レチノイン酸関連オーファンレセプターアルファ（ＲＯＲ−アルファ）のリガンド結合ドメインの結晶構造
本発明は、ＲＯＲαの結晶化形態およびその製造方法に関するものである。本発明はまた、ＲＯＲαの三次元モデルおよびＲＯＲαモジュレーターの設計手段を提供する。ＲＯＲαに結合するリガンドもまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、結晶化形態のＲＯＲαおよびその製造方法に関するものである。さらに本発明は、ＲＯＲαの三次元モデルおよびＲＯＲαモジュレーターの設計手段を提供する。
【０００２】
発明の背景
レチノイン酸関連オーファンレセプターα（ＲＯＲα）は、レセプター、たとえばレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）および甲状腺レセプター（ＴＲ）が属する核レセプタータンパク質ファミリーの一オーファン構成員である。核レセプターファミリーの他の構成員と同様、ＲＯＲαは、幾つかのドメイン、中でもＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）から成るモジュラー構造を呈する。後者は、Ｘ線構造が解明されているＴ３Ｒβ（２５％）、ＶＤＲ（２４％）、ＲＡＲα（２４％）、ＰＰＡＲα（２４％）およびＲＸＲα（２０％）のＬＢＤと低い度合の相同性を表す。しかしながら、ＲＯＲαのＬＢＤを結晶化させる試みは現在までのところ失敗に帰しており、ＲＯＲαのＸ線構造は全く入手できなかった。さらに、この点に加えてリガンドも現在までのところ全く同定されていない。レセプターの生理学的役割についての我々の理解は、天然リガンドの発見により大きく増すことになる。さらに、空間的構成が与えられれば、ＲＯＲαのアゴニストおよびアンタゴニストの設計の助けとなる。
【０００３】
発明の要約
一局面において、本発明は、ＲＯＲαの結晶性ＬＢＤを提供する。関連局面では、本発明は、リガンドと結合したＲＯＲαの結晶性ＬＢＤを提供する。別の局面において、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤの空間的構成を表す座標のセットを提供する。関連局面において、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表す１セットの座標を含むＲＯＲαのＬＢＤのモデルを提供する。別の関連局面において、本発明は、薬剤設計に有用な座標のセットを提供する。さらに別の関連局面において、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤに結合する物質の同定方法であって、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表すモデルを準備し、上記モデルと候補物質の相互作用を評価し、そしてＲＯＲαのＬＢＤと相互作用すると予測される物質を選択する方法を提供する。この方法により同定される物質もまた提供される。
【０００４】
さらに別の局面において、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤの結合するＲＯＲαのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定方法であって、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表す原子座標の一つまたはそれ以上のセットによる合理的薬剤設計を実施することにより可能性のある化合物を選択し、可能性のある化合物をＲＯＲαのＬＢＤと接触させ、そしてＲＯＲαのＬＢＤへの化合物の結合を測定することを含む方法を提供する。この方法により同定されるアゴニストおよびアンタゴニストもまた提供される。
【０００５】
別の局面において、本発明は、ＲＯＲαと相互作用する化合物についてのスクリーニング方法であって、ＲＯＲαを候補化合物と接触させ、ステロールの不存在下で候補化合物およびＲＯＲα間の相互作用を測定し、そして化合物がステロールの不存在下でＲＯＲαと相互作用する場合にそれを選択することを含む方法を提供する。好ましいステロール類は、コレステロールまたはコレステロール誘導体である。この方法により同定される化合物もまた提供される。
【０００６】
本発明の別の局面では、コレステロール関連疾患のスクリーニングを目的とするＲＯＲαの使用が提供される。
【０００７】
さらに別の局面において、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤおよびステロール、好ましくはコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む組成物を提供する。好ましい実施態様において、上記組成物は結晶化可能である。
【０００８】
表および図面の簡単な説明
表１：コレステロールとの複合体におけるＲＯＲαのＬＢＤの天然結晶データおよびＸ線データ統計値。
【０００９】
表２：Ｈｇ誘導体結晶データ、Ｘ線データおよび重原子精密化統計値（コレステロールとの複合体について）。
【００１０】
表３：精密化統計値（コレステロールとの複合体について）。
表４：ＲＯＲαへのコレステロールの結合を阻止する突然変異の効果を示す。
【００１１】
表５：ＲＯＲα転写活性に対するフルバスタチンの効果を示す。
表６：ＲＯＲアルファ転写活性に対するコレステロールおよびコレステロール誘導体の効果。
【００１２】
表７：コレステロールサルフェートとの複合体におけるＲＯＲαのＬＢＤの天然結晶データおよび精密化統計値。
【００１３】
表８：コレステロールとの複合体におけるＲＯＲαのＬＢＤの代表的構造についての原子構造座標（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【００１４】
表９：コレステロールサルフェートとの複合体におけるＲＯＲαのＬＢＤの代表的構造についての原子構造座標（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００１５】
図１：ヒトＲＯＲαの配列（スイスプロットＰ３５３９８−１）。
図２は、ＲＯＲα‐ＬＢＤおよびコレステロール間における複合体のＸ線構造表す概略図を示す。
【００１６】
図３は、ＲＯＲα‐ＬＢＤおよびコレステロール間における複合体のズームイン写真を示す（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【００１７】
図４：親和力を増加させ、アンタゴニスト活性を得るためのリガンドの提案（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【００１８】
図５：親和力を増加させるためのコレステロールのさらなる誘導体の提案（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【００１９】
図６は、２５−ＯＨコレステロールおよびコレステロールサルフェートによるコレステロールの置換を示す。
【００２０】
図７は、ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールのＸ線構造のズーム写真を示す（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００２１】
図８：コレステロールサルフェートとＲＯＲ（アルファ）のＬＢＰにより行なわれる相互作用の概観（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００２２】
図９：ＲＯＲ（アルファ）／コレステロール‐サルフェートおよびＲＯＲ（アルファ）／コレステロールのＸ線構造の比較（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００２３】
図１０：ＲＯＲ（アルファ）／コレステロール（左）およびＲＯＲ（アルファ）／コレステロール‐サルフェート（右）のＸ線構造の比較（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００２４】
図１１：結晶化で使用される構築物の配列。二次構造エレメントは配列の下に示されている。コレステロールに対し４オングストロームより近位に非水素原子を有するアミノ酸は、赤色で強調されている（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００２５】
発明の詳細な記載
本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤの結晶を提供する。さらに、本発明は、Ｘ線結晶学による上記結晶の構造測定法を提供する。一実施態様において、結晶の構造は１.８８オングストロームの分解能まで解明されている。驚くべきことに、結晶はＲＯＲαに結合したリガンドを含むことが見出された。リガンドは、コレステ−５−エン−３ベータ−オール（コレステロール）として同定された。すなわち、本発明は、たとえばインシリコ（コンピューター利用）スクリーニング、ドッキングおよび合理的薬剤設計に有用なＲＯＲαのＬＢＤの空間的構成に関する情報だけでなく、リガンド結合に関与するアミノ酸の同定に有用であるＲＯＲαに結合しているリガンドとしてのコレステロールに関する情報も提供する。本発明にしたがって提供される情報は、下記で実例を挙げている通り、ＲＯＲαのＬＢＤに結合する化合物の設計基盤として使用され得る。本発明により提供されるＲＯＲαの結晶ＬＢＤは、いかなる結晶形態でもとり得るが、好ましくは単結晶である。さらに好ましい実施態様において、結晶は、ａ＝５５オングストローム±５オングストローム、ｂ＝５０オングストローム±５オングストローム、ｃ＝６０オングストローム±６オングストロームおよびβ＝９８.５°±９°の大きさを有する単位格子および空間群Ｐ２１を含む。好ましくは、単位格子の大きさは、ａ＝５５.９オングストローム±２オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム±２オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム±２オングストロームおよびβ＝９８.７°±５°またはａ＝５４.４オングストローム±２オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム±２オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム±２オングストローム、β＝９７.８°±５°である。別の好ましい実施態様において、ＲＯＲαの結晶ＬＢＤはヒトに由来する。本発明によるＲＯＲαの結晶ＬＢＤは、好ましくは第二化学物質と会合している。かかる物質は天然または合成化学分子のいずれでもあり得、好ましいのは小分子であり、さらに好ましいのは小親油性分子である。コレステロールは、本発明にしたがって、この結合ポケットへ収まるリガンドとして同定されている。すなわち、特に好ましい実施態様において、かかる物質はコレステロールまたはコレステロール誘導体である。本明細書で使用されている「小分子」の語は、分子量が３０００Ｄａ未満、さらに好ましくは１０００Ｄａ未満、最も好ましくは５００Ｄａ未満である、天然または合成化合物、好ましくは有機分子をいう。本明細書で使用されている「親油性」の語は、主として非極性であり、水に僅かしか溶けない化合物をいう。典型例には、脂肪酸、レチノイン酸、メラトニン、ステロイドホルモン、ビタミンＤ誘導体が含まれ得る。他の例には、タモキシフェンまたはラロキシフェンのような親油性分子が含まれ得る。本発明によると、特に好ましい親油性リガンドは、コレステロールおよびその誘導体である。本明細書で使用されている「コレステロール誘導体」は、コレステロールとの類似性、たとえば同じ全体構造を有するが、置換基が異なるかまたは不飽和結合の位置または立体異性体の差異を伴う分子をいう。上記コレステロール誘導体についての例は、たとえばhttp://www.steraloids.comにおいて見出され得る。
【００２６】
ＲＯＲαのＬＢＤの結晶および所望により第二化学種は、バッチ結晶化法、蒸気拡散法（シッティングドロップ法またはハンギングドロップ法による）および微小透析法を含む若干の技術により育成され得る。結晶のシーディングは、Ｘ線品質の結晶を得ることが必要な場合もある。したがって、結晶の標準ミクロおよび／またはマクロシーディングが使用され得る。初期結晶をハンギングドロップから４℃または室温（約２０℃）で数週間にわたって成長させ得る。次にそれに続いて、初期結晶からのマクロシーディングにより結晶を成長させ得る。一旦本発明の結晶を成長させると、Ｘ線回折データが収集され得る。たとえばＸ線回折データ収集用ＭＡＲイメージングプレート検出装置が使用され得る。慣用的供給源（たとえば密封管または回転式アノード）で発せられたＸ線を用いるかまたはシンクロトロンソースを用いることにより、結晶が特性確認され得る。
【００２７】
特性確認およびデータ収集方法には、歳差運動写真撮影、振動／回転データ収集および回折計データ収集があるが、これらに限定はされない。下記で実例が示されている通り、重原子誘導体は、４ｍＭ酢酸メチル水銀の溶液に１時間結晶を浸すことにより得られる。データ処理および縮小は、ＨＫＬ総合ソフトウェア［OtwinowskiおよびMinor、Meth.Enzymol.２７６：３０７−３２６（１９９７）］のプログラム（ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ）を用いて実施され得る。重原子位置は、プログラム、たとえばＳｎＢ［Weeks,C.M. & Miller,R.（１９９９）J.Appl.Cryst.３２、１２０−１２４］またはＣＣＰ４プログラム総合ソフトウェア［Collaborative Computational Project、ナンバー４、Acta Cryst.Ｄ５３：７６０−７６３（１９９４）］のプログラム（例、ＳＨＥＬＸおよびＲＳＰＳ）を用いて見出され得る。電子密度地図は、ＣＣＰ４プログラム総合ソフトウェア［Collaborative Computational Project、ナンバー４、Acta Cryst.Ｄ５３：７６０−７６３（１９９４）］のプログラム（例、ＭＬＰＨＡＲＥおよびＤＭ）または別法としてＳＨＡＲＰ［La Fortelle,E.D.およびBricogne,G.、Methods in Enzymology ２７６：４７２−４９４（１９９７）］およびＳＯＬＯＭＯＮを用いて計算され得る。分子モデルは、Ｏ［Jones,T.a.et al.、ACTA Crystallogr.Ａ４７：１１０−１１９（１９９１）］を用いてこの地図へ構築され得る。タンパク質についての完全分子モデルは、実験的電子密度地図に基づいて構築され得る。Ｘ−ＰＬＯＲ［Brunger、X-PLOR v.３.１Manual、New Haven : Yale University,(1993)］を用い、またはＣＮＳにより最大尤推定法残差を用いて［Brunger,A.T.etal.、Acta Cryst.Ｄ５４：９０５−９２１（１９９８）］ポジショナルおよびシミュレーション化アニーリング精密化を散在させたモデルビルディングにより、ＲＯＲαのＬＢＤの明白なトレースおよび配列割り当てが行われ得る。
【００２８】
したがって、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表す座標のセットを含む合理的薬剤設計に有用なＲＯＲαのＬＢＤの構造モデルを提供する。すなわち、好ましい実施態様は、表８または９における原子座標の一またはそれ以上のセットを含むＬＢＤ ＲＯＲαの構造を具体的に表すモデルを提供する。他の好ましい実施態様は、コンピューターハードウェアまたは本発明のモデルを含むコンピューターシステムおよび本発明のモデルを含むコンピューター読取可能媒体を提供する。座標のセットは、好ましくはＲＯＲαのＬＢＤの結晶学的解析により決定されるが、利用可能な方法であれば全て、本明細書で開示されているかまたはＲＯＲαのＬＢＤの独立した結晶学的解析から入手されたデータを用いてかかるモデルを構築するのに使用され得る。「構造座標」の語は、タンパク質またはタンパク質‐リガンド複合体の結晶形態の原子（散乱中心）によりＸ線の単色ビームの回折で得られたパターンに関連した数学的等式から誘導されたカーテシアン座標をいう。回折データを用いることにより、結晶の反復単位の電子密度地図が算出される。次いで、電子密度地図を用いて、酵素または酵素複合体の個々の原子の位置を確立する。座標における変動は、構造座標の数学的操作故に生じ得る。たとえば、表８または９に示された構造座標は、構造座標の結晶学的置換、構造座標の分割、構造座標のセットへの整数加算または減算、構造座標の反転または上記の組合せにより操作され得る。別法として、アミノ酸の突然変異、付加、置換および／または欠失、または結晶を構成している成分のいずれかにおける他の変化に起因した結晶構造における修飾もまた、構造座標における変動を説明するものであり得る。上記変動が、元の座標と比べて許容される標準誤差内に含まれる場合、生じた三次元形状は同じであると見なされる。したがって、分子または分子複合体またはその一部分が、同じと見なされるほどＲＯＲαのＬＢＤの構造の全部または一部と十分に類似しているか否かを決定するのには、様々なコンピューター解析が必要である。上記解析は、現行のソフトウエアアプリケーション、たとえばＱＵＡＮＴＡ(Molecular Simulations Inc., San Diego, Calif.)バージョン４.１のMolecular Similarity（分子類似性）アプリケーションで、添付のユーザーズガイドの説明にしたがって実施され得る。本発明の目的とするところでは、表８または９に列挙された構造座標により記された関連性のあるバックボーン原子に重ね合わせたとき、１.５オングストローム未満の保存残基バックボーン原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ）の二乗平均偏差を有する分子または分子複合体であれば同一であると考えられる。さらに好ましくは、二乗平均偏差は１.０オングストローム未満である。「二乗平均偏差」の語は、平均からの偏差の平方の相加平均の平方根を意味する。それは、傾向または対象からの偏差または変動を表す一方法である。本発明の目的の場合、「二乗平均偏差」は、本明細書に記載されている構造座標により定義されたところによるとＲＯＲαのＬＢＤのバックボーンの関連性のある部分からのタンパク質またはタンパク質リガンド複合体のバックボーンにおける変動を定義する。
【００２９】
ある種の実施態様において、データセットは、限定無しで、ＲＯＲαのＬＢＤの結合ポケットを含む、ＲＯＲαのＬＢＤの構造の一部分を具体的に表す。本明細書で使用されている「結合ポケット」の語は、その形状の結果として、別の化学物質または化合物と好都合に会合する分子または分子複合体の一領域をいう。本発明によると、好ましい結合ポケットは、図３、４、５、７、８、９または１０に示されたアミノ酸、すなわち以下のアミノ酸：Ｃｙｓ３２１、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ｌｅｕ３２８、Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ３５６、Ａｌａ３５７、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｇｌｕ３６２、Ａｌａ３６３、Ｖａｌ３９７、Ｐｈｅ３９８、Ａｒｇ４００、Ｍｅｔ４０１、Ａｒｇ４０３、Ａｌａ４０４、Ｖａｌ４１２、Ｔｙｒ４１３、Ｐｈｅ４１４、Ｐｈｅ４２４、Ｌｅｕ４２７、Ｃｙｓ４２９、Ｐｈｅ４３２、Ｉｌｅ４３３、Ｖａｌ４３６、Ｈｉｓ５１７、Ｌｙｓ５２０およびＴｙｒ５４０（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｐ３５３９８−１による番号付け）の１個またはそれ以上を含む。
【００３０】
本発明の一実施態様において、モデルは、ＲＯＲαのＬＢＤと相互作用する物質を同定するのに使用され得る。一般に、本発明による分子類似性アプリケーションは、異なる構造、同じ構造の異なる立体配座、および同じ構造の異なる部分間における比較を可能にする。ドッキングプログラム、たとえばＧＲＡＭ、ＤＯＣＫまたはＡＵＴＯＤＯＣＫを用いたコンピューターモデリングの使用を通して、潜在的相互作用性物質を調べる［Dunbrack et al.、Folding & Design、２：２７−４２（１９９７）］。この手順は、ＲＯＲαのＬＢＤへの潜在的リガンドのコンピューターフィッティング（当てはめ）を含むもので、たとえば潜在的リガンドの形状および化学構造が如何にうまく本発明により提供される結合ポケットと補完し合うかを確認し得る。コンピュータープログラムはまた、ＲＯＲαのＬＢＤへのリガンドの誘引、反発および立体障害を評価するのにも使用され得る。一般的に、適合度が堅固である（例、立体障害性が低い、および／または引力が大きい）と、これらの特性は堅固な結合定数と一致することから、潜在的薬剤は強力なものとなる。さらに、可能性のある薬剤の設計における特異性が高いと、薬剤がＲＯＲαタンパク質または他のタンパク質（特に核に存在するタンパク質）の他の特性に干渉する見込みは低くなる。これにより、他のタンパク質との望ましくない相互作用に起因して起こり得る副作用は最小限となる。最初に可能性のある相互作用性物質は、化学ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。次いで、この方法で選択されたリガンドを、１個またはそれ以上の有望な潜在的リガンドが同定されるまでコンピューターモデリングプログラムにより系統的に修飾し得る。別法として、ＲＯＲαの既知リガンド、たとえば本発明により同定されたコレステロールは、系統的修飾についての出発点として使用され得る。上記コンピューターモデリングにより、実施可能であり、そのうちのいずれかは有用な薬剤となり得る無数の本質的に無作為な化学修飾とは反対に、有限数の合理的化学修飾の選択が可能となる。各化学的修飾は追加の化学工程を必要とし、それらは有限数の化合物の合成については妥当なものであるが、可能な修飾が全て合成される必要がある場合直ちに収拾がつかなくなる。すなわち、本明細書で開示されている三次元構造の使用およびコンピューターモデリングを通して、多数のこれら化合物がコンピューターモニタースクリーン上で迅速にスクリーニングされ得、莫大な数の化合物の労力を要する合成を行わずとも数少ない見込みのある候補が決定され得る。
【００３１】
したがって、ＲＯＲαのＬＢＤに結合する物質の同定方法が提供される。上記方法は、典型的には、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表すモデルを準備し、候補物質と上記モデルとの相互作用を評価し、ＲＯＲαのＬＢＤと相互作用すると予測される物質を選択し、そして所望により、ＲＯＲαのＬＢＤと選択された物質を接触させる工程を含む。好ましい実施態様において、かかる方法では、本明細書においてたとえば図３、４、５、７、８、９または１０で開示されている通り、候補化合物の３−Ｄ構造を、表８または９に示された３−Ｄ分子モデルまたは好ましい結合ポケットの一部であるかまたは直接または間接的にリガンドの結合に関与するアミノ酸の座標と比較する。好ましくは、上記アミノ酸は、候補化合物における水素結合性官能基と（直接または水分子を介して）水素結合を形成し得るか、または好都合なｖｄＷ−相互作用を形成し得る。相互作用は、好ましくはコンピューター支援による方法、たとえば、ＲＯＲαのＬＢＤの原子間における原子間距離が容易に引き出され、異なる候補化合物の水素結合性官能基および３Ｄ分子モデルにおいて結合ポケットを形成するアミノ酸の水素結合原子間の距離（またはｖｄＷ−相互作用形成基間の距離）を比較することにより、２構造間における最適水素結合およびｖｄＷ−相互作用に基づいて、理論的にＲＯＲαのＬＢＤの３−Ｄ分子モデルポケットと最も安定した複合体を形成する候補化合物が同定され得るように、上記構造座標データをデータ構造に入力するデータ処理法により評価される。
【００３２】
好ましい実施態様において、物質は、ｖｄＷ−相互作用または水素結合相互作用により直接的または間接的に（例、水分子を介して）図３、４、５、７、８、９または１０に示されているかまたはＣｙｓ３２１、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ｌｅｕ３２８、Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ３５６、Ａｌａ３５７、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｇｌｕ３６２、Ａｌａ３６３、Ｖａｌ３９７、Ｐｈｅ３９８、Ａｒｇ４００、Ｍｅｔ４０１、Ａｒｇ４０３、Ａｌａ４０４、Ｖａｌ４１２、Ｔｙｒ４１３、Ｐｈｅ４１４、Ｐｈｅ４２４、Ｌｅｕ４２７、Ｃｙｓ４２９、Ｐｈｅ４３２、Ｉｌｅ４３３、Ｖａｌ４３６、Ｈｉｓ５１７、Ｌｙｓ５２０およびＴｙｒ５４０、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ａｒｇ４００、Ａｒｇ４０３から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸の原子と相互作用するように設計される。さらに好ましい実施態様において、物質は、ｖｄＷ−相互作用または水素結合相互作用により直接的または間接的（例、水分子を介して）にＧｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ａｒｇ４００、Ａｒｇ４０３またはＴｒｐ３５３、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ａｌａ３６３、Ｍｅｔ４０１、Ｐｈｅ４１４、Ｌｅｕ４２７、Ｐｈｅ４３２、Ｖａｌ４３６から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸の原子と相互作用する。上記方法を用いて同定される物質もまた提供される。好ましい物質は小分子であり、さらに好ましいのは小親油性分子（極性基をもつと思われる）であり、特に好ましいのはコレステロールまたはコレステロール誘導体、たとえばコレステロールサルフェートである。さらに好ましい実施態様において、ＲＯＲαへの物質の結合定数は、少なくとも１μＭ、好ましくは少なくとも１００ｎＭ、さらに好ましくは少なくとも１０ｎＭである。
