一方向性多孔質複合体の製造方法および一方向性多孔質複合体
【課題】 優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、強度が異方的で変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させた一方向に連通した気孔と弾性を有する新しい一方向性多孔質複合体と、この一方向性多孔質複合体を簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造できる新しい一方向性多孔質複合体の製造方法を提供する。
【解決手段】 水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液とを混合し、氷結晶の成長サイズおよび成長方向を制御して凍結処理し、凍結乾燥することを特徴とする。
【解決手段】 水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液とを混合し、氷結晶の成長サイズおよび成長方向を制御して凍結処理し、凍結乾燥することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、一方向性多孔質複合体の製造方法および一方向に連通した気孔と弾性とを有する一方向性多孔質複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療の分野では、損傷を受けた組織や器官に代わる種々の人工生体材料の研究開発が盛んに進められている。また、骨欠損部の治療においては、人工骨材や人工骨充填材等のインプラントが用いられる。このようなインプラントには生体骨に類似の機械的特性はもちろん、生体適合性や骨誘導性が求められる。この骨誘導性とは、生体適用後に徐々に吸収されて、骨再生サイクルに取り込まれ、自身の骨に置換していく性質のことをいう。
【０００３】
脊椎動物の骨は、リン酸カルシウムの一種である水酸アパタイト（水酸アパタイト）と、タンパク質であるコラーゲンとからなる複合体である。これらは、生体骨中で水酸アパタイトが、そのｃ軸方向にコラーゲン繊維に沿って配向した特有の構造を形成し、この構造が骨に特有の機械的性質を与えていることが知られている。
【０００４】
そこで、硬いが脆くインプラント後に崩壊をきたすという強度の問題や、使用時の操作性が悪い等の問題を有していた、既存のリン酸カルシウムを使用した多孔体人工骨に代わって、上記のような生体骨に類似の構造組成を有する、水酸アパタイトとコラーゲンからなる二元複合生体材料が提案され（たとえば、特許文献１）、また、水酸アパタイト、コラーゲンおよびアルギン酸塩からなる三元複合生体材料も提案されている（たとえば、特許文献２）。これら複合生体材料は、上記のとおり、水酸アパタイトとコラーゲン、あるいは、さらにアルギン酸塩を含んでおり、水酸アパタイトのｃ軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した微小多孔質構造を有するように製造することができるとしている。このような構成を有するため、この複合生体材料は、スポンジ状の弾力性を有し、従来の強度の問題や、使用時の操作性の問題を解消することはもちろん、生体適合性および骨誘導性にも優れた複合生体材料であるとされている。
【特許文献１】ＷＯ ２００３／０３５１２８号公報
【特許文献２】特開２００３−１９０２７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の上記特許文献１および特許文献２のような複合生体材料は、球状の気孔が無秩序に存在しているため、強度が等方的であり、部位によっては周囲組織につぶされて変形するという強度の問題が依然として解消できないでいた。また、気孔の連通性が少ないため、細胞や組織の侵入性が不十分な場合があった。さらに、このような問題を解決しようとすると、たとえば、つなぎ材としてのコラーゲンを別途添加する工程や、ゲル化剤として、たとえば水酸化ナトリウムを添加する工程等が必要になる等、製造工程がさらに煩雑となり、手間とコストがかかるという問題があった。
【０００６】
そこで、本願発明は、以上のとおりの背景から、従来の問題点を解決すべく、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、強度が異方的で変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させた一方向に連通した気孔と弾性を有する新しい一方向性多孔質複合体と、この一方向性多孔質複合体を簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造できる、新しい一方向性多孔質複合体の製造方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明は、前記の課題を解決するものとして、第１には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液とを混合し、氷結晶の成長サイズおよび成長方向を制御して凍結処理し、凍結乾燥することを特徴とする。
【０００８】
また、本願発明は、第２には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向されているものであることを特徴とし、第３には、前記凍結
処理において、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合によって得られる混合物の特定箇所を冷却して、前記混合物全体を凍結することを特徴とし、第４には、前記凍結乾燥後に、さらに真空下で加熱処理することを特徴とし、第５には、前記凍結乾燥後に、化学架橋剤で処理することを特徴とする。
【０００９】
さらに、第６には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維の凝集体であって、一方向に連通した気孔からなる多孔質を有することを特徴とし、第７には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向されているものであること
を特徴とし、そして、第８には、気孔率８０％以上であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本願第１から第５の発明によれば、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、強度が異方的で変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させた一方向性多孔質複合体を、簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造できる。
【００１１】
第６から第８の発明によれば、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、強度が異方的で変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本願発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【００１３】
本願発明の一方向性多孔質複合体の製造方法は、水酸アパタイトとコラーゲンとを必須成分として含有している複合繊維である、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維（以下、ＨＡｐ／Ｃｏｌとすることがある）と緩衝液とを混合し、均一になるまで十分に混練し、ペースト状にして、水酸アパタイト／コラーゲン複合物（以下、混合物とすることがある）とする。次に、このペースト状の前記混合物を、凍結処理するために凍結装置等の型に注入し、冷却を開始して完全に凍結させる。
