レンチウイルスベクターの精巣への感染による遺伝子組換え鳥類作製法
【課題】これまでＧ０トランスジェニック鳥類において目的タンパク質の高生産法は開示されてきたが、実用化にはすべての細胞に均一に導入遺伝子を有するＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫において導入遺伝子の高生産が必要とされている。
【解決手段】幼雛期の鳥類の雄性生殖器へ外来遺伝子を導入することによって、該雄性生殖器内において雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムに外来遺伝子を挿入することからなるトランスジェニック鳥類作製法。
【解決手段】幼雛期の鳥類の雄性生殖器へ外来遺伝子を導入することによって、該雄性生殖器内において雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムに外来遺伝子を挿入することからなるトランスジェニック鳥類作製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルスベクターを鳥類生殖器にインジェクションすることで、鳥類生殖細胞にｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子導入を行う方法に関する。また、該手法により得られる目的遺伝子導入精子を用いて、自然交配あるいは人工交配により得られる、すべての細胞中に導入遺伝子を有するトランスジェニック鳥類及びその子孫に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、組換えタンパク質生産技術が開発され多くの高機能性タンパク質製剤が次々と上市され、医薬品、食品業界で注目されている。ところが、生理活性の高いタンパク質医薬品は糖鎖修飾に代表される高度な翻訳後修飾が必要とされるため、一般的に動物培養細胞を用いた生産コストの高い発現システムおよび生産方法が用いられている。
【０００３】
従来動物培養細胞でしか生産できないタンパク質をより安価に大量に生産する方法として期待されているのがトランスジェニック動物の利用である。ウシ、ヤギ、ヒツジといった大型哺乳類動物をトランスジェニック動物にする手法開発が先行したが、大型の哺乳動物を大量に飼育するには広大なスペースを要し、また性成熟の期間も長いという問題点があり、いくつかのターゲットで実用化に至ってはいるものの、未だリスクが非常に高い。
【０００４】
これに対し、ニワトリやウズラに代表される家禽類は、飼育スペースが小さく、性成熟期間が短いなどの利点がある。そのため、有用タンパク質生産へのトランスジェニック鳥類の利用は大いに期待が持たれる。
トランスジェニック鳥類作製技術に関しては、特許文献１および特許文献２に開示されている。特許文献１では、外来遺伝子が導入された細胞と、導入されていない細胞をモザイク状に有する個体（本明細書ではＧ０とする）の作製法を開示している。特許文献２では、ニワトリ胚への外来遺伝子の導入による効率的な子孫トランスジェニック鳥類作製法を開示している。また、Ｋａｍｉｈｉｒａらが報告したトランスジェニック鳥類作製技術からは、Ｇ１（本明細書ではＧ０を用いた交配によって得られる後代ですべての細胞に導入遺伝子を均一に有する個体をＧ１とする。）作製効率はわずかに数パーセントであった（非特許文献１）。特許文献３では、脊椎動物において雄性生殖器内へ外因性遺伝物質を導入することによるトランスジェニック動物の作製方法を開示しているが、背骨側深くに存在する鳥類の雄性生殖器に遺伝子導入する手法を開示も示唆もしない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレット
【特許文献２】特開２００２−１７６８８０号公報
【特許文献３】特表２００２−５４３８１４号公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｓｅｐｔ．２００５，ｐ．１０８６４−１０８７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでＧ０トランスジェニック鳥類において目的タンパク質の高生産法は開示されてきたが、実用化にはすべての細胞に導入遺伝子を均一に有するＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫において目的タンパク質の高生産が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これまでＧ０トランスジェニック鳥類における目的タンパク質の高生産法は確立している。しかし、生産された目的タンパク質を医薬品タンパク質とする実用化に向けては、その品質が均一であることが必須であるため、すべての細胞に導入遺伝子を均一に有するＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫において目的タンパク質の高生産が必要とされている。
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、幼雛期に雄鳥類の雄性生殖器である精巣内へウイルスベクターを導入することによって得られたＧ０トランスジェニック鳥類から、高効率にＧ１トランスジェニック鳥類を得ることができることを見出した。
【０００７】
よって、本発明が提供するのは、以下のとおりである。
（１）幼雛期の鳥類の雄性生殖器へ外来遺伝子を導入することによって、該雄性生殖器内において雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムに外来遺伝子を挿入することからなるトランスジェニック鳥類作製法。
（２）外来遺伝子の導入に、外来遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはウイルスベクターを用いる（１）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（３）外来遺伝子の導入に、複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いる（２）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（４）複製能欠損型レトロウイルスベクターが、モロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含む（２）又は（３）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（５）複製能欠損型レトロウイルスベクターが複製能欠損型レンチウイルスベクターである（３）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（６）複製能欠損型レンチウイルスベクターがヒト免疫不全ウイルス由来ウイルスベクター由来の配列を含む（５）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（７）複製能欠損型レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇエンベロープを含む（３）〜（６）いずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（８）外来遺伝子の導入に、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法又はマイクロインジェクション法を用いる（１）〜（７）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（９）雄性生殖細胞が、精原幹細胞、Ｂ型精原幹細胞、精母細胞又は精細胞である（１）〜（８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１０）支持細胞が、セルトリ細胞又はライディッヒ細胞である（１）〜（８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１１）外来遺伝子が、有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列である（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１２）有用タンパク質が、抗体、サイトカイン又は成長因子である（１１）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１３）鳥類がニワトリまたはウズラである（１）〜（１２）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１４）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で得られたＧ０トランスジェニック鳥類。
（１５）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で得られた外来遺伝子が導入された精子を持つＧ０トランスジェニック鳥類との自然交配または人工交配により誕生したＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫。
（１６）鳥類がニワトリまたはウズラである（１５）に記載のＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫。
（１７）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で外来遺伝子を導入した雄性生殖細胞。
（１８）（１７）に記載の雄性生殖細胞より分化した精子。
（１９）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で外来遺伝子を導入した支持細胞。
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
まず、本発明によるトランスジェニック鳥類作製法について説明する。
本発明のトランスジェニック鳥類作製法は、幼雛期に雄鳥類の雄性生殖器へ外来遺伝子を導入することによって、該雄性生殖器内において雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムに外来遺伝子を挿入することを特徴とする。
本発明で用いられる鳥類は特に限定されることはなく、例えばニワトリ、ウズラ、カモ、七面鳥等が挙げられる。中でもニワトリやウズラは入手が容易であり、産卵種として多産であり、長年の飼育経験から安全性が認められている点で特に好ましい。
【０００９】
幼雛期とは、孵化後１日〜３０日までのことを示し、開腹して雄性生殖器である精巣内へ遺伝子導入できれば特に限定されないが、孵化後１〜３日が、雄性生殖細胞及び／又は支持細胞への遺伝子導入効率が良い観点、及び、体内の精巣へ遺伝子導入器具のアクセスが容易であることから好ましい。
【００１０】
本発明では、外来遺伝子の導入に、外来遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたは外来遺伝子をコードするウイルスベクターを用いることが好ましい。上記ウイルスベクターとしては、例えばレトロウイルスが挙げられる。
レトロウイルスとしては特に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、マウス肝細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、マウス胚性肝細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）等の他、レンチウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等が挙げられる。
安全性の観点からポリヌクレオチド、複製能欠損型レトロウイルスが好ましく、標的細胞である雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムへの導入効率の観点から、複製能欠損型レトロウイルスがより好ましく、複製能欠損型レンチウイルスが特に好ましい。また、複製能欠損型レンチウイルス以外の複製能欠損型レトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含むものが好ましい。
本発明においては、鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパクを人為的にウシ水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質とすることが好ましいが、このウイルスタイプに限定されるものではない。
【００１１】
上記外来遺伝子としては特に限定されないが、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等をコードする既知のマーカー遺伝子；ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）等の成長因子やヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、サイトカイン、抗体等の有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列等が挙げられる。
上記マーカー遺伝子としては、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ又はβ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ配列が好ましい。
上記有用タンパク質としては、抗体、サイトカイン又は成長因子が好ましい。
【００１２】
