モラクセラ・エスピーの検出方法
【課題】繊維製品の生乾き臭の原因菌を、簡便、迅速かつ正確に検出するための手段を提供する。
【解決手段】特定の塩基配列で表される核酸と９７％以上の同一性を有する塩基配列で表される核酸の存在を検出する、モラクセラ・エスピー（Moraxellasp．）の検出方法。該方法がモラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを少なくとも１種用いて前記核酸の存在を検出する方法。
【解決手段】特定の塩基配列で表される核酸と９７％以上の同一性を有する塩基配列で表される核酸の存在を検出する、モラクセラ・エスピー（Moraxellasp．）の検出方法。該方法がモラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを少なくとも１種用いて前記核酸の存在を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タオル、寝具等のサニタリー用品や衣類等の繊維製品（以下、本明細書において、単に「繊維製品」ともいう）は、清潔に保つことで心地よい使用感・着用感が得られる。また、サニタリー用品や衣類等の繊維製品は人体に纏うものであり、タオル、寝具等は人体に直接接触させて使用するものであるため、これらを清潔に保つことは衛生面からも重要である。近年の社会的な衛生志向の高まりに伴い、サニタリー用品や衣類等の繊維製品を清潔に保つことに関する人々の関心は高まっている。
【０００３】
近年、消費者の生活環境への関心の高まりから、身の回りの不快な臭気（本明細書において、「異臭」ともいう）を除去することが以前にも増して望まれている。タオル、寝具等のサニタリー用品、衣料等の繊維製品に付着する臭気は、タバコなどの外的要因の他に、繊維製品の使用を繰り返すことにより生じる、人体由来の内的要因が挙げられる。
下着、タオル及びハンカチを初めとするヒトの皮膚と直接接触するような繊維製品、又は皮脂を含んだ汗や角質などを吸収又は付着する可能性のある繊維製品は、洗濯後、被洗物を洗濯槽内等の湿気の多い場所にしばらく放置した場合、室内干しの場合、雨や汗で濡れた場合、又は乾燥が不十分の場合に、特有の臭いを生ずることがある。この臭いは一般に生乾き臭と呼ばれるものであり、十分な乾燥を行うことで大部分を除去することができる。しかしながら、十分な乾燥を行い、生乾き臭が感じられなくなった繊維製品であっても、汗や雨などで繊維製品が湿気を帯びると雑巾臭様の生乾き臭が生じることがある。繊維製品がこの生乾き臭を一度発生するようになると、洗濯後の十分な乾燥により一時的には生乾き臭を除去できるが、使用時に雑巾臭様の生乾き臭が再発し易くなる。このような再発し易い生乾き臭は、室内干しの場合のみならず、低温乾燥機能を備えた洗濯機又は乾燥機を用いた場合や、室外干し乾燥の場合でさえも湿気を帯びると生じる場合がある。
再発性の生乾き臭の特徴的な点は、洗濯し十分に乾燥した後は発生しない、ないし殆ど低減されるが、湿気を帯びるだけで臭いが発生する点にある。再発性の生乾き臭は、長期間タンスなどに収納した場合に生じ易い。しかしながら、下着、ハンカチ又はタオルなど、ヒトの肌との接触機会が多く、洗浄−使用サイクルの期間の短い使用頻度の多い繊維製品は、一度この生乾き臭が発生するようになると使用中に臭いが再発してくることが多い。さらには、洗濯回数が増えるほど生乾き臭の臭い強度が高まる傾向がある。
【０００４】
この生乾き臭は、繊維製品に特定の微生物が繁殖して不快臭成分を産生することが原因の１つである。したがって、生乾き臭を抑制するためには微生物が繁殖しないように衣類等を清潔に保つことが重要である。
生乾き臭の原因となる微生物の繁殖を効果的に抑制するには、当該微生物を明らかにするとともにその存在箇所や伝播経路を明らかにし、各場面での制御が重要となってくる。これまでは生乾き臭の原因となる微生物はほとんど特定されておらず、また特定された場合においても生乾き臭原因菌の存在を確認するためには寒天培地などを用いた培養法により菌を単離する必要があった。この方法では、生乾き臭原因菌か否かの判定には専門性が必要であり、さらに非常に時間と労力がかかっていた。繊維製品の生乾き臭の発生を効果的に抑制するために、生乾き臭の原因となる微生物の簡便かつ迅速な検出方法を確立することが望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、繊維製品の生乾き臭の原因菌を、簡便、迅速かつ正確に検出するための手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、生乾き臭を発する繊維製品から生乾き臭を産生する微生物としてモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）を単離することに成功した。そして、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列と相同性を有する塩基配列の全部又は一部が含まれているか否かを確認することで、繊維製品の生乾き臭の原因菌を簡便、迅速かつ正確に検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成させたものである。
【０００７】
本発明は、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列で表される核酸、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列で表される核酸の存在を検出する、モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）の検出方法に関する。
【０００８】
また、本発明は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用のオリゴヌクレオチドであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関する。
（ａ）配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【０００９】
また、本発明は、前記（ａ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｂ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｂ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を含むモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用の核酸増幅反応用プライマーセットであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、プライマーセットに関する。
【００１０】
また、本発明は、上記オリゴヌクレオチド又は上記プライマーセットを含む、モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用の検出キットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、繊維製品の生乾き臭の原因菌を、簡便、迅速かつ正確に検出することができる。また、本発明によれば、上記検出に使用できるオリゴヌクレオチド、プライマーセット及び検出キットが提供される。また、本発明によれば、繊維製品が生乾き臭を発生しうることの評価を行うことができる。また、本発明によれば、繊維製品の衛生状態、洗濯状態の評価を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図１−２】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図１−３】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図１−４】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図２】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図３】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図４】生乾き臭を発するタオル４種から抽出したＤＮＡを試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。Ｍは分子量マーカーを表す。
【図５】居住環境から菌叢をサンプリングして培養し、これから抽出したＤＮＡを試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表５に記載のサンプリング番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明における「モラクセラ・エスピー」とは、生乾き臭を発するタオル、バスタオル及びＴシャツからサンプリングした菌叢を培養法により解析した結果、すべての菌叢において検出された、いわゆる生乾き臭産生菌である。
モラクセラ・エスピーの分離株であるモラクセラ・エスピー４−１株の１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、モラクセラ・エスピーの分離株であるモラクセラ・エスピー４−４株の塩基配列を配列番号２に示す。モラクセラ・エスピー４−１株及びモラクセラ・エスピー４−４株の塩基配列は、配列番号３に示すモラクセラ・オスロエンシス（Moraxella osloensis）ＡＴＣＣ１９９７６株の１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列と高い同一性（identity）を有し、モラクセラ・オスロエンシスも繊維製品において生乾き臭を産生することが明らかとなっている。したがって、本発明における「モラクセラ・エスピー」は、モラクセラ・オスロエンシスも包含する。
なお、後述の実施例でも示すように、本明細書における「生乾き臭」は、モラクセラ・エスピーが繊維製品中に生存又はそこで増殖して産生される臭い、又は、乾燥によって繊維に囚われていた臭いが繊維製品の湿潤により再び解放され、低閾値であるため感じられ易い臭いである。そして再発性の生乾き臭が、４−メチル３−ヘキセン酸（本明細書において、「４Ｍ３Ｈ」ともいう）を主とする中級分岐脂肪酸臭であることを見出した。
【００１４】
本発明において「モラクセラ・エスピー」とは、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の塩基配列と９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を含む微生物を意味する。本発明の検出方法で検出されるモラクセラ・エスピーは、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列中に、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の１〜５０４位の塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含むことが好ましく、９９％以上の同一性を有する塩基配列を含むことがより好ましい。塩基配列の同一性（％）については、Lipman-Pearson法（Science，227，1435，1985）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００１５】
本発明の検出方法で検出されるモラクセラ・エスピーは、生乾き臭を産生する生乾き臭原因菌であることが好ましく、該生乾き臭成分として４−メチル３−ヘキセン酸（４Ｍ３Ｈ）を産生することがより好ましい。また、本発明の検出方法で検出されるモラクセラ・エスピーは、下記表１に示すモラクセラ・エスピー分離株（４−１株）やモラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６株などのモラクセラ・オスロエンシスの菌学的性質と同一の菌学的性質を有することが好ましい。
【００１６】
【表１】
【００１７】
本発明の検出方法は、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列で表される核酸、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列で表される核酸の存在を検出するものであり、これによりモラクセラ・エスピーを特異的に検出することができる。前記塩基配列で表される核酸の存在を検出する方法としては、シークエンス法、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Loop-Mediated Isothermal Amplification（ＬＡＭＰ）法）等の遺伝子工学的手法が挙げられる。これら方法は通常の方法により行うことができるが、特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用いることで、モラクセラ・エスピーを簡便、迅速かつ正確に検出することができる点から好ましい。
【００１８】
本発明の検出方法に好ましく用いられるオリゴヌクレオチド（以下、本発明のオリゴヌクレオチドと呼ぶことがある。）は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチドであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。
（ａ）配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００１９】
