乳癌の遠隔転移を予測するための分子予後サインおよびその使用
本発明は、乳癌転移を予測するために有用である独特の１４個の遺伝子分子予後サインに基づいている。特に、本発明は、これらの遺伝子の発現レベルを検出および分析するための方法および試薬、並びに乳癌転移のリスクの予測に発現レベル情報を用いる方法に関する。本発明の一局面では、乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞におけるＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１として知られる遺伝子のｍＲＮＡ発現を測定し、これらの遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに基づく腫瘍転移のリスクを予測することを含む、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００７年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／８９８，９６３号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８９８，９６３号の内容は、本願中にその全体が参考として本明細書により援用される。
【０００２】
本発明は、乳癌転移の予後に関する。特に、本発明は、乳癌患者のリンパ節転移陰性のエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性腫瘍の転移のリスクの予測に有用である多重遺伝子の予後サインに関する。多重遺伝子の予後サインは１４個の遺伝子を含み、乳癌患者のＥＲ陽性腫瘍に含まれるそれらのｍＲＮＡは、ホルマリン固定のパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）の組織切片から得ることができ、それらの発現レベルは当該技術分野において知られている方法によって測定される。このようにして、本発明は、リンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌の遠隔転移のリスクを評価するための日常的な臨床検査室試験に適している。
【背景技術】
【０００３】
乳癌は、複雑な異種疾患である。乳癌の早期の検出により、成功的な治療および回復が改善される。日常的に検査されているマンモグラフィーは、ステージＩの乳癌の検出を増やし、付随して、より多くの女性がリンパ節転移陰性腫瘍であると診断される。（非特許文献１）。米国において、毎年、乳癌であると診断されたおよそ２４０，０００人の女性のうち約４３％がリンパ節転移陰性である。
【０００４】
現在のガイドラインに基づくと、８５〜９０％のリンパ節転移陰性の患者が、外科処置後、それによる全身アジュバント療法の候補者となる。このような全身アジュバント療法には、化学療法およびホルモン療法が含まれてもよい。しかしながら、局所的処置（乳腺切除または腫瘍摘出手術および放射線療法）を受けているリンパ節転移陰性乳癌の女性のうち約６０〜７０％が遠隔再発を経験することはない。乳腺患者の処置決定は、転移に関する各々の患者のリスクの評価、複数の臨床的であり、病理組織学的なパラメータを用いた処置への応答から恩恵を受ける。
【０００５】
最近のいくつかの研究では、マイクロアレイが使用され、患者の遺伝子発現プロフィールも有用な予後情報を提供することができることを示している。これらの研究の一部は、それらの大きさ、それらの検定の程度により、集中した注目を浴びている。（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００６】
ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｄａｉら（非特許文献２）によって同定された７０個の遺伝子の予後サインに関して集められた、結果として生じた信頼は、欧州試験であるリンパ節転移陰性疾患のためのマイクロアレイによって化学療法を避けられ得る（ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ Ｎｏｄｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｙ Ａｖｏｉｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ＭＩＮＤＡＣＴ）にその取り込みをもたらしている。同様に、非特許文献７によって記載されているＰＣＲに基づく２１個の遺伝子の予測サインは、北アメリカの乳癌インターグループ（Ｔｈｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ）による第ＩＩＩ相試験（臨床癌試験の評価のためのプログラム（Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｓｔｓ：ＰＡＣＣＴ）に含まれている。（非特許文献８）。
【０００７】
非特許文献９による２１個の遺伝子の予測サイン（５個の標準化遺伝子を含む）は、タモキシフェン処置患者に由来された。そのサインの独立性は、従来の免疫組織化学（ＩＨＣ）試験にすでに用いられていた遺伝子および／またはタンパク質とのその実質的な重複により関心が寄せられてきた。（非特許文献１０）。ＥＲ陽性の乳癌患者に対する標準的なホルモン療法は、タモキシフェン単独から、タモキシフェン＋アロマターゼ阻害剤の連続使用へ、またはアロマターゼ阻害剤単独へと変更されつつある。（非特許文献１１；非特許文献１２）。タモキシフェン処置に独立している予後ツールは、アロマターゼ阻害剤の摂取を計画している患者に対する基準リスクの測定の提供に重要であり得る。
【０００８】
このようにして、乳癌患者の遠隔転移のリスクを予測する日常的な臨床検査室試験に用いることができる遺伝子に基づく予後アッセイは必要である。理想的には、このアッセイは、相対的に少数の遺伝子の発現レベルの測定を必要とし、このような遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、ＦＦＰＥ腫瘍切片などの日常的な回収法によって保存された腫瘍組織から容易に得ることができる。遠隔転移のリスクに関する情報は、乳癌患者、特に初期段階のリンパ節転移陰性患者の処置戦略の指針に用いることができ、その結果、遠隔転移のリスクが高い患者は適切に処置され、遠隔転移のリスクが低い患者はある種の処置の副作用から免れる場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂ．Ｃａｄｙ，１９９７，Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍ ６：１９５−２０２
【非特許文献２】ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｈ．Ｄａｉら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−５３６
【非特許文献３】ＭＪ ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ，ＹＤ Ｈｅら，２００２，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４７：１９９９−２００９
【非特許文献４】Ｙ．Ｗａｎｇ，ＪＧ Ｋｌｉｊｎら，２００５，Ｌａｎｃｅｔ ３６５：６７１−６７９
【非特許文献５】Ｈ．Ｄａｉ，Ｕ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６
【非特許文献６】ＨＹ Ｃｈａｎｇ，ＤＳ Ｎｕｙｔｅｎら，２００５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：３７３８−３７４３
【非特許文献７】ＳＰ Ｐａｉｋ，Ｓ．Ｓｈａｋら，２００４，Ｎ ＥｎｇｌＪ Ｍｅｄ ３５１：２８１７−２８２６
【非特許文献８】ＶＧ Ｋａｋｌａｍａｎｉ ａｎｄ ＷＪ Ｇｒａｄｉｓｈａｒ，２００６，Ｃｕｒｒ Ｔｒｅａｔ Ｏｐｔｉｏｎｓ Ｏｎｃｏｌ ７：１２３−８
【非特許文献９】ＳＰ Ｐａｉｋ，２００４，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５１：２８１７−２８２６
【非特許文献１０】ＤＲ Ｃａｒｒｉｚｏｓａ ａｎｄ ＬＡ Ｃａｒｅｙ，２００５，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ ４：７−１０
【非特許文献１１】ＥＰ Ｗｉｎｅｒ，Ｃ．Ｈｕｄｉｓら，２００５，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：６１９−６２９
【非特許文献１２】ＳＭ Ｓｗａｉｎ，２００５，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５３：２８０７−９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、乳癌患者のＥＲ陽性腫瘍の転移のリスクを予測するための１４個の遺伝子サインに関する。本発明は、部分的には、初期段階のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性患者の試験に基づき、この患者の大部分は、一次診断後の治療決定を導くための更なる情報を必要とする。本発明の分子サインに含まれる１４個の遺伝子を表２に開示する。当業者は、多数の可能な供給源から得られるＲＮＡを用いて、本明細書に記載されている１４個の遺伝子に関して発現プロファイリングを行い、次に、この発現データを、予後転移スコアを決定するためにて提供されたアルゴリズムに挿入することができる。
【００１１】
本発明の一局面では、乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞におけるＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１として知られる遺伝子のｍＲＮＡ発現を測定し、これらの遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに基づく腫瘍転移のリスクを予測することを含む、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関する。
【００１２】
本発明の別の局面では、乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞における遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを測定し、それにより、これらの遺伝子の発現レベルに基づく転移スコア（ＭＳ）を得て、この転移スコアと所定の転移スコアカットポイント（ＭＳ閾値）とを比較することによってこの乳癌患者について腫瘍転移のリスクを測定することを含む、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関する。
【００１３】
本発明の更なる局面では、乳癌患者は、そのＭＳが所定のＭＳ閾値よりも高い場合に、腫瘍転移のリスクが増加していると決定される。
【００１４】
本発明の別の局面では、乳癌患者は、そのＭＳが所定のＭＳ閾値よりも低い場合に、腫瘍転移のリスクが減少していると決定される。
【００１５】
本発明の一局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、１４個の遺伝子サインのｍＲＮＡはＥＲ陽性の腫瘍細胞から得られ、ｃＤＮＡに逆転写され、ポリメラーゼ鎖反応増幅によって検出される。
【００１６】
本発明の別の局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、ＥＲ陽性の腫瘍細胞のｍＲＮＡは逆転写され、表３に記載される、配列番号１〜３４の各遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される。
【００１７】
本発明の別の局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、ＥＲ陽性の腫瘍細胞からのｍＲＮＡ発現の測定は、内在性対照（単数または複数）として、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７、またはそれらの組み合わせとして知られる遺伝子のいずれか１つのｍＲＮＡ発現に対して標準化される。
【００１８】
本発明の別の局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、ＥＲ陽性の腫瘍細胞からのｍＲＮＡ発現は、マイクロアレイによって検出される。
【００１９】
本発明の別の局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、ｍＲＮＡ発現は、下記：
【００２０】
【数１】
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の遺伝子の各遺伝子（ｉ）の標準化された発現レベルであり、ａ０は０．０２２であり、ａｉは１４個の遺伝子サインにおける遺伝子の各々について表２に示されている値に対応する）
によって転移スコア（ＭＳ）に計算される。
【００２１】
本発明の別の局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、ｍＲＮＡ発現は、下記：
【００２２】
【数２】
等式１
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の遺伝子の各遺伝子（ｉ）の標準化された発現レベルであり、ａ０は０．０２２であり、ｂは−０．２５１であり、ａｉは１４個の遺伝子サインに含まれる遺伝子の各々について表２に示されている値に対応する）
によって転移スコア（ＭＳ）に計算される。標準化された発現レベルは、Δ（ΔＣｔ）において測定される発現レベルからトレーニングセットの遺伝子の平均発現を差し引くことによって得られ、次に、その遺伝子の遺伝子発現の標準偏差によって割られる。トレーニングセットの各遺伝子についての遺伝子発現の平均および標準偏差は表４に示される。等式１は、実施例１、２および３において用いられた。
【００２３】
本発明の更なる局面では、ＭＳ式は、下記の定義：
【００２４】
【数３】
等式２
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の遺伝子の各遺伝子（ｉ）のΔ（ΔＣｔ）において測定される発現レベルであり、ａ０が０．８６５７であり、ｂが−０．０４７７８であり、ａｉが全ての遺伝子について１である）
を推定することができる。等式２は、実施例４および５において用いられた。
【００２５】
本発明の更なる局面では、ＭＳ式は、ａ＝０、ｂ＝−１、ａｉ＝１であり得る。
【００２６】
本発明の別の局面では、上述された１４個の遺伝子の発現プロファイリングを用いて、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、各遺伝子（ｉ）の発現レベルＧｉは、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ 等式４
（式中、
Ｃｔは指数関数的な標的増幅のＰＣＲ閾値サイクルであり、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ＥＣは内在性対照であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者の試料ＲＮＡであり、ｒｅｆＲＮＡは参照ＲＮＡである）
によって遺伝子発現値Ｇｉに計算される。
【００２７】
本発明の別の局面では、上述した１４個の遺伝子の発現プロファイリングを用いて、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、各遺伝子（ｉ）の発現レベルＧｉは、ＭＳスコアの１つの値に組み合わされ、ここで、関連のあるＭＳ閾値またはカットポイントよりも高いＭＳスコアを有する患者は、腫瘍転移に関して高いリスクにある。
【００２８】
本発明の一局面では、遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを検出するための試薬、酵素；およびバッファーを含むキットに関する。
【００２９】
本発明の別の局面では、遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むマイクロアレイに関する。
配列リスト
添付された配列リストは、全体として参照により本明細書中に援用される。配列リストは、表３に示されるオリゴヌクレオチド（配列番号１〜３４）を与える。これらのオリゴヌクレオチドは、表３に列挙された遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅における例示的なプライマーである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１ａ】ａ）遠隔転移までの時間、ｂ）ＣＰＭＣのトレーニングセットに関する全生存についてのカプラン−マイヤー曲線を示し、そこでは、高リスクおよび低リスク群は、カットポイントとしてゼロを用いたＭＳ（ＣＶ）によって特定された。
【図１ｂ】ａ）遠隔転移までの時間、ｂ）ＣＰＭＣのトレーニングセットに関する全生存についてのカプラン−マイヤー曲線を示し、そこでは、高リスクおよび低リスク群は、カットポイントとしてゼロを用いたＭＳ（ＣＶ）によって特定された。
【図２】ＣＰＭＣのトレーニングセットにおける５年以内のＭＳ（ＣＶ）による遠隔転移を予測するためのＲＯＣ曲線である。ＡＵＣ＝０．７６（０．６５−０．８７）。
【図３ａ】ガイ病院からの２８０人の未処置患者の遺伝子サインおよびアジュバント！によって特定されたリスク群によるカプラン−マイヤー曲線を示す。具体的には、図３ａ）およびｂ）は、１４個の遺伝子サインを用いた結果を記載し、図３ｃ）およびｄ）は、アジュバント！因子を用いた結果を示す。ａ）ＭＳリスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｂ）ＭＳリスク群よる全生存、ｃ）アジュバント！リスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｄ）アジュバント！リスク群による全生存。
【図３ｂ】ガイ病院からの２８０人の未処置患者の遺伝子サインおよびアジュバント！によって特定されたリスク群によるカプラン−マイヤー曲線を示す。具体的には、図３ａ）およびｂ）は、１４個の遺伝子サインを用いた結果を記載し、図３ｃ）およびｄ）は、アジュバント！因子を用いた結果を示す。ａ）ＭＳリスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｂ）ＭＳリスク群よる全生存、ｃ）アジュバント！リスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｄ）アジュバント！リスク群による全生存。
【図３ｃ】ガイ病院からの２８０人の未処置患者の遺伝子サインおよびアジュバント！によって特定されたリスク群によるカプラン−マイヤー曲線を示す。具体的には、図３ａ）およびｂ）は、１４個の遺伝子サインを用いた結果を記載し、図３ｃ）およびｄ）は、アジュバント！因子を用いた結果を示す。ａ）ＭＳリスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｂ）ＭＳリスク群よる全生存、ｃ）アジュバント！リスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｄ）アジュバント！リスク群による全生存。
【図３ｄ】ガイ病院からの２８０人の未処置患者の遺伝子サインおよびアジュバント！によって特定されたリスク群によるカプラン−マイヤー曲線を示す。具体的には、図３ａ）およびｂ）は、１４個の遺伝子サインを用いた結果を記載し、図３ｃ）およびｄ）は、アジュバント！因子を用いた結果を示す。ａ）ＭＳリスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｂ）ＭＳリスク群よる全生存、ｃ）アジュバント！リスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｄ）アジュバント！リスク群による全生存。
【図４ａ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図４ｂ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図４ｃ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図４ｄ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図４ｅ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図４ｆ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図５】２８０人のガイの未処理患者からの５年および１０年以内の遠隔転移の可能性に対する転移スコア（ＭＳ）の比較である。
【図６】１４個の遺伝子サインからの１０年以内の遠隔転移の可能性に対する、ガイ病院からの未処置患者についてのアジュバント！からの１０年の再発率の比較である。
【図７Ａ】ミュエンスター大学の患者における遠隔転移のない生存についてのカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図７Ｂ】ミュエンスター大学の患者における遠隔転移のない生存についてのカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図８】ガイ病院からの２０５人の処置患者に関する３ＭＳ群（高、中、低）の遠隔転移なしの生存のカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図９】ガイ病院からの２０５人の処置患者によって測定された２つのリスク群（高および低）における遠隔転移なしの生存のカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図１０】ガイの処置試料に関する５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣ＝０．７（０．５７−０．８７）。
【図１１Ａ】ガイ処置試料におけるＭＳによる高対低のリスク群のハザード率に依存した時間を示す。
【図１１Ｂ】ガイ処置試料におけるＭＳによる高対低のリスク群のハザード率に依存した時間を示す。
【図１２】２３４人の日本人試料における３つのＭＳ群（高、中、および低）に関する遠隔転移なしの生存（ＤＭＦＳ）のカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図１３】２３４人の日本人試料における２つのリスク群（高ＭＳは高リスクを有し、中および低ＭＳは低リスクを有する）についての遠隔転移なしの生存（ＤＭＦＳ）のカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図１４】日本人患者に関する５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣ＝０．７３（０．６３−０．８４）。
【図１５Ａ】時間の関数として、ＭＳ群に対する年換算でのハザード率、および高対低リスク群のハザード率を示す。
【図１５Ｂ】時間の関数として、ＭＳ群に対する年換算でのハザード率、および高対低リスク群のハザード率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、乳癌転移を予測するために用いることができる多重遺伝子サイン、本明細書に開示されている遺伝子を検出するための方法および試薬、並びにこのような試薬を利用するアッセイまたはキットを提供する。本明細書に開示されている乳癌転移に関連した遺伝子は、乳癌患者のＥＲ陽性腫瘍の遠隔転移の可能性を診断、スクリーニング、および評価するのに有用である。
【００３２】
表２に開示されている分子サインの１４個の遺伝子の発現プロファイリングは、遠隔転移の予後を容易に推測することができる。表２に示されている情報は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）を含み、国立衛生研究所／国立医学図書館の全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から得られ、記載されている各遺伝子の１つの変異転写配列を特定する。この変異体の配列に基づいて、試薬は、１４個の遺伝子サインの各遺伝子の全ての変異体を特定するために設計されてもよい。表３は、各遺伝子の全ての変異体が増幅されるように、１４個の遺伝子サインの各遺伝子を検出するために用いることができる例示的なプライマーセットを提供する。このようにして、本発明は、本明細書に開示されている全ての遺伝子の全ての知られている転移変異体の発現プロファイリングを提供する。
【００３３】
また、表２には、各ＲｅｆＳｅｑのヌクレオチド配列を公開する参考文献が示されている。これらの参考文献の全ては、全体として参照により本明細書に援用される。また、表２には、各遺伝子の記述がある。参考文献および記述はともにＮＣＢＩによって提供された。
【００３４】
ＣＥＮＰＡ遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００１８０９によって特定され、Ｂｌａｃｋ，Ｂ．Ｅ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｄ．Ｒ．ら，２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３０（６９９９）：５７８−５８２に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３５】
ＰＫＭＹＴ１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００４２０３によって特定され、Ｂｒｙａｎ，Ｂ．Ａ．，Ｄｙｓｏｎ，Ｏ．Ｆ．ら，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７（ＰＴ３），５１９−５２９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３６】
ＭＥＬＫ遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０１４７９１によって特定され、Ｂｅｕｌｌｅｎｓ，Ｍ．，Ｖａｎｃａｕｗｅｎｂｅｒｇｈ，Ｓ．ら，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（４８），４０００３−４００１１に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３７】
ＭＹＢＬ２遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００２４６６によって特定され、Ｂｒｙａｎ，Ｂ．Ａ．，Ｄｙｓｏｎ，Ｏ．Ｆ．ら，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７（ＰＴ３），５１９−５２９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３８】
ＢＵＢ１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００４３６６によって特定され、Ｍｏｒｒｏｗ，ＣＪ．，Ｔｉｇｈｅ，Ａ．ら，２００５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１８（ＰＴ１６），３６３９−３６５２に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３９】
ＲＡＣＧＡＰ１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０１３２７７によって特定され、Ｎｉｉｙａ，Ｆ．，Ｘｉｅ，Ｘ．ら，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（４３），３６５０２−３６５０９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４０】
ＴＫ１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００３２５８によって特定され、Ｋａｒｂｏｗｎｉｋ，Ｍ．，Ｂｒｚｅｚｉａｎｓｋａ，Ｅ．ら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２２５（２），２６７−２７３に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４１】
ＵＢＥ２Ｓ遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０１４５０１によって特定され、Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｄｉａｚ，Ｌ．Ａ．ら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２２），１５８２９−１５８３５に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４２】
ＤＣ１３遺伝子は、参照配列ＡＦ２０１９３５によって特定され、Ｇｕ，Ｙ．，Ｐｅｎｇ，Ｙ．ら，Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ，Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ Ｎｏｖ．５，１９９９、中国国家ヒトゲノムセンター、上海、351 Ｇｕｏ Ｓｈｏｕｊｉｎｇ Ｒｏａｄ，Ｚｈａｎｇｊｉａｎｇ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｐａｒｋ，Ｐｕｄｏｎｇ，Ｓｈａｎｇｈａｉ（上海市浦東新區張江高科技園區郭守敬路351號）201203、中華人民共和国に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４３】
ＲＦＣ４遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００２９１６によって特定され、Ｇｕｐｔｅ，Ｒ．Ｓ．，Ｗｅｎｇ，Ｙ．ら，２００５，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４（２），３２３−３２９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４４】
ＰＲＲ１１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０１８３０４によって特定され、Ｗｅｉｎｍａｎｎ，Ａ．Ｓ．，Ｙａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，２００２，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６（２），２３５−２４４に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４５】
ＤＩＡＰＨ３遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０３０９３２によって特定され、Ｋａｔｏｈ，Ｍ．およびＫａｔｏｈ，Ｍ．，２００４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１３（３），４７３−４７８に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４６】
ＯＲＣ６Ｌ遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０１４３２１によって特定され、Ｓｉｂａｎｉ，Ｓ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｇ．Ｂ．ら，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４（２１），７８８５−７８９６に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４７】
ＣＣＮＢ１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０３１９６６によって特定され、Ｚｈａｏ，Ｍ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｔ．ら，２００６，Ｅｘｐ Ｏｎｃｏｌ ２８（１），４４−４８に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４８】
ＰＰＩＧ遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００４７９２によって特定され、Ｌｉｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｅｕ，Ｓ．ら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２１（３），６３８−６４７に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４９】
ＮＵＰ２１４遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００５０８５によって特定され、Ｇｒａｕｘ，Ｃ，Ｃｏｏｌｓ，Ｊ．ら，２００４，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６（１０），１０８４−１０８９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００５０】
ＳＬＵ７遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００６４２５によって特定され、Ｓｈｏｍｒｏｎ，Ｎ．，Ａｌｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．ら，２００５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１８（ＰＴ６），１１５１−１１５９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００５１】
また、表２には、各遺伝子ｉに対する転移スコアを決定するために必要とされる一定のａｉについての値が示され、それは、その遺伝子について得られた発現プロファイリングの結果に基づいている。転移スコアの誘導およびその使用、遺伝子発現プロファイリングの方法、そこから得られたデータの使用が下記に記載されている。
【００５２】
このようにして、本発明は、乳癌転移についてともに予後となる１４個の別々の遺伝子、試験試料にあるこれらの遺伝子の発現レベルを決定する方法、遠隔転移を発祥する個体の可能性を決定する方法、処置戦略を選択するための開示されている遺伝子の使用方法を提供する。
【００５３】
本発明は、従来、当該技術分野において知られていなかった１４個の遺伝子サインの独自の組み合わせを提供する。したがって、本発明は、本明細書に開示されている遺伝子に基づく新規な方法を提供し、また、乳癌転移に関連した（例えば、乳癌転移の予後に関する）方法において、知られてはいるが、従来無関係とされた遺伝子を用いる方法を提供する。
【００５４】
当業者は、核酸分子が二重鎖分子であってもよく、１本鎖の特定配列への言及が、同様に、相補鎖の対応する部位への言及であることを容易に認識する。ヌクレオチド配列の定義において、核酸分子の１本鎖上の特定部位でのアデニン、チミジン（ウリジン）、シトシン、またはグアニンへの言及も、核酸分子の相補鎖上の対応する部位でのチミジン（ウリジン）、アデニン、グアニン、またはシトシン（それぞれ）を定義する。つまり、特定のヌクレオチド配列に言及するために、いずれかの鎖に言及がなされてもよい。プローブおよびプライマーは、いずれかの鎖にハイブリダイズするように設計されてもよく、本明細書に開示されている遺伝子発現プロファイリング法は、一般に、いずれかの鎖を標的としてもよい。
腫瘍組織供給源およびＲＮＡ抽出
本発明では、標的ポリヌクレオチド分子は、乳癌に苦しんでいる個体から採取された試料から抽出される。試料は、任意の臨床的に許容される方法で回収されてもよいが、遺伝子特異的なポリヌクレオチド（即ち、転写ＲＮＡ、またはメッセージ）は保存されるように回収されなければならない。次に、このようにして試料から得られたｍＲＮＡまたは核酸は、さらに分析されてもよい。例えば、遺伝子（例えば、表２に示されている遺伝子）に特異的なオリゴヌクレオチド対は、試料に含まれる特異的なｍＲＮＡ（単数または複数）を増幅させるために用いられてもよい。次に、各メッセージの量が測定されるか、またはプロファイルすることができ、疾患予後と関連付けることができる。あるいは、ｍＲＮＡまたはそれから誘導される核酸（即ち、ｃＤＮＡ、増幅されたＤＮＡまたは濃縮されたＲＮＡ）は、標準または対照のポリヌクレオチド分子から区別されるように標識されてもよく、両者は、上述されるマーカーのいくつかもしくは全部、またはマーカーセットもしくはサブセットを含むマイクロアレイに、同時にまたは個別にハイブリダイズされてもよい。あるいは、ｍＲＮＡまたはそこから誘導される核酸は、標準または対照のポリヌクレオチド分子と同じ標識で標識されてもよく、ここで、特定のプローブで各々のハイブリダイゼーションの強度が比較される。
【００５５】
試料は、いずれかの臨床的に関連する組織試料を含んでもよく、例えば、ホルマリン固定されたパラフィン包埋試料、凍結試料、腫瘍検体もしくは細針吸引物、または、ＥＲ陽性の腫瘍細胞を含む体液試料、例えば血液、血漿、血清、リンパ液、腹水もしくは嚢胞液、尿、または乳頭浸出液である。
【００５６】
トータルおよびポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製する方法は周知であり、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ − Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４））に記載されている。ＲＮＡは、細胞の溶解、そこに含まれているタンパク質の変性を含む、当該技術分野において周知であるいずれかの手法によって、ＥＲ陽性の腫瘍細胞から単離されてよい。
【００５７】
組織試料からＲＮＡを調製するための一例として、ＲＮＡは、当該技術分野において周知の技術を用いて、ホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から単離されてもよい。この目的のための市販キットは、例えば、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｑｉａｇｅｎ、またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから得ることができる。ＦＦＰＥ組織からトータルＲＮＡを単離する例示的な方法は、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ Ｓｌｉｄｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｚｙｍｏ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，Ｃａｌｉｆ.)に従えば、下記のとおりである。要約すると、Ｚｙｍｏキットから得られる溶液は、対象とする選択されたＦＦＰＥ組織領域全体に塗布され、乾燥される。次に、包埋された組織は、スライドから剥がされ、プロテイナーゼＫを含む遠心管に入れられる。組織を数時間インキュベート後、細胞溶解物を遠心分離し、上清を別の管に移す。ＲＮＡは、グアニジニウムチオシネート／βメルカプトエタノール溶液にエタノールを加え、混合した溶液を用いて、溶解物から抽出される。試料をスピンカラムに適用し、１分間回転される。エタノールおよびＴｒｉｓ／ＥＤＴＡを含むバッファーを用いてカラムを洗浄する。ＤＮａｓｅをカラムに添加し、インキュベートする。加熱したＲＮＡａｓｅを含まない水をカラムに添加し、遠心分離することによって、カラムからＲＮＡを抽出する。純粋なトータルＲＮＡは溶出物に存在する。
【００５８】
更なる工程は、汚染しているＤＮＡを除去するために用いられてもよく、例えば、上述されるように、スピンカラムにＤＮａｓｅが添加される。細胞溶解物は、非イオン性界面活性剤を用い、その後、核、したがって、細胞性ＤＮＡのバルクを除去するために、マイクロ遠心分離によって達成されてもよい。一態様では、ＲＮＡは、グアニジニウムチオシネートの存在下で細胞溶解後、ＣｓＣｌ遠心分離によりＤＮＡからＲＮＡを分離することによって対象とする種々のタイプの細胞から抽出される（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−５２９９（１９７９））。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロース（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ − Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照されたい）。あるいは、ＤＮＡからのＲＮＡの分離は、有機抽出、例えば、熱フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて達成することができる。
【００５９】
必要に応じて、ＲＮａｓｅ阻害剤を溶解バッファーに添加してもよい。同様に、ある種の細胞型については、タンパク質変性／消化工程をプロトコールに加えることが望ましい場合がある。
【００６０】
多くの応用に関して、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）などの、細胞から抽出された他の細胞性ＲＮＡに関して、選択的にｍＲＮＡを濃縮することが望ましい。大部分のｍＲＮＡは、それらの３’末端でポリ（Ａ）テールを含む。これは、アフィニティークロマトグラフィーによって；例えば、固体支持体、例えばセルロースまたはＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）に結合されたオリゴ（ｄＴ）またはポリ（Ｕ）を用いて、濃縮が可能になる（Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照されたい）。このようにして結合後、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、２ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１％ＳＤＳを用いてアフィニティーカラムから溶出される。
【００６１】
ＲＮＡ試料は、複数の異なるｍＲＮＡ分子を含んでもよく、各ｍＲＮＡ分子は、種々のヌクレオチド配列を有する。特定の態様では、ＲＮＡ試料のｍＲＮＡ分子は、本明細書に開示されている１４個の遺伝子の各々に対応するｍＲＮＡを含む。更なる特定の態様では、細胞からのトータルＲＮＡまたはｍＲＮＡは、本発明の方法に用いられる。ＲＮＡの供給源は、任意のＥＲ陽性の腫瘍細胞由来の細胞であってもよい。特定の態様では、本発明の方法は、１×１０６細胞以下からトータルｍＲＮＡまたはトータルＲＮＡを含む試料とともに用いられる。
遺伝子発現を測定するための試薬
本発明は、遺伝子発現プロファイリング、乳癌転移の予後の測定に用いることができる核酸分子を提供する。本明細書に記載されている１４個の遺伝子サインの遺伝子発現プロファイリングにおいて、プライマーとして用いることができる例示的な核酸分子は、表３に示されている。
【００６２】
表３に示されるように：
遺伝子ＢＵＢ１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１、下流プライマー（３’）としての配列番号２を用いて増幅される。
【００６３】
遺伝子ＣＣＮＢ１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号３、下流プライマー（３’）としての配列番号４を用いて増幅される。
【００６４】
遺伝子ＣＥＮＰＡは逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号５、下流プライマー（３’）としての配列番号６を用いて増幅される。
【００６５】
遺伝子ＤＣ１３は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号７、下流プライマー（３’）としての配列番号８を用いて増幅される。
【００６６】
遺伝子ＤＩＡＰＨ３は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号９、下流プライマー（３’）としての配列番号１０を用いて増幅される。
【００６７】
遺伝子ＭＥＬＫは逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１１、下流プライマー（３’）としての配列番号１２を用いて増幅される。
【００６８】
