万能ウイルス様粒子（ＶＬＰ）インフルエンザワクチン
本明細書に記載するのは、切断、再設計、または改変された１つまたは複数のＨＡ分子をその表面に提示するインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。また、こうしたＶＬＰの製造方法および使用方法も記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示内容を本明細書に援用する、どちらも２０１０年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３０５，７６８号明細書および米国仮特許出願第６１／３０５，７５９号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の委託研究に関する記載
該当なし。
【０００３】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むインフルエンザ抗原タンパク質について記載し、こうしたＶＬＰの産生方法および使用方法についても記載する。
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型およびＣ型）は、ヒトおよび他の哺乳類種ならびに鳥種の呼吸器感染症の原因因子である。このウイルスの生活環に特有の生物学的および疫学的特徴により、新たなウイルス株の急速な抗原進化、および持続的出現が引き起こされ、特にＡ型ウイルスにおいてそうである。この抗原変異体の持続的出現により、季節性インフルエンザのエピデミック、および不規則な間隔での世界的なパンデミックが起こる。例年のインフルエンザのエピデミックは毎年、米国だけで約３６，０００人、世界全体で２５０，０００人の死亡と関連しており、同時に莫大な健康および経済上の負担の原因となっている。パンデミックインフルエンザはヒトの健康の重大な脅威となっており、１９１８年のパンデミックのような世界的な現象は、５，０００万人の死亡、および壊滅的な社会経済的影響の原因となった。
【０００５】
インフルエンザウイルスは、分節した一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する。インフルエンザＡウイルスは、ビリオン粒子の表面に２つの主要な糖タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を提示し、これらの２つの分子の抗原性に基づき１６種のＨＡサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６）および９種のＮＡサブタイプ（Ｎ１〜Ｎ９）に分類される。インフルエンザ感染後の主な免疫応答は、表面糖タンパク質ＨＡおよびＮＡを標的とする。ＨＡに対する抗体は、細胞表面受容体に対するウイルス結合を阻止し、ウイルスの侵入および感染を防止することができる。しかしながら、この応答は次第に無効になり、抗原ドリフト（突然変異の蓄積）または抗原シフト（遺伝子再集合による入れ替わり）に起因する新たな抗原変異体から保護することができない。
【０００６】
現在、季節性またはパンデミックインフルエンザ疾患を制御する最も効果的な介入の１つは、予防的ワクチン接種である。この実施には、最も新しいヒトウイルス分離株で製剤化されたワクチンを感受性の被検体に毎年投与する必要がある。こうしたワクチンは通常、各々孵化鶏卵または培養細胞で増殖させた個々のウイルスから調製され、その後ワクチン接種率を高める最終的なワクチン製剤にブレンドされる。インフルエンザウイルスの抗原変異が頻繁に起こるため、ワクチンは、ワクチンの防御効果を維持するため定期的に再製剤化して新たな抗原変異体を取り込む必要がある。
【０００７】
したがってワクチンの有効性は、ワクチンとヒトに流行するウイルス株との抗原類似性の程度による。さらに、高齢者などワクチン接種した人の一定の割合は、最新のワクチンで防御免疫を誘導できない。
【０００８】
ファージディスプレイ抗体ライブラリーを用いて行われた最近の研究から、広範囲のインフルエンザウイルスサブタイプの感染を阻止できる広い中和抗体が明らかになった（Ｊｉａｎｈｕａ Ｓｕｉ ｅｔ．ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：２６５−２７３）。広範囲のウイルスを中和するこうした抗体の能力は、ウイルス感染またはワクチン接種により誘導される主な中和メカニズムである受容体結合の阻止ではなく、ＨＡ分子のステム領域に存在する高度に保存されたサブドミナントエピトープと反応し、膜融合を阻害することにより感染を阻止することによって生じる。これらの高度に保存されたサブドミナントエピトープを提示するワクチンが設計されれば、広範囲のインフルエンザサブタイプから保護することができる広い中和免疫応答が惹起される。
【０００９】
最新のワクチンの製剤化に必要なウイルス成分を産生するには、選択したウイルスを孵化鶏卵または培養細胞に感染させることにより増殖する。このプロセスは、細胞表面に受容体を含むシアル酸にＨＡ分子を介して結合するウイルスの能力、侵入、ウイルス複製、および卵または培養細胞の液体からのウイルス子孫の単離に依存する。ウイルスＨＡの切断、再操作または改変を行えば、受容体結合を阻止することになり、ウイルス複製およびこうしたワクチンの製造を妨げることと考えられる。
【００１０】
インフルエンザＶＬＰは、２種、３種または４種のウイルス遺伝子（Ｍ１、Ｍ２、ＨＡおよびＮＡ）の同時発現により産生されるものであり、Ｍ１、Ｍ２または（類似の基質タンパク質）ＨＡおよびＮＡが構造の主要かつ本質的な成分である。たとえば、米国特許出願公開第２００８／００３１８９５号明細書および同第２００９／００２２７６２号明細書を参照されたい。これらの遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、細胞に同時にまたは連続的にトランスフェクトされ、転写され、そのそれぞれのタンパク質に翻訳されて、それらがウイルス様粒子に自己集合する。ウイルスとは異なり、受容体結合およびウイルス侵入に使用されるＨＡの領域を修飾しても、細胞からのＶＬＰの産生、アセンブリーまたは放出は阻害されない。すなわち、ＶＬＰを産生すれば、分子の遺伝的に多様なイムノドミナント領域を含むＨＡの大部分の欠失および改変が可能になるのに対し、ウイルスの複製方法はこれらの修飾を許容するものではない。また、同様の修飾は、やはりＶＬＰワクチンの表面に提示されるＮＡ分子に導入することもできる。
【００１１】
しかしながら、インフルエンザワクチン組成物、ならびにこうした組成物を製造および使用する方法が依然として求められている。
【発明の概要】
【００１２】
本明細書に記載するのは、少なくとも１つの切断型および／またはハイブリッドインフルエンザ抗原タンパク質（たとえば、ＨＡまたはＮＡ）を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。また、こうしたＶＬＰを含む組成物のほか、こうしたＶＬＰの製造方法および使用方法についても記載する。本明細書に記載のＶＬＰはウイルス遺伝子材料を有しておらず、したがって複製したり、または感染を引き起こしたりすることができない。一方、ＶＬＰは野生型ビリオンと形態学的類似性、生化学的類似性および抗原類似性があるため、高い免疫抗原性を示し、有効な防御免疫応答を惹起することができる。ＶＬＰは、ビリオンを不活化したワクチンと異なり、感染性ではなく化学的処理の必要がないため、ネイティブなコンフォメーションを維持している。さらに、本発明は、現在のインフルエンザウイルスおよび進化するインフルエンザウイルスから広く保護することによりインフルエンザワクチンを毎シーズン製剤化することに伴う問題も解決する。
【００１３】
このため、一態様では、本明細書に開示されるのは、本明細書において提供されるのはウイルス様粒子（ＶＬＰ）であることを含み、少なくとも１つの基質タンパク質（たとえば、Ｍ１などのインフルエンザ基質タンパク質、トゴ（ｔｈｏｇｏｔｏ）基質タンパク質およびＲＳＶ基質タンパク質）；および修飾インフルエンザポリペプチド（たとえば、ＨＡまたはＮＡなどの糖タンパク質）を含み、その修飾がインフルエンザ（たとえば、ＨＡ）ポリペプチドの膜貫通および細胞質尾部ドメインの外側に１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。ある種の実施形態では、欠失は、少なくとも１５０の連続したアミノ酸残基の欠失を含む。他の実施形態では、欠失は、連続していない２つ以上の欠失を含む。なおさらなる実施形態では、インフルエンザポリペプチド（たとえば、ＨＡ）は、１つまたは複数のアミノ酸突然変異（置換および／または付加）、たとえば、修飾インフルエンザポリペプチド（たとえば、ＨＡ）に、少なくとも１つのタンパク質分解開裂部位および／または少なくとも１つのリンカーが挿入されている実施形態を含む。リンカーは既知のリンカー配列でもよいし、あるいは本明細書に記載の分子を使用して新規に作製してもよい。本明細書に開示されたＶＬＰのいずれかでは、ＶＬＰは多価であってもよい、すなわち、本明細書に記載するような野生型および／または修飾インフルエンザポリペプチドの任意の組み合わせを含め、複数のインフルエンザ抗原タンパク質を含んでもよい。さらに、本明細書に記載のＶＬＰのいずれかでは、修飾インフルエンザ（たとえば、ＨＡまたはＮＡ）ポリペプチドの膜貫通および／または細胞質ドメインは、修飾インフルエンザポリペプチドと異なる株またはサブタイプ由来の膜貫通および／または細胞質ドメインで置換されている。さらに、本明細書に記載のＶＬＰのいずれかは、別のインフルエンザタンパク質、たとえば１つまたは複数の別の野生型基質タンパク質（Ｍ１および／またはＭ２）、１つまたは複数の別の改変（変異および／またはハイブリッド）基質タンパク質（Ｍ１および／またはＭ２）、１つまたは複数の野生型抗原性糖タンパク質（ＨＡおよび／またはＮＡ）、１つまたは複数のハイブリッド抗原性糖タンパク質（ＨＡおよび／またはＮＡ）、１つまたは複数の修飾抗原性糖タンパク質（ＨＡおよび／またはＮＡ）、１つまたは複数のハイブリッドおよび修飾抗原ポリペプチド（ＨＡおよび／またはＮＡ）、１つまたは複数のヌクレオプロテイン（ＮＰ）、１つまたは複数のＰＢ１タンパク質、１つまたは複数のＰＢ２タンパク質、１つまたは複数のＰＡタンパク質、およびこれらの組み合わせをさらに含んでいてもよい。ある種の実施形態では、ＶＬＰは、２つ以上の抗原性糖タンパク質（修飾または野生型の任意の組み合わせ）がＶＬＰの表面に発現する（たとえば、その結果、免疫応答を引き起こす）という点で多価である。本明細書に記載のＶＬＰのいずれかは、ＶＬＰのアセンブリーおよび放出を可能にする条件下で真核細胞（たとえば、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、トリ細胞、植物細胞または哺乳動物細胞）に発現させることができる。
【００１４】
別の態様では、本明細書に記載するのは、上記のようなＶＬＰのいずれかを含む宿主細胞である。ある種の実施形態では、宿主細胞は、ＶＬＰのポリペプチドをコードする１つまたは複数のベクターからの、本明細書に記載するようなＶＬＰのアセンブリーおよび放出を可能にする。ある種の実施形態では、真核細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、トリ細胞、植物細胞または哺乳動物細胞からなる群から選択される。
【００１５】
なお別の態様では、本明細書で提供するのは、本明細書に記載のＶＬＰのいずれかを産生する方法であって、少なくとも１つの基質タンパク質および少なくとも１つの修飾インフルエンザ（たとえば、ＨＡ）ポリペプチドをコードする１つまたは複数のベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトするステップ、およびＶＬＰの形成を可能にする条件下でタンパク質の組み合わせを発現させるステップを含む方法である。ＶＬＰのいずれかでは、基質タンパク質は、インフルエンザＭ１タンパク質でも、トゴ（ｔｈｏｇｏｔｏ）基質タンパク質でも、ＲＳＶ基質タンパク質でもよい。他の実施形態では、別のベクターまたは同じベクターが別のタンパク質、たとえば別のインフルエンザタンパク質（たとえば、ＮＡタンパク質等）をコードしていてもよい。ある種の実施形態では、少なくとも１つのベクターが、インフルエンザＭ２タンパク質をコードする配列を含む。発現ベクターはプラスミドでも、ウイルスベクターでも、バキュロウイルスベクターでも、または非ウイルスベクターでもよい。ベクターは、ＶＬＰのタンパク質の１つをコードしていても、２つ以上をコードしていても、または全部をコードしていてもよい。本明細書に記載のＶＬＰの産生方法のいずれかでは、ベクターの１つまたは複数を宿主細胞に安定にトランスフェクトしてもよい。ある種の実施形態では、少なくとも１つの基質タンパク質および修飾インフルエンザＨＡポリペプチドが別々のベクターにコードされ、修飾インフルエンザＨＡポリペプチドタンパク質をコードするベクターをトランスフェクトする前に少なくとも１つの基質タンパク質をコードするベクターを細胞に安定にトランスフェクトする。ベクターがコードするタンパク質は、全長野生型、全長ミュータント、切断型野生型、切断型ミュータント、ならびに／または、全長および／もしくは切断型野生型タンパク質または変異タンパク質を含むハイブリッドタンパク質であってもよい。細胞は、真核細胞、たとえば、酵母細胞でも、昆虫細胞でも、両生類細胞でも、トリ細胞でも、植物細胞でも、または哺乳動物細胞でもよい。ある種の実施形態では、少なくとも１つのＭタンパク質は、インフルエンザ基質タンパク質を含む。
【００１６】
なおさらなる態様では、本明細書に記載するのは、本明細書に記載するような少なくとも１つのＶＬＰを含む免疫原性組成物である。ある種の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかは、異なる修飾インフルエンザ（たとえば、ＨＡ）ポリペプチドを含む少なくとも２つのＶＬＰを含んでもよい。ある種の実施形態では、この組成物は、各ＶＬＰが異なる修飾ＨＡタンパク質を含む少なくとも２つのＶＬＰ、または２つ以上の改変ＨＡまたはＮＡ糖タンパク質をその表面に提示する単一のＶＬＰ（たとえば、。多価のＶＬＰ）を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔａｉｎｓ）。なおさらなる実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。
【００１７】
なおさらなる態様では、本明細書で提供するのは、被検体内でインフルエンザに対する免疫応答を引き起こす方法であって、被検体に本明細書に記載するような有効量のＶＬＰおよび／または免疫原性組成物を被検体（たとえば、ヒト）に投与することを含む方法である。ある種の実施形態では、組成物を粘膜投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、または経口投与する。ある種の実施形態では、この方法は、インフルエンザの複数の株またはサブタイプに対する免疫応答を引き起こし、それにより被検体を様々なインフルエンザウイルスによるインフルエンザ感染から、および／または長期間（２つ以上のインフルエンザ（ｆｌｕ）シーズン）にわたり保護する「万能」ワクチンを与える。
【００１８】
本方法のいずれかは、複数回の投与（たとえば、反復投与スケジュール）を含んでもよい。
【００１９】
別の態様では、本明細書に記載するようなインフルエンザＶＬＰを産生するパッケージング細胞株を提供する。この細胞株に少なくとも２つのＭタンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを安定にトランスフェクトして、安定にトランスフェクトされていない１つまたは複数のインフルエンザタンパク質をコードする配列をこの細胞に導入し、発現させると、細胞がＶＬＰを産生する。ある種の実施形態では、Ｍ１および／またはＭ２をコードする配列をパッケージング細胞株に安定に組み込み、ＶＬＰの表面に発現する修飾ＨＡタンパク質をコードする配列を細胞に導入してＶＬＰを形成する。他の実施形態では、修飾ＨＡタンパク質の１つまたは複数をコードする配列を細胞に安定に組み込み、パッケージング細胞株を形成し、少なくとも２つのＭタンパク質をコードする配列を導入するとＶＬＰが形成される。パッケージング細胞は、昆虫細胞でも、植物細胞でも、哺乳動物細胞でも、細菌細胞でも、または真菌細胞でもよい。ある種の実施形態では、パッケージング細胞は哺乳動物（たとえば、ヒト）細胞株である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＨＡ１配列の一部を除去し、シグナルペプチドとＨＡ１分子の残りの部分との間に挿入を導入した改変ＨＡ分子構造の模式図を示す。模式図および配列に記載されているようにジスルフィドの結合形成を防止するため、突然変異を導入する。分子のＨＡ２部分は、膜貫通および細胞質ドメインを含むその全体が維持される。このコンストラクトは、「１ＴＡ」（配列番号１および２）とする。
【図２】図２は、シグナルペプチドの除去後のＮＨ２末端配列が、保存されたエピトープの一部を形成する配列、および鎖間のジスルフィド結合を形成するためのＣ２０残基を含む第２の改変ＨＡ分子の模式図を示す。これは、切断されたＨＡ１の部分（Ｒ２４１〜Ｌ３３３）、および全ＨＡ２フラグメントと遺伝的に連鎖している。このコンストラクトは、「２ＴＡ」（配列番号３および４）とする。
【図３】図３は、改変ＨＡの模式的構造を示す。この場合、シグナルペプチドの除去後のΝＨ２末端部分（Ｄ１７〜Ｐ６５）が、設計された１２アミノ酸のリンカー（ＤＩＧＰＧＫＶＧＹＧＰＧ、配列番号１１）を介して切断されたＨＡ１の領域（Ｍ２８１〜Ｒ３４６）に連結され、この全フラグメントが、Ｖ４１２からＤ４１２への、およびＬ４１９からＧ４１９への突然変異を導入してタンパク質凝集を防止した完全なＨＡ２（Ｇ３４７〜Ｉ５６８）に結合している。このコンストラクトは、「３ＴＡ」（配列番号５および６）とする。
【図４】図４は、ＨＡ２フラグメントの、シグナルペプチドの除去後の全アミノ酸配列を包含する切断型ＨＡ分子（細胞外、膜貫通および細胞質ドメインを含むＧ３４７〜Ｉ５６８の模式図を示す。このコンストラクトは、「４ＴＡ」（配列番号７および８）とする。
【図５Ａ】図５Ａは、ＨＡ１の配列内に２つ（１つはＰ６５位とＬ６６位との間、およびもう１つはＩ２８０位とＭ２８１位との間）のタンパク質分解開裂部位（各々ＰＱＲＥＲＲＲＫＲ、配列番号１２である１０アミノ酸のインサート）を導入して再操作したＨＡ分子の模式図である。このコンストラクトは、「５ＴＡ」（配列番号９および１０）とする。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＨＡ１の配列内に２つ（１つはＰ６５位とＬ６６位との間、およびもう１つはＩ２８０位とＭ２８１位との間）のタンパク質分解開裂部位（各々ＰＱＲＥＲＲＲＫＲ、配列番号１２である１０アミノ酸のインサート）を導入して再操作したＨＡ分子の模式図である。発現して修飾ＨＡがそのネイティブなコンフォメーションにフォールディングした後、最もドミナントな高度に可変性の抗原部位を提示するこの構造の球状頭部をプロテアーゼ処理により除去して、広い防御免疫応答を惹起する高度に保存されたサブドミナントエピトープを露出することができる。この構造は、Ｃ２０とＣ４８３との間の鎖内ジスルフィド結合により維持される。このコンストラクトは、「５ＴＡ」（配列番号９および１０）とする。
【図６】図６のパネルＩは、ＶＬＰ産生のため、図示した調節エレメントの下、決められた位置にインフルエンザ遺伝子を有する、哺乳動物細胞の例示的なＤＮＡベクターの模式図である。図６のパネルＩＩは、ＶＬＰ産生のため、図示した調節エレメントの下、決められた位置にインフルエンザ遺伝子を有する、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系の例示的なＤＮＡベクターの模式図である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＶＬＰの持続的産生のため、哺乳動物細胞へのベクターのトランスフェクション、タンパク質の発現、および安定にトランスフェクトされた細胞株の選択に利用した戦略の例を図示する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＶＬＰの持続的産生のため、哺乳動物細胞へのベクターのトランスフェクション、タンパク質の発現、および安定にトランスフェクトされた細胞株の選択に利用した戦略の例を図示する。
【図８】図８Ａは、一次抗体として抗Ｍ２抗体、および二次抗体としてフルオレセインＦＩＴＣ標識抗マウスを用いた、Ｍ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）の結果を示す。図８Ａは、未染色の対照である。図８Ｂは、一次抗体として抗Ｍ２抗体、および二次抗体としてフルオレセインＦＩＴＣ標識抗マウスを用いた、Ｍ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）の結果を示す。図８Ｂはアイソタイプコントロールを示す。図８Ｃは、一次抗体として抗Ｍ２抗体、および二次抗体としてフルオレセインＦＩＴＣ標識抗マウスを用いた、Ｍ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）の結果を示す。図８Ｃは、Ｍ２の表面発現に対して染色したアイソタイプコントロールを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｍ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の細胞ライセートのウエスタンブロットを示す。図９Ａは、ＭＤＣＫ細胞のタンパク質レベルを示す（レーン１は通常のＭＤＣＫ細胞の結果を示し、レーン２はＭ１／Ｍ２タンパク質を構成的に発現するＭＤＣＫ細胞の結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｍ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の細胞ライセートのウエスタンブロットを示す。図９ＢはＣＨＯ細胞の結果を示す。レーン１は陰性対照（ＣＨＯ細胞ライセート）を示し、レーン２はインフルエンザウイルスＰＲ８を感染させたＣＨＯ細胞を示し、レーン３はＭ１／Ｍ２を構成的に発現するＣＨＯ細胞（クローン１）を示し、レーン４はＭ１／Ｍ２を構成的に発現するＣＨＯ細胞（クローン２）を示す。
【図１０】図１０は、Ｍ１／Ｍ２およびＮＡ／ＨＡ（改変）をトランスフェクトした哺乳動物細胞の細胞ライセートのウエスタンブロットを示す。図１０はＣＨＯ細胞ライセートおよび濃縮／精製された培養上清のタンパク質レベルを示す。レーン１はインフルエンザウイルス対照（ＨＡ５／ＮＡ１の再集合ＰＲ８）、レーン２は陰性対照としてトランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞、レーン３および５はＭ１／Ｍ２をＮＡ／ＨＡ改変５ＴＡと一緒にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞ライセート（レーン３）、およびＮＡ／ＨＡ改変３ＴＡ（レーン５）と一緒にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞ライセートである。レーン４および６はそれぞれ、Ｍ１／Ｍ２をＮＡ／改変ＨＡ−５ＴＡと一緒にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の濃縮／精製された培養上清、およびＮＡ／改変ＨＡ−３ＴＡと一緒にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の濃縮／精製された培養上清を示す。
【図１１】図１１は、ＣＨＯ細胞で産生され、Ｍ１／Ｍ２−ＮＡ／ＨＡトランスフェクト細胞の培養上清から精製されたＶＬＰの電子顕微鏡写真像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の実施には、他に記載がない限り、当該技術分野の技術の範囲内にある化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を利用する。こうした技術は、文献に詳細に説明されている。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ），２ｎｄ ｅｄ．（Ｎｅｗｔｏｎ ＆ Ｇｒａｈａｍ ｅｄｓ．，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｆｉｅｌｄｓ ＆ Ｋｎｉｐｅ ｅｄｓ．，１９９１，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００２２】
本明細書に引用する刊行物、特許および特許出願についてはすべて、その全体を本明細書に援用する。
【００２３】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容により明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数のものを含む。したがって、たとえば、「ａ ＶＬＰ」という場合は、２つ以上のそうしたＶＬＰの混合物を含む。
【００２４】
定義
本明細書で使用する場合、「サブウイルス粒子」「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」という用語は、複製しないウイルス殻をいう。ＶＬＰは一般に、以下に限定されるものではないが、カプシドタンパク質、コートタンパク質、殻タンパク質、表面タンパク質および／もしくはエンベロープタンパク質と呼ばれるタンパク質などの１つまたは複数のウイルスタンパク質、またはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドからなる。ＶＬＰは、適切な発現系でタンパク質を組換え発現させると、自然に形成され得る。特定のＶＬＰを産生する方法は、当該技術分野において公知であり、以下でより詳細に考察する。ウイルスタンパク質の組換え発現後のＶＬＰの存在については、電子顕微鏡、生物物理学的特徴付けおよび同種のものなどにより当該技術分野において公知の従来の技術を用いて検出することができる。たとえば、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９９１）６０：１４４５−１４５６；Ｈａｇｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：４５０３−４５０５を参照されたい。たとえば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離により単離し、および／または特徴的な密度バンディング（たとえば、実施例）により特定することができる。あるいは、対象のＶＬＰ調製物のガラス化した水性サンプルを用いて低温電子顕微鏡観察を行い、適切な撮影条件下で画像を記録してもよい。ＶＬＰ精製の別の方法として、親和性法、イオン交換法、サイズ排除法および逆相法などのクロマトグラフィー技術があるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
本明細書に使用する場合、「ハイブリッド」または「キメラ」という用語は、分子（たとえば、タンパク質またはＶＬＰ）が、少なくとも２つの異なるタンパク質の各部分を含むことをいう。たとえば、ハイブリッドインフルエンザＨＡタンパク質とは、インフルエンザＨＡタンパク質の少なくとも一部（たとえば１つまたは複数の抗原決定基を含む一部）、および異種のタンパク質（たとえば、異なるインフルエンザタンパク質または異なるウイルスタンパク質、たとえばＲＳＶまたはＶＳＶタンパク質の細胞質および／または膜貫通ドメイン）の一部を含むタンパク質をいう。本明細書に記載するようなハイブリッド分子は、別の異種のポリペプチド（全長またはその一部）に融合した全長タンパク質、および異種のポリペプチド（全長またはその一部）に融合したタンパク質の一部を含んでもよいことが明らかであろう。また、ハイブリッドは、野生型配列、または異種のドメインの任意の１つ、一部または全部の変異配列を含んでもよいことも明らかであろう。
【００２６】
特定のウイルスタンパク質に由来する「粒子形成ポリペプチド」とは、ＶＬＰの形成に有利に働く条件下でＶＬＰを形成する能力を有する、全長またはほぼ全長のウイルスタンパク質、およびそのフラグメント、または内部欠失を持つウイルスタンパク質を意味する。したがって、このポリペプチドは、当該分子の全長配列、フラグメント、切断された部分配列のほか、アナログおよび前駆体形態を含んでもよい。このためこの用語は、ポリペプチドがＶＬＰを形成する能力を保持する限り、配列に対する欠失、付加および置換を意図している。よって、この用語は、ウイルス分離株の間ではコートタンパク質の変異が起こることが多いため、特定のポリペプチドの自然変異を含む。また、この用語は、当該タンパク質がＶＬＰを形成する能力を保持する限り、そのタンパク質において自然に発生しない欠失、付加および置換も含む。好ましい置換は、性質上保存的なものである、すなわち、側鎖に関連しているアミノ酸の群内で起こる置換である。具体的には、アミノ酸は一般に４つの群：（１）酸性−アスパルテートおよびグルタメート；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを芳香族アミノ酸に分類することもある。
【００２７】
「抗原」とは、宿主の免疫系を刺激して液性および／または細胞性の抗原特異的応答を生じさせる１つまたは複数のエピトープ（線状、立体構造またはその両方）を含む分子をいう。この用語は、「免疫原」という用語と同義で使われる。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５アミノ酸を含むものであるが、３〜４という少ないアミノ酸であってもよい。ＣＴＬエピトープなどのＴ細胞エピトープは少なくとも約７〜９アミノ酸を、ヘルパーＴ細胞エピトープは少なくとも約１２〜２０アミノ酸を含む。通常、エピトープは、９、１０、１２または１５アミノ酸など約７〜１５アミノ酸を含む。この用語は、タンパク質が本明細書で定義した免疫学的応答を惹起する能力を維持する限り、天然配列と比較して欠失、付加および置換（一般に性質上保存的）などの修飾を含むポリペプチドを含む。これらの修飾は、部位特異的変異誘発によるなど人為的なものであってもよいし、または抗原を産生する宿主の突然変異によるなど偶発的なものであってもよい。
【００２８】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」とは、被検体において目的の組成物中に存在する抗原に対して液性および／または細胞性免疫応答を生じさせることをいう。本開示においては、「液性免疫応答」とは、抗体分子が関与する免疫応答をいい、「細胞性免疫応答」とは、Ｔリンパ球および／または他の白血球が関与するものをいう。細胞性免疫の１つの重要な側面として、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答が挙げられる。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）がコードし、細胞表面に発現するタンパク質と共に提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内の微生物の破壊、またはそうした微生物に感染した細胞の溶解を誘導および促進するのを助ける。細胞性免疫のもう１つの側面として、ヘルパーＴ細胞抗原特異的応答が挙げられる。ヘルパーＴ細胞は、表面にＭＨＣ分子と共にペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性を亢進するのを助ける働きをする。また、「細胞性免疫応答」は、サイトカイン、ケモカイン、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものなど活性化Ｔ細胞および／または他の白血球により産生される他のそうした分子の産生もいう。このため、免疫学的応答は、以下の作用：Ｂ細胞による抗体の産生；および／または目的の組成物またはワクチンに存在する抗原に特異的なサプレッサーＴ細胞および／またはγΔＴ細胞の活性化の１つまたは複数を含み得る。これらの応答は、感染性を中和し、および／または抗体−補体または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、免疫された宿主を保護する働きをし得る。こうした応答は、当該技術分野において周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて判定することができる。
【００２９】
「免疫原性組成物」は、組成物が被検体に投与されると、被検体に目的の抗原分子に対する液性および／または細胞性免疫応答を生じさせる抗原分子を含む組成物である。
【００３０】
「実質的に精製された」は一般に、ある物質がその物質が存在するサンプルの過半の割合を有するように物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）を単離することをいう。典型的には、サンプル中の実質的に精製された構成成分は、サンプルの５０％、好ましくは８０％〜８５％、一層好ましくは９０〜９５％を構成する。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製する技術は、当該技術分野において公知であり、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度による沈降が挙げられる。
【００３１】
「コード配列」または選択されたポリペプチド「をコードする」配列とは、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置くと、インビボでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子をいう。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、以下に限定されるものではないが、ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらに合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置してもよい。
【００３２】
典型的な「制御エレメント」として、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’側に位置する）、翻訳の開始を最適化する配列（コード配列の５’側に位置する）、および翻訳終結配列、ならびに／またはオープンクロマチン構造を制御する配列エレメントがあるが、これに限定されるものではない たとえば、ＭｃＣａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９２：５４３１−５４３５；Ｋｏｃｈｅｔｏｖ ｅｔ ａｌ（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４４０：３５１−３５５を参照されたい。
【００３３】
「核酸」分子は、以下に限定されるものではないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（たとえば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらに合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。この用語にはさらに、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基アナログのいずれかを含む配列も含まれる。
【００３４】
「作動可能に連結された」とは、その記載された各要素がその通常の機能を発揮するように構成されている各エレメントの配置をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結された個々のプロモーターは、活性化されるとコード配列を発現させることができる。プロモーターは、コード配列の発現を誘導するように機能する限り、コード配列と隣接させる必要はない。このため、たとえば、プロモーター配列とコード配列との間に転写されるが翻訳されない介在配列が存在してもよく、このプロモーター配列がコード配列に「作動可能に連結された」と見なされることに変わりはない。
【００３５】
本明細書で使用する場合、核酸分子について記載する「組換え体」とは、その起源または操作によって、（１）ポリヌクレオチドが本来結合するポリヌクレオチドの全部または一部と結合していない、および／または、（２）ポリヌクレオチドが本来連結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結しているゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、半合成由来または合成由来のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドについて使用する「組換え体」という用語は、組換えポリヌクレオチドの発現により産生されるポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および単細胞体として培養された原核微生物または真核細胞株を示す他のこうした用語は同義で使われ、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの被導入体として使用することができる、または使用されてきた細胞をいい、かつ最初にトランスフェクトされた細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的または人為的突然変異により最初の親と形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡが必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解されよう。所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列が存在するなど適切な特性を特徴とするため、親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義が意図している子孫に含まれ、上記の用語に包含される。
【００３６】
アミノ酸配列の「類似性」を判定する技術は、当該技術分野において周知である。一般に、「類似性」は、適切な場所の２つ以上のポリペプチドのアミノ酸とアミノ酸を正確に比較した場合に、アミノ酸が同一であるか、または電荷または疎水性など類似の化学的および／または物理的性質を有することを意味する。その後比較したポリペプチド配列間のいわゆる「類似率」を決定することができる。また、核酸およびアミノ酸配列の同一性を判定する技術は当該技術分野において周知であり、その遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を（通常ｃＤＮＡ中間体を介して）決定すること、およびそれがコードするアミノ酸配列を決定すること、およびこれをもう１つのアミノ酸配列と比較することを含む。一般に、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の「同一性」とはそれぞれ、ヌクレオチドとヌクレオチドとの正確な一致度またはアミノ酸とアミノ酸との正確な一致度をいう。
【００３７】
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、その「同一率」を判定することにより比較することができる。同様に２つ以上のアミノ酸配列も、その「同一率」を判定することにより比較することができる。２つの配列の同一率は一般に、核酸配列かペプチド配列かを問わず、整列させた２つの配列間でマッチングしている正確な数を、短いほうの配列の長さで割り、その商に１００を掛けたものとして記載される。核酸配列の適切なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより得られる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡにより開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により標準化されたスコアリングマトリクスを用いてペプチド配列に応用してもよい。配列間の同一率または類似率の計算に好適なプログラムは一般に、当該技術分野において公知である。
