原を含む液体製剤を霧化して霧化製剤を生成するステップであって、霧化製剤を生成するために、前記免疫原は、ＢｏＮＴ、炭疽菌抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン抗原、ペスト菌抗原およびそれらの組合せからなる群から選択されるステップと、
ｂ）霧化製剤を凍結させて凍結粒子を生成するステップと、
ｃ）凍結粒子を乾燥させて乾燥粉末粒子を生成するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記ＢｏＮＴはＢｏＮＴ／Ａであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記炭疽菌抗原は炭疽菌の組換え防御抗原（ｒＰＡ）であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ブドウ球菌エンテロトキシンは組換えブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ｒＳＥＢ）であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペスト菌免疫原はＦ１−Ｖ融合タンパク質（Ｆ１−Ｖ）であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記液体製剤は複数の免疫原を含み、前記複数の免疫原は炭疽菌ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／Ａ、ｒＳＥＢおよびＦ１−Ｖを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記液体製剤はＨＢｓＡｇをさらに含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記乾燥粉末粒子は少なくとも８０μｍから３００μｍの範囲の平均粒径を有することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記液体製剤は少なくとも１つの追加のアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記免疫原は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムアジュバントに吸着されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記液体製剤は少なくとも１つの賦形剤をさらに含むことを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの賦形剤は、マンニトール、トレハロース、デキストランまたはそれらの任意の組合せであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記液体製剤はマンニトールおよびトレハロースを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記液体製剤はデキストランおよびトレハロースを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記霧化、凍結および乾燥ステップは単一のチャンバー内で実施されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
前記凍結ステップは、霧化製剤を、液体製剤の凝固点未満の温度を有する冷媒に導入することによって実施されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
前記冷媒は気体であることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
前記冷媒は液体であることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４５】
前記乾燥ステップは凍結粒子を気体と接触させることによって実施されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４６】
前記乾燥ステップは冷たい乾燥気体中での昇華によって実施されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４７】
前記凍結粒子は凍結乾燥によってさらに乾燥されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４８】
前記乾燥粒子はフィルター上に収集されることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項４９】
前記凍結粒子は、乾燥ステップの間、流動状態であることを特徴とする請求項２２または請求項２７に記載の方法。
【請求項５０】
請求項７に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象のＢ型肝炎を予防することを含むことを特徴とする、対象のＢ型肝炎を予防する方法。
【請求項５１】
請求項７に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎に感染したかまたは曝露した対象を治療する方法。
【請求項５２】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象のＢｏＮＴに関連するボツリヌス中毒または症状の発生を予防することを含むことを特徴とする、対象のＢｏＮＴ曝露に関連するボツリヌス中毒または症状の発生を予防する方法。
【請求項５３】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、ＢｏＮＴに曝露した対象を治療する方法。
【請求項５４】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象の炭疽菌曝露に関連する炭疽または症状の発生を予防することを含むことを特徴とする、対象の炭疽菌曝露に関連する炭疽または症状の発生を予防する方法。
【請求項５５】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、炭疽菌に曝露した対象を治療する方法。
【請求項５６】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象のブドウ球菌エンテロトキシン曝露に関連する症状の発生を予防することを含むことを特徴とする、対象のブドウ球菌エンテロトキシン曝露に関連する症状の発生を予防する方法。
【請求項５７】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、ブドウ球菌エンテロトキシンに曝露した対象を治療する方法。
【請求項５８】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象のペスト菌曝露に関連するペストまたは症状の発生を予防することを含むことを特徴とする、対象のペスト菌曝露に関連するペストまたは症状の発生を予防する方法。
【請求項５９】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、ペスト菌に曝露した対象を治療する方法。
【請求項６０】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象の炭疽菌ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｆ１−ＶまたはｒＳＥＢへの曝露に関連する疾患または症状の発生を予防することを含むことを特徴とする、対象の炭疽菌ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｆ１−ＶまたはｒＳＥＢへの曝露に関連する疾患または症状の発生を予防する方法。
【請求項６１】
請求項１に記載の少なくとも１つの医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療することを含むことを特徴とする、炭疽菌ｒＰＡ、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｆ１−ＶまたはｒＳＥＢに曝露した対象を治療する方法。
【請求項６２】
対象はヒト患者であることを特徴とする請求項５０から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
請求項１または請求項７に記載のミョウバン吸着ワクチン粒子の安定粉末製剤を、薬学上許容される担体中で再調製することを含むことを特徴とする、再調製された液体ミョウバン吸着ワクチンを生成するための方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ−１】
【図９Ａ−２】
【図９Ａ−３】
【図９Ｂ−１】
【図９Ｂ−２】
【図９Ｂ−３】
【図９Ｃ−１】
【図９Ｃ−２】
【図９Ｃ−３】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ−１】
【図９Ａ−２】
【図９Ａ−３】
【図９Ｂ−１】
【図９Ｂ−２】
【図９Ｂ−３】
【図９Ｃ−１】
【図９Ｃ−２】
【図９Ｃ−３】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【公表番号】特表２０１０−５０２７４７（Ｐ２０１０−５０２７４７Ａ）
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２７６１４（Ｐ２００９−５２７６１４）
【出願日】平成１９年９月１０日（２００７．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７８０７６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７９４６４
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５９５１１７０９１）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー (539)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ ０７４１７−１８８０， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１０日（２００７．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７８０７６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７９４６４
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５９５１１７０９１）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー (539)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ ０７４１７−１８８０， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]