遺伝子ＭＹＢＬ２は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１３、下流プライマー（３’）としての配列番号１４を用いて増幅される。
【００６９】
遺伝子ＮＵＰ２１４は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号２９、下流プライマー（３’）としての配列番号３０を用いて増幅される。
【００７０】
遺伝子ＯＲＣ６Ｌは逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１５、下流プライマー（３’）としての配列番号１６を用いて増幅される。
【００７１】
遺伝子ＰＫＭＹＴ１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１７、下流プライマー（３’）としての配列番号１８を用いて増幅される。
【００７２】
遺伝子ＰＰＩＧは逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号３１、下流プライマー（３’）としての配列番号３２を用いて増幅される。
【００７３】
遺伝子ＰＲＲ１１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１９、下流プライマー（３’）としての配列番号２０を用いて増幅される。
【００７４】
遺伝子ＲＡＣＧＡＰ１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号２１、下流プライマー（３’）としての配列番号２２を用いて増幅される。
【００７５】
遺伝子ＲＦＣ４は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号２３、下流プライマー（３’）としての配列番号２４を用いて増幅される。
【００７６】
遺伝子ＳＬＵ７は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号３３、下流プライマー（３’）としての配列番号３４を用いて増幅される。
【００７７】
遺伝子ＴＫ１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号２５、下流プライマー（３’）としての配列番号２６を用いて増幅される。
【００７８】
遺伝子ＵＢＥ２Ｓは逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号２７、下流プライマー（３’）としての配列番号２８を用いて増幅される。
【００７９】
表２に示されている各遺伝子の完全なヌクレオチド配列に基づいて、当業者は、本明細書に記載されている１４個の遺伝子サインの増幅および／または検出に用いることができる更なるプライマーおよび／またはプローブを容易に設計し、合成することができる。
【００８０】
本発明の特定の局面では、表３に開示されている配列は、遺伝子発現プロファイリング試薬として用いることができる。本明細書中で使用するとき、「遺伝子発現プロファイリング試薬」とは、配列がｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであることを問わず、本明細書に記載されている遺伝子の特定の標的遺伝子のヌクレオチド配列を増幅および／または検出する方法に特に有用である試薬を指す。例えば、プロファイリング試薬は、好ましくは、異なる代替の遺伝子ヌクレオチド配列間を区別することができ、それによって、測定されるべきヌクレオチド配列の同定および定量を可能にする。典型的には、このようなプロファイリング試薬は、配列特異的な方法で相補的な塩基対によって標的核酸分子にハイブリダイズすることができ、試験試料に含まれる従来知られている形態などの他の核酸配列から標的配列を区別する。検出試薬の例には、表３に示されている配列の１つと実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む標的核酸にハイブリダイズするプローブが挙げられる。好ましい態様では、このようなプローブは、異なる遺伝子の核酸間で区別することができる。検出試薬の別の例には、逆転写またはＰＣＲなどの、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に沿ったヌクレオチド伸長の開始点として作用するプライマーが挙げられる。また、本明細書に示されている配列情報は、例えば、本発明のいずれかの遺伝子を逆転写および／または増幅（例えば、ＰＣＲを用いて）するプライマーを設計するために有用でもある。
【００８１】
本発明の１つの好ましい態様では、検出試薬は、表２に開示されている遺伝子のいずれかに対応する標的核酸分子のセグメントにハイブリダイズする、単離されたもしくは合成のＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチドプローブまたはプライマーまたはＰＮＡオリゴマー、あるいはＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＰＮＡの組み合わせである。ポリヌクレオチドの形態での検出試薬は、場合により、修飾された塩基類似体、インターカレート剤または副溝結合剤を含んでもよい。プローブなどの多重検出試薬は、例えば、固体支持体（例えば、アレイまたはビーズ）に付され、または溶液（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎアッセイ、またはプライマー伸長反応）で供給されて、発現プロファイリングキットを形成してもよい。
【００８２】
プローブまたはプライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーである。このようなオリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、標的核酸分子と少なくとも約８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、１００、１２０（または中間の任意の他の数）、またはそれを超える連続したヌクレオチドにハイブリダイズする相補的ヌクレオチド配列の領域を含む。
【００８３】
他の好ましいプライマーおよびプローブ配列は、表２に開示されている遺伝子のヌクレオチド配列を用いて容易に決定することができる。このようなプライマーおよびプローブは、本発明の遺伝子の発現プロファイリングのための試薬として直接的に有用であり、いずれかのキット／システムフォーマットに導入することができることは当業者に明確である。
【００８４】
標的遺伝子配列に特異的なプローブまたはプライマーを生成するために、遺伝子／転写配列は、典型的には、ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端で開始するコンピュータアルゴリズムを用いて調べられる。次に、典型的なアルゴリズムは、遺伝子配列に独特であり、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のＧＣ含有量を有し、ハイブリダイゼーションを妨げる可能性のある予測される二次構造を欠如し、および／または他の所望の特徴を有し、または他の望ましくない特徴を欠如している、所定の長さのオリゴマーを同定する。
【００８５】
本発明のプライマーまたはプローブは、典型的には、長さにして、少なくとも約８ヌクレオチドである。本発明の一態様では、プライマーまたはプローブは、長さにして少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましい態様では、プライマーまたはプローブは、長さにして少なくとも約１２ヌクレオチドである。より好ましいた態様では、プライマーまたはプローブは、長さにして少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドである。プローブの最大の長さは、用いられるアッセイのタイプに応じて、検出されるべき標的配列と同程度の長さであり得るが、典型的には、長さにして、約５０、６０、６５、または７０ヌクレオチド未満である。プライマーの場合には、典型的には、長さにして約３０ヌクレオチド未満である。本発明の特定の好ましい態様では、プライマーまたはプローブは、約１８と約２８ヌクレオチドの長さの範囲内である。しかしながら、他の態様では、核酸アレイ、プローブが基材に付される他の態様などのように、プローブはより長くてもよく、例えば、長さにして、３０〜７０、７５、８０、９０、１００、またはより長いヌクレオチドである。
【００８６】
本発明は、修飾された、合成のもしくは天然に存在しないヌクレオチドまたは構造成分、あるいは当該技術分野において知られている代替の／修飾された核酸化学を含む核酸類似体を包含する。このような核酸類似体は、例えば、表２において特定されている遺伝子の１以上を検出するための検出試薬（例えば、プライマー／プローブ）として有用である。さらに、これらの類似体を含むキット／システム（例えば、ビーズ、アレイなど）も本発明によって包含される。例えば、本発明の多型配列に基づくＰＮＡオリゴマーが、特に意図される。ＰＮＡオリゴマーは、ＤＮＡの類似体であり、そこでは、リン酸塩骨格は、ペプチド様骨格と置換される（Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４：１０８１−１０８２［１９９４］，Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６：７９３−７９６［１９９６］，Ｋｕｍａｒら，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３［９］：１２６９−１２７２［２００１］，国際公開第ＷＯ９６／０４０００号）。ＰＮＡは、従来のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体よりも高いアフィニティーおよび特異性で相補的ＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズする。ＰＮＡの特性は、伝統的なオリゴヌクレオチドおよびペプチドを用いては達成不可能な新しい分子生物学および生化学応用を可能にする。
【００８７】
核酸の結合特性および／または安定性を改善する核酸修飾の追加の例には、塩基類似体、例えばイノソン、インターカレート剤（米国特許第４，８３５，２６３号）、例えばエチジウムブロマイドおよびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、副溝結合剤（米国特許第５，８０１，１１５号）の使用を含む。このようにして、核酸分子、発現プロファイリング試薬（例えば、プローブおよびプライマー）、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドへの本明細書中での言及には、ＰＮＡオリゴマーおよび他の核酸類似体が含まれる。核酸類似体、当該技術分野において知られている代替の／修飾された核酸化学の他の例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００２）に記載されている。
【００８８】
各々の対立遺伝子に特異的なプライマーまたはプローブの設計は、標的核酸分子のヌクレオチド配列の正確な組成、プライマーまたはプローブの長さなどの変数に依存するが、プライマーおよびプローブの使用における別の因子は、プローブまたはプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションが実行される条件のストリンジェンシーである。高いストリンジェンシーな条件は、低イオン強度および／または高い反応温度を有するバッファーを利用し、安定な二重鎖を形成するために、プローブ／プライマーと標的配列との間の密接な適合を必要とする傾向がある。しかしながら、ストリンジェンシーが高すぎると、ハイブリダイゼーションは全く起こらない場合もある。対照的に、低いストリンジェンシー条件は、高イオン強度および／または低反応温度を有するバッファーを有し、プローブ／プライマーと標的配列との間のより不適合な塩基を有する安定な二重鎖の形成を許す。一例であって、限定されないが、対立遺伝子に特異的なプローブを用いた高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件のための例示的な条件は下記のとおりである：５×標準的なリン酸生理食塩水ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）、０．５％ ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）を含む溶液を５５℃で用いたプレハイブリダイゼーション、プローブと同溶液中で、同温度の標的核酸分子とのインキュベーション、その後、２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液を５５℃または室温で用いた洗浄。
【００８９】
中程度のストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、例えば、約５０ｍＭ ＫＣｌを含む溶液を約４６℃で用いるプライマー伸長反応に対して使用されてもよい。あるいは、この反応は、６０℃などの高温で実行されてもよい。別の態様では、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドの連結アッセイ（ＯＬＡ）反応に適し、ここで、２つのプローブは、標的配列の完全に相補的である場合に連結され、４６℃の温度で約１００ｍＭ ＫＣｌの溶液を利用してもよい。
【００９０】
ハイブリダイゼーションに基づくアッセイでは、１つの遺伝子配列の標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、他の遺伝子に由来する配列にはハイブリダイズしない特異的なプローブを設計することができる。ハイブリダイゼーション条件は、遺伝子間のハイブリダイゼーション強度、好ましくは本質的に２成分応答において有意に検出可能な相違があるように十分にストリンジェントでなければならない。それによって、プローブは、遺伝子配列のうちのただ１つにハイブリダイズするかまたは１つの遺伝子配列の有意により強力にハイブリダイズする。標的部位がプローブの配列に沿ってどこでも整列されるように、プローブが特定の遺伝子の標的配列にハイブリダイズするように設計されてもよいが、このプローブは、好ましくは、プローブの中心位置（例えば、プローブのいずれかの末端からの少なくとも３ヌクレオチドであるプローブ内の位置）で遺伝子配列が整列されるように標的配列のセグメントにハイブリダイズするように設計される。このプローブの設計は、一般に、異なる遺伝子間のハイブリダイゼーションにおいて良好な区別を達成する。
【００９１】
オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、当該技術分野において周知の方法によって調製されてもよい。化学合成法には、限定されないが、Ｎａｒａｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：９０［１９７９］によって記述されているホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：１０９［１９７９］によって記述されているホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９［１９８１］によって記述されているジエチルホスホアミデート法；米国特許第４，４５８，０６６号に記述されている固体支持法が含まれる。アレイに場合には、複数のプローブは、複数の異なる遺伝子配列の同時分析のための同じ支持体上に固定化されてもよい。
【００９２】
ＰＣＲに基づくアッセイの１タイプでは、遺伝子特異的なプライマーは、遺伝子配列に重複する標的核酸分子上の領域にハイブリダイズし、プライマーが完全な相補性を示す遺伝子配列の増幅をプライムするだけである（Ｇｉｂｂｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：２４２７−２４４８［１９８９］）。典型的には、プライマーの３’最大ヌクレオチドは、標的核酸分子と整列し、相補的となる。このプライマーは、遠位部位をハイブリダイズする第２プライマーとともに用いられる。増幅は、２つのプライマーから開始し、どの遺伝子／転写物が試験試料に存在するかを指示する検出可能な生成物を生成する。このＰＣＲに基づくアッセイは、下記に示されるＴａｑＭａｎアッセイの一部として利用することができる。
【００９３】
本明細書に記載されている１４個の遺伝子サインの遺伝子は、核酸試料に含まれる対象とするポリヌクレオチドのコピー数を増加させるために用いられる、種々の核酸増幅法のうちのいずれか１つによって検出することができる。このような増幅法は、当該技術分野において周知であり、それらには、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，編集，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９９２］）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０［１９８９］；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７［１９８８］）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国特許第５，２７０，１８４号および同第５，４２２，２５２号）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）（米国特許第５，３９９，４９１号）、連結リンカー増幅（ＬＬＡ）（米国特許第６，０２７，９２３号）など、等温増幅法、例えば、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立した配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１８７４［１９９０］）が含まれる。このような方法論に基づいて、当業者は、本明細書に開示されている遺伝子を増幅させるために、対象とする遺伝子配列の任意の適切な領域５’および３’において容易にプライマーを設計することができる。このようなプライマーは、任意の長さのＤＮＡを逆転写し、増幅させるために用いることができ、その結果、その配列に対象とする遺伝子を含む。
【００９４】
一般に、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも１６ヌクレオチドである。より典型的には、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも約２０ヌクレオチドである。本発明の好ましい態様では、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも約３０ヌクレオチドである。本発明のより好ましい態様では、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも約３２、４０、４５、５０、または６０ヌクレオチドである。本発明のなお別の好ましい態様では、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドである。本発明の増幅されたポリヌクレオチドの全長は、エクソン、イントロンまたは全遺伝子と同程度の長さであり得るが、増幅産物は、典型的には、長さにして最大約１，０００ヌクレオチドである（しかし、ある種の増幅方法は、長さにして１，０００ヌクレオチドよりも大きい増幅産物を生じてもよい）。より好ましくは、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして約１５０〜２５０ヌクレオチドよりも大きくはない。
【００９５】
本発明の態様では、本発明の遺伝子発現プロファイリング試薬は、検出可能なシグナルを発光する蛍光レポーター色素を用いて標識される。好ましいレポーター色素は蛍光色素であるが、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーなどの検出試薬に結合することができる任意のレポーター色素は本発明における使用に適している。このような色素には、限定されないが、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｄａｎｓ、Ｅｏｓｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、６−Ｆａｍ、Ｔｅｔ、Ｊｏｅ、Ｈｅｘ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｒｈｏｄｏｌ Ｇｒｅｅｎ、Ｔａｍｒａ、Ｒｏｘ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが含まれる。
【００９６】
本発明のなお別の態様では、検出試薬は、特に、その試薬がＴａｑＭａｎ（米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，５３８，８４８号）などの自己クエンチングプローブ、または分子指標プローブ（米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号）、あるいは他のステムレスまたは線状指標プローブ（Ｌｉｖａｋら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌ．４：３５７−３６２［１９９５］；Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８ ［１９９６］；Ｎａｚａｒｅｎｋｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５１６−２５２１［１９９７］；米国特許第５，８６６，３３６号および同第６，１１７，６３５号）として用いられる場合に、Ｔａｍｒａなどのクエンチャー色素を用いてさらに標識されてもよい。
【００９７】
また、本発明の検出試薬は、他の標識を含んでもよく、限定されないが、ストレプトアビジン結合に対するビオチン、抗体結合に対するハプテン、ジップコードの対などの別の相補性オリゴヌクレオチドへの結合に対するオリゴヌクレオチドが含まれる。
遺伝子発現キットおよびシステム
当業者は、本明細書に開示されている遺伝子および配列情報に基づいて、発現プロファイリング試薬が、個別にまたは組み合わせて本発明のいずれかの遺伝子を評価するために作製され、用いることができ、このような検出試薬が、当該技術分野において周知である確立したキットまたはシステムの１つに容易に組み込むことができることを認識する。用語「キット」および「システム」は、遺伝子発現プロファイリング試薬との関連において本明細書中で使用するとき、複数の遺伝子発現プロファイリング試薬の組み合わせ、または１以上のタイプのエレメントもしくは成分（例えば、他のタイプの生化学試薬、容器、包装、例えば市販用に意図された包装、遺伝子プロファイリング試薬が結合する基材、電子機器コンポーネントなど）と組み合わせた１以上の遺伝子発現プロファイリング試薬などのようなものを指すことが意図される。したがって、本発明は、さらに、遺伝子発現プロファイリングキットおよびシステムを提供し、限定されないが、パッケージ化されたプローブおよびプライマーセット（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ／プライマーセット）、核酸分子のアレイ／マイクロアレイ、１以上のプローブ、プライマー、または本発明の１以上の遺伝子をプロファイルするための他の検出試薬が挙げられる。キット／システムは、場合により、種々の電子機器コンポーネントを含むことができる；例えば、種々の製造業者から提供されるアレイ（「ＤＮＡチップ」）および微小流体システム（「ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ」システム）は電子機器コンポーネントを含む。他のキット／システム（例えば、プローブ／プライマーセット）は、電子機器コンポーネントを含まなくてもよいが、例えば、１以上の容器に包装された１以上の遺伝子発現プロファイリング試薬（並びに、場合により、他の生化学試薬）から構成されてもよい。
【００９８】
ある態様では、遺伝子発現プロファイリングキットは、典型的には、１以上の検出試薬、並びに、遺伝子を含む核酸分子の逆転写、増幅および／または検出などのアッセイまたは反応を行うために必要な他の成分（例えば、バッファー、酵素、例えば逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼ、逆転写および鎖伸長ヌクレオチド、例えばデオキシヌクレオチド三リン酸、サンガータイプのＤＮＡシークエンシング反応の場合には、連鎖停止ヌクレオチド、陽性対照配列、陰性対照配列など）を含む。さらに、キットは、標的核酸の量を測定するための手段、その量と標準とを比較するための手段を含み、対象とする遺伝子を含む核酸分子を検出するキットを用いるための指示書を含むことができる。本発明の一態様では、本明細書に開示されている１以上の遺伝子の発現をプロフィールする１以上のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。本発明の好ましい態様では、遺伝子発現プロファイリングキット／システムは、核酸アレイ、または区分化されたキットの形態であり、微小流体／ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステムが含まれる。
【００９９】
遺伝子発現プロファイリングキット／システムは、例えば、各々の標的遺伝子配列の位置でまたはその近傍で核酸分子にハイブリダイズする１以上のプローブ、またはプローブ対を含んでもよい。遺伝子特異的なプローブの複数の対は、大多数の遺伝子を同時に評価するキット／システムに含むことができ、それらの遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子は、本発明の遺伝子である。あるキット／システムでは、遺伝子特異的なプローブは、アレイまたはビーズなどの基材に固定されている。例えば、同基材は、表２に示されている遺伝子の少なくとも１つもしくは実質的に全部の遺伝子、またはその中間の任意の他の数において検出するための遺伝子特異的なプローブを含むことができる。
【０１００】
用語「アレイ」、「マイクロアレイ」、および「ＤＮＡチップ」は、本明細書において、基材（例えば、ガラス、プラスチック、紙、ナイロンまたは他のタイプのメンブレン、フィルタ−、チップ、もしくは他の適切な固体支持体）に付された別個のポリヌクレオチド群のアレイを指すように互換可能に使用されている。ポリヌクレオチドは、上記基材上で直接合成されるか、または基材とは別個に合成された後、その基材に付されてもよい。一態様では、マイクロアレイは、米国特許第５，８３７，８３２号（Ｃｈｅｅら）、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９５／１１９９５号（Ｃｈｅｅら）、Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５〜１６８０［１９９６］）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０６１４〜１０６１９［１９９６］）に記載される方法に従って、調製され、使用される。これらの文献の全ては、全体として参照により本明細書に援用される。他の態様では、このようなアレイは、Ｂｒｏｗｎら、米国特許第５，８０７，５２２号により記載される方法により生成される。
【０１０１】
核酸アレイは、下記の参考文献に概説されている：Ｚａｍｍａｔｔｅｏら，“Ｎｅｗ ｃｈｉｐｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．８：８５−１０１（２００２）；Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら，“Ａｃｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｇｅｎｅｔ．１２（４）：１８１−９２（Ｄｅｃ．２００２）；Ｈｅｌｌｅｒ，“ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｄｅｖｉｃｅｓ，ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．４：１２９−５３（２００２）；Ｅｐｕｂ Ｍａｒ．２２ ２００２；Ｋｏｌｃｈｉｎｓｋｙら，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳＮＰｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｇｅｌ−ｂａｓｅｄ ｃｈｉｐｓ，”Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９（４）：３４３−６０（Ａｐｒ．２００２）；ＭｃＧａｌｌら，“Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｅｎｅｃｈｉｐ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ ａｒｒａｙｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２１−４２（２００２）。
【０１０２】
任意数のプローブ、例えば遺伝子特異的プローブは、アレイにおいて実施されてもよく、各プローブまたはプローブ対は、異なる遺伝子配列位置にハイブリダイズすることができる。ポリヌクレオチドプローブの場合、それらは、光指向性化学プロセスを用いて、基材上の指定領域で合成することができる（または、別個に合成された後、指定領域に付することができる）。各ＤＮＡチップは、格子様パタ−ンで整列され（例えば、１０セント硬貨の大きさに）小型化された、例えば、数千から数億個の個々の合成ポリヌクレオチドプローブを含むことができる。好ましくは、プローブは、順序立ったアドレス指定可能なアレイで固体支持体に付される。
【０１０３】
マイクロアレイは、固体支持体に固定された多数の独特の一本鎖ポリヌクレオチド、通常、合成アンチセンスポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡフラグメントのいずれかから構成され得る。典型的なポリヌクレオチドは、好ましくは長さにして約６〜６０ヌクレオチド、より好ましくは長さにして約１５〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは長さにして約１８〜２５ヌクレオチドである。ある種のタイプのマイクロアレイまたは他の検出キット／システムに関しては、長さにしてほんの約７〜２０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい場合がある。他のタイプのアレイ、例えば化学発光検出技術と組み合わせて使用されるアレイにおいて、好ましいプローブの長さは、例えば、長さにして約１５〜８０ヌクレオチド、好ましくは長さにして約５０〜７０ヌクレオチド、より好ましくは長さにして約５５〜６５ヌクレオチド、最も好ましくは長さにして約６０ヌクレオチドであってもよい。このマイクロアレイまたは検出キットは、遺伝子／転写物の既知の５’配列または３’配列を網羅するポリヌクレオチド、遺伝子／転写物の全長配列を網羅する連続するポリヌクレオチド；または標的遺伝子／転写物配列の長さに沿った特定の領域、特に、表２に開示されている１以上の遺伝子に対応する領域から選択される独特のポリヌクレオチドを含むことができる。このマイクロアレイまたは検出キットにおいて用いられるポリヌクレオチドは、対象とする遺伝子または複数の遺伝子に対して特異的（例えば、標的遺伝子配列内の特定のサイン配列に対して特異的、または複数の異なる配列部位にある特定の遺伝子配列に対して特異的）であり得るか、あるいは対象とする多型遺伝子／転写物または複数の遺伝子／複数の転写物に対して特異的であり得る。
【０１０４】
ポリヌクレオチドアレイに基づくハイブリダイゼ−ションアッセイは、完全一致した標的配列およびミスマッチした標的配列に対するプローブのハイブリダイゼ−ション安定性の差異に依存する。
【０１０５】
他の態様では、アッセイは、化学発光検出技術と組み合わせて用いられる。下記の特許および特許出願は、その全てが全体として参照により本明細書中に援用され、化学発光検出に関するさらなる情報を提供する：米国特許出願第１０／６２０３３２号および同第１０／６２０３３３号は、マイクロアレイ検出のための化学発光アプローチを記載し；米国特許第６１２４４７８号、同第６１０７０２４号、同第５９９４０７３号、同第５９８１７６８号、同第５８７１９３８号、同第５８４３６８１号、同第５８００９９９号、および同第５７７３６２８号は、化学発光検出を実施するための方法およびジオキセタンの組成物を記載し；米国出願公開第ＵＳ２００２／０１１０８２８号は、マイクロアレイコントロールのための方法および組成物を開示する。
【０１０６】
本発明の一態様では、核酸アレイは、長さにして約１５〜２５ヌクレオチドのプローブのアレイを含むことができる。さらなる態様では、核酸アレイは、任意数のプローブを含むことができ、ここで、少なくとも１つのプローブは、表２に開示されている１以上の遺伝子を検出することができ、および／または少なくとも１つのプローブは、表２に開示されている配列からなる群より選択される遺伝子配列、並びにそれに相補的な配列のうちの１つのフラグメントを含み、そのフラグメントは、少なくとも約８個の連続するヌクレオチド、好ましくは、１０個、１２個、１５個、１６個、１８個、２０個、より好ましくは２２個、２５個、３０個、４０個、４７個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、８０個、９０個、１００個（またはその中間の他の任意の個数）以上連続するヌクレオチド、表２に開示されている遺伝子の配列（またはそれに相補的である）を含む。ある態様では、この遺伝子部位に対して相補的なヌクレオチドは、上記プローブの中心から５、４、３、２、または１ヌクレオチド内、より好ましくはそのプローブの中心にある。
【０１０７】
ポリヌクレオチドプローブは、全体として参照により本明細書中に援用されるＰＣＴ国際出願第ＷＯ９５／２５１１１６号（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら）に記載されるように、化学カップリング手順およびインクジェット適用装置を用いることによって、基材表面上で合成され得る。別の局面では、ドット（またはスロット）ブロットと類似する「格子状」アレイが、真空系、熱的結合手順、ＵＶ結合手順、機械的結合手順、または化学結合手順を用いて、基材表面にｃＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを整列させて結合するために使用され得る。アレイ、例えば、上記のアレイは、手動によって、あるいは利用可能なデバイス（スロットブロット装置またはドットブロット装置）、材料（適切な任意の固体支持体）、および機器（ロボット機器を含む）を用いることによって生成することができ、８個、２４個、９６個、３８４個、１５３６個、６１４４個以上のポリヌクレオチド、または市販の機器の効率的使用のために適する他の任意の数のポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０１０８】
このようなアレイまたは他のキット／システムを用いて、本発明は、試験試料中に含まれる本明細書に開示されている遺伝子を同定し、その発現をプロファイリングするための方法を提供する。このような方法は、典型的には、核酸の試験試料を、本発明の少なくとも１つの遺伝子配列の位置に対応する１以上のプローブを含むアレイとともにインキュベートすること、並びにこの試験試料由来の核酸とプローブの１以上との結合について評価することを伴う。遺伝子発現プロファイリング試薬（またはこのような１以上の遺伝子発現プロファイリング試薬を用いるキット／システム）を試験試料とともにインキュベートする条件は変化する。このインキュベーション条件は、アッセイにおいて用いられるフォーマット、用いられるプロファイリング方法、並びにアッセイにおいて用いられるプロファイリング試薬のタイプおよび性質などの因子に依存する。当業者は、市販のハイブリダイゼーション、増幅およびアレイアッセイフォーマットのうちのいずれか１つが、本明細書に開示されている遺伝子を検出するために容易に適合され得ることを認識する。
【０１０９】
本発明の遺伝子発現プロファイリングキット／システムは、試験試料から核酸を調製し、その後、逆転写、ＲＮＡ濃縮、遺伝子配列を含む核酸分子の増幅および／または検出のために用いられる成分を含んでもよい。このような試料調製成分は、いずれかの腫瘍組織供給源、例えば、限定されないが、新鮮な腫瘍生検、凍結もしくはホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）の組織標本、またはいずれかの方法によって回収および保存された腫瘍由来の核酸抽出物（ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を生成するために用いることができる。上述される方法において用いられる試験試料は、アッセイフォーマット、プロファイリング方法の性質、アッセイされるべき試験試料として用いられる特定の組織、細胞または抽出物などの因子に基づいて変更する。核酸を調製する方法は、当該技術分野において周知であり、利用されるシステムと適合可能な試料を得るために容易に適用され得る。試験試料から核酸を抽出するための自動化された試料調製システムは市販され、例えば、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ ＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００，Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＲＩＳＭ ６７００、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳｙｓｔｅｍｓのＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。
【０１１０】
本発明によって意図されるキットの別の形態は、区分化されたキットである。区分化されたキットには、試薬が別々の容器に含められているいずれかのキットが含まれる。このような容器には、例えば、小さなガラス容器、プラスチック容器、プラスチック、ガラスもしくはペーパーのストリップ、またはシリカなどのアレイ用材料が含まれる。このような容器は、試験試料および試薬が二次汚染しないように１つの区分から別の区分に、あるいは１つの容器からキットに含まれない別の入れ物に、試薬を効率的に移すことができる。このような容器には、例えば、試験試料を受け入れる１以上の容器、本発明の１以上の遺伝子の発現をプロファイリングするための少なくとも１つのプローブまたは他の遺伝子発現プロファイリング試薬を含む１以上の容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓバッファーなど）を含む１以上の容器、結合したプローブまたは他の遺伝子発現プロファイリング試薬の存在を示すために用いられる試薬を含む１以上の容器が含まれてもよい。このキットは、場合により、さらに、区分および／または試薬、例えば、逆転写、ＲＮＡ濃縮、核酸増幅または他の酵素反応、例えばプライマー伸長反応、ハイブリダイゼーション、連結、電気泳動（好ましくはキャピラリー電気泳動）、質量分析、および／またはレーザー誘導の蛍光検出のための試薬を含む。また、キットは、そのキットを用いるための指示書を含んでもよい。例示的な区分化されたキットは、当該技術分野において知られている微小流体デバイスを含む（例えば、Ｗｅｉｇｌら，“Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２４，５５［３］：３４９−７７［２００３年２月］を参照されたい）。このような微小流体デバイスでは、容器は、例えば、微小流体「区分」、「チャンバー」、または「チャネル」とも呼ばれる場合がある。
遺伝子発現プロファイリング試薬の使用
本発明の表３に示される核酸分子は、特に、乳癌転移の予後における種々の用途を有する。例えば、核酸分子は、増幅プライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、転写ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、増幅されたＤＮＡまたは他の核酸分子を用いた発現プロファイリングのために、並びに、表２に開示されている遺伝子およびそれらの相同体をコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために有用である。
【０１１１】
プローブは、核酸分子の全長に沿って、いずれかのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。好ましくは、本発明のプローブは、表２に指示されている遺伝子の遺伝子配列を包含する標的配列の領域にハイブリダイズする。より好ましくは、プローブは、配列特異的な方法で、遺伝子を含む標的配列にハイブリダイズし、その結果、標的配列と、標的配列とは異なる他のヌクレオチド配列とを区別する。このようなプローブは、試験試料に含まれる遺伝子を含む核酸の存在の検出に特に有用である。
【０１１２】
このようにして、本発明の核酸分子は、本明細書に開示されている遺伝子の発現レベルを検出およびプロファイリングするために、ハイブリダイゼーションプローブ、逆転写および／または増幅プライマーとしても用いることができ、それにより、乳癌およびその発現プロファイリングを有する個体は遠隔転移に対するリスクにあることを決定する。開示されている発現プロファイリングは、遠隔転移に対する予後ツールを提供する。
転移スコアの作成
表２に開示されている１４個の遺伝子の発現レベルは、転移リスクを予測する転移スコア（ＭＳ）を誘導するために用いることができる。発現レベルは、Δ（ΔＣｔ）法によって計算されてもよく、ここで、Ｃｔは、標的増幅のための閾値サイクル；即ち、標的の時間の指数関数的な増幅が始まるＰＣＲにおけるサイクル数である。（ＫＪ Ｌｉｖａｋ ａｎｄ ＴＤ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４０２−４０８）。１４個のプロファイルされた遺伝子の各々のｍＲＮＡのレベルは、
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＧｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
として定義されてもよく、ここで、ＧＯＩは対象とする遺伝子（１４個のサイン遺伝子の各々）であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者試料から得られたＲＮＡであり、ｒｅｆＲＮＡは校正参照ＲＮＡであり、ＥＣは内在性対照である。各サイン遺伝子の発現レベルは、初めに、表２（ＥＣ）に列挙されている３個の内在性対照遺伝子に標準化されてもよい。３個の内在性対照（ＣｔＥＣ）の増幅から得られた、Ｃｔ（複数）の平均のＣｔを用いて、ただ１つの対照遺伝子が用いられる場合に発生する標準化バイアスのリスクを最小化することができる。（Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，ＰＪ Ｈｉｇｇｉｎｓら，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：３３２−３３７）。内在性対照遺伝子を増幅するために選択的に用いられてもよいプライマーを表３に列挙している；しかし、これらの内在性対照を増幅することができるプライマーは、これらの開示されたオリゴヌクレオチドに限定されない。対象とする遺伝子の調整された発現レベルは、校正参照ＲＮＡプール、ｒｅｆＲＮＡ（ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）にさらに標準化されてもよい。これは、種々の機械から得られた発現結果を標準化するために用いられてもよい。
Δ（ΔＣｔ）値は、１４個のサイン遺伝子の各々についての遺伝子発現プロファイリングにおいて得られ、転移スコア（ＭＳ）を作成するための下記の式：
【０１１３】
【数４】
（式中、Ｇｉは１４個の遺伝子予後サインの各遺伝子（ｉ）の発現レベルを表す）
に用いられてもよい。Ｇｉの値は、上述される発現プロファイリングにおいて得られるΔ（ΔＣｔ）である。各遺伝子ｉについての定数ａｉは、表２に与えられている。定数ａ０は０．０２２である；これは、ＭＳを中心にし、それにより、その中央値はゼロとなる。Ｍは、成分リストにおける遺伝子数である；この場合は１４である。このようにして、ＭＳは、表２に開示されている１４個の遺伝子についての発現レベルの総和の測定であり、各々は、表２にもある特定の定数ａｉによって乗じられ、最終的には、この総和は、ＭＳを誘導するために中心の定数０．０２２に加えられる。
【０１１４】
あるいは、Δ（ΔＣｔ）値は、１４個のサイン遺伝子の各々についての遺伝子発現プロファイリングにおいて得られ、転移スコア（ＭＳ）を作成するための下記の式：
【０１１５】
【数５】
（式中、Ｇｉは１４個の遺伝子予後サインの各遺伝子の標準化された発現レベルを表す）