なお、配列番号４の塩基配列において「１若しくは数個」とは、１〜５個であることが好ましく、１〜４個であることがより好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１〜２個であることがさらに好ましく、１個であることが特に好ましい。配列番号５の塩基配列において「１若しくは数個」とは、１〜４個であることが好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１〜２個であることがさらに好ましく、１個であることが特に好ましい。配列番号６の塩基配列において「１若しくは数個」とは、１〜５個であることが好ましく、１〜４個であることがより好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１〜２個であることがさらに好ましく、１個であることが特に好ましい。配列番号７の塩基配列において「１若しくは数個」とは、１〜６個であることが好ましく、１〜５個であることがより好ましく、１〜４個であることがより好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１〜２個であることがさらに好ましく、１個であることが特に好ましい。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号４〜７のいずれかの塩基配列又は該塩基配列と好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８６％以上、より好ましくは８７％以上、より好ましくは８８％以上、より好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を有するものであってもよい。
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列と、該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列の相補配列の同一性が高い領域（例えば同一性が８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８６％以上、より好ましくは８７％以上、より好ましくは８８％以上、より好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）でハイブリダイズし、同一性が低い領域ではハイブリダイズしない条件を指す。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。このような条件として、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液、より好ましくは３×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液、さらに好ましくは１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にて、６０℃、より好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃で８〜１６時間恒温してハイブリダイズさせる条件が挙げられる。また、上記「ストリンジェントな条件」として、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する温度及び塩濃度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）ペプチド核酸（ＰＮＡ）等やこれらのキメラ核酸の他、ＤＮＡやＲＮＡにおけるホスホジエステル結合の一部又は全部をホスホロチオエート結合等の他の結合に置き換えた核酸が含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、通常の方法で化学合成することができるし、試薬メーカーから購入することもできる。
【００２１】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、シークエンス法、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Loop-Mediated Isothermal Amplification（ＬＡＭＰ）法）等の通常の方法によりモラクセラ・エスピーを検出することができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーション法によりモラクセラ・エスピーを検出する場合、本発明のオリゴヌクレオチドをモラクセラ・エスピーのゲノムＤＮＡを含みうる試料溶液に添加して該ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡと本発明のオリゴヌクレオチドをストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる。モラクセラ・エスピーのゲノムＤＮＡを含みうる試料に特に制限はないが、衣類、タオル類、カーテンやバスマットなどのファブリック類、洗面台や洗濯機およびキッチンシンクなどの住環境設備、土壌や埃など、又はこれらからのＤＮＡ抽出物などが挙げられる。ここで用いる本発明のオリゴヌクレオチドは標識物によって標識されていることが好ましい。該標識物に特に制限はないが、放射性物質、酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分のいずれの部分に標識してもよい。標的ＤＮＡが存在する場合には標識された本発明のオリゴヌクレオチドが該標的ＤＮＡとハイブリダイズするため、該標的ＤＮＡとハイブリダイズした本発明のオリゴヌクレオチドの該標識を検出することで、モラクセラ・エスピーを検出することができる。かかる標識の検出手段としては、例えば本発明のオリゴヌクレオチドが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フイルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。上記ハイブリダイゼーション反応は、試料又は試料中のＤＮＡを固相担体に固定化させた状態で実施することが好ましい。これにより未反応のオリゴヌクレオチドを洗浄により除去することができ、正確な検出が可能になる。
別のハイブリダイゼーション反応の形態として、上記オリゴヌクレオチドを捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、該捕捉プローブと、検出対象である標的核酸の塩基配列のうち該捕捉プローブとは異なる部位で結合する標識核酸プローブとの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、該標的核酸自体を標識して捕捉プローブに捕捉された標的核酸を検出することもできる。
例えば、検出対象となる微生物がモラクセラ・エスピー４−１株又は４−４株である場合において、配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いると、それぞれ配列番号１及び配列番号２の塩基配列で表されるモラクセラ・エスピー４−１株及び４−４株の１６ｓ ｒＤＮＡの１７６〜１９７位の相補配列部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。同様に、配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いると、配列番号１及び配列番号２の１７９〜１９７位の塩基配列の相補配列部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いると、配列番号１及び配列番号２の４２８〜４５２位の塩基配列部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いると、配列番号１及び配列番号２の４５８〜４８５位の塩基配列部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。ここで、ストリンジェントな条件とは上記のストリンジェントな条件と同義である。
【００２３】
核酸増幅法（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等）によりモラクセラ・エスピーを検出する場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼによる複製開始点を提供する核酸増幅反応用プライマー（好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応用プライマー）として使用することができる。核酸増幅法においては標的核酸を増幅するために、通常には、本発明のオリゴヌクレオチドと、本発明のオリゴヌクレオチドとペアとなって標的核酸を増幅するための他のオリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットが必要となる。当該他のオリゴヌクレオチドは通常の方法で設計・作製することができる。この場合において、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡは１６ｓ ｒＤＮＡの断片であることが好ましい。
【００２４】
ＰＣＲ法及びＬＡＭＰ法は、少なくとも下記（i）〜（iii）の工程を含む。
（i）モラクセラ・エスピーを含みうる試料又はそのＤＮＡ抽出物と、ｄＮＴＰと、ＤＮＡポリメラーゼと、本発明のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットとを混合して核酸増幅用反応液を調製する工程、
（ii）上記核酸増幅用反応液を核酸増幅反応に付する工程、
（iii）増幅された核酸を検出する工程。
【００２５】
ＰＣＲ法の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマーを１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０〜６０℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行うことができる。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いれば、標的ＤＮＡを定量することもでき、これにより検出対象である微生物の数を測定することも可能になる。ＰＣＲはサーマルサイクラーを用いて行う。
一方、ＬＡＭＰ法では６０℃付近の等温で増幅反応が進行するのでサーマルサイクラーを要せず、恒温槽で反応を進行させることができる。ＬＡＭＰ法においては４種類のオリゴヌクレオチドプライマーが必要になるが、このようなプライマーの設計は専用のソフトウェアを用いて行うことができる。
【００２６】
核酸増幅反応により増幅したＤＮＡ断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物量を経時的に計測する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。また、本発明において、増幅産物の検出は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、蛍光物質などで標識されたプライマーを用いる方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にエチジウムブロマイドなどのＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法、増幅産物による反応液の濁度を検出する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法が好ましい。
検体にモラクセラ・エスピーが含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、特定のサイズを有するＤＮＡ断片の増幅が認められる。具体的には、検体にモラクセラ・エスピーが含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲ反応を行うと、約３００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。このような操作を行うことにより、検体にモラクセラ・エスピーが含まれているかを確認することができる。
【００２７】
ＰＣＲ法で使用するＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ等の高温耐性のＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。また、ＬＡＭＰ法等の等温増幅反応においてはＡａｃＤＮＡポリメラーゼやＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ等の鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼを用いる。核酸増幅用反応液には試料、プライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ等の他、プライマーと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションや使用するＤＮＡポリメラーゼに適した緩衝液等の他の成分を含ませてもよい。
【００２８】
本発明のモラクセラ・エスピーの検出方法において、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチドを少なくとも１種用いることが好ましく、少なくとも２種のプライマーからなるプライマーセットを用いた核酸増幅反応を行い、前記少なくとも２種のプライマーのうち少なくとも１種のプライマーが前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、前記（ａ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｂ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｂ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を含むプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことがさらに好ましい。
