乳由来タンパク質加水分解物の製法
本発明は、乳由来タンパク質加水分解物を製造するための酵素的方法と、例えば人工栄養乳組成物における、かかる加水分解物の使用とに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願はコンピューター読取可能な形式の配列表を含む。このコンピューター読取可能形式は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、乳由来タンパク質加水分解物を製造するための酵素的方法と、例えば人工栄養乳組成物中における、かかる加水分解物の使用とに関する。
【背景技術】
【０００３】
乳幼児の母乳栄養に代替し得る人工栄養乳が開発されてきた。
かかる人工栄養乳は、適切な離乳食が始まるまで、乳幼児の栄養要求を完全に満たさなければならない。更に、味は重要であり、少なくとも親は苦味のない人工栄養乳を好む。通常の牛乳の代わに加水分解乳タンパク質、例えば部分加水分解ホエータンパク質や高加水分解カゼインを含む人工栄養乳がよく使用される。アレルギー性が低く、味も許容し得るからである。
【０００４】
文献記載の部分加水分解物の調製法の多くは、ブタ膵臓組織の抽出により製造されるトリプシン調製物等の膵臓酵素の使用を含む（例えばＷＯ９３０４５９３Ａ１、ＵＳ５０３９５３２Ａ等を参照）。文献記載の方法の中には、トリプシン及びキモトリプシンの混合物の使用を含むものもある。例えばＥＰ０３５３１２２Ａは、キモトリプシン／トリプシン活性の比が１．５〜３．０であるトリプシンとキモトリプシンとの混合物を使用して、低アレルギー性ホエータンパク質加水分解物を調製する方法を開示する。ＥＰ０６３１７３１Ａ１によれば、トリプシン対キモトリプシン比が１．３〜１８、より好ましくは４〜６（ＵＳＰ単位）のトリプシンとキモトリプシンとの混合物が、通常は好適な性質を有する加水分解物を与えるとされている。
【０００５】
いくつかの理由から、微生物から産生されるタンパク質分解酵素の使用によって利点が得られる場合がある。例えば、微生物による酵素産生は効率的であり、制御が容易である。よって、かかる酵素は大量に、且つ高純度で生産することができる。また、微生物酵素の使用は、動物材料からの酵素抽出に伴う増大するＱＡ関連の困難を克服する助けにもなるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者等の目的の一つは、微生物から産生される酵素を用いて、低アレルギー誘発性の乳由来タンパク質加水分解物を製造する方法を開発することである。別の目的は、トリプシンとキモトリプシンとを含む抽出調製物を用いて調製された加水分解物のタンパク質フラグメントプロフィールと類似のタンパク質フラグメントプロフィールを有する乳由来タンパク質加水分解物を、微生物から産生される酵素を用いて製造する方法を開発することである。別の目的は、微生物から産生される酵素を用いて、許容し得る味の乳由来タンパク質加水分解物を製造する方法を開発することである。特に、低アレルギー誘発性を有し、トリプシンとキモトリプシンとを含む抽出調製物を用いて調製された加水分解物のタンパク質フラグメントプロフィールと類似のタンパク質フラグメントプロフィールを有し、及び／又は、特に苦みの面で許容し得る味を有する、部分的ホエータンパク質加水分解物を得ることが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は驚くべきことに、微生物から産生された酵素が、例えば人工栄養乳に含ませる乳由来タンパク質加水分解物の製造に使用できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、乳由来タンパク質加水分解物の調製法であって、
乳由来タンパク性物質の溶液を、
ａ）微生物から産生されるトリプシン様エンドペプチダーゼ、及び
ｂ）微生物から産生される少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼ、
を用いて処理することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ブタトリプシン（上のトレース）との比較でフザリウム（Fusarium）トリプシン（下のトレース）のＵＶクロマトグラムを示すとともに、主なピークのペプチド配列同一性を示す。
【図２】図２は、ウシトリプシン（上のトレース）と比較したブラキスポリエラ（Brachysporiella）プロテアーゼ（下のトレース）のＵＶクロマトグラムを示すとともに、主なピークのペプチド配列同一性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の方法では、乳由来タンパク性物質を出発物質として使用する。かかる乳由来タンパク性物質は、例えば、ホエー由来タンパク性物質、カゼイン、又はホエー由来タンパク性物質とカゼインとの混合物からなる。ホエー由来タンパク性物質の原料としては、例えばチーズ製造時に得られるホエー、特にレンネットによるカゼインの凝固から生じるスイートホエーが挙げられる。ホエー由来タンパク性物質は、限外ろ過物（ＵＦホエー）やホエータンパク質分離物等の、タンパク質が３５〜８０％の範囲の濃縮物の形で使用してもよい。このホエー由来タンパク性物質は、イオン交換及び／又は電気透析により得られるもの（ＥＤホエー）でもよい。好適な実施態様によれば、乳由来タンパク性物質はホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）である。
【００１１】
カゼイン源は酸性カゼインでも脱脂乳固体でもよい。
ホエー由来タンパク性物質及び／又はカゼインは、例えば液体濃縮物又は粉末の形で使用される。
【００１２】
好適な実施態様によれば、乳由来タンパク性物質はホエー由来タンパク性物質である。より好適な実施態様によれば、かかるホエー由来タンパク性物質の供給源は、カゼイノ−グリコ−マクロペプチド（ＣＧＭＰ）を除去したスイートホエー又はホエータンパク質分離物である。更に好適な実施態様によれば、かかるホエー由来タンパク性物質の供給源は、カゼイノ−グリコ−マクロペプチド（ＣＧＭＰ）を除去したスイートホエーである。
【００１３】
スイートホエーからＣＧＭＰを除去することにより、ヒトの母乳に近いスレオニン含量を有するタンパク性物質が得られる。続いて、この改質スイートホエーに、含量の少ないアミノ酸（基本的にはヒスチジンとアルギニン）を補完してもよい。スイートホエーからＣＧＭＰを除去する方法は、ＥＰ８８０９０２に記載されている。
【００１４】
本発明の方法では、タンパク性物質を希釈又は復元し、溶液又は懸濁物とする。そのタンパク性物質の含量は、好ましくは約２〜３５重量％、より好ましくは約５〜３０重量％とする。
【００１５】
本発明の方法では、乳由来タンパク性物質を、少なくとも２種のエンドペプチダーゼで処理する。これらはいずれも微生物から産生されたものである。
【００１６】
本発明の方法で使用されるエンドペプチダーゼは、どのような属の微生物から産生されたものでもよい。本発明の目的によれば、所与の生物に関して本明細書において使用される「から産生される」等の語は、本発明で使用されるポリペプチドが、当該所与の生物の細胞の発酵により製造されることを意味する。ポリペプチドは、産生生物が元来有するものであってもよく、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を宿主生物に導入して、異種的に産生させたものであってもよい。
【００１７】
本発明の方法で使用されるエンドペプチダーゼの１つは、トリプシン様エンドペプチダーゼである。本明細書では「トリプシン様エンドペプチダーゼ」という語を、ペプチド又はタンパク質をアルギニン及び／又はリジンのＬ−異性体のＣ末端側で優先的に切断するエンドペプチダーゼとして定義する。
【００１８】
好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、ペプチド又はタンパク質をアルギニン及びリジンのＣ末端側で優先的に切断する。これはエンドペプチダーゼが、他のアミノ酸の後における切断よりも、アルギニン及びリジンの後における切断に高い特異性を示すことを意味する。
【００１９】
別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、ペプチド又はタンパク質をアルギニン又はリジンのＣ末端側で優先的に切断する。これはエンドペプチダーゼが、他のアミノ酸の後における切断よりも、アルギニン又はリジンの後における切断に高い特異性を示すことを意味する。
【００２０】
別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、ペプチド又はタンパク質をアルギニンのＣ末端側で優先的に切断する。これはエンドペプチダーゼが、他のアミノ酸の後における切断よりも、アルギニンの後における切断に高い特異性を示すことを意味する。
【００２１】
別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、リジンのＣ末端側でペプチド又はタンパク質を優先的に切断する。これはエンドペプチダーゼが、他のアミノ酸の後における切断よりも、リジンの後における切断に高い特異性を示すことを意味する。
【００２２】
別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、ペプチド又はタンパク質をアルギニン又はリジンのＣ末端側で特異的に切断する。
【００２３】
好適な実施態様によれば、本発明のトリプシン様エンドペプチダーゼは、トリプシン比が１００超である。ここでトリプシン比とは、Ａｒｇ又はＬｙｓの後で切断する時の酵素活性（何れか大きい方）を、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ又はＶａｌの何れか１つの後で切断する時の酵素活性（何れか大きい方）で割った値として決定される。すなわち、好適な実施態様によれば、本発明のトリプシン様エンドペプチダーゼは、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ又はＶａの何れか１つの後における切断に対する特異性（何れか大きい方）より、Ａｒｇ又はＬｙｓの後における切断に対する特異性（何れか大きい方）の方が少なくとも１００倍高い。トリプシン比を求めるための活性測定は、エンドペプチダーゼ活性が最適ｐＨにおけるエンドペプチダーゼ活性の少なくとも半分となるようなｐＨ値で行なうべきである。トリプシン比は、例えば、本願の実施例１に記載のように決定すればよい。
【００２４】
典型的には、かかるトリプシン様エンドペプチダーゼは、ｐＨ約６．０〜約１１．０、好ましくはｐＨ約８〜約１０で、温度約４０℃〜約７０℃、好ましくは温度約４５℃〜約６５℃で、又は約４５℃〜約６０℃で、最適のタンパク質分解活性を有する。
【００２５】
好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、真菌エンドペプチダーゼである。より好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、フザリウム（Fusarium）株、好ましくはフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）由来である。これは例えば、本願の配列番号２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を有する（SWISSPROT No. P35049）。配列番号２のアミノ酸２５〜２４８で示されるアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）由来のトリプシン様エンドペプチダーゼが既に報告されている（ＵＳ５，２８８，６２７；ＵＳ５，６９３，５２０）。
【００２６】
ある実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）由来のものである。例えば、本願の配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＡＰ９７７Ｓが挙げられる（GENESEQP: ADZ80577）。別の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼはフザリウムｃｆ．ソラニ（Fusarium cf. solani）由来のものである。例えば、本願の配列番号６として示されるアミノ酸配列を有するＡＰ９７１が挙げられる。
【００２７】
本発明の目的によれば、所与の由来源（すなわち生物）からポリヌクレオチド又はポリペプチドを得ることとの関連で、本明細書で使用される「に由来する」等の語は、そのポリヌクレオチド（又はそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）が、その由来生物中に天然に存在するポリヌクレオチド配列と同一であるか、或いはその配列の変種であることを意味する。ここで、そのポリヌクレオチド配列が別の生物に挿入されたものか否かや、そのポリヌクレオチドが別の生物により産生されたものか否かは無関係である。
【００２８】
好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、真菌由来である。更に好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、フザリウム（Fusarium）株由来である。
【００２９】
本発明の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは：
ｉ）配列番号２、４又は６の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ii）（ｉ）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
iii）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
iv）配列番号２、４又は６の何れの成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種、
よりなる群から選択される。
【００３０】
本明細書では「成熟ポリペプチド」という語を、翻訳及び翻訳後修飾（例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端末端切断、グリコシル化、リン酸化等）を経た最終型のエンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドとして定義する。
【００３１】
本明細書では「成熟ポリペプチドコード配列」という語を、エンドペプチダーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として定義する。
【００３２】
配列番号２の成熟ポリペプチドは、アミノ酸２５〜２４８でもよい。配列番号４の成熟ポリペプチドは、アミノ酸２６〜２５１でもよい。配列番号６の成熟ポリペプチドは、アミノ酸１８〜２５０でもよい。
【００３３】
本発明の目的によれば、２つのアミノ酸配列間の同一性は、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を用い、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277）のNeedleプログラムの好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降で実行して決定する。使用される任意パラメータは、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ０．５、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と表示されるNeedleの出力（-nobriefオプションを用いて得られる）を、同一性パーセントとして使用する。これは以下の式で計算される。
（同一の残基数×１００）／
（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
【００３４】
本発明の目的によれば、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性は、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, 前述）を使用して、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 前述）のNeedleプログラムの好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降で実行して決定する。使用される任意パラメータは、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ０．５、EDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と表示されるNeedleの出力（-nobriefオプションを用いて得られる）を、同一性パーセントとして使用する。これは以下の式で計算される。
（同一のデオキシリボヌクレオチド数×１００）／
（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
【００３５】
本発明の好適な一実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。別のより好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２のアミノ酸２５〜２４８を含む。更に好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２のアミノ酸２５〜２４８からなる。
【００３６】