【００１４】
この凍結処理は、凍結することで前記混合物の構成成分を結晶化させ（すなわち氷結晶）この氷結晶の成長サイズ、および、成長方向を制御して行い、その後に凍結乾燥することで、一方向に連通した気孔からなる多孔質を有するＨＡｐ／Ｃｏｌの凝集体である一方向性多孔質複合体を製造する。
【００１５】
前記凍結処理においては、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合によって得られる混合物の任意の特定箇所（実際的には、この混合物が注入された容器の特定箇所）を冷却して、前記混合物全体を凍結することで、冷却した特定箇所（冷却面）から氷結晶が一方向に成長して、凍結乾燥後に一方向の連通性が高い気孔を有する多孔質複合体を、さらに効率よく得ることができる。この特定箇所は、底面や側面等、特に限定されない。さらには、前記混合物内（もしくは、混合物が注入された容器内）に冷却板や冷却
棒を挿入し、これを冷却して前記混合物を凍結してもよい。
【００１６】
「氷結晶の成長サイズ、および、成長方向を制御」について説明すると、具体的には、まず、「サイズ」については、冷却面の温度によって制御できる。たとえば、−１００℃では気孔横断面の短軸長さが５〜２０μｍ、−３０℃では気孔横断面の短軸長さが３０〜６０μｍとすることができる。次に、「方向」については、冷却面の設定によって制御できる。たとえば、前記混合物の底面（実際的には、混合物が注入されている容器の底面）のみを冷却すると、鉛直方向の一方向性連通気孔が形成され、また、前記混合物の側面（実際的には、混合物が注入されている円筒容器の側面）の場合は、側面から中心に向かって収束する一方向性連通気孔が形成される。
【００１７】
このように一方向性連通気孔を形成させることで、本願発明の一方向性多孔質複合体の強度は、一方向性連通気孔に対して平行な方向への圧縮強度が高いため、筋肉圧等によって潰れやすい方向に対して優先的に強度を付与することができる。また、組織再生については、従来の多孔質複合体が有する無秩序の球状気孔に比べ、一方向に連通した気孔は骨組織や血管の積極的な再生を気孔方向に沿って速やかに生じさせることができ、また、再生速度は気孔のサイズを大きくすることで高めることができる。そして、気孔サイズが大きすぎると強度が悪化し、小さいと強度が高くなるが、組織誘導の効果が低くなることを考慮して、上記の氷結晶の成長サイズ、および、成長方向を制御して凍結処理を行うことで、気孔サイズを制御して、気孔サイズを適宜組み合わせることにより、骨欠損部の状態に応じて部位最適化された、本願発明の多孔質複合体からなる人工骨材等を作製することができる。
【００１８】
なお、ＨＡｐ／Ｃｏｌの混合比率について説明すると、吸着水の重量を除いた重量比で、９０／１０〜６０／４０、特に８５／１５〜７０／３０の範囲で設定することが好ましい。この「吸着水の重量を除いた重量比」とは、大気下の熱重量測定によって、昇温速度２０℃／分において、室温（通常２５℃）〜２００℃の範囲の重量減少分を「吸着水」、２００〜６００℃の範囲の重量減少を「コラーゲン」、残り分を「水酸アパタイト」として算出することを示す。
【００１９】
このとき、ＨＡｐ／Ｃｏｌは、たとえば、水酸アパタイトのｃ軸がコラーゲン繊維軸に沿うように配向されている、生体骨に類似の微小多孔質構造を有する複合繊維体（たとえば、特開平１１−１９９２０９号公報参照）であることが望ましく、これをさらに凍結乾燥して、粉末状にしたものを使用することが、緩衝液の混合が容易となり、さらに望ましい。このような複合繊維体は、たとえば、水酸化カルシウム溶液とコラーゲンを含むリン酸塩水溶液を反応容器中に同時滴下し、生じた沈澱物を乾燥することにより得ることができる。ここで、用いられるコラーゲンは、特に限定されないが、分子量が大きいとＨＡｐ／Ｃｏｌ繊維合成時のコラーゲンの分散が悪くなるため、単分子なコラーゲンを用いることが好ましい。特に、ペプシン処理したアテロコラーゲンはモノメリックであることに加え、抗原性が低いため、好ましい。
【００２０】
水酸アパタイトは、一般組成をCa5(PO4)3OH、とする化合物であり、その反応の非化学
量論性によって、CaHPO4 、Ca3(PO4)2、Ca4O(PO4)2、Ca10(PO4)6(OH)2、CaP4O11、Ca(PO3)2、Ca2P2O7、Ca(H2PO4)2・H2O等、リン酸カルシウムと称される１群の化合物を含んでいる。また、水酸アパタイトは、Ca5(PO4)3OH、またはCa10(PO4)6(OH)2の組成式で示される化合物を基本成分とするもので、Ca成分の一部分は、Sr、Ba、MG、Fe、Al、Y、La、Na、K、H等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、(PO4)成分の一部分が、VO4、BO3、SO4、CO3、SiO4等から選ばれる１種以上で置換されてもよいし、さらに、(OH)成分の一部分が、F、Cl、O、CO3等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、これらの各
成分の一部が欠失していてもよい。
【００２１】
なお、水酸アパタイトは、通常の微結晶や非晶質、結晶体の他に、同型固溶体、置換型固溶体、侵入型固溶体であってもよく、非量子論的欠陥を含むものであってもよい。
【００２２】
コラーゲンは、現在では２０種類程度の分子種の異なるものが、哺乳動物に限らず、魚類を含む広範な動物の生体組織中に存在することが知られている。本願発明で用いられるコラーゲンは、その出発原料とする動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されず、任意のものを用いることができるが、一般的には、哺乳動物（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）や鳥類（たとえば、ニワトリ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが用いられる。また、魚類（たとえば、タラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ等）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を出発原料として用いてもよい。さらには、上記のような動物組織からの抽出ではなく、遺伝子組換え技術によって人工的に得られたコラーゲンを用いてもよい。
【００２３】
本願発明で用いられるコラーゲンは特に限定されないが、たとえば、Ｉ型コラーゲン、コラーゲンタンパク質のアミノ酸残基を、アセチル化、コハク化、マレイル化、フタル化、ベンゾイル化、エステル化、アミド化、グアニジノ化等といった化学修飾したものを用いてもよい。
【００２４】
本願発明に用いられる緩衝液は、イオン種やイオン強度を制御した溶媒であり、たとえば、イオン種が、無機イオンであるリン酸緩衝液等、あるいは、有機イオンであるトリス緩衝液や酢酸緩衝液等、各種の緩衝液を使用することができる。また、イオン強度は、上記のとおりペースト状にした水酸アパタイト／コラーゲン複合物中の値として、０．０１〜０．５の範囲、特に０．０２〜０．２の範囲であることが好ましい。
【００２５】
また、本願発明は、凍結乾燥における凍結温度を制御することで、多孔質複合体の気孔形状および気孔サイズを制御することができ、たとえば、気孔率を８０％以上にすることができる。この制御条件については、基本的には、上記の氷結晶の成長サイズ、および、成長方向を制御する条件に準じている。
【００２６】