【００３８】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移すことができる（たとえば、細菌プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状キャリアおよびリポソーム）。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、宿主細胞に１つまたは複数の目的の配列の発現を誘導することができる任意の核酸コンストラクトを意味する。したがって、この用語は、ウイルスベクターだけでなく、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクルを含む。この用語は、「核酸発現ベクター」および「発現カセット」という用語と同義に使用される。
【００３９】
「被検体」は、以下に限定されるものではないが、ヒト、および他の霊長類、たとえばチンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種などの非ヒト霊長類；農用動物、たとえばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；家庭で飼育される哺乳動物、たとえばイヌおよびネコ；実験動物、たとえばマウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯動物；トリ、たとえば家庭で飼育されるトリ、野生のトリおよび猟鳥、たとえばニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽、アヒル、ガチョウおよび同種のものなどの脊椎動物亜門に属する任意の動物を意味する。この用語は、特定の年齢を示すものではない。したがって、成体個体および新生個体の両方を包含することを意図している。上述の系は、上記の脊椎動物種のいずれかに使用することを意図している。これらの脊椎動物の免疫系がどれも同様に働くためである。
【００４０】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、ある材料が生物学的またはその他の点で望ましいこと、すなわち、製剤または組成物として許容できない生物学的作用を何ら引き起こすことなく、または材料が含まれる組成物の要素のいずれとも有害な相互作用を引き起こすことなく材料を個体に投与することができることを意味する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「処置」とは、（ｉ）伝統的なワクチンと同様の感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の抑制または消失、および（ｉｉｉ）目的の病原体の実質的または完全な排除のいずれかをいう。処置は予防的（感染の前）に行っても、または治療的（感染後）に行ってもよい。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「アジュバント」という用語は、製剤中の特定の免疫原（たとえばＶＬＰ）と組み合わせて使用して場合、免疫応答を増強するか、あるいは、他の点で変化または修飾する化合物をいう。免疫応答の修飾としては、抗体および細胞性免疫応答のどちらか一方あるいは両方の特異性の強化または拡大が挙げられる。また、免疫応答の修飾は、ある種の抗原特異的免疫応答を低下または抑制することも意味する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「有効用量」は一般に、免疫を誘導する、感染症を予防および／または軽減する、または感染症の少なくとも１つの症状を緩和する、および／または別の用量のＶＬＰの有効性を高めるのに十分な本発明のＶＬＰの量をいう。有効用量とは、感染症の発現を遅延させる、または最小限に抑えるのに十分なＶＬＰの量をいう場合がある。また、有効用量は、感染症の処置または管理において治療効果が得られるＶＬＰの量をいうこともある。さらに、有効用量は、感染症の処置または管理において治療効果が得られる、本発明のＶＬＰ単独、または他の治療剤と組み合わせた量でもある。また、有効用量は、将来の感染性因子との接触に対して被検体自身の（たとえば、ヒトの）免疫応答を増強するのに十分な量であってもよい。免疫のレベルは、たとえば、プラーク中和アッセイ、補体結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、またはマイクロ中和アッセイで、たとえば、中和分泌および／または血清抗体の量を測定することによりモニターすることができる。ワクチンの場合、「有効用量」は、疾患を予防する、および／または症状の重症度を緩和する量である。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、所望の生物学的作用を実現するのに必要または十分なＶＬＰの量をいう。有効量の組成物は、選択した結果を達成する量と考えられ、こうした量は、当業者であれば、通常の実験に基づいて決定することができる。たとえば、感染症を予防、処置および／または軽減する有効量は、本発明のＶＬＰに接触すると免疫系の活性化を引き起こし、その結果抗原特異的な免疫応答を生じさせるのに必要な量であってもよい。また、この用語は、「十分な量」と同義である。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「多価」という用語は、ＶＬＰが複数の種類または株の感染性因子に対して複数の抗原タンパク質を有することをいう。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「免疫刺激因子」という用語は、身体自体の化学的メッセンジャー（サイトカイン）により免疫応答を増強する化合物をいう。これらの分子は、免疫賦活活性、免疫増強活性およびプロ炎症性活性を持つ様々なサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン、たとえばインターフェロン、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；増殖因子（たとえば、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；ならびに他の免疫賦活分子、たとえばマクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２等を含む。免疫刺激因子分子は、本発明のＶＬＰと同じ製剤で投与してもよいし、あるいは別々に投与してもよい。免疫賦活作用を引き起こすには、タンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターのどちらを投与してもよい。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「防御免疫応答」または「防御応答」という用語は、脊椎動物（たとえば、ヒト）に見られ、感染症の予防もしくは軽減、またはその少なくとも１つの症状の緩和を行う、感染性因子に対する抗体が介在する免疫応答をいう。本発明のＶＬＰは、たとえば、感染性因子を中和する、感染性因子の細胞への進入を阻止する、前記感染性因子の複製を阻止する、および／または宿主細胞を感染および破壊から保護する抗体の産生を刺激するができる。また、この用語は、脊椎動物（たとえば、ヒト）に見られ、インフルエンザ感染の予防もしくは軽減、またはその少なくとも１つの症状の緩和を行う、感染性因子に対するＴリンパ球および／または他の白血球が介在する免疫応答をいうこともある。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「抗原製剤」または「抗原組成物」という用語は、脊椎動物、たとえば哺乳動物に投与すると、免疫応答を誘導する調製物をいう。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「ワクチン」という用語は、脊椎動物に投与することができる形態であり、かつ免疫を誘導する、感染症を予防および／または軽減する、および／または感染症の少なくとも１つの症状を緩和する、および／または別の用量のＶＬＰの有効性を高めるのに十分な防御免疫応答を誘導する本発明のＶＬＰを含む製剤をいう。典型的には、ワクチンは、本発明の組成物を懸濁または溶解させる通常の食塩水または緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、本発明の組成物を、感染症の予防、軽減、またはその他点での処置に使用すると都合がよいことがある。ワクチンは、宿主に導入すると、以下に限定されるものではないが、抗体および／もしくはサイトカインの産生、ならびに／または、細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、ならびに／または他の細胞応答などの免疫応答を誘導することができる。
【００５０】
全体の概要
本明細書に記載するのは、インフルエンザ感染からのヒトの保護、および／またはヒトの処置に使用することができるインフルエンザＶＬＰである。特に、本明細書に記載するのは、ウイルスのイムノドミナント領域および／または超可変領域（たとえば、抗原部分）の一部を形成または構成するアミノ酸残基およびペプチド配列の欠失により様々な異なるインフルエンザ（ｆｌｕ）ウイルスに対して強い免疫学的防御応答を誘導するＶＬＰインフルエンザワクチンである。これにより、本来免疫学的に隠れたエピトープがドミナントになり、高い免疫抗原性を示すようになる。
【００５１】
構造修飾ＨＡ分子を作製するには、この糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、切断、挿入、突然変異またはこれらの組み合わせにより改変ＨＡ分子の合成のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を設定して再編成する。上述のように、前述のＶＬＰを含む本明細書に記載のＶＬＰは、ウイルス感染、または別のワクチン組成物または製剤による免疫化により刺激される応答と比較して異なる免疫応答を誘導する。このＶＰＬワクチンにより誘導される広い中和反応は、複数のインフルエンザウイルス株またはサブタイプの異なるサブタイプから保護する。
【００５２】
ウイルス様粒子
インフルエンザタンパク質をコードする配列が真核細胞に発現すると、そのタンパク質は、非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己集合することが明らかにされている。Ｌａｔｈａｍ ＆ Ｇａｌａｒｚａ（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１３）：６１５４−６１６５；Ｇａｌａｒｚａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｖｉｒａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１）：２４４−５１；ならびに米国特許出願公開第２００８／０２３３１５０号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３１８９５号明細書および米国特許出願公開第２００９／００２２７６２号明細書を参照されたい。
【００５３】
本開示は、真核細胞の形質膜のインフルエンザＶＬＰであって、修飾インフルエンザ抗原タンパク質をその表面に持つＶＬＰに関する。このＶＬＰは、単独で、または１つもしくは複数の別のＶＬＰおよび／またはアジュバントと組み合わせて、インフルエンザ感染を防止する免疫応答を刺激する。
【００５４】
本明細書に記載のＶＬＰ（サブウイルス構造ワクチン（ＳＶＳＶ）ともいう）は典型的には、基質タンパク質Ｍ（Ｍ１とも呼ばれる）および任意選択的に、Ｍ２タンパク質をコードする遺伝子の天然および／または変異核酸配列から作られるウイルスタンパク質からなる。基質タンパク質Ｍは、起こり得るすべての多価サブウイルス構造ワクチンの組み合わせを形成する一般的な要素である。Ｍ１およびＭ２タンパク質は、どのようなウイルスに由来するものでもよい。ある種の実施形態では、ＶＬＰのＭ１および／またはＭ２タンパク質は、インフルエンザ基質タンパク質に由来する。他の実施形態では、ＶＬＰのＭ１および／またはＭ２タンパク質は、ＲＳＶまたはトゴ（ｔｈｏｇｏｔｏ）ウイルスに由来する。Ｍ１および／またはＭ２タンパク質は、たとえば本明細書、または米国特許出願公開第２００８／００３１８９５号明細書および米国特許出願公開第２００９／００２２７６２号明細書に開示されているように修飾（変異）されていてもよい。
【００５５】
ワクチンの表面に取り込まれるエンベロープウイルスについては、同一ファミリーに由来するインフルエンザタンパク質を選択しても、または異なるファミリーに由来するインフルエンザタンパク質を選択してもよい。同一ワクチン粒子へのインフルエンザタンパク質の取り込みは、これらのタンパク質をコードする核酸を変化させることにより細胞質尾部および膜貫通アミノ酸配列を共通の糖タンパク質のものに置換することで促進することができる。このアプローチは、可能である多くの多価サブウイルスワクチンの組み合わせの設計を可能にする。
【００５６】
１．修飾インフルエンザ抗原ポリペプチド
上述のように、本明細書に記載のＶＬＰは、修飾（たとえば、切断、欠失、ハイブリッド等）インフルエンザ抗原ポリペプチドを含む。
【００５７】
ある種の実施形態では、修飾インフルエンザ抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドである。ヘマグルチニン（ＨＡ）分子の主な機能は、ウイルス感染の開始の重要なステップである受容体結合と膜融合活性とである。さらに、ＨＡは、中和抗体が産生されるウイルスの主要表面抗原でもある。前駆体分子（ＨＡ０）は、２つのポリペプチド（ＨＡ１）および（ＨＡ２）に開裂し、単一のジスルフィド結合により共有結合する。ＨＡ０の開裂は、ウイルス感染性に必須の本質的なプロセスであり、ＨＡ２サブユニットのＮＨ２末端の融合ペプチドが活性化し、ＨＡの融合能を活性化する。
【００５８】
ＨＡ構造の最も重要な免疫ドミナント抗原部位は分子の頭にあり、主にＨＡ１サブユニットにより形成される。突然変異によるこれらの抗原領域の変化（抗原ドリフト）またはＨＡの入れ替わり（抗原シフト）により、ウイルスは、宿主の中和抗体から逃れ、新しい細胞の感染を開始する。構造のステム部分には、これらの部位だけでなく、高度に保存されたサブドミナントエピトープも存在する。しかしながら、免疫の階層のため、これらの部位は免疫系により大部分が認識されず、顕著な抗体反応を起こすことができない。それでも、これらの領域を標的とする抗体は、膜融合を阻害し、したがってウイルスの侵入を阻害することにより感染を阻止することができる。
【００５９】
このため、本発明に記載するワクチンは、主要なイムノドミナントエピトープを欠損し、分子のステム部分に存在するサブドミナント抗原部位を主に提示する、切断して再設計した改変ＨＡ分子をＶＬＰに発現させることに基づく。これらの構造修飾ＨＡは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の表面に取り込まれて単一の非感染性保護粒子（ＳＮＩＰＰ）インフルエンザワクチンを形成する。
【００６０】
ある態様では、修飾（改変）ＨＡポリペプチドは、たとえば、ＨＡ１およびＨＡ２サブユニットの代替構造に結合した移行シグナル配列を含む短いＮＨ２末端領域を維持したまま、イムノドミナントエピトープの一部または全部を除去することにより、ＨＡ１ドメインの一部を欠損している。欠失（切断）は、任意の長さ、たとえば１０〜３００塩基対（またはこの間の任意の値、たとえば、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、５０塩基対、７５塩基対、１００塩基対、１２５塩基対、１５０塩基対、１７５塩基対、２００塩基対、２２５塩基対、２５０塩基対、２７５塩基対、３００塩基対またはそれ以上の塩基対）であってもよい。さらに、欠失は連続した塩基対であってもよいし、あるいは、ＨＡポリペプチドの様々な領域の塩基対を除去してもよく、たとえばＮ末端の１０以上の塩基対と、分子の中央領域（たとえば、移行シグナル配列のＣ末端側の１０以上の塩基対の領域）の別の塩基対（１０〜３００またはさらにそれ以上）とを除去する。他の修飾として、以下に限定されるものではないが、リンカーの付加、ポリペプチドの１つまたは複数の残基の突然変異、および同種のものがある。ＨＡ分子の特定の修飾はＤＮＡレベルで容易に行うことができ、その後ＶＬＰのアセンブリーに必要な遺伝子と共にサブクローニングする。
【００６１】
よって、ＶＬＰ中に得られるインフルエンザ抗原タンパク質（たとえば、ＨＡ）は、任意のやり方、たとえば１つまたは複数のアミノ酸の欠失および／または１つのアミノ酸の突然変異により修飾することができる。
【００６２】
一実施形態では、ＨＡポリペプチドのＮ末端に近いアミノ酸を除去することによりインフルエンザＨＡポリペプチドを修飾する。たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、残基Ｈ２４〜Ｇ２４０を除去してもよい。任意選択的に、アミノ酸Ｄ１７〜Ｙ２３および分泌シグナル配列を保持したまま、ＨＡ１のＮＨ２末端の他の部分を除去する。保持した短い配列は、Ｃ４８３との鎖間のジスルフィド結合の形成を促進し、分子を安定化する残基Ｃ２０を維持している。ＨＡ１の残りの領域（Ｒ２４１−Ｌ３３３）は、Ｃ３１８とジスルフィド結合を形成し、折れ曲がりを保持する残基Ｃ２９４が組み込まれた一連のβシートを形成する。任意選択的に、Ｃ２９０位の残基をＧに変異させて、Ｃ２９４またはＣ３１８のどちらかとのジスルフィド結合形成の可能性を阻止する。
【００６３】
他の実施形態では、修飾（改変）ＨＡは、ジスルフィド結合を促進する残基（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｃ２０およびＣ４８３）を含むＨＡ１のＮＨ２末端（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｄ１７〜Ｐ６５）を含む。こうした修飾ＨＡポリペプチドについては、ＨＡ１の別の領域、たとえば、酵素切断部位、およびＣ５８とのジスルフィド結合の形成を促進する未変化のＣ２９０を含む、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、残基２４１〜３４６に結合していてもよい。
【００６４】
なお他の実施形態では、ＨＡ１のＮＨ２末端部分（野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｄ１７〜Ｐ６５）を含む修飾ＨＡを提供する。任意選択的に、シグナルペプチドの開裂後、このフラグメントを、たとえばペプチドリンカーによりＨＡ１の別の部分（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｍ２８１〜Ｒ３４６）に結合してもよい。どのような長さのどのようなペプチドリンカーを使用してもよい。ある種の実施形態では、ペプチドリンカーは、５〜２５アミノ酸（その間の任意の数字を含む）、たとえば１２アミノ酸のリンカー（ＤＩＧＰＧＫＶＧＹＧＰＧ、配列番号１１）である。このコンストラクトでは、ジスルフィド結合の形成を促進する残基が維持される（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｃ２０−Ｃ４８３、Ｃ２９４−Ｃ３１８およびＣ５８−Ｃ２９０の対合残基）。
【００６５】
本明細書に記載の修飾ＨＡ１ポリペプチド（フラグメント）のいずれかは、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含むＨＡ２フラグメント（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、残基Ｇ３４７〜Ｉ５６８を含むＨＡ２フラグメント））に作動可能に連結してもよい。実施例１および図を参照されたい。さらに、ＨＡ２ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸に突然変異、たとえば、タンパク質凝集を阻害または予防する残基の突然変異（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｖ４１２からＤ４１２およびＬ４１９からＧ４１９）を導入してもよい。たとえば、図３を参照されたい。
【００６６】
なおさらなる実施形態では、修飾ＨＡは、分泌シグナルペプチドに結合したＨＡ２の全フラグメントからなる。このコンストラクトは、分泌シグナル配列、ＨＡ２細胞外（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、３４７〜５２０）膜貫通および細胞質（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、５２１〜５６８）ドメインを含む。他の改変ＨＡの場合と同様に、シグナルペプチドは転写／転位の際に除去され、ＶＬＰワクチンに取り込まれるＨＡ２構造には存在しない。ＨＡ２サブユニットのカルボキシル末端の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部は、Ｍ１タンパク質が由来するインフルエンザウイルスの類似の配列、またはＭ１アナログと最もよく相互作用する配列で置換してもよいことが明らかであろう。たとえば、図４を参照されたい。
【００６７】
別の実施形態では、タンパク質の配列内に２つ以上の１２ｍｅｒの連続塩基性タンパク質分解開裂部位を挿入することによりＨＡを修飾する。野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、好適な挿入部位の非限定的な例として、Ｐ６５とＬ６６との間および／またはＩ２８０とＭ２８１との間が挙げられる。さらに、ネイティブなタンパク質分解開裂部位（ＫＫＲ〜ＧＧＧ）の１つまたは複数の残基を変異させて、この位置での開列を防止してもよい。この分子をプロテアーゼ処理すると、ＨＡの球状頭部が除去され、ＨＡ２ステムおよび残りのＨＡ１部分により形成される保存されたエピトープが露出される。たとえば、図５Ａおよび図５Ｂを参照されたい。
【００６８】
２．ポリペプチドをコードする配列
本明細書に記載するように産生されるＶＬＰは、標準的な組換え技術を用いて調製すると都合がよい。ＶＬＰ形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入し、細胞にタンパク質を発現させると、ＶＬＰにアセンブルする。
【００６９】
ＶＬＰを形成し、および／または、ＶＬＰに取り込まれる分子（修飾抗原（たとえば、ＨＡ）ポリペプチドを含む構造および／または抗原ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリーニングするか、または遺伝子を含むことが分かっているベクターからその遺伝子を誘導することなどにより、組換え方法を用いて得ることができる。たとえば、天然または変異細胞産物をコードする配列を含むプラスミドについては、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．などの寄託機関または商業的供給源から取得することができる。目的のヌクレオチド配列を含むプラスミドは、適切な制限酵素で消化することができ、標準的な分子生物学技術を用いてそのヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメントを遺伝子導入ベクターに挿入すればよい。
【００７０】
あるいは、ｃＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのフェノール抽出およびＰＣＲなどの標準的な技術を用いて、配列を発現するかまたは配列を含む細胞から取得してもよい。たとえば、ＤＮＡの採取および単離に使用される技術について記載したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上掲を参照されたい。簡単に説明すると、目的の遺伝子を発現する細胞由来のｍＲＮＡを逆転写酵素で逆転写すればよい。次いで所望の配列の各側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて一本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅する（米国特許第４，６８３，２０２号明細書、同第４，６８３，１９５号明細書および同第４，８００，１５９号明細書を参照、さらにＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｅｒｌｉｃｈ（ｅｄ．），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）も参照）。
【００７１】
また、目的のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ合成機（たとえば、ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．から入手することができるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３９２ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いてクローニングではなく合成して作製してもよい。ヌクレオチド配列は、所望の発現産物に適切なコドンを用いて設計することができる。標準的な方法により調製された重複オリゴヌクレオチドから完全な配列を構築し、完全なコード配列に構築する。たとえば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照されたい。
【００７２】
本明細書に記載のＶＬＰは典型的には、Ｍ１、および少なくとも１つの修飾インフルエンザ（たとえば、ＨＡ抗原）、任意選択的にＭ２タンパク質をコードする配列を細胞に発現させることにより形成される。発現タンパク質は、ＶＬＰの表面に抗原性糖タンパク質が存在するＶＬＰに自己集合する。
【００７３】
ある種の実施形態では、マトリクスをコードする配列は、ＲＳＶ基質タンパク質である。他の実施形態では、マトリクスをコードする配列は、インフルエンザ基質タンパク質である。また、マトリクスをコードする配列は、１つまたは複数の突然変異（修飾）、たとえば米国特許出願公開第２００８／００３１８９５号明細書および米国特許出願公開第２００９／００２２７６２号明細書に記載されているような修飾基質タンパク質を含んでもよいことも明らかであろう。本明細書に記載のＶＬＰは、他のインフルエンザタンパク質（野生型、修飾型（ミュータント）および／または野生型もしくはミュータントのハイブリッド）をさらに含んでもよい。
【００７４】
本明細書に記載のＶＬＰに使用されるタンパク質のいずれかは、ハイブリッド（またはキメラ）タンパク質であってもよい。ポリペプチドの全部または一部が、他のウイルス由来の配列および／または他のインフルエンザ株由来の配列で置換されていてもよいことが明らかであろう。例示的な一実施形態では、ＶＬＰのタンパク質のいずれかは、膜貫通および／または細胞質尾部ドメイン、たとえばＨＡまたはＮＡなどインフルエンザタンパク質由来のドメインをコードする異種配列を含むという点でハイブリッドであってもよい。たとえば、米国特許出願公開第２００８／００３１８９５号明細書および米国特許出願公開第２００９／００２２７６２号明細書を参照されたい。
【００７５】
好ましくは、インフルエンザＶＬＰの形成に利用する配列は、天然インフルエンザポリヌクレオチド配列に対して約６０％〜８０％（または６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％および７９％などその間の任意の値）の配列同一性を示し、一層好ましくはその配列は、天然ポリヌクレオチド配列に対して約８０％〜１００％（または８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％などその間の任意の値）の配列同一性を示す。
【００７６】
本明細書に記載の配列のいずれかは、他の配列をさらに含んでもよい。たとえば、ワクチンの効力をさらに高めるため、ハイブリッド分子を発現させ、サブウイルス構造に取り込ませる。これらのハイブリッド分子は、ＤＮＡレベルで基質タンパク質遺伝子をコードする配列をアジュバントまたは免疫調節部分をコードする配列と結合することにより作製する。サブウイルス構造の形成の際に、これらのハイブリッドタンパク質は、Ｍ１または任意のＭ２がアジュバント分子を有するかどうかに応じて粒子内または粒子上に取り込まれる。１つまたは複数のポリペプチド免疫調節ポリペプチド（たとえば、下記に詳述するアジュバント）がＶＬＰの本明細書に記載の配列に取り込まれると、効力が高まり、したがって防御免疫応答の刺激に必要な抗原の量を減少させる可能性がある。あるいは、下記のように、本明細書に記載の配列からＶＬＰを産生した後、ＶＬＰ含有組成物に１つまたは複数の他の分子（ポリペプチドまたは小分子）を含めてもよい。
【００７７】
これらのサブウイルス構造体は、感染性ウイルス核酸を含まず、感染性ではないため、化学的な不活性化の必要がない。化学的処理を行わなければ、ネイティブなエピトープおよびタンパク質のコンフォメーションが維持され、ワクチンの免疫原性特性が高まる。
【００７８】
本明細書に記載の配列は、任意の組み合わせで相互に作動可能に連結してもよい。たとえば、１つまたは複数の配列を同じプロモーターおよび／または異なるプロモーターから発現させてもよい。下記のように、各配列を１つまたは複数のベクターに組み込んでもよい。
【００７９】
２．発現ベクター
ＶＬＰに取り込まれるように、所望のポリペプチドをコードする配列を含むコンストラクトを合成したら、コンストラクトを任意の好適な発現用ベクターまたはレプリコンにクローニングしてもよい。多くのクローニングベクターが当業者に公知であり、当業者であれば、発現に関する本明細書の教示内容および当該技術分野において公知の情報に照らして任意の特定の宿主細胞型に適切なベクターおよび制御エレメントを容易に選択することができる。一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，上掲またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，上掲を参照されたい。
【００８０】
本明細書に記載するようにＶＬＰにアセンブルする配列の発現に使用できるベクターの非限定的な例として、ウイルス系ベクター（たとえば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス）、バキュロウイルスベクター（実施例を参照されたい）、プラスミドベクター、非ウイルスベクター、哺乳動物ベクター、哺乳動物の人工染色体（たとえば、リポソーム、粒子状キャリア等）およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００８１】
発現ベクターは典型的には、コード配列、および好適な宿主でのコード領域の発現を可能にする発現制御エレメントを含む。制御エレメントは一般には、プロモーター、翻訳開始コドンのほか、翻訳および転写終結配列、ならびにインサートをベクターに導入するための挿入部位を含む。翻訳制御エレメントについては、Ｍ．Ｋｏｚａｋが概説している（たとえば、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ７（８）：５６３−５７４，１９９６；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７６（９）：８１５−８２１，１９９４；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０８（２）：２２９−２４１，１９８９；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，ａｎｄ Ｓｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ６０：３６０−３７５，１９７９）。
【００８２】
たとえば、哺乳動物細胞の典型的な発現プロモーターには特に、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーターなどのＣＭＶプロモーター（ＣＭＶプロモーターはイントロンＡを含んでもよい）、ＲＳＶ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター（ＭＭＬＶ−ＬＴＲ）、ＦＩＶ−ＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターがある。また、哺乳動物の発現にはマウスのメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターなど他の非ウイルスプロモーターも使用される。典型的には、転写終結配列およびポリアデニル化配列も存在し、翻訳終止コドンの３’側に位置する。好ましくは、コード配列の５’側に位置する、翻訳の開始を最適化するための配列も存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．，上掲に記載されているようなＳＶ４０に由来するもののほか、ウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。また、本明細書に記載するようなコンストラクトに、スプライス供与部位およびスプライス受容部位を含むイントロンを設計してもよい（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）。
【００８３】
また、本明細書では、哺乳動物のコンストラクトの発現レベルを高めるためエンハンサーエレメントを使用してもよい。例として、Ｄｉｊｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されているようなＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されているようなラウス肉腫ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター、およびＢｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されているようなヒトＣＭＶ由来のエレメント、たとえばＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）が挙げられる。
【００８４】
１つまたは複数のベクターが、ＶＬＰに取り込まれるタンパク質をコードする１つまたは複数の配列を含んでもよいことが明らかであろう。たとえば、１つのベクターが、ＶＬＰに見出されるタンパク質をすべてコードする配列を有していてもよい。あるいは、複数のベクターを使用してもよい（たとえば、各々が１つのポリペプチドをコードする配列をコードする複数のコンストラクト、または各々が１つまたは複数のポリペプチドをコードする配列をコードする複数のコンストラクト）。１つのベクターが複数のポリペプチドをコードする配列を含む実施形態では、それらの配列は、同じベクター内で同一の転写制御エレメント（たとえば、プロモーター）に作動可能に連結しても、または異なる転写制御エレメント（たとえば、プロモーター）に作動可能に連結してもよい。さらに、ベクターは、別の遺伝子発現制御配列、たとえば導入遺伝子のサイレンシングを防止し、染色体の組み込み部位と関係なく一定かつ安定した高レベルの遺伝子発現をもたらすクロマチンオープニングエレメントを含んでもよい。これは、ハウスキーピング遺伝子に近接して位置し、ベクター内で染色体の導入遺伝子の位置に関係なく、組み込まれた導入遺伝子周囲に転写活性なオープンクロマチン環境を作り、転写およびタンパク質発現を最大化するＤＮＡ配列モチーフである。
【００８５】
さらに、非インフルエンザタンパク質をコードする１つまたは複数の配列、たとえば、以下に限定されるものではないが、免疫調節分子（たとえば、以下に記載するアジュバント）、たとえば、免疫調節オリゴヌクレオチド（たとえば、ＣｐＧｓ）、サイトカイン、無毒化細菌毒素および同種のものを含むおよび／またはコードする配列を発現させ、ＶＬＰに取り込ませもよい。
【００８６】
３．ＶＬＰの産生
上述のように、真核宿主細胞に発現したインフルエンザタンパク質は、非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己集合することが明らかになっている。これを踏まえ、次に本明細書に記載の配列および／またはベクターを使用して適切な宿主細胞を形質転換する。本明細書に記載のＶＬＰを形成するタンパク質をコードするコンストラクトは、様々な異なる細胞型、以下に限定されるものではないが、昆虫細胞、真菌（酵母）細胞および哺乳動物細胞を用いてインフルエンザＶＬＰを産生するための効率的な手段となる。
【００８７】
好ましくは、サブウイルス構造ワクチンは、トランスフェクション、連続細胞株の樹立（標準的なプロトコルを用いる）および／または当業者に公知の目的のインフルエンザ遺伝子を有するＤＮＡコンストラクトの感染を行ってから、真核細胞に産生する。サブウイルス構造の形成に必要なタンパク質の発現レベルは、選択した遺伝子の転写を誘導する真核プロモーターまたはウイルスプロモーターの配列最適化により最大化する。サブウイルス構造ワクチンは培養基に放出され、そこから精製され、その後ワクチンとして製剤化される。サブウイルス構造体は感染性でなく、したがってＶＬＰの不活性化は、一部の死菌ウイルスワクチンと同様に必要ない
【００８８】
本明細書に記載するような配列から発現したインフルエンザポリペプチドは、抗原性糖タンパク質を表面に提示するＶＬＰに自己集合する能力があるため、こうしたＶＬＰは所望の配列を共導入することにより多くの宿主細胞で産生することができる。（たとえば、１つまたは複数の発現ベクター内の）配列は、様々に組み合わせて宿主細胞に安定におよび／または一過性に組み込んでもよい。
【００８９】
好適な宿主細胞には、細菌細胞、哺乳動物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）細胞があるが、これに限定されるものではない。
【００９０】
たとえば、多くの哺乳動物細胞株が当該技術分野において公知であり、初代細胞のほか、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手可能な不死化細胞株、たとえば、以下に限定されるものではないが、ＭＤＣＫ、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（たとえば、ＳＢ２０細胞）、およびＣＥＭＸ１７４（こうした細胞株は、たとえばＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可能）が挙げられる。
【００９１】
同様に、本発現コンストラクトには、細菌宿主、たとえばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびストレプトコッカス・エスピーピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）も使用される。
【００９２】
本開示に有用な酵母宿主として特に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クリベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・ギレリモンディ（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられる。真菌宿主には、たとえば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）がある。
【００９３】
バキュロウイルスベクターと使用される昆虫細胞として特に、アエデス・アエギプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）およびトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）が挙げられる。Ｌａｔｈａｍ ＆ Ｇａｌａｒｚａ（２００１） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１３）：６１５４−６１６５；Ｇａｌａｒｚａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｖｉｒａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１）：２４４−５１；ならびに米国特許出願公開第２００５／５０１８６６２１号明細書および米国特許出願公開第２００６／０２６３８０４号明細書を参照されたい。
【００９４】
上述の配列の１つまたは複数を発現する細胞株は、本明細書に記載された開示を踏まえ、ＶＬＰのタンパク質をコードする１つまたは複数の発現ベクターコンストラクトを安定に組み込むことにより容易に作製することができる。安定に組み込まれたインフルエンザ配列の発現を調節するプロモーターは構成的でも、または誘導的でもよい。こうして、基質タンパク質の１つまたは複数の両方を安定に組み込み、本明細書に記載の配列（たとえば、ハイブリッドタンパク質）を宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させると、抗原性糖タンパク質を提示する複製しないウイルス粒子が形成される。