上記ウイルスベクターにコードされる遺伝子は、上記外来遺伝子のほかにプロモーター、エンハンサー、調節因子等、特に限定されないが、鳥類細胞で外来遺伝子が発現するために、適切にデザインされたものを用いることが好ましい。
プロモーターとは遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節する、ＤＮＡ又はＲＮＡ上の領域のことである。プロモーターとしては鳥類で有効に機能するプロモーターであれば限定されないが、一般的によく用いられている、ＥＦ１αプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ミューリン・フォフフォグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターや、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウスザルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター等のウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導型プロモーターのような誘導型プロモーターを用いることができる。また、組織特異的なプロモーターを用いると、鳥類の特定の組織・細胞で特に強い導入タンパク質の発現が望める。その例として、オボアルブミンプロモーターが挙げられ、ユビキタス発現プロモーターとしてニワトリβアクチンプロモーターがあげられる。
【００１３】
エンハンサーとは、プロモーターからの転写を促進する配列であるが、単独では転写を起こせないＤＮＡ又はＲＮＡ上の領域を指す。本来機能しているものとは異なるプロモーターに連結した場合にも機能することが多いので、プロモーターとの組み合わせについては限定しない。エンハンサーとしては、特に限定されないが、ＳＶ４０、ＣＭＶ、チミジンキナーゼエンハンサー、ステロイド応答エレメントやリゾチームエンハンサー等が挙げられる。
調節因子は転写調節や、転写後のＲＮＡの安定化に寄与する、単独では転写を起こせないＤＮＡまたはＲＮＡ上の領域のことである。調節因子としては特に限定されないが、ウッドチャック肝炎ウイルス由来調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＷＰＲＥ、米国特許６１３６５９７号明細書）等が挙げられる。
上記外来遺伝子、プロモーター、エンハンサー、調節因子等はベクターコンストラクト上でプロウイルスの５´末端および３´末端の間に挿入される。
上記ウイルスベクターは、５’末端、３’末端に長い反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＬＴＲ）の少なくとも一部を含む。ＬＴＲは転写プロモーター遺伝子やｐｏｌｙＡ付加シグナルを持つことから、プロモーター遺伝子やターミネーター遺伝子として利用し得る。ウイルスベクターにおいて、目的タンパク質のコード配列、プロモーター遺伝子、転写エンハンサー及び／又は調節エレメントは、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に含まれる。ＬＴＲ以外のプロモーターを用いる差異は、プロモーターの下流に目的タンパク質のコード配列を接続した構造を有することが好ましい。ウイルスベクターが転写され、ウイルス粒子が作製されるためには、５’ＬＴＲから３’ＬＴＲの間にターミネーターやｐｏｌｙＡシグナルを含まないことが好ましい。
【００１４】
次に、本発明で好適に用いられる複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製法について、好ましい一態様を説明する。
本発明で用いられる複製能欠損型レトロウイルスベクターは、複製に必要とされるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を欠失している。ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子を保有するパッケージング細胞に目的とする有用タンパク質を発現可能な複製能欠損型レトロウイルスプラスミドとＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを共導入し、培養上清をウイルス液とする。あるいは、望ましくは、上記ウイルス液を感染させたパッケージング細胞にＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを導入し、培養上清をウイルス液とする。ウイルス液は、必要に応じて濃縮することが好ましい。
複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製は、このような方法に限定されるものではない。
【００１５】
上記ウイルス液において、ウイルスベクターの力価（タイター）は、１×１０８〜１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌが好ましく、１×１０９〜１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌがより好ましい。
上記ウイルス液の力価は、レンチウイルス以外のレトロウイルスベクターの場合、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＲＬ−１６５８）を使用し、レンチウイルスベクターの場合は、Ｈｅｌａ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＣＬ−２）を使用して、これら細胞にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義する。具体的には、２４ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約１．９ｃｍ２）に存在する５×１０４のＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＨｅｌａ細胞に、１０２から１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、例えばマーカー遺伝子である蛍光タンパク質を発現している細胞の割合を調べることによりウイルス液の力価を測定する。
【００１６】
外来遺伝子を導入する標的細胞としては、精巣内にある細胞であれば特に限定されず、精原幹細胞、Ｂ型精原幹細胞、精母細胞、精細胞等の雄性生殖細胞や、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞等の支持細胞等が挙げられ、これら細胞のゲノムに後述の手法によりインビボで外来遺伝子を導入する。
【００１７】
遺伝子導入方法としてはリン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等の既知のあらゆる方法が可能であるが、マイクロインジェクション法が簡便で好ましい。
また遺伝子導入器具としては、特に限定されないが、ガラス製、プラスチック製素材が強度、再現性が良く、好ましい。遺伝子導入器具の形状としては限定されないが、先端の細いまたは鋭利である針または管状の形状が好ましく、精巣にアクセスするため必要に応じ先端を曲げたものも用いることが出来る。
【００１８】
上述のトランスジェニック鳥類作製法で得られた鳥類は、一部の雄性生殖細胞及び／又は支持細胞に外来遺伝子を有するＧ０トランスジェニック鳥類であり、外来遺伝子を有する雄性生殖細胞が分化して、外来遺伝子を有する精子となる。そして、外来遺伝子が導入された精子を持つＧ０トランスジェニック鳥類との自然交配または人工交配により誕生したＧ１トランスジェニック鳥類とその子孫は、全ての体細胞に外来遺伝子を有することとなる。
【００１９】
以下に、幼雛期に雄鳥類の雄性生殖器へ遺伝子を導入し、外来遺伝子が導入された精子を持つＧ０トランスジェニック鳥類を得た後、全身のすべての細胞に外来遺伝子を有する鳥類個体を作製する好ましい形態での手法を開示するが、記載の手法に限定されることはない。
幼雛期の雄性生殖器に遺伝子導入を行った雄鳥類個体を、公知の獣医学的または畜産学的方法によって性成熟させる。ここに言う性成熟とは、雄個体が精子を産生することを示す。性成熟した該雄個体を、雌鳥類個体と交配させ、得られうる子孫より外来遺伝子を有する個体を選抜する。
【００２０】
交配方法としては、自然交配または人工交配を用いることが出来る。ここでいう人工交配としては、雄個体精子を雌卵子と受精させ得るあらゆる公知の手法を用いることができ、例として、精子を採取して雌生殖器へ導入する方法、卵子への体外受精等が挙げられるがこれに限定されない。
交配する雌個体としては特に限定しないが、同種の鳥類の他に、異種鳥類も可能である。野生型鳥類や外来遺伝子を導入したトランスジェニック鳥類を交配に用いることも可能であるが特に限定しない。
【００２１】
交配によって得られる個体について、導入した外来遺伝子を有する個体の選別方法は公知のあらゆる手法を用いることができる。例えば、鳥類体細胞ゲノムDNAを用いたＰＣＲにより目的遺伝子の導入確認が挙げられるが、これに限定しない。また、導入遺伝子が発現しているか否かの選別には公知のあらゆる手段を用いることができ、ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）やＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ等の免疫学的方法が挙げられるが、これに限定しない。
本発明によると、交配によって得られる全身に目的とする外来遺伝子を有する鳥類を得、該個体およびその子孫から得られる血液、体細胞及び／又は卵より、目的とする有用タンパク質を既知の抽出、精製法により回収し、医薬品原料としての供給が可能である。
抽出、精製に用いる方法としては特に限定されず、例えば、分別沈殿、遠心法、二相分離、限外濾過、膜分離、クロマトグラフィー、免疫化学的方法、結晶化することのいずれか及び／又はその組み合わせを含む方法などが挙げられる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、極めて高い確率で導入した外来遺伝子を後代へ伝播できるトランスジェニック鳥類作製が可能となり、すべての細胞に均一に外来遺伝子を有するＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫において有用タンパク質の高生産が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
以下、断りがない限りＰＣＲ反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、ライゲーションにはＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、プロメガ社製）、ＰＣＲ反応液および電気泳動により得たＤＮＡ断片精製にはＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ ｕｐ−（東洋紡社製）を使用した。操作は特に記載のない限り説明書の指示に従った。
（実施例１）複製能欠損型レトロウイルスベクターコンストラクトの構築
複製能欠損型レトロウイルスベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβを、ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｓｅｐｔ．２００５，ｐ．１０８６４−１０８７４に記載の方法に従って、構築した。構築方法を以下に示す。
複製能欠損型レトロウイルスベクタープラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏ（クローンテック社製）から一連のミューリン・ホスホグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＮｅｏｒ遺伝子を含む断片を制限酵素ＢａｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩによって除去した。また、ｐＬＮＨＸ（クローンテック社製）由来Ｎｅｏｒ遺伝子、ｐｍｉｗＺ由来ニワトリβアクチンプロモーターおよびｐＣＭＶβ由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）をｐＭＳＣＶのＢａｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入しｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβとした。本ベクターコンストラクトの概略図を図１に示す。
【００２４】
（実施例２）複製能欠損型レンチウイルスベクターの作製
複製能欠損型レンチウイルスベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷベクターを構築した。構築方法を以下に示す。
ｐＷＨＶ８（ＡＴＣＣ ４５０９７）ベクターより、ＷＰＲＥ配列を合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡ−３’（配列番号１、下線部はＫｐｎＩ制限酵素サイト）、５’−ＡＴＡＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣ−３’（配列番号２、下線部はＫｐｎＩ制限酵素サイト）をプライマーとして用いてＰＣＲ（９４℃１５秒、６３℃３０秒、６８℃４０秒；３５サイクル）で増幅した。これを制限酵素ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで処理し、ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ２（ノバジェン社製）のＮｏｔＩ−ＫｐｎＩサイトに挿入し、このプラスミドをｐＥＴ−Ｂｌｕｅ２Ｗとした。