さらに、この凍結乾燥後に、真空炉を使って減圧下で行う熱処理（真空熱処理）することで、脱水縮合を生じさせ、効率よく架橋を生成することができ、より弾性に富み、安定した多孔質複合体を製造することができる。真空熱処理の実施条件としては、コラーゲンにおける効率のよい架橋生成を考慮すると、温度は９０〜１７０℃の範囲、より好ましくは１００〜１５０℃の範囲であり、圧力（真空度）は気圧２０Ｐａ以下の減圧状態が好ましい。そして、処理時間は、温度によって変化する。具体的には、たとえば、処理温度が９０〜１１０℃の範囲の場合、処理時間は７２〜１６８時間が好ましく、処理温度が１１０〜１３０℃の範囲の場合、処理時間は２４〜１２０時間が好ましく、また、処理温度が１３０〜１５０℃の範囲の場合、処理時間は８〜４８時間以上が好ましく、さらに、処理温度が１５０〜１７０℃の範囲の場合、処理時間は３〜２４時間が好ましい。そして、コラーゲンの熱分解の進行をできるだけ抑制するために、コラーゲンに架橋が導入された後はできるだけ短時間に上記熱処理を終えることが好ましい。
【００２７】
さらにまた、化学架橋剤を使用することによっても、上記の真空熱処理と同様に効率よくコラーゲンに架橋を導入させることができる。本願発明における化学架橋剤は、タンパク質を架橋でき、水溶性を有するものであれば特に限定されるものではない。このタンパク質の架橋剤については、たとえば、Biomaterials 18, p95〜105 (1997)記載のものが使用でき、中でも、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系およびイミダゾール系架橋剤が、経済性、安全性および操作性の観点から好ましい。さらに具体的には、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドが、さらに好ましい。
【００２８】
このような製造方法によって、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維の凝集体であって、一方向に連通した気孔からなる多孔質を有することで、スポンジ様の弾性（粘弾性）を発揮することを特徴とした、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させることができる多孔質複合体を、簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造することができる。さらに、このとき水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸
が繊維軸方向に配向されているものであること、さらにまた、気孔率が８０％以上とすることによって、さらに効率よく、多孔質複合体の上記作用効果を実現できる。
【００２９】
そして、このような製造方法で製造された一方向性多孔質複合体は、生体骨類似体として、たとえば、骨欠損部の治療における人工骨材や人工骨充填材等のインプラントに活用することができる。
【００３０】
以下に、実施例を例示しながら、さらに詳しく本願発明の一方向性多孔質複合体の製造方法および一方向に連通する気孔と弾性とを有する一方向性多孔質複合体について説明する。もちろん、以下の例によって本願発明が限定されることはない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：本願発明の一方向性多孔質複合体の試験例と、その比較例
１．一方向性多孔質複合体の作製
（１） 水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維体（ＨＡｐ／Ｃｏｌ：混合比率は、８０／２０）７ｇと、リン酸緩衝液（１００ｍＭ, ｐＨ６．８）５６ｍＬとを混合し、均一になるまで十分に混練してペースト状とした。
（２） このペースト状の混合物を、凍結装置のペースト成形容器の型に注入し、容器底面から凍結冷却を開始して、前記ペーストを完全に凍結した。図１にこの凍結装置の構成例を例示した。この凍結装置１は、凍結乾燥機（ＡＤ２.０-ＥＬ-ＳＣ、バーチス社製）
付属の冷却台２、冷却台２の温度を伝導する真鍮台３、Ｈａｐ／Ｃｏｌからなるペースト状混合物４を注入するシリコーンからなる成形容器５（内径６０ｍｍ×高さ２０ｍｍ）とから構成されている。そして、前記真鍮台３から冷却台２の温度が、真鍮台３上に設置されている成形容器５内のペースト状混合物４に伝導し、凍結させる。
（３） 凍結完了後、凍結乾燥を行った。
（４） そして、１４０℃、１２時間の条件で、真空下で加熱処理（真空熱処理）を行い、脱水縮合を生じさせて、本願発明の一方向性多孔質複合体、すなわち、多孔質のＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体を作製した。
２．走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による観察
作製した一方向性多孔質複合体をカッターで、図２（Ａ）における、矢印Ａ−Ａおよび矢印Ｂ−Ｂに示したように切断（カッティング）し、その切断面を白金コーティングした。そして、この切断面から気孔構造に確認をＳＥＭで行った。
【００３２】
結果は、図３（Ａ）（Ｂ）に示したとおりであった。横断面図であるＡ−Ａ断面図および縦断面図であるＢ−Ｂ断面図ともに、気孔が確認できた。特に、縦断面図であるＢ−Ｂ断面図に示したように、多孔質複合体における気孔は、図２（Ａ）中の矢印Ｃで示した冷却面からの冷却方向に沿って、一方向に気孔が連通していることが確認できた。
３．圧縮強度試験
図２（Ｂ）に例示したように、作製した一方向性多孔質複合体から内径１０ｍｍ、高さ１０ｍｍの円柱（または、内径８ｍｍ、高さ８ｍｍ）を、白矢印で示した気孔軸が高さ方
向と平行および垂直になるように切り出した。この円柱を、リン酸緩衝液に浸漬し、減圧脱気した後、３７℃で静置してインキュベーションした。
【００３３】
２４時間のインキュベーション後、テクスチャーアナライザーを用いてリン酸緩衝液に浸漬した状態で多孔質複合体の圧縮試験を行った。押し込み速度０．１ｍｍ／ｓで押し込み、圧縮歪み２〜８％の範囲の応力−歪み曲線の傾きから圧縮弾性率を求め、圧縮歪み２０％時の応力を圧縮強度とした。
【００３４】
結果を表１に示した。値は、４サンプルの平均値±標準偏差で表記した。多孔質複合体は高い圧縮弾性率と強度を示し、それらは気孔方向による異方性も示した。多孔質複合体中の連通気孔軸と同方向に対する弾性率と強度は、垂直方向に対するよりもそれぞれ７倍および４倍高かった。
【００３５】
【表１】
実施例２：化学架橋剤を使用した一方向性多孔質複合体の検証Ｉ
上記実施例１で作製した一方向性多孔質複合体を、エタノールに浸漬後、減圧して脱泡し、室温で減圧乾燥した。内径８ｍｍ、高さ８ｍｍの円柱を、気孔軸が高さ方向と平行になるように切り出した。実施例１と同様にＰＢＳ中での圧縮試験を行った。
【００３６】
結果は、上記表１に示したとおりであった。
実施例３：化学架橋剤を使用した一方向性多孔質複合体の検証ＩＩ
実施例１で作製した一方向性多孔質複合体を、５０ｍＭの１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）を含むエタノールに浸漬した。速やかに減圧して脱泡し、室温にて外液をマグネティックスターラーで１２時間攪拌した。エタノールで繰り返し洗浄し、未反応ＥＤＣおよび副生成物を除去した後、減圧乾燥した。実施例２と同様にサンプルを切り出し、ＰＢＳ中での圧縮試験を行った。
【００３７】
結果は、上記の表１に示したとおりであった。
【００３８】
すなわち、化学架橋剤ＥＤＣをさらに用いたことで、本願発明の一方向性多孔質複合体の機械的強度を大幅に向上させることができることを確認できた。
実施例４：動物実験用の一方向性多孔質複合体の作製
４−１．動物実験用の一方向性多孔質複合体の作製
実施例１で作製した一方向性多孔質複合体を試料片１０×１０×３ｍｍの大きさに切り出した。一方向性気孔は短辺方向に対して垂直になるよう成型した。２５ｋＧｙの線量にてγ線滅菌を行い動物実験用の一方向性多孔質複合体とした。