別の好適な本発明の一実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号４の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号４の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。別のより好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号４のアミノ酸２６〜２５１を含む。更に好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号４の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号４のアミノ酸２６〜２５１からなる。
【００３７】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号６の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号６の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号６のアミノ酸１８〜２５０を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号６の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号６のアミノ酸１８〜２５０からなる。
【００３８】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）、（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００３９】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４０】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号５の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号５の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４１】
本発明との関連において、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件は、５×ＳＳＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの剪断及び変性したサケ精子ＤＮＡ、及び、非常に低い及び低いストリンジェンシーでは２５％ホルムアミド、中程度及び中程度〜高いストリンジェンシーでは３５％ホルムアミド、或いは、高い及び非常に高いストリンジェンシーでは５０％ホルムアミドの存在下、４２℃で、標準的なサザンブロッティング法に従って、最適には１２〜２４時間行われるプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションと定義される。担体材料は最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを用いて、好ましくは４５℃（非常に低いストリンジェンシー）で、より好ましくは５０℃（低いストリンジェンシー）で、更に好ましくは５５℃（中程度のストリンジェンシー）で、よりいっそう好ましくは６０℃（中程度〜高いストリンジェンシー）で、更にいっそう好ましくは６５℃（高いストリンジェンシー）で、最も好ましくは７０℃（非常に高いストリンジェンシー）で、各回１５分で３回洗浄される。
【００４２】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４３】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４４】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号５の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４５】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２、４又は６の成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種である。
【００４６】
本発明との関連において、かかる変種は、対立遺伝子（天然）多型であってもよく、人工の変種であってもよい。また、成熟ポリペプチドの１又は２以上（又は数個）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含んでいてもよい。アミノ酸変化は軽微なものであることが好ましい。すなわち、タンパク質の折り畳み及び／又は活性に大きな影響を与えない保存的アミノ酸の置換又は挿入；小さな欠失、典型的には１〜３０個程度のアミノ酸の欠失；小さなアミノ末端又はカルボキシ末端の伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基の伸長；最大２０〜２５残基程度の小さなリンカーペプチド；或いは、精製を容易にするために正味荷電や他の作用を改変する小さな伸長、例えばポリヒスチジン部分、抗原性エピトープ又は結合ドメイン等が挙げられる。
【００４７】
トリプシン様エンドペプチダーゼの濃度は、好ましくは１ｇの乳由来タンパク質当たり１，０００〜１，０００，０００ＵＳＰトリプシン単位、更に好ましくは５，０００〜５００，０００、及び最も好ましくは２５，０００〜２５０，０００である。
【００４８】
１ＵＳＰトリプシン単位は、ｐＨ７．６、２５℃で、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル塩酸塩（ＢＡＥＥ）を基質として使用して、２５３ｎｍで０．００３の吸光度変化を引き起こす活性である。
【００４９】
比活性は、異なるトリプシン様エンドペプチダーゼ間で非常に大きく変化し得るが、当業者は例えば加水分解度に基づいて、使用されるトリプシン様エンドペプチダーゼの量を容易に決定できるであろう。
【００５０】
トリプシン様エンドペプチダーゼと乳由来タンパク質との比は、好ましくは０．０１〜１０％重量／重量、更に好ましくは０．０１〜５％、更に好ましくは０．０５〜２．５％、更に好ましくは０．５〜１％、最も好ましくは約０．７５％である。
【００５１】
本発明の方法において乳由来タンパク性物質は、トリプシン様エンドペプチダーゼと少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼを用いて処理される。
【００５２】
好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、セリンエンドペプチダーゼである。
【００５３】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの活性は、トリプシン様エンドペプチダーゼよりも特異性が低い。
【００５４】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、哺乳動物のキモトリプシン、例えばブタ膵臓組織から抽出されるキモトリプシンの活性と類似の活性を有する。
【００５５】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、任意の他の天然のアミノ酸のカルボキシ末端側での切断よりも、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン又はヒスチジンの何れのカルボキシ末端側での切断に対して、より高い特異性を有する。
【００５６】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン又はヒスチジンの少なくとも１つのカルボキシ末端での切断に対して、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシン、リジン、プロリン、セリン、スレオニン、及びバリンの何れか１つのカルボキシ末端側での切断に対する特異性より、少なくとも３倍、好ましくは少なくとも５倍高い特異性を有する。
【００５７】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、アルギニンのカルボキシ末端側での切断よりも、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン、及びヒスチジンよりなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸のそれぞれのカルボキシ末端側での切断に対して、より高い特異性を有する。
【００５８】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、リジンのカルボキシ末端側での切断よりも、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン、及びヒスチジンよりなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸のそれぞれのカルボキシ末端側での切断に対して、より高い特異性を有する。
【００５９】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、アルギニンとリジンの両方のカルボキシ末端側での切断よりも、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン、及びヒスチジンのそれぞれのカルボキシ末端側での切断に対して、より高い特異性を有する。
【００６０】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、キモトリプシン比が少なくとも３、好ましくは少なくとも５である。少なくとも５のキモトリプシン比は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ（何れか大きい方）の１つの後で切断する時の酵素の活性は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ又はＶａｌ（何れか大きい方）の１つの後で切断する時の活性より、少なくとも５倍高いことを意味する。すなわち、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ（何れか大きい方）の１つの後で切断することに対する特異性が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ又はＶａｌ（何れか大きい方）の１つの後で切断することに対する特異性より、少なくとも３倍高く、好ましくは少なくとも５倍高い。キモトリプシン比を測定するためのかかる活性測定は、エンドペプチダーゼの活性が、その最適ｐＨでのエンドペプチダーゼの活性の少なくとも半分であるｐＨ値で行うべきである。キモトリプシン比は、本願の実施例１に記載のように決定される。
【００６１】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、細菌性エンドペプチダーゼである。より好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、ノカルジオプシス（Nocardiopsis）株、好ましくはノカルジオプシス（Nocardiopsis）ＮＲＲＬ１８２６２種（例えばＷＯ８８／０３９４７に記載のもの）由来である。例えば、本願の配列番号８の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。ノカルジオプシス（Nocardiopsis）ＮＲＲＬ１８２６２種由来であるプロテアーゼのＤＮＡ配列とアミノ酸配列は、例えばデンマーク特許出願第１９９６０００１３号に記載されている。
【００６２】
より好適な別の実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、メタリジウム（Metarhizium）、好ましくは例えば本願の配列番号１０の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を有するメタリジウム・アニソプリイ（Metarhizium anisopliae）（TREMBL:Q9Y843）由来である。更に好適な別の実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、ブラキスポリエラ（Brachysporiella）、好ましくは例えば本願の配列番号１２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を有するブラキスポリエラ・ガヤナ（Brachysporiella gayana）（CGMCC0865）由来である。メタリジウム・アニソプリイ（Metarhizium anisopliae）とブラキスポリエラ・ガヤナ（Brachysporiella gayana）由来であるプロテアーゼのＤＮＡ配列とアミノ酸配列は、例えばＷＯ０４０７２２７９に公表されている。
【００６３】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、細菌から産生される。
【００６４】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、
ｉ）配列番号８、１０又は１２の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ii）（ｉ）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
iii）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
iv）配列番号８、１０又は１２の何れの成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種、
よりなる群から選択される。
【００６５】
配列番号１０の成熟ポリペプチドとしては、アミノ酸１８７〜３７４が挙げられる。配列番号１２のポリペプチドとしては、アミノ酸１９０〜３７５が挙げられる。
【００６６】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号８の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号８の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号８のアミノ酸１〜１８８を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号８の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号８のアミノ酸１〜１８８からなる。
【００６７】
別の本発明の好適な一実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１０の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１０の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１０のアミノ酸１８７〜３７４を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１０の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１０のアミノ酸１８７〜３７４からなる。
【００６８】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１２の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１２のアミノ酸１９０〜３７５を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１２のアミノ酸１９０〜３７５からなる。
【００６９】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７０】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号９の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号９の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７１】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７２】
別の好適な本発明の実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７３】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号９の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７４】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７５】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号８、１０又は１２の成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種である。
【００７６】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの濃度は、１ｇの乳由来タンパク質当たり、好ましくは１００〜１００，０００ＵＳＰキモトリプシン単位、より好ましくは５００〜５０，０００、最も好ましくは１，０００〜２０，０００である。
【００７７】
１ＵＳＰキモトリプシン単位は、ｐＨ７．０、２５℃で、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンエチルエステル（ＡＴＥＥ）を基質とした場合に、２３７ｎｍで０．００７５の吸光度変化を引き起こす活性である。
【００７８】
比活性はエンドペプチダーゼの種類に応じて大きく異なる場合があるが、当業者であれば、例えば加水分解度に基づいて、使用される少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの量を容易に決定できるであろう。
