リラキシンキメラポリペプチドならびにそれらの製造法および使用
リラキシン−３のキメラポリペプチド、そのプレプロポリペプチド、こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに関連する発現ベクターおよび宿主細胞を記述する。該ポリペプチドは、アッセイ方法で使用しうるＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２との受容体−リガンド複合体を調製するのに使用しうる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リラキシン−３のＢ鎖およびリラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖を含んでなる、生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項２】
前記リラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖が、リラキシン−１のＡ鎖、リラキシン−２のＡ鎖、インスリン様３のＡ鎖、インスリン様４のＡ鎖、インスリン様５のＡ鎖およびインスリン様６のＡ鎖よりなる群から選択される、請求項１に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項３】
前記リラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖がインスリン様５のＡ鎖である、請求項２に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項５】
第一のペプチド結合によりリラキシンＣ鎖に結合されたリラキシンＢ鎖（該リラキシンＣ鎖は第二のペプチド結合によりリラキシン／インスリンファミリーメンバーのＡ鎖にさらに結合される）、ならびに、リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドのＡ鎖とＣ鎖の間の第二のペプチド結合およびＣ鎖とＢ鎖の間の第一のペプチド結合から選択される最低１個の位置に挿入されたプロテアーゼ切断部位を含んでなる、リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記Ａ鎖が、リラキシン−１のＡ鎖、リラキシン−２のＡ鎖、インスリン様３のＡ鎖、インスリン様４のＡ鎖、インスリン様５のＡ鎖およびインスリン様６のＡ鎖よりなる群から選択される、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記プロテアーゼ切断部位がＣ鎖およびＡ鎖を結合するペプチド結合に挿入されている、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記プロテアーゼ切断部位がフリン切断部位である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
（ｉ）配列番号７に示されるところのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするその相補物、よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項５に記載のポリヌクレオチドによりコードされるプレプロポリペプチド。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリヌクレオチドによりコードされるプレプロポリペプチド。
【請求項１２】
組換え宿主細胞中での発現に適する発現ベクターであって、前記ベクターが請求項９に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、上記ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１４】
ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含んでなる受容体成分を含んでなる受容体−リガンド複合体であって、前記受容体成分が、請求項１に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチドを含んでなるリガンド成分に結合されている、上記複合体。
【請求項１５】
前記生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチドが、配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有しかつ放射性同位体標識を担持する、請求項１４に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１６】
前記受容体成分が、単離された細胞膜若しくは脂質小胞と会合したＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含んでなる、請求項１５に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１７】
前記受容体成分および前記リガンド成分がそれぞれ実質的に純粋な形態にある、請求項１５に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１８】
受容体成分がＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方を含んでなる、請求項１５に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１９】
（ａ）請求項５に記載の第一の発現ベクター、および挿入されたプロテアーゼ切断部位でリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドを切断するためのプロテアーゼを発現する第二のベクターで宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすること；ならびに
（ｂ）リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドおよびプロテアーゼ双方が発現されるように宿主細胞を増殖させて、それによりプロテアーゼがリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドの前記挿入されたプロテアーゼ切断部位でペプチド結合を切断して成熟リラキシン−３キメラポリペプチドを生じること
を含んでなる、組換え細胞からの成熟リラキシン−３キメラポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
プロテアーゼがフリンであり、かつ、プロテアーゼ切断部位がフリン部位である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２をコードする発現ベクターで形質転換若しくはトランスフェクトした宿主細胞の細胞表面上で受容体成分を発現させること；および該受容体成分をリラキシン−３キメラポリペプチドと複合体形成させることをさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）（ｉ）化合物を含んでなる試験サンプルを、（ｉｉ）最低１種の受容体および請求項１に記載のリラキシン−３キメラポリペプチドを含んでなるアッセイ試薬と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）を実施した後に、最低１種の受容体の生物学的活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で測定した生物学的活性を、化合物を含有しない対照サンプルをアッセイ試薬と接触させることにより得られる対照測定値と比較する段階
を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２よりなる群から選択される最低１種の受容体の生物学的活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項２３】
前記最低１種の受容体がラット由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記最低１種の受容体がヒト由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
