一塩基多型の検出方法
【課題】アレル特異的増幅法（ＭＡＳＡ法）による核酸試料中の所定のＳＮＰの検出において、ＳＮＰの検出エラーがなく、より安価な検出方法を提供すること。
【解決手段】本発明の方法は、従来のアレル特異的増幅法において用いられるＳＮＰの特定の塩基に特異的なプライマーとともに、このプライマーがハイブリダイズしないＳＮＰの他の塩基と優先的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるブロッキング剤を用いてＰＣＲを行う工程を含む。このブロッキング剤は、３’末端にｄｄＮＴＰを含む。
【解決手段】本発明の方法は、従来のアレル特異的増幅法において用いられるＳＮＰの特定の塩基に特異的なプライマーとともに、このプライマーがハイブリダイズしないＳＮＰの他の塩基と優先的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるブロッキング剤を用いてＰＣＲを行う工程を含む。このブロッキング剤は、３’末端にｄｄＮＴＰを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸試料中の所定の一塩基多型（single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）の検出方法に関する。より詳細には、アレル特異的増幅法により、ＳＮＰを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いた遺伝子診断法の中で、点突然変異または一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する方法は２種類に分類される。１つは既知の位置の塩基を検出する方法であり、他方は未知の点変異をスクリーニングする方法である。アレル特異的増幅法は、前者の既知の位置の塩基を感度よく検出する方法の１つであり、ＭＡＳＡ法（mutant allele specific amplification）と呼ばれている。
【０００３】
ＭＡＳＡ法の原理は、ＳＮＰを含む配列に相補的な塩基配列を有する約２０塩基からなるプライマーを用いて、鋳型となるＤＮＡと耐熱性ポリメラーゼとともにＰＣＲを行うことによって特定のＳＮＰを含む領域を特異的に増幅して、ゲル電気泳動によってバンドとして検出することからなる。
【０００４】
その具体的手順は、まずＳＮＰを含むＤＮＡ断片を増幅させるときに、例えば、リバース側のプライマーがＳＮＰを含まない部分に相補的であり、そしてフォワード側のプライマーがＳＮＰを含む部分に相補的であるように、ＳＮＰを挟む１組のプライマーを用意する。ここで、フォワード側のプライマーは、ＳＮＰのうちの１種類の塩基に相補的である塩基が３’末端になるように設計する。そのため、フォワード側のプライマーに応じて、ＳＮＰのうち１種類の塩基を有するＤＮＡ断片のみが、プライマーと鋳型とがフルマッチであるためハイブリダイズし、ＰＣＲ増幅産物を生じ、ゲル上で陽性のバンドとして検出される。一方、用いたプライマーが検出対象のＤＮＡ断片に含まれない場合は、プライマーと鋳型とはミスマッチであるためハイブリダイズせず、このＤＮＡ断片はＰＣＲで増幅されない。
【０００５】
より具体的には、例えば、ＳＮＰの塩基がＡおよびＧである場合、Ａに相補的であるように設計されたプライマーを用いた場合に、遺伝子型がＡ／Ａ型の場合およびＡ／Ｇ型の場合はバンドを検出できるが、遺伝子型がＧ／Ｇ型の場合はバンドを検出しない。一方、Ｇに相補的であるように設計されたプライマーを用いた場合には、遺伝子型がＧ／Ｇ型の場合およびＡ／Ｇ型の場合はバンドを検出できるが、遺伝子型がＡ／Ａ型の場合はバンドを検出しない。このように、ＭＡＳＡ法によれば、遺伝子型を判別すること可能である。
【０００６】
しかし、プライマーと鋳型ＤＮＡとのミスマッチがＳＮＰの１塩基のみであるため、その反応時間や温度、あるいは反応に用いるｄＮＴＰ濃度、バッファーに含まれるマグネシウム濃度、ＰＣＲのサイクル数などの反応条件を厳密に規定しなければ、プライマーと鋳型とがハイブリダイズして増幅する擬陽性の問題が生じる。すなわち、本来であれば、プライマーの３’末端のＳＮＰ対応塩基が試料中の標的ＳＮＰ塩基と非相補的である場合はそこからのプライマー伸長反応は起きないが、実際には多くの場合において伸長してしまう。
【０００７】
より正確な検出のために、プライマー配列の改良が試みられている（特許文献１および２）。特許文献１では、プライマーの５’側に、鋳型ＤＮＡと完全には相補的でない２〜４０塩基の長さの塩基配列を付加することにより、厳密な反応条件の制御を行わなくとも、非特異的アニールを抑制して特異性を向上できることを開示している。しかし、この方法では、完全には誤検出を防止できない。
【０００８】
また、特許文献２では、ＳＮＰ近傍が特定の配列を有する場合のプライマー設計が開示されている。具体的には、標的ＳＮＰ塩基の３’側にすぐ隣接する塩基がＧであり、もう一塩基隣の塩基がＧである場合、アレル特異性プライマーを、３’末端塩基がＳＮＰ対応塩基であり、かつ３’末端から２番目の塩基をＴかＧとし、かつ３’末端から３番目の塩基をＴかＧのいずれかとし、かつ３’末端から４番目の塩基から５’末端の塩基までの塩基配列を標的ＳＮＰ塩基から３’側に対して三塩基隣の塩基から所望の塩基までの配列に対して相補的であるように設計している。このようなプライマーを用いることにより、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確にＳＮＰ判別が可能となる。しかし、ＳＮＰ近傍の塩基配列が異なる場合には、このプライマーは有用ではない。
【０００９】
一方、プライマー配列の改良ではなく、プライマーとともにブロッキング剤を用いる方法が開発されている（特許文献３）。特許文献３の方法では、例えば、ＳＮＰの塩基がＡおよびＧである場合、Ａに相補的であるように設計されたプライマーとともに、Ｇに相補的なプライマーの３’末端に核酸類似物を有するブロッキング剤を用いる。ブロッキング剤は、その３’末端に核酸類似物を有するため、鋳型にハイブリダイズしても鋳型ＤＮＡは増幅しない。そのため、Ａに相補的なプライマーは、ミスマッチであるＧを含む鋳型とのハイブリダイゼーションが確実にブロックされるため、誤検出を防止できる。特許文献１で挙げられる核酸類似物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡとは、ＤＮＡに類似の構造を有する非天然の化合物であり、ＤＮＡやＲＮＡのようなリン酸結合ではなく、ペプチド結合で骨格が形成されている。ＰＮＡの特徴は、ＤＮＡに見られるリン酸基による負電荷の反発がＰＮＡでは解消されているため、鋳型ＤＮＡとより強くハイブリダイズし、相補鎖認識力も高い点である。しかし、ＰＮＡは、特殊な構造を有する化合物であるため、非常に高価である。そのため、検出対象のＳＮＰごとにブロッキング剤の合成を行う必要がある特許文献３の方法は、費用の面を考慮すると実用的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−２７５１８号公報
【特許文献２】特開２００７−３１９１３７号公報
【特許文献３】特許第２８４２６９４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＭＡＳＡ法による核酸試料中の所定のＳＮＰの検出において、ＳＮＰの検出エラーがなく、より安価な検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法を提供し、該方法において、
該所定の一塩基多型は、第１の塩基および第２の塩基の２種類の塩基を有し、
該核酸試料は、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）および該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）のいずれか１または両方を含み、
該方法は、
（ａ）該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｂ）該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；および
（ｃ）該核酸試料について、該工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１およびＦ２）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；そして
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い。
【００１３】
１つの実施態様では、上記第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、上記第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして上記第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、上記第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。
【００１４】
１つの実施態様では、上記第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、上記第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして上記第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、上記第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。
【００１５】
１つの実施態様では、上記第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）と上記第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とは、上記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００１６】
１つの実施態様では、上記第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）と上記第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とは、上記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００１７】
１つの実施態様では、上記工程（ｃ）において、
上記工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが上記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
上記工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）がともに存在する場合は遺伝子型が第１／第２型であり、そして
上記工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しないが上記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在する場合は遺伝子型が第２／第２型であると判定する。
【００１８】
本発明はまた、核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法を提供し、該方法において、
該所定の一塩基多型は、第１の塩基、第２の塩基、および第３の塩基の３種類の塩基を有し、
該核酸試料は、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、および該所定の一塩基多型による第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含み、
該方法は、
（ｄ）該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｅ）該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｆ）該所定の一塩基多型の第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と該所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；および
（ｇ）該核酸試料について、該工程（ｄ）〜（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２およびＦ３）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高く；そして
該第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、該第１のＤＮＡ鎖および該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖および該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高い。
【００１９】
１つの実施態様では、上記工程（ｇ）において、
上記工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが上記工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
上記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが上記工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
上記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが上記工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
上記工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが上記工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
上記工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが上記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、そして
上記工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが上記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であると判定する。
【００２０】
本発明はさらに、核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法を提供し、該方法において、
該所定の一塩基多型は、第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基、および第４の塩基の４種類の塩基を有し、
該核酸試料は、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）、および該所定の一塩基多型による第４の塩基を有するＤＮＡ鎖（第４のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含み、
該方法は、
（ｈ）第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｉ）第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｊ）第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と該所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；
（ｋ）第４の塩基検出用プライマー対（第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）および第４の対プライマー（Ｐｃ４））と該所定の一塩基多型に対応する第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ４）を検出する工程；および
（ｌ）該核酸試料について、該工程（ｈ）〜（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）は、該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第４の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ４）は、該第４のＤＮＡ鎖の第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高く；
該第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高く；そして
該第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）よりも高い。
【００２１】
１つの実施態様では、上記工程（ｌ）において、
上記工程（ｈ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが上記工程（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
上記工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが上記工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
上記工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが上記工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であり、
上記工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在するが上記工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第４型であり、
上記工程（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが上記工程（ｈ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
上記工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが上記工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
上記工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在するが上記工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第４型であり、
上記工程（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが上記工程（ｈ）、（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、
上記工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在するが上記工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第４型であり、そして
上記工程（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ４）が存在するが上記工程（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第４／第４型であると判定する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、従来のＭＡＳＡ法に準じて設計されたプライマー対とともに、３’末端にｄｄＮＴＰを有するブロッキング剤を用いることにより、より確実かつより安価にＳＮＰの検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明に用いるプライマーおよびブロッキング剤の融解温度（Ｔｍ）と第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）の状態との関係を示すグラフである。
【図２】本発明に用いるプライマーおよびブロッキング剤の融解温度（Ｔｍ）と第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）の状態との関係を示すグラフである。
【図３】本発明で設計したプライマーおよびブロッキング剤とＳＮＰを含む鋳型ＤＮＡとの関係を示す模式図である。
【図４】ＳＮＰ検出用のプライマー対を本発明のブロッキング剤とともに用いた場合（実施例１）または用いなかった場合（比較例１）のＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明のＳＮＰの検出方法は、核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応（具体的には、ＰＣＲ）を利用して検出する方法であり、ＳＮＰの各塩基に対するＰＣＲごとにプライマー対とブロッキング剤とを用いる。