【００７９】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの乳由来タンパク質に対する比は、好ましくは０．００１〜１％重量／重量、より好ましくは０．００１〜０．５％、更に好ましくは０．００５〜０．２５％、よりいっそう好ましくは０．０２〜０．１％、最も好ましくは約０．０５％である。
【００８０】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの使用濃度は、トリプシン様エンドペプチダーゼの使用濃度に対し、エンドペプチダーゼ重量基準で、好ましくは２％〜５０％、より好ましくは５％〜２０％、更に好ましくは５％〜１５％、最も好ましくは約１０％である。
【００８１】
ＵＳＰトリプシン単位で測定されるトリプシン様エンドペプチダーゼの活性は、ＵＳＰキモトリプシン単位で測定される少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの活性より、好ましくは５倍〜５００倍高く、より好ましくは１０倍〜２００倍高い。
【００８２】
加水分解前の任意の予備工程としては、ホエータンパク質フラグメント、例えば血清アルブミン（ＢＳＡ）、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、及び免疫グロブリン（特にＩｇＧ）を確実に変性するために、乳由来タンパク性物質の溶液又は懸濁物を予備加熱する工程が挙げられる。この工程により通常は、（後述されるように）免疫化学的に評価した場合の残存抗原性が低減される。好適な実施態様によれば、予備工程は、タンパク性物質を約７５〜９５℃で約５〜３０分加熱することにより行われる。別の好適な実施態様によれば、予備工程は、タンパク性物質を１３５℃より高い温度で約１〜５秒間加熱することにより行われる。別の好適な実施態様によれば、予備工程は、タンパク性物質を１３０℃より高い温度で約３０〜６０秒間加熱することにより行われる。
【００８３】
加水分解反応に好適に適用される条件は、当業者には周知であろう。これは例えば、ＵＳ５０３９５３２又はＥＰ０６３１７３１Ａ１の開示等に従って行われる。例えば、約４０℃〜６０℃の温度で、１〜６時間、ｐＨ６．５〜８．５、好ましくは６．５〜８の範囲で行われる。
【００８４】
好適な実施態様によれば、タンパク性物質は、ペプチダーゼによる１回目の処理後、更に２回目のタンパク質分解的加水分解を受け、次にエンドペプチダーゼ不活性化が行われる。より好適な実施態様によれば、タンパク性物質は、ＵＳ５０３９５３２に開示されているように、１回目と２回目のタンパク質分解的加水分解の間で熱処理を受ける。
【００８５】
加水分解条件とは無関係に、加水分解物に対して、エンドペプチダーゼを不活性化する追加の工程を行うことが好ましい。好適な実施態様によれば、このペプチダーゼ不活性化は、約７０〜１１０℃、好ましくは７５〜９５℃の温度で、約０．１〜３０分の熱処理を含む。或いは、エンドペプチダーゼは、超高温の滅菌（例えば約１３０℃で約３０〜６０秒間）により不活性化される。
【００８６】
得られたタンパク質加水分解物は、更に清澄化してもよい。これは液体状態で保存してもよい。加水分解物を限外ろ過し、溶媒留去等により濃縮し、或いは噴霧乾燥や凍結乾燥等の乾燥を行ってもよい。
【００８７】
好適な実施態様によれば、得られるタンパク質加水分解物は、中程度の加水分解を有する。別の好適な実施態様によれば、得られるタンパク質加水分解物の加水分解度は、５〜３０％、好ましくは１０〜２５％、更に好ましくは１２〜２０％である。特に好適な加水分解度は約１４％である。別の好適な加水分解度は約１５％である。
【００８８】
加水分解度（ＤＨ）は、この方法により得られるタンパク質加水分解度を示す。本発明との関連において、加水分解度（ＤＨ）は以下のように定義される：
ＤＨ＝（切断されるペプチド結合の数／ペプチド結合の総数）×１００％
【００８９】
得られるタンパク質加水分解物の加水分解度（ＤＨ）は、Church, F. C. et al. (1983) Spectrophotometric Assay Using o-Phthaldialdehyde for Determination of Proteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins, J. Dairy Sci. 66: 1219-1227の方法に従って、分光光学的に測定される。
【００９０】
得られるタンパク質加水分解物中のペプチドの分子量分布は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定される。好適な実施態様によれば、本発明の加水分解物を構成するペプチドのうち、分子量２０，０００ｋＤａ超のペプチドは、重量基準で１％未満である。
【００９１】
本発明の方法により得られる加水分解物は、検出可能な無傷乳タンパク質を有さないことが好ましい。加水分解物に無傷乳タンパク質が存在しないことは、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により立証される。同一のゲル中で、加水分解物と非加水分解タンパク質出発物質とを直接比較することができる。好適な実施態様によれば、本発明の加水分解物を構成するペプチドのうち、無傷乳由来タンパク質は重量基準で１％未満である。
【００９２】
本発明の方法により得られる加水分解物の残存抗原性は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定される。非加水分解乳タンパク質は、アッセイで確立される直線的用量応答内に入る濃度で、固相上に固定化される。以後の、ウサギ抗牛乳タンパク質とウサギＩｇＧに反応性の酵素結合体との連続インキュベーションは、抗原性で認識可能なタンパク質及びペプチドの存在を明らかにする。加水分解物で得られる結果は、非加水分解タンパク質出発物質で得られる結果と、質量ベースで比較される。次に加水分解物の抗原性低下パーセントが算出される。
【００９３】
好適な実施態様によれば、本発明の方法により得られるタンパク質加水分解物は、ＥＬＩＳＡにより測定すると、対応する非加水分解乳由来タンパク性物質に対して、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、更に好ましくは少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％の抗原性の低下を有し、更に最も好ましくは抗原性の低下は少なくとも約９９％である。
【００９４】
好適な実施態様によれば、本発明の方法により得られるタンパク質加水分解物は、人工栄養乳組成物である。
【００９５】
好適な実施態様によれば、本発明は、人工栄養乳組成物を調製する方法であって、上記開示に従って乳由来タンパク質加水分解物を得る工程を含むとともに、得られた乳由来タンパク質加水分解物を人工栄養乳組成物に含める工程を更に含む方法に関する。
【００９６】
かかる人工栄養乳組成物は、粉末、濃縮液体又は即時使用液体の何れの形でもよい。
【００９７】
かかる人工栄養乳組成物は、ヒト乳幼児の栄養要求を満足するように調整された成分を含むことが好ましい。すなわち、人工栄養乳は、本発明の方法に従って得られるタンパク質加水分解物以外に、脂質源、炭水化物源、及び他の栄養物質（例えばビタミンやミネラル）を含有するのが好ましい。典型的には、上記栄養物質の一部又は全部を供給するべく、人工栄養乳に動物油、植物油、デンプン、ショ糖、乳糖及び／又は固形コーンシロップを加えてもよい。
【００９８】
本発明のタンパク質加水分解物を含む人工栄養乳組成物は、栄養的に完全であることが好ましい。「栄養的に完全」という用語は、組成物が、健康なヒトの生命を長期間維持するのに充分な栄養物質を含有することを意味する。
【００９９】
好適な実施態様によれば、本発明のタンパク質加水分解物を含む人工栄養乳組成物は、タンパク質の０．１〜２重量％の遊離アルギニン及び／又はタンパク質の０．１〜３重量％の遊離ヒスチジンを追加的に含む。本発明の方法において、改質スイートホエー又はホエータンパク質分離物が乳由来タンパク性物質として使用される場合、遊離アルギニン及び／又は遊離ヒスチジンの添加が特に好ましい。
【０１００】
別の好適な実施態様によれば、本発明のタンパク質加水分解物を含む人工栄養乳組成物は、少なくとも５％の乾燥固形分、好ましくは約１０〜３０％の量の乾燥固形分の乳由来タンパク質加水分解物を含む、栄養的に完全な組成物の形である。
【実施例】
【０１０１】
［実施例１］
抽出されたブタ膵臓トリプシン調製物の微生物代替物
膵臓トリプシンNovo 6.0S（Novozymes A/Sから入手できる−以下のＰＴＮで）は、ブタ膵臓組織の抽出により産生される生成物である。ＰＴＮの主要な成分はトリプシンとキモトリプシンであり、トリプシン:キモトリプシンの比は少なくとも12.5:1（活性ベース、すなわちUSPトリプシン単位:USPキモトリプシン単位）である。
【０１０２】
ＰＴＮのような抽出された酵素調製物に対する適切な微生物の代替物を同定するために、Bachemから入手できる１０個の異なるＳｕｃ−ＡＡＰＸ−ｐＮＡ基質（Ｘ＝Ａ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、及びＶ）に対する異なる微生物プロテアーゼのｐＨ９での活性を測定した。これらの測定値に基づいて、各微生物プロテアーゼのトリプシン比（ＴＲ）とキモトリプシン比（ＣＲ）とを算出した。トリプシン比とキモトリプシン比は以下のように定義される：
【０１０３】
ＴＲ＝Ｓｕｃ−ＡＡＰ（Ｒ／Ｋ）−ｐＮＡに対する最大活性／Ｓｕｃ−ＡＡＰ非（Ｒ／Ｋ）−ｐＮＡに対する最大活性
ＣＲ＝Ｓｕｃ−ＡＡＰ（Ｆ／Ｌ／Ｍ）−ｐＮＡに対する最大活性／Ｓｕｃ−ＡＡＰ非（Ｆ／Ｌ／Ｍ）−ｐＮＡに対する最大活性
【０１０４】
トリプシン比
トリプシンは、アルギニン残基又はリジン残基のカルボキシ末端側で切断する特異的セリンエンドペプチダーゼであり、すなわちこれらは、Ｐ１位のＲ又はＫに対する厳密な優先性を有する。従ってトリプシン様プロテアーゼの適切な定義は、トリプシン比が＞１００であり、これは、８個の他のＳｕｃ−ＡＡＰ非（Ｒ／Ｋ）−ｐＮＡの何れに対する活性が、最適なＳｕｃ−ＡＡＰ（Ｒ／Ｋ）−ｐＮＡ基質に対する活性の１％未満であることを意味する。
【０１０５】
キモトリプシン比
キモトリプシンは、芳香族アミノ酸残基（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＰｈｅ）又は疎水性アミノ酸残基Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、及びＨｉｓの何れのカルボキシ末端側での切断に対してあまり厳密ではない優先性を有する。トリプシンと比較して、キモトリプシンはあまり特異的ではないエンドペプチダーゼであり、キモトリプシン様プロテアーゼの妥当な定義は、キモトリプシン比＞５であり、これは、７個の他のＳｕｃ−ＡＡＰ非（Ｆ／Ｌ／Ｍ）−ｐＮＡ基質の何れの上の活性が、最適なＳｕｃ−ＡＡＰ非（Ｆ／Ｌ／Ｍ）−ｐＮＡ基質に対する活性の２０％未満であることを意味する。
【０１０６】
Ｓｕｃ−ＡＡＰＸ−ｐＮＡアッセイ
プロテアーゼ：
ＰＴＮ
ブタトリプシン（UNIPROT:P00761）
フザリウムトリプシン（フザリウム・オキシスポルムからのトリプシン様プロテアーゼ、配列番号２）
ウシTLCK-処理キモトリプシン（Sigma, C-3142）
アルカラーゼ（Novozymes A/Sから入手できる）
バシロペプチダーゼ F（バシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）から, UNIPROT:Q65JX1）
ブラキスポリエラ（Brachysporiella）プロテアーゼ（ブラキスポリエラ・ガヤナから、配列番号１２）
エスペラーゼ（Novozymes A/Sから入手できる）
メタリジウムプロテアーゼ（メタリジウム・アニソプリイから入手できる、配列番号１０）
ノカルジオプシスプロテアーゼ（ノカルジオプシスＮＲＲＬ１８２６２種由来である、配列番号８）
サビナーゼ（Novozymes A/Sから入手できる）
【０１０７】
基質:
Suc-AAPA-pNA（Bachem L-1775）
Suc-AAPR-pNA（Bachem L-1720）
Suc-AAPD-pNA（Bachem L-1835）
Suc-AAPE-pNA（Bachem L-1710）
Suc-AAPI-pNA（Bachem L-1790）
Suc-AAPL-pNA（Bachem L-1390）
Suc-AAPK-pNA（Bachem L-1725）
Suc-AAPM-pNA（Bachem L-1395）
Suc-AAPF-pNA（Bachem L-1400）
Suc-AAPV-pNA（Bachem L-1770）
【０１０８】
温度：
室温（２５℃）
アッセイ緩衝液：100mM コハク酸、100mM ＨＥＰＥＳ、100mM CHES, 100mM CABS, 1mM CaCl2, 150mM KCl, 0.01% トリトンX-100、pH 9.0。
【０１０９】
アッセイ：
２０μlのペプチダーゼ希釈駅（０．０１％トリトンX-100で希釈）をマイクロタイタープレートのウェルに入れた。２００μlのｐＮＡ基質（５０mgを１．０ml ＤＭＳＯに溶解し、更にアッセイ緩衝液で９０×希釈した）を加えることにより、アッセイを開始した。ＯＤ４０５での初期上昇をペプチダーゼ活性の尺度として追跡した。４分間の測定時間内で直線（又はほぼ直線）プロットが達成されなかった場合、ペプチダーゼを更に希釈し、アッセイを繰り返した。
【０１１０】
データ：
【表１】
【０１１１】
表で各エンドペプチダーゼについて報告した活性データは、最適なSuc-AAPX-pNA基質の活性に対するものである。
【０１１２】
結論：
トリプシン比＞１００を有するプロテアーゼとしてトリプシン様プロテアーゼの上記定義を使用すると、ブタトリプシン（ＴＲ＝１７５０）とフザリウム（Fusarium）トリプシン（ＴＲ＞１０，０００）は、トリプシン様プロテアーゼである。試験したプロテアーゼの残りは、トリプシン様プロテアーゼではない。
【０１１３】
キモトリプシン比＞５を有するプロテアーゼとしてキモトリプシン様プロテアーゼの上記定義を使用すると、ウシキモトリプシン（ＣＲ＝１６０）、アルカラーゼ（ＣＲ＝４０）、ブラキスポリエラプロテアーゼ（ＣＲ＝２．２）、エスペラーゼ（ＣＲ＝６．２）、メタリジウムプロテアーゼ（ＣＲ＝２７）、ノカルジオプシスプロテアーゼ（ＣＲ＝７．７）、及びサビナーゼ（ＣＲ＝９．７）は、キモトリプシン様プロテアーゼである。残りの試験したプロテアーゼはキモトリプシン様プロテアーゼではない。
【０１１４】
キモトリプシン様プロテアーゼの別の定義は、キモトリプシンに対する相対的活性差の二乗の和を計算することであろう。この定義を使用して、メタリジウムプロテアーゼは、最高のキモトリプシン様セリンプロテアーゼであり、次にブラキスポリエラプロテアーゼ、ノカルジオプシスプロテアーゼ、サビナーゼ、及びアルカラーゼとなる（データは示していない）。
【０１１５】
［実施例２］
微生物エンドペプチダーゼの組合せによるＷＰＣの加水分解
次の工程は、微生物エンドペプチダーゼの混合物を使用したホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）で、２つの酵素混合物を同様に使用した場合にＰＴＮについて得られるものと同じ程度の加水分解（ＤＨ）が得られるかどうかを調べることであった。
【０１１６】
加水分解実験
我々が行った加水分解アッセイは、２工程加水分解法である。８．４％のＷＰＣ（８０％ホエータンパク質を含有する）をｐＨ８．０の緩衝液に懸濁した。１回目の加水分解工程は、酵素量の半分を加え、溶液を５５℃で攪拌しながら２時間インキュベートすることにより行った。次に部分加水分解ホエータンパク質基質を、短時間の熱処理（９０℃で５分間）により変性させた。２回目の加水分解工程は、酵素量の他の半分を加え、溶液を５５℃で攪拌しながら３０分間インキュベートすることにより行った。最後に酵素反応を停止させ、更に短時間の熱処理（９０℃で１０分間）により酵素を不活性化させた。ホエータンパク質／ペプチドの最終濃度は６．４％ＷＰであった。このアッセイを使用することにより、我々は、ＰＴＮを微生物代替物と比較することができるはずである。
【０１１７】
アルカリ性範囲で加水分解中にＨ+が生成するために、我々は最大量の酵素の一部についてｐＨをチェックした。ｐＨの低下を検出することができず、我々のｐＨ８．０緩衝液は、加水分解中のｐＨを調節するのに充分強力であることを示していた。
【０１１８】
まず我々は、４種類の異なる量のＰＴＮを試験した（０．６２５、１．２５、２．５、及び５．０ｍｇトリプシン／ｇホエータンパク質）。最少量について、ホエータンパク質加水分解物は非常に粘性があり、エッペンドルフチューブから出すのがほとんど不可能であり、従ってこの加水分解物のＤＨは測定できなかった。ＰＴＮ加水分解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、少なくとも５．０ｍｇトリプシン／ｇホエータンパク質量について、ほとんどの無傷タンパク質は分解されていることを示した。次にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは、等量のタンパク質／ペプチドを各レーンにのせた。５．０ｍｇトリプシン／ｇホエータンパク質ＰＴＮ用量についてＤＨ＝９．４％であった。
【０１１９】
次に我々は、精製トリプシン（ブタトリプシンとフザリウム（Fusarium）トリプシン）を用いて加水分解実験を少し行った。比較的多い量でも、約６．５％を超えるＤＨは得ることができなかった。以下のデータ欄を参照。
【０１２０】
最後に我々は、３回目の加水分解を行って、フザリウム（Fusarium）トリプシンの量を５．０ｍｇトリプシン／ｇホエータンパク質で一定に維持し、キモトリプシン様プロテアーゼの量を変化させた（０．２５、０．５、及び１．０ｍｇプロテアーゼ／ｇホエータンパク質）。ここで我々は、ＰＴＮ用量を等量にしたもの同じ範囲のＤＨ値を得た（ＤＨ＝９．４％）。
【０１２１】
２回目のキモトリプシン様プロテアーゼの量を上昇させることのＤＨに対する作用は、２回目のプロテアーゼに依存して異なる作用を有することがわかる。フザリウム（Fusarium）トリプシンとバシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のグルタミルペプチダーゼＢＬ（これはキモトリプシン様プロテアーゼではない）との組合せは、フザリウム（Fusarium）トリプシン単独で見られたように安定するようである。