【００３３】
さらに、ＲＯＲαのアゴニストおよびアンタゴニストが提供される。一実施態様では、ＲＯＲαのアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法が提供される。上記方法では、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表す原子座標の一またはそれ以上のセットで合理的な薬剤設計を実施することにより潜在的アゴニストまたはアンタゴニスト化合物を選択し、可能性のある化合物をＲＯＲαのＬＢＤと接触させ、ＲＯＲαの生物活性を測定する。選択は、典型的にはコンピューターモデリングと連係的に為される。可能性のある化合物は、それがＲＯＲαの生物活性を高める場合アゴニストとして、またはそれがＲＯＲαの生物活性を減じる場合アンタゴニストとして同定される。上記方法により同定されるアゴニストおよびアンタゴニストもまた提供される。アゴニストまたはアンタゴニストは、ＲＯＲαの天然リガンドにより用いられる結合ポケットに結合する必要は無いが、また別の位置で結合し、アロステリック的にその効果を発揮し得る。本発明によるアゴニストの好ましい具体例は、アゴニスト位置、すなわちＨ１２がＨ３−Ｈ４領域と一緒になって、補助活性化因子に関して適切な相互作用表面、すなわち完全ＡＦ−２を形成する位置にあるらせん１２（Ｈ１２）を安定させる化合物である（たとえば、Renaud & Moras、Cell.Mol.Life Sci.、５７、１７４８−１７６９、２０００で概説）。本発明によるアンタゴニストの好ましい具体例は、たとえばＨ１２の位置を傾けることによりＨ１２のアゴニスト位置を脱安定化する化合物である（たとえばRenaud & Moras、２０００、前出で概説）。Ｈ１２の脱安定化は、たとえば２６位に巨大置換基をもつコレステロール誘導体により、すなわちＴｙｒ５４０および／またはＨｉｓ５１７を置換することにより達成され得る。好ましい実施態様において、上記アゴニストまたはアンタゴニストは小分子である。特に好ましいのは、親油性小分子である。限定するわけではないが、例としては、たとえば脂肪酸、レチノイン酸、メラトニン、ステロイドホルモン、ビタミンＤ誘導体、ならびにタモキシフェンまたはラロキシフェンと類似した化合物またはその誘導体がある。一実施態様において、上記アゴニストまたはアンタゴニストは、コレステロールまたはコレステロール誘導体であり得る。本発明の好ましい実施態様において、コレステロールリガンドは、本発明により提供された構造情報を用いることにより、本発明により提供されるＲＯＲαのＬＢＤのリガンド結合ポケット（ＬＢＰ）により強く結合するコレステロール誘導体へ修飾されている。本発明により提供される構造情報を用いて設計されたより強く競合的に結合するコレステロール誘導体についての一例は、コレステロールサルフェートである（下記参照）。別の好ましい実施態様において、本発明は、アゴニスト位置にあるＲＯＲαのＨ１２を安定化させる化合物の治療有効量および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。関連実施態様において、本発明は、アゴニスト位置にあるＲＯＲαのＨ１２を脱安定化する化合物の治療有効量および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
一旦潜在的結合性物質、たとえばアゴニストまたはアンタゴニストが同定されると、それは化学物質のライブラリーから選択され得るかまたは別法として潜在的リガンドが新たに合成され得る。特異的化合物の１個または比較的小さい基でもその新たな合成は、薬剤設計技術において妥当である。見込みのある薬剤を標準結合検定法にかけることにより、特定ＲＯＲα機能、たとえば下記で例証されているＲＯＲαのＤＮＡ結合に対するその効果が試験され得る。適切な薬剤が同定されると、たとえばＲＯＲαのＬＢＤの結合ポケットおよび薬剤間に形成されたタンパク質‐リガンド複合体を含む補足的結晶を成長させ得る。好ましくは、結晶がＸ線を有効に回折することにより、タンパク質‐リガンド複合体の原子座標が５.０オングストロームより大きい、さらに好ましくは３.０オングストロームより大きいかまたは２.０オングストロームより大きい分解能まで測定され得る。補足的結晶の三次元構造は、分子置換分析により測定され得る。分子置換では、検索モデルとして既知三次元構造を用いることにより、新たな結晶形態の密接に関連した分子またはタンパク質‐リガンド複合体の構造を測定し得る。新たな結晶の測定されたＸ線回折特性を、検索モデル構造と比較して、新たな結晶におけるタンパク質の位置および配向をコンピューターで計算する。使用され得るコンピュータープログラムには、ＣＣＰ４プログラム総合ソフトウェア［Collaborative Computational Project、ナンバー４、Acta Cryst.Ｄ５３：７６０−７６３（１９９４）］のプログラム（ＡＭＯＲＥ、ＭＯＬＲＥＰ）またはＸ−ＰＬＯＲ［Brunger、X-PLOR v3.1 Manual、New Haven : Yale University,(1993)］がある。一旦位置および配向が判明すると、検索モデルを用いて電子密度地図を算出することにより、Ｘ線位相が提供され得る。その後、電子密度を構造差異について調べ、検索モデルを修正して新たな構造と同様にする。この方法を用いると、請求された構造を用いることによりＲＯＲα複合体のいずれかの上記ＬＢＤの三次元構造を解明することが可能である。本明細書に記載されている薬剤スクリーニング検定法の全てについて、薬剤の構造に対するさらなる精密化が一般的には必要であり、特定薬剤スクリーニング検定法により提供される工程のいずれかおよび／または全部の連続反復により為され得る。
【００３５】
合理的設計により同定された物質は、薬剤スクリーニング検定法でさらに分析され得る。本発明の薬剤スクリーニング検定法は、ＲＯＲαのリン酸化を増すことにより、ＲＯＲαを二量体化または別の核レセプターとヘテロ二量体化させることにより、補助活性化因子と相互作用するその能力を改良することにより、その立体配座を変えることにより、そしてそのＤＮＡ結合能力を高めることにより、リガンド結合後のＲＯＲαが遺伝子の転写調節を行う能力に関するものを含む、ＲＯＲαの官能性を測定するための若干の検定法のいずれかを使用し得る。一結合検定法では、ＲＯＲα結合部位を含む核酸を、コーティングまたは固体支持体上に置く。好ましい結合部位は、ハーフサイトＡＧＧＴＣＡの直前にある６ｂｐの高ＡＴモチーフにより構成される応答エレメント（ＲＯＲＥ）およびGiguere et al.、１９９４、Genes & Development ８：５３８−５５３、Mc Broom et al.、１９９５、Mol.Cel.Biol.１５：７９６−８０８、Moraitis & Giguere、１９９９；Molecular Endocrinology.１３：４３１−４３９で与えられているこの応答エレメントの可能な変異型である。核酸を固体支持体上に置く方法は、当業界ではよく知られており、核酸へのビオチン結合および固体支持体へのアビジンの結合を含む。ＲＯＲαを核酸と平衡状態にし、薬剤が結合を破壊するか促進するかを見るためにそれらを試験する。
【００３６】
別の検定法において、補助活性化因子タンパク質、たとえばＧＲＩＰまたはＤＲＩＰ２０５（Brandon‐Atkins et al.、１９９９、Molecular Endocrinology １３：１５５０−１５５７）、またはＳＲＣ１、ＮｃｏＡ−１、ＥＲＡＰ／Ｐ１６０、ＳＲＣ２／ＮｃｏＡ−２、ＡＣＴＲ、ＳＲＣ−３、ｐＣＩＰ、ＥＲＡＰ−１４０、ＲＩＰ１４０、ＲＩＰ１６０Ｐ／Ｃａｆ、ＣＢＰ／Ｐ）、ＡＲＡ７０、Ａｄａ３、Ｒａｐ４６、ＧＲＩＰ１７０、ＴＲＩＰ１、ＰＧＣ１および２、ＳＰＴ６、ＴＩＦα、ＳＷ１／ＳＮＵＥＲＦ、ＴＲＡＰ１００、ＴＲＡＰ２２０、ＤＲＩＰ、ＮＳＤ１（Robyr et al.、２０００、Mol.Endo.１４：３２９−３４７）を、コーティングまたは固体支持体上に置く。ＲＯＲαタンパク質は標識され得る。たとえば、一実施態様では、放射性標識ＲＯＲαタンパク質を用いて、結合に対する薬剤の効果を測定する。別の実施態様では、ＲＯＲαタンパク質の天然紫外線吸収を使用する。さらに別の実施態様では、補助活性化因子ペプチドでコーティングしたバイアコアチップ（ファルマシア）を使用し、表面伝導性の変化を測定し得る。さらに別の実施態様では、ＲＯＲαおよびそれらのＤＮＡ結合部位間の相互作用に対する有望薬剤（候補化合物）の効果を、活性化ＲＯＲαタンパク質を含むかまたは含むように誘導され得る生きている細胞において検定する。リポーター遺伝子、たとえばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは３−ガラクトシダーゼなどについての異種遺伝子を含む細胞を、ＲＯＲα結合部位を含むプロモーターに機能し得るように結合する。次いで、有望薬剤を細胞と接触させる。有望薬剤の不存在および存在下で生成されるリポーターの量（および／または活性）を測定し、比較する。生成されるリポーターの量（および／または活性）を減らす有望薬剤は、ＲＯＲα ＤＮＡ結合の候補アンタゴニストであり、生成されるリポーターの量（および／または活性）を増やす有望薬剤はＲＯＲα ＤＮＡ結合の候補アゴニストである。リポーター遺伝子産物の検出方法は文献で容易に入手できる。たとえば、ルシフェラーゼ検定法は、製造業者のプロトコール（プロメガ）にしたがって実施され得、ベータ‐ガラクトシダーゼ検定法は、Ausubel et al.により報告された要領［Current Protocols in Molecular Biology中、J. Wiley & Sons, Inc. (1994)］で実施され得る。一例において、トランスフェクション反応は、ＲＯＲαタンパク質を含むように修飾されたプラスミドによる細胞のトランスフェクションを含み得る。
【００３７】
一実施態様において、本発明方法により同定される有望薬剤は、当業界で公知の検定法を用いることにより薬理学的活性について試験され得る。たとえば、同定された有望薬剤は、国際公開第０１／２６７３７号で開示された方法を用いて過度の骨または軟骨喪失を伴う疾患または医学的状態の予防または処置について可能性のある薬剤としての活性について試験され得る。たとえば、リポーター検定法は、骨鉱化作用および再造形作用の既知モジュレーターである、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）またはオステオカルシン（ＯＣ）を用いて実施され得る。ＢＳＰまたはＯＣプロモーターがリポーター遺伝子、たとえばホタルルシフェラーゼ遺伝子を駆動するリポーター構築物により適切な細胞をトランスフェクションし得る。次いで、有望薬剤を細胞と接触させる。有望薬剤の不存在および存在下で生成されるルシフェラーゼ活性の量を測定し、比較する。別の実施態様において、本発明による有望薬剤の試験システムは、古典的卵巣切除ラットモデルの使用であり得、卵巣機能の喪失により、循環しているエストロゲンの低下が誘導され、直ちに骨量が減少する（Wronski et al.、Calcified Tissue International. ４５（６）：３６０、１９８９）。卵巣切除術の１２週間後に開始して８週間の治療処置期間中、薬剤を卵巣切除動物で試験し、骨鉱質密度をモニターする。８週間無傷の動物の予防的処置である別タイプの実験も予測され得る。
【００３８】
コレステロールは、ＲＯＲαのリガンドであることが見出された。この発見により、本発明は、ＲＯＲαに結合する化合物を同定する、特にＲＯＲα活性を調節する化合物を同定するための新規検定方法を提供し、それらの方法では、候補化合物およびＲＯＲα間の相互作用をコレステロール低減化、好ましくはコレステロール不含有環境で行わせる。かかる方法は、典型的には、（ａ）ＲＯＲαを候補化合物と接触させ、（ｂ）本質的にコレステロール不含有環境で候補化合物およびＲＯＲα間の相互作用を測定し、そして（ｃ）化合物がＲＯＲαと相互作用する場合にはそれを選択するという段階を含む。必要条件ではないが、コレステロール低減化、または好ましくは本質的コレステロール不含有環境で全方法‐段階を実施するのが好ましい。さらに好ましい実施態様において、かかる方法は真核生物細胞系に関するものである。さらに別のさらに好ましい実施態様では昆虫細胞を使用する。昆虫細胞は、新たなステロール合成能を欠くことにより真核生物細胞とは異なる。これらの細胞は、コレステロール不含有条件下で増殖され得ることが示されている（Cleverley et al.１９９７、Exp.Cell Res.２３３：２８８−２９６）。すなわち、かかる細胞系は、たとえば、適切な昆虫細胞ベクターでクローン化されたＲＯＲαおよび古典的リポーターＲＯＲＥｔｋｌｕｃを用いてＲＯＲαリガンドの活性をモニターするのに適切な細胞バックグラウンドを提供し得る。別の実施態様では、真核生物細胞、好ましくはヒト細胞を使用する。これらの細胞は、たとえば、本質的にコレステロール不含有の培地および本質的にＬＤＬ‐コレステロール不含有の血清（ＬＤＬ−不含有血清の調製物は、Goldstein et al、１９８３、Methods in Enzymology ９８：２４１−２６０に記載されている）中で培養され得る。哺乳類細胞は、コレステロールを内因的に生産することができる。本発明による本質的コレステロール不含有環境の意味は、内因的に生産された上記コレステロールを含まない。一実施態様において、内因的コレステロール生産性哺乳類細胞は、たとえば化合物の内因性コレステロール置換能力をスクリーニングする検定法で使用され得る。
【００３９】
核レセプターは、リガンド結合時に特異的遺伝子または遺伝子のセットの転写を調節することが知られており、そのため治療薬として有用な化合物についてスクリーニングするための興味深い標的とされている。しかしながら、これまでのところ、治療薬の開発に役立ち得るＲＯＲαの分子機構について理解を深めることは、ＲＯＲαのＬＢＤと結合するリガンドの情報を欠くことにより厳しく阻まれてきた。本発明によるレセプターＲＯＲαのリガンドとしてのコレステロールの同定により、ＲＯＲαの生理学的役割が新たに看破され、コレステロール関連疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαが提供されている。コレステロール生合成における欠損は、脳損傷、骨格欠損、骨硬化を伴う場合もあり、四肢発育不全または脊椎形成不全を含む様々な臨床的特徴に至らしめることが示されている（Nwokoro et al.、Mol Genet Metab ７４：１−２ １０５−１９ ２００１）。すなわち、コレステロール関連疾患は、内分泌疾患、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患、代謝性疾患、たとえば肥満、炎症性疾患、皮膚病、ＣＮＳ関連疾患、たとえばアルツハイマー病および細胞増殖およびアポトーシスにおける疾患、たとえば腫瘍関連疾患を含み得る。
【００４０】
一実施態様において、本発明は、内分泌疾患、特にステロイドホルモンの合成またはステロイド生成の調節に関連した疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。全ステロイド生成組織においては、合成されるホルモンとは関係無く、ステロイド生成細胞における初段階は、コレステロールから第一ステロイド、プレグネノロンへの変換である（Stocco、Ann Rev Physiol ６３：１９３−２１３、２００１）。
【００４１】
別の実施態様において、本発明は、コレステロールホメオスタシスの障害の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。コレステロールホメオスタシスの崩壊は病的状態を誘発し、最もよく起こるのはアテローム性動脈硬化症である。高コレステロール血症は、よく知られた危険因子である。スタチンを用いることにより、本発明は、ＲＯＲαの活性および強力な抗アテローム性動脈硬化性分子間の直接関連を示すことから（表５）、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患を抑える化合物を検索するための分子標的としてのＲＯＲαの有用性を立証している。
【００４２】
別の実施態様において、本発明は、代謝性疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。Ｃ／ＥＢＰおよびＰＰＡＲγが重要な役割を演じている事象のカスケードが脂質生成を開始させることは知られている。さらに、ＲＯＲαは、ＰＰＡＲγを強く誘導することができる（Sundvold et al.Biochem.Biophys.Res.Com.２８７：３８３−３９０、２００１）。ＳＲＥＢＰは脂質生成プログラムを促進し、ＳＲＥＢＰ活性は細胞内コレステロールのレベルに敏感である（Brown et al. Cell ８９：３３１−３４０、１９９７）。すなわち、本発明によると、ＲＯＲαは、２型糖尿病をまねき得る脂質生成、肥満の進展およびインスリン抵抗性に関連した疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的として提供される。さらに、成熟脂肪細胞は、免疫学的応答、血管疾患および食欲調節においてある一定の役割を演じる因子を分泌する。脂肪細胞由来因子には、レプチン、プロスタグランジン類およびレシスチンがある。すなわちＲＯＲαのリガンドとしてコレステロールを提供する本発明は、免疫応答、血管疾患および食欲調節に関連した疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。
【００４３】
最近、間葉幹細胞はこれら３系統に分化する潜在能力を有することが示された（Pittenger et al.、１９９９ Science ２８４：１４３−１４７）。すなわち、見かけ上の相互関係は、脂肪細胞および骨芽細胞表現型間に存在すると仮定される。この均衡は、骨粗そう症患者における脂肪細胞に向かってスイッチされる。本発明は、脂質生成経路または脂肪細胞、軟骨細胞または骨芽細胞系統への間葉幹細胞の分化における重要なプレーヤーとしてのＲＯＲα（ＰＰＡＲγまたはＣ／ＥＢＰとして）を提供する。すなわち、本発明は、脂質生成に向かうこのスイッチにおいてＲＯＲαを連結するため、骨粗しょう症における治療介入についての可能性のある標的である。
【００４４】
別の実施態様において、本発明は、炎症性疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。分子リンクは、コレステロールおよびサイトカイン間で確立されており、アテローム発生における炎症および免疫性の掛かり合いを示している。さらに、ＲＯＲαは炎症に関与している（国際公開第０１／２６７３７号、Bourdji et al. J.Biol.Chem. ２７５：１２２４３−１２２５０、２０００、Delerive et al.、EMBO reports ２１：４２−４８、２００１）。
【００４５】
別の実施態様において、本発明は、皮膚病の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。ＲＯＲαは皮膚で高度発現される（Becker‐Andre、１９９３、Biochem.Biophys.Res.Commun. １９４：１３７１−１３７９）。さらに、コレステロール生合成の遺伝的障害をもつ患者の臨床観察は、羞明および円形脱毛ならびに小胞皮膚萎縮症を報告している。
【００４６】
別の実施態様において、本発明は、アルツハイマー病の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。リポタンパク質対立遺伝子ＡｐｏＥ４は、アルツハイマー病の発病増加と関連している（Trittmatter et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA９０：１９７７−１９８１、１９９３）。海馬ニューロンにおける原形質膜コレステロールの枯渇により、Ａｂｅｔａ（アミロイドベータタンパク質、Simons et al. PNAS ９５：６４６０−６４６４、１９９８）、アミロイド前駆タンパク質の開裂産物、すなわち上記疾患の病因における主要因子の形成が阻害される。さらに、ＲＯＲαノックアウトマウスの主たる特徴は重い運動失調であり、それらの小脳は著しく萎縮している。これは、運動障害に陥りやすい稀な遺伝病に関与している。
【００４７】
実施例
（Ｈｉｓ）6ＲＯＲα-ＬＢＤ３０４-５５６のクローニングおよび発現
ＡＴＧコドンまでのポリヘドリン（多角体タンパク質）プロモーターの一部をコード化するＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＲＳ３６５（5’-ACCATCTCGCAAATAAATAAG-3’）およびＭＧ３８４（5’-ATGATGATGATGATGATGGC-TGCTGCCCATGGTGGGAACTCGAGGCCTGCAGGG-3’）を用いることによりｐＢＡＫＰａｃ８プラスミド（クロンテック）からのＰＣＲにより増幅する。ＭＧ３８４は、鋳型ＤＮＡには存在しないが、ＡＴＧコドンの正面にあるコザック配列をコード化する５'伸長部分および最終遺伝子操作ベクターに存在するＨｉｓ標識の一部を有する。第二ＰＣＲ反応は、ＲＯＲαタンパク質のリガンド結合ドメイン（ａａ３０４−ａａ５５６；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｐ３５３９８−１による番号付け）をコード化するプラスミド鋳型でのオリゴヌクレオチドＭＧ３８３（5’-GCCATCATCATCATCATC-ATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGCAGAATTAGAACACCTTGC-3’）およびＭＧ３８５（5’-GTACCAGATCTTCTAGATTCGTTACCCATCAATTTGCATTG-3’）により行なわれる。第一ＰＣＲフラグメントについては、オリゴヌクレオチドＭＧ３８３は、第一ＰＣＲフラグメントに存在する伸長部と相補的であり、ＭＧ３８４によるフラグメントの伸長により付加された５'伸長部を有する。新たな両フラグメントを混合し、ＭＧ３６５およびＲＳ３６５でのＰＣＲ増幅により、コザック配列、ＡＴＧ、（Ｈｉｓ）６‐標識およびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ開裂部位(Amersham Pharmacia)についての開裂部位をコード化する新たなフラグメントが、ＲＯＲαリガンド結合ドメインの正面に導入される。この新しいフラグメントは、標的プラスミドｐＢＡＫＰａｃ８と共通した２つの相同性領域を両末端に有する。遺伝子操作を加えた遺伝子のクローニングベクターへの組込みは、前述の方法（Geiser et al.、BioTechniques ３１ ８８−９２、２００１）を用いることにより行なわれる。生成したクローンのＤＮＡ配列解析により、クローンが意図された通りであることを確認する。このプラスミドをｐＸＩ３３８と称する。
【００４８】
リポフェクションを用いて、プラスミドｐＸ１３３８を、線状化ＢａｃＰＡＫ６（ＡｃＮＰＶ）ウイルスＤＮＡとＳｆ−２１昆虫細胞へコトランスフェクションする。５日後に採取したウイルス上清を、プラーク精製にかけて均一なウイルス集団を得、それに続いて小規模増幅し、ウエスタンブロッティングにより生産について分析する。分析された６個の細胞ペレット全部において抗ＲＯＲα抗体（サンタクルス、カタログ番号ｓｃ−６０６２）を用いることにより、正確なサイズのバンドが容易に検出され得る。一ウイルス分離株をさらなる増幅用に選択する。マスターウイルスストック、次いで作業ウイルスストックをＳｆ−９細胞でのさらなる増幅により生成する。力価をプラーク検定法により測定する。速度論実験により、７２時間１.８２×１０６細胞／ｍｌ（ＴＯＩ）での１ ＭＯＩを用いてＲＯＲα−ｓＬＢＤについての最適生産条件が示される。これらの条件下で、タンパク質の大きな分画は、昆虫細胞において可溶性のままである。２つのウェーブバイオリアクター作業を、上記条件下において各々約１０〜１３リットルで実施する。Heraeus Cryofuge Ｍ７０００における１０分間６０００ｇでの遠心分離により細胞を採取し、ペレットを−８０℃で貯蔵する。
【００４９】
（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ３０４−５５６の精製および特性確認
（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ３０４−５５６を、標準方法にしたがってＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー、次いでアニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。２０ｇの細胞ペーストから、１５ｍｇ前後の（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ３０４−５５６が精製される。タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーでは単量体として振るまう。Ｎ−末端配列解析は、Ｎ−末端が遮断されていることを示す。質量分析計による解析は、アセチル‐デスＭｅｔ−（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ３０４−５５６（Acet- GSSHHHHHHLEVLFQGPAELEH…MQIDG）に対応する３１５１５.４の均一分子質量を示す。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼによるＮ−末端６ｘＨｉｓ標識のタンパク質加水分解的開裂により、有用な結晶を生じないが均一のタンパク質が生じる。対照的に、非開裂ＲＯＲα−ＬＢＤは、Ｘ線回折解析に適切な結晶をもたらす。