【００２５】
一塩基多型（single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）とは、一般的には、遺伝子の塩基配列が１カ所だけ異なる状態およびその部位をいう。また、多型とは、一般的には、母集団中１％以上の頻度で存在する２以上の対立遺伝子（アレル）をいう。本発明において、「ＳＮＰ」は、好ましくは、当業者が自由に利用可能な公開されたデータベースに登録されたＳＮＰであって、そのリファレンス番号から特定できるＳＮＰである。このようなデータベースとしては、例えば、ＮＣＢＩ（ＮＬＭ、ＮＩＨ）のＳＮＰデータベースおよびＩＭＳ−ＪＳＴ（東京大学、科学技術振興財団）のＪＳＮＰ（登録商標）データベースが挙げられる。本発明において所定の一塩基多型（ＳＮＰ）とは、このような特定の位置のＳＮＰをいう。
【００２６】
ＳＮＰには、第１の塩基と第２の塩基との２種類の塩基を有する場合だけでなく、第１の塩基、第２の塩基、および第３の塩基の３種類の塩基を有する場合、ならびに第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基、および第４の塩基の４種類の塩基を有する場合がある。
【００２７】
「アレル」とは対立遺伝子をいい、倍数体のゲノムを有する生物において、相同染色体の相同な場所に位置している遺伝子をいう。同じＤＮＡ鎖が２本存在するので、例えば、ＳＮＰが２種類の塩基を有する場合には、１つのＳＮＰにつき、両方とも第１の塩基、両方とも第２の塩基、およびそれぞれ異なる塩基の３つのパターンが存在する。
【００２８】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーまたはブロッキング剤の一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーまたはブロッキング剤とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などを考慮して決定することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行うと、プライマーまたはブロッキング剤を標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーまたはブロッキング剤は、市販のプライマー構築ソフトを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーまたはブロッキング剤は、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
【００２９】
本発明において核酸試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。これらの核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または生体由来試料、食品、土壌、排水などから分離された微生物由来試料から調製することができる。好ましくは、核酸またはゲノムＤＮＡを含む試料、あるいは核酸またはゲノムＤＮＡ自体であり、例えば、血液や体液などの生体試料や、これらから調製された核酸やゲノムＤＮＡが挙げられる。生体試料の採取方法、採取部位などは、特に制限されず、また、核酸やゲノムＤＮＡの調製方法も従来公知の方法を適用でき、特に制限されない。
【００３０】
本発明において鋳型とは、相補鎖合成の型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を有する「相補鎖」は、鋳型に対応する鎖としての意味を有する。両者の関係はあくまでも相対的なものにすぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型になることができる。また、核酸の合成とは、合成起点となったオリゴヌクレオチドからの核酸の伸長を意味する。合成に加えて、さらに他の核酸の生成と、この生成された核酸の伸長反応とが連続して起きるとき、一連の反応を総合して増幅という。
【００３１】
本発明において設計されたプライマー対およびブロッキング剤の製造方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボまたはインビトロで製造してもよい。例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボまたはインビトロで製造してもよい。例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法などにより合成できる。例えば、ＡＢＩ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡ合成機を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
【００３２】
これらのオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよびブロッキング剤は、標的とする領域に特異的にハイブリダイズするために、標的ＤＮＡ上の特定部位を含む５〜１００塩基の領域、好ましくは１０〜５０塩基の領域、特に好ましくは１５〜３５塩基の領域に対し、これと相補的な塩基配列を含むことが好ましい。
【００３３】
核酸増幅反応（具体的には、ＰＣＲ）に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（Strand displacement）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax）などの好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（E.coli）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントなどが挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｅｒ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａａｃ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
【００３４】
核酸増幅反応において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどの触媒、ｄＮＴＰミックスなどの基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファーなどの緩衝液が挙げられる。さらに、ジメチルスルホキシドやベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）などの添加物、陽イオン錯体などを使用してもよい。
【００３５】
さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの当該技術分野において公知のいかなるものであってもよく、特に制限されない。
【００３６】
さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当該技術分野において公知のいかなるものであってもよく、特に制限されない。好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物である。
【００３７】
本発明の第１の実施態様は、所定のＳＮＰが、第１の塩基および第２の塩基の２種類の塩基を有する場合のＳＮＰの検出方法である。この場合、核酸試料は、所定のＳＮＰによる第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）および所定のＳＮＰによる第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）のいずれか１または両方を含む。
【００３８】
第１の実施態様によれば、本発明の方法は、
（ａ）所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｂ）所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と所定の一塩基多型の第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；および
（ｃ）核酸試料について、工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１およびＦ２）の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含む。
【００３９】
本発明の第１の実施態様の方法では、それぞれのＳＮＰ塩基に対する２組のプライマー対が用いられ、これらはそれぞれ以下のように設計される。
【００４０】
第１の塩基検出用プライマー対のうち、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）は、第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし；そして、第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、第１のＤＮＡ鎖の第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００４１】
第２の塩基検出用プライマー対のうち、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）は、第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし；そして、第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、第２のＤＮＡ鎖の第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００４２】
好ましくは、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）は、第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）は、第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）および第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、それぞれ独立して、フォワード側に設計してもよく、リバース側に設計してもよい。好ましくは、Ｐｓ１およびＰｓ２は、両方とも同じ側のプライマーである。さらに好ましくは、Ｐｓ１およびＰｓ２は、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列を含むように設計される。
【００４３】
また、それぞれの対プライマー（Ｐｃ１およびＰｃ２）は、Ｐｓ１およびＰｓ２からそれぞれ通常５０〜１０００塩基、好ましくは５０〜５００塩基離れた位置の任意の領域にハイブリダイズする。Ｐｓ１およびＰｓ２は、より好ましくは同一の領域にハイブリダイズし得、さらに好ましくは同一の塩基配列であり得る。
【００４４】
この方法で用いるブロッキング剤は、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有することが特徴である。通常のＤＮＡ鎖を構成するデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、デオキシリボースの３’の部分がＯＨ基である。このＯＨ基にｄＮＴＰのリン酸基が結合できるためにＤＮＡ鎖が合成されていく。しかし、ｄｄＮＴＰは、３’の部分に酸素原子がないため、ｄＮＴＰのリン酸基が結合することができない。したがって、３’末端にｄｄＮＴＰを有すると、標的の領域にハイブリダイズしても３’末端から伸長しないため、ＰＣＲによる増幅はブロックされる。このｄｄＮＴＰは、通常の塩基配列の決定に使用されているため、塩基配列決定用の試薬として市販されている。そのため、容易にかつ安価に入手可能である。
【００４５】
このようなｄｄＮＴＰを有するブロッキング剤は、それぞれ以下のように設計されている。
【００４６】
第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い。第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、好ましくは、第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。さらに好ましくは、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）と第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とは、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００４７】
第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い。第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、好ましくは、第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。さらに好ましくは、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）と第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とは、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００４８】
プライマーおよびブロッキング剤の設計については、ＳＮＰ塩基の種類により、プライマーのＴｍとブロッキング剤のＴｍとが逆転するように設計する。この関係を図１および２に示す。例えば、第１の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−１）、Ｔｍ（Ｐｓ２−１）およびＴｍ（Ｂ１−１）、Ｔｍ（Ｂ２−１）とし、そして第２の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−２）、Ｔｍ（Ｐｓ２−２）およびＴｍ（Ｂ１−２）、Ｔｍ（Ｂ２−２）とする。プライマーＰｓ１、Ｐｓ２およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２が、第１の塩基とハイブリダイズする場合には、それぞれ図１（ｉ）および（ii）に示すように、
Ｔｍ（Ｂ１−１） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ１−１）
Ｔｍ（Ｐｓ２−１）＜ Ｔｍ（Ｂ２−１）
となり、そして第２の塩基とハイブリダイズする場合には、それぞれ図２（ｉ）および（ii）に示すように、
Ｔｍ（Ｐｓ１−２）＜ Ｔｍ（Ｂ１−２）
Ｔｍ（Ｂ２−２） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ２−２）
となるように、ＳＮＰ対応プライマーとｄｄＮＴＰブロッキング剤とを設計する。
【００４９】
Ｔｍ値のおおよその温度は、以下の式：
Ｔｍ（℃）＝４×（プライマー中のＧ＋Ｃの数）＋２×（Ａ＋Ｔの数）
により求めることができる。したがって、各プライマーの長さを調節するなどの手段によって、適切なＴｍ値に調節することができる。
【００５０】
ブロッキング剤におけるｄｄＮＴＰは、３’末端に配置されるが、ｄｄＮＴＰは必ずしもＳＮＰの位置に配置されなくてもよい。しかし、ブロッキング剤をＳＮＰに応じて個別に合成するための費用を考慮すると、ＳＮＰを３’末端としてその位置にｄｄＮＴＰを配置するようにブロッキング剤を設計することが好ましい。
【００５１】
工程（ａ）におけるＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）およびブロッキング剤（Ｂ１）と核酸試料中のＳＮＰを含む鋳型ＤＮＡとの関係を、ＳＮＰがＡおよびＧである検体の場合を例に挙げて、図３を参照して説明する。図３（ｉ）においては、アレルのＳＮＰがいずれもＡである。ブロッキング剤はＧ特異的であり、鋳型ＤＮＡとミスマッチがあるため、Ａアレル特異的プライマー（Ｐｓ１）が鋳型ＤＮＡに優先的にハイブリダイズする。一方、図３（iii）においては、アレルのＳＮＰがいずれもＧである。ブロッキング剤（Ｂ１）は鋳型ＤＮＡとフルマッチであるため優先的にハイブリダイズし、Ａアレル特異的プライマーはハイブリダイズしない。図３（ii）においては、アレルは、ＡおよびＧのそれぞれのＳＮＰを有する。そのため、ＳＮＰがＡの場合には、ブロッキング剤（Ｂ１）はミスマッチであるため、Ａアレル特異的プライマー（Ｐｓ１）が優先的にハイブリダイズし、Ｇの場合には、ブロッキング剤（Ｂ１）がフルマッチであるため、Ａアレル特異的プライマー（Ｐｓ１）はハイブリダイズしない。このようなそれぞれのＳＮＰに対するハイブリダイゼーションの優先度は、Ｔｍによって制御される。したがって、ＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）およびブロッキング剤（Ｂ１）を、上述のようなＴｍ値とすることにより、この図３に示すような確実なハイブリダイズが達成される。したがって、図３（ｉ）および（ii）の場合には、ＰＣＲによりＡアレルを有するＤＮＡ断片（Ｆ１）が増幅されて、検出される。
【００５２】
上記の図３の例の場合、次いで行われる工程（ｂ）において、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）をＧアレル特異的とし、ブロッキング剤（Ｂ２）を第１の塩基であるＡに特異的にすることにより、Ｐｓ２がＧアレルのみハイブリダイズし、Ｇアレルを有するＤＮＡ断片（Ｆ２）が検出される。
【００５３】
このようにして工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１およびＦ２）の存在により、ＳＮＰの遺伝子型を判定することができる（工程（ｃ））。
【００５４】
より具体的には、ＳＮＰの遺伝子型を判定する工程（ｃ）において、
工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）がともに存在する場合は遺伝子型が第１／第２型であり、そして
工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しないが上記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在する場合は遺伝子型が第２／第２型であると判定する。
【００５５】
このように、本発明の方法によれば、所定のＳＮＰが第１の塩基および第２の塩基の２種類の塩基を有する場合、工程（ａ）および（ｂ）の２回の核酸増幅反応を行うことによって、遺伝子型を正確に判定することができる。
【００５６】
本発明の第２の実施態様は、所定のＳＮＰが、第１の塩基、第２の塩基、および第３の塩基の３種類の塩基を有する場合のＳＮＰの検出方法である。この場合、核酸試料は、所定のＳＮＰによる第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、所定のＳＮＰによる第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、および所定のＳＮＰによる第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含む。
【００５７】
本発明の第２の実施態様によれば、本発明の方法は、上記の核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
（ｄ）所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｅ）所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｆ）所定の一塩基多型の第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；および
（ｇ）核酸試料について、工程（ｄ）〜（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２およびＦ３）の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含む。
【００５８】
本発明の第２の実施態様の方法では、それぞれのＳＮＰ塩基に対する３組のプライマー対が用いられ、これらはそれぞれ以下のように設計される。
【００５９】
第１の塩基検出用プライマー対のうち、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）は、第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし；そして、第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、第１のＤＮＡ鎖の第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００６０】