【０１２２】
ＤＨ値（以下のデータ欄参照）とＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のホエータンパク質加水分解物の外観には相関関係がある。フザリウム（Fusarium）トリプシンとノカルジオプシス（Nocardiopsis）プロテアーゼとの組合せは（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから−データは示していない）、ＷＰＣ基質から無傷タンパク質を除去するのに最適なセリンプロテアーゼの組合せのようである。
【０１２３】
加水分解アッセイ
使用したエンドペプチダーゼ：
【表２】
【０１２４】
ＰＴＮ６．０Ｓ中のトリプシンとキモトリプシン含量の算出について我々は、ブタトリプシンの比活性＝７０００ＵＳＰ／ｍｇとブタキモトリプシンの比活性＝４５００ＵＳＰ／ｍｇを使用した。他の調製物中の酵素濃度は、Ａ２８０／Ｅ２８０から推定した。ＰＴＮを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８に溶解した。他の酵素は、融解後「そのまま」使用した。
【０１２５】
加水分解：
８４ｍｇ／ｍｌのＷＰＣ（全乾燥物質の約８０％のタンパク質を含むArlaからのLactProdan80）を、１．０Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、５０ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８．０に懸濁し、２７％ＮａＯＨを用いてｐＨをｐＨ８．０に調整した。この懸濁物１０００μｌを氷上のエッペンドルフチューブに入れた。２５μｌのプロテアーゼ溶液を加え、エッペンドルフチューブを、あらかじめ５５℃に加熱したエッペンドルフサーモミキサーに移した。サーモミキサー上でチューブを１２０分間インキュベートした（５５℃、１４００ｒｐｍ）。チューブを、あらかじめ９０℃に加熱した別のエッペンドルフサーモミキサーに移し、このサーモミキサー上で５分間インキュベートした（９０℃、１４００ｒｐｍ）。チューブを最初の５５℃のエッペンドルフサーモミキサーに戻し、５分後（加水分解混合物を５５℃にするため）、２５μｌのペプチダーゼ溶液を加え、チューブをサーモミキサー上で３０分間インキュベートした（５５℃、１４００ｒｐｍ）。最後にチューブを再度９０℃のサーモミキサーに移し、このサーモミキサー上で１０分間インキュベートした（９０℃、１４００ｒｐｍ）。
【０１２６】
加水分解物（６４ｍｇ／ｍｌホエータンパク質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し（データは示していない）、ＯＰＡ法を使用してＤＨを測定した。
【０１２７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
加水分解物を０．１％ ＳＤＳで５×希釈した。この希釈物の２０μlを、還元剤を有する２０μlの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合した。この混合物を沸騰させ、１０μlを４〜２０％トリス−グリシンゲルに適用した。
【０１２８】
ＤＨを測定するためのＯＰＡ法：
加水分解物を０．０１％ トリトンＸ−１００で８０×希釈した。この希釈物３０μlをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に移し、２２５μｌの新たに調製したＯＰＡ試薬を加え、２分後、ＭＴＰリーダーで３４０ｎｍの吸光度を読んだ。未知試料の応答をセリン標準希釈シリーズと比較し、ｍｇ／ｍｌセリンとして表した。「ＯＰＡ応答」を「ｍｇ／ｍｌ基質」に対する「加水分解物中のｍｇ／ｍｌセリン」として計算した。ＤＨの計算のために、酵素ブランクの「ＯＰＡ応答」を引いた。
【０１２９】
ＯＰＡ試薬
３．８１ｇのテトラホウ酸二ナトリウム（Merch 6308）と１．００ｇのＳＤＳ（BIO-RAD 161-0301）を８０mlの脱イオン水に溶解した。使用直前に、２．０mlのエタノール中に溶解した８０mgのｏ−フタルジアルデヒド（MercK 821027）を加え、１．０mlの１０％（w/w）ＤＴＥ（Merch 24511）を加えた。最後に脱イオン水を用いて、容量を１００mlに調整した。
【０１３０】
データ：
【表３】
【０１３１】
結論：
微生物ＰＴＮ−リプレーサー（ＰＴＮとして与える）を使用して、ＷＰＣの同程度の加水分解（ＤＨ）を得ることが可能のようである。トリプシン様プロテアーゼ単独では、ＰＴＮと同じＤＨを得ることはできないことも、結果から明らかである。
【０１３２】
［実施例３］
フザリウム（Fusarium）トリプシンとブラキスポリエラ（Brachysporiella）エンドペプチダーゼの切断特異性分析
初めに：
微生物トリプシン様エンドペプチダーゼであるフザリウム（Fusarium）トリプシンのタンパク質分解的切断特異性を、ブタトリプシンと比較した。ブラキスポリエラ（Brachysporiella）からの微生物キモトリプシン様エンドペプチダーゼのタンパク質分解的切断特異性を、ＴＬＣＫ処理ブタキモトリプシンのタンパク質分解的特異性と比較した（ＴＬＣＫは、キモトリプシンに影響を与えることなくトリプシンを不活性化する）。
【０１３３】
記載のエンドペプチダーゼを変性モデル基質ウシベータ−ラクトグロブリンＡとともにインキュベートすることにより、切断特異性分析を行った。得られたタンパク質分解性ペプチドの配列を、タンパク質同定に使用されるタンデム質量スペクトルデータ解析プログラム（ＳＥＱＵＥＳＴ）と組合せたオンラインRP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MSと、ウシベータ−ラクトグロブリンＡのみを含むデータベースにより、決定した。
【０１３４】
試料：
プロテアーゼ：
ブタトリプシン（UniProt accession: P00761）
フザリウムトリプシン（フザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼ、配列番号２）
ウシTLCK処理キモトリプシン（Sigma, C-3142）
ブラキスポリエラプロテアーゼ（ブラキスポリエラ・ガヤナから、配列番号１２）
基質：
ベータ−ラクトグロブリンＡ、牛乳から（Sigma L7880 097K7010）
【０１３５】
タンパク質分解：
ベータ−ラクトグロブリンＡの変性：
牛乳（Sigma L7880 097K7010）からの約１１ｍｇ量のベータ−ラクトグロブリンＡを１ｍｌの緩衝液（１００ｍＭ 酢酸アンモニウム、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８）に溶解した。ベータ−ラクトグロブリンのジスルフィド結合をジチオスレイトール（ＤＴＴ、ＣＡＳ番号3483-12-3）を加えて還元し、最終濃度２０ｍＭとした。混合物を室温（２５℃）で３０分インキュベートした。次に２−ヨードアセトアミド（ＣＡＳ番号144-48-9）を最終濃度５５ｍＭになるように加えた。後者の混合物を暗所で室温で３０分インキュベートした。
【０１３６】
プロテアーゼでインキュベートする前に、変性したベータ−ラクトグロブリンＡを、１００ｍＭ 酢酸アンモニア、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８に緩衝液交換した。緩衝液交換は、GE-healthcareのＰＤ−１０脱塩カラム（セファデックスＧ−２５カラム材料）で行った。まずカラムを２５ｍｌの１００ｍＭ 酢酸アンモニウム、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８で平衡化した。ベータ−ラクトグロブリン試料の容量を平衡化緩衝液を用いて最終容量２．５ｍｌに調整し、カラムにのせた。３．５ｍｌの１００ｍＭ 酢酸アンモニア、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８でベータ−ラクトグロブリンＡを溶出した。２８０ｎｍで推定吸光係数（Ａ２８０）１により、緩衝液交換したベータ−ラクトグロブリンの最終タンパク質濃度を２ｍｇ／ｍｌであると決定した。
【０１３７】
タンパク質分解インキュベーション：
１９０μlの溶液に対応する４００μg量のベータ−ラクトグロブリンを４０℃で以下の量のプロテアーゼを用いてインキュベートした：
ブタトリプシン ８μｇ
フザリウムトリプシン １６μｇ
ウシＴＬＣＫ処理キモトリプシン ４μｇ
ブラキスポリエラプロテアーゼ ４μｇ
【０１３８】
１８時間後、１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＣＡＳ番号76-05-1）水溶液を試料中に最終濃度１％ ＴＦＡになるように加えて、タンパク質分解工程を停止させた。すべての試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析するまで−２０℃で保存した。
【０１３９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法：
すべてのタンパク質分解試料を、Waters Ｃ１８カラム（ACQUITY UPLC（商標）BEH C18、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）、Thermo ScientificのAccela液体クロマトグラフィーシステム、及びThermo ScientificのLTQ Orbitrap XL ETDハイブリッド質量スペクトル装置からなるRP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MS装置で分析した。２０μlの容量をカラムに注入した。ペプチドを以下の勾配により分離した：
【０１４０】
溶媒Ａ：ＵＨＱ水中０．１％ギ酸（ＣＡＳ番号64-18-6）、溶媒Ｂ：アセトニトリル（ＣＡＳ番号75-05-8）中０．１％ギ酸。
【表４】
【０１４１】
溶出するペプチドをオンラインでＵＶ検出器により２１４ｎｍで追跡し、次にＭＳ／ＭＳモードで質量スペクトル装置により追跡した。得られるＵＶクロマトグラムを図１と２に示す。質量スペクトル装置中の前駆体イオンを３０，０００（FWHM）の分解能で検出し、フラグメントイオンを１５，０００（FWHM）の分解能で検出した。得られるＭＳとＭＳ／ＭＳスペクトルをＳＥＱＵＥＳＴソフトウェア（米国特許第６，０１７，６９３号と５，５３８，８９７号のアルゴリズム）を用いてProteome Discoverer（バージョン１．０、Thermo Fisher Scientific）を介して、ベータ−ラクトグロブリンに対して解析した。切断酵素を、「非特異的」切断特異性で「酵素無し」と規定した。強いＵＶ強度の一部のタンパク質分解フラグメントを、図１と２に示すように同定した。
【０１４２】
結果：
比較のために、フザリウム（Fusarium）トリプシンアッセイ（下のトレース）のＵＶクロマトグラムを、ブタトリプシンアッセイ（上のトレース）とともに図１に示し、いくつかの主要なペプチドの配列同一性を示す。同様に図２では、ブラキスポリエラ（Brachysporiella）プロテアーゼアッセイ（下のトレース）のＵＶクロマトグラムを、ウシキモトリプシン（下のトレース）とともに示す。すべての場合で、同定されたペプチドは、上のトレースと下のトレースの両方で検出されている。
【０１４３】
結論：
図１では、ウシベータ−ラクトグロブリンＡの共通のタンパク質分解ペプチドが、フザリウム（Fusarium）トリプシンとブタトリプシンについて検出され、従って２つのエンドペプチダーゼは両方ともトリプシン様特異性を有する。図２では、ベータ−ラクトグロブリンＡの一部の共通のタンパク質分解ペプチドがブラキスポリエラ（Brachysporiella）プロテアーゼとウシキモトリプシンについて検出される。
【技術分野】
【０００１】
本願はコンピューター読取可能な形式の配列表を含む。このコンピューター読取可能形式は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、乳由来タンパク質加水分解物を製造するための酵素的方法と、例えば人工栄養乳組成物中における、かかる加水分解物の使用とに関する。
【背景技術】
【０００３】
乳幼児の母乳栄養に代替し得る人工栄養乳が開発されてきた。
かかる人工栄養乳は、適切な離乳食が始まるまで、乳幼児の栄養要求を完全に満たさなければならない。更に、味は重要であり、少なくとも親は苦味のない人工栄養乳を好む。通常の牛乳の代わに加水分解乳タンパク質、例えば部分加水分解ホエータンパク質や高加水分解カゼインを含む人工栄養乳がよく使用される。アレルギー性が低く、味も許容し得るからである。
【０００４】
文献記載の部分加水分解物の調製法の多くは、ブタ膵臓組織の抽出により製造されるトリプシン調製物等の膵臓酵素の使用を含む（例えばＷＯ９３０４５９３Ａ１、ＵＳ５０３９５３２Ａ等を参照）。文献記載の方法の中には、トリプシン及びキモトリプシンの混合物の使用を含むものもある。例えばＥＰ０３５３１２２Ａは、キモトリプシン／トリプシン活性の比が１．５〜３．０であるトリプシンとキモトリプシンとの混合物を使用して、低アレルギー性ホエータンパク質加水分解物を調製する方法を開示する。ＥＰ０６３１７３１Ａ１によれば、トリプシン対キモトリプシン比が１．３〜１８、より好ましくは４〜６（ＵＳＰ単位）のトリプシンとキモトリプシンとの混合物が、通常は好適な性質を有する加水分解物を与えるとされている。
【０００５】
いくつかの理由から、微生物から産生されるタンパク質分解酵素の使用によって利点が得られる場合がある。例えば、微生物による酵素産生は効率的であり、制御が容易である。よって、かかる酵素は大量に、且つ高純度で生産することができる。また、微生物酵素の使用は、動物材料からの酵素抽出に伴う増大するＱＡ関連の困難を克服する助けにもなるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者等の目的の一つは、微生物から産生される酵素を用いて、低アレルギー誘発性の乳由来タンパク質加水分解物を製造する方法を開発することである。別の目的は、トリプシンとキモトリプシンとを含む抽出調製物を用いて調製された加水分解物のタンパク質フラグメントプロフィールと類似のタンパク質フラグメントプロフィールを有する乳由来タンパク質加水分解物を、微生物から産生される酵素を用いて製造する方法を開発することである。別の目的は、微生物から産生される酵素を用いて、許容し得る味の乳由来タンパク質加水分解物を製造する方法を開発することである。特に、低アレルギー誘発性を有し、トリプシンとキモトリプシンとを含む抽出調製物を用いて調製された加水分解物のタンパク質フラグメントプロフィールと類似のタンパク質フラグメントプロフィールを有し、及び／又は、特に苦みの面で許容し得る味を有する、部分的ホエータンパク質加水分解物を得ることが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は驚くべきことに、微生物から産生された酵素が、例えば人工栄養乳に含ませる乳由来タンパク質加水分解物の製造に使用できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、乳由来タンパク質加水分解物の調製法であって、
乳由来タンパク性物質の溶液を、
ａ）微生物から産生されるトリプシン様エンドペプチダーゼ、及び
ｂ）微生物から産生される少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼ、
を用いて処理することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ブタトリプシン（上のトレース）との比較でフザリウム（Fusarium）トリプシン（下のトレース）のＵＶクロマトグラムを示すとともに、主なピークのペプチド配列同一性を示す。
【図２】図２は、ウシトリプシン（上のトレース）と比較したブラキスポリエラ（Brachysporiella）プロテアーゼ（下のトレース）のＵＶクロマトグラムを示すとともに、主なピークのペプチド配列同一性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の方法では、乳由来タンパク性物質を出発物質として使用する。かかる乳由来タンパク性物質は、例えば、ホエー由来タンパク性物質、カゼイン、又はホエー由来タンパク性物質とカゼインとの混合物からなる。ホエー由来タンパク性物質の原料としては、例えばチーズ製造時に得られるホエー、特にレンネットによるカゼインの凝固から生じるスイートホエーが挙げられる。ホエー由来タンパク性物質は、限外ろ過物（ＵＦホエー）やホエータンパク質分離物等の、タンパク質が３５〜８０％の範囲の濃縮物の形で使用してもよい。このホエー由来タンパク性物質は、イオン交換及び／又は電気透析により得られるもの（ＥＤホエー）でもよい。好適な実施態様によれば、乳由来タンパク性物質はホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）である。
【００１１】
カゼイン源は酸性カゼインでも脱脂乳固体でもよい。
ホエー由来タンパク性物質及び／又はカゼインは、例えば液体濃縮物又は粉末の形で使用される。
【００１２】
好適な実施態様によれば、乳由来タンパク性物質はホエー由来タンパク性物質である。より好適な実施態様によれば、かかるホエー由来タンパク性物質の供給源は、カゼイノ−グリコ−マクロペプチド（ＣＧＭＰ）を除去したスイートホエー又はホエータンパク質分離物である。更に好適な実施態様によれば、かかるホエー由来タンパク性物質の供給源は、カゼイノ−グリコ−マクロペプチド（ＣＧＭＰ）を除去したスイートホエーである。
【００１３】
スイートホエーからＣＧＭＰを除去することにより、ヒトの母乳に近いスレオニン含量を有するタンパク性物質が得られる。続いて、この改質スイートホエーに、含量の少ないアミノ酸（基本的にはヒスチジンとアルギニン）を補完してもよい。スイートホエーからＣＧＭＰを除去する方法は、ＥＰ８８０９０２に記載されている。
