中枢神経系の炎症疾病の血液マーカーとしての切断およびリン酸化されたＣＲＭＰ２
本発明は、被験体における中枢神経系の炎症疾病のin vitroにおける予知、診断および／またはモニタリングのための方法に関し、前記方法は、被験体からの免疫系細胞の試料中における、チロシン４７９（Ｙ４７９）上でリン酸化された、場合によりセリン４６５（Ｓ４６５）上でさらにリン酸化された、コラプシン応答媒介タンパク質２（ＣＲＭＰ２）の存在を検出することを含み、場合によりセリン４６５上でさらにリン酸化された、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在の検出は、中枢神経系の炎症疾病を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、中枢神経系の炎症疾病を予測、診断および／または処置するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
神経炎症疾病、すなわち中枢神経系の炎症疾病は、炎症、および通常は脱髄、および軸索損傷に関連した急激な神経障害によって特徴付けられる。これらの疾患では、神経炎症が、脳および脊髄における神経細胞線維を絶縁する髄鞘を損傷し、それが下にある神経に対して広範でしばしば永久的な損傷を引き起こす。神経炎症疾病を患う患者には、感覚機能および運動機能の劇的で時に永久的な低下が起こる。神経炎症疾病に関連した有病率、罹患率および死亡率に因り、それらはかなりの医学的、社会的および経済的重荷を課す。北米においてはこれらの神経学的状態に５００万人を超える人が罹患し、そして年間７５０億米ドルを超える治療費が発生すると推定されている。
【０００３】
神経炎症疾病は診断および処置が困難である。残念なことに、不正確な診断により患者に不確実性が生じる。従って、神経炎症症状を寛解しそして神経学的機能を保存するための適切な処置法が確実に実行されるために、神経炎症疾病を診断するための迅速かつ正確な方法が重要である。従って、中枢神経系の炎症疾病を予測、診断および／または処置するための新たな方法が必要とされる。
【０００４】
本発明者らは、国際出願ＷＯ２００３／０２２２９８において、免疫系の機能障害に関連した病態の処置、予知または診断のためのコラプシン応答媒介タンパク質２（ＣＲＭＰ２）の可能性ある使用を示した。より具体的には、本発明者らは、ＣＲＭＰ２が、異常免疫病態を患う患者のＴリンパ球において高いレベルで存在し、そして高度にリン酸化された型のＣＲＭＰ２の核移行が、ＨＴＬＶ−１に感染したリンパ球、またはＦａｓ／Ｆａｓリガンド系に関連した免疫不全を有する患者のＴリンパ球において増加したことを示した。
【０００５】
ＣＲＭＰは、中枢神経系（ＣＮＳ）の軸索成長中の細胞骨格再配列のモデュレーターであることが知られている５つのメンバーのファミリーである。Ｔリンパ球およびＣＮＳにおいては、ＣＲＭＰ２は、６２ｋＤａの完全長型（ＣＲＭＰ２−６２）および５８ｋＤａの切断型（ＣＲＭＰ２−５８）の両方を提示する。４つのリン酸化型のＣＲＭＰ２がこれまでに記載されている：セリン５２２上でリン酸化されたＣＲＭＰ２（ｐＣＲＭＰ２−Ｓｅｒ５２２）、トレオニン５０９および５１４上でリン酸化されたＣＲＭＰ２（ｐＣＲＭＰ２−Ｔｈｒ５０９／５１４）、トレオニン５５５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２（ｐＣＲＭＰ２−Ｔｈｒ５５５）およびセリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２（Uchida et al. (2005) Genes Cells 10:165-179; Cole et al. (2006) J Biol Chem 281:16581-16588）。
【０００６】
本発明者らは、ＣＲＭＰ２の新たなリン酸化部位を同定した：チロシン４７９（Ｙ４７９）。本発明者らは、Ｙ４７９のリン酸化が、ＣＸＣＬ１２ケモカインによるＴリンパ球の膜ＣＸＣＲ４レセプターの活性化によって誘導され（Varrin-Doyer et al. (2009) J Biol Chem 284:13265-13276）、一方、Ｓ４６５のリン酸化はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の刺激後に誘導されたことを実証した。
【０００７】
発明の要約
本発明は、（ｉ）Ｙ４７９の突然変異が、Ｔ細胞極性化およびＴ細胞遊走速度を含むＴ細胞遊走能を減少させ、これは、神経炎症過程におけるＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の重要性を示し、そして（ｉｉ）ＨＴＬＶ−１によって誘発される多発性硬化症または脊髄症を患う患者が、高いレベルのＳｅｒ４６５のリン酸化され切断されたＣＲＭＰ２を有する活性化Ｔ細胞個体群を提示したという本発明者らによる意外な所見からもたらされる。これらのリン酸化および切断は、患者の免疫細胞におけるウェスタンブロットまたはフローサイトメトリーによって容易に検出できるという利点を有する。
【０００８】
従って、本発明は、被験体における中枢神経系の炎症疾病のin vitroにおける予知、診断および／またはモニタリングのための方法に関し、前記方法は、被験体からの免疫系細胞の試料中における、チロシン４７９（Ｙ４７９）上でリン酸化されたコラプシン応答媒介タンパク質２（ＣＲＭＰ２）の存在を検出することを含み、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在の検出は、中枢神経系の炎症疾病を示す。
【０００９】
本発明はまた、チロシン４７９上でリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体、および中枢神経系の炎症疾病の予知、診断および／またはモニタリングにおけるその使用、免疫細胞の遊走を減少させるためのその使用、および中枢神経系の炎症疾病の処置におけるその使用に関する。
【００１０】
本発明はまた、チロシン４７９および／またはセリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２を検出するための前記において定義したような抗体に関する。
【００１１】
本発明はまた、Ｔリンパ球の遊走を減少させるために使用するためのＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニスト、および中枢神経系の炎症疾病の処置における使用に関する。
【００１２】
発明の詳細な説明
中枢神経系の炎症疾病
本明細書において使用する「中枢神経系の炎症疾病」または「神経炎症疾病」は、炎症、脱髄、あるいは軸索および／または神経の損傷に関連した、中枢神経系の疾病を示す。中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症疾病は、非感染性または感染性であり得る。炎症病変を引き起こし得る非感染性疾病としては、いくつかの毒素、自己免疫疾病および免疫介在性状態が挙げられる。ウイルス、細菌、真菌、原虫および後生動物寄生虫は全て、ＣＮＳの炎症疾病を引き起こし得る。ＣＮＳの炎症疾病は特に、ＷＨＯによって刊行されている疾病および関連保険問題の国際統計分類（International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems）のコードＧ００からＧ０９に集められている。ＣＮＳの炎症疾病の例としては、髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脊髄症または脳脊髄炎；頭蓋内および髄腔内の膿瘍および肉芽腫；頭蓋内および髄腔内の静脈炎および血栓性静脈炎；多発性硬化症；アルツハイマー病およびパーキンソン病を伴うウイルス感染、細菌感染または寄生虫感染が挙げられる。好ましくは、本発明によるＣＮＳの炎症疾病は、髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脳脊髄炎、脳炎（encephalititis）または脊髄症、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病を伴うウイルス感染または細菌感染からなる群より選択される。より好ましくは、本発明によるＣＮＳの炎症疾病は、脳炎、多発性硬化症、アルツハイマー病およびパーキンソン病を伴うウイルス感染からなる群より選択される。
【００１３】
本明細書において使用する「髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脊髄症または脳脊髄炎を伴うウイルス感染」としては、レトロウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、水痘、水痘帯状疱疹ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ポリオウイルス、ＨＴＬＶ−１およびエプシュタン・バーウイルスに因るウイルス感染が挙げられる。好ましくは、本発明によるウイルス感染は、ＨＴＬＶ−１またはＨＩＶに因るウイルス感染からなる群より選択される。
【００１４】
本明細書において使用する「髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脊髄症または脳脊髄炎を伴う細菌感染」としては、Haemophilis influenzae、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus agalactiae、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis、Escherichia coli、Klebsiella、Friedlander bacillus、Bacillus anthracis、Neisseria gonorrhoeae、Leptospira、Listeria monocytogenes、Borrelia、Treponema pallidum、Salmonella、Mycobacterium tuberculosisおよびSalmonella entericaに因る細菌感染が挙げられる。
【００１５】
本明細書において使用する「髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脊髄症または脳脊髄炎を伴う寄生虫感染」としては、Trypanosoma、特にTrypanosoma bruceiおよびTrypanosoma cruzi、Toxoplasma gondiiおよびNaegleria fowleriに因る寄生虫感染が挙げられる。
【００１６】
ＣＲＭＰ２
本明細書において使用する「コラプシン応答媒介タンパク質２」または「ＣＲＭＰ２」または「ＵＬＩＰ２」は、神経成長円錐の発育（Goshima et al. (1995) Nature 376:509-514; Charrier et al. (2003) Mol. Neurobiol. 28:51-64）および微小管組織を介した神経細胞の遊走において初めて記載されたリン酸化タンパク質を指す。それは、細胞質リン酸化タンパク質のＣＲＭＰ／ＴＯＡＤ／Ｕｌｉｐ／ＤＲＰファミリーのメンバーである。好ましくは、ＣＲＭＰ２は、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００１７】
本発明の脈絡において、本発明者らは、ＣＲＭＰ２が、チロシン４７９（Ｙ４７９）上でリン酸化され得ることを実証した。さらに、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２は、完全長型または切断型のいずれかであり得る。Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の完全長型は、完全長型の６２ｋＤａのＣＲＭＰ２（ＣＲＭＰ２−６２）に対応するが、切断型は、切断型の５８ｋＤａのＣＲＭＰ２（ＣＲＭＰ２−５８）に対応する。より特定すると、ＣＲＭＰ２−５８は、ＣＲＭＰ２のアミノ酸４８９から５３２の間に位置するRogemond et al.に記載の切断部位におけるＣＲＭＰ２−６２の切断によって得られる（Rogemond et al. (2008) J. Biol. Chem 283:14751-14761）。ＣＲＭＰ２およびＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２、特にその切断型のそれは、セリン４６５（Ｓ４６５）上でさらにリン酸化され得る。
【００１８】
抗体およびその使用
本発明は、チロシン４７９上でリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体に関する。
【００１９】
本明細書において使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子およびこれらの免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。従って、「抗体」という用語は、完全な抗体分子だけではなく、抗体フラグメント並びに抗体の変異体（誘導体も含む）および抗体フラグメントの変異体も含む。本発明による抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
【００２０】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」は、特異的な抗原に対して作られ、そして例えばＢ細胞またはハイブリドーマの単一のクローンによって組換えまたは産生され得る、単一のアミノ酸組成の抗体を指す。
【００２１】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の可変領域または抗原結合領域を含む。適切な抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２フラグメントおよびディアボディが挙げられる。本発明による抗体はまたラクダ科ナノボディであり得る。本発明による抗体は、改変された抗体であり得る。特に、本発明による抗体は、マーカー部分にコンジュゲーションされ得る。マーカー部分は、例えば、非放射性マーカー部分、例えばフルオロフォア、補酵素、例えばビオチン、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、色素、ポリエチレングリコールなどであり得る。
【００２２】
「特異的」という用語は、ターゲットへのリガンドの認識または結合を言及する場合、前記リガンドが、ターゲットとの構造的類似性を全く示さない別のターゲットと実質的に相互作用することなく、ターゲットと相互作用することを意味する。特に、前記に定義したようなＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体は、ＣＲＭＰ２がチロシン残基４７９上にリン酸基を有する場合にはＣＲＭＰ２を特異的に認識し結合するが、ＣＲＭＰ２がチロシン残基４７９上にリン酸基を有さない場合にはそうではない。好ましくは、前記に定義したようなＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体はまた、ＣＲＭＰ２がセリン４６５上にリン酸基をさらに有する場合にもＣＲＭＰ２を認識し結合する。
【００２３】
本発明はまた、セリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２（Ｓ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２）に特異的な抗体に関する。特に、前記に定義したようなＳ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な前記抗体は、ＣＲＭＰ２がセリン残基４６５上にリン酸基を有する場合にはＣＲＭＰ２を特異的に認識し結合するが、ＣＲＭＰ２がチロシン残基４６５上にリン酸基を有さない場合にはそうではない。好ましくは、前記に定義したようなＳ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体はまた、ＣＲＭＰ２がチロシン４７９上にリン酸基をさらに有する場合にもＣＲＭＰ２を認識し結合する。
【００２４】
前記に定義したような抗体は、完全長および／または切断されリン酸化されたＣＲＭＰ２を認識し結合する。好ましくは、前記に定義したようなＳ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体は、切断されたＳ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２を認識し結合する。
【００２５】
対象の抗原と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生するための方法は当業者に公知である（例えば、Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.); Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA: Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY;および Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497参照）。
【００２６】
所望の特異性を有する本発明による抗体を含む抗血清を産生するために、リン酸化されたＣＲＭＰ２を使用して、適切な動物、例えばマウス、ウサギ、または霊長類を免疫化し得る。標準的なアジュバント、例えばフロイントアジュバントを標準的な免疫化プロトコールに従って使用することができる、試験血を採取し、そして対象の抗原に対する反応性の力価を決定することによって、免疫原調製物に対する動物の免疫応答をモニタリングし得る。抗原に対して特異的に反応性である抗体を濃縮するための抗血清のさらなる分画および抗体の精製を、続いて、当業者に周知の方法を使用して達成することができる。
【００２７】
モノクローナル抗体を、当業者によく知られた種々の技術を使用して得ることができる。典型的には、所望の抗原で免疫化された動物からの脾臓細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合によって不死化する（Kohler and Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519）。不死化の代替的な方法としては、エプシュタイン・バーウイルス、発癌遺伝子もしくはレトロウイルスを用いての形質転換、または当技術分野において周知の他の方法が挙げられる。単一の不死化細胞から生じるコロニーを、抗原に対する所望の特異性および親和性を有する抗体の産生のためにスクリーニングし、そしてこのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔への注射を含む種々の技術によって増強され得る。さらに、Huse et al.(1989) Science 246:1275-1281によって概略が示された一般的なプロトコールに従ってヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、所望の特異性を有する抗体またはこのような抗体の結合フラグメントをコードする核酸配列が同定されると、モノクローナル抗体はまた組換え産生され得る。モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ法を使用して（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）またはファージディスプレイによって産生され得る。「ファージディスプレイ」という用語は、本明細書において、バクテリオファージカプシド上に発現されそしてカプシドをコードする遺伝子に挿入された核酸配列によってコードされた、リガンドを選択するための方法を指す。この方法は、当業者には周知であり、そして特にScott and Smith (1990) Science 249:386-390、およびMarks et al. (1991) J. Mol. Biol.222:581-597によって記載されている。
【００２８】
特定の態様において、前記に定義した抗体はヒト化モノクローナル抗体である。「ヒト化抗体」は、ヒト抗体とより密接に一致する（アミノ酸配列において）ように改変された非ヒト抗体を指す。特定の態様において、非ヒト抗体の可変領域の抗原結合残基の外のアミノ酸残基が改変される。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。特定の態様において、ヒト化抗体は、ヒト抗体のＣＤＲの全部または一部を、所望の抗原結合特異性を有する非ヒト抗体などの別の抗体からのＣＤＲの全部または一部で置換することによって構築される。特定の態様において、ヒト化抗体は、ＣＤＲの全部または実質的に全部が非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、そしてフレームワーク領域（ＦＲ）の全部または実質的に全部がヒト抗体のＦＲに対応する、可変領域を含む。特定のこのような態様において、ヒト化抗体はさらに、ヒト抗体の定常領域（Ｆｃ）を含む。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるために行なわれる。さらなる詳細については、Jones et al. (1986) Nature321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329;およびPresta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照されたい。ヒト化抗体の使用は、マウス定常領域の免疫原性に関連した潜在的な問題を取り除く。
【００２９】
本発明に従って使用する前に、本発明による抗体を精製し得る。抗体精製のための方法は生物医学研究の分野において周知であり、それには精製しようとする抗体の独特な特徴に依拠するものもあり、また、幅広い適用に適した標準的なタンパク質分離技術であるものもある。
【００３０】