【００５０】
結晶化
５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ ｐＨ７.５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ中の組換え体ヒトＲＯＲα−ＬＢＤを、１４ｍｇ／ｍｌに濃縮する。ハンプトン リサーチからのＶＤＸ結晶化プレートおよびシリコーン処理した顕微鏡カバーグラスと共に標準的蒸気拡散ハンギングドロップ設備を用いて結晶化を実施する。カバーグラス上で混合することにより結晶化小滴を作製する。２.０μｌのタンパク質ストック溶液を２.０μｌのレザーバー溶液と共に２０℃で７００μｌのレザーバー溶液に対して平衡状態にする。市販のスクリーニングキットを用いて、予備的な結晶条件を見出す。精密条件で、結晶は、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８.４、１９%ＰＥＧ６０００、０.２ＭのＣａＣｌ２のレザーバーにより２０℃で２週間以内に０.１５×０.１５×０.３ｍｍのサイズに成長する。天然結晶の空間群はＰ２１であり、単位格子パラメーターはａ＝５５.９オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム、β＝９８.７°および空間群Ｐ２１である。一非対称単位につき一単量体が存在する。結晶は、シンクロトロン（ＥＳＲＦでのＳＮＢＬ、グルノーブル）で少なくとも１.８８オングストロームに回折する。
【００５１】
Ｘ線データ収集
天然データ収集のため、上記要領で成長させた結晶を、約１０秒間２０％グリセリン（レザーバー組成物に加えて）を含む溶液５μｌに移す。次いで、結晶を迅速にナイロン製クリオループ（ハンプトン リサーチ）に載せ、１０５ＫでのＸ線データ収集用に冷窒素気流中で直接冷凍する。European Synchrotron Radiation Facilityのスイス−ノルウェジアン ビームラインのｍａｒ３４５イメージプレートシステム（λ＝０.８７２７オングストローム）により回折データを集める。各１.０°回転の合計２３０画像を、１７８ｍｍの結晶〜検出器距離（１８０ｍｍのリードアウトプレート直径を用いる）による時間モード（１フレームにつき１５秒）で集める。未処理回折データを処理し、ＨＫＬプログラム総合ソフトウェアのバージョン１.９６.６（OtwinowskiおよびMinor、１９９６）でスケールする。結晶データおよびネイティブデータのデータ収集統計を表４に示す。天然結晶の空間群はＰ２１であり、単位格子パラメーターは、ａ＝５５.９オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム、β＝９８.７°である。１非対称単位当たり１単量体が存在する。ウィルソンプロットにより推定されるＢファクターは２０（オングストローム）２である。Ｈｇ誘導体データ収集については、４ｍＭの酢酸メチル水銀を含む（レザーバー組成物に加えて）溶液５μｌに結晶を予め１時間浸す。次いで、天然結晶の場合と同様に低温冷却を実施する。European Synchrotron Radiation Facilityのスイス‐ノルウェジアン ビームラインのｍａｒ３４５イメージプレートシステム（λ＝０.８７２７オングストローム）により回折データを集める。各１.０°回転の合計２８７画像を、１７８ｍｍの結晶〜検出器距離（１８０ｍｍのリードアウトプレート直径を用いる）による時間モード（１フレームにつき１５秒）で集める。未処理回折データを処理し、ＨＫＬプログラム総合ソフトウェアのバージョン１.９６.６（OtwinowskiおよびMinor、１９９６）でスケールする。結晶データおよびＨｇ−誘導体データのデータ収集統計を表２に示す。Ｈｇ誘導体結晶の空間群はＰ２１であり、単位格子パラメーターは、ａ＝５５.６オングストローム、ｂ＝５０.０オングストローム、ｃ＝６０.１オングストローム、β＝９８.０°である。１非対称単位当たり１単量体が存在する。ウィルソンプロットにより推定されるＢファクターは２９（オングストローム）２である。
【００５２】
構造解明
ｐｂｄ−エントリ２ｌｂｄ（ｈＲＡＲγ）または１ｂｓｘ（ｈＴＲβ）の座標に基いた幾つかの異なるモデルを用いることによる、プログラムＡｍｏＲｅ（Navaza、１９９４）またはＭＯＬＲＥＰバージョン６.２.５.（Vagin & Teplyakov、J.Appl.Cryst. ３０、１０２２−１０２５、１９９７）による分子置換により構造を解明する試みは、成功していない。すなわち、水銀置換結晶に関する単波長実験からのデータを、ＳＩＲＡＳによる初回位相決定についてのネイティブデータセットと一緒に使用する。異常分散差および同形差パターソン地図は、少なくとも１個の共通した主要ピークを示す。観察された異常分散差を用いるＤＲＥＡＲ正規化（Blessing & Smith、J.Appl.Cryst.３２、６６４−６７０、１９９９）と共にＳｎＢバージョン２.１（Weeks & Miller、J.Appl.Cryst.３２、１２０−１２４、１９９９）を用いて、４個のＨｇ‐部位を決定する。それに続いて、ＭＬＰＨＡＲＥバージョン４.１（ＣＣＰ４、１９９４）を用いて、重原子パラメーターを精密化する。ＤＭ（ＣＣＰ４、１９９４）による後続の密度修正により、優れた実験的ＳＩＲＡＳ地図が得られる。ｍａｐｍａｎプログラムでの骨格化により、Ｏバージョン７.０（Jones et al.、Acta Crystallogr．Ａ４７：１１０−１９、１９９１）での連鎖トレーシングおよびモデルビルディングが可能となる。
【００５３】
精密化
タンパク質（残基Ｈｉｓ３０８−Ｐｈｅ５４４は可視電子密度を有していた）を構築し、１１２個の水分子を実験的ＳＩＲＡＳ地図へ挿入した後、数回の精密化および手動再構築の交互サイクルにより、Ｒｃｒｙｓｔ＝２８.１％（８オングストローム‐１.８８オングストローム）を有するモデルを作製することにより、ＬＢＰにおけるリガンドについての優れた２Ｆｏ−ＦｃおよびＦｏ−Ｆｃ地図が得られる。優れた品質の電子密度により、コレステ−５−エン−３ベータ−オール（コレステロール）であるものとしてリガンドが明白に同定され得る。次いで、コレステロールリガンドを電子密度へ構築し、Ｘ−ＰＬＯＲパラメーター‐および構造‐ファイルが、Ｘ−ＰＬＯＲパラメーター‐および構造‐ファイルの作成に使用され得るプログラムＸＰＬＯ２Ｄ（Kleyewgt G.、ＣＣＰ４／ＥＳＦ−ＥＡＣＢＭ Newsletter on Protein Crystallography ３１、４５−５０、１９９５）により作製され得る。さらに精密化および１１９個のさらなる水分子の挿入（合計２３１個の水分子となる）のサイクルにより、最終Ｒｃｒｙｓｔ＝２４.８%およびＲｆｒｅｅ＝２６.３％が得られる（シグマ カットオフ無し、８オングストローム〜１.８オングストローム、２５５９２特有反射の作業セット、１２７９反射の試験セット）。一般に、電子密度は、弱い密度を有するループ４９３−４９８以外、優れた品質を有する（残基３０８−５４４は、モデルに含まれる）。精密化は、タンパク質についてのEnghおよびHuberの力場（Engh & Huber、Acta Crystallogr.Ａ４７：３９２−４００、１９９１）を用いるＸ−ＰＬＯＲ３.１（A.Bruenger、Ｘ−ＰＬＯＲバージョン３.１：A system for X-ray Crystallography and NMR、Yale University Press, New Haven, CT, USA, 1992)で行なわれる。使用される連鎖識別子は、タンパク質についてのＡ（残基Ｈｉｓ３０８−Ｐｈｅ５４４、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｐ３５３９８−１による番号付け）、リガンドについてのＬ（コレステロール：残基１）および水分子についてのＶ（合計２３１）である。ｐｄｂ−ファイルでリガンドコレステロールについて使用される原子数は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる原子数と同じではない。
【化１】
【００５４】
モデルの品質を、Ｘ−ＰＬＯＲ３.１（A.Bruenger、同上、１９９２）およびＰＲＯＣＨＥＣＫｖ３.３（Laskowski et al.、J.Appl.Cryst.１９９２、２６：２８３−９１）で評価する（表３参照）。複合体ＲＯＲα／コレステロールの最終モデルは、良好な外面的形態を有し（ｒｍｓ結合長＝０.０１３オングストローム、ｒｍｓ結合角＝１.４６°）、ＰＲＯＣＨＥＣＫｖ３.３により測定されたところによると、ラマチャンドラン（Ramachandran）プロットの不認可領域に残基は無い。分子グラフィック写真は、Ｏバージョン７.０（Jones et al.、同上、１９９１）により作製される。
【００５５】
表１：
【表１】
【００５６】
表２：
【表２】
【００５７】
表３：
【表３】
【００５８】
ＲＯＲα−ＬＢＤの全体構造
ＲＯＲα−ＬＢＤは、ＮＲ−ＬＢＤについての標準的な折りたたみ構造をとり（Wurtz et al.、Nat Struct Biol ３、２０６、１９９６）、加えて２個のらせんＨ２＊およびＨ１１＊を有する。Ｈ１２の位置により判断すると（図２および３も参照）、ＲＯＲα−ＬＢＤはアゴニスト結合状態にある。この位置にあるＨ１２は、Ｈ３−Ｈ４領域と一緒になって、補助活性化因子についての適切な相互作用表面、すなわち完全ＡＦ−２を形成する（Renaud & Moras、Cell.Mol.Life Sci.、５７、１７４８−１７６９、２０００で概説）。この結晶構造を得るために補助活性化因子ペプチドが付加されることはない。追加のＨ２＊らせんはまた、ペルオキシソーム増殖因子−活性化レセプター（ＰＰＡＲ；Nolte et al.、Nature、３９５、１３７−１４３、１９９８）についてはＨ２およびＨ３間に見出される。Ｈ１１＊は、既知ＬＢＤ構造の中でＲＯＲα−ＬＢＤ（およびＲＯＲβ−ＬＢＤ、Stehlin et al.、Embo J.、２０、５８２２−５８３２、２００１）に特有なものである。それは、ＲＡＲのループ１１−１２の中間部分と概ね重なり合う。ＲＯＲα−ＬＢＤの全体構造は、ＲＯＲβ−ＬＢＤの一つと類似しているが（例、Stehlin et al.、同上、２００１における図４により判断）、ＲＯＲβ−ＬＢＤの座標は入手できないため、ＲＯＲα−ＬＢＤとの定量的比較は為され得ない。ＲＯＲα−ＬＢＤについては、リガンドについての推定エントランス部位（複合体の溶媒接近可能表面により判断）は、Ｈ２およびＨ３間に位置し、たとえばＲＡＲ−γについて仮定されているように（Renaud et al.、３７８、６８１−６８９、１９９５）、Ｈ１２側ではない。結晶では、非対称単位のＲＯＲα−ＬＢＤ分子は、近隣分子とは二量体を形成しない。これは、天然ゲルではＲＯＲα−ＬＢＤが単量体としてふるまうという発見と一致する。以下のＣｙｓ残基は酢酸メチル水銀と反応した（Ｈｇ部位の分率座標については表２参照）：Ｃｙｓ３２１（部位３）、Ｃｙｓ４２９（部位１）、Ｃｙｓ５０５（部位４）およびＣｙｓ５１４（部位２）。すなわち、これらの反応性Ｃｙｓ残基はＳｅｒへの突然変異についての候補であり、その結果恐らくはE.coliでの可溶性発現が獲得される。結晶化セットアップに存在するタンパク質種は、以下の配列Ｈｉｓ６−標識およびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位およびＲＯＲα−ＬＢＤの残基３０４−５５６：
【表４】
【００５９】
リガンドの同定およびリガンド結合ポケットの説明
ＣＳＤ（エントリＦＩＺＤＵＮ）からの２６−ＯＨ−コレステロールの小分子Ｘ線構造は、この不偏電子密度への完全明白なフィット（２６−ＯＨ基の除去およびＣ２４−Ｃ２５結合周囲での１２０°回転後）を示す。すなわち、高分解能の優れた品質により、リガンドはコレステ−５−エン−３ベータ−オール（コレステロール）として同定され得る。ＲＯＲαのリガンド結合ポケットさらに精密に調べると、コレステロールの末端イソプロピル基のＣ２７がＴｒｐ３５３の側鎖とｖｄＷ接触をもち、Ｃ２６がＩｌｅ３６０の側鎖とｖｄＷ接触をもっていることが判る。Ｃ２６における置換基は、Ｈ１２の位置に影響を及ぼす可能性を有する（例、Ｃ２６における巨大置換基は、Ｈ１２をそのアゴニスト位置から除去し得るため、コレステロールのアンタゴニスト的誘導体を誘導する）。この結晶構造におけるＨ１２は、アゴニスト位置をとる。それは、ＯＨ−Ｔｙｒ５４０（Ｈ１２）およびＮＥ２−Ｈｉｓ５１７（Ｈ１１）間の水素結合（距離２.８オングストローム）によりアゴニスト位置で安定している。これら２残基は、ＲＯＲのα−、β−およびγ−のイソ型間で変換される。
【００６０】
ＬＢＰは、分子間水素結合（ＯＨ−Ｔｙｒ５４０およびＮＥ２−Ｈｉｓ５１７間の距離は２.８オングストロームである）を形成するＴｙｒ５４０およびＨｉｓ５１７以外、ＡＦ−２側では本質的に疎水性である（Ｈ５ Ｎ−末端、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１２）。ＬＢＰは、Ｈ３側（ループ１−２、Ｈ３、Ｈ５ Ｃ−末端）で極性が高い。ループ１−２におけるＧｌｎ３２２およびＴｙｒ３２３の主鎖ＮＨおよびＨ５におけるＡｒｇ４００およびＡｒｇ４０３の側鎖は、正の静電ポテンシャルの発生に寄与する。すなわち３−オール基における負に荷電した置換基（例、ＳＯ４−）は、かなり親和力が増強された誘導体を生じる（図４）。親水性部分には１２個の水分子が整列している。これらの水分子のうち５個は、最低のＢファクターを有する［１４（オングストローム）２〜２４（オングストローム）２］７水分子（合計２３１水分子のうち）の中にある。コレステロールの３−オール基は、整列した水分子のネットワークを介して、ＮＥ-Ａｒｇ４０３、ＮＨ２-Ａｒｇ４０３、ＣＯ-Ａｒｇ４００、ＮＨ１-Ａｒｇ４００、ＮＨ-Ｔｙｒ３２３、ＯＥ１-Ｇｌｎ３２２およびＮＨ-Ｇｌｎ３２２との水介在水素結合を成している。
【００６１】
リガンドについての平均Ｂ値［２０.１（オングストローム）２］は、タンパク質についての平均Ｂ値［３８.３（オングストローム）２］より低く、コレステロールの全非水素原子についての優れた電子密度が認識できるという事実と一致している。すなわち、コレステロールは、ＬＢＰにおいて十分に特定された単一立体配座をとる。これは、ＲＯＲβ−ＬＢＤに存在する非天然リガンドステアリン酸について報告された（Stehlin et al.、同上、２００１）多重低エネルギー立体配座とは対照的である。以下の残基は、リガンドコレステロールに対し４オングストロームより近位に非水素原子を有する：Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ３５６、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ａｌａ３６３、Ｖａｌ３９７、Ａｒｇ４００、Ｍｅｔ４０１、Ｖａｌ４１２、Ｔｙｒ４１３、Ｐｈｅ４１４、Ｐｈｅ４２４、Ｌｅｕ４２７、Ｐｈｅ４３２、Ｖａｌ４３６およびＨｉｓ５１７。
【００６２】
ＲＯＲαのＬＢＤに結合するコレステロール誘導体の設計
全般的に、ＬＢＰへのリガンドコレステロールのフィットは非常に良好である。にもかかわらず、リガンドのｖｄＷ‐表面と、ＬＢＰのｖｄＷ‐表面を比較すると、依然としてコレステロールの誘導体化についての可能性が僅かに存在し（図４および５）、親和力が増強され得ることが示される。追加の水素結合は、６位（ＯＥ１−Ｇｌｕ３６２への水を介した水素結合）、１９位（ＣＯ−Ｔｙｒ４１３への水素結合）または２６位（ＯＨ−Ｔｙｒ５４０および／またはＮＥ２−Ｈｉｓ５１７への水素結合）に付加されたヒドロキシ基により得られる。かなりの静電気相互作用エネルギーが、３位に付加された荷電基、たとえばＳＯ４−により得られる（ＮＨ１−Ａｒｇ４００、ＮＨ２−Ａｒｇ４０３、ＮＥ−Ａｒｇ４０３、ＮＨ−Ｇｌｎ３２２および／またはＮＨ−Ｔｙｒ３２３への水分子を介した水素結合および静電気相互作用）。さらなるｖｄＷ相互作用は、１２位（Ｐｈｅ３９８、Ｍｅｔ４０１の側鎖へのｖｄＷ接触）、１８位（Ｖａｌ４１２、Ｐｈｅ３９８の側鎖へのｖｄＷ接触）、２７位（Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ４２９、Ｐｈｅ４３２の側鎖へのｖｄＷ接触）に付加された追加メチル基または２１位（Ｐｈｅ４２４、Ｉｌｅ４３３、Ｖａｌ４３６、Ｐｈｅ４３７の側鎖へのｖｄＷ接触）に付加された追加エチル基により得られる。４および６位における修飾は、必要ならば、あまり親和力を変えることなく物理化学的または薬物動態パラメーターを修正するのに使用され得る。巨大置換基を伴う２６位における誘導体は、Ｈ１２をそのアゴニスト位置で脱安定化する可能性を有するため、誘導体にアンタゴニスト的活性を与える。
【００６３】
コレステロールについての作用機構
本Ｘ線構造は、以下の構造的作用機構を促す：コレステロール（または恐らくはコレステロール誘導体）はＨ２,Ｈ３側からＬＢＰに入り、これは恐らくはＡｒｇ４００およびＡｒｇ４０３から発生した静電界により導かれたと思われる。次いで、コレステロール（またはこの位置にある誘導体）のイソプロピル末端は、ＬＢＰの他端に影響を及ぼし、これがＨ１２と接触をもつことにより、ＬＸＸＬＬ−結合部位への補助活性化因子の結合を調節する。Ｃ２６に巨大置換基を伴うコレステロール誘導体は、そのアゴニスト立体配座からＨ１２を置換することにより、補助活性化因子結合を阻止し、さらにＴｙｒ５４０およびＨｉｓ５１７間の水素結合を安定させるコレステロール誘導体はアゴニスト立体配座をさらに強化する。
【００６４】
ＲＯＲα‐ＬＢＤの選択された突然変異
ＲＯＲα‐ＬＢＤ Ｘ線構造からの座標を用いて、コレステロールの結合を阻止すべきＬＢＰにおける一連の点突然変異が設計され、加えてＴｙｒ５４０（Ｈ１２）およびＨｉｓ５１７間の水素結合の喪失によりＨ１２安定化を阻止／低減化すべき突然変異が提案される（Ｔｙｒ５４０‐＞Ｐｈｅ５４０突然変異）。突然変異の詳細は下記に包含される。
【表５】
【００６５】
一時的トランスフェクション実験では、ＲＯＲα突然変異体の転写活性を、それらの野生型対応物質と比較する。Ｕ２ＯＳ細胞を、ＲＯＲαについての共通応答エレメントをもつルシフェラーゼリポーター遺伝子（ＲＯＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃ）と一緒にＲＯＲα（ＲＯＲ）またはその突然変異形態についての発現ベクターでトランスフェクションする。ルシフェラーゼ活性を、６ウェルプレートからの細胞で検定し、野生型ＲＯＲα発現プラスミドでトランスフェクションした細胞での活性と関連づける。結果をタンパク質含有率に対して正規化する。図は平均±ＳＤを示し、左パネルでは結果を野生型ＲＯＲαの活性と比べた誘導％として表す。表４で示されている通り、ＬＢＰにおける全突然変異（ただし突然変異Ｐｈｅ４３２‐＞Ｔｒｐ４３２を除く）は、ＲＯＲαの転写活性を顕著に／徹底的に低減化することから、事実上ＲＯＲαの活性形態がコレステロールに結合しているという結論に達する。突然変異Ｔｒｐ４３２の側鎖は、Ａｒｇ５１６およびＬｙｓ５２０の側鎖もまたそれらの立体配座を相応じて変える場合に、ＬＢＰにおけるコレステロールとの立体衝突が起こらない立体配座をとる可能性を有する。これら２残基は表面にあり、それらの側鎖立体配座は相互作用により安定化されないため、これは、ＬＢＰにおける他の突然変異とは対照的に、Ｐｈｅ４３２‐＞Ｔｒｐ４３２突然変異についての転写活性が僅かしか失われず、コレステロールとの立体衝突を阻止する可能な代替的側鎖立体配座が無いことの説明となる。突然変異Ｔｙｒ５４０‐＞Ｐｈｅ５４０は転写活性の約４０％の喪失をまねくことから、Ｔｙｒ５４０およびＨｉｓ５１７間の水素結合がかなりの量でアゴニスト位置にあるＨ１２の安定化に寄与することがわかる。
【００６６】
表４
【表６】
【００６７】
ＲＯＲα転写活性に対するＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤、フルバスタチンの効果
哺乳類細胞は、リポタンパク質（ＬＤＬ−コレステロール）からの取込によりコレステロールを受け取り、メバロン酸塩経路を通じてコレステロールを合成することができる。細胞が本質的にステロール不含有の条件下で培養される状況において、主要転写因子、ＳＲＥＢＰは、タンパク質加水分解的に開裂され、これが転写因子を核に放出する。この転写因子は、ＨＭＧ‐ＣｏＡレダクターゼを転写活性化することができ、これがメバロン酸塩経路を通したコレステロール生合成における重大な段階である。高コレステロール状態についての既知薬剤であるスタチン類は、ＨＭＧ‐ＣｏＡレダクターゼの特異的阻害剤である。細胞をステロール不含有培地で培養するとき、それらのＨＭＧ‐ＣｏＡレダクターゼは強く活性化される。この実験では、本質的にステロール不含有培地で培養された細胞を、フルバスタチンで処理する。ＲＯＲα活性の明らかな減少が観察されることから、細胞内コレステロールレベルの低下は、ＲＯＲα転写活性の減少により翻訳されるという結論に導かれる（表５）。Ｕ２ＯＳ細胞を、ＲＯＲαについての共通応答エレメントをもつルシフェラーゼリポーター遺伝子（ＲＯＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃ）と一緒にＲＯＲα（ＲＯＲ）用発現ベクターでトランスフェクションする。ルシフェラーゼ活性を６ウェルプレートからの細胞で検定し、フルバスタチン処理を伴うかまたは伴わなわずにトランスフェクションされた細胞での活性と関連づける。結果をタンパク質含有率に対して正規化する。
【００６８】
表５：
【表７】
【００６９】
ＲＯＲＥに結合するＲＯＲαのコレステロールサルフェート阻害
コレステロールサルフェート（表６における化合物番号１２）を含む様々なコレステロール誘導体を、本質的にコレステロール不含有培地でＲＯＲαのＲＯＲＥへの結合についてスクリーニングする。ＲＯＲαタンパク質は、バクロウイルス系で発現される。他の化合物は、番号２：５α−コレスタン−３−オン（ステラロイドＣ４５５０）、３：４−コレステン−３α−オール（Ｃ６０９０）、４：５−コレステン−３β,６−ジオール（Ｃ６４１８）、５：５−コレステン−３β,７α−ジオール７−ベンゾエート（Ｃ６４２５）、６：５−コレステン−３β,７β−ジオール７−ベンゾエート（Ｃ６４３８）、７：５−コレステン−３β,１９−ジオール（Ｃ６４７０）、８：５−,２５Ｒ−コレステン−３β,２６−ジオール（Ｃ６５７０）、９：５−コレステン−２４β−エチル−３β−オールアセテート（Ｃ６６８１）、１０：５−コレステン−３α−オール（Ｃ６７３０）、１１：５−コレステン−３β−オール（Ｃ６７６０）、１２：５−コレステン−３β−オールサルフェート、ナトリウム塩（Ｃ６９０５）、１３：７,（５α）−コレステン−３β−オール（Ｃ７４００）、１４：７−デヒドロコレステロール（フルカ３０８００）である。これは、Ｘ線構造により予測された通り、コレステロールサルフェートがコレステロールを置換できることを示している。
【００７０】
ＲＯＲアルファ転写活性に対するコレステロールおよびコレステロール誘導体の効果
次に、我々は、コレステロールを部分的に枯渇させた真核生物細胞において、ＲＯＲα転写活性がコレステロールを加えることにより再構成され得るか否かを確立する。したがって、我々は、細胞をヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）、コレステロールシャトルとして機能することが知られているシクロデキストリン誘導体で処理する。ＨＰＣＤ処理は、細胞内コレステロールの部分枯渇を目指す実験で使用される。メバロン酸塩経路の活性化を通じて細胞内コレステロールの増加を阻止するため、同じく細胞をロバスタチンで処理し、ＬＤＬ不含有血清を含む培地でそれらを培養する。ＨＰＣＤおよびロバスタチンの組合せを用いることにより、ＲＯＲＥリポーターの転写は、コレステロール、エピコレステロールおよびコレスタノールに応答し、さらに高い度合でコレステロールサルフェートおよび７−デヒドロコレステロールにより刺激されることがわかった。対照的に、試験された全ヒドロキシコレステロールは、顕著な活性を示すことはなく、コレステロール誘導体５−コレステン−２４β−エチル−３β−オール−アセテートは、賦形剤と比べてもＲＯＲα転写活性の増加を全く誘発しない（表６）。これらのデータは、我々のＲＯＲαのＸ線構造を用いたコレステロール誘導体に関するドッキング試験と十分な相関関係を示す。
【００７１】
表６：
【表８】
【００７２】
質量分析法によるリガンド交換スクリーニング