【００１４】
本発明の方法では、タンパク性物質を希釈又は復元し、溶液又は懸濁物とする。そのタンパク性物質の含量は、好ましくは約２〜３５重量％、より好ましくは約５〜３０重量％とする。
【００１５】
本発明の方法では、乳由来タンパク性物質を、少なくとも２種のエンドペプチダーゼで処理する。これらはいずれも微生物から産生されたものである。
【００１６】
本発明の方法で使用されるエンドペプチダーゼは、どのような属の微生物から産生されたものでもよい。本発明の目的によれば、所与の生物に関して本明細書において使用される「から産生される」等の語は、本発明で使用されるポリペプチドが、当該所与の生物の細胞の発酵により製造されることを意味する。ポリペプチドは、産生生物が元来有するものであってもよく、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を宿主生物に導入して、異種的に産生させたものであってもよい。
【００１７】
本発明の方法で使用されるエンドペプチダーゼの１つは、トリプシン様エンドペプチダーゼである。本明細書では「トリプシン様エンドペプチダーゼ」という語を、ペプチド又はタンパク質をアルギニン及び／又はリジンのＬ−異性体のＣ末端側で優先的に切断するエンドペプチダーゼとして定義する。
【００１８】
好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、ペプチド又はタンパク質をアルギニン及びリジンのＣ末端側で優先的に切断する。これはエンドペプチダーゼが、他のアミノ酸の後における切断よりも、アルギニン及びリジンの後における切断に高い特異性を示すことを意味する。
【００１９】
別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、ペプチド又はタンパク質をアルギニン又はリジンのＣ末端側で優先的に切断する。これはエンドペプチダーゼが、他のアミノ酸の後における切断よりも、アルギニン又はリジンの後における切断に高い特異性を示すことを意味する。
【００２０】
別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、ペプチド又はタンパク質をアルギニンのＣ末端側で優先的に切断する。これはエンドペプチダーゼが、他のアミノ酸の後における切断よりも、アルギニンの後における切断に高い特異性を示すことを意味する。
【００２１】
別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、リジンのＣ末端側でペプチド又はタンパク質を優先的に切断する。これはエンドペプチダーゼが、他のアミノ酸の後における切断よりも、リジンの後における切断に高い特異性を示すことを意味する。
【００２２】
別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、ペプチド又はタンパク質をアルギニン又はリジンのＣ末端側で特異的に切断する。
【００２３】
好適な実施態様によれば、本発明のトリプシン様エンドペプチダーゼは、トリプシン比が１００超である。ここでトリプシン比とは、Ａｒｇ又はＬｙｓの後で切断する時の酵素活性（何れか大きい方）を、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ又はＶａｌの何れか１つの後で切断する時の酵素活性（何れか大きい方）で割った値として決定される。すなわち、好適な実施態様によれば、本発明のトリプシン様エンドペプチダーゼは、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ又はＶａの何れか１つの後における切断に対する特異性（何れか大きい方）より、Ａｒｇ又はＬｙｓの後における切断に対する特異性（何れか大きい方）の方が少なくとも１００倍高い。トリプシン比を求めるための活性測定は、エンドペプチダーゼ活性が最適ｐＨにおけるエンドペプチダーゼ活性の少なくとも半分となるようなｐＨ値で行なうべきである。トリプシン比は、例えば、本願の実施例１に記載のように決定すればよい。
【００２４】
典型的には、かかるトリプシン様エンドペプチダーゼは、ｐＨ約６．０〜約１１．０、好ましくはｐＨ約８〜約１０で、温度約４０℃〜約７０℃、好ましくは温度約４５℃〜約６５℃で、又は約４５℃〜約６０℃で、最適のタンパク質分解活性を有する。
【００２５】
好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、真菌エンドペプチダーゼである。より好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、フザリウム（Fusarium）株、好ましくはフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）由来である。これは例えば、本願の配列番号２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を有する（SWISSPROT No. P35049）。配列番号２のアミノ酸２５〜２４８で示されるアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）由来のトリプシン様エンドペプチダーゼが既に報告されている（ＵＳ５，２８８，６２７；ＵＳ５，６９３，５２０）。
【００２６】
ある実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）由来のものである。例えば、本願の配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＡＰ９７７Ｓが挙げられる（GENESEQP: ADZ80577）。別の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼはフザリウムｃｆ．ソラニ（Fusarium cf. solani）由来のものである。例えば、本願の配列番号６として示されるアミノ酸配列を有するＡＰ９７１が挙げられる。
【００２７】
本発明の目的によれば、所与の由来源（すなわち生物）からポリヌクレオチド又はポリペプチドを得ることとの関連で、本明細書で使用される「に由来する」等の語は、そのポリヌクレオチド（又はそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）が、その由来生物中に天然に存在するポリヌクレオチド配列と同一であるか、或いはその配列の変種であることを意味する。ここで、そのポリヌクレオチド配列が別の生物に挿入されたものか否かや、そのポリヌクレオチドが別の生物により産生されたものか否かは無関係である。
【００２８】
好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、真菌由来である。更に好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、フザリウム（Fusarium）株由来である。
【００２９】
本発明の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは：
ｉ）配列番号２、４又は６の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ii）（ｉ）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
iii）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
iv）配列番号２、４又は６の何れの成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種、
よりなる群から選択される。
【００３０】
本明細書では「成熟ポリペプチド」という語を、翻訳及び翻訳後修飾（例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端末端切断、グリコシル化、リン酸化等）を経た最終型のエンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドとして定義する。
【００３１】
本明細書では「成熟ポリペプチドコード配列」という語を、エンドペプチダーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として定義する。
【００３２】
配列番号２の成熟ポリペプチドは、アミノ酸２５〜２４８でもよい。配列番号４の成熟ポリペプチドは、アミノ酸２６〜２５１でもよい。配列番号６の成熟ポリペプチドは、アミノ酸１８〜２５０でもよい。
【００３３】
本発明の目的によれば、２つのアミノ酸配列間の同一性は、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を用い、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277）のNeedleプログラムの好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降で実行して決定する。使用される任意パラメータは、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ０．５、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と表示されるNeedleの出力（-nobriefオプションを用いて得られる）を、同一性パーセントとして使用する。これは以下の式で計算される。
（同一の残基数×１００）／
（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
【００３４】
本発明の目的によれば、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性は、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, 前述）を使用して、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 前述）のNeedleプログラムの好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降で実行して決定する。使用される任意パラメータは、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ０．５、EDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と表示されるNeedleの出力（-nobriefオプションを用いて得られる）を、同一性パーセントとして使用する。これは以下の式で計算される。
（同一のデオキシリボヌクレオチド数×１００）／
（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
【００３５】
本発明の好適な一実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。別のより好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２のアミノ酸２５〜２４８を含む。更に好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２のアミノ酸２５〜２４８からなる。
【００３６】
別の好適な本発明の一実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号４の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号４の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。別のより好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号４のアミノ酸２６〜２５１を含む。更に好適な本発明の実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号４の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号４のアミノ酸２６〜２５１からなる。
【００３７】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号６の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号６の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号６のアミノ酸１８〜２５０を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号６の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号６のアミノ酸１８〜２５０からなる。
【００３８】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）、（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００３９】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４０】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号５の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号５の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４１】
本発明との関連において、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件は、５×ＳＳＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの剪断及び変性したサケ精子ＤＮＡ、及び、非常に低い及び低いストリンジェンシーでは２５％ホルムアミド、中程度及び中程度〜高いストリンジェンシーでは３５％ホルムアミド、或いは、高い及び非常に高いストリンジェンシーでは５０％ホルムアミドの存在下、４２℃で、標準的なサザンブロッティング法に従って、最適には１２〜２４時間行われるプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションと定義される。担体材料は最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを用いて、好ましくは４５℃（非常に低いストリンジェンシー）で、より好ましくは５０℃（低いストリンジェンシー）で、更に好ましくは５５℃（中程度のストリンジェンシー）で、よりいっそう好ましくは６０℃（中程度〜高いストリンジェンシー）で、更にいっそう好ましくは６５℃（高いストリンジェンシー）で、最も好ましくは７０℃（非常に高いストリンジェンシー）で、各回１５分で３回洗浄される。
【００４２】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４３】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４４】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号５の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４５】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号２、４又は６の成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種である。
【００４６】
本発明との関連において、かかる変種は、対立遺伝子（天然）多型であってもよく、人工の変種であってもよい。また、成熟ポリペプチドの１又は２以上（又は数個）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含んでいてもよい。アミノ酸変化は軽微なものであることが好ましい。すなわち、タンパク質の折り畳み及び／又は活性に大きな影響を与えない保存的アミノ酸の置換又は挿入；小さな欠失、典型的には１〜３０個程度のアミノ酸の欠失；小さなアミノ末端又はカルボキシ末端の伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基の伸長；最大２０〜２５残基程度の小さなリンカーペプチド；或いは、精製を容易にするために正味荷電や他の作用を改変する小さな伸長、例えばポリヒスチジン部分、抗原性エピトープ又は結合ドメイン等が挙げられる。
【００４７】
トリプシン様エンドペプチダーゼの濃度は、好ましくは１ｇの乳由来タンパク質当たり１，０００〜１，０００，０００ＵＳＰトリプシン単位、更に好ましくは５，０００〜５００，０００、及び最も好ましくは２５，０００〜２５０，０００である。
【００４８】
１ＵＳＰトリプシン単位は、ｐＨ７．６、２５℃で、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル塩酸塩（ＢＡＥＥ）を基質として使用して、２５３ｎｍで０．００３の吸光度変化を引き起こす活性である。
【００４９】
比活性は、異なるトリプシン様エンドペプチダーゼ間で非常に大きく変化し得るが、当業者は例えば加水分解度に基づいて、使用されるトリプシン様エンドペプチダーゼの量を容易に決定できるであろう。
【００５０】
トリプシン様エンドペプチダーゼと乳由来タンパク質との比は、好ましくは０．０１〜１０％重量／重量、更に好ましくは０．０１〜５％、更に好ましくは０．０５〜２．５％、更に好ましくは０．５〜１％、最も好ましくは約０．７５％である。
【００５１】
本発明の方法において乳由来タンパク性物質は、トリプシン様エンドペプチダーゼと少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼを用いて処理される。
【００５２】