塩析を最初の工程として使用して、他の望ましくないタンパク質から所望の抗体を分離することができる。好ましい塩は硫酸アンモニウムであり、これはタンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させることによってタンパク質を沈降させる。その後、タンパク質は、その溶解度に基づいて沈降する。タンパク質がより疎水性であればある程、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈降する可能性が高くなる。典型的なプロトコールは生じる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％となるように、タンパク質溶液に飽和硫酸アンモニウムを加えるものである。これは大半の疎水性タンパク質を沈降させる。所望の抗体を、その疎水性により適切な硫酸アンモニウム濃度で沈降させ、そしてその後、必要であれば透析またはダイアフィルトレーションのいずれかを通して過剰な塩を除去しながら緩衝液中で可溶化する。タンパク質の溶解度に依拠する他の方法、例えば冷エタノール沈降法は当業者に周知であり、そしてこれを使用して、血清などのタンパク質混合物から抗体画分を調製し得る。
【００３１】
予測される分子量に基づいて、抗体を、種々の孔径のメンブレン（例えばAmiconまたはMilliporeメンブレン）を通した限外濾過を使用してより大きなおよびより小さなサイズのタンパク質から単離することができる。第一工程として、タンパク質混合物（例えば血清または細胞培養上清）を、所望の抗体の予測される分子量よりも小さな分子量カットオフを有する孔径を有するメンブレンを通して限外濾過する。その後、限外濾過の残余分を、所望の抗体の予測される分子量よりも大きな分子量カットオフを有するメンブレンに対して限外濾過する。抗体はメンブレンを通って濾液中へと入り、これをその後、次の工程のカラムクロマトグラフィーで処理することができる。
【００３２】
本発明による抗体はまた、そのサイズ、正味の表面荷電、疎水性およびリガンドに対する親和性に基づいて、他の抗体を含む他のタンパク質から分離することができる。カラムクロマトグラフィーは頻繁に使用される方法である。例えば、抗体を、抗体のＦｃ領域中のドメインに結合する細菌細胞壁タンパク質である、プロテインＡまたはプロテインＧの固定されたカラムを使用して他の非抗体タンパク質から単離することができる。さらに、異なる抗原に対する抗体を、抗体精製のための好ましい形式のカラムクロマトグラフィーのカラムに固定された、これらの抗原に対するその明確に異なる親和性に基づいて分離することができる。これらの全ての方法は当技術分野において周知であり、そしてクロマトグラフィー技術を、任意の規模で、そして多くの異なる製造業者（例えばPharmacia Biotech）からの装置を使用して実施することができることは当業者には明らかであろう。
【００３３】
本発明はまた、チロシン４７９上で、場合によりさらにセリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２を検出するための前記に定義したような抗体の使用に関する。前記検出は、抗体の結合を可視化することを可能とする適切な免疫検出技術を使用して実施され得る。このような検出技術は当業者には周知であり、そしてこれには免疫組織細胞化学、免疫蛍光、免疫沈降、ウェスタンイムノブロット、化学発光、比色技術および放射標識技術が挙げられる。
【００３４】
好ましい態様において、本発明による抗体の使用は、さらに切断型であるＣＲＭＰ２を検出するためである。
【００３５】
in vitroにおける予知、診断および／またはモニタリングのための方法
本発明は、被験体における中枢神経系の炎症疾病のin vitroにおける予知、診断および／またはモニタリングのための方法に関し、前記方法は、被験体からの免疫系細胞の試料中における、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在を検出することを含み、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在の検出は中枢神経系の炎症疾病を示す。
【００３６】
本発明はまた、被験体における中枢神経系の炎症疾病を検出するためのin vitroにおける方法を記載し、前記方法は、被験体から採取した免疫系細胞の試料中における、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在をin vitroにおいて検出することを含み、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在の検出は中枢神経系の炎症疾病を示す。
【００３７】
本明細書において使用する「診断法」または「診断」は、被験体が病態を患っているかどうかを決定するための方法を指す。
【００３８】
本明細書において使用する「予知法」または「予知」は、被験体が病態を発症する可能性があるかどうかを決定するための方法を指す。
【００３９】
本明細書において使用する「モニタリング法」は、被験体における病態の発展を決定するための方法を指す。
【００４０】
本明細書において使用する「免疫系細胞」は、自然免疫反応および適応免疫反応の細胞、特にＴリンパ球およびＢリンパ球、樹状細胞、単球およびナチュラルキラー細胞を包含する。
【００４１】
本明細書において使用する「試料」は、より大きなセットの一部を指す。好ましくは、本発明による免疫系細胞の試料は、被験体の血液または脳から採取し、および／または特に血液細胞の亜個体群などを含む。好ましくは、本発明による免疫系細胞の試料は、Ｔリンパ球を含むまたはそれからなる。
【００４２】
特定の態様において、前記に定義した方法において、前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２は完全長型である。別の特定の態様において、前記の定義した方法において、前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２は切断型である。これらの態様において、前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２はセリン４６５上でさらにリン酸化され得る。好ましくは、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２が切断型である場合、それはセリン４６５上でさらにリン酸化される。さらに、ＣＲＭＰ２は、セリン５２２、トレオニン５０９、トレオニン５１４および／またはトレオニン５５５などの他のリン酸化部位上でさらにリン酸化され得る。
【００４３】
本発明の脈絡において、被験体の免疫系細胞の試料中におけるＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在の検出は、タンパク質の存在を可視化することを可能とする任意の適切な技術によって行なわれ得る。特に、ＣＲＭＰ２に対して、より好ましくはＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に対してまたはＳ４６５／Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に対して特異的な親和性を提示する化合物を使用して実施することができる。このような適切な化合物としては、特に抗体およびアプタマーが挙げられる。好ましくは、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２は、抗体、好ましくは、前記に定義したようなＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体を用いて検出される。従って、前記タンパク質の存在を可視化することを可能とする適切な技術は、抗体の結合を可視化することを可能とする任意の免疫検出技術を包含する。このような検出技術は当業者には周知であり、そしてこれには免疫組織細胞化学、免疫蛍光、免疫沈降、ウェスタンイムノブロット、化学発光、比色技術および放射標識技術が挙げられる。
【００４４】
本明細書において使用する「被験体」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばげっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌまたは霊長類）を指す。好ましくは、被験体はヒトである。
【００４５】
本発明はまた、中枢神経系の炎症疾病の予知、診断および／またはモニタリングにおいて使用するための前記に定義したような抗体に関する。
【００４６】
処置法
本発明はまた免疫細胞の遊走を減少させるために使用するための前記に定義したような抗体に関する。特に、本発明は、免疫細胞の遊走を減少させるために使用するためのチロシン４７９上でリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体に関する。
【００４７】
本明細書において使用する「免疫細胞」は、自然免疫反応および適応免疫反応の細胞、特にＴリンパ球およびＢリンパ球、樹状細胞、単球およびナチュラルキラー細胞を包含する。好ましくは、本発明による免疫細胞はＴリンパ球である。
【００４８】
本発明の脈絡において、「免疫細胞の遊走」は、リンパ器官からエフェクター部位への免疫細胞の移動を指す。本明細書において使用する「免疫細胞の遊走を減少させること」は、免疫細胞の遊走速度を遅延させること、リンパ器官からエフェクター部位へと遊走する免疫細胞の数を減少させること、またはエフェクター部位への免疫細胞の遊走を阻害することを意味する。好ましくは、本発明の脈絡において、エフェクター部位は脳である。
【００４９】
本発明はまた、前記に定義したような中枢神経系の炎症疾病の処置において使用するための前記に定義したような抗体に関する。
【００５０】
本発明はまた、治療有効量の前記に定義したような抗体をそれを必要とする被験体に投与することを含む、中枢神経系の炎症疾病の処置法に関する。
【００５１】
本明細書において使用する「処置すること」または「処置」という用語は、このような用語を適用する疾患もしくは状態、またはこのような疾患もしくは状態の１つ以上の症状を逆行、軽減、その進行を阻害、または予防することを意味する。
【００５２】
本発明によると、「被験体」または「それを必要とする被験体」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばげっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌまたは霊長類）を意図する。
【００５３】
「治療有効量」という用語は、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で、前記疾病を処置するために十分な抗体の量を意味する。しかしながら、本発明の抗体の１日の総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医師によって決定されることが理解される。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効投与量レベルは、処置される疾患および疾患の重症度、使用する具体的な抗体の活性、使用する具体的な組成物、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事、投与時刻、投与経路、および使用する具体的な抗体の排泄速度、処置期間、使用する具体的な抗体と組み合わせてまたは同時に使用する薬物、および医学分野において周知の同様な因子を含む多種多様な因子に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで化合物の投与量を開始し、そして所望の効果が達成されるまで投与量を次第に増加させることは当業者の技能内において周知である。
【００５４】
本発明の抗体を、中枢神経系の炎症疾病を処置するための任意の他の治療戦略と組み合わせて使用し得る。
【００５５】
ＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニストおよびその使用
本発明者らは、チロシン４７９上のＣＲＭＰ２のリン酸化が、ＣＸＣＲ４レセプターによって制御されたことを実証した。従って、ＣＸＣＲ４レセプターを阻害することで、チロシン４７９上のＣＲＭＰ２のリン酸化が妨げられ、従って、免疫細胞の遊走が減少するだろう。
【００５６】
従って、本発明はまた、前記に定義したような免疫細胞の遊走を減少させるために使用するためのＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニストに関する。好ましくは、ＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニストは、Ｔリンパ球の遊走を減少させるために使用するためのものである。
【００５７】
本明細書において使用する「ＣＸＣＲ４レセプター」または「フーシン」は、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１２とも呼ばれる）に特異的なα−ケモカインレセプターであるＣＸＣケモカインレセプターを指す。
【００５８】
本発明の脈絡において、「ＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニスト」は、ＣＸＣＲ４レセプターに結合することによって直接的に、または間接的に、ＣＸＣＲ４レセプターの下流のシグナルカスケードを阻害する化合物を指す。ＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニストの例としては、ＣＸＣＲ４レセプターに特異的な抗体、ＡＭＤ０７０、ＡＭＤ３１００（またはプレリキサホル）、ＡＭＤ３４６５、４Ｆ−ベンゾイル−ＴＮ１４００３（またはＴ１４０）、ＫＲＨ−３９５５、およびビシクラムが挙げられる。
【００５９】
本発明はまた、前記に定義したような中枢神経系の炎症疾病の処置において使用するための前記に定義したようなアンタゴニストに関する。
【００６０】
治療有効量の前記に定義したようなＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニストの、それを必要とする被験体への投与を含む、中枢神経系の炎症疾病の処置法もまた本発明の目的である。
【００６１】
本発明のアンタゴニストは、中枢神経系の炎症疾病を処置するための任意の他の治療戦略と組み合わせて使用され得る。特に、本発明のアンタゴニストは、本発明の抗体と組み合わせて使用され得る。
【００６２】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いての処理および固定から０、２、５または１０分後の極性化ＣＲＭＰ２を有する、コラーゲンＩでコーティングされたスライドに付着している、ジャーカット細胞の数（％）を示すヒストグラムを示す。
【図２】図２は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）だけを用いての処理後、またはＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００を用いての処理後の極性化ＣＲＭＰ２を有する、コラーゲンＩでコーティングされたスライドに付着している、ジャーカット細胞の数（％）を示すヒストグラムを示す。
【図３】図３は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いて（＋）または用いずに（−）１０または３０分間かけて処理し、溶解し、そして細胞下分画にかけた、ジャーカット細胞の全細胞溶解液、細胞質画分または細胞骨格画分に対して実施したウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗ＣＲＭＰ２−ｐｅｐ４抗体または抗ＣＲＭＰ−Ｃ−ｔｅｒ抗体を使用して実施された。白抜き矢印は、完全長型のＣＲＭＰ２を示し、そして黒い矢印は切断型のＣＲＭＰ２を示す。ウェスタンブロットはまた、抗ビメンチン抗体、抗Ｅｒｋ１／２抗体および抗ｐＥｒｋ１／２抗体を用いても実施された。ウェスタンブロットの左の数字は、分子量（ｋＤａ）を示す。ウェスタンブロットの下の数字は、非処理細胞を用いて得られたシグナル強度と比較した、処理細胞を用いて得られたシグナル強度の相対値を示す。
【図４】図４は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いて０、２、５、１０または３０分間かけて処理し、溶解し、そしてリン酸化型の濃縮にかけられた、ジャーカット細胞の全細胞溶解液、非リン酸化タンパク質（素通り画分）またはリン酸化タンパク質（溶出液）に対して実施されたウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは抗ＣＲＭＰ２−ｐｅｐ４抗体または抗ＣＲＭＰ−Ｃ−ｔｅｒ抗体を使用して実施された。白抜きの矢印は完全長型のＣＲＭＰ２を示し、そして黒い矢印は切断型のＣＲＭＰ２を示す。ウェスタンブロットはまた、抗Ｅｒｋ１／２抗体および抗ｐＥｒｋ１／２抗体を用いても実施された。ウェスタンブロットの左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。
【図５】図５は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いて０、１、２、４、６、１０、１５または３０分間かけて処理したジャーカットＴ細胞の細胞溶解液に対して実施したウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗ＣＲＭＰ２−ｐＳｅｒ５２２抗体、抗ＣＲＭＰ２−ｐＴｈｒ５０９／５１４抗体、抗ＣＲＭＰ−Ｃ−ｔｅｒ抗体、抗ｐＥｒｋ１／２抗体および抗Ｅｒｋ１／２抗体を使用して実施された。ウェスタンブロットの左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。ウェスタンブロットの下の数字は、非処理細胞を用いて得られたシグナル強度と比較した、処理細胞を用いて得られたシグナル強度の相対値を示す。
【図６】図６は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いて０、１、２、４、６、１０、１５または３０分間かけて処理したジャーカットＴ細胞の細胞溶解液に対して実施したウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗Ｃｄｋ５−ｐＴｙｒ１２抗体、抗Ｃｄｋ５−ｐＳｅｒ１５９抗体、抗Ｃｄｋ５抗体、抗ＧＳＫ−３α−ｐＴｙｒ２７９抗体、抗ＧＳＫ−３β−ｐＴｙｒ２１６抗体、抗ＧＳＫ−３α抗体および抗ＧＳＫ−３β抗体を使用して実施された。ウェスタンブロットの左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。ウェスタンブロットの下の数字は、非処理細胞を用いて得られたシグナル強度と比較した、処理細胞を用いて得られたシグナル強度の相対値を示す。
【図７】図７は、残基１５〜４８９の切断されたＣＲＭＰ２の構造のリボンダイアグラムを示す。挿入図は、切断されたＣＲＭＰ２の表面図を示し、これは残基Ｒ４６７、Ｐ４７０およびＰ４７３の表面露出を示す（濃灰色）。
【図８】図８は、ＣＲＭＰ２−ＧＳＴまたはＧＳＴに結合したセファロース−４Ｂビーズと共にインキュベーションした初代Ｔリンパ球またはＤｅｖ神経細胞の細胞溶解液に対して実施したウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗Ｙｅｓ抗体、抗ＣＲＭＰ２抗体および抗ＧＳＴ抗体を使用して実施された。ウェスタンブロットの左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。
【図９】図９は、ＡＴＰの存在下（＋）または非存在下において、活性組換えＹｅｓを用いて（＋）または用いずに、および組換えＣＲＭＰ２を用いて（＋）または用いずに実施されたin vitroにおけるキナーゼアッセイの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗リン酸化チロシン残基抗体および抗ＣＲＭＰ２抗体を使用して実施された。ウェスタンブロットの右の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。
【図１０】図１０は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いて０、１、２、４、６、１０、１５または３０分間かけて処理したジャーカット細胞の細胞溶解液に対して実施したウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗ＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ４７９抗体、抗ＣＲＭＰ−Ｃ−ｔｅｒ抗体、抗ＣＲＭＰ２−ｐｅｐ４抗体、抗Ｓｒｃ−ｐＴｙｒ４１６抗体および抗Ｓｒｃ抗体を使用して実施された。白抜きの矢印は完全長型のＣＲＭＰ２を示し、そして黒い矢印は切断型のＣＲＭＰ２を示す。ウェスタンブロットの左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。ウェスタンブロットの下の数字は、非処理細胞を用いて得られたシグナル強度と比較した、処理細胞を用いて得られたシグナル強度の相対値を示す。
【図１１】図１１は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いての処理および固定の後に極性化ＣＲＭＰ２を有する、コラーゲンＩでコーティングされたスライドに付着している、ＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−ＷＴ（線入りの棒）またはＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−Ｙ４７９Ｆ突然変異体（白い棒）を用いてトランスフェクションされた、ジャーカット細胞の数（トランスフェクションされた細胞数と比較した％）を示すヒストグラムを示す。ＣＲＭＰ２は、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて観察された。
【図１２】図１２は、トランスウェルチャンバーにおいてＣＸＣＬ１２の方向にトランスマイグレーションする、空ベクター（ドットの棒）プラスミド、ＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−ＷＴ（線入りの棒）プラスミドまたはＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−Ｙ４７９Ｆ（白い棒）プラスミドを用いてトランスフェクションされた、ジャーカット細胞の数を示すヒストグラムを示す。