４−２．動物実験用の比較用多孔質複合体の作製
比較用多孔質複合体として、従来作製されている凍結乾燥処理による無秩序な気孔構造を持った多孔質複合体（無秩序多孔質複合体）を作製した。実施例１の（１）で作製した
ペーストを同様な型に流し込み−２０℃で全方位から凍結し、同じ条件で凍結乾燥と真空熱処理を行った。試料片は上記４−１と同様に１０×１０×３ｍｍの大きさに切り出して、γ線滅菌処理を行った。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察により、気孔構造は従来報告されている無秩序な多孔構造を持っていることを確認した。
実施例５：一方向性多孔質複合体の生体内における組織観察
ウィスターラット（１０週齢；体重２８０−３２０）の背部皮下の筋肉と皮膚との間に、上記４−１及び４−２において作製した一方向性多孔質複合体及び無秩序多孔質複合体を、それぞれ別個のウィスターラットに移植した。その際に気孔構造に関しては十分に配慮を行った。そして、移植して２週間後に真皮組織ごと摘出した。１０％ホルムアルデヒドで固定し、アルコールにて脱水した後、キシレンで洗浄を行い、パラフィンワックスに埋め込んだ。これを厚さ5μｍの薄片にしてHE染色を行い、光学顕微鏡で組織観察を行っ
た。
【００３９】
図４に、光学顕微鏡写真（無秩序多孔質複合体（ａ）（ｃ）、一方向性多孔質複合体（ｂ）（ｄ））を示す。図４中の黒三角（▲）は侵入組織を示すものである。一方向性多孔質複合体（ａ）及び無秩序多孔質複合体（ｂ）はどちらも、明確な分解は生じていなかった。ここで、一方向性多孔質複合体（ａ）では、制御した気孔に周囲組織からの線維芽細胞様細胞などの浸潤が認められ、材料内部までほぼ均一に組織が侵入していた。一方、無秩序多孔質複合体（ｂ）では、組織侵入は外側だけに観察され、材料内部の気孔内への組織侵入は観察されなかった。このことより、組織侵入において、一方向に連通させた気孔構造の方が無秩序な気孔構造の材料よりも優れており、本願発明の一方向性多孔質複合体は細胞・組織親友性が優れていることが示された。
実施例６：一方向性多孔質複合体の生体内での血管新生に関する評価
上記４−１において作製した一方向性多孔質複合体に、２００μｌの血管由来の各成長因子（塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）０．２５μｇ／ｍｌと２．５μｇ／ｍｌ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）２．５μｇ／ｍｌ）を別個に滴下した後、それぞれを実施例５と同様に別個のラット背部皮下に移植した。そして、移植２週間後に摘出を行い、実施例５と同様な処理を行い、光学顕微鏡で観察して、生体内での血管新生に関する評価を行った。ここで、血管新生量を定量化するため、抗ＳＭＡ染色を用いて面積を計算した。また、比較例として、上記４−２において作製した無秩序多孔質複合体と、成長因子の代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を添加した一方向性多孔質複合体を用いた。
【００４０】
図５に、光学顕微鏡写真（無秩序多孔質複合体（ａ）、ＰＢＳ添加（ｂ）、ＦＧＦ０．２５μｇ／ｍｌ添加（ｃ）、ＦＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｄ）、ＶＥＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｅ））を示す。無秩序多孔質複合体（ａ）では、血管新生が殆ど観察されなかった。また、ＰＢＳ添加した一方向性多孔質複合体（ｂ）では、無秩序多孔質複合体（ａ）と比較して血管新生が観測されたが、成長因子を用いた一方向性多孔質複合体（ｃ）−（ｅ）ほど多くは無かった。そして、ＦＧＦ０．２５μｇ／ｍｌ添加（ｃ）とＦＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｄ）とＶＥＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｅ）を比較すると、ＦＧＦ濃度を増加させると血管新生が多くなり（（ｃ）＜（ｄ））、同じ濃度であればＦＧＦよりもＶＥＧＦの方が血管新生を促進している（（ｄ）＜（ｅ））ことが図５より明らかであるが、新生血管の面積計算からも統計学的に優位差があった。このことより、これら成長因子と一方向性多孔質構造の組み合わせることにより、一方向性多孔質複合体材料内部に血管新生を加速できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本願発明の一方向性多孔質複合体を作製する際に使用した、凍結装置の一例を例示した模式図であり、（Ａ）は側面図、（Ｂ）は平面図である。
【図２】本願発明の一方向性多孔質複合体の気孔構造を確認するため、試料の調製の様子を例示した模式図であり、（Ａ）は多孔質複合体のカッティングの様子、（Ｂ）は気孔軸の方向を例示している。
【図３】本願発明の一方向性多孔質複合体の気孔構造を例示した図であり、（Ａ）は図２のＡ−Ａ断面図を本願発明の一方向性多孔質複合体の横断面図として、（Ｂ）図２のＢ−Ｂ断面図を本願発明の一方向性多孔質複合体の縦断面図として例示している。
【図４】ラットの背部皮下の筋肉と皮膚との間に、本願発明の一方向性多孔質複合体を移植して、２週間後に摘出して、ＨＥ染色した試料（（ｂ）、（ｄ））の光学顕微鏡写真である。比較として、従来の無秩序多孔質複合体を用いて、同様に移植、摘出、染色した試料（（ａ）、（ｃ））の光学顕微鏡写真も示す。
【図５】ラットの背部皮下の筋肉と皮膚との間に、本願発明の一方向性多孔質複合体に血管由来の成長因子を添加した後に移植して、２週間後に摘出して、抗ＳＭＡ染色した試料（ＦＧＦ０．２５μｇ／ｍｌ添加（ｃ）、ＦＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｄ）、ＶＥＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｅ））の光学顕微鏡写真である。比較として、無秩序多孔質複合体（ａ）及びＰＢＳ添加した一方向性多孔質複合体（ｂ）を用いて、同様に移植、摘出、染色した試料の光学顕微鏡写真も示す。
【符号の説明】
【００４２】
１ 凍結装置
２ 冷却台
３ 真鍮台
４ ペースト状混合物
５ 成形容器
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、一方向性多孔質複合体の製造方法および一方向に連通した気孔と弾性とを有する一方向性多孔質複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療の分野では、損傷を受けた組織や器官に代わる種々の人工生体材料の研究開発が盛んに進められている。また、骨欠損部の治療においては、人工骨材や人工骨充填材等のインプラントが用いられる。このようなインプラントには生体骨に類似の機械的特性はもちろん、生体適合性や骨誘導性が求められる。この骨誘導性とは、生体適用後に徐々に吸収されて、骨再生サイクルに取り込まれ、自身の骨に置換していく性質のことをいう。
【０００３】
脊椎動物の骨は、リン酸カルシウムの一種である水酸アパタイト（水酸アパタイト）と、タンパク質であるコラーゲンとからなる複合体である。これらは、生体骨中で水酸アパタイトが、そのｃ軸方向にコラーゲン繊維に沿って配向した特有の構造を形成し、この構造が骨に特有の機械的性質を与えていることが知られている。
【０００４】