好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、セリンエンドペプチダーゼである。
【００５３】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの活性は、トリプシン様エンドペプチダーゼよりも特異性が低い。
【００５４】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、哺乳動物のキモトリプシン、例えばブタ膵臓組織から抽出されるキモトリプシンの活性と類似の活性を有する。
【００５５】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、任意の他の天然のアミノ酸のカルボキシ末端側での切断よりも、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン又はヒスチジンの何れのカルボキシ末端側での切断に対して、より高い特異性を有する。
【００５６】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン又はヒスチジンの少なくとも１つのカルボキシ末端での切断に対して、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシン、リジン、プロリン、セリン、スレオニン、及びバリンの何れか１つのカルボキシ末端側での切断に対する特異性より、少なくとも３倍、好ましくは少なくとも５倍高い特異性を有する。
【００５７】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、アルギニンのカルボキシ末端側での切断よりも、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン、及びヒスチジンよりなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸のそれぞれのカルボキシ末端側での切断に対して、より高い特異性を有する。
【００５８】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、リジンのカルボキシ末端側での切断よりも、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン、及びヒスチジンよりなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸のそれぞれのカルボキシ末端側での切断に対して、より高い特異性を有する。
【００５９】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、アルギニンとリジンの両方のカルボキシ末端側での切断よりも、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン、及びヒスチジンのそれぞれのカルボキシ末端側での切断に対して、より高い特異性を有する。
【００６０】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、キモトリプシン比が少なくとも３、好ましくは少なくとも５である。少なくとも５のキモトリプシン比は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ（何れか大きい方）の１つの後で切断する時の酵素の活性は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ又はＶａｌ（何れか大きい方）の１つの後で切断する時の活性より、少なくとも５倍高いことを意味する。すなわち、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ（何れか大きい方）の１つの後で切断することに対する特異性が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ又はＶａｌ（何れか大きい方）の１つの後で切断することに対する特異性より、少なくとも３倍高く、好ましくは少なくとも５倍高い。キモトリプシン比を測定するためのかかる活性測定は、エンドペプチダーゼの活性が、その最適ｐＨでのエンドペプチダーゼの活性の少なくとも半分であるｐＨ値で行うべきである。キモトリプシン比は、本願の実施例１に記載のように決定される。
【００６１】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、細菌性エンドペプチダーゼである。より好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、ノカルジオプシス（Nocardiopsis）株、好ましくはノカルジオプシス（Nocardiopsis）ＮＲＲＬ１８２６２種（例えばＷＯ８８／０３９４７に記載のもの）由来である。例えば、本願の配列番号８の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。ノカルジオプシス（Nocardiopsis）ＮＲＲＬ１８２６２種由来であるプロテアーゼのＤＮＡ配列とアミノ酸配列は、例えばデンマーク特許出願第１９９６０００１３号に記載されている。
【００６２】
より好適な別の実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、メタリジウム（Metarhizium）、好ましくは例えば本願の配列番号１０の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を有するメタリジウム・アニソプリイ（Metarhizium anisopliae）（TREMBL:Q9Y843）由来である。更に好適な別の実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、ブラキスポリエラ（Brachysporiella）、好ましくは例えば本願の配列番号１２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を有するブラキスポリエラ・ガヤナ（Brachysporiella gayana）（CGMCC0865）由来である。メタリジウム・アニソプリイ（Metarhizium anisopliae）とブラキスポリエラ・ガヤナ（Brachysporiella gayana）由来であるプロテアーゼのＤＮＡ配列とアミノ酸配列は、例えばＷＯ０４０７２２７９に公表されている。
【００６３】
別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、細菌から産生される。
【００６４】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、
ｉ）配列番号８、１０又は１２の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ii）（ｉ）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
iii）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
iv）配列番号８、１０又は１２の何れの成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種、
よりなる群から選択される。
【００６５】
配列番号１０の成熟ポリペプチドとしては、アミノ酸１８７〜３７４が挙げられる。配列番号１２のポリペプチドとしては、アミノ酸１９０〜３７５が挙げられる。
【００６６】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号８の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号８の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号８のアミノ酸１〜１８８を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号８の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号８のアミノ酸１〜１８８からなる。
【００６７】
別の本発明の好適な一実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１０の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１０の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１０のアミノ酸１８７〜３７４を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１０の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１０のアミノ酸１８７〜３７４からなる。
【００６８】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１２の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１２のアミノ酸１９０〜３７５を含む。本発明の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１２の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。本発明の別の更に好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１２のアミノ酸１９０〜３７５からなる。
【００６９】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７０】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号９の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号９の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７１】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは低いストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、更に好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、よりいっそう好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７２】
別の好適な本発明の実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７３】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号９の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７４】
本発明の別の好適な実施態様によれば、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼは、配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％又は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７５】
本発明の別の好適な実施態様によれば、トリプシン様エンドペプチダーゼは、配列番号８、１０又は１２の成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種である。
【００７６】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの濃度は、１ｇの乳由来タンパク質当たり、好ましくは１００〜１００，０００ＵＳＰキモトリプシン単位、より好ましくは５００〜５０，０００、最も好ましくは１，０００〜２０，０００である。
【００７７】
１ＵＳＰキモトリプシン単位は、ｐＨ７．０、２５℃で、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンエチルエステル（ＡＴＥＥ）を基質とした場合に、２３７ｎｍで０．００７５の吸光度変化を引き起こす活性である。
【００７８】
比活性はエンドペプチダーゼの種類に応じて大きく異なる場合があるが、当業者であれば、例えば加水分解度に基づいて、使用される少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの量を容易に決定できるであろう。
【００７９】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの乳由来タンパク質に対する比は、好ましくは０．００１〜１％重量／重量、より好ましくは０．００１〜０．５％、更に好ましくは０．００５〜０．２５％、よりいっそう好ましくは０．０２〜０．１％、最も好ましくは約０．０５％である。
【００８０】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの使用濃度は、トリプシン様エンドペプチダーゼの使用濃度に対し、エンドペプチダーゼ重量基準で、好ましくは２％〜５０％、より好ましくは５％〜２０％、更に好ましくは５％〜１５％、最も好ましくは約１０％である。
【００８１】
ＵＳＰトリプシン単位で測定されるトリプシン様エンドペプチダーゼの活性は、ＵＳＰキモトリプシン単位で測定される少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの活性より、好ましくは５倍〜５００倍高く、より好ましくは１０倍〜２００倍高い。
【００８２】
加水分解前の任意の予備工程としては、ホエータンパク質フラグメント、例えば血清アルブミン（ＢＳＡ）、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、及び免疫グロブリン（特にＩｇＧ）を確実に変性するために、乳由来タンパク性物質の溶液又は懸濁物を予備加熱する工程が挙げられる。この工程により通常は、（後述されるように）免疫化学的に評価した場合の残存抗原性が低減される。好適な実施態様によれば、予備工程は、タンパク性物質を約７５〜９５℃で約５〜３０分加熱することにより行われる。別の好適な実施態様によれば、予備工程は、タンパク性物質を１３５℃より高い温度で約１〜５秒間加熱することにより行われる。別の好適な実施態様によれば、予備工程は、タンパク性物質を１３０℃より高い温度で約３０〜６０秒間加熱することにより行われる。
【００８３】
加水分解反応に好適に適用される条件は、当業者には周知であろう。これは例えば、ＵＳ５０３９５３２又はＥＰ０６３１７３１Ａ１の開示等に従って行われる。例えば、約４０℃〜６０℃の温度で、１〜６時間、ｐＨ６．５〜８．５、好ましくは６．５〜８の範囲で行われる。
【００８４】
好適な実施態様によれば、タンパク性物質は、ペプチダーゼによる１回目の処理後、更に２回目のタンパク質分解的加水分解を受け、次にエンドペプチダーゼ不活性化が行われる。より好適な実施態様によれば、タンパク性物質は、ＵＳ５０３９５３２に開示されているように、１回目と２回目のタンパク質分解的加水分解の間で熱処理を受ける。
【００８５】
加水分解条件とは無関係に、加水分解物に対して、エンドペプチダーゼを不活性化する追加の工程を行うことが好ましい。好適な実施態様によれば、このペプチダーゼ不活性化は、約７０〜１１０℃、好ましくは７５〜９５℃の温度で、約０．１〜３０分の熱処理を含む。或いは、エンドペプチダーゼは、超高温の滅菌（例えば約１３０℃で約３０〜６０秒間）により不活性化される。
【００８６】
得られたタンパク質加水分解物は、更に清澄化してもよい。これは液体状態で保存してもよい。加水分解物を限外ろ過し、溶媒留去等により濃縮し、或いは噴霧乾燥や凍結乾燥等の乾燥を行ってもよい。
【００８７】
好適な実施態様によれば、得られるタンパク質加水分解物は、中程度の加水分解を有する。別の好適な実施態様によれば、得られるタンパク質加水分解物の加水分解度は、５〜３０％、好ましくは１０〜２５％、更に好ましくは１２〜２０％である。特に好適な加水分解度は約１４％である。別の好適な加水分解度は約１５％である。
【００８８】
加水分解度（ＤＨ）は、この方法により得られるタンパク質加水分解度を示す。本発明との関連において、加水分解度（ＤＨ）は以下のように定義される：
ＤＨ＝（切断されるペプチド結合の数／ペプチド結合の総数）×１００％
【００８９】
得られるタンパク質加水分解物の加水分解度（ＤＨ）は、Church, F. C. et al. (1983) Spectrophotometric Assay Using o-Phthaldialdehyde for Determination of Proteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins, J. Dairy Sci. 66: 1219-1227の方法に従って、分光光学的に測定される。
【００９０】
得られるタンパク質加水分解物中のペプチドの分子量分布は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定される。好適な実施態様によれば、本発明の加水分解物を構成するペプチドのうち、分子量２０，０００ｋＤａ超のペプチドは、重量基準で１％未満である。
【００９１】
本発明の方法により得られる加水分解物は、検出可能な無傷乳タンパク質を有さないことが好ましい。加水分解物に無傷乳タンパク質が存在しないことは、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により立証される。同一のゲル中で、加水分解物と非加水分解タンパク質出発物質とを直接比較することができる。好適な実施態様によれば、本発明の加水分解物を構成するペプチドのうち、無傷乳由来タンパク質は重量基準で１％未満である。
【００９２】