に用いられてもよい。Ｇｉの値は、上述される発現プロファイリングにおいて得られるΔ（ΔＣｔ）において測定される元々の発現レベルから平均の遺伝子発現を差し引き、次に、トレーニングセットにおける遺伝子発現の標準偏差によって割ることにより得られる。各遺伝子ｉに対する定数ａｉは、表２に与えられている。定数ｂは、−０．２５１であった。正しいサインおよびスケーリングを得るには、予測材料として主成分を用いて一変量Ｃｏｘモデルからであった。定数α０は０．０２２である；これは、ＭＳを中心にし、それにより、その中央値はゼロとなる。Ｍは、成分リストにある遺伝子数である；この場合は１４である。このようにして、ＭＳは、表２に開示されている１４個の遺伝子についての発現レベルの総和の測定であり、各々は、表２にも示されている特定の定数ａｉによって乗じられる。この総和は、定数ｂによって乗じられ、次に、中心定数０．０２２は、ＭＳを誘導するために加えられる。
【０１１６】
いずれかの新しい試料は、その患者に関する１４個の遺伝子発現プロファイリングデータからこの転移スコアを作成することによって評価されてもよく、このスコアから、患者についての遠隔転移の可能性を測定することができる。
【０１１７】
ＭＳスコアは、上述されるΔ（ΔＣｔ）の値の和を単純化することができ、この場合、ＭＳの式は、α０の値をゼロで置換することによって単純化され、定数ａｉは１であることに留意されたい。
【０１１８】
また、ＭＳは、上述されるΔ（ΔＣｔ）の値の和を単純化し、次に、正しいサインおよびスケーリングについて定数−０．０４７７８によって乗じられ、それにより、遠隔転移リスクは、ＭＳの増加とともに増えることに留意されたい。最後に、定数０．８６５７は、ＭＳがゼロになるように添加される。この代替の方法において誘導されるＭＳスコアは、１４個全ての遺伝子の等しい計量を有する。遠隔転移のリスクは、ＭＳが増加するにつれて増える。本明細書に記載されている２つの異なるＭＳスコアは、非常に高い相関を有し、ピアソン相関係数は０．９９９より大きい。
ＭＳからの遠隔転移可能性の作成
いずれかの個体の患者に関する遠隔転移の可能性は、基礎生存関数としてＷｅｉｂｕｌｌ分布を用いて、変更可能な時間点でＭＳから計算され得る。
【０１１９】
１４個の遺伝子サインの発現プロファイリングから、上記で得られた転移スコア（ＭＳ）は、Ｃｏｘ比例ハザードモデルによって遠隔転移の可能性に転換された。Ｃｏｘモデルは、基準のハザード機能を特定しないため、ハザードおよび生存機能は、初めに、パラメトリック抑制モデルを通じて構築された。パラメトリックな抑制モデルにおいて、遠隔転移なしの生存時間は結果であり、転移スコア（ＭＳ）は独立した可変インプットであった。イベント時間は、Ｗｅｉｂｕｌｌ分布を有するように想定された；その２つのパラメータは、ＭＳが誘導される生存データを用いて推定された。患者についてある種の時間内に遠隔転移の可能性を計算するために、ＭＳ値は、単に、生存機能についてその式に置換される。
リスク測定におけるＭＳスコアの臨床応用
転移に関するリスクの測定にＭＳスコアを用いるという１つの方法は、ＭＳ「カットポイント」としても知られている１以上のＭＳ閾値を作成することである。このようなＭＳ閾値は、このような患者が増加したリスクまたは減少したリスクのいずれかを有するかを決定するために、乳癌患者のＭＳスコアと比較した場合に、基準として用いることができる。ＭＳ閾値は、異なる方法によって測定することができ、転移スコアの異なる定義によって異なっている。実施例１、２および３で用いられる等式１において定義されているＭＳに関して、ＭＳ閾値は、高リスク群対低リスク群のハザード率から決定された。遠隔転移なしの生存についてのカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線は、ＭＳカットポイントによって特定された高および低リスクの患者群について作成される。カットポイントとしての中央値ＭＳの選択は、ＭＳの１０パーセンタイルからＭＳの９０パーセンタイルの異なるカットポイントを用いた、高リスク群対低リスク群のハザード率の計算に基づいている。中央値のカットポイントは、高および低リスク群において等しい数の個体が存在する場合に、カットポイントとして特定することができ、実施例１に記載されるトレーニング試料において最大に近いハザード率を生み出すことが見出される。中央値ＭＳのカットポイントを用いたハザード率（ＨＲ）および９５％の信頼区間が計算され、報告され得る。ログランク（ｌｏｇ ｒａｎｋ）試験が行われ、ハザード率は、異なるカットポイントについて計算される。５年での遠隔転移の予測における１４個の遺伝子サインの精度および値は、種々の手段によって評価することができる。（ＸＨ Ｚｈｏｕ，Ｎ．Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，編集，２００２，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。実施例４および５で用いられる等式２において定義されているＭＳに関して、ＭＳ閾値は、実施例２に記載されているガイ病院からの試料における５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳの感受性および特異性から決定される。２つのカットポイントは、５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳの感受性が、第１のカットポイントが用いられると９０％を超えるように選択される。第２のカットポイントは、５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳの感受性および特異性がともに７０％であるように選択される。等式２において定義されているＭＳに関して、第１のＭＳ閾値は−０．１１８６であり、第２のＭＳ閾値は０．３０１９である。２つのＭＳカットポイントを用いた場合、高、中、および低ＭＳ群がある。ガイ病院からの処置された試料、日本の愛知県がんセンターからの試料では、高ＭＳ群は、高リスク群として設計され、中および低ＭＳ群は低リスク群として設計される。
【実施例】
【０１２０】
下記の実施例は、例証するために提供され、請求される発明を限定するものではない。
（実施例１）
１４個の遺伝子予後サインのｍＲＮＡ発現レベルが１４２人のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌患者の遠隔転移に対するリスクを予測する
下記の実施例は、１４個の遺伝子予後サインがどのようにして同定され、日常的な臨床検査室試験においてでさえ、乳癌患者の遠隔転移に関する予後の決定にどのように用いることができるかを例証する。臨床医は、生検、ＦＦＰＥ、凍結組織などの多くの手段から得られたＲＮＡを用いて、本明細書に開示されている１４個の遺伝子に基づくｍＲＮＡ発現プロファイリングを行い、次に、予後転移スコアを測定するために本明細書に与えられたアルゴリズムに発現データを挿入することができる。
【０１２１】
リンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌患者から得られたＦＦＰＥ組織は、後述される実施例に用いられた。初期セットの２００個の遺伝子を分析して、最終の１４個の遺伝子サインを誘導した。文献で以前に報告された遺伝子は、このサインのための候補遺伝子として含められた。また、本実施例では、このサインと、日常的に使用されている予後因子およびツールとの重複の程度を測定した。
【０１２２】
リンパ節転移陰性のＥＲ陽性患者からの腫瘍は、この試験のために選択され、それは、リンパ節転移陰性患者に関する予後情報が処置戦略の指標に非常に価値があるからである。また、マイクロアレイ研究は、この腫瘍のサブセットが他のタイプの乳癌腫瘍と臨床的に区別されることを指示する。（Ｔ．Ｓｏｒｌｉｅ，ＣＭ Ｐｅｒｏｕら，２００１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：１０８６９−１０８７４；Ｃ．Ｓｏｔｉｒｉｏｕ，ＳＹ Ｎｅｏら，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：１０３９３−１０３９８）。ＦＦＰＥ切片において、Ｈ．Ｄａｉ（Ｈ．Ｄａｉ，ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６）、ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ（ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｈ．Ｄａｉら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−５３６）、ＳＰ Ｐａｉｋ（ＳＰ Ｐａｉｋ，Ｓ．Ｓｈａｋら，２００４，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５１：２８１７−２８２６）によって報告された遺伝子サインからの発現プロファイリングのために遺伝子が選択され、これらの遺伝子の構造安定性、並びに日常的に回収され、保存された臨床試料が転移の予後に用いられ得る程度を測定した。遺伝子発現データから、転移スコアを作製して、いずれかの期間、個々の患者における遠隔転移の可能性を推測した。
患者および試料
初期段階の乳癌を有する、合計１４２人のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性患者が選択され、全ては、全身性アジュバント療法で処置されていない患者由来であった（表１のトレーニング試料）。この研究を乳癌症例のサブセットに限定することによって、分子サインは、転移とのより説得力のある関連性を伴って同定され、異なる試料セット全体でより堅固であり、日常的な臨床実施への転換を良好に促進するように少量の遺伝子を含んでいる。患者の平均年齢は、約６２歳である（３１〜８９歳の範囲）。
【０１２３】
非常に特徴付けられた乳房腫瘍試料セットが本研究のための試料の供給源として役割を果たした；このセットは、カリフォルニア パシフィック メディカルセンター（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＰＭＣ）で１９７５から１９８６年まで生じた。初期の研究のための試験対象患者基準は、リンパ節転移陰性であり、全身療法を受けておらず、８年間フォローアップケアを受けた患者由来の腫瘍からの試料を含んでいた。
【０１２４】
各機関の医療倫理委員会によって、本研究における使用のための試料が承認された。試料を提供する患者は、ＥＳＲ１遺伝子の発現レベルの測定に基づいて、ＥＲ陽性として分類された。ＥＳＲ１遺伝子の発現レベルは、個体のＥＲ状態とよく相関する。（Ｍ．Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｐｈｏら，２００４，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４（１）：３５−４２；ＪＭ Ｋｎｏｗｌｄｅｎ，ＪＭ Ｇｅｅら，１９９７，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３：２１６５−２１７２）。
【０１２５】
遠隔転移のない生存が、癌に関連した死亡に最も直接的に連結されるため、一次評価項目として選択された。二次評価項目は、全生存であった。
試料加工
各々のパラフィンブロックから４つの１０μｍ切片をＲＮＡ抽出のために用いた。腫瘍領域は、ガイドスライドに基づいて取り出し、そこでは、癌の細胞領域は、病理学者によって標識され、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ Ｓｌｉｄｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ ＣＡ）を用いてＲＮＡを抽出した。
【０１２６】
トータルＲＮＡの収量は試料間で変化した。分析に利用可能なＲＮＡ量を増やすために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ線状増幅が、抽出されたＲＮＡに対して行われた。ＦＦＰＥ試料から単離されたＲＮＡは、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐＩＩ ａＲＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）を用いて、Ｔ７に基づくＲＮＡ増幅に供した。
【０１２７】
ＲＮＡ増幅の前後で、遺伝子発現の一貫性を評価するために、多数の実験が、異なる試料に含まれる種々の遺伝子に対して行われた。初めに、０．１〜１００ｎｇのトータルＲＮＡを用いて、本研究の一部ではない６７個のＦＦＰＥ試料由来のＲＮＡに対して増幅を行った。２０個の遺伝子のプロファイリングは、得られた濃縮ＲＮＡおよび元々の濃縮されていないＲＮＡを用いて行われた。これらの比較は、倍数濃縮が遺伝子間で変換することを示した；しかしながら、相対的な発現レベルは、６７個の試料のうち２０個全ての遺伝子において、ＲＮＡ増幅の前後で一貫していた。
【０１２８】
本研究のためのＲＮＡは、上述したように、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐＩＩ ａＲＮＡ増幅キットを用いた増幅によって濃縮された。トータルＲＮＡは、分光光度測定（ＯＤ２６０）を用いて定量された。
遺伝子発現プロファイリング
既刊文献の調査およびマイクロアレイに基づく遺伝子発現プロファイリング実験の結果に基づいて、最適な予後サインを決定するために、最初に、２００個の候補遺伝子が分析用に選択された。このセットは、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら（ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｈ．Ｄａｉら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−５３６）によって記載された７０個の遺伝子の予後パネル、Ｄａｉら（Ｈ．Ｄａｉ，ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６）によって分析された１０４個の遺伝子、Ｐａｉｋら（ＳＰ Ｐａｉｋ，Ｓ．Ｓｈａｋら，２００４，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５１：２８１７−２８２６）によって報告されたタモキシフェン処置に対する応答のためのサインを含む１６個の遺伝子のパネル、Ｗｅｓｔら（Ｍ．Ｗｅｓｔ，Ｃ．Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅら，２００１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：１１４６２−１１４６７）によって報告された２４個のＥＲ関連遺伝子由来の遺伝子を含んでいた。
【０１２９】
Ｊ．Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ，Ｋ．Ｄｅ Ｐｒｅｔｅｒら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ３（７）：Ｒｅｓｅａｒｃｈ ００３４．１−００３４．１１（Ｅｐｕｂ ２００２）に記載されている方法に従って、発現データを標準化するために内在性対照（ＥＣ）として、追加の遺伝子が選択された。また、内在性対照は、本明細書では「ハウスキーピング遺伝子」とも呼ばれる。６個の内在性対照遺伝子は、凍結された乳癌腫瘍の１５０個の試料におけるそれらの発現レベルの安定性について試験された。ＶａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅらのｇｅＮｏｒｍプログラムを用いて発現データを分析し、この場合、Ｍ値は、遺伝子発現レベルの安定性の測定として決定される。（Ｊ．Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ，Ｋ．Ｄｅ Ｐｒｅｔｅｒら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ３（７）：Ｒｅｓｅａｒｃｈ ００３４．１−００３４．１１，Ｅｐｕｂ ２００２）。Ｍ値が低くなると、遺伝子はより安定になる。結果を表７に示す。Ｍ値は、ＰＰＩＧ、ＳＬＵ７およびＮＵＰ２１４がこの試料セットにおいて最も安定な内在性対照であることを指示し、試験された試料全体で遺伝子発現の変化が最も小さかった。これらの３つの遺伝子の安定性は、１３８個の乳癌腫瘍ＦＦＰＥ試料で有効であった。結果を表８に示す。
【０１３０】
選択された２００個の遺伝子、並びに３つのＥＣ遺伝子の発現レベルは、１４２個のＲＮＡ試料においてプロファイルされた。遺伝子発現プロファイリングに関して、１工程の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて相対的な定量化を行った。標的遺伝子の発現が参照の安定に発現される対照遺伝子のセットの発現と比較して評価される点で、定量化は「相対的」であった。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎのインターカレーティング色素（Ｓｔｒａｇａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて、リアルタイムＰＣＲ中に増幅産物を視覚化した。要約すると、反応ミックスは、抽出された試料ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することを可能にした。次に、このｃＤＮＡは、後述する循環パラメータに従って、同じ反応管においてＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ条件は、表３に開示されている上流および下流のプライマーが、対象とする遺伝子の標的配列のそれぞれ５’および３’にハイブリダイズするのを可能にするように設計され、その後、これらのプライマーから伸長させ、ハイブリダイゼーションと伸長のサイクルを繰り返して、増幅産物を作製する。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎの存在下でＰＣＲを行った。この色素は、二本鎖ＤＮＡにインターカレートし、増幅産物を視覚できるようにする。ＲＴ−ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で行い、生成物の間接的な測定として、インターカレートしたＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎの量を用いて、ＰＣＲを通じて周期的なサイクルで存在する増幅産物の量を検出した。（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎの蛍光強度はＤＮＡに結合すると１００倍を超えて増大する。）ＰＣＲプライマーは、各遺伝子の全て知られているスプライス変異体を増幅するように設計され、その結果、全てのＰＣＲ生成物の大きさは、長さにして１５０塩基対より短くなり、分解して相対的に短い長さのＲＮＡがＦＦＰＥ試料に見出されるように期待される。本明細書に記載されている分子サインにおける１４個の遺伝子、並びに３個の内在性対照遺伝子の増幅に用いられるプライマーは、表３に列挙されている。ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、２点測定で、３８４ウェル増幅プレートで行った。各ウェルは、１５μｌの反応ミックスを含んでいた。サイクルプロフィールは、５０℃で２分、９５℃で１分、６０℃で３０分、その後、９５℃で１５秒と６０℃で３０秒を４５サイクルからなり、増幅産物の解離分析で終了する。ＰＣＲ成分は、本質的には、Ｌ．Ｒｏｇｇｅ，Ｅ．Ｂｉａｎｃｈｉら，２０００，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２５：９６−１０１に記載されているとおりであった。
【０１３１】
遺伝子発現の相対的変化は、定量的ＰＣＲによって測定された。発現レベルは、Δ（ΔＣｔ）法によって計算され、ここで、Ｃｔは標的増幅に対する閾値サイクルであり；即ち、標的の時間の指数関数的増幅が開始するＰＣＲのサイクル数である。（ＫＪ Ｌｉｖａｋ ａｎｄ ＴＤ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４０２−４０８）。対象とする遺伝子のｍＲＮＡの相対レベルは、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
（式中、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ｔｅｓｔＲＮＡは試料ＲＮＡであり、ｒｅｆＲＮＡは校正参照ＲＮＡであり、ＥＣは内在性対照である）
のように特定された。対象とする遺伝子ごとの発現レベルは、初めに、３つの内在性対照遺伝子に標準化された。３つの内在性対照（ＣｔＥＣ）の平均を表すＣｔを用いて、たった１つの対照遺伝子が用いられた場合に生じるであろう標準化バイアスのリスクを最小限にする。（Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，ＰＪ Ｈｉｇｇｉｎｓら，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：３３２−３３７）。内在性対照を増幅するために用いられるプライマーは、表３に列挙されている。対象とする遺伝子の調整された発現レベルは、さらに、校正参照ＲＮＡプール、ｒｅｆＲＮＡ（ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆ．）に対して標準化された。これは、種々の機器から得られる発現結果を標準化するために用いられた。２００個の遺伝子の発現プロファイリング実験で得られたΔ（ΔＣｔ）値は、後述する統計学的分析に用いられ、本発明の１４個の遺伝子予後サインを決定した。
１４個の遺伝子サインの決定
元々の２００個の遺伝子の発現プロファイリングからのデータ（即ち、上記で得られたΔ（ΔＣｔ）値）を用いて、遠隔転移に対する生存時間を測定するための半教師あり主成分（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：ＳＰＣ）が、予後サインを含む遺伝子のリストを生じさせるために用いられた。（Ｅ．Ｂａｉｒ ａｎｄ Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，２００４，ＰｌｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：０５１１−０５２２）。ＳＰＣ計算は、Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，ＴＪ Ｈａｓｔｉｅら，２００２，ＰＮＡＳ ９９：６５６７−６７４２の方法に従って、Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ ａｔ Ｓｔａｎｄｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｃａｌｉｆ．の研究室を経由したオンラインで利用可能であるＰＡＭアプリケーションを用いて行われた。
【０１３２】
初めに、一変量のＣｏｘ比例ハザードモデルを用いて、遠隔転移との遺伝子の関連性に従って、遺伝子をランク付けした。Ｐ値＜０．０５であるそれらの遺伝子が有意であると考えられた。Ｃｏｘスコアのいずれかの切断に関して、ＳＰＣは、最適な閾値に到達した遺伝子の成分（即ち、主成分）を計算した：ＳＰＣは、最適な閾値を選択するためのＣｏｘモデル（単一変数としての主成分を有する）と併せて内部の相互検証を用いた。正しいサインおよびスケーリングを決定するために、ＳＰＣによって得られた第一の主成分遺伝子リストが重要であり、一変量のＣｏｘモデルにおける予測材料として用いられた。
【０１３３】
ＳＰＣによって生成される主成分遺伝子リストは、さらに、Ｌａｓｓｏ抑制法によって減らした。（Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，１９９６，Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃ Ｂ，５８：２６７−２８８）。Ｌａｓｓｏ抑制は、ＬＡＲＳアルゴリズムを用いて行われた。（Ｂ．Ｅｆｒｏｎ，Ｔ．Ｈａｓｔｉｅら，２００４，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ３２：４０７−４９９；Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら，編集，２００２，Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ＬＡＲＳアルゴリズムに用いられた結果変数は、ＳＰＣによって選択された主成分であった。Ｌａｓｓｏ法は、予め特定された精度を用いて、このスコアを再生することができる遺伝子のサブセットを選択した。
転移スコア
転移スコア（ＭＳ）は下記の形式：
【０１３４】
【数６】
を有する。Ｇｉは、１４個の遺伝子予後サインの各Ｌａｓｓｏ誘導の遺伝子（ｉ）の標準的な発現レベルを表す。このＧｉ値は、上述される発現プロファイリングにおいて得られるΔ（ΔＣｔ）から全集団におけるその遺伝子の平均的遺伝子発現を差し引き、次に、その遺伝子の標準偏差で割ることによって計算される。定数ａｉは、表２に列挙されている１４個の遺伝子の第１の主成分への荷重である。各遺伝子ｉについてのａｉスコアは、表２に与えられている。定数ｂは−０．２５１であり、正しいサインおよびスケーリングを得るために、予測材料として主成分を含む一変量のＣｏｘモデル由来であった。定数ａ０は０．０２２である；これは、中央値がゼロになるようにＭＳを中心にする。Ｍは、成分リストにおける遺伝子数である；このケースでは１４である。したがって、ＭＳは表２に開示されている１４個の遺伝子についての、一定量の発現レベルの総和であり、各々は、特定の定数ａｉによって乗じる；次に、この総和は、定数ｂによって乗じられ、中心の定数０．０２２にこの総和を加算した。
【０１３５】
このスコアは、本明細書においては、ＭＳ（全て）と呼ばれ、それは、試験された１４２人全てのＥＲ陽性個体の分析に基づくためである。いずれかの新しい試料は、その患者についての１４個の遺伝子発現プロファイリングデータから、場合により、このスコアからこの転移スコアを生じることによって評価されてもよく、患者に対する遠隔転移の可能性を測定することができる。
ＭＳからの遠隔転移可能性の発生
いずれかの個体の患者に関する遠隔転移の可能性は、可変時間点でのＭＳから計算することができ、基準生存関数としてＷｅｉｂｕｌｌ分布を用いる。
【０１３６】
１４個の遺伝子サインの発現プロファイリングからの、上記で得られた転移スコア（ＭＳ）は、Ｃｏｘ比例ハザードモデルによって遠隔転移の可能性に転換された。Ｃｏｘモデルは基準ハザード関数を特定しないため、ハザードおよび生存関数は、初めに、パラメータの回帰モデルを介して構築された。パラメータの回帰モデルでは、遠隔転移なしの生存時間は結果であり、転移スコア（ＭＳ）は独立した可変インプットとであった。イベント時間は、Ｗｅｉｂｕｌｌ分布を有するように推定された；その２つのパラメータは、ＭＳが誘導される生存データを用いて推定された。ある患者に対して、ある時間内の遠隔転移の可能性を計算するために、ＭＳ値は、単に、生存関数に対する式に置換される。
事前検証
この研究では、１４２個の試験患者が、無作為に１０のサブセットに分けられた。１つのサブセットが取り除かれ、全ＳＰＣ手法が残りの９個のサブセットの統合に対して行われた。遺伝子が選択され、９個のサブセットに構築された予後材料が、残りのサブセットに対して、相互検証転移スコアのＭＳ（ＣＶ）を得るように適用された。この相互検証手法は、ＭＳ（ＣＶ）が全ての患者について記入されるまで、１０回行われた。このようにしてＭＳ（ＣＶ）を構築することによって、各々１０分の１の一片は、直接的には、対応する生存する時間を使用せず、即ち、教師なしと考えることができる。
【０１３７】
これは、試料における全ての個体に対して誘導された変数をもたらし、次に、その性能について試験され、他の臨床変数と比較することができた。しかしながら、ＭＳ（全て）は、試験された全ての１４２個の個体に構築され、同じように試験された場合、相当なバイアスを生成した。
【０１３８】
ＲＯＣ曲線下の時間に依存した面積（ＡＵＣ）が計算されると、ＭＳ（ＣＶ）を用いて、１４個の遺伝子予後サインの精度を計算した（後述される）。また、ＭＳ（ＣＶ）は、１４個の遺伝子サインが臨床予測材料と組み合わせられると、Ｃｏｘ抑制モデルに用いられた。ＭＳ（ＣＶ）には、通常の（事前検証されていない）予測材料とは対照的に、１つの自由度がなければならない。事前検証されていない予測材料は、より多くの自由度を有している。
ＭＳの統計学的分析
遠隔転移なしの生存、並びに全生存についてのカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線は、カットポイントとしてＭＳ（ＣＶ）の中央値（即ち、ＭＳ（ＣＶ）の５０パーセンタイル）を用いて、高リスクおよび低リスク患者群について作成された。カットポイントとしての中央値ＭＳの選択は、ＭＳの１０パーセンタイルからＭＳの９０パーセンタイルまでの異なるカットポイントを用いて、高リスク対低リスク群のハザード率の計算に基づいた。高リスクおよび低リスクの個体の平衡数、並びに最大に近いハザード率は、カットポイントとして中央値を選択するための決定因子であった。
【０１３９】
中央値ＭＳのカットポイントを用いたハザード率（ＨＲ）および９５％の信頼区間（ＣＩ）が計算され、報告された。ログランク試験を行い、ハザード率を異なるカットポイントについて計算した。５年以内での遠隔転移の予測における１４個の遺伝子サインの精度および値は、種々の手段によって評価された。（ＸＨ Ｚｈｏｕ，Ｎ． Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，編集，２００２，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【０１４０】
一変量および多変量のＣｏｘ比例ハザード抑制は、年齢、腫瘍サイズ、腫瘍悪性度、および１４個の遺伝子サインを用いて行われた。サインに関する臨床サブグループ分析も行われた。統計学的分析は、本明細書に記されている統計パッケージを除いて、ＳＡＳ（登録商標）９．１統計学的ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，Ｎ．Ｃ．）を用いて行われた。
多重遺伝子サイン
研究された２００個の候補遺伝子のうち、４４個は、一変量のＣｏｘ比例ハザード抑制において、調整されていないＰ値＜０．０５であった。僅かな手に予後を有する患者は、３７個の遺伝子のアップレギュレーションを示し、７個の遺伝子はダウンレギュレーションを示した。ＰＡＭにおける半教師あり主成分手法（ＳＰＣ）により３８個の予後材料が得られた。この遺伝子リストは、さらに、ＬＡＲＳアルゴリズムを介して、Ｌａｓｓｏ抑制を用いることによって、１４（表２）まで減らされた。表２は、各遺伝子の記述を与える。種々のカットポイントでのハザード率（ＨＲ）（パーセンタイルＭＳ（ＣＶ））を計算した。ＭＳ（ＣＶ）の中央値は、患者を低リスク群および高リスク群に分類するために選択された。
結果
低リスク群および高リスク群の遠隔転移なしの生存率並びに全生存率
トレーニングセットにおいて、相互検証した転移スコア、ＭＳ（ＣＶ）の中央値によって定義されるように、７１個の低リスクおよび７１個の高リスク患者において７および２４個の遠隔転移があった。カプラン−マイヤー推定（図１ａ）は、ログランクのｐ値が０．０００２８である２つの群の間の遠隔転移なしの生存（ＤＭＦＳ）における有意差を指示した。低リスク群の５年および１０年のＤＭＦＳ比（標準誤差）は、それぞれ０．９６（０．０２５）および０．９０（０．０３７）であった。高リスク群については、対応する比は、０．７４（０．０５３）および０．６２（０．０６６）であった。全生存（図１ｂ）については、また、２つの群間に有意差があった（ログランクのｐ値＝０．００４８）。低リスク群の５年および１０年のＯＳ率（標準誤差）は、０．９０（０．０３６）および０．７８（０．０５９）であり、対応する比は、高リスク群においては０．７９（０．０４９）および０．０４８（０．０７０）であった（表５）。
一変量および多変量のＣｏｘ抑制モデルからのハザード率
ＤＭＦＳを予測するためのＭＳによる高リスク群対低リスク群の未調整ハザード率は、一変量のＣｏｘ抑制分析によって指示されるように、４．２３（９５％ＣＩ＝１．８２〜９．８５）であった。比較すると、腫瘍悪性度（中＋高悪性度対低悪性度）による高リスク群対低リスク群は、未調整のハザード率が２．１８（１．０４〜４．５９）であった。腫瘍サイズは、ＤＭＦＳの予測において有意（ｐ＝０．０５）であり、直径にして１ｃｍ増加あたりハザードにして７％の増加であるが、年齢は、この患者セットでは有意な因子ではなかった。多変量のＣｏｘ抑制分析では、１４個の分子サインのリスク群は、ハザード率が３．２６（１．２６〜８．３８）であり、これは、外科的処置での年齢、腫瘍サイズおよび悪性度によって調整された。それは、多変量分析において、唯一の有意なリスク因子（ｐ＝０．０１４）であった。
診断精度および予測値
５年以内の遠隔転移を予測するための１４個の有意なリスク群の診断精度および予測値を表９に要約した。感度は、５年内に遠隔転移があった患者に対しては０．８６であり、特異性は、そうでない患者に対しては０．５７であった。陰性予測値（ＮＰＶ）は９６％であり、ほんの４％の個体が５年以内に遠隔転移であったことを指示し、その場合、その個体が低リスク群にいたことをその遺伝子サインは指示した。それにもかかわらず、陽性適中率（ＰＰＶ）はほんの２６％であり、ほんの２６％の個体が遠隔転移を発症したことを指示し、分子サインは、その個体が高リスクにあることを指示した。高ＮＰＶおよび低ＰＰＶは、部分的には、５年以内の遠隔転移の低い有病率に起因し、それは、現在の患者セットでは０．１５であると推定された。
【０１４１】
さらに、５年以内の遠隔転移を予測するための連続的なＭＳ（ＣＶ）の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を図２に示した。ＡＵＣは、５年以内の遠隔転移の予測については０．７６（０．６５〜０．８７）であった。１０年以内の死亡予測に対するＡＵＣは、０．６１（０．４９〜０．７３）であった。０．５よりも大きいＡＵＣについての片側試験は有意であり、転移および死亡の評価項目に対しては、対応するｐ値は＜０．０００１および０．０４であった。
検討
経路分析は、本明細書に開示されている予後サインにおける１４個の遺伝子が、多様な生物学的機能に関与していることを表すが、大多数の遺伝子は、細胞増殖と関連している。１４個の遺伝子のうち１１個は、不良転帰へと導く腫瘍において、協調的に過剰発現されることが見出されたＴＰ５３およびＴＮＦシグナル経路と関連している。ＢＵＢ１、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＰＫＭＹＴ１、ＰＲＲ１１およびＯＲＣ６Ｌは、細胞周期に関連した遺伝子である。ＤＩＡＰＨは、アクチン細胞骨格および生物発生に関与する遺伝子である。ＤＣ１３は、シトクロムオキシダーゼの集合と関連することが期待されている。
【０１４２】
従来報告された研究は、ＲＮＡの供給源として凍結組織の使用に制限され、マイクロアレイ上にプロファイルされたが、本実施例に記載の発明は、ＦＦＰＥ腫瘍試料における遺伝子プロファイリングに対して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いてもよいことを示す。このようにして、アジュバント療法の日常的な使用に先立って拡張された結果データを有する患者由来の保存された乳癌患者切片の使用を提供する。
【０１４３】
遠隔転移なしの生存は、本実施例において記載される研究のための予後評価項目である。教師あり主成分（ＳＰＣ）法を用いて、本発明の１４個の遺伝子サインパネルを構築した。このサインの集合において使用されるアプローチは、個体の発現プロフィールを、任意の所定時間、遠隔転移のリスクの測定に言い換えることができる転移スコア（ＭＳ）の誘導を可能にする。任意の期間、転移のリスクを定量する能力は、処置の決定における患者および臨床医の間の非常に柔軟性のある予後情報を与え、これは、患者の間でリスク寛容および計画対象期間が変化するためである。
【０１４４】
１４個の遺伝子の分子サインを用いて、高および低リスク群は、遠隔転移なしの生存率、並びに全生存率において有意差があった。このサインは、乳癌予後において日常的ではなく試験された増殖遺伝子を含む。１４個の遺伝子サインは、Ｈ．Ｄａｉ，ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら（２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６）によって記述される５０個の遺伝子サインとは１０個の遺伝子の重複がある。対照的に、ほんの６個の遺伝子は、Ｄａｉ，ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら（２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−５３６）によって記述される７０個の遺伝子サインと重複する。これは、ＥＲ陽性患者とＥＲ陰性患者の両方を含む、その研究が患者のより異種な群を分析したという事実によって説明することができる。本明細書に記載されているサインは、ＳＰ Ｐａｉｋ，Ｓ．Ｓｈａｋら，（２００４，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５１：２８１７−２８２６）によって記述される１６個のサインと重複する２つの増幅遺伝子を有していた。
【０１４５】
本明細書に記載されている分子サインは、多変量分析から指示されるように、年齢、腫瘍サイズおよび悪性度などの伝統的なリスク因子より、独立した予後値を有する。このサインは、腫瘍悪性度が低い場合、さらにより有力な予後の測定を提供する。Ｄａｉらによって報告されているように、低い悪性度の腫瘍を有するこの患者群のサブセットは、従来推定されたものよりも実に高い転移のリスクにある可能性がある。（Ｄａｉら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６）。また、本明細書に記載されているサインは、年齢にして５５歳未満の女性からの試料を最初に用いたｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら（２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−５３６）およびＤａｉら（２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６）によって初期に報告された予後遺伝子の信頼を広げている。それは、このサインが、乳癌患者の一般的な範囲に類似している広い年齢分布（中央値６４歳）の患者において確認された。
【０１４６】
ＦＦＰＥ組織の試料への使用は、凍結した組織を用いるマイクロアレイよりもさらに少量の切片でさえ、異なる検出プラットフォーム（定量的ＰＣＲ対マイクロアレイ）で一部の遺伝子を確認した。結果のこの反復は、転移能が腫瘍に含まれる少数の細胞よりはむしろ、その大部分の細胞の固有の特徴であるという、ＢｅｒｎａｒｄｓおよびＷｅｉｎｂｅｒｇによって記述された概念と一致している。（Ｒ．Ｂｅｒｎａｒｄｓ ａｎｄ ＲＡ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：８２３）。
【０１４７】
また、本明細書に記載されている発明は、ＴｉｂｓｈｉｒａｎｉおよびＥｆｒｏｎによって提唱された事前検証技術を用いることによる予後材料性能の客観的評価を提供する。（Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｂ．Ｅｆｒｏｎ，２００２，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １：ａｒｔｉｃｌｅ １）。研究者の中には、次第に巨大になり、特徴付けられたデータベースにおいて独立した検証の重要性に気付くものもあった。（Ｒ．Ｓｉｍｏｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２００５，２３：７３３２−７３４１；ＤＦ Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ，２００４，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４：３０９−１４；ＤＦ Ｈａｙｅｓ，Ｂ．Ｔｒｏｃｋら，１９９８，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２：３０５−３１９；ＤＧ Ａｉｒｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ｒｏｙｓｔｏｎ，２０００，Ｓｔａｔ Ｍｅｄ １９：４５３−７３）。
【０１４８】
本発明では、従来のマーカーおよびツールに明確な情報を与え、全身処置と混同されない独自の１４個の遺伝子予後サインが提供される。このサインは、初期の段階のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性患者について、ＦＦＰＥ切片およびＲＴ−ＰＣＲを用いて生成されるが、それを当該技術分野において知られている任意の方法と併せて用い、そのサインにおける遺伝子のｍＲＮＡ発現、並びに、限定されないが、ＦＦＰＥ切片、凍結された組織試料および新鮮な腫瘍生検を含む任意の腫瘍組織供給源から得られたｍＲＮＡを測定してもよい。本発明の１４個の遺伝子サインのｍＲＮＡ発現レベルに基づいて、転移スコアは、いずれかの個体の乳癌患者に対して遠隔転移を定量するために計算され得る。このようにして、本明細書に開示されている本発明は、いずれかの期間でＥＲ陽性の乳癌患者の日常的な臨床検査室試験における使用を可能にする。
（実施例２）
１４個の遺伝子サインは２８０個のＦＦＰＥ試料を用いた未処理のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
全身処置を受けていない独立した試料セットにおける、リンパ節転移陰性（Ｎ−）、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）の乳癌患者の遠隔転移を予測することができる１４個の遺伝子発現サインを確認する努力がなされた。１４個の遺伝子サインの有効性を評価するために用いられた、実施例１の実験プロトコールおよび統計学的分析について述べる。
患者＆方法
ガイ病院の乳房組織およびデータバンクの遡及検索は、初期の乳癌であると診断され、明確な局所療法（乳房温存療法または乳腺切除）を有しているが、追加のアジュバント全身処置を受けていない患者の集団を特定するためになされた。この研究グループは、１９７５年〜２００１年に、臨床的な腫瘍サイズが３ｃｍ以下であり、病理学的に腋窩のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性腫瘍を有し、５年フォローアップよりも長い女性に制限された。総数４１２人の患者が特定され、それらは、ＲＮＡ抽出に使用可能である十分にホルマリン固定された、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を有してもいた。本研究のために患者の資料およびデータの使用は、ガイ研究倫理委員会によって承認された。
【０１４９】
このグループから、３００人の患者由来の腫瘍をプロファイルするには十分なｍＲＮＡの量と質があった。その後、さらに２０ケースが、この試験から排除された。６人の患者は、遠隔転移前、両側に乳癌であり、６人は、遺伝子発現レベルでは欠損値であり、８つの腫瘍は、現在の技術を用いた再評価に基づいてＥＲ陰性であることがわかった。このようにして、総数２８０人の患者が分析に含められた（表１のガイ病院からの検証セット）。選択バイアスを評価するために、本発明者らは、試験対象患者基準を満足することが確認され、ＲＮＡ抽出に十分なＦＦＰＥ組織を有していた４１２人の患者を用いて分析した。２つのセット間で年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度における有意差がなかったので、選択バイアスを検出しなかった。
【０１５０】
このグループの患者におけるＥＲ状態は、同時期のＩＨＣアッセイを用いて再評価された。Ａｌｌｒｅｄスコアが３以上は、受容体陽性と考えられた。腫瘍は、ＷＨＯガイドライン（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｔｕｍｏｒｉ １９８２；６８：１８１）に従って分類され、組織学的悪性度は、改変されたＢｌｏｏｍおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ法（Ｅｌｓｔｏｎ ＣＷ ＆ Ｅｌｌｉｓ １０．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｉ．Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｒａｄｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９１；１９：４０３−１０）を用いて確かめられた。
【０１５１】
トレーニングセットと比較すると、検証セットは若年者であり、大きな腫瘍を有し、その大部分が高悪性度の腫瘍であった（表１）。それらの特徴における差異に関する試験は非常に有意である（ｐ＜０．００１）。