（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ２６９−５５６を、Ｓｆ９細胞で製造し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。１３５μＭ濃度のトリス−ＨＣｌ緩衝液中のタンパク質を、１０倍モル過剰の２５−ヒドロキシコレステロール（５−コレステン−３ベータ,２５−ジオール）またはコレステロールサルフェート（５−コレステン−３ベータ−オール−サルフェート）と４℃で一晩インキュベーションする。質量分析前に、タンパク質を、製造業者の使用説明書にしたがって使い捨てＣｅｎｔｒｉ Ｓｐｉｎ２０カラム(Princeton Separations, Adelphia, NJ)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７.０）中での高速緩衝液交換にかける。マイクロマスＺ型エレクトロスプレーイオン化ソース（ＥＳＩ）を備えたＱ−Ｔｏｆ（Micromass, Manchester, UK）四重極飛行時間型ハイブリッドタンデム質量分析計を用いて、質量分析法を実施する。捕捉質量範囲は、典型的には５秒でｍ／ｚ１５００〜４５００である。質量分析法を調整することにより、非共有結合複合体の多価核種の検出が可能となる。ソース遮断温度および脱溶媒和温度をそれぞれ５０℃および８０℃に保つ。試料コーン電圧（Ｖｃ）を標準測定用の２３ボルトにセットする。インソース誘導フラグメンテーション実験を、Ｖｃを１００ボルトまで高めることにより実施する。タンパク質溶液を１０μＬ／分の流速で注入する。データを記録し、Ｍａｓｓｌｙｎｘソフトウェアを用いて処理する。ＭａｘＥｎｔ分析ソフトウェア（マイクロマス、マンチェスター、英国）を用いて、スペクトルをデコンヴォルーションする。結果は、２５−ＯＨコレステロールおよびコレステロールサルフェートが両方ともＲＯＲ−ＬＢＤに結合したコレステロールを完全に置換できることを示している。さらに、リガンド／ＲＯＲ−ＬＢＤ−複合体およびアポ−ＲＯＲ−ＬＢＤ（リガンド無し）間の様々なコーン電圧（Ｖｃ）での比較は、コレステロールおよび２５−ＯＨコレステロールがインソース衝突に対して類似した安定性を有することを示している。対照的に、コレステロールサルフェート／ＲＯＲ−ＬＢＤ複合体は、コレステロールまたは２５−ＯＨコレステロール複合体よりも安定している。
【００７３】
２.２０オングストローム分解能での複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールサルフェートの結晶化およびＸ線構造：構造に基く設計の一例
複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールサルフェートに関する全アミノ酸残基（例、添付のコレステロールサルフェートとの複合体の座標、表９）を、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリＰ３５３９８（３３を引いた図１に示されたＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｐ３５３９８−１による所定のアミノ酸の番号に対応する）のスプライス変異型アルファ−１（すなわちＰ３５３９８−２）にしたがって番号づけする。複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールに関する全アミノ酸残基（例、添付のコレステロールとの複合体の座標、表８）を、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリＰ３５３９８のスプライス変異型アルファ−２（すなわちＰ３５３９８−１）にしたがって番号づけするが、ただし、使用された番号づけがＰ３５３９８−２にしたがっている図７〜１１を除き、コレステロールサルフェート複合体との比較検討におけるものを除く。請求の範囲に明記されている全アミノ酸残基を、図１に示された、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリＰ３５３９８のスプライス変異型アルファ−２（すなわち、Ｐ３５３９８−１）にしたがって番号づけする。
【００７４】
コレステロールサルフェートがＲＯＲ（アルファ）のリガンドであるという提案は、１.６３オングストローム分解能で以前に測定したＲＯＲ（アルファ）／コレステロールのＸ線構造を用いた、構造に基く設計の結果である。特に、後者のＸ線構造は、水分子が置換されている場合、ＬＢＰの親水性部分にコレステロールのヒドロキシ基に結合した置換基のための空間があることを示している。３個のアルギニン（Ａｒｇ２９２、Ａｒｇ３７０およびＡｒｇ３６７）および２個の遊離バックボーンアミド窒素（ＮＨ−Ｇｌｎ２８９およびＮＨ−Ｔｙｒ２９０）の存在は、少なくとも２個の水素結合アクセプター官能基（例、硫酸基）をもつ負に荷電した置換基を強く示唆している。ドッキング試験は、コレステロールサルフェートがコレステロールよりも高い親和力を有するという予測を導く。それに続いて、事実上ＲＯＲ（アルファ）ＬＢＤに結合したコレステロールがコレステロールサルフェートにより置換され得ることがＭＳ分析により示される。
【００７５】
次いで、複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールサルフェートは共結晶化され得、複合体のＸ線構造は２.２０オングストローム分解能で解明され、２０オングストローム〜２.２０オングストロームのデータについてＲｃｒｙｓｔは１９.４％およびＲｆｒｅｅは２１.９％である。観察された結合モードは以下の特徴を示す：
【００７６】
１）コレステロールサルフェートおよびコレステロールは類似した全般的結合モードを有するが、コレステロールサルフェートはＬＢＰの親水性正荷電部分に向かって僅かに（例、対応するＣ３原子は０.８５オングストロームほど）置き換えられている。これは、硫酸基により為された静電気および水素結合相互作用の最適化により説明され得る。
【００７７】
２）ＬＢＰの親水性部分におけるコレステロールについて存在する７個の整列した水分子は、コレステロールサルフェートとの複合体により置換されている。硫酸基およびＮＨ１−Ａｒｇ３６７およびＯ−Ａｌａ３３０間の相互作用を仲介する唯一保存された水分子は依然として存在する。
【００７８】
３）硫酸基は、ＮＨ−Ｇｌｎ２８９、ＮＨ−Ｔｙｒ２９０およびＮＨ１−Ａｒｇ３７０との直接水素結合相互作用を成す。これはドッキング仮説を確認するもので、コレステロールサルフェートの提案を導く。
【００７９】
４）コレステロールおよびコレステロールサルフェートとのＲＯＲ（アルファ）の複合体のタンパク質部分における唯一の顕著な変化は、Ｉｌｅ３２７の側鎖およびループ１〜２（残基Ｇｌｎ２８９およびＴｙｒ２９０）について起こる。
【００８０】
分子生物学、発酵、精製およびＭＳ分析
構築物（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ２７０−５２３の生成、発酵および精製は、上記要領で行なわれる。コレステロールサルフェートによるコレステロールの置換は３７℃で行なわれ、ＭＳ分析により確認される。コレステロールサルフェートをＤＭＳＯに５０ｍＭで溶かし、７３μＭの（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ２７０−５２３溶液に１.０ｍＭ最終濃度で加える。生成した溶液を３７℃で一晩インキュベーションし、ＳＰＸ７５カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した後、結晶化試験用に１７.６ｍｇ／ｍｌに濃縮する。天然複合体のＭＳ測定を前記要領で行う（Kallen et al.、Structure、第１０巻、１６９７−１７０７、２００２）。同量のＲＯＲαＬＢＤタンパク質を５％ＤＭＳＯと同一条件下でインキュベーションすることにより、対照実験を行う。タンパク質濃度は、５０ｍＭのＡｃＯＮＨ４（ｐＨ７.０）中約１５μＭである。Ｖｃ＝２０ボルトの同一条件下で両スペクトルを記録する。
【００８１】
結晶化
結晶化に使用されるタンパク質は、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５ｍＭのＤＴＴ中１７.６ｍｇ／ｍｌである。結晶化条件について最初からの検索に取りかかる。ハンプトン リサーチ製のＶＤＸ結晶化プレートおよびシリコーン処理した顕微鏡カバーグラスによる、標準蒸気拡散ハンギングドロップ設備を用いて、試験を実施する。１.０μｌのタンパク質ストック溶液を１.０μｌの結晶化溶液とカバーグラス上で混合することにより、結晶化小滴を４℃でセットアップする。
【００８２】
Ｘ線データ収集：ほぼ正確な大きさ６０μｍ×６０μｍ×２００μｍの単結晶を、ナイロン製ＣｒｙｏＬｏｏｐ（ハンプトン リサーチ）により固定し、１００ＫでのＸ線データ収集用に冷窒素気流中で急速冷凍する。マレサーチ（Marresearch）ＣＣＤ検出器および０.９２００オングストローム波長での入射単色Ｘ線ビームを用いて、スイス ライト ソース（３００ｍＡで稼動）、ビームラインＸ０６ＳＡで回折データを集める。１フレーム当たり９秒の曝露時間および１５０ｍｍの結晶〜検出器距離を用いて、合計２２６画像を各１.０°回転により集める。未処理回折データを処理し、ＨＫＬプログラム総合ソフトウェアバージョン１.９６.１（OtwinowskiおよびMinor、１９９６）でスケーリングする。ウィルソンプロット分析による推定Ｂファクターは３２.９（オングストローム）２である。結晶データおよびデータ収集統計を表７に示す：
表７：
【００８３】
【表９】
【００８４】
構造決定および精密化：１.６３オングストローム分解能に精密化した複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールの座標を標準モデルとして用いて構造を決定する。プログラムＲＥＦＭＡＣバージョン５.０（ＣＣＰ４、Acta Crystallogr．Ｄ５０、７６０−７６３、１９９４）を精密化に使用する。バルク溶媒補正、初期異方性Ｂファクター補正および抑制等方性原子Ｂファクター精密化を適用する。精密化標的は振幅を用いる最尤標的である。構造因子振幅においてシグマカットオフは適用されない。特有反射の５.０％（８２９）を含む試験セットを用いて、精密化中終始、交差検定を使用する。水分子は、プログラムＡＲＰ／ｗＡＲＰにより同定され、差異ピーク高（３.０σより大）および距離基準に基づいて選択される。７０（オングストローム）２より大きい温度因子をもつ水分子は拒絶される。プログラムＯバージョン７.０（A.Jones et al.、１９９１）をモデル復元に使用する。最終モデルについての精密化統計値を表２に示す。複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールサルフェートの最終モデルは、良好な外面的形態（ｒｍｓ結合長＝０.０１４オングストローム、ｒｍｓ結合角＝１.４１°）を有し、残基は、ラマチャンドランプロットの不認可領域には無い。
【００８５】
結晶化、データ収集：データ収集に使用する結晶は、０.２ＭのＭｇＣｌ２、１６％ｗ／ｖＰＥＧ４０００、０.１ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８.５から成る適切な溶液より得られる。結晶は、６週間以内に０.２ｍｍまでの最大大きさに達した。すなわち、コレステロールサルフェートとＲＯＲαＬＢＤの複合体は、ａ＝５４.４オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム、β＝９７.８°、Ｐ２１および１複合体／非対称単位の結晶形態で結晶化され、これはコレステロールとの複合体で以前に得られた結晶形態と類似している。
【００８６】
ＲＯＲ（アルファ）に結合したコレステロールサルフェートの立体配座およびその相互作用：一般に、電子密度は、弱い密度しかもたないアミノ酸４６１−４６４（Ｌ９−１０）以外、優れた質を有する。精密化モデルのタンパク質部分は、Ｈｉｓ標識からの最終２個のＨｉｓアミノ酸、次いでＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）部位（ＬＥＶＬＦＱＧ）およびＲＯＲα−ＬＢＤのアミノ酸２７１−５１１により構成される。精密化モデルはまた、２５６個の水分子および１個のコレステロールサルフェート分子を含む。硫酸基により、ＮＨ−Ｇｌｎ２８９（３.０オングストローム）、ＮＨ−Ｔｙｒ２９０（２.９オングストローム）との直接水素結合相互作用およびＮＨ１−Ａｒｇ３７０（３.０オングストローム、３.１オングストローム）との二座配位相互作用を為す。水介在相互作用は、ＮＨ１−Ａｒｇ３６７により為される。
【００８７】
ＲＯＲ（アルファ）ＬＢＤに結合したコレステロールサルフェートおよびコレステロールのＸ線構造の比較
図１０は、コレステロールおよびコレステロールサルフェートとのＲＯＲ（アルファ）複合体についての重ね合わせ（各ＬＢＤのＣαを用いる）を示す。重ね合わせ後の残基Ｐｒｏ２７０−Ｐｈｅ５１１のＣα原子についてのｒ.ｍ.ｓ.ｄは０.２６オングストロームである。タンパク質部分における唯一の顕著な変化は、Ｉｌｅ３２７の側鎖およびループ１−２（残基Ｇｌｎ２８９およびＴｙｒ２９０）について生じる：Ｇｌｎ２８９およびＴｙｒ２９０についてのバックボーンＮＨ原子は、硫酸基との相互作用を改善するために、硫酸基に向かって約０.８オングストロームほど移動する（各側鎖の同時移動を伴う）。Ｉｌｅ３２７の側鎖は、末端イソプロピル基との立体衝突を回避するために僅かに移動しなければならない（図９）。比較結果は、コレステロールサルフェートおよびコレステロールが類似した全般的結合モードを有するが、コレステロールサルフェートはＬＢＰの親水性正荷電部分に向かって僅かに（例、対応するＣ３原子は０.８５オングストロームおよび対応するＣ２原子は０.７オングストロームほど）置き換えられていることを示す（図９）。これは、硫酸基により為される静電気および水素結合相互作用の最適化により説明され得る。ＬＢＰの親水性部分におけるコレステロールについて存在する７個の整列した水分子は、コレステロールサルフェートとの複合体では置き換えられている（図１０）。硫酸基およびＮＨ１−Ａｒｇ３６７およびＯ−Ａｌａ３３０間の相互作用を仲介する唯一保存された水分子は依然として存在している。硫酸基は、ＮＨ−Ｇｌｎ２８９、ＮＨ−Ｔｙｒ２９０およびＮＨ１−Ａｒｇ３７０との直接水素結合相互作用を為す。これはドッキング仮説を確認するもので、コレステロールサルフェートの提案が導かれる。
【００８８】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【表４３】
【００８９】
【表４４】
【表４５】
【表４６】
【表４７】
【表４８】
【表４９】
【表５０】
【表５１】
【表５２】
【表５３】
【表５４】
【表５５】
【表５６】
【表５７】
【表５８】
【表５９】
【表６０】
【表６１】
【表６２】
【表６３】
【表６４】
【表６５】
【表６６】
【表６７】
【表６８】
【表６９】
【表７０】
【表７１】
【表７２】
【表７３】
【表７４】
【表７５】
【表７６】
【表７７】
【表７８】
【表７９】
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１：ヒトＲＯＲαの配列（スイスプロットＰ３５３９８−１）。
【図２】図２は、ＲＯＲα‐ＬＢＤおよびコレステロール間における複合体のＸ線構造表す概略図を示す。
【図３】図３は、ＲＯＲα‐ＬＢＤおよびコレステロール間における複合体のズームイン写真を示す（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【図４】図４：親和力を増加させ、アンタゴニスト活性を得るためのリガンドの提案（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【図５】図５：親和力を増加させるためのコレステロールのさらなる誘導体の提案（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【図６】図６は、２５−ＯＨコレステロールおよびコレステロールサルフェートによるコレステロールの置換を示す。
【図７】図７は、ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールのＸ線構造のズーム写真を示す（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【図８】図８：コレステロールサルフェートとＲＯＲ（アルファ）のＬＢＰにより行なわれる相互作用の概観（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【図９】図９：ＲＯＲ（アルファ）／コレステロール‐サルフェートおよびＲＯＲ（アルファ）／コレステロールのＸ線構造の比較（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【図１０】図１０：ＲＯＲ（アルファ）／コレステロール（左）およびＲＯＲ（アルファ）／コレステロール‐サルフェート（右）のＸ線構造の比較（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【図１１】図１１：結晶化で使用される構築物の配列。二次構造エレメントは配列の下に示されている。コレステロールに対し４オングストロームより近位に非水素原子を有するアミノ酸は、赤色で強調されている（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、結晶化形態のＲＯＲαおよびその製造方法に関するものである。さらに本発明は、ＲＯＲαの三次元モデルおよびＲＯＲαモジュレーターの設計手段を提供する。
【０００２】
発明の背景
レチノイン酸関連オーファンレセプターα（ＲＯＲα）は、レセプター、たとえばレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）および甲状腺レセプター（ＴＲ）が属する核レセプタータンパク質ファミリーの一オーファン構成員である。核レセプターファミリーの他の構成員と同様、ＲＯＲαは、幾つかのドメイン、中でもＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）から成るモジュラー構造を呈する。後者は、Ｘ線構造が解明されているＴ３Ｒβ（２５％）、ＶＤＲ（２４％）、ＲＡＲα（２４％）、ＰＰＡＲα（２４％）およびＲＸＲα（２０％）のＬＢＤと低い度合の相同性を表す。しかしながら、ＲＯＲαのＬＢＤを結晶化させる試みは現在までのところ失敗に帰しており、ＲＯＲαのＸ線構造は全く入手できなかった。さらに、この点に加えてリガンドも現在までのところ全く同定されていない。レセプターの生理学的役割についての我々の理解は、天然リガンドの発見により大きく増すことになる。さらに、空間的構成が与えられれば、ＲＯＲαのアゴニストおよびアンタゴニストの設計の助けとなる。
【０００３】
発明の要約
一局面において、本発明は、ＲＯＲαの結晶性ＬＢＤを提供する。関連局面では、本発明は、リガンドと結合したＲＯＲαの結晶性ＬＢＤを提供する。別の局面において、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤの空間的構成を表す座標のセットを提供する。関連局面において、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表す１セットの座標を含むＲＯＲαのＬＢＤのモデルを提供する。別の関連局面において、本発明は、薬剤設計に有用な座標のセットを提供する。さらに別の関連局面において、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤに結合する物質の同定方法であって、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表すモデルを準備し、上記モデルと候補物質の相互作用を評価し、そしてＲＯＲαのＬＢＤと相互作用すると予測される物質を選択する方法を提供する。この方法により同定される物質もまた提供される。
【０００４】
さらに別の局面において、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤの結合するＲＯＲαのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定方法であって、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表す原子座標の一つまたはそれ以上のセットによる合理的薬剤設計を実施することにより可能性のある化合物を選択し、可能性のある化合物をＲＯＲαのＬＢＤと接触させ、そしてＲＯＲαのＬＢＤへの化合物の結合を測定することを含む方法を提供する。この方法により同定されるアゴニストおよびアンタゴニストもまた提供される。
【０００５】
別の局面において、本発明は、ＲＯＲαと相互作用する化合物についてのスクリーニング方法であって、ＲＯＲαを候補化合物と接触させ、ステロールの不存在下で候補化合物およびＲＯＲα間の相互作用を測定し、そして化合物がステロールの不存在下でＲＯＲαと相互作用する場合にそれを選択することを含む方法を提供する。好ましいステロール類は、コレステロールまたはコレステロール誘導体である。この方法により同定される化合物もまた提供される。
【０００６】
本発明の別の局面では、コレステロール関連疾患のスクリーニングを目的とするＲＯＲαの使用が提供される。
【０００７】
さらに別の局面において、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤおよびステロール、好ましくはコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む組成物を提供する。好ましい実施態様において、上記組成物は結晶化可能である。
【０００８】
表および図面の簡単な説明
表１：コレステロールとの複合体におけるＲＯＲαのＬＢＤの天然結晶データおよびＸ線データ統計値。
【０００９】
表２：Ｈｇ誘導体結晶データ、Ｘ線データおよび重原子精密化統計値（コレステロールとの複合体について）。
【００１０】
表３：精密化統計値（コレステロールとの複合体について）。
表４：ＲＯＲαへのコレステロールの結合を阻止する突然変異の効果を示す。
【００１１】
表５：ＲＯＲα転写活性に対するフルバスタチンの効果を示す。
表６：ＲＯＲアルファ転写活性に対するコレステロールおよびコレステロール誘導体の効果。
【００１２】
表７：コレステロールサルフェートとの複合体におけるＲＯＲαのＬＢＤの天然結晶データおよび精密化統計値。
【００１３】
表８：コレステロールとの複合体におけるＲＯＲαのＬＢＤの代表的構造についての原子構造座標（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【００１４】
表９：コレステロールサルフェートとの複合体におけるＲＯＲαのＬＢＤの代表的構造についての原子構造座標（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００１５】
図１：ヒトＲＯＲαの配列（スイスプロットＰ３５３９８−１）。
図２は、ＲＯＲα‐ＬＢＤおよびコレステロール間における複合体のＸ線構造表す概略図を示す。
【００１６】
図３は、ＲＯＲα‐ＬＢＤおよびコレステロール間における複合体のズームイン写真を示す（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【００１７】
図４：親和力を増加させ、アンタゴニスト活性を得るためのリガンドの提案（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【００１８】
図５：親和力を増加させるためのコレステロールのさらなる誘導体の提案（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【００１９】
図６は、２５−ＯＨコレステロールおよびコレステロールサルフェートによるコレステロールの置換を示す。
【００２０】
図７は、ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールのＸ線構造のズーム写真を示す（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００２１】
図８：コレステロールサルフェートとＲＯＲ（アルファ）のＬＢＰにより行なわれる相互作用の概観（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００２２】
図９：ＲＯＲ（アルファ）／コレステロール‐サルフェートおよびＲＯＲ（アルファ）／コレステロールのＸ線構造の比較（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００２３】
図１０：ＲＯＲ（アルファ）／コレステロール（左）およびＲＯＲ（アルファ）／コレステロール‐サルフェート（右）のＸ線構造の比較（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００２４】
図１１：結晶化で使用される構築物の配列。二次構造エレメントは配列の下に示されている。コレステロールに対し４オングストロームより近位に非水素原子を有するアミノ酸は、赤色で強調されている（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【００２５】
発明の詳細な記載