【図１３】図１３は、器官型の海馬切片の近くにスポットされると神経組織上において遊走する、ＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−ＷＴ（線入りの棒）プラスミドまたはＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−Ｙ４７９Ｆ（白い棒）プラスミドを用いてトランスフェクションされた、ジャーカット細胞の数を示すヒストグラムを示す。
【００６４】
実施例１
以下の実施例は、チロシン４７９残基上でのＣＲＭＰ２のリン酸化がＴ細胞の遊走において重要であることを実証する。
【００６５】
材料および方法
細胞および抗体
ジャーカットＴ細胞株を、１０％ウシ胎児血清の補充されたＲＰＭＩ１６４０中で培養した。健康ドナーの血液から選択された初代Ｔリンパ球を、１〜２週間かけて１０％ＡＢヒト血清およびＩＬ２（２０Ｕ/mL）の補充されたＲＰＭＩ中で培養した。
【００６６】
完全長型および切断型のＣＲＭＰ２の両方を認識するウサギポリクローナル抗体が、Rogemond et al. (2008) J. Biol. Chem 283:14751-14761に記載されている。Ｃ−ｔｅｒおよびｐｅｐ４の抗血清を生成するために使用されたペプチド配列は、それぞれ、ＣＲＭＰ２配列中のＡＡ５５７〜５７２およびＡＡ４５４〜４６５に局在していた。抗体を、対応する固定化されたペプチド上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ＣＲＭＰ２−ｐＳｅｒ５２２およびＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ５０９／５１４を認識するヒツジ抗血清はKinasource Limited (Dundee, UK)製であった。本発明者らによって産生されたウサギポリクローナル抗体は、Ｙ４７９上でリン酸化されたペプチドＡＡ４７０〜４８３（ＣＲＭＰ２−ｐＹ４７９）に対して生じ、そして対応する固定されたペプチド上でのアフィニティクロマトグラフィーによって２工程法で精製した（工程１：抗非リン酸化ペプチド抗体の排除、工程２：抗リン酸化ペプチド抗体の精製）。ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９ペプチドおよびＣＲＭＰ２−ｐＹ４７９ペプチドに対して実施されたＥＬＩＳＡは、本発明者らによって産生された抗ＣＲＭＰ２−ｐＹ４７９抗体の特異性を示した。さらに、ホスファターゼＣＩＰを用いてのＴ細胞溶解液の処理は、ウェスタンブロットにおける陽性シグナルをかなり減少させた。Ｙｅｓキナーゼに対するウサギポリクローナル抗体はUpstate製であった。マウス抗ビメンチン／ＬＮ６抗体はCalbiochem製であった。Cell Signaling製の抗Ｅｒｋ抗体および抗リン酸化Ｅｒｋ抗体は、非リン酸化およびリン酸化ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ（Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２）を認識した。抗Ｃｄｋ５抗体、抗ＣＤＫ５−ｐＴｙｒ１５抗体、抗Ｃｄｋ５−ｐＳｅｒ１５９抗体および抗Ｓｒｃ抗体は、Santa Cruz Biotechnology製であった。ウサギ抗リン酸化Ｓｒｃファミリー抗体はCell Signaling製であり、そしてこれはＳｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、ＬＣＫ、ＨｃｋおよびＹｅｓ上におけるリン酸化Ｔｙｒ４１６を認識した。ウサギ抗ＧＳＫ−３抗体はChemicon International製であった。Upstate Millipore製のマウス抗ｐＧＳＫ−３抗体は、活性型のＧＳＫ−３α（ｐＴｙｒ２７９）およびＧＳＫ−３β（ｐＴｙｒ２１６）を認識した。ホスホ濃縮磁気ビーズ（TALON（登録商標）PMAC）をClontechから購入した。
【００６７】
プラスミドおよび構築物
ＣＲＭＰ２−Ｆｌａｇ−ｗｔプラスミドは、Rogemond et al. (2008) J. Biol. Chem 283:14751-14761に記載されている。簡潔に言うと、完全長ＣＲＭＰ２をＰＣＲによって増幅し、そしてｐＣＭＶ２−ＦＬＡＧベクター（Sigma, l’Isle d’Abeau, France）に一方向に挿入した。
【００６８】
突然変異：２工程のＰＣＲ手順を使用して、ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９Ｆ突然変異体を生成した。最初に、Ｙ４７９−Ｆ突然変異を含むＣ末端フラグメント（４７１〜５７２）を、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入するリバースプライマー、およびＦ（ＴＴＣ）で置換されたコドンＹ４７９（ＴＡＣ）を有するフォワードプライマーを使用して生成した。次に、この突然変異したフラグメントを、リバースプライマーとして２回目のＰＣＲ反応において、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩを導入する野生型フォワードプライマーと共に使用した。最終のＰＣＲ産物を、ｐＣＭＶ２−ＦｌａｇベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、そして突然変異体のＤＮＡ配列をシークエンスによって確認した。
【００６９】
トランスフェクション：ジャーカットＴ細胞を、製造業者の指示に従って、Amaxa Nucleofector技術(Koln, Germany)を使用してＣＲＭＰ２−Ｆｌａｇ−ｗｔプラスミド、ＣＲＭＰ２−Ｆｌａｇ−Ｙ４７９Ｆプラスミドおよび空Ｆｌａｇプラスミドを用いてトランスフェクションした。Ｔ細胞をトランスフェクションから１８時間後に使用した。トランスフェクションされた細胞を、抗Ｆｌａｇ抗体を用いての免疫染色によって可視化した。トランスフェクション率は、大半のＦｌａｇ構築物において４０〜５０％に達した。
【００７０】
免疫細胞化学
ＣＲＭＰ２型、Ｙｅｓキナーゼおよび中間径フィラメントのビメンチンを、コラーゲンＩでコーティングされたスライド（２０μg/ml）に付着させそして処理（アセトン−２０℃；１０分間）により固定されたジャーカット細胞および初代Ｔ細胞に対する間接的な免疫蛍光によって検出した。細胞を特異的な抗体と共に（１時間、３７℃）、その後、Ａｌｅｘａ４８８または５４６にコンジュゲーションした抗マウスまたは抗ウサギまたは抗ヒツジＩｇＧ抗体と共に（１時間、３７℃）インキュベーションし、そしてＡｘｉｏｐｌａｎ ＩＩ蛍光顕微鏡（Carl Zeiss）を使用して調べた。核対比染色を、蛍光ＤＮＡインターカレート剤である４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI, Boehringer Mannheim）を使用して実施した。
【００７１】
タンパク質相互作用アッセイ（プルダウンＧＳＴ−ＣＲＭＰ２）
前記のように調製した１００μlのジャーカット細胞溶解液を、グルタチオン−セファロース４Ｂ（Pharmacia Biotech）に結合させた（４℃で１時間）８０μlのＧＳＴ−ＣＲＭＰ２融合タンパク質または８０μlのＧＳＴタンパク質のいずれかに加えた。ＧＳＴ−ＣＲＭＰ２ビーズおよびＧＳＴビーズを４回洗浄し（５０mMトリス（ｐＨ７．４）、１mM ＥＤＴＡ、１５０mM ＮａＣｌ、および０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０）、そしてＣＲＭＰ−２ビーズにまたはＧＳＴビーズのみに結合したタンパク質を溶出した。ＧＳＴ（ＧＳＴビーズにおける）、ＹｅｓおよびＣＲＭＰ２（ＧＳＴ−ＣＲＭＰ２ビーズにおける）並びにＧＳＴ（ＧＳＴビーズおよびＧＳＴ−ＣＲＭＰ２ビーズにおける）をウェスタンブロットによって明らかとした。
【００７２】
ウェスタンブロット
ＣＸＣＬ１２による処理後、細胞を、ホスファターゼ阻害剤（フッ化Ｎａ５mM、ピロリン酸Ｎａ１mM、β−グリセロリン酸１mM、オルトバナジン酸１mM）およびプロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリートＴＭ（Roche）の補充されたホモジナイゼーション緩衝液（トリス２０mM、ＥＤＴＡ１mM、ＥＧＴＡ５mM、スクロース１０％、ｐＨ７．４）中に溶解した。溶解液を超音波にかけて、細胞凝集物を解離させ、そして全タンパク質をローリーアッセイ（Bio-Rad）によって測定した。タンパク質試料（１０〜２０μg）を還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、そして遮断溶液（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％無脂肪ドライミルク、１時間）と共に前もってインキュベーションしたニトロセルロースメンブレン（BA85; Schleicher & Schuell Microscience）に転写し、そして特異的な抗体に対してブロッティングし（一晩、４℃）、その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させたウサギおよびヒツジのＩｇＧ抗体と共にインキュベーションし（１時間、室温）、そして化学発光（ＥＣＬ）検出システム（Covalab Lyon, France）を行なった。イムノブロットバンドの濃度定量をImage Quant (Molecular dynamics)を使用して実施し、そしてデータをあらゆる処理の前に検出された量に対する比として表現した。
【００７３】
データベースおよび構造分析
予測プログラムＰＲＯＳＩＴＥ（http://us.expasy.org/prosite）を使用して、ＣＲＭＰ２上における推定チロシンキナーゼ部位を同定した。ＣＲＭＰ２の構造を、ＣＲＭＰ２のＤ鎖について入手可能な座標に基づいて(Stenmark et al. (2007) J. Neurochem. 101:906-917) (タンパク質データバンクエントリー2GSE)、Viewerlite/4.2 (Accelrys)を使用してモデリングした。
【００７４】
ＣＲＭＰ２のクローニングおよび発現
ヒトＣＲＭＰ−２に対するコード配列（ＮＭ＿１３８６）を、発現ベクターｐＥｔ２１ｂ（Novagen）にサブクローニングし、その結果、Ｎ末端にヘキサヒスチジンタグを有する構築物が得られた。このプラスミドを、Escherichia coli BL21(DE3)細胞に形質転換した。発現のために、細胞を、バブル型フラスコ中の１５００mLのＴＢ培地（７％グリセロール、５０μg/mlのカナマイシンおよび１００μLのＢＲＥＯＸを含む）中で増殖させた。細胞を＋３７℃で、６００nmにおける吸光度が２．５に到達するまで増殖させた。培養液を＋１８℃まで水浴中で１時間かけて冷却した。ＣＲＭＰ−２の発現を、０．５mmol/LのＩＰＴＧの添加によって誘導し、そして発現を＋１８℃で一晩かけて継続させた。細胞を遠心分離によって収集し、そしてペレットを、コンプリートＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Roche, Basel, Switzerland）および２０００Ｕのベンゾナーゼの補充された溶解緩衝液（２０mMトリス、５００mM ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴ、２０％グリセロール、０．１％トリトン、１０mMイミダゾール）中に懸濁した。溶液を氷上で数サイクルの間、超音波にかけた。試料を１４，０００ｇで４℃で３０分間遠心分離にかけ、そして上清を、溶解緩衝液（QIAGEN）中に５０％再懸濁した１．５mlのＮｉ−ＮＴＡ樹脂と共に４℃で９０分間かけてインキュベーションした。Ｈｉｓタグのついたタンパク質を、洗浄緩衝液（２０mMトリス、５００mM ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴ、２０％グリセロール、０．１％トリトン、２０mMイミダゾール）中のＮｉ樹脂から精製し、そして溶出緩衝液（洗浄緩衝液＋１５０mMイミダゾール）を用いて１mlの画分ずつ溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【００７５】
in vitroにおけるＹｅｓキナーゼアッセイ
アッセイ前に、ＨｉｓタグのついたＣＲＭＰ２を、製造業者の指示に従って、Float-A-lyzer技術(Interchim)を使用して一晩かけて４℃で緩衝液（４０mM ＭＯＰＳ、０．５mM ＥＤＴＡ、５％グリセロール）中で透析した。Ｙｅｓキナーゼアッセイのために、０．６μgの透析されたＨｉｓタグのついたＣＲＭＰ２を、酵素希釈緩衝液（２０mM ＭＯＰＳ ｐＨ７、１mM ＥＤＴＡ、０．０１％Ｂｒｉｊ、０．１％β−メルカプトエタノール、５％グリセロール）中に事前に希釈された２０ngの組換え完全長ヒトＹｅｓ（Millipore）と共にインキュベーションした。反応を、５０μlの反応緩衝液（８mM ＭＯＰＳ、０．２mM ＥＤＴＡ、３０mM ＭｇＣｌ２、２mM ＥＧＴＡ、１０mM β−グリセロリン酸、０．４mM Ｎａ３ＶＯ４、０．４mM ＤＴＴ、２００μM ＡＴＰ）中で３０℃で３０分間かけて行なった。反応をローディング緩衝液を用いて停止し、そして混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。
【００７６】
トランスマイグレーションアッセイ
Ｔ細胞のトランスマイグレーションを、マイクロトランスウェルシステム（Costar Transwell支持体−Ａ）および器官型のマウス脳培養液（Ｂ）の両方においてジャーカットＴ細胞を用いて実施した。
【００７７】
Ａ：トランスマイグレーションを、３回、トランスウェルシステム（ボイデンチャンバー、Costar、直径５μmの孔サイズのメンブレン）中でVincent et al. (2005) J. Immunol. 175:7650-7660に記載のように実施した。簡潔に言うと、Ｔ細胞調製物（３×１０５個の細胞／ウェル）を上のチャンバーに加え、そしてＣＸＣＬ１２を下の区画に加えた（１０ng/ml）。３７℃で２時間インキュベーションした後、下のチャンバー中で遊走している細胞を、顕微鏡下で計測した（少なくとも３０か所の視野を調べた）。
【００７８】
Ｂ：神経組織上におけるＴ細胞のトランスマイグレーションを、以下のように調製した海馬培養液上でアッセイした。生後（Ｐ７）Ｃ５７ＢＬ６マウスの海馬を解剖し、そしてグルコース（６．５mg/ml）の補充された冷ゲイ平衡化溶液中に直ちに入れた。４００μmの切片を、ＭｃＩＩｗａｉｎティッシュチョッパーを使用して海馬の中隔側頭軸に対して垂直に切断した。切片を過剰な組織については注意深く整え、そして６つの切片を、６ウェルプレート中の３０mmの半透過性メンブレンインサート（Millicell-CM, Millipore）上に置いた（各々のウェルは１mlの培養培地を含む）。培養培地は、５０％最小必須培地（Gibco）、２５％ハンク平衡塩溶液、２５％熱不活化ウシ血清（Gibco）、１％ｌ−グルタミン２００mM（Gibco）および６．５mg/ml Ｄ−グルコースから構成された。プレートを３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションした。培養培地を１週間に２回交換した。ex vivoにおいて生体の蛍光色素カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル／ＣＦＳＥ（１mM、５分間、３７℃）を使用して染色されたジャーカットＴ細胞（１つの切片あたり１×１０６個の細胞）を、海馬切片（１週間培養液）の近くにスポットした。３７℃で１８時間接触させた後、切片をＤ−ＭＥＭを用いて十分に洗浄し、エタノールで固定し（１０分間、４℃）、そして核対比染色のためにＤＡＰＩと共にインキュベーションした。蛍光顕微鏡下で計測された浸潤リンパ球の数は、ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆを用いてトランスフェクションされたＴ細胞個体群において減少した。
【００７９】
統計分析
２つの平均の比較における統計学的有意性は、独立スチューデントｔ検定を用いて試験され、０．０５未満のｐ値を有意と考えた。遊走試験においては、遊走リンパ球の数を光学顕微鏡（１条件あたり１５〜２０個の顕微鏡視野、２回または３回の独立した実験）によって計測し、そしてデータを、１視野あたりの遊走リンパ球の平均数として表現した。
【００８０】
結果
ＣＸＣＬ１２は、Ｔリンパ球の尾足におけるＣＲＭＰ２の極性化を誘導する
ケモカインとＣＲＭＰ２との間の連関を定義するために、本発明者らはまず、ＣＸＣＬ１２シグナリング下におけるジャーカットＴ細胞におけるＣＲＭＰ２の局在を調べた。本発明者らは、完全長および切断産物のＣＲＭＰ２を認識する２つの異なる抗ＣＲＭＰ２抗体（抗Ｃ−ｔｅｒ抗体および抗ｐｅｐ４抗体）を使用した。非処理Ｔ細胞の免疫蛍光研究は、ＣＲＭＰ２が、点状のドットとしてＴ細胞の細胞質内に見られたことを明らかとした。ＣＸＣＬ１２による処理下において、ＣＲＭＰ２は、２分以内に細胞の後縁に移動し、そして１０分間の処理後に大半の極性化した細胞において準排他的な尾足における局在を示した。ＣＲＭＰ２極性化のこのような現象は、処理から３０分後にも依然として観察された。非処理ジャーカットＴ細胞は、細胞において非対称的なＣＲＭＰ２の分布を示したが、ＣＸＣＬ１２の処理後に１．６〜２倍の増加が観察された（図１）。同じようなＣＲＭＰ２の再局在化が、抗ｐｅｐ４抗体染色によっても観察された。さらに、尾足へのＣＲＭＰ２の分布が、ビメンチンの再局在化と同時に起こり、このビメンチンは極性化しているＴ細胞の後縁に迅速に再分布した。興味深いことに、ＣＲＭＰ２の再局在化は、ＣＸＣＬ１２レセプター（ＣＸＣＲ４）のアンタゴニストであるＡＭＤ３１００の存在下において非常に大きな程度で逆行し（３５％の減少）、結果として、ＣＸＣＬ１２誘導応答の特異性が確認された（図２）。これらの結果は、ケモカインが、ビメンチンと協奏して、Ｔリンパ球において、すなわちフレキシブルな尾足構造へと、ＣＲＭＰ２の動的な再局在化を誘導し得るという意見を支持した。
【００８１】
ＣＸＣＬ１２は、細胞骨格へのＣＲＭＰ２の結合をモデュレーションする。
Ｔ細胞の尾足にはビメンチンおよび微小管が豊富であり（Serrador et al. (1999) Trends Cell Biol. 9:228-233）、この２つの細胞骨格エレメントは両方共に、ＣＲＭＰ２の結合対（Vincent et al. (2005) J. Immunol. 175:7650-7660; Gu et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:17917-17920）並びにＴリンパ球の極性化および遊走におけるアクター（Krummel et al. (2006) Nat. Immunol. 7:1143-1149）として記載されていることは周知である。このことから、本発明者らは、ＣＸＣＬ１２が、細胞骨格へのＣＲＭＰ２の結合をモデュレーションして、Ｔ細胞の運動性を促進し得ると仮定した。ＣＸＣｌ２による処理後（１００ng/ml、１０分間および３０分間）、細胞下分画をジャーカットＴ細胞抽出物に対して実施して、細胞骨格エレメントおよび会合タンパク質を細胞質画分から単離した。ビメンチン、チューブリンＰＡＲＰおよびＨｓｐ９０に対する抗体を使用する細胞下画分の同定は、細胞骨格画分と細胞質画分との間のコンタミが全くないことを示した。細胞骨格画分は、中間径フィラメントのビメンチンを示したが、チューブリンは含まず、これはおそらく、チューブリンが細胞質に見られるので脱重合に起因する。その後、異なる画分を、抗ＣＲＭＰ２抗体を使用してウェスタンブロットにかけた。非処理細胞の全細胞溶解液において、抗Ｃ−ｔｅｒ抗体は、以前に記載された完全長ＣＲＭＰ２（６２ｋＤａ）に対応するＣＲＭＰ２バンド、およびより高い分子量を有するバンドを明らかとした（図３）。抗ｐｅｐ４抗体は主に、神経細胞において報告されているような（Rogemond et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:14751-14761）、切断型のＣＲＭＰ２に対応する５８ｋＤａバンドを認識した。抗ｐｅｐ４抗体の親和性は、完全長型よりも切断型に対しての方が高かった。ＣＸＣＬ１２による処理後、その効率をＥｒｋ１／２リン酸化によって評価し（図３）、ＣＲＭＰ２発現の差異は全細胞溶解液においては検出できなかった。しかしながら、ＣＲＭＰ２型の分布は調べたＴ細胞の区画によって異なった。完全長ＣＲＭＰ２およびより高い分子量バンドは細胞質画分に見られた。これらはＣＸＣＬ１２処理下において主な変化を示さなかった。ＣＲＭＰ２はまた、６２ｋＤａの完全長型および５８ｋＤａの切断型として細胞骨格画分においてより少ない程度で見られた。興味深いことに、両方の型の発現は、ＣＸＣＬ１２による処理の後に増強された。切断されたＣＲＭＰ２の大半が核に見られ、そしてＣＸＣＲ４による活性化下で改変されなかったことは注記すべきである。これらの結果は、ＣＲＭＰ２がＴリンパ球の細胞骨格区画に分布し、そしてＣＸＣＬ１２はこの分布を変化させ、細胞骨格エレメントとＣＲＭＰ２の会合を増強する能力を有することを示した。
【００８２】
ＣＸＣＬ１２は、ＣＲＭＰ２のリン酸化を増加させる。