そこで、硬いが脆くインプラント後に崩壊をきたすという強度の問題や、使用時の操作性が悪い等の問題を有していた、既存のリン酸カルシウムを使用した多孔体人工骨に代わって、上記のような生体骨に類似の構造組成を有する、水酸アパタイトとコラーゲンからなる二元複合生体材料が提案され（たとえば、特許文献１）、また、水酸アパタイト、コラーゲンおよびアルギン酸塩からなる三元複合生体材料も提案されている（たとえば、特許文献２）。これら複合生体材料は、上記のとおり、水酸アパタイトとコラーゲン、あるいは、さらにアルギン酸塩を含んでおり、水酸アパタイトのｃ軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した微小多孔質構造を有するように製造することができるとしている。このような構成を有するため、この複合生体材料は、スポンジ状の弾力性を有し、従来の強度の問題や、使用時の操作性の問題を解消することはもちろん、生体適合性および骨誘導性にも優れた複合生体材料であるとされている。
【特許文献１】ＷＯ ２００３／０３５１２８号公報
【特許文献２】特開２００３−１９０２７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の上記特許文献１および特許文献２のような複合生体材料は、球状の気孔が無秩序に存在しているため、強度が等方的であり、部位によっては周囲組織につぶされて変形するという強度の問題が依然として解消できないでいた。また、気孔の連通性が少ないため、細胞や組織の侵入性が不十分な場合があった。さらに、このような問題を解決しようとすると、たとえば、つなぎ材としてのコラーゲンを別途添加する工程や、ゲル化剤として、たとえば水酸化ナトリウムを添加する工程等が必要になる等、製造工程がさらに煩雑となり、手間とコストがかかるという問題があった。
【０００６】
そこで、本願発明は、以上のとおりの背景から、従来の問題点を解決すべく、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、強度が異方的で変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させた一方向に連通した気孔と弾性を有する新しい一方向性多孔質複合体と、この一方向性多孔質複合体を簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造できる、新しい一方向性多孔質複合体の製造方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明は、前記の課題を解決するものとして、第１には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液とを混合し、氷結晶の成長サイズおよび成長方向を制御して凍結処理し、凍結乾燥することを特徴とする。
【０００８】
また、本願発明は、第２には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向されているものであることを特徴とし、第３には、前記凍結
処理において、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合によって得られる混合物の特定箇所を冷却して、前記混合物全体を凍結することを特徴とし、第４には、前記凍結乾燥後に、さらに真空下で加熱処理することを特徴とし、第５には、前記凍結乾燥後に、化学架橋剤で処理することを特徴とする。
【０００９】
さらに、第６には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維の凝集体であって、一方向に連通した気孔からなる多孔質を有することを特徴とし、第７には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向されているものであること
を特徴とし、そして、第８には、気孔率８０％以上であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本願第１から第５の発明によれば、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、強度が異方的で変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させた一方向性多孔質複合体を、簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造できる。
【００１１】
第６から第８の発明によれば、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、強度が異方的で変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本願発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【００１３】
本願発明の一方向性多孔質複合体の製造方法は、水酸アパタイトとコラーゲンとを必須成分として含有している複合繊維である、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維（以下、ＨＡｐ／Ｃｏｌとすることがある）と緩衝液とを混合し、均一になるまで十分に混練し、ペースト状にして、水酸アパタイト／コラーゲン複合物（以下、混合物とすることがある）とする。次に、このペースト状の前記混合物を、凍結処理するために凍結装置等の型に注入し、冷却を開始して完全に凍結させる。
【００１４】
この凍結処理は、凍結することで前記混合物の構成成分を結晶化させ（すなわち氷結晶）この氷結晶の成長サイズ、および、成長方向を制御して行い、その後に凍結乾燥することで、一方向に連通した気孔からなる多孔質を有するＨＡｐ／Ｃｏｌの凝集体である一方向性多孔質複合体を製造する。
【００１５】
前記凍結処理においては、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合によって得られる混合物の任意の特定箇所（実際的には、この混合物が注入された容器の特定箇所）を冷却して、前記混合物全体を凍結することで、冷却した特定箇所（冷却面）から氷結晶が一方向に成長して、凍結乾燥後に一方向の連通性が高い気孔を有する多孔質複合体を、さらに効率よく得ることができる。この特定箇所は、底面や側面等、特に限定されない。さらには、前記混合物内（もしくは、混合物が注入された容器内）に冷却板や冷却
棒を挿入し、これを冷却して前記混合物を凍結してもよい。
【００１６】
「氷結晶の成長サイズ、および、成長方向を制御」について説明すると、具体的には、まず、「サイズ」については、冷却面の温度によって制御できる。たとえば、−１００℃では気孔横断面の短軸長さが５〜２０μｍ、−３０℃では気孔横断面の短軸長さが３０〜６０μｍとすることができる。次に、「方向」については、冷却面の設定によって制御できる。たとえば、前記混合物の底面（実際的には、混合物が注入されている容器の底面）のみを冷却すると、鉛直方向の一方向性連通気孔が形成され、また、前記混合物の側面（実際的には、混合物が注入されている円筒容器の側面）の場合は、側面から中心に向かって収束する一方向性連通気孔が形成される。
【００１７】
このように一方向性連通気孔を形成させることで、本願発明の一方向性多孔質複合体の強度は、一方向性連通気孔に対して平行な方向への圧縮強度が高いため、筋肉圧等によって潰れやすい方向に対して優先的に強度を付与することができる。また、組織再生については、従来の多孔質複合体が有する無秩序の球状気孔に比べ、一方向に連通した気孔は骨組織や血管の積極的な再生を気孔方向に沿って速やかに生じさせることができ、また、再生速度は気孔のサイズを大きくすることで高めることができる。そして、気孔サイズが大きすぎると強度が悪化し、小さいと強度が高くなるが、組織誘導の効果が低くなることを考慮して、上記の氷結晶の成長サイズ、および、成長方向を制御して凍結処理を行うことで、気孔サイズを制御して、気孔サイズを適宜組み合わせることにより、骨欠損部の状態に応じて部位最適化された、本願発明の多孔質複合体からなる人工骨材等を作製することができる。