本発明のモラクセラ・エスピーの検出方法において、前記プライマーが増幅しうる標的ＤＮＡはモラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡの連続した部分塩基配列であることが好ましい。ＰＣＲ法において、２種類のプライマー（１種類のプライマー対）からなるプライマーセットでは増幅される該部分塩基配列は１種類であり、３種類以上のプライマー（２種類以上のプライマー対）からなるプライマーセットでは該部分塩基配列は２種類以上となる。また、２種類以上の該部分塩基配列は一部重複していてもよい。２種類以上の該部分塩基配列が一部重複しているケースとしては、１つのプライマーに対して、対になるプライマーが２種類以上含まれる場合が挙げられる。前記プライマーセットを構成する少なくとも２種のプライマーは、ストリンジェントな条件下で１６ｓ ｒＤＮＡの中の標的ＤＮＡにハイブリダイズする。ここで、ストリンジェントな条件は上述の条件と同一である。
【００２９】
本発明のプライマーセットは、前記（ａ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｂ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｂ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を含むモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用の核酸増幅反応用プライマーセットであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。このようなプライマーセットはＰＣＲ法に好適に用いることができる。
【００３０】
本発明の検出キットは、本発明のオリゴヌクレオチド又は本発明のプライマーセットと、ハイブリダイゼーション反応や核酸増幅反応に必要な各種の試薬類が予めパッケージングされた、モラクセラ・エスピー検出するためのキットである。本発明の検出キットには、本発明のオリゴヌクレオチド若しくは本発明のプライマーセット又はこれらの標識物の他、目的に応じて、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）酵素基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ等）等、微生物の遺伝子検出に通常用いられる物質を含有する。本発明の検出キットは、本発明のプライマーセットによって検出反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）等を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしうる塩基配列を含むＤＮＡ断片や、本発明のプライマーセットが増幅しうる塩基配列を含むＤＮＡ断片等が挙げられる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
試験例１ 生乾き臭原因物質の特定
洗濯乾燥の後に生乾き臭が強く発生した木綿のタオルを家庭より回収して５０ｇを裁断し、ジクロロメタン５００ｍＬよりニオイ成分を抽出後減圧濃縮した。さらに、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬを抽出溶液に添加し、水層を回収し、２Ｍ塩酸２００ｍＬ添加し酸性にした。この溶液に、ジクロロメタン２００ｍＬを加え有機層を減圧濃縮し、酸性成分の濃縮物を１ｍＬに定容した。
【００３３】
続いて、アジレント社製ガスクロマトグラフィーにゲステル社製Preparative Fraction Collector（ＰＦＣ）装置を接続したものを用い、濃縮物を下記の条件下でＧＣ保持時間により分画し、目的成分周辺のＧＣ３０回分を内径６ｍｍ、長さ１１７ｍｍのガラス管に充填した充填剤（商品名：TENAX TA、ジーエルサイエンス社製）２００ｍｇに捕集した。
（ＧＣ−ＰＦＣ条件）
ＧＣ：Agilent 6890N（商品名、アジレント社製）
カラム：DB-1（商品名、アジレント社製）、長さ３０ｍ、内径０．５３ｍｍ、膜厚１μｍ
４０℃１ｍｉｎ．hold→６℃／ｍｉｎ．to ６０℃→４℃／ｍｉｎ．to ３００℃
Injection volume：２μＬ
ＰＦＣ(Gerstel社製)：trap time １８ｍｉｎ．to ２４ｍｉｎ.、３０ｔｉｍｅｓ
trap：TENAX TA（商品名、ジーエルサイエンス社製）２００ｍｇ
【００３４】
最後にTENAXに捕集した目的成分をゲステル社製Thermal Desorption system（ＴＤＳ）をアジレント社製ＧＣ−ＭＳに接続した装置にて、下記条件下で分析した。
（ＴＤＳ−ＧＣ−ＭＳ条件）
GC：Agilent 6890N（商品名、アジレント社製）
MS：Agilent 5973（商品名、アジレント社製）
TDS脱着条件：２５０℃、パージ流量５０ｍＬ／ｍｉｎ、パージ時間 ３ｍｉｎ．
カラム：DB-FFAP（商品名、アジレント社製）、長さ３０ｍ、内径２５０μｍ、膜厚０．２５μｍ
４０℃１ｍｉｎ．hold→６℃／ｍｉｎ．to ６０℃→２℃／ｍｉｎ．to ２４０℃
【００３５】
解析の結果、生乾き臭の主原因物質は４Ｍ３Ｈをはじめとする中級分岐脂肪酸であることが明らかとなった。
【００３６】
試験例２ 生乾き臭原因菌の特定
（１）菌株の単離
洗濯乾燥の後に生乾き臭が発生した木綿のタオル又はバスタオルを裁断し、ＬＰ（レシチン・ポリソルベート）希釈液（日本製薬社製）を添加後、攪拌した溶液０．１ｍＬをＳＣＤ−ＬＰ（レシチン・ポリソルベート添加ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト）寒天培地（日本製薬社製）に塗沫し、３５℃、２４時間培養後、得られたコロニーから微生物を単離した。単離された各菌株の同定は１６ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の上流領域約５００ｂｐの塩基配列を決定し、当該塩基配列と基準株との同一性に基づき行なった。塩基配列の同一性は、遺伝子情報処理ソフトウェアＣｌｕｓｔａｌＷを用いて算出した。なおモラクセラ・エスピーに関してはモラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６の塩基配列を決定し、その塩基配列と比較することで同定した。
各タオル又はバスタオルから単離された菌株を表２に示す。
【００３７】
（２）繊維製品での生乾き臭再現試験
上記で単離された各種菌株をそれぞれ生乾き臭が発生した木綿のタオル、あるいは使用後洗濯して保管していた木綿のタオルを滅菌処理したものに接種し、３５℃で２４時間加湿条件下（湿度１００％）で培養後、生乾き臭の発生の有無を下記基準に基づいて、香料評価の訓練を受けた専門評価者（Ｎ＝３）により、合意により判定した。
１：生乾き臭の発生が非常に強い
２：生乾き臭の発生が強い
３：生乾き臭の発生が弱い
４：生乾き臭が全くしない
その結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
（３）結果
表２の結果から、すべての生乾き臭発生タオル・バスタオルから、モラクセラ・エスピーが単離された。また、単離されたモラクセラ・エスピーは、その菌数も多かった。さらに、単離したモラクセラ・エスピーを生乾き臭が発生したタオルを滅菌処理したものに接種したところ、非常に強い生乾き臭が発生することが確認された。
したがって、生乾き臭には本菌種などの特定の微生物が関与していることが明らかとなった。
【００４０】
試験例３ モラクセラ・オスロエンシス ＡＴＣＣ１９９７６（ＡＴＣＣより購入）からの生乾き臭発生の確認
（１）タオルでの不快臭再現試験
モラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６を用いて試験例２と同様の方法で生乾き臭発生の有無を確認した結果、モラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６を接種したタオルから非常に強い生乾き臭が発生することを確認した。
【００４１】
実施例１ モラクセラ・エスピーの検出
（１）検体の調製
下記表３に示す種々の菌株を検体として用意した。
試料番号１の菌株はDSM（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）、試料番号２の菌株はATCC（American Type Culture Collection）、試料番号３の菌株はＮＣＩＭＢ（National Collection of Industrial，Marine and Food Bacteria）、試料番号４〜７に示す菌株はNBRC（NITE Biological Resource Center）からそれぞれ購入した。
また、試料番号８〜２６の菌株は、不快なニオイが発生したタオルからＬＰ希釈液中に抽出された菌株をＳＣＤ−ＬＰ寒天培地で３０℃、４８時間培養後、得られたコロニーを再単離することで単離した。単離された各菌株の同定は、１６ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の中の上流域約５００ｂｐ又は約１５００ｂｐの塩基配列を決定し、該塩基配列の同一性に基づき行った。
【００４２】
また、単離された菌株であるモラクセラ・エスピー４−１株、モラクセラ・エスピー４−４株及びモラクセラ・オスロエンシスの１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を基準として、各菌株の１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の同一性を比較した。ここで、モラクセラ・オスロエンシスの１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は、モラクセラ・オスロエンシスの基準株であるモラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列（配列番号３）を用いた。配列番号３の塩基配列は、モラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６株からゲノムＤＮＡを抽出し、１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を解析することで決定した。塩基配列の同一性は、遺伝子情報処理ソフトウェアClustalW（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いて算出した。なお、モラクセラ・エスピー４−１株は、２０１０年１０月１４日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ-22030として寄託された。
その結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
（２）ゲノムＤＮＡの調製
上記各菌株をＳＣＤ寒天培地に接種して３５℃で２４時間培養後、白金耳を用いて各菌体を寒天培地から回収した。回収した菌体から、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製、PrepMan Ultra Reagent（商品名））を用いてゲノムＤＮＡ溶液を調製した。
【００４５】
（３）プライマーの合成
配列番号４〜７の各々の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成して脱塩により精製し、プライマーとした。
【００４６】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレート（前記（２）で調製したゲノムＤＮＡ溶液を無菌蒸留水で１００倍希釈した溶液）１μＬ、TaKaRa EX Taq HS（商品名、タカラバイオ社製）０．１μＬ、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のｄＮＴＰ混合液）１．６μＬ、１０倍濃縮反応用バッファー（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のバッファー）２μＬ、配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．４μＬ、配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．４μＬ、無菌蒸留水１４．５μＬ混合することで、２０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。
陰性対照（ネガティブコントロール）として滅菌蒸留水をＤＮＡテンプレートの代わりに混合したＰＣＲ反応液も同様に調製した。
上記配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせに代えて、配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号６の塩基配列の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ、及び配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせについても同様にＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ社製）を用いて遺伝子増幅処理を行なった。ＰＣＲ反応条件は、（i）９８℃、１０秒間の熱変性反応、（ii）６８℃、１分間のアニーリングおよび伸長反応を３０サイクル行なった。
【００４７】
（５）アガロースゲル電気泳動