転移スコア
実施例１のトレーニング試料において誘導された等式１のＭＳは、ガイ病院からの未処置患者に適用された。実施例１では、ＲＮＡは濃縮されたが、ガイ病院からの未処置患者の場合には、ＲＮＡ試料は濃縮されなかった。
【０１５２】
濃縮していない試料にＭＳを適用するために、濃縮された試料と濃縮されていない試料との間の変換因子は、分子サインにおける遺伝子の各々に対して、実施例１の９３個のトレーニング試料から得られた。
結果
低リスク群および高リスク群の遠隔転移なしの生存率および全生存率
それぞれ、７１人の低リスク患者においては４（５．６％）の遠隔転移があり、２０９人のＭＳの高リスク患者においては６２（２９．７％）の遠隔転移があった。カプラン−マイヤー推定（図３ａ）は、ログランクのｐ値が６．０２ｅ−５である２つの群の間のＤＭＦＳにおける有意差を指示した。低リスク群の５年および１０年のＤＭＦＳ比（標準誤差）は、それぞれ０．９９（０．０１４）および０．９６（０．０２５）であった。高リスク群については、対応する生存率は、０．８６（０．０２５）および０．７６（０．０３１）であった（表１２）。
【０１５３】
アジュバント！リスク群については、ＤＭＦＳのカプラン−マイヤー曲線を図３ｃに示した。５年および１０年のＤＭＦＳ比（標準誤差）は、それぞれ、低リスク群については０．９６（０．０２３）および０．９３（０．０３）であり、高リスク群については０．８７（０．０３）および０．７７（０．０３１）であった。アジュバント！によって特定されるものよりも、ＭＳによって特定される高リスク群と低リスク群との間の生存率において大きな差異があった。
【０１５４】
全生存（ＯＳ）に関して、カプラン−マイヤー曲線（図３ｂ）は、ＭＳ低リスク群と高リスク群との間のＯＳ比に有意差を指示した（ログランクのｐ値＝０．０００２８）。５年および１０年のＯＳ比は、それぞれ、低リスク群については０．９７（０．０２０）および０．９４（０．０２８）であり、高リスク群については０．９２（０．０１９）および０．７１（０．０３２）であった。図３ｄは、５年および１０年の全生存を予測するためのアジュバント！についてのカプラン−マイヤーを示した。ＭＳおよびアジュバント！は、全生存に関する類似の予後情報を提供する。
一変量および多変量のＣｏｘ抑制モデルからのハザード率
遠隔転移までの時間を予測するためのＭＳによる高リスク群対低リスク群の未調整のハザード率は６．１２（９５％ＣＩ＝２．２３〜１６．８３）であった（表１０）。ＭＳリスク群に対する未調整のハザード率は、アジュバント！、年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度によって特定される群のハザード率よりも高い。アジュバントは、第２の最大のハザード率が２．６３であった（９５％ＣＩ １．３０〜５．３２）。組織学的悪性度および腫瘍サイズによるリスク群は、ＤＭＦＳの予測に有意であり、年齢群では有意でなかった。
【０１５５】
年齢群は、ＯＳの予測に最も有意な予後因子であり、未調整のハザード率は２．９（９５％ＣＩ ２．０３〜４．１８）であった（表１０）。それにもかかわらず、ＭＳリスク群は、全生存を予測することができ、ＨＲは２．４９であった。
【０１５６】
ＭＳリスク群、年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度の臨床病理学的なリスク因子による遠隔転移までの時間の多変量のＣｏｘ抑制（表１１ａ）では、年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度によって調整されたＭＳリスク群のハザード率は４．８１（１．７１〜１３．５３、ｐ＝０．００３）である。ＭＳリスク群は、多変量分析における唯一の有意なリスク因子であった。したがって、遺伝子サインは、伝統的な臨床病理学的なリスク因子と比較してＤＭＦＳに対して独立した予後値を有し、これらの因子内で情報の一部を捕捉する。
【０１５７】
１４個の遺伝子サインによるリスク群、アジュバント！によるリスク群を用いた遠隔転移までの時間の多変量Ｃｏｘ抑制（表１１ｂ）では、対応する調節されたハザード率は、５．３２（１．９２〜１４．７３）および２．０６（１．０２〜４．１９）であった。ＭＳとアジュバント！のリスク群は、ＤＭＦＳを予測するために有意のままであった。これは、ＭＳおよびアジュバント！が、互いに非常に独立した相補的な予後情報を担持することを指示する。
異なる臨床下位群における分子サインの性能
表１３は、遺伝子サインが若年および老齢の閉経前および閉経後の女性における遠隔転移を予測することを示す。小さいサイズの腫瘍を有する患者では非常に予後的であるが（ＨＲ＝１４．１６、ｐ＝０．００９）、２ｃｍより大きな腫瘍を有する患者では有意でない。低悪性度の下位群におけるハザード率（ＨＲ＝７．６）は、高悪性度（ＨＲ＝４．６）よりも高いが、それは、小さな試料サイズ（６０試料中、７イベント）のため、低い悪性度の下位群における有意性（ｐ＝０．０６）の傾向を示すだけである。
【０１５８】
種々のサブグループにおけるハザード率は、検定試料セットにおける遺伝子サインが低い悪性度、小サイズの腫瘍、若年であり閉経前の患者においてより予後的である。ＭＳリスク群と臨床的変数との間の相互作用に関する公式な試験は有意ではなかった。しかしながら、このサインも、ＣＰＭＣトレーニングセットにおける低悪性度の腫瘍においてより予後的であった。それにもかかわらず、相互作用分析は、多重試験が行われるため、予備的であると見なされなければならない。
診断精度および予測値
１０年以内の遠隔転移を予測するためのＭＡおよびアジュバント！によるリスク群の診断精度および予測値を表４に示した。ＭＳリスク群は、アジュバント！のリスク群の０．９０（０．７８〜０．９６）よりも感度が０．９４（０．８４〜０．９８）と高いが、特異性は類似している（ＭＳについては０．３（０．２４〜０．３７）対アジュバント！については０．３１（０．２６〜０．３８））。１０年以内の遠隔転移の推測された有病率を用いると、ＭＳリスク群に対するＰＰＶおよびＮＰＶは、それぞれ０．２３（０．２１〜０．２５）および０．９７（０．８８〜０．９９）であった。対応する値は、アジュバント！リスク群に対しては０．２３（０．２０〜０．２５）および０．９３（０．８５〜０．９７）であった。したがって、ＭＳは、アジュバント！よりも１０年以内に遠隔転移がないものを僅かに良好に予測することができ、１０年以内の遠隔転移を有するものに対する予測値は、分子および臨床予後材料に対して同じであった。
【０１５９】
５年および１０年以内の遠隔転移を予測するための連続的ＭＳのＲＯＣ曲線（図４）は、ＡＵＣ（９５％ＣＩ）が０．７３（０．６５〜０．８１）、０．７０（０．６３〜０．７８）であった。１０年以内の死亡を予測するＲＯＣ曲線は、ＡＵＣが０．６８（０．６１〜０．７８）であった。したがって、ＭＳは、遠隔転移および死亡を予測する。
【０１６０】
対照的に、アジュバント！による５年以内、１０年以内の遠隔転移、１０年以内の死亡を予測するためのＲＯＣ曲線のＡＵＣは、０．６３（０．５３〜０．７２）、０．６５（０．５７〜０．７３）、および０．６３（０．５６〜０．７１）であり、それらは、ＭＳによる対応する値よりも低かった。
遠隔転移の可能性の連続的予測材料としてのＭＳ
図５は、転移スコアＭＳを用いて個体の患者についての５および１０年での遠隔転移の可能性を示す。５年および１０年の遠隔転移の可能性は、中央値（最小〜最大）が８．２％（１．４％〜３１．２％）および１５．２％（２．７％〜５０．９％）であった。リスク群を定義するためのカットポイントであるゼロＭＳでは、５年および１０年遠隔転移可能性は、それぞれ５％および１０％であった。
【０１６１】
ＭＳによる１０以内の遠隔転移の可能性は、アジュバント！による１０年以内の再発の可能性と比較された（図６）。決定係数（Ｒ２）は、０．１５であり、ＭＳによる遠隔転移の可能性におけるほんのごく一部の変動がアジュバント！によって説明可能であるとこを指示した。ＭＳによる遠隔転移の可能性は、アジュバント！による再発の可能性よりも低かった。それは、全ての再発イベントがアジュバント！再発可能性に含まれたためであり、遠隔転移だけが遠隔転移の可能性のＭＳ推測におけるイベントとしてカウントされた。
検討
初めに、１４個の遺伝子の予後サインは、リンパ節転移陰性の初期段階の未処置乳癌トレーニングセットにおいて、遠隔転移のための定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＦＦＰＥ切片からのｍＲＮＡ発現に基づいて開発された。得られたサインは、異なる期間で個体に関するリスクを定量する転移スコア（ＭＳ）を生じさせるために用いられ、高リスクおよび低リスクに試料セットを二分するために用いられた。最近の「事前検証」の統計学的な技術を用いたトレーニングセットの初期の内部検証後、本発明者らは、類似の独立した検証集団におけるトレーニングセットの正確に二分された切断を用いて、発現サインを検証した。トレーニングセットおよび検証セットにおけるサインの性能特徴は同じであった。一変量および多変量のハザード率は、ＤＭＦＳを予測するために、それぞれ、検証セットについては６．１２および４．８１であり、トレーニングセットについては４．２３および３．２６であった。多変量分析では、転移スコアだけが、他の臨床病理学的因子の腫瘍サイズのみについて有意である傾向を伴って、有意のままであった。また、１４個の遺伝子の予後サインは、全生存を予測することができ、検証セットでは一変量ハザード率は２．４９であった。５年および１０年以内の遠隔転移を予測し、１０年以内の死亡を予測するための連続ＭＳのＲＯＣ曲線は、ＡＵＣがそれぞれ０．７３、０．７０および０．６８であった。サインは、腫瘍悪性度が低い場合にはより有力な予後を提供した（ハザード率は低悪性度では７．５８であり、高悪性度の腫瘍では４．５９であった）。例えば、Ｄａｉらは、患者の連続体の反射ではなく、むしろ患者の別個の群における差異性能であるものとして、分類の予後力の変化を解釈した。
【０１６２】
アジュバント！から計算されたリスクと比較した場合、ウェブに基づく決定支援では、ＭＳとの適度な相関だけがあった。多変動のＣｏｘ抑制では、ＭＳおよびアジュバント！リスク群はともに、互いに調製されると、優位な予後因子を維持する。アジュバント！と比較したＭＳによって特定される高リスク群と低リスク群との間の生存率には大きな差異があった。ＭＡは、アジュバント！よりも１０年以内の遠隔転移を持たないものを良好に予測することができた。これらのデータは、分子サインが、乳癌の遠隔転移を予測するのに、日常的であるかまたはより最近である予後ツールに独立した情報を提供することを示す。
（実施例３）
１４個の遺伝子サインは、９６個のＦＦＰＥ試料を用いて、処理および未処理のリンパ節転移陰性およびＥＲ陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
処置および未処置の患者を有する独立した試料セットにおける、リンパ節転移陰性（Ｎ−）、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）の乳癌患者のおける遠隔転移を予測することができる１４個の遺伝子発現サインを確認する努力がなされた。１４個の遺伝子サインの有効性を分析および評価するために用いられた、実施例１の実験プロトコールおよび統計学的分析について述べる。
患者＆方法
平均年齢が５６．７歳である９６人のＮ−、ＥＲ＋乳癌患者の集団は、検証研究のために選択された（表１５）。検証研究における患者は、ミュエンスター大学から選択された。それらのうち、１５人は未処置であり、５４人はタモキシフェン単独で処置され、６人は化学療法だけで処置され、２人はタモキシフェンと化学療法を用いて処置された。１９人の患者は、未知の処置状態であった。サインにおける１４個の遺伝子は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてＦＦＰＥ試料においてプロファイルされた。以前に誘導された転移スコア（ＭＳ）は、遺伝子発現レベルからの検証セットのために計算された。患者は、ゼロであった所定のＭＳカットポイントを用いて、２つの群に層をなしていた。
転移スコアの検証
実施例１の試料を用いて誘導された等式１のＭＳは、ミュエンスター大学からの患者に適用された。この実施例では、また、腫瘍組織由来のＲＮＡは濃縮されたが、実施例１のものよりは程度が小さかった。この試料にＭＳを適用するために、濃縮された試料と濃縮されていない試料との間の転換因子が、サインにおける１４個の遺伝子の各々について、ミュエンスター大学からの９３個の試料から得られた。また、濃縮された試料と濃縮されていない試料との間の転換因子は、実施例１のＣＰＭＣからの９３個のトレーニング試料から得られた。次に、ＣＰＭＣとミュエンスター大学の遺伝子発現レベルとの間の転換因子は、転換因子のそれらの２つのセットを用いて計算された。
結果
遠隔転移なしの生存率率
カットポイントとしてＭＳゼロを用いて、患者は、高リスクと低リスクとして分類された。９６人全ての患者のうち、４８人の患者は、高リスクとして同定され、５年のＤＭＦ生存率（標準誤差）は０．６１（０．０７２）であり、４８人の低リスク患者は、対応する生存率が０．８８（０．０５２）であった。６２人の処置された患者のうち、３２人の高リスクおよび３０人の低リスク患者では、５年のＤＭＦ生存率は、それぞれ０．６６（０．０８４）および０．８９（０．０６０）であった。タモキシフェン処置単独を受けた５４人の患者のうち、２６人の高リスク患者および２８人の低リスク患者は、５年のＤＭＦ生存率は、それぞれ０．６５（０．０９４）および０．８８（０．０６５）であった（表１６）。
未調整のハザード率
全集団について、ＭＳは、遠隔転移なしの（ＤＭＦ）生存と相関した。Ｃｏｘ比例ハザード抑制は、ＭＳの単位増加あたりの２．６７（１．２８〜５．５７）倍に増加したハザードを指示した（ｐ＝０．００８７）。カットポイントとしてゼロを用いると、全集団における高リスクと低リスク患者のハザード率は、２．６５（１．１６−６．０６，ｐ＝０．０２１）であった。６１人の処置された患者については、ハザード率は３．０８（０．９９〜９．５６，ｐ＝０．０５２）であった。タモキシフェン単独で処置された５４人の患者については、ハザード率は、２．９３（０．９２〜９．３５，ｐ＝０．０７）。異なる群の患者についての生存率およびハザード率は、それぞれ、表１６および図に要約されている。
【０１６３】
元々は未処置の患者由来である、ＲＴ−ＰＣＲに基づく１４個の遺伝子サインは、ＦＦＰＥ組織を用いた独立した試料セットにおいて、Ｎ−、ＥＲ＋、タモキシフェン処置された患者の遠隔転移を予測することができる。高リスクおよび低リスクのタモキシフェンを単独で処理された患者の大きさ差異ＤＭＦＳ比（０．６５対０．８８）があり、その場合、２つの群は、カットポイントとしてゼロを用いたＭＳによって特定された。多様なＭＳの上位および下位の五分位数における差異リスクは、全ての患者、タモキシフェンを単独で処理された患者に対して、それぞれ３．９９および３．７５倍であった。予後サインは、全身処置と混同されない基準リスクを提供することができる。さらに、処置を受ける患者についての転移リスクを予測することができる。したがって、遺伝子サインは、その後の療法とは独立して、治療法の決定を導くための乏しい臨床転帰を用いて女性を特定するのに適切である。
（実施例４）
１４個の遺伝子サインは、２０５個のＦＦＰＥ試料を用いた、タモキシフェン処置のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
患者
ガイ病院で１９７５年から２００１年に外科的処置を受けたＮ−、ＥＲ＋の乳癌を有する２０５人の女性の集団を選択した。フォローアップの中央値は９．３年である。そのうち、１７人（８．９％）が遠隔転移であり、４４人（２１．５％）が死亡し、１７人（８．９％）が局所および遠隔再発であった。
【０１６４】
１３８人（６７．３％）の患者は、ステージＩであり、６７人（３２．７％）がステージＩＩであった。全ての患者は、アジュバントのホルモン療法を受けたが、化学療法は受けなかった。この集団では、平均（ＳＤ）年齢は５９．３（１０．４）歳であった。６４％は、５５歳を超え、８０．５％が閉経後であった。全ての腫瘍は、直径にして≦３ｃｍであり、平均（ＳＤ）の腫瘍直径は１．６７ｃｍ（１．０）であった。６０人（２９．３％）、９８人（４７．８％）、４７人（２２．９％）の患者は、腫瘍の組織学的悪性がそれぞれ１、２、３であった。（表１７）
エンドポイント
本発明者らは、初期カットポイントとして、外科的処置から、遠隔転移なしの生存（ＤＭＦＳ）とも呼ばれる、遠隔転移までの時間を選択する。イベントは遠隔転移である。反対側の再発および再発なしの死亡が検査イベントであり、局所再発は、考慮されるべきイベントおよび検査イベントではなかった。ＤＭＦＳカットポイント、そのイベントおよび検査ルールの定義は、予後分子マーカー研究（Ｐａｉｋら ２００４）に関する全米外科アジュバント胸部および腸管プロジェクト（ＮＳＡＢＰ）によって採用された定義を用いて調整された。ＤＭＦＳカットポイントは、癌に関連した死亡に最も直接的に連結されている。
遺伝子発現サインおよび転移スコア（ＭＳ）
１４個の遺伝子サインは、従来、実施例１に記載されるカリフォルニア・パシフィック・メディカル・デンター（ＣＰＭＣ）からのＦＦＰＥ試料を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによるプロファイリング研究を用いて開発された。インジェニュイティプログラムによる経路分析は、そのサインの１４個の遺伝子のうち多数が細胞増殖と関連することを示した。１４個の遺伝子のうち１０個が、乏しい結果の腫瘍において協調的に過剰発現することが見出されたＴＰ５３シグナル経路と関連している。
【０１６５】
転移スコア（ＭＳ）は、各個体について計算された。この実施例におけるＭＳは、以前に記載されたサインのうち１４個の遺伝子の遺伝子発現に基づいていた。しかしながら、本実施例におけるＭＳを計算するためのアルゴリズムは、従来の実施例について記載された実施例とは異なっていた。それにもかかわらず、新しいアルゴリズムを用いて誘導されたＭＳは、従来の方法を用いて誘導されたＭＳと非常に相関し、ピアソン相関係数は＞０．９９であった。さらに、本実施例では、以前の３つの実施例において低および高リスク群を分類するために、たった１つのカットポイントを用いたこととは対照的に、高、中くらい、低のＭＳ群を分類するために、２つのカットポイントを使用した。
【０１６６】
サインの１４個の遺伝子は、実施例１に記載される研究において選択され、新しいＭＳスコアおよびカットポイントは、実施例２に記載されるガイ病院からの未処置試料を用いて、この研究に基づいて測定された。新しいＭＳアルゴリズムは、実施例４および５で適用され、検証された。そこで、新しい転移スコア（ＭＳ（新規））が、１４個の遺伝子の遺伝子発現レベルの平均の陰性として計算される。この新しいスコアを用いて、１４個の遺伝子は、同計量を与えた。高いＭＳが遠隔転移の高リスクに対応するように、−１の乗数を用いた。新しいＭＳは、下記の式：
【０１６７】
【数７】
（式中、Ｇｉはサインにおける１４個の遺伝子の中心の発現レベルである）
において表すことができる。
【０１６８】
ＭＳ（新規）の２つのカットポイントは、高、中、および低ＭＳ群に患者を分類するために選択された。低いカットポイントは−１．４７であり、上のカットポイントは−０．８４３であった。−１．４７よりも小さなＭＳを有する個体は、低ＭＳ群であった。−１．４７と−０．８４３との間のＭＳを有する個体は、低リスクであると考えられ、−０．８４３よりも高いＭＳを有する個体は高ＭＳによる１０年以内群であった。低いＭＳを有するものは、低リスクであると考えられ、中間のＭＳおよび高いＭＳ群にあるものは、ガイの未処理試料の高リスクとして考えられる場合（換言すれば、−１．４７を超えるＭＳを有するものは高リスクであると考えられる）、ＭＳリスク群の感受性は９０％を超える。一方、低ＭＳおよび中間ＭＳは、低リスクであると考えられ、高いＭＳを有するものは高リスクであると考えられる場合（換言すれば、−０．８４３よりも低いＭＳを有するものは、低リスクであると考えられ、−０．８４３よりも高いＭＳを有するものは、高リスクであると考えられた）、ガイの未処理試料におけるＭＳリスク群の感受性および特異性は、７０％程度である。
【０１６９】
未処置の試料については、中間のＭＳ群は、高いＭＳ群のものと類似したリスクを有し、高いＭＳ群および中間のＭＳ群は、低ＭＳを有するものよりも高かった。しかしながら、ホルモン治療で処置された患者に関しては、中間のＭＳ群は、低ＭＳ群のものと同じリスクを有している。高いＭＳ群のリスクは、中間のＭＳおよび低ＭＳ群のリスクよりも高い。
【０１７０】
１４個の遺伝子サインを適用する別の方法は、下記のように、等式２を用いることによる。１４個の遺伝子サインは、以前に、実施例１に記載されるように、カリフォルニア パシフィック メディカル センター（ＣＰＭＣ）によるプロファイリング研究を用いて開発された。プログラムの創意による経路分析は、サインの１４個の遺伝子のうち大部分が、細胞増殖と関連していることを示した。１４個の遺伝子のうち１０個は、不良転帰の腫瘍における協調的に過剰発現することを見出されたＴＰ５３シグナル経路と関連している。
【０１７１】
転移スコア（ＭＳ）は、各個体について計算された。この実施例におけるＭＳは、前述したように、サインのおける１４個の遺伝子の遺伝子発現に基づいていた。しかしながら、この実施例におけるＭＳを計算するためのアルゴリズムは、１４個の遺伝子が等しく計量される等式２に基づいていた。さらに、この実施例では、２つのカットポイントは、前述の３つの実施例における低および高リスク群に患者を分類するためのたった１つカットポイントを用いるのとは対照的に、高、中および低ＭＳ群に患者をグループ化するために用いられた。サインの１４個の遺伝子は、実施例１に記載されるように、この研究において選択され、新しいＭＳスコアおよびカットポイントは、実施例２に記載されるガイ病院からの未処置の試料を用いた研究に基づいて測定された。新しいＭＳアルゴリズムは、実施例４および５において適用され、検証された。
【０１７２】
ＭＳ（新しい）の２つのカットポイントは、高、中および低ＭＳ群に患者を分類するために選択された。カットポイントは、第１のカットポイントが−０．１１９である上記ＭＳを有する個体が５年以内に遠隔転移を有する高リスクの個体として分類される場合、ＭＳリスク群の感受性は０．７程度となるように決定された。ＭＳが０．３０２である第２のカットポイントは、感受性および特異性が０．７となるように選択された。
【０１７３】
実施例２において測定されたＭＳと、１４個全ての遺伝子の遺伝子発現の平均の陰性としてのＭＳは、互いに単に一次変換であることに留意しなければならない。それ自体は、それらは完全相関（ピアソン相関係数＝１）を有し、高、中、及び低ＭＳへの患者の分類は、記載されている対応するカットポイントを用いる同じである。
統計学的分析
遠隔転移なしの生存に関するカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線は、高、中および低ＭＳ群について作成された。３つの群のＤＭＦＳ比を調べると、中および低ＭＳ群は、高ＭＳを有する高リスク群と比較される低リスク群として組み合わせられた。ログランク試験を行った。
【０１７４】
ＤＭＦＳカットポイントについてのＭＳ群の一変量および多変量のＣｏｘ比例ハザード抑制分析を行った。高リスク（高ＭＳ）群対低リスク（組み合わせられた中間および低ＭＳ群）群のハザード率は、多変量分析における年齢（年）、腫瘍サイズ（ｃｍ）、および組織学的悪性度について調整された。
【０１７５】
ＭＳと年齢、腫瘍サイズとの関連性は、ＡＮＯＶＡ試験を用いて調べられ、ＭＳ群と組織学的悪性度との関連は、関連の強固性についてはＣｒａｍｍｅｒ’ｓ Ｖによって、統計学的有意性についてはｃｈｉ−ｓｑによって評価された。
【０１７６】
また、ＭＳリスク群のハザード率は、異なる臨床のサブグループについて計算された。それらの群には、閉経前対閉経後、年齢≦５５歳対＞５５歳、腫瘍サイズ＞２ｃｍ対≦２ｃｍ、組織学的悪性度１＆２対悪性度３が含まれる。
【０１７７】
診断精度を評価するために、５年以内の遠隔転移を予測する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線をプロットした。ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）を計算した。感受性、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）および陰性予測値（ＮＰＶ）は、ＭＳによる高対低リスク群に関する９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を用いて計算された。
【０１７８】
ＭＳ群のハザード率の時間依存性は、打ち切りデータを操作することができるスプライン曲線フィッティング技術を用いて年換算のハザードを評価することによって調査された。Ｒ２．４．１におけるＨＥＦＴ手法を用いた。年換算のハザードは、ＭＳ高および低リスク群について評価され、そこから、異なる時間のハザード率を計算した。
【０１７９】
カプラン−マイヤー推定およびＣｏｘ比例ハザードは、Ｒ２．４１．１およびＳＡＳ９．１を用いて行われた。ＲＯＣ曲線およびＡＵＣは、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ’ｓ ＲＯＣプログラムを用いて推定された。ＡＵＣの信頼区間を推定するためのＤｅｌｏｎｇ法を用いた。
結果
ＭＳ低リスクおよび高リスク群における遠隔転移なしの生存率
１３６人の個体の低ＭＳ群において８個の遠隔転移、２９人の個体の中ＭＳ群において２個の遠隔転移、３０人の個体の高ＭＳ群において７個の遠隔転移があった。１０年のＤＭＦＳ比（ＳＥ）は、低、中、およびＭＳ群について、それぞれ０．９２１（０．０２８），０．９６６（０．０３４）および０．８０４（０．０６８）であった。ＤＭＦＳ比において有意差があり、ログランクのｐ値は０．０４であった。ＤＭＦＳ比は、低および中のＭＳ群において同じであったので、それらを組み合わせて、低リスク群を形成した。低リスク群は、１０年のＤＭＦＳ比が０．９２８（０．０２５）であり、高リスク群についての０．８０４（０．０６８）の対応する比とは有意に異なっていた（表１８）。ログランクのｐ値は０．０１１であった。３つのＭＳ群および２つのＭＳリスク群に対する遠隔転移なしの生存のカプラン−マイヤープロットは、それぞれ図８および図９に示された。
一変量および多変量のＣｏｘ抑制モデルからのハザード率
遠隔転移までの時間を予測するためのＭＳ高リスク対低リスク群の一変量ハザード率は、３．２５（９５％ＣＩ＝１．２４または８．５４、ｐ値＝０．０１７）であった。年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度によって調整された場合、ハザード率は、表１９において５．８２（１．７１−１．７５）であった。ＭＳリスク群は、多変量分析において有意である唯一のリスク因子であった。したがって、遺伝子サインは、伝統的な臨床病理学的なリスク因子と比較したＤＭＦＳに対する独立した予後値を有し、これらの因子の情報の一部を捕捉する。
ＭＳリスク群と、他の臨床および病理学的特徴との関連性
ＭＳリスク群は、組織学的悪性度との非常に有意な関連を有する（関連についてのｃｈｉ−ｓｑに関するＣｒａｍｍｅｒ’ｓ Ｖ＝０．６５、ｐ＜０．０００１）。６０個の悪性度１の腫瘍について、ＭＳ高リスクはなかった（０％）。対照的に、９８個の悪性度２の腫瘍については９（９．２％）、４７個の悪性度３の腫瘍については３１（６６％）であった。
【０１８０】
腫瘍サイズは、ＭＳ高リスク群において大きいが、この差は、統計学的な差異ではなった（ＭＳ高および低リスク群では、それぞれ１．８７ｃｍおよび１．６１ｃｍ、ＡＮＯＶＡ ｐ値＝０．１４）。ＭＳリスク群と年齢との関連性は有意ではなかった（平均年齢は、高および低リスク群では５９．３であり、ＡＮＯＶ ｐ＝０．３４）。結果を表２０に概説した。
異なる臨床サブグループにおける分子サインの性能
ＭＳリスク群のハザード率は、≦２ｃｍの腫瘍で３．７（１．１−１２．６）であり、＞２ｃｍの腫瘍で３．０（０．６−１４．８）であった。５５歳よりも若い女性では、ＨＲは、７．４（１．０−５４．７）であり、５５歳よりも上の女性では２．８（０．８８−８．８）であった。組織学的悪性度１および２の腫瘍については、ＨＲは、１２．８（３．８−４３．１）であり、悪性度３の腫瘍について、ＨＲは１．５３（０．１６−１４．７）であった（表２１）。
診断精度および予測値
５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳリスク群の感受性、特異性、ＰＰＶおよびＮＰＶを表２２に示した。ＭＳリスク群の感受性は、０．５０（０．５０−０．７６）であり、特異性は、０．８２（０．７６−０．８７）であった。０．０５であると推定された５年の遠隔転移比を用いると、ＰＰＶおよびＮＰＶは、それぞれ０．１３（０．０６８−０．２３）および０．９７（０．９４−０．９８）と推定された（表２２）。ＭＳリスク群の高いＮＰＶは、低リスクである患者の化学療法などのより積極的な処置を除外するために用いられることが重要である。
【０１８１】
５年以内の遠隔転移を予測するための連続ＭＳのＲＯＣ曲線を図１０に示し、ＡＵＣは０．７２（０．５７−０．８７）であると推定された。
予後サインの時間依存性
ＭＳ高および低リスク群についての年換算したハザード率を図１１ａに示し、２つの群の間のハザード率の時間依存性を図１１ｂに示した。高リスク群については、年のハザード率は外科的処置から約３年で２．５％のピークに達し、その後、次の数年かけて徐々に減少した。しかしながら、低リスク群の年換算のハザード率は、フォローアップした１０年間で、僅かであるが着実な増加を示した。その後、ＭＳリスク群のハザード率は、時間依存的であった。２、５、および１０年で、それぞれ４．６、３．６および２．１であった。
（実施例５）
１４個の遺伝子サインは２３４個のＦＦＰＥ試料を用いたアジュバントホルモン的に処置されたリンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
患者
愛知県がんセンターにおいて１９９５年から２００３年に外科的処置を受けたＮ−、ＥＲ＋乳癌の２３４人の日本人女性の集団を選択した。フォローアップの中央値は８．７年であった。それらの中には、３１人（１３％）が遠隔転移であり、１９人（８．１％）が死亡し、４６人（１９．７％）が局所および遠隔再発であった。
【０１８２】
１４６人（６２％）の患者がステージＩであり、８８人（３８％）がステージＩＩであった。全ての患者はアジュバントホルモン処置を受けたが、化学療法は受けなかった。１１２人の閉経後の女性は、タモキシフェンで処置された。１２２人の閉経前の女性のうち、１０２人がタモキシフェンを受け、２０人がゾラデックス処置を受けた。この手段は、平均（ＳＤ）年齢は５３（１１）歳であり、平均（ＳＤ）腫瘍直径は２．０５ｃｍ（１．１）であった。７４人（３２％）、１１３人（４８％）、および４７人（２０％）の患者は、組織学的悪性度がそれぞれ１、２および３の腫瘍であった。（表２３）
遺伝子発現サインおよび転移スコア（ＭＳ）
１４個の遺伝子発現サインは前述において作製され、ＦＦＥ試料を用いたＲＴ−ＰＣＲにより米国および欧州におけるプロファイリング研究において評価された。プログラムＩｎｇｅｎｕｉｔｙによる経路分析は、サインの１４個の遺伝子の大多数が、細胞増殖と関連していることを示した。１４個の遺伝子のうち１０個は、乏しい結果の腫瘍において協調的に過剰発現することが見出されたＴＰ５３シグナル経路と関連している。
【０１８３】
転移スコア（ＭＳ）は、各個体について計算された。ＭＳは、サインの１４個の遺伝子の遺伝子発現レベル（ΔΔＣｔによる）の平均の陰性に基づいていた。さらん、２つのカットポイントは、以前に、ガイ病院からの未処置の患者からの腫瘍組織を用いた研究から測定され（実施例２）、患者を高、中間および低ＭＳ群にグループ分けした。
統計学的分析
遠隔転移なしの全生存に関するカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線は、高、中間および低ＭＳ群について作製された。３つの群のＤＭＦＳ比を調べると、中間および低ＭＳ群は、高リスク群と比較される低リスク群として、高ＭＳと比較された。ログランク試験を行った。
【０１８４】
ＤＭＦＳおよびＯＳエンドポイントに関するＭＳ群の一変量および多変量のＣｏｘ比例ハザード抑制分析を行った。高リスク（高ＭＳ）対低リスク（中間および低ＭＳ群の組み合わせ）群は、１つの多変量分析において、年齢（年）、腫瘍サイズ（ｃｍ）および組織学的悪性度について調整された。別の多変量分析では、閉経状態、処置、腫瘍サイズ、組織学的悪性度およびＰｇＲ状態について調整された。
【０１８５】
ＭＳ群と、年齢、腫瘍サイズとの関連性は、ＡＮＯＶＡ試験を用いて調べられ、ＭＳ群と組織学的悪性度および腫瘍サブタイプとの関連性は、関連した強度についてのＣｒａｍｍｅｒ’ｓ Ｖ、統計学的差異についてはｃｈｉ−ｓｑによって評価された。
【０１８６】
また、ＭＳリスク群のハザード率は、異なる臨床サブグループについて計算された。それらのグループは、閉経前対閉経後、年齢≦５５歳対＞５５歳、腫瘍サイズ＜２ｃｍ対≦２ｃｍ、組織学的悪性度１＆２対悪性度３、ＰｇＲ＋ｖｅ対−ｖｅを含む。
【０１８７】
診断精度を評価するために、５年以内の遠隔転移を予測するＭＳの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線をプロットした。ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）を計算した。感受性、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）および陰性予測値（ＮＰＶ）は、ＭＳによる高対低リスク群に関する９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を用いて計算された。
【０１８８】
ＭＳ群のハザード率の時間依存性は、打ち切りデータを操作することができるスプライン曲線フィッティング技術を用いて年換算のハザードを評価することによって調査された。Ｒ２．４．１におけるＨＥＦＴ手法を用いた。年換算のハザードは、ＭＳ高および低リスク群について評価され、そこから、異なる時間のハザード率を計算した。
【０１８９】
カプラン−マイヤー推定およびＣｏｘ比例ハザードは、Ｒ２．４１．１およびＳＡＳ９．１を用いて行われた。ＲＯＣ曲線およびＡＵＣは、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ’ｓ ＲＯＣプログラムを用いて推定された。ＡＵＣの信頼区間を推定するためのＤｅｌｏｎｇ法を用いた。
結果
ＭＳ低リスクおよび高リスク群における遠隔転移なしの生存率
７７人の個体の低ＭＳ群において６個の遠隔転移、６６人の個体の中間ＭＳ群において４個の遠隔転移、９５人の個体の高ＭＳ群において２１個の遠隔転移があった。１０年のＤＭＦＳ比（ＳＥ）は、低、中、および高ＭＳ群について、それぞれ、０．８９（０．０５）、０．９１（０．０４）および０．７５（０．０５）であった。ＤＭＦＳ比において有意差があり、ログランクのｐ値は０．００４であった。ＤＭＦＳ比は、低および中ＭＤ群において同じであったので、それらを組み合わせて、低リスク群を形成した。低リスク群は、１０年のＤＭＦＳ比が０．８９５（０．０３４）であり、高リスク群についての０．７５（０．０５）の対応する比とは有意に異なっていた（表２４）。ログランクのｐ値は０．０００９２であった。３つのＭＳ群に対する遠隔転移なしの生存のカプラン−マイヤープロットは図１２に示され、２つのリスク群（高ＭＳおよび中と低ＭＳの組み合わせ）についてのカプラン−マイヤープロットは図１３に示された。
一変量および多変量のＣｏｘ抑制モデルからのハザード率
遠隔転移までの時間を予測するためのＭＳ高リスク対低リスク群の一変量ハザード率は、３．３２（９５％ＣＩ＝１．５６〜７．０６、ｐ値＝０．００１８）であった。年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度によって調整された場合、ハザード率は、３．７９（１．４２−１０．１、ｐ＝０．００７８）であった。ＭＳに加えて、腫瘍サイズは、多変量分析における唯一の他の有意因子であり、ＨＲは１ｃｍあたり１．４増加した（ｐ＝０．００７）（表２５）。別の多変量分析では、ＭＳリスク群は、閉経状態、処置、腫瘍、腫瘍サイズ、組織学的悪性度およびＰｇＲ状態によって調整された。ＭＳリスク群のこの調整されたハザード率は、３．４４（１．２７−９．３４）であった（表２７）。さらに、腫瘍サイズは、この多変量分析において唯一の他の有意因子であった（ＨＲ＝１ｃｍあたり１．４５の増加、ｐ＝０．００４９）。したがって、遺伝子サインは、伝統的な臨床病理学的なリスク因子と比較したＤＭＦＳに対する独立した予後値を有し、これらの因子の情報の一部を捕捉する。
ＭＳリスク群と、他の臨床および病理学的特徴との関連性
ＭＳリスク群は、組織学的悪性度との非常に有意な関連を有する（関連についてのｃｈｉ−ｓｑに関するＣｒａｍｍｅｒ’ｓ Ｖ＝０．５４、ｐ＜０．０００１）。７４個の悪性度１の腫瘍について、ほんの４個（５．４％）がＭＳ高リスクであった。対照的に、１１３個の悪性度２の腫瘍については５４（４７．８％）、４７個の悪性度３の腫瘍については３７（７８．７％）がＭＳ高リスクであった。
【０１９０】
また、ＭＳリスク群は、腫瘍のサブタイプと関連した（Ｃｒａｍｍｅｒ’ｓ Ｖ＝０．２５、ｐ＝０．０２）。７７個の硬性腫瘍のうち２３個（２９．８％）がＭＳ高リスクであり、１０８個の乳頭管腫瘍のうち４５個（４１．７％）、３８個の固定管の２４個（６３．２％）がＭＳ高リスクであった。
【０１９１】
腫瘍サイズは、ＭＳ高リスク群において大きいが（ＭＳ高および低リスク群においてそれぞれ２．２３ｃｍおよび１．９３ｃｍ、ＡＮＯＶＡ ｐ値＝０．０３７）、ＭＳリスク群と年齢との関連性は有意ではなかった（ｐ＝０．２９）。結果を表２６に概説した。
異なる臨床サブグループにおける分子サインの性能
ＭＳリスト群は、≦２ｃｍ、低悪性度（悪性度１および２）およびＰｇＲ＋ｖｅである腫瘍を有する若年（年齢≦５５歳）、閉経前の女性において遠隔転移を予測することができる。ＭＳリスク群のハザード率は、≦２ｃｍの腫瘍では４．５（１．２−１７．３）および＞２ｃｍの腫瘍では２．３（０．９２−５．６）であった。閉経前の女性では、ＨＲは、６．０（１．６−２３．３）であり、閉経後の女性では２．１（０．８３−５．１）であった。組織学的悪性度１および２の腫瘍を有する女性については、ＨＲは３．６（１．５−８．４）であり、悪性度３の腫瘍では、ＨＲは２．４（０．２９−１８．８）であった。ＭＳリスク群のＨＲは、ＰｇＲ＋ｖｅ腫瘍では３．５（１．４−９．０）であり、ＰｇＲ−ｖｅ腫瘍では２．１（０．５７−７．４９）であった（表２８）。
診断精度および予測値
５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳリスク群の感受性、特異性、ＰＰＶおよびＮＰＶを表に示した。ＭＳリスク群の感受性は、０．８１（０．６０−０．９２）であり、特異性は、０．６５（０．５８−０．７１）であった。０．００９５であると推定された５年の遠隔転移比を用いると、ＰＰＶおよびＮＰＶは、それぞれ０．１９（０．１５−０．２４）および０．９７（０．９３−０．９９）と推定された（表２９）。ＭＳリスク群の高いＮＰＶは、低リスクである患者の化学療法などのより積極的な処置を除外するために用いられることが重要であった。５年以内の遠隔転移を予測するための連続ＭＳのＲＯＣ曲線を図１４に示し、ＡＵＣは０．７３（０．６３−０．８４）であると推定された。
予後サインの時間依存性
ＭＳ高および低リスク群についての年換算したハザード率を図１５ａに示し、２つの群の間のハザード率の時間依存性を図１５ｂに示した。高リスク群については、年のハザード率は外科的処置から約３年で３．５％のピークに達し、その後、次の数年かけて徐々に減少した。しかしながら、低リスク群の年換算のハザード率は、フォローアップした１０年間で、僅かであるが着実な増加を示した。その後、ＭＳリスク群のハザード率は、時間依存的であった。２、５、および１０年で、それぞれ４．８、３．４および１．８であった。
【０１９２】
この実施例および前述の実施例から分かるように、１４個の遺伝子サインは、白人およびアジア民族系の乳癌患者における有効なリスク予測材料であることが示され、１４個の遺伝子予後サインの構造安定性を指示している。
【０１９３】
本明細書に引用されている全ての刊行物および特許は、全体として参照により本明細書に援用される。本発明の記載されている組成物、方法およびシステムの種々の修飾および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなしに当業者に明確となる。本発明は、特定の好ましい態様およびある種の実施例と関連して記載されているが、請求される発明はこのような特定の態様に不当に限定されてはならないことは理解すべきである。実際に、分子生物学、遺伝学および関連した分野における当業者に明らかである、本発明を実施するための上述した様式の種々の修飾は、続く特許請求の範囲にあることが意図される。
【０１９４】
【表１】
【０１９５】
【表２】
【０１９６】
【表３】
【０１９７】
【表４】
【０１９８】
【表５】
【０１９９】
【表６】
【０２００】
【表７】
【０２０１】
【表８】
【０２０２】
【表９】
【０２０３】
【表１０】
【０２０４】
【表１１】
【０２０５】
【表１２】
【０２０６】
【表１３】
【０２０７】
【表１４】
【０２０８】
【表１５】
【０２０９】
【表１６】
【０２１０】
【表１７】
【０２１１】
【表１８】
【０２１２】
【表１９】
【０２１３】
【表２０】
【０２１４】
【表２１】
【０２１５】
【表２２】
【０２１６】
【表２３】
【０２１７】
【表２４】
【０２１８】
【表２５】
【０２１９】
【表２６】
【０２２０】
【表２７】
【０２２１】
【表２８】
【０２２２】
【表２９】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００７年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／８９８，９６３号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８９８，９６３号の内容は、本願中にその全体が参考として本明細書により援用される。
【０００２】
本発明は、乳癌転移の予後に関する。特に、本発明は、乳癌患者のリンパ節転移陰性のエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性腫瘍の転移のリスクの予測に有用である多重遺伝子の予後サインに関する。多重遺伝子の予後サインは１４個の遺伝子を含み、乳癌患者のＥＲ陽性腫瘍に含まれるそれらのｍＲＮＡは、ホルマリン固定のパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）の組織切片から得ることができ、それらの発現レベルは当該技術分野において知られている方法によって測定される。このようにして、本発明は、リンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌の遠隔転移のリスクを評価するための日常的な臨床検査室試験に適している。
【背景技術】
【０００３】
乳癌は、複雑な異種疾患である。乳癌の早期の検出により、成功的な治療および回復が改善される。日常的に検査されているマンモグラフィーは、ステージＩの乳癌の検出を増やし、付随して、より多くの女性がリンパ節転移陰性腫瘍であると診断される。（非特許文献１）。米国において、毎年、乳癌であると診断されたおよそ２４０，０００人の女性のうち約４３％がリンパ節転移陰性である。
【０００４】
現在のガイドラインに基づくと、８５〜９０％のリンパ節転移陰性の患者が、外科処置後、それによる全身アジュバント療法の候補者となる。このような全身アジュバント療法には、化学療法およびホルモン療法が含まれてもよい。しかしながら、局所的処置（乳腺切除または腫瘍摘出手術および放射線療法）を受けているリンパ節転移陰性乳癌の女性のうち約６０〜７０％が遠隔再発を経験することはない。乳腺患者の処置決定は、転移に関する各々の患者のリスクの評価、複数の臨床的であり、病理組織学的なパラメータを用いた処置への応答から恩恵を受ける。
【０００５】
最近のいくつかの研究では、マイクロアレイが使用され、患者の遺伝子発現プロフィールも有用な予後情報を提供することができることを示している。これらの研究の一部は、それらの大きさ、それらの検定の程度により、集中した注目を浴びている。（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００６】
ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｄａｉら（非特許文献２）によって同定された７０個の遺伝子の予後サインに関して集められた、結果として生じた信頼は、欧州試験であるリンパ節転移陰性疾患のためのマイクロアレイによって化学療法を避けられ得る（ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ Ｎｏｄｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｙ Ａｖｏｉｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ＭＩＮＤＡＣＴ）にその取り込みをもたらしている。同様に、非特許文献７によって記載されているＰＣＲに基づく２１個の遺伝子の予測サインは、北アメリカの乳癌インターグループ（Ｔｈｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ）による第ＩＩＩ相試験（臨床癌試験の評価のためのプログラム（Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｓｔｓ：ＰＡＣＣＴ）に含まれている。（非特許文献８）。