【００９５】
ある種の実施形態では、抗原性の異なる２つ以上のインフルエンザタンパク質を安定に発現する哺乳動物細胞株を作製する。こうした細胞株に、Ｍ１、Ｍ２および／または別の糖タンパク質（たとえば、同一もしくは異なるウイルス株由来）をコードする配列を導入して本明細書に記載するようなＶＬＰを産生する。あるいは、Ｍ１タンパク質（および、任意選択的にＭ２）を安定に産生する細胞株を作製し、選択した株由来のインフルエンザ抗原タンパク質をコードする配列を細胞株に導入し、所望の抗原性糖タンパク質を提示するＶＬＰを産生してもよい。
【００９６】
ＶＬＰ産生細胞株が由来する親細胞株は、たとえば、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、酵母細胞株、細菌細胞株など上述のどのような細胞から選択してもよい。好ましい実施形態では、細胞株は哺乳動物細胞株（たとえば、２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＭＲＣ−５、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０および骨髄腫細胞）である。哺乳動物細胞を用いてインフルエンザＶＬＰを産生すると、（ｉ）ＶＬＰが形成され、（ｉｉ）適切な翻訳後修飾（グリコシル化、パルミチル化）および出芽が起こり、（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞汚染物質が存在せず、（ｉｖ）精製しやすくなる。
【００９７】
また、細胞株を作製するだけでなく、インフルエンザをコードする配列を宿主細胞に一過性に発現させてもよい。好適な組換え発現宿主細胞系には、当該技術分野において周知の細菌発現系、哺乳動物発現系、バキュロウイルス／昆虫発現系、ワクシニア発現系、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）発現系、アルファウイルス属（たとえば、シンドビス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ））発現系、哺乳動物発現系、酵母発現系およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）発現系があるが、これに限定されるものではない。特に好ましい発現系は、哺乳動物細胞株、ワクシニア系、シンドビス系、昆虫系および酵母系である。
【００９８】
多くの好適な発現系が市販されており、たとえば、バキュロウイルス発現（Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）；Ｂｅａｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：３７８（１９９１）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．））、ワクシニア発現系（Ｅａｒｌ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ」Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．），Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１３５，８５５号明細書、１９９２年８月４日発行）、細菌を用いた発現（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ ＰＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、酵母を用いた発現（本明細書に援用するＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．ａｎｄ Ｔｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国再発行特許第３５，７４９号明細書、１９９８年３月１７日発行；本明細書に援用するＳｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，米国特許第５，６２９，２０３号明細書、１９９７年５月１３日発行；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，６２（１−２）：７９−９３（１９９２）；Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ ８（６）：４２３−４８８（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（１９９０）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４（１９９１））、哺乳動物細胞を用いた発現（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒｏｕｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．；たとえば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６（１９８３）；１９８３，Ｌａｕ，Ｙ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５（１９８４）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，ｐｐ５３７−５６６．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．（１９９１））、ならびに植物細胞を用いた発現（植物クローニングベクター，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ−Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．，およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．；Ｈｏｏｄ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６）；Ｎａｇｅｌ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６７：３２５（１９９０）；Ａｎ，ｅｔ ａｌ．，「Ｂｉｎａｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、およびＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ３：ｌ−１９（１９８８）；Ｍｉｋｉ，Ｂ．Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．２４９−２６５における他のもの、およびＰｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｈｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｉｅｎ，Ａｕｓｔｒｉａ，（１９８７）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐ．Ｇ．Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，１９９７；Ｍｉｇｌａｎｉ，Ｇｕｒｂａｃｈａｎ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｈｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ，１９９７）における他のものが挙げられる。
【００９９】
サブウイルス構造ワクチンの形成に必要なタンパク質をコードする変異遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、その後必要なレベルで発現させると、サブウイルス構造ワクチンがアセンブルし、次いで細胞表面から培養基に放出される（図７）。
【０１００】
選択した発現系および宿主に応じて、粒子形成ポリペプチドが発現してＶＬＰが形成され得る条件下で、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることによりＶＬＰを産生する。どの増殖条件を選択するのがよいかは当該技術分野の技術の範囲内である。ＶＬＰを形成し、細胞内に維持する場合、細胞を溶解してもＶＬＰを実質的にインタクトな状態に維持する化学的、物理的または機械的手段を用いて細胞を破壊する。こうした方法は当業者に公知であり、たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ａｎｇａｌ，Ｅｄｓ．，１９９０）に記載されている。あるいは、ＶＬＰを分泌させ、周囲の培養基から回収してもよい。
【０１０１】
次いで密度勾配遠心分離、たとえば、スクロースグラジエント、ＰＥＧ沈殿、ペレット化および同種のもの（たとえば、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６９２９−６９３６を参照されたい）のほか、標準的な精製技術、たとえば、イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーなどにより、粒子をその完全性を失わないようにする方法を用いて単離する（または実質的に精製する）。
【０１０２】
組成物
本明細書に記載するように産生されるＶＬＰを使用して被検体に投与すると、免疫応答を惹起することができる。上記で論じたように、ＶＬＰは、様々な抗原（たとえば、１つまたは複数の株または分離株由来の１つまたは複数の修飾インフルエンザ抗原）を含んでもよい。精製されたＶＬＰは、通常ワクチン組成物の形態で脊椎動物被検体に投与してもよい。また、混合ワクチンを使用してもよく、こうしたワクチンは、たとえば、インフルエンザもしくは他の生物に由来する他のサブユニットタンパク質および／またはこうした抗原をコードする遺伝子送達ワクチンを含む。
【０１０３】
ＶＬＰ免疫刺激（またはワクチン）組成物は、様々な賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調節剤および同種のものを含んでもよい。免疫刺激組成物は、免疫学的応答を惹起するのに十分な量のＶＬＰ／抗原を含む。適切な有効量は、当業者であれば決定することができる。こうした量は、通常の試験で決定できる比較的広い範囲となり、一般にＶＬＰ／抗原約０．１μｇ〜約１０ｍｇ（またはそれ以上）、一層好ましくは約１μｇ〜約３００μｇ程度の量である。
【０１０４】
サブウイルス構造ワクチンは細胞培養基から精製し、適切な緩衝液とａ）防腐剤または抗生物質；ｂ）タンパク質または有機化合物を含む安定剤；ｃ）ワクチンの効力を高め、免疫応答（液性および細胞性）を調節するアジュバントまたは免疫調節剤；またはｄ）免疫系の特定の細胞に対するワクチン抗原の提示を増強する分子などの添加剤と共に製剤化する。このワクチンは、調製物の適切な保管を図り、有効期間を最大化するため凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））形態で調製してもよい。これにより、免疫原性、効力および有効性を維持したまま長期間にわたりワクチンの貯蔵が可能になる。
【０１０５】
本明細書に記載の組成物には、キャリアが任意選択的に存在する。キャリア自体は典型的には、組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導しない分子である。好適なキャリアは典型的には、大きくてゆっくりと代謝される巨大分子、たとえばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）、および不活性ウイルス粒子である。粒子状キャリアの例として、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来するもののほか、ポリ（ラクチド）に由来する微小粒子およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に由来する微小粒子（ＰＬＧと呼ばれる）がある。たとえば、Ｊｅｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ Ｊ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｄ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照されたい。こうしたキャリアは、当業者によく知られている。
【０１０６】
加えて、これらのキャリアは、免疫刺激薬（「アジュバント」）の役割を果たしてもよい。例示的なアジュバントとして、（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、たとえば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等；（２）水中油型エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（下記を参照されたい）または細菌の細胞壁成分など他の特定の免疫刺激薬を含むあるいは含まない）、たとえば（ａ）５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５（必須ではないが、任意選択的に様々な量のＭＴＰ−ＰＥ（下記を参照されたい）を含む）を含み、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏ ｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）などのマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロンの粒子に製剤化されたＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号パンフレット）、（ｂ）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照されたい）を含み、サブミクロンのエマルジョンに高圧乳化するかまたはボルテックスしてより大きな粒度のエマルジョンにしたＳＡＦおよび（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリ脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群の１つまたは複数、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘｕ）の細菌の細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；（３）Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．）などのサポニンアジュバントを使用してもよいし、またはそれからＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）など粒子を生成してもよい；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン、たとえばインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２等）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、βケモカイン（ＭＩＰ、１−α、１−β Ｒａｎｔｅｓ等）；（６）細菌のＡＤＰリボシル化トキシンの無毒化ミュータント、たとえばコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３（６３番目の野生型アミノ酸がリジンで置換されている）ＬＴ−Ｒ７２（７２番目の野生型アミノ酸がアルギニンで置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（１０９番目の野生型アミノ酸がセリンで置換されている）およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（９番目の野生型アミノ酸がリジンで置換され、１２９番目の野生型アミノ酸がグリシンで置換されている）（たとえば、国際公開第９３／１３２０２号パンフレットおよび国際公開第９２／１９２６５号パンフレットを参照されたい）；ならびに（７）免疫刺激薬として働き組成物の有効性を高める他の物質があるが、これに限定されるものではない。
【０１０７】
ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アクテイル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルアトム（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルアトミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−フイドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）等があるが、これに限定されるものではない。
【０１０８】
本明細書での使用に好適な免疫調節分子の例として、上述および以下のアジュバントがある：ＩＬ−１およびＩＬ−２（Ｋａｒｕｐｉａｈ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４４：２９０−２９８、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１７１６−１７３３、Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４、および米国特許第４，７３８，９２７号明細書−）；ＩＬ−３およびＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ ５７：５０３−５１２、Ｇｏｌｕｍｂｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：７１３−７１６、および米国特許第５，０１７，６９１号明細書）；ＩＬ−５およびＩＬ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：４１１６−４１２１、および国際公開第９０／０６３７０号パンフレット）；ＩＬ−７（米国特許第４，９６５，１９５号明細書）；ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｓｕｍｍｅｒ １９９４）；ＩＬ−１４およびＩＬ−１５；αインターフェロン（Ｆｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｄｒｕｇｓ ４２：７４９−７６５、米国特許第４，８９２，７４３号明細書および同第４，９６６，８４３号明細書、国際公開第８５／０２８６２号パンフレット、Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８４：３１６−３２０、Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．７８：３８７−３９４、Ｔｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２０４６−２０５０およびＦａｋｔｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：８６７−８７２）；β−インターフェロン（Ｓｅｉｆ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６６４−６７１）；γ−インターフェロン（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９４５６−９４６０，Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：７８２０−７８２５，Ｍａｉｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０：３４−４２および米国特許第４，７６２，７９１号明細書および同第４，７２７，１３８号明細書）；Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４，９９９，２９１号明細書および同第４，８１０，６４３号明細書）；ＧＭ−ＣＳＦ（国際公開第８５／０４１８８号パンフレット）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４４：９４２−９５１）；ＣＤ３（Ｋｒｉｓｓａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６：２５８−２６６）；ＩＣＡＭ−１（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３８：５１２−５１４，Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３１：６２４−６２７）；ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３（Ｗａｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：９２３−９３２）；ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Β７．１−β２−ミクログロブリン（Ｐａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２２５３−２２５７）；カルネキシンなどのシャペロン；ならびにＭＨＣ結合トランスポータータンパク質またはそのアナログ（Ｐｏｗｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：５２８−５３１）。また、免疫調節因子は、これらの分子のアゴニストでも、アンタゴニストでも、またはリガンドでもよい。たとえば、受容体の可溶形態は、多くの場合、因子自体の変異形態と同様にこれらの種類の因子のアンタゴニストとして挙動することがある。
【０１０９】
上記の物質をコードする核酸分子のほか、本発明に使用するのに有利な他の核酸分子については、たとえば、アメリカンタイプカルチャーコレクションなどの寄託機関、またはＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）などの商業的供給源のような様々な供給源から容易に取得することができる。代表的な例として、ＢＢＧ１２（１２７アミノ酸の成熟タンパク質を含むＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む）、ＢＢＧ６（γインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３９６５６（ＴＮＦをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号２０６６３（α−インターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３１９０２、３１９０２および３９５１７（β−インターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６７０２４（インターロイキン−１ｂをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３９４０５、３９４５２、３９５１６、３９６２６および３９６７３（インターロイキン−２をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５９３９９、５９３９８および６７３２６（インターロイキン−３をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５７５９２（インターロイキン−４をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５９３９４および５９３９５（インターロイキン−５をコードする配列を含む）、ならびにＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６７１５３（インターロイキン−６をコードする配列を含む）が挙げられる。
【０１１０】
上記のポリペプチドの１つまたは複数をコードするプラスミドは適切な制限酵素で消化することができ、目的の特定の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは標準的な分子生物学技術を用いて遺伝子導入ベクター（たとえば、上記のような発現ベクター）に挿入することができる。（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上掲、またはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照されたい）。
【０１１１】
投与
ＶＬＰ、およびそうしたＶＬＰを含む組成物は、たとえば、非経口注射（たとえば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内または間質の組織腔）、または直腸投与、経口投与（たとえば錠剤、噴霧剤）、経膣投与、局所投与、経皮投与（たとえば国際公開第９９／２７９６１号パンフレットを参照）または経皮投与（たとえば国際公開第０２／０７４２４４号パンフレットおよび国際公開第０２／０６４１６２号パンフレット）、経鼻投与（たとえば国際公開第０３／０２８７６０号パンフレット）、点眼投与、点耳投与、経肺投与または他の粘膜投与など任意の送達方法で被検体に投与してもよい。同一または異なる経路で反復投与を行ってもよい。好ましい実施形態では、投与を経鼻で行う。
【０１１２】
ＶＬＰ（およびＶＬＰを含む組成物）は、他のワクチンの送達より前に投与しても、それと同時に投与しても、またはそれより後に投与してもよい。また、ＶＬＰの投与部位は、投与される他のワクチン組成物と同一でも、または異なってもよい。
【０１１３】
ＶＬＰ組成物による投薬処置は単回投与スケジュールでも、または反復投与スケジュールでもよい。反復投与スケジュールは、ワクチンの一次接種コースで１〜１０回投与を行い、次いでその後免疫応答を維持および／または増強するように選択した時間間隔でさらに投与する、たとえば二次投与の場合１〜４ヶ月で投与し、さらに必要な場合、それに続いて後数ヶ月後投与するスケジュールである。また、投薬処置は、少なくともある程度、その方式の効力、利用したワクチン送達、その被検体の必要性により決定され、開業医の判断により左右されることがある。
【０１１４】
本明細書で言及した特許、特許出願および刊行物はすべて、その全体を本明細書に援用する。
【０１１５】
理解しやすいように図面および例によりある程度詳細に開示を行ってきたが、本開示の精神または範囲を逸脱することなく様々な変更および修正を実施できることが当業者には明らかであろう。このため、前述の開示および下記の例は、限定的に解釈してはならない。したがって、開示された修飾について所定の野生型ＨＡ配列（たとえば、ＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３）を用いて番号付けを行ったが、対応する突然変異を他のＨＡ配列において容易に作製することができることが明らかであろう。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：切断して再設計した改変ＨＡ分子の作製
様々な修飾ＨＡ分子を以下の通り設計した。
【０１１７】
ＨＡ１フラグメントの一部（Ｈ２３〜Ｇ２４０の２１７ａａ）を除去することにより、改変ＨＡ分子を作製した。その際、分泌シグナル配列の除去後、ＮＨ２末端のアミノ酸Ｄ１７〜Ｙ２３を維持した。この短い配列は、Ｃ４８３との鎖間のジスルフィド結合の形成を促進し、分子を安定化する残基Ｃ２０を保持していた。ＨＡ１の残りの領域Ｒ２４１〜Ｌ３３３は、Ｃ３１８とジスルフィド結合を形成し、折れ曲がりを保持する残基Ｃ２９４が組み込まれた一連のβシートを形成する。さらに、Ｃ２９０位の残基をＧに変異させて、Ｃ２９４またはＣ３１８のどちらかとのジスルフィド結合形成の可能性を阻止した。このＨＡ１フラグメントは、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含む全ＨＡ２フラグメントと遺伝的に連鎖していた。
【０１１８】
得られたコンストラクトを「１ＴＡ改変ＨＡ」と名付け、図１に示す。このコンストラクトのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、以下の通りである。
改変ＨＡ １ＴＡのヌクレオチド配列（配列番号１）：
ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＧＴＴＡＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＧＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＡＡＣＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡ
改変ＨＡ−１ＴＡのアミノ酸配列（配列番号２）：
ＭＥＫＩＶＬＬＦＡＩＶＳＬＶＫＳＤＱＩＣＩＧＹＲＭＥＦＦＷＴＩＬＫＰＮＤＡＩＮＦＥＳＮＧＮＦＩＡＰＥＹＡＹＫＩＶＫＫＧＤＳＴＩＭＫＳＥＬＥＹＧＮＧＮＴＫＣＱＴＰＭＧＡＩＮＳＳＭＰＦＨＮＩＨＰＬＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＮＲＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＱＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＳＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫＭＮＴＱＦＥＡＶＧＲＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＭＥＤＧＦＬＤＶＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＤＫＶＲＬＱＬＲＤＮＡＫＥＬＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＱＹＳＥＥＡＲＬＫＲＥＥＩＳＧＶＫＬＥＳＩＧＩＹＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＶＡＧＬＳＬＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ。
【０１１９】
Ｃ４８３とのジスルフィド結合を促進するＣ２０と、高度に保存されたエピトープの形成に寄与する部分とを含むＨＡ１のＮＨ２末端（Ｄ１７〜Ｐ６５）を包含するように、もう１つの改変ＨＡを設計した。これは、酵素切断部位、およびＣ５８とのジスルフィド結合の形成を促進する未変化のＣ２９０を含む残りのＨＡ１部分２４１〜３４６位に結合していた。このＨＡ１フラグメントは、膜貫通および細胞質ドメインを含む全ＨＡ２フラグメント（Ｇ３４７〜Ｉ５６８）と遺伝的に連鎖していた。
【０１２０】
このコンストラクトを改変ＨＡ「２ＴＡ」と名付け、図２に示す。ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を下記に示す。
改変ＨＡ−２ＴＡのヌクレオチド配列（配列番号３）：
ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＧＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡ
改変ＨＡ−２ＴＡのアミノ酸配列（配列番号４）：
ＭＥＫＩＶＬＬＦＡＩＶＳＬＶＫＳＤＱＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＥＱＶＤＴＩＭＥＫＮＶＴＶＴＨＡＱＤＩＬＥＫＫＨＮＧＫＬＣＤＬＤＧＶＫＰＲＭＥＦＦＷＴＩＬＫＰＮＤＡＩＮＦＥＳＮＧＮＦＩＡＰＥＹＡＹＫＩＶＫＫＧＤＳＴＩＭＫＳＥＬＥＹＧＮＣＮＴＫＣＱＴＰＭＧＡＩＮＳＳＭＰＦＨＮＩＨＰＬＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＮＲＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＱＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＳＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫＭＮＴＱＦＥＡＶＧＲＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＭＥＤＧＦＬＤＶＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＤＫＶＲＬＱＬＲＤＮＡＫＥＬＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＱＹＳＥＥＡＲＬＫＲＥＥＩＳＧＶＫＬＥＳＩＧＩＹＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＶＡＧＬＳＬＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【０１２１】
もう１つの改変ＨＡを図３に示す。このコンストラクトは、シグナルペプチドの開裂後、設計された１２ａａのペプチドリンカー（ＤＩＧＰＧＫＶＧＹＧＰＧ、配列番号１１）を介してＨＡ１の別の部分（Ｍ２８１〜Ｒ３４６）に結合したＨＡ１のＮＨ２末端部分（Ｄ１７〜Ｐ６５）を含む。このコンストラクトでは、ジスルフィド結合の形成を促進するＣ２０−Ｃ４８３、Ｃ２９４−Ｃ３１８およびＣ５８−Ｃ２９０の対合残基が維持されている。全ＨＡ２領域（Ｇ３４７〜Ｉ５６８）は、ＨＡ１フラグメントと遺伝的に連鎖していた。また、ＨＡ２にはＶ４１２からＤ４１２へ、およびＬ４１９からＧ４１９への突然変異を導入してタンパク質凝集を防止した。
【０１２２】
このコンストラクトは「３ＴＡ改変ＨＡ」とし、模式図を図３に示す。３ＴＡ分子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を下記に示す。
改変ＨＡ−３ＴＡのヌクレオチド配列（配列番号５）：
ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＴＡＧＧＡＴＡＣＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＣＧＡＣＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡ
改変ＨＡ−３ＴＡのアミノ酸配列（配列番号６）：
ＭＥＫＩＶＬＬＦＡＩＶＳＬＶＫＳＤＱＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＥＱＶＤＴＩＭＥＫＮＶＴＶＴＨＡＱＤＩＬＥＫＫＨＮＧＫＬＣＤＬＤＧＶＫＰＤＩＧＰＧＫＶＧＹＧＰＧＭＫＳＥＬＥＹＧＮＣＮＴＫＣＱＴＰＭＧＡＩＮＳＳＭＰＦＨＮＩＨＰＬＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＮＲＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＱＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＳＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫＭＮＴＱＦＥＡＤＧＲＥＦＮＮＧＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＭＥＤＧＦＬＤＶＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＤＫＶＲＬＱＬＲＤＮＡＫＥＬＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＱＹＳＥＥＡＲＬＫＲＥＥＩＳＧＶＫＬＥＳＩＧＩＹＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＶＡＧＬＳＬＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【０１２３】
修飾インフルエンザＨＡのもう１つの例を図４に示す（「４ＴＡ」と名付けた）。このコンストラクトは、ＨＡ２フラグメント（細胞外領域（残基３４７〜５２０）、および分泌シグナルペプチドに結合した膜貫通および細胞質ドメイン（残基５２１〜５６８）ドメインを含む。シグナルペプチドは転写／転位の際に除去され、ＶＬＰワクチンに取り込まれるＨＡ２構造には存在しない（他の改変ＨＡの場合と同様）。さらに、ＨＡ２サブユニットのカルボキシル末端の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部は任意選択的に、Ｍ１タンパク質が由来するインフルエンザウイルスの類似の配列、またはＭ１アナログと最もよく相互作用する配列で置換されている。こうした分子のコンタクトは粒子のアセンブリーおよび放出を増強する。４ＴＡ分子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を下記に示す。
改変ＨＡ−４ＴＡのヌクレオチド配列（配列番号７）：
ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡ
改変ＨＡ−４ＴＡのアミノ酸配列（配列番号８）：
ＭＥＫＩＶＬＬＦＡＩＶＳＬＶＫＳＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＱＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＳＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫＭＮＴＱＦＥＡＶＧＲＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＭＥＤＧＦＬＤＶＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＤＫＶＲＬＱＬＲＤＮＡＫＥＬＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＱＹＳＥＥＡＲＬＫＲＥＥＩＳＧＶＫＬＥＳＩＧＩＹＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＶＡＧＬＳＬＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【０１２４】
もう１つの例では、タンパク質の配列内に１つまたは複数の開裂部位を挿入することによりインフルエンザＨＡポリペプチドを改変する。図５Ａ（「５ＴＡ」と名付けた）に示すように、例示的な挿入部位として、Ｐ６５とＬ６６との間および／またはＩ２８０とＭ２８１との間が挙げられる。図５はまた例示的な１２残基の開裂部位（たとえば、１２ｍｅｒの連続塩基性タンパク質分解開裂部位）を示す。また、ネイティブなタンパク質分解開裂部位（ＫＫＲ〜ＧＧＧ）の３残基の突然変異を含む別の変化を加えて、この位置での開裂を防止してもよい。この分子をプロテアーゼ処理すると（図５Ｂを参照されたい）、ＨＡの球状頭部が除去され、ＨＡ２ステムおよび残りのＨＡ１部分により形成される保存されたエピトープが露出される。５ＴＡ分子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を下記に示す。
改変ＨＡ−５ＴＡのヌクレオチド配列（配列番号９）：
ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＴＴＧＴＡＧＣＧＴＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡＴＧＴＧＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＧＧＡＡＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＣＡＧＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＣＴＧＴＴＡＣＣＣＡＧＧＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＧＣＡＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＡＡＡＧＴＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＧＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＴＧＴＣＣＡＴＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＴＡＣＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＴＡＡＴＡＣＣＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＧＧＴＡＣＴＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＣＣＴＡＴＡＴＴＴＣＣＧＴＴＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＴＡＧＣＴＡＣＴＡＧＡＴＣＣＡＡＡＧＴＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＧＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡ
改変ＨＡ−５ＴＡのアミノ酸配列（配列番号１０）：
ＭＥＫＩＶＬＬＦＡＩＶＳＬＶＫＳＤＱＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＥＱＶＤＴＩＭＥＫＮＶＴＶＴＨＡＱＤＩＬＥＫＫＨＮＧＫＬＣＤＬＤＧＶＫＰＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＬＩＬＲＤＣＳＶＡＧＷＬＬＧＮＰＭＣＤＥＦＩＮＶＰＥＷＳＹＩＶＥＫＡＮＰＶＮＤＬＣＹＰＧＤＦＮＤＹＥＥＬＫＨＬＬＳＲＩＮＨＦＥＫＩＱＩＩＰＫＳＳＷＳＳＨＥＡＳＬＧＶＳＳＡＣＰＹＱＧＫＳＳＦＦＲＮＶＶＷＬＩＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＰＮＤＡＡＥＱＴＫＬＹＱＮＰＴＴＹＩＳＶＧＴＳＴＬＮＱＲＬＶＰＲＩＡＴＲＳＫＶＮＧＱＳＧＲＭＥＦＦＷＴＩＬＫＰＮＤＡＩＮＦＥＳＮＧＮＦＩＡＰＥＹＡＹＫＩＶＫＫＧＤＳＴＩＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＭＫＳＥＬＥＹＧＮＣＮＴＫＣＱＴＰＭＧＡＩＮＳＳＭＰＦＨＮＩＨＰＬＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＮＲＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＱＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＳＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫＭＮＴＱＦＥＡＶＧＲＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＭＥＤＧＦＬＤＶＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＤＫＶＲＬＱＬＲＤＮＡＫＥＬＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＱＹＳＥＥＡＲＬＫＲＥＥＩＳＧＶＫＬＥＳＩＧＩＹＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＶＡＧＬＳＬＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【０１２５】
これらの改変構造は典型的には、ＨＡ１ドメインの大部分を欠損し、イムノドミナントエピトープの大半を除去してあるが、ＨＡ１およびＨＡ２サブユニットの代替構造に結合した移行シグナル配列を含む短いＮＨ２末端領域を維持している。ＨＡ分子の特定の修飾をＤＮＡレベルで行い、その後ＶＬＰのアセンブリーに必要な遺伝子の組み合わせと共にサブクローニングする。
【０１２６】
真核発現系において修飾ＨＡ遺伝子単独で、またはＭ１（または機能的に類似の基質タンパク質）、Ｍ２、ＮＡおよびＮＰと共に、すなわち組み合わせて修飾ＨＡ遺伝子を合成すると、その表面に様々な修飾ＨＡ分子を提示する小胞粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）が産生される。修飾ＨＡの構造により、様々なインフルエンザウイルスサブタイプおよび抗原変異体に対して強力で広い防御免疫応答をこの構造内で引き起こすことができる保存されたサブドミナントエピトープの抗原プロファイルが示される。
【０１２７】
したがって、このワクチンは、新たなミュータントに効果がある広範囲の保護作用を与え、その有効性を長期間持続させる。上記に詳述したように、適切なＶＬＰを産生して評価する様々な方法が当業者に公知である。たとえば、修飾ＨＡをコードするＤＮＡ配列などＶＬＰの形成に必要な遺伝子は、真核細胞を用いて発現させることができる。ＶＬＰの産生には、以下に限定されるものではないが、プラスミド、ベクター、ウイルス、または単一もしくは複数の遺伝子を細胞に導入して発現させる他の方法を用いるバキュロウイルス／昆虫細胞系、一過性にまたは安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞または原核細胞など他の組換え発現系を使用する。産生されたＶＬＰについて、イムノドミナント領域およびサブドミナント領域を認識する抗体との反応性を試験する。保存されたサブドミナントエピトープを認識する抗体と反応する修飾ＨＡを有するＶＬＰ構造体を使用して動物を免役し、野生型のインタクトなウイルスに対する血清の中和能、およびマウスおよびフェレットの攻撃ウイルスに対して広い防御免疫応答を惹起する能力を評価する。
【０１２８】
また上記のように、記載したＶＬＰワクチン（本明細書に記載するようなＡ型およびＢ型ウイルスの修飾ＨＡとアセンブルしたＶＬＰを用いて製剤化したもの）でヒトまたはインフルエンザに対して感受性がある他の種を免疫化すると、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスのサブタイプおよび抗原変異体ならびにそれらの抗原変異体から保護できる広い中和免疫応答が惹起される。
【０１２９】
実施例２：特有のＨＡ分子を提示するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生するための、複数の遺伝子を有する哺乳動物のＤＮＡプラスミドベクターまたは組換えバキュロウイルスの作製
この例では、ＶＬＰの産生に必要なコンストラクトの作製について記載する。作製されるコンストラクトの一般的な構造を図６に示す。遺伝子発現の高度で持続可能なレベルだけでなく、安定にトランスフェクトされた細胞の産生速度をも高める特有の調節配列を含む哺乳動物プラスミド（ベクター、図６、パネルＩ）に目的の遺伝子をサブクローニングする。ＶＬＰを産生する別の方法は、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系の利用である。作製されるコンストラクトの全体的な構造を図６のパネルＩＩに示す。
【０１３０】
遺伝子各々が哺乳動物プロモーター（ＣＭＶプロモーターまたはプロモーターＡ）の転写制御下となるように、適切な制限部位を使用してインフルエンザＭ１およびＭ２遺伝子を哺乳動物プラスミド発現ベクターに連続的にサブクローニングした。さらに、インフルエンザＭ１およびＭ２遺伝子をクローニングしたプラスミドは、抗生物質選択マーカー（たとえば、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシン）と、各遺伝子の上流に、哺乳動物染色体内にＤＮＡが組み込まれた後にオープンクロマチン状態を維持する特定の配列とを含んでいた。したがって、これらのコンストラクトは、一過性または安定なタンパク質発現実験を行うのに好適なものである。
【０１３１】
蛍光セルソーティングを用いた、安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の選択の例を図８Ａ〜図８Ｃに示す。さらに、安定にトランスフェクトされたＭＤＣＫおよびＣＨＯ細胞のＭ１／Ｍ２タンパク質の発現レベルをぞれぞれ図９Ａおよび図９Ｂに示す。
【０１３２】
遺伝子が各々哺乳動物プロモーター（ＣＭＶプロモーターまたはプロモーターＡ）の転写制御下となるように、適切な制限部位を用いて改変ＨＡおよびＮＡ遺伝子を別の哺乳動物プラスミド発現ベクターにサブクローニングした。
【０１３３】
各コンストラクトの完成後、制限酵素解析およびシーケンシングにより遺伝子の方向性および完全性を確認した。ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｔｂｌ２コンピテントＥ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞を形質転換し、ｍａｘｉ−ｐｒｅｐによるＤＮＡ調製（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を行って各コンストラクトのプラスミドＤＮＡをさらに増幅した。分光光度法によりプラスミドＤＮＡの濃度を判定した。一過性トランスフェクションは環状ＤＮＡを利用して行ったのに対し、安定な細胞株を産生するためのトランスフェクションは、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素で切断した直鎖ＤＮＡを用いて行った。
【０１３４】
昆虫細胞を用いてＶＬＰを産生するためバキュロウイルストランスファーベクターを作製した。図６のパネルＩＩに図示するように４つのインフルエンザ遺伝子を単一のプラスミドにサブクローニングし、バキュロウイルスプロモーターの転写制御下とした。前述のつのように、制限酵素解析およびシーケンシングにより遺伝子の方向性および完全性を確認した。ｍａｘｉ−ｐｒｅｐによるＤＮＡ調製を行ってプラスミドＤＮＡをさらに増幅した。直線化したバキュロウイルスＤＮＡとトランスファーベクター（４つのインフルエンザ遺伝子を有する）をＳｆ９昆虫細胞にコトランスフェクトすると、ＶＬＰワクチンを産生するための組換えバキュロウイルスが作製される。
【０１３５】
実施例３：エレクトロポレーションによる哺乳動物細胞へのＤＮＡプラスミドのトランスフェクション
実施例２に記載されているような所望のベクターの作製後、ベクターを利用して哺乳動物細胞（ＣＨＯ、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＷＩ−３８またはＭＲＣ５）でＶＬＰを産生した。
【０１３６】
安定にトランスフェクトされた細胞を作製するため、直線化したＤＮＡをエレクトロポレーションにより細胞に導入した。簡単に説明すると、ＤＮＡのエレクトロポレーションの２４時間前に、２４時間で８０〜８５％コンフルエントな単層が形成されるように、選択した細胞を約４百万個の細胞濃度でＴ−１７５フラスコに播種した。エレクトロポレーションの前に、細胞単層を８ｍｌの１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄してから、４ｍｌの１×トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で処理し、５分間３７℃でインキュベートした。フラスコに１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む６ｍｌのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を加えて細胞を再懸濁し、チューブに集め、その後５００×ｇで５分間遠心分離によりペレット状にした。細胞ペレットを５ｍｌの氷冷１×ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で２回洗浄し、次いで５００μｌの氷冷１×ＲＰＭＩに再懸濁した。
【０１３７】
細胞懸濁液に、Ｍ１／Ｍ２を発現する６ｇの直線化したプラスミド、またはＭ１／Ｍ２とＮＡ／改変ＨＡを発現するプラスミドを加え、ピペッティングにより穏やかに混合し、次いで０．４ｃｍギャップエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に移した。キュベットをＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓａｒに入れ、以下のパラメーター：４００Ｖ、９６０μＦを用いて細胞にエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションを行った細胞を室温で５分間維持し、次いで１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭを含む６ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。エレクトロポレーションから６時間後、培地を吸引し、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、新鮮培地を加えた。抗生物質選択が開始されるまで３７℃、５％ＣＯ２で細胞をインキュベートした。
【０１３８】
懸濁液細胞、たとえばＣＨＯ細胞株のエレクトロポレーションには、改変プロトコルを使用した。トリプシン処理を必要とすることなく、細胞を培養容器から直接集めた。その後、上記のようなステップを行った。
【０１３９】
実施例４：化学的方法による哺乳動物細胞へのＤＮＡプラスミドのトランスフェクション
トランスフェクションのため、５ｍｌのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地（ＣＨＯ細胞）、または５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充した１０ｍｌのＤＭＥＭ（Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ５、ＷＩ−３８）を用いて哺乳動物細胞（ＣＨＯ、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ５またはＷＩ−３８）を１．５×１０６〜２．５×１０６細胞／ｍｌの密度で適切な培養容器（ＣＨＯ細胞の場合、２５ｃｍ２フラスコ、またはＶｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ５またはＷＩ−３８細胞の場合７５ｃｍ２フラスコ）に蒔いて調製した。トランスフェクション手順の開始の２４時間前に接着細胞（Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ５、ＷＩ−３８）を蒔いた。
【０１４０】
このステップ後、プラスミドＤＮＡとリポフェクタミンとのＤＮＡ−脂質複合体形成反応を準備した。一方のチューブで目的のプラスミドＤＮＡまたはその混合物を５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈し、他方のチューブで２０μｌのリポフェクタミン２０００を４８０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で希釈した。リポフェクタミン−ＯｐｔｉＭＥＭ混合物を室温で５分間インキュベートした。
【０１４１】
このステップ後、プラスミドＤＮＡ−ＯｐｔｉＭＥＭ混合物をリポフェクタミン−ＯｐｔｉＭＥＭ混合物と組み合わせて、反応を室温で２０分間進行させた。次いでＤＮＡ−リポフェクタミン複合体を、上記のように既に蒔いてあった細胞に加えた。ＣＨＯ細胞の場合、ＤＮＡ−リポフェクタミン複合体の添加から５時間後、２５ｃｍ２フラスコの内容物の２．５ｍｌを別の２５ｃｍ２フラスコに移し、両方のフラスコに４．５ｍｌのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地を加えた。培養フラスコ内で接着細胞を維持し、５ｍｌの新鮮な培地を加えた。細胞への毒性があることを証明できた抗生物質をＤＮＡ−脂質複合体に取り込ませることにより細胞の内部に送達することができたため、トランスフェクションプロセスに使用した試薬または培地は、抗生物質をまったく含んでいなかった。
【０１４２】
目的のタンパク質を一過性に発現させてＶＬＰを産生するため、ＤＮＡがネイティブな環状形態であるＤＮＡ−脂質複合体の形態でプラスミドを細胞に導入した。トランスフェクト細胞のライセートおよび培養上清におけるＶＬＰタンパク質の発現をトランスフェクションから７２〜９６時間後に評価した。
【０１４３】
目的のプラスミドに細胞の染色体ＤＮＡを組み込み、連続的なタンパク質発現状態を確立する、安定にトランスフェクトされた細胞を作製するため、細胞に導入したプラスミドが直鎖構造であること以外はトランスフェクションの手順に従った。目的の遺伝子をクローニングしたプラスミドは、抗生物質耐性マーカー、たとえばハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシンをさらに含む。このため、トランスフェクションから４８〜９６時間後に、プラスミドにより送達される耐性遺伝子に基づき最適な抗生物質を培養基に加えて細胞を選択した。選択から８〜１０日後、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて表面タンパク質の発現および検出に基づき、抗生物質の存在下で増殖した細胞を単離した。
【０１４４】
実施例５：タンパク質の一過性発現のための環状ＤＮＡのトランスフェクション、および改変ＨＡを提示するＶＬＰのアセンブリー
エレクトロポレーションあるいは化学的トランスフェクションにより未切断環状プラスミドの組み合わせを哺乳動物細胞に導入してＶＬＰ産生の評価を行った。この例では、Ｍ１／Ｍ２ベクターをＮＡ／ＨＡ（改変、図１）と組み合わせて、上述の２つのトランスフェクション方法のどちらかにより哺乳動物細胞（ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ５またはＷＩ−３８）に送達した。
【０１４５】
細胞ライセート、培養上清および濃縮精製された上清のウエスタンブロット解析から、図１０に示すようにこれらのタンパク質が細胞に発現し、培養基に放出されることが明らかになった。さらに、ネガティブ染色電子顕微鏡観察およびクライオ電子顕微鏡法により、これらの細胞に産生および放出され濃縮および精製した材料を調べた。これらの研究から、インフルエンザウイルスなどのエンベロープウイルス粒子に似たウイルス様粒子の存在が明らかになった（図１１）。
【０１４６】
実施例６：安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞を作製するための、直線化したＤＮＡのトランスフェクション
直線化したプラスミドＤＮＡを哺乳動物細胞にトランスフェクトすると、プラスミドが宿主細胞のゲノムに組み込まれる。実施例１に記載したコンストラクトのいずれかの直鎖形態を送達すると、プラスミドが組み込まれ、その後ベクターＤＮＡが有する遺伝子が発現する。この戦略により、目的の遺伝子産物を構成的に発現する安定にトランスフェクトされた細胞株の産生が可能になる。
【０１４７】
このアプローチに従い、直線化したＭ１／Ｍ２ベクター（図６Ａ）をエレクトロポレーションまたは化学的トランスフェクションによりＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞またはＣＨＯ細胞に導入した。このステップ後、プラスミドが有する抗生物質耐性遺伝子に基づいて選択した１種の抗生物質（ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシン）で細胞を処理した。Ｍ１／Ｍ２ベクターはハイグロマイシン耐性遺伝子を含んでおり、したがってこのプラスミドをトランスフェクトした細胞をその抗生物質で処理して安定にトランスフェクトされた細胞株を選択した。抗生物質の存在下で増殖した細胞について、その表面でのＭ２タンパク質の発現を蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて試験し、クローニングした。
【０１４８】
図８は、細胞集団の一部がＭ２タンパク質を発現することを明らかにする、Ｍ１／Ｍ２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳヒストグラムを示す。複数の細胞クローンを増殖させ、Ｍ１およびＭ２タンパク質の両方の発現をウエスタンブロットによりさらに解析した。
【０１４９】
さらに、図９ＡおよびＢに示すように、選択したＭ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされたＭＤＣＫおよびＣＨＯ細胞株は、これらのタンパク質を構成的に発現する。これらの細胞株に、特有のＨＡ分子を提示するインフルエンザウイルス様粒子のアセンブリーおよび放出のためＮＡ／ＨＡ（改変）（図１〜５）を有するベクターをトランスフェクトしてもよい。
【０１５０】
実施例７：安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の選択
次いで目的の遺伝子をコードする直線化したプラスミドをトランスフェクトした哺乳動物細胞を抗生物質処理に付し、トランスフェクトされたプラスミドが宿主細胞ゲノムに組み込まれた細胞を選別した。トランスフェクトされたプラスミド は、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシンのいずれかに耐性を付与する抗生物質耐性カセットを含む。
【０１５１】
トランスフェクションから約４８〜７２時間後、細胞培養基に適切な濃度の抗生物質（４００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシン、１０ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンまたは１０ｕｇ／ｍｌのネオマイシン）を加えて細胞に選択圧をかけ、この培地でトランスフェクト細胞を数回にわたり継代した。このプロセスにより、トランスフェクトされたプラスミドから染色体に遺伝子が組み込まれた細胞のみが生存することができ、残りの集団から選別された。
【０１５２】
実施例８：Ｍ１／Ｍ２をトランスフェクトした細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）解析
上記のように得た細胞を組織培養フラスコから回収し、５００×ｇで５分間連続遠心分離により３回洗浄し、続いてリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。３回目の洗浄の後、細胞をカウントし、それぞれ５×１０６細胞の３つのアリコートに分けた。細胞表面のＭ２発現でソートすることになっていた第１のアリコートは、ＰＢＳで１：５００に希釈した抗Ｍ２モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と室温で１時間インキュベートした。第２のアリコートは、ＰＢＳで１：２００に希釈したインフルエンザＡヌクレオプロテインに対するモノクローナル抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｏ，ＭＥ）と室温で１時間インキュベートした。このアリコートは、フローサイトメトリー実験のアイソタイプコントロールとした。第３のアリコートは、本実験の未染色の対照とした。
【０１５３】
それぞれの抗体とのインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで１：１００に希釈したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と室温で１時間インキュベートした。これらの処理後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３ｍｌを最終容量とした細胞培養基に再懸濁した。次いでこれらのサンプルをＭｏＦｌｏセルソーターで解析した。
【０１５４】
特有の緑色蛍光スペクトルで判定して細胞表面に高レベルのＭ２タンパク質を発現した細胞を１細胞／ウェルとして、各ウェルに１００μｌの細胞培養基を含む９６ウェルプレートにソートした。図８は、Ｍ１／Ｍ２トランスフェクト細胞を用いて行ったソーティング実験を示す。
【０１５５】
この選択方法は、本明細書に記載のコンストラクトのいずれか（たとえば、図１〜５）をトランスフェクトした細胞の同定および単離に応用される。ＮＡ／ＨＡ改変１（図１）を有するＤＮＡベクターをトランスフェクトした細胞は、細胞表面に表示されるＮＡおよびＨＡタンパク質の両方を発現するため、これらのタンパク質を持続的に発現する安定にトランスフェクトされたクローンの同定および単離が可能になる。ＨＡによる選択には、改変ＨＡ分子の保存されたエピトープを認識する広い中和モノクローナル抗体を使用する。第１の安定にトランスフェクトされた細胞株の作製後、第２のトランスフェクションを行い、この基礎となる細胞株の宿主ゲノムに遺伝子のもう１つの組を導入し、組み込む。この戦略を図７Ｂに示す。さらに、２回目のトランスフェクションで作製された安定にトランスフェクトされた細胞株の同定および選択をＦＡＣＳ分析により行う。図６に示すベクターコンストラクト（パネルＩに示すコンストラクト）により送達されるＮＡを含むまたは含まない改変ＨＡの５つのコンストラクトは、表面分子であり、細胞膜に提示され、したがって改変ＨＡ分子を含むＶＬＰを持続的に産生する安定にトランスフェクトされた細胞株を同定および選択するＦＡＣＳ戦略に好適である。
【０１５６】
実施例９：安定にトランスフェクトされ、構成的に産生されるＭ１およびＭ２インフルエンザタンパク質のエンドポイントクローニングおよび増殖
安定にトランスフェクトされた細胞集団からクローン細胞株を取得するため、エンドポイントクローニングを実施した。細胞を回収し、血球計数器を用いてカウントした。次いで最終濃度が１０細胞／ｍｌになるように適切な量の培養基で細胞を希釈した。この細胞調製物を穏やかに撹拌して細胞が均一に分布するようにしてから、１００μｌ／ウェルで滅菌９６ウェルプレートに蒔いた。次いでプレートを５％ＣＯ２の湿潤雰囲気、３７℃でインキュベートし、クローンの細胞増殖について定期的にモニターした。活発に増殖している細胞を含むウェルを一定期間にわたり特定した。これらのウェルのクローン細胞が約７０〜８０％コンフルエントになったとき、６ウェルプレート、２５ｃｍおよび７５ｃｍフラスコに連続継代してスケールアップした。
【０１５７】
実施例１０：タンパク質発現の解析
トランスフェクトされた哺乳動物細胞の細胞ペレットおよび上清についてタンパク質発現の解析を行った。トランスフェクトされた（Ｔｒａｎｆｅｃｔｅｄ）細胞を回収し、１×ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液［トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５０ｍＭ、塩化ナトリウム１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、１％トリトンＸ−１００、１％ＮＰ−４０、０．１％硫酸ドデシルナトリウム］に再懸濁し、次いで凍結融解サイクルにより破壊し、ピペッティングし、最後にその後使用するまで−２０℃で保存した。各サンプルの総タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により推定した。簡単に説明すると、１０μｌのサンプルを、室温に予め温めておいた１．０ｍｌの１×Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に加えた。次いでこの反応混合物を激しく振盪して均一な溶液を得た。分光光度計を使用して５９５ｎｍの波長で各サンプルの吸光度を測定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて既知濃度のウシ血清アルブミンの５９５ｎｍの吸光度を測定してプロットした標準曲線を用いて各サンプルのタンパク質濃度を判定した。
【０１５８】
ウエスタンブロット解析のため、等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、１２５Ｖで１．５時間電気泳動により分離した。その後、タンパク質をニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットし、以下のステップ：ブロッキング、一次抗体とのインキュベーション、洗浄、西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体とのインキュベーション、再度洗浄、最後に化学発光基質との反応およびシグナル検出を含むウエスタンブロット手順に付した。
【０１５９】
実施例１１：インフルエンザＭ１およびＭ２タンパク質を持続的に発現する細胞株の選択
Ｍ１およびＭ２インフルエンザ遺伝子を有する直線化したＤＮＡベクターを、ＭＤＣＫ細胞およびＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。ハイグロマイシンによる選択後、細胞を抗体の組み合わせ（最初に一次抗体として、細胞表面に発現したＭ２タンパク質と反応した抗Ｍ２マウスモノクローナル、続いて二次抗体としてフルオレッセインコンジュゲート抗マウス抗体）で標識してから、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて単細胞クローンを単離した。
【０１６０】
ソートした単細胞を増殖し、ウエスタンブロットによりＭ１およびＭ２タンパク質の発現をさらに評価した。細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％）にロードし、電気泳動により分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、４％脱脂乳で１時間ブロッキングした。次いで膜をマウスモノクローナル抗Ｍ１タンパク質（１：４０，０００希釈）およびマウスモノクローナル抗Ｍ２タンパク質（１：１０００希釈）（Ａｂｃａｍ、クローン１４Ｃ２）と一晩インキュベートした。膜を１×ＴＢＳＴで５分間３回洗浄し、次いで西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（２％脱脂乳で１：５０，０００希釈）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と１時間インキュベートした。膜を１×ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、続いてＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と５分インキュベーションした。膜をＨｙＢＩｏｔ ＣＬオートラジオグラフィーフィルム（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍｅｔｕｃｈｅｎ，ＮＪ）に密着させた。
【０１６１】
図９Ａレーン３に示すように、ＭＤＣＫ細胞ライセートには、分子量（ＭＷ）約２７ｋＤＡのＭ１タンパク質、およびＭＷ約１１ｋＤＡのＭ２タンパク質に対応する２つの主要なバンドが出現したのに対し、トランスフェクトされなかった対照は、これらのタンパク質の存在を示さなかった。レーン１はタンパク質マーカー、レーン２はインフルエンザＭ１およびＭ２タンパク質を発現しないＭＤＣＫ細胞（陰性対照）、レーン３はインフルエンザＭ１およびＭ２タンパク質を構成的に発現するＭＤＣＫ細胞である。図９Ｂに示すように同じプラスミドをＣＨＯ細胞に導入した場合、さらにＶＥＲＯ細胞でも、同様の結果が得られた。
【０１６２】
実施例１２
Ｍ１／Ｍ２を産生する細胞における改変ＨＡ／ＮＡタンパク質の発現
ＮＡを含むまたは含まない改変ＨＡ分子（図６パネルＩ−ＨＡ／ＮＡ）を有するＤＮＡベクターを、Ｍ１／Ｍ２ＤＮＡベクター（図１−パネルＩ−Ｍ１／Ｍ２）と一緒に、あるいは、Ｍ１／Ｍ２を発現している細胞にトランスフェクトすると、これらのタンパク質が発現し、タンパク質は、細胞ライセートだけでなく、細胞上清および濃縮精製された上清にも存在した。
【０１６３】
これらのサンプルのウエスタンブロット解析を図１０に示し、これにより、トランスフェクト細胞にＭ１、Ｍ２およびＨＡタンパク質が発現することが示される。
【０１６４】
実施例１３
ネガティブ染色電子顕微鏡観察によるインフルエンザＶＬＰの調査
トランスフェクト細胞の上清を２００，０００×ｇ、４℃で１．５時間超遠心に付した。超遠心後のペレットをＰＢＳに再懸濁し、再懸濁したペレットの２０μｌを電子顕微鏡観察用に確保した。この２０μｌのサンプルを４％パラホルムアルデヒドで固定してから、固定材料の５μｌを２００メッシュのカーボンコートしたグリッド（ＥＭＳ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）に載せ、グリッドを５分間カバーし、次いで水で３回洗浄した。この後、コートしたグリッドに２％酢酸ウラニルを、グリッドを酢酸ウラニルで過剰染色しないように素早く５滴滴下した。グリッドから過剰な溶液をブロットし、次いで風乾してからこれをＪＯＥＬ ＪＥＭ １００ＣＸ透過型電子顕微鏡に導入した。サンプルは、６０，０００×〜１００，０００×の倍率で観察した。
【０１６５】
図１１は、Ｍ１／Ｍ２−ＨＡ／ＮＡ ＣＨＯ細胞の精製された上清から得られた画像を示す。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示内容を本明細書に援用する、どちらも２０１０年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３０５，７６８号明細書および米国仮特許出願第６１／３０５，７５９号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の委託研究に関する記載
該当なし。
【０００３】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むインフルエンザ抗原タンパク質について記載し、こうしたＶＬＰの産生方法および使用方法についても記載する。
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型およびＣ型）は、ヒトおよび他の哺乳類種ならびに鳥種の呼吸器感染症の原因因子である。このウイルスの生活環に特有の生物学的および疫学的特徴により、新たなウイルス株の急速な抗原進化、および持続的出現が引き起こされ、特にＡ型ウイルスにおいてそうである。この抗原変異体の持続的出現により、季節性インフルエンザのエピデミック、および不規則な間隔での世界的なパンデミックが起こる。例年のインフルエンザのエピデミックは毎年、米国だけで約３６，０００人、世界全体で２５０，０００人の死亡と関連しており、同時に莫大な健康および経済上の負担の原因となっている。パンデミックインフルエンザはヒトの健康の重大な脅威となっており、１９１８年のパンデミックのような世界的な現象は、５，０００万人の死亡、および壊滅的な社会経済的影響の原因となった。
【０００５】
インフルエンザウイルスは、分節した一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する。インフルエンザＡウイルスは、ビリオン粒子の表面に２つの主要な糖タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を提示し、これらの２つの分子の抗原性に基づき１６種のＨＡサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６）および９種のＮＡサブタイプ（Ｎ１〜Ｎ９）に分類される。インフルエンザ感染後の主な免疫応答は、表面糖タンパク質ＨＡおよびＮＡを標的とする。ＨＡに対する抗体は、細胞表面受容体に対するウイルス結合を阻止し、ウイルスの侵入および感染を防止することができる。しかしながら、この応答は次第に無効になり、抗原ドリフト（突然変異の蓄積）または抗原シフト（遺伝子再集合による入れ替わり）に起因する新たな抗原変異体から保護することができない。
【０００６】
現在、季節性またはパンデミックインフルエンザ疾患を制御する最も効果的な介入の１つは、予防的ワクチン接種である。この実施には、最も新しいヒトウイルス分離株で製剤化されたワクチンを感受性の被検体に毎年投与する必要がある。こうしたワクチンは通常、各々孵化鶏卵または培養細胞で増殖させた個々のウイルスから調製され、その後ワクチン接種率を高める最終的なワクチン製剤にブレンドされる。インフルエンザウイルスの抗原変異が頻繁に起こるため、ワクチンは、ワクチンの防御効果を維持するため定期的に再製剤化して新たな抗原変異体を取り込む必要がある。
【０００７】
したがってワクチンの有効性は、ワクチンとヒトに流行するウイルス株との抗原類似性の程度による。さらに、高齢者などワクチン接種した人の一定の割合は、最新のワクチンで防御免疫を誘導できない。
【０００８】
ファージディスプレイ抗体ライブラリーを用いて行われた最近の研究から、広範囲のインフルエンザウイルスサブタイプの感染を阻止できる広い中和抗体が明らかになった（Ｊｉａｎｈｕａ Ｓｕｉ ｅｔ．ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：２６５−２７３）。広範囲のウイルスを中和するこうした抗体の能力は、ウイルス感染またはワクチン接種により誘導される主な中和メカニズムである受容体結合の阻止ではなく、ＨＡ分子のステム領域に存在する高度に保存されたサブドミナントエピトープと反応し、膜融合を阻害することにより感染を阻止することによって生じる。これらの高度に保存されたサブドミナントエピトープを提示するワクチンが設計されれば、広範囲のインフルエンザサブタイプから保護することができる広い中和免疫応答が惹起される。
【０００９】
最新のワクチンの製剤化に必要なウイルス成分を産生するには、選択したウイルスを孵化鶏卵または培養細胞に感染させることにより増殖する。このプロセスは、細胞表面に受容体を含むシアル酸にＨＡ分子を介して結合するウイルスの能力、侵入、ウイルス複製、および卵または培養細胞の液体からのウイルス子孫の単離に依存する。ウイルスＨＡの切断、再操作または改変を行えば、受容体結合を阻止することになり、ウイルス複製およびこうしたワクチンの製造を妨げることと考えられる。
【００１０】
インフルエンザＶＬＰは、２種、３種または４種のウイルス遺伝子（Ｍ１、Ｍ２、ＨＡおよびＮＡ）の同時発現により産生されるものであり、Ｍ１、Ｍ２または（類似の基質タンパク質）ＨＡおよびＮＡが構造の主要かつ本質的な成分である。たとえば、米国特許出願公開第２００８／００３１８９５号明細書および同第２００９／００２２７６２号明細書を参照されたい。これらの遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、細胞に同時にまたは連続的にトランスフェクトされ、転写され、そのそれぞれのタンパク質に翻訳されて、それらがウイルス様粒子に自己集合する。ウイルスとは異なり、受容体結合およびウイルス侵入に使用されるＨＡの領域を修飾しても、細胞からのＶＬＰの産生、アセンブリーまたは放出は阻害されない。すなわち、ＶＬＰを産生すれば、分子の遺伝的に多様なイムノドミナント領域を含むＨＡの大部分の欠失および改変が可能になるのに対し、ウイルスの複製方法はこれらの修飾を許容するものではない。また、同様の修飾は、やはりＶＬＰワクチンの表面に提示されるＮＡ分子に導入することもできる。
【００１１】
しかしながら、インフルエンザワクチン組成物、ならびにこうした組成物を製造および使用する方法が依然として求められている。
【発明の概要】
【００１２】
本明細書に記載するのは、少なくとも１つの切断型および／またはハイブリッドインフルエンザ抗原タンパク質（たとえば、ＨＡまたはＮＡ）を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。また、こうしたＶＬＰを含む組成物のほか、こうしたＶＬＰの製造方法および使用方法についても記載する。本明細書に記載のＶＬＰはウイルス遺伝子材料を有しておらず、したがって複製したり、または感染を引き起こしたりすることができない。一方、ＶＬＰは野生型ビリオンと形態学的類似性、生化学的類似性および抗原類似性があるため、高い免疫抗原性を示し、有効な防御免疫応答を惹起することができる。ＶＬＰは、ビリオンを不活化したワクチンと異なり、感染性ではなく化学的処理の必要がないため、ネイティブなコンフォメーションを維持している。さらに、本発明は、現在のインフルエンザウイルスおよび進化するインフルエンザウイルスから広く保護することによりインフルエンザワクチンを毎シーズン製剤化することに伴う問題も解決する。
【００１３】