ｐＬＮΔＡβ（ＷＯ２００４／０１６０８１）の制限酵素ＮｏｔＩでβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子を切り出した。
ｐｃＤＮＡ４（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩ−ＫｐｎＩサイトに、ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ２Ｗを制限酵素ＮｏｔＩ、ＫｐｎＩで処理した断片およびβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子を挿入し、ｐｃＤＮＡ４／β−ｇａｌＷとした。
次いで、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＥを作製した。
ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃ（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５：２３１−２３８）を制限酵素ＮｈｅＩで処理し、ｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）（東洋紡社製）の制限酵素ＸｂａＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ｓｃＦｖ−Ｆｃとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ｓｃＦｖ−Ｆｃから制限酵素ＸｈａＩ、ＮｏｔＩでｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子を切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃから制限酵素ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩでニワトリβアクチンプロモーター遺伝子を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）の制限酵素ＮｏｔＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ΔＡｓとした。
ｐＬｅｎｔｉ／ＴＯＰＯ−ＧＦＰ（インビトロジェン社製）を制限酵素ＸｂａＩ、ＳｐｅＩでＧＦＰ遺伝子を切り取り、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）の制限酵素ＸｂａＩ−ＳｐｅＩサイトへ挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＦＰとした。
ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ（クローンテック社製）から制限酵素ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩでミューリン・ポスポグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター遺伝子を切り取り、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＦＰの制限酵素ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＰＧとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＰＧから制限酵素ＸｈｏＩでＰＧＫプロモーター遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）の制限酵素ＸｈｏＩサイトに挿入しｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＰとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＰから制限酵素ＣｌａＩおよびＫｐｎＩでＰＧＫプロモーター遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を切り出し、ｐＬｅｎｔｉ／ＴＯＰＯ−ＧＦＰの制限酵素ＣｌａＩ−ＫｐｎＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ＧＰとした。
ｐＬｅｎｔｉ／ＧＰを制限酵素ＸｈｏＩで処理し、再び２断片をライゲーションしてｐＬｅｎｔｉ／ＰＧとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ΔＡｓから制限酵素ＣｌａＩでニワトリβアクチンプロモーター遺伝子およびｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子を切り出し、ｐＬｅｎｔｉ／ＰＧの制限酵素ＣｌａＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＧとした。
ＥＧＦＰはｐＩＲＥＳＥＧＦＰ（クローンテック社製）を鋳型として、合成遺伝子５’−ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣ−３’（配列番号３、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素部位）、５’−ＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４、下線部はＫｐｎＩ制限酵素部位）をプライマーとして、ＰＣＲ（９４℃／１５秒、５２℃／３０秒、６８℃／４８秒；３５サイクル）により増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩで処理し、ｐＬｅｎｔｉ／ＰＧの制限酵素ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ＰＥとした。これを制限酵素ＨｐａＩ、ＢｌｎＩで処理しＰＧＫプロモーターおよびＥＧＦＰ断片を切りだし、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＧの制限酵素ＨｐａＩ−ＢｌｎＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＥとした。
次にｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥを作製した。
Ｔｈｅ ＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロ社製）のｐＬＰベクター（インビトロ社製）よりＣｅｎｔｒａｌ ＤＮＡ ｆｌａｐ（ウイルスゲノムを宿主核に移行するのを促進する配列、本明細書ではｃＤｆとする。）領域をプライマー５’−ＡＣＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴ−３’（配列番号５、下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）および５’−ＡＡＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣ−３’（配列番号６、下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）を用いてＰＣＲ（９４℃１５秒、５９℃３０秒、６８℃３０秒；３５サイクル）で増幅した。これを制限酵素ＸｂａＩで処理し、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＥの制限酵素ＸｂａＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥとした。
ここで、ｐｃＤＮＡ４／β−ｇａｌＷを制限酵素ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩで処理し、β−ｇａｌおよびＷＰＲＥ遺伝子を切り出した。また、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥを制限酵素ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩで処理し、β−ｇａｌおよびＷＰＲＥ遺伝子を挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔΔＡβＷとした。また、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで処理し、ｃＤｆおよびアクチンプロモーター遺伝子を切り取り、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔΔＡβＷの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷとした。本ベクターコンストラクトの概略図は図１に示す。
【００２５】
（実施例３）ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβとｐＶＳＶ−Ｇを用いた複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製
以後、特に記述のない限り、培地は１０％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ；ギブコ社製）を用いた。培養は３７℃、ＣＯ２５％で行った。
実施例１で構築したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβより複製能欠損型レトロウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞ＧＰ２９３（クロンテック社製）を１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュ（底面積６０ｃｍ２）に５×１０６細胞／ディッシュ（７０％コンフルエント）になるように播種した（翌日９０％コンフルエントになるようにする）。次の日、培地を取り除き、７ｍｌの培地を加えた。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００（インビトロジェン社製）を１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名、ギブコ社製）に懸濁し、室温で５分置いた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。１２μｇのｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβと１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した（プラスミドＤＮＡ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き、９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）を加え、さらに２４時間培養した。
培養上清を０．４５μｍセルロースアセテートフィルター（アドバンテック社製）に通し、遠心管に集め、５００００×ｇで９０分間遠心分離した。ウイルスの沈殿に約１０μ１のＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して、一晩４℃で静置させ、翌日ウイルス粒子を懸濁し、ウイルス溶液とした。
【００２６】
（実施例４）ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞の選択
本発明では、高力価の複製能欠損型レトロウイルスベクターを得るために、一旦安定パッケージング細胞を作製し、それを用いて改めて複製能欠損型レトロウイルスベクターを作製した。
ウイルス感染の前日に２４ウェル培養プレート（底面積１．９ｃｍ２）にＧＰ２９３細胞を１．５×１０４細胞／ウェルとなるように播種し培養した。ウイルス感染の当日１０μｇ／ｍｌのポリプロピレンを含有する培地１ｍｌと交換した。これに実施例３で作製したウイルス液を感染させた。以後、細胞を限界希釈法によりクローン化した。具体的には、次の日、細胞を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ社製）を含む培地に懸濁し、同じ培地に１０細胞／ｍｌとなるように希釈した。希釈した細胞を９６ウェル培養プレートに１００μｌずつ播種し（ウェルに１個の細胞が入るようにする）、細胞増殖速度が速く、ＧＰ２９３と形態の近い細胞を選択し、ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞クローンを得た。
【００２７】
（実施例５）ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞とｐＶＳＶ−Ｇを用いた複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製
実施例４で得られたｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞を１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュに５×１０６細胞／ディッシュ（７０％コンフレント）になるように播種した（翌日９０％コンフルエントになるようにする）。次の日、培地を取り除き、７ｍｌの培地を加えた。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００を１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、室温で５分置いた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した（ｐＶＳＶ−Ｇ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とｐＶＳＶ−Ｇ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き、９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、さらに２４時間培養した。