【００１８】
なお、ＨＡｐ／Ｃｏｌの混合比率について説明すると、吸着水の重量を除いた重量比で、９０／１０〜６０／４０、特に８５／１５〜７０／３０の範囲で設定することが好ましい。この「吸着水の重量を除いた重量比」とは、大気下の熱重量測定によって、昇温速度２０℃／分において、室温（通常２５℃）〜２００℃の範囲の重量減少分を「吸着水」、２００〜６００℃の範囲の重量減少を「コラーゲン」、残り分を「水酸アパタイト」として算出することを示す。
【００１９】
このとき、ＨＡｐ／Ｃｏｌは、たとえば、水酸アパタイトのｃ軸がコラーゲン繊維軸に沿うように配向されている、生体骨に類似の微小多孔質構造を有する複合繊維体（たとえば、特開平１１−１９９２０９号公報参照）であることが望ましく、これをさらに凍結乾燥して、粉末状にしたものを使用することが、緩衝液の混合が容易となり、さらに望ましい。このような複合繊維体は、たとえば、水酸化カルシウム溶液とコラーゲンを含むリン酸塩水溶液を反応容器中に同時滴下し、生じた沈澱物を乾燥することにより得ることができる。ここで、用いられるコラーゲンは、特に限定されないが、分子量が大きいとＨＡｐ／Ｃｏｌ繊維合成時のコラーゲンの分散が悪くなるため、単分子なコラーゲンを用いることが好ましい。特に、ペプシン処理したアテロコラーゲンはモノメリックであることに加え、抗原性が低いため、好ましい。
【００２０】
水酸アパタイトは、一般組成をCa5(PO4)3OH、とする化合物であり、その反応の非化学
量論性によって、CaHPO4 、Ca3(PO4)2、Ca4O(PO4)2、Ca10(PO4)6(OH)2、CaP4O11、Ca(PO3)2、Ca2P2O7、Ca(H2PO4)2・H2O等、リン酸カルシウムと称される１群の化合物を含んでいる。また、水酸アパタイトは、Ca5(PO4)3OH、またはCa10(PO4)6(OH)2の組成式で示される化合物を基本成分とするもので、Ca成分の一部分は、Sr、Ba、MG、Fe、Al、Y、La、Na、K、H等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、(PO4)成分の一部分が、VO4、BO3、SO4、CO3、SiO4等から選ばれる１種以上で置換されてもよいし、さらに、(OH)成分の一部分が、F、Cl、O、CO3等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、これらの各
成分の一部が欠失していてもよい。
【００２１】
なお、水酸アパタイトは、通常の微結晶や非晶質、結晶体の他に、同型固溶体、置換型固溶体、侵入型固溶体であってもよく、非量子論的欠陥を含むものであってもよい。
【００２２】
コラーゲンは、現在では２０種類程度の分子種の異なるものが、哺乳動物に限らず、魚類を含む広範な動物の生体組織中に存在することが知られている。本願発明で用いられるコラーゲンは、その出発原料とする動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されず、任意のものを用いることができるが、一般的には、哺乳動物（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）や鳥類（たとえば、ニワトリ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが用いられる。また、魚類（たとえば、タラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ等）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を出発原料として用いてもよい。さらには、上記のような動物組織からの抽出ではなく、遺伝子組換え技術によって人工的に得られたコラーゲンを用いてもよい。
【００２３】
本願発明で用いられるコラーゲンは特に限定されないが、たとえば、Ｉ型コラーゲン、コラーゲンタンパク質のアミノ酸残基を、アセチル化、コハク化、マレイル化、フタル化、ベンゾイル化、エステル化、アミド化、グアニジノ化等といった化学修飾したものを用いてもよい。
【００２４】
本願発明に用いられる緩衝液は、イオン種やイオン強度を制御した溶媒であり、たとえば、イオン種が、無機イオンであるリン酸緩衝液等、あるいは、有機イオンであるトリス緩衝液や酢酸緩衝液等、各種の緩衝液を使用することができる。また、イオン強度は、上記のとおりペースト状にした水酸アパタイト／コラーゲン複合物中の値として、０．０１〜０．５の範囲、特に０．０２〜０．２の範囲であることが好ましい。
【００２５】
また、本願発明は、凍結乾燥における凍結温度を制御することで、多孔質複合体の気孔形状および気孔サイズを制御することができ、たとえば、気孔率を８０％以上にすることができる。この制御条件については、基本的には、上記の氷結晶の成長サイズ、および、成長方向を制御する条件に準じている。
【００２６】
さらに、この凍結乾燥後に、真空炉を使って減圧下で行う熱処理（真空熱処理）することで、脱水縮合を生じさせ、効率よく架橋を生成することができ、より弾性に富み、安定した多孔質複合体を製造することができる。真空熱処理の実施条件としては、コラーゲンにおける効率のよい架橋生成を考慮すると、温度は９０〜１７０℃の範囲、より好ましくは１００〜１５０℃の範囲であり、圧力（真空度）は気圧２０Ｐａ以下の減圧状態が好ましい。そして、処理時間は、温度によって変化する。具体的には、たとえば、処理温度が９０〜１１０℃の範囲の場合、処理時間は７２〜１６８時間が好ましく、処理温度が１１０〜１３０℃の範囲の場合、処理時間は２４〜１２０時間が好ましく、また、処理温度が１３０〜１５０℃の範囲の場合、処理時間は８〜４８時間以上が好ましく、さらに、処理温度が１５０〜１７０℃の範囲の場合、処理時間は３〜２４時間が好ましい。そして、コラーゲンの熱分解の進行をできるだけ抑制するために、コラーゲンに架橋が導入された後はできるだけ短時間に上記熱処理を終えることが好ましい。
【００２７】
さらにまた、化学架橋剤を使用することによっても、上記の真空熱処理と同様に効率よくコラーゲンに架橋を導入させることができる。本願発明における化学架橋剤は、タンパク質を架橋でき、水溶性を有するものであれば特に限定されるものではない。このタンパク質の架橋剤については、たとえば、Biomaterials 18, p95〜105 (1997)記載のものが使用でき、中でも、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系およびイミダゾール系架橋剤が、経済性、安全性および操作性の観点から好ましい。さらに具体的には、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドが、さらに好ましい。
【００２８】
このような製造方法によって、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維の凝集体であって、一方向に連通した気孔からなる多孔質を有することで、スポンジ様の弾性（粘弾性）を発揮することを特徴とした、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させることができる多孔質複合体を、簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造することができる。さらに、このとき水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸
が繊維軸方向に配向されているものであること、さらにまた、気孔率が８０％以上とすることによって、さらに効率よく、多孔質複合体の上記作用効果を実現できる。