神経細胞におけるＣＲＭＰ２の機能的調節は主に、特にＧＳＫ−３βキナーゼ活性およびＣｄｋ５のキナーゼ活性を介する、そのリン酸化状態に依存する（Uchida et al. (2005) Genes Cells 10:165-179）。それ故、本発明者らは、Ｔリンパ球において、ＣＸＣＬ１２が、そのリン酸化のモデュレーションを通して、細胞骨格へのＣＲＭＰ２の結合を改変し得るかどうかを研究した。ＣＲＭＰ２のリン酸化を評価するために、本発明者らは、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）による処理後にジャーカットＴ細胞の全細胞抽出物に対してリン酸化タンパク質濃縮アッセイ（TALON（登録商標）PMAC Clonetech）を実施し、そして処理から２、５、１０および３０分後にウェスタンブロットによって非リン酸化画分（素通り画分）およびリン酸化画分（溶出液）に対してイムノブロットを行なった。抗Ｃ−ｔｅｒ抗体によって明らかとなった完全長ＣＲＭＰ２型は、非リン酸化画分およびリン酸化画分の両方に存在した（図４）。これに対し、切断型のＣＲＭＰ２は、リン酸化タンパク質プールにおいてのみ見られ、このことは、この型が、大部分はリン酸化されていることを示す。ＣＸＣＬ１２による処理は、ＣＲＭＰ２リン酸化型のレベルを急速に増加させ、処理から２分後にピークに達し、そして依然として３０分後にも高かった。リン酸化タンパク質濃縮手順の効率は、リン酸化Ｅｒｋ１／２イムノブロットによって確認され、これは、溶出液中のリン酸化タンパク質の特異的存在、および同時に、ＣＸＣＬ１２による処理後の増加を確認した。健康ドナーから単離した初代Ｔリンパ球に対して実施された類似の実験は類似の観察を示した。ＣＸＣＬ１２に応答したＣＲＭＰ２リン酸化のより正確な評価を、それぞれＣｄｋ５キナーゼおよびＧＳＫ−３キナーゼによってターゲティングされる２つの部位を認識する、抗ＣＲＭＰ２−ｐＳｅｒ５２２抗体および抗ＣＲＭＰ２−ｐＴｈｒ５０９／５１４抗体を使用して実施した（図５）。ジャーカット細胞溶解液のイムノブロットは、ＣＲＭＰ２−ｐＳｅｒ５２２およびＣＲＭＰ２−ｐＴｈｒ５０９／５１４が、Ｔ細胞において完全長６２ｋＤａのＣＲＭＰ２として存在し、そしてケモカイン処理中に種々に発現され、その効率はリン酸化Ｅｒｋ１／２の検出によって確認された。Ｓｅｒ５２２リン酸化は比較的低いレベルで見られたが、Ｔｈｒ５０９／５１４リン酸化は、４分後までに急速に減少し、そしてその後は検出できなかった。これは、Ｃｄｋ５キナーゼおよびＧＳＫ−３キナーゼの活性型である、Ｃｄｋ−ｐＴｙｒ１５、Ｃｄｋ５−ｐＳｅｒ１５９、ＧＳＫ−３α−ｐＴｙｒ２７９およびＧＳＫ−３β−ｐＴｙｒ２１６の検出によって評価される、Ｃｄｋ５キナーゼおよびＧＳＫ−３キナーゼの活性と一致した（図６）。Ｃｄｋ５は、Ｔｙｒ１５およびＳｅｒ１５９上において安定したレベルのリン酸化を示し、Ｃｄｋ５の保存された活性化レベルを反映した。これに対し、ＧＳＫ−３は、ＧＳＫ−３βアイソフォーム上で主に検出された脱リン酸化を示し、これは処理から４分後に始まる低下した活性を反映した。合わせて考えると、これらの結果が初めて、神経細胞において以前に記載されたように、ＣＲＭＰ２残基のＳｅｒ５２２およびＴｈｒ５０９／５１４がＴリンパ球においてリン酸化され得ることを明らかとした。より重要なことには、それらは、ＣＸＣＬ１２が、ＣＲＭＰ２のこれらの残基のリン酸化の異なるモデュレーションをもたらすシグナルカスケードをトリガーし、すなわち、Ｔｈｒ５０９／５１４上におけるリン酸化は正味で減少することを実証する。興味深いことに、これらのモデュレーションは主に完全長型ＣＲＭＰ２上で検出されたが、リン酸化タンパク質濃縮アッセイ（図４）は、ケモカイン処理後の切断型のＣＲＭＰ２の強力なリン酸化を示した。これにより本発明者らは、ＣＸＣＬ１２に対するＣＲＭＰ２の応答におけるさらに他のリン酸化ターゲットの関与を疑った。
【００８３】
チロシン４７９は、ＣＲＭＰ２配列における新たなリン酸化残基である。
ＣＸＣＬ１２が、Ｌｃｋ、ＺＡＰ−７０およびＩｔｋを含むチロシンキナーゼの連続的補充および活性化を含む、Ｔリンパ球におけるチロシンリン酸化カスケードをトリガーすることが知られている（Patrussi et al. (2008) Immunol. Lett. 115:75-82）。それ故、本発明者らは、ＣＲＭＰ２タンパク質配列を分析することによって、ケモカイン処理下でモデュレーションされる可能性のあるチロシンターゲット残基について探索した。５７２個のアミノ酸のデータベース研究は、残基４７２〜４７９内のリン酸化チロシン共通モチーフＫｘｘｘＤｘｘＹ内に位置する、可能性ある新たなリン酸化残基としてチロシン４７９（Ｙ４７９）を同定した（図７）。さらに、この領域の検査はまた、Ｙ４７９の近くの、残基４６７〜４７３内のＲｘｘＰｘｘＰ型の推定ＳＨ３結合モチーフの存在を示した。結合タンパク質対へのこれらの配列の近づきやすさを評価するために、本発明者らは、フラグメント１５〜４８９について入手可能な座標に基づいて、ＣＲＭＰ２の既知構造内（図７）におけるＹ４７９およびＳＨ３結合モチーフの両方の位置を評価した（Stenmark et al. (2007) J. Neurochem. 101:906-917）。このＣＲＭＰ２型の表面露出図は、Ｙ４７９とは対照的に、推定ＳＨ３結合モチーフが露出していることを明らかとし、このことは、ＳＨ３ドメインを有するタンパク質との結合の可能性を示唆する（図７の挿入図）。ＳＨ３ドメイン結合モチーフとの相互作用は、タンパク質コンフォメーション変化を誘導し（Martinez and Serrano (1999) Nat. Struct. Biol. 6:1010-1016）、よって前記タンパク質コンフォメーションがその後のＹ４７９の露出の基礎であり得ることが示された。これらの観察は、ＣＲＭＰ２配列内の主要な推定リン酸化チロシンとしてのＹ４７９を示唆した。
【００８４】
ＣＲＭＰ２のチロシンリン酸化は、ＳｒｃファミリーキナーゼＹｅｓによって行なわれ、そしてこれはケモカイン処理下で増加する。
潜在的なリン酸化可能な部位Ｙ４７９に近い推定ＳＨ３結合モチーフの存在の観点から、そのＳＨ３ドメインを通したＣＲＭＰ２とチロシンキナーゼとの間の可能性ある相互作用を研究した。これは、活性コンフォメーションで折りたたまれたままであるいくつかのタンパク質ＳＨ３ドメインを有するメンブレンアレイを使用して実施された。１０個の異なるリンパ球チロシンキナーゼ（エーベルソンキナーゼ（Ａｂｌ）、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｙｅｓ、ｃ−Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、Ｂｌｋ）およびＴｅｃファミリーキナーゼ（Ｉｔｋ、Ｔｘｋ、Ｂｌｋ）を含む）がこのアレイに存在した。Ｈｉｓタグのついた組換えＣＲＭＰ２のハイブリダイゼーション後、タンパク質−タンパク質相互作用を、抗Ｈｉｓ抗体を使用して可視化し、そしてスポット強度は相互作用の強度を明らかとした（表１）。
【００８５】
表１：ＳＨ３タンパク質−ＣＲＭＰ２の相互作用の同定
ＣＲＭＰ２−Ｈｉｓ組換えタンパク質を、製造業者の指示に従って、３８個のタンパク質のＳＨ３ドメインを用いて２回スポットされたメンブレン（TranSignal TM SH3ドメインアレイＩ-Panomics）と共にインキュベーションした。抗Ｈｉｓ抗体は、いくつかのチロシンキナーゼタンパク質のＳＨ３ドメインを含む、複数のＳＨ３ドメインとＣＲＭＰ２との会合を明らかとした。スポット強度（−から＋＋＋まで）は、リガンドＣＲＭＰ２に対するＳＨ３ドメインの結合親和性を示し、そしてＣＲＭＰ２についての強力なチロシンキナーゼ候補としてのＹｅｓを明らかとした。
【００８６】
【表１】
【００８７】
Ｙｅｓキナーゼは、ＣＲＭＰ２への強い結合を示したが、ＢｌｋおよびＡｂｌは弱いシグナルを示した。さらに、Ｖａｖ１、ＰＬＣγ、ＩＴＳＮおよびＰＩ３βに属する４つの非キナーゼタンパク質ＳＨ３ドメインもまた、ＣＲＭＰ２への強い結合を示した。興味深いことに、ＰＬＣγおよびＩＴＳＮは以前に、ＣＲＭＰ２に対する結合対として観察されている（Quinn et al. (2003) J. Neurosci. 23:2815-2823; Buttner et al. (2005) Biochemistry 44:6938-6947）。その後、本発明者らは、ＣＲＭＰ２リン酸化についてのより強力なチロシンキナーゼ候補であるＹｅｓに焦点を当てた。
【００８８】
Ｙｅｓ／ＣＲＭＰ２相互作用をいくつかのアプローチによって評価した。まず、これらのタンパク質の局在を、コラーゲンＩでコーティングされたカバーガラスに付着させ、そしてその後、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml、５分間）で処理した、初代Ｔリンパ球およびジャーカットＴ細胞上で評価した。抗Ｙｅｓ抗体および抗ｐｅｐ４抗体を用いて実施された免疫蛍光は、特に極性化したＴ細胞の尾足における、ＣＲＭＰ２およびＹｅｓの共分布を示した。Ｙｅｓ／ＣＲＭＰ２の相互作用を次に、初代Ｔリンパ球および神経細胞（Ｄｅｖ細胞株）（ＣＲＭＰ２はまた、中枢神経系（ＣＮＳ）における運動性にも関与しているため）からの細胞溶解液を使用してＧＳＴプルダウンアッセイによって調べた（図８）。グルタチオン−セファロースビーズ上に固定されたＣＲＭＰ２を細胞溶解液と共にインキュベーションした。両方の細胞型からの溶出液に対して実施されたウェスタンブロットは、ＣＲＭＰ２−ＧＳＴと会合したＹｅｓタンパク質の存在は示したが、ＧＳＴのみと会合したものは示さなかった。合わせて考えると、これらの結果は、ＣＲＭＰ２に対する強力な結合対としてのＹｅｓキナーゼを規定した。この相互作用の機能的意義を評価するために、in vitroにおけるキナーゼアッセイを、活性組換えヒトＹｅｓキナーゼおよび基質としてのＨｉｓタグのついたＣＲＭＰ２を使用して実施した（図９）。リン酸化を、イムノブロットによって抗リン酸化チロシン抗体を使用して検出した。対照はＣＲＭＰ２の非存在下において実施され、これはＹｅｓの自己リン酸化を示した。ＣＲＭＰ２のリン酸化に対応するバンドは、ＡＴＰの存在下においてのみ検出された。タンパク質リン酸化の結果として、このバンドは、分子量の僅かな増加を示した。
【００８９】
Ｔ細胞におけるチロシンリン酸化型のＣＲＭＰ２の存在を確認するために、リン酸化残基Ｔｙｒ４７９を含むＣＲＭＰ２配列のフラグメント（ＡＡ４７０〜４８３）に対するポリクローナル抗体を生じさせた。この抗体を用いてのイムノブロットは、完全長および５８ｋＤａの切断されたタンパク質の両方として検出された、Ｔリンパ球におけるＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ４７９の存在を明らかとした。
【００９０】
ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml；０、１、２、４、６、１０、１５、３０分間）を用いて処理したジャーカットＴ細胞におけるＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ４７９の調査は、Ｔｙｒ４７９リン酸化の増加を示し（図１０）、これは主に処理から８〜１４分後に観察された。ＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ４７９の増加した発現は、ＣＲＭＰ２−Ｔｈｒ５０９／５１４の減少と同時に起こり、これはその依存性を示唆する。Ｔｙｒ４７９リン酸化のこのピークは、Ｙｅｓを含むリン酸化Ｓｒｃファミリーメンバーを認識する抗体である、抗Ｓｒｃ−ｐＴｙｒ４１６抗体を使用したイムノブロットによって示されるように、この時点においてＳｒｃ−ファミリーキナーゼの活性化と相関した。その後、免疫蛍光を、リン酸化型および非リン酸化型のＣＲＭＰ２に対する抗体を使用して、ＣＸＣＬ１２で処理した（１５分間）ジャーカット細胞に対して実施した。ＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ４７９についての染色は主に、Ｔリンパ球における極性化した分布を伴った。ビメンチンとの共局在は、それぞれビメンチンと会合しているまたは会合していないのいずれかである抗ｐｅｐ４抗体および抗Ｃ−ｔｅｒ抗体によって認識されるＣＲＭＰ２型と比較して、リン酸化されたＣＲＭＰ２−Ｔｙｒ４７９は主に、尾を引く極においてビメンチンと共局在することを示した。合わせて考えると、これらの結果は、ＣＸＣＬ１２シグナリングによってモデュレーションされ、細胞骨格エレメントと共局在し、そしてＳｒｃ−ファミリーキナーゼＹｅｓによってターゲティングされ得る、新たな型のリン酸化ＣＲＭＰ２を同定した。
【００９１】
ＣＲＭＰ２−Ｔｙｒ４７９リン酸化は、ケモカインにより誘導されるＴ細胞の極性化および遊走に関与する。
Ｔｙｒ４７９上におけるＣＲＭＰ２リン酸化の機能的意義を評価するために、本発明者らは、完全長ＣＲＭＰ２配列上における突然変異Ｙ４７９−Ｆを工学操作した。その後、Ｔ細胞の極性化に対するＴｙｒ４７９リン酸化障害の作用を、ＦｌａｇのタグのついたＣＲＭＰ２−ｗｔおよびＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆ突然変異体を用いて一過性にトランスフェクションされたジャーカットＴ細胞において分析した。トランスフェクションから２４時間後、Ｔ細胞をコラーゲンＩでコーティングされたスライドに付着させ、その後、ＣＸＣＬ１２で処理し、そして蛍光顕微鏡によって調べた。Ｆｌａｇ陽性免疫染色によって可視化されるような、トランスフェクションされたＴ細胞におけるＣＲＭＰ２の極性化を、ビメンチンネットワークの共局在化に基づいて調べた。これにより本発明者らは、ＣＲＭＰ２−ｗｔまたはＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−ＦのいずれかでトランスフェクションされたＦｌａｇ陽性Ｔ細胞の極性化を評価することが可能となった（全トランスフェクション細胞に対する比率として表現）。ＣＲＭＰ２−ｗｔを用いてトランスフェクションされた非処理ジャーカットＴ細胞個体群は、約２８％の自発的に極性化した細胞を示したが、これは、ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆ突然変異体を用いてトランスフェクションされたＴ細胞においては明らかに減少した（図１１）。ＣＸＣＬ１２による処理後、ビメンチンは、ＣＲＭＰ２−ｗｔでトランスフェクションされたＴ細胞においては尾足に迅速に再分布した。これに対し、ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆでトランスフェクションされた細胞は、明らかにあまり極性化しなかった（図１１）。さらに、ＣＸＣＬ１２による処理後の極性化した細胞数の増加は、ＣＲＭＰ２−ｗｔよりもＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆを用いてトランスフェクションされたジャーカットＴ細胞においての方がより少なく（それぞれ４２％ｖｓ３１％）（図１１）、従って、Ｔ細胞の極性化に対するＴｒｙ４７９リン酸化の影響が確認された。これらの結果は明らかに、Ｔリンパ球の極性化におけるＣＲＭＰ２−Ｔｙｒ４７９リン酸化の役割を示した。
【００９２】
Ｔ細胞の極性化は遊走にとって必要条件であるので、本発明者らはさらに、Ｔ細胞の遊走に対するＴｙｒ４７９リン酸化の影響を評価した。従って、本発明者らはまず、トランスウェルチャンバーにおいてトランスマイグレーションアッセイを実施することによって、ＣＸＣＬ１２の方へと、トランスフェクションされたジャーカットＴ細胞が遊走する能力を評価した。図１２に示したように、ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆでトランスフェクションされた細胞の遊走速度は、ＣＲＭＰ２−ｗｔおよび対照細胞（空ベクター）と比較して劇的に減少した。血管を横切るために必要であるＴ細胞のトランスマイグレーションを超えて、侵入組織内における遊走もまた、特にＣＮＳ内においてはキーポイントである（ＣＮＳではＣＸＣＬ１２およびその同族レセプターが構成的に発現されている）。それ故、本発明者らは、Ｔｙｒ４７９リン酸化が、神経組織内におけるＴ細胞の遊走に対して影響を及ぼすかどうかを、マウス海馬器官型培養液を使用して調べた。トランスフェクションされたジャーカットＴ細胞（４０〜５０％のトランスフェクション効率）を、生体の色素のＣＦＳＥで染色することにより、神経組織上および神経組織中の両方においてそれらを容易に可視化した。その後、細胞を脳切片の近くにスポットし、そして１８時間のインキュベーション後に計測した。ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆでトランスフェクションされた細胞は、野生型のトランスフェクション細胞と比較して、神経細胞上を移動する低下した能力を示した（図１３）。これらの結果は、神経組織内のＴ細胞の遊走過程におけるＣＲＭＰ２−Ｔｙｒ４７９リン酸化の役割を実証した。
【００９３】
従って、本発明者らは、チロシン４７９上のリン酸化がＴ細胞の遊走に対して影響を及ぼし、従って、ＣＮＳの炎症疾病の予測マーカーとして使用することができることを実証した。
【００９４】
実施例２
本発明者らは、ＴＣＲ刺激によって媒介されるＴリンパ球の活性化が、ＣＲＭＰ２、より特定すると、国際出願ＷＯ２００３／０２２２９８に記載の抗ペプチド４抗体による切断型のＣＲＭＰ２の検出の増加をもたらしたことを示した。
【００９５】
興味深いことに、これらの抗体は、カラムで濃縮されたリン酸化型のＣＲＭＰ２を強く認識した。さらに、Ｓ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２は、ＣＮＳに記載されたリン酸化型のＣＲＭＰ２の中で主要なリン酸化型のＣＲＭＰ２である。
【００９６】
従って、これらの結果は、切断されたＳ４６５リン酸化ＣＲＭＰ２の検出が、ＴＣＲ刺激によって媒介されるＴリンパ球の活性化に関連し、そしてこれをＴＣＲ活性化の末梢マーカーとして使用することができることを示唆する。
【００９７】
実施例３
本発明者らは、ＨＴＬＶ−１感染に関連した多発性硬化症または脊髄症を患う患者において、活性化Ｔリンパ球の亜個体群（ＣＤ６９＋および／またはＨＬＡ−ＤＲ＋）が、健康被験体よりもより強くＣＲＭＰ２を発現したことを示した。
【００９８】
本発明者らは、この改変が、Ｔリンパ球の遊走能の増加に関連することを示した。さらに、この増加は、抗ＣＲＭＰ２抗体を使用して阻害され得る。
【００９９】
ＣＲＭＰ２の高い発現は、抗ペプチド４抗体を使用して検出された。これらの抗体は特にリン酸化および切断された型のＣＲＭＰ２を認識するので、この増加した検出はおそらく、ＣＲＭＰ２リン酸化の改変、特に、ＣＲＭＰ２のＳ４６５リン酸化に起因する。
【０１００】
従って、これらの結果は、ＣＲＭＰ２の切断およびＴリンパ球におけるリン酸化ＣＲＭＰ２の過剰発現が（ＴＣＲ刺激を介するセリン４６５上およびケモカイン活性化を介するチロシン４７９上）、神経炎症過程の末梢マーカーであり、そしてこれを中枢神経系の炎症疾病の早期診断、予知またはモニタリングに使用することができることを実証する。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、中枢神経系の炎症疾病を予測、診断および／または処置するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
神経炎症疾病、すなわち中枢神経系の炎症疾病は、炎症、および通常は脱髄、および軸索損傷に関連した急激な神経障害によって特徴付けられる。これらの疾患では、神経炎症が、脳および脊髄における神経細胞線維を絶縁する髄鞘を損傷し、それが下にある神経に対して広範でしばしば永久的な損傷を引き起こす。神経炎症疾病を患う患者には、感覚機能および運動機能の劇的で時に永久的な低下が起こる。神経炎症疾病に関連した有病率、罹患率および死亡率に因り、それらはかなりの医学的、社会的および経済的重荷を課す。北米においてはこれらの神経学的状態に５００万人を超える人が罹患し、そして年間７５０億米ドルを超える治療費が発生すると推定されている。
【０００３】
神経炎症疾病は診断および処置が困難である。残念なことに、不正確な診断により患者に不確実性が生じる。従って、神経炎症症状を寛解しそして神経学的機能を保存するための適切な処置法が確実に実行されるために、神経炎症疾病を診断するための迅速かつ正確な方法が重要である。従って、中枢神経系の炎症疾病を予測、診断および／または処置するための新たな方法が必要とされる。
【０００４】
本発明者らは、国際出願ＷＯ２００３／０２２２９８において、免疫系の機能障害に関連した病態の処置、予知または診断のためのコラプシン応答媒介タンパク質２（ＣＲＭＰ２）の可能性ある使用を示した。より具体的には、本発明者らは、ＣＲＭＰ２が、異常免疫病態を患う患者のＴリンパ球において高いレベルで存在し、そして高度にリン酸化された型のＣＲＭＰ２の核移行が、ＨＴＬＶ−１に感染したリンパ球、またはＦａｓ／Ｆａｓリガンド系に関連した免疫不全を有する患者のＴリンパ球において増加したことを示した。
【０００５】
ＣＲＭＰは、中枢神経系（ＣＮＳ）の軸索成長中の細胞骨格再配列のモデュレーターであることが知られている５つのメンバーのファミリーである。Ｔリンパ球およびＣＮＳにおいては、ＣＲＭＰ２は、６２ｋＤａの完全長型（ＣＲＭＰ２−６２）および５８ｋＤａの切断型（ＣＲＭＰ２−５８）の両方を提示する。４つのリン酸化型のＣＲＭＰ２がこれまでに記載されている：セリン５２２上でリン酸化されたＣＲＭＰ２（ｐＣＲＭＰ２−Ｓｅｒ５２２）、トレオニン５０９および５１４上でリン酸化されたＣＲＭＰ２（ｐＣＲＭＰ２−Ｔｈｒ５０９／５１４）、トレオニン５５５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２（ｐＣＲＭＰ２−Ｔｈｒ５５５）およびセリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２（Uchida et al. (2005) Genes Cells 10:165-179; Cole et al. (2006) J Biol Chem 281:16581-16588）。
【０００６】
本発明者らは、ＣＲＭＰ２の新たなリン酸化部位を同定した：チロシン４７９（Ｙ４７９）。本発明者らは、Ｙ４７９のリン酸化が、ＣＸＣＬ１２ケモカインによるＴリンパ球の膜ＣＸＣＲ４レセプターの活性化によって誘導され（Varrin-Doyer et al. (2009) J Biol Chem 284:13265-13276）、一方、Ｓ４６５のリン酸化はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の刺激後に誘導されたことを実証した。
【０００７】
発明の要約
本発明は、（ｉ）Ｙ４７９の突然変異が、Ｔ細胞極性化およびＴ細胞遊走速度を含むＴ細胞遊走能を減少させ、これは、神経炎症過程におけるＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の重要性を示し、そして（ｉｉ）ＨＴＬＶ−１によって誘発される多発性硬化症または脊髄症を患う患者が、高いレベルのＳｅｒ４６５のリン酸化され切断されたＣＲＭＰ２を有する活性化Ｔ細胞個体群を提示したという本発明者らによる意外な所見からもたらされる。これらのリン酸化および切断は、患者の免疫細胞におけるウェスタンブロットまたはフローサイトメトリーによって容易に検出できるという利点を有する。