培養上清を０．４５μｍセルロースアセテートフィルターに通し、遠心管に集め、５００００×ｇで９０分間遠心分離し、約１０μ１のＴＮＥ緩衝液を添加して、一晩４℃で静置させ、翌日ウイルス粒子を懸濁し、複製能欠損型レトロウイルス溶液とした。
【００２８】
（実施例６）ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷを用いた複製能欠損型レンチウイルスベクターの調製
本発明に用いた複製能欠損型レンチウイルスベクターは、インビトロジェン社製レンチウイルスベクターのプロトコールを参考に作製した。以下、特に断りがない限り、該プロトコールに従った。
複製能欠損型レンチウイルスベクターは以下の手法により調製した。
実施例２で構築したベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷよりレンチウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞２９３ＦＴ細胞（インビトロジェン社製）を１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュに５×１０６細胞／ディッシュ（７０％コンフルエント）になるように播種した（翌日９０％コンフルエントになるようにする）。次の日、培地を取り除き、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、０．１ｍＭ ＭＥＭ Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；ギブコ社製）を加えた５ｍｌのＤ−ＭＥＭに交換した。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００を１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、室温で５分置いた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。２．２４μｇのｐＬＰ１、３．３６μｇのｐＬＰ２、２．２４μｇのｐＬＰ／ＶＳＶ−Ｇ、４．２μｇのｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した（プラスミドＤＮＡ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き、１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた９ｍｌのＤ−ＭＥＭ培地を加え、さらに２４時間培養した。培養上清を０．４５μｍセルロースアセテートフィルターに通し、遠心管に集め、５００００×ｇで９０分間遠心分離し、約１０μ１のＴＮＥ緩衝液を添加して、一晩４℃で静置させ、翌日ウイルス粒子を懸濁し、複製能欠損型レンチウイルスベクター溶液とした。
【００２９】
（実施例７）複製能欠損型レトロウイルスベクターの力価測定
複製能欠損型レトロウイルス液の力価は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＲＬ−１６５８）にレトロウイルス液を添加したとき、感染し発現した細胞の数によって定義した。
２４ウェル培養プレートに１．５×１０４細胞／ウェルで播種した。翌日の細胞数３×１０４細胞／ウェルに対して、１０２〜１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、４８時間後にＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４）で３回洗浄し、０．２５％グルタルアルデヒド溶液を加え４℃で１０分間置いた。その後、ＰＢＳで４回洗浄し、Ｘ−ｇａｌ染色溶液（２００ｍＭ Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、２００ｍＭ Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］、２Ｍ ＭｇＣｌ、２０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ／Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を加え、室温で３〜６時間置いた後、β−ガラクトシダーゼの活性を示す細胞数を求めた。本発明では、ウイルス力価は５．６×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００３０】
（実施例８）複製能欠損型レンチウイルスベクターの力価測定
複製能欠損型レンチウイルスベクター液の力価は、Ｈｅｌａ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＣＬ−２）に複製能欠損型レンチウイルスベクター液を添加したとき、感染し発現した細胞の数によって定義した。
２４ウェル培養プレートに２×１０４細胞／ウェルで播種した。翌日の細胞数４×１０４細胞／ウェルに対して、１０２〜１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、実施例７と同様にしてβ−ガラクトシダーゼの活性を示す細胞数を求めた。本発明では、ウイルス力価は１．５×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００３１】
（実施例９）ニワトリ精巣への遺伝子導入のためのガラスマイクロピペットの作製
ウイルス溶液打ち込み用のガラスマイクロピペットは、ガラス管をマイクロピペット作製機で加工し、外径約２０μｍになるように作製した。また、精巣へウイルスを注入しやすいように、先を約４５度に曲げて使用した。
【００３２】
（実施例１０）ニワトリ精巣へのウイルスベクターを用いた遺伝子導入
生後２日目のオスの雛（１２羽；うち、５羽に実施例５で調整した複製能欠損型レトロウイルスベクター溶液を注入。７羽に実施例６で調製した複製能欠損型レンチウイルス溶液を注入）の大腿部にベントバルビタール麻酔液を筋肉注射し、眠らせた。その後、左側を下に保定し、皮膚、腹腔を切開し、精巣を露出させた（左側の精巣にのみ遺伝子導入を行った）。ピンセットで精巣を固定し、マイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ ５２４６；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＨａｍＢｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、濃縮したウイルス溶液をそれぞれ約６〜８μｌ程度注入した。最後に腹腔、皮膚の順番でアロンアルファー（商品名、東亜合成社製）により接着した。
【００３３】
（実施例１１）ニワトリ精巣ゲノムへの導入遺伝子の組込み検出による検定
ウイルス導入後７日目（生後９日目）の雄の雛から摘出した精巣より、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡社製）を用いてゲノムを精製した。これを鋳型としたＰＣＲ（９４℃／１５秒、６０℃／３０秒、６８℃／３０秒；３５サイクル）により遺伝子の導入を確認した。プライマーは５’−ＧＴＣＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＧＣ−３’（配列番号７）、５’−ＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧ−３’（配列番号８）を用いた。結果を図２に示す。図２中のＲは右側精巣を示し、Ｌはインジェクションを行った左側精巣を示す。
図２の結果から、遺伝子導入をおこなった左側の精巣ゲノムに導入遺伝子が挿入されていることが分かる。しかしながら、対照実験として行った、右側の精巣のゲノムではその挿入が確認できない。
【００３４】
（実施例１２）ニワトリ精巣での導入遺伝子の発現検出による検定
ウイルス導入後７日目（生後９日目）の雄の雛から摘出した精巣をＰＢＳで３回洗浄し、アルデヒド固定液（０．２％ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ、２％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＢＳ）を加え、４℃で６０分間固定した。その後、ＰＢＳで４回洗浄し、Ｘ−ｇａｌ染色溶液を加え、３７℃で３時間おいたところ、生殖腺への定着を確認することができた。結果を図３に示す。図３の結果から複製能欠損型レトロウイルス及び複製能欠損型レンチウイルスでの遺伝子導入で精巣に目的遺伝子が挿入され、発現していることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】インジェクションに用いた複製能欠損型レトロウイルスベクターコンストラクトおよび複製能欠損型レンチウイルスベクターコンストラクトの概略図を示す。
【図２】実施例１１で行ったウイルスベクター導入後７日目の個体の精巣への導入遺伝子挿入の検定結果を示す。
【図３】実施例１２で行ったウイルスベクター導入後７日目の個体の精巣でのβ−ガラクトシダーゼ活性測定結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルスベクターを鳥類生殖器にインジェクションすることで、鳥類生殖細胞にｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子導入を行う方法に関する。また、該手法により得られる目的遺伝子導入精子を用いて、自然交配あるいは人工交配により得られる、すべての細胞中に導入遺伝子を有するトランスジェニック鳥類及びその子孫に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、組換えタンパク質生産技術が開発され多くの高機能性タンパク質製剤が次々と上市され、医薬品、食品業界で注目されている。ところが、生理活性の高いタンパク質医薬品は糖鎖修飾に代表される高度な翻訳後修飾が必要とされるため、一般的に動物培養細胞を用いた生産コストの高い発現システムおよび生産方法が用いられている。
【０００３】
従来動物培養細胞でしか生産できないタンパク質をより安価に大量に生産する方法として期待されているのがトランスジェニック動物の利用である。ウシ、ヤギ、ヒツジといった大型哺乳類動物をトランスジェニック動物にする手法開発が先行したが、大型の哺乳動物を大量に飼育するには広大なスペースを要し、また性成熟の期間も長いという問題点があり、いくつかのターゲットで実用化に至ってはいるものの、未だリスクが非常に高い。
【０００４】
これに対し、ニワトリやウズラに代表される家禽類は、飼育スペースが小さく、性成熟期間が短いなどの利点がある。そのため、有用タンパク質生産へのトランスジェニック鳥類の利用は大いに期待が持たれる。
トランスジェニック鳥類作製技術に関しては、特許文献１および特許文献２に開示されている。特許文献１では、外来遺伝子が導入された細胞と、導入されていない細胞をモザイク状に有する個体（本明細書ではＧ０とする）の作製法を開示している。特許文献２では、ニワトリ胚への外来遺伝子の導入による効率的な子孫トランスジェニック鳥類作製法を開示している。また、Ｋａｍｉｈｉｒａらが報告したトランスジェニック鳥類作製技術からは、Ｇ１（本明細書ではＧ０を用いた交配によって得られる後代ですべての細胞に導入遺伝子を均一に有する個体をＧ１とする。）作製効率はわずかに数パーセントであった（非特許文献１）。特許文献３では、脊椎動物において雄性生殖器内へ外因性遺伝物質を導入することによるトランスジェニック動物の作製方法を開示しているが、背骨側深くに存在する鳥類の雄性生殖器に遺伝子導入する手法を開示も示唆もしない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレット
【特許文献２】特開２００２−１７６８８０号公報
【特許文献３】特表２００２−５４３８１４号公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｓｅｐｔ．２００５，ｐ．１０８６４−１０８７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでＧ０トランスジェニック鳥類において目的タンパク質の高生産法は開示されてきたが、実用化にはすべての細胞に導入遺伝子を均一に有するＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫において目的タンパク質の高生産が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これまでＧ０トランスジェニック鳥類における目的タンパク質の高生産法は確立している。しかし、生産された目的タンパク質を医薬品タンパク質とする実用化に向けては、その品質が均一であることが必須であるため、すべての細胞に導入遺伝子を均一に有するＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫において目的タンパク質の高生産が必要とされている。
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、幼雛期に雄鳥類の雄性生殖器である精巣内へウイルスベクターを導入することによって得られたＧ０トランスジェニック鳥類から、高効率にＧ１トランスジェニック鳥類を得ることができることを見出した。