本発明の方法により得られる加水分解物の残存抗原性は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定される。非加水分解乳タンパク質は、アッセイで確立される直線的用量応答内に入る濃度で、固相上に固定化される。以後の、ウサギ抗牛乳タンパク質とウサギＩｇＧに反応性の酵素結合体との連続インキュベーションは、抗原性で認識可能なタンパク質及びペプチドの存在を明らかにする。加水分解物で得られる結果は、非加水分解タンパク質出発物質で得られる結果と、質量ベースで比較される。次に加水分解物の抗原性低下パーセントが算出される。
【００９３】
好適な実施態様によれば、本発明の方法により得られるタンパク質加水分解物は、ＥＬＩＳＡにより測定すると、対応する非加水分解乳由来タンパク性物質に対して、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、更に好ましくは少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％の抗原性の低下を有し、更に最も好ましくは抗原性の低下は少なくとも約９９％である。
【００９４】
好適な実施態様によれば、本発明の方法により得られるタンパク質加水分解物は、人工栄養乳組成物である。
【００９５】
好適な実施態様によれば、本発明は、人工栄養乳組成物を調製する方法であって、上記開示に従って乳由来タンパク質加水分解物を得る工程を含むとともに、得られた乳由来タンパク質加水分解物を人工栄養乳組成物に含める工程を更に含む方法に関する。
【００９６】
かかる人工栄養乳組成物は、粉末、濃縮液体又は即時使用液体の何れの形でもよい。
【００９７】
かかる人工栄養乳組成物は、ヒト乳幼児の栄養要求を満足するように調整された成分を含むことが好ましい。すなわち、人工栄養乳は、本発明の方法に従って得られるタンパク質加水分解物以外に、脂質源、炭水化物源、及び他の栄養物質（例えばビタミンやミネラル）を含有するのが好ましい。典型的には、上記栄養物質の一部又は全部を供給するべく、人工栄養乳に動物油、植物油、デンプン、ショ糖、乳糖及び／又は固形コーンシロップを加えてもよい。
【００９８】
本発明のタンパク質加水分解物を含む人工栄養乳組成物は、栄養的に完全であることが好ましい。「栄養的に完全」という用語は、組成物が、健康なヒトの生命を長期間維持するのに充分な栄養物質を含有することを意味する。
【００９９】
好適な実施態様によれば、本発明のタンパク質加水分解物を含む人工栄養乳組成物は、タンパク質の０．１〜２重量％の遊離アルギニン及び／又はタンパク質の０．１〜３重量％の遊離ヒスチジンを追加的に含む。本発明の方法において、改質スイートホエー又はホエータンパク質分離物が乳由来タンパク性物質として使用される場合、遊離アルギニン及び／又は遊離ヒスチジンの添加が特に好ましい。
【０１００】
別の好適な実施態様によれば、本発明のタンパク質加水分解物を含む人工栄養乳組成物は、少なくとも５％の乾燥固形分、好ましくは約１０〜３０％の量の乾燥固形分の乳由来タンパク質加水分解物を含む、栄養的に完全な組成物の形である。
【実施例】
【０１０１】
［実施例１］
抽出されたブタ膵臓トリプシン調製物の微生物代替物
膵臓トリプシンNovo 6.0S（Novozymes A/Sから入手できる−以下のＰＴＮで）は、ブタ膵臓組織の抽出により産生される生成物である。ＰＴＮの主要な成分はトリプシンとキモトリプシンであり、トリプシン:キモトリプシンの比は少なくとも12.5:1（活性ベース、すなわちUSPトリプシン単位:USPキモトリプシン単位）である。
【０１０２】
ＰＴＮのような抽出された酵素調製物に対する適切な微生物の代替物を同定するために、Bachemから入手できる１０個の異なるＳｕｃ−ＡＡＰＸ−ｐＮＡ基質（Ｘ＝Ａ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、及びＶ）に対する異なる微生物プロテアーゼのｐＨ９での活性を測定した。これらの測定値に基づいて、各微生物プロテアーゼのトリプシン比（ＴＲ）とキモトリプシン比（ＣＲ）とを算出した。トリプシン比とキモトリプシン比は以下のように定義される：
【０１０３】
ＴＲ＝Ｓｕｃ−ＡＡＰ（Ｒ／Ｋ）−ｐＮＡに対する最大活性／Ｓｕｃ−ＡＡＰ非（Ｒ／Ｋ）−ｐＮＡに対する最大活性
ＣＲ＝Ｓｕｃ−ＡＡＰ（Ｆ／Ｌ／Ｍ）−ｐＮＡに対する最大活性／Ｓｕｃ−ＡＡＰ非（Ｆ／Ｌ／Ｍ）−ｐＮＡに対する最大活性
【０１０４】
トリプシン比
トリプシンは、アルギニン残基又はリジン残基のカルボキシ末端側で切断する特異的セリンエンドペプチダーゼであり、すなわちこれらは、Ｐ１位のＲ又はＫに対する厳密な優先性を有する。従ってトリプシン様プロテアーゼの適切な定義は、トリプシン比が＞１００であり、これは、８個の他のＳｕｃ−ＡＡＰ非（Ｒ／Ｋ）−ｐＮＡの何れに対する活性が、最適なＳｕｃ−ＡＡＰ（Ｒ／Ｋ）−ｐＮＡ基質に対する活性の１％未満であることを意味する。
【０１０５】
キモトリプシン比
キモトリプシンは、芳香族アミノ酸残基（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＰｈｅ）又は疎水性アミノ酸残基Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、及びＨｉｓの何れのカルボキシ末端側での切断に対してあまり厳密ではない優先性を有する。トリプシンと比較して、キモトリプシンはあまり特異的ではないエンドペプチダーゼであり、キモトリプシン様プロテアーゼの妥当な定義は、キモトリプシン比＞５であり、これは、７個の他のＳｕｃ−ＡＡＰ非（Ｆ／Ｌ／Ｍ）−ｐＮＡ基質の何れの上の活性が、最適なＳｕｃ−ＡＡＰ非（Ｆ／Ｌ／Ｍ）−ｐＮＡ基質に対する活性の２０％未満であることを意味する。
【０１０６】
Ｓｕｃ−ＡＡＰＸ−ｐＮＡアッセイ
プロテアーゼ：
ＰＴＮ
ブタトリプシン（UNIPROT:P00761）
フザリウムトリプシン（フザリウム・オキシスポルムからのトリプシン様プロテアーゼ、配列番号２）
ウシTLCK-処理キモトリプシン（Sigma, C-3142）
アルカラーゼ（Novozymes A/Sから入手できる）
バシロペプチダーゼ F（バシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）から, UNIPROT:Q65JX1）
ブラキスポリエラ（Brachysporiella）プロテアーゼ（ブラキスポリエラ・ガヤナから、配列番号１２）
エスペラーゼ（Novozymes A/Sから入手できる）
メタリジウムプロテアーゼ（メタリジウム・アニソプリイから入手できる、配列番号１０）
ノカルジオプシスプロテアーゼ（ノカルジオプシスＮＲＲＬ１８２６２種由来である、配列番号８）
サビナーゼ（Novozymes A/Sから入手できる）
【０１０７】
基質:
Suc-AAPA-pNA（Bachem L-1775）
Suc-AAPR-pNA（Bachem L-1720）
Suc-AAPD-pNA（Bachem L-1835）
Suc-AAPE-pNA（Bachem L-1710）
Suc-AAPI-pNA（Bachem L-1790）
Suc-AAPL-pNA（Bachem L-1390）
Suc-AAPK-pNA（Bachem L-1725）
Suc-AAPM-pNA（Bachem L-1395）
Suc-AAPF-pNA（Bachem L-1400）
Suc-AAPV-pNA（Bachem L-1770）
【０１０８】
温度：
室温（２５℃）
アッセイ緩衝液：100mM コハク酸、100mM ＨＥＰＥＳ、100mM CHES, 100mM CABS, 1mM CaCl2, 150mM KCl, 0.01% トリトンX-100、pH 9.0。
【０１０９】
アッセイ：
２０μlのペプチダーゼ希釈駅（０．０１％トリトンX-100で希釈）をマイクロタイタープレートのウェルに入れた。２００μlのｐＮＡ基質（５０mgを１．０ml ＤＭＳＯに溶解し、更にアッセイ緩衝液で９０×希釈した）を加えることにより、アッセイを開始した。ＯＤ４０５での初期上昇をペプチダーゼ活性の尺度として追跡した。４分間の測定時間内で直線（又はほぼ直線）プロットが達成されなかった場合、ペプチダーゼを更に希釈し、アッセイを繰り返した。
【０１１０】
データ：
【表１】
【０１１１】
表で各エンドペプチダーゼについて報告した活性データは、最適なSuc-AAPX-pNA基質の活性に対するものである。
【０１１２】
結論：
トリプシン比＞１００を有するプロテアーゼとしてトリプシン様プロテアーゼの上記定義を使用すると、ブタトリプシン（ＴＲ＝１７５０）とフザリウム（Fusarium）トリプシン（ＴＲ＞１０，０００）は、トリプシン様プロテアーゼである。試験したプロテアーゼの残りは、トリプシン様プロテアーゼではない。
【０１１３】
キモトリプシン比＞５を有するプロテアーゼとしてキモトリプシン様プロテアーゼの上記定義を使用すると、ウシキモトリプシン（ＣＲ＝１６０）、アルカラーゼ（ＣＲ＝４０）、ブラキスポリエラプロテアーゼ（ＣＲ＝２．２）、エスペラーゼ（ＣＲ＝６．２）、メタリジウムプロテアーゼ（ＣＲ＝２７）、ノカルジオプシスプロテアーゼ（ＣＲ＝７．７）、及びサビナーゼ（ＣＲ＝９．７）は、キモトリプシン様プロテアーゼである。残りの試験したプロテアーゼはキモトリプシン様プロテアーゼではない。
【０１１４】
キモトリプシン様プロテアーゼの別の定義は、キモトリプシンに対する相対的活性差の二乗の和を計算することであろう。この定義を使用して、メタリジウムプロテアーゼは、最高のキモトリプシン様セリンプロテアーゼであり、次にブラキスポリエラプロテアーゼ、ノカルジオプシスプロテアーゼ、サビナーゼ、及びアルカラーゼとなる（データは示していない）。
【０１１５】
［実施例２］
微生物エンドペプチダーゼの組合せによるＷＰＣの加水分解
次の工程は、微生物エンドペプチダーゼの混合物を使用したホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）で、２つの酵素混合物を同様に使用した場合にＰＴＮについて得られるものと同じ程度の加水分解（ＤＨ）が得られるかどうかを調べることであった。
【０１１６】
加水分解実験
我々が行った加水分解アッセイは、２工程加水分解法である。８．４％のＷＰＣ（８０％ホエータンパク質を含有する）をｐＨ８．０の緩衝液に懸濁した。１回目の加水分解工程は、酵素量の半分を加え、溶液を５５℃で攪拌しながら２時間インキュベートすることにより行った。次に部分加水分解ホエータンパク質基質を、短時間の熱処理（９０℃で５分間）により変性させた。２回目の加水分解工程は、酵素量の他の半分を加え、溶液を５５℃で攪拌しながら３０分間インキュベートすることにより行った。最後に酵素反応を停止させ、更に短時間の熱処理（９０℃で１０分間）により酵素を不活性化させた。ホエータンパク質／ペプチドの最終濃度は６．４％ＷＰであった。このアッセイを使用することにより、我々は、ＰＴＮを微生物代替物と比較することができるはずである。
【０１１７】
アルカリ性範囲で加水分解中にＨ+が生成するために、我々は最大量の酵素の一部についてｐＨをチェックした。ｐＨの低下を検出することができず、我々のｐＨ８．０緩衝液は、加水分解中のｐＨを調節するのに充分強力であることを示していた。
【０１１８】
まず我々は、４種類の異なる量のＰＴＮを試験した（０．６２５、１．２５、２．５、及び５．０ｍｇトリプシン／ｇホエータンパク質）。最少量について、ホエータンパク質加水分解物は非常に粘性があり、エッペンドルフチューブから出すのがほとんど不可能であり、従ってこの加水分解物のＤＨは測定できなかった。ＰＴＮ加水分解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、少なくとも５．０ｍｇトリプシン／ｇホエータンパク質量について、ほとんどの無傷タンパク質は分解されていることを示した。次にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは、等量のタンパク質／ペプチドを各レーンにのせた。５．０ｍｇトリプシン／ｇホエータンパク質ＰＴＮ用量についてＤＨ＝９．４％であった。
【０１１９】
次に我々は、精製トリプシン（ブタトリプシンとフザリウム（Fusarium）トリプシン）を用いて加水分解実験を少し行った。比較的多い量でも、約６．５％を超えるＤＨは得ることができなかった。以下のデータ欄を参照。
【０１２０】
最後に我々は、３回目の加水分解を行って、フザリウム（Fusarium）トリプシンの量を５．０ｍｇトリプシン／ｇホエータンパク質で一定に維持し、キモトリプシン様プロテアーゼの量を変化させた（０．２５、０．５、及び１．０ｍｇプロテアーゼ／ｇホエータンパク質）。ここで我々は、ＰＴＮ用量を等量にしたもの同じ範囲のＤＨ値を得た（ＤＨ＝９．４％）。
【０１２１】
２回目のキモトリプシン様プロテアーゼの量を上昇させることのＤＨに対する作用は、２回目のプロテアーゼに依存して異なる作用を有することがわかる。フザリウム（Fusarium）トリプシンとバシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のグルタミルペプチダーゼＢＬ（これはキモトリプシン様プロテアーゼではない）との組合せは、フザリウム（Fusarium）トリプシン単独で見られたように安定するようである。
【０１２２】
ＤＨ値（以下のデータ欄参照）とＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のホエータンパク質加水分解物の外観には相関関係がある。フザリウム（Fusarium）トリプシンとノカルジオプシス（Nocardiopsis）プロテアーゼとの組合せは（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから−データは示していない）、ＷＰＣ基質から無傷タンパク質を除去するのに最適なセリンプロテアーゼの組合せのようである。
【０１２３】
加水分解アッセイ
使用したエンドペプチダーゼ：
【表２】
【０１２４】
ＰＴＮ６．０Ｓ中のトリプシンとキモトリプシン含量の算出について我々は、ブタトリプシンの比活性＝７０００ＵＳＰ／ｍｇとブタキモトリプシンの比活性＝４５００ＵＳＰ／ｍｇを使用した。他の調製物中の酵素濃度は、Ａ２８０／Ｅ２８０から推定した。ＰＴＮを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８に溶解した。他の酵素は、融解後「そのまま」使用した。
【０１２５】
加水分解：
８４ｍｇ／ｍｌのＷＰＣ（全乾燥物質の約８０％のタンパク質を含むArlaからのLactProdan80）を、１．０Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、５０ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８．０に懸濁し、２７％ＮａＯＨを用いてｐＨをｐＨ８．０に調整した。この懸濁物１０００μｌを氷上のエッペンドルフチューブに入れた。２５μｌのプロテアーゼ溶液を加え、エッペンドルフチューブを、あらかじめ５５℃に加熱したエッペンドルフサーモミキサーに移した。サーモミキサー上でチューブを１２０分間インキュベートした（５５℃、１４００ｒｐｍ）。チューブを、あらかじめ９０℃に加熱した別のエッペンドルフサーモミキサーに移し、このサーモミキサー上で５分間インキュベートした（９０℃、１４００ｒｐｍ）。チューブを最初の５５℃のエッペンドルフサーモミキサーに戻し、５分後（加水分解混合物を５５℃にするため）、２５μｌのペプチダーゼ溶液を加え、チューブをサーモミキサー上で３０分間インキュベートした（５５℃、１４００ｒｐｍ）。最後にチューブを再度９０℃のサーモミキサーに移し、このサーモミキサー上で１０分間インキュベートした（９０℃、１４００ｒｐｍ）。
【０１２６】
加水分解物（６４ｍｇ／ｍｌホエータンパク質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し（データは示していない）、ＯＰＡ法を使用してＤＨを測定した。
【０１２７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
加水分解物を０．１％ ＳＤＳで５×希釈した。この希釈物の２０μlを、還元剤を有する２０μlの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合した。この混合物を沸騰させ、１０μlを４〜２０％トリス−グリシンゲルに適用した。
【０１２８】
ＤＨを測定するためのＯＰＡ法：
加水分解物を０．０１％ トリトンＸ−１００で８０×希釈した。この希釈物３０μlをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に移し、２２５μｌの新たに調製したＯＰＡ試薬を加え、２分後、ＭＴＰリーダーで３４０ｎｍの吸光度を読んだ。未知試料の応答をセリン標準希釈シリーズと比較し、ｍｇ／ｍｌセリンとして表した。「ＯＰＡ応答」を「ｍｇ／ｍｌ基質」に対する「加水分解物中のｍｇ／ｍｌセリン」として計算した。ＤＨの計算のために、酵素ブランクの「ＯＰＡ応答」を引いた。
【０１２９】
ＯＰＡ試薬
３．８１ｇのテトラホウ酸二ナトリウム（Merch 6308）と１．００ｇのＳＤＳ（BIO-RAD 161-0301）を８０mlの脱イオン水に溶解した。使用直前に、２．０mlのエタノール中に溶解した８０mgのｏ−フタルジアルデヒド（MercK 821027）を加え、１．０mlの１０％（w/w）ＤＴＥ（Merch 24511）を加えた。最後に脱イオン水を用いて、容量を１００mlに調整した。
【０１３０】
データ：
【表３】
【０１３１】
結論：
微生物ＰＴＮ−リプレーサー（ＰＴＮとして与える）を使用して、ＷＰＣの同程度の加水分解（ＤＨ）を得ることが可能のようである。トリプシン様プロテアーゼ単独では、ＰＴＮと同じＤＨを得ることはできないことも、結果から明らかである。
【０１３２】
［実施例３］
フザリウム（Fusarium）トリプシンとブラキスポリエラ（Brachysporiella）エンドペプチダーゼの切断特異性分析
初めに：
微生物トリプシン様エンドペプチダーゼであるフザリウム（Fusarium）トリプシンのタンパク質分解的切断特異性を、ブタトリプシンと比較した。ブラキスポリエラ（Brachysporiella）からの微生物キモトリプシン様エンドペプチダーゼのタンパク質分解的切断特異性を、ＴＬＣＫ処理ブタキモトリプシンのタンパク質分解的特異性と比較した（ＴＬＣＫは、キモトリプシンに影響を与えることなくトリプシンを不活性化する）。