【０００８】
従って、本発明は、被験体における中枢神経系の炎症疾病のin vitroにおける予知、診断および／またはモニタリングのための方法に関し、前記方法は、被験体からの免疫系細胞の試料中における、チロシン４７９（Ｙ４７９）上でリン酸化されたコラプシン応答媒介タンパク質２（ＣＲＭＰ２）の存在を検出することを含み、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在の検出は、中枢神経系の炎症疾病を示す。
【０００９】
本発明はまた、チロシン４７９上でリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体、および中枢神経系の炎症疾病の予知、診断および／またはモニタリングにおけるその使用、免疫細胞の遊走を減少させるためのその使用、および中枢神経系の炎症疾病の処置におけるその使用に関する。
【００１０】
本発明はまた、チロシン４７９および／またはセリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２を検出するための前記において定義したような抗体に関する。
【００１１】
本発明はまた、Ｔリンパ球の遊走を減少させるために使用するためのＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニスト、および中枢神経系の炎症疾病の処置における使用に関する。
【００１２】
発明の詳細な説明
中枢神経系の炎症疾病
本明細書において使用する「中枢神経系の炎症疾病」または「神経炎症疾病」は、炎症、脱髄、あるいは軸索および／または神経の損傷に関連した、中枢神経系の疾病を示す。中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症疾病は、非感染性または感染性であり得る。炎症病変を引き起こし得る非感染性疾病としては、いくつかの毒素、自己免疫疾病および免疫介在性状態が挙げられる。ウイルス、細菌、真菌、原虫および後生動物寄生虫は全て、ＣＮＳの炎症疾病を引き起こし得る。ＣＮＳの炎症疾病は特に、ＷＨＯによって刊行されている疾病および関連保険問題の国際統計分類（International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems）のコードＧ００からＧ０９に集められている。ＣＮＳの炎症疾病の例としては、髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脊髄症または脳脊髄炎；頭蓋内および髄腔内の膿瘍および肉芽腫；頭蓋内および髄腔内の静脈炎および血栓性静脈炎；多発性硬化症；アルツハイマー病およびパーキンソン病を伴うウイルス感染、細菌感染または寄生虫感染が挙げられる。好ましくは、本発明によるＣＮＳの炎症疾病は、髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脳脊髄炎、脳炎（encephalititis）または脊髄症、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病を伴うウイルス感染または細菌感染からなる群より選択される。より好ましくは、本発明によるＣＮＳの炎症疾病は、脳炎、多発性硬化症、アルツハイマー病およびパーキンソン病を伴うウイルス感染からなる群より選択される。
【００１３】
本明細書において使用する「髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脊髄症または脳脊髄炎を伴うウイルス感染」としては、レトロウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、水痘、水痘帯状疱疹ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ポリオウイルス、ＨＴＬＶ−１およびエプシュタン・バーウイルスに因るウイルス感染が挙げられる。好ましくは、本発明によるウイルス感染は、ＨＴＬＶ−１またはＨＩＶに因るウイルス感染からなる群より選択される。
【００１４】
本明細書において使用する「髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脊髄症または脳脊髄炎を伴う細菌感染」としては、Haemophilis influenzae、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus agalactiae、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis、Escherichia coli、Klebsiella、Friedlander bacillus、Bacillus anthracis、Neisseria gonorrhoeae、Leptospira、Listeria monocytogenes、Borrelia、Treponema pallidum、Salmonella、Mycobacterium tuberculosisおよびSalmonella entericaに因る細菌感染が挙げられる。
【００１５】
本明細書において使用する「髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脊髄症または脳脊髄炎を伴う寄生虫感染」としては、Trypanosoma、特にTrypanosoma bruceiおよびTrypanosoma cruzi、Toxoplasma gondiiおよびNaegleria fowleriに因る寄生虫感染が挙げられる。
【００１６】
ＣＲＭＰ２
本明細書において使用する「コラプシン応答媒介タンパク質２」または「ＣＲＭＰ２」または「ＵＬＩＰ２」は、神経成長円錐の発育（Goshima et al. (1995) Nature 376:509-514; Charrier et al. (2003) Mol. Neurobiol. 28:51-64）および微小管組織を介した神経細胞の遊走において初めて記載されたリン酸化タンパク質を指す。それは、細胞質リン酸化タンパク質のＣＲＭＰ／ＴＯＡＤ／Ｕｌｉｐ／ＤＲＰファミリーのメンバーである。好ましくは、ＣＲＭＰ２は、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００１７】
本発明の脈絡において、本発明者らは、ＣＲＭＰ２が、チロシン４７９（Ｙ４７９）上でリン酸化され得ることを実証した。さらに、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２は、完全長型または切断型のいずれかであり得る。Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の完全長型は、完全長型の６２ｋＤａのＣＲＭＰ２（ＣＲＭＰ２−６２）に対応するが、切断型は、切断型の５８ｋＤａのＣＲＭＰ２（ＣＲＭＰ２−５８）に対応する。より特定すると、ＣＲＭＰ２−５８は、ＣＲＭＰ２のアミノ酸４８９から５３２の間に位置するRogemond et al.に記載の切断部位におけるＣＲＭＰ２−６２の切断によって得られる（Rogemond et al. (2008) J. Biol. Chem 283:14751-14761）。ＣＲＭＰ２およびＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２、特にその切断型のそれは、セリン４６５（Ｓ４６５）上でさらにリン酸化され得る。
【００１８】
抗体およびその使用
本発明は、チロシン４７９上でリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体に関する。
【００１９】
本明細書において使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子およびこれらの免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。従って、「抗体」という用語は、完全な抗体分子だけではなく、抗体フラグメント並びに抗体の変異体（誘導体も含む）および抗体フラグメントの変異体も含む。本発明による抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
【００２０】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」は、特異的な抗原に対して作られ、そして例えばＢ細胞またはハイブリドーマの単一のクローンによって組換えまたは産生され得る、単一のアミノ酸組成の抗体を指す。
【００２１】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の可変領域または抗原結合領域を含む。適切な抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２フラグメントおよびディアボディが挙げられる。本発明による抗体はまたラクダ科ナノボディであり得る。本発明による抗体は、改変された抗体であり得る。特に、本発明による抗体は、マーカー部分にコンジュゲーションされ得る。マーカー部分は、例えば、非放射性マーカー部分、例えばフルオロフォア、補酵素、例えばビオチン、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、色素、ポリエチレングリコールなどであり得る。
【００２２】
「特異的」という用語は、ターゲットへのリガンドの認識または結合を言及する場合、前記リガンドが、ターゲットとの構造的類似性を全く示さない別のターゲットと実質的に相互作用することなく、ターゲットと相互作用することを意味する。特に、前記に定義したようなＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体は、ＣＲＭＰ２がチロシン残基４７９上にリン酸基を有する場合にはＣＲＭＰ２を特異的に認識し結合するが、ＣＲＭＰ２がチロシン残基４７９上にリン酸基を有さない場合にはそうではない。好ましくは、前記に定義したようなＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体はまた、ＣＲＭＰ２がセリン４６５上にリン酸基をさらに有する場合にもＣＲＭＰ２を認識し結合する。
【００２３】
本発明はまた、セリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２（Ｓ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２）に特異的な抗体に関する。特に、前記に定義したようなＳ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な前記抗体は、ＣＲＭＰ２がセリン残基４６５上にリン酸基を有する場合にはＣＲＭＰ２を特異的に認識し結合するが、ＣＲＭＰ２がチロシン残基４６５上にリン酸基を有さない場合にはそうではない。好ましくは、前記に定義したようなＳ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体はまた、ＣＲＭＰ２がチロシン４７９上にリン酸基をさらに有する場合にもＣＲＭＰ２を認識し結合する。
【００２４】
前記に定義したような抗体は、完全長および／または切断されリン酸化されたＣＲＭＰ２を認識し結合する。好ましくは、前記に定義したようなＳ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体は、切断されたＳ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２を認識し結合する。
【００２５】
対象の抗原と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生するための方法は当業者に公知である（例えば、Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.); Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA: Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY;および Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497参照）。
【００２６】
所望の特異性を有する本発明による抗体を含む抗血清を産生するために、リン酸化されたＣＲＭＰ２を使用して、適切な動物、例えばマウス、ウサギ、または霊長類を免疫化し得る。標準的なアジュバント、例えばフロイントアジュバントを標準的な免疫化プロトコールに従って使用することができる、試験血を採取し、そして対象の抗原に対する反応性の力価を決定することによって、免疫原調製物に対する動物の免疫応答をモニタリングし得る。抗原に対して特異的に反応性である抗体を濃縮するための抗血清のさらなる分画および抗体の精製を、続いて、当業者に周知の方法を使用して達成することができる。
【００２７】
モノクローナル抗体を、当業者によく知られた種々の技術を使用して得ることができる。典型的には、所望の抗原で免疫化された動物からの脾臓細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合によって不死化する（Kohler and Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519）。不死化の代替的な方法としては、エプシュタイン・バーウイルス、発癌遺伝子もしくはレトロウイルスを用いての形質転換、または当技術分野において周知の他の方法が挙げられる。単一の不死化細胞から生じるコロニーを、抗原に対する所望の特異性および親和性を有する抗体の産生のためにスクリーニングし、そしてこのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔への注射を含む種々の技術によって増強され得る。さらに、Huse et al.(1989) Science 246:1275-1281によって概略が示された一般的なプロトコールに従ってヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、所望の特異性を有する抗体またはこのような抗体の結合フラグメントをコードする核酸配列が同定されると、モノクローナル抗体はまた組換え産生され得る。モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ法を使用して（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）またはファージディスプレイによって産生され得る。「ファージディスプレイ」という用語は、本明細書において、バクテリオファージカプシド上に発現されそしてカプシドをコードする遺伝子に挿入された核酸配列によってコードされた、リガンドを選択するための方法を指す。この方法は、当業者には周知であり、そして特にScott and Smith (1990) Science 249:386-390、およびMarks et al. (1991) J. Mol. Biol.222:581-597によって記載されている。
【００２８】
特定の態様において、前記に定義した抗体はヒト化モノクローナル抗体である。「ヒト化抗体」は、ヒト抗体とより密接に一致する（アミノ酸配列において）ように改変された非ヒト抗体を指す。特定の態様において、非ヒト抗体の可変領域の抗原結合残基の外のアミノ酸残基が改変される。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。特定の態様において、ヒト化抗体は、ヒト抗体のＣＤＲの全部または一部を、所望の抗原結合特異性を有する非ヒト抗体などの別の抗体からのＣＤＲの全部または一部で置換することによって構築される。特定の態様において、ヒト化抗体は、ＣＤＲの全部または実質的に全部が非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、そしてフレームワーク領域（ＦＲ）の全部または実質的に全部がヒト抗体のＦＲに対応する、可変領域を含む。特定のこのような態様において、ヒト化抗体はさらに、ヒト抗体の定常領域（Ｆｃ）を含む。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるために行なわれる。さらなる詳細については、Jones et al. (1986) Nature321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329;およびPresta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照されたい。ヒト化抗体の使用は、マウス定常領域の免疫原性に関連した潜在的な問題を取り除く。
【００２９】
本発明に従って使用する前に、本発明による抗体を精製し得る。抗体精製のための方法は生物医学研究の分野において周知であり、それには精製しようとする抗体の独特な特徴に依拠するものもあり、また、幅広い適用に適した標準的なタンパク質分離技術であるものもある。
【００３０】
塩析を最初の工程として使用して、他の望ましくないタンパク質から所望の抗体を分離することができる。好ましい塩は硫酸アンモニウムであり、これはタンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させることによってタンパク質を沈降させる。その後、タンパク質は、その溶解度に基づいて沈降する。タンパク質がより疎水性であればある程、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈降する可能性が高くなる。典型的なプロトコールは生じる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％となるように、タンパク質溶液に飽和硫酸アンモニウムを加えるものである。これは大半の疎水性タンパク質を沈降させる。所望の抗体を、その疎水性により適切な硫酸アンモニウム濃度で沈降させ、そしてその後、必要であれば透析またはダイアフィルトレーションのいずれかを通して過剰な塩を除去しながら緩衝液中で可溶化する。タンパク質の溶解度に依拠する他の方法、例えば冷エタノール沈降法は当業者に周知であり、そしてこれを使用して、血清などのタンパク質混合物から抗体画分を調製し得る。
【００３１】
予測される分子量に基づいて、抗体を、種々の孔径のメンブレン（例えばAmiconまたはMilliporeメンブレン）を通した限外濾過を使用してより大きなおよびより小さなサイズのタンパク質から単離することができる。第一工程として、タンパク質混合物（例えば血清または細胞培養上清）を、所望の抗体の予測される分子量よりも小さな分子量カットオフを有する孔径を有するメンブレンを通して限外濾過する。その後、限外濾過の残余分を、所望の抗体の予測される分子量よりも大きな分子量カットオフを有するメンブレンに対して限外濾過する。抗体はメンブレンを通って濾液中へと入り、これをその後、次の工程のカラムクロマトグラフィーで処理することができる。
【００３２】
本発明による抗体はまた、そのサイズ、正味の表面荷電、疎水性およびリガンドに対する親和性に基づいて、他の抗体を含む他のタンパク質から分離することができる。カラムクロマトグラフィーは頻繁に使用される方法である。例えば、抗体を、抗体のＦｃ領域中のドメインに結合する細菌細胞壁タンパク質である、プロテインＡまたはプロテインＧの固定されたカラムを使用して他の非抗体タンパク質から単離することができる。さらに、異なる抗原に対する抗体を、抗体精製のための好ましい形式のカラムクロマトグラフィーのカラムに固定された、これらの抗原に対するその明確に異なる親和性に基づいて分離することができる。これらの全ての方法は当技術分野において周知であり、そしてクロマトグラフィー技術を、任意の規模で、そして多くの異なる製造業者（例えばPharmacia Biotech）からの装置を使用して実施することができることは当業者には明らかであろう。
【００３３】
本発明はまた、チロシン４７９上で、場合によりさらにセリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２を検出するための前記に定義したような抗体の使用に関する。前記検出は、抗体の結合を可視化することを可能とする適切な免疫検出技術を使用して実施され得る。このような検出技術は当業者には周知であり、そしてこれには免疫組織細胞化学、免疫蛍光、免疫沈降、ウェスタンイムノブロット、化学発光、比色技術および放射標識技術が挙げられる。
【００３４】
好ましい態様において、本発明による抗体の使用は、さらに切断型であるＣＲＭＰ２を検出するためである。
【００３５】
in vitroにおける予知、診断および／またはモニタリングのための方法
本発明は、被験体における中枢神経系の炎症疾病のin vitroにおける予知、診断および／またはモニタリングのための方法に関し、前記方法は、被験体からの免疫系細胞の試料中における、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在を検出することを含み、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在の検出は中枢神経系の炎症疾病を示す。
【００３６】
本発明はまた、被験体における中枢神経系の炎症疾病を検出するためのin vitroにおける方法を記載し、前記方法は、被験体から採取した免疫系細胞の試料中における、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在をin vitroにおいて検出することを含み、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在の検出は中枢神経系の炎症疾病を示す。
【００３７】
本明細書において使用する「診断法」または「診断」は、被験体が病態を患っているかどうかを決定するための方法を指す。
【００３８】
本明細書において使用する「予知法」または「予知」は、被験体が病態を発症する可能性があるかどうかを決定するための方法を指す。
【００３９】
本明細書において使用する「モニタリング法」は、被験体における病態の発展を決定するための方法を指す。
【００４０】