第２の塩基検出用プライマー対のうち、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）は、第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし；そして、第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、第２のＤＮＡ鎖の第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００６１】
第３の塩基検出用プライマー対のうち、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）は、第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし；そして、第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、第３のＤＮＡ鎖の第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００６２】
好ましくは、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）は、第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）は、第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）は、第３の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。第１、第２および第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１、Ｐｓ２およびＰｓ３）は、それぞれ独立して、フォワード側に設計してもよく、リバース側に設計してもよい。好ましくは、Ｐｓ１、Ｐｓ２およびＰｓ３は、いずれも同じ側のプライマーである。さらに好ましくは、Ｐｓ１、Ｐｓ２およびＰｓ３は、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列を含むように設計される。
【００６３】
また、それぞれの対プライマー（Ｐｃ１、Ｐｃ２およびＰｃ３）は、Ｐｓ１、Ｐｓ２およびＰｓ３からそれぞれ通常５０〜１０００塩基、好ましくは５０〜５００塩基離れた位置の任意の領域にハイブリダイズする。Ｐｓ１、Ｐｓ２およびＰｓ３は、より好ましくは同一の領域にハイブリダイズし得、さらに好ましくは同一の塩基配列であり得る。
【００６４】
本発明の第２の実施態様の方法では、ブロッキング剤は、それぞれ以下のように設計されている。
【００６５】
第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、第２のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にｄｄＮＴＰを有するポリヌクレオチドであり、そして第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、第２のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い。第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、好ましくは、第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。さらに好ましくは、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）と第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とは、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００６６】
第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、第１のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にｄｄＮＴＰを有するポリヌクレオチドであり、そして第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高い。第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、好ましくは、第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。さらに好ましくは、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）と第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とは、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００６７】
第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、第１のＤＮＡ鎖および第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にｄｄＮＴＰを有するポリヌクレオチドであり、そして第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖および第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高い。第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、好ましくは、第３の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。さらに好ましくは、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）と第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とは、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００６８】
プライマーおよびブロッキング剤の設計については、上記の本発明の第１の実施態様の場合と同様である。例えば、第１の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−１）、Ｔｍ（Ｐｓ２−１）、Ｔｍ（Ｐｓ３−１）およびＴｍ（Ｂ１−１）、Ｔｍ（Ｂ２−１）、Ｔｍ（Ｂ３−１）とし、第２の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−２）、Ｔｍ（Ｐｓ２−２）、Ｔｍ（Ｐｓ３−２）およびＴｍ（Ｂ１−２）、Ｔｍ（Ｂ２−２）、Ｔｍ（Ｂ３−２）とし、そして第３の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−３）、Ｔｍ（Ｐｓ２−３）、Ｔｍ（Ｐｓ３−３）およびＴｍ（Ｂ１−３）、Ｔｍ（Ｂ２−３）、Ｔｍ（Ｂ３−３）とする。第１の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３が、第１の塩基とハイブリダイズする場合、には、
Ｔｍ（Ｂ１−１） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ１−１）
Ｔｍ（Ｐｓ２−１）＜ Ｔｍ（Ｂ２−１）
Ｔｍ（Ｐｓ３−１）＜ Ｔｍ（Ｂ３−１）
となり、第２の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ２−２） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ２−２）
Ｔｍ（Ｐｓ１−２）＜ Ｔｍ（Ｂ１−２）
Ｔｍ（Ｐｓ３−２）＜ Ｔｍ（Ｂ３−２）
となり、そして第３の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ３−３） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ３−３）
Ｔｍ（Ｐｓ１−３）＜ Ｔｍ（Ｂ１−３）
Ｔｍ（Ｐｓ２−３）＜ Ｔｍ（Ｂ２−３）
となる。
【００６９】
したがって、核酸試料について、工程（ｄ）〜（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２およびＦ３）の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定することができる（工程（ｇ））。
【００７０】
より具体的には、ＳＮＰの遺伝子型を判定する工程（ｇ）において、
工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが上記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、そして
工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが上記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であると判定する。
【００７１】
このように、本発明の方法によれば、所定のＳＮＰが第１の塩基、第２の塩基および第３の塩基の３種類の塩基を有する場合、工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の３回の核酸増幅反応を行うことによって、遺伝子型を正確に判定することができる。
【００７２】
本発明の第３の実施態様は、所定のＳＮＰが、第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基、および第４の塩基の４種類の塩基を有する場合のＳＮＰの検出方法である。この場合、核酸試料は、所定のＳＮＰによる第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、所定のＳＮＰによる第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、所定のＳＮＰによる第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）、および所定のＳＮＰによる第４の塩基を有するＤＮＡ鎖（第４のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含む。
【００７３】
本発明の第３の実施態様によれば、本発明の方法は、上記の核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
（ｈ）第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｉ）第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｊ）第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；
（ｋ）第４の塩基検出用プライマー対（第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）および第４の対プライマー（Ｐｃ４））と所定の一塩基多型に対応する第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ４）を検出する工程；および
（ｌ）核酸試料について、工程（ｈ）〜（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含む。
【００７４】
本発明の第３の実施態様の方法では、それぞれのＳＮＰ塩基に対する４組のプライマー対が用いられる。各一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４）は、上記本発明の第２の実施態様の場合と同様に、それぞれに対応するＤＮＡ鎖のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、各塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１、Ｐｃ２、Ｐｃ３およびＰｃ４）は、それぞれに対応するＤＮＡ鎖の各一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００７５】
好ましくは、各ＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４）は、それぞれのＳＮＰ塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。各ＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４）は、それぞれ独立して、フォワード側に設計してもよく、リバースに設計してもよい。好ましくは、Ｐｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４は、いずれも同じ側のプライマーである。さらに好ましくは、ＰＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４は、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列を含むように設計される。
【００７６】
本発明の第３の実施態様の方法では、ブロッキング剤は、それぞれ以下のように設計されている。
【００７７】
第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、第２のＤＮＡ鎖、第３のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、第２のＤＮＡ鎖、第３のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い。
【００７８】
第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、第１のＤＮＡ鎖、第３のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖、第３のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰ含む領域に対するＴｍ値が、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高い。
【００７９】
第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、第１のＤＮＡ鎖、第２のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖、第２のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高い。
【００８０】
第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）は、第１のＤＮＡ鎖、第２のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第４のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ４）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖、第２のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第４のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ４）よりも高い。
【００８１】
プライマーおよびブロッキング剤の設計については、上記の本発明の第１および第２の実施態様の場合と同様である。例えば、第１の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３、Ｐｓ４およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−１）、Ｔｍ（Ｐｓ２−１）、Ｔｍ（Ｐｓ３−１）、Ｔｍ（Ｐｓ４−１）およびＴｍ（Ｂ１−１）、Ｔｍ（Ｂ２−１）、Ｔｍ（Ｂ３−１）、Ｔｍ（Ｂ４−１）とし、第２の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３、Ｐｓ４およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−２）、Ｔｍ（Ｐｓ２−２）、Ｔｍ（Ｐｓ３−２）、Ｔｍ（Ｐｓ４−２）およびＴｍ（Ｂ１−２）、Ｔｍ（Ｂ２−２）、Ｔｍ（Ｂ３−２）、Ｔｍ（Ｂ４−２）とし、第３の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３、Ｐｓ４およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−３）、Ｔｍ（Ｐｓ２−３）、Ｔｍ（Ｐｓ３−３）、Ｔｍ（Ｐｓ４−３）およびＴｍ（Ｂ１−３）、Ｔｍ（Ｂ２−３）、Ｔｍ（Ｂ３−３）、Ｔｍ（Ｂ４−３）とし、そして第４の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３、Ｐｓ４およびブロッキング剤Ｂ１とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−４）、Ｔｍ（Ｐｓ２−４）、Ｔｍ（Ｐｓ３−４）、Ｔｍ（Ｐｓ４−４）およびＴｍ（Ｂ１−４）、Ｔｍ（Ｂ２−４）、Ｔｍ（Ｂ３−４）、Ｔｍ（Ｂ４−４）とする。プライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３、Ｐｓ４およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４が、第１の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ１−１） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ１−１）
Ｔｍ（Ｐｓ２−１）＜ Ｔｍ（Ｂ２−１）
Ｔｍ（Ｐｓ３−１）＜ Ｔｍ（Ｂ３−１）
Ｔｍ（Ｐｓ４−１）＜ Ｔｍ（Ｂ４−１）
となり、第２の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ２−２） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ２−２）
Ｔｍ（Ｐｓ１−２）＜ Ｔｍ（Ｂ１−２）
Ｔｍ（Ｐｓ３−２）＜ Ｔｍ（Ｂ３−２）
Ｔｍ（Ｐｓ４−２）＜ Ｔｍ（Ｂ４−２）
となり、第３の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ３−３） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ３−３）
Ｔｍ（Ｐｓ１−３）＜ Ｔｍ（Ｂ１−３）
Ｔｍ（Ｐｓ２−３）＜ Ｔｍ（Ｂ２−３）
Ｔｍ（Ｐｓ４−３）＜ Ｔｍ（Ｂ４−３）
となり、そして第４の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ４−４） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ４−４）
Ｔｍ（Ｐｓ１−４）＜ Ｔｍ（Ｂ１−４）
Ｔｍ（Ｐｓ２−４）＜ Ｔｍ（Ｂ２−４）
Ｔｍ（Ｐｓ３−４）＜ Ｔｍ（Ｂ３−４）
となる。
【００８２】
したがって、核酸試料について、工程（ｈ）〜（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定することができる（工程（ｌ））。
【００８３】
より具体的には、ＳＮＰの遺伝子型を判定する工程（ｌ）において、
工程（ｈ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが工程（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であり、
工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在するが工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第４型であり、
工程（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが工程（ｈ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在するが工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第４型であり、
工程（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが工程（ｈ）、（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、