生物学的活性を前記測定することが、受容体−リガンド複合体の形成を同定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
リガンド成分が放射標識され、また、受容体−リガンド複合体の形成を前記同定することがオートラジオグラフィーを実施することを含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
生物学的活性を前記測定することが二次メッセンジャー応答を測定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
生物学的活性を前記測定することが、細胞内カルシウムイオン濃度若しくは細胞内ｃＡＭＰ濃度により
二次メッセンジャー応答を測定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記最低１種の受容体が、ＧＰＣＲ１３５宿主細胞若しくはＧＰＣＲ１４２宿主細胞からの単離された細胞膜と会合され、また、該最低１種の受容体の生物学的活性を前記測定することが、３５Ｓ−ＧＴＰγＳ、３３Ｐ−ＧＴＰγＰおよび３２Ｐ−ＧＴＰγＰよりなる群から選択されるγ−リン酸標識ＧＴＰ分子を使用して、単離された膜のタンパク質リン酸化の量を測定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
リラキシン−３キメラポリペプチドが、配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）最低１種の受容体を、試験化合物、および請求項１に記載の標識リラキシン−３キメラポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該最低１種の受容体に結合する該標識リラキシン−３キメラポリペプチドの量を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で得られる量を、該最低１種の受容体を試験化合物の非存在下で該標識リラキシン−３キメラポリペプチドと接触させることにより得られる対照測定値と比較する段階
を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２よりなる群から選択される最低１種の受容体に結合する化合物の同定方法。
【請求項３２】
前記最低１種の受容体がラット由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記最低１種の受容体がヒト由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
標識リラキシン−３キメラポリペプチドが、リラキシン−３のＢ鎖およびリラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖を含んでなり、前記リラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖が、リラキシン−１のＡ鎖、リラキシン−２のＡ鎖、インスリン様３のＡ鎖、インスリン様４のＡ鎖、インスリン様５のＡ鎖およびインスリン様６のＡ鎖よりなる群から選択され、かつ、該標識リラキシン−３キメラポリペプチドが放射標識で標識されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
標識キメラリラキシン−３ポリペプチドが、配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項１】
リラキシン−３のＢ鎖およびリラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖を含んでなる、生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項２】
前記リラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖が、リラキシン−１のＡ鎖、リラキシン−２のＡ鎖、インスリン様３のＡ鎖、インスリン様４のＡ鎖、インスリン様５のＡ鎖およびインスリン様６のＡ鎖よりなる群から選択される、請求項１に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項３】
前記リラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖がインスリン様５のＡ鎖である、請求項２に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項５】
第一のペプチド結合によりリラキシンＣ鎖に結合されたリラキシンＢ鎖（該リラキシンＣ鎖は第二のペプチド結合によりリラキシン／インスリンファミリーメンバーのＡ鎖にさらに結合される）、ならびに、リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドのＡ鎖とＣ鎖の間の第二のペプチド結合およびＣ鎖とＢ鎖の間の第一のペプチド結合から選択される最低１個の位置に挿入されたプロテアーゼ切断部位を含んでなる、リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記Ａ鎖が、リラキシン−１のＡ鎖、リラキシン−２のＡ鎖、インスリン様３のＡ鎖、インスリン様４のＡ鎖、インスリン様５のＡ鎖およびインスリン様６のＡ鎖よりなる群から選択される、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記プロテアーゼ切断部位がＣ鎖およびＡ鎖を結合するペプチド結合に挿入されている、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記プロテアーゼ切断部位がフリン切断部位である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
（ｉ）配列番号７に示されるところのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするその相補物、よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項５に記載のポリヌクレオチドによりコードされるプレプロポリペプチド。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリヌクレオチドによりコードされるプレプロポリペプチド。
【請求項１２】
組換え宿主細胞中での発現に適する発現ベクターであって、前記ベクターが請求項９に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、上記ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１４】
ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含んでなる受容体成分を含んでなる受容体−リガンド複合体であって、前記受容体成分が、請求項１に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチドを含んでなるリガンド成分に結合されている、上記複合体。
【請求項１５】
前記生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチドが、配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有しかつ放射性同位体標識を担持する、請求項１４に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１６】
前記受容体成分が、単離された細胞膜若しくは脂質小胞と会合したＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含んでなる、請求項１５に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１７】
前記受容体成分および前記リガンド成分がそれぞれ実質的に純粋な形態にある、請求項１５に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１８】
受容体成分がＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方を含んでなる、請求項１５に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１９】