本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤの結晶を提供する。さらに、本発明は、Ｘ線結晶学による上記結晶の構造測定法を提供する。一実施態様において、結晶の構造は１.８８オングストロームの分解能まで解明されている。驚くべきことに、結晶はＲＯＲαに結合したリガンドを含むことが見出された。リガンドは、コレステ−５−エン−３ベータ−オール（コレステロール）として同定された。すなわち、本発明は、たとえばインシリコ（コンピューター利用）スクリーニング、ドッキングおよび合理的薬剤設計に有用なＲＯＲαのＬＢＤの空間的構成に関する情報だけでなく、リガンド結合に関与するアミノ酸の同定に有用であるＲＯＲαに結合しているリガンドとしてのコレステロールに関する情報も提供する。本発明にしたがって提供される情報は、下記で実例を挙げている通り、ＲＯＲαのＬＢＤに結合する化合物の設計基盤として使用され得る。本発明により提供されるＲＯＲαの結晶ＬＢＤは、いかなる結晶形態でもとり得るが、好ましくは単結晶である。さらに好ましい実施態様において、結晶は、ａ＝５５オングストローム±５オングストローム、ｂ＝５０オングストローム±５オングストローム、ｃ＝６０オングストローム±６オングストロームおよびβ＝９８.５°±９°の大きさを有する単位格子および空間群Ｐ２１を含む。好ましくは、単位格子の大きさは、ａ＝５５.９オングストローム±２オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム±２オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム±２オングストロームおよびβ＝９８.７°±５°またはａ＝５４.４オングストローム±２オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム±２オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム±２オングストローム、β＝９７.８°±５°である。別の好ましい実施態様において、ＲＯＲαの結晶ＬＢＤはヒトに由来する。本発明によるＲＯＲαの結晶ＬＢＤは、好ましくは第二化学物質と会合している。かかる物質は天然または合成化学分子のいずれでもあり得、好ましいのは小分子であり、さらに好ましいのは小親油性分子である。コレステロールは、本発明にしたがって、この結合ポケットへ収まるリガンドとして同定されている。すなわち、特に好ましい実施態様において、かかる物質はコレステロールまたはコレステロール誘導体である。本明細書で使用されている「小分子」の語は、分子量が３０００Ｄａ未満、さらに好ましくは１０００Ｄａ未満、最も好ましくは５００Ｄａ未満である、天然または合成化合物、好ましくは有機分子をいう。本明細書で使用されている「親油性」の語は、主として非極性であり、水に僅かしか溶けない化合物をいう。典型例には、脂肪酸、レチノイン酸、メラトニン、ステロイドホルモン、ビタミンＤ誘導体が含まれ得る。他の例には、タモキシフェンまたはラロキシフェンのような親油性分子が含まれ得る。本発明によると、特に好ましい親油性リガンドは、コレステロールおよびその誘導体である。本明細書で使用されている「コレステロール誘導体」は、コレステロールとの類似性、たとえば同じ全体構造を有するが、置換基が異なるかまたは不飽和結合の位置または立体異性体の差異を伴う分子をいう。上記コレステロール誘導体についての例は、たとえばhttp://www.steraloids.comにおいて見出され得る。
【００２６】
ＲＯＲαのＬＢＤの結晶および所望により第二化学種は、バッチ結晶化法、蒸気拡散法（シッティングドロップ法またはハンギングドロップ法による）および微小透析法を含む若干の技術により育成され得る。結晶のシーディングは、Ｘ線品質の結晶を得ることが必要な場合もある。したがって、結晶の標準ミクロおよび／またはマクロシーディングが使用され得る。初期結晶をハンギングドロップから４℃または室温（約２０℃）で数週間にわたって成長させ得る。次にそれに続いて、初期結晶からのマクロシーディングにより結晶を成長させ得る。一旦本発明の結晶を成長させると、Ｘ線回折データが収集され得る。たとえばＸ線回折データ収集用ＭＡＲイメージングプレート検出装置が使用され得る。慣用的供給源（たとえば密封管または回転式アノード）で発せられたＸ線を用いるかまたはシンクロトロンソースを用いることにより、結晶が特性確認され得る。
【００２７】
特性確認およびデータ収集方法には、歳差運動写真撮影、振動／回転データ収集および回折計データ収集があるが、これらに限定はされない。下記で実例が示されている通り、重原子誘導体は、４ｍＭ酢酸メチル水銀の溶液に１時間結晶を浸すことにより得られる。データ処理および縮小は、ＨＫＬ総合ソフトウェア［OtwinowskiおよびMinor、Meth.Enzymol.２７６：３０７−３２６（１９９７）］のプログラム（ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ）を用いて実施され得る。重原子位置は、プログラム、たとえばＳｎＢ［Weeks,C.M. & Miller,R.（１９９９）J.Appl.Cryst.３２、１２０−１２４］またはＣＣＰ４プログラム総合ソフトウェア［Collaborative Computational Project、ナンバー４、Acta Cryst.Ｄ５３：７６０−７６３（１９９４）］のプログラム（例、ＳＨＥＬＸおよびＲＳＰＳ）を用いて見出され得る。電子密度地図は、ＣＣＰ４プログラム総合ソフトウェア［Collaborative Computational Project、ナンバー４、Acta Cryst.Ｄ５３：７６０−７６３（１９９４）］のプログラム（例、ＭＬＰＨＡＲＥおよびＤＭ）または別法としてＳＨＡＲＰ［La Fortelle,E.D.およびBricogne,G.、Methods in Enzymology ２７６：４７２−４９４（１９９７）］およびＳＯＬＯＭＯＮを用いて計算され得る。分子モデルは、Ｏ［Jones,T.a.et al.、ACTA Crystallogr.Ａ４７：１１０−１１９（１９９１）］を用いてこの地図へ構築され得る。タンパク質についての完全分子モデルは、実験的電子密度地図に基づいて構築され得る。Ｘ−ＰＬＯＲ［Brunger、X-PLOR v.３.１Manual、New Haven : Yale University,(1993)］を用い、またはＣＮＳにより最大尤推定法残差を用いて［Brunger,A.T.etal.、Acta Cryst.Ｄ５４：９０５−９２１（１９９８）］ポジショナルおよびシミュレーション化アニーリング精密化を散在させたモデルビルディングにより、ＲＯＲαのＬＢＤの明白なトレースおよび配列割り当てが行われ得る。
【００２８】
したがって、本発明は、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表す座標のセットを含む合理的薬剤設計に有用なＲＯＲαのＬＢＤの構造モデルを提供する。すなわち、好ましい実施態様は、表８または９における原子座標の一またはそれ以上のセットを含むＬＢＤ ＲＯＲαの構造を具体的に表すモデルを提供する。他の好ましい実施態様は、コンピューターハードウェアまたは本発明のモデルを含むコンピューターシステムおよび本発明のモデルを含むコンピューター読取可能媒体を提供する。座標のセットは、好ましくはＲＯＲαのＬＢＤの結晶学的解析により決定されるが、利用可能な方法であれば全て、本明細書で開示されているかまたはＲＯＲαのＬＢＤの独立した結晶学的解析から入手されたデータを用いてかかるモデルを構築するのに使用され得る。「構造座標」の語は、タンパク質またはタンパク質‐リガンド複合体の結晶形態の原子（散乱中心）によりＸ線の単色ビームの回折で得られたパターンに関連した数学的等式から誘導されたカーテシアン座標をいう。回折データを用いることにより、結晶の反復単位の電子密度地図が算出される。次いで、電子密度地図を用いて、酵素または酵素複合体の個々の原子の位置を確立する。座標における変動は、構造座標の数学的操作故に生じ得る。たとえば、表８または９に示された構造座標は、構造座標の結晶学的置換、構造座標の分割、構造座標のセットへの整数加算または減算、構造座標の反転または上記の組合せにより操作され得る。別法として、アミノ酸の突然変異、付加、置換および／または欠失、または結晶を構成している成分のいずれかにおける他の変化に起因した結晶構造における修飾もまた、構造座標における変動を説明するものであり得る。上記変動が、元の座標と比べて許容される標準誤差内に含まれる場合、生じた三次元形状は同じであると見なされる。したがって、分子または分子複合体またはその一部分が、同じと見なされるほどＲＯＲαのＬＢＤの構造の全部または一部と十分に類似しているか否かを決定するのには、様々なコンピューター解析が必要である。上記解析は、現行のソフトウエアアプリケーション、たとえばＱＵＡＮＴＡ(Molecular Simulations Inc., San Diego, Calif.)バージョン４.１のMolecular Similarity（分子類似性）アプリケーションで、添付のユーザーズガイドの説明にしたがって実施され得る。本発明の目的とするところでは、表８または９に列挙された構造座標により記された関連性のあるバックボーン原子に重ね合わせたとき、１.５オングストローム未満の保存残基バックボーン原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ）の二乗平均偏差を有する分子または分子複合体であれば同一であると考えられる。さらに好ましくは、二乗平均偏差は１.０オングストローム未満である。「二乗平均偏差」の語は、平均からの偏差の平方の相加平均の平方根を意味する。それは、傾向または対象からの偏差または変動を表す一方法である。本発明の目的の場合、「二乗平均偏差」は、本明細書に記載されている構造座標により定義されたところによるとＲＯＲαのＬＢＤのバックボーンの関連性のある部分からのタンパク質またはタンパク質リガンド複合体のバックボーンにおける変動を定義する。
【００２９】
ある種の実施態様において、データセットは、限定無しで、ＲＯＲαのＬＢＤの結合ポケットを含む、ＲＯＲαのＬＢＤの構造の一部分を具体的に表す。本明細書で使用されている「結合ポケット」の語は、その形状の結果として、別の化学物質または化合物と好都合に会合する分子または分子複合体の一領域をいう。本発明によると、好ましい結合ポケットは、図３、４、５、７、８、９または１０に示されたアミノ酸、すなわち以下のアミノ酸：Ｃｙｓ３２１、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ｌｅｕ３２８、Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ３５６、Ａｌａ３５７、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｇｌｕ３６２、Ａｌａ３６３、Ｖａｌ３９７、Ｐｈｅ３９８、Ａｒｇ４００、Ｍｅｔ４０１、Ａｒｇ４０３、Ａｌａ４０４、Ｖａｌ４１２、Ｔｙｒ４１３、Ｐｈｅ４１４、Ｐｈｅ４２４、Ｌｅｕ４２７、Ｃｙｓ４２９、Ｐｈｅ４３２、Ｉｌｅ４３３、Ｖａｌ４３６、Ｈｉｓ５１７、Ｌｙｓ５２０およびＴｙｒ５４０（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｐ３５３９８−１による番号付け）の１個またはそれ以上を含む。
【００３０】
本発明の一実施態様において、モデルは、ＲＯＲαのＬＢＤと相互作用する物質を同定するのに使用され得る。一般に、本発明による分子類似性アプリケーションは、異なる構造、同じ構造の異なる立体配座、および同じ構造の異なる部分間における比較を可能にする。ドッキングプログラム、たとえばＧＲＡＭ、ＤＯＣＫまたはＡＵＴＯＤＯＣＫを用いたコンピューターモデリングの使用を通して、潜在的相互作用性物質を調べる［Dunbrack et al.、Folding & Design、２：２７−４２（１９９７）］。この手順は、ＲＯＲαのＬＢＤへの潜在的リガンドのコンピューターフィッティング（当てはめ）を含むもので、たとえば潜在的リガンドの形状および化学構造が如何にうまく本発明により提供される結合ポケットと補完し合うかを確認し得る。コンピュータープログラムはまた、ＲＯＲαのＬＢＤへのリガンドの誘引、反発および立体障害を評価するのにも使用され得る。一般的に、適合度が堅固である（例、立体障害性が低い、および／または引力が大きい）と、これらの特性は堅固な結合定数と一致することから、潜在的薬剤は強力なものとなる。さらに、可能性のある薬剤の設計における特異性が高いと、薬剤がＲＯＲαタンパク質または他のタンパク質（特に核に存在するタンパク質）の他の特性に干渉する見込みは低くなる。これにより、他のタンパク質との望ましくない相互作用に起因して起こり得る副作用は最小限となる。最初に可能性のある相互作用性物質は、化学ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。次いで、この方法で選択されたリガンドを、１個またはそれ以上の有望な潜在的リガンドが同定されるまでコンピューターモデリングプログラムにより系統的に修飾し得る。別法として、ＲＯＲαの既知リガンド、たとえば本発明により同定されたコレステロールは、系統的修飾についての出発点として使用され得る。上記コンピューターモデリングにより、実施可能であり、そのうちのいずれかは有用な薬剤となり得る無数の本質的に無作為な化学修飾とは反対に、有限数の合理的化学修飾の選択が可能となる。各化学的修飾は追加の化学工程を必要とし、それらは有限数の化合物の合成については妥当なものであるが、可能な修飾が全て合成される必要がある場合直ちに収拾がつかなくなる。すなわち、本明細書で開示されている三次元構造の使用およびコンピューターモデリングを通して、多数のこれら化合物がコンピューターモニタースクリーン上で迅速にスクリーニングされ得、莫大な数の化合物の労力を要する合成を行わずとも数少ない見込みのある候補が決定され得る。
【００３１】
したがって、ＲＯＲαのＬＢＤに結合する物質の同定方法が提供される。上記方法は、典型的には、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表すモデルを準備し、候補物質と上記モデルとの相互作用を評価し、ＲＯＲαのＬＢＤと相互作用すると予測される物質を選択し、そして所望により、ＲＯＲαのＬＢＤと選択された物質を接触させる工程を含む。好ましい実施態様において、かかる方法では、本明細書においてたとえば図３、４、５、７、８、９または１０で開示されている通り、候補化合物の３−Ｄ構造を、表８または９に示された３−Ｄ分子モデルまたは好ましい結合ポケットの一部であるかまたは直接または間接的にリガンドの結合に関与するアミノ酸の座標と比較する。好ましくは、上記アミノ酸は、候補化合物における水素結合性官能基と（直接または水分子を介して）水素結合を形成し得るか、または好都合なｖｄＷ−相互作用を形成し得る。相互作用は、好ましくはコンピューター支援による方法、たとえば、ＲＯＲαのＬＢＤの原子間における原子間距離が容易に引き出され、異なる候補化合物の水素結合性官能基および３Ｄ分子モデルにおいて結合ポケットを形成するアミノ酸の水素結合原子間の距離（またはｖｄＷ−相互作用形成基間の距離）を比較することにより、２構造間における最適水素結合およびｖｄＷ−相互作用に基づいて、理論的にＲＯＲαのＬＢＤの３−Ｄ分子モデルポケットと最も安定した複合体を形成する候補化合物が同定され得るように、上記構造座標データをデータ構造に入力するデータ処理法により評価される。
【００３２】
好ましい実施態様において、物質は、ｖｄＷ−相互作用または水素結合相互作用により直接的または間接的に（例、水分子を介して）図３、４、５、７、８、９または１０に示されているかまたはＣｙｓ３２１、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ｌｅｕ３２８、Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ３５６、Ａｌａ３５７、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｇｌｕ３６２、Ａｌａ３６３、Ｖａｌ３９７、Ｐｈｅ３９８、Ａｒｇ４００、Ｍｅｔ４０１、Ａｒｇ４０３、Ａｌａ４０４、Ｖａｌ４１２、Ｔｙｒ４１３、Ｐｈｅ４１４、Ｐｈｅ４２４、Ｌｅｕ４２７、Ｃｙｓ４２９、Ｐｈｅ４３２、Ｉｌｅ４３３、Ｖａｌ４３６、Ｈｉｓ５１７、Ｌｙｓ５２０およびＴｙｒ５４０、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ａｒｇ４００、Ａｒｇ４０３から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸の原子と相互作用するように設計される。さらに好ましい実施態様において、物質は、ｖｄＷ−相互作用または水素結合相互作用により直接的または間接的（例、水分子を介して）にＧｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ａｒｇ４００、Ａｒｇ４０３またはＴｒｐ３５３、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ａｌａ３６３、Ｍｅｔ４０１、Ｐｈｅ４１４、Ｌｅｕ４２７、Ｐｈｅ４３２、Ｖａｌ４３６から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸の原子と相互作用する。上記方法を用いて同定される物質もまた提供される。好ましい物質は小分子であり、さらに好ましいのは小親油性分子（極性基をもつと思われる）であり、特に好ましいのはコレステロールまたはコレステロール誘導体、たとえばコレステロールサルフェートである。さらに好ましい実施態様において、ＲＯＲαへの物質の結合定数は、少なくとも１μＭ、好ましくは少なくとも１００ｎＭ、さらに好ましくは少なくとも１０ｎＭである。
【００３３】
さらに、ＲＯＲαのアゴニストおよびアンタゴニストが提供される。一実施態様では、ＲＯＲαのアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法が提供される。上記方法では、ＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表す原子座標の一またはそれ以上のセットで合理的な薬剤設計を実施することにより潜在的アゴニストまたはアンタゴニスト化合物を選択し、可能性のある化合物をＲＯＲαのＬＢＤと接触させ、ＲＯＲαの生物活性を測定する。選択は、典型的にはコンピューターモデリングと連係的に為される。可能性のある化合物は、それがＲＯＲαの生物活性を高める場合アゴニストとして、またはそれがＲＯＲαの生物活性を減じる場合アンタゴニストとして同定される。上記方法により同定されるアゴニストおよびアンタゴニストもまた提供される。アゴニストまたはアンタゴニストは、ＲＯＲαの天然リガンドにより用いられる結合ポケットに結合する必要は無いが、また別の位置で結合し、アロステリック的にその効果を発揮し得る。本発明によるアゴニストの好ましい具体例は、アゴニスト位置、すなわちＨ１２がＨ３−Ｈ４領域と一緒になって、補助活性化因子に関して適切な相互作用表面、すなわち完全ＡＦ−２を形成する位置にあるらせん１２（Ｈ１２）を安定させる化合物である（たとえば、Renaud & Moras、Cell.Mol.Life Sci.、５７、１７４８−１７６９、２０００で概説）。本発明によるアンタゴニストの好ましい具体例は、たとえばＨ１２の位置を傾けることによりＨ１２のアゴニスト位置を脱安定化する化合物である（たとえばRenaud & Moras、２０００、前出で概説）。Ｈ１２の脱安定化は、たとえば２６位に巨大置換基をもつコレステロール誘導体により、すなわちＴｙｒ５４０および／またはＨｉｓ５１７を置換することにより達成され得る。好ましい実施態様において、上記アゴニストまたはアンタゴニストは小分子である。特に好ましいのは、親油性小分子である。限定するわけではないが、例としては、たとえば脂肪酸、レチノイン酸、メラトニン、ステロイドホルモン、ビタミンＤ誘導体、ならびにタモキシフェンまたはラロキシフェンと類似した化合物またはその誘導体がある。一実施態様において、上記アゴニストまたはアンタゴニストは、コレステロールまたはコレステロール誘導体であり得る。本発明の好ましい実施態様において、コレステロールリガンドは、本発明により提供された構造情報を用いることにより、本発明により提供されるＲＯＲαのＬＢＤのリガンド結合ポケット（ＬＢＰ）により強く結合するコレステロール誘導体へ修飾されている。本発明により提供される構造情報を用いて設計されたより強く競合的に結合するコレステロール誘導体についての一例は、コレステロールサルフェートである（下記参照）。別の好ましい実施態様において、本発明は、アゴニスト位置にあるＲＯＲαのＨ１２を安定化させる化合物の治療有効量および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。関連実施態様において、本発明は、アゴニスト位置にあるＲＯＲαのＨ１２を脱安定化する化合物の治療有効量および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
一旦潜在的結合性物質、たとえばアゴニストまたはアンタゴニストが同定されると、それは化学物質のライブラリーから選択され得るかまたは別法として潜在的リガンドが新たに合成され得る。特異的化合物の１個または比較的小さい基でもその新たな合成は、薬剤設計技術において妥当である。見込みのある薬剤を標準結合検定法にかけることにより、特定ＲＯＲα機能、たとえば下記で例証されているＲＯＲαのＤＮＡ結合に対するその効果が試験され得る。適切な薬剤が同定されると、たとえばＲＯＲαのＬＢＤの結合ポケットおよび薬剤間に形成されたタンパク質‐リガンド複合体を含む補足的結晶を成長させ得る。好ましくは、結晶がＸ線を有効に回折することにより、タンパク質‐リガンド複合体の原子座標が５.０オングストロームより大きい、さらに好ましくは３.０オングストロームより大きいかまたは２.０オングストロームより大きい分解能まで測定され得る。補足的結晶の三次元構造は、分子置換分析により測定され得る。分子置換では、検索モデルとして既知三次元構造を用いることにより、新たな結晶形態の密接に関連した分子またはタンパク質‐リガンド複合体の構造を測定し得る。新たな結晶の測定されたＸ線回折特性を、検索モデル構造と比較して、新たな結晶におけるタンパク質の位置および配向をコンピューターで計算する。使用され得るコンピュータープログラムには、ＣＣＰ４プログラム総合ソフトウェア［Collaborative Computational Project、ナンバー４、Acta Cryst.Ｄ５３：７６０−７６３（１９９４）］のプログラム（ＡＭＯＲＥ、ＭＯＬＲＥＰ）またはＸ−ＰＬＯＲ［Brunger、X-PLOR v3.1 Manual、New Haven : Yale University,(1993)］がある。一旦位置および配向が判明すると、検索モデルを用いて電子密度地図を算出することにより、Ｘ線位相が提供され得る。その後、電子密度を構造差異について調べ、検索モデルを修正して新たな構造と同様にする。この方法を用いると、請求された構造を用いることによりＲＯＲα複合体のいずれかの上記ＬＢＤの三次元構造を解明することが可能である。本明細書に記載されている薬剤スクリーニング検定法の全てについて、薬剤の構造に対するさらなる精密化が一般的には必要であり、特定薬剤スクリーニング検定法により提供される工程のいずれかおよび／または全部の連続反復により為され得る。
【００３５】
合理的設計により同定された物質は、薬剤スクリーニング検定法でさらに分析され得る。本発明の薬剤スクリーニング検定法は、ＲＯＲαのリン酸化を増すことにより、ＲＯＲαを二量体化または別の核レセプターとヘテロ二量体化させることにより、補助活性化因子と相互作用するその能力を改良することにより、その立体配座を変えることにより、そしてそのＤＮＡ結合能力を高めることにより、リガンド結合後のＲＯＲαが遺伝子の転写調節を行う能力に関するものを含む、ＲＯＲαの官能性を測定するための若干の検定法のいずれかを使用し得る。一結合検定法では、ＲＯＲα結合部位を含む核酸を、コーティングまたは固体支持体上に置く。好ましい結合部位は、ハーフサイトＡＧＧＴＣＡの直前にある６ｂｐの高ＡＴモチーフにより構成される応答エレメント（ＲＯＲＥ）およびGiguere et al.、１９９４、Genes & Development ８：５３８−５５３、Mc Broom et al.、１９９５、Mol.Cel.Biol.１５：７９６−８０８、Moraitis & Giguere、１９９９；Molecular Endocrinology.１３：４３１−４３９で与えられているこの応答エレメントの可能な変異型である。核酸を固体支持体上に置く方法は、当業界ではよく知られており、核酸へのビオチン結合および固体支持体へのアビジンの結合を含む。ＲＯＲαを核酸と平衡状態にし、薬剤が結合を破壊するか促進するかを見るためにそれらを試験する。
【００３６】
別の検定法において、補助活性化因子タンパク質、たとえばＧＲＩＰまたはＤＲＩＰ２０５（Brandon‐Atkins et al.、１９９９、Molecular Endocrinology １３：１５５０−１５５７）、またはＳＲＣ１、ＮｃｏＡ−１、ＥＲＡＰ／Ｐ１６０、ＳＲＣ２／ＮｃｏＡ−２、ＡＣＴＲ、ＳＲＣ−３、ｐＣＩＰ、ＥＲＡＰ−１４０、ＲＩＰ１４０、ＲＩＰ１６０Ｐ／Ｃａｆ、ＣＢＰ／Ｐ）、ＡＲＡ７０、Ａｄａ３、Ｒａｐ４６、ＧＲＩＰ１７０、ＴＲＩＰ１、ＰＧＣ１および２、ＳＰＴ６、ＴＩＦα、ＳＷ１／ＳＮＵＥＲＦ、ＴＲＡＰ１００、ＴＲＡＰ２２０、ＤＲＩＰ、ＮＳＤ１（Robyr et al.、２０００、Mol.Endo.１４：３２９−３４７）を、コーティングまたは固体支持体上に置く。ＲＯＲαタンパク質は標識され得る。たとえば、一実施態様では、放射性標識ＲＯＲαタンパク質を用いて、結合に対する薬剤の効果を測定する。別の実施態様では、ＲＯＲαタンパク質の天然紫外線吸収を使用する。さらに別の実施態様では、補助活性化因子ペプチドでコーティングしたバイアコアチップ（ファルマシア）を使用し、表面伝導性の変化を測定し得る。さらに別の実施態様では、ＲＯＲαおよびそれらのＤＮＡ結合部位間の相互作用に対する有望薬剤（候補化合物）の効果を、活性化ＲＯＲαタンパク質を含むかまたは含むように誘導され得る生きている細胞において検定する。リポーター遺伝子、たとえばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは３−ガラクトシダーゼなどについての異種遺伝子を含む細胞を、ＲＯＲα結合部位を含むプロモーターに機能し得るように結合する。次いで、有望薬剤を細胞と接触させる。有望薬剤の不存在および存在下で生成されるリポーターの量（および／または活性）を測定し、比較する。生成されるリポーターの量（および／または活性）を減らす有望薬剤は、ＲＯＲα ＤＮＡ結合の候補アンタゴニストであり、生成されるリポーターの量（および／または活性）を増やす有望薬剤はＲＯＲα ＤＮＡ結合の候補アゴニストである。リポーター遺伝子産物の検出方法は文献で容易に入手できる。たとえば、ルシフェラーゼ検定法は、製造業者のプロトコール（プロメガ）にしたがって実施され得、ベータ‐ガラクトシダーゼ検定法は、Ausubel et al.により報告された要領［Current Protocols in Molecular Biology中、J. Wiley & Sons, Inc. (1994)］で実施され得る。一例において、トランスフェクション反応は、ＲＯＲαタンパク質を含むように修飾されたプラスミドによる細胞のトランスフェクションを含み得る。