このため、一態様では、本明細書に開示されるのは、本明細書において提供されるのはウイルス様粒子（ＶＬＰ）であることを含み、少なくとも１つの基質タンパク質（たとえば、Ｍ１などのインフルエンザ基質タンパク質、トゴ（ｔｈｏｇｏｔｏ）基質タンパク質およびＲＳＶ基質タンパク質）；および修飾インフルエンザポリペプチド（たとえば、ＨＡまたはＮＡなどの糖タンパク質）を含み、その修飾がインフルエンザ（たとえば、ＨＡ）ポリペプチドの膜貫通および細胞質尾部ドメインの外側に１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。ある種の実施形態では、欠失は、少なくとも１５０の連続したアミノ酸残基の欠失を含む。他の実施形態では、欠失は、連続していない２つ以上の欠失を含む。なおさらなる実施形態では、インフルエンザポリペプチド（たとえば、ＨＡ）は、１つまたは複数のアミノ酸突然変異（置換および／または付加）、たとえば、修飾インフルエンザポリペプチド（たとえば、ＨＡ）に、少なくとも１つのタンパク質分解開裂部位および／または少なくとも１つのリンカーが挿入されている実施形態を含む。リンカーは既知のリンカー配列でもよいし、あるいは本明細書に記載の分子を使用して新規に作製してもよい。本明細書に開示されたＶＬＰのいずれかでは、ＶＬＰは多価であってもよい、すなわち、本明細書に記載するような野生型および／または修飾インフルエンザポリペプチドの任意の組み合わせを含め、複数のインフルエンザ抗原タンパク質を含んでもよい。さらに、本明細書に記載のＶＬＰのいずれかでは、修飾インフルエンザ（たとえば、ＨＡまたはＮＡ）ポリペプチドの膜貫通および／または細胞質ドメインは、修飾インフルエンザポリペプチドと異なる株またはサブタイプ由来の膜貫通および／または細胞質ドメインで置換されている。さらに、本明細書に記載のＶＬＰのいずれかは、別のインフルエンザタンパク質、たとえば１つまたは複数の別の野生型基質タンパク質（Ｍ１および／またはＭ２）、１つまたは複数の別の改変（変異および／またはハイブリッド）基質タンパク質（Ｍ１および／またはＭ２）、１つまたは複数の野生型抗原性糖タンパク質（ＨＡおよび／またはＮＡ）、１つまたは複数のハイブリッド抗原性糖タンパク質（ＨＡおよび／またはＮＡ）、１つまたは複数の修飾抗原性糖タンパク質（ＨＡおよび／またはＮＡ）、１つまたは複数のハイブリッドおよび修飾抗原ポリペプチド（ＨＡおよび／またはＮＡ）、１つまたは複数のヌクレオプロテイン（ＮＰ）、１つまたは複数のＰＢ１タンパク質、１つまたは複数のＰＢ２タンパク質、１つまたは複数のＰＡタンパク質、およびこれらの組み合わせをさらに含んでいてもよい。ある種の実施形態では、ＶＬＰは、２つ以上の抗原性糖タンパク質（修飾または野生型の任意の組み合わせ）がＶＬＰの表面に発現する（たとえば、その結果、免疫応答を引き起こす）という点で多価である。本明細書に記載のＶＬＰのいずれかは、ＶＬＰのアセンブリーおよび放出を可能にする条件下で真核細胞（たとえば、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、トリ細胞、植物細胞または哺乳動物細胞）に発現させることができる。
【００１４】
別の態様では、本明細書に記載するのは、上記のようなＶＬＰのいずれかを含む宿主細胞である。ある種の実施形態では、宿主細胞は、ＶＬＰのポリペプチドをコードする１つまたは複数のベクターからの、本明細書に記載するようなＶＬＰのアセンブリーおよび放出を可能にする。ある種の実施形態では、真核細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、トリ細胞、植物細胞または哺乳動物細胞からなる群から選択される。
【００１５】
なお別の態様では、本明細書で提供するのは、本明細書に記載のＶＬＰのいずれかを産生する方法であって、少なくとも１つの基質タンパク質および少なくとも１つの修飾インフルエンザ（たとえば、ＨＡ）ポリペプチドをコードする１つまたは複数のベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトするステップ、およびＶＬＰの形成を可能にする条件下でタンパク質の組み合わせを発現させるステップを含む方法である。ＶＬＰのいずれかでは、基質タンパク質は、インフルエンザＭ１タンパク質でも、トゴ（ｔｈｏｇｏｔｏ）基質タンパク質でも、ＲＳＶ基質タンパク質でもよい。他の実施形態では、別のベクターまたは同じベクターが別のタンパク質、たとえば別のインフルエンザタンパク質（たとえば、ＮＡタンパク質等）をコードしていてもよい。ある種の実施形態では、少なくとも１つのベクターが、インフルエンザＭ２タンパク質をコードする配列を含む。発現ベクターはプラスミドでも、ウイルスベクターでも、バキュロウイルスベクターでも、または非ウイルスベクターでもよい。ベクターは、ＶＬＰのタンパク質の１つをコードしていても、２つ以上をコードしていても、または全部をコードしていてもよい。本明細書に記載のＶＬＰの産生方法のいずれかでは、ベクターの１つまたは複数を宿主細胞に安定にトランスフェクトしてもよい。ある種の実施形態では、少なくとも１つの基質タンパク質および修飾インフルエンザＨＡポリペプチドが別々のベクターにコードされ、修飾インフルエンザＨＡポリペプチドタンパク質をコードするベクターをトランスフェクトする前に少なくとも１つの基質タンパク質をコードするベクターを細胞に安定にトランスフェクトする。ベクターがコードするタンパク質は、全長野生型、全長ミュータント、切断型野生型、切断型ミュータント、ならびに／または、全長および／もしくは切断型野生型タンパク質または変異タンパク質を含むハイブリッドタンパク質であってもよい。細胞は、真核細胞、たとえば、酵母細胞でも、昆虫細胞でも、両生類細胞でも、トリ細胞でも、植物細胞でも、または哺乳動物細胞でもよい。ある種の実施形態では、少なくとも１つのＭタンパク質は、インフルエンザ基質タンパク質を含む。
【００１６】
なおさらなる態様では、本明細書に記載するのは、本明細書に記載するような少なくとも１つのＶＬＰを含む免疫原性組成物である。ある種の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかは、異なる修飾インフルエンザ（たとえば、ＨＡ）ポリペプチドを含む少なくとも２つのＶＬＰを含んでもよい。ある種の実施形態では、この組成物は、各ＶＬＰが異なる修飾ＨＡタンパク質を含む少なくとも２つのＶＬＰ、または２つ以上の改変ＨＡまたはＮＡ糖タンパク質をその表面に提示する単一のＶＬＰ（たとえば、。多価のＶＬＰ）を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔａｉｎｓ）。なおさらなる実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。
【００１７】
なおさらなる態様では、本明細書で提供するのは、被検体内でインフルエンザに対する免疫応答を引き起こす方法であって、被検体に本明細書に記載するような有効量のＶＬＰおよび／または免疫原性組成物を被検体（たとえば、ヒト）に投与することを含む方法である。ある種の実施形態では、組成物を粘膜投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、または経口投与する。ある種の実施形態では、この方法は、インフルエンザの複数の株またはサブタイプに対する免疫応答を引き起こし、それにより被検体を様々なインフルエンザウイルスによるインフルエンザ感染から、および／または長期間（２つ以上のインフルエンザ（ｆｌｕ）シーズン）にわたり保護する「万能」ワクチンを与える。
【００１８】
本方法のいずれかは、複数回の投与（たとえば、反復投与スケジュール）を含んでもよい。
【００１９】
別の態様では、本明細書に記載するようなインフルエンザＶＬＰを産生するパッケージング細胞株を提供する。この細胞株に少なくとも２つのＭタンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを安定にトランスフェクトして、安定にトランスフェクトされていない１つまたは複数のインフルエンザタンパク質をコードする配列をこの細胞に導入し、発現させると、細胞がＶＬＰを産生する。ある種の実施形態では、Ｍ１および／またはＭ２をコードする配列をパッケージング細胞株に安定に組み込み、ＶＬＰの表面に発現する修飾ＨＡタンパク質をコードする配列を細胞に導入してＶＬＰを形成する。他の実施形態では、修飾ＨＡタンパク質の１つまたは複数をコードする配列を細胞に安定に組み込み、パッケージング細胞株を形成し、少なくとも２つのＭタンパク質をコードする配列を導入するとＶＬＰが形成される。パッケージング細胞は、昆虫細胞でも、植物細胞でも、哺乳動物細胞でも、細菌細胞でも、または真菌細胞でもよい。ある種の実施形態では、パッケージング細胞は哺乳動物（たとえば、ヒト）細胞株である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＨＡ１配列の一部を除去し、シグナルペプチドとＨＡ１分子の残りの部分との間に挿入を導入した改変ＨＡ分子構造の模式図を示す。模式図および配列に記載されているようにジスルフィドの結合形成を防止するため、突然変異を導入する。分子のＨＡ２部分は、膜貫通および細胞質ドメインを含むその全体が維持される。このコンストラクトは、「１ＴＡ」（配列番号１および２）とする。
【図２】図２は、シグナルペプチドの除去後のＮＨ２末端配列が、保存されたエピトープの一部を形成する配列、および鎖間のジスルフィド結合を形成するためのＣ２０残基を含む第２の改変ＨＡ分子の模式図を示す。これは、切断されたＨＡ１の部分（Ｒ２４１〜Ｌ３３３）、および全ＨＡ２フラグメントと遺伝的に連鎖している。このコンストラクトは、「２ＴＡ」（配列番号３および４）とする。
【図３】図３は、改変ＨＡの模式的構造を示す。この場合、シグナルペプチドの除去後のΝＨ２末端部分（Ｄ１７〜Ｐ６５）が、設計された１２アミノ酸のリンカー（ＤＩＧＰＧＫＶＧＹＧＰＧ、配列番号１１）を介して切断されたＨＡ１の領域（Ｍ２８１〜Ｒ３４６）に連結され、この全フラグメントが、Ｖ４１２からＤ４１２への、およびＬ４１９からＧ４１９への突然変異を導入してタンパク質凝集を防止した完全なＨＡ２（Ｇ３４７〜Ｉ５６８）に結合している。このコンストラクトは、「３ＴＡ」（配列番号５および６）とする。
【図４】図４は、ＨＡ２フラグメントの、シグナルペプチドの除去後の全アミノ酸配列を包含する切断型ＨＡ分子（細胞外、膜貫通および細胞質ドメインを含むＧ３４７〜Ｉ５６８の模式図を示す。このコンストラクトは、「４ＴＡ」（配列番号７および８）とする。
【図５Ａ】図５Ａは、ＨＡ１の配列内に２つ（１つはＰ６５位とＬ６６位との間、およびもう１つはＩ２８０位とＭ２８１位との間）のタンパク質分解開裂部位（各々ＰＱＲＥＲＲＲＫＲ、配列番号１２である１０アミノ酸のインサート）を導入して再操作したＨＡ分子の模式図である。このコンストラクトは、「５ＴＡ」（配列番号９および１０）とする。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＨＡ１の配列内に２つ（１つはＰ６５位とＬ６６位との間、およびもう１つはＩ２８０位とＭ２８１位との間）のタンパク質分解開裂部位（各々ＰＱＲＥＲＲＲＫＲ、配列番号１２である１０アミノ酸のインサート）を導入して再操作したＨＡ分子の模式図である。発現して修飾ＨＡがそのネイティブなコンフォメーションにフォールディングした後、最もドミナントな高度に可変性の抗原部位を提示するこの構造の球状頭部をプロテアーゼ処理により除去して、広い防御免疫応答を惹起する高度に保存されたサブドミナントエピトープを露出することができる。この構造は、Ｃ２０とＣ４８３との間の鎖内ジスルフィド結合により維持される。このコンストラクトは、「５ＴＡ」（配列番号９および１０）とする。
【図６】図６のパネルＩは、ＶＬＰ産生のため、図示した調節エレメントの下、決められた位置にインフルエンザ遺伝子を有する、哺乳動物細胞の例示的なＤＮＡベクターの模式図である。図６のパネルＩＩは、ＶＬＰ産生のため、図示した調節エレメントの下、決められた位置にインフルエンザ遺伝子を有する、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系の例示的なＤＮＡベクターの模式図である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＶＬＰの持続的産生のため、哺乳動物細胞へのベクターのトランスフェクション、タンパク質の発現、および安定にトランスフェクトされた細胞株の選択に利用した戦略の例を図示する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＶＬＰの持続的産生のため、哺乳動物細胞へのベクターのトランスフェクション、タンパク質の発現、および安定にトランスフェクトされた細胞株の選択に利用した戦略の例を図示する。
【図８】図８Ａは、一次抗体として抗Ｍ２抗体、および二次抗体としてフルオレセインＦＩＴＣ標識抗マウスを用いた、Ｍ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）の結果を示す。図８Ａは、未染色の対照である。図８Ｂは、一次抗体として抗Ｍ２抗体、および二次抗体としてフルオレセインＦＩＴＣ標識抗マウスを用いた、Ｍ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）の結果を示す。図８Ｂはアイソタイプコントロールを示す。図８Ｃは、一次抗体として抗Ｍ２抗体、および二次抗体としてフルオレセインＦＩＴＣ標識抗マウスを用いた、Ｍ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）の結果を示す。図８Ｃは、Ｍ２の表面発現に対して染色したアイソタイプコントロールを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｍ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の細胞ライセートのウエスタンブロットを示す。図９Ａは、ＭＤＣＫ細胞のタンパク質レベルを示す（レーン１は通常のＭＤＣＫ細胞の結果を示し、レーン２はＭ１／Ｍ２タンパク質を構成的に発現するＭＤＣＫ細胞の結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｍ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の細胞ライセートのウエスタンブロットを示す。図９ＢはＣＨＯ細胞の結果を示す。レーン１は陰性対照（ＣＨＯ細胞ライセート）を示し、レーン２はインフルエンザウイルスＰＲ８を感染させたＣＨＯ細胞を示し、レーン３はＭ１／Ｍ２を構成的に発現するＣＨＯ細胞（クローン１）を示し、レーン４はＭ１／Ｍ２を構成的に発現するＣＨＯ細胞（クローン２）を示す。
【図１０】図１０は、Ｍ１／Ｍ２およびＮＡ／ＨＡ（改変）をトランスフェクトした哺乳動物細胞の細胞ライセートのウエスタンブロットを示す。図１０はＣＨＯ細胞ライセートおよび濃縮／精製された培養上清のタンパク質レベルを示す。レーン１はインフルエンザウイルス対照（ＨＡ５／ＮＡ１の再集合ＰＲ８）、レーン２は陰性対照としてトランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞、レーン３および５はＭ１／Ｍ２をＮＡ／ＨＡ改変５ＴＡと一緒にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞ライセート（レーン３）、およびＮＡ／ＨＡ改変３ＴＡ（レーン５）と一緒にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞ライセートである。レーン４および６はそれぞれ、Ｍ１／Ｍ２をＮＡ／改変ＨＡ−５ＴＡと一緒にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の濃縮／精製された培養上清、およびＮＡ／改変ＨＡ−３ＴＡと一緒にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の濃縮／精製された培養上清を示す。
【図１１】図１１は、ＣＨＯ細胞で産生され、Ｍ１／Ｍ２−ＮＡ／ＨＡトランスフェクト細胞の培養上清から精製されたＶＬＰの電子顕微鏡写真像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の実施には、他に記載がない限り、当該技術分野の技術の範囲内にある化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を利用する。こうした技術は、文献に詳細に説明されている。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ），２ｎｄ ｅｄ．（Ｎｅｗｔｏｎ ＆ Ｇｒａｈａｍ ｅｄｓ．，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｆｉｅｌｄｓ ＆ Ｋｎｉｐｅ ｅｄｓ．，１９９１，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００２２】
本明細書に引用する刊行物、特許および特許出願についてはすべて、その全体を本明細書に援用する。
【００２３】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容により明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数のものを含む。したがって、たとえば、「ａ ＶＬＰ」という場合は、２つ以上のそうしたＶＬＰの混合物を含む。
【００２４】
定義
本明細書で使用する場合、「サブウイルス粒子」「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」という用語は、複製しないウイルス殻をいう。ＶＬＰは一般に、以下に限定されるものではないが、カプシドタンパク質、コートタンパク質、殻タンパク質、表面タンパク質および／もしくはエンベロープタンパク質と呼ばれるタンパク質などの１つまたは複数のウイルスタンパク質、またはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドからなる。ＶＬＰは、適切な発現系でタンパク質を組換え発現させると、自然に形成され得る。特定のＶＬＰを産生する方法は、当該技術分野において公知であり、以下でより詳細に考察する。ウイルスタンパク質の組換え発現後のＶＬＰの存在については、電子顕微鏡、生物物理学的特徴付けおよび同種のものなどにより当該技術分野において公知の従来の技術を用いて検出することができる。たとえば、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９９１）６０：１４４５−１４５６；Ｈａｇｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：４５０３−４５０５を参照されたい。たとえば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離により単離し、および／または特徴的な密度バンディング（たとえば、実施例）により特定することができる。あるいは、対象のＶＬＰ調製物のガラス化した水性サンプルを用いて低温電子顕微鏡観察を行い、適切な撮影条件下で画像を記録してもよい。ＶＬＰ精製の別の方法として、親和性法、イオン交換法、サイズ排除法および逆相法などのクロマトグラフィー技術があるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
本明細書に使用する場合、「ハイブリッド」または「キメラ」という用語は、分子（たとえば、タンパク質またはＶＬＰ）が、少なくとも２つの異なるタンパク質の各部分を含むことをいう。たとえば、ハイブリッドインフルエンザＨＡタンパク質とは、インフルエンザＨＡタンパク質の少なくとも一部（たとえば１つまたは複数の抗原決定基を含む一部）、および異種のタンパク質（たとえば、異なるインフルエンザタンパク質または異なるウイルスタンパク質、たとえばＲＳＶまたはＶＳＶタンパク質の細胞質および／または膜貫通ドメイン）の一部を含むタンパク質をいう。本明細書に記載するようなハイブリッド分子は、別の異種のポリペプチド（全長またはその一部）に融合した全長タンパク質、および異種のポリペプチド（全長またはその一部）に融合したタンパク質の一部を含んでもよいことが明らかであろう。また、ハイブリッドは、野生型配列、または異種のドメインの任意の１つ、一部または全部の変異配列を含んでもよいことも明らかであろう。
【００２６】
特定のウイルスタンパク質に由来する「粒子形成ポリペプチド」とは、ＶＬＰの形成に有利に働く条件下でＶＬＰを形成する能力を有する、全長またはほぼ全長のウイルスタンパク質、およびそのフラグメント、または内部欠失を持つウイルスタンパク質を意味する。したがって、このポリペプチドは、当該分子の全長配列、フラグメント、切断された部分配列のほか、アナログおよび前駆体形態を含んでもよい。このためこの用語は、ポリペプチドがＶＬＰを形成する能力を保持する限り、配列に対する欠失、付加および置換を意図している。よって、この用語は、ウイルス分離株の間ではコートタンパク質の変異が起こることが多いため、特定のポリペプチドの自然変異を含む。また、この用語は、当該タンパク質がＶＬＰを形成する能力を保持する限り、そのタンパク質において自然に発生しない欠失、付加および置換も含む。好ましい置換は、性質上保存的なものである、すなわち、側鎖に関連しているアミノ酸の群内で起こる置換である。具体的には、アミノ酸は一般に４つの群：（１）酸性−アスパルテートおよびグルタメート；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを芳香族アミノ酸に分類することもある。
【００２７】
「抗原」とは、宿主の免疫系を刺激して液性および／または細胞性の抗原特異的応答を生じさせる１つまたは複数のエピトープ（線状、立体構造またはその両方）を含む分子をいう。この用語は、「免疫原」という用語と同義で使われる。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５アミノ酸を含むものであるが、３〜４という少ないアミノ酸であってもよい。ＣＴＬエピトープなどのＴ細胞エピトープは少なくとも約７〜９アミノ酸を、ヘルパーＴ細胞エピトープは少なくとも約１２〜２０アミノ酸を含む。通常、エピトープは、９、１０、１２または１５アミノ酸など約７〜１５アミノ酸を含む。この用語は、タンパク質が本明細書で定義した免疫学的応答を惹起する能力を維持する限り、天然配列と比較して欠失、付加および置換（一般に性質上保存的）などの修飾を含むポリペプチドを含む。これらの修飾は、部位特異的変異誘発によるなど人為的なものであってもよいし、または抗原を産生する宿主の突然変異によるなど偶発的なものであってもよい。
【００２８】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」とは、被検体において目的の組成物中に存在する抗原に対して液性および／または細胞性免疫応答を生じさせることをいう。本開示においては、「液性免疫応答」とは、抗体分子が関与する免疫応答をいい、「細胞性免疫応答」とは、Ｔリンパ球および／または他の白血球が関与するものをいう。細胞性免疫の１つの重要な側面として、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答が挙げられる。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）がコードし、細胞表面に発現するタンパク質と共に提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内の微生物の破壊、またはそうした微生物に感染した細胞の溶解を誘導および促進するのを助ける。細胞性免疫のもう１つの側面として、ヘルパーＴ細胞抗原特異的応答が挙げられる。ヘルパーＴ細胞は、表面にＭＨＣ分子と共にペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性を亢進するのを助ける働きをする。また、「細胞性免疫応答」は、サイトカイン、ケモカイン、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものなど活性化Ｔ細胞および／または他の白血球により産生される他のそうした分子の産生もいう。このため、免疫学的応答は、以下の作用：Ｂ細胞による抗体の産生；および／または目的の組成物またはワクチンに存在する抗原に特異的なサプレッサーＴ細胞および／またはγΔＴ細胞の活性化の１つまたは複数を含み得る。これらの応答は、感染性を中和し、および／または抗体−補体または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、免疫された宿主を保護する働きをし得る。こうした応答は、当該技術分野において周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて判定することができる。
【００２９】
「免疫原性組成物」は、組成物が被検体に投与されると、被検体に目的の抗原分子に対する液性および／または細胞性免疫応答を生じさせる抗原分子を含む組成物である。
【００３０】
「実質的に精製された」は一般に、ある物質がその物質が存在するサンプルの過半の割合を有するように物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）を単離することをいう。典型的には、サンプル中の実質的に精製された構成成分は、サンプルの５０％、好ましくは８０％〜８５％、一層好ましくは９０〜９５％を構成する。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製する技術は、当該技術分野において公知であり、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度による沈降が挙げられる。
【００３１】
「コード配列」または選択されたポリペプチド「をコードする」配列とは、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置くと、インビボでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子をいう。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、以下に限定されるものではないが、ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらに合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置してもよい。
【００３２】
典型的な「制御エレメント」として、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’側に位置する）、翻訳の開始を最適化する配列（コード配列の５’側に位置する）、および翻訳終結配列、ならびに／またはオープンクロマチン構造を制御する配列エレメントがあるが、これに限定されるものではない たとえば、ＭｃＣａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９２：５４３１−５４３５；Ｋｏｃｈｅｔｏｖ ｅｔ ａｌ（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４４０：３５１−３５５を参照されたい。
【００３３】
「核酸」分子は、以下に限定されるものではないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（たとえば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらに合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。この用語にはさらに、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基アナログのいずれかを含む配列も含まれる。
【００３４】
「作動可能に連結された」とは、その記載された各要素がその通常の機能を発揮するように構成されている各エレメントの配置をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結された個々のプロモーターは、活性化されるとコード配列を発現させることができる。プロモーターは、コード配列の発現を誘導するように機能する限り、コード配列と隣接させる必要はない。このため、たとえば、プロモーター配列とコード配列との間に転写されるが翻訳されない介在配列が存在してもよく、このプロモーター配列がコード配列に「作動可能に連結された」と見なされることに変わりはない。
【００３５】
本明細書で使用する場合、核酸分子について記載する「組換え体」とは、その起源または操作によって、（１）ポリヌクレオチドが本来結合するポリヌクレオチドの全部または一部と結合していない、および／または、（２）ポリヌクレオチドが本来連結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結しているゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、半合成由来または合成由来のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドについて使用する「組換え体」という用語は、組換えポリヌクレオチドの発現により産生されるポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および単細胞体として培養された原核微生物または真核細胞株を示す他のこうした用語は同義で使われ、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの被導入体として使用することができる、または使用されてきた細胞をいい、かつ最初にトランスフェクトされた細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的または人為的突然変異により最初の親と形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡが必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解されよう。所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列が存在するなど適切な特性を特徴とするため、親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義が意図している子孫に含まれ、上記の用語に包含される。
【００３６】
アミノ酸配列の「類似性」を判定する技術は、当該技術分野において周知である。一般に、「類似性」は、適切な場所の２つ以上のポリペプチドのアミノ酸とアミノ酸を正確に比較した場合に、アミノ酸が同一であるか、または電荷または疎水性など類似の化学的および／または物理的性質を有することを意味する。その後比較したポリペプチド配列間のいわゆる「類似率」を決定することができる。また、核酸およびアミノ酸配列の同一性を判定する技術は当該技術分野において周知であり、その遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を（通常ｃＤＮＡ中間体を介して）決定すること、およびそれがコードするアミノ酸配列を決定すること、およびこれをもう１つのアミノ酸配列と比較することを含む。一般に、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の「同一性」とはそれぞれ、ヌクレオチドとヌクレオチドとの正確な一致度またはアミノ酸とアミノ酸との正確な一致度をいう。
【００３７】
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、その「同一率」を判定することにより比較することができる。同様に２つ以上のアミノ酸配列も、その「同一率」を判定することにより比較することができる。２つの配列の同一率は一般に、核酸配列かペプチド配列かを問わず、整列させた２つの配列間でマッチングしている正確な数を、短いほうの配列の長さで割り、その商に１００を掛けたものとして記載される。核酸配列の適切なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより得られる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡにより開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により標準化されたスコアリングマトリクスを用いてペプチド配列に応用してもよい。配列間の同一率または類似率の計算に好適なプログラムは一般に、当該技術分野において公知である。
【００３８】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移すことができる（たとえば、細菌プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状キャリアおよびリポソーム）。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、宿主細胞に１つまたは複数の目的の配列の発現を誘導することができる任意の核酸コンストラクトを意味する。したがって、この用語は、ウイルスベクターだけでなく、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクルを含む。この用語は、「核酸発現ベクター」および「発現カセット」という用語と同義に使用される。
【００３９】
「被検体」は、以下に限定されるものではないが、ヒト、および他の霊長類、たとえばチンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種などの非ヒト霊長類；農用動物、たとえばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；家庭で飼育される哺乳動物、たとえばイヌおよびネコ；実験動物、たとえばマウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯動物；トリ、たとえば家庭で飼育されるトリ、野生のトリおよび猟鳥、たとえばニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽、アヒル、ガチョウおよび同種のものなどの脊椎動物亜門に属する任意の動物を意味する。この用語は、特定の年齢を示すものではない。したがって、成体個体および新生個体の両方を包含することを意図している。上述の系は、上記の脊椎動物種のいずれかに使用することを意図している。これらの脊椎動物の免疫系がどれも同様に働くためである。
【００４０】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、ある材料が生物学的またはその他の点で望ましいこと、すなわち、製剤または組成物として許容できない生物学的作用を何ら引き起こすことなく、または材料が含まれる組成物の要素のいずれとも有害な相互作用を引き起こすことなく材料を個体に投与することができることを意味する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「処置」とは、（ｉ）伝統的なワクチンと同様の感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の抑制または消失、および（ｉｉｉ）目的の病原体の実質的または完全な排除のいずれかをいう。処置は予防的（感染の前）に行っても、または治療的（感染後）に行ってもよい。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「アジュバント」という用語は、製剤中の特定の免疫原（たとえばＶＬＰ）と組み合わせて使用して場合、免疫応答を増強するか、あるいは、他の点で変化または修飾する化合物をいう。免疫応答の修飾としては、抗体および細胞性免疫応答のどちらか一方あるいは両方の特異性の強化または拡大が挙げられる。また、免疫応答の修飾は、ある種の抗原特異的免疫応答を低下または抑制することも意味する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「有効用量」は一般に、免疫を誘導する、感染症を予防および／または軽減する、または感染症の少なくとも１つの症状を緩和する、および／または別の用量のＶＬＰの有効性を高めるのに十分な本発明のＶＬＰの量をいう。有効用量とは、感染症の発現を遅延させる、または最小限に抑えるのに十分なＶＬＰの量をいう場合がある。また、有効用量は、感染症の処置または管理において治療効果が得られるＶＬＰの量をいうこともある。さらに、有効用量は、感染症の処置または管理において治療効果が得られる、本発明のＶＬＰ単独、または他の治療剤と組み合わせた量でもある。また、有効用量は、将来の感染性因子との接触に対して被検体自身の（たとえば、ヒトの）免疫応答を増強するのに十分な量であってもよい。免疫のレベルは、たとえば、プラーク中和アッセイ、補体結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、またはマイクロ中和アッセイで、たとえば、中和分泌および／または血清抗体の量を測定することによりモニターすることができる。ワクチンの場合、「有効用量」は、疾患を予防する、および／または症状の重症度を緩和する量である。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、所望の生物学的作用を実現するのに必要または十分なＶＬＰの量をいう。有効量の組成物は、選択した結果を達成する量と考えられ、こうした量は、当業者であれば、通常の実験に基づいて決定することができる。たとえば、感染症を予防、処置および／または軽減する有効量は、本発明のＶＬＰに接触すると免疫系の活性化を引き起こし、その結果抗原特異的な免疫応答を生じさせるのに必要な量であってもよい。また、この用語は、「十分な量」と同義である。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「多価」という用語は、ＶＬＰが複数の種類または株の感染性因子に対して複数の抗原タンパク質を有することをいう。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「免疫刺激因子」という用語は、身体自体の化学的メッセンジャー（サイトカイン）により免疫応答を増強する化合物をいう。これらの分子は、免疫賦活活性、免疫増強活性およびプロ炎症性活性を持つ様々なサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン、たとえばインターフェロン、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；増殖因子（たとえば、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；ならびに他の免疫賦活分子、たとえばマクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２等を含む。免疫刺激因子分子は、本発明のＶＬＰと同じ製剤で投与してもよいし、あるいは別々に投与してもよい。免疫賦活作用を引き起こすには、タンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターのどちらを投与してもよい。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「防御免疫応答」または「防御応答」という用語は、脊椎動物（たとえば、ヒト）に見られ、感染症の予防もしくは軽減、またはその少なくとも１つの症状の緩和を行う、感染性因子に対する抗体が介在する免疫応答をいう。本発明のＶＬＰは、たとえば、感染性因子を中和する、感染性因子の細胞への進入を阻止する、前記感染性因子の複製を阻止する、および／または宿主細胞を感染および破壊から保護する抗体の産生を刺激するができる。また、この用語は、脊椎動物（たとえば、ヒト）に見られ、インフルエンザ感染の予防もしくは軽減、またはその少なくとも１つの症状の緩和を行う、感染性因子に対するＴリンパ球および／または他の白血球が介在する免疫応答をいうこともある。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「抗原製剤」または「抗原組成物」という用語は、脊椎動物、たとえば哺乳動物に投与すると、免疫応答を誘導する調製物をいう。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「ワクチン」という用語は、脊椎動物に投与することができる形態であり、かつ免疫を誘導する、感染症を予防および／または軽減する、および／または感染症の少なくとも１つの症状を緩和する、および／または別の用量のＶＬＰの有効性を高めるのに十分な防御免疫応答を誘導する本発明のＶＬＰを含む製剤をいう。典型的には、ワクチンは、本発明の組成物を懸濁または溶解させる通常の食塩水または緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、本発明の組成物を、感染症の予防、軽減、またはその他点での処置に使用すると都合がよいことがある。ワクチンは、宿主に導入すると、以下に限定されるものではないが、抗体および／もしくはサイトカインの産生、ならびに／または、細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、ならびに／または他の細胞応答などの免疫応答を誘導することができる。