工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在するが工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第４型であり、そして
工程（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ４）が存在するが工程（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第４／第４型であると判定する。
【００８４】
このように、本発明の方法によれば、所定のＳＮＰが第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基および第４の塩基の４種類の塩基を有する場合、工程（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）の４回の核酸増幅反応を行うことによって、遺伝子型を正確に判定することができる。
【実施例】
【００８５】
（参考例１：検体の準備）
ヒトエストロゲン受容体遺伝子（以下、ＥＲ遺伝子と略する）を含む溶液を３種類準備した。これら３種類の溶液に含まれるＥＲ遺伝子は、予めＸＸ型、Ｘｘ型およびｘｘ型であることがそれぞれ判明している。ＥＲ遺伝子多型は、第１エクソンと第２エクソンとの間のイントロン領域に存在する遺伝子多型であり、制限酵素ＸｂａＩにより切断されるかまたはされないかによって判別可能な遺伝子多型を有する。ここで、ｘ型とは制限酵素ＸｂａＩにより切断される制限部位を有さないＥＲ遺伝子の遺伝子型をいい、そしてＸ型とは制限酵素ＸｂａＩにより切断される制限部位を有するＥＲ遺伝子の遺伝子型をいう。
【００８６】
これらの３種類の検体から、遺伝子多型部位を含むＥＲ遺伝子の一部をＰＣＲ反応によりそれぞれ増幅した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ反応専用のキット（BIOLINE社 BIOTAQ DNA POLYMERASE（ｄＮＴＰ付き））、フォワードプライマー（catgaaccaccatgctcagt：配列番号１）およびリバースプライマー（ttacctcttgccgtctgttg：配列番号２）を用いた。ＰＣＲ反応は、最初の変性工程を９５℃で５分行った後、１サイクルの変性工程が９４℃で３０秒、アニール工程が６０℃で３０秒、鎖伸長工程が７４℃で３０秒とするサイクルを３０サイクル行い、そして、最後の伸長工程を７４℃で７分行った。増幅したＥＲ遺伝子は、以下に示す塩基配列（配列番号３）を有する。
【００８７】
【化１】
【００８８】
ここで、遺伝子多型部位は、配列番号３における遺伝子の２４９位の塩基であり、ＡまたはＧのいずれかである。遺伝子多型部位の塩基がＡである場合はｘ型であり、一方、遺伝子多型部位の塩基がＧである場合はＸ型である。
【００８９】
（実施例１）
（１）ブロッキング剤の調製
１μＬのＴｄＴ（３０ユニット／反応）、２μＬの１０×ｂｕｆｆｅｒ、４μＬのｄｄＴＴＰ溶液（０．５ｍＭ）および２μＬのオリゴＤＮＡ（ccaatgctcatcccaacttt：配列番号４）（５０μＭ）を含む溶液中で、３７℃にて４時間反応後、７０℃で１０分間反応させることにより、配列番号４のオリゴＤＮＡの３’末端にｄｄＴＴＰを付加したブロッキング剤（ccaatgctcatcccaactttdT：配列番号５）を調製した。また、上記溶液のｄｄＴＴＰをｄｄＣＴＰに置き換えた溶液で同様の反応を行い、配列番号４のオリゴＤＮＡの３’末端にｄｄＣＴＰを付加したブロッキング剤（ccaatgctcatcccaactttdC：配列番号６）を調製した。ブロッキング剤は、後述するリバースプライマーと競合するものである。付加したｄｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰは、上記ＥＲ遺伝子の遺伝子多型部位に対応するように設計した。
【００９０】
（２）一塩基多型の判定
上記３種類それぞれの検体についてＳＮＰの判定を、配列番号５および６のブロッキング剤をそれぞれ用いたＰＣＲ反応（ｉ）および（ｉｉ）にて行った。
【００９１】
（ｉ）第１のＰＣＲ反応
まず、第１のＰＣＲ反応として、ＰＣＲ反応専用のキット（BIOLINE社 BIOTAQ DNA POLYMERASE（ｄＮＴＰ付き））、配列番号５のブロッキング剤（Ｇ検出用ブロッキング剤）、フォワードプライマー（ctgtgttgtccatcagttga：配列番号７）およびリバースプライマー（ccaatgctcatcccaacttc：配列番号８）（Ｇ検出用プライマー）を用いて、最初の変性工程を９５℃で５分行った後、１サイクルの変性工程が９４℃で３０秒、アニール工程が６０℃で３０秒、鎖伸長工程が７４℃で３０秒とするサイクルを３０サイクル行った。そして、最後の伸長工程を７４℃で７分行った。
【００９２】
（ｉｉ）第２のＰＣＲ反応
第２のＰＣＲ反応は、上記第１のＰＣＲ反応におけるリバースプライマー（配列番号８）の代わりに、配列番号９に示すリバースプライマー（ccaatgctcatcccaacact：配列番号９）（Ａ検出用プライマー）を用い、配列番号５に示すブロッキング剤の代わりに、配列番号６に示すブロッキング剤（Ａ検出用ブロッキング剤）を用いたこと以外は、上記第１のＰＣＲ反応と同様に行った。
【００９３】
なお、配列番号８に示すリバースプライマーの遺伝子配列は、Ｘ型の遺伝子（塩基Ｇ）に対してはハイブリダイセーション効率が高いが、ｘ型の遺伝子に対してはハイブリダイセーション効率が低い。そして、ｘ型の遺伝子（塩基Ａ）に対しては、配列番号５に示すブロッキング剤の方が、配列番号８に示すリバースプライマーよりもハイブリダイセーション効率が高いが、Ｘ型の遺伝子に対しては、配列番号５に示すブロッキング剤の方が、配列番号８に示すリバースプライマーよりもハイブリダイセーション効率が低い。一方、配列番号９に示すリバースプライマーの遺伝子配列は、ｘ型の遺伝子に対してはハイブリダイセーション効率が高いが、Ｘ型の遺伝子に対してはハイブリダイセーション効率が低い。そして、Ｘ型の遺伝子に対しては、配列番号６に示すブロッキング剤の方が、配列番号９に示すリバースプライマーよりもハイブリダイセーション効率が高いが、Ｘ型の遺伝子に対しては、配列番号６に示すブロッキング剤の方が、配列番号９に示すリバースプライマーよりもハイブリダイセーション効率が低い。
【００９４】
以上の点を融点で表現すると、ｘ型の遺伝子（塩基Ａ）に対しては、
Ｔｍ（Ｐｓ１）＝５３．９℃＜Ｔｍ（Ｂ１）＝５４．６℃、および
Ｔｍ（Ｂ２）＝５４．３℃＜Ｔｍ（Ｐｓ２）＝５６．３℃
であり、そしてＸ型の遺伝子（塩基Ｇ）に対しては、
Ｔｍ（Ｂ１）＝５４．３℃＜Ｔｍ（Ｐｓ１）＝５６．３℃、および
Ｔｍ（Ｐｓ２）＝５６．１℃＜Ｔｍ（Ｂ２）＝５６．５℃
である。ここで、Ｂ１とは配列番号５に示すブロッキング剤（Ｇ検出用ブロッキング剤）を、Ｂ２とは配列番号６に示すブロッキング剤（Ａ検出用ブロッキング剤）を、Ｐｓ１とは配列番号８に示すリバースプライマー（Ｇ検出用プライマー）を、Ｐｓ２とは配列番号９に示すリバースプライマー（Ａ検出用プライマー）をそれぞれ意味する。
【００９５】
（ｉｉｉ）電気泳動
第１のＰＣＲ反応および第２のＰＣＲ反応後のそれぞれの溶液中に増幅された遺伝子が存在するか否かの判定を、マイクロチップ電気泳動（株式会社島津製作所製、ＭｕｌｔｉＮＡ、ＤＮＡ−５００キット）により行った。結果を図４のレーン１〜６に示す。なお、レーンＭは、分子量マーカーである。図４の電気泳動写真の各レーンの下部に、検体の遺伝子型および用いたリバースプライマーの種類を示す。
【００９６】
（比較例１）
第１のＰＣＲ反応において配列番号５のブロッキング剤（Ｇ検出用ブロッキング剤）を用いなかったこと、および第２のＰＣＲ反応において配列番号６のブロッキング剤（Ａ検出用ブロッキング剤）を用いなかったこと以外は、実施例１と同様に行った。これは、いわゆるＭＡＳＡ法という従来手法である。結果を図４のレーン７〜１２に示す。
【００９７】
実施例１の電気泳動は、予め知られていた遺伝子多型を示唆するものであった。具体的には、予めＸＸ型（Ｇ／Ｇ型）であると知られている遺伝子を含む検体においては、Ｇ検出用プライマーを用いた第１のＰＣＲ反応後の溶液にのみ遺伝子の増幅産物が確認された（図４のレーン１および４）。一方、予めｘｘ型（Ａ／Ａ型）であると知られている遺伝子を含む検体においては、Ａ検出用プライマーを用いた第２のＰＣＲ反応後の溶液にのみ遺伝子の増幅産物が確認された（図４のレーン３および６）。そして、予めＸｘ型（Ｇ／Ａ型）であると知られている遺伝子を含む検体においては、第１および２のＰＣＲ反応後の溶液のいずれにおいても遺伝子の増幅産物が確認された（図４のレーン２および５）。しかしながら、比較例１の電気泳動では、増幅産物が検出されるべきではない溶液に増幅産物の存在が確認された（図４のレーン９および１０）。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、従来のＭＡＳＡ法に準じて設計されたプライマー対とともに、３’末端にｄｄＮＴＰを有するブロッキング剤を用いることにより、より確実かつより安価にＳＮＰの検出を行うことができる。したがって、ＳＮＰの判別をより容易に実施することができるため、ＳＮＰが深く関連していることが明らかな糖尿病や高血圧症などの疾病の発症リスクを予測することができる。さらに、癌特異的な変異の検出にも応用可能であり、さらには、癌特有の微量の変異検出においても、本発明の方法によって感度よくかつ正確に、微量変異を検出できるものと考えられる。また、ヒト白血球型抗原や血小板同種抗原、あるいは病原微生物のタイピングのような、類似する塩基配列を含む複数の遺伝子間の微細な塩基配列の相違の検出にも有用である。あるいは、わずかな塩基配列の相違に起因して活性が異なる薬剤代謝遺伝子のタイプを判別することによる、テーラーメード医療への応用も可能と考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸試料中の所定の一塩基多型（single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）の検出方法に関する。より詳細には、アレル特異的増幅法により、ＳＮＰを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いた遺伝子診断法の中で、点突然変異または一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する方法は２種類に分類される。１つは既知の位置の塩基を検出する方法であり、他方は未知の点変異をスクリーニングする方法である。アレル特異的増幅法は、前者の既知の位置の塩基を感度よく検出する方法の１つであり、ＭＡＳＡ法（mutant allele specific amplification）と呼ばれている。
【０００３】
ＭＡＳＡ法の原理は、ＳＮＰを含む配列に相補的な塩基配列を有する約２０塩基からなるプライマーを用いて、鋳型となるＤＮＡと耐熱性ポリメラーゼとともにＰＣＲを行うことによって特定のＳＮＰを含む領域を特異的に増幅して、ゲル電気泳動によってバンドとして検出することからなる。
【０００４】
その具体的手順は、まずＳＮＰを含むＤＮＡ断片を増幅させるときに、例えば、リバース側のプライマーがＳＮＰを含まない部分に相補的であり、そしてフォワード側のプライマーがＳＮＰを含む部分に相補的であるように、ＳＮＰを挟む１組のプライマーを用意する。ここで、フォワード側のプライマーは、ＳＮＰのうちの１種類の塩基に相補的である塩基が３’末端になるように設計する。そのため、フォワード側のプライマーに応じて、ＳＮＰのうち１種類の塩基を有するＤＮＡ断片のみが、プライマーと鋳型とがフルマッチであるためハイブリダイズし、ＰＣＲ増幅産物を生じ、ゲル上で陽性のバンドとして検出される。一方、用いたプライマーが検出対象のＤＮＡ断片に含まれない場合は、プライマーと鋳型とはミスマッチであるためハイブリダイズせず、このＤＮＡ断片はＰＣＲで増幅されない。
【０００５】
より具体的には、例えば、ＳＮＰの塩基がＡおよびＧである場合、Ａに相補的であるように設計されたプライマーを用いた場合に、遺伝子型がＡ／Ａ型の場合およびＡ／Ｇ型の場合はバンドを検出できるが、遺伝子型がＧ／Ｇ型の場合はバンドを検出しない。一方、Ｇに相補的であるように設計されたプライマーを用いた場合には、遺伝子型がＧ／Ｇ型の場合およびＡ／Ｇ型の場合はバンドを検出できるが、遺伝子型がＡ／Ａ型の場合はバンドを検出しない。このように、ＭＡＳＡ法によれば、遺伝子型を判別すること可能である。
【０００６】
しかし、プライマーと鋳型ＤＮＡとのミスマッチがＳＮＰの１塩基のみであるため、その反応時間や温度、あるいは反応に用いるｄＮＴＰ濃度、バッファーに含まれるマグネシウム濃度、ＰＣＲのサイクル数などの反応条件を厳密に規定しなければ、プライマーと鋳型とがハイブリダイズして増幅する擬陽性の問題が生じる。すなわち、本来であれば、プライマーの３’末端のＳＮＰ対応塩基が試料中の標的ＳＮＰ塩基と非相補的である場合はそこからのプライマー伸長反応は起きないが、実際には多くの場合において伸長してしまう。
【０００７】
より正確な検出のために、プライマー配列の改良が試みられている（特許文献１および２）。特許文献１では、プライマーの５’側に、鋳型ＤＮＡと完全には相補的でない２〜４０塩基の長さの塩基配列を付加することにより、厳密な反応条件の制御を行わなくとも、非特異的アニールを抑制して特異性を向上できることを開示している。しかし、この方法では、完全には誤検出を防止できない。
【０００８】
また、特許文献２では、ＳＮＰ近傍が特定の配列を有する場合のプライマー設計が開示されている。具体的には、標的ＳＮＰ塩基の３’側にすぐ隣接する塩基がＧであり、もう一塩基隣の塩基がＧである場合、アレル特異性プライマーを、３’末端塩基がＳＮＰ対応塩基であり、かつ３’末端から２番目の塩基をＴかＧとし、かつ３’末端から３番目の塩基をＴかＧのいずれかとし、かつ３’末端から４番目の塩基から５’末端の塩基までの塩基配列を標的ＳＮＰ塩基から３’側に対して三塩基隣の塩基から所望の塩基までの配列に対して相補的であるように設計している。このようなプライマーを用いることにより、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確にＳＮＰ判別が可能となる。しかし、ＳＮＰ近傍の塩基配列が異なる場合には、このプライマーは有用ではない。
【０００９】
一方、プライマー配列の改良ではなく、プライマーとともにブロッキング剤を用いる方法が開発されている（特許文献３）。特許文献３の方法では、例えば、ＳＮＰの塩基がＡおよびＧである場合、Ａに相補的であるように設計されたプライマーとともに、Ｇに相補的なプライマーの３’末端に核酸類似物を有するブロッキング剤を用いる。ブロッキング剤は、その３’末端に核酸類似物を有するため、鋳型にハイブリダイズしても鋳型ＤＮＡは増幅しない。そのため、Ａに相補的なプライマーは、ミスマッチであるＧを含む鋳型とのハイブリダイゼーションが確実にブロックされるため、誤検出を防止できる。特許文献１で挙げられる核酸類似物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡとは、ＤＮＡに類似の構造を有する非天然の化合物であり、ＤＮＡやＲＮＡのようなリン酸結合ではなく、ペプチド結合で骨格が形成されている。ＰＮＡの特徴は、ＤＮＡに見られるリン酸基による負電荷の反発がＰＮＡでは解消されているため、鋳型ＤＮＡとより強くハイブリダイズし、相補鎖認識力も高い点である。しかし、ＰＮＡは、特殊な構造を有する化合物であるため、非常に高価である。そのため、検出対象のＳＮＰごとにブロッキング剤の合成を行う必要がある特許文献３の方法は、費用の面を考慮すると実用的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−２７５１８号公報
【特許文献２】特開２００７−３１９１３７号公報
【特許文献３】特許第２８４２６９４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＭＡＳＡ法による核酸試料中の所定のＳＮＰの検出において、ＳＮＰの検出エラーがなく、より安価な検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法を提供し、該方法において、
該所定の一塩基多型は、第１の塩基および第２の塩基の２種類の塩基を有し、
該核酸試料は、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）および該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）のいずれか１または両方を含み、
該方法は、
（ａ）該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｂ）該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；および
（ｃ）該核酸試料について、該工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１およびＦ２）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；そして
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い。
【００１３】
１つの実施態様では、上記第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、上記第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして上記第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、上記第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。
【００１４】
１つの実施態様では、上記第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、上記第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして上記第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、上記第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。
【００１５】
１つの実施態様では、上記第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）と上記第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とは、上記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００１６】
１つの実施態様では、上記第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）と上記第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とは、上記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００１７】
１つの実施態様では、上記工程（ｃ）において、
上記工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが上記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
上記工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）がともに存在する場合は遺伝子型が第１／第２型であり、そして
上記工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しないが上記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在する場合は遺伝子型が第２／第２型であると判定する。
【００１８】
本発明はまた、核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法を提供し、該方法において、
該所定の一塩基多型は、第１の塩基、第２の塩基、および第３の塩基の３種類の塩基を有し、
該核酸試料は、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、および該所定の一塩基多型による第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含み、
該方法は、
（ｄ）該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｅ）該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｆ）該所定の一塩基多型の第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と該所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；および
（ｇ）該核酸試料について、該工程（ｄ）〜（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２およびＦ３）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高く；そして