【０００７】
よって、本発明が提供するのは、以下のとおりである。
（１）幼雛期の鳥類の雄性生殖器へ外来遺伝子を導入することによって、該雄性生殖器内において雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムに外来遺伝子を挿入することからなるトランスジェニック鳥類作製法。
（２）外来遺伝子の導入に、外来遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはウイルスベクターを用いる（１）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（３）外来遺伝子の導入に、複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いる（２）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（４）複製能欠損型レトロウイルスベクターが、モロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含む（２）又は（３）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（５）複製能欠損型レトロウイルスベクターが複製能欠損型レンチウイルスベクターである（３）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（６）複製能欠損型レンチウイルスベクターがヒト免疫不全ウイルス由来ウイルスベクター由来の配列を含む（５）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（７）複製能欠損型レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇエンベロープを含む（３）〜（６）いずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（８）外来遺伝子の導入に、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法又はマイクロインジェクション法を用いる（１）〜（７）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（９）雄性生殖細胞が、精原幹細胞、Ｂ型精原幹細胞、精母細胞又は精細胞である（１）〜（８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１０）支持細胞が、セルトリ細胞又はライディッヒ細胞である（１）〜（８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１１）外来遺伝子が、有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列である（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１２）有用タンパク質が、抗体、サイトカイン又は成長因子である（１１）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１３）鳥類がニワトリまたはウズラである（１）〜（１２）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１４）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で得られたＧ０トランスジェニック鳥類。
（１５）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で得られた外来遺伝子が導入された精子を持つＧ０トランスジェニック鳥類との自然交配または人工交配により誕生したＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫。
（１６）鳥類がニワトリまたはウズラである（１５）に記載のＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫。
（１７）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で外来遺伝子を導入した雄性生殖細胞。
（１８）（１７）に記載の雄性生殖細胞より分化した精子。
（１９）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で外来遺伝子を導入した支持細胞。
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
まず、本発明によるトランスジェニック鳥類作製法について説明する。
本発明のトランスジェニック鳥類作製法は、幼雛期に雄鳥類の雄性生殖器へ外来遺伝子を導入することによって、該雄性生殖器内において雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムに外来遺伝子を挿入することを特徴とする。
本発明で用いられる鳥類は特に限定されることはなく、例えばニワトリ、ウズラ、カモ、七面鳥等が挙げられる。中でもニワトリやウズラは入手が容易であり、産卵種として多産であり、長年の飼育経験から安全性が認められている点で特に好ましい。
【０００９】
幼雛期とは、孵化後１日〜３０日までのことを示し、開腹して雄性生殖器である精巣内へ遺伝子導入できれば特に限定されないが、孵化後１〜３日が、雄性生殖細胞及び／又は支持細胞への遺伝子導入効率が良い観点、及び、体内の精巣へ遺伝子導入器具のアクセスが容易であることから好ましい。
【００１０】
本発明では、外来遺伝子の導入に、外来遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたは外来遺伝子をコードするウイルスベクターを用いることが好ましい。上記ウイルスベクターとしては、例えばレトロウイルスが挙げられる。
レトロウイルスとしては特に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、マウス肝細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、マウス胚性肝細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）等の他、レンチウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等が挙げられる。
安全性の観点からポリヌクレオチド、複製能欠損型レトロウイルスが好ましく、標的細胞である雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムへの導入効率の観点から、複製能欠損型レトロウイルスがより好ましく、複製能欠損型レンチウイルスが特に好ましい。また、複製能欠損型レンチウイルス以外の複製能欠損型レトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含むものが好ましい。
本発明においては、鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパクを人為的にウシ水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質とすることが好ましいが、このウイルスタイプに限定されるものではない。
【００１１】
上記外来遺伝子としては特に限定されないが、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等をコードする既知のマーカー遺伝子；ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）等の成長因子やヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、サイトカイン、抗体等の有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列等が挙げられる。
上記マーカー遺伝子としては、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ又はβ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ配列が好ましい。
上記有用タンパク質としては、抗体、サイトカイン又は成長因子が好ましい。
【００１２】
上記ウイルスベクターにコードされる遺伝子は、上記外来遺伝子のほかにプロモーター、エンハンサー、調節因子等、特に限定されないが、鳥類細胞で外来遺伝子が発現するために、適切にデザインされたものを用いることが好ましい。
プロモーターとは遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節する、ＤＮＡ又はＲＮＡ上の領域のことである。プロモーターとしては鳥類で有効に機能するプロモーターであれば限定されないが、一般的によく用いられている、ＥＦ１αプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ミューリン・フォフフォグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターや、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウスザルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター等のウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導型プロモーターのような誘導型プロモーターを用いることができる。また、組織特異的なプロモーターを用いると、鳥類の特定の組織・細胞で特に強い導入タンパク質の発現が望める。その例として、オボアルブミンプロモーターが挙げられ、ユビキタス発現プロモーターとしてニワトリβアクチンプロモーターがあげられる。
【００１３】
エンハンサーとは、プロモーターからの転写を促進する配列であるが、単独では転写を起こせないＤＮＡ又はＲＮＡ上の領域を指す。本来機能しているものとは異なるプロモーターに連結した場合にも機能することが多いので、プロモーターとの組み合わせについては限定しない。エンハンサーとしては、特に限定されないが、ＳＶ４０、ＣＭＶ、チミジンキナーゼエンハンサー、ステロイド応答エレメントやリゾチームエンハンサー等が挙げられる。
調節因子は転写調節や、転写後のＲＮＡの安定化に寄与する、単独では転写を起こせないＤＮＡまたはＲＮＡ上の領域のことである。調節因子としては特に限定されないが、ウッドチャック肝炎ウイルス由来調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＷＰＲＥ、米国特許６１３６５９７号明細書）等が挙げられる。
上記外来遺伝子、プロモーター、エンハンサー、調節因子等はベクターコンストラクト上でプロウイルスの５´末端および３´末端の間に挿入される。
上記ウイルスベクターは、５’末端、３’末端に長い反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＬＴＲ）の少なくとも一部を含む。ＬＴＲは転写プロモーター遺伝子やｐｏｌｙＡ付加シグナルを持つことから、プロモーター遺伝子やターミネーター遺伝子として利用し得る。ウイルスベクターにおいて、目的タンパク質のコード配列、プロモーター遺伝子、転写エンハンサー及び／又は調節エレメントは、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に含まれる。ＬＴＲ以外のプロモーターを用いる差異は、プロモーターの下流に目的タンパク質のコード配列を接続した構造を有することが好ましい。ウイルスベクターが転写され、ウイルス粒子が作製されるためには、５’ＬＴＲから３’ＬＴＲの間にターミネーターやｐｏｌｙＡシグナルを含まないことが好ましい。
【００１４】
次に、本発明で好適に用いられる複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製法について、好ましい一態様を説明する。
本発明で用いられる複製能欠損型レトロウイルスベクターは、複製に必要とされるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を欠失している。ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子を保有するパッケージング細胞に目的とする有用タンパク質を発現可能な複製能欠損型レトロウイルスプラスミドとＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを共導入し、培養上清をウイルス液とする。あるいは、望ましくは、上記ウイルス液を感染させたパッケージング細胞にＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを導入し、培養上清をウイルス液とする。ウイルス液は、必要に応じて濃縮することが好ましい。
複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製は、このような方法に限定されるものではない。
【００１５】
上記ウイルス液において、ウイルスベクターの力価（タイター）は、１×１０８〜１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌが好ましく、１×１０９〜１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌがより好ましい。