【０１３３】
記載のエンドペプチダーゼを変性モデル基質ウシベータ−ラクトグロブリンＡとともにインキュベートすることにより、切断特異性分析を行った。得られたタンパク質分解性ペプチドの配列を、タンパク質同定に使用されるタンデム質量スペクトルデータ解析プログラム（ＳＥＱＵＥＳＴ）と組合せたオンラインRP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MSと、ウシベータ−ラクトグロブリンＡのみを含むデータベースにより、決定した。
【０１３４】
試料：
プロテアーゼ：
ブタトリプシン（UniProt accession: P00761）
フザリウムトリプシン（フザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼ、配列番号２）
ウシTLCK処理キモトリプシン（Sigma, C-3142）
ブラキスポリエラプロテアーゼ（ブラキスポリエラ・ガヤナから、配列番号１２）
基質：
ベータ−ラクトグロブリンＡ、牛乳から（Sigma L7880 097K7010）
【０１３５】
タンパク質分解：
ベータ−ラクトグロブリンＡの変性：
牛乳（Sigma L7880 097K7010）からの約１１ｍｇ量のベータ−ラクトグロブリンＡを１ｍｌの緩衝液（１００ｍＭ 酢酸アンモニウム、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８）に溶解した。ベータ−ラクトグロブリンのジスルフィド結合をジチオスレイトール（ＤＴＴ、ＣＡＳ番号3483-12-3）を加えて還元し、最終濃度２０ｍＭとした。混合物を室温（２５℃）で３０分インキュベートした。次に２−ヨードアセトアミド（ＣＡＳ番号144-48-9）を最終濃度５５ｍＭになるように加えた。後者の混合物を暗所で室温で３０分インキュベートした。
【０１３６】
プロテアーゼでインキュベートする前に、変性したベータ−ラクトグロブリンＡを、１００ｍＭ 酢酸アンモニア、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８に緩衝液交換した。緩衝液交換は、GE-healthcareのＰＤ−１０脱塩カラム（セファデックスＧ−２５カラム材料）で行った。まずカラムを２５ｍｌの１００ｍＭ 酢酸アンモニウム、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８で平衡化した。ベータ−ラクトグロブリン試料の容量を平衡化緩衝液を用いて最終容量２．５ｍｌに調整し、カラムにのせた。３．５ｍｌの１００ｍＭ 酢酸アンモニア、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８でベータ−ラクトグロブリンＡを溶出した。２８０ｎｍで推定吸光係数（Ａ２８０）１により、緩衝液交換したベータ−ラクトグロブリンの最終タンパク質濃度を２ｍｇ／ｍｌであると決定した。
【０１３７】
タンパク質分解インキュベーション：
１９０μlの溶液に対応する４００μg量のベータ−ラクトグロブリンを４０℃で以下の量のプロテアーゼを用いてインキュベートした：
ブタトリプシン ８μｇ
フザリウムトリプシン １６μｇ
ウシＴＬＣＫ処理キモトリプシン ４μｇ
ブラキスポリエラプロテアーゼ ４μｇ
【０１３８】
１８時間後、１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＣＡＳ番号76-05-1）水溶液を試料中に最終濃度１％ ＴＦＡになるように加えて、タンパク質分解工程を停止させた。すべての試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析するまで−２０℃で保存した。
【０１３９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法：
すべてのタンパク質分解試料を、Waters Ｃ１８カラム（ACQUITY UPLC（商標）BEH C18、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）、Thermo ScientificのAccela液体クロマトグラフィーシステム、及びThermo ScientificのLTQ Orbitrap XL ETDハイブリッド質量スペクトル装置からなるRP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MS装置で分析した。２０μlの容量をカラムに注入した。ペプチドを以下の勾配により分離した：
【０１４０】
溶媒Ａ：ＵＨＱ水中０．１％ギ酸（ＣＡＳ番号64-18-6）、溶媒Ｂ：アセトニトリル（ＣＡＳ番号75-05-8）中０．１％ギ酸。
【表４】
【０１４１】
溶出するペプチドをオンラインでＵＶ検出器により２１４ｎｍで追跡し、次にＭＳ／ＭＳモードで質量スペクトル装置により追跡した。得られるＵＶクロマトグラムを図１と２に示す。質量スペクトル装置中の前駆体イオンを３０，０００（FWHM）の分解能で検出し、フラグメントイオンを１５，０００（FWHM）の分解能で検出した。得られるＭＳとＭＳ／ＭＳスペクトルをＳＥＱＵＥＳＴソフトウェア（米国特許第６，０１７，６９３号と５，５３８，８９７号のアルゴリズム）を用いてProteome Discoverer（バージョン１．０、Thermo Fisher Scientific）を介して、ベータ−ラクトグロブリンに対して解析した。切断酵素を、「非特異的」切断特異性で「酵素無し」と規定した。強いＵＶ強度の一部のタンパク質分解フラグメントを、図１と２に示すように同定した。
【０１４２】
結果：
比較のために、フザリウム（Fusarium）トリプシンアッセイ（下のトレース）のＵＶクロマトグラムを、ブタトリプシンアッセイ（上のトレース）とともに図１に示し、いくつかの主要なペプチドの配列同一性を示す。同様に図２では、ブラキスポリエラ（Brachysporiella）プロテアーゼアッセイ（下のトレース）のＵＶクロマトグラムを、ウシキモトリプシン（下のトレース）とともに示す。すべての場合で、同定されたペプチドは、上のトレースと下のトレースの両方で検出されている。
【０１４３】
結論：
図１では、ウシベータ−ラクトグロブリンＡの共通のタンパク質分解ペプチドが、フザリウム（Fusarium）トリプシンとブタトリプシンについて検出され、従って２つのエンドペプチダーゼは両方ともトリプシン様特異性を有する。図２では、ベータ−ラクトグロブリンＡの一部の共通のタンパク質分解ペプチドがブラキスポリエラ（Brachysporiella）プロテアーゼとウシキモトリプシンについて検出される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳由来タンパク質加水分解物の調製法であって、
乳由来タンパク性物質の溶液を、
ａ）微生物から産生されるトリプシン様エンドペプチダーゼ、及び
ｂ）微生物から産生される少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼ、
を用いて処理することを含む方法。
【請求項２】
トリプシン様エンドペプチダーゼが、フザリウム（Fusarium）株由来である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
トリプシン様エンドペプチダーゼが、
ｉ）配列番号２、４又は６の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ii）（ｉ）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
iii）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
iv）配列番号２、４又は６の何れの成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種
よりなる群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
トリプシン様エンドペプチダーゼと乳由来タンパク質との比が、０．０１〜１０重量／重量％、好ましくは０．０１〜５％、より好ましくは０．０５〜２．５％、更に好ましくは０．５〜１％である、請求項１〜３の何れか１項記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼが、アルギニン及びリジンのカルボキシ末端側での切断よりも、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン、及びヒスチジンのカルボキシ末端側での切断に対して、より高い特異性を有する、請求項１〜４の何れか１項記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼのキモトリプシン比が少なくとも３である、請求項１〜５の何れか１項記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼが、ノカルジオプシス（Nocardiopsis）、メタリジウム（Metarhizium）又はブラキスポリエラ（Brachysporiella）株由来である、請求項１〜６の何れか１項記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼが、
ｉ）配列番号８、１０又は１２の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ii）（ｉ）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
iii）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
iv）配列番号８、１０又は１２の何れの成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種、
よりなる群から選択される、請求項１〜７の何れか１項記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの乳由来タンパク質に対する比が、０．００１〜１％重量／重量、好ましくは０．００１〜０．５％、より好ましくは０．００５〜０．２５％、更に好ましくは０．０２〜０．１％である、請求項１〜８の何れか１項記載の方法。
【請求項１０】
エンドペプチダーゼ重量基準で、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの濃度が、トリプシン様エンドペプチダーゼの濃度の２％〜５０％である、請求項１〜９の何れか１項記載の方法。
【請求項１１】
加水分解が、約４０℃〜６０℃の温度で１〜６時間、ｐＨ値６．５〜８．５の範囲内で行われる、請求項１〜１０の何れか１項記載の方法。
【請求項１２】
得られるタンパク質加水分解物の加水分解度が、５〜３０％、好ましくは１０〜２５％、より好ましくは１２〜２０％である、請求項１〜１１の何れか１項記載の方法。
【請求項１３】
得られるタンパク質加水分解物を構成するペプチドのうち、２０，０００ｋＤａより大きい分子量を有するペプチドが、重量基準で１％未満である、請求項１〜１２の何れか１項記載の方法。
【請求項１４】
得られるタンパク質加水分解物のＥＬＩＳＡにより測定される抗原性が、対応する非加水分解乳由来タンパク性物質に比べて、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、とりわけ好ましくは少なくとも約９８％、特に好ましくは少なくとも約９９％低い、請求項１〜１３の何れか１項記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４の何れか１項記載の方法において、人工栄養乳組成物中に乳由来タンパク質加水分解物を含める工程を更に含んでなる、人工栄養乳組成物を調製する方法。
【請求項１】
乳由来タンパク質加水分解物の調製法であって、
乳由来タンパク性物質の溶液を、
ａ）微生物から産生されるトリプシン様エンドペプチダーゼ、及び
ｂ）微生物から産生される少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼ、
を用いて処理することを含む方法。
【請求項２】
トリプシン様エンドペプチダーゼが、フザリウム（Fusarium）株由来である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
トリプシン様エンドペプチダーゼが、
ｉ）配列番号２、４又は６の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ii）（ｉ）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
iii）配列番号１、３又は５の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
iv）配列番号２、４又は６の何れの成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種
よりなる群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
トリプシン様エンドペプチダーゼと乳由来タンパク質との比が、０．０１〜１０重量／重量％、好ましくは０．０１〜５％、より好ましくは０．０５〜２．５％、更に好ましくは０．５〜１％である、請求項１〜３の何れか１項記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼが、アルギニン及びリジンのカルボキシ末端側での切断よりも、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン、及びヒスチジンのカルボキシ末端側での切断に対して、より高い特異性を有する、請求項１〜４の何れか１項記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼのキモトリプシン比が少なくとも３である、請求項１〜５の何れか１項記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼが、ノカルジオプシス（Nocardiopsis）、メタリジウム（Metarhizium）又はブラキスポリエラ（Brachysporiella）株由来である、請求項１〜６の何れか１項記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼが、
ｉ）配列番号８、１０又は１２の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ii）（ｉ）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、（ii）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列と、或いは（iii）（ｉ）又は（ii）の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
iii）配列番号７、９又は１１の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
iv）配列番号８、１０又は１２の何れの成熟ポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変種、
よりなる群から選択される、請求項１〜７の何れか１項記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの乳由来タンパク質に対する比が、０．００１〜１％重量／重量、好ましくは０．００１〜０．５％、より好ましくは０．００５〜０．２５％、更に好ましくは０．０２〜０．１％である、請求項１〜８の何れか１項記載の方法。
【請求項１０】
エンドペプチダーゼ重量基準で、少なくとも１つの他のエンドペプチダーゼの濃度が、トリプシン様エンドペプチダーゼの濃度の２％〜５０％である、請求項１〜９の何れか１項記載の方法。
【請求項１１】
加水分解が、約４０℃〜６０℃の温度で１〜６時間、ｐＨ値６．５〜８．５の範囲内で行われる、請求項１〜１０の何れか１項記載の方法。
【請求項１２】
得られるタンパク質加水分解物の加水分解度が、５〜３０％、好ましくは１０〜２５％、より好ましくは１２〜２０％である、請求項１〜１１の何れか１項記載の方法。
【請求項１３】
得られるタンパク質加水分解物を構成するペプチドのうち、２０，０００ｋＤａより大きい分子量を有するペプチドが、重量基準で１％未満である、請求項１〜１２の何れか１項記載の方法。
【請求項１４】
得られるタンパク質加水分解物のＥＬＩＳＡにより測定される抗原性が、対応する非加水分解乳由来タンパク性物質に比べて、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、とりわけ好ましくは少なくとも約９８％、特に好ましくは少なくとも約９９％低い、請求項１〜１３の何れか１項記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４の何れか１項記載の方法において、人工栄養乳組成物中に乳由来タンパク質加水分解物を含める工程を更に含んでなる、人工栄養乳組成物を調製する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５２２４９８（Ｐ２０１２−５２２４９８Ａ）
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２６６２（Ｐ２０１２−５０２６６２）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５４２９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１２５４６
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５４２９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１２５４６
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]