該第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、該第１のＤＮＡ鎖および該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖および該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高い。
【００１９】
１つの実施態様では、上記工程（ｇ）において、
上記工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが上記工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
上記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが上記工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
上記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが上記工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
上記工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが上記工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
上記工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが上記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、そして
上記工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが上記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であると判定する。
【００２０】
本発明はさらに、核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法を提供し、該方法において、
該所定の一塩基多型は、第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基、および第４の塩基の４種類の塩基を有し、
該核酸試料は、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）、および該所定の一塩基多型による第４の塩基を有するＤＮＡ鎖（第４のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含み、
該方法は、
（ｈ）第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｉ）第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｊ）第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と該所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；
（ｋ）第４の塩基検出用プライマー対（第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）および第４の対プライマー（Ｐｃ４））と該所定の一塩基多型に対応する第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ４）を検出する工程；および
（ｌ）該核酸試料について、該工程（ｈ）〜（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）は、該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第４の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ４）は、該第４のＤＮＡ鎖の第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高く；
該第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高く；そして
該第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）よりも高い。
【００２１】
１つの実施態様では、上記工程（ｌ）において、
上記工程（ｈ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが上記工程（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
上記工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが上記工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
上記工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが上記工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であり、
上記工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在するが上記工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第４型であり、
上記工程（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが上記工程（ｈ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
上記工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが上記工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
上記工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在するが上記工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第４型であり、
上記工程（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが上記工程（ｈ）、（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、
上記工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在するが上記工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第４型であり、そして
上記工程（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ４）が存在するが上記工程（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第４／第４型であると判定する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、従来のＭＡＳＡ法に準じて設計されたプライマー対とともに、３’末端にｄｄＮＴＰを有するブロッキング剤を用いることにより、より確実かつより安価にＳＮＰの検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明に用いるプライマーおよびブロッキング剤の融解温度（Ｔｍ）と第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）の状態との関係を示すグラフである。
【図２】本発明に用いるプライマーおよびブロッキング剤の融解温度（Ｔｍ）と第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）の状態との関係を示すグラフである。
【図３】本発明で設計したプライマーおよびブロッキング剤とＳＮＰを含む鋳型ＤＮＡとの関係を示す模式図である。
【図４】ＳＮＰ検出用のプライマー対を本発明のブロッキング剤とともに用いた場合（実施例１）または用いなかった場合（比較例１）のＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明のＳＮＰの検出方法は、核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応（具体的には、ＰＣＲ）を利用して検出する方法であり、ＳＮＰの各塩基に対するＰＣＲごとにプライマー対とブロッキング剤とを用いる。
【００２５】
一塩基多型（single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）とは、一般的には、遺伝子の塩基配列が１カ所だけ異なる状態およびその部位をいう。また、多型とは、一般的には、母集団中１％以上の頻度で存在する２以上の対立遺伝子（アレル）をいう。本発明において、「ＳＮＰ」は、好ましくは、当業者が自由に利用可能な公開されたデータベースに登録されたＳＮＰであって、そのリファレンス番号から特定できるＳＮＰである。このようなデータベースとしては、例えば、ＮＣＢＩ（ＮＬＭ、ＮＩＨ）のＳＮＰデータベースおよびＩＭＳ−ＪＳＴ（東京大学、科学技術振興財団）のＪＳＮＰ（登録商標）データベースが挙げられる。本発明において所定の一塩基多型（ＳＮＰ）とは、このような特定の位置のＳＮＰをいう。
【００２６】
ＳＮＰには、第１の塩基と第２の塩基との２種類の塩基を有する場合だけでなく、第１の塩基、第２の塩基、および第３の塩基の３種類の塩基を有する場合、ならびに第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基、および第４の塩基の４種類の塩基を有する場合がある。
【００２７】
「アレル」とは対立遺伝子をいい、倍数体のゲノムを有する生物において、相同染色体の相同な場所に位置している遺伝子をいう。同じＤＮＡ鎖が２本存在するので、例えば、ＳＮＰが２種類の塩基を有する場合には、１つのＳＮＰにつき、両方とも第１の塩基、両方とも第２の塩基、およびそれぞれ異なる塩基の３つのパターンが存在する。
【００２８】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーまたはブロッキング剤の一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーまたはブロッキング剤とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などを考慮して決定することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行うと、プライマーまたはブロッキング剤を標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーまたはブロッキング剤は、市販のプライマー構築ソフトを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーまたはブロッキング剤は、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
【００２９】
本発明において核酸試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。これらの核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または生体由来試料、食品、土壌、排水などから分離された微生物由来試料から調製することができる。好ましくは、核酸またはゲノムＤＮＡを含む試料、あるいは核酸またはゲノムＤＮＡ自体であり、例えば、血液や体液などの生体試料や、これらから調製された核酸やゲノムＤＮＡが挙げられる。生体試料の採取方法、採取部位などは、特に制限されず、また、核酸やゲノムＤＮＡの調製方法も従来公知の方法を適用でき、特に制限されない。
【００３０】
本発明において鋳型とは、相補鎖合成の型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を有する「相補鎖」は、鋳型に対応する鎖としての意味を有する。両者の関係はあくまでも相対的なものにすぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型になることができる。また、核酸の合成とは、合成起点となったオリゴヌクレオチドからの核酸の伸長を意味する。合成に加えて、さらに他の核酸の生成と、この生成された核酸の伸長反応とが連続して起きるとき、一連の反応を総合して増幅という。
【００３１】
本発明において設計されたプライマー対およびブロッキング剤の製造方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボまたはインビトロで製造してもよい。例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボまたはインビトロで製造してもよい。例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法などにより合成できる。例えば、ＡＢＩ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡ合成機を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
【００３２】
これらのオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよびブロッキング剤は、標的とする領域に特異的にハイブリダイズするために、標的ＤＮＡ上の特定部位を含む５〜１００塩基の領域、好ましくは１０〜５０塩基の領域、特に好ましくは１５〜３５塩基の領域に対し、これと相補的な塩基配列を含むことが好ましい。
【００３３】
核酸増幅反応（具体的には、ＰＣＲ）に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（Strand displacement）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax）などの好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（E.coli）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントなどが挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｅｒ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａａｃ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
【００３４】
核酸増幅反応において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどの触媒、ｄＮＴＰミックスなどの基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファーなどの緩衝液が挙げられる。さらに、ジメチルスルホキシドやベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）などの添加物、陽イオン錯体などを使用してもよい。
【００３５】
さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの当該技術分野において公知のいかなるものであってもよく、特に制限されない。
【００３６】
さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当該技術分野において公知のいかなるものであってもよく、特に制限されない。好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物である。
【００３７】
本発明の第１の実施態様は、所定のＳＮＰが、第１の塩基および第２の塩基の２種類の塩基を有する場合のＳＮＰの検出方法である。この場合、核酸試料は、所定のＳＮＰによる第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）および所定のＳＮＰによる第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）のいずれか１または両方を含む。
【００３８】
第１の実施態様によれば、本発明の方法は、
（ａ）所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｂ）所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と所定の一塩基多型の第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；および
（ｃ）核酸試料について、工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１およびＦ２）の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含む。
【００３９】
本発明の第１の実施態様の方法では、それぞれのＳＮＰ塩基に対する２組のプライマー対が用いられ、これらはそれぞれ以下のように設計される。
【００４０】
第１の塩基検出用プライマー対のうち、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）は、第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし；そして、第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、第１のＤＮＡ鎖の第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００４１】
第２の塩基検出用プライマー対のうち、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）は、第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし；そして、第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、第２のＤＮＡ鎖の第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００４２】
好ましくは、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）は、第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）は、第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）および第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、それぞれ独立して、フォワード側に設計してもよく、リバース側に設計してもよい。好ましくは、Ｐｓ１およびＰｓ２は、両方とも同じ側のプライマーである。さらに好ましくは、Ｐｓ１およびＰｓ２は、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列を含むように設計される。
【００４３】
また、それぞれの対プライマー（Ｐｃ１およびＰｃ２）は、Ｐｓ１およびＰｓ２からそれぞれ通常５０〜１０００塩基、好ましくは５０〜５００塩基離れた位置の任意の領域にハイブリダイズする。Ｐｓ１およびＰｓ２は、より好ましくは同一の領域にハイブリダイズし得、さらに好ましくは同一の塩基配列であり得る。
【００４４】
この方法で用いるブロッキング剤は、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有することが特徴である。通常のＤＮＡ鎖を構成するデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、デオキシリボースの３’の部分がＯＨ基である。このＯＨ基にｄＮＴＰのリン酸基が結合できるためにＤＮＡ鎖が合成されていく。しかし、ｄｄＮＴＰは、３’の部分に酸素原子がないため、ｄＮＴＰのリン酸基が結合することができない。したがって、３’末端にｄｄＮＴＰを有すると、標的の領域にハイブリダイズしても３’末端から伸長しないため、ＰＣＲによる増幅はブロックされる。このｄｄＮＴＰは、通常の塩基配列の決定に使用されているため、塩基配列決定用の試薬として市販されている。そのため、容易にかつ安価に入手可能である。
【００４５】
このようなｄｄＮＴＰを有するブロッキング剤は、それぞれ以下のように設計されている。
【００４６】