上記ウイルス液の力価は、レンチウイルス以外のレトロウイルスベクターの場合、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＲＬ−１６５８）を使用し、レンチウイルスベクターの場合は、Ｈｅｌａ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＣＬ−２）を使用して、これら細胞にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義する。具体的には、２４ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約１．９ｃｍ２）に存在する５×１０４のＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＨｅｌａ細胞に、１０２から１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、例えばマーカー遺伝子である蛍光タンパク質を発現している細胞の割合を調べることによりウイルス液の力価を測定する。
【００１６】
外来遺伝子を導入する標的細胞としては、精巣内にある細胞であれば特に限定されず、精原幹細胞、Ｂ型精原幹細胞、精母細胞、精細胞等の雄性生殖細胞や、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞等の支持細胞等が挙げられ、これら細胞のゲノムに後述の手法によりインビボで外来遺伝子を導入する。
【００１７】
遺伝子導入方法としてはリン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等の既知のあらゆる方法が可能であるが、マイクロインジェクション法が簡便で好ましい。
また遺伝子導入器具としては、特に限定されないが、ガラス製、プラスチック製素材が強度、再現性が良く、好ましい。遺伝子導入器具の形状としては限定されないが、先端の細いまたは鋭利である針または管状の形状が好ましく、精巣にアクセスするため必要に応じ先端を曲げたものも用いることが出来る。
【００１８】
上述のトランスジェニック鳥類作製法で得られた鳥類は、一部の雄性生殖細胞及び／又は支持細胞に外来遺伝子を有するＧ０トランスジェニック鳥類であり、外来遺伝子を有する雄性生殖細胞が分化して、外来遺伝子を有する精子となる。そして、外来遺伝子が導入された精子を持つＧ０トランスジェニック鳥類との自然交配または人工交配により誕生したＧ１トランスジェニック鳥類とその子孫は、全ての体細胞に外来遺伝子を有することとなる。
【００１９】
以下に、幼雛期に雄鳥類の雄性生殖器へ遺伝子を導入し、外来遺伝子が導入された精子を持つＧ０トランスジェニック鳥類を得た後、全身のすべての細胞に外来遺伝子を有する鳥類個体を作製する好ましい形態での手法を開示するが、記載の手法に限定されることはない。
幼雛期の雄性生殖器に遺伝子導入を行った雄鳥類個体を、公知の獣医学的または畜産学的方法によって性成熟させる。ここに言う性成熟とは、雄個体が精子を産生することを示す。性成熟した該雄個体を、雌鳥類個体と交配させ、得られうる子孫より外来遺伝子を有する個体を選抜する。
【００２０】
交配方法としては、自然交配または人工交配を用いることが出来る。ここでいう人工交配としては、雄個体精子を雌卵子と受精させ得るあらゆる公知の手法を用いることができ、例として、精子を採取して雌生殖器へ導入する方法、卵子への体外受精等が挙げられるがこれに限定されない。
交配する雌個体としては特に限定しないが、同種の鳥類の他に、異種鳥類も可能である。野生型鳥類や外来遺伝子を導入したトランスジェニック鳥類を交配に用いることも可能であるが特に限定しない。
【００２１】
交配によって得られる個体について、導入した外来遺伝子を有する個体の選別方法は公知のあらゆる手法を用いることができる。例えば、鳥類体細胞ゲノムDNAを用いたＰＣＲにより目的遺伝子の導入確認が挙げられるが、これに限定しない。また、導入遺伝子が発現しているか否かの選別には公知のあらゆる手段を用いることができ、ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）やＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ等の免疫学的方法が挙げられるが、これに限定しない。
本発明によると、交配によって得られる全身に目的とする外来遺伝子を有する鳥類を得、該個体およびその子孫から得られる血液、体細胞及び／又は卵より、目的とする有用タンパク質を既知の抽出、精製法により回収し、医薬品原料としての供給が可能である。
抽出、精製に用いる方法としては特に限定されず、例えば、分別沈殿、遠心法、二相分離、限外濾過、膜分離、クロマトグラフィー、免疫化学的方法、結晶化することのいずれか及び／又はその組み合わせを含む方法などが挙げられる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、極めて高い確率で導入した外来遺伝子を後代へ伝播できるトランスジェニック鳥類作製が可能となり、すべての細胞に均一に外来遺伝子を有するＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫において有用タンパク質の高生産が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
以下、断りがない限りＰＣＲ反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、ライゲーションにはＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、プロメガ社製）、ＰＣＲ反応液および電気泳動により得たＤＮＡ断片精製にはＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ ｕｐ−（東洋紡社製）を使用した。操作は特に記載のない限り説明書の指示に従った。
（実施例１）複製能欠損型レトロウイルスベクターコンストラクトの構築
複製能欠損型レトロウイルスベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβを、ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｓｅｐｔ．２００５，ｐ．１０８６４−１０８７４に記載の方法に従って、構築した。構築方法を以下に示す。
複製能欠損型レトロウイルスベクタープラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏ（クローンテック社製）から一連のミューリン・ホスホグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＮｅｏｒ遺伝子を含む断片を制限酵素ＢａｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩによって除去した。また、ｐＬＮＨＸ（クローンテック社製）由来Ｎｅｏｒ遺伝子、ｐｍｉｗＺ由来ニワトリβアクチンプロモーターおよびｐＣＭＶβ由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）をｐＭＳＣＶのＢａｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入しｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβとした。本ベクターコンストラクトの概略図を図１に示す。
【００２４】
（実施例２）複製能欠損型レンチウイルスベクターの作製
複製能欠損型レンチウイルスベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷベクターを構築した。構築方法を以下に示す。
ｐＷＨＶ８（ＡＴＣＣ ４５０９７）ベクターより、ＷＰＲＥ配列を合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡ−３’（配列番号１、下線部はＫｐｎＩ制限酵素サイト）、５’−ＡＴＡＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣ−３’（配列番号２、下線部はＫｐｎＩ制限酵素サイト）をプライマーとして用いてＰＣＲ（９４℃１５秒、６３℃３０秒、６８℃４０秒；３５サイクル）で増幅した。これを制限酵素ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで処理し、ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ２（ノバジェン社製）のＮｏｔＩ−ＫｐｎＩサイトに挿入し、このプラスミドをｐＥＴ−Ｂｌｕｅ２Ｗとした。
ｐＬＮΔＡβ（ＷＯ２００４／０１６０８１）の制限酵素ＮｏｔＩでβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子を切り出した。
ｐｃＤＮＡ４（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩ−ＫｐｎＩサイトに、ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ２Ｗを制限酵素ＮｏｔＩ、ＫｐｎＩで処理した断片およびβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子を挿入し、ｐｃＤＮＡ４／β−ｇａｌＷとした。
次いで、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＥを作製した。
ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃ（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５：２３１−２３８）を制限酵素ＮｈｅＩで処理し、ｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）（東洋紡社製）の制限酵素ＸｂａＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ｓｃＦｖ−Ｆｃとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ｓｃＦｖ−Ｆｃから制限酵素ＸｈａＩ、ＮｏｔＩでｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子を切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃから制限酵素ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩでニワトリβアクチンプロモーター遺伝子を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）の制限酵素ＮｏｔＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ΔＡｓとした。
ｐＬｅｎｔｉ／ＴＯＰＯ−ＧＦＰ（インビトロジェン社製）を制限酵素ＸｂａＩ、ＳｐｅＩでＧＦＰ遺伝子を切り取り、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）の制限酵素ＸｂａＩ−ＳｐｅＩサイトへ挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＦＰとした。
ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ（クローンテック社製）から制限酵素ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩでミューリン・ポスポグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター遺伝子を切り取り、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＦＰの制限酵素ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＰＧとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＰＧから制限酵素ＸｈｏＩでＰＧＫプロモーター遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）の制限酵素ＸｈｏＩサイトに挿入しｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＰとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＰから制限酵素ＣｌａＩおよびＫｐｎＩでＰＧＫプロモーター遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を切り出し、ｐＬｅｎｔｉ／ＴＯＰＯ−ＧＦＰの制限酵素ＣｌａＩ−ＫｐｎＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ＧＰとした。
ｐＬｅｎｔｉ／ＧＰを制限酵素ＸｈｏＩで処理し、再び２断片をライゲーションしてｐＬｅｎｔｉ／ＰＧとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ΔＡｓから制限酵素ＣｌａＩでニワトリβアクチンプロモーター遺伝子およびｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子を切り出し、ｐＬｅｎｔｉ／ＰＧの制限酵素ＣｌａＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＧとした。