反応液中の目的ＤＮＡ断片の増幅を、アガロースゲル電気泳動およびSYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）による染色により確認した。反応液を２％アガロールゲルにアプライし、ＴＢＡバッファー中、１００ボルトで３０分電気泳動を行った。次いでゲルを取り出し、SYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）溶液中に３０分浸漬して染色後、ＵＶランプ照射の下ポラロイドカメラで撮影した。ＤＮＡ断片の長さは、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流しておくことで、移動度の相対比較によって算出した。
【００４８】
（６）結果
配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを組み合わせた場合の電気泳動の写真を図１−１、図１−２、図１−３及び図１−４に示す。なお、図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
また、配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを組み合わせた場合のＰＣＲ反応における遺伝子断片増幅の有無をまとめたものを下記表４に示す。
【００４９】
【表４】
【００５０】
また、配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号６で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを組み合わせた場合の電気泳動の写真を図２に、配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号６で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを組み合わせた場合の電気泳動の写真を図３に示す。なお、図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いた場合、モラクセラ・エスピー分離株１１株及びモラクセラ・オスロエンシスでゲル上の約３００ｂｐの位置に目的のＤＮＡ断片が検出された一方、モラクセラ・エスピー以外の１０株ではゲル上の３００ｂｐの位置の付近に目的のＤＮＡ断片は検出されなかった。
以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることで、モラクセラ・エスピーを特異的に検出することができることがわかった。
【００５２】
実施例２ 環境試料からのモラクセラ・エスピーの検出
モラクセラ・エスピーが単離された生乾き臭を発するタオルを試料としてモラクセラ・エスピーの検出を試みた。
【００５３】
（１）検体からのゲノムＤＮＡの調製
生乾き臭発生タオル４種を用意し（それぞれ試料Ｔ１〜Ｔ４と呼ぶ）、これを検体として使用した。タオルを細かく裁断し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製、PrepMan Ultra Reagent（商品名））を用いてゲノムＤＮＡ溶液を調製した。
【００５４】
（２）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレート（前記（１）で調製したゲノムＤＮＡ溶液を無菌蒸留水で１００倍希釈した溶液）５μＬ、TaKaRa EX Taq HS（商品名、タカラバイオ社製）０．１μＬ、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のｄＮＴＰ混合液）１．６μＬ、１０倍濃縮反応用バッファー（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のバッファー）２μＬ、配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．４μＬ、配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．４μＬ、無菌蒸留水１０．５μＬ混合することで、２０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。
陰性対照（ネガティブコントロール）として滅菌蒸留水をＤＮＡテンプレートの代わりに混合したＰＣＲ反応液も同様に調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ社製）を用いて遺伝子増幅処理を行なった。ＰＣＲ反応条件は、（i）９８℃、１０秒間の熱変性反応、（ii）６８℃、１分間のアニーリングおよび伸長反応を４０サイクル行なった。
【００５５】
（３）アガロースゲル電気泳動
反応液中の目的ＤＮＡ断片の増幅を、アガロースゲル電気泳動およびSYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）による染色により確認した。反応液を２％アガロールゲルにアプライし、ＴＢＡバッファー中、１００ボルトで３０分電気泳動を行った。次いでゲルを取り出し、SYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）溶液中に３０分浸漬して染色後、ＵＶランプ照射の下ポラロイドカメラで撮影した。ＤＮＡ断片の長さは、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流しておくことで、移動度の相対比較によって算出した。
【００５６】
（４）結果
電気泳動の結果を示す写真を図４に示す。
モラクセラ・エスピーが単離された生乾き臭を発する４種のタオル（Ｔ１〜Ｔ４）すべてにおいて、ゲル上の約３００ｂｐの位置に増幅されたＤＮＡ断片が検出された。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、様々な菌種の菌株が存在する環境試料からもモラクセラ・エスピーを検出できることがわかった。
【００５７】
実施例３ 居住環境におけるモラクセラ・エスピーの存在の評価
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて住居内からのモラクセラ・エスピーの検出を試みた。
【００５８】
（１）検体の調製
下記表５に示す箇所から菌叢をＳＣＤ−ＬＰスタンプ培地（日水製薬社製）を用いて採取し、そのまま３０℃で２４時間培養した。
【００５９】
【表５】
【００６０】
（２）ゲノムＤＮＡの調製
培養後のコロニーはサンプリング箇所ごとに複数菌株まとめて白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製PrepMan Ultra（商品名））を用いてゲノムＤＮＡ溶液を調製した。
【００６１】
（３）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレート（前記（２）で調製したゲノムＤＮＡ溶液を無菌蒸留水で１００倍希釈した溶液）１μＬ、TaKaRa EX Taq HS（タカラバイオ社製、商品名）０．１μＬ、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のｄＮＴＰ混合液）１．６μＬ、１０倍濃縮反応用バッファー（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のバッファー）２μＬ、配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．４μＬ、配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）を０．４μＬ、無菌蒸留水を１４．５μＬ混合することで、２０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。
陰性対照（ネガティブコントロール）として滅菌蒸留水をテンプレートの代わりに混合したＰＣＲ反応液も同様に調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ社製）を用いて遺伝子増幅処理を行なった。ＰＣＲ反応条件は、（i）９８℃、１０秒間の熱変性反応、（ii）６８℃、１分間のアニーリングおよび伸長反応を３０サイクル行なった。
【００６２】
（４）アガロースゲル電気泳動
反応液中の目的ＤＮＡ断片の増幅を、アガロースゲル電気泳動およびSYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）による染色により確認した。反応液を２％アガロールゲルにアプライし、ＴＢＡバッファー中、１００ボルトで３０分電気泳動を行った。次いでゲルを取り出し、SYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）溶液中に３０分浸漬して染色後、ＵＶランプ照射の下ポラロイドカメラで撮影した。ＤＮＡ断片の長さは、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流しておくことで、移動度の相対比較によって算出した。
【００６３】
（５）結果
電気泳動の結果を示す写真を図５に示す。
キッチンのシンク、洗面台、シャワー室、便器周り由来の菌叢からゲル上の約３００ｂｐの位置に遺伝子断片が検出され、モラクセラ・エスピーは衣類だけではなく、台所、洗面所、トイレなど様々な住環境に存在することが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タオル、寝具等のサニタリー用品や衣類等の繊維製品（以下、本明細書において、単に「繊維製品」ともいう）は、清潔に保つことで心地よい使用感・着用感が得られる。また、サニタリー用品や衣類等の繊維製品は人体に纏うものであり、タオル、寝具等は人体に直接接触させて使用するものであるため、これらを清潔に保つことは衛生面からも重要である。近年の社会的な衛生志向の高まりに伴い、サニタリー用品や衣類等の繊維製品を清潔に保つことに関する人々の関心は高まっている。
【０００３】
近年、消費者の生活環境への関心の高まりから、身の回りの不快な臭気（本明細書において、「異臭」ともいう）を除去することが以前にも増して望まれている。タオル、寝具等のサニタリー用品、衣料等の繊維製品に付着する臭気は、タバコなどの外的要因の他に、繊維製品の使用を繰り返すことにより生じる、人体由来の内的要因が挙げられる。
下着、タオル及びハンカチを初めとするヒトの皮膚と直接接触するような繊維製品、又は皮脂を含んだ汗や角質などを吸収又は付着する可能性のある繊維製品は、洗濯後、被洗物を洗濯槽内等の湿気の多い場所にしばらく放置した場合、室内干しの場合、雨や汗で濡れた場合、又は乾燥が不十分の場合に、特有の臭いを生ずることがある。この臭いは一般に生乾き臭と呼ばれるものであり、十分な乾燥を行うことで大部分を除去することができる。しかしながら、十分な乾燥を行い、生乾き臭が感じられなくなった繊維製品であっても、汗や雨などで繊維製品が湿気を帯びると雑巾臭様の生乾き臭が生じることがある。繊維製品がこの生乾き臭を一度発生するようになると、洗濯後の十分な乾燥により一時的には生乾き臭を除去できるが、使用時に雑巾臭様の生乾き臭が再発し易くなる。このような再発し易い生乾き臭は、室内干しの場合のみならず、低温乾燥機能を備えた洗濯機又は乾燥機を用いた場合や、室外干し乾燥の場合でさえも湿気を帯びると生じる場合がある。
再発性の生乾き臭の特徴的な点は、洗濯し十分に乾燥した後は発生しない、ないし殆ど低減されるが、湿気を帯びるだけで臭いが発生する点にある。再発性の生乾き臭は、長期間タンスなどに収納した場合に生じ易い。しかしながら、下着、ハンカチ又はタオルなど、ヒトの肌との接触機会が多く、洗浄−使用サイクルの期間の短い使用頻度の多い繊維製品は、一度この生乾き臭が発生するようになると使用中に臭いが再発してくることが多い。さらには、洗濯回数が増えるほど生乾き臭の臭い強度が高まる傾向がある。
【０００４】
この生乾き臭は、繊維製品に特定の微生物が繁殖して不快臭成分を産生することが原因の１つである。したがって、生乾き臭を抑制するためには微生物が繁殖しないように衣類等を清潔に保つことが重要である。
生乾き臭の原因となる微生物の繁殖を効果的に抑制するには、当該微生物を明らかにするとともにその存在箇所や伝播経路を明らかにし、各場面での制御が重要となってくる。これまでは生乾き臭の原因となる微生物はほとんど特定されておらず、また特定された場合においても生乾き臭原因菌の存在を確認するためには寒天培地などを用いた培養法により菌を単離する必要があった。この方法では、生乾き臭原因菌か否かの判定には専門性が必要であり、さらに非常に時間と労力がかかっていた。繊維製品の生乾き臭の発生を効果的に抑制するために、生乾き臭の原因となる微生物の簡便かつ迅速な検出方法を確立することが望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、繊維製品の生乾き臭の原因菌を、簡便、迅速かつ正確に検出するための手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、生乾き臭を発する繊維製品から生乾き臭を産生する微生物としてモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）を単離することに成功した。そして、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列と相同性を有する塩基配列の全部又は一部が含まれているか否かを確認することで、繊維製品の生乾き臭の原因菌を簡便、迅速かつ正確に検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成させたものである。
【０００７】
本発明は、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列で表される核酸、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列で表される核酸の存在を検出する、モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）の検出方法に関する。
【０００８】
また、本発明は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用のオリゴヌクレオチドであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関する。