【０００７】
非特許文献９による２１個の遺伝子の予測サイン（５個の標準化遺伝子を含む）は、タモキシフェン処置患者に由来された。そのサインの独立性は、従来の免疫組織化学（ＩＨＣ）試験にすでに用いられていた遺伝子および／またはタンパク質とのその実質的な重複により関心が寄せられてきた。（非特許文献１０）。ＥＲ陽性の乳癌患者に対する標準的なホルモン療法は、タモキシフェン単独から、タモキシフェン＋アロマターゼ阻害剤の連続使用へ、またはアロマターゼ阻害剤単独へと変更されつつある。（非特許文献１１；非特許文献１２）。タモキシフェン処置に独立している予後ツールは、アロマターゼ阻害剤の摂取を計画している患者に対する基準リスクの測定の提供に重要であり得る。
【０００８】
このようにして、乳癌患者の遠隔転移のリスクを予測する日常的な臨床検査室試験に用いることができる遺伝子に基づく予後アッセイは必要である。理想的には、このアッセイは、相対的に少数の遺伝子の発現レベルの測定を必要とし、このような遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、ＦＦＰＥ腫瘍切片などの日常的な回収法によって保存された腫瘍組織から容易に得ることができる。遠隔転移のリスクに関する情報は、乳癌患者、特に初期段階のリンパ節転移陰性患者の処置戦略の指針に用いることができ、その結果、遠隔転移のリスクが高い患者は適切に処置され、遠隔転移のリスクが低い患者はある種の処置の副作用から免れる場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂ．Ｃａｄｙ，１９９７，Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍ ６：１９５−２０２
【非特許文献２】ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｈ．Ｄａｉら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−５３６
【非特許文献３】ＭＪ ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ，ＹＤ Ｈｅら，２００２，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４７：１９９９−２００９
【非特許文献４】Ｙ．Ｗａｎｇ，ＪＧ Ｋｌｉｊｎら，２００５，Ｌａｎｃｅｔ ３６５：６７１−６７９
【非特許文献５】Ｈ．Ｄａｉ，Ｕ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６
【非特許文献６】ＨＹ Ｃｈａｎｇ，ＤＳ Ｎｕｙｔｅｎら，２００５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：３７３８−３７４３
【非特許文献７】ＳＰ Ｐａｉｋ，Ｓ．Ｓｈａｋら，２００４，Ｎ ＥｎｇｌＪ Ｍｅｄ ３５１：２８１７−２８２６
【非特許文献８】ＶＧ Ｋａｋｌａｍａｎｉ ａｎｄ ＷＪ Ｇｒａｄｉｓｈａｒ，２００６，Ｃｕｒｒ Ｔｒｅａｔ Ｏｐｔｉｏｎｓ Ｏｎｃｏｌ ７：１２３−８
【非特許文献９】ＳＰ Ｐａｉｋ，２００４，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５１：２８１７−２８２６
【非特許文献１０】ＤＲ Ｃａｒｒｉｚｏｓａ ａｎｄ ＬＡ Ｃａｒｅｙ，２００５，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ ４：７−１０
【非特許文献１１】ＥＰ Ｗｉｎｅｒ，Ｃ．Ｈｕｄｉｓら，２００５，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：６１９−６２９
【非特許文献１２】ＳＭ Ｓｗａｉｎ，２００５，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５３：２８０７−９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、乳癌患者のＥＲ陽性腫瘍の転移のリスクを予測するための１４個の遺伝子サインに関する。本発明は、部分的には、初期段階のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性患者の試験に基づき、この患者の大部分は、一次診断後の治療決定を導くための更なる情報を必要とする。本発明の分子サインに含まれる１４個の遺伝子を表２に開示する。当業者は、多数の可能な供給源から得られるＲＮＡを用いて、本明細書に記載されている１４個の遺伝子に関して発現プロファイリングを行い、次に、この発現データを、予後転移スコアを決定するためにて提供されたアルゴリズムに挿入することができる。
【００１１】
本発明の一局面では、乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞におけるＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１として知られる遺伝子のｍＲＮＡ発現を測定し、これらの遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに基づく腫瘍転移のリスクを予測することを含む、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関する。
【００１２】
本発明の別の局面では、乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞における遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを測定し、それにより、これらの遺伝子の発現レベルに基づく転移スコア（ＭＳ）を得て、この転移スコアと所定の転移スコアカットポイント（ＭＳ閾値）とを比較することによってこの乳癌患者について腫瘍転移のリスクを測定することを含む、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関する。
【００１３】
本発明の更なる局面では、乳癌患者は、そのＭＳが所定のＭＳ閾値よりも高い場合に、腫瘍転移のリスクが増加していると決定される。
【００１４】
本発明の別の局面では、乳癌患者は、そのＭＳが所定のＭＳ閾値よりも低い場合に、腫瘍転移のリスクが減少していると決定される。
【００１５】
本発明の一局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、１４個の遺伝子サインのｍＲＮＡはＥＲ陽性の腫瘍細胞から得られ、ｃＤＮＡに逆転写され、ポリメラーゼ鎖反応増幅によって検出される。
【００１６】
本発明の別の局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、ＥＲ陽性の腫瘍細胞のｍＲＮＡは逆転写され、表３に記載される、配列番号１〜３４の各遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される。
【００１７】
本発明の別の局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、ＥＲ陽性の腫瘍細胞からのｍＲＮＡ発現の測定は、内在性対照（単数または複数）として、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７、またはそれらの組み合わせとして知られる遺伝子のいずれか１つのｍＲＮＡ発現に対して標準化される。
【００１８】
本発明の別の局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、ＥＲ陽性の腫瘍細胞からのｍＲＮＡ発現は、マイクロアレイによって検出される。
【００１９】
本発明の別の局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、ｍＲＮＡ発現は、下記：
【００２０】
【数１】
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の遺伝子の各遺伝子（ｉ）の標準化された発現レベルであり、ａ０は０．０２２であり、ａｉは１４個の遺伝子サインにおける遺伝子の各々について表２に示されている値に対応する）
によって転移スコア（ＭＳ）に計算される。
【００２１】
本発明の別の局面では、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、ｍＲＮＡ発現は、下記：
【００２２】
【数２】
等式１
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の遺伝子の各遺伝子（ｉ）の標準化された発現レベルであり、ａ０は０．０２２であり、ｂは−０．２５１であり、ａｉは１４個の遺伝子サインに含まれる遺伝子の各々について表２に示されている値に対応する）
によって転移スコア（ＭＳ）に計算される。標準化された発現レベルは、Δ（ΔＣｔ）において測定される発現レベルからトレーニングセットの遺伝子の平均発現を差し引くことによって得られ、次に、その遺伝子の遺伝子発現の標準偏差によって割られる。トレーニングセットの各遺伝子についての遺伝子発現の平均および標準偏差は表４に示される。等式１は、実施例１、２および３において用いられた。
【００２３】
本発明の更なる局面では、ＭＳ式は、下記の定義：
【００２４】
【数３】
等式２
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の遺伝子の各遺伝子（ｉ）のΔ（ΔＣｔ）において測定される発現レベルであり、ａ０が０．８６５７であり、ｂが−０．０４７７８であり、ａｉが全ての遺伝子について１である）
を推定することができる。等式２は、実施例４および５において用いられた。
【００２５】
本発明の更なる局面では、ＭＳ式は、ａ＝０、ｂ＝−１、ａｉ＝１であり得る。
【００２６】
本発明の別の局面では、上述された１４個の遺伝子の発現プロファイリングを用いて、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、各遺伝子（ｉ）の発現レベルＧｉは、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ 等式４
（式中、
Ｃｔは指数関数的な標的増幅のＰＣＲ閾値サイクルであり、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ＥＣは内在性対照であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者の試料ＲＮＡであり、ｒｅｆＲＮＡは参照ＲＮＡである）
によって遺伝子発現値Ｇｉに計算される。
【００２７】
本発明の別の局面では、上述した１４個の遺伝子の発現プロファイリングを用いて、乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法に関し、その場合、各遺伝子（ｉ）の発現レベルＧｉは、ＭＳスコアの１つの値に組み合わされ、ここで、関連のあるＭＳ閾値またはカットポイントよりも高いＭＳスコアを有する患者は、腫瘍転移に関して高いリスクにある。
【００２８】
本発明の一局面では、遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを検出するための試薬、酵素；およびバッファーを含むキットに関する。
【００２９】
本発明の別の局面では、遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むマイクロアレイに関する。
配列リスト
添付された配列リストは、全体として参照により本明細書中に援用される。配列リストは、表３に示されるオリゴヌクレオチド（配列番号１〜３４）を与える。これらのオリゴヌクレオチドは、表３に列挙された遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅における例示的なプライマーである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１ａ】ａ）遠隔転移までの時間、ｂ）ＣＰＭＣのトレーニングセットに関する全生存についてのカプラン−マイヤー曲線を示し、そこでは、高リスクおよび低リスク群は、カットポイントとしてゼロを用いたＭＳ（ＣＶ）によって特定された。
【図１ｂ】ａ）遠隔転移までの時間、ｂ）ＣＰＭＣのトレーニングセットに関する全生存についてのカプラン−マイヤー曲線を示し、そこでは、高リスクおよび低リスク群は、カットポイントとしてゼロを用いたＭＳ（ＣＶ）によって特定された。
【図２】ＣＰＭＣのトレーニングセットにおける５年以内のＭＳ（ＣＶ）による遠隔転移を予測するためのＲＯＣ曲線である。ＡＵＣ＝０．７６（０．６５−０．８７）。
【図３ａ】ガイ病院からの２８０人の未処置患者の遺伝子サインおよびアジュバント！によって特定されたリスク群によるカプラン−マイヤー曲線を示す。具体的には、図３ａ）およびｂ）は、１４個の遺伝子サインを用いた結果を記載し、図３ｃ）およびｄ）は、アジュバント！因子を用いた結果を示す。ａ）ＭＳリスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｂ）ＭＳリスク群よる全生存、ｃ）アジュバント！リスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｄ）アジュバント！リスク群による全生存。
【図３ｂ】ガイ病院からの２８０人の未処置患者の遺伝子サインおよびアジュバント！によって特定されたリスク群によるカプラン−マイヤー曲線を示す。具体的には、図３ａ）およびｂ）は、１４個の遺伝子サインを用いた結果を記載し、図３ｃ）およびｄ）は、アジュバント！因子を用いた結果を示す。ａ）ＭＳリスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｂ）ＭＳリスク群よる全生存、ｃ）アジュバント！リスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｄ）アジュバント！リスク群による全生存。
【図３ｃ】ガイ病院からの２８０人の未処置患者の遺伝子サインおよびアジュバント！によって特定されたリスク群によるカプラン−マイヤー曲線を示す。具体的には、図３ａ）およびｂ）は、１４個の遺伝子サインを用いた結果を記載し、図３ｃ）およびｄ）は、アジュバント！因子を用いた結果を示す。ａ）ＭＳリスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｂ）ＭＳリスク群よる全生存、ｃ）アジュバント！リスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｄ）アジュバント！リスク群による全生存。
【図３ｄ】ガイ病院からの２８０人の未処置患者の遺伝子サインおよびアジュバント！によって特定されたリスク群によるカプラン−マイヤー曲線を示す。具体的には、図３ａ）およびｂ）は、１４個の遺伝子サインを用いた結果を記載し、図３ｃ）およびｄ）は、アジュバント！因子を用いた結果を示す。ａ）ＭＳリスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｂ）ＭＳリスク群よる全生存、ｃ）アジュバント！リスク群による遠隔転移（ＤＭＦＳ）までの時間、ｄ）アジュバント！リスク群による全生存。
【図４ａ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図４ｂ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図４ｃ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図４ｄ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図４ｅ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図４ｆ】遺伝子サインおよびオンラインプログラムアジュバント！のレシーバー操作特徴（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示す。ａ）遺伝子サインに関する５年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｂ）遺伝子サインに関する１０年以内の遠隔転移についてのＲＯＣ曲線、ｃ）遺伝子サインに関する１０年以内の死亡に関するＲＯＣ曲線、ｄ）アジュバント！に関する５年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｅ）アジュバント！に関する１０年以内の転移についてのＲＯＣ曲線、ｆ）ガイ病院からの未処理患者についてのアジュバント！に関する１０年以内の死亡についてのＲＯＣ曲線。
【図５】２８０人のガイの未処理患者からの５年および１０年以内の遠隔転移の可能性に対する転移スコア（ＭＳ）の比較である。
【図６】１４個の遺伝子サインからの１０年以内の遠隔転移の可能性に対する、ガイ病院からの未処置患者についてのアジュバント！からの１０年の再発率の比較である。
【図７Ａ】ミュエンスター大学の患者における遠隔転移のない生存についてのカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図７Ｂ】ミュエンスター大学の患者における遠隔転移のない生存についてのカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図８】ガイ病院からの２０５人の処置患者に関する３ＭＳ群（高、中、低）の遠隔転移なしの生存のカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図９】ガイ病院からの２０５人の処置患者によって測定された２つのリスク群（高および低）における遠隔転移なしの生存のカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図１０】ガイの処置試料に関する５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣ＝０．７（０．５７−０．８７）。
【図１１Ａ】ガイ処置試料におけるＭＳによる高対低のリスク群のハザード率に依存した時間を示す。
【図１１Ｂ】ガイ処置試料におけるＭＳによる高対低のリスク群のハザード率に依存した時間を示す。
【図１２】２３４人の日本人試料における３つのＭＳ群（高、中、および低）に関する遠隔転移なしの生存（ＤＭＦＳ）のカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図１３】２３４人の日本人試料における２つのリスク群（高ＭＳは高リスクを有し、中および低ＭＳは低リスクを有する）についての遠隔転移なしの生存（ＤＭＦＳ）のカプラン−マイヤー曲線を示す。
【図１４】日本人患者に関する５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣ＝０．７３（０．６３−０．８４）。
【図１５Ａ】時間の関数として、ＭＳ群に対する年換算でのハザード率、および高対低リスク群のハザード率を示す。
【図１５Ｂ】時間の関数として、ＭＳ群に対する年換算でのハザード率、および高対低リスク群のハザード率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、乳癌転移を予測するために用いることができる多重遺伝子サイン、本明細書に開示されている遺伝子を検出するための方法および試薬、並びにこのような試薬を利用するアッセイまたはキットを提供する。本明細書に開示されている乳癌転移に関連した遺伝子は、乳癌患者のＥＲ陽性腫瘍の遠隔転移の可能性を診断、スクリーニング、および評価するのに有用である。
【００３２】
表２に開示されている分子サインの１４個の遺伝子の発現プロファイリングは、遠隔転移の予後を容易に推測することができる。表２に示されている情報は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）を含み、国立衛生研究所／国立医学図書館の全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から得られ、記載されている各遺伝子の１つの変異転写配列を特定する。この変異体の配列に基づいて、試薬は、１４個の遺伝子サインの各遺伝子の全ての変異体を特定するために設計されてもよい。表３は、各遺伝子の全ての変異体が増幅されるように、１４個の遺伝子サインの各遺伝子を検出するために用いることができる例示的なプライマーセットを提供する。このようにして、本発明は、本明細書に開示されている全ての遺伝子の全ての知られている転移変異体の発現プロファイリングを提供する。
【００３３】
また、表２には、各ＲｅｆＳｅｑのヌクレオチド配列を公開する参考文献が示されている。これらの参考文献の全ては、全体として参照により本明細書に援用される。また、表２には、各遺伝子の記述がある。参考文献および記述はともにＮＣＢＩによって提供された。
【００３４】
ＣＥＮＰＡ遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００１８０９によって特定され、Ｂｌａｃｋ，Ｂ．Ｅ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｄ．Ｒ．ら，２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３０（６９９９）：５７８−５８２に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３５】
ＰＫＭＹＴ１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００４２０３によって特定され、Ｂｒｙａｎ，Ｂ．Ａ．，Ｄｙｓｏｎ，Ｏ．Ｆ．ら，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７（ＰＴ３），５１９−５２９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３６】
ＭＥＬＫ遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０１４７９１によって特定され、Ｂｅｕｌｌｅｎｓ，Ｍ．，Ｖａｎｃａｕｗｅｎｂｅｒｇｈ，Ｓ．ら，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（４８），４０００３−４００１１に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３７】
ＭＹＢＬ２遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００２４６６によって特定され、Ｂｒｙａｎ，Ｂ．Ａ．，Ｄｙｓｏｎ，Ｏ．Ｆ．ら，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７（ＰＴ３），５１９−５２９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３８】
ＢＵＢ１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００４３６６によって特定され、Ｍｏｒｒｏｗ，ＣＪ．，Ｔｉｇｈｅ，Ａ．ら，２００５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１８（ＰＴ１６），３６３９−３６５２に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００３９】
ＲＡＣＧＡＰ１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０１３２７７によって特定され、Ｎｉｉｙａ，Ｆ．，Ｘｉｅ，Ｘ．ら，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（４３），３６５０２−３６５０９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４０】
ＴＫ１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００３２５８によって特定され、Ｋａｒｂｏｗｎｉｋ，Ｍ．，Ｂｒｚｅｚｉａｎｓｋａ，Ｅ．ら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２２５（２），２６７−２７３に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４１】
ＵＢＥ２Ｓ遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０１４５０１によって特定され、Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｄｉａｚ，Ｌ．Ａ．ら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２２），１５８２９−１５８３５に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４２】
ＤＣ１３遺伝子は、参照配列ＡＦ２０１９３５によって特定され、Ｇｕ，Ｙ．，Ｐｅｎｇ，Ｙ．ら，Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ，Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ Ｎｏｖ．５，１９９９、中国国家ヒトゲノムセンター、上海、351 Ｇｕｏ Ｓｈｏｕｊｉｎｇ Ｒｏａｄ，Ｚｈａｎｇｊｉａｎｇ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｐａｒｋ，Ｐｕｄｏｎｇ，Ｓｈａｎｇｈａｉ（上海市浦東新區張江高科技園區郭守敬路351號）201203、中華人民共和国に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４３】
ＲＦＣ４遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００２９１６によって特定され、Ｇｕｐｔｅ，Ｒ．Ｓ．，Ｗｅｎｇ，Ｙ．ら，２００５，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４（２），３２３−３２９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４４】
ＰＲＲ１１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０１８３０４によって特定され、Ｗｅｉｎｍａｎｎ，Ａ．Ｓ．，Ｙａｎ，Ｐ．Ｓ．ら，２００２，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６（２），２３５−２４４に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４５】
ＤＩＡＰＨ３遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０３０９３２によって特定され、Ｋａｔｏｈ，Ｍ．およびＫａｔｏｈ，Ｍ．，２００４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１３（３），４７３−４７８に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４６】
ＯＲＣ６Ｌ遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０１４３２１によって特定され、Ｓｉｂａｎｉ，Ｓ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｇ．Ｂ．ら，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４（２１），７８８５−７８９６に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４７】
ＣＣＮＢ１遺伝子は、参照配列ＮＭ＿０３１９６６によって特定され、Ｚｈａｏ，Ｍ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｔ．ら，２００６，Ｅｘｐ Ｏｎｃｏｌ ２８（１），４４−４８に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４８】
ＰＰＩＧ遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００４７９２によって特定され、Ｌｉｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｅｕ，Ｓ．ら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２１（３），６３８−６４７に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００４９】
ＮＵＰ２１４遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００５０８５によって特定され、Ｇｒａｕｘ，Ｃ，Ｃｏｏｌｓ，Ｊ．ら，２００４，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６（１０），１０８４−１０８９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００５０】
ＳＬＵ７遺伝子は、参照配列ＮＭ＿００６４２５によって特定され、Ｓｈｏｍｒｏｎ，Ｎ．，Ａｌｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．ら，２００５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１８（ＰＴ６），１１５１−１１５９に開示されている。この参照配列および参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
【００５１】
また、表２には、各遺伝子ｉに対する転移スコアを決定するために必要とされる一定のａｉについての値が示され、それは、その遺伝子について得られた発現プロファイリングの結果に基づいている。転移スコアの誘導およびその使用、遺伝子発現プロファイリングの方法、そこから得られたデータの使用が下記に記載されている。
【００５２】
このようにして、本発明は、乳癌転移についてともに予後となる１４個の別々の遺伝子、試験試料にあるこれらの遺伝子の発現レベルを決定する方法、遠隔転移を発祥する個体の可能性を決定する方法、処置戦略を選択するための開示されている遺伝子の使用方法を提供する。
【００５３】
本発明は、従来、当該技術分野において知られていなかった１４個の遺伝子サインの独自の組み合わせを提供する。したがって、本発明は、本明細書に開示されている遺伝子に基づく新規な方法を提供し、また、乳癌転移に関連した（例えば、乳癌転移の予後に関する）方法において、知られてはいるが、従来無関係とされた遺伝子を用いる方法を提供する。
【００５４】
当業者は、核酸分子が二重鎖分子であってもよく、１本鎖の特定配列への言及が、同様に、相補鎖の対応する部位への言及であることを容易に認識する。ヌクレオチド配列の定義において、核酸分子の１本鎖上の特定部位でのアデニン、チミジン（ウリジン）、シトシン、またはグアニンへの言及も、核酸分子の相補鎖上の対応する部位でのチミジン（ウリジン）、アデニン、グアニン、またはシトシン（それぞれ）を定義する。つまり、特定のヌクレオチド配列に言及するために、いずれかの鎖に言及がなされてもよい。プローブおよびプライマーは、いずれかの鎖にハイブリダイズするように設計されてもよく、本明細書に開示されている遺伝子発現プロファイリング法は、一般に、いずれかの鎖を標的としてもよい。
腫瘍組織供給源およびＲＮＡ抽出
本発明では、標的ポリヌクレオチド分子は、乳癌に苦しんでいる個体から採取された試料から抽出される。試料は、任意の臨床的に許容される方法で回収されてもよいが、遺伝子特異的なポリヌクレオチド（即ち、転写ＲＮＡ、またはメッセージ）は保存されるように回収されなければならない。次に、このようにして試料から得られたｍＲＮＡまたは核酸は、さらに分析されてもよい。例えば、遺伝子（例えば、表２に示されている遺伝子）に特異的なオリゴヌクレオチド対は、試料に含まれる特異的なｍＲＮＡ（単数または複数）を増幅させるために用いられてもよい。次に、各メッセージの量が測定されるか、またはプロファイルすることができ、疾患予後と関連付けることができる。あるいは、ｍＲＮＡまたはそれから誘導される核酸（即ち、ｃＤＮＡ、増幅されたＤＮＡまたは濃縮されたＲＮＡ）は、標準または対照のポリヌクレオチド分子から区別されるように標識されてもよく、両者は、上述されるマーカーのいくつかもしくは全部、またはマーカーセットもしくはサブセットを含むマイクロアレイに、同時にまたは個別にハイブリダイズされてもよい。あるいは、ｍＲＮＡまたはそこから誘導される核酸は、標準または対照のポリヌクレオチド分子と同じ標識で標識されてもよく、ここで、特定のプローブで各々のハイブリダイゼーションの強度が比較される。
【００５５】
試料は、いずれかの臨床的に関連する組織試料を含んでもよく、例えば、ホルマリン固定されたパラフィン包埋試料、凍結試料、腫瘍検体もしくは細針吸引物、または、ＥＲ陽性の腫瘍細胞を含む体液試料、例えば血液、血漿、血清、リンパ液、腹水もしくは嚢胞液、尿、または乳頭浸出液である。
【００５６】
トータルおよびポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製する方法は周知であり、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ − Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４））に記載されている。ＲＮＡは、細胞の溶解、そこに含まれているタンパク質の変性を含む、当該技術分野において周知であるいずれかの手法によって、ＥＲ陽性の腫瘍細胞から単離されてよい。
【００５７】
組織試料からＲＮＡを調製するための一例として、ＲＮＡは、当該技術分野において周知の技術を用いて、ホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から単離されてもよい。この目的のための市販キットは、例えば、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｑｉａｇｅｎ、またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから得ることができる。ＦＦＰＥ組織からトータルＲＮＡを単離する例示的な方法は、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ Ｓｌｉｄｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｚｙｍｏ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，Ｃａｌｉｆ.)に従えば、下記のとおりである。要約すると、Ｚｙｍｏキットから得られる溶液は、対象とする選択されたＦＦＰＥ組織領域全体に塗布され、乾燥される。次に、包埋された組織は、スライドから剥がされ、プロテイナーゼＫを含む遠心管に入れられる。組織を数時間インキュベート後、細胞溶解物を遠心分離し、上清を別の管に移す。ＲＮＡは、グアニジニウムチオシネート／βメルカプトエタノール溶液にエタノールを加え、混合した溶液を用いて、溶解物から抽出される。試料をスピンカラムに適用し、１分間回転される。エタノールおよびＴｒｉｓ／ＥＤＴＡを含むバッファーを用いてカラムを洗浄する。ＤＮａｓｅをカラムに添加し、インキュベートする。加熱したＲＮＡａｓｅを含まない水をカラムに添加し、遠心分離することによって、カラムからＲＮＡを抽出する。純粋なトータルＲＮＡは溶出物に存在する。
【００５８】
更なる工程は、汚染しているＤＮＡを除去するために用いられてもよく、例えば、上述されるように、スピンカラムにＤＮａｓｅが添加される。細胞溶解物は、非イオン性界面活性剤を用い、その後、核、したがって、細胞性ＤＮＡのバルクを除去するために、マイクロ遠心分離によって達成されてもよい。一態様では、ＲＮＡは、グアニジニウムチオシネートの存在下で細胞溶解後、ＣｓＣｌ遠心分離によりＤＮＡからＲＮＡを分離することによって対象とする種々のタイプの細胞から抽出される（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−５２９９（１９７９））。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロース（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ − Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照されたい）。あるいは、ＤＮＡからのＲＮＡの分離は、有機抽出、例えば、熱フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて達成することができる。
【００５９】
必要に応じて、ＲＮａｓｅ阻害剤を溶解バッファーに添加してもよい。同様に、ある種の細胞型については、タンパク質変性／消化工程をプロトコールに加えることが望ましい場合がある。
【００６０】
多くの応用に関して、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）などの、細胞から抽出された他の細胞性ＲＮＡに関して、選択的にｍＲＮＡを濃縮することが望ましい。大部分のｍＲＮＡは、それらの３’末端でポリ（Ａ）テールを含む。これは、アフィニティークロマトグラフィーによって；例えば、固体支持体、例えばセルロースまたはＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）に結合されたオリゴ（ｄＴ）またはポリ（Ｕ）を用いて、濃縮が可能になる（Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照されたい）。このようにして結合後、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、２ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１％ＳＤＳを用いてアフィニティーカラムから溶出される。
【００６１】
ＲＮＡ試料は、複数の異なるｍＲＮＡ分子を含んでもよく、各ｍＲＮＡ分子は、種々のヌクレオチド配列を有する。特定の態様では、ＲＮＡ試料のｍＲＮＡ分子は、本明細書に開示されている１４個の遺伝子の各々に対応するｍＲＮＡを含む。更なる特定の態様では、細胞からのトータルＲＮＡまたはｍＲＮＡは、本発明の方法に用いられる。ＲＮＡの供給源は、任意のＥＲ陽性の腫瘍細胞由来の細胞であってもよい。特定の態様では、本発明の方法は、１×１０６細胞以下からトータルｍＲＮＡまたはトータルＲＮＡを含む試料とともに用いられる。
遺伝子発現を測定するための試薬
本発明は、遺伝子発現プロファイリング、乳癌転移の予後の測定に用いることができる核酸分子を提供する。本明細書に記載されている１４個の遺伝子サインの遺伝子発現プロファイリングにおいて、プライマーとして用いることができる例示的な核酸分子は、表３に示されている。
【００６２】
表３に示されるように：
遺伝子ＢＵＢ１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１、下流プライマー（３’）としての配列番号２を用いて増幅される。
【００６３】
遺伝子ＣＣＮＢ１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号３、下流プライマー（３’）としての配列番号４を用いて増幅される。
【００６４】
遺伝子ＣＥＮＰＡは逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号５、下流プライマー（３’）としての配列番号６を用いて増幅される。
【００６５】
遺伝子ＤＣ１３は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号７、下流プライマー（３’）としての配列番号８を用いて増幅される。
【００６６】
遺伝子ＤＩＡＰＨ３は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号９、下流プライマー（３’）としての配列番号１０を用いて増幅される。
【００６７】
遺伝子ＭＥＬＫは逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１１、下流プライマー（３’）としての配列番号１２を用いて増幅される。
【００６８】
遺伝子ＭＹＢＬ２は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１３、下流プライマー（３’）としての配列番号１４を用いて増幅される。
【００６９】
遺伝子ＮＵＰ２１４は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号２９、下流プライマー（３’）としての配列番号３０を用いて増幅される。
【００７０】
遺伝子ＯＲＣ６Ｌは逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１５、下流プライマー（３’）としての配列番号１６を用いて増幅される。
【００７１】
遺伝子ＰＫＭＹＴ１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１７、下流プライマー（３’）としての配列番号１８を用いて増幅される。
【００７２】
遺伝子ＰＰＩＧは逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号３１、下流プライマー（３’）としての配列番号３２を用いて増幅される。
【００７３】
遺伝子ＰＲＲ１１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号１９、下流プライマー（３’）としての配列番号２０を用いて増幅される。
【００７４】
遺伝子ＲＡＣＧＡＰ１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号２１、下流プライマー（３’）としての配列番号２２を用いて増幅される。
【００７５】
遺伝子ＲＦＣ４は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号２３、下流プライマー（３’）としての配列番号２４を用いて増幅される。
【００７６】
遺伝子ＳＬＵ７は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号３３、下流プライマー（３’）としての配列番号３４を用いて増幅される。
【００７７】
遺伝子ＴＫ１は逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号２５、下流プライマー（３’）としての配列番号２６を用いて増幅される。
【００７８】
遺伝子ＵＢＥ２Ｓは逆転写され、上流プライマー（５’）としての配列番号２７、下流プライマー（３’）としての配列番号２８を用いて増幅される。
【００７９】
表２に示されている各遺伝子の完全なヌクレオチド配列に基づいて、当業者は、本明細書に記載されている１４個の遺伝子サインの増幅および／または検出に用いることができる更なるプライマーおよび／またはプローブを容易に設計し、合成することができる。
【００８０】
本発明の特定の局面では、表３に開示されている配列は、遺伝子発現プロファイリング試薬として用いることができる。本明細書中で使用するとき、「遺伝子発現プロファイリング試薬」とは、配列がｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであることを問わず、本明細書に記載されている遺伝子の特定の標的遺伝子のヌクレオチド配列を増幅および／または検出する方法に特に有用である試薬を指す。例えば、プロファイリング試薬は、好ましくは、異なる代替の遺伝子ヌクレオチド配列間を区別することができ、それによって、測定されるべきヌクレオチド配列の同定および定量を可能にする。典型的には、このようなプロファイリング試薬は、配列特異的な方法で相補的な塩基対によって標的核酸分子にハイブリダイズすることができ、試験試料に含まれる従来知られている形態などの他の核酸配列から標的配列を区別する。検出試薬の例には、表３に示されている配列の１つと実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む標的核酸にハイブリダイズするプローブが挙げられる。好ましい態様では、このようなプローブは、異なる遺伝子の核酸間で区別することができる。検出試薬の別の例には、逆転写またはＰＣＲなどの、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に沿ったヌクレオチド伸長の開始点として作用するプライマーが挙げられる。また、本明細書に示されている配列情報は、例えば、本発明のいずれかの遺伝子を逆転写および／または増幅（例えば、ＰＣＲを用いて）するプライマーを設計するために有用でもある。