（ａ）請求項５に記載の第一の発現ベクター、および挿入されたプロテアーゼ切断部位でリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドを切断するためのプロテアーゼを発現する第二のベクターで宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすること；ならびに
（ｂ）リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドおよびプロテアーゼ双方が発現されるように宿主細胞を増殖させて、それによりプロテアーゼがリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドの前記挿入されたプロテアーゼ切断部位でペプチド結合を切断して成熟リラキシン−３キメラポリペプチドを生じること
を含んでなる、組換え細胞からの成熟リラキシン−３キメラポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
プロテアーゼがフリンであり、かつ、プロテアーゼ切断部位がフリン部位である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２をコードする発現ベクターで形質転換若しくはトランスフェクトした宿主細胞の細胞表面上で受容体成分を発現させること；および該受容体成分をリラキシン−３キメラポリペプチドと複合体形成させることをさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）（ｉ）化合物を含んでなる試験サンプルを、（ｉｉ）最低１種の受容体および請求項１に記載のリラキシン−３キメラポリペプチドを含んでなるアッセイ試薬と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）を実施した後に、最低１種の受容体の生物学的活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で測定した生物学的活性を、化合物を含有しない対照サンプルをアッセイ試薬と接触させることにより得られる対照測定値と比較する段階
を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２よりなる群から選択される最低１種の受容体の生物学的活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項２３】
前記最低１種の受容体がラット由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記最低１種の受容体がヒト由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
生物学的活性を前記測定することが、受容体−リガンド複合体の形成を同定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
リガンド成分が放射標識され、また、受容体−リガンド複合体の形成を前記同定することがオートラジオグラフィーを実施することを含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
生物学的活性を前記測定することが二次メッセンジャー応答を測定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
生物学的活性を前記測定することが、細胞内カルシウムイオン濃度若しくは細胞内ｃＡＭＰ濃度により
二次メッセンジャー応答を測定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記最低１種の受容体が、ＧＰＣＲ１３５宿主細胞若しくはＧＰＣＲ１４２宿主細胞からの単離された細胞膜と会合され、また、該最低１種の受容体の生物学的活性を前記測定することが、３５Ｓ−ＧＴＰγＳ、３３Ｐ−ＧＴＰγＰおよび３２Ｐ−ＧＴＰγＰよりなる群から選択されるγ−リン酸標識ＧＴＰ分子を使用して、単離された膜のタンパク質リン酸化の量を測定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
リラキシン−３キメラポリペプチドが、配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）最低１種の受容体を、試験化合物、および請求項１に記載の標識リラキシン−３キメラポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該最低１種の受容体に結合する該標識リラキシン−３キメラポリペプチドの量を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で得られる量を、該最低１種の受容体を試験化合物の非存在下で該標識リラキシン−３キメラポリペプチドと接触させることにより得られる対照測定値と比較する段階
を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２よりなる群から選択される最低１種の受容体に結合する化合物の同定方法。
【請求項３２】
前記最低１種の受容体がラット由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記最低１種の受容体がヒト由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
標識リラキシン−３キメラポリペプチドが、リラキシン−３のＢ鎖およびリラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖を含んでなり、前記リラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖が、リラキシン−１のＡ鎖、リラキシン−２のＡ鎖、インスリン様３のＡ鎖、インスリン様４のＡ鎖、インスリン様５のＡ鎖およびインスリン様６のＡ鎖よりなる群から選択され、かつ、該標識リラキシン−３キメラポリペプチドが放射標識で標識されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
標識キメラリラキシン−３ポリペプチドが、配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の方法。
【図１Ａ−１Ｄ】
【図２】
【図３Ａ−３Ｄ】
【図４Ａ−４Ｄ】
【図５Ａ−５Ｄ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３Ａ−３Ｄ】
【図４Ａ−４Ｄ】
【図５Ａ−５Ｄ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５１２０９１（Ｐ２００８−５１２０９１Ａ）
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３０１２６（Ｐ２００７−５３０１２６）
【出願日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３０２５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２６３５５
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（３９００３３００８）ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (616)
【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ ＮＡＡＭＬＯＺＥ ＶＥＮＮＯＯＴＳＣＨＡＰ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３０２５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２６３５５
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（３９００３３００８）ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (616)
【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ ＮＡＡＭＬＯＺＥ ＶＥＮＮＯＯＴＳＣＨＡＰ
【Ｆターム（参考）】
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