【００２９】
そして、このような製造方法で製造された一方向性多孔質複合体は、生体骨類似体として、たとえば、骨欠損部の治療における人工骨材や人工骨充填材等のインプラントに活用することができる。
【００３０】
以下に、実施例を例示しながら、さらに詳しく本願発明の一方向性多孔質複合体の製造方法および一方向に連通する気孔と弾性とを有する一方向性多孔質複合体について説明する。もちろん、以下の例によって本願発明が限定されることはない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：本願発明の一方向性多孔質複合体の試験例と、その比較例
１．一方向性多孔質複合体の作製
（１） 水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維体（ＨＡｐ／Ｃｏｌ：混合比率は、８０／２０）７ｇと、リン酸緩衝液（１００ｍＭ, ｐＨ６．８）５６ｍＬとを混合し、均一になるまで十分に混練してペースト状とした。
（２） このペースト状の混合物を、凍結装置のペースト成形容器の型に注入し、容器底面から凍結冷却を開始して、前記ペーストを完全に凍結した。図１にこの凍結装置の構成例を例示した。この凍結装置１は、凍結乾燥機（ＡＤ２.０-ＥＬ-ＳＣ、バーチス社製）
付属の冷却台２、冷却台２の温度を伝導する真鍮台３、Ｈａｐ／Ｃｏｌからなるペースト状混合物４を注入するシリコーンからなる成形容器５（内径６０ｍｍ×高さ２０ｍｍ）とから構成されている。そして、前記真鍮台３から冷却台２の温度が、真鍮台３上に設置されている成形容器５内のペースト状混合物４に伝導し、凍結させる。
（３） 凍結完了後、凍結乾燥を行った。
（４） そして、１４０℃、１２時間の条件で、真空下で加熱処理（真空熱処理）を行い、脱水縮合を生じさせて、本願発明の一方向性多孔質複合体、すなわち、多孔質のＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体を作製した。
２．走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による観察
作製した一方向性多孔質複合体をカッターで、図２（Ａ）における、矢印Ａ−Ａおよび矢印Ｂ−Ｂに示したように切断（カッティング）し、その切断面を白金コーティングした。そして、この切断面から気孔構造に確認をＳＥＭで行った。
【００３２】
結果は、図３（Ａ）（Ｂ）に示したとおりであった。横断面図であるＡ−Ａ断面図および縦断面図であるＢ−Ｂ断面図ともに、気孔が確認できた。特に、縦断面図であるＢ−Ｂ断面図に示したように、多孔質複合体における気孔は、図２（Ａ）中の矢印Ｃで示した冷却面からの冷却方向に沿って、一方向に気孔が連通していることが確認できた。
３．圧縮強度試験
図２（Ｂ）に例示したように、作製した一方向性多孔質複合体から内径１０ｍｍ、高さ１０ｍｍの円柱（または、内径８ｍｍ、高さ８ｍｍ）を、白矢印で示した気孔軸が高さ方
向と平行および垂直になるように切り出した。この円柱を、リン酸緩衝液に浸漬し、減圧脱気した後、３７℃で静置してインキュベーションした。
【００３３】
２４時間のインキュベーション後、テクスチャーアナライザーを用いてリン酸緩衝液に浸漬した状態で多孔質複合体の圧縮試験を行った。押し込み速度０．１ｍｍ／ｓで押し込み、圧縮歪み２〜８％の範囲の応力−歪み曲線の傾きから圧縮弾性率を求め、圧縮歪み２０％時の応力を圧縮強度とした。
【００３４】
結果を表１に示した。値は、４サンプルの平均値±標準偏差で表記した。多孔質複合体は高い圧縮弾性率と強度を示し、それらは気孔方向による異方性も示した。多孔質複合体中の連通気孔軸と同方向に対する弾性率と強度は、垂直方向に対するよりもそれぞれ７倍および４倍高かった。
【００３５】
【表１】
実施例２：化学架橋剤を使用した一方向性多孔質複合体の検証Ｉ
上記実施例１で作製した一方向性多孔質複合体を、エタノールに浸漬後、減圧して脱泡し、室温で減圧乾燥した。内径８ｍｍ、高さ８ｍｍの円柱を、気孔軸が高さ方向と平行になるように切り出した。実施例１と同様にＰＢＳ中での圧縮試験を行った。
【００３６】
結果は、上記表１に示したとおりであった。
実施例３：化学架橋剤を使用した一方向性多孔質複合体の検証ＩＩ
実施例１で作製した一方向性多孔質複合体を、５０ｍＭの１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）を含むエタノールに浸漬した。速やかに減圧して脱泡し、室温にて外液をマグネティックスターラーで１２時間攪拌した。エタノールで繰り返し洗浄し、未反応ＥＤＣおよび副生成物を除去した後、減圧乾燥した。実施例２と同様にサンプルを切り出し、ＰＢＳ中での圧縮試験を行った。
【００３７】
結果は、上記の表１に示したとおりであった。
【００３８】
すなわち、化学架橋剤ＥＤＣをさらに用いたことで、本願発明の一方向性多孔質複合体の機械的強度を大幅に向上させることができることを確認できた。
実施例４：動物実験用の一方向性多孔質複合体の作製
４−１．動物実験用の一方向性多孔質複合体の作製
実施例１で作製した一方向性多孔質複合体を試料片１０×１０×３ｍｍの大きさに切り出した。一方向性気孔は短辺方向に対して垂直になるよう成型した。２５ｋＧｙの線量にてγ線滅菌を行い動物実験用の一方向性多孔質複合体とした。
４−２．動物実験用の比較用多孔質複合体の作製
比較用多孔質複合体として、従来作製されている凍結乾燥処理による無秩序な気孔構造を持った多孔質複合体（無秩序多孔質複合体）を作製した。実施例１の（１）で作製した
ペーストを同様な型に流し込み−２０℃で全方位から凍結し、同じ条件で凍結乾燥と真空熱処理を行った。試料片は上記４−１と同様に１０×１０×３ｍｍの大きさに切り出して、γ線滅菌処理を行った。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察により、気孔構造は従来報告されている無秩序な多孔構造を持っていることを確認した。
実施例５：一方向性多孔質複合体の生体内における組織観察
ウィスターラット（１０週齢；体重２８０−３２０）の背部皮下の筋肉と皮膚との間に、上記４−１及び４−２において作製した一方向性多孔質複合体及び無秩序多孔質複合体を、それぞれ別個のウィスターラットに移植した。その際に気孔構造に関しては十分に配慮を行った。そして、移植して２週間後に真皮組織ごと摘出した。１０％ホルムアルデヒドで固定し、アルコールにて脱水した後、キシレンで洗浄を行い、パラフィンワックスに埋め込んだ。これを厚さ5μｍの薄片にしてHE染色を行い、光学顕微鏡で組織観察を行っ
た。
【００３９】
図４に、光学顕微鏡写真（無秩序多孔質複合体（ａ）（ｃ）、一方向性多孔質複合体（ｂ）（ｄ））を示す。図４中の黒三角（▲）は侵入組織を示すものである。一方向性多孔質複合体（ａ）及び無秩序多孔質複合体（ｂ）はどちらも、明確な分解は生じていなかった。ここで、一方向性多孔質複合体（ａ）では、制御した気孔に周囲組織からの線維芽細胞様細胞などの浸潤が認められ、材料内部までほぼ均一に組織が侵入していた。一方、無秩序多孔質複合体（ｂ）では、組織侵入は外側だけに観察され、材料内部の気孔内への組織侵入は観察されなかった。このことより、組織侵入において、一方向に連通させた気孔構造の方が無秩序な気孔構造の材料よりも優れており、本願発明の一方向性多孔質複合体は細胞・組織親友性が優れていることが示された。
実施例６：一方向性多孔質複合体の生体内での血管新生に関する評価