【００３７】
一実施態様において、本発明方法により同定される有望薬剤は、当業界で公知の検定法を用いることにより薬理学的活性について試験され得る。たとえば、同定された有望薬剤は、国際公開第０１／２６７３７号で開示された方法を用いて過度の骨または軟骨喪失を伴う疾患または医学的状態の予防または処置について可能性のある薬剤としての活性について試験され得る。たとえば、リポーター検定法は、骨鉱化作用および再造形作用の既知モジュレーターである、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）またはオステオカルシン（ＯＣ）を用いて実施され得る。ＢＳＰまたはＯＣプロモーターがリポーター遺伝子、たとえばホタルルシフェラーゼ遺伝子を駆動するリポーター構築物により適切な細胞をトランスフェクションし得る。次いで、有望薬剤を細胞と接触させる。有望薬剤の不存在および存在下で生成されるルシフェラーゼ活性の量を測定し、比較する。別の実施態様において、本発明による有望薬剤の試験システムは、古典的卵巣切除ラットモデルの使用であり得、卵巣機能の喪失により、循環しているエストロゲンの低下が誘導され、直ちに骨量が減少する（Wronski et al.、Calcified Tissue International. ４５（６）：３６０、１９８９）。卵巣切除術の１２週間後に開始して８週間の治療処置期間中、薬剤を卵巣切除動物で試験し、骨鉱質密度をモニターする。８週間無傷の動物の予防的処置である別タイプの実験も予測され得る。
【００３８】
コレステロールは、ＲＯＲαのリガンドであることが見出された。この発見により、本発明は、ＲＯＲαに結合する化合物を同定する、特にＲＯＲα活性を調節する化合物を同定するための新規検定方法を提供し、それらの方法では、候補化合物およびＲＯＲα間の相互作用をコレステロール低減化、好ましくはコレステロール不含有環境で行わせる。かかる方法は、典型的には、（ａ）ＲＯＲαを候補化合物と接触させ、（ｂ）本質的にコレステロール不含有環境で候補化合物およびＲＯＲα間の相互作用を測定し、そして（ｃ）化合物がＲＯＲαと相互作用する場合にはそれを選択するという段階を含む。必要条件ではないが、コレステロール低減化、または好ましくは本質的コレステロール不含有環境で全方法‐段階を実施するのが好ましい。さらに好ましい実施態様において、かかる方法は真核生物細胞系に関するものである。さらに別のさらに好ましい実施態様では昆虫細胞を使用する。昆虫細胞は、新たなステロール合成能を欠くことにより真核生物細胞とは異なる。これらの細胞は、コレステロール不含有条件下で増殖され得ることが示されている（Cleverley et al.１９９７、Exp.Cell Res.２３３：２８８−２９６）。すなわち、かかる細胞系は、たとえば、適切な昆虫細胞ベクターでクローン化されたＲＯＲαおよび古典的リポーターＲＯＲＥｔｋｌｕｃを用いてＲＯＲαリガンドの活性をモニターするのに適切な細胞バックグラウンドを提供し得る。別の実施態様では、真核生物細胞、好ましくはヒト細胞を使用する。これらの細胞は、たとえば、本質的にコレステロール不含有の培地および本質的にＬＤＬ‐コレステロール不含有の血清（ＬＤＬ−不含有血清の調製物は、Goldstein et al、１９８３、Methods in Enzymology ９８：２４１−２６０に記載されている）中で培養され得る。哺乳類細胞は、コレステロールを内因的に生産することができる。本発明による本質的コレステロール不含有環境の意味は、内因的に生産された上記コレステロールを含まない。一実施態様において、内因的コレステロール生産性哺乳類細胞は、たとえば化合物の内因性コレステロール置換能力をスクリーニングする検定法で使用され得る。
【００３９】
核レセプターは、リガンド結合時に特異的遺伝子または遺伝子のセットの転写を調節することが知られており、そのため治療薬として有用な化合物についてスクリーニングするための興味深い標的とされている。しかしながら、これまでのところ、治療薬の開発に役立ち得るＲＯＲαの分子機構について理解を深めることは、ＲＯＲαのＬＢＤと結合するリガンドの情報を欠くことにより厳しく阻まれてきた。本発明によるレセプターＲＯＲαのリガンドとしてのコレステロールの同定により、ＲＯＲαの生理学的役割が新たに看破され、コレステロール関連疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαが提供されている。コレステロール生合成における欠損は、脳損傷、骨格欠損、骨硬化を伴う場合もあり、四肢発育不全または脊椎形成不全を含む様々な臨床的特徴に至らしめることが示されている（Nwokoro et al.、Mol Genet Metab ７４：１−２ １０５−１９ ２００１）。すなわち、コレステロール関連疾患は、内分泌疾患、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患、代謝性疾患、たとえば肥満、炎症性疾患、皮膚病、ＣＮＳ関連疾患、たとえばアルツハイマー病および細胞増殖およびアポトーシスにおける疾患、たとえば腫瘍関連疾患を含み得る。
【００４０】
一実施態様において、本発明は、内分泌疾患、特にステロイドホルモンの合成またはステロイド生成の調節に関連した疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。全ステロイド生成組織においては、合成されるホルモンとは関係無く、ステロイド生成細胞における初段階は、コレステロールから第一ステロイド、プレグネノロンへの変換である（Stocco、Ann Rev Physiol ６３：１９３−２１３、２００１）。
【００４１】
別の実施態様において、本発明は、コレステロールホメオスタシスの障害の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。コレステロールホメオスタシスの崩壊は病的状態を誘発し、最もよく起こるのはアテローム性動脈硬化症である。高コレステロール血症は、よく知られた危険因子である。スタチンを用いることにより、本発明は、ＲＯＲαの活性および強力な抗アテローム性動脈硬化性分子間の直接関連を示すことから（表５）、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患を抑える化合物を検索するための分子標的としてのＲＯＲαの有用性を立証している。
【００４２】
別の実施態様において、本発明は、代謝性疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。Ｃ／ＥＢＰおよびＰＰＡＲγが重要な役割を演じている事象のカスケードが脂質生成を開始させることは知られている。さらに、ＲＯＲαは、ＰＰＡＲγを強く誘導することができる（Sundvold et al.Biochem.Biophys.Res.Com.２８７：３８３−３９０、２００１）。ＳＲＥＢＰは脂質生成プログラムを促進し、ＳＲＥＢＰ活性は細胞内コレステロールのレベルに敏感である（Brown et al. Cell ８９：３３１−３４０、１９９７）。すなわち、本発明によると、ＲＯＲαは、２型糖尿病をまねき得る脂質生成、肥満の進展およびインスリン抵抗性に関連した疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的として提供される。さらに、成熟脂肪細胞は、免疫学的応答、血管疾患および食欲調節においてある一定の役割を演じる因子を分泌する。脂肪細胞由来因子には、レプチン、プロスタグランジン類およびレシスチンがある。すなわちＲＯＲαのリガンドとしてコレステロールを提供する本発明は、免疫応答、血管疾患および食欲調節に関連した疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。
【００４３】
最近、間葉幹細胞はこれら３系統に分化する潜在能力を有することが示された（Pittenger et al.、１９９９ Science ２８４：１４３−１４７）。すなわち、見かけ上の相互関係は、脂肪細胞および骨芽細胞表現型間に存在すると仮定される。この均衡は、骨粗そう症患者における脂肪細胞に向かってスイッチされる。本発明は、脂質生成経路または脂肪細胞、軟骨細胞または骨芽細胞系統への間葉幹細胞の分化における重要なプレーヤーとしてのＲＯＲα（ＰＰＡＲγまたはＣ／ＥＢＰとして）を提供する。すなわち、本発明は、脂質生成に向かうこのスイッチにおいてＲＯＲαを連結するため、骨粗しょう症における治療介入についての可能性のある標的である。
【００４４】
別の実施態様において、本発明は、炎症性疾患の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。分子リンクは、コレステロールおよびサイトカイン間で確立されており、アテローム発生における炎症および免疫性の掛かり合いを示している。さらに、ＲＯＲαは炎症に関与している（国際公開第０１／２６７３７号、Bourdji et al. J.Biol.Chem. ２７５：１２２４３−１２２５０、２０００、Delerive et al.、EMBO reports ２１：４２−４８、２００１）。
【００４５】
別の実施態様において、本発明は、皮膚病の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。ＲＯＲαは皮膚で高度発現される（Becker‐Andre、１９９３、Biochem.Biophys.Res.Commun. １９４：１３７１−１３７９）。さらに、コレステロール生合成の遺伝的障害をもつ患者の臨床観察は、羞明および円形脱毛ならびに小胞皮膚萎縮症を報告している。
【００４６】
別の実施態様において、本発明は、アルツハイマー病の処置に有用な化合物をスクリーニングするための標的としてのＲＯＲαを提供する。リポタンパク質対立遺伝子ＡｐｏＥ４は、アルツハイマー病の発病増加と関連している（Trittmatter et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA９０：１９７７−１９８１、１９９３）。海馬ニューロンにおける原形質膜コレステロールの枯渇により、Ａｂｅｔａ（アミロイドベータタンパク質、Simons et al. PNAS ９５：６４６０−６４６４、１９９８）、アミロイド前駆タンパク質の開裂産物、すなわち上記疾患の病因における主要因子の形成が阻害される。さらに、ＲＯＲαノックアウトマウスの主たる特徴は重い運動失調であり、それらの小脳は著しく萎縮している。これは、運動障害に陥りやすい稀な遺伝病に関与している。
【００４７】
実施例
（Ｈｉｓ）6ＲＯＲα-ＬＢＤ３０４-５５６のクローニングおよび発現
ＡＴＧコドンまでのポリヘドリン（多角体タンパク質）プロモーターの一部をコード化するＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＲＳ３６５（5’-ACCATCTCGCAAATAAATAAG-3’）およびＭＧ３８４（5’-ATGATGATGATGATGATGGC-TGCTGCCCATGGTGGGAACTCGAGGCCTGCAGGG-3’）を用いることによりｐＢＡＫＰａｃ８プラスミド（クロンテック）からのＰＣＲにより増幅する。ＭＧ３８４は、鋳型ＤＮＡには存在しないが、ＡＴＧコドンの正面にあるコザック配列をコード化する５'伸長部分および最終遺伝子操作ベクターに存在するＨｉｓ標識の一部を有する。第二ＰＣＲ反応は、ＲＯＲαタンパク質のリガンド結合ドメイン（ａａ３０４−ａａ５５６；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｐ３５３９８−１による番号付け）をコード化するプラスミド鋳型でのオリゴヌクレオチドＭＧ３８３（5’-GCCATCATCATCATCATC-ATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGCAGAATTAGAACACCTTGC-3’）およびＭＧ３８５（5’-GTACCAGATCTTCTAGATTCGTTACCCATCAATTTGCATTG-3’）により行なわれる。第一ＰＣＲフラグメントについては、オリゴヌクレオチドＭＧ３８３は、第一ＰＣＲフラグメントに存在する伸長部と相補的であり、ＭＧ３８４によるフラグメントの伸長により付加された５'伸長部を有する。新たな両フラグメントを混合し、ＭＧ３６５およびＲＳ３６５でのＰＣＲ増幅により、コザック配列、ＡＴＧ、（Ｈｉｓ）６‐標識およびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ開裂部位(Amersham Pharmacia)についての開裂部位をコード化する新たなフラグメントが、ＲＯＲαリガンド結合ドメインの正面に導入される。この新しいフラグメントは、標的プラスミドｐＢＡＫＰａｃ８と共通した２つの相同性領域を両末端に有する。遺伝子操作を加えた遺伝子のクローニングベクターへの組込みは、前述の方法（Geiser et al.、BioTechniques ３１ ８８−９２、２００１）を用いることにより行なわれる。生成したクローンのＤＮＡ配列解析により、クローンが意図された通りであることを確認する。このプラスミドをｐＸＩ３３８と称する。
【００４８】
リポフェクションを用いて、プラスミドｐＸ１３３８を、線状化ＢａｃＰＡＫ６（ＡｃＮＰＶ）ウイルスＤＮＡとＳｆ−２１昆虫細胞へコトランスフェクションする。５日後に採取したウイルス上清を、プラーク精製にかけて均一なウイルス集団を得、それに続いて小規模増幅し、ウエスタンブロッティングにより生産について分析する。分析された６個の細胞ペレット全部において抗ＲＯＲα抗体（サンタクルス、カタログ番号ｓｃ−６０６２）を用いることにより、正確なサイズのバンドが容易に検出され得る。一ウイルス分離株をさらなる増幅用に選択する。マスターウイルスストック、次いで作業ウイルスストックをＳｆ−９細胞でのさらなる増幅により生成する。力価をプラーク検定法により測定する。速度論実験により、７２時間１.８２×１０６細胞／ｍｌ（ＴＯＩ）での１ ＭＯＩを用いてＲＯＲα−ｓＬＢＤについての最適生産条件が示される。これらの条件下で、タンパク質の大きな分画は、昆虫細胞において可溶性のままである。２つのウェーブバイオリアクター作業を、上記条件下において各々約１０〜１３リットルで実施する。Heraeus Cryofuge Ｍ７０００における１０分間６０００ｇでの遠心分離により細胞を採取し、ペレットを−８０℃で貯蔵する。
【００４９】
（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ３０４−５５６の精製および特性確認
（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ３０４−５５６を、標準方法にしたがってＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー、次いでアニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。２０ｇの細胞ペーストから、１５ｍｇ前後の（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ３０４−５５６が精製される。タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーでは単量体として振るまう。Ｎ−末端配列解析は、Ｎ−末端が遮断されていることを示す。質量分析計による解析は、アセチル‐デスＭｅｔ−（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ３０４−５５６（Acet- GSSHHHHHHLEVLFQGPAELEH…MQIDG）に対応する３１５１５.４の均一分子質量を示す。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼによるＮ−末端６ｘＨｉｓ標識のタンパク質加水分解的開裂により、有用な結晶を生じないが均一のタンパク質が生じる。対照的に、非開裂ＲＯＲα−ＬＢＤは、Ｘ線回折解析に適切な結晶をもたらす。
【００５０】
結晶化
５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ ｐＨ７.５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ中の組換え体ヒトＲＯＲα−ＬＢＤを、１４ｍｇ／ｍｌに濃縮する。ハンプトン リサーチからのＶＤＸ結晶化プレートおよびシリコーン処理した顕微鏡カバーグラスと共に標準的蒸気拡散ハンギングドロップ設備を用いて結晶化を実施する。カバーグラス上で混合することにより結晶化小滴を作製する。２.０μｌのタンパク質ストック溶液を２.０μｌのレザーバー溶液と共に２０℃で７００μｌのレザーバー溶液に対して平衡状態にする。市販のスクリーニングキットを用いて、予備的な結晶条件を見出す。精密条件で、結晶は、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８.４、１９%ＰＥＧ６０００、０.２ＭのＣａＣｌ２のレザーバーにより２０℃で２週間以内に０.１５×０.１５×０.３ｍｍのサイズに成長する。天然結晶の空間群はＰ２１であり、単位格子パラメーターはａ＝５５.９オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム、β＝９８.７°および空間群Ｐ２１である。一非対称単位につき一単量体が存在する。結晶は、シンクロトロン（ＥＳＲＦでのＳＮＢＬ、グルノーブル）で少なくとも１.８８オングストロームに回折する。
【００５１】
Ｘ線データ収集
天然データ収集のため、上記要領で成長させた結晶を、約１０秒間２０％グリセリン（レザーバー組成物に加えて）を含む溶液５μｌに移す。次いで、結晶を迅速にナイロン製クリオループ（ハンプトン リサーチ）に載せ、１０５ＫでのＸ線データ収集用に冷窒素気流中で直接冷凍する。European Synchrotron Radiation Facilityのスイス−ノルウェジアン ビームラインのｍａｒ３４５イメージプレートシステム（λ＝０.８７２７オングストローム）により回折データを集める。各１.０°回転の合計２３０画像を、１７８ｍｍの結晶〜検出器距離（１８０ｍｍのリードアウトプレート直径を用いる）による時間モード（１フレームにつき１５秒）で集める。未処理回折データを処理し、ＨＫＬプログラム総合ソフトウェアのバージョン１.９６.６（OtwinowskiおよびMinor、１９９６）でスケールする。結晶データおよびネイティブデータのデータ収集統計を表４に示す。天然結晶の空間群はＰ２１であり、単位格子パラメーターは、ａ＝５５.９オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム、β＝９８.７°である。１非対称単位当たり１単量体が存在する。ウィルソンプロットにより推定されるＢファクターは２０（オングストローム）２である。Ｈｇ誘導体データ収集については、４ｍＭの酢酸メチル水銀を含む（レザーバー組成物に加えて）溶液５μｌに結晶を予め１時間浸す。次いで、天然結晶の場合と同様に低温冷却を実施する。European Synchrotron Radiation Facilityのスイス‐ノルウェジアン ビームラインのｍａｒ３４５イメージプレートシステム（λ＝０.８７２７オングストローム）により回折データを集める。各１.０°回転の合計２８７画像を、１７８ｍｍの結晶〜検出器距離（１８０ｍｍのリードアウトプレート直径を用いる）による時間モード（１フレームにつき１５秒）で集める。未処理回折データを処理し、ＨＫＬプログラム総合ソフトウェアのバージョン１.９６.６（OtwinowskiおよびMinor、１９９６）でスケールする。結晶データおよびＨｇ−誘導体データのデータ収集統計を表２に示す。Ｈｇ誘導体結晶の空間群はＰ２１であり、単位格子パラメーターは、ａ＝５５.６オングストローム、ｂ＝５０.０オングストローム、ｃ＝６０.１オングストローム、β＝９８.０°である。１非対称単位当たり１単量体が存在する。ウィルソンプロットにより推定されるＢファクターは２９（オングストローム）２である。
【００５２】
構造解明
ｐｂｄ−エントリ２ｌｂｄ（ｈＲＡＲγ）または１ｂｓｘ（ｈＴＲβ）の座標に基いた幾つかの異なるモデルを用いることによる、プログラムＡｍｏＲｅ（Navaza、１９９４）またはＭＯＬＲＥＰバージョン６.２.５.（Vagin & Teplyakov、J.Appl.Cryst. ３０、１０２２−１０２５、１９９７）による分子置換により構造を解明する試みは、成功していない。すなわち、水銀置換結晶に関する単波長実験からのデータを、ＳＩＲＡＳによる初回位相決定についてのネイティブデータセットと一緒に使用する。異常分散差および同形差パターソン地図は、少なくとも１個の共通した主要ピークを示す。観察された異常分散差を用いるＤＲＥＡＲ正規化（Blessing & Smith、J.Appl.Cryst.３２、６６４−６７０、１９９９）と共にＳｎＢバージョン２.１（Weeks & Miller、J.Appl.Cryst.３２、１２０−１２４、１９９９）を用いて、４個のＨｇ‐部位を決定する。それに続いて、ＭＬＰＨＡＲＥバージョン４.１（ＣＣＰ４、１９９４）を用いて、重原子パラメーターを精密化する。ＤＭ（ＣＣＰ４、１９９４）による後続の密度修正により、優れた実験的ＳＩＲＡＳ地図が得られる。ｍａｐｍａｎプログラムでの骨格化により、Ｏバージョン７.０（Jones et al.、Acta Crystallogr．Ａ４７：１１０−１９、１９９１）での連鎖トレーシングおよびモデルビルディングが可能となる。
【００５３】
精密化
タンパク質（残基Ｈｉｓ３０８−Ｐｈｅ５４４は可視電子密度を有していた）を構築し、１１２個の水分子を実験的ＳＩＲＡＳ地図へ挿入した後、数回の精密化および手動再構築の交互サイクルにより、Ｒｃｒｙｓｔ＝２８.１％（８オングストローム‐１.８８オングストローム）を有するモデルを作製することにより、ＬＢＰにおけるリガンドについての優れた２Ｆｏ−ＦｃおよびＦｏ−Ｆｃ地図が得られる。優れた品質の電子密度により、コレステ−５−エン−３ベータ−オール（コレステロール）であるものとしてリガンドが明白に同定され得る。次いで、コレステロールリガンドを電子密度へ構築し、Ｘ−ＰＬＯＲパラメーター‐および構造‐ファイルが、Ｘ−ＰＬＯＲパラメーター‐および構造‐ファイルの作成に使用され得るプログラムＸＰＬＯ２Ｄ（Kleyewgt G.、ＣＣＰ４／ＥＳＦ−ＥＡＣＢＭ Newsletter on Protein Crystallography ３１、４５−５０、１９９５）により作製され得る。さらに精密化および１１９個のさらなる水分子の挿入（合計２３１個の水分子となる）のサイクルにより、最終Ｒｃｒｙｓｔ＝２４.８%およびＲｆｒｅｅ＝２６.３％が得られる（シグマ カットオフ無し、８オングストローム〜１.８オングストローム、２５５９２特有反射の作業セット、１２７９反射の試験セット）。一般に、電子密度は、弱い密度を有するループ４９３−４９８以外、優れた品質を有する（残基３０８−５４４は、モデルに含まれる）。精密化は、タンパク質についてのEnghおよびHuberの力場（Engh & Huber、Acta Crystallogr.Ａ４７：３９２−４００、１９９１）を用いるＸ−ＰＬＯＲ３.１（A.Bruenger、Ｘ−ＰＬＯＲバージョン３.１：A system for X-ray Crystallography and NMR、Yale University Press, New Haven, CT, USA, 1992)で行なわれる。使用される連鎖識別子は、タンパク質についてのＡ（残基Ｈｉｓ３０８−Ｐｈｅ５４４、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｐ３５３９８−１による番号付け）、リガンドについてのＬ（コレステロール：残基１）および水分子についてのＶ（合計２３１）である。ｐｄｂ−ファイルでリガンドコレステロールについて使用される原子数は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる原子数と同じではない。
【化１】
【００５４】
モデルの品質を、Ｘ−ＰＬＯＲ３.１（A.Bruenger、同上、１９９２）およびＰＲＯＣＨＥＣＫｖ３.３（Laskowski et al.、J.Appl.Cryst.１９９２、２６：２８３−９１）で評価する（表３参照）。複合体ＲＯＲα／コレステロールの最終モデルは、良好な外面的形態を有し（ｒｍｓ結合長＝０.０１３オングストローム、ｒｍｓ結合角＝１.４６°）、ＰＲＯＣＨＥＣＫｖ３.３により測定されたところによると、ラマチャンドラン（Ramachandran）プロットの不認可領域に残基は無い。分子グラフィック写真は、Ｏバージョン７.０（Jones et al.、同上、１９９１）により作製される。
【００５５】
表１：
【表１】
【００５６】
表２：
【表２】
【００５７】
表３：
【表３】
【００５８】
ＲＯＲα−ＬＢＤの全体構造