ＥＧＦＰはｐＩＲＥＳＥＧＦＰ（クローンテック社製）を鋳型として、合成遺伝子５’−ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣ−３’（配列番号３、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素部位）、５’−ＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４、下線部はＫｐｎＩ制限酵素部位）をプライマーとして、ＰＣＲ（９４℃／１５秒、５２℃／３０秒、６８℃／４８秒；３５サイクル）により増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩで処理し、ｐＬｅｎｔｉ／ＰＧの制限酵素ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ＰＥとした。これを制限酵素ＨｐａＩ、ＢｌｎＩで処理しＰＧＫプロモーターおよびＥＧＦＰ断片を切りだし、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＧの制限酵素ＨｐａＩ−ＢｌｎＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＥとした。
次にｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥを作製した。
Ｔｈｅ ＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロ社製）のｐＬＰベクター（インビトロ社製）よりＣｅｎｔｒａｌ ＤＮＡ ｆｌａｐ（ウイルスゲノムを宿主核に移行するのを促進する配列、本明細書ではｃＤｆとする。）領域をプライマー５’−ＡＣＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴ−３’（配列番号５、下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）および５’−ＡＡＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣ−３’（配列番号６、下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）を用いてＰＣＲ（９４℃１５秒、５９℃３０秒、６８℃３０秒；３５サイクル）で増幅した。これを制限酵素ＸｂａＩで処理し、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＥの制限酵素ＸｂａＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥとした。
ここで、ｐｃＤＮＡ４／β−ｇａｌＷを制限酵素ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩで処理し、β−ｇａｌおよびＷＰＲＥ遺伝子を切り出した。また、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥを制限酵素ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩで処理し、β−ｇａｌおよびＷＰＲＥ遺伝子を挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔΔＡβＷとした。また、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで処理し、ｃＤｆおよびアクチンプロモーター遺伝子を切り取り、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔΔＡβＷの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷとした。本ベクターコンストラクトの概略図は図１に示す。
【００２５】
（実施例３）ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβとｐＶＳＶ−Ｇを用いた複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製
以後、特に記述のない限り、培地は１０％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ；ギブコ社製）を用いた。培養は３７℃、ＣＯ２５％で行った。
実施例１で構築したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβより複製能欠損型レトロウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞ＧＰ２９３（クロンテック社製）を１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュ（底面積６０ｃｍ２）に５×１０６細胞／ディッシュ（７０％コンフルエント）になるように播種した（翌日９０％コンフルエントになるようにする）。次の日、培地を取り除き、７ｍｌの培地を加えた。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００（インビトロジェン社製）を１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名、ギブコ社製）に懸濁し、室温で５分置いた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。１２μｇのｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβと１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した（プラスミドＤＮＡ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き、９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）を加え、さらに２４時間培養した。
培養上清を０．４５μｍセルロースアセテートフィルター（アドバンテック社製）に通し、遠心管に集め、５００００×ｇで９０分間遠心分離した。ウイルスの沈殿に約１０μ１のＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して、一晩４℃で静置させ、翌日ウイルス粒子を懸濁し、ウイルス溶液とした。
【００２６】
（実施例４）ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞の選択
本発明では、高力価の複製能欠損型レトロウイルスベクターを得るために、一旦安定パッケージング細胞を作製し、それを用いて改めて複製能欠損型レトロウイルスベクターを作製した。
ウイルス感染の前日に２４ウェル培養プレート（底面積１．９ｃｍ２）にＧＰ２９３細胞を１．５×１０４細胞／ウェルとなるように播種し培養した。ウイルス感染の当日１０μｇ／ｍｌのポリプロピレンを含有する培地１ｍｌと交換した。これに実施例３で作製したウイルス液を感染させた。以後、細胞を限界希釈法によりクローン化した。具体的には、次の日、細胞を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ社製）を含む培地に懸濁し、同じ培地に１０細胞／ｍｌとなるように希釈した。希釈した細胞を９６ウェル培養プレートに１００μｌずつ播種し（ウェルに１個の細胞が入るようにする）、細胞増殖速度が速く、ＧＰ２９３と形態の近い細胞を選択し、ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞クローンを得た。
【００２７】
（実施例５）ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞とｐＶＳＶ−Ｇを用いた複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製
実施例４で得られたｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞を１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュに５×１０６細胞／ディッシュ（７０％コンフレント）になるように播種した（翌日９０％コンフルエントになるようにする）。次の日、培地を取り除き、７ｍｌの培地を加えた。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００を１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、室温で５分置いた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した（ｐＶＳＶ−Ｇ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とｐＶＳＶ−Ｇ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き、９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、さらに２４時間培養した。
培養上清を０．４５μｍセルロースアセテートフィルターに通し、遠心管に集め、５００００×ｇで９０分間遠心分離し、約１０μ１のＴＮＥ緩衝液を添加して、一晩４℃で静置させ、翌日ウイルス粒子を懸濁し、複製能欠損型レトロウイルス溶液とした。
【００２８】
（実施例６）ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷを用いた複製能欠損型レンチウイルスベクターの調製
本発明に用いた複製能欠損型レンチウイルスベクターは、インビトロジェン社製レンチウイルスベクターのプロトコールを参考に作製した。以下、特に断りがない限り、該プロトコールに従った。
複製能欠損型レンチウイルスベクターは以下の手法により調製した。
実施例２で構築したベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷよりレンチウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞２９３ＦＴ細胞（インビトロジェン社製）を１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュに５×１０６細胞／ディッシュ（７０％コンフルエント）になるように播種した（翌日９０％コンフルエントになるようにする）。次の日、培地を取り除き、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、０．１ｍＭ ＭＥＭ Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；ギブコ社製）を加えた５ｍｌのＤ−ＭＥＭに交換した。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００を１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、室温で５分置いた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。２．２４μｇのｐＬＰ１、３．３６μｇのｐＬＰ２、２．２４μｇのｐＬＰ／ＶＳＶ−Ｇ、４．２μｇのｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した（プラスミドＤＮＡ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き、１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた９ｍｌのＤ−ＭＥＭ培地を加え、さらに２４時間培養した。培養上清を０．４５μｍセルロースアセテートフィルターに通し、遠心管に集め、５００００×ｇで９０分間遠心分離し、約１０μ１のＴＮＥ緩衝液を添加して、一晩４℃で静置させ、翌日ウイルス粒子を懸濁し、複製能欠損型レンチウイルスベクター溶液とした。
【００２９】
（実施例７）複製能欠損型レトロウイルスベクターの力価測定
複製能欠損型レトロウイルス液の力価は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＲＬ−１６５８）にレトロウイルス液を添加したとき、感染し発現した細胞の数によって定義した。
２４ウェル培養プレートに１．５×１０４細胞／ウェルで播種した。翌日の細胞数３×１０４細胞／ウェルに対して、１０２〜１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、４８時間後にＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４）で３回洗浄し、０．２５％グルタルアルデヒド溶液を加え４℃で１０分間置いた。その後、ＰＢＳで４回洗浄し、Ｘ−ｇａｌ染色溶液（２００ｍＭ Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、２００ｍＭ Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］、２Ｍ ＭｇＣｌ、２０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ／Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を加え、室温で３〜６時間置いた後、β−ガラクトシダーゼの活性を示す細胞数を求めた。本発明では、ウイルス力価は５．６×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００３０】
（実施例８）複製能欠損型レンチウイルスベクターの力価測定