上記４−１において作製した一方向性多孔質複合体に、２００μｌの血管由来の各成長因子（塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）０．２５μｇ／ｍｌと２．５μｇ／ｍｌ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）２．５μｇ／ｍｌ）を別個に滴下した後、それぞれを実施例５と同様に別個のラット背部皮下に移植した。そして、移植２週間後に摘出を行い、実施例５と同様な処理を行い、光学顕微鏡で観察して、生体内での血管新生に関する評価を行った。ここで、血管新生量を定量化するため、抗ＳＭＡ染色を用いて面積を計算した。また、比較例として、上記４−２において作製した無秩序多孔質複合体と、成長因子の代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を添加した一方向性多孔質複合体を用いた。
【００４０】
図５に、光学顕微鏡写真（無秩序多孔質複合体（ａ）、ＰＢＳ添加（ｂ）、ＦＧＦ０．２５μｇ／ｍｌ添加（ｃ）、ＦＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｄ）、ＶＥＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｅ））を示す。無秩序多孔質複合体（ａ）では、血管新生が殆ど観察されなかった。また、ＰＢＳ添加した一方向性多孔質複合体（ｂ）では、無秩序多孔質複合体（ａ）と比較して血管新生が観測されたが、成長因子を用いた一方向性多孔質複合体（ｃ）−（ｅ）ほど多くは無かった。そして、ＦＧＦ０．２５μｇ／ｍｌ添加（ｃ）とＦＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｄ）とＶＥＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｅ）を比較すると、ＦＧＦ濃度を増加させると血管新生が多くなり（（ｃ）＜（ｄ））、同じ濃度であればＦＧＦよりもＶＥＧＦの方が血管新生を促進している（（ｄ）＜（ｅ））ことが図５より明らかであるが、新生血管の面積計算からも統計学的に優位差があった。このことより、これら成長因子と一方向性多孔質構造の組み合わせることにより、一方向性多孔質複合体材料内部に血管新生を加速できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本願発明の一方向性多孔質複合体を作製する際に使用した、凍結装置の一例を例示した模式図であり、（Ａ）は側面図、（Ｂ）は平面図である。
【図２】本願発明の一方向性多孔質複合体の気孔構造を確認するため、試料の調製の様子を例示した模式図であり、（Ａ）は多孔質複合体のカッティングの様子、（Ｂ）は気孔軸の方向を例示している。
【図３】本願発明の一方向性多孔質複合体の気孔構造を例示した図であり、（Ａ）は図２のＡ−Ａ断面図を本願発明の一方向性多孔質複合体の横断面図として、（Ｂ）図２のＢ−Ｂ断面図を本願発明の一方向性多孔質複合体の縦断面図として例示している。
【図４】ラットの背部皮下の筋肉と皮膚との間に、本願発明の一方向性多孔質複合体を移植して、２週間後に摘出して、ＨＥ染色した試料（（ｂ）、（ｄ））の光学顕微鏡写真である。比較として、従来の無秩序多孔質複合体を用いて、同様に移植、摘出、染色した試料（（ａ）、（ｃ））の光学顕微鏡写真も示す。
【図５】ラットの背部皮下の筋肉と皮膚との間に、本願発明の一方向性多孔質複合体に血管由来の成長因子を添加した後に移植して、２週間後に摘出して、抗ＳＭＡ染色した試料（ＦＧＦ０．２５μｇ／ｍｌ添加（ｃ）、ＦＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｄ）、ＶＥＧＦ２．５μｇ／ｍｌ添加（ｅ））の光学顕微鏡写真である。比較として、無秩序多孔質複合体（ａ）及びＰＢＳ添加した一方向性多孔質複合体（ｂ）を用いて、同様に移植、摘出、染色した試料の光学顕微鏡写真も示す。
【符号の説明】
【００４２】
１ 凍結装置
２ 冷却台
３ 真鍮台
４ ペースト状混合物
５ 成形容器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液とを混合し、氷結晶の成長サイズおよび成長方向を制御して凍結処理し、凍結乾燥することを特徴とする一方向性多孔質複合体の製造方法。
【請求項２】
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向さ
れているものであることを特徴とする請求項１の製造方法。
【請求項３】
前記凍結処理において、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合によって得られる混合物の特定箇所を冷却して、前記混合物全体を凍結することを特徴とする請求項１または２の製造方法。
【請求項４】
前記凍結乾燥後に、さらに真空下で加熱処理することを特徴とする請求項１から３いずれかの製造方法。
【請求項５】
前記凍結乾燥後に、化学架橋剤で処理することを特徴とする請求項１から３いずれかの製造方法。
【請求項６】
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維の凝集体であって、一方向に連通した気孔からなる多孔質を有することを特徴とする一方向性多孔質複合体。
【請求項７】
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向さ
れているものであることを特徴とする請求項６の一方向性多孔質複合体。
【請求項８】
気孔率８０％以上であることを特徴とする請求項６または７の一方向性多孔質複合体。
【請求項１】
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液とを混合し、氷結晶の成長サイズおよび成長方向を制御して凍結処理し、凍結乾燥することを特徴とする一方向性多孔質複合体の製造方法。
【請求項２】
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向さ
れているものであることを特徴とする請求項１の製造方法。
【請求項３】
前記凍結処理において、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合によって得られる混合物の特定箇所を冷却して、前記混合物全体を凍結することを特徴とする請求項１または２の製造方法。
【請求項４】
前記凍結乾燥後に、さらに真空下で加熱処理することを特徴とする請求項１から３いずれかの製造方法。
【請求項５】
前記凍結乾燥後に、化学架橋剤で処理することを特徴とする請求項１から３いずれかの製造方法。
【請求項６】
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維の凝集体であって、一方向に連通した気孔からなる多孔質を有することを特徴とする一方向性多孔質複合体。
【請求項７】
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向さ
れているものであることを特徴とする請求項６の一方向性多孔質複合体。
【請求項８】
気孔率８０％以上であることを特徴とする請求項６または７の一方向性多孔質複合体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−９８１１７（Ｐ２００７−９８１１７Ａ）
【公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２２５５４５（Ｐ２００６−２２５５４５）
【出願日】平成１８年８月２２日（２００６．８．２２）
【出願人】（３０１０２３２３８）独立行政法人物質・材料研究機構 (1,333)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２２日（２００６．８．２２）
【出願人】（３０１０２３２３８）独立行政法人物質・材料研究機構 (1,333)
【Ｆターム（参考）】
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