【００５０】
全体の概要
本明細書に記載するのは、インフルエンザ感染からのヒトの保護、および／またはヒトの処置に使用することができるインフルエンザＶＬＰである。特に、本明細書に記載するのは、ウイルスのイムノドミナント領域および／または超可変領域（たとえば、抗原部分）の一部を形成または構成するアミノ酸残基およびペプチド配列の欠失により様々な異なるインフルエンザ（ｆｌｕ）ウイルスに対して強い免疫学的防御応答を誘導するＶＬＰインフルエンザワクチンである。これにより、本来免疫学的に隠れたエピトープがドミナントになり、高い免疫抗原性を示すようになる。
【００５１】
構造修飾ＨＡ分子を作製するには、この糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、切断、挿入、突然変異またはこれらの組み合わせにより改変ＨＡ分子の合成のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を設定して再編成する。上述のように、前述のＶＬＰを含む本明細書に記載のＶＬＰは、ウイルス感染、または別のワクチン組成物または製剤による免疫化により刺激される応答と比較して異なる免疫応答を誘導する。このＶＰＬワクチンにより誘導される広い中和反応は、複数のインフルエンザウイルス株またはサブタイプの異なるサブタイプから保護する。
【００５２】
ウイルス様粒子
インフルエンザタンパク質をコードする配列が真核細胞に発現すると、そのタンパク質は、非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己集合することが明らかにされている。Ｌａｔｈａｍ ＆ Ｇａｌａｒｚａ（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１３）：６１５４−６１６５；Ｇａｌａｒｚａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｖｉｒａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１）：２４４−５１；ならびに米国特許出願公開第２００８／０２３３１５０号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３１８９５号明細書および米国特許出願公開第２００９／００２２７６２号明細書を参照されたい。
【００５３】
本開示は、真核細胞の形質膜のインフルエンザＶＬＰであって、修飾インフルエンザ抗原タンパク質をその表面に持つＶＬＰに関する。このＶＬＰは、単独で、または１つもしくは複数の別のＶＬＰおよび／またはアジュバントと組み合わせて、インフルエンザ感染を防止する免疫応答を刺激する。
【００５４】
本明細書に記載のＶＬＰ（サブウイルス構造ワクチン（ＳＶＳＶ）ともいう）は典型的には、基質タンパク質Ｍ（Ｍ１とも呼ばれる）および任意選択的に、Ｍ２タンパク質をコードする遺伝子の天然および／または変異核酸配列から作られるウイルスタンパク質からなる。基質タンパク質Ｍは、起こり得るすべての多価サブウイルス構造ワクチンの組み合わせを形成する一般的な要素である。Ｍ１およびＭ２タンパク質は、どのようなウイルスに由来するものでもよい。ある種の実施形態では、ＶＬＰのＭ１および／またはＭ２タンパク質は、インフルエンザ基質タンパク質に由来する。他の実施形態では、ＶＬＰのＭ１および／またはＭ２タンパク質は、ＲＳＶまたはトゴ（ｔｈｏｇｏｔｏ）ウイルスに由来する。Ｍ１および／またはＭ２タンパク質は、たとえば本明細書、または米国特許出願公開第２００８／００３１８９５号明細書および米国特許出願公開第２００９／００２２７６２号明細書に開示されているように修飾（変異）されていてもよい。
【００５５】
ワクチンの表面に取り込まれるエンベロープウイルスについては、同一ファミリーに由来するインフルエンザタンパク質を選択しても、または異なるファミリーに由来するインフルエンザタンパク質を選択してもよい。同一ワクチン粒子へのインフルエンザタンパク質の取り込みは、これらのタンパク質をコードする核酸を変化させることにより細胞質尾部および膜貫通アミノ酸配列を共通の糖タンパク質のものに置換することで促進することができる。このアプローチは、可能である多くの多価サブウイルスワクチンの組み合わせの設計を可能にする。
【００５６】
１．修飾インフルエンザ抗原ポリペプチド
上述のように、本明細書に記載のＶＬＰは、修飾（たとえば、切断、欠失、ハイブリッド等）インフルエンザ抗原ポリペプチドを含む。
【００５７】
ある種の実施形態では、修飾インフルエンザ抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドである。ヘマグルチニン（ＨＡ）分子の主な機能は、ウイルス感染の開始の重要なステップである受容体結合と膜融合活性とである。さらに、ＨＡは、中和抗体が産生されるウイルスの主要表面抗原でもある。前駆体分子（ＨＡ０）は、２つのポリペプチド（ＨＡ１）および（ＨＡ２）に開裂し、単一のジスルフィド結合により共有結合する。ＨＡ０の開裂は、ウイルス感染性に必須の本質的なプロセスであり、ＨＡ２サブユニットのＮＨ２末端の融合ペプチドが活性化し、ＨＡの融合能を活性化する。
【００５８】
ＨＡ構造の最も重要な免疫ドミナント抗原部位は分子の頭にあり、主にＨＡ１サブユニットにより形成される。突然変異によるこれらの抗原領域の変化（抗原ドリフト）またはＨＡの入れ替わり（抗原シフト）により、ウイルスは、宿主の中和抗体から逃れ、新しい細胞の感染を開始する。構造のステム部分には、これらの部位だけでなく、高度に保存されたサブドミナントエピトープも存在する。しかしながら、免疫の階層のため、これらの部位は免疫系により大部分が認識されず、顕著な抗体反応を起こすことができない。それでも、これらの領域を標的とする抗体は、膜融合を阻害し、したがってウイルスの侵入を阻害することにより感染を阻止することができる。
【００５９】
このため、本発明に記載するワクチンは、主要なイムノドミナントエピトープを欠損し、分子のステム部分に存在するサブドミナント抗原部位を主に提示する、切断して再設計した改変ＨＡ分子をＶＬＰに発現させることに基づく。これらの構造修飾ＨＡは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の表面に取り込まれて単一の非感染性保護粒子（ＳＮＩＰＰ）インフルエンザワクチンを形成する。
【００６０】
ある態様では、修飾（改変）ＨＡポリペプチドは、たとえば、ＨＡ１およびＨＡ２サブユニットの代替構造に結合した移行シグナル配列を含む短いＮＨ２末端領域を維持したまま、イムノドミナントエピトープの一部または全部を除去することにより、ＨＡ１ドメインの一部を欠損している。欠失（切断）は、任意の長さ、たとえば１０〜３００塩基対（またはこの間の任意の値、たとえば、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、５０塩基対、７５塩基対、１００塩基対、１２５塩基対、１５０塩基対、１７５塩基対、２００塩基対、２２５塩基対、２５０塩基対、２７５塩基対、３００塩基対またはそれ以上の塩基対）であってもよい。さらに、欠失は連続した塩基対であってもよいし、あるいは、ＨＡポリペプチドの様々な領域の塩基対を除去してもよく、たとえばＮ末端の１０以上の塩基対と、分子の中央領域（たとえば、移行シグナル配列のＣ末端側の１０以上の塩基対の領域）の別の塩基対（１０〜３００またはさらにそれ以上）とを除去する。他の修飾として、以下に限定されるものではないが、リンカーの付加、ポリペプチドの１つまたは複数の残基の突然変異、および同種のものがある。ＨＡ分子の特定の修飾はＤＮＡレベルで容易に行うことができ、その後ＶＬＰのアセンブリーに必要な遺伝子と共にサブクローニングする。
【００６１】
よって、ＶＬＰ中に得られるインフルエンザ抗原タンパク質（たとえば、ＨＡ）は、任意のやり方、たとえば１つまたは複数のアミノ酸の欠失および／または１つのアミノ酸の突然変異により修飾することができる。
【００６２】
一実施形態では、ＨＡポリペプチドのＮ末端に近いアミノ酸を除去することによりインフルエンザＨＡポリペプチドを修飾する。たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、残基Ｈ２４〜Ｇ２４０を除去してもよい。任意選択的に、アミノ酸Ｄ１７〜Ｙ２３および分泌シグナル配列を保持したまま、ＨＡ１のＮＨ２末端の他の部分を除去する。保持した短い配列は、Ｃ４８３との鎖間のジスルフィド結合の形成を促進し、分子を安定化する残基Ｃ２０を維持している。ＨＡ１の残りの領域（Ｒ２４１−Ｌ３３３）は、Ｃ３１８とジスルフィド結合を形成し、折れ曲がりを保持する残基Ｃ２９４が組み込まれた一連のβシートを形成する。任意選択的に、Ｃ２９０位の残基をＧに変異させて、Ｃ２９４またはＣ３１８のどちらかとのジスルフィド結合形成の可能性を阻止する。
【００６３】
他の実施形態では、修飾（改変）ＨＡは、ジスルフィド結合を促進する残基（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｃ２０およびＣ４８３）を含むＨＡ１のＮＨ２末端（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｄ１７〜Ｐ６５）を含む。こうした修飾ＨＡポリペプチドについては、ＨＡ１の別の領域、たとえば、酵素切断部位、およびＣ５８とのジスルフィド結合の形成を促進する未変化のＣ２９０を含む、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、残基２４１〜３４６に結合していてもよい。
【００６４】
なお他の実施形態では、ＨＡ１のＮＨ２末端部分（野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｄ１７〜Ｐ６５）を含む修飾ＨＡを提供する。任意選択的に、シグナルペプチドの開裂後、このフラグメントを、たとえばペプチドリンカーによりＨＡ１の別の部分（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｍ２８１〜Ｒ３４６）に結合してもよい。どのような長さのどのようなペプチドリンカーを使用してもよい。ある種の実施形態では、ペプチドリンカーは、５〜２５アミノ酸（その間の任意の数字を含む）、たとえば１２アミノ酸のリンカー（ＤＩＧＰＧＫＶＧＹＧＰＧ、配列番号１１）である。このコンストラクトでは、ジスルフィド結合の形成を促進する残基が維持される（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｃ２０−Ｃ４８３、Ｃ２９４−Ｃ３１８およびＣ５８−Ｃ２９０の対合残基）。
【００６５】
本明細書に記載の修飾ＨＡ１ポリペプチド（フラグメント）のいずれかは、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含むＨＡ２フラグメント（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、残基Ｇ３４７〜Ｉ５６８を含むＨＡ２フラグメント））に作動可能に連結してもよい。実施例１および図を参照されたい。さらに、ＨＡ２ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸に突然変異、たとえば、タンパク質凝集を阻害または予防する残基の突然変異（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、Ｖ４１２からＤ４１２およびＬ４１９からＧ４１９）を導入してもよい。たとえば、図３を参照されたい。
【００６６】
なおさらなる実施形態では、修飾ＨＡは、分泌シグナルペプチドに結合したＨＡ２の全フラグメントからなる。このコンストラクトは、分泌シグナル配列、ＨＡ２細胞外（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、３４７〜５２０）膜貫通および細胞質（たとえば、野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、５２１〜５６８）ドメインを含む。他の改変ＨＡの場合と同様に、シグナルペプチドは転写／転位の際に除去され、ＶＬＰワクチンに取り込まれるＨＡ２構造には存在しない。ＨＡ２サブユニットのカルボキシル末端の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部は、Ｍ１タンパク質が由来するインフルエンザウイルスの類似の配列、またはＭ１アナログと最もよく相互作用する配列で置換してもよいことが明らかであろう。たとえば、図４を参照されたい。
【００６７】
別の実施形態では、タンパク質の配列内に２つ以上の１２ｍｅｒの連続塩基性タンパク質分解開裂部位を挿入することによりＨＡを修飾する。野生型ＨＡ配列のＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３の番号でいうと、好適な挿入部位の非限定的な例として、Ｐ６５とＬ６６との間および／またはＩ２８０とＭ２８１との間が挙げられる。さらに、ネイティブなタンパク質分解開裂部位（ＫＫＲ〜ＧＧＧ）の１つまたは複数の残基を変異させて、この位置での開列を防止してもよい。この分子をプロテアーゼ処理すると、ＨＡの球状頭部が除去され、ＨＡ２ステムおよび残りのＨＡ１部分により形成される保存されたエピトープが露出される。たとえば、図５Ａおよび図５Ｂを参照されたい。
【００６８】
２．ポリペプチドをコードする配列
本明細書に記載するように産生されるＶＬＰは、標準的な組換え技術を用いて調製すると都合がよい。ＶＬＰ形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入し、細胞にタンパク質を発現させると、ＶＬＰにアセンブルする。
【００６９】
ＶＬＰを形成し、および／または、ＶＬＰに取り込まれる分子（修飾抗原（たとえば、ＨＡ）ポリペプチドを含む構造および／または抗原ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリーニングするか、または遺伝子を含むことが分かっているベクターからその遺伝子を誘導することなどにより、組換え方法を用いて得ることができる。たとえば、天然または変異細胞産物をコードする配列を含むプラスミドについては、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．などの寄託機関または商業的供給源から取得することができる。目的のヌクレオチド配列を含むプラスミドは、適切な制限酵素で消化することができ、標準的な分子生物学技術を用いてそのヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメントを遺伝子導入ベクターに挿入すればよい。
【００７０】
あるいは、ｃＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのフェノール抽出およびＰＣＲなどの標準的な技術を用いて、配列を発現するかまたは配列を含む細胞から取得してもよい。たとえば、ＤＮＡの採取および単離に使用される技術について記載したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上掲を参照されたい。簡単に説明すると、目的の遺伝子を発現する細胞由来のｍＲＮＡを逆転写酵素で逆転写すればよい。次いで所望の配列の各側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて一本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅する（米国特許第４，６８３，２０２号明細書、同第４，６８３，１９５号明細書および同第４，８００，１５９号明細書を参照、さらにＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｅｒｌｉｃｈ（ｅｄ．），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）も参照）。
【００７１】
また、目的のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ合成機（たとえば、ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．から入手することができるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３９２ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いてクローニングではなく合成して作製してもよい。ヌクレオチド配列は、所望の発現産物に適切なコドンを用いて設計することができる。標準的な方法により調製された重複オリゴヌクレオチドから完全な配列を構築し、完全なコード配列に構築する。たとえば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照されたい。
【００７２】
本明細書に記載のＶＬＰは典型的には、Ｍ１、および少なくとも１つの修飾インフルエンザ（たとえば、ＨＡ抗原）、任意選択的にＭ２タンパク質をコードする配列を細胞に発現させることにより形成される。発現タンパク質は、ＶＬＰの表面に抗原性糖タンパク質が存在するＶＬＰに自己集合する。
【００７３】
ある種の実施形態では、マトリクスをコードする配列は、ＲＳＶ基質タンパク質である。他の実施形態では、マトリクスをコードする配列は、インフルエンザ基質タンパク質である。また、マトリクスをコードする配列は、１つまたは複数の突然変異（修飾）、たとえば米国特許出願公開第２００８／００３１８９５号明細書および米国特許出願公開第２００９／００２２７６２号明細書に記載されているような修飾基質タンパク質を含んでもよいことも明らかであろう。本明細書に記載のＶＬＰは、他のインフルエンザタンパク質（野生型、修飾型（ミュータント）および／または野生型もしくはミュータントのハイブリッド）をさらに含んでもよい。
【００７４】
本明細書に記載のＶＬＰに使用されるタンパク質のいずれかは、ハイブリッド（またはキメラ）タンパク質であってもよい。ポリペプチドの全部または一部が、他のウイルス由来の配列および／または他のインフルエンザ株由来の配列で置換されていてもよいことが明らかであろう。例示的な一実施形態では、ＶＬＰのタンパク質のいずれかは、膜貫通および／または細胞質尾部ドメイン、たとえばＨＡまたはＮＡなどインフルエンザタンパク質由来のドメインをコードする異種配列を含むという点でハイブリッドであってもよい。たとえば、米国特許出願公開第２００８／００３１８９５号明細書および米国特許出願公開第２００９／００２２７６２号明細書を参照されたい。
【００７５】
好ましくは、インフルエンザＶＬＰの形成に利用する配列は、天然インフルエンザポリヌクレオチド配列に対して約６０％〜８０％（または６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％および７９％などその間の任意の値）の配列同一性を示し、一層好ましくはその配列は、天然ポリヌクレオチド配列に対して約８０％〜１００％（または８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％などその間の任意の値）の配列同一性を示す。
【００７６】
本明細書に記載の配列のいずれかは、他の配列をさらに含んでもよい。たとえば、ワクチンの効力をさらに高めるため、ハイブリッド分子を発現させ、サブウイルス構造に取り込ませる。これらのハイブリッド分子は、ＤＮＡレベルで基質タンパク質遺伝子をコードする配列をアジュバントまたは免疫調節部分をコードする配列と結合することにより作製する。サブウイルス構造の形成の際に、これらのハイブリッドタンパク質は、Ｍ１または任意のＭ２がアジュバント分子を有するかどうかに応じて粒子内または粒子上に取り込まれる。１つまたは複数のポリペプチド免疫調節ポリペプチド（たとえば、下記に詳述するアジュバント）がＶＬＰの本明細書に記載の配列に取り込まれると、効力が高まり、したがって防御免疫応答の刺激に必要な抗原の量を減少させる可能性がある。あるいは、下記のように、本明細書に記載の配列からＶＬＰを産生した後、ＶＬＰ含有組成物に１つまたは複数の他の分子（ポリペプチドまたは小分子）を含めてもよい。
【００７７】
これらのサブウイルス構造体は、感染性ウイルス核酸を含まず、感染性ではないため、化学的な不活性化の必要がない。化学的処理を行わなければ、ネイティブなエピトープおよびタンパク質のコンフォメーションが維持され、ワクチンの免疫原性特性が高まる。
【００７８】
本明細書に記載の配列は、任意の組み合わせで相互に作動可能に連結してもよい。たとえば、１つまたは複数の配列を同じプロモーターおよび／または異なるプロモーターから発現させてもよい。下記のように、各配列を１つまたは複数のベクターに組み込んでもよい。
【００７９】
２．発現ベクター
ＶＬＰに取り込まれるように、所望のポリペプチドをコードする配列を含むコンストラクトを合成したら、コンストラクトを任意の好適な発現用ベクターまたはレプリコンにクローニングしてもよい。多くのクローニングベクターが当業者に公知であり、当業者であれば、発現に関する本明細書の教示内容および当該技術分野において公知の情報に照らして任意の特定の宿主細胞型に適切なベクターおよび制御エレメントを容易に選択することができる。一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，上掲またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，上掲を参照されたい。
【００８０】
本明細書に記載するようにＶＬＰにアセンブルする配列の発現に使用できるベクターの非限定的な例として、ウイルス系ベクター（たとえば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス）、バキュロウイルスベクター（実施例を参照されたい）、プラスミドベクター、非ウイルスベクター、哺乳動物ベクター、哺乳動物の人工染色体（たとえば、リポソーム、粒子状キャリア等）およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００８１】
発現ベクターは典型的には、コード配列、および好適な宿主でのコード領域の発現を可能にする発現制御エレメントを含む。制御エレメントは一般には、プロモーター、翻訳開始コドンのほか、翻訳および転写終結配列、ならびにインサートをベクターに導入するための挿入部位を含む。翻訳制御エレメントについては、Ｍ．Ｋｏｚａｋが概説している（たとえば、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ７（８）：５６３−５７４，１９９６；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７６（９）：８１５−８２１，１９９４；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０８（２）：２２９−２４１，１９８９；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，ａｎｄ Ｓｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ６０：３６０−３７５，１９７９）。
【００８２】
たとえば、哺乳動物細胞の典型的な発現プロモーターには特に、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーターなどのＣＭＶプロモーター（ＣＭＶプロモーターはイントロンＡを含んでもよい）、ＲＳＶ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター（ＭＭＬＶ−ＬＴＲ）、ＦＩＶ−ＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターがある。また、哺乳動物の発現にはマウスのメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターなど他の非ウイルスプロモーターも使用される。典型的には、転写終結配列およびポリアデニル化配列も存在し、翻訳終止コドンの３’側に位置する。好ましくは、コード配列の５’側に位置する、翻訳の開始を最適化するための配列も存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．，上掲に記載されているようなＳＶ４０に由来するもののほか、ウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。また、本明細書に記載するようなコンストラクトに、スプライス供与部位およびスプライス受容部位を含むイントロンを設計してもよい（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）。
【００８３】
また、本明細書では、哺乳動物のコンストラクトの発現レベルを高めるためエンハンサーエレメントを使用してもよい。例として、Ｄｉｊｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されているようなＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されているようなラウス肉腫ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター、およびＢｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されているようなヒトＣＭＶ由来のエレメント、たとえばＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）が挙げられる。
【００８４】
１つまたは複数のベクターが、ＶＬＰに取り込まれるタンパク質をコードする１つまたは複数の配列を含んでもよいことが明らかであろう。たとえば、１つのベクターが、ＶＬＰに見出されるタンパク質をすべてコードする配列を有していてもよい。あるいは、複数のベクターを使用してもよい（たとえば、各々が１つのポリペプチドをコードする配列をコードする複数のコンストラクト、または各々が１つまたは複数のポリペプチドをコードする配列をコードする複数のコンストラクト）。１つのベクターが複数のポリペプチドをコードする配列を含む実施形態では、それらの配列は、同じベクター内で同一の転写制御エレメント（たとえば、プロモーター）に作動可能に連結しても、または異なる転写制御エレメント（たとえば、プロモーター）に作動可能に連結してもよい。さらに、ベクターは、別の遺伝子発現制御配列、たとえば導入遺伝子のサイレンシングを防止し、染色体の組み込み部位と関係なく一定かつ安定した高レベルの遺伝子発現をもたらすクロマチンオープニングエレメントを含んでもよい。これは、ハウスキーピング遺伝子に近接して位置し、ベクター内で染色体の導入遺伝子の位置に関係なく、組み込まれた導入遺伝子周囲に転写活性なオープンクロマチン環境を作り、転写およびタンパク質発現を最大化するＤＮＡ配列モチーフである。
【００８５】
さらに、非インフルエンザタンパク質をコードする１つまたは複数の配列、たとえば、以下に限定されるものではないが、免疫調節分子（たとえば、以下に記載するアジュバント）、たとえば、免疫調節オリゴヌクレオチド（たとえば、ＣｐＧｓ）、サイトカイン、無毒化細菌毒素および同種のものを含むおよび／またはコードする配列を発現させ、ＶＬＰに取り込ませもよい。
【００８６】
３．ＶＬＰの産生
上述のように、真核宿主細胞に発現したインフルエンザタンパク質は、非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己集合することが明らかになっている。これを踏まえ、次に本明細書に記載の配列および／またはベクターを使用して適切な宿主細胞を形質転換する。本明細書に記載のＶＬＰを形成するタンパク質をコードするコンストラクトは、様々な異なる細胞型、以下に限定されるものではないが、昆虫細胞、真菌（酵母）細胞および哺乳動物細胞を用いてインフルエンザＶＬＰを産生するための効率的な手段となる。
【００８７】
好ましくは、サブウイルス構造ワクチンは、トランスフェクション、連続細胞株の樹立（標準的なプロトコルを用いる）および／または当業者に公知の目的のインフルエンザ遺伝子を有するＤＮＡコンストラクトの感染を行ってから、真核細胞に産生する。サブウイルス構造の形成に必要なタンパク質の発現レベルは、選択した遺伝子の転写を誘導する真核プロモーターまたはウイルスプロモーターの配列最適化により最大化する。サブウイルス構造ワクチンは培養基に放出され、そこから精製され、その後ワクチンとして製剤化される。サブウイルス構造体は感染性でなく、したがってＶＬＰの不活性化は、一部の死菌ウイルスワクチンと同様に必要ない
【００８８】
本明細書に記載するような配列から発現したインフルエンザポリペプチドは、抗原性糖タンパク質を表面に提示するＶＬＰに自己集合する能力があるため、こうしたＶＬＰは所望の配列を共導入することにより多くの宿主細胞で産生することができる。（たとえば、１つまたは複数の発現ベクター内の）配列は、様々に組み合わせて宿主細胞に安定におよび／または一過性に組み込んでもよい。
【００８９】
好適な宿主細胞には、細菌細胞、哺乳動物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）細胞があるが、これに限定されるものではない。
【００９０】
たとえば、多くの哺乳動物細胞株が当該技術分野において公知であり、初代細胞のほか、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手可能な不死化細胞株、たとえば、以下に限定されるものではないが、ＭＤＣＫ、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（たとえば、ＳＢ２０細胞）、およびＣＥＭＸ１７４（こうした細胞株は、たとえばＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可能）が挙げられる。
【００９１】
同様に、本発現コンストラクトには、細菌宿主、たとえばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびストレプトコッカス・エスピーピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）も使用される。
【００９２】
本開示に有用な酵母宿主として特に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クリベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・ギレリモンディ（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられる。真菌宿主には、たとえば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）がある。
【００９３】
バキュロウイルスベクターと使用される昆虫細胞として特に、アエデス・アエギプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）およびトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）が挙げられる。Ｌａｔｈａｍ ＆ Ｇａｌａｒｚａ（２００１） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１３）：６１５４−６１６５；Ｇａｌａｒｚａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｖｉｒａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１）：２４４−５１；ならびに米国特許出願公開第２００５／５０１８６６２１号明細書および米国特許出願公開第２００６／０２６３８０４号明細書を参照されたい。
【００９４】
上述の配列の１つまたは複数を発現する細胞株は、本明細書に記載された開示を踏まえ、ＶＬＰのタンパク質をコードする１つまたは複数の発現ベクターコンストラクトを安定に組み込むことにより容易に作製することができる。安定に組み込まれたインフルエンザ配列の発現を調節するプロモーターは構成的でも、または誘導的でもよい。こうして、基質タンパク質の１つまたは複数の両方を安定に組み込み、本明細書に記載の配列（たとえば、ハイブリッドタンパク質）を宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させると、抗原性糖タンパク質を提示する複製しないウイルス粒子が形成される。
【００９５】
ある種の実施形態では、抗原性の異なる２つ以上のインフルエンザタンパク質を安定に発現する哺乳動物細胞株を作製する。こうした細胞株に、Ｍ１、Ｍ２および／または別の糖タンパク質（たとえば、同一もしくは異なるウイルス株由来）をコードする配列を導入して本明細書に記載するようなＶＬＰを産生する。あるいは、Ｍ１タンパク質（および、任意選択的にＭ２）を安定に産生する細胞株を作製し、選択した株由来のインフルエンザ抗原タンパク質をコードする配列を細胞株に導入し、所望の抗原性糖タンパク質を提示するＶＬＰを産生してもよい。
【００９６】
ＶＬＰ産生細胞株が由来する親細胞株は、たとえば、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、酵母細胞株、細菌細胞株など上述のどのような細胞から選択してもよい。好ましい実施形態では、細胞株は哺乳動物細胞株（たとえば、２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＭＲＣ−５、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０および骨髄腫細胞）である。哺乳動物細胞を用いてインフルエンザＶＬＰを産生すると、（ｉ）ＶＬＰが形成され、（ｉｉ）適切な翻訳後修飾（グリコシル化、パルミチル化）および出芽が起こり、（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞汚染物質が存在せず、（ｉｖ）精製しやすくなる。
【００９７】
また、細胞株を作製するだけでなく、インフルエンザをコードする配列を宿主細胞に一過性に発現させてもよい。好適な組換え発現宿主細胞系には、当該技術分野において周知の細菌発現系、哺乳動物発現系、バキュロウイルス／昆虫発現系、ワクシニア発現系、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）発現系、アルファウイルス属（たとえば、シンドビス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ））発現系、哺乳動物発現系、酵母発現系およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）発現系があるが、これに限定されるものではない。特に好ましい発現系は、哺乳動物細胞株、ワクシニア系、シンドビス系、昆虫系および酵母系である。
【００９８】
多くの好適な発現系が市販されており、たとえば、バキュロウイルス発現（Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）；Ｂｅａｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：３７８（１９９１）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．））、ワクシニア発現系（Ｅａｒｌ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ」Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．），Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１３５，８５５号明細書、１９９２年８月４日発行）、細菌を用いた発現（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ ＰＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、酵母を用いた発現（本明細書に援用するＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．ａｎｄ Ｔｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国再発行特許第３５，７４９号明細書、１９９８年３月１７日発行；本明細書に援用するＳｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，米国特許第５，６２９，２０３号明細書、１９９７年５月１３日発行；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，６２（１−２）：７９−９３（１９９２）；Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ ８（６）：４２３−４８８（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（１９９０）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４（１９９１））、哺乳動物細胞を用いた発現（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒｏｕｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．；たとえば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６（１９８３）；１９８３，Ｌａｕ，Ｙ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５（１９８４）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，ｐｐ５３７−５６６．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．（１９９１））、ならびに植物細胞を用いた発現（植物クローニングベクター，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ−Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．，およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．；Ｈｏｏｄ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６）；Ｎａｇｅｌ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６７：３２５（１９９０）；Ａｎ，ｅｔ ａｌ．，「Ｂｉｎａｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、およびＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ３：ｌ−１９（１９８８）；Ｍｉｋｉ，Ｂ．Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．２４９−２６５における他のもの、およびＰｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｈｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｉｅｎ，Ａｕｓｔｒｉａ，（１９８７）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐ．Ｇ．Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，１９９７；Ｍｉｇｌａｎｉ，Ｇｕｒｂａｃｈａｎ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｈｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ，１９９７）における他のものが挙げられる。