（ａ）配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【０００９】
また、本発明は、前記（ａ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｂ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｂ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を含むモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用の核酸増幅反応用プライマーセットであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、プライマーセットに関する。
【００１０】
また、本発明は、上記オリゴヌクレオチド又は上記プライマーセットを含む、モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用の検出キットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、繊維製品の生乾き臭の原因菌を、簡便、迅速かつ正確に検出することができる。また、本発明によれば、上記検出に使用できるオリゴヌクレオチド、プライマーセット及び検出キットが提供される。また、本発明によれば、繊維製品が生乾き臭を発生しうることの評価を行うことができる。また、本発明によれば、繊維製品の衛生状態、洗濯状態の評価を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図１−２】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図１−３】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図１−４】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図２】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図３】単離された菌株を試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【図４】生乾き臭を発するタオル４種から抽出したＤＮＡを試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。Ｍは分子量マーカーを表す。
【図５】居住環境から菌叢をサンプリングして培養し、これから抽出したＤＮＡを試料として、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸増幅反応を行い、反応液をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中の番号は表５に記載のサンプリング番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明における「モラクセラ・エスピー」とは、生乾き臭を発するタオル、バスタオル及びＴシャツからサンプリングした菌叢を培養法により解析した結果、すべての菌叢において検出された、いわゆる生乾き臭産生菌である。
モラクセラ・エスピーの分離株であるモラクセラ・エスピー４−１株の１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、モラクセラ・エスピーの分離株であるモラクセラ・エスピー４−４株の塩基配列を配列番号２に示す。モラクセラ・エスピー４−１株及びモラクセラ・エスピー４−４株の塩基配列は、配列番号３に示すモラクセラ・オスロエンシス（Moraxella osloensis）ＡＴＣＣ１９９７６株の１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列と高い同一性（identity）を有し、モラクセラ・オスロエンシスも繊維製品において生乾き臭を産生することが明らかとなっている。したがって、本発明における「モラクセラ・エスピー」は、モラクセラ・オスロエンシスも包含する。
なお、後述の実施例でも示すように、本明細書における「生乾き臭」は、モラクセラ・エスピーが繊維製品中に生存又はそこで増殖して産生される臭い、又は、乾燥によって繊維に囚われていた臭いが繊維製品の湿潤により再び解放され、低閾値であるため感じられ易い臭いである。そして再発性の生乾き臭が、４−メチル３−ヘキセン酸（本明細書において、「４Ｍ３Ｈ」ともいう）を主とする中級分岐脂肪酸臭であることを見出した。
【００１４】
本発明において「モラクセラ・エスピー」とは、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の塩基配列と９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を含む微生物を意味する。本発明の検出方法で検出されるモラクセラ・エスピーは、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列中に、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の１〜５０４位の塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含むことが好ましく、９９％以上の同一性を有する塩基配列を含むことがより好ましい。塩基配列の同一性（％）については、Lipman-Pearson法（Science，227，1435，1985）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００１５】
本発明の検出方法で検出されるモラクセラ・エスピーは、生乾き臭を産生する生乾き臭原因菌であることが好ましく、該生乾き臭成分として４−メチル３−ヘキセン酸（４Ｍ３Ｈ）を産生することがより好ましい。また、本発明の検出方法で検出されるモラクセラ・エスピーは、下記表１に示すモラクセラ・エスピー分離株（４−１株）やモラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６株などのモラクセラ・オスロエンシスの菌学的性質と同一の菌学的性質を有することが好ましい。
【００１６】
【表１】
【００１７】
本発明の検出方法は、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列で表される核酸、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列で表される核酸の存在を検出するものであり、これによりモラクセラ・エスピーを特異的に検出することができる。前記塩基配列で表される核酸の存在を検出する方法としては、シークエンス法、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Loop-Mediated Isothermal Amplification（ＬＡＭＰ）法）等の遺伝子工学的手法が挙げられる。これら方法は通常の方法により行うことができるが、特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用いることで、モラクセラ・エスピーを簡便、迅速かつ正確に検出することができる点から好ましい。
【００１８】
本発明の検出方法に好ましく用いられるオリゴヌクレオチド（以下、本発明のオリゴヌクレオチドと呼ぶことがある。）は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチドであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。
（ａ）配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【００１９】
なお、配列番号４の塩基配列において「１若しくは数個」とは、１〜５個であることが好ましく、１〜４個であることがより好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１〜２個であることがさらに好ましく、１個であることが特に好ましい。配列番号５の塩基配列において「１若しくは数個」とは、１〜４個であることが好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１〜２個であることがさらに好ましく、１個であることが特に好ましい。配列番号６の塩基配列において「１若しくは数個」とは、１〜５個であることが好ましく、１〜４個であることがより好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１〜２個であることがさらに好ましく、１個であることが特に好ましい。配列番号７の塩基配列において「１若しくは数個」とは、１〜６個であることが好ましく、１〜５個であることがより好ましく、１〜４個であることがより好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１〜２個であることがさらに好ましく、１個であることが特に好ましい。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号４〜７のいずれかの塩基配列又は該塩基配列と好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８６％以上、より好ましくは８７％以上、より好ましくは８８％以上、より好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を有するものであってもよい。
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列と、該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列の相補配列の同一性が高い領域（例えば同一性が８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８６％以上、より好ましくは８７％以上、より好ましくは８８％以上、より好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）でハイブリダイズし、同一性が低い領域ではハイブリダイズしない条件を指す。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。このような条件として、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液、より好ましくは３×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液、さらに好ましくは１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にて、６０℃、より好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃で８〜１６時間恒温してハイブリダイズさせる条件が挙げられる。また、上記「ストリンジェントな条件」として、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する温度及び塩濃度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）ペプチド核酸（ＰＮＡ）等やこれらのキメラ核酸の他、ＤＮＡやＲＮＡにおけるホスホジエステル結合の一部又は全部をホスホロチオエート結合等の他の結合に置き換えた核酸が含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、通常の方法で化学合成することができるし、試薬メーカーから購入することもできる。
【００２１】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、シークエンス法、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Loop-Mediated Isothermal Amplification（ＬＡＭＰ）法）等の通常の方法によりモラクセラ・エスピーを検出することができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーション法によりモラクセラ・エスピーを検出する場合、本発明のオリゴヌクレオチドをモラクセラ・エスピーのゲノムＤＮＡを含みうる試料溶液に添加して該ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡと本発明のオリゴヌクレオチドをストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる。モラクセラ・エスピーのゲノムＤＮＡを含みうる試料に特に制限はないが、衣類、タオル類、カーテンやバスマットなどのファブリック類、洗面台や洗濯機およびキッチンシンクなどの住環境設備、土壌や埃など、又はこれらからのＤＮＡ抽出物などが挙げられる。ここで用いる本発明のオリゴヌクレオチドは標識物によって標識されていることが好ましい。該標識物に特に制限はないが、放射性物質、酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分のいずれの部分に標識してもよい。標的ＤＮＡが存在する場合には標識された本発明のオリゴヌクレオチドが該標的ＤＮＡとハイブリダイズするため、該標的ＤＮＡとハイブリダイズした本発明のオリゴヌクレオチドの該標識を検出することで、モラクセラ・エスピーを検出することができる。かかる標識の検出手段としては、例えば本発明のオリゴヌクレオチドが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フイルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。上記ハイブリダイゼーション反応は、試料又は試料中のＤＮＡを固相担体に固定化させた状態で実施することが好ましい。これにより未反応のオリゴヌクレオチドを洗浄により除去することができ、正確な検出が可能になる。