ＲＯＲα−ＬＢＤは、ＮＲ−ＬＢＤについての標準的な折りたたみ構造をとり（Wurtz et al.、Nat Struct Biol ３、２０６、１９９６）、加えて２個のらせんＨ２＊およびＨ１１＊を有する。Ｈ１２の位置により判断すると（図２および３も参照）、ＲＯＲα−ＬＢＤはアゴニスト結合状態にある。この位置にあるＨ１２は、Ｈ３−Ｈ４領域と一緒になって、補助活性化因子についての適切な相互作用表面、すなわち完全ＡＦ−２を形成する（Renaud & Moras、Cell.Mol.Life Sci.、５７、１７４８−１７６９、２０００で概説）。この結晶構造を得るために補助活性化因子ペプチドが付加されることはない。追加のＨ２＊らせんはまた、ペルオキシソーム増殖因子−活性化レセプター（ＰＰＡＲ；Nolte et al.、Nature、３９５、１３７−１４３、１９９８）についてはＨ２およびＨ３間に見出される。Ｈ１１＊は、既知ＬＢＤ構造の中でＲＯＲα−ＬＢＤ（およびＲＯＲβ−ＬＢＤ、Stehlin et al.、Embo J.、２０、５８２２−５８３２、２００１）に特有なものである。それは、ＲＡＲのループ１１−１２の中間部分と概ね重なり合う。ＲＯＲα−ＬＢＤの全体構造は、ＲＯＲβ−ＬＢＤの一つと類似しているが（例、Stehlin et al.、同上、２００１における図４により判断）、ＲＯＲβ−ＬＢＤの座標は入手できないため、ＲＯＲα−ＬＢＤとの定量的比較は為され得ない。ＲＯＲα−ＬＢＤについては、リガンドについての推定エントランス部位（複合体の溶媒接近可能表面により判断）は、Ｈ２およびＨ３間に位置し、たとえばＲＡＲ−γについて仮定されているように（Renaud et al.、３７８、６８１−６８９、１９９５）、Ｈ１２側ではない。結晶では、非対称単位のＲＯＲα−ＬＢＤ分子は、近隣分子とは二量体を形成しない。これは、天然ゲルではＲＯＲα−ＬＢＤが単量体としてふるまうという発見と一致する。以下のＣｙｓ残基は酢酸メチル水銀と反応した（Ｈｇ部位の分率座標については表２参照）：Ｃｙｓ３２１（部位３）、Ｃｙｓ４２９（部位１）、Ｃｙｓ５０５（部位４）およびＣｙｓ５１４（部位２）。すなわち、これらの反応性Ｃｙｓ残基はＳｅｒへの突然変異についての候補であり、その結果恐らくはE.coliでの可溶性発現が獲得される。結晶化セットアップに存在するタンパク質種は、以下の配列Ｈｉｓ６−標識およびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位およびＲＯＲα−ＬＢＤの残基３０４−５５６：
【表４】
【００５９】
リガンドの同定およびリガンド結合ポケットの説明
ＣＳＤ（エントリＦＩＺＤＵＮ）からの２６−ＯＨ−コレステロールの小分子Ｘ線構造は、この不偏電子密度への完全明白なフィット（２６−ＯＨ基の除去およびＣ２４−Ｃ２５結合周囲での１２０°回転後）を示す。すなわち、高分解能の優れた品質により、リガンドはコレステ−５−エン−３ベータ−オール（コレステロール）として同定され得る。ＲＯＲαのリガンド結合ポケットさらに精密に調べると、コレステロールの末端イソプロピル基のＣ２７がＴｒｐ３５３の側鎖とｖｄＷ接触をもち、Ｃ２６がＩｌｅ３６０の側鎖とｖｄＷ接触をもっていることが判る。Ｃ２６における置換基は、Ｈ１２の位置に影響を及ぼす可能性を有する（例、Ｃ２６における巨大置換基は、Ｈ１２をそのアゴニスト位置から除去し得るため、コレステロールのアンタゴニスト的誘導体を誘導する）。この結晶構造におけるＨ１２は、アゴニスト位置をとる。それは、ＯＨ−Ｔｙｒ５４０（Ｈ１２）およびＮＥ２−Ｈｉｓ５１７（Ｈ１１）間の水素結合（距離２.８オングストローム）によりアゴニスト位置で安定している。これら２残基は、ＲＯＲのα−、β−およびγ−のイソ型間で変換される。
【００６０】
ＬＢＰは、分子間水素結合（ＯＨ−Ｔｙｒ５４０およびＮＥ２−Ｈｉｓ５１７間の距離は２.８オングストロームである）を形成するＴｙｒ５４０およびＨｉｓ５１７以外、ＡＦ−２側では本質的に疎水性である（Ｈ５ Ｎ−末端、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１２）。ＬＢＰは、Ｈ３側（ループ１−２、Ｈ３、Ｈ５ Ｃ−末端）で極性が高い。ループ１−２におけるＧｌｎ３２２およびＴｙｒ３２３の主鎖ＮＨおよびＨ５におけるＡｒｇ４００およびＡｒｇ４０３の側鎖は、正の静電ポテンシャルの発生に寄与する。すなわち３−オール基における負に荷電した置換基（例、ＳＯ４−）は、かなり親和力が増強された誘導体を生じる（図４）。親水性部分には１２個の水分子が整列している。これらの水分子のうち５個は、最低のＢファクターを有する［１４（オングストローム）２〜２４（オングストローム）２］７水分子（合計２３１水分子のうち）の中にある。コレステロールの３−オール基は、整列した水分子のネットワークを介して、ＮＥ-Ａｒｇ４０３、ＮＨ２-Ａｒｇ４０３、ＣＯ-Ａｒｇ４００、ＮＨ１-Ａｒｇ４００、ＮＨ-Ｔｙｒ３２３、ＯＥ１-Ｇｌｎ３２２およびＮＨ-Ｇｌｎ３２２との水介在水素結合を成している。
【００６１】
リガンドについての平均Ｂ値［２０.１（オングストローム）２］は、タンパク質についての平均Ｂ値［３８.３（オングストローム）２］より低く、コレステロールの全非水素原子についての優れた電子密度が認識できるという事実と一致している。すなわち、コレステロールは、ＬＢＰにおいて十分に特定された単一立体配座をとる。これは、ＲＯＲβ−ＬＢＤに存在する非天然リガンドステアリン酸について報告された（Stehlin et al.、同上、２００１）多重低エネルギー立体配座とは対照的である。以下の残基は、リガンドコレステロールに対し４オングストロームより近位に非水素原子を有する：Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ３５６、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ａｌａ３６３、Ｖａｌ３９７、Ａｒｇ４００、Ｍｅｔ４０１、Ｖａｌ４１２、Ｔｙｒ４１３、Ｐｈｅ４１４、Ｐｈｅ４２４、Ｌｅｕ４２７、Ｐｈｅ４３２、Ｖａｌ４３６およびＨｉｓ５１７。
【００６２】
ＲＯＲαのＬＢＤに結合するコレステロール誘導体の設計
全般的に、ＬＢＰへのリガンドコレステロールのフィットは非常に良好である。にもかかわらず、リガンドのｖｄＷ‐表面と、ＬＢＰのｖｄＷ‐表面を比較すると、依然としてコレステロールの誘導体化についての可能性が僅かに存在し（図４および５）、親和力が増強され得ることが示される。追加の水素結合は、６位（ＯＥ１−Ｇｌｕ３６２への水を介した水素結合）、１９位（ＣＯ−Ｔｙｒ４１３への水素結合）または２６位（ＯＨ−Ｔｙｒ５４０および／またはＮＥ２−Ｈｉｓ５１７への水素結合）に付加されたヒドロキシ基により得られる。かなりの静電気相互作用エネルギーが、３位に付加された荷電基、たとえばＳＯ４−により得られる（ＮＨ１−Ａｒｇ４００、ＮＨ２−Ａｒｇ４０３、ＮＥ−Ａｒｇ４０３、ＮＨ−Ｇｌｎ３２２および／またはＮＨ−Ｔｙｒ３２３への水分子を介した水素結合および静電気相互作用）。さらなるｖｄＷ相互作用は、１２位（Ｐｈｅ３９８、Ｍｅｔ４０１の側鎖へのｖｄＷ接触）、１８位（Ｖａｌ４１２、Ｐｈｅ３９８の側鎖へのｖｄＷ接触）、２７位（Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ４２９、Ｐｈｅ４３２の側鎖へのｖｄＷ接触）に付加された追加メチル基または２１位（Ｐｈｅ４２４、Ｉｌｅ４３３、Ｖａｌ４３６、Ｐｈｅ４３７の側鎖へのｖｄＷ接触）に付加された追加エチル基により得られる。４および６位における修飾は、必要ならば、あまり親和力を変えることなく物理化学的または薬物動態パラメーターを修正するのに使用され得る。巨大置換基を伴う２６位における誘導体は、Ｈ１２をそのアゴニスト位置で脱安定化する可能性を有するため、誘導体にアンタゴニスト的活性を与える。
【００６３】
コレステロールについての作用機構
本Ｘ線構造は、以下の構造的作用機構を促す：コレステロール（または恐らくはコレステロール誘導体）はＨ２,Ｈ３側からＬＢＰに入り、これは恐らくはＡｒｇ４００およびＡｒｇ４０３から発生した静電界により導かれたと思われる。次いで、コレステロール（またはこの位置にある誘導体）のイソプロピル末端は、ＬＢＰの他端に影響を及ぼし、これがＨ１２と接触をもつことにより、ＬＸＸＬＬ−結合部位への補助活性化因子の結合を調節する。Ｃ２６に巨大置換基を伴うコレステロール誘導体は、そのアゴニスト立体配座からＨ１２を置換することにより、補助活性化因子結合を阻止し、さらにＴｙｒ５４０およびＨｉｓ５１７間の水素結合を安定させるコレステロール誘導体はアゴニスト立体配座をさらに強化する。
【００６４】
ＲＯＲα‐ＬＢＤの選択された突然変異
ＲＯＲα‐ＬＢＤ Ｘ線構造からの座標を用いて、コレステロールの結合を阻止すべきＬＢＰにおける一連の点突然変異が設計され、加えてＴｙｒ５４０（Ｈ１２）およびＨｉｓ５１７間の水素結合の喪失によりＨ１２安定化を阻止／低減化すべき突然変異が提案される（Ｔｙｒ５４０‐＞Ｐｈｅ５４０突然変異）。突然変異の詳細は下記に包含される。
【表５】
【００６５】
一時的トランスフェクション実験では、ＲＯＲα突然変異体の転写活性を、それらの野生型対応物質と比較する。Ｕ２ＯＳ細胞を、ＲＯＲαについての共通応答エレメントをもつルシフェラーゼリポーター遺伝子（ＲＯＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃ）と一緒にＲＯＲα（ＲＯＲ）またはその突然変異形態についての発現ベクターでトランスフェクションする。ルシフェラーゼ活性を、６ウェルプレートからの細胞で検定し、野生型ＲＯＲα発現プラスミドでトランスフェクションした細胞での活性と関連づける。結果をタンパク質含有率に対して正規化する。図は平均±ＳＤを示し、左パネルでは結果を野生型ＲＯＲαの活性と比べた誘導％として表す。表４で示されている通り、ＬＢＰにおける全突然変異（ただし突然変異Ｐｈｅ４３２‐＞Ｔｒｐ４３２を除く）は、ＲＯＲαの転写活性を顕著に／徹底的に低減化することから、事実上ＲＯＲαの活性形態がコレステロールに結合しているという結論に達する。突然変異Ｔｒｐ４３２の側鎖は、Ａｒｇ５１６およびＬｙｓ５２０の側鎖もまたそれらの立体配座を相応じて変える場合に、ＬＢＰにおけるコレステロールとの立体衝突が起こらない立体配座をとる可能性を有する。これら２残基は表面にあり、それらの側鎖立体配座は相互作用により安定化されないため、これは、ＬＢＰにおける他の突然変異とは対照的に、Ｐｈｅ４３２‐＞Ｔｒｐ４３２突然変異についての転写活性が僅かしか失われず、コレステロールとの立体衝突を阻止する可能な代替的側鎖立体配座が無いことの説明となる。突然変異Ｔｙｒ５４０‐＞Ｐｈｅ５４０は転写活性の約４０％の喪失をまねくことから、Ｔｙｒ５４０およびＨｉｓ５１７間の水素結合がかなりの量でアゴニスト位置にあるＨ１２の安定化に寄与することがわかる。
【００６６】
表４
【表６】
【００６７】
ＲＯＲα転写活性に対するＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤、フルバスタチンの効果
哺乳類細胞は、リポタンパク質（ＬＤＬ−コレステロール）からの取込によりコレステロールを受け取り、メバロン酸塩経路を通じてコレステロールを合成することができる。細胞が本質的にステロール不含有の条件下で培養される状況において、主要転写因子、ＳＲＥＢＰは、タンパク質加水分解的に開裂され、これが転写因子を核に放出する。この転写因子は、ＨＭＧ‐ＣｏＡレダクターゼを転写活性化することができ、これがメバロン酸塩経路を通したコレステロール生合成における重大な段階である。高コレステロール状態についての既知薬剤であるスタチン類は、ＨＭＧ‐ＣｏＡレダクターゼの特異的阻害剤である。細胞をステロール不含有培地で培養するとき、それらのＨＭＧ‐ＣｏＡレダクターゼは強く活性化される。この実験では、本質的にステロール不含有培地で培養された細胞を、フルバスタチンで処理する。ＲＯＲα活性の明らかな減少が観察されることから、細胞内コレステロールレベルの低下は、ＲＯＲα転写活性の減少により翻訳されるという結論に導かれる（表５）。Ｕ２ＯＳ細胞を、ＲＯＲαについての共通応答エレメントをもつルシフェラーゼリポーター遺伝子（ＲＯＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃ）と一緒にＲＯＲα（ＲＯＲ）用発現ベクターでトランスフェクションする。ルシフェラーゼ活性を６ウェルプレートからの細胞で検定し、フルバスタチン処理を伴うかまたは伴わなわずにトランスフェクションされた細胞での活性と関連づける。結果をタンパク質含有率に対して正規化する。
【００６８】
表５：
【表７】
【００６９】
ＲＯＲＥに結合するＲＯＲαのコレステロールサルフェート阻害
コレステロールサルフェート（表６における化合物番号１２）を含む様々なコレステロール誘導体を、本質的にコレステロール不含有培地でＲＯＲαのＲＯＲＥへの結合についてスクリーニングする。ＲＯＲαタンパク質は、バクロウイルス系で発現される。他の化合物は、番号２：５α−コレスタン−３−オン（ステラロイドＣ４５５０）、３：４−コレステン−３α−オール（Ｃ６０９０）、４：５−コレステン−３β,６−ジオール（Ｃ６４１８）、５：５−コレステン−３β,７α−ジオール７−ベンゾエート（Ｃ６４２５）、６：５−コレステン−３β,７β−ジオール７−ベンゾエート（Ｃ６４３８）、７：５−コレステン−３β,１９−ジオール（Ｃ６４７０）、８：５−,２５Ｒ−コレステン−３β,２６−ジオール（Ｃ６５７０）、９：５−コレステン−２４β−エチル−３β−オールアセテート（Ｃ６６８１）、１０：５−コレステン−３α−オール（Ｃ６７３０）、１１：５−コレステン−３β−オール（Ｃ６７６０）、１２：５−コレステン−３β−オールサルフェート、ナトリウム塩（Ｃ６９０５）、１３：７,（５α）−コレステン−３β−オール（Ｃ７４００）、１４：７−デヒドロコレステロール（フルカ３０８００）である。これは、Ｘ線構造により予測された通り、コレステロールサルフェートがコレステロールを置換できることを示している。
【００７０】
ＲＯＲアルファ転写活性に対するコレステロールおよびコレステロール誘導体の効果
次に、我々は、コレステロールを部分的に枯渇させた真核生物細胞において、ＲＯＲα転写活性がコレステロールを加えることにより再構成され得るか否かを確立する。したがって、我々は、細胞をヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）、コレステロールシャトルとして機能することが知られているシクロデキストリン誘導体で処理する。ＨＰＣＤ処理は、細胞内コレステロールの部分枯渇を目指す実験で使用される。メバロン酸塩経路の活性化を通じて細胞内コレステロールの増加を阻止するため、同じく細胞をロバスタチンで処理し、ＬＤＬ不含有血清を含む培地でそれらを培養する。ＨＰＣＤおよびロバスタチンの組合せを用いることにより、ＲＯＲＥリポーターの転写は、コレステロール、エピコレステロールおよびコレスタノールに応答し、さらに高い度合でコレステロールサルフェートおよび７−デヒドロコレステロールにより刺激されることがわかった。対照的に、試験された全ヒドロキシコレステロールは、顕著な活性を示すことはなく、コレステロール誘導体５−コレステン−２４β−エチル−３β−オール−アセテートは、賦形剤と比べてもＲＯＲα転写活性の増加を全く誘発しない（表６）。これらのデータは、我々のＲＯＲαのＸ線構造を用いたコレステロール誘導体に関するドッキング試験と十分な相関関係を示す。
【００７１】
表６：
【表８】
【００７２】
質量分析法によるリガンド交換スクリーニング
（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ２６９−５５６を、Ｓｆ９細胞で製造し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。１３５μＭ濃度のトリス−ＨＣｌ緩衝液中のタンパク質を、１０倍モル過剰の２５−ヒドロキシコレステロール（５−コレステン−３ベータ,２５−ジオール）またはコレステロールサルフェート（５−コレステン−３ベータ−オール−サルフェート）と４℃で一晩インキュベーションする。質量分析前に、タンパク質を、製造業者の使用説明書にしたがって使い捨てＣｅｎｔｒｉ Ｓｐｉｎ２０カラム(Princeton Separations, Adelphia, NJ)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７.０）中での高速緩衝液交換にかける。マイクロマスＺ型エレクトロスプレーイオン化ソース（ＥＳＩ）を備えたＱ−Ｔｏｆ（Micromass, Manchester, UK）四重極飛行時間型ハイブリッドタンデム質量分析計を用いて、質量分析法を実施する。捕捉質量範囲は、典型的には５秒でｍ／ｚ１５００〜４５００である。質量分析法を調整することにより、非共有結合複合体の多価核種の検出が可能となる。ソース遮断温度および脱溶媒和温度をそれぞれ５０℃および８０℃に保つ。試料コーン電圧（Ｖｃ）を標準測定用の２３ボルトにセットする。インソース誘導フラグメンテーション実験を、Ｖｃを１００ボルトまで高めることにより実施する。タンパク質溶液を１０μＬ／分の流速で注入する。データを記録し、Ｍａｓｓｌｙｎｘソフトウェアを用いて処理する。ＭａｘＥｎｔ分析ソフトウェア（マイクロマス、マンチェスター、英国）を用いて、スペクトルをデコンヴォルーションする。結果は、２５−ＯＨコレステロールおよびコレステロールサルフェートが両方ともＲＯＲ−ＬＢＤに結合したコレステロールを完全に置換できることを示している。さらに、リガンド／ＲＯＲ−ＬＢＤ−複合体およびアポ−ＲＯＲ−ＬＢＤ（リガンド無し）間の様々なコーン電圧（Ｖｃ）での比較は、コレステロールおよび２５−ＯＨコレステロールがインソース衝突に対して類似した安定性を有することを示している。対照的に、コレステロールサルフェート／ＲＯＲ−ＬＢＤ複合体は、コレステロールまたは２５−ＯＨコレステロール複合体よりも安定している。
【００７３】
２.２０オングストローム分解能での複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールサルフェートの結晶化およびＸ線構造：構造に基く設計の一例
複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールサルフェートに関する全アミノ酸残基（例、添付のコレステロールサルフェートとの複合体の座標、表９）を、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリＰ３５３９８（３３を引いた図１に示されたＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｐ３５３９８−１による所定のアミノ酸の番号に対応する）のスプライス変異型アルファ−１（すなわちＰ３５３９８−２）にしたがって番号づけする。複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールに関する全アミノ酸残基（例、添付のコレステロールとの複合体の座標、表８）を、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリＰ３５３９８のスプライス変異型アルファ−２（すなわちＰ３５３９８−１）にしたがって番号づけするが、ただし、使用された番号づけがＰ３５３９８−２にしたがっている図７〜１１を除き、コレステロールサルフェート複合体との比較検討におけるものを除く。請求の範囲に明記されている全アミノ酸残基を、図１に示された、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリＰ３５３９８のスプライス変異型アルファ−２（すなわち、Ｐ３５３９８−１）にしたがって番号づけする。
【００７４】
コレステロールサルフェートがＲＯＲ（アルファ）のリガンドであるという提案は、１.６３オングストローム分解能で以前に測定したＲＯＲ（アルファ）／コレステロールのＸ線構造を用いた、構造に基く設計の結果である。特に、後者のＸ線構造は、水分子が置換されている場合、ＬＢＰの親水性部分にコレステロールのヒドロキシ基に結合した置換基のための空間があることを示している。３個のアルギニン（Ａｒｇ２９２、Ａｒｇ３７０およびＡｒｇ３６７）および２個の遊離バックボーンアミド窒素（ＮＨ−Ｇｌｎ２８９およびＮＨ−Ｔｙｒ２９０）の存在は、少なくとも２個の水素結合アクセプター官能基（例、硫酸基）をもつ負に荷電した置換基を強く示唆している。ドッキング試験は、コレステロールサルフェートがコレステロールよりも高い親和力を有するという予測を導く。それに続いて、事実上ＲＯＲ（アルファ）ＬＢＤに結合したコレステロールがコレステロールサルフェートにより置換され得ることがＭＳ分析により示される。
【００７５】
次いで、複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールサルフェートは共結晶化され得、複合体のＸ線構造は２.２０オングストローム分解能で解明され、２０オングストローム〜２.２０オングストロームのデータについてＲｃｒｙｓｔは１９.４％およびＲｆｒｅｅは２１.９％である。観察された結合モードは以下の特徴を示す：
【００７６】
１）コレステロールサルフェートおよびコレステロールは類似した全般的結合モードを有するが、コレステロールサルフェートはＬＢＰの親水性正荷電部分に向かって僅かに（例、対応するＣ３原子は０.８５オングストロームほど）置き換えられている。これは、硫酸基により為された静電気および水素結合相互作用の最適化により説明され得る。
【００７７】
２）ＬＢＰの親水性部分におけるコレステロールについて存在する７個の整列した水分子は、コレステロールサルフェートとの複合体により置換されている。硫酸基およびＮＨ１−Ａｒｇ３６７およびＯ−Ａｌａ３３０間の相互作用を仲介する唯一保存された水分子は依然として存在する。
【００７８】
３）硫酸基は、ＮＨ−Ｇｌｎ２８９、ＮＨ−Ｔｙｒ２９０およびＮＨ１−Ａｒｇ３７０との直接水素結合相互作用を成す。これはドッキング仮説を確認するもので、コレステロールサルフェートの提案を導く。
【００７９】
４）コレステロールおよびコレステロールサルフェートとのＲＯＲ（アルファ）の複合体のタンパク質部分における唯一の顕著な変化は、Ｉｌｅ３２７の側鎖およびループ１〜２（残基Ｇｌｎ２８９およびＴｙｒ２９０）について起こる。
【００８０】
分子生物学、発酵、精製およびＭＳ分析
構築物（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ２７０−５２３の生成、発酵および精製は、上記要領で行なわれる。コレステロールサルフェートによるコレステロールの置換は３７℃で行なわれ、ＭＳ分析により確認される。コレステロールサルフェートをＤＭＳＯに５０ｍＭで溶かし、７３μＭの（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ２７０−５２３溶液に１.０ｍＭ最終濃度で加える。生成した溶液を３７℃で一晩インキュベーションし、ＳＰＸ７５カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した後、結晶化試験用に１７.６ｍｇ／ｍｌに濃縮する。天然複合体のＭＳ測定を前記要領で行う（Kallen et al.、Structure、第１０巻、１６９７−１７０７、２００２）。同量のＲＯＲαＬＢＤタンパク質を５％ＤＭＳＯと同一条件下でインキュベーションすることにより、対照実験を行う。タンパク質濃度は、５０ｍＭのＡｃＯＮＨ４（ｐＨ７.０）中約１５μＭである。Ｖｃ＝２０ボルトの同一条件下で両スペクトルを記録する。
【００８１】
結晶化
結晶化に使用されるタンパク質は、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５ｍＭのＤＴＴ中１７.６ｍｇ／ｍｌである。結晶化条件について最初からの検索に取りかかる。ハンプトン リサーチ製のＶＤＸ結晶化プレートおよびシリコーン処理した顕微鏡カバーグラスによる、標準蒸気拡散ハンギングドロップ設備を用いて、試験を実施する。１.０μｌのタンパク質ストック溶液を１.０μｌの結晶化溶液とカバーグラス上で混合することにより、結晶化小滴を４℃でセットアップする。
【００８２】
Ｘ線データ収集：ほぼ正確な大きさ６０μｍ×６０μｍ×２００μｍの単結晶を、ナイロン製ＣｒｙｏＬｏｏｐ（ハンプトン リサーチ）により固定し、１００ＫでのＸ線データ収集用に冷窒素気流中で急速冷凍する。マレサーチ（Marresearch）ＣＣＤ検出器および０.９２００オングストローム波長での入射単色Ｘ線ビームを用いて、スイス ライト ソース（３００ｍＡで稼動）、ビームラインＸ０６ＳＡで回折データを集める。１フレーム当たり９秒の曝露時間および１５０ｍｍの結晶〜検出器距離を用いて、合計２２６画像を各１.０°回転により集める。未処理回折データを処理し、ＨＫＬプログラム総合ソフトウェアバージョン１.９６.１（OtwinowskiおよびMinor、１９９６）でスケーリングする。ウィルソンプロット分析による推定Ｂファクターは３２.９（オングストローム）２である。結晶データおよびデータ収集統計を表７に示す：
表７：
【００８３】
【表９】
【００８４】
構造決定および精密化：１.６３オングストローム分解能に精密化した複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールの座標を標準モデルとして用いて構造を決定する。プログラムＲＥＦＭＡＣバージョン５.０（ＣＣＰ４、Acta Crystallogr．Ｄ５０、７６０−７６３、１９９４）を精密化に使用する。バルク溶媒補正、初期異方性Ｂファクター補正および抑制等方性原子Ｂファクター精密化を適用する。精密化標的は振幅を用いる最尤標的である。構造因子振幅においてシグマカットオフは適用されない。特有反射の５.０％（８２９）を含む試験セットを用いて、精密化中終始、交差検定を使用する。水分子は、プログラムＡＲＰ／ｗＡＲＰにより同定され、差異ピーク高（３.０σより大）および距離基準に基づいて選択される。７０（オングストローム）２より大きい温度因子をもつ水分子は拒絶される。プログラムＯバージョン７.０（A.Jones et al.、１９９１）をモデル復元に使用する。最終モデルについての精密化統計値を表２に示す。複合体ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールサルフェートの最終モデルは、良好な外面的形態（ｒｍｓ結合長＝０.０１４オングストローム、ｒｍｓ結合角＝１.４１°）を有し、残基は、ラマチャンドランプロットの不認可領域には無い。