本明細書において使用する「免疫系細胞」は、自然免疫反応および適応免疫反応の細胞、特にＴリンパ球およびＢリンパ球、樹状細胞、単球およびナチュラルキラー細胞を包含する。
【００４１】
本明細書において使用する「試料」は、より大きなセットの一部を指す。好ましくは、本発明による免疫系細胞の試料は、被験体の血液または脳から採取し、および／または特に血液細胞の亜個体群などを含む。好ましくは、本発明による免疫系細胞の試料は、Ｔリンパ球を含むまたはそれからなる。
【００４２】
特定の態様において、前記に定義した方法において、前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２は完全長型である。別の特定の態様において、前記の定義した方法において、前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２は切断型である。これらの態様において、前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２はセリン４６５上でさらにリン酸化され得る。好ましくは、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２が切断型である場合、それはセリン４６５上でさらにリン酸化される。さらに、ＣＲＭＰ２は、セリン５２２、トレオニン５０９、トレオニン５１４および／またはトレオニン５５５などの他のリン酸化部位上でさらにリン酸化され得る。
【００４３】
本発明の脈絡において、被験体の免疫系細胞の試料中におけるＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在の検出は、タンパク質の存在を可視化することを可能とする任意の適切な技術によって行なわれ得る。特に、ＣＲＭＰ２に対して、より好ましくはＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に対してまたはＳ４６５／Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に対して特異的な親和性を提示する化合物を使用して実施することができる。このような適切な化合物としては、特に抗体およびアプタマーが挙げられる。好ましくは、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２は、抗体、好ましくは、前記に定義したようなＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体を用いて検出される。従って、前記タンパク質の存在を可視化することを可能とする適切な技術は、抗体の結合を可視化することを可能とする任意の免疫検出技術を包含する。このような検出技術は当業者には周知であり、そしてこれには免疫組織細胞化学、免疫蛍光、免疫沈降、ウェスタンイムノブロット、化学発光、比色技術および放射標識技術が挙げられる。
【００４４】
本明細書において使用する「被験体」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばげっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌまたは霊長類）を指す。好ましくは、被験体はヒトである。
【００４５】
本発明はまた、中枢神経系の炎症疾病の予知、診断および／またはモニタリングにおいて使用するための前記に定義したような抗体に関する。
【００４６】
処置法
本発明はまた免疫細胞の遊走を減少させるために使用するための前記に定義したような抗体に関する。特に、本発明は、免疫細胞の遊走を減少させるために使用するためのチロシン４７９上でリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体に関する。
【００４７】
本明細書において使用する「免疫細胞」は、自然免疫反応および適応免疫反応の細胞、特にＴリンパ球およびＢリンパ球、樹状細胞、単球およびナチュラルキラー細胞を包含する。好ましくは、本発明による免疫細胞はＴリンパ球である。
【００４８】
本発明の脈絡において、「免疫細胞の遊走」は、リンパ器官からエフェクター部位への免疫細胞の移動を指す。本明細書において使用する「免疫細胞の遊走を減少させること」は、免疫細胞の遊走速度を遅延させること、リンパ器官からエフェクター部位へと遊走する免疫細胞の数を減少させること、またはエフェクター部位への免疫細胞の遊走を阻害することを意味する。好ましくは、本発明の脈絡において、エフェクター部位は脳である。
【００４９】
本発明はまた、前記に定義したような中枢神経系の炎症疾病の処置において使用するための前記に定義したような抗体に関する。
【００５０】
本発明はまた、治療有効量の前記に定義したような抗体をそれを必要とする被験体に投与することを含む、中枢神経系の炎症疾病の処置法に関する。
【００５１】
本明細書において使用する「処置すること」または「処置」という用語は、このような用語を適用する疾患もしくは状態、またはこのような疾患もしくは状態の１つ以上の症状を逆行、軽減、その進行を阻害、または予防することを意味する。
【００５２】
本発明によると、「被験体」または「それを必要とする被験体」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばげっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌまたは霊長類）を意図する。
【００５３】
「治療有効量」という用語は、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で、前記疾病を処置するために十分な抗体の量を意味する。しかしながら、本発明の抗体の１日の総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医師によって決定されることが理解される。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効投与量レベルは、処置される疾患および疾患の重症度、使用する具体的な抗体の活性、使用する具体的な組成物、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事、投与時刻、投与経路、および使用する具体的な抗体の排泄速度、処置期間、使用する具体的な抗体と組み合わせてまたは同時に使用する薬物、および医学分野において周知の同様な因子を含む多種多様な因子に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで化合物の投与量を開始し、そして所望の効果が達成されるまで投与量を次第に増加させることは当業者の技能内において周知である。
【００５４】
本発明の抗体を、中枢神経系の炎症疾病を処置するための任意の他の治療戦略と組み合わせて使用し得る。
【００５５】
ＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニストおよびその使用
本発明者らは、チロシン４７９上のＣＲＭＰ２のリン酸化が、ＣＸＣＲ４レセプターによって制御されたことを実証した。従って、ＣＸＣＲ４レセプターを阻害することで、チロシン４７９上のＣＲＭＰ２のリン酸化が妨げられ、従って、免疫細胞の遊走が減少するだろう。
【００５６】
従って、本発明はまた、前記に定義したような免疫細胞の遊走を減少させるために使用するためのＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニストに関する。好ましくは、ＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニストは、Ｔリンパ球の遊走を減少させるために使用するためのものである。
【００５７】
本明細書において使用する「ＣＸＣＲ４レセプター」または「フーシン」は、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１２とも呼ばれる）に特異的なα−ケモカインレセプターであるＣＸＣケモカインレセプターを指す。
【００５８】
本発明の脈絡において、「ＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニスト」は、ＣＸＣＲ４レセプターに結合することによって直接的に、または間接的に、ＣＸＣＲ４レセプターの下流のシグナルカスケードを阻害する化合物を指す。ＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニストの例としては、ＣＸＣＲ４レセプターに特異的な抗体、ＡＭＤ０７０、ＡＭＤ３１００（またはプレリキサホル）、ＡＭＤ３４６５、４Ｆ−ベンゾイル−ＴＮ１４００３（またはＴ１４０）、ＫＲＨ−３９５５、およびビシクラムが挙げられる。
【００５９】
本発明はまた、前記に定義したような中枢神経系の炎症疾病の処置において使用するための前記に定義したようなアンタゴニストに関する。
【００６０】
治療有効量の前記に定義したようなＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニストの、それを必要とする被験体への投与を含む、中枢神経系の炎症疾病の処置法もまた本発明の目的である。
【００６１】
本発明のアンタゴニストは、中枢神経系の炎症疾病を処置するための任意の他の治療戦略と組み合わせて使用され得る。特に、本発明のアンタゴニストは、本発明の抗体と組み合わせて使用され得る。
【００６２】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いての処理および固定から０、２、５または１０分後の極性化ＣＲＭＰ２を有する、コラーゲンＩでコーティングされたスライドに付着している、ジャーカット細胞の数（％）を示すヒストグラムを示す。
【図２】図２は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）だけを用いての処理後、またはＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００を用いての処理後の極性化ＣＲＭＰ２を有する、コラーゲンＩでコーティングされたスライドに付着している、ジャーカット細胞の数（％）を示すヒストグラムを示す。
【図３】図３は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いて（＋）または用いずに（−）１０または３０分間かけて処理し、溶解し、そして細胞下分画にかけた、ジャーカット細胞の全細胞溶解液、細胞質画分または細胞骨格画分に対して実施したウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗ＣＲＭＰ２−ｐｅｐ４抗体または抗ＣＲＭＰ−Ｃ−ｔｅｒ抗体を使用して実施された。白抜き矢印は、完全長型のＣＲＭＰ２を示し、そして黒い矢印は切断型のＣＲＭＰ２を示す。ウェスタンブロットはまた、抗ビメンチン抗体、抗Ｅｒｋ１／２抗体および抗ｐＥｒｋ１／２抗体を用いても実施された。ウェスタンブロットの左の数字は、分子量（ｋＤａ）を示す。ウェスタンブロットの下の数字は、非処理細胞を用いて得られたシグナル強度と比較した、処理細胞を用いて得られたシグナル強度の相対値を示す。
【図４】図４は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いて０、２、５、１０または３０分間かけて処理し、溶解し、そしてリン酸化型の濃縮にかけられた、ジャーカット細胞の全細胞溶解液、非リン酸化タンパク質（素通り画分）またはリン酸化タンパク質（溶出液）に対して実施されたウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは抗ＣＲＭＰ２−ｐｅｐ４抗体または抗ＣＲＭＰ−Ｃ−ｔｅｒ抗体を使用して実施された。白抜きの矢印は完全長型のＣＲＭＰ２を示し、そして黒い矢印は切断型のＣＲＭＰ２を示す。ウェスタンブロットはまた、抗Ｅｒｋ１／２抗体および抗ｐＥｒｋ１／２抗体を用いても実施された。ウェスタンブロットの左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。
【図５】図５は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いて０、１、２、４、６、１０、１５または３０分間かけて処理したジャーカットＴ細胞の細胞溶解液に対して実施したウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗ＣＲＭＰ２−ｐＳｅｒ５２２抗体、抗ＣＲＭＰ２−ｐＴｈｒ５０９／５１４抗体、抗ＣＲＭＰ−Ｃ−ｔｅｒ抗体、抗ｐＥｒｋ１／２抗体および抗Ｅｒｋ１／２抗体を使用して実施された。ウェスタンブロットの左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。ウェスタンブロットの下の数字は、非処理細胞を用いて得られたシグナル強度と比較した、処理細胞を用いて得られたシグナル強度の相対値を示す。
【図６】図６は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いて０、１、２、４、６、１０、１５または３０分間かけて処理したジャーカットＴ細胞の細胞溶解液に対して実施したウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗Ｃｄｋ５−ｐＴｙｒ１２抗体、抗Ｃｄｋ５−ｐＳｅｒ１５９抗体、抗Ｃｄｋ５抗体、抗ＧＳＫ−３α−ｐＴｙｒ２７９抗体、抗ＧＳＫ−３β−ｐＴｙｒ２１６抗体、抗ＧＳＫ−３α抗体および抗ＧＳＫ−３β抗体を使用して実施された。ウェスタンブロットの左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。ウェスタンブロットの下の数字は、非処理細胞を用いて得られたシグナル強度と比較した、処理細胞を用いて得られたシグナル強度の相対値を示す。
【図７】図７は、残基１５〜４８９の切断されたＣＲＭＰ２の構造のリボンダイアグラムを示す。挿入図は、切断されたＣＲＭＰ２の表面図を示し、これは残基Ｒ４６７、Ｐ４７０およびＰ４７３の表面露出を示す（濃灰色）。
【図８】図８は、ＣＲＭＰ２−ＧＳＴまたはＧＳＴに結合したセファロース−４Ｂビーズと共にインキュベーションした初代Ｔリンパ球またはＤｅｖ神経細胞の細胞溶解液に対して実施したウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗Ｙｅｓ抗体、抗ＣＲＭＰ２抗体および抗ＧＳＴ抗体を使用して実施された。ウェスタンブロットの左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。
【図９】図９は、ＡＴＰの存在下（＋）または非存在下において、活性組換えＹｅｓを用いて（＋）または用いずに、および組換えＣＲＭＰ２を用いて（＋）または用いずに実施されたin vitroにおけるキナーゼアッセイの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗リン酸化チロシン残基抗体および抗ＣＲＭＰ２抗体を使用して実施された。ウェスタンブロットの右の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。
【図１０】図１０は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いて０、１、２、４、６、１０、１５または３０分間かけて処理したジャーカット細胞の細胞溶解液に対して実施したウェスタンブロットの結果を示す。ウェスタンブロットは、抗ＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ４７９抗体、抗ＣＲＭＰ−Ｃ−ｔｅｒ抗体、抗ＣＲＭＰ２−ｐｅｐ４抗体、抗Ｓｒｃ−ｐＴｙｒ４１６抗体および抗Ｓｒｃ抗体を使用して実施された。白抜きの矢印は完全長型のＣＲＭＰ２を示し、そして黒い矢印は切断型のＣＲＭＰ２を示す。ウェスタンブロットの左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。ウェスタンブロットの下の数字は、非処理細胞を用いて得られたシグナル強度と比較した、処理細胞を用いて得られたシグナル強度の相対値を示す。
【図１１】図１１は、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）を用いての処理および固定の後に極性化ＣＲＭＰ２を有する、コラーゲンＩでコーティングされたスライドに付着している、ＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−ＷＴ（線入りの棒）またはＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−Ｙ４７９Ｆ突然変異体（白い棒）を用いてトランスフェクションされた、ジャーカット細胞の数（トランスフェクションされた細胞数と比較した％）を示すヒストグラムを示す。ＣＲＭＰ２は、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて観察された。
【図１２】図１２は、トランスウェルチャンバーにおいてＣＸＣＬ１２の方向にトランスマイグレーションする、空ベクター（ドットの棒）プラスミド、ＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−ＷＴ（線入りの棒）プラスミドまたはＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−Ｙ４７９Ｆ（白い棒）プラスミドを用いてトランスフェクションされた、ジャーカット細胞の数を示すヒストグラムを示す。
【図１３】図１３は、器官型の海馬切片の近くにスポットされると神経組織上において遊走する、ＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−ＷＴ（線入りの棒）プラスミドまたはＣＲＭＰ２Ｆｌａｇ−Ｙ４７９Ｆ（白い棒）プラスミドを用いてトランスフェクションされた、ジャーカット細胞の数を示すヒストグラムを示す。
【００６４】
実施例１
以下の実施例は、チロシン４７９残基上でのＣＲＭＰ２のリン酸化がＴ細胞の遊走において重要であることを実証する。
【００６５】
材料および方法
細胞および抗体
ジャーカットＴ細胞株を、１０％ウシ胎児血清の補充されたＲＰＭＩ１６４０中で培養した。健康ドナーの血液から選択された初代Ｔリンパ球を、１〜２週間かけて１０％ＡＢヒト血清およびＩＬ２（２０Ｕ/mL）の補充されたＲＰＭＩ中で培養した。
【００６６】
完全長型および切断型のＣＲＭＰ２の両方を認識するウサギポリクローナル抗体が、Rogemond et al. (2008) J. Biol. Chem 283:14751-14761に記載されている。Ｃ−ｔｅｒおよびｐｅｐ４の抗血清を生成するために使用されたペプチド配列は、それぞれ、ＣＲＭＰ２配列中のＡＡ５５７〜５７２およびＡＡ４５４〜４６５に局在していた。抗体を、対応する固定化されたペプチド上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ＣＲＭＰ２−ｐＳｅｒ５２２およびＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ５０９／５１４を認識するヒツジ抗血清はKinasource Limited (Dundee, UK)製であった。本発明者らによって産生されたウサギポリクローナル抗体は、Ｙ４７９上でリン酸化されたペプチドＡＡ４７０〜４８３（ＣＲＭＰ２−ｐＹ４７９）に対して生じ、そして対応する固定されたペプチド上でのアフィニティクロマトグラフィーによって２工程法で精製した（工程１：抗非リン酸化ペプチド抗体の排除、工程２：抗リン酸化ペプチド抗体の精製）。ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９ペプチドおよびＣＲＭＰ２−ｐＹ４７９ペプチドに対して実施されたＥＬＩＳＡは、本発明者らによって産生された抗ＣＲＭＰ２−ｐＹ４７９抗体の特異性を示した。さらに、ホスファターゼＣＩＰを用いてのＴ細胞溶解液の処理は、ウェスタンブロットにおける陽性シグナルをかなり減少させた。Ｙｅｓキナーゼに対するウサギポリクローナル抗体はUpstate製であった。マウス抗ビメンチン／ＬＮ６抗体はCalbiochem製であった。Cell Signaling製の抗Ｅｒｋ抗体および抗リン酸化Ｅｒｋ抗体は、非リン酸化およびリン酸化ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ（Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２）を認識した。抗Ｃｄｋ５抗体、抗ＣＤＫ５−ｐＴｙｒ１５抗体、抗Ｃｄｋ５−ｐＳｅｒ１５９抗体および抗Ｓｒｃ抗体は、Santa Cruz Biotechnology製であった。ウサギ抗リン酸化Ｓｒｃファミリー抗体はCell Signaling製であり、そしてこれはＳｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、ＬＣＫ、ＨｃｋおよびＹｅｓ上におけるリン酸化Ｔｙｒ４１６を認識した。ウサギ抗ＧＳＫ−３抗体はChemicon International製であった。Upstate Millipore製のマウス抗ｐＧＳＫ−３抗体は、活性型のＧＳＫ−３α（ｐＴｙｒ２７９）およびＧＳＫ−３β（ｐＴｙｒ２１６）を認識した。ホスホ濃縮磁気ビーズ（TALON（登録商標）PMAC）をClontechから購入した。
【００６７】
プラスミドおよび構築物
ＣＲＭＰ２−Ｆｌａｇ−ｗｔプラスミドは、Rogemond et al. (2008) J. Biol. Chem 283:14751-14761に記載されている。簡潔に言うと、完全長ＣＲＭＰ２をＰＣＲによって増幅し、そしてｐＣＭＶ２−ＦＬＡＧベクター（Sigma, l’Isle d’Abeau, France）に一方向に挿入した。
【００６８】