【００９９】
サブウイルス構造ワクチンの形成に必要なタンパク質をコードする変異遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、その後必要なレベルで発現させると、サブウイルス構造ワクチンがアセンブルし、次いで細胞表面から培養基に放出される（図７）。
【０１００】
選択した発現系および宿主に応じて、粒子形成ポリペプチドが発現してＶＬＰが形成され得る条件下で、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることによりＶＬＰを産生する。どの増殖条件を選択するのがよいかは当該技術分野の技術の範囲内である。ＶＬＰを形成し、細胞内に維持する場合、細胞を溶解してもＶＬＰを実質的にインタクトな状態に維持する化学的、物理的または機械的手段を用いて細胞を破壊する。こうした方法は当業者に公知であり、たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ａｎｇａｌ，Ｅｄｓ．，１９９０）に記載されている。あるいは、ＶＬＰを分泌させ、周囲の培養基から回収してもよい。
【０１０１】
次いで密度勾配遠心分離、たとえば、スクロースグラジエント、ＰＥＧ沈殿、ペレット化および同種のもの（たとえば、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６９２９−６９３６を参照されたい）のほか、標準的な精製技術、たとえば、イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーなどにより、粒子をその完全性を失わないようにする方法を用いて単離する（または実質的に精製する）。
【０１０２】
組成物
本明細書に記載するように産生されるＶＬＰを使用して被検体に投与すると、免疫応答を惹起することができる。上記で論じたように、ＶＬＰは、様々な抗原（たとえば、１つまたは複数の株または分離株由来の１つまたは複数の修飾インフルエンザ抗原）を含んでもよい。精製されたＶＬＰは、通常ワクチン組成物の形態で脊椎動物被検体に投与してもよい。また、混合ワクチンを使用してもよく、こうしたワクチンは、たとえば、インフルエンザもしくは他の生物に由来する他のサブユニットタンパク質および／またはこうした抗原をコードする遺伝子送達ワクチンを含む。
【０１０３】
ＶＬＰ免疫刺激（またはワクチン）組成物は、様々な賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調節剤および同種のものを含んでもよい。免疫刺激組成物は、免疫学的応答を惹起するのに十分な量のＶＬＰ／抗原を含む。適切な有効量は、当業者であれば決定することができる。こうした量は、通常の試験で決定できる比較的広い範囲となり、一般にＶＬＰ／抗原約０．１μｇ〜約１０ｍｇ（またはそれ以上）、一層好ましくは約１μｇ〜約３００μｇ程度の量である。
【０１０４】
サブウイルス構造ワクチンは細胞培養基から精製し、適切な緩衝液とａ）防腐剤または抗生物質；ｂ）タンパク質または有機化合物を含む安定剤；ｃ）ワクチンの効力を高め、免疫応答（液性および細胞性）を調節するアジュバントまたは免疫調節剤；またはｄ）免疫系の特定の細胞に対するワクチン抗原の提示を増強する分子などの添加剤と共に製剤化する。このワクチンは、調製物の適切な保管を図り、有効期間を最大化するため凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））形態で調製してもよい。これにより、免疫原性、効力および有効性を維持したまま長期間にわたりワクチンの貯蔵が可能になる。
【０１０５】
本明細書に記載の組成物には、キャリアが任意選択的に存在する。キャリア自体は典型的には、組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導しない分子である。好適なキャリアは典型的には、大きくてゆっくりと代謝される巨大分子、たとえばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）、および不活性ウイルス粒子である。粒子状キャリアの例として、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来するもののほか、ポリ（ラクチド）に由来する微小粒子およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に由来する微小粒子（ＰＬＧと呼ばれる）がある。たとえば、Ｊｅｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ Ｊ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｄ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照されたい。こうしたキャリアは、当業者によく知られている。
【０１０６】
加えて、これらのキャリアは、免疫刺激薬（「アジュバント」）の役割を果たしてもよい。例示的なアジュバントとして、（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、たとえば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等；（２）水中油型エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（下記を参照されたい）または細菌の細胞壁成分など他の特定の免疫刺激薬を含むあるいは含まない）、たとえば（ａ）５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５（必須ではないが、任意選択的に様々な量のＭＴＰ−ＰＥ（下記を参照されたい）を含む）を含み、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏ ｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）などのマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロンの粒子に製剤化されたＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号パンフレット）、（ｂ）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照されたい）を含み、サブミクロンのエマルジョンに高圧乳化するかまたはボルテックスしてより大きな粒度のエマルジョンにしたＳＡＦおよび（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリ脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群の１つまたは複数、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘｕ）の細菌の細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；（３）Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．）などのサポニンアジュバントを使用してもよいし、またはそれからＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）など粒子を生成してもよい；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン、たとえばインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２等）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、βケモカイン（ＭＩＰ、１−α、１−β Ｒａｎｔｅｓ等）；（６）細菌のＡＤＰリボシル化トキシンの無毒化ミュータント、たとえばコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３（６３番目の野生型アミノ酸がリジンで置換されている）ＬＴ−Ｒ７２（７２番目の野生型アミノ酸がアルギニンで置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（１０９番目の野生型アミノ酸がセリンで置換されている）およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（９番目の野生型アミノ酸がリジンで置換され、１２９番目の野生型アミノ酸がグリシンで置換されている）（たとえば、国際公開第９３／１３２０２号パンフレットおよび国際公開第９２／１９２６５号パンフレットを参照されたい）；ならびに（７）免疫刺激薬として働き組成物の有効性を高める他の物質があるが、これに限定されるものではない。
【０１０７】
ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アクテイル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルアトム（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルアトミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−フイドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）等があるが、これに限定されるものではない。
【０１０８】
本明細書での使用に好適な免疫調節分子の例として、上述および以下のアジュバントがある：ＩＬ−１およびＩＬ−２（Ｋａｒｕｐｉａｈ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４４：２９０−２９８、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１７１６−１７３３、Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４、および米国特許第４，７３８，９２７号明細書−）；ＩＬ−３およびＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ ５７：５０３−５１２、Ｇｏｌｕｍｂｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：７１３−７１６、および米国特許第５，０１７，６９１号明細書）；ＩＬ−５およびＩＬ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：４１１６−４１２１、および国際公開第９０／０６３７０号パンフレット）；ＩＬ−７（米国特許第４，９６５，１９５号明細書）；ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｓｕｍｍｅｒ １９９４）；ＩＬ−１４およびＩＬ−１５；αインターフェロン（Ｆｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｄｒｕｇｓ ４２：７４９−７６５、米国特許第４，８９２，７４３号明細書および同第４，９６６，８４３号明細書、国際公開第８５／０２８６２号パンフレット、Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８４：３１６−３２０、Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．７８：３８７−３９４、Ｔｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２０４６−２０５０およびＦａｋｔｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：８６７−８７２）；β−インターフェロン（Ｓｅｉｆ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６６４−６７１）；γ−インターフェロン（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９４５６−９４６０，Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：７８２０−７８２５，Ｍａｉｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０：３４−４２および米国特許第４，７６２，７９１号明細書および同第４，７２７，１３８号明細書）；Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４，９９９，２９１号明細書および同第４，８１０，６４３号明細書）；ＧＭ−ＣＳＦ（国際公開第８５／０４１８８号パンフレット）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４４：９４２−９５１）；ＣＤ３（Ｋｒｉｓｓａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６：２５８−２６６）；ＩＣＡＭ−１（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３８：５１２−５１４，Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３１：６２４−６２７）；ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３（Ｗａｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：９２３−９３２）；ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Β７．１−β２−ミクログロブリン（Ｐａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２２５３−２２５７）；カルネキシンなどのシャペロン；ならびにＭＨＣ結合トランスポータータンパク質またはそのアナログ（Ｐｏｗｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：５２８−５３１）。また、免疫調節因子は、これらの分子のアゴニストでも、アンタゴニストでも、またはリガンドでもよい。たとえば、受容体の可溶形態は、多くの場合、因子自体の変異形態と同様にこれらの種類の因子のアンタゴニストとして挙動することがある。
【０１０９】
上記の物質をコードする核酸分子のほか、本発明に使用するのに有利な他の核酸分子については、たとえば、アメリカンタイプカルチャーコレクションなどの寄託機関、またはＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）などの商業的供給源のような様々な供給源から容易に取得することができる。代表的な例として、ＢＢＧ１２（１２７アミノ酸の成熟タンパク質を含むＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む）、ＢＢＧ６（γインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３９６５６（ＴＮＦをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号２０６６３（α−インターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３１９０２、３１９０２および３９５１７（β−インターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６７０２４（インターロイキン−１ｂをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３９４０５、３９４５２、３９５１６、３９６２６および３９６７３（インターロイキン−２をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５９３９９、５９３９８および６７３２６（インターロイキン−３をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５７５９２（インターロイキン−４をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５９３９４および５９３９５（インターロイキン−５をコードする配列を含む）、ならびにＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６７１５３（インターロイキン−６をコードする配列を含む）が挙げられる。
【０１１０】
上記のポリペプチドの１つまたは複数をコードするプラスミドは適切な制限酵素で消化することができ、目的の特定の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは標準的な分子生物学技術を用いて遺伝子導入ベクター（たとえば、上記のような発現ベクター）に挿入することができる。（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上掲、またはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照されたい）。
【０１１１】
投与
ＶＬＰ、およびそうしたＶＬＰを含む組成物は、たとえば、非経口注射（たとえば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内または間質の組織腔）、または直腸投与、経口投与（たとえば錠剤、噴霧剤）、経膣投与、局所投与、経皮投与（たとえば国際公開第９９／２７９６１号パンフレットを参照）または経皮投与（たとえば国際公開第０２／０７４２４４号パンフレットおよび国際公開第０２／０６４１６２号パンフレット）、経鼻投与（たとえば国際公開第０３／０２８７６０号パンフレット）、点眼投与、点耳投与、経肺投与または他の粘膜投与など任意の送達方法で被検体に投与してもよい。同一または異なる経路で反復投与を行ってもよい。好ましい実施形態では、投与を経鼻で行う。
【０１１２】
ＶＬＰ（およびＶＬＰを含む組成物）は、他のワクチンの送達より前に投与しても、それと同時に投与しても、またはそれより後に投与してもよい。また、ＶＬＰの投与部位は、投与される他のワクチン組成物と同一でも、または異なってもよい。
【０１１３】
ＶＬＰ組成物による投薬処置は単回投与スケジュールでも、または反復投与スケジュールでもよい。反復投与スケジュールは、ワクチンの一次接種コースで１〜１０回投与を行い、次いでその後免疫応答を維持および／または増強するように選択した時間間隔でさらに投与する、たとえば二次投与の場合１〜４ヶ月で投与し、さらに必要な場合、それに続いて後数ヶ月後投与するスケジュールである。また、投薬処置は、少なくともある程度、その方式の効力、利用したワクチン送達、その被検体の必要性により決定され、開業医の判断により左右されることがある。
【０１１４】
本明細書で言及した特許、特許出願および刊行物はすべて、その全体を本明細書に援用する。
【０１１５】
理解しやすいように図面および例によりある程度詳細に開示を行ってきたが、本開示の精神または範囲を逸脱することなく様々な変更および修正を実施できることが当業者には明らかであろう。このため、前述の開示および下記の例は、限定的に解釈してはならない。したがって、開示された修飾について所定の野生型ＨＡ配列（たとえば、ＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ６ＤＱ３３）を用いて番号付けを行ったが、対応する突然変異を他のＨＡ配列において容易に作製することができることが明らかであろう。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：切断して再設計した改変ＨＡ分子の作製
様々な修飾ＨＡ分子を以下の通り設計した。
【０１１７】
ＨＡ１フラグメントの一部（Ｈ２３〜Ｇ２４０の２１７ａａ）を除去することにより、改変ＨＡ分子を作製した。その際、分泌シグナル配列の除去後、ＮＨ２末端のアミノ酸Ｄ１７〜Ｙ２３を維持した。この短い配列は、Ｃ４８３との鎖間のジスルフィド結合の形成を促進し、分子を安定化する残基Ｃ２０を保持していた。ＨＡ１の残りの領域Ｒ２４１〜Ｌ３３３は、Ｃ３１８とジスルフィド結合を形成し、折れ曲がりを保持する残基Ｃ２９４が組み込まれた一連のβシートを形成する。さらに、Ｃ２９０位の残基をＧに変異させて、Ｃ２９４またはＣ３１８のどちらかとのジスルフィド結合形成の可能性を阻止した。このＨＡ１フラグメントは、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含む全ＨＡ２フラグメントと遺伝的に連鎖していた。
【０１１８】
得られたコンストラクトを「１ＴＡ改変ＨＡ」と名付け、図１に示す。このコンストラクトのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、以下の通りである。
改変ＨＡ １ＴＡのヌクレオチド配列（配列番号１）：
ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＧＴＴＡＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＧＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＡＡＣＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡ
改変ＨＡ−１ＴＡのアミノ酸配列（配列番号２）：
ＭＥＫＩＶＬＬＦＡＩＶＳＬＶＫＳＤＱＩＣＩＧＹＲＭＥＦＦＷＴＩＬＫＰＮＤＡＩＮＦＥＳＮＧＮＦＩＡＰＥＹＡＹＫＩＶＫＫＧＤＳＴＩＭＫＳＥＬＥＹＧＮＧＮＴＫＣＱＴＰＭＧＡＩＮＳＳＭＰＦＨＮＩＨＰＬＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＮＲＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＱＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＳＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫＭＮＴＱＦＥＡＶＧＲＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＭＥＤＧＦＬＤＶＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＤＫＶＲＬＱＬＲＤＮＡＫＥＬＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＱＹＳＥＥＡＲＬＫＲＥＥＩＳＧＶＫＬＥＳＩＧＩＹＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＶＡＧＬＳＬＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ。
【０１１９】
Ｃ４８３とのジスルフィド結合を促進するＣ２０と、高度に保存されたエピトープの形成に寄与する部分とを含むＨＡ１のＮＨ２末端（Ｄ１７〜Ｐ６５）を包含するように、もう１つの改変ＨＡを設計した。これは、酵素切断部位、およびＣ５８とのジスルフィド結合の形成を促進する未変化のＣ２９０を含む残りのＨＡ１部分２４１〜３４６位に結合していた。このＨＡ１フラグメントは、膜貫通および細胞質ドメインを含む全ＨＡ２フラグメント（Ｇ３４７〜Ｉ５６８）と遺伝的に連鎖していた。
【０１２０】
このコンストラクトを改変ＨＡ「２ＴＡ」と名付け、図２に示す。ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を下記に示す。
改変ＨＡ−２ＴＡのヌクレオチド配列（配列番号３）：
ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＧＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡ
改変ＨＡ−２ＴＡのアミノ酸配列（配列番号４）：
ＭＥＫＩＶＬＬＦＡＩＶＳＬＶＫＳＤＱＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＥＱＶＤＴＩＭＥＫＮＶＴＶＴＨＡＱＤＩＬＥＫＫＨＮＧＫＬＣＤＬＤＧＶＫＰＲＭＥＦＦＷＴＩＬＫＰＮＤＡＩＮＦＥＳＮＧＮＦＩＡＰＥＹＡＹＫＩＶＫＫＧＤＳＴＩＭＫＳＥＬＥＹＧＮＣＮＴＫＣＱＴＰＭＧＡＩＮＳＳＭＰＦＨＮＩＨＰＬＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＮＲＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＱＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＳＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫＭＮＴＱＦＥＡＶＧＲＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＭＥＤＧＦＬＤＶＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＤＫＶＲＬＱＬＲＤＮＡＫＥＬＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＱＹＳＥＥＡＲＬＫＲＥＥＩＳＧＶＫＬＥＳＩＧＩＹＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＶＡＧＬＳＬＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【０１２１】
もう１つの改変ＨＡを図３に示す。このコンストラクトは、シグナルペプチドの開裂後、設計された１２ａａのペプチドリンカー（ＤＩＧＰＧＫＶＧＹＧＰＧ、配列番号１１）を介してＨＡ１の別の部分（Ｍ２８１〜Ｒ３４６）に結合したＨＡ１のＮＨ２末端部分（Ｄ１７〜Ｐ６５）を含む。このコンストラクトでは、ジスルフィド結合の形成を促進するＣ２０−Ｃ４８３、Ｃ２９４−Ｃ３１８およびＣ５８−Ｃ２９０の対合残基が維持されている。全ＨＡ２領域（Ｇ３４７〜Ｉ５６８）は、ＨＡ１フラグメントと遺伝的に連鎖していた。また、ＨＡ２にはＶ４１２からＤ４１２へ、およびＬ４１９からＧ４１９への突然変異を導入してタンパク質凝集を防止した。
【０１２２】
このコンストラクトは「３ＴＡ改変ＨＡ」とし、模式図を図３に示す。３ＴＡ分子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を下記に示す。
改変ＨＡ−３ＴＡのヌクレオチド配列（配列番号５）：
ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＴＡＧＧＡＴＡＣＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＣＧＡＣＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡ
改変ＨＡ−３ＴＡのアミノ酸配列（配列番号６）：
ＭＥＫＩＶＬＬＦＡＩＶＳＬＶＫＳＤＱＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＥＱＶＤＴＩＭＥＫＮＶＴＶＴＨＡＱＤＩＬＥＫＫＨＮＧＫＬＣＤＬＤＧＶＫＰＤＩＧＰＧＫＶＧＹＧＰＧＭＫＳＥＬＥＹＧＮＣＮＴＫＣＱＴＰＭＧＡＩＮＳＳＭＰＦＨＮＩＨＰＬＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＮＲＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＱＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＳＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫＭＮＴＱＦＥＡＤＧＲＥＦＮＮＧＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＭＥＤＧＦＬＤＶＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＤＫＶＲＬＱＬＲＤＮＡＫＥＬＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＱＹＳＥＥＡＲＬＫＲＥＥＩＳＧＶＫＬＥＳＩＧＩＹＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＶＡＧＬＳＬＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【０１２３】
修飾インフルエンザＨＡのもう１つの例を図４に示す（「４ＴＡ」と名付けた）。このコンストラクトは、ＨＡ２フラグメント（細胞外領域（残基３４７〜５２０）、および分泌シグナルペプチドに結合した膜貫通および細胞質ドメイン（残基５２１〜５６８）ドメインを含む。シグナルペプチドは転写／転位の際に除去され、ＶＬＰワクチンに取り込まれるＨＡ２構造には存在しない（他の改変ＨＡの場合と同様）。さらに、ＨＡ２サブユニットのカルボキシル末端の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部は任意選択的に、Ｍ１タンパク質が由来するインフルエンザウイルスの類似の配列、またはＭ１アナログと最もよく相互作用する配列で置換されている。こうした分子のコンタクトは粒子のアセンブリーおよび放出を増強する。４ＴＡ分子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を下記に示す。
改変ＨＡ−４ＴＡのヌクレオチド配列（配列番号７）：
ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡ
改変ＨＡ−４ＴＡのアミノ酸配列（配列番号８）：
ＭＥＫＩＶＬＬＦＡＩＶＳＬＶＫＳＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＱＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＳＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫＭＮＴＱＦＥＡＶＧＲＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＭＥＤＧＦＬＤＶＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＤＫＶＲＬＱＬＲＤＮＡＫＥＬＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＱＹＳＥＥＡＲＬＫＲＥＥＩＳＧＶＫＬＥＳＩＧＩＹＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＶＡＧＬＳＬＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【０１２４】
もう１つの例では、タンパク質の配列内に１つまたは複数の開裂部位を挿入することによりインフルエンザＨＡポリペプチドを改変する。図５Ａ（「５ＴＡ」と名付けた）に示すように、例示的な挿入部位として、Ｐ６５とＬ６６との間および／またはＩ２８０とＭ２８１との間が挙げられる。図５はまた例示的な１２残基の開裂部位（たとえば、１２ｍｅｒの連続塩基性タンパク質分解開裂部位）を示す。また、ネイティブなタンパク質分解開裂部位（ＫＫＲ〜ＧＧＧ）の３残基の突然変異を含む別の変化を加えて、この位置での開裂を防止してもよい。この分子をプロテアーゼ処理すると（図５Ｂを参照されたい）、ＨＡの球状頭部が除去され、ＨＡ２ステムおよび残りのＨＡ１部分により形成される保存されたエピトープが露出される。５ＴＡ分子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を下記に示す。
改変ＨＡ−５ＴＡのヌクレオチド配列（配列番号９）：
ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＴＴＧＴＡＧＣＧＴＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡＴＧＴＧＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＧＧＡＡＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＣＡＧＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＣＴＧＴＴＡＣＣＣＡＧＧＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＧＣＡＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＡＡＡＧＴＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＧＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＴＧＴＣＣＡＴＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＴＡＣＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＴＡＡＴＡＣＣＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＧＧＴＡＣＴＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＣＣＴＡＴＡＴＴＴＣＣＧＴＴＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＴＡＧＣＴＡＣＴＡＧＡＴＣＣＡＡＡＧＴＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＧＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡ
改変ＨＡ−５ＴＡのアミノ酸配列（配列番号１０）：
ＭＥＫＩＶＬＬＦＡＩＶＳＬＶＫＳＤＱＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＥＱＶＤＴＩＭＥＫＮＶＴＶＴＨＡＱＤＩＬＥＫＫＨＮＧＫＬＣＤＬＤＧＶＫＰＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＬＩＬＲＤＣＳＶＡＧＷＬＬＧＮＰＭＣＤＥＦＩＮＶＰＥＷＳＹＩＶＥＫＡＮＰＶＮＤＬＣＹＰＧＤＦＮＤＹＥＥＬＫＨＬＬＳＲＩＮＨＦＥＫＩＱＩＩＰＫＳＳＷＳＳＨＥＡＳＬＧＶＳＳＡＣＰＹＱＧＫＳＳＦＦＲＮＶＶＷＬＩＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＰＮＤＡＡＥＱＴＫＬＹＱＮＰＴＴＹＩＳＶＧＴＳＴＬＮＱＲＬＶＰＲＩＡＴＲＳＫＶＮＧＱＳＧＲＭＥＦＦＷＴＩＬＫＰＮＤＡＩＮＦＥＳＮＧＮＦＩＡＰＥＹＡＹＫＩＶＫＫＧＤＳＴＩＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＭＫＳＥＬＥＹＧＮＣＮＴＫＣＱＴＰＭＧＡＩＮＳＳＭＰＦＨＮＩＨＰＬＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＮＲＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＱＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＳＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳＩＩＤＫＭＮＴＱＦＥＡＶＧＲＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＭＥＤＧＦＬＤＶＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＤＫＶＲＬＱＬＲＤＮＡＫＥＬＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＱＹＳＥＥＡＲＬＫＲＥＥＩＳＧＶＫＬＥＳＩＧＩＹＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＶＡＧＬＳＬＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【０１２５】
これらの改変構造は典型的には、ＨＡ１ドメインの大部分を欠損し、イムノドミナントエピトープの大半を除去してあるが、ＨＡ１およびＨＡ２サブユニットの代替構造に結合した移行シグナル配列を含む短いＮＨ２末端領域を維持している。ＨＡ分子の特定の修飾をＤＮＡレベルで行い、その後ＶＬＰのアセンブリーに必要な遺伝子の組み合わせと共にサブクローニングする。
【０１２６】
真核発現系において修飾ＨＡ遺伝子単独で、またはＭ１（または機能的に類似の基質タンパク質）、Ｍ２、ＮＡおよびＮＰと共に、すなわち組み合わせて修飾ＨＡ遺伝子を合成すると、その表面に様々な修飾ＨＡ分子を提示する小胞粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）が産生される。修飾ＨＡの構造により、様々なインフルエンザウイルスサブタイプおよび抗原変異体に対して強力で広い防御免疫応答をこの構造内で引き起こすことができる保存されたサブドミナントエピトープの抗原プロファイルが示される。
【０１２７】
したがって、このワクチンは、新たなミュータントに効果がある広範囲の保護作用を与え、その有効性を長期間持続させる。上記に詳述したように、適切なＶＬＰを産生して評価する様々な方法が当業者に公知である。たとえば、修飾ＨＡをコードするＤＮＡ配列などＶＬＰの形成に必要な遺伝子は、真核細胞を用いて発現させることができる。ＶＬＰの産生には、以下に限定されるものではないが、プラスミド、ベクター、ウイルス、または単一もしくは複数の遺伝子を細胞に導入して発現させる他の方法を用いるバキュロウイルス／昆虫細胞系、一過性にまたは安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞または原核細胞など他の組換え発現系を使用する。産生されたＶＬＰについて、イムノドミナント領域およびサブドミナント領域を認識する抗体との反応性を試験する。保存されたサブドミナントエピトープを認識する抗体と反応する修飾ＨＡを有するＶＬＰ構造体を使用して動物を免役し、野生型のインタクトなウイルスに対する血清の中和能、およびマウスおよびフェレットの攻撃ウイルスに対して広い防御免疫応答を惹起する能力を評価する。
【０１２８】
また上記のように、記載したＶＬＰワクチン（本明細書に記載するようなＡ型およびＢ型ウイルスの修飾ＨＡとアセンブルしたＶＬＰを用いて製剤化したもの）でヒトまたはインフルエンザに対して感受性がある他の種を免疫化すると、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスのサブタイプおよび抗原変異体ならびにそれらの抗原変異体から保護できる広い中和免疫応答が惹起される。
【０１２９】
実施例２：特有のＨＡ分子を提示するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生するための、複数の遺伝子を有する哺乳動物のＤＮＡプラスミドベクターまたは組換えバキュロウイルスの作製
この例では、ＶＬＰの産生に必要なコンストラクトの作製について記載する。作製されるコンストラクトの一般的な構造を図６に示す。遺伝子発現の高度で持続可能なレベルだけでなく、安定にトランスフェクトされた細胞の産生速度をも高める特有の調節配列を含む哺乳動物プラスミド（ベクター、図６、パネルＩ）に目的の遺伝子をサブクローニングする。ＶＬＰを産生する別の方法は、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系の利用である。作製されるコンストラクトの全体的な構造を図６のパネルＩＩに示す。
【０１３０】