複製能欠損型レンチウイルスベクター液の力価は、Ｈｅｌａ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＣＬ−２）に複製能欠損型レンチウイルスベクター液を添加したとき、感染し発現した細胞の数によって定義した。
２４ウェル培養プレートに２×１０４細胞／ウェルで播種した。翌日の細胞数４×１０４細胞／ウェルに対して、１０２〜１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、実施例７と同様にしてβ−ガラクトシダーゼの活性を示す細胞数を求めた。本発明では、ウイルス力価は１．５×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００３１】
（実施例９）ニワトリ精巣への遺伝子導入のためのガラスマイクロピペットの作製
ウイルス溶液打ち込み用のガラスマイクロピペットは、ガラス管をマイクロピペット作製機で加工し、外径約２０μｍになるように作製した。また、精巣へウイルスを注入しやすいように、先を約４５度に曲げて使用した。
【００３２】
（実施例１０）ニワトリ精巣へのウイルスベクターを用いた遺伝子導入
生後２日目のオスの雛（１２羽；うち、５羽に実施例５で調整した複製能欠損型レトロウイルスベクター溶液を注入。７羽に実施例６で調製した複製能欠損型レンチウイルス溶液を注入）の大腿部にベントバルビタール麻酔液を筋肉注射し、眠らせた。その後、左側を下に保定し、皮膚、腹腔を切開し、精巣を露出させた（左側の精巣にのみ遺伝子導入を行った）。ピンセットで精巣を固定し、マイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ ５２４６；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＨａｍＢｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、濃縮したウイルス溶液をそれぞれ約６〜８μｌ程度注入した。最後に腹腔、皮膚の順番でアロンアルファー（商品名、東亜合成社製）により接着した。
【００３３】
（実施例１１）ニワトリ精巣ゲノムへの導入遺伝子の組込み検出による検定
ウイルス導入後７日目（生後９日目）の雄の雛から摘出した精巣より、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡社製）を用いてゲノムを精製した。これを鋳型としたＰＣＲ（９４℃／１５秒、６０℃／３０秒、６８℃／３０秒；３５サイクル）により遺伝子の導入を確認した。プライマーは５’−ＧＴＣＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＧＣ−３’（配列番号７）、５’−ＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧ−３’（配列番号８）を用いた。結果を図２に示す。図２中のＲは右側精巣を示し、Ｌはインジェクションを行った左側精巣を示す。
図２の結果から、遺伝子導入をおこなった左側の精巣ゲノムに導入遺伝子が挿入されていることが分かる。しかしながら、対照実験として行った、右側の精巣のゲノムではその挿入が確認できない。
【００３４】
（実施例１２）ニワトリ精巣での導入遺伝子の発現検出による検定
ウイルス導入後７日目（生後９日目）の雄の雛から摘出した精巣をＰＢＳで３回洗浄し、アルデヒド固定液（０．２％ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ、２％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＢＳ）を加え、４℃で６０分間固定した。その後、ＰＢＳで４回洗浄し、Ｘ−ｇａｌ染色溶液を加え、３７℃で３時間おいたところ、生殖腺への定着を確認することができた。結果を図３に示す。図３の結果から複製能欠損型レトロウイルス及び複製能欠損型レンチウイルスでの遺伝子導入で精巣に目的遺伝子が挿入され、発現していることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】インジェクションに用いた複製能欠損型レトロウイルスベクターコンストラクトおよび複製能欠損型レンチウイルスベクターコンストラクトの概略図を示す。
【図２】実施例１１で行ったウイルスベクター導入後７日目の個体の精巣への導入遺伝子挿入の検定結果を示す。
【図３】実施例１２で行ったウイルスベクター導入後７日目の個体の精巣でのβ−ガラクトシダーゼ活性測定結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幼雛期の鳥類の雄性生殖器へ外来遺伝子を導入することによって、該雄性生殖器内において雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムに外来遺伝子を挿入することからなるトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項２】
外来遺伝子の導入に、外来遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはウイルスベクターを用いる請求項１に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項３】
外来遺伝子の導入に、複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いる請求項２に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項４】
複製能欠損型レトロウイルスベクターが、モロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含む請求項２又は３に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項５】
複製能欠損型レトロウイルスベクターが複製能欠損型レンチウイルスベクターである請求項３に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項６】
複製能欠損型レンチウイルスベクターがヒト免疫不全ウイルス由来の配列を含む請求項５に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項７】
複製能欠損型レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇエンベロープを含む請求項３〜６いずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項８】
外来遺伝子の導入に、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法又はマイクロインジェクション法を用いる請求項１〜７のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項９】
雄性生殖細胞が、精原幹細胞、Ｂ型精原幹細胞、精母細胞又は精細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項１０】
支持細胞が、セルトリ細胞又はライディッヒ細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項１１】
外来遺伝子が、有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列である請求項１〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項１２】
有用タンパク質が、抗体、サイトカイン又は成長因子である請求項１１に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項１３】
鳥類がニワトリまたはウズラである請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で得られたＧ０トランスジェニック鳥類。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で得られた外来遺伝子が導入された精子を持つＧ０トランスジェニック鳥類との自然交配または人工交配により誕生したＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫。
【請求項１６】
鳥類がニワトリまたはウズラである請求項１５に記載のＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で外来遺伝子を導入した雄性生殖細胞。
【請求項１８】
請求項１７に記載の雄性生殖細胞より分化した精子。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で外来遺伝子を導入した支持細胞。
【請求項１】
幼雛期の鳥類の雄性生殖器へ外来遺伝子を導入することによって、該雄性生殖器内において雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムに外来遺伝子を挿入することからなるトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項２】
外来遺伝子の導入に、外来遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはウイルスベクターを用いる請求項１に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項３】
外来遺伝子の導入に、複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いる請求項２に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項４】
複製能欠損型レトロウイルスベクターが、モロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含む請求項２又は３に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項５】
複製能欠損型レトロウイルスベクターが複製能欠損型レンチウイルスベクターである請求項３に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項６】
複製能欠損型レンチウイルスベクターがヒト免疫不全ウイルス由来の配列を含む請求項５に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項７】
複製能欠損型レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇエンベロープを含む請求項３〜６いずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項８】
外来遺伝子の導入に、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法又はマイクロインジェクション法を用いる請求項１〜７のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項９】
雄性生殖細胞が、精原幹細胞、Ｂ型精原幹細胞、精母細胞又は精細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項１０】
支持細胞が、セルトリ細胞又はライディッヒ細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項１１】
外来遺伝子が、有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列である請求項１〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項１２】
有用タンパク質が、抗体、サイトカイン又は成長因子である請求項１１に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項１３】
鳥類がニワトリまたはウズラである請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で得られたＧ０トランスジェニック鳥類。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で得られた外来遺伝子が導入された精子を持つＧ０トランスジェニック鳥類との自然交配または人工交配により誕生したＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫。
【請求項１６】
鳥類がニワトリまたはウズラである請求項１５に記載のＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で外来遺伝子を導入した雄性生殖細胞。
【請求項１８】
請求項１７に記載の雄性生殖細胞より分化した精子。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で外来遺伝子を導入した支持細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−２７５００４（Ｐ２００７−２７５００４Ａ）
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１０７８１２（Ｐ２００６−１０７８１２）
【出願日】平成１８年４月１０日（２００６．４．１０）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１０日（２００６．４．１０）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
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