突然変異：２工程のＰＣＲ手順を使用して、ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９Ｆ突然変異体を生成した。最初に、Ｙ４７９−Ｆ突然変異を含むＣ末端フラグメント（４７１〜５７２）を、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入するリバースプライマー、およびＦ（ＴＴＣ）で置換されたコドンＹ４７９（ＴＡＣ）を有するフォワードプライマーを使用して生成した。次に、この突然変異したフラグメントを、リバースプライマーとして２回目のＰＣＲ反応において、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩを導入する野生型フォワードプライマーと共に使用した。最終のＰＣＲ産物を、ｐＣＭＶ２−ＦｌａｇベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、そして突然変異体のＤＮＡ配列をシークエンスによって確認した。
【００６９】
トランスフェクション：ジャーカットＴ細胞を、製造業者の指示に従って、Amaxa Nucleofector技術(Koln, Germany)を使用してＣＲＭＰ２−Ｆｌａｇ−ｗｔプラスミド、ＣＲＭＰ２−Ｆｌａｇ−Ｙ４７９Ｆプラスミドおよび空Ｆｌａｇプラスミドを用いてトランスフェクションした。Ｔ細胞をトランスフェクションから１８時間後に使用した。トランスフェクションされた細胞を、抗Ｆｌａｇ抗体を用いての免疫染色によって可視化した。トランスフェクション率は、大半のＦｌａｇ構築物において４０〜５０％に達した。
【００７０】
免疫細胞化学
ＣＲＭＰ２型、Ｙｅｓキナーゼおよび中間径フィラメントのビメンチンを、コラーゲンＩでコーティングされたスライド（２０μg/ml）に付着させそして処理（アセトン−２０℃；１０分間）により固定されたジャーカット細胞および初代Ｔ細胞に対する間接的な免疫蛍光によって検出した。細胞を特異的な抗体と共に（１時間、３７℃）、その後、Ａｌｅｘａ４８８または５４６にコンジュゲーションした抗マウスまたは抗ウサギまたは抗ヒツジＩｇＧ抗体と共に（１時間、３７℃）インキュベーションし、そしてＡｘｉｏｐｌａｎ ＩＩ蛍光顕微鏡（Carl Zeiss）を使用して調べた。核対比染色を、蛍光ＤＮＡインターカレート剤である４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI, Boehringer Mannheim）を使用して実施した。
【００７１】
タンパク質相互作用アッセイ（プルダウンＧＳＴ−ＣＲＭＰ２）
前記のように調製した１００μlのジャーカット細胞溶解液を、グルタチオン−セファロース４Ｂ（Pharmacia Biotech）に結合させた（４℃で１時間）８０μlのＧＳＴ−ＣＲＭＰ２融合タンパク質または８０μlのＧＳＴタンパク質のいずれかに加えた。ＧＳＴ−ＣＲＭＰ２ビーズおよびＧＳＴビーズを４回洗浄し（５０mMトリス（ｐＨ７．４）、１mM ＥＤＴＡ、１５０mM ＮａＣｌ、および０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０）、そしてＣＲＭＰ−２ビーズにまたはＧＳＴビーズのみに結合したタンパク質を溶出した。ＧＳＴ（ＧＳＴビーズにおける）、ＹｅｓおよびＣＲＭＰ２（ＧＳＴ−ＣＲＭＰ２ビーズにおける）並びにＧＳＴ（ＧＳＴビーズおよびＧＳＴ−ＣＲＭＰ２ビーズにおける）をウェスタンブロットによって明らかとした。
【００７２】
ウェスタンブロット
ＣＸＣＬ１２による処理後、細胞を、ホスファターゼ阻害剤（フッ化Ｎａ５mM、ピロリン酸Ｎａ１mM、β−グリセロリン酸１mM、オルトバナジン酸１mM）およびプロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリートＴＭ（Roche）の補充されたホモジナイゼーション緩衝液（トリス２０mM、ＥＤＴＡ１mM、ＥＧＴＡ５mM、スクロース１０％、ｐＨ７．４）中に溶解した。溶解液を超音波にかけて、細胞凝集物を解離させ、そして全タンパク質をローリーアッセイ（Bio-Rad）によって測定した。タンパク質試料（１０〜２０μg）を還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、そして遮断溶液（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％無脂肪ドライミルク、１時間）と共に前もってインキュベーションしたニトロセルロースメンブレン（BA85; Schleicher & Schuell Microscience）に転写し、そして特異的な抗体に対してブロッティングし（一晩、４℃）、その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させたウサギおよびヒツジのＩｇＧ抗体と共にインキュベーションし（１時間、室温）、そして化学発光（ＥＣＬ）検出システム（Covalab Lyon, France）を行なった。イムノブロットバンドの濃度定量をImage Quant (Molecular dynamics)を使用して実施し、そしてデータをあらゆる処理の前に検出された量に対する比として表現した。
【００７３】
データベースおよび構造分析
予測プログラムＰＲＯＳＩＴＥ（http://us.expasy.org/prosite）を使用して、ＣＲＭＰ２上における推定チロシンキナーゼ部位を同定した。ＣＲＭＰ２の構造を、ＣＲＭＰ２のＤ鎖について入手可能な座標に基づいて(Stenmark et al. (2007) J. Neurochem. 101:906-917) (タンパク質データバンクエントリー2GSE)、Viewerlite/4.2 (Accelrys)を使用してモデリングした。
【００７４】
ＣＲＭＰ２のクローニングおよび発現
ヒトＣＲＭＰ−２に対するコード配列（ＮＭ＿１３８６）を、発現ベクターｐＥｔ２１ｂ（Novagen）にサブクローニングし、その結果、Ｎ末端にヘキサヒスチジンタグを有する構築物が得られた。このプラスミドを、Escherichia coli BL21(DE3)細胞に形質転換した。発現のために、細胞を、バブル型フラスコ中の１５００mLのＴＢ培地（７％グリセロール、５０μg/mlのカナマイシンおよび１００μLのＢＲＥＯＸを含む）中で増殖させた。細胞を＋３７℃で、６００nmにおける吸光度が２．５に到達するまで増殖させた。培養液を＋１８℃まで水浴中で１時間かけて冷却した。ＣＲＭＰ−２の発現を、０．５mmol/LのＩＰＴＧの添加によって誘導し、そして発現を＋１８℃で一晩かけて継続させた。細胞を遠心分離によって収集し、そしてペレットを、コンプリートＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Roche, Basel, Switzerland）および２０００Ｕのベンゾナーゼの補充された溶解緩衝液（２０mMトリス、５００mM ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴ、２０％グリセロール、０．１％トリトン、１０mMイミダゾール）中に懸濁した。溶液を氷上で数サイクルの間、超音波にかけた。試料を１４，０００ｇで４℃で３０分間遠心分離にかけ、そして上清を、溶解緩衝液（QIAGEN）中に５０％再懸濁した１．５mlのＮｉ−ＮＴＡ樹脂と共に４℃で９０分間かけてインキュベーションした。Ｈｉｓタグのついたタンパク質を、洗浄緩衝液（２０mMトリス、５００mM ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴ、２０％グリセロール、０．１％トリトン、２０mMイミダゾール）中のＮｉ樹脂から精製し、そして溶出緩衝液（洗浄緩衝液＋１５０mMイミダゾール）を用いて１mlの画分ずつ溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【００７５】
in vitroにおけるＹｅｓキナーゼアッセイ
アッセイ前に、ＨｉｓタグのついたＣＲＭＰ２を、製造業者の指示に従って、Float-A-lyzer技術(Interchim)を使用して一晩かけて４℃で緩衝液（４０mM ＭＯＰＳ、０．５mM ＥＤＴＡ、５％グリセロール）中で透析した。Ｙｅｓキナーゼアッセイのために、０．６μgの透析されたＨｉｓタグのついたＣＲＭＰ２を、酵素希釈緩衝液（２０mM ＭＯＰＳ ｐＨ７、１mM ＥＤＴＡ、０．０１％Ｂｒｉｊ、０．１％β−メルカプトエタノール、５％グリセロール）中に事前に希釈された２０ngの組換え完全長ヒトＹｅｓ（Millipore）と共にインキュベーションした。反応を、５０μlの反応緩衝液（８mM ＭＯＰＳ、０．２mM ＥＤＴＡ、３０mM ＭｇＣｌ２、２mM ＥＧＴＡ、１０mM β−グリセロリン酸、０．４mM Ｎａ３ＶＯ４、０．４mM ＤＴＴ、２００μM ＡＴＰ）中で３０℃で３０分間かけて行なった。反応をローディング緩衝液を用いて停止し、そして混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。
【００７６】
トランスマイグレーションアッセイ
Ｔ細胞のトランスマイグレーションを、マイクロトランスウェルシステム（Costar Transwell支持体−Ａ）および器官型のマウス脳培養液（Ｂ）の両方においてジャーカットＴ細胞を用いて実施した。
【００７７】
Ａ：トランスマイグレーションを、３回、トランスウェルシステム（ボイデンチャンバー、Costar、直径５μmの孔サイズのメンブレン）中でVincent et al. (2005) J. Immunol. 175:7650-7660に記載のように実施した。簡潔に言うと、Ｔ細胞調製物（３×１０５個の細胞／ウェル）を上のチャンバーに加え、そしてＣＸＣＬ１２を下の区画に加えた（１０ng/ml）。３７℃で２時間インキュベーションした後、下のチャンバー中で遊走している細胞を、顕微鏡下で計測した（少なくとも３０か所の視野を調べた）。
【００７８】
Ｂ：神経組織上におけるＴ細胞のトランスマイグレーションを、以下のように調製した海馬培養液上でアッセイした。生後（Ｐ７）Ｃ５７ＢＬ６マウスの海馬を解剖し、そしてグルコース（６．５mg/ml）の補充された冷ゲイ平衡化溶液中に直ちに入れた。４００μmの切片を、ＭｃＩＩｗａｉｎティッシュチョッパーを使用して海馬の中隔側頭軸に対して垂直に切断した。切片を過剰な組織については注意深く整え、そして６つの切片を、６ウェルプレート中の３０mmの半透過性メンブレンインサート（Millicell-CM, Millipore）上に置いた（各々のウェルは１mlの培養培地を含む）。培養培地は、５０％最小必須培地（Gibco）、２５％ハンク平衡塩溶液、２５％熱不活化ウシ血清（Gibco）、１％ｌ−グルタミン２００mM（Gibco）および６．５mg/ml Ｄ−グルコースから構成された。プレートを３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションした。培養培地を１週間に２回交換した。ex vivoにおいて生体の蛍光色素カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル／ＣＦＳＥ（１mM、５分間、３７℃）を使用して染色されたジャーカットＴ細胞（１つの切片あたり１×１０６個の細胞）を、海馬切片（１週間培養液）の近くにスポットした。３７℃で１８時間接触させた後、切片をＤ−ＭＥＭを用いて十分に洗浄し、エタノールで固定し（１０分間、４℃）、そして核対比染色のためにＤＡＰＩと共にインキュベーションした。蛍光顕微鏡下で計測された浸潤リンパ球の数は、ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆを用いてトランスフェクションされたＴ細胞個体群において減少した。
【００７９】
統計分析
２つの平均の比較における統計学的有意性は、独立スチューデントｔ検定を用いて試験され、０．０５未満のｐ値を有意と考えた。遊走試験においては、遊走リンパ球の数を光学顕微鏡（１条件あたり１５〜２０個の顕微鏡視野、２回または３回の独立した実験）によって計測し、そしてデータを、１視野あたりの遊走リンパ球の平均数として表現した。
【００８０】
結果
ＣＸＣＬ１２は、Ｔリンパ球の尾足におけるＣＲＭＰ２の極性化を誘導する
ケモカインとＣＲＭＰ２との間の連関を定義するために、本発明者らはまず、ＣＸＣＬ１２シグナリング下におけるジャーカットＴ細胞におけるＣＲＭＰ２の局在を調べた。本発明者らは、完全長および切断産物のＣＲＭＰ２を認識する２つの異なる抗ＣＲＭＰ２抗体（抗Ｃ−ｔｅｒ抗体および抗ｐｅｐ４抗体）を使用した。非処理Ｔ細胞の免疫蛍光研究は、ＣＲＭＰ２が、点状のドットとしてＴ細胞の細胞質内に見られたことを明らかとした。ＣＸＣＬ１２による処理下において、ＣＲＭＰ２は、２分以内に細胞の後縁に移動し、そして１０分間の処理後に大半の極性化した細胞において準排他的な尾足における局在を示した。ＣＲＭＰ２極性化のこのような現象は、処理から３０分後にも依然として観察された。非処理ジャーカットＴ細胞は、細胞において非対称的なＣＲＭＰ２の分布を示したが、ＣＸＣＬ１２の処理後に１．６〜２倍の増加が観察された（図１）。同じようなＣＲＭＰ２の再局在化が、抗ｐｅｐ４抗体染色によっても観察された。さらに、尾足へのＣＲＭＰ２の分布が、ビメンチンの再局在化と同時に起こり、このビメンチンは極性化しているＴ細胞の後縁に迅速に再分布した。興味深いことに、ＣＲＭＰ２の再局在化は、ＣＸＣＬ１２レセプター（ＣＸＣＲ４）のアンタゴニストであるＡＭＤ３１００の存在下において非常に大きな程度で逆行し（３５％の減少）、結果として、ＣＸＣＬ１２誘導応答の特異性が確認された（図２）。これらの結果は、ケモカインが、ビメンチンと協奏して、Ｔリンパ球において、すなわちフレキシブルな尾足構造へと、ＣＲＭＰ２の動的な再局在化を誘導し得るという意見を支持した。
【００８１】
ＣＸＣＬ１２は、細胞骨格へのＣＲＭＰ２の結合をモデュレーションする。
Ｔ細胞の尾足にはビメンチンおよび微小管が豊富であり（Serrador et al. (1999) Trends Cell Biol. 9:228-233）、この２つの細胞骨格エレメントは両方共に、ＣＲＭＰ２の結合対（Vincent et al. (2005) J. Immunol. 175:7650-7660; Gu et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:17917-17920）並びにＴリンパ球の極性化および遊走におけるアクター（Krummel et al. (2006) Nat. Immunol. 7:1143-1149）として記載されていることは周知である。このことから、本発明者らは、ＣＸＣＬ１２が、細胞骨格へのＣＲＭＰ２の結合をモデュレーションして、Ｔ細胞の運動性を促進し得ると仮定した。ＣＸＣｌ２による処理後（１００ng/ml、１０分間および３０分間）、細胞下分画をジャーカットＴ細胞抽出物に対して実施して、細胞骨格エレメントおよび会合タンパク質を細胞質画分から単離した。ビメンチン、チューブリンＰＡＲＰおよびＨｓｐ９０に対する抗体を使用する細胞下画分の同定は、細胞骨格画分と細胞質画分との間のコンタミが全くないことを示した。細胞骨格画分は、中間径フィラメントのビメンチンを示したが、チューブリンは含まず、これはおそらく、チューブリンが細胞質に見られるので脱重合に起因する。その後、異なる画分を、抗ＣＲＭＰ２抗体を使用してウェスタンブロットにかけた。非処理細胞の全細胞溶解液において、抗Ｃ−ｔｅｒ抗体は、以前に記載された完全長ＣＲＭＰ２（６２ｋＤａ）に対応するＣＲＭＰ２バンド、およびより高い分子量を有するバンドを明らかとした（図３）。抗ｐｅｐ４抗体は主に、神経細胞において報告されているような（Rogemond et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:14751-14761）、切断型のＣＲＭＰ２に対応する５８ｋＤａバンドを認識した。抗ｐｅｐ４抗体の親和性は、完全長型よりも切断型に対しての方が高かった。ＣＸＣＬ１２による処理後、その効率をＥｒｋ１／２リン酸化によって評価し（図３）、ＣＲＭＰ２発現の差異は全細胞溶解液においては検出できなかった。しかしながら、ＣＲＭＰ２型の分布は調べたＴ細胞の区画によって異なった。完全長ＣＲＭＰ２およびより高い分子量バンドは細胞質画分に見られた。これらはＣＸＣＬ１２処理下において主な変化を示さなかった。ＣＲＭＰ２はまた、６２ｋＤａの完全長型および５８ｋＤａの切断型として細胞骨格画分においてより少ない程度で見られた。興味深いことに、両方の型の発現は、ＣＸＣＬ１２による処理の後に増強された。切断されたＣＲＭＰ２の大半が核に見られ、そしてＣＸＣＲ４による活性化下で改変されなかったことは注記すべきである。これらの結果は、ＣＲＭＰ２がＴリンパ球の細胞骨格区画に分布し、そしてＣＸＣＬ１２はこの分布を変化させ、細胞骨格エレメントとＣＲＭＰ２の会合を増強する能力を有することを示した。
【００８２】
ＣＸＣＬ１２は、ＣＲＭＰ２のリン酸化を増加させる。
神経細胞におけるＣＲＭＰ２の機能的調節は主に、特にＧＳＫ−３βキナーゼ活性およびＣｄｋ５のキナーゼ活性を介する、そのリン酸化状態に依存する（Uchida et al. (2005) Genes Cells 10:165-179）。それ故、本発明者らは、Ｔリンパ球において、ＣＸＣＬ１２が、そのリン酸化のモデュレーションを通して、細胞骨格へのＣＲＭＰ２の結合を改変し得るかどうかを研究した。ＣＲＭＰ２のリン酸化を評価するために、本発明者らは、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml）による処理後にジャーカットＴ細胞の全細胞抽出物に対してリン酸化タンパク質濃縮アッセイ（TALON（登録商標）PMAC Clonetech）を実施し、そして処理から２、５、１０および３０分後にウェスタンブロットによって非リン酸化画分（素通り画分）およびリン酸化画分（溶出液）に対してイムノブロットを行なった。抗Ｃ−ｔｅｒ抗体によって明らかとなった完全長ＣＲＭＰ２型は、非リン酸化画分およびリン酸化画分の両方に存在した（図４）。これに対し、切断型のＣＲＭＰ２は、リン酸化タンパク質プールにおいてのみ見られ、このことは、この型が、大部分はリン酸化されていることを示す。ＣＸＣＬ１２による処理は、ＣＲＭＰ２リン酸化型のレベルを急速に増加させ、処理から２分後にピークに達し、そして依然として３０分後にも高かった。リン酸化タンパク質濃縮手順の効率は、リン酸化Ｅｒｋ１／２イムノブロットによって確認され、これは、溶出液中のリン酸化タンパク質の特異的存在、および同時に、ＣＸＣＬ１２による処理後の増加を確認した。健康ドナーから単離した初代Ｔリンパ球に対して実施された類似の実験は類似の観察を示した。ＣＸＣＬ１２に応答したＣＲＭＰ２リン酸化のより正確な評価を、それぞれＣｄｋ５キナーゼおよびＧＳＫ−３キナーゼによってターゲティングされる２つの部位を認識する、抗ＣＲＭＰ２−ｐＳｅｒ５２２抗体および抗ＣＲＭＰ２−ｐＴｈｒ５０９／５１４抗体を使用して実施した（図５）。ジャーカット細胞溶解液のイムノブロットは、ＣＲＭＰ２−ｐＳｅｒ５２２およびＣＲＭＰ２−ｐＴｈｒ５０９／５１４が、Ｔ細胞において完全長６２ｋＤａのＣＲＭＰ２として存在し、そしてケモカイン処理中に種々に発現され、その効率はリン酸化Ｅｒｋ１／２の検出によって確認された。Ｓｅｒ５２２リン酸化は比較的低いレベルで見られたが、Ｔｈｒ５０９／５１４リン酸化は、４分後までに急速に減少し、そしてその後は検出できなかった。これは、Ｃｄｋ５キナーゼおよびＧＳＫ−３キナーゼの活性型である、Ｃｄｋ−ｐＴｙｒ１５、Ｃｄｋ５−ｐＳｅｒ１５９、ＧＳＫ−３α−ｐＴｙｒ２７９およびＧＳＫ−３β−ｐＴｙｒ２１６の検出によって評価される、Ｃｄｋ５キナーゼおよびＧＳＫ−３キナーゼの活性と一致した（図６）。Ｃｄｋ５は、Ｔｙｒ１５およびＳｅｒ１５９上において安定したレベルのリン酸化を示し、Ｃｄｋ５の保存された活性化レベルを反映した。これに対し、ＧＳＫ−３は、ＧＳＫ−３βアイソフォーム上で主に検出された脱リン酸化を示し、これは処理から４分後に始まる低下した活性を反映した。合わせて考えると、これらの結果が初めて、神経細胞において以前に記載されたように、ＣＲＭＰ２残基のＳｅｒ５２２およびＴｈｒ５０９／５１４がＴリンパ球においてリン酸化され得ることを明らかとした。より重要なことには、それらは、ＣＸＣＬ１２が、ＣＲＭＰ２のこれらの残基のリン酸化の異なるモデュレーションをもたらすシグナルカスケードをトリガーし、すなわち、Ｔｈｒ５０９／５１４上におけるリン酸化は正味で減少することを実証する。興味深いことに、これらのモデュレーションは主に完全長型ＣＲＭＰ２上で検出されたが、リン酸化タンパク質濃縮アッセイ（図４）は、ケモカイン処理後の切断型のＣＲＭＰ２の強力なリン酸化を示した。これにより本発明者らは、ＣＸＣＬ１２に対するＣＲＭＰ２の応答におけるさらに他のリン酸化ターゲットの関与を疑った。
【００８３】
チロシン４７９は、ＣＲＭＰ２配列における新たなリン酸化残基である。
ＣＸＣＬ１２が、Ｌｃｋ、ＺＡＰ−７０およびＩｔｋを含むチロシンキナーゼの連続的補充および活性化を含む、Ｔリンパ球におけるチロシンリン酸化カスケードをトリガーすることが知られている（Patrussi et al. (2008) Immunol. Lett. 115:75-82）。それ故、本発明者らは、ＣＲＭＰ２タンパク質配列を分析することによって、ケモカイン処理下でモデュレーションされる可能性のあるチロシンターゲット残基について探索した。５７２個のアミノ酸のデータベース研究は、残基４７２〜４７９内のリン酸化チロシン共通モチーフＫｘｘｘＤｘｘＹ内に位置する、可能性ある新たなリン酸化残基としてチロシン４７９（Ｙ４７９）を同定した（図７）。さらに、この領域の検査はまた、Ｙ４７９の近くの、残基４６７〜４７３内のＲｘｘＰｘｘＰ型の推定ＳＨ３結合モチーフの存在を示した。結合タンパク質対へのこれらの配列の近づきやすさを評価するために、本発明者らは、フラグメント１５〜４８９について入手可能な座標に基づいて、ＣＲＭＰ２の既知構造内（図７）におけるＹ４７９およびＳＨ３結合モチーフの両方の位置を評価した（Stenmark et al. (2007) J. Neurochem. 101:906-917）。このＣＲＭＰ２型の表面露出図は、Ｙ４７９とは対照的に、推定ＳＨ３結合モチーフが露出していることを明らかとし、このことは、ＳＨ３ドメインを有するタンパク質との結合の可能性を示唆する（図７の挿入図）。ＳＨ３ドメイン結合モチーフとの相互作用は、タンパク質コンフォメーション変化を誘導し（Martinez and Serrano (1999) Nat. Struct. Biol. 6:1010-1016）、よって前記タンパク質コンフォメーションがその後のＹ４７９の露出の基礎であり得ることが示された。これらの観察は、ＣＲＭＰ２配列内の主要な推定リン酸化チロシンとしてのＹ４７９を示唆した。
【００８４】
ＣＲＭＰ２のチロシンリン酸化は、ＳｒｃファミリーキナーゼＹｅｓによって行なわれ、そしてこれはケモカイン処理下で増加する。