第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い。第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、好ましくは、第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。さらに好ましくは、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）と第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とは、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００４７】
第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い。第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、好ましくは、第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。さらに好ましくは、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）と第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とは、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００４８】
プライマーおよびブロッキング剤の設計については、ＳＮＰ塩基の種類により、プライマーのＴｍとブロッキング剤のＴｍとが逆転するように設計する。この関係を図１および２に示す。例えば、第１の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−１）、Ｔｍ（Ｐｓ２−１）およびＴｍ（Ｂ１−１）、Ｔｍ（Ｂ２−１）とし、そして第２の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−２）、Ｔｍ（Ｐｓ２−２）およびＴｍ（Ｂ１−２）、Ｔｍ（Ｂ２−２）とする。プライマーＰｓ１、Ｐｓ２およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２が、第１の塩基とハイブリダイズする場合には、それぞれ図１（ｉ）および（ii）に示すように、
Ｔｍ（Ｂ１−１） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ１−１）
Ｔｍ（Ｐｓ２−１）＜ Ｔｍ（Ｂ２−１）
となり、そして第２の塩基とハイブリダイズする場合には、それぞれ図２（ｉ）および（ii）に示すように、
Ｔｍ（Ｐｓ１−２）＜ Ｔｍ（Ｂ１−２）
Ｔｍ（Ｂ２−２） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ２−２）
となるように、ＳＮＰ対応プライマーとｄｄＮＴＰブロッキング剤とを設計する。
【００４９】
Ｔｍ値のおおよその温度は、以下の式：
Ｔｍ（℃）＝４×（プライマー中のＧ＋Ｃの数）＋２×（Ａ＋Ｔの数）
により求めることができる。したがって、各プライマーの長さを調節するなどの手段によって、適切なＴｍ値に調節することができる。
【００５０】
ブロッキング剤におけるｄｄＮＴＰは、３’末端に配置されるが、ｄｄＮＴＰは必ずしもＳＮＰの位置に配置されなくてもよい。しかし、ブロッキング剤をＳＮＰに応じて個別に合成するための費用を考慮すると、ＳＮＰを３’末端としてその位置にｄｄＮＴＰを配置するようにブロッキング剤を設計することが好ましい。
【００５１】
工程（ａ）におけるＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）およびブロッキング剤（Ｂ１）と核酸試料中のＳＮＰを含む鋳型ＤＮＡとの関係を、ＳＮＰがＡおよびＧである検体の場合を例に挙げて、図３を参照して説明する。図３（ｉ）においては、アレルのＳＮＰがいずれもＡである。ブロッキング剤はＧ特異的であり、鋳型ＤＮＡとミスマッチがあるため、Ａアレル特異的プライマー（Ｐｓ１）が鋳型ＤＮＡに優先的にハイブリダイズする。一方、図３（iii）においては、アレルのＳＮＰがいずれもＧである。ブロッキング剤（Ｂ１）は鋳型ＤＮＡとフルマッチであるため優先的にハイブリダイズし、Ａアレル特異的プライマーはハイブリダイズしない。図３（ii）においては、アレルは、ＡおよびＧのそれぞれのＳＮＰを有する。そのため、ＳＮＰがＡの場合には、ブロッキング剤（Ｂ１）はミスマッチであるため、Ａアレル特異的プライマー（Ｐｓ１）が優先的にハイブリダイズし、Ｇの場合には、ブロッキング剤（Ｂ１）がフルマッチであるため、Ａアレル特異的プライマー（Ｐｓ１）はハイブリダイズしない。このようなそれぞれのＳＮＰに対するハイブリダイゼーションの優先度は、Ｔｍによって制御される。したがって、ＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）およびブロッキング剤（Ｂ１）を、上述のようなＴｍ値とすることにより、この図３に示すような確実なハイブリダイズが達成される。したがって、図３（ｉ）および（ii）の場合には、ＰＣＲによりＡアレルを有するＤＮＡ断片（Ｆ１）が増幅されて、検出される。
【００５２】
上記の図３の例の場合、次いで行われる工程（ｂ）において、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）をＧアレル特異的とし、ブロッキング剤（Ｂ２）を第１の塩基であるＡに特異的にすることにより、Ｐｓ２がＧアレルのみハイブリダイズし、Ｇアレルを有するＤＮＡ断片（Ｆ２）が検出される。
【００５３】
このようにして工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１およびＦ２）の存在により、ＳＮＰの遺伝子型を判定することができる（工程（ｃ））。
【００５４】
より具体的には、ＳＮＰの遺伝子型を判定する工程（ｃ）において、
工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）がともに存在する場合は遺伝子型が第１／第２型であり、そして
工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しないが上記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在する場合は遺伝子型が第２／第２型であると判定する。
【００５５】
このように、本発明の方法によれば、所定のＳＮＰが第１の塩基および第２の塩基の２種類の塩基を有する場合、工程（ａ）および（ｂ）の２回の核酸増幅反応を行うことによって、遺伝子型を正確に判定することができる。
【００５６】
本発明の第２の実施態様は、所定のＳＮＰが、第１の塩基、第２の塩基、および第３の塩基の３種類の塩基を有する場合のＳＮＰの検出方法である。この場合、核酸試料は、所定のＳＮＰによる第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、所定のＳＮＰによる第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、および所定のＳＮＰによる第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含む。
【００５７】
本発明の第２の実施態様によれば、本発明の方法は、上記の核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
（ｄ）所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｅ）所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｆ）所定の一塩基多型の第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；および
（ｇ）核酸試料について、工程（ｄ）〜（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２およびＦ３）の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含む。
【００５８】
本発明の第２の実施態様の方法では、それぞれのＳＮＰ塩基に対する３組のプライマー対が用いられ、これらはそれぞれ以下のように設計される。
【００５９】
第１の塩基検出用プライマー対のうち、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）は、第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし；そして、第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、第１のＤＮＡ鎖の第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００６０】
第２の塩基検出用プライマー対のうち、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）は、第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし；そして、第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、第２のＤＮＡ鎖の第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００６１】
第３の塩基検出用プライマー対のうち、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）は、第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし；そして、第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、第３のＤＮＡ鎖の第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００６２】
好ましくは、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）は、第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）は、第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）は、第３の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。第１、第２および第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１、Ｐｓ２およびＰｓ３）は、それぞれ独立して、フォワード側に設計してもよく、リバース側に設計してもよい。好ましくは、Ｐｓ１、Ｐｓ２およびＰｓ３は、いずれも同じ側のプライマーである。さらに好ましくは、Ｐｓ１、Ｐｓ２およびＰｓ３は、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列を含むように設計される。
【００６３】
また、それぞれの対プライマー（Ｐｃ１、Ｐｃ２およびＰｃ３）は、Ｐｓ１、Ｐｓ２およびＰｓ３からそれぞれ通常５０〜１０００塩基、好ましくは５０〜５００塩基離れた位置の任意の領域にハイブリダイズする。Ｐｓ１、Ｐｓ２およびＰｓ３は、より好ましくは同一の領域にハイブリダイズし得、さらに好ましくは同一の塩基配列であり得る。
【００６４】
本発明の第２の実施態様の方法では、ブロッキング剤は、それぞれ以下のように設計されている。
【００６５】
第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、第２のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にｄｄＮＴＰを有するポリヌクレオチドであり、そして第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、第２のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い。第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、好ましくは、第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。さらに好ましくは、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）と第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とは、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００６６】
第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、第１のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にｄｄＮＴＰを有するポリヌクレオチドであり、そして第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高い。第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、好ましくは、第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。さらに好ましくは、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）と第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とは、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００６７】
第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、第１のＤＮＡ鎖および第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にｄｄＮＴＰを有するポリヌクレオチドであり、そして第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖および第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高い。第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、好ましくは、第３の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。さらに好ましくは、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）と第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とは、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる。
【００６８】
プライマーおよびブロッキング剤の設計については、上記の本発明の第１の実施態様の場合と同様である。例えば、第１の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−１）、Ｔｍ（Ｐｓ２−１）、Ｔｍ（Ｐｓ３−１）およびＴｍ（Ｂ１−１）、Ｔｍ（Ｂ２−１）、Ｔｍ（Ｂ３−１）とし、第２の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−２）、Ｔｍ（Ｐｓ２−２）、Ｔｍ（Ｐｓ３−２）およびＴｍ（Ｂ１−２）、Ｔｍ（Ｂ２−２）、Ｔｍ（Ｂ３−２）とし、そして第３の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−３）、Ｔｍ（Ｐｓ２−３）、Ｔｍ（Ｐｓ３−３）およびＴｍ（Ｂ１−３）、Ｔｍ（Ｂ２−３）、Ｔｍ（Ｂ３−３）とする。第１の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３が、第１の塩基とハイブリダイズする場合、には、
Ｔｍ（Ｂ１−１） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ１−１）
Ｔｍ（Ｐｓ２−１）＜ Ｔｍ（Ｂ２−１）
Ｔｍ（Ｐｓ３−１）＜ Ｔｍ（Ｂ３−１）
となり、第２の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ２−２） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ２−２）
Ｔｍ（Ｐｓ１−２）＜ Ｔｍ（Ｂ１−２）
Ｔｍ（Ｐｓ３−２）＜ Ｔｍ（Ｂ３−２）
となり、そして第３の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ３−３） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ３−３）
Ｔｍ（Ｐｓ１−３）＜ Ｔｍ（Ｂ１−３）
Ｔｍ（Ｐｓ２−３）＜ Ｔｍ（Ｂ２−３）
となる。
【００６９】
したがって、核酸試料について、工程（ｄ）〜（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２およびＦ３）の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定することができる（工程（ｇ））。
【００７０】
より具体的には、ＳＮＰの遺伝子型を判定する工程（ｇ）において、
工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが上記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、そして
工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが上記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であると判定する。
【００７１】
このように、本発明の方法によれば、所定のＳＮＰが第１の塩基、第２の塩基および第３の塩基の３種類の塩基を有する場合、工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の３回の核酸増幅反応を行うことによって、遺伝子型を正確に判定することができる。
【００７２】
本発明の第３の実施態様は、所定のＳＮＰが、第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基、および第４の塩基の４種類の塩基を有する場合のＳＮＰの検出方法である。この場合、核酸試料は、所定のＳＮＰによる第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、所定のＳＮＰによる第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、所定のＳＮＰによる第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）、および所定のＳＮＰによる第４の塩基を有するＤＮＡ鎖（第４のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含む。
【００７３】
本発明の第３の実施態様によれば、本発明の方法は、上記の核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
（ｈ）第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｉ）第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｊ）第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；
（ｋ）第４の塩基検出用プライマー対（第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）および第４の対プライマー（Ｐｃ４））と所定の一塩基多型に対応する第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ４）を検出する工程；および
（ｌ）核酸試料について、工程（ｈ）〜（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含む。
【００７４】
本発明の第３の実施態様の方法では、それぞれのＳＮＰ塩基に対する４組のプライマー対が用いられる。各一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４）は、上記本発明の第２の実施態様の場合と同様に、それぞれに対応するＤＮＡ鎖のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、各塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１、Ｐｃ２、Ｐｃ３およびＰｃ４）は、それぞれに対応するＤＮＡ鎖の各一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズする。
【００７５】