別のハイブリダイゼーション反応の形態として、上記オリゴヌクレオチドを捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、該捕捉プローブと、検出対象である標的核酸の塩基配列のうち該捕捉プローブとは異なる部位で結合する標識核酸プローブとの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、該標的核酸自体を標識して捕捉プローブに捕捉された標的核酸を検出することもできる。
例えば、検出対象となる微生物がモラクセラ・エスピー４−１株又は４−４株である場合において、配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いると、それぞれ配列番号１及び配列番号２の塩基配列で表されるモラクセラ・エスピー４−１株及び４−４株の１６ｓ ｒＤＮＡの１７６〜１９７位の相補配列部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。同様に、配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いると、配列番号１及び配列番号２の１７９〜１９７位の塩基配列の相補配列部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いると、配列番号１及び配列番号２の４２８〜４５２位の塩基配列部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いると、配列番号１及び配列番号２の４５８〜４８５位の塩基配列部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。ここで、ストリンジェントな条件とは上記のストリンジェントな条件と同義である。
【００２３】
核酸増幅法（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等）によりモラクセラ・エスピーを検出する場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼによる複製開始点を提供する核酸増幅反応用プライマー（好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応用プライマー）として使用することができる。核酸増幅法においては標的核酸を増幅するために、通常には、本発明のオリゴヌクレオチドと、本発明のオリゴヌクレオチドとペアとなって標的核酸を増幅するための他のオリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットが必要となる。当該他のオリゴヌクレオチドは通常の方法で設計・作製することができる。この場合において、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡは１６ｓ ｒＤＮＡの断片であることが好ましい。
【００２４】
ＰＣＲ法及びＬＡＭＰ法は、少なくとも下記（i）〜（iii）の工程を含む。
（i）モラクセラ・エスピーを含みうる試料又はそのＤＮＡ抽出物と、ｄＮＴＰと、ＤＮＡポリメラーゼと、本発明のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットとを混合して核酸増幅用反応液を調製する工程、
（ii）上記核酸増幅用反応液を核酸増幅反応に付する工程、
（iii）増幅された核酸を検出する工程。
【００２５】
ＰＣＲ法の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマーを１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０〜６０℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行うことができる。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いれば、標的ＤＮＡを定量することもでき、これにより検出対象である微生物の数を測定することも可能になる。ＰＣＲはサーマルサイクラーを用いて行う。
一方、ＬＡＭＰ法では６０℃付近の等温で増幅反応が進行するのでサーマルサイクラーを要せず、恒温槽で反応を進行させることができる。ＬＡＭＰ法においては４種類のオリゴヌクレオチドプライマーが必要になるが、このようなプライマーの設計は専用のソフトウェアを用いて行うことができる。
【００２６】
核酸増幅反応により増幅したＤＮＡ断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物量を経時的に計測する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。また、本発明において、増幅産物の検出は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、蛍光物質などで標識されたプライマーを用いる方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にエチジウムブロマイドなどのＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法、増幅産物による反応液の濁度を検出する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法が好ましい。
検体にモラクセラ・エスピーが含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、特定のサイズを有するＤＮＡ断片の増幅が認められる。具体的には、検体にモラクセラ・エスピーが含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲ反応を行うと、約３００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。このような操作を行うことにより、検体にモラクセラ・エスピーが含まれているかを確認することができる。
【００２７】
ＰＣＲ法で使用するＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ等の高温耐性のＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。また、ＬＡＭＰ法等の等温増幅反応においてはＡａｃＤＮＡポリメラーゼやＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ等の鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼを用いる。核酸増幅用反応液には試料、プライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ等の他、プライマーと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションや使用するＤＮＡポリメラーゼに適した緩衝液等の他の成分を含ませてもよい。
【００２８】
本発明のモラクセラ・エスピーの検出方法において、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチドを少なくとも１種用いることが好ましく、少なくとも２種のプライマーからなるプライマーセットを用いた核酸増幅反応を行い、前記少なくとも２種のプライマーのうち少なくとも１種のプライマーが前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、前記（ａ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｂ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｂ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を含むプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことがさらに好ましい。
本発明のモラクセラ・エスピーの検出方法において、前記プライマーが増幅しうる標的ＤＮＡはモラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡの連続した部分塩基配列であることが好ましい。ＰＣＲ法において、２種類のプライマー（１種類のプライマー対）からなるプライマーセットでは増幅される該部分塩基配列は１種類であり、３種類以上のプライマー（２種類以上のプライマー対）からなるプライマーセットでは該部分塩基配列は２種類以上となる。また、２種類以上の該部分塩基配列は一部重複していてもよい。２種類以上の該部分塩基配列が一部重複しているケースとしては、１つのプライマーに対して、対になるプライマーが２種類以上含まれる場合が挙げられる。前記プライマーセットを構成する少なくとも２種のプライマーは、ストリンジェントな条件下で１６ｓ ｒＤＮＡの中の標的ＤＮＡにハイブリダイズする。ここで、ストリンジェントな条件は上述の条件と同一である。
【００２９】
本発明のプライマーセットは、前記（ａ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｂ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｂ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を含むモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用の核酸増幅反応用プライマーセットであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。このようなプライマーセットはＰＣＲ法に好適に用いることができる。
【００３０】
本発明の検出キットは、本発明のオリゴヌクレオチド又は本発明のプライマーセットと、ハイブリダイゼーション反応や核酸増幅反応に必要な各種の試薬類が予めパッケージングされた、モラクセラ・エスピー検出するためのキットである。本発明の検出キットには、本発明のオリゴヌクレオチド若しくは本発明のプライマーセット又はこれらの標識物の他、目的に応じて、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）酵素基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ等）等、微生物の遺伝子検出に通常用いられる物質を含有する。本発明の検出キットは、本発明のプライマーセットによって検出反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）等を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしうる塩基配列を含むＤＮＡ断片や、本発明のプライマーセットが増幅しうる塩基配列を含むＤＮＡ断片等が挙げられる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
試験例１ 生乾き臭原因物質の特定
洗濯乾燥の後に生乾き臭が強く発生した木綿のタオルを家庭より回収して５０ｇを裁断し、ジクロロメタン５００ｍＬよりニオイ成分を抽出後減圧濃縮した。さらに、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬを抽出溶液に添加し、水層を回収し、２Ｍ塩酸２００ｍＬ添加し酸性にした。この溶液に、ジクロロメタン２００ｍＬを加え有機層を減圧濃縮し、酸性成分の濃縮物を１ｍＬに定容した。
【００３３】
続いて、アジレント社製ガスクロマトグラフィーにゲステル社製Preparative Fraction Collector（ＰＦＣ）装置を接続したものを用い、濃縮物を下記の条件下でＧＣ保持時間により分画し、目的成分周辺のＧＣ３０回分を内径６ｍｍ、長さ１１７ｍｍのガラス管に充填した充填剤（商品名：TENAX TA、ジーエルサイエンス社製）２００ｍｇに捕集した。
（ＧＣ−ＰＦＣ条件）
ＧＣ：Agilent 6890N（商品名、アジレント社製）
カラム：DB-1（商品名、アジレント社製）、長さ３０ｍ、内径０．５３ｍｍ、膜厚１μｍ
４０℃１ｍｉｎ．hold→６℃／ｍｉｎ．to ６０℃→４℃／ｍｉｎ．to ３００℃
Injection volume：２μＬ
ＰＦＣ(Gerstel社製)：trap time １８ｍｉｎ．to ２４ｍｉｎ.、３０ｔｉｍｅｓ
trap：TENAX TA（商品名、ジーエルサイエンス社製）２００ｍｇ
【００３４】
最後にTENAXに捕集した目的成分をゲステル社製Thermal Desorption system（ＴＤＳ）をアジレント社製ＧＣ−ＭＳに接続した装置にて、下記条件下で分析した。
（ＴＤＳ−ＧＣ−ＭＳ条件）
GC：Agilent 6890N（商品名、アジレント社製）
MS：Agilent 5973（商品名、アジレント社製）
TDS脱着条件：２５０℃、パージ流量５０ｍＬ／ｍｉｎ、パージ時間 ３ｍｉｎ．
カラム：DB-FFAP（商品名、アジレント社製）、長さ３０ｍ、内径２５０μｍ、膜厚０．２５μｍ
４０℃１ｍｉｎ．hold→６℃／ｍｉｎ．to ６０℃→２℃／ｍｉｎ．to ２４０℃
【００３５】
解析の結果、生乾き臭の主原因物質は４Ｍ３Ｈをはじめとする中級分岐脂肪酸であることが明らかとなった。
【００３６】
試験例２ 生乾き臭原因菌の特定
（１）菌株の単離