【００８５】
結晶化、データ収集：データ収集に使用する結晶は、０.２ＭのＭｇＣｌ２、１６％ｗ／ｖＰＥＧ４０００、０.１ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８.５から成る適切な溶液より得られる。結晶は、６週間以内に０.２ｍｍまでの最大大きさに達した。すなわち、コレステロールサルフェートとＲＯＲαＬＢＤの複合体は、ａ＝５４.４オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム、β＝９７.８°、Ｐ２１および１複合体／非対称単位の結晶形態で結晶化され、これはコレステロールとの複合体で以前に得られた結晶形態と類似している。
【００８６】
ＲＯＲ（アルファ）に結合したコレステロールサルフェートの立体配座およびその相互作用：一般に、電子密度は、弱い密度しかもたないアミノ酸４６１−４６４（Ｌ９−１０）以外、優れた質を有する。精密化モデルのタンパク質部分は、Ｈｉｓ標識からの最終２個のＨｉｓアミノ酸、次いでＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）部位（ＬＥＶＬＦＱＧ）およびＲＯＲα−ＬＢＤのアミノ酸２７１−５１１により構成される。精密化モデルはまた、２５６個の水分子および１個のコレステロールサルフェート分子を含む。硫酸基により、ＮＨ−Ｇｌｎ２８９（３.０オングストローム）、ＮＨ−Ｔｙｒ２９０（２.９オングストローム）との直接水素結合相互作用およびＮＨ１−Ａｒｇ３７０（３.０オングストローム、３.１オングストローム）との二座配位相互作用を為す。水介在相互作用は、ＮＨ１−Ａｒｇ３６７により為される。
【００８７】
ＲＯＲ（アルファ）ＬＢＤに結合したコレステロールサルフェートおよびコレステロールのＸ線構造の比較
図１０は、コレステロールおよびコレステロールサルフェートとのＲＯＲ（アルファ）複合体についての重ね合わせ（各ＬＢＤのＣαを用いる）を示す。重ね合わせ後の残基Ｐｒｏ２７０−Ｐｈｅ５１１のＣα原子についてのｒ.ｍ.ｓ.ｄは０.２６オングストロームである。タンパク質部分における唯一の顕著な変化は、Ｉｌｅ３２７の側鎖およびループ１−２（残基Ｇｌｎ２８９およびＴｙｒ２９０）について生じる：Ｇｌｎ２８９およびＴｙｒ２９０についてのバックボーンＮＨ原子は、硫酸基との相互作用を改善するために、硫酸基に向かって約０.８オングストロームほど移動する（各側鎖の同時移動を伴う）。Ｉｌｅ３２７の側鎖は、末端イソプロピル基との立体衝突を回避するために僅かに移動しなければならない（図９）。比較結果は、コレステロールサルフェートおよびコレステロールが類似した全般的結合モードを有するが、コレステロールサルフェートはＬＢＰの親水性正荷電部分に向かって僅かに（例、対応するＣ３原子は０.８５オングストロームおよび対応するＣ２原子は０.７オングストロームほど）置き換えられていることを示す（図９）。これは、硫酸基により為される静電気および水素結合相互作用の最適化により説明され得る。ＬＢＰの親水性部分におけるコレステロールについて存在する７個の整列した水分子は、コレステロールサルフェートとの複合体では置き換えられている（図１０）。硫酸基およびＮＨ１−Ａｒｇ３６７およびＯ−Ａｌａ３３０間の相互作用を仲介する唯一保存された水分子は依然として存在している。硫酸基は、ＮＨ−Ｇｌｎ２８９、ＮＨ−Ｔｙｒ２９０およびＮＨ１−Ａｒｇ３７０との直接水素結合相互作用を為す。これはドッキング仮説を確認するもので、コレステロールサルフェートの提案が導かれる。
【００８８】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【表４３】
【００８９】
【表４４】
【表４５】
【表４６】
【表４７】
【表４８】
【表４９】
【表５０】
【表５１】
【表５２】
【表５３】
【表５４】
【表５５】
【表５６】
【表５７】
【表５８】
【表５９】
【表６０】
【表６１】
【表６２】
【表６３】
【表６４】
【表６５】
【表６６】
【表６７】
【表６８】
【表６９】
【表７０】
【表７１】
【表７２】
【表７３】
【表７４】
【表７５】
【表７６】
【表７７】
【表７８】
【表７９】
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１：ヒトＲＯＲαの配列（スイスプロットＰ３５３９８−１）。
【図２】図２は、ＲＯＲα‐ＬＢＤおよびコレステロール間における複合体のＸ線構造表す概略図を示す。
【図３】図３は、ＲＯＲα‐ＬＢＤおよびコレステロール間における複合体のズームイン写真を示す（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【図４】図４：親和力を増加させ、アンタゴニスト活性を得るためのリガンドの提案（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【図５】図５：親和力を増加させるためのコレステロールのさらなる誘導体の提案（スイスプロットＰ３５３９８−１による番号付け）。
【図６】図６は、２５−ＯＨコレステロールおよびコレステロールサルフェートによるコレステロールの置換を示す。
【図７】図７は、ＲＯＲ（アルファ）／コレステロールのＸ線構造のズーム写真を示す（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【図８】図８：コレステロールサルフェートとＲＯＲ（アルファ）のＬＢＰにより行なわれる相互作用の概観（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【図９】図９：ＲＯＲ（アルファ）／コレステロール‐サルフェートおよびＲＯＲ（アルファ）／コレステロールのＸ線構造の比較（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【図１０】図１０：ＲＯＲ（アルファ）／コレステロール（左）およびＲＯＲ（アルファ）／コレステロール‐サルフェート（右）のＸ線構造の比較（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【図１１】図１１：結晶化で使用される構築物の配列。二次構造エレメントは配列の下に示されている。コレステロールに対し４オングストロームより近位に非水素原子を有するアミノ酸は、赤色で強調されている（スイスプロットＰ３５３９８−２による番号付け）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項２】
ＲＯＲαのＬＢＤが小分子と会合している、請求項１記載のＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項３】
ＲＯＲαのＬＢＤが親油性物質と会合している、請求項１または２記載のＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項４】
ＲＯＲαのＬＢＤがコレステロールまたはコレステロールの誘導体と会合している、請求項１、２または３記載のＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項５】
結晶が、ａ＝５５.９オングストローム±２オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム±２オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム±２オングストロームおよびβ＝９８.７°±５°の大きさを有する単位格子および空間群Ｐ２（１）を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項６】
ＲＯＲαの結晶性ＬＢＤが表８または９の原子構造座標またはその一部を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の結晶の重原子誘導体。
【請求項８】
表８または９における原子座標の一つまたはそれ以上のセットを含むＬＢＤ ＲＯＲαの構造を具体的に表すモデルを含むコンピューター読取可能媒体。
【請求項９】
ＲＯＲαのＬＢＤに結合する物質の同定方法であって、
（ａ）表８または９における原子座標の一つまたはそれ以上のセットを含むＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表すモデルを提供し、
（ｂ）上記モデルと候補物質の相互作用を評価し、そして
（ｃ）ＲＯＲαのＬＢＤと相互作用すると予測される物質を選択する
ことを含む方法。
【請求項１０】
選択された物質をＲＯＲαのＬＢＤとさらに接触させる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
物質が、Ｃｙｓ３２１、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ｌｅｕ３２８、Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ３５６、Ａｌａ３５７、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｇｌｕ３６２、Ａｌａ３６３、Ｖａｌ３９７、Ｐｈｅ３９８、Ａｒｇ４００、Ｍｅｔ４０１、Ａｒｇ４０３、Ａｌａ４０４、Ｖａｌ４１２、Ｔｙｒ４１３、Ｐｈｅ４１４、Ｐｈｅ４２４、Ｌｅｕ４２７、Ｃｙｓ４２９、Ｐｈｅ４３２、Ｉｌｅ４３３、Ｖａｌ４３６、Ｈｉｓ５１７、Ｌｙｓ５２０およびＴｙｒ５４０から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用する、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
物質が、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ａｒｇ４００およびＡｒｇ４０３から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用する、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１３】
相同体が、１.５オングストローム以下のアミノ酸のバックボーン原子からの二乗平均偏差（derivation）を有する、上記モデルの相同体を用いる請求項９、１０、１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
物質が小分子である、請求項９、１０、１１、１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
物質がコレステロールまたはコレステロール誘導体である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）表８または９に示された原子座標の一つまたはそれ以上のセットによる合理的な薬剤設計を実施することにより可能性のある化合物を選択し、ただし選択はコンピューターモデリングと連係的に実施するものとし、（ｂ）可能性のある化合物をＲＯＲαのＬＢＤと接触させ、そして（ｃ）ＲＯＲαの生物活性を測定することを含む、ＲＯＲαのＬＢＤに結合するアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法。
【請求項１７】
化合物が、Ｃｙｓ３２１、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ｌｅｕ３２８、Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ３５６、Ａｌａ３５７、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｇｌｕ３６２、Ａｌａ３６３、Ｖａｌ３９７、Ｐｈｅ３９８、Ａｒｇ４００、Ｍｅｔ４０１、Ａｒｇ４０３、Ａｌａ４０４、Ｖａｌ４１２、Ｔｙｒ４１３、Ｐｈｅ４１４、Ｐｈｅ４２４、Ｌｅｕ４２７、Ｃｙｓ４２９、Ｐｈｅ４３２、Ｉｌｅ４３３、Ｖａｌ４３６、Ｈｉｓ５１７、Ｌｙｓ５２０およびＴｙｒ５４０から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用するように設計されている、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
物質が、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ａｒｇ４００およびＡｒｇ４０３から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
化合物がアゴニスト位置におけるＲＯＲαのＬＢＤのらせん１２を安定化させる場合にはそれがＲＯＲαアゴニストとして選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
化合物がアゴニスト位置からＲＯＲαのＬＢＤのらせん１２を脱安定化させる場合にはそれがＲＯＲαアンタゴニストとして選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
アゴニスト位置におけるＲＯＲαのらせん１２を安定化させる化合物の治療有効量および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
アゴニスト位置からＲＯＲαのらせん１２を脱安定化させる化合物の治療有効量および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
ＲＯＲαと相互作用する化合物についてのスクリーニング方法であって、
（ａ）ＲＯＲαを候補化合物と接触させ、（ｂ）ステロールの不存在下で候補化合物およびＲＯＲα間における相互作用を測定し、そして（ｃ）化合物がＲＯＲαと相互作用する場合にはそれを選択することを含む方法。
【請求項２４】
コレステロール関連疾患の処置に有用な化合物についての請求項２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
内分泌疾患、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患、代謝性疾患、たとえば肥満、炎症性疾患、皮膚病、ＣＮＳに関連した疾患、たとえばアルツハイマー病および腫瘍関連疾患の処置に有用な化合物についての請求項２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
コレステロール関連疾患の処置に有用な化合物を同定するための細胞スクリーニング検定法におけるＲＯＲαの使用。
【請求項２７】
内分泌疾患、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患、代謝性疾患、たとえば肥満、炎症性疾患、皮膚病、ＣＮＳに関連した疾患、たとえばアルツハイマー病および腫瘍関連疾患による化合物を同定するための細胞スクリーニング検定法におけるＲＯＲαの使用。
【請求項２８】
ＲＯＲαのＬＢＤおよびコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む組成物。
【請求項２９】
組成物が結晶化し得る、請求項２８記載の組成物。
【請求項１】
ＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項２】
ＲＯＲαのＬＢＤが小分子と会合している、請求項１記載のＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項３】
ＲＯＲαのＬＢＤが親油性物質と会合している、請求項１または２記載のＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項４】
ＲＯＲαのＬＢＤがコレステロールまたはコレステロールの誘導体と会合している、請求項１、２または３記載のＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項５】
結晶が、ａ＝５５.９オングストローム±２オングストローム、ｂ＝４９.９オングストローム±２オングストローム、ｃ＝６０.７オングストローム±２オングストロームおよびβ＝９８.７°±５°の大きさを有する単位格子および空間群Ｐ２（１）を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項６】
ＲＯＲαの結晶性ＬＢＤが表８または９の原子構造座標またはその一部を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のＲＯＲαの結晶性ＬＢＤ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の結晶の重原子誘導体。
【請求項８】
表８または９における原子座標の一つまたはそれ以上のセットを含むＬＢＤ ＲＯＲαの構造を具体的に表すモデルを含むコンピューター読取可能媒体。
【請求項９】
ＲＯＲαのＬＢＤに結合する物質の同定方法であって、
（ａ）表８または９における原子座標の一つまたはそれ以上のセットを含むＲＯＲαのＬＢＤの構造を具体的に表すモデルを提供し、
（ｂ）上記モデルと候補物質の相互作用を評価し、そして
（ｃ）ＲＯＲαのＬＢＤと相互作用すると予測される物質を選択する
ことを含む方法。
【請求項１０】
選択された物質をＲＯＲαのＬＢＤとさらに接触させる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
物質が、Ｃｙｓ３２１、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ｌｅｕ３２８、Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ３５６、Ａｌａ３５７、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｇｌｕ３６２、Ａｌａ３６３、Ｖａｌ３９７、Ｐｈｅ３９８、Ａｒｇ４００、Ｍｅｔ４０１、Ａｒｇ４０３、Ａｌａ４０４、Ｖａｌ４１２、Ｔｙｒ４１３、Ｐｈｅ４１４、Ｐｈｅ４２４、Ｌｅｕ４２７、Ｃｙｓ４２９、Ｐｈｅ４３２、Ｉｌｅ４３３、Ｖａｌ４３６、Ｈｉｓ５１７、Ｌｙｓ５２０およびＴｙｒ５４０から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用する、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
物質が、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ａｒｇ４００およびＡｒｇ４０３から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用する、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１３】
相同体が、１.５オングストローム以下のアミノ酸のバックボーン原子からの二乗平均偏差（derivation）を有する、上記モデルの相同体を用いる請求項９、１０、１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
物質が小分子である、請求項９、１０、１１、１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
物質がコレステロールまたはコレステロール誘導体である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）表８または９に示された原子座標の一つまたはそれ以上のセットによる合理的な薬剤設計を実施することにより可能性のある化合物を選択し、ただし選択はコンピューターモデリングと連係的に実施するものとし、（ｂ）可能性のある化合物をＲＯＲαのＬＢＤと接触させ、そして（ｃ）ＲＯＲαの生物活性を測定することを含む、ＲＯＲαのＬＢＤに結合するアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法。
【請求項１７】
化合物が、Ｃｙｓ３２１、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ｌｅｕ３２８、Ｔｒｐ３５３、Ｃｙｓ３５６、Ａｌａ３５７、Ｌｙｓ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｇｌｕ３６２、Ａｌａ３６３、Ｖａｌ３９７、Ｐｈｅ３９８、Ａｒｇ４００、Ｍｅｔ４０１、Ａｒｇ４０３、Ａｌａ４０４、Ｖａｌ４１２、Ｔｙｒ４１３、Ｐｈｅ４１４、Ｐｈｅ４２４、Ｌｅｕ４２７、Ｃｙｓ４２９、Ｐｈｅ４３２、Ｉｌｅ４３３、Ｖａｌ４３６、Ｈｉｓ５１７、Ｌｙｓ５２０およびＴｙｒ５４０から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用するように設計されている、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
物質が、Ｇｌｎ３２２、Ｔｙｒ３２３、Ａｒｇ４００およびＡｒｇ４０３から成る群から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
化合物がアゴニスト位置におけるＲＯＲαのＬＢＤのらせん１２を安定化させる場合にはそれがＲＯＲαアゴニストとして選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
化合物がアゴニスト位置からＲＯＲαのＬＢＤのらせん１２を脱安定化させる場合にはそれがＲＯＲαアンタゴニストとして選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
アゴニスト位置におけるＲＯＲαのらせん１２を安定化させる化合物の治療有効量および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
アゴニスト位置からＲＯＲαのらせん１２を脱安定化させる化合物の治療有効量および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
ＲＯＲαと相互作用する化合物についてのスクリーニング方法であって、
（ａ）ＲＯＲαを候補化合物と接触させ、（ｂ）ステロールの不存在下で候補化合物およびＲＯＲα間における相互作用を測定し、そして（ｃ）化合物がＲＯＲαと相互作用する場合にはそれを選択することを含む方法。
【請求項２４】
コレステロール関連疾患の処置に有用な化合物についての請求項２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
内分泌疾患、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患、代謝性疾患、たとえば肥満、炎症性疾患、皮膚病、ＣＮＳに関連した疾患、たとえばアルツハイマー病および腫瘍関連疾患の処置に有用な化合物についての請求項２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
コレステロール関連疾患の処置に有用な化合物を同定するための細胞スクリーニング検定法におけるＲＯＲαの使用。
【請求項２７】
内分泌疾患、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患、代謝性疾患、たとえば肥満、炎症性疾患、皮膚病、ＣＮＳに関連した疾患、たとえばアルツハイマー病および腫瘍関連疾患による化合物を同定するための細胞スクリーニング検定法におけるＲＯＲαの使用。
【請求項２８】
ＲＯＲαのＬＢＤおよびコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む組成物。
【請求項２９】
組成物が結晶化し得る、請求項２８記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００６−５０２９７０（Ｐ２００６−５０２９７０Ａ）
【公表日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５０１４５１（Ｐ２００４−５０１４５１）
【出願日】平成１５年４月２８日（２００３．４．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００４４３３
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０９３３１２
【国際公開日】平成１５年１１月１３日（２００３．１１．１３）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年４月２８日（２００３．４．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００４４３３
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０９３３１２
【国際公開日】平成１５年１１月１３日（２００３．１１．１３）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
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