潜在的なリン酸化可能な部位Ｙ４７９に近い推定ＳＨ３結合モチーフの存在の観点から、そのＳＨ３ドメインを通したＣＲＭＰ２とチロシンキナーゼとの間の可能性ある相互作用を研究した。これは、活性コンフォメーションで折りたたまれたままであるいくつかのタンパク質ＳＨ３ドメインを有するメンブレンアレイを使用して実施された。１０個の異なるリンパ球チロシンキナーゼ（エーベルソンキナーゼ（Ａｂｌ）、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｙｅｓ、ｃ−Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、Ｂｌｋ）およびＴｅｃファミリーキナーゼ（Ｉｔｋ、Ｔｘｋ、Ｂｌｋ）を含む）がこのアレイに存在した。Ｈｉｓタグのついた組換えＣＲＭＰ２のハイブリダイゼーション後、タンパク質−タンパク質相互作用を、抗Ｈｉｓ抗体を使用して可視化し、そしてスポット強度は相互作用の強度を明らかとした（表１）。
【００８５】
表１：ＳＨ３タンパク質−ＣＲＭＰ２の相互作用の同定
ＣＲＭＰ２−Ｈｉｓ組換えタンパク質を、製造業者の指示に従って、３８個のタンパク質のＳＨ３ドメインを用いて２回スポットされたメンブレン（TranSignal TM SH3ドメインアレイＩ-Panomics）と共にインキュベーションした。抗Ｈｉｓ抗体は、いくつかのチロシンキナーゼタンパク質のＳＨ３ドメインを含む、複数のＳＨ３ドメインとＣＲＭＰ２との会合を明らかとした。スポット強度（−から＋＋＋まで）は、リガンドＣＲＭＰ２に対するＳＨ３ドメインの結合親和性を示し、そしてＣＲＭＰ２についての強力なチロシンキナーゼ候補としてのＹｅｓを明らかとした。
【００８６】
【表１】
【００８７】
Ｙｅｓキナーゼは、ＣＲＭＰ２への強い結合を示したが、ＢｌｋおよびＡｂｌは弱いシグナルを示した。さらに、Ｖａｖ１、ＰＬＣγ、ＩＴＳＮおよびＰＩ３βに属する４つの非キナーゼタンパク質ＳＨ３ドメインもまた、ＣＲＭＰ２への強い結合を示した。興味深いことに、ＰＬＣγおよびＩＴＳＮは以前に、ＣＲＭＰ２に対する結合対として観察されている（Quinn et al. (2003) J. Neurosci. 23:2815-2823; Buttner et al. (2005) Biochemistry 44:6938-6947）。その後、本発明者らは、ＣＲＭＰ２リン酸化についてのより強力なチロシンキナーゼ候補であるＹｅｓに焦点を当てた。
【００８８】
Ｙｅｓ／ＣＲＭＰ２相互作用をいくつかのアプローチによって評価した。まず、これらのタンパク質の局在を、コラーゲンＩでコーティングされたカバーガラスに付着させ、そしてその後、ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml、５分間）で処理した、初代Ｔリンパ球およびジャーカットＴ細胞上で評価した。抗Ｙｅｓ抗体および抗ｐｅｐ４抗体を用いて実施された免疫蛍光は、特に極性化したＴ細胞の尾足における、ＣＲＭＰ２およびＹｅｓの共分布を示した。Ｙｅｓ／ＣＲＭＰ２の相互作用を次に、初代Ｔリンパ球および神経細胞（Ｄｅｖ細胞株）（ＣＲＭＰ２はまた、中枢神経系（ＣＮＳ）における運動性にも関与しているため）からの細胞溶解液を使用してＧＳＴプルダウンアッセイによって調べた（図８）。グルタチオン−セファロースビーズ上に固定されたＣＲＭＰ２を細胞溶解液と共にインキュベーションした。両方の細胞型からの溶出液に対して実施されたウェスタンブロットは、ＣＲＭＰ２−ＧＳＴと会合したＹｅｓタンパク質の存在は示したが、ＧＳＴのみと会合したものは示さなかった。合わせて考えると、これらの結果は、ＣＲＭＰ２に対する強力な結合対としてのＹｅｓキナーゼを規定した。この相互作用の機能的意義を評価するために、in vitroにおけるキナーゼアッセイを、活性組換えヒトＹｅｓキナーゼおよび基質としてのＨｉｓタグのついたＣＲＭＰ２を使用して実施した（図９）。リン酸化を、イムノブロットによって抗リン酸化チロシン抗体を使用して検出した。対照はＣＲＭＰ２の非存在下において実施され、これはＹｅｓの自己リン酸化を示した。ＣＲＭＰ２のリン酸化に対応するバンドは、ＡＴＰの存在下においてのみ検出された。タンパク質リン酸化の結果として、このバンドは、分子量の僅かな増加を示した。
【００８９】
Ｔ細胞におけるチロシンリン酸化型のＣＲＭＰ２の存在を確認するために、リン酸化残基Ｔｙｒ４７９を含むＣＲＭＰ２配列のフラグメント（ＡＡ４７０〜４８３）に対するポリクローナル抗体を生じさせた。この抗体を用いてのイムノブロットは、完全長および５８ｋＤａの切断されたタンパク質の両方として検出された、Ｔリンパ球におけるＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ４７９の存在を明らかとした。
【００９０】
ＣＸＣＬ１２（１００ng/ml；０、１、２、４、６、１０、１５、３０分間）を用いて処理したジャーカットＴ細胞におけるＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ４７９の調査は、Ｔｙｒ４７９リン酸化の増加を示し（図１０）、これは主に処理から８〜１４分後に観察された。ＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ４７９の増加した発現は、ＣＲＭＰ２−Ｔｈｒ５０９／５１４の減少と同時に起こり、これはその依存性を示唆する。Ｔｙｒ４７９リン酸化のこのピークは、Ｙｅｓを含むリン酸化Ｓｒｃファミリーメンバーを認識する抗体である、抗Ｓｒｃ−ｐＴｙｒ４１６抗体を使用したイムノブロットによって示されるように、この時点においてＳｒｃ−ファミリーキナーゼの活性化と相関した。その後、免疫蛍光を、リン酸化型および非リン酸化型のＣＲＭＰ２に対する抗体を使用して、ＣＸＣＬ１２で処理した（１５分間）ジャーカット細胞に対して実施した。ＣＲＭＰ２−ｐＴｙｒ４７９についての染色は主に、Ｔリンパ球における極性化した分布を伴った。ビメンチンとの共局在は、それぞれビメンチンと会合しているまたは会合していないのいずれかである抗ｐｅｐ４抗体および抗Ｃ−ｔｅｒ抗体によって認識されるＣＲＭＰ２型と比較して、リン酸化されたＣＲＭＰ２−Ｔｙｒ４７９は主に、尾を引く極においてビメンチンと共局在することを示した。合わせて考えると、これらの結果は、ＣＸＣＬ１２シグナリングによってモデュレーションされ、細胞骨格エレメントと共局在し、そしてＳｒｃ−ファミリーキナーゼＹｅｓによってターゲティングされ得る、新たな型のリン酸化ＣＲＭＰ２を同定した。
【００９１】
ＣＲＭＰ２−Ｔｙｒ４７９リン酸化は、ケモカインにより誘導されるＴ細胞の極性化および遊走に関与する。
Ｔｙｒ４７９上におけるＣＲＭＰ２リン酸化の機能的意義を評価するために、本発明者らは、完全長ＣＲＭＰ２配列上における突然変異Ｙ４７９−Ｆを工学操作した。その後、Ｔ細胞の極性化に対するＴｙｒ４７９リン酸化障害の作用を、ＦｌａｇのタグのついたＣＲＭＰ２−ｗｔおよびＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆ突然変異体を用いて一過性にトランスフェクションされたジャーカットＴ細胞において分析した。トランスフェクションから２４時間後、Ｔ細胞をコラーゲンＩでコーティングされたスライドに付着させ、その後、ＣＸＣＬ１２で処理し、そして蛍光顕微鏡によって調べた。Ｆｌａｇ陽性免疫染色によって可視化されるような、トランスフェクションされたＴ細胞におけるＣＲＭＰ２の極性化を、ビメンチンネットワークの共局在化に基づいて調べた。これにより本発明者らは、ＣＲＭＰ２−ｗｔまたはＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−ＦのいずれかでトランスフェクションされたＦｌａｇ陽性Ｔ細胞の極性化を評価することが可能となった（全トランスフェクション細胞に対する比率として表現）。ＣＲＭＰ２−ｗｔを用いてトランスフェクションされた非処理ジャーカットＴ細胞個体群は、約２８％の自発的に極性化した細胞を示したが、これは、ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆ突然変異体を用いてトランスフェクションされたＴ細胞においては明らかに減少した（図１１）。ＣＸＣＬ１２による処理後、ビメンチンは、ＣＲＭＰ２−ｗｔでトランスフェクションされたＴ細胞においては尾足に迅速に再分布した。これに対し、ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆでトランスフェクションされた細胞は、明らかにあまり極性化しなかった（図１１）。さらに、ＣＸＣＬ１２による処理後の極性化した細胞数の増加は、ＣＲＭＰ２−ｗｔよりもＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆを用いてトランスフェクションされたジャーカットＴ細胞においての方がより少なく（それぞれ４２％ｖｓ３１％）（図１１）、従って、Ｔ細胞の極性化に対するＴｒｙ４７９リン酸化の影響が確認された。これらの結果は明らかに、Ｔリンパ球の極性化におけるＣＲＭＰ２−Ｔｙｒ４７９リン酸化の役割を示した。
【００９２】
Ｔ細胞の極性化は遊走にとって必要条件であるので、本発明者らはさらに、Ｔ細胞の遊走に対するＴｙｒ４７９リン酸化の影響を評価した。従って、本発明者らはまず、トランスウェルチャンバーにおいてトランスマイグレーションアッセイを実施することによって、ＣＸＣＬ１２の方へと、トランスフェクションされたジャーカットＴ細胞が遊走する能力を評価した。図１２に示したように、ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆでトランスフェクションされた細胞の遊走速度は、ＣＲＭＰ２−ｗｔおよび対照細胞（空ベクター）と比較して劇的に減少した。血管を横切るために必要であるＴ細胞のトランスマイグレーションを超えて、侵入組織内における遊走もまた、特にＣＮＳ内においてはキーポイントである（ＣＮＳではＣＸＣＬ１２およびその同族レセプターが構成的に発現されている）。それ故、本発明者らは、Ｔｙｒ４７９リン酸化が、神経組織内におけるＴ細胞の遊走に対して影響を及ぼすかどうかを、マウス海馬器官型培養液を使用して調べた。トランスフェクションされたジャーカットＴ細胞（４０〜５０％のトランスフェクション効率）を、生体の色素のＣＦＳＥで染色することにより、神経組織上および神経組織中の両方においてそれらを容易に可視化した。その後、細胞を脳切片の近くにスポットし、そして１８時間のインキュベーション後に計測した。ＣＲＭＰ２−Ｙ４７９−Ｆでトランスフェクションされた細胞は、野生型のトランスフェクション細胞と比較して、神経細胞上を移動する低下した能力を示した（図１３）。これらの結果は、神経組織内のＴ細胞の遊走過程におけるＣＲＭＰ２−Ｔｙｒ４７９リン酸化の役割を実証した。
【００９３】
従って、本発明者らは、チロシン４７９上のリン酸化がＴ細胞の遊走に対して影響を及ぼし、従って、ＣＮＳの炎症疾病の予測マーカーとして使用することができることを実証した。
【００９４】
実施例２
本発明者らは、ＴＣＲ刺激によって媒介されるＴリンパ球の活性化が、ＣＲＭＰ２、より特定すると、国際出願ＷＯ２００３／０２２２９８に記載の抗ペプチド４抗体による切断型のＣＲＭＰ２の検出の増加をもたらしたことを示した。
【００９５】
興味深いことに、これらの抗体は、カラムで濃縮されたリン酸化型のＣＲＭＰ２を強く認識した。さらに、Ｓ４６５のリン酸化されたＣＲＭＰ２は、ＣＮＳに記載されたリン酸化型のＣＲＭＰ２の中で主要なリン酸化型のＣＲＭＰ２である。
【００９６】
従って、これらの結果は、切断されたＳ４６５リン酸化ＣＲＭＰ２の検出が、ＴＣＲ刺激によって媒介されるＴリンパ球の活性化に関連し、そしてこれをＴＣＲ活性化の末梢マーカーとして使用することができることを示唆する。
【００９７】
実施例３
本発明者らは、ＨＴＬＶ−１感染に関連した多発性硬化症または脊髄症を患う患者において、活性化Ｔリンパ球の亜個体群（ＣＤ６９＋および／またはＨＬＡ−ＤＲ＋）が、健康被験体よりもより強くＣＲＭＰ２を発現したことを示した。
【００９８】
本発明者らは、この改変が、Ｔリンパ球の遊走能の増加に関連することを示した。さらに、この増加は、抗ＣＲＭＰ２抗体を使用して阻害され得る。
【００９９】
ＣＲＭＰ２の高い発現は、抗ペプチド４抗体を使用して検出された。これらの抗体は特にリン酸化および切断された型のＣＲＭＰ２を認識するので、この増加した検出はおそらく、ＣＲＭＰ２リン酸化の改変、特に、ＣＲＭＰ２のＳ４６５リン酸化に起因する。
【０１００】
従って、これらの結果は、ＣＲＭＰ２の切断およびＴリンパ球におけるリン酸化ＣＲＭＰ２の過剰発現が（ＴＣＲ刺激を介するセリン４６５上およびケモカイン活性化を介するチロシン４７９上）、神経炎症過程の末梢マーカーであり、そしてこれを中枢神経系の炎症疾病の早期診断、予知またはモニタリングに使用することができることを実証する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における中枢神経系の炎症疾病のin vitroにおける予知、診断および／またはモニタリングのための方法であって、前記方法は、被験体からの免疫系細胞の試料中における、チロシン４７９（Ｙ４７９）上でリン酸化されたコラプシン応答媒介タンパク質２（ＣＲＭＰ２）の存在を検出することを含み、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在の検出は、中枢神経系の炎症疾病を示す、前記方法。
【請求項２】
前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２が切断型である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２が、セリン４６５（Ｓ４６５）上でさらにリン酸化されている、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２が、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体を用いて検出される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記の中枢神経系の炎症疾病が、髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脳脊髄炎、脳炎（encephalititis）または脊髄症、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病を伴うウイルス感染または細菌感染からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
チロシン４７９上でリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体。
【請求項７】
セリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体。
【請求項８】
中枢神経系の炎症疾病の予知、診断および／またはモニタリングにおいて使用するための請求項６または７記載の抗体。
【請求項９】
免疫細胞の遊走を減少させるために使用するための請求項６または７記載の抗体。
【請求項１０】
中枢神経系の炎症疾病の処置において使用するための請求項６または７記載の抗体。
【請求項１１】
前記の中枢神経系の炎症疾病が、髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脳脊髄炎、脳炎（encephalititis）または脊髄症、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病を伴うウイルス感染または細菌感染からなる群より選択される、請求項１０記載の使用のための抗体。
【請求項１２】
チロシン４７９および／またはセリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２を検出するための請求項６または７において定義したような抗体の使用。
【請求項１３】
さらに切断型であるＣＲＭＰ２を検出するための、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
免疫細胞の遊走を減少させるために使用するためのＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニスト。
【請求項１５】
中枢神経系の炎症疾病の処置において使用するための、請求項１４記載の使用のためのアンタゴニスト。
【請求項１６】
前記の中枢神経系の炎症疾病が、髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脳脊髄炎、脳炎（encephalititis）または脊髄症、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病を伴うウイルス感染または細菌感染からなる群より選択される、請求項１５記載の使用のためのアンタゴニスト。
【請求項１】
被験体における中枢神経系の炎症疾病のin vitroにおける予知、診断および／またはモニタリングのための方法であって、前記方法は、被験体からの免疫系細胞の試料中における、チロシン４７９（Ｙ４７９）上でリン酸化されたコラプシン応答媒介タンパク質２（ＣＲＭＰ２）の存在を検出することを含み、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２の存在の検出は、中枢神経系の炎症疾病を示す、前記方法。
【請求項２】
前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２が切断型である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２が、セリン４６５（Ｓ４６５）上でさらにリン酸化されている、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記のＹ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２が、Ｙ４７９のリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体を用いて検出される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記の中枢神経系の炎症疾病が、髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脳脊髄炎、脳炎（encephalititis）または脊髄症、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病を伴うウイルス感染または細菌感染からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
チロシン４７９上でリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体。
【請求項７】
セリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２に特異的な抗体。
【請求項８】
中枢神経系の炎症疾病の予知、診断および／またはモニタリングにおいて使用するための請求項６または７記載の抗体。
【請求項９】
免疫細胞の遊走を減少させるために使用するための請求項６または７記載の抗体。
【請求項１０】
中枢神経系の炎症疾病の処置において使用するための請求項６または７記載の抗体。
【請求項１１】
前記の中枢神経系の炎症疾病が、髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脳脊髄炎、脳炎（encephalititis）または脊髄症、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病を伴うウイルス感染または細菌感染からなる群より選択される、請求項１０記載の使用のための抗体。
【請求項１２】
チロシン４７９および／またはセリン４６５上でリン酸化されたＣＲＭＰ２を検出するための請求項６または７において定義したような抗体の使用。
【請求項１３】
さらに切断型であるＣＲＭＰ２を検出するための、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
免疫細胞の遊走を減少させるために使用するためのＣＸＣＲ４レセプターのアンタゴニスト。
【請求項１５】
中枢神経系の炎症疾病の処置において使用するための、請求項１４記載の使用のためのアンタゴニスト。
【請求項１６】
前記の中枢神経系の炎症疾病が、髄膜炎、脳炎、脊髄炎、脳脊髄炎、脳炎（encephalititis）または脊髄症、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病を伴うウイルス感染または細菌感染からなる群より選択される、請求項１５記載の使用のためのアンタゴニスト。
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５３３０７９（Ｐ２０１２−５３３０７９Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２０１１１（Ｐ２０１２−５２０１１１）
【出願日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５４２１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００７２０９
【国際公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【出願人】（５９６０９６１８０）ユニベルシテ・クロード・ベルナール・リヨン・プルミエ (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５４２１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００７２０９
【国際公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【出願人】（５９６０９６１８０）ユニベルシテ・クロード・ベルナール・リヨン・プルミエ (16)
【Ｆターム（参考）】
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