好ましくは、各ＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４）は、それぞれのＳＮＰ塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する。各ＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４）は、それぞれ独立して、フォワード側に設計してもよく、リバースに設計してもよい。好ましくは、Ｐｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４は、いずれも同じ側のプライマーである。さらに好ましくは、ＰＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３およびＰｓ４は、所定のＳＮＰが存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列を含むように設計される。
【００７６】
本発明の第３の実施態様の方法では、ブロッキング剤は、それぞれ以下のように設計されている。
【００７７】
第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、第２のＤＮＡ鎖、第３のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第１のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、第２のＤＮＡ鎖、第３のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第１のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い。
【００７８】
第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、第１のＤＮＡ鎖、第３のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第２のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖、第３のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰ含む領域に対するＴｍ値が、第２のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高い。
【００７９】
第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、第１のＤＮＡ鎖、第２のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖、第２のＤＮＡ鎖および第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第３のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高い。
【００８０】
第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）は、第１のＤＮＡ鎖、第２のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして第４のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第４のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ４）よりも低いが、第１のＤＮＡ鎖、第２のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖の所定のＳＮＰを含む領域に対するＴｍ値が、第４のＳＮＰ対応プライマー（Ｐｓ４）よりも高い。
【００８１】
プライマーおよびブロッキング剤の設計については、上記の本発明の第１および第２の実施態様の場合と同様である。例えば、第１の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３、Ｐｓ４およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−１）、Ｔｍ（Ｐｓ２−１）、Ｔｍ（Ｐｓ３−１）、Ｔｍ（Ｐｓ４−１）およびＴｍ（Ｂ１−１）、Ｔｍ（Ｂ２−１）、Ｔｍ（Ｂ３−１）、Ｔｍ（Ｂ４−１）とし、第２の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３、Ｐｓ４およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−２）、Ｔｍ（Ｐｓ２−２）、Ｔｍ（Ｐｓ３−２）、Ｔｍ（Ｐｓ４−２）およびＴｍ（Ｂ１−２）、Ｔｍ（Ｂ２−２）、Ｔｍ（Ｂ３−２）、Ｔｍ（Ｂ４−２）とし、第３の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３、Ｐｓ４およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−３）、Ｔｍ（Ｐｓ２−３）、Ｔｍ（Ｐｓ３−３）、Ｔｍ（Ｐｓ４−３）およびＴｍ（Ｂ１−３）、Ｔｍ（Ｂ２−３）、Ｔｍ（Ｂ３−３）、Ｔｍ（Ｂ４−３）とし、そして第４の塩基とプライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３、Ｐｓ４およびブロッキング剤Ｂ１とのＴｍを、それぞれＴｍ（Ｐｓ１−４）、Ｔｍ（Ｐｓ２−４）、Ｔｍ（Ｐｓ３−４）、Ｔｍ（Ｐｓ４−４）およびＴｍ（Ｂ１−４）、Ｔｍ（Ｂ２−４）、Ｔｍ（Ｂ３−４）、Ｔｍ（Ｂ４−４）とする。プライマーＰｓ１、Ｐｓ２、Ｐｓ３、Ｐｓ４およびブロッキング剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４が、第１の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ１−１） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ１−１）
Ｔｍ（Ｐｓ２−１）＜ Ｔｍ（Ｂ２−１）
Ｔｍ（Ｐｓ３−１）＜ Ｔｍ（Ｂ３−１）
Ｔｍ（Ｐｓ４−１）＜ Ｔｍ（Ｂ４−１）
となり、第２の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ２−２） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ２−２）
Ｔｍ（Ｐｓ１−２）＜ Ｔｍ（Ｂ１−２）
Ｔｍ（Ｐｓ３−２）＜ Ｔｍ（Ｂ３−２）
Ｔｍ（Ｐｓ４−２）＜ Ｔｍ（Ｂ４−２）
となり、第３の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ３−３） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ３−３）
Ｔｍ（Ｐｓ１−３）＜ Ｔｍ（Ｂ１−３）
Ｔｍ（Ｐｓ２−３）＜ Ｔｍ（Ｂ２−３）
Ｔｍ（Ｐｓ４−３）＜ Ｔｍ（Ｂ４−３）
となり、そして第４の塩基とハイブリダイズする場合には、
Ｔｍ（Ｂ４−４） ＜ Ｔｍ（Ｐｓ４−４）
Ｔｍ（Ｐｓ１−４）＜ Ｔｍ（Ｂ１−４）
Ｔｍ（Ｐｓ２−４）＜ Ｔｍ（Ｂ２−４）
Ｔｍ（Ｐｓ３−４）＜ Ｔｍ（Ｂ３−４）
となる。
【００８２】
したがって、核酸試料について、工程（ｈ）〜（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定することができる（工程（ｌ））。
【００８３】
より具体的には、ＳＮＰの遺伝子型を判定する工程（ｌ）において、
工程（ｈ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが工程（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であり、
工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在するが工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第４型であり、
工程（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが工程（ｈ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在するが工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第４型であり、
工程（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが工程（ｈ）、（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、
工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在するが工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第４型であり、そして
工程（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ４）が存在するが工程（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第４／第４型であると判定する。
【００８４】
このように、本発明の方法によれば、所定のＳＮＰが第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基および第４の塩基の４種類の塩基を有する場合、工程（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）の４回の核酸増幅反応を行うことによって、遺伝子型を正確に判定することができる。
【実施例】
【００８５】
（参考例１：検体の準備）
ヒトエストロゲン受容体遺伝子（以下、ＥＲ遺伝子と略する）を含む溶液を３種類準備した。これら３種類の溶液に含まれるＥＲ遺伝子は、予めＸＸ型、Ｘｘ型およびｘｘ型であることがそれぞれ判明している。ＥＲ遺伝子多型は、第１エクソンと第２エクソンとの間のイントロン領域に存在する遺伝子多型であり、制限酵素ＸｂａＩにより切断されるかまたはされないかによって判別可能な遺伝子多型を有する。ここで、ｘ型とは制限酵素ＸｂａＩにより切断される制限部位を有さないＥＲ遺伝子の遺伝子型をいい、そしてＸ型とは制限酵素ＸｂａＩにより切断される制限部位を有するＥＲ遺伝子の遺伝子型をいう。
【００８６】
これらの３種類の検体から、遺伝子多型部位を含むＥＲ遺伝子の一部をＰＣＲ反応によりそれぞれ増幅した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ反応専用のキット（BIOLINE社 BIOTAQ DNA POLYMERASE（ｄＮＴＰ付き））、フォワードプライマー（catgaaccaccatgctcagt：配列番号１）およびリバースプライマー（ttacctcttgccgtctgttg：配列番号２）を用いた。ＰＣＲ反応は、最初の変性工程を９５℃で５分行った後、１サイクルの変性工程が９４℃で３０秒、アニール工程が６０℃で３０秒、鎖伸長工程が７４℃で３０秒とするサイクルを３０サイクル行い、そして、最後の伸長工程を７４℃で７分行った。増幅したＥＲ遺伝子は、以下に示す塩基配列（配列番号３）を有する。
【００８７】
【化１】
【００８８】
ここで、遺伝子多型部位は、配列番号３における遺伝子の２４９位の塩基であり、ＡまたはＧのいずれかである。遺伝子多型部位の塩基がＡである場合はｘ型であり、一方、遺伝子多型部位の塩基がＧである場合はＸ型である。
【００８９】
（実施例１）
（１）ブロッキング剤の調製
１μＬのＴｄＴ（３０ユニット／反応）、２μＬの１０×ｂｕｆｆｅｒ、４μＬのｄｄＴＴＰ溶液（０．５ｍＭ）および２μＬのオリゴＤＮＡ（ccaatgctcatcccaacttt：配列番号４）（５０μＭ）を含む溶液中で、３７℃にて４時間反応後、７０℃で１０分間反応させることにより、配列番号４のオリゴＤＮＡの３’末端にｄｄＴＴＰを付加したブロッキング剤（ccaatgctcatcccaactttdT：配列番号５）を調製した。また、上記溶液のｄｄＴＴＰをｄｄＣＴＰに置き換えた溶液で同様の反応を行い、配列番号４のオリゴＤＮＡの３’末端にｄｄＣＴＰを付加したブロッキング剤（ccaatgctcatcccaactttdC：配列番号６）を調製した。ブロッキング剤は、後述するリバースプライマーと競合するものである。付加したｄｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰは、上記ＥＲ遺伝子の遺伝子多型部位に対応するように設計した。
【００９０】
（２）一塩基多型の判定
上記３種類それぞれの検体についてＳＮＰの判定を、配列番号５および６のブロッキング剤をそれぞれ用いたＰＣＲ反応（ｉ）および（ｉｉ）にて行った。
【００９１】
（ｉ）第１のＰＣＲ反応
まず、第１のＰＣＲ反応として、ＰＣＲ反応専用のキット（BIOLINE社 BIOTAQ DNA POLYMERASE（ｄＮＴＰ付き））、配列番号５のブロッキング剤（Ｇ検出用ブロッキング剤）、フォワードプライマー（ctgtgttgtccatcagttga：配列番号７）およびリバースプライマー（ccaatgctcatcccaacttc：配列番号８）（Ｇ検出用プライマー）を用いて、最初の変性工程を９５℃で５分行った後、１サイクルの変性工程が９４℃で３０秒、アニール工程が６０℃で３０秒、鎖伸長工程が７４℃で３０秒とするサイクルを３０サイクル行った。そして、最後の伸長工程を７４℃で７分行った。
【００９２】
（ｉｉ）第２のＰＣＲ反応
第２のＰＣＲ反応は、上記第１のＰＣＲ反応におけるリバースプライマー（配列番号８）の代わりに、配列番号９に示すリバースプライマー（ccaatgctcatcccaacact：配列番号９）（Ａ検出用プライマー）を用い、配列番号５に示すブロッキング剤の代わりに、配列番号６に示すブロッキング剤（Ａ検出用ブロッキング剤）を用いたこと以外は、上記第１のＰＣＲ反応と同様に行った。
【００９３】
なお、配列番号８に示すリバースプライマーの遺伝子配列は、Ｘ型の遺伝子（塩基Ｇ）に対してはハイブリダイセーション効率が高いが、ｘ型の遺伝子に対してはハイブリダイセーション効率が低い。そして、ｘ型の遺伝子（塩基Ａ）に対しては、配列番号５に示すブロッキング剤の方が、配列番号８に示すリバースプライマーよりもハイブリダイセーション効率が高いが、Ｘ型の遺伝子に対しては、配列番号５に示すブロッキング剤の方が、配列番号８に示すリバースプライマーよりもハイブリダイセーション効率が低い。一方、配列番号９に示すリバースプライマーの遺伝子配列は、ｘ型の遺伝子に対してはハイブリダイセーション効率が高いが、Ｘ型の遺伝子に対してはハイブリダイセーション効率が低い。そして、Ｘ型の遺伝子に対しては、配列番号６に示すブロッキング剤の方が、配列番号９に示すリバースプライマーよりもハイブリダイセーション効率が高いが、Ｘ型の遺伝子に対しては、配列番号６に示すブロッキング剤の方が、配列番号９に示すリバースプライマーよりもハイブリダイセーション効率が低い。
【００９４】
以上の点を融点で表現すると、ｘ型の遺伝子（塩基Ａ）に対しては、
Ｔｍ（Ｐｓ１）＝５３．９℃＜Ｔｍ（Ｂ１）＝５４．６℃、および
Ｔｍ（Ｂ２）＝５４．３℃＜Ｔｍ（Ｐｓ２）＝５６．３℃
であり、そしてＸ型の遺伝子（塩基Ｇ）に対しては、
Ｔｍ（Ｂ１）＝５４．３℃＜Ｔｍ（Ｐｓ１）＝５６．３℃、および
Ｔｍ（Ｐｓ２）＝５６．１℃＜Ｔｍ（Ｂ２）＝５６．５℃
である。ここで、Ｂ１とは配列番号５に示すブロッキング剤（Ｇ検出用ブロッキング剤）を、Ｂ２とは配列番号６に示すブロッキング剤（Ａ検出用ブロッキング剤）を、Ｐｓ１とは配列番号８に示すリバースプライマー（Ｇ検出用プライマー）を、Ｐｓ２とは配列番号９に示すリバースプライマー（Ａ検出用プライマー）をそれぞれ意味する。
【００９５】
（ｉｉｉ）電気泳動
第１のＰＣＲ反応および第２のＰＣＲ反応後のそれぞれの溶液中に増幅された遺伝子が存在するか否かの判定を、マイクロチップ電気泳動（株式会社島津製作所製、ＭｕｌｔｉＮＡ、ＤＮＡ−５００キット）により行った。結果を図４のレーン１〜６に示す。なお、レーンＭは、分子量マーカーである。図４の電気泳動写真の各レーンの下部に、検体の遺伝子型および用いたリバースプライマーの種類を示す。
【００９６】
（比較例１）
第１のＰＣＲ反応において配列番号５のブロッキング剤（Ｇ検出用ブロッキング剤）を用いなかったこと、および第２のＰＣＲ反応において配列番号６のブロッキング剤（Ａ検出用ブロッキング剤）を用いなかったこと以外は、実施例１と同様に行った。これは、いわゆるＭＡＳＡ法という従来手法である。結果を図４のレーン７〜１２に示す。
【００９７】
実施例１の電気泳動は、予め知られていた遺伝子多型を示唆するものであった。具体的には、予めＸＸ型（Ｇ／Ｇ型）であると知られている遺伝子を含む検体においては、Ｇ検出用プライマーを用いた第１のＰＣＲ反応後の溶液にのみ遺伝子の増幅産物が確認された（図４のレーン１および４）。一方、予めｘｘ型（Ａ／Ａ型）であると知られている遺伝子を含む検体においては、Ａ検出用プライマーを用いた第２のＰＣＲ反応後の溶液にのみ遺伝子の増幅産物が確認された（図４のレーン３および６）。そして、予めＸｘ型（Ｇ／Ａ型）であると知られている遺伝子を含む検体においては、第１および２のＰＣＲ反応後の溶液のいずれにおいても遺伝子の増幅産物が確認された（図４のレーン２および５）。しかしながら、比較例１の電気泳動では、増幅産物が検出されるべきではない溶液に増幅産物の存在が確認された（図４のレーン９および１０）。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、従来のＭＡＳＡ法に準じて設計されたプライマー対とともに、３’末端にｄｄＮＴＰを有するブロッキング剤を用いることにより、より確実かつより安価にＳＮＰの検出を行うことができる。したがって、ＳＮＰの判別をより容易に実施することができるため、ＳＮＰが深く関連していることが明らかな糖尿病や高血圧症などの疾病の発症リスクを予測することができる。さらに、癌特異的な変異の検出にも応用可能であり、さらには、癌特有の微量の変異検出においても、本発明の方法によって感度よくかつ正確に、微量変異を検出できるものと考えられる。また、ヒト白血球型抗原や血小板同種抗原、あるいは病原微生物のタイピングのような、類似する塩基配列を含む複数の遺伝子間の微細な塩基配列の相違の検出にも有用である。あるいは、わずかな塩基配列の相違に起因して活性が異なる薬剤代謝遺伝子のタイプを判別することによる、テーラーメード医療への応用も可能と考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第１の塩基および第２の塩基の２種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）および該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）のいずれか１または両方を含み、
（ａ）該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｂ）該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；および
（ｃ）該核酸試料について、該工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１およびＦ２）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；そして
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い、
方法。
【請求項２】
前記第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）が、前記第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして前記第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）が、前記第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）が、前記第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして前記第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）が、前記第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）と前記第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とが、前記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）と前記第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とが、前記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｃ）において、
前記工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが前記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