【００８１】
本発明の１つの好ましい態様では、検出試薬は、表２に開示されている遺伝子のいずれかに対応する標的核酸分子のセグメントにハイブリダイズする、単離されたもしくは合成のＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチドプローブまたはプライマーまたはＰＮＡオリゴマー、あるいはＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＰＮＡの組み合わせである。ポリヌクレオチドの形態での検出試薬は、場合により、修飾された塩基類似体、インターカレート剤または副溝結合剤を含んでもよい。プローブなどの多重検出試薬は、例えば、固体支持体（例えば、アレイまたはビーズ）に付され、または溶液（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎアッセイ、またはプライマー伸長反応）で供給されて、発現プロファイリングキットを形成してもよい。
【００８２】
プローブまたはプライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーである。このようなオリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、標的核酸分子と少なくとも約８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、１００、１２０（または中間の任意の他の数）、またはそれを超える連続したヌクレオチドにハイブリダイズする相補的ヌクレオチド配列の領域を含む。
【００８３】
他の好ましいプライマーおよびプローブ配列は、表２に開示されている遺伝子のヌクレオチド配列を用いて容易に決定することができる。このようなプライマーおよびプローブは、本発明の遺伝子の発現プロファイリングのための試薬として直接的に有用であり、いずれかのキット／システムフォーマットに導入することができることは当業者に明確である。
【００８４】
標的遺伝子配列に特異的なプローブまたはプライマーを生成するために、遺伝子／転写配列は、典型的には、ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端で開始するコンピュータアルゴリズムを用いて調べられる。次に、典型的なアルゴリズムは、遺伝子配列に独特であり、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のＧＣ含有量を有し、ハイブリダイゼーションを妨げる可能性のある予測される二次構造を欠如し、および／または他の所望の特徴を有し、または他の望ましくない特徴を欠如している、所定の長さのオリゴマーを同定する。
【００８５】
本発明のプライマーまたはプローブは、典型的には、長さにして、少なくとも約８ヌクレオチドである。本発明の一態様では、プライマーまたはプローブは、長さにして少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましい態様では、プライマーまたはプローブは、長さにして少なくとも約１２ヌクレオチドである。より好ましいた態様では、プライマーまたはプローブは、長さにして少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドである。プローブの最大の長さは、用いられるアッセイのタイプに応じて、検出されるべき標的配列と同程度の長さであり得るが、典型的には、長さにして、約５０、６０、６５、または７０ヌクレオチド未満である。プライマーの場合には、典型的には、長さにして約３０ヌクレオチド未満である。本発明の特定の好ましい態様では、プライマーまたはプローブは、約１８と約２８ヌクレオチドの長さの範囲内である。しかしながら、他の態様では、核酸アレイ、プローブが基材に付される他の態様などのように、プローブはより長くてもよく、例えば、長さにして、３０〜７０、７５、８０、９０、１００、またはより長いヌクレオチドである。
【００８６】
本発明は、修飾された、合成のもしくは天然に存在しないヌクレオチドまたは構造成分、あるいは当該技術分野において知られている代替の／修飾された核酸化学を含む核酸類似体を包含する。このような核酸類似体は、例えば、表２において特定されている遺伝子の１以上を検出するための検出試薬（例えば、プライマー／プローブ）として有用である。さらに、これらの類似体を含むキット／システム（例えば、ビーズ、アレイなど）も本発明によって包含される。例えば、本発明の多型配列に基づくＰＮＡオリゴマーが、特に意図される。ＰＮＡオリゴマーは、ＤＮＡの類似体であり、そこでは、リン酸塩骨格は、ペプチド様骨格と置換される（Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４：１０８１−１０８２［１９９４］，Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６：７９３−７９６［１９９６］，Ｋｕｍａｒら，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３［９］：１２６９−１２７２［２００１］，国際公開第ＷＯ９６／０４０００号）。ＰＮＡは、従来のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体よりも高いアフィニティーおよび特異性で相補的ＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズする。ＰＮＡの特性は、伝統的なオリゴヌクレオチドおよびペプチドを用いては達成不可能な新しい分子生物学および生化学応用を可能にする。
【００８７】
核酸の結合特性および／または安定性を改善する核酸修飾の追加の例には、塩基類似体、例えばイノソン、インターカレート剤（米国特許第４，８３５，２６３号）、例えばエチジウムブロマイドおよびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、副溝結合剤（米国特許第５，８０１，１１５号）の使用を含む。このようにして、核酸分子、発現プロファイリング試薬（例えば、プローブおよびプライマー）、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドへの本明細書中での言及には、ＰＮＡオリゴマーおよび他の核酸類似体が含まれる。核酸類似体、当該技術分野において知られている代替の／修飾された核酸化学の他の例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００２）に記載されている。
【００８８】
各々の対立遺伝子に特異的なプライマーまたはプローブの設計は、標的核酸分子のヌクレオチド配列の正確な組成、プライマーまたはプローブの長さなどの変数に依存するが、プライマーおよびプローブの使用における別の因子は、プローブまたはプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションが実行される条件のストリンジェンシーである。高いストリンジェンシーな条件は、低イオン強度および／または高い反応温度を有するバッファーを利用し、安定な二重鎖を形成するために、プローブ／プライマーと標的配列との間の密接な適合を必要とする傾向がある。しかしながら、ストリンジェンシーが高すぎると、ハイブリダイゼーションは全く起こらない場合もある。対照的に、低いストリンジェンシー条件は、高イオン強度および／または低反応温度を有するバッファーを有し、プローブ／プライマーと標的配列との間のより不適合な塩基を有する安定な二重鎖の形成を許す。一例であって、限定されないが、対立遺伝子に特異的なプローブを用いた高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件のための例示的な条件は下記のとおりである：５×標準的なリン酸生理食塩水ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）、０．５％ ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）を含む溶液を５５℃で用いたプレハイブリダイゼーション、プローブと同溶液中で、同温度の標的核酸分子とのインキュベーション、その後、２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液を５５℃または室温で用いた洗浄。
【００８９】
中程度のストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、例えば、約５０ｍＭ ＫＣｌを含む溶液を約４６℃で用いるプライマー伸長反応に対して使用されてもよい。あるいは、この反応は、６０℃などの高温で実行されてもよい。別の態様では、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドの連結アッセイ（ＯＬＡ）反応に適し、ここで、２つのプローブは、標的配列の完全に相補的である場合に連結され、４６℃の温度で約１００ｍＭ ＫＣｌの溶液を利用してもよい。
【００９０】
ハイブリダイゼーションに基づくアッセイでは、１つの遺伝子配列の標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、他の遺伝子に由来する配列にはハイブリダイズしない特異的なプローブを設計することができる。ハイブリダイゼーション条件は、遺伝子間のハイブリダイゼーション強度、好ましくは本質的に２成分応答において有意に検出可能な相違があるように十分にストリンジェントでなければならない。それによって、プローブは、遺伝子配列のうちのただ１つにハイブリダイズするかまたは１つの遺伝子配列の有意により強力にハイブリダイズする。標的部位がプローブの配列に沿ってどこでも整列されるように、プローブが特定の遺伝子の標的配列にハイブリダイズするように設計されてもよいが、このプローブは、好ましくは、プローブの中心位置（例えば、プローブのいずれかの末端からの少なくとも３ヌクレオチドであるプローブ内の位置）で遺伝子配列が整列されるように標的配列のセグメントにハイブリダイズするように設計される。このプローブの設計は、一般に、異なる遺伝子間のハイブリダイゼーションにおいて良好な区別を達成する。
【００９１】
オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、当該技術分野において周知の方法によって調製されてもよい。化学合成法には、限定されないが、Ｎａｒａｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：９０［１９７９］によって記述されているホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：１０９［１９７９］によって記述されているホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９［１９８１］によって記述されているジエチルホスホアミデート法；米国特許第４，４５８，０６６号に記述されている固体支持法が含まれる。アレイに場合には、複数のプローブは、複数の異なる遺伝子配列の同時分析のための同じ支持体上に固定化されてもよい。
【００９２】
ＰＣＲに基づくアッセイの１タイプでは、遺伝子特異的なプライマーは、遺伝子配列に重複する標的核酸分子上の領域にハイブリダイズし、プライマーが完全な相補性を示す遺伝子配列の増幅をプライムするだけである（Ｇｉｂｂｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：２４２７−２４４８［１９８９］）。典型的には、プライマーの３’最大ヌクレオチドは、標的核酸分子と整列し、相補的となる。このプライマーは、遠位部位をハイブリダイズする第２プライマーとともに用いられる。増幅は、２つのプライマーから開始し、どの遺伝子／転写物が試験試料に存在するかを指示する検出可能な生成物を生成する。このＰＣＲに基づくアッセイは、下記に示されるＴａｑＭａｎアッセイの一部として利用することができる。
【００９３】
本明細書に記載されている１４個の遺伝子サインの遺伝子は、核酸試料に含まれる対象とするポリヌクレオチドのコピー数を増加させるために用いられる、種々の核酸増幅法のうちのいずれか１つによって検出することができる。このような増幅法は、当該技術分野において周知であり、それらには、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，編集，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９９２］）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０［１９８９］；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７［１９８８］）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国特許第５，２７０，１８４号および同第５，４２２，２５２号）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）（米国特許第５，３９９，４９１号）、連結リンカー増幅（ＬＬＡ）（米国特許第６，０２７，９２３号）など、等温増幅法、例えば、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立した配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１８７４［１９９０］）が含まれる。このような方法論に基づいて、当業者は、本明細書に開示されている遺伝子を増幅させるために、対象とする遺伝子配列の任意の適切な領域５’および３’において容易にプライマーを設計することができる。このようなプライマーは、任意の長さのＤＮＡを逆転写し、増幅させるために用いることができ、その結果、その配列に対象とする遺伝子を含む。
【００９４】
一般に、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも１６ヌクレオチドである。より典型的には、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも約２０ヌクレオチドである。本発明の好ましい態様では、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも約３０ヌクレオチドである。本発明のより好ましい態様では、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも約３２、４０、４５、５０、または６０ヌクレオチドである。本発明のなお別の好ましい態様では、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドである。本発明の増幅されたポリヌクレオチドの全長は、エクソン、イントロンまたは全遺伝子と同程度の長さであり得るが、増幅産物は、典型的には、長さにして最大約１，０００ヌクレオチドである（しかし、ある種の増幅方法は、長さにして１，０００ヌクレオチドよりも大きい増幅産物を生じてもよい）。より好ましくは、増幅されたポリヌクレオチドは、長さにして約１５０〜２５０ヌクレオチドよりも大きくはない。
【００９５】
本発明の態様では、本発明の遺伝子発現プロファイリング試薬は、検出可能なシグナルを発光する蛍光レポーター色素を用いて標識される。好ましいレポーター色素は蛍光色素であるが、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーなどの検出試薬に結合することができる任意のレポーター色素は本発明における使用に適している。このような色素には、限定されないが、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｄａｎｓ、Ｅｏｓｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、６−Ｆａｍ、Ｔｅｔ、Ｊｏｅ、Ｈｅｘ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｒｈｏｄｏｌ Ｇｒｅｅｎ、Ｔａｍｒａ、Ｒｏｘ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが含まれる。
【００９６】
本発明のなお別の態様では、検出試薬は、特に、その試薬がＴａｑＭａｎ（米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，５３８，８４８号）などの自己クエンチングプローブ、または分子指標プローブ（米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号）、あるいは他のステムレスまたは線状指標プローブ（Ｌｉｖａｋら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌ．４：３５７−３６２［１９９５］；Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８ ［１９９６］；Ｎａｚａｒｅｎｋｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５１６−２５２１［１９９７］；米国特許第５，８６６，３３６号および同第６，１１７，６３５号）として用いられる場合に、Ｔａｍｒａなどのクエンチャー色素を用いてさらに標識されてもよい。
【００９７】
また、本発明の検出試薬は、他の標識を含んでもよく、限定されないが、ストレプトアビジン結合に対するビオチン、抗体結合に対するハプテン、ジップコードの対などの別の相補性オリゴヌクレオチドへの結合に対するオリゴヌクレオチドが含まれる。
遺伝子発現キットおよびシステム
当業者は、本明細書に開示されている遺伝子および配列情報に基づいて、発現プロファイリング試薬が、個別にまたは組み合わせて本発明のいずれかの遺伝子を評価するために作製され、用いることができ、このような検出試薬が、当該技術分野において周知である確立したキットまたはシステムの１つに容易に組み込むことができることを認識する。用語「キット」および「システム」は、遺伝子発現プロファイリング試薬との関連において本明細書中で使用するとき、複数の遺伝子発現プロファイリング試薬の組み合わせ、または１以上のタイプのエレメントもしくは成分（例えば、他のタイプの生化学試薬、容器、包装、例えば市販用に意図された包装、遺伝子プロファイリング試薬が結合する基材、電子機器コンポーネントなど）と組み合わせた１以上の遺伝子発現プロファイリング試薬などのようなものを指すことが意図される。したがって、本発明は、さらに、遺伝子発現プロファイリングキットおよびシステムを提供し、限定されないが、パッケージ化されたプローブおよびプライマーセット（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ／プライマーセット）、核酸分子のアレイ／マイクロアレイ、１以上のプローブ、プライマー、または本発明の１以上の遺伝子をプロファイルするための他の検出試薬が挙げられる。キット／システムは、場合により、種々の電子機器コンポーネントを含むことができる；例えば、種々の製造業者から提供されるアレイ（「ＤＮＡチップ」）および微小流体システム（「ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ」システム）は電子機器コンポーネントを含む。他のキット／システム（例えば、プローブ／プライマーセット）は、電子機器コンポーネントを含まなくてもよいが、例えば、１以上の容器に包装された１以上の遺伝子発現プロファイリング試薬（並びに、場合により、他の生化学試薬）から構成されてもよい。
【００９８】
ある態様では、遺伝子発現プロファイリングキットは、典型的には、１以上の検出試薬、並びに、遺伝子を含む核酸分子の逆転写、増幅および／または検出などのアッセイまたは反応を行うために必要な他の成分（例えば、バッファー、酵素、例えば逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼ、逆転写および鎖伸長ヌクレオチド、例えばデオキシヌクレオチド三リン酸、サンガータイプのＤＮＡシークエンシング反応の場合には、連鎖停止ヌクレオチド、陽性対照配列、陰性対照配列など）を含む。さらに、キットは、標的核酸の量を測定するための手段、その量と標準とを比較するための手段を含み、対象とする遺伝子を含む核酸分子を検出するキットを用いるための指示書を含むことができる。本発明の一態様では、本明細書に開示されている１以上の遺伝子の発現をプロフィールする１以上のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。本発明の好ましい態様では、遺伝子発現プロファイリングキット／システムは、核酸アレイ、または区分化されたキットの形態であり、微小流体／ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステムが含まれる。
【００９９】
遺伝子発現プロファイリングキット／システムは、例えば、各々の標的遺伝子配列の位置でまたはその近傍で核酸分子にハイブリダイズする１以上のプローブ、またはプローブ対を含んでもよい。遺伝子特異的なプローブの複数の対は、大多数の遺伝子を同時に評価するキット／システムに含むことができ、それらの遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子は、本発明の遺伝子である。あるキット／システムでは、遺伝子特異的なプローブは、アレイまたはビーズなどの基材に固定されている。例えば、同基材は、表２に示されている遺伝子の少なくとも１つもしくは実質的に全部の遺伝子、またはその中間の任意の他の数において検出するための遺伝子特異的なプローブを含むことができる。
【０１００】
用語「アレイ」、「マイクロアレイ」、および「ＤＮＡチップ」は、本明細書において、基材（例えば、ガラス、プラスチック、紙、ナイロンまたは他のタイプのメンブレン、フィルタ−、チップ、もしくは他の適切な固体支持体）に付された別個のポリヌクレオチド群のアレイを指すように互換可能に使用されている。ポリヌクレオチドは、上記基材上で直接合成されるか、または基材とは別個に合成された後、その基材に付されてもよい。一態様では、マイクロアレイは、米国特許第５，８３７，８３２号（Ｃｈｅｅら）、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９５／１１９９５号（Ｃｈｅｅら）、Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５〜１６８０［１９９６］）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０６１４〜１０６１９［１９９６］）に記載される方法に従って、調製され、使用される。これらの文献の全ては、全体として参照により本明細書に援用される。他の態様では、このようなアレイは、Ｂｒｏｗｎら、米国特許第５，８０７，５２２号により記載される方法により生成される。
【０１０１】
核酸アレイは、下記の参考文献に概説されている：Ｚａｍｍａｔｔｅｏら，“Ｎｅｗ ｃｈｉｐｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．８：８５−１０１（２００２）；Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら，“Ａｃｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｇｅｎｅｔ．１２（４）：１８１−９２（Ｄｅｃ．２００２）；Ｈｅｌｌｅｒ，“ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｄｅｖｉｃｅｓ，ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．４：１２９−５３（２００２）；Ｅｐｕｂ Ｍａｒ．２２ ２００２；Ｋｏｌｃｈｉｎｓｋｙら，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳＮＰｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｇｅｌ−ｂａｓｅｄ ｃｈｉｐｓ，”Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９（４）：３４３−６０（Ａｐｒ．２００２）；ＭｃＧａｌｌら，“Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｅｎｅｃｈｉｐ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ ａｒｒａｙｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２１−４２（２００２）。
【０１０２】
任意数のプローブ、例えば遺伝子特異的プローブは、アレイにおいて実施されてもよく、各プローブまたはプローブ対は、異なる遺伝子配列位置にハイブリダイズすることができる。ポリヌクレオチドプローブの場合、それらは、光指向性化学プロセスを用いて、基材上の指定領域で合成することができる（または、別個に合成された後、指定領域に付することができる）。各ＤＮＡチップは、格子様パタ−ンで整列され（例えば、１０セント硬貨の大きさに）小型化された、例えば、数千から数億個の個々の合成ポリヌクレオチドプローブを含むことができる。好ましくは、プローブは、順序立ったアドレス指定可能なアレイで固体支持体に付される。
【０１０３】
マイクロアレイは、固体支持体に固定された多数の独特の一本鎖ポリヌクレオチド、通常、合成アンチセンスポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡフラグメントのいずれかから構成され得る。典型的なポリヌクレオチドは、好ましくは長さにして約６〜６０ヌクレオチド、より好ましくは長さにして約１５〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは長さにして約１８〜２５ヌクレオチドである。ある種のタイプのマイクロアレイまたは他の検出キット／システムに関しては、長さにしてほんの約７〜２０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい場合がある。他のタイプのアレイ、例えば化学発光検出技術と組み合わせて使用されるアレイにおいて、好ましいプローブの長さは、例えば、長さにして約１５〜８０ヌクレオチド、好ましくは長さにして約５０〜７０ヌクレオチド、より好ましくは長さにして約５５〜６５ヌクレオチド、最も好ましくは長さにして約６０ヌクレオチドであってもよい。このマイクロアレイまたは検出キットは、遺伝子／転写物の既知の５’配列または３’配列を網羅するポリヌクレオチド、遺伝子／転写物の全長配列を網羅する連続するポリヌクレオチド；または標的遺伝子／転写物配列の長さに沿った特定の領域、特に、表２に開示されている１以上の遺伝子に対応する領域から選択される独特のポリヌクレオチドを含むことができる。このマイクロアレイまたは検出キットにおいて用いられるポリヌクレオチドは、対象とする遺伝子または複数の遺伝子に対して特異的（例えば、標的遺伝子配列内の特定のサイン配列に対して特異的、または複数の異なる配列部位にある特定の遺伝子配列に対して特異的）であり得るか、あるいは対象とする多型遺伝子／転写物または複数の遺伝子／複数の転写物に対して特異的であり得る。
【０１０４】
ポリヌクレオチドアレイに基づくハイブリダイゼ−ションアッセイは、完全一致した標的配列およびミスマッチした標的配列に対するプローブのハイブリダイゼ−ション安定性の差異に依存する。
【０１０５】
他の態様では、アッセイは、化学発光検出技術と組み合わせて用いられる。下記の特許および特許出願は、その全てが全体として参照により本明細書中に援用され、化学発光検出に関するさらなる情報を提供する：米国特許出願第１０／６２０３３２号および同第１０／６２０３３３号は、マイクロアレイ検出のための化学発光アプローチを記載し；米国特許第６１２４４７８号、同第６１０７０２４号、同第５９９４０７３号、同第５９８１７６８号、同第５８７１９３８号、同第５８４３６８１号、同第５８００９９９号、および同第５７７３６２８号は、化学発光検出を実施するための方法およびジオキセタンの組成物を記載し；米国出願公開第ＵＳ２００２／０１１０８２８号は、マイクロアレイコントロールのための方法および組成物を開示する。
【０１０６】
本発明の一態様では、核酸アレイは、長さにして約１５〜２５ヌクレオチドのプローブのアレイを含むことができる。さらなる態様では、核酸アレイは、任意数のプローブを含むことができ、ここで、少なくとも１つのプローブは、表２に開示されている１以上の遺伝子を検出することができ、および／または少なくとも１つのプローブは、表２に開示されている配列からなる群より選択される遺伝子配列、並びにそれに相補的な配列のうちの１つのフラグメントを含み、そのフラグメントは、少なくとも約８個の連続するヌクレオチド、好ましくは、１０個、１２個、１５個、１６個、１８個、２０個、より好ましくは２２個、２５個、３０個、４０個、４７個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、８０個、９０個、１００個（またはその中間の他の任意の個数）以上連続するヌクレオチド、表２に開示されている遺伝子の配列（またはそれに相補的である）を含む。ある態様では、この遺伝子部位に対して相補的なヌクレオチドは、上記プローブの中心から５、４、３、２、または１ヌクレオチド内、より好ましくはそのプローブの中心にある。
【０１０７】
ポリヌクレオチドプローブは、全体として参照により本明細書中に援用されるＰＣＴ国際出願第ＷＯ９５／２５１１１６号（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら）に記載されるように、化学カップリング手順およびインクジェット適用装置を用いることによって、基材表面上で合成され得る。別の局面では、ドット（またはスロット）ブロットと類似する「格子状」アレイが、真空系、熱的結合手順、ＵＶ結合手順、機械的結合手順、または化学結合手順を用いて、基材表面にｃＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを整列させて結合するために使用され得る。アレイ、例えば、上記のアレイは、手動によって、あるいは利用可能なデバイス（スロットブロット装置またはドットブロット装置）、材料（適切な任意の固体支持体）、および機器（ロボット機器を含む）を用いることによって生成することができ、８個、２４個、９６個、３８４個、１５３６個、６１４４個以上のポリヌクレオチド、または市販の機器の効率的使用のために適する他の任意の数のポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０１０８】
このようなアレイまたは他のキット／システムを用いて、本発明は、試験試料中に含まれる本明細書に開示されている遺伝子を同定し、その発現をプロファイリングするための方法を提供する。このような方法は、典型的には、核酸の試験試料を、本発明の少なくとも１つの遺伝子配列の位置に対応する１以上のプローブを含むアレイとともにインキュベートすること、並びにこの試験試料由来の核酸とプローブの１以上との結合について評価することを伴う。遺伝子発現プロファイリング試薬（またはこのような１以上の遺伝子発現プロファイリング試薬を用いるキット／システム）を試験試料とともにインキュベートする条件は変化する。このインキュベーション条件は、アッセイにおいて用いられるフォーマット、用いられるプロファイリング方法、並びにアッセイにおいて用いられるプロファイリング試薬のタイプおよび性質などの因子に依存する。当業者は、市販のハイブリダイゼーション、増幅およびアレイアッセイフォーマットのうちのいずれか１つが、本明細書に開示されている遺伝子を検出するために容易に適合され得ることを認識する。
【０１０９】
本発明の遺伝子発現プロファイリングキット／システムは、試験試料から核酸を調製し、その後、逆転写、ＲＮＡ濃縮、遺伝子配列を含む核酸分子の増幅および／または検出のために用いられる成分を含んでもよい。このような試料調製成分は、いずれかの腫瘍組織供給源、例えば、限定されないが、新鮮な腫瘍生検、凍結もしくはホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）の組織標本、またはいずれかの方法によって回収および保存された腫瘍由来の核酸抽出物（ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を生成するために用いることができる。上述される方法において用いられる試験試料は、アッセイフォーマット、プロファイリング方法の性質、アッセイされるべき試験試料として用いられる特定の組織、細胞または抽出物などの因子に基づいて変更する。核酸を調製する方法は、当該技術分野において周知であり、利用されるシステムと適合可能な試料を得るために容易に適用され得る。試験試料から核酸を抽出するための自動化された試料調製システムは市販され、例えば、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ ＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００，Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＲＩＳＭ ６７００、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳｙｓｔｅｍｓのＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。
【０１１０】
本発明によって意図されるキットの別の形態は、区分化されたキットである。区分化されたキットには、試薬が別々の容器に含められているいずれかのキットが含まれる。このような容器には、例えば、小さなガラス容器、プラスチック容器、プラスチック、ガラスもしくはペーパーのストリップ、またはシリカなどのアレイ用材料が含まれる。このような容器は、試験試料および試薬が二次汚染しないように１つの区分から別の区分に、あるいは１つの容器からキットに含まれない別の入れ物に、試薬を効率的に移すことができる。このような容器には、例えば、試験試料を受け入れる１以上の容器、本発明の１以上の遺伝子の発現をプロファイリングするための少なくとも１つのプローブまたは他の遺伝子発現プロファイリング試薬を含む１以上の容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓバッファーなど）を含む１以上の容器、結合したプローブまたは他の遺伝子発現プロファイリング試薬の存在を示すために用いられる試薬を含む１以上の容器が含まれてもよい。このキットは、場合により、さらに、区分および／または試薬、例えば、逆転写、ＲＮＡ濃縮、核酸増幅または他の酵素反応、例えばプライマー伸長反応、ハイブリダイゼーション、連結、電気泳動（好ましくはキャピラリー電気泳動）、質量分析、および／またはレーザー誘導の蛍光検出のための試薬を含む。また、キットは、そのキットを用いるための指示書を含んでもよい。例示的な区分化されたキットは、当該技術分野において知られている微小流体デバイスを含む（例えば、Ｗｅｉｇｌら，“Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２４，５５［３］：３４９−７７［２００３年２月］を参照されたい）。このような微小流体デバイスでは、容器は、例えば、微小流体「区分」、「チャンバー」、または「チャネル」とも呼ばれる場合がある。
遺伝子発現プロファイリング試薬の使用
本発明の表３に示される核酸分子は、特に、乳癌転移の予後における種々の用途を有する。例えば、核酸分子は、増幅プライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、転写ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、増幅されたＤＮＡまたは他の核酸分子を用いた発現プロファイリングのために、並びに、表２に開示されている遺伝子およびそれらの相同体をコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために有用である。
【０１１１】
プローブは、核酸分子の全長に沿って、いずれかのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。好ましくは、本発明のプローブは、表２に指示されている遺伝子の遺伝子配列を包含する標的配列の領域にハイブリダイズする。より好ましくは、プローブは、配列特異的な方法で、遺伝子を含む標的配列にハイブリダイズし、その結果、標的配列と、標的配列とは異なる他のヌクレオチド配列とを区別する。このようなプローブは、試験試料に含まれる遺伝子を含む核酸の存在の検出に特に有用である。
【０１１２】
このようにして、本発明の核酸分子は、本明細書に開示されている遺伝子の発現レベルを検出およびプロファイリングするために、ハイブリダイゼーションプローブ、逆転写および／または増幅プライマーとしても用いることができ、それにより、乳癌およびその発現プロファイリングを有する個体は遠隔転移に対するリスクにあることを決定する。開示されている発現プロファイリングは、遠隔転移に対する予後ツールを提供する。
転移スコアの作成
表２に開示されている１４個の遺伝子の発現レベルは、転移リスクを予測する転移スコア（ＭＳ）を誘導するために用いることができる。発現レベルは、Δ（ΔＣｔ）法によって計算されてもよく、ここで、Ｃｔは、標的増幅のための閾値サイクル；即ち、標的の時間の指数関数的な増幅が始まるＰＣＲにおけるサイクル数である。（ＫＪ Ｌｉｖａｋ ａｎｄ ＴＤ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４０２−４０８）。１４個のプロファイルされた遺伝子の各々のｍＲＮＡのレベルは、
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＧｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
として定義されてもよく、ここで、ＧＯＩは対象とする遺伝子（１４個のサイン遺伝子の各々）であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者試料から得られたＲＮＡであり、ｒｅｆＲＮＡは校正参照ＲＮＡであり、ＥＣは内在性対照である。各サイン遺伝子の発現レベルは、初めに、表２（ＥＣ）に列挙されている３個の内在性対照遺伝子に標準化されてもよい。３個の内在性対照（ＣｔＥＣ）の増幅から得られた、Ｃｔ（複数）の平均のＣｔを用いて、ただ１つの対照遺伝子が用いられる場合に発生する標準化バイアスのリスクを最小化することができる。（Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，ＰＪ Ｈｉｇｇｉｎｓら，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：３３２−３３７）。内在性対照遺伝子を増幅するために選択的に用いられてもよいプライマーを表３に列挙している；しかし、これらの内在性対照を増幅することができるプライマーは、これらの開示されたオリゴヌクレオチドに限定されない。対象とする遺伝子の調整された発現レベルは、校正参照ＲＮＡプール、ｒｅｆＲＮＡ（ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）にさらに標準化されてもよい。これは、種々の機械から得られた発現結果を標準化するために用いられてもよい。
Δ（ΔＣｔ）値は、１４個のサイン遺伝子の各々についての遺伝子発現プロファイリングにおいて得られ、転移スコア（ＭＳ）を作成するための下記の式：
【０１１３】
【数４】
（式中、Ｇｉは１４個の遺伝子予後サインの各遺伝子（ｉ）の発現レベルを表す）
に用いられてもよい。Ｇｉの値は、上述される発現プロファイリングにおいて得られるΔ（ΔＣｔ）である。各遺伝子ｉについての定数ａｉは、表２に与えられている。定数ａ０は０．０２２である；これは、ＭＳを中心にし、それにより、その中央値はゼロとなる。Ｍは、成分リストにおける遺伝子数である；この場合は１４である。このようにして、ＭＳは、表２に開示されている１４個の遺伝子についての発現レベルの総和の測定であり、各々は、表２にもある特定の定数ａｉによって乗じられ、最終的には、この総和は、ＭＳを誘導するために中心の定数０．０２２に加えられる。
【０１１４】
あるいは、Δ（ΔＣｔ）値は、１４個のサイン遺伝子の各々についての遺伝子発現プロファイリングにおいて得られ、転移スコア（ＭＳ）を作成するための下記の式：
【０１１５】
【数５】
（式中、Ｇｉは１４個の遺伝子予後サインの各遺伝子の標準化された発現レベルを表す）
に用いられてもよい。Ｇｉの値は、上述される発現プロファイリングにおいて得られるΔ（ΔＣｔ）において測定される元々の発現レベルから平均の遺伝子発現を差し引き、次に、トレーニングセットにおける遺伝子発現の標準偏差によって割ることにより得られる。各遺伝子ｉに対する定数ａｉは、表２に与えられている。定数ｂは、−０．２５１であった。正しいサインおよびスケーリングを得るには、予測材料として主成分を用いて一変量Ｃｏｘモデルからであった。定数α０は０．０２２である；これは、ＭＳを中心にし、それにより、その中央値はゼロとなる。Ｍは、成分リストにある遺伝子数である；この場合は１４である。このようにして、ＭＳは、表２に開示されている１４個の遺伝子についての発現レベルの総和の測定であり、各々は、表２にも示されている特定の定数ａｉによって乗じられる。この総和は、定数ｂによって乗じられ、次に、中心定数０．０２２は、ＭＳを誘導するために加えられる。
【０１１６】
いずれかの新しい試料は、その患者に関する１４個の遺伝子発現プロファイリングデータからこの転移スコアを作成することによって評価されてもよく、このスコアから、患者についての遠隔転移の可能性を測定することができる。
【０１１７】
ＭＳスコアは、上述されるΔ（ΔＣｔ）の値の和を単純化することができ、この場合、ＭＳの式は、α０の値をゼロで置換することによって単純化され、定数ａｉは１であることに留意されたい。
【０１１８】
また、ＭＳは、上述されるΔ（ΔＣｔ）の値の和を単純化し、次に、正しいサインおよびスケーリングについて定数−０．０４７７８によって乗じられ、それにより、遠隔転移リスクは、ＭＳの増加とともに増えることに留意されたい。最後に、定数０．８６５７は、ＭＳがゼロになるように添加される。この代替の方法において誘導されるＭＳスコアは、１４個全ての遺伝子の等しい計量を有する。遠隔転移のリスクは、ＭＳが増加するにつれて増える。本明細書に記載されている２つの異なるＭＳスコアは、非常に高い相関を有し、ピアソン相関係数は０．９９９より大きい。
ＭＳからの遠隔転移可能性の作成
いずれかの個体の患者に関する遠隔転移の可能性は、基礎生存関数としてＷｅｉｂｕｌｌ分布を用いて、変更可能な時間点でＭＳから計算され得る。
【０１１９】
１４個の遺伝子サインの発現プロファイリングから、上記で得られた転移スコア（ＭＳ）は、Ｃｏｘ比例ハザードモデルによって遠隔転移の可能性に転換された。Ｃｏｘモデルは、基準のハザード機能を特定しないため、ハザードおよび生存機能は、初めに、パラメトリック抑制モデルを通じて構築された。パラメトリックな抑制モデルにおいて、遠隔転移なしの生存時間は結果であり、転移スコア（ＭＳ）は独立した可変インプットであった。イベント時間は、Ｗｅｉｂｕｌｌ分布を有するように想定された；その２つのパラメータは、ＭＳが誘導される生存データを用いて推定された。患者についてある種の時間内に遠隔転移の可能性を計算するために、ＭＳ値は、単に、生存機能についてその式に置換される。
リスク測定におけるＭＳスコアの臨床応用
転移に関するリスクの測定にＭＳスコアを用いるという１つの方法は、ＭＳ「カットポイント」としても知られている１以上のＭＳ閾値を作成することである。このようなＭＳ閾値は、このような患者が増加したリスクまたは減少したリスクのいずれかを有するかを決定するために、乳癌患者のＭＳスコアと比較した場合に、基準として用いることができる。ＭＳ閾値は、異なる方法によって測定することができ、転移スコアの異なる定義によって異なっている。実施例１、２および３で用いられる等式１において定義されているＭＳに関して、ＭＳ閾値は、高リスク群対低リスク群のハザード率から決定された。遠隔転移なしの生存についてのカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線は、ＭＳカットポイントによって特定された高および低リスクの患者群について作成される。カットポイントとしての中央値ＭＳの選択は、ＭＳの１０パーセンタイルからＭＳの９０パーセンタイルの異なるカットポイントを用いた、高リスク群対低リスク群のハザード率の計算に基づいている。中央値のカットポイントは、高および低リスク群において等しい数の個体が存在する場合に、カットポイントとして特定することができ、実施例１に記載されるトレーニング試料において最大に近いハザード率を生み出すことが見出される。中央値ＭＳのカットポイントを用いたハザード率（ＨＲ）および９５％の信頼区間が計算され、報告され得る。ログランク（ｌｏｇ ｒａｎｋ）試験が行われ、ハザード率は、異なるカットポイントについて計算される。５年での遠隔転移の予測における１４個の遺伝子サインの精度および値は、種々の手段によって評価することができる。（ＸＨ Ｚｈｏｕ，Ｎ．Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，編集，２００２，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。実施例４および５で用いられる等式２において定義されているＭＳに関して、ＭＳ閾値は、実施例２に記載されているガイ病院からの試料における５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳの感受性および特異性から決定される。２つのカットポイントは、５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳの感受性が、第１のカットポイントが用いられると９０％を超えるように選択される。第２のカットポイントは、５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳの感受性および特異性がともに７０％であるように選択される。等式２において定義されているＭＳに関して、第１のＭＳ閾値は−０．１１８６であり、第２のＭＳ閾値は０．３０１９である。２つのＭＳカットポイントを用いた場合、高、中、および低ＭＳ群がある。ガイ病院からの処置された試料、日本の愛知県がんセンターからの試料では、高ＭＳ群は、高リスク群として設計され、中および低ＭＳ群は低リスク群として設計される。