遺伝子各々が哺乳動物プロモーター（ＣＭＶプロモーターまたはプロモーターＡ）の転写制御下となるように、適切な制限部位を使用してインフルエンザＭ１およびＭ２遺伝子を哺乳動物プラスミド発現ベクターに連続的にサブクローニングした。さらに、インフルエンザＭ１およびＭ２遺伝子をクローニングしたプラスミドは、抗生物質選択マーカー（たとえば、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシン）と、各遺伝子の上流に、哺乳動物染色体内にＤＮＡが組み込まれた後にオープンクロマチン状態を維持する特定の配列とを含んでいた。したがって、これらのコンストラクトは、一過性または安定なタンパク質発現実験を行うのに好適なものである。
【０１３１】
蛍光セルソーティングを用いた、安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の選択の例を図８Ａ〜図８Ｃに示す。さらに、安定にトランスフェクトされたＭＤＣＫおよびＣＨＯ細胞のＭ１／Ｍ２タンパク質の発現レベルをぞれぞれ図９Ａおよび図９Ｂに示す。
【０１３２】
遺伝子が各々哺乳動物プロモーター（ＣＭＶプロモーターまたはプロモーターＡ）の転写制御下となるように、適切な制限部位を用いて改変ＨＡおよびＮＡ遺伝子を別の哺乳動物プラスミド発現ベクターにサブクローニングした。
【０１３３】
各コンストラクトの完成後、制限酵素解析およびシーケンシングにより遺伝子の方向性および完全性を確認した。ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｔｂｌ２コンピテントＥ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞を形質転換し、ｍａｘｉ−ｐｒｅｐによるＤＮＡ調製（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を行って各コンストラクトのプラスミドＤＮＡをさらに増幅した。分光光度法によりプラスミドＤＮＡの濃度を判定した。一過性トランスフェクションは環状ＤＮＡを利用して行ったのに対し、安定な細胞株を産生するためのトランスフェクションは、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素で切断した直鎖ＤＮＡを用いて行った。
【０１３４】
昆虫細胞を用いてＶＬＰを産生するためバキュロウイルストランスファーベクターを作製した。図６のパネルＩＩに図示するように４つのインフルエンザ遺伝子を単一のプラスミドにサブクローニングし、バキュロウイルスプロモーターの転写制御下とした。前述のつのように、制限酵素解析およびシーケンシングにより遺伝子の方向性および完全性を確認した。ｍａｘｉ−ｐｒｅｐによるＤＮＡ調製を行ってプラスミドＤＮＡをさらに増幅した。直線化したバキュロウイルスＤＮＡとトランスファーベクター（４つのインフルエンザ遺伝子を有する）をＳｆ９昆虫細胞にコトランスフェクトすると、ＶＬＰワクチンを産生するための組換えバキュロウイルスが作製される。
【０１３５】
実施例３：エレクトロポレーションによる哺乳動物細胞へのＤＮＡプラスミドのトランスフェクション
実施例２に記載されているような所望のベクターの作製後、ベクターを利用して哺乳動物細胞（ＣＨＯ、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＷＩ−３８またはＭＲＣ５）でＶＬＰを産生した。
【０１３６】
安定にトランスフェクトされた細胞を作製するため、直線化したＤＮＡをエレクトロポレーションにより細胞に導入した。簡単に説明すると、ＤＮＡのエレクトロポレーションの２４時間前に、２４時間で８０〜８５％コンフルエントな単層が形成されるように、選択した細胞を約４百万個の細胞濃度でＴ−１７５フラスコに播種した。エレクトロポレーションの前に、細胞単層を８ｍｌの１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄してから、４ｍｌの１×トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で処理し、５分間３７℃でインキュベートした。フラスコに１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む６ｍｌのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を加えて細胞を再懸濁し、チューブに集め、その後５００×ｇで５分間遠心分離によりペレット状にした。細胞ペレットを５ｍｌの氷冷１×ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で２回洗浄し、次いで５００μｌの氷冷１×ＲＰＭＩに再懸濁した。
【０１３７】
細胞懸濁液に、Ｍ１／Ｍ２を発現する６ｇの直線化したプラスミド、またはＭ１／Ｍ２とＮＡ／改変ＨＡを発現するプラスミドを加え、ピペッティングにより穏やかに混合し、次いで０．４ｃｍギャップエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に移した。キュベットをＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓａｒに入れ、以下のパラメーター：４００Ｖ、９６０μＦを用いて細胞にエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションを行った細胞を室温で５分間維持し、次いで１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭを含む６ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。エレクトロポレーションから６時間後、培地を吸引し、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、新鮮培地を加えた。抗生物質選択が開始されるまで３７℃、５％ＣＯ２で細胞をインキュベートした。
【０１３８】
懸濁液細胞、たとえばＣＨＯ細胞株のエレクトロポレーションには、改変プロトコルを使用した。トリプシン処理を必要とすることなく、細胞を培養容器から直接集めた。その後、上記のようなステップを行った。
【０１３９】
実施例４：化学的方法による哺乳動物細胞へのＤＮＡプラスミドのトランスフェクション
トランスフェクションのため、５ｍｌのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地（ＣＨＯ細胞）、または５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充した１０ｍｌのＤＭＥＭ（Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ５、ＷＩ−３８）を用いて哺乳動物細胞（ＣＨＯ、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ５またはＷＩ−３８）を１．５×１０６〜２．５×１０６細胞／ｍｌの密度で適切な培養容器（ＣＨＯ細胞の場合、２５ｃｍ２フラスコ、またはＶｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ５またはＷＩ−３８細胞の場合７５ｃｍ２フラスコ）に蒔いて調製した。トランスフェクション手順の開始の２４時間前に接着細胞（Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ５、ＷＩ−３８）を蒔いた。
【０１４０】
このステップ後、プラスミドＤＮＡとリポフェクタミンとのＤＮＡ−脂質複合体形成反応を準備した。一方のチューブで目的のプラスミドＤＮＡまたはその混合物を５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈し、他方のチューブで２０μｌのリポフェクタミン２０００を４８０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で希釈した。リポフェクタミン−ＯｐｔｉＭＥＭ混合物を室温で５分間インキュベートした。
【０１４１】
このステップ後、プラスミドＤＮＡ−ＯｐｔｉＭＥＭ混合物をリポフェクタミン−ＯｐｔｉＭＥＭ混合物と組み合わせて、反応を室温で２０分間進行させた。次いでＤＮＡ−リポフェクタミン複合体を、上記のように既に蒔いてあった細胞に加えた。ＣＨＯ細胞の場合、ＤＮＡ−リポフェクタミン複合体の添加から５時間後、２５ｃｍ２フラスコの内容物の２．５ｍｌを別の２５ｃｍ２フラスコに移し、両方のフラスコに４．５ｍｌのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地を加えた。培養フラスコ内で接着細胞を維持し、５ｍｌの新鮮な培地を加えた。細胞への毒性があることを証明できた抗生物質をＤＮＡ−脂質複合体に取り込ませることにより細胞の内部に送達することができたため、トランスフェクションプロセスに使用した試薬または培地は、抗生物質をまったく含んでいなかった。
【０１４２】
目的のタンパク質を一過性に発現させてＶＬＰを産生するため、ＤＮＡがネイティブな環状形態であるＤＮＡ−脂質複合体の形態でプラスミドを細胞に導入した。トランスフェクト細胞のライセートおよび培養上清におけるＶＬＰタンパク質の発現をトランスフェクションから７２〜９６時間後に評価した。
【０１４３】
目的のプラスミドに細胞の染色体ＤＮＡを組み込み、連続的なタンパク質発現状態を確立する、安定にトランスフェクトされた細胞を作製するため、細胞に導入したプラスミドが直鎖構造であること以外はトランスフェクションの手順に従った。目的の遺伝子をクローニングしたプラスミドは、抗生物質耐性マーカー、たとえばハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシンをさらに含む。このため、トランスフェクションから４８〜９６時間後に、プラスミドにより送達される耐性遺伝子に基づき最適な抗生物質を培養基に加えて細胞を選択した。選択から８〜１０日後、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて表面タンパク質の発現および検出に基づき、抗生物質の存在下で増殖した細胞を単離した。
【０１４４】
実施例５：タンパク質の一過性発現のための環状ＤＮＡのトランスフェクション、および改変ＨＡを提示するＶＬＰのアセンブリー
エレクトロポレーションあるいは化学的トランスフェクションにより未切断環状プラスミドの組み合わせを哺乳動物細胞に導入してＶＬＰ産生の評価を行った。この例では、Ｍ１／Ｍ２ベクターをＮＡ／ＨＡ（改変、図１）と組み合わせて、上述の２つのトランスフェクション方法のどちらかにより哺乳動物細胞（ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ５またはＷＩ−３８）に送達した。
【０１４５】
細胞ライセート、培養上清および濃縮精製された上清のウエスタンブロット解析から、図１０に示すようにこれらのタンパク質が細胞に発現し、培養基に放出されることが明らかになった。さらに、ネガティブ染色電子顕微鏡観察およびクライオ電子顕微鏡法により、これらの細胞に産生および放出され濃縮および精製した材料を調べた。これらの研究から、インフルエンザウイルスなどのエンベロープウイルス粒子に似たウイルス様粒子の存在が明らかになった（図１１）。
【０１４６】
実施例６：安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞を作製するための、直線化したＤＮＡのトランスフェクション
直線化したプラスミドＤＮＡを哺乳動物細胞にトランスフェクトすると、プラスミドが宿主細胞のゲノムに組み込まれる。実施例１に記載したコンストラクトのいずれかの直鎖形態を送達すると、プラスミドが組み込まれ、その後ベクターＤＮＡが有する遺伝子が発現する。この戦略により、目的の遺伝子産物を構成的に発現する安定にトランスフェクトされた細胞株の産生が可能になる。
【０１４７】
このアプローチに従い、直線化したＭ１／Ｍ２ベクター（図６Ａ）をエレクトロポレーションまたは化学的トランスフェクションによりＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞またはＣＨＯ細胞に導入した。このステップ後、プラスミドが有する抗生物質耐性遺伝子に基づいて選択した１種の抗生物質（ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシン）で細胞を処理した。Ｍ１／Ｍ２ベクターはハイグロマイシン耐性遺伝子を含んでおり、したがってこのプラスミドをトランスフェクトした細胞をその抗生物質で処理して安定にトランスフェクトされた細胞株を選択した。抗生物質の存在下で増殖した細胞について、その表面でのＭ２タンパク質の発現を蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて試験し、クローニングした。
【０１４８】
図８は、細胞集団の一部がＭ２タンパク質を発現することを明らかにする、Ｍ１／Ｍ２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳヒストグラムを示す。複数の細胞クローンを増殖させ、Ｍ１およびＭ２タンパク質の両方の発現をウエスタンブロットによりさらに解析した。
【０１４９】
さらに、図９ＡおよびＢに示すように、選択したＭ１／Ｍ２が安定にトランスフェクトされたＭＤＣＫおよびＣＨＯ細胞株は、これらのタンパク質を構成的に発現する。これらの細胞株に、特有のＨＡ分子を提示するインフルエンザウイルス様粒子のアセンブリーおよび放出のためＮＡ／ＨＡ（改変）（図１〜５）を有するベクターをトランスフェクトしてもよい。
【０１５０】
実施例７：安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の選択
次いで目的の遺伝子をコードする直線化したプラスミドをトランスフェクトした哺乳動物細胞を抗生物質処理に付し、トランスフェクトされたプラスミドが宿主細胞ゲノムに組み込まれた細胞を選別した。トランスフェクトされたプラスミド は、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシンのいずれかに耐性を付与する抗生物質耐性カセットを含む。
【０１５１】
トランスフェクションから約４８〜７２時間後、細胞培養基に適切な濃度の抗生物質（４００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシン、１０ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンまたは１０ｕｇ／ｍｌのネオマイシン）を加えて細胞に選択圧をかけ、この培地でトランスフェクト細胞を数回にわたり継代した。このプロセスにより、トランスフェクトされたプラスミドから染色体に遺伝子が組み込まれた細胞のみが生存することができ、残りの集団から選別された。
【０１５２】
実施例８：Ｍ１／Ｍ２をトランスフェクトした細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）解析
上記のように得た細胞を組織培養フラスコから回収し、５００×ｇで５分間連続遠心分離により３回洗浄し、続いてリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。３回目の洗浄の後、細胞をカウントし、それぞれ５×１０６細胞の３つのアリコートに分けた。細胞表面のＭ２発現でソートすることになっていた第１のアリコートは、ＰＢＳで１：５００に希釈した抗Ｍ２モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と室温で１時間インキュベートした。第２のアリコートは、ＰＢＳで１：２００に希釈したインフルエンザＡヌクレオプロテインに対するモノクローナル抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｏ，ＭＥ）と室温で１時間インキュベートした。このアリコートは、フローサイトメトリー実験のアイソタイプコントロールとした。第３のアリコートは、本実験の未染色の対照とした。
【０１５３】
それぞれの抗体とのインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで１：１００に希釈したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と室温で１時間インキュベートした。これらの処理後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３ｍｌを最終容量とした細胞培養基に再懸濁した。次いでこれらのサンプルをＭｏＦｌｏセルソーターで解析した。
【０１５４】
特有の緑色蛍光スペクトルで判定して細胞表面に高レベルのＭ２タンパク質を発現した細胞を１細胞／ウェルとして、各ウェルに１００μｌの細胞培養基を含む９６ウェルプレートにソートした。図８は、Ｍ１／Ｍ２トランスフェクト細胞を用いて行ったソーティング実験を示す。
【０１５５】
この選択方法は、本明細書に記載のコンストラクトのいずれか（たとえば、図１〜５）をトランスフェクトした細胞の同定および単離に応用される。ＮＡ／ＨＡ改変１（図１）を有するＤＮＡベクターをトランスフェクトした細胞は、細胞表面に表示されるＮＡおよびＨＡタンパク質の両方を発現するため、これらのタンパク質を持続的に発現する安定にトランスフェクトされたクローンの同定および単離が可能になる。ＨＡによる選択には、改変ＨＡ分子の保存されたエピトープを認識する広い中和モノクローナル抗体を使用する。第１の安定にトランスフェクトされた細胞株の作製後、第２のトランスフェクションを行い、この基礎となる細胞株の宿主ゲノムに遺伝子のもう１つの組を導入し、組み込む。この戦略を図７Ｂに示す。さらに、２回目のトランスフェクションで作製された安定にトランスフェクトされた細胞株の同定および選択をＦＡＣＳ分析により行う。図６に示すベクターコンストラクト（パネルＩに示すコンストラクト）により送達されるＮＡを含むまたは含まない改変ＨＡの５つのコンストラクトは、表面分子であり、細胞膜に提示され、したがって改変ＨＡ分子を含むＶＬＰを持続的に産生する安定にトランスフェクトされた細胞株を同定および選択するＦＡＣＳ戦略に好適である。
【０１５６】
実施例９：安定にトランスフェクトされ、構成的に産生されるＭ１およびＭ２インフルエンザタンパク質のエンドポイントクローニングおよび増殖
安定にトランスフェクトされた細胞集団からクローン細胞株を取得するため、エンドポイントクローニングを実施した。細胞を回収し、血球計数器を用いてカウントした。次いで最終濃度が１０細胞／ｍｌになるように適切な量の培養基で細胞を希釈した。この細胞調製物を穏やかに撹拌して細胞が均一に分布するようにしてから、１００μｌ／ウェルで滅菌９６ウェルプレートに蒔いた。次いでプレートを５％ＣＯ２の湿潤雰囲気、３７℃でインキュベートし、クローンの細胞増殖について定期的にモニターした。活発に増殖している細胞を含むウェルを一定期間にわたり特定した。これらのウェルのクローン細胞が約７０〜８０％コンフルエントになったとき、６ウェルプレート、２５ｃｍおよび７５ｃｍフラスコに連続継代してスケールアップした。
【０１５７】
実施例１０：タンパク質発現の解析
トランスフェクトされた哺乳動物細胞の細胞ペレットおよび上清についてタンパク質発現の解析を行った。トランスフェクトされた（Ｔｒａｎｆｅｃｔｅｄ）細胞を回収し、１×ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液［トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５０ｍＭ、塩化ナトリウム１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、１％トリトンＸ−１００、１％ＮＰ−４０、０．１％硫酸ドデシルナトリウム］に再懸濁し、次いで凍結融解サイクルにより破壊し、ピペッティングし、最後にその後使用するまで−２０℃で保存した。各サンプルの総タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により推定した。簡単に説明すると、１０μｌのサンプルを、室温に予め温めておいた１．０ｍｌの１×Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に加えた。次いでこの反応混合物を激しく振盪して均一な溶液を得た。分光光度計を使用して５９５ｎｍの波長で各サンプルの吸光度を測定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて既知濃度のウシ血清アルブミンの５９５ｎｍの吸光度を測定してプロットした標準曲線を用いて各サンプルのタンパク質濃度を判定した。
【０１５８】
ウエスタンブロット解析のため、等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、１２５Ｖで１．５時間電気泳動により分離した。その後、タンパク質をニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットし、以下のステップ：ブロッキング、一次抗体とのインキュベーション、洗浄、西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体とのインキュベーション、再度洗浄、最後に化学発光基質との反応およびシグナル検出を含むウエスタンブロット手順に付した。
【０１５９】
実施例１１：インフルエンザＭ１およびＭ２タンパク質を持続的に発現する細胞株の選択
Ｍ１およびＭ２インフルエンザ遺伝子を有する直線化したＤＮＡベクターを、ＭＤＣＫ細胞およびＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。ハイグロマイシンによる選択後、細胞を抗体の組み合わせ（最初に一次抗体として、細胞表面に発現したＭ２タンパク質と反応した抗Ｍ２マウスモノクローナル、続いて二次抗体としてフルオレッセインコンジュゲート抗マウス抗体）で標識してから、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて単細胞クローンを単離した。
【０１６０】
ソートした単細胞を増殖し、ウエスタンブロットによりＭ１およびＭ２タンパク質の発現をさらに評価した。細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％）にロードし、電気泳動により分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、４％脱脂乳で１時間ブロッキングした。次いで膜をマウスモノクローナル抗Ｍ１タンパク質（１：４０，０００希釈）およびマウスモノクローナル抗Ｍ２タンパク質（１：１０００希釈）（Ａｂｃａｍ、クローン１４Ｃ２）と一晩インキュベートした。膜を１×ＴＢＳＴで５分間３回洗浄し、次いで西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（２％脱脂乳で１：５０，０００希釈）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と１時間インキュベートした。膜を１×ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、続いてＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と５分インキュベーションした。膜をＨｙＢＩｏｔ ＣＬオートラジオグラフィーフィルム（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍｅｔｕｃｈｅｎ，ＮＪ）に密着させた。
【０１６１】
図９Ａレーン３に示すように、ＭＤＣＫ細胞ライセートには、分子量（ＭＷ）約２７ｋＤＡのＭ１タンパク質、およびＭＷ約１１ｋＤＡのＭ２タンパク質に対応する２つの主要なバンドが出現したのに対し、トランスフェクトされなかった対照は、これらのタンパク質の存在を示さなかった。レーン１はタンパク質マーカー、レーン２はインフルエンザＭ１およびＭ２タンパク質を発現しないＭＤＣＫ細胞（陰性対照）、レーン３はインフルエンザＭ１およびＭ２タンパク質を構成的に発現するＭＤＣＫ細胞である。図９Ｂに示すように同じプラスミドをＣＨＯ細胞に導入した場合、さらにＶＥＲＯ細胞でも、同様の結果が得られた。
【０１６２】
実施例１２
Ｍ１／Ｍ２を産生する細胞における改変ＨＡ／ＮＡタンパク質の発現
ＮＡを含むまたは含まない改変ＨＡ分子（図６パネルＩ−ＨＡ／ＮＡ）を有するＤＮＡベクターを、Ｍ１／Ｍ２ＤＮＡベクター（図１−パネルＩ−Ｍ１／Ｍ２）と一緒に、あるいは、Ｍ１／Ｍ２を発現している細胞にトランスフェクトすると、これらのタンパク質が発現し、タンパク質は、細胞ライセートだけでなく、細胞上清および濃縮精製された上清にも存在した。
【０１６３】
これらのサンプルのウエスタンブロット解析を図１０に示し、これにより、トランスフェクト細胞にＭ１、Ｍ２およびＨＡタンパク質が発現することが示される。
【０１６４】
実施例１３
ネガティブ染色電子顕微鏡観察によるインフルエンザＶＬＰの調査
トランスフェクト細胞の上清を２００，０００×ｇ、４℃で１．５時間超遠心に付した。超遠心後のペレットをＰＢＳに再懸濁し、再懸濁したペレットの２０μｌを電子顕微鏡観察用に確保した。この２０μｌのサンプルを４％パラホルムアルデヒドで固定してから、固定材料の５μｌを２００メッシュのカーボンコートしたグリッド（ＥＭＳ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）に載せ、グリッドを５分間カバーし、次いで水で３回洗浄した。この後、コートしたグリッドに２％酢酸ウラニルを、グリッドを酢酸ウラニルで過剰染色しないように素早く５滴滴下した。グリッドから過剰な溶液をブロットし、次いで風乾してからこれをＪＯＥＬ ＪＥＭ １００ＣＸ透過型電子顕微鏡に導入した。サンプルは、６０，０００×〜１００，０００×の倍率で観察した。
【０１６５】
図１１は、Ｍ１／Ｍ２−ＨＡ／ＮＡ ＣＨＯ細胞の精製された上清から得られた画像を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの基質タンパク質；および
修飾インフルエンザＨＡポリペプチドを含み、前記修飾は、前記ＨＡポリペプチドの膜貫通および細胞質尾部ドメインの外側に１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失を含むことを特徴とする
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２】
請求項１に記載のＶＬＰにおいて、前記欠失は少なくとも１５０アミノ酸の残基の欠失を含むことを特徴とするＶＬＰ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＶＬＰにおいて、前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドの少なくとも１つの残基が変異していることを特徴とするＶＬＰ。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のＶＬＰにおいて、少なくとも１つのタンパク質分解開裂部位または少なくとも１つのリンカーが前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドに挿入されていることを特徴とするＶＬＰ。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のＶＬＰにおいて、前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドの前記膜貫通ドメインは前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドと異なる株もしくはサブタイプ由来のＨＡ膜貫通ドメインで置換されている、および／または、前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドの前記細胞質ドメインは前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドと異なる株またはサブタイプ由来のＨＡ細胞質ドメインで置換されていることを特徴とするＶＬＰ。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載のＶＬＰにおいて、別のインフルエンザタンパク質、たとえば１つまたは複数の野生型基質タンパク質、１つまたは複数の変異基質タンパク質、１つまたは複数のハイブリッド基質タンパク質、１つまたは複数の変異およびハイブリッド基質タンパク質 １つまたは複数の野生型抗原性糖タンパク質、１つまたは複数の修飾抗原性糖タンパク質、１つまたは複数のハイブリッド抗原性糖タンパク質、１つまたは複数の修飾およびハイブリッド抗原性糖タンパク質、１つまたは複数のヌクレオプロテイン（ＮＰ）、１つまたは複数のＰＢ１タンパク質、１つまたは複数のＰＢ２タンパク質、１つまたは複数のＰＡタンパク質またはこれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とするＶＬＰ。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載のＶＬＰにおいて、前記ＶＬＰはＶＬＰのアセンブリーおよび放出を可能にする条件下で真核細胞に発現することを特徴とするＶＬＰ。
【請求項８】
請求項７に記載のＶＬＰにおいて、前記真核細胞は酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、トリ細胞、植物細胞または哺乳動物細胞からなる群から選択されることを特徴とするＶＬＰ。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載のＶＬＰを産生する方法において、
少なくとも１つの基質タンパク質および少なくとも１つの修飾インフルエンザＨＡポリペプチドをコードする１つまたは複数のベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトするステップと、ＶＬＰの形成を可能にする条件下で前記タンパク質の組み合わせを発現させるステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、少なくとも１つの基質タンパク質はインフルエンザＭ１タンパク質、トゴ（ｔｈｏｇｏｔｏ）基質タンパク質およびＲＳＶ基質タンパク質からなる群から選択され、さらに少なくとも１つのベクターが任意選択的にインフルエンザＭ２タンパク質をコードする配列をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の方法において、前記１つまたは複数のベクターは前記宿主細胞に安定にトランスフェクトされ、任意選択的に前記少なくとも１つの基質タンパク質および前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドが別々のベクターにコードされ、さらに前記少なくとも１つの基質タンパク質をコードする前記ベクターは、前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドタンパク質をコードする前記ベクターをトランスフェクトする前に前記細胞に安定にトランスフェクトされることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜８の何れか１項に記載の少なくとも１つのＶＬＰ、および任意選択的にアジュバントをさらに含むことを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の免疫原性組成物において、前記組成物は異なる修飾インフルエンザＨＡポリペプチドを含む少なくとも２つのＶＬＰを含むことを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項１４】
被検体内でインフルエンザに対する免疫応答を引き起こす方法において、請求項１〜８の何れか１項に記載のＶＬＰまたは請求項１２もしくは１３に記載の免疫原性組成物を有効量で前記被検体に投与することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記組成物は粘膜投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与または経口投与されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法において、前記免疫応答はインフルエンザの複数の株またはサブタイプから前記被検体を保護することを特徴とする方法。
【請求項１】
少なくとも１つの基質タンパク質；および
修飾インフルエンザＨＡポリペプチドを含み、前記修飾は、前記ＨＡポリペプチドの膜貫通および細胞質尾部ドメインの外側に１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失を含むことを特徴とする
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２】
請求項１に記載のＶＬＰにおいて、前記欠失は少なくとも１５０アミノ酸の残基の欠失を含むことを特徴とするＶＬＰ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＶＬＰにおいて、前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドの少なくとも１つの残基が変異していることを特徴とするＶＬＰ。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のＶＬＰにおいて、少なくとも１つのタンパク質分解開裂部位または少なくとも１つのリンカーが前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドに挿入されていることを特徴とするＶＬＰ。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のＶＬＰにおいて、前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドの前記膜貫通ドメインは前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドと異なる株もしくはサブタイプ由来のＨＡ膜貫通ドメインで置換されている、および／または、前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドの前記細胞質ドメインは前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドと異なる株またはサブタイプ由来のＨＡ細胞質ドメインで置換されていることを特徴とするＶＬＰ。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載のＶＬＰにおいて、別のインフルエンザタンパク質、たとえば１つまたは複数の野生型基質タンパク質、１つまたは複数の変異基質タンパク質、１つまたは複数のハイブリッド基質タンパク質、１つまたは複数の変異およびハイブリッド基質タンパク質 １つまたは複数の野生型抗原性糖タンパク質、１つまたは複数の修飾抗原性糖タンパク質、１つまたは複数のハイブリッド抗原性糖タンパク質、１つまたは複数の修飾およびハイブリッド抗原性糖タンパク質、１つまたは複数のヌクレオプロテイン（ＮＰ）、１つまたは複数のＰＢ１タンパク質、１つまたは複数のＰＢ２タンパク質、１つまたは複数のＰＡタンパク質またはこれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とするＶＬＰ。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載のＶＬＰにおいて、前記ＶＬＰはＶＬＰのアセンブリーおよび放出を可能にする条件下で真核細胞に発現することを特徴とするＶＬＰ。
【請求項８】
請求項７に記載のＶＬＰにおいて、前記真核細胞は酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、トリ細胞、植物細胞または哺乳動物細胞からなる群から選択されることを特徴とするＶＬＰ。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載のＶＬＰを産生する方法において、
少なくとも１つの基質タンパク質および少なくとも１つの修飾インフルエンザＨＡポリペプチドをコードする１つまたは複数のベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトするステップと、ＶＬＰの形成を可能にする条件下で前記タンパク質の組み合わせを発現させるステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、少なくとも１つの基質タンパク質はインフルエンザＭ１タンパク質、トゴ（ｔｈｏｇｏｔｏ）基質タンパク質およびＲＳＶ基質タンパク質からなる群から選択され、さらに少なくとも１つのベクターが任意選択的にインフルエンザＭ２タンパク質をコードする配列をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の方法において、前記１つまたは複数のベクターは前記宿主細胞に安定にトランスフェクトされ、任意選択的に前記少なくとも１つの基質タンパク質および前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドが別々のベクターにコードされ、さらに前記少なくとも１つの基質タンパク質をコードする前記ベクターは、前記修飾インフルエンザＨＡポリペプチドタンパク質をコードする前記ベクターをトランスフェクトする前に前記細胞に安定にトランスフェクトされることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜８の何れか１項に記載の少なくとも１つのＶＬＰ、および任意選択的にアジュバントをさらに含むことを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の免疫原性組成物において、前記組成物は異なる修飾インフルエンザＨＡポリペプチドを含む少なくとも２つのＶＬＰを含むことを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項１４】
被検体内でインフルエンザに対する免疫応答を引き起こす方法において、請求項１〜８の何れか１項に記載のＶＬＰまたは請求項１２もしくは１３に記載の免疫原性組成物を有効量で前記被検体に投与することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記組成物は粘膜投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与または経口投与されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法において、前記免疫応答はインフルエンザの複数の株またはサブタイプから前記被検体を保護することを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１３−５２０１６７（Ｐ２０１３−５２０１６７Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５３９０３（Ｐ２０１２−５５３９０３）
【出願日】平成２３年２月１８日（２０１１．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００３００
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０２９００
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（５１２２１２０６９）テクノヴァックス，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＥＣＨＮＯＶＡＸ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１８日（２０１１．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００３００
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０２９００
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（５１２２１２０６９）テクノヴァックス，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＥＣＨＮＯＶＡＸ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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