洗濯乾燥の後に生乾き臭が発生した木綿のタオル又はバスタオルを裁断し、ＬＰ（レシチン・ポリソルベート）希釈液（日本製薬社製）を添加後、攪拌した溶液０．１ｍＬをＳＣＤ−ＬＰ（レシチン・ポリソルベート添加ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト）寒天培地（日本製薬社製）に塗沫し、３５℃、２４時間培養後、得られたコロニーから微生物を単離した。単離された各菌株の同定は１６ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の上流領域約５００ｂｐの塩基配列を決定し、当該塩基配列と基準株との同一性に基づき行なった。塩基配列の同一性は、遺伝子情報処理ソフトウェアＣｌｕｓｔａｌＷを用いて算出した。なおモラクセラ・エスピーに関してはモラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６の塩基配列を決定し、その塩基配列と比較することで同定した。
各タオル又はバスタオルから単離された菌株を表２に示す。
【００３７】
（２）繊維製品での生乾き臭再現試験
上記で単離された各種菌株をそれぞれ生乾き臭が発生した木綿のタオル、あるいは使用後洗濯して保管していた木綿のタオルを滅菌処理したものに接種し、３５℃で２４時間加湿条件下（湿度１００％）で培養後、生乾き臭の発生の有無を下記基準に基づいて、香料評価の訓練を受けた専門評価者（Ｎ＝３）により、合意により判定した。
１：生乾き臭の発生が非常に強い
２：生乾き臭の発生が強い
３：生乾き臭の発生が弱い
４：生乾き臭が全くしない
その結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
（３）結果
表２の結果から、すべての生乾き臭発生タオル・バスタオルから、モラクセラ・エスピーが単離された。また、単離されたモラクセラ・エスピーは、その菌数も多かった。さらに、単離したモラクセラ・エスピーを生乾き臭が発生したタオルを滅菌処理したものに接種したところ、非常に強い生乾き臭が発生することが確認された。
したがって、生乾き臭には本菌種などの特定の微生物が関与していることが明らかとなった。
【００４０】
試験例３ モラクセラ・オスロエンシス ＡＴＣＣ１９９７６（ＡＴＣＣより購入）からの生乾き臭発生の確認
（１）タオルでの不快臭再現試験
モラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６を用いて試験例２と同様の方法で生乾き臭発生の有無を確認した結果、モラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６を接種したタオルから非常に強い生乾き臭が発生することを確認した。
【００４１】
実施例１ モラクセラ・エスピーの検出
（１）検体の調製
下記表３に示す種々の菌株を検体として用意した。
試料番号１の菌株はDSM（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）、試料番号２の菌株はATCC（American Type Culture Collection）、試料番号３の菌株はＮＣＩＭＢ（National Collection of Industrial，Marine and Food Bacteria）、試料番号４〜７に示す菌株はNBRC（NITE Biological Resource Center）からそれぞれ購入した。
また、試料番号８〜２６の菌株は、不快なニオイが発生したタオルからＬＰ希釈液中に抽出された菌株をＳＣＤ−ＬＰ寒天培地で３０℃、４８時間培養後、得られたコロニーを再単離することで単離した。単離された各菌株の同定は、１６ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の中の上流域約５００ｂｐ又は約１５００ｂｐの塩基配列を決定し、該塩基配列の同一性に基づき行った。
【００４２】
また、単離された菌株であるモラクセラ・エスピー４−１株、モラクセラ・エスピー４−４株及びモラクセラ・オスロエンシスの１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を基準として、各菌株の１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の同一性を比較した。ここで、モラクセラ・オスロエンシスの１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は、モラクセラ・オスロエンシスの基準株であるモラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列（配列番号３）を用いた。配列番号３の塩基配列は、モラクセラ・オスロエンシスＡＴＣＣ１９９７６株からゲノムＤＮＡを抽出し、１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を解析することで決定した。塩基配列の同一性は、遺伝子情報処理ソフトウェアClustalW（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いて算出した。なお、モラクセラ・エスピー４−１株は、２０１０年１０月１４日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ-22030として寄託された。
その結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
（２）ゲノムＤＮＡの調製
上記各菌株をＳＣＤ寒天培地に接種して３５℃で２４時間培養後、白金耳を用いて各菌体を寒天培地から回収した。回収した菌体から、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製、PrepMan Ultra Reagent（商品名））を用いてゲノムＤＮＡ溶液を調製した。
【００４５】
（３）プライマーの合成
配列番号４〜７の各々の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成して脱塩により精製し、プライマーとした。
【００４６】
（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレート（前記（２）で調製したゲノムＤＮＡ溶液を無菌蒸留水で１００倍希釈した溶液）１μＬ、TaKaRa EX Taq HS（商品名、タカラバイオ社製）０．１μＬ、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のｄＮＴＰ混合液）１．６μＬ、１０倍濃縮反応用バッファー（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のバッファー）２μＬ、配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．４μＬ、配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．４μＬ、無菌蒸留水１４．５μＬ混合することで、２０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。
陰性対照（ネガティブコントロール）として滅菌蒸留水をＤＮＡテンプレートの代わりに混合したＰＣＲ反応液も同様に調製した。
上記配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせに代えて、配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号６の塩基配列の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ、及び配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせについても同様にＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ社製）を用いて遺伝子増幅処理を行なった。ＰＣＲ反応条件は、（i）９８℃、１０秒間の熱変性反応、（ii）６８℃、１分間のアニーリングおよび伸長反応を３０サイクル行なった。
【００４７】
（５）アガロースゲル電気泳動
反応液中の目的ＤＮＡ断片の増幅を、アガロースゲル電気泳動およびSYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）による染色により確認した。反応液を２％アガロールゲルにアプライし、ＴＢＡバッファー中、１００ボルトで３０分電気泳動を行った。次いでゲルを取り出し、SYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）溶液中に３０分浸漬して染色後、ＵＶランプ照射の下ポラロイドカメラで撮影した。ＤＮＡ断片の長さは、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流しておくことで、移動度の相対比較によって算出した。
【００４８】
（６）結果
配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを組み合わせた場合の電気泳動の写真を図１−１、図１−２、図１−３及び図１−４に示す。なお、図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
また、配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを組み合わせた場合のＰＣＲ反応における遺伝子断片増幅の有無をまとめたものを下記表４に示す。
【００４９】
【表４】
【００５０】
また、配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号６で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを組み合わせた場合の電気泳動の写真を図２に、配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号６で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを組み合わせた場合の電気泳動の写真を図３に示す。なお、図中の番号は表３に記載の試料番号を表し、Ｍは分子量マーカーを表す。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いた場合、モラクセラ・エスピー分離株１１株及びモラクセラ・オスロエンシスでゲル上の約３００ｂｐの位置に目的のＤＮＡ断片が検出された一方、モラクセラ・エスピー以外の１０株ではゲル上の３００ｂｐの位置の付近に目的のＤＮＡ断片は検出されなかった。
以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることで、モラクセラ・エスピーを特異的に検出することができることがわかった。
【００５２】
実施例２ 環境試料からのモラクセラ・エスピーの検出
モラクセラ・エスピーが単離された生乾き臭を発するタオルを試料としてモラクセラ・エスピーの検出を試みた。
【００５３】
（１）検体からのゲノムＤＮＡの調製
生乾き臭発生タオル４種を用意し（それぞれ試料Ｔ１〜Ｔ４と呼ぶ）、これを検体として使用した。タオルを細かく裁断し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製、PrepMan Ultra Reagent（商品名））を用いてゲノムＤＮＡ溶液を調製した。
【００５４】
（２）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレート（前記（１）で調製したゲノムＤＮＡ溶液を無菌蒸留水で１００倍希釈した溶液）５μＬ、TaKaRa EX Taq HS（商品名、タカラバイオ社製）０．１μＬ、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のｄＮＴＰ混合液）１．６μＬ、１０倍濃縮反応用バッファー（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のバッファー）２μＬ、配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．４μＬ、配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．４μＬ、無菌蒸留水１０．５μＬ混合することで、２０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。
陰性対照（ネガティブコントロール）として滅菌蒸留水をＤＮＡテンプレートの代わりに混合したＰＣＲ反応液も同様に調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ社製）を用いて遺伝子増幅処理を行なった。ＰＣＲ反応条件は、（i）９８℃、１０秒間の熱変性反応、（ii）６８℃、１分間のアニーリングおよび伸長反応を４０サイクル行なった。
【００５５】
（３）アガロースゲル電気泳動
反応液中の目的ＤＮＡ断片の増幅を、アガロースゲル電気泳動およびSYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）による染色により確認した。反応液を２％アガロールゲルにアプライし、ＴＢＡバッファー中、１００ボルトで３０分電気泳動を行った。次いでゲルを取り出し、SYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）溶液中に３０分浸漬して染色後、ＵＶランプ照射の下ポラロイドカメラで撮影した。ＤＮＡ断片の長さは、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流しておくことで、移動度の相対比較によって算出した。
【００５６】
（４）結果
電気泳動の結果を示す写真を図４に示す。
モラクセラ・エスピーが単離された生乾き臭を発する４種のタオル（Ｔ１〜Ｔ４）すべてにおいて、ゲル上の約３００ｂｐの位置に増幅されたＤＮＡ断片が検出された。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、様々な菌種の菌株が存在する環境試料からもモラクセラ・エスピーを検出できることがわかった。