【実施例】
【０１２０】
下記の実施例は、例証するために提供され、請求される発明を限定するものではない。
（実施例１）
１４個の遺伝子予後サインのｍＲＮＡ発現レベルが１４２人のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌患者の遠隔転移に対するリスクを予測する
下記の実施例は、１４個の遺伝子予後サインがどのようにして同定され、日常的な臨床検査室試験においてでさえ、乳癌患者の遠隔転移に関する予後の決定にどのように用いることができるかを例証する。臨床医は、生検、ＦＦＰＥ、凍結組織などの多くの手段から得られたＲＮＡを用いて、本明細書に開示されている１４個の遺伝子に基づくｍＲＮＡ発現プロファイリングを行い、次に、予後転移スコアを測定するために本明細書に与えられたアルゴリズムに発現データを挿入することができる。
【０１２１】
リンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌患者から得られたＦＦＰＥ組織は、後述される実施例に用いられた。初期セットの２００個の遺伝子を分析して、最終の１４個の遺伝子サインを誘導した。文献で以前に報告された遺伝子は、このサインのための候補遺伝子として含められた。また、本実施例では、このサインと、日常的に使用されている予後因子およびツールとの重複の程度を測定した。
【０１２２】
リンパ節転移陰性のＥＲ陽性患者からの腫瘍は、この試験のために選択され、それは、リンパ節転移陰性患者に関する予後情報が処置戦略の指標に非常に価値があるからである。また、マイクロアレイ研究は、この腫瘍のサブセットが他のタイプの乳癌腫瘍と臨床的に区別されることを指示する。（Ｔ．Ｓｏｒｌｉｅ，ＣＭ Ｐｅｒｏｕら，２００１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：１０８６９−１０８７４；Ｃ．Ｓｏｔｉｒｉｏｕ，ＳＹ Ｎｅｏら，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：１０３９３−１０３９８）。ＦＦＰＥ切片において、Ｈ．Ｄａｉ（Ｈ．Ｄａｉ，ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６）、ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ（ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｈ．Ｄａｉら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−５３６）、ＳＰ Ｐａｉｋ（ＳＰ Ｐａｉｋ，Ｓ．Ｓｈａｋら，２００４，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５１：２８１７−２８２６）によって報告された遺伝子サインからの発現プロファイリングのために遺伝子が選択され、これらの遺伝子の構造安定性、並びに日常的に回収され、保存された臨床試料が転移の予後に用いられ得る程度を測定した。遺伝子発現データから、転移スコアを作製して、いずれかの期間、個々の患者における遠隔転移の可能性を推測した。
患者および試料
初期段階の乳癌を有する、合計１４２人のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性患者が選択され、全ては、全身性アジュバント療法で処置されていない患者由来であった（表１のトレーニング試料）。この研究を乳癌症例のサブセットに限定することによって、分子サインは、転移とのより説得力のある関連性を伴って同定され、異なる試料セット全体でより堅固であり、日常的な臨床実施への転換を良好に促進するように少量の遺伝子を含んでいる。患者の平均年齢は、約６２歳である（３１〜８９歳の範囲）。
【０１２３】
非常に特徴付けられた乳房腫瘍試料セットが本研究のための試料の供給源として役割を果たした；このセットは、カリフォルニア パシフィック メディカルセンター（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＰＭＣ）で１９７５から１９８６年まで生じた。初期の研究のための試験対象患者基準は、リンパ節転移陰性であり、全身療法を受けておらず、８年間フォローアップケアを受けた患者由来の腫瘍からの試料を含んでいた。
【０１２４】
各機関の医療倫理委員会によって、本研究における使用のための試料が承認された。試料を提供する患者は、ＥＳＲ１遺伝子の発現レベルの測定に基づいて、ＥＲ陽性として分類された。ＥＳＲ１遺伝子の発現レベルは、個体のＥＲ状態とよく相関する。（Ｍ．Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｐｈｏら，２００４，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４（１）：３５−４２；ＪＭ Ｋｎｏｗｌｄｅｎ，ＪＭ Ｇｅｅら，１９９７，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３：２１６５−２１７２）。
【０１２５】
遠隔転移のない生存が、癌に関連した死亡に最も直接的に連結されるため、一次評価項目として選択された。二次評価項目は、全生存であった。
試料加工
各々のパラフィンブロックから４つの１０μｍ切片をＲＮＡ抽出のために用いた。腫瘍領域は、ガイドスライドに基づいて取り出し、そこでは、癌の細胞領域は、病理学者によって標識され、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ Ｓｌｉｄｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ ＣＡ）を用いてＲＮＡを抽出した。
【０１２６】
トータルＲＮＡの収量は試料間で変化した。分析に利用可能なＲＮＡ量を増やすために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ線状増幅が、抽出されたＲＮＡに対して行われた。ＦＦＰＥ試料から単離されたＲＮＡは、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐＩＩ ａＲＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）を用いて、Ｔ７に基づくＲＮＡ増幅に供した。
【０１２７】
ＲＮＡ増幅の前後で、遺伝子発現の一貫性を評価するために、多数の実験が、異なる試料に含まれる種々の遺伝子に対して行われた。初めに、０．１〜１００ｎｇのトータルＲＮＡを用いて、本研究の一部ではない６７個のＦＦＰＥ試料由来のＲＮＡに対して増幅を行った。２０個の遺伝子のプロファイリングは、得られた濃縮ＲＮＡおよび元々の濃縮されていないＲＮＡを用いて行われた。これらの比較は、倍数濃縮が遺伝子間で変換することを示した；しかしながら、相対的な発現レベルは、６７個の試料のうち２０個全ての遺伝子において、ＲＮＡ増幅の前後で一貫していた。
【０１２８】
本研究のためのＲＮＡは、上述したように、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐＩＩ ａＲＮＡ増幅キットを用いた増幅によって濃縮された。トータルＲＮＡは、分光光度測定（ＯＤ２６０）を用いて定量された。
遺伝子発現プロファイリング
既刊文献の調査およびマイクロアレイに基づく遺伝子発現プロファイリング実験の結果に基づいて、最適な予後サインを決定するために、最初に、２００個の候補遺伝子が分析用に選択された。このセットは、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら（ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｈ．Ｄａｉら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−５３６）によって記載された７０個の遺伝子の予後パネル、Ｄａｉら（Ｈ．Ｄａｉ，ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６）によって分析された１０４個の遺伝子、Ｐａｉｋら（ＳＰ Ｐａｉｋ，Ｓ．Ｓｈａｋら，２００４，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５１：２８１７−２８２６）によって報告されたタモキシフェン処置に対する応答のためのサインを含む１６個の遺伝子のパネル、Ｗｅｓｔら（Ｍ．Ｗｅｓｔ，Ｃ．Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅら，２００１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：１１４６２−１１４６７）によって報告された２４個のＥＲ関連遺伝子由来の遺伝子を含んでいた。
【０１２９】
Ｊ．Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ，Ｋ．Ｄｅ Ｐｒｅｔｅｒら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ３（７）：Ｒｅｓｅａｒｃｈ ００３４．１−００３４．１１（Ｅｐｕｂ ２００２）に記載されている方法に従って、発現データを標準化するために内在性対照（ＥＣ）として、追加の遺伝子が選択された。また、内在性対照は、本明細書では「ハウスキーピング遺伝子」とも呼ばれる。６個の内在性対照遺伝子は、凍結された乳癌腫瘍の１５０個の試料におけるそれらの発現レベルの安定性について試験された。ＶａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅらのｇｅＮｏｒｍプログラムを用いて発現データを分析し、この場合、Ｍ値は、遺伝子発現レベルの安定性の測定として決定される。（Ｊ．Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ，Ｋ．Ｄｅ Ｐｒｅｔｅｒら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ３（７）：Ｒｅｓｅａｒｃｈ ００３４．１−００３４．１１，Ｅｐｕｂ ２００２）。Ｍ値が低くなると、遺伝子はより安定になる。結果を表７に示す。Ｍ値は、ＰＰＩＧ、ＳＬＵ７およびＮＵＰ２１４がこの試料セットにおいて最も安定な内在性対照であることを指示し、試験された試料全体で遺伝子発現の変化が最も小さかった。これらの３つの遺伝子の安定性は、１３８個の乳癌腫瘍ＦＦＰＥ試料で有効であった。結果を表８に示す。
【０１３０】
選択された２００個の遺伝子、並びに３つのＥＣ遺伝子の発現レベルは、１４２個のＲＮＡ試料においてプロファイルされた。遺伝子発現プロファイリングに関して、１工程の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて相対的な定量化を行った。標的遺伝子の発現が参照の安定に発現される対照遺伝子のセットの発現と比較して評価される点で、定量化は「相対的」であった。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎのインターカレーティング色素（Ｓｔｒａｇａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて、リアルタイムＰＣＲ中に増幅産物を視覚化した。要約すると、反応ミックスは、抽出された試料ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することを可能にした。次に、このｃＤＮＡは、後述する循環パラメータに従って、同じ反応管においてＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ条件は、表３に開示されている上流および下流のプライマーが、対象とする遺伝子の標的配列のそれぞれ５’および３’にハイブリダイズするのを可能にするように設計され、その後、これらのプライマーから伸長させ、ハイブリダイゼーションと伸長のサイクルを繰り返して、増幅産物を作製する。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎの存在下でＰＣＲを行った。この色素は、二本鎖ＤＮＡにインターカレートし、増幅産物を視覚できるようにする。ＲＴ−ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で行い、生成物の間接的な測定として、インターカレートしたＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎの量を用いて、ＰＣＲを通じて周期的なサイクルで存在する増幅産物の量を検出した。（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎの蛍光強度はＤＮＡに結合すると１００倍を超えて増大する。）ＰＣＲプライマーは、各遺伝子の全て知られているスプライス変異体を増幅するように設計され、その結果、全てのＰＣＲ生成物の大きさは、長さにして１５０塩基対より短くなり、分解して相対的に短い長さのＲＮＡがＦＦＰＥ試料に見出されるように期待される。本明細書に記載されている分子サインにおける１４個の遺伝子、並びに３個の内在性対照遺伝子の増幅に用いられるプライマーは、表３に列挙されている。ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、２点測定で、３８４ウェル増幅プレートで行った。各ウェルは、１５μｌの反応ミックスを含んでいた。サイクルプロフィールは、５０℃で２分、９５℃で１分、６０℃で３０分、その後、９５℃で１５秒と６０℃で３０秒を４５サイクルからなり、増幅産物の解離分析で終了する。ＰＣＲ成分は、本質的には、Ｌ．Ｒｏｇｇｅ，Ｅ．Ｂｉａｎｃｈｉら，２０００，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２５：９６−１０１に記載されているとおりであった。
【０１３１】
遺伝子発現の相対的変化は、定量的ＰＣＲによって測定された。発現レベルは、Δ（ΔＣｔ）法によって計算され、ここで、Ｃｔは標的増幅に対する閾値サイクルであり；即ち、標的の時間の指数関数的増幅が開始するＰＣＲのサイクル数である。（ＫＪ Ｌｉｖａｋ ａｎｄ ＴＤ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４０２−４０８）。対象とする遺伝子のｍＲＮＡの相対レベルは、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
（式中、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ｔｅｓｔＲＮＡは試料ＲＮＡであり、ｒｅｆＲＮＡは校正参照ＲＮＡであり、ＥＣは内在性対照である）
のように特定された。対象とする遺伝子ごとの発現レベルは、初めに、３つの内在性対照遺伝子に標準化された。３つの内在性対照（ＣｔＥＣ）の平均を表すＣｔを用いて、たった１つの対照遺伝子が用いられた場合に生じるであろう標準化バイアスのリスクを最小限にする。（Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，ＰＪ Ｈｉｇｇｉｎｓら，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：３３２−３３７）。内在性対照を増幅するために用いられるプライマーは、表３に列挙されている。対象とする遺伝子の調整された発現レベルは、さらに、校正参照ＲＮＡプール、ｒｅｆＲＮＡ（ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆ．）に対して標準化された。これは、種々の機器から得られる発現結果を標準化するために用いられた。２００個の遺伝子の発現プロファイリング実験で得られたΔ（ΔＣｔ）値は、後述する統計学的分析に用いられ、本発明の１４個の遺伝子予後サインを決定した。
１４個の遺伝子サインの決定
元々の２００個の遺伝子の発現プロファイリングからのデータ（即ち、上記で得られたΔ（ΔＣｔ）値）を用いて、遠隔転移に対する生存時間を測定するための半教師あり主成分（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：ＳＰＣ）が、予後サインを含む遺伝子のリストを生じさせるために用いられた。（Ｅ．Ｂａｉｒ ａｎｄ Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，２００４，ＰｌｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：０５１１−０５２２）。ＳＰＣ計算は、Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，ＴＪ Ｈａｓｔｉｅら，２００２，ＰＮＡＳ ９９：６５６７−６７４２の方法に従って、Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ ａｔ Ｓｔａｎｄｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｃａｌｉｆ．の研究室を経由したオンラインで利用可能であるＰＡＭアプリケーションを用いて行われた。
【０１３２】
初めに、一変量のＣｏｘ比例ハザードモデルを用いて、遠隔転移との遺伝子の関連性に従って、遺伝子をランク付けした。Ｐ値＜０．０５であるそれらの遺伝子が有意であると考えられた。Ｃｏｘスコアのいずれかの切断に関して、ＳＰＣは、最適な閾値に到達した遺伝子の成分（即ち、主成分）を計算した：ＳＰＣは、最適な閾値を選択するためのＣｏｘモデル（単一変数としての主成分を有する）と併せて内部の相互検証を用いた。正しいサインおよびスケーリングを決定するために、ＳＰＣによって得られた第一の主成分遺伝子リストが重要であり、一変量のＣｏｘモデルにおける予測材料として用いられた。
【０１３３】
ＳＰＣによって生成される主成分遺伝子リストは、さらに、Ｌａｓｓｏ抑制法によって減らした。（Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，１９９６，Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃ Ｂ，５８：２６７−２８８）。Ｌａｓｓｏ抑制は、ＬＡＲＳアルゴリズムを用いて行われた。（Ｂ．Ｅｆｒｏｎ，Ｔ．Ｈａｓｔｉｅら，２００４，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ３２：４０７−４９９；Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら，編集，２００２，Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ＬＡＲＳアルゴリズムに用いられた結果変数は、ＳＰＣによって選択された主成分であった。Ｌａｓｓｏ法は、予め特定された精度を用いて、このスコアを再生することができる遺伝子のサブセットを選択した。
転移スコア
転移スコア（ＭＳ）は下記の形式：
【０１３４】
【数６】
を有する。Ｇｉは、１４個の遺伝子予後サインの各Ｌａｓｓｏ誘導の遺伝子（ｉ）の標準的な発現レベルを表す。このＧｉ値は、上述される発現プロファイリングにおいて得られるΔ（ΔＣｔ）から全集団におけるその遺伝子の平均的遺伝子発現を差し引き、次に、その遺伝子の標準偏差で割ることによって計算される。定数ａｉは、表２に列挙されている１４個の遺伝子の第１の主成分への荷重である。各遺伝子ｉについてのａｉスコアは、表２に与えられている。定数ｂは−０．２５１であり、正しいサインおよびスケーリングを得るために、予測材料として主成分を含む一変量のＣｏｘモデル由来であった。定数ａ０は０．０２２である；これは、中央値がゼロになるようにＭＳを中心にする。Ｍは、成分リストにおける遺伝子数である；このケースでは１４である。したがって、ＭＳは表２に開示されている１４個の遺伝子についての、一定量の発現レベルの総和であり、各々は、特定の定数ａｉによって乗じる；次に、この総和は、定数ｂによって乗じられ、中心の定数０．０２２にこの総和を加算した。
【０１３５】
このスコアは、本明細書においては、ＭＳ（全て）と呼ばれ、それは、試験された１４２人全てのＥＲ陽性個体の分析に基づくためである。いずれかの新しい試料は、その患者についての１４個の遺伝子発現プロファイリングデータから、場合により、このスコアからこの転移スコアを生じることによって評価されてもよく、患者に対する遠隔転移の可能性を測定することができる。
ＭＳからの遠隔転移可能性の発生
いずれかの個体の患者に関する遠隔転移の可能性は、可変時間点でのＭＳから計算することができ、基準生存関数としてＷｅｉｂｕｌｌ分布を用いる。
【０１３６】
１４個の遺伝子サインの発現プロファイリングからの、上記で得られた転移スコア（ＭＳ）は、Ｃｏｘ比例ハザードモデルによって遠隔転移の可能性に転換された。Ｃｏｘモデルは基準ハザード関数を特定しないため、ハザードおよび生存関数は、初めに、パラメータの回帰モデルを介して構築された。パラメータの回帰モデルでは、遠隔転移なしの生存時間は結果であり、転移スコア（ＭＳ）は独立した可変インプットとであった。イベント時間は、Ｗｅｉｂｕｌｌ分布を有するように推定された；その２つのパラメータは、ＭＳが誘導される生存データを用いて推定された。ある患者に対して、ある時間内の遠隔転移の可能性を計算するために、ＭＳ値は、単に、生存関数に対する式に置換される。
事前検証
この研究では、１４２個の試験患者が、無作為に１０のサブセットに分けられた。１つのサブセットが取り除かれ、全ＳＰＣ手法が残りの９個のサブセットの統合に対して行われた。遺伝子が選択され、９個のサブセットに構築された予後材料が、残りのサブセットに対して、相互検証転移スコアのＭＳ（ＣＶ）を得るように適用された。この相互検証手法は、ＭＳ（ＣＶ）が全ての患者について記入されるまで、１０回行われた。このようにしてＭＳ（ＣＶ）を構築することによって、各々１０分の１の一片は、直接的には、対応する生存する時間を使用せず、即ち、教師なしと考えることができる。
【０１３７】
これは、試料における全ての個体に対して誘導された変数をもたらし、次に、その性能について試験され、他の臨床変数と比較することができた。しかしながら、ＭＳ（全て）は、試験された全ての１４２個の個体に構築され、同じように試験された場合、相当なバイアスを生成した。
【０１３８】
ＲＯＣ曲線下の時間に依存した面積（ＡＵＣ）が計算されると、ＭＳ（ＣＶ）を用いて、１４個の遺伝子予後サインの精度を計算した（後述される）。また、ＭＳ（ＣＶ）は、１４個の遺伝子サインが臨床予測材料と組み合わせられると、Ｃｏｘ抑制モデルに用いられた。ＭＳ（ＣＶ）には、通常の（事前検証されていない）予測材料とは対照的に、１つの自由度がなければならない。事前検証されていない予測材料は、より多くの自由度を有している。
ＭＳの統計学的分析
遠隔転移なしの生存、並びに全生存についてのカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線は、カットポイントとしてＭＳ（ＣＶ）の中央値（即ち、ＭＳ（ＣＶ）の５０パーセンタイル）を用いて、高リスクおよび低リスク患者群について作成された。カットポイントとしての中央値ＭＳの選択は、ＭＳの１０パーセンタイルからＭＳの９０パーセンタイルまでの異なるカットポイントを用いて、高リスク対低リスク群のハザード率の計算に基づいた。高リスクおよび低リスクの個体の平衡数、並びに最大に近いハザード率は、カットポイントとして中央値を選択するための決定因子であった。
【０１３９】
中央値ＭＳのカットポイントを用いたハザード率（ＨＲ）および９５％の信頼区間（ＣＩ）が計算され、報告された。ログランク試験を行い、ハザード率を異なるカットポイントについて計算した。５年以内での遠隔転移の予測における１４個の遺伝子サインの精度および値は、種々の手段によって評価された。（ＸＨ Ｚｈｏｕ，Ｎ． Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，編集，２００２，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【０１４０】
一変量および多変量のＣｏｘ比例ハザード抑制は、年齢、腫瘍サイズ、腫瘍悪性度、および１４個の遺伝子サインを用いて行われた。サインに関する臨床サブグループ分析も行われた。統計学的分析は、本明細書に記されている統計パッケージを除いて、ＳＡＳ（登録商標）９．１統計学的ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，Ｎ．Ｃ．）を用いて行われた。
多重遺伝子サイン
研究された２００個の候補遺伝子のうち、４４個は、一変量のＣｏｘ比例ハザード抑制において、調整されていないＰ値＜０．０５であった。僅かな手に予後を有する患者は、３７個の遺伝子のアップレギュレーションを示し、７個の遺伝子はダウンレギュレーションを示した。ＰＡＭにおける半教師あり主成分手法（ＳＰＣ）により３８個の予後材料が得られた。この遺伝子リストは、さらに、ＬＡＲＳアルゴリズムを介して、Ｌａｓｓｏ抑制を用いることによって、１４（表２）まで減らされた。表２は、各遺伝子の記述を与える。種々のカットポイントでのハザード率（ＨＲ）（パーセンタイルＭＳ（ＣＶ））を計算した。ＭＳ（ＣＶ）の中央値は、患者を低リスク群および高リスク群に分類するために選択された。
結果
低リスク群および高リスク群の遠隔転移なしの生存率並びに全生存率
トレーニングセットにおいて、相互検証した転移スコア、ＭＳ（ＣＶ）の中央値によって定義されるように、７１個の低リスクおよび７１個の高リスク患者において７および２４個の遠隔転移があった。カプラン−マイヤー推定（図１ａ）は、ログランクのｐ値が０．０００２８である２つの群の間の遠隔転移なしの生存（ＤＭＦＳ）における有意差を指示した。低リスク群の５年および１０年のＤＭＦＳ比（標準誤差）は、それぞれ０．９６（０．０２５）および０．９０（０．０３７）であった。高リスク群については、対応する比は、０．７４（０．０５３）および０．６２（０．０６６）であった。全生存（図１ｂ）については、また、２つの群間に有意差があった（ログランクのｐ値＝０．００４８）。低リスク群の５年および１０年のＯＳ率（標準誤差）は、０．９０（０．０３６）および０．７８（０．０５９）であり、対応する比は、高リスク群においては０．７９（０．０４９）および０．０４８（０．０７０）であった（表５）。
一変量および多変量のＣｏｘ抑制モデルからのハザード率
ＤＭＦＳを予測するためのＭＳによる高リスク群対低リスク群の未調整ハザード率は、一変量のＣｏｘ抑制分析によって指示されるように、４．２３（９５％ＣＩ＝１．８２〜９．８５）であった。比較すると、腫瘍悪性度（中＋高悪性度対低悪性度）による高リスク群対低リスク群は、未調整のハザード率が２．１８（１．０４〜４．５９）であった。腫瘍サイズは、ＤＭＦＳの予測において有意（ｐ＝０．０５）であり、直径にして１ｃｍ増加あたりハザードにして７％の増加であるが、年齢は、この患者セットでは有意な因子ではなかった。多変量のＣｏｘ抑制分析では、１４個の分子サインのリスク群は、ハザード率が３．２６（１．２６〜８．３８）であり、これは、外科的処置での年齢、腫瘍サイズおよび悪性度によって調整された。それは、多変量分析において、唯一の有意なリスク因子（ｐ＝０．０１４）であった。
診断精度および予測値
５年以内の遠隔転移を予測するための１４個の有意なリスク群の診断精度および予測値を表９に要約した。感度は、５年内に遠隔転移があった患者に対しては０．８６であり、特異性は、そうでない患者に対しては０．５７であった。陰性予測値（ＮＰＶ）は９６％であり、ほんの４％の個体が５年以内に遠隔転移であったことを指示し、その場合、その個体が低リスク群にいたことをその遺伝子サインは指示した。それにもかかわらず、陽性適中率（ＰＰＶ）はほんの２６％であり、ほんの２６％の個体が遠隔転移を発症したことを指示し、分子サインは、その個体が高リスクにあることを指示した。高ＮＰＶおよび低ＰＰＶは、部分的には、５年以内の遠隔転移の低い有病率に起因し、それは、現在の患者セットでは０．１５であると推定された。
【０１４１】
さらに、５年以内の遠隔転移を予測するための連続的なＭＳ（ＣＶ）の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を図２に示した。ＡＵＣは、５年以内の遠隔転移の予測については０．７６（０．６５〜０．８７）であった。１０年以内の死亡予測に対するＡＵＣは、０．６１（０．４９〜０．７３）であった。０．５よりも大きいＡＵＣについての片側試験は有意であり、転移および死亡の評価項目に対しては、対応するｐ値は＜０．０００１および０．０４であった。
検討
経路分析は、本明細書に開示されている予後サインにおける１４個の遺伝子が、多様な生物学的機能に関与していることを表すが、大多数の遺伝子は、細胞増殖と関連している。１４個の遺伝子のうち１１個は、不良転帰へと導く腫瘍において、協調的に過剰発現されることが見出されたＴＰ５３およびＴＮＦシグナル経路と関連している。ＢＵＢ１、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＰＫＭＹＴ１、ＰＲＲ１１およびＯＲＣ６Ｌは、細胞周期に関連した遺伝子である。ＤＩＡＰＨは、アクチン細胞骨格および生物発生に関与する遺伝子である。ＤＣ１３は、シトクロムオキシダーゼの集合と関連することが期待されている。
【０１４２】
従来報告された研究は、ＲＮＡの供給源として凍結組織の使用に制限され、マイクロアレイ上にプロファイルされたが、本実施例に記載の発明は、ＦＦＰＥ腫瘍試料における遺伝子プロファイリングに対して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いてもよいことを示す。このようにして、アジュバント療法の日常的な使用に先立って拡張された結果データを有する患者由来の保存された乳癌患者切片の使用を提供する。
【０１４３】
遠隔転移なしの生存は、本実施例において記載される研究のための予後評価項目である。教師あり主成分（ＳＰＣ）法を用いて、本発明の１４個の遺伝子サインパネルを構築した。このサインの集合において使用されるアプローチは、個体の発現プロフィールを、任意の所定時間、遠隔転移のリスクの測定に言い換えることができる転移スコア（ＭＳ）の誘導を可能にする。任意の期間、転移のリスクを定量する能力は、処置の決定における患者および臨床医の間の非常に柔軟性のある予後情報を与え、これは、患者の間でリスク寛容および計画対象期間が変化するためである。
【０１４４】
１４個の遺伝子の分子サインを用いて、高および低リスク群は、遠隔転移なしの生存率、並びに全生存率において有意差があった。このサインは、乳癌予後において日常的ではなく試験された増殖遺伝子を含む。１４個の遺伝子サインは、Ｈ．Ｄａｉ，ＬＪ ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら（２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６）によって記述される５０個の遺伝子サインとは１０個の遺伝子の重複がある。対照的に、ほんの６個の遺伝子は、Ｄａｉ，ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら（２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−５３６）によって記述される７０個の遺伝子サインと重複する。これは、ＥＲ陽性患者とＥＲ陰性患者の両方を含む、その研究が患者のより異種な群を分析したという事実によって説明することができる。本明細書に記載されているサインは、ＳＰ Ｐａｉｋ，Ｓ．Ｓｈａｋら，（２００４，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５１：２８１７−２８２６）によって記述される１６個のサインと重複する２つの増幅遺伝子を有していた。
【０１４５】
本明細書に記載されている分子サインは、多変量分析から指示されるように、年齢、腫瘍サイズおよび悪性度などの伝統的なリスク因子より、独立した予後値を有する。このサインは、腫瘍悪性度が低い場合、さらにより有力な予後の測定を提供する。Ｄａｉらによって報告されているように、低い悪性度の腫瘍を有するこの患者群のサブセットは、従来推定されたものよりも実に高い転移のリスクにある可能性がある。（Ｄａｉら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６）。また、本明細書に記載されているサインは、年齢にして５５歳未満の女性からの試料を最初に用いたｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら（２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−５３６）およびＤａｉら（２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：４０５９−４０６６）によって初期に報告された予後遺伝子の信頼を広げている。それは、このサインが、乳癌患者の一般的な範囲に類似している広い年齢分布（中央値６４歳）の患者において確認された。
【０１４６】
ＦＦＰＥ組織の試料への使用は、凍結した組織を用いるマイクロアレイよりもさらに少量の切片でさえ、異なる検出プラットフォーム（定量的ＰＣＲ対マイクロアレイ）で一部の遺伝子を確認した。結果のこの反復は、転移能が腫瘍に含まれる少数の細胞よりはむしろ、その大部分の細胞の固有の特徴であるという、ＢｅｒｎａｒｄｓおよびＷｅｉｎｂｅｒｇによって記述された概念と一致している。（Ｒ．Ｂｅｒｎａｒｄｓ ａｎｄ ＲＡ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：８２３）。
【０１４７】
また、本明細書に記載されている発明は、ＴｉｂｓｈｉｒａｎｉおよびＥｆｒｏｎによって提唱された事前検証技術を用いることによる予後材料性能の客観的評価を提供する。（Ｒ．Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｂ．Ｅｆｒｏｎ，２００２，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １：ａｒｔｉｃｌｅ １）。研究者の中には、次第に巨大になり、特徴付けられたデータベースにおいて独立した検証の重要性に気付くものもあった。（Ｒ．Ｓｉｍｏｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２００５，２３：７３３２−７３４１；ＤＦ Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ，２００４，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４：３０９−１４；ＤＦ Ｈａｙｅｓ，Ｂ．Ｔｒｏｃｋら，１９９８，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２：３０５−３１９；ＤＧ Ａｉｒｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ｒｏｙｓｔｏｎ，２０００，Ｓｔａｔ Ｍｅｄ １９：４５３−７３）。
【０１４８】
本発明では、従来のマーカーおよびツールに明確な情報を与え、全身処置と混同されない独自の１４個の遺伝子予後サインが提供される。このサインは、初期の段階のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性患者について、ＦＦＰＥ切片およびＲＴ−ＰＣＲを用いて生成されるが、それを当該技術分野において知られている任意の方法と併せて用い、そのサインにおける遺伝子のｍＲＮＡ発現、並びに、限定されないが、ＦＦＰＥ切片、凍結された組織試料および新鮮な腫瘍生検を含む任意の腫瘍組織供給源から得られたｍＲＮＡを測定してもよい。本発明の１４個の遺伝子サインのｍＲＮＡ発現レベルに基づいて、転移スコアは、いずれかの個体の乳癌患者に対して遠隔転移を定量するために計算され得る。このようにして、本明細書に開示されている本発明は、いずれかの期間でＥＲ陽性の乳癌患者の日常的な臨床検査室試験における使用を可能にする。
（実施例２）
１４個の遺伝子サインは２８０個のＦＦＰＥ試料を用いた未処理のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
全身処置を受けていない独立した試料セットにおける、リンパ節転移陰性（Ｎ−）、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）の乳癌患者の遠隔転移を予測することができる１４個の遺伝子発現サインを確認する努力がなされた。１４個の遺伝子サインの有効性を評価するために用いられた、実施例１の実験プロトコールおよび統計学的分析について述べる。
患者＆方法
ガイ病院の乳房組織およびデータバンクの遡及検索は、初期の乳癌であると診断され、明確な局所療法（乳房温存療法または乳腺切除）を有しているが、追加のアジュバント全身処置を受けていない患者の集団を特定するためになされた。この研究グループは、１９７５年〜２００１年に、臨床的な腫瘍サイズが３ｃｍ以下であり、病理学的に腋窩のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性腫瘍を有し、５年フォローアップよりも長い女性に制限された。総数４１２人の患者が特定され、それらは、ＲＮＡ抽出に使用可能である十分にホルマリン固定された、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を有してもいた。本研究のために患者の資料およびデータの使用は、ガイ研究倫理委員会によって承認された。
【０１４９】
このグループから、３００人の患者由来の腫瘍をプロファイルするには十分なｍＲＮＡの量と質があった。その後、さらに２０ケースが、この試験から排除された。６人の患者は、遠隔転移前、両側に乳癌であり、６人は、遺伝子発現レベルでは欠損値であり、８つの腫瘍は、現在の技術を用いた再評価に基づいてＥＲ陰性であることがわかった。このようにして、総数２８０人の患者が分析に含められた（表１のガイ病院からの検証セット）。選択バイアスを評価するために、本発明者らは、試験対象患者基準を満足することが確認され、ＲＮＡ抽出に十分なＦＦＰＥ組織を有していた４１２人の患者を用いて分析した。２つのセット間で年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度における有意差がなかったので、選択バイアスを検出しなかった。
【０１５０】
このグループの患者におけるＥＲ状態は、同時期のＩＨＣアッセイを用いて再評価された。Ａｌｌｒｅｄスコアが３以上は、受容体陽性と考えられた。腫瘍は、ＷＨＯガイドライン（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｔｕｍｏｒｉ １９８２；６８：１８１）に従って分類され、組織学的悪性度は、改変されたＢｌｏｏｍおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ法（Ｅｌｓｔｏｎ ＣＷ ＆ Ｅｌｌｉｓ １０．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｉ．Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｒａｄｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９１；１９：４０３−１０）を用いて確かめられた。
【０１５１】
トレーニングセットと比較すると、検証セットは若年者であり、大きな腫瘍を有し、その大部分が高悪性度の腫瘍であった（表１）。それらの特徴における差異に関する試験は非常に有意である（ｐ＜０．００１）。
転移スコア
実施例１のトレーニング試料において誘導された等式１のＭＳは、ガイ病院からの未処置患者に適用された。実施例１では、ＲＮＡは濃縮されたが、ガイ病院からの未処置患者の場合には、ＲＮＡ試料は濃縮されなかった。
【０１５２】
濃縮していない試料にＭＳを適用するために、濃縮された試料と濃縮されていない試料との間の変換因子は、分子サインにおける遺伝子の各々に対して、実施例１の９３個のトレーニング試料から得られた。
結果
低リスク群および高リスク群の遠隔転移なしの生存率および全生存率
それぞれ、７１人の低リスク患者においては４（５．６％）の遠隔転移があり、２０９人のＭＳの高リスク患者においては６２（２９．７％）の遠隔転移があった。カプラン−マイヤー推定（図３ａ）は、ログランクのｐ値が６．０２ｅ−５である２つの群の間のＤＭＦＳにおける有意差を指示した。低リスク群の５年および１０年のＤＭＦＳ比（標準誤差）は、それぞれ０．９９（０．０１４）および０．９６（０．０２５）であった。高リスク群については、対応する生存率は、０．８６（０．０２５）および０．７６（０．０３１）であった（表１２）。
【０１５３】
アジュバント！リスク群については、ＤＭＦＳのカプラン−マイヤー曲線を図３ｃに示した。５年および１０年のＤＭＦＳ比（標準誤差）は、それぞれ、低リスク群については０．９６（０．０２３）および０．９３（０．０３）であり、高リスク群については０．８７（０．０３）および０．７７（０．０３１）であった。アジュバント！によって特定されるものよりも、ＭＳによって特定される高リスク群と低リスク群との間の生存率において大きな差異があった。
【０１５４】
全生存（ＯＳ）に関して、カプラン−マイヤー曲線（図３ｂ）は、ＭＳ低リスク群と高リスク群との間のＯＳ比に有意差を指示した（ログランクのｐ値＝０．０００２８）。５年および１０年のＯＳ比は、それぞれ、低リスク群については０．９７（０．０２０）および０．９４（０．０２８）であり、高リスク群については０．９２（０．０１９）および０．７１（０．０３２）であった。図３ｄは、５年および１０年の全生存を予測するためのアジュバント！についてのカプラン−マイヤーを示した。ＭＳおよびアジュバント！は、全生存に関する類似の予後情報を提供する。
一変量および多変量のＣｏｘ抑制モデルからのハザード率
遠隔転移までの時間を予測するためのＭＳによる高リスク群対低リスク群の未調整のハザード率は６．１２（９５％ＣＩ＝２．２３〜１６．８３）であった（表１０）。ＭＳリスク群に対する未調整のハザード率は、アジュバント！、年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度によって特定される群のハザード率よりも高い。アジュバントは、第２の最大のハザード率が２．６３であった（９５％ＣＩ １．３０〜５．３２）。組織学的悪性度および腫瘍サイズによるリスク群は、ＤＭＦＳの予測に有意であり、年齢群では有意でなかった。
【０１５５】
年齢群は、ＯＳの予測に最も有意な予後因子であり、未調整のハザード率は２．９（９５％ＣＩ ２．０３〜４．１８）であった（表１０）。それにもかかわらず、ＭＳリスク群は、全生存を予測することができ、ＨＲは２．４９であった。
【０１５６】
ＭＳリスク群、年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度の臨床病理学的なリスク因子による遠隔転移までの時間の多変量のＣｏｘ抑制（表１１ａ）では、年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度によって調整されたＭＳリスク群のハザード率は４．８１（１．７１〜１３．５３、ｐ＝０．００３）である。ＭＳリスク群は、多変量分析における唯一の有意なリスク因子であった。したがって、遺伝子サインは、伝統的な臨床病理学的なリスク因子と比較してＤＭＦＳに対して独立した予後値を有し、これらの因子内で情報の一部を捕捉する。
【０１５７】
１４個の遺伝子サインによるリスク群、アジュバント！によるリスク群を用いた遠隔転移までの時間の多変量Ｃｏｘ抑制（表１１ｂ）では、対応する調節されたハザード率は、５．３２（１．９２〜１４．７３）および２．０６（１．０２〜４．１９）であった。ＭＳとアジュバント！のリスク群は、ＤＭＦＳを予測するために有意のままであった。これは、ＭＳおよびアジュバント！が、互いに非常に独立した相補的な予後情報を担持することを指示する。
異なる臨床下位群における分子サインの性能