前記工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）がともに存在する場合は遺伝子型が第１／第２型であり、そして
前記工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しないが前記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在する場合は遺伝子型が第２／第２型であると判定する、
請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第１の塩基、第２の塩基、および第３の塩基の３種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、および該所定の一塩基多型による第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含み、
（ｄ）該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｅ）該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｆ）該所定の一塩基多型の第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と該所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；および
（ｇ）該核酸試料について、該工程（ｄ）〜（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２およびＦ３）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高く；そして
該第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、該第１のＤＮＡ鎖および該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖および該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高い、
方法。
【請求項８】
前記工程（ｇ）において、
前記工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが前記工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
前記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが前記工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
前記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが前記工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
前記工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが前記工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
前記工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが前記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、そして
前記工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが前記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であると判定する、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基、および第４の塩基の４種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）、および該所定の一塩基多型による第４の塩基を有するＤＮＡ鎖（第４のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含み、
（ｈ）第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｉ）第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｊ）第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と該所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；
（ｋ）第４の塩基検出用プライマー対（第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）および第４の対プライマー（Ｐｃ４））と該所定の一塩基多型に対応する第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ４）を検出する工程；および
（ｌ）該核酸試料について、該工程（ｈ）〜（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）は、該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第４の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ４）は、該第４のＤＮＡ鎖の第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高く；
該第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高く；そして
該第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）よりも高い、
方法。
【請求項１０】
前記工程（ｌ）において、
前記工程（ｈ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが前記工程（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
前記工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが前記工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
前記工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが前記工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であり、
前記工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在するが前記工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第４型であり、
前記工程（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが前記工程（ｈ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
前記工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが前記工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
前記工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在するが前記工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第４型であり、
前記工程（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが前記工程（ｈ）、（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、
前記工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在するが前記工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第４型であり、そして
前記工程（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ４）が存在するが前記工程（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第４／第４型であると判定する、
請求項９に記載の方法。
【請求項１】
核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第１の塩基および第２の塩基の２種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）および該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）のいずれか１または両方を含み、
（ａ）該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｂ）該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；および
（ｃ）該核酸試料について、該工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１およびＦ２）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；そして
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高い、
方法。
【請求項２】
前記第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）が、前記第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして前記第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）が、前記第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）が、前記第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして前記第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）が、前記第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）と前記第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とが、前記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）と前記第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とが、前記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｃ）において、
前記工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが前記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
前記工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）がともに存在する場合は遺伝子型が第１／第２型であり、そして
前記工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しないが前記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在する場合は遺伝子型が第２／第２型であると判定する、
請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第１の塩基、第２の塩基、および第３の塩基の３種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、および該所定の一塩基多型による第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含み、
（ｄ）該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｅ）該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｆ）該所定の一塩基多型の第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と該所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；および
（ｇ）該核酸試料について、該工程（ｄ）〜（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２およびＦ３）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高く；そして
該第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、該第１のＤＮＡ鎖および該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖および該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高い、
方法。
【請求項８】
前記工程（ｇ）において、
前記工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが前記工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
前記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが前記工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
前記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが前記工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
前記工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが前記工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
前記工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが前記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、そして
前記工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが前記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であると判定する、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基、および第４の塩基の４種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）、および該所定の一塩基多型による第４の塩基を有するＤＮＡ鎖（第４のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含み、
（ｈ）第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｉ）第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｊ）第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と該所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；
（ｋ）第４の塩基検出用プライマー対（第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）および第４の対プライマー（Ｐｃ４））と該所定の一塩基多型に対応する第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ４）を検出する工程；および
（ｌ）該核酸試料について、該工程（ｈ）〜（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）は、該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第４の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ４）は、該第４のＤＮＡ鎖の第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高く；
該第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高く；そして
該第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）よりも高い、
方法。
【請求項１０】
前記工程（ｌ）において、
前記工程（ｈ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが前記工程（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
前記工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが前記工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
前記工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが前記工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であり、
前記工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在するが前記工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第４型であり、
前記工程（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが前記工程（ｈ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
前記工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが前記工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
前記工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在するが前記工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第４型であり、
前記工程（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが前記工程（ｈ）、（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、
前記工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在するが前記工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第４型であり、そして
前記工程（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ４）が存在するが前記工程（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第４／第４型であると判定する、
請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１７２３２３（Ｐ２０１０−１７２３２３Ａ）
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１８０１（Ｐ２００９−２１８０１）
【出願日】平成２１年２月２日（２００９．２．２）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２日（２００９．２．２）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
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