【００５７】
実施例３ 居住環境におけるモラクセラ・エスピーの存在の評価
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて住居内からのモラクセラ・エスピーの検出を試みた。
【００５８】
（１）検体の調製
下記表５に示す箇所から菌叢をＳＣＤ−ＬＰスタンプ培地（日水製薬社製）を用いて採取し、そのまま３０℃で２４時間培養した。
【００５９】
【表５】
【００６０】
（２）ゲノムＤＮＡの調製
培養後のコロニーはサンプリング箇所ごとに複数菌株まとめて白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製PrepMan Ultra（商品名））を用いてゲノムＤＮＡ溶液を調製した。
【００６１】
（３）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレート（前記（２）で調製したゲノムＤＮＡ溶液を無菌蒸留水で１００倍希釈した溶液）１μＬ、TaKaRa EX Taq HS（タカラバイオ社製、商品名）０．１μＬ、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のｄＮＴＰ混合液）１．６μＬ、１０倍濃縮反応用バッファー（タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のバッファー）２μＬ、配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．４μＬ、配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）を０．４μＬ、無菌蒸留水を１４．５μＬ混合することで、２０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。
陰性対照（ネガティブコントロール）として滅菌蒸留水をテンプレートの代わりに混合したＰＣＲ反応液も同様に調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ社製）を用いて遺伝子増幅処理を行なった。ＰＣＲ反応条件は、（i）９８℃、１０秒間の熱変性反応、（ii）６８℃、１分間のアニーリングおよび伸長反応を３０サイクル行なった。
【００６２】
（４）アガロースゲル電気泳動
反応液中の目的ＤＮＡ断片の増幅を、アガロースゲル電気泳動およびSYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）による染色により確認した。反応液を２％アガロールゲルにアプライし、ＴＢＡバッファー中、１００ボルトで３０分電気泳動を行った。次いでゲルを取り出し、SYBER safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン社製）溶液中に３０分浸漬して染色後、ＵＶランプ照射の下ポラロイドカメラで撮影した。ＤＮＡ断片の長さは、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流しておくことで、移動度の相対比較によって算出した。
【００６３】
（５）結果
電気泳動の結果を示す写真を図５に示す。
キッチンのシンク、洗面台、シャワー室、便器周り由来の菌叢からゲル上の約３００ｂｐの位置に遺伝子断片が検出され、モラクセラ・エスピーは衣類だけではなく、台所、洗面所、トイレなど様々な住環境に存在することが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列で表される核酸、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列で表される核酸の存在を検出する、モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）の検出方法。
【請求項２】
モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）の１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチドを少なくとも１種用いて前記核酸の存在を検出する、請求項１に記載の検出方法。
（ａ）配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドを核酸増幅反応用プライマーとして用いる、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記核酸増幅反応用プライマーがポリメラーゼ連鎖反応用プライマーである、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
少なくとも２種のプライマーからなるプライマーセットを用いた核酸増幅反応を行い、前記少なくとも２種のプライマーのうち少なくとも１種のプライマーが前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記（ａ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｂ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｂ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を含むプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う、請求項２〜５のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
前記モラクセラ・エスピーが、生乾き臭原因菌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項８】
前記モラクセラ・エスピーが、４−メチル３−ヘキセン酸を産生する微生物である、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用のオリゴヌクレオチドであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１０】
核酸増幅反応用プライマーとして用いられる、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記核酸増幅反応用プライマーがポリメラーゼ連鎖反応用プライマーである、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記モラクセラ・エスピーが、生乾き臭原因菌である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記モラクセラ・エスピーが、４−メチル３−ヘキセン酸を産生する微生物である、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
下記（ａ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｂ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、又は下記（ｂ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を含むモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用の核酸増幅反応用プライマーセットであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、プライマーセット。
（ａ）配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１５】
前記核酸増幅反応用プライマーがポリメラーゼ連鎖反応用プライマーである、請求項１４に記載のプライマーセット。
【請求項１６】
前記モラクセラ・エスピーが、生乾き臭原因菌である、請求項１４又は１５に記載のプライマーセット。
【請求項１７】
前記モラクセラ・エスピーが、４−メチル３−ヘキセン酸を産生する微生物である、請求項１６に記載のプライマーセット。
【請求項１８】
請求項９〜１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用の検出キット。
【請求項１】
配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列で表される核酸、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列で表される核酸の存在を検出する、モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）の検出方法。
【請求項２】
モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）の１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチドを少なくとも１種用いて前記核酸の存在を検出する、請求項１に記載の検出方法。
（ａ）配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドを核酸増幅反応用プライマーとして用いる、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記核酸増幅反応用プライマーがポリメラーゼ連鎖反応用プライマーである、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
少なくとも２種のプライマーからなるプライマーセットを用いた核酸増幅反応を行い、前記少なくとも２種のプライマーのうち少なくとも１種のプライマーが前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記（ａ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、前記（ｂ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、又は前記（ｂ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を含むプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う、請求項２〜５のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
前記モラクセラ・エスピーが、生乾き臭原因菌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項８】
前記モラクセラ・エスピーが、４−メチル３−ヘキセン酸を産生する微生物である、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用のオリゴヌクレオチドであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１０】
核酸増幅反応用プライマーとして用いられる、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記核酸増幅反応用プライマーがポリメラーゼ連鎖反応用プライマーである、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記モラクセラ・エスピーが、生乾き臭原因菌である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記モラクセラ・エスピーが、４−メチル３−ヘキセン酸を産生する微生物である、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
下記（ａ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、下記（ｂ）及び（ｃ）のオリゴヌクレオチド対、又は下記（ｂ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を含むモラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用の核酸増幅反応用プライマーセットであって、モラクセラ・エスピーの１６ｓ ｒＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、プライマーセット。
（ａ）配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号７の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
【請求項１５】
前記核酸増幅反応用プライマーがポリメラーゼ連鎖反応用プライマーである、請求項１４に記載のプライマーセット。
【請求項１６】
前記モラクセラ・エスピーが、生乾き臭原因菌である、請求項１４又は１５に記載のプライマーセット。
【請求項１７】
前記モラクセラ・エスピーが、４−メチル３−ヘキセン酸を産生する微生物である、請求項１６に記載のプライマーセット。
【請求項１８】
請求項９〜１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、モラクセラ・エスピー（Moraxella sp．）検出用の検出キット。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２５４８０７（Ｐ２０１１−２５４８０７Ａ）
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８３０３０（Ｐ２０１１−８３０３０）
【出願日】平成２３年４月４日（２０１１．４．４）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月４日（２０１１．４．４）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]