表１３は、遺伝子サインが若年および老齢の閉経前および閉経後の女性における遠隔転移を予測することを示す。小さいサイズの腫瘍を有する患者では非常に予後的であるが（ＨＲ＝１４．１６、ｐ＝０．００９）、２ｃｍより大きな腫瘍を有する患者では有意でない。低悪性度の下位群におけるハザード率（ＨＲ＝７．６）は、高悪性度（ＨＲ＝４．６）よりも高いが、それは、小さな試料サイズ（６０試料中、７イベント）のため、低い悪性度の下位群における有意性（ｐ＝０．０６）の傾向を示すだけである。
【０１５８】
種々のサブグループにおけるハザード率は、検定試料セットにおける遺伝子サインが低い悪性度、小サイズの腫瘍、若年であり閉経前の患者においてより予後的である。ＭＳリスク群と臨床的変数との間の相互作用に関する公式な試験は有意ではなかった。しかしながら、このサインも、ＣＰＭＣトレーニングセットにおける低悪性度の腫瘍においてより予後的であった。それにもかかわらず、相互作用分析は、多重試験が行われるため、予備的であると見なされなければならない。
診断精度および予測値
１０年以内の遠隔転移を予測するためのＭＡおよびアジュバント！によるリスク群の診断精度および予測値を表４に示した。ＭＳリスク群は、アジュバント！のリスク群の０．９０（０．７８〜０．９６）よりも感度が０．９４（０．８４〜０．９８）と高いが、特異性は類似している（ＭＳについては０．３（０．２４〜０．３７）対アジュバント！については０．３１（０．２６〜０．３８））。１０年以内の遠隔転移の推測された有病率を用いると、ＭＳリスク群に対するＰＰＶおよびＮＰＶは、それぞれ０．２３（０．２１〜０．２５）および０．９７（０．８８〜０．９９）であった。対応する値は、アジュバント！リスク群に対しては０．２３（０．２０〜０．２５）および０．９３（０．８５〜０．９７）であった。したがって、ＭＳは、アジュバント！よりも１０年以内に遠隔転移がないものを僅かに良好に予測することができ、１０年以内の遠隔転移を有するものに対する予測値は、分子および臨床予後材料に対して同じであった。
【０１５９】
５年および１０年以内の遠隔転移を予測するための連続的ＭＳのＲＯＣ曲線（図４）は、ＡＵＣ（９５％ＣＩ）が０．７３（０．６５〜０．８１）、０．７０（０．６３〜０．７８）であった。１０年以内の死亡を予測するＲＯＣ曲線は、ＡＵＣが０．６８（０．６１〜０．７８）であった。したがって、ＭＳは、遠隔転移および死亡を予測する。
【０１６０】
対照的に、アジュバント！による５年以内、１０年以内の遠隔転移、１０年以内の死亡を予測するためのＲＯＣ曲線のＡＵＣは、０．６３（０．５３〜０．７２）、０．６５（０．５７〜０．７３）、および０．６３（０．５６〜０．７１）であり、それらは、ＭＳによる対応する値よりも低かった。
遠隔転移の可能性の連続的予測材料としてのＭＳ
図５は、転移スコアＭＳを用いて個体の患者についての５および１０年での遠隔転移の可能性を示す。５年および１０年の遠隔転移の可能性は、中央値（最小〜最大）が８．２％（１．４％〜３１．２％）および１５．２％（２．７％〜５０．９％）であった。リスク群を定義するためのカットポイントであるゼロＭＳでは、５年および１０年遠隔転移可能性は、それぞれ５％および１０％であった。
【０１６１】
ＭＳによる１０以内の遠隔転移の可能性は、アジュバント！による１０年以内の再発の可能性と比較された（図６）。決定係数（Ｒ２）は、０．１５であり、ＭＳによる遠隔転移の可能性におけるほんのごく一部の変動がアジュバント！によって説明可能であるとこを指示した。ＭＳによる遠隔転移の可能性は、アジュバント！による再発の可能性よりも低かった。それは、全ての再発イベントがアジュバント！再発可能性に含まれたためであり、遠隔転移だけが遠隔転移の可能性のＭＳ推測におけるイベントとしてカウントされた。
検討
初めに、１４個の遺伝子の予後サインは、リンパ節転移陰性の初期段階の未処置乳癌トレーニングセットにおいて、遠隔転移のための定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＦＦＰＥ切片からのｍＲＮＡ発現に基づいて開発された。得られたサインは、異なる期間で個体に関するリスクを定量する転移スコア（ＭＳ）を生じさせるために用いられ、高リスクおよび低リスクに試料セットを二分するために用いられた。最近の「事前検証」の統計学的な技術を用いたトレーニングセットの初期の内部検証後、本発明者らは、類似の独立した検証集団におけるトレーニングセットの正確に二分された切断を用いて、発現サインを検証した。トレーニングセットおよび検証セットにおけるサインの性能特徴は同じであった。一変量および多変量のハザード率は、ＤＭＦＳを予測するために、それぞれ、検証セットについては６．１２および４．８１であり、トレーニングセットについては４．２３および３．２６であった。多変量分析では、転移スコアだけが、他の臨床病理学的因子の腫瘍サイズのみについて有意である傾向を伴って、有意のままであった。また、１４個の遺伝子の予後サインは、全生存を予測することができ、検証セットでは一変量ハザード率は２．４９であった。５年および１０年以内の遠隔転移を予測し、１０年以内の死亡を予測するための連続ＭＳのＲＯＣ曲線は、ＡＵＣがそれぞれ０．７３、０．７０および０．６８であった。サインは、腫瘍悪性度が低い場合にはより有力な予後を提供した（ハザード率は低悪性度では７．５８であり、高悪性度の腫瘍では４．５９であった）。例えば、Ｄａｉらは、患者の連続体の反射ではなく、むしろ患者の別個の群における差異性能であるものとして、分類の予後力の変化を解釈した。
【０１６２】
アジュバント！から計算されたリスクと比較した場合、ウェブに基づく決定支援では、ＭＳとの適度な相関だけがあった。多変動のＣｏｘ抑制では、ＭＳおよびアジュバント！リスク群はともに、互いに調製されると、優位な予後因子を維持する。アジュバント！と比較したＭＳによって特定される高リスク群と低リスク群との間の生存率には大きな差異があった。ＭＡは、アジュバント！よりも１０年以内の遠隔転移を持たないものを良好に予測することができた。これらのデータは、分子サインが、乳癌の遠隔転移を予測するのに、日常的であるかまたはより最近である予後ツールに独立した情報を提供することを示す。
（実施例３）
１４個の遺伝子サインは、９６個のＦＦＰＥ試料を用いて、処理および未処理のリンパ節転移陰性およびＥＲ陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
処置および未処置の患者を有する独立した試料セットにおける、リンパ節転移陰性（Ｎ−）、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）の乳癌患者のおける遠隔転移を予測することができる１４個の遺伝子発現サインを確認する努力がなされた。１４個の遺伝子サインの有効性を分析および評価するために用いられた、実施例１の実験プロトコールおよび統計学的分析について述べる。
患者＆方法
平均年齢が５６．７歳である９６人のＮ−、ＥＲ＋乳癌患者の集団は、検証研究のために選択された（表１５）。検証研究における患者は、ミュエンスター大学から選択された。それらのうち、１５人は未処置であり、５４人はタモキシフェン単独で処置され、６人は化学療法だけで処置され、２人はタモキシフェンと化学療法を用いて処置された。１９人の患者は、未知の処置状態であった。サインにおける１４個の遺伝子は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてＦＦＰＥ試料においてプロファイルされた。以前に誘導された転移スコア（ＭＳ）は、遺伝子発現レベルからの検証セットのために計算された。患者は、ゼロであった所定のＭＳカットポイントを用いて、２つの群に層をなしていた。
転移スコアの検証
実施例１の試料を用いて誘導された等式１のＭＳは、ミュエンスター大学からの患者に適用された。この実施例では、また、腫瘍組織由来のＲＮＡは濃縮されたが、実施例１のものよりは程度が小さかった。この試料にＭＳを適用するために、濃縮された試料と濃縮されていない試料との間の転換因子が、サインにおける１４個の遺伝子の各々について、ミュエンスター大学からの９３個の試料から得られた。また、濃縮された試料と濃縮されていない試料との間の転換因子は、実施例１のＣＰＭＣからの９３個のトレーニング試料から得られた。次に、ＣＰＭＣとミュエンスター大学の遺伝子発現レベルとの間の転換因子は、転換因子のそれらの２つのセットを用いて計算された。
結果
遠隔転移なしの生存率率
カットポイントとしてＭＳゼロを用いて、患者は、高リスクと低リスクとして分類された。９６人全ての患者のうち、４８人の患者は、高リスクとして同定され、５年のＤＭＦ生存率（標準誤差）は０．６１（０．０７２）であり、４８人の低リスク患者は、対応する生存率が０．８８（０．０５２）であった。６２人の処置された患者のうち、３２人の高リスクおよび３０人の低リスク患者では、５年のＤＭＦ生存率は、それぞれ０．６６（０．０８４）および０．８９（０．０６０）であった。タモキシフェン処置単独を受けた５４人の患者のうち、２６人の高リスク患者および２８人の低リスク患者は、５年のＤＭＦ生存率は、それぞれ０．６５（０．０９４）および０．８８（０．０６５）であった（表１６）。
未調整のハザード率
全集団について、ＭＳは、遠隔転移なしの（ＤＭＦ）生存と相関した。Ｃｏｘ比例ハザード抑制は、ＭＳの単位増加あたりの２．６７（１．２８〜５．５７）倍に増加したハザードを指示した（ｐ＝０．００８７）。カットポイントとしてゼロを用いると、全集団における高リスクと低リスク患者のハザード率は、２．６５（１．１６−６．０６，ｐ＝０．０２１）であった。６１人の処置された患者については、ハザード率は３．０８（０．９９〜９．５６，ｐ＝０．０５２）であった。タモキシフェン単独で処置された５４人の患者については、ハザード率は、２．９３（０．９２〜９．３５，ｐ＝０．０７）。異なる群の患者についての生存率およびハザード率は、それぞれ、表１６および図に要約されている。
【０１６３】
元々は未処置の患者由来である、ＲＴ−ＰＣＲに基づく１４個の遺伝子サインは、ＦＦＰＥ組織を用いた独立した試料セットにおいて、Ｎ−、ＥＲ＋、タモキシフェン処置された患者の遠隔転移を予測することができる。高リスクおよび低リスクのタモキシフェンを単独で処理された患者の大きさ差異ＤＭＦＳ比（０．６５対０．８８）があり、その場合、２つの群は、カットポイントとしてゼロを用いたＭＳによって特定された。多様なＭＳの上位および下位の五分位数における差異リスクは、全ての患者、タモキシフェンを単独で処理された患者に対して、それぞれ３．９９および３．７５倍であった。予後サインは、全身処置と混同されない基準リスクを提供することができる。さらに、処置を受ける患者についての転移リスクを予測することができる。したがって、遺伝子サインは、その後の療法とは独立して、治療法の決定を導くための乏しい臨床転帰を用いて女性を特定するのに適切である。
（実施例４）
１４個の遺伝子サインは、２０５個のＦＦＰＥ試料を用いた、タモキシフェン処置のリンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
患者
ガイ病院で１９７５年から２００１年に外科的処置を受けたＮ−、ＥＲ＋の乳癌を有する２０５人の女性の集団を選択した。フォローアップの中央値は９．３年である。そのうち、１７人（８．９％）が遠隔転移であり、４４人（２１．５％）が死亡し、１７人（８．９％）が局所および遠隔再発であった。
【０１６４】
１３８人（６７．３％）の患者は、ステージＩであり、６７人（３２．７％）がステージＩＩであった。全ての患者は、アジュバントのホルモン療法を受けたが、化学療法は受けなかった。この集団では、平均（ＳＤ）年齢は５９．３（１０．４）歳であった。６４％は、５５歳を超え、８０．５％が閉経後であった。全ての腫瘍は、直径にして≦３ｃｍであり、平均（ＳＤ）の腫瘍直径は１．６７ｃｍ（１．０）であった。６０人（２９．３％）、９８人（４７．８％）、４７人（２２．９％）の患者は、腫瘍の組織学的悪性がそれぞれ１、２、３であった。（表１７）
エンドポイント
本発明者らは、初期カットポイントとして、外科的処置から、遠隔転移なしの生存（ＤＭＦＳ）とも呼ばれる、遠隔転移までの時間を選択する。イベントは遠隔転移である。反対側の再発および再発なしの死亡が検査イベントであり、局所再発は、考慮されるべきイベントおよび検査イベントではなかった。ＤＭＦＳカットポイント、そのイベントおよび検査ルールの定義は、予後分子マーカー研究（Ｐａｉｋら ２００４）に関する全米外科アジュバント胸部および腸管プロジェクト（ＮＳＡＢＰ）によって採用された定義を用いて調整された。ＤＭＦＳカットポイントは、癌に関連した死亡に最も直接的に連結されている。
遺伝子発現サインおよび転移スコア（ＭＳ）
１４個の遺伝子サインは、従来、実施例１に記載されるカリフォルニア・パシフィック・メディカル・デンター（ＣＰＭＣ）からのＦＦＰＥ試料を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによるプロファイリング研究を用いて開発された。インジェニュイティプログラムによる経路分析は、そのサインの１４個の遺伝子のうち多数が細胞増殖と関連することを示した。１４個の遺伝子のうち１０個が、乏しい結果の腫瘍において協調的に過剰発現することが見出されたＴＰ５３シグナル経路と関連している。
【０１６５】
転移スコア（ＭＳ）は、各個体について計算された。この実施例におけるＭＳは、以前に記載されたサインのうち１４個の遺伝子の遺伝子発現に基づいていた。しかしながら、本実施例におけるＭＳを計算するためのアルゴリズムは、従来の実施例について記載された実施例とは異なっていた。それにもかかわらず、新しいアルゴリズムを用いて誘導されたＭＳは、従来の方法を用いて誘導されたＭＳと非常に相関し、ピアソン相関係数は＞０．９９であった。さらに、本実施例では、以前の３つの実施例において低および高リスク群を分類するために、たった１つのカットポイントを用いたこととは対照的に、高、中くらい、低のＭＳ群を分類するために、２つのカットポイントを使用した。
【０１６６】
サインの１４個の遺伝子は、実施例１に記載される研究において選択され、新しいＭＳスコアおよびカットポイントは、実施例２に記載されるガイ病院からの未処置試料を用いて、この研究に基づいて測定された。新しいＭＳアルゴリズムは、実施例４および５で適用され、検証された。そこで、新しい転移スコア（ＭＳ（新規））が、１４個の遺伝子の遺伝子発現レベルの平均の陰性として計算される。この新しいスコアを用いて、１４個の遺伝子は、同計量を与えた。高いＭＳが遠隔転移の高リスクに対応するように、−１の乗数を用いた。新しいＭＳは、下記の式：
【０１６７】
【数７】
（式中、Ｇｉはサインにおける１４個の遺伝子の中心の発現レベルである）
において表すことができる。
【０１６８】
ＭＳ（新規）の２つのカットポイントは、高、中、および低ＭＳ群に患者を分類するために選択された。低いカットポイントは−１．４７であり、上のカットポイントは−０．８４３であった。−１．４７よりも小さなＭＳを有する個体は、低ＭＳ群であった。−１．４７と−０．８４３との間のＭＳを有する個体は、低リスクであると考えられ、−０．８４３よりも高いＭＳを有する個体は高ＭＳによる１０年以内群であった。低いＭＳを有するものは、低リスクであると考えられ、中間のＭＳおよび高いＭＳ群にあるものは、ガイの未処理試料の高リスクとして考えられる場合（換言すれば、−１．４７を超えるＭＳを有するものは高リスクであると考えられる）、ＭＳリスク群の感受性は９０％を超える。一方、低ＭＳおよび中間ＭＳは、低リスクであると考えられ、高いＭＳを有するものは高リスクであると考えられる場合（換言すれば、−０．８４３よりも低いＭＳを有するものは、低リスクであると考えられ、−０．８４３よりも高いＭＳを有するものは、高リスクであると考えられた）、ガイの未処理試料におけるＭＳリスク群の感受性および特異性は、７０％程度である。
【０１６９】
未処置の試料については、中間のＭＳ群は、高いＭＳ群のものと類似したリスクを有し、高いＭＳ群および中間のＭＳ群は、低ＭＳを有するものよりも高かった。しかしながら、ホルモン治療で処置された患者に関しては、中間のＭＳ群は、低ＭＳ群のものと同じリスクを有している。高いＭＳ群のリスクは、中間のＭＳおよび低ＭＳ群のリスクよりも高い。
【０１７０】
１４個の遺伝子サインを適用する別の方法は、下記のように、等式２を用いることによる。１４個の遺伝子サインは、以前に、実施例１に記載されるように、カリフォルニア パシフィック メディカル センター（ＣＰＭＣ）によるプロファイリング研究を用いて開発された。プログラムの創意による経路分析は、サインの１４個の遺伝子のうち大部分が、細胞増殖と関連していることを示した。１４個の遺伝子のうち１０個は、不良転帰の腫瘍における協調的に過剰発現することを見出されたＴＰ５３シグナル経路と関連している。
【０１７１】
転移スコア（ＭＳ）は、各個体について計算された。この実施例におけるＭＳは、前述したように、サインのおける１４個の遺伝子の遺伝子発現に基づいていた。しかしながら、この実施例におけるＭＳを計算するためのアルゴリズムは、１４個の遺伝子が等しく計量される等式２に基づいていた。さらに、この実施例では、２つのカットポイントは、前述の３つの実施例における低および高リスク群に患者を分類するためのたった１つカットポイントを用いるのとは対照的に、高、中および低ＭＳ群に患者をグループ化するために用いられた。サインの１４個の遺伝子は、実施例１に記載されるように、この研究において選択され、新しいＭＳスコアおよびカットポイントは、実施例２に記載されるガイ病院からの未処置の試料を用いた研究に基づいて測定された。新しいＭＳアルゴリズムは、実施例４および５において適用され、検証された。
【０１７２】
ＭＳ（新しい）の２つのカットポイントは、高、中および低ＭＳ群に患者を分類するために選択された。カットポイントは、第１のカットポイントが−０．１１９である上記ＭＳを有する個体が５年以内に遠隔転移を有する高リスクの個体として分類される場合、ＭＳリスク群の感受性は０．７程度となるように決定された。ＭＳが０．３０２である第２のカットポイントは、感受性および特異性が０．７となるように選択された。
【０１７３】
実施例２において測定されたＭＳと、１４個全ての遺伝子の遺伝子発現の平均の陰性としてのＭＳは、互いに単に一次変換であることに留意しなければならない。それ自体は、それらは完全相関（ピアソン相関係数＝１）を有し、高、中、及び低ＭＳへの患者の分類は、記載されている対応するカットポイントを用いる同じである。
統計学的分析
遠隔転移なしの生存に関するカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線は、高、中および低ＭＳ群について作成された。３つの群のＤＭＦＳ比を調べると、中および低ＭＳ群は、高ＭＳを有する高リスク群と比較される低リスク群として組み合わせられた。ログランク試験を行った。
【０１７４】
ＤＭＦＳカットポイントについてのＭＳ群の一変量および多変量のＣｏｘ比例ハザード抑制分析を行った。高リスク（高ＭＳ）群対低リスク（組み合わせられた中間および低ＭＳ群）群のハザード率は、多変量分析における年齢（年）、腫瘍サイズ（ｃｍ）、および組織学的悪性度について調整された。
【０１７５】
ＭＳと年齢、腫瘍サイズとの関連性は、ＡＮＯＶＡ試験を用いて調べられ、ＭＳ群と組織学的悪性度との関連は、関連の強固性についてはＣｒａｍｍｅｒ’ｓ Ｖによって、統計学的有意性についてはｃｈｉ−ｓｑによって評価された。
【０１７６】
また、ＭＳリスク群のハザード率は、異なる臨床のサブグループについて計算された。それらの群には、閉経前対閉経後、年齢≦５５歳対＞５５歳、腫瘍サイズ＞２ｃｍ対≦２ｃｍ、組織学的悪性度１＆２対悪性度３が含まれる。
【０１７７】
診断精度を評価するために、５年以内の遠隔転移を予測する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線をプロットした。ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）を計算した。感受性、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）および陰性予測値（ＮＰＶ）は、ＭＳによる高対低リスク群に関する９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を用いて計算された。
【０１７８】
ＭＳ群のハザード率の時間依存性は、打ち切りデータを操作することができるスプライン曲線フィッティング技術を用いて年換算のハザードを評価することによって調査された。Ｒ２．４．１におけるＨＥＦＴ手法を用いた。年換算のハザードは、ＭＳ高および低リスク群について評価され、そこから、異なる時間のハザード率を計算した。
【０１７９】
カプラン−マイヤー推定およびＣｏｘ比例ハザードは、Ｒ２．４１．１およびＳＡＳ９．１を用いて行われた。ＲＯＣ曲線およびＡＵＣは、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ’ｓ ＲＯＣプログラムを用いて推定された。ＡＵＣの信頼区間を推定するためのＤｅｌｏｎｇ法を用いた。
結果
ＭＳ低リスクおよび高リスク群における遠隔転移なしの生存率
１３６人の個体の低ＭＳ群において８個の遠隔転移、２９人の個体の中ＭＳ群において２個の遠隔転移、３０人の個体の高ＭＳ群において７個の遠隔転移があった。１０年のＤＭＦＳ比（ＳＥ）は、低、中、およびＭＳ群について、それぞれ０．９２１（０．０２８），０．９６６（０．０３４）および０．８０４（０．０６８）であった。ＤＭＦＳ比において有意差があり、ログランクのｐ値は０．０４であった。ＤＭＦＳ比は、低および中のＭＳ群において同じであったので、それらを組み合わせて、低リスク群を形成した。低リスク群は、１０年のＤＭＦＳ比が０．９２８（０．０２５）であり、高リスク群についての０．８０４（０．０６８）の対応する比とは有意に異なっていた（表１８）。ログランクのｐ値は０．０１１であった。３つのＭＳ群および２つのＭＳリスク群に対する遠隔転移なしの生存のカプラン−マイヤープロットは、それぞれ図８および図９に示された。
一変量および多変量のＣｏｘ抑制モデルからのハザード率
遠隔転移までの時間を予測するためのＭＳ高リスク対低リスク群の一変量ハザード率は、３．２５（９５％ＣＩ＝１．２４または８．５４、ｐ値＝０．０１７）であった。年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度によって調整された場合、ハザード率は、表１９において５．８２（１．７１−１．７５）であった。ＭＳリスク群は、多変量分析において有意である唯一のリスク因子であった。したがって、遺伝子サインは、伝統的な臨床病理学的なリスク因子と比較したＤＭＦＳに対する独立した予後値を有し、これらの因子の情報の一部を捕捉する。
ＭＳリスク群と、他の臨床および病理学的特徴との関連性
ＭＳリスク群は、組織学的悪性度との非常に有意な関連を有する（関連についてのｃｈｉ−ｓｑに関するＣｒａｍｍｅｒ’ｓ Ｖ＝０．６５、ｐ＜０．０００１）。６０個の悪性度１の腫瘍について、ＭＳ高リスクはなかった（０％）。対照的に、９８個の悪性度２の腫瘍については９（９．２％）、４７個の悪性度３の腫瘍については３１（６６％）であった。
【０１８０】
腫瘍サイズは、ＭＳ高リスク群において大きいが、この差は、統計学的な差異ではなった（ＭＳ高および低リスク群では、それぞれ１．８７ｃｍおよび１．６１ｃｍ、ＡＮＯＶＡ ｐ値＝０．１４）。ＭＳリスク群と年齢との関連性は有意ではなかった（平均年齢は、高および低リスク群では５９．３であり、ＡＮＯＶ ｐ＝０．３４）。結果を表２０に概説した。
異なる臨床サブグループにおける分子サインの性能
ＭＳリスク群のハザード率は、≦２ｃｍの腫瘍で３．７（１．１−１２．６）であり、＞２ｃｍの腫瘍で３．０（０．６−１４．８）であった。５５歳よりも若い女性では、ＨＲは、７．４（１．０−５４．７）であり、５５歳よりも上の女性では２．８（０．８８−８．８）であった。組織学的悪性度１および２の腫瘍については、ＨＲは、１２．８（３．８−４３．１）であり、悪性度３の腫瘍について、ＨＲは１．５３（０．１６−１４．７）であった（表２１）。
診断精度および予測値
５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳリスク群の感受性、特異性、ＰＰＶおよびＮＰＶを表２２に示した。ＭＳリスク群の感受性は、０．５０（０．５０−０．７６）であり、特異性は、０．８２（０．７６−０．８７）であった。０．０５であると推定された５年の遠隔転移比を用いると、ＰＰＶおよびＮＰＶは、それぞれ０．１３（０．０６８−０．２３）および０．９７（０．９４−０．９８）と推定された（表２２）。ＭＳリスク群の高いＮＰＶは、低リスクである患者の化学療法などのより積極的な処置を除外するために用いられることが重要である。
【０１８１】
５年以内の遠隔転移を予測するための連続ＭＳのＲＯＣ曲線を図１０に示し、ＡＵＣは０．７２（０．５７−０．８７）であると推定された。
予後サインの時間依存性
ＭＳ高および低リスク群についての年換算したハザード率を図１１ａに示し、２つの群の間のハザード率の時間依存性を図１１ｂに示した。高リスク群については、年のハザード率は外科的処置から約３年で２．５％のピークに達し、その後、次の数年かけて徐々に減少した。しかしながら、低リスク群の年換算のハザード率は、フォローアップした１０年間で、僅かであるが着実な増加を示した。その後、ＭＳリスク群のハザード率は、時間依存的であった。２、５、および１０年で、それぞれ４．６、３．６および２．１であった。
（実施例５）
１４個の遺伝子サインは２３４個のＦＦＰＥ試料を用いたアジュバントホルモン的に処置されたリンパ節転移陰性のＥＲ陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
患者
愛知県がんセンターにおいて１９９５年から２００３年に外科的処置を受けたＮ−、ＥＲ＋乳癌の２３４人の日本人女性の集団を選択した。フォローアップの中央値は８．７年であった。それらの中には、３１人（１３％）が遠隔転移であり、１９人（８．１％）が死亡し、４６人（１９．７％）が局所および遠隔再発であった。
【０１８２】
１４６人（６２％）の患者がステージＩであり、８８人（３８％）がステージＩＩであった。全ての患者はアジュバントホルモン処置を受けたが、化学療法は受けなかった。１１２人の閉経後の女性は、タモキシフェンで処置された。１２２人の閉経前の女性のうち、１０２人がタモキシフェンを受け、２０人がゾラデックス処置を受けた。この手段は、平均（ＳＤ）年齢は５３（１１）歳であり、平均（ＳＤ）腫瘍直径は２．０５ｃｍ（１．１）であった。７４人（３２％）、１１３人（４８％）、および４７人（２０％）の患者は、組織学的悪性度がそれぞれ１、２および３の腫瘍であった。（表２３）
遺伝子発現サインおよび転移スコア（ＭＳ）
１４個の遺伝子発現サインは前述において作製され、ＦＦＥ試料を用いたＲＴ−ＰＣＲにより米国および欧州におけるプロファイリング研究において評価された。プログラムＩｎｇｅｎｕｉｔｙによる経路分析は、サインの１４個の遺伝子の大多数が、細胞増殖と関連していることを示した。１４個の遺伝子のうち１０個は、乏しい結果の腫瘍において協調的に過剰発現することが見出されたＴＰ５３シグナル経路と関連している。
【０１８３】
転移スコア（ＭＳ）は、各個体について計算された。ＭＳは、サインの１４個の遺伝子の遺伝子発現レベル（ΔΔＣｔによる）の平均の陰性に基づいていた。さらん、２つのカットポイントは、以前に、ガイ病院からの未処置の患者からの腫瘍組織を用いた研究から測定され（実施例２）、患者を高、中間および低ＭＳ群にグループ分けした。
統計学的分析
遠隔転移なしの全生存に関するカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線は、高、中間および低ＭＳ群について作製された。３つの群のＤＭＦＳ比を調べると、中間および低ＭＳ群は、高リスク群と比較される低リスク群として、高ＭＳと比較された。ログランク試験を行った。
【０１８４】
ＤＭＦＳおよびＯＳエンドポイントに関するＭＳ群の一変量および多変量のＣｏｘ比例ハザード抑制分析を行った。高リスク（高ＭＳ）対低リスク（中間および低ＭＳ群の組み合わせ）群は、１つの多変量分析において、年齢（年）、腫瘍サイズ（ｃｍ）および組織学的悪性度について調整された。別の多変量分析では、閉経状態、処置、腫瘍サイズ、組織学的悪性度およびＰｇＲ状態について調整された。
【０１８５】
ＭＳ群と、年齢、腫瘍サイズとの関連性は、ＡＮＯＶＡ試験を用いて調べられ、ＭＳ群と組織学的悪性度および腫瘍サブタイプとの関連性は、関連した強度についてのＣｒａｍｍｅｒ’ｓ Ｖ、統計学的差異についてはｃｈｉ−ｓｑによって評価された。
【０１８６】
また、ＭＳリスク群のハザード率は、異なる臨床サブグループについて計算された。それらのグループは、閉経前対閉経後、年齢≦５５歳対＞５５歳、腫瘍サイズ＜２ｃｍ対≦２ｃｍ、組織学的悪性度１＆２対悪性度３、ＰｇＲ＋ｖｅ対−ｖｅを含む。
【０１８７】
診断精度を評価するために、５年以内の遠隔転移を予測するＭＳの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線をプロットした。ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）を計算した。感受性、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）および陰性予測値（ＮＰＶ）は、ＭＳによる高対低リスク群に関する９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を用いて計算された。
【０１８８】
ＭＳ群のハザード率の時間依存性は、打ち切りデータを操作することができるスプライン曲線フィッティング技術を用いて年換算のハザードを評価することによって調査された。Ｒ２．４．１におけるＨＥＦＴ手法を用いた。年換算のハザードは、ＭＳ高および低リスク群について評価され、そこから、異なる時間のハザード率を計算した。
【０１８９】
カプラン−マイヤー推定およびＣｏｘ比例ハザードは、Ｒ２．４１．１およびＳＡＳ９．１を用いて行われた。ＲＯＣ曲線およびＡＵＣは、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ’ｓ ＲＯＣプログラムを用いて推定された。ＡＵＣの信頼区間を推定するためのＤｅｌｏｎｇ法を用いた。
結果
ＭＳ低リスクおよび高リスク群における遠隔転移なしの生存率
７７人の個体の低ＭＳ群において６個の遠隔転移、６６人の個体の中間ＭＳ群において４個の遠隔転移、９５人の個体の高ＭＳ群において２１個の遠隔転移があった。１０年のＤＭＦＳ比（ＳＥ）は、低、中、および高ＭＳ群について、それぞれ、０．８９（０．０５）、０．９１（０．０４）および０．７５（０．０５）であった。ＤＭＦＳ比において有意差があり、ログランクのｐ値は０．００４であった。ＤＭＦＳ比は、低および中ＭＤ群において同じであったので、それらを組み合わせて、低リスク群を形成した。低リスク群は、１０年のＤＭＦＳ比が０．８９５（０．０３４）であり、高リスク群についての０．７５（０．０５）の対応する比とは有意に異なっていた（表２４）。ログランクのｐ値は０．０００９２であった。３つのＭＳ群に対する遠隔転移なしの生存のカプラン−マイヤープロットは図１２に示され、２つのリスク群（高ＭＳおよび中と低ＭＳの組み合わせ）についてのカプラン−マイヤープロットは図１３に示された。
一変量および多変量のＣｏｘ抑制モデルからのハザード率
遠隔転移までの時間を予測するためのＭＳ高リスク対低リスク群の一変量ハザード率は、３．３２（９５％ＣＩ＝１．５６〜７．０６、ｐ値＝０．００１８）であった。年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度によって調整された場合、ハザード率は、３．７９（１．４２−１０．１、ｐ＝０．００７８）であった。ＭＳに加えて、腫瘍サイズは、多変量分析における唯一の他の有意因子であり、ＨＲは１ｃｍあたり１．４増加した（ｐ＝０．００７）（表２５）。別の多変量分析では、ＭＳリスク群は、閉経状態、処置、腫瘍、腫瘍サイズ、組織学的悪性度およびＰｇＲ状態によって調整された。ＭＳリスク群のこの調整されたハザード率は、３．４４（１．２７−９．３４）であった（表２７）。さらに、腫瘍サイズは、この多変量分析において唯一の他の有意因子であった（ＨＲ＝１ｃｍあたり１．４５の増加、ｐ＝０．００４９）。したがって、遺伝子サインは、伝統的な臨床病理学的なリスク因子と比較したＤＭＦＳに対する独立した予後値を有し、これらの因子の情報の一部を捕捉する。
ＭＳリスク群と、他の臨床および病理学的特徴との関連性
ＭＳリスク群は、組織学的悪性度との非常に有意な関連を有する（関連についてのｃｈｉ−ｓｑに関するＣｒａｍｍｅｒ’ｓ Ｖ＝０．５４、ｐ＜０．０００１）。７４個の悪性度１の腫瘍について、ほんの４個（５．４％）がＭＳ高リスクであった。対照的に、１１３個の悪性度２の腫瘍については５４（４７．８％）、４７個の悪性度３の腫瘍については３７（７８．７％）がＭＳ高リスクであった。
【０１９０】
また、ＭＳリスク群は、腫瘍のサブタイプと関連した（Ｃｒａｍｍｅｒ’ｓ Ｖ＝０．２５、ｐ＝０．０２）。７７個の硬性腫瘍のうち２３個（２９．８％）がＭＳ高リスクであり、１０８個の乳頭管腫瘍のうち４５個（４１．７％）、３８個の固定管の２４個（６３．２％）がＭＳ高リスクであった。
【０１９１】
腫瘍サイズは、ＭＳ高リスク群において大きいが（ＭＳ高および低リスク群においてそれぞれ２．２３ｃｍおよび１．９３ｃｍ、ＡＮＯＶＡ ｐ値＝０．０３７）、ＭＳリスク群と年齢との関連性は有意ではなかった（ｐ＝０．２９）。結果を表２６に概説した。
異なる臨床サブグループにおける分子サインの性能
ＭＳリスト群は、≦２ｃｍ、低悪性度（悪性度１および２）およびＰｇＲ＋ｖｅである腫瘍を有する若年（年齢≦５５歳）、閉経前の女性において遠隔転移を予測することができる。ＭＳリスク群のハザード率は、≦２ｃｍの腫瘍では４．５（１．２−１７．３）および＞２ｃｍの腫瘍では２．３（０．９２−５．６）であった。閉経前の女性では、ＨＲは、６．０（１．６−２３．３）であり、閉経後の女性では２．１（０．８３−５．１）であった。組織学的悪性度１および２の腫瘍を有する女性については、ＨＲは３．６（１．５−８．４）であり、悪性度３の腫瘍では、ＨＲは２．４（０．２９−１８．８）であった。ＭＳリスク群のＨＲは、ＰｇＲ＋ｖｅ腫瘍では３．５（１．４−９．０）であり、ＰｇＲ−ｖｅ腫瘍では２．１（０．５７−７．４９）であった（表２８）。
診断精度および予測値
５年以内の遠隔転移を予測するためのＭＳリスク群の感受性、特異性、ＰＰＶおよびＮＰＶを表に示した。ＭＳリスク群の感受性は、０．８１（０．６０−０．９２）であり、特異性は、０．６５（０．５８−０．７１）であった。０．００９５であると推定された５年の遠隔転移比を用いると、ＰＰＶおよびＮＰＶは、それぞれ０．１９（０．１５−０．２４）および０．９７（０．９３−０．９９）と推定された（表２９）。ＭＳリスク群の高いＮＰＶは、低リスクである患者の化学療法などのより積極的な処置を除外するために用いられることが重要であった。５年以内の遠隔転移を予測するための連続ＭＳのＲＯＣ曲線を図１４に示し、ＡＵＣは０．７３（０．６３−０．８４）であると推定された。
予後サインの時間依存性
ＭＳ高および低リスク群についての年換算したハザード率を図１５ａに示し、２つの群の間のハザード率の時間依存性を図１５ｂに示した。高リスク群については、年のハザード率は外科的処置から約３年で３．５％のピークに達し、その後、次の数年かけて徐々に減少した。しかしながら、低リスク群の年換算のハザード率は、フォローアップした１０年間で、僅かであるが着実な増加を示した。その後、ＭＳリスク群のハザード率は、時間依存的であった。２、５、および１０年で、それぞれ４．８、３．４および１．８であった。
【０１９２】
この実施例および前述の実施例から分かるように、１４個の遺伝子サインは、白人およびアジア民族系の乳癌患者における有効なリスク予測材料であることが示され、１４個の遺伝子予後サインの構造安定性を指示している。
【０１９３】
本明細書に引用されている全ての刊行物および特許は、全体として参照により本明細書に援用される。本発明の記載されている組成物、方法およびシステムの種々の修飾および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなしに当業者に明確となる。本発明は、特定の好ましい態様およびある種の実施例と関連して記載されているが、請求される発明はこのような特定の態様に不当に限定されてはならないことは理解すべきである。実際に、分子生物学、遺伝学および関連した分野における当業者に明らかである、本発明を実施するための上述した様式の種々の修飾は、続く特許請求の範囲にあることが意図される。
【０１９４】
【表１】
【０１９５】
【表２】
【０１９６】
【表３】
【０１９７】
【表４】
【０１９８】
【表５】
【０１９９】
【表６】
【０２００】
【表７】
【０２０１】
【表８】
【０２０２】
【表９】
【０２０３】
【表１０】
【０２０４】
【表１１】
【０２０５】
【表１２】
【０２０６】
【表１３】
【０２０７】
【表１４】
【０２０８】
【表１５】
【０２０９】
【表１６】
【０２１０】
【表１７】
【０２１１】
【表１８】
【０２１２】
【表１９】
【０２１３】
【表２０】
【０２１４】
【表２１】
【０２１５】
【表２２】
【０２１６】
【表２３】
【０２１７】
【表２４】
【０２１８】
【表２５】
【０２１９】
【表２６】
【０２２０】
【表２７】
【０２２１】
【表２８】
【０２２２】
【表２９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法であって、
（ａ）前記乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞における遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを測定し、それによって、前記遺伝子の発現レベルに基づく転移スコア（ＭＳ）を得て；
（ｂ）前記転移スコアと所定の転移スコアのカットオフ閾値（ＭＳ閾値）とを比較することによって、前記乳癌患者の腫瘍転移のリスクを測定する
ことを含む方法。
【請求項２】
工程（ｂ）において、前記乳癌患者のＭＳが所定のＭＳ閾値よりも高い場合に、前記乳癌患者は、腫瘍転移のリスクが増加していると決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）において、そのＭＳが所定のＭＳ閾値よりも低い場合に、前記乳癌患者は、腫瘍転移のリスクが減少していると決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、２以上のＭＳ閾値が、前記乳癌患者について腫瘍転移のリスクの決定に用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記乳癌患者が、リンパ節において検出可能な腫瘍細胞を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記乳癌患者が、腫瘍転移を発症するリスクが増加している、請求項１に記載方法。
【請求項７】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、ホルマリン固定されたパラフィン包埋された切片に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、腫瘍生検由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、凍結腫瘍組織由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子のｍＲＮＡが、エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞から得られ、ｃＤＮＡに逆転写され、前記ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍＲＮＡが、逆転写およびＰＣＲ増幅前に濃縮される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子の各々のｍＲＮＡが、逆転写され、表３の配列番号１〜３０に示される対応する遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子の発現レベルが、あるハウスキーピング遺伝子または２以上のハウスキーピング遺伝子の平均の発現レベルに対して標準化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７で構成される群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡが、逆転写され、表３に列挙される、配列番号２９〜３４の前記ハウスキーピング遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現レベルが、マイクロアレイによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数８】
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルであり、ａ０は０．０２２であり、ａｉは前記遺伝子の各々について表２にある値に対応する）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記各々の遺伝子（ｉ）の発現レベルが、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
（式中、
Ｃｔは指数関数的な標的増幅のＰＣＲ閾値サイクルであり、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ＥＣは内在性対照であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者の試料ＲＮＡであり、ｒｅｆ ＲＮＡは参照ＲＮＡである）
によって遺伝子発現値Ｇｉに算定される、請求項１7に記載の方法。
【請求項１９】
ａ０が０であり、ａｉが１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数９】
（式中、
Ｍが１４であり、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の基準化された発現レベルであり、ａ０が０．０２２であり、ｂが−０．２５１であり、ａｉが前記遺伝子の各々について表２に示される値に対応する）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数１０】
（式中、
Ｍが１４であり、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルであり、ａ０が０．８６５７であり、ｂが−０．０４７７８であり、ａｉが前記遺伝子の各々について１である）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数１１】
（式中、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルである）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記転移スコア（ＭＳ）が、１４個の前記遺伝子の各遺伝子の発現レベルを一緒に加えることによって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを検出するための試薬（複数）、および酵素；並びにバッファーを含むキット。
【請求項２５】
１以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルを検出するための試薬（複数）またはその組み合せをさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７で構成される群から選択される、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ。
【請求項２８】
ハウスキーピング遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２７に記載のマイクロアレイ。
【請求項２９】
前記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７からなる群から選択される、請求項２８に記載のマイクロアレイ。
【請求項１】
乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法であって、
（ａ）前記乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞における遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを測定し、それによって、前記遺伝子の発現レベルに基づく転移スコア（ＭＳ）を得て；
（ｂ）前記転移スコアと所定の転移スコアのカットオフ閾値（ＭＳ閾値）とを比較することによって、前記乳癌患者の腫瘍転移のリスクを測定する
ことを含む方法。
【請求項２】
工程（ｂ）において、前記乳癌患者のＭＳが所定のＭＳ閾値よりも高い場合に、前記乳癌患者は、腫瘍転移のリスクが増加していると決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）において、そのＭＳが所定のＭＳ閾値よりも低い場合に、前記乳癌患者は、腫瘍転移のリスクが減少していると決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、２以上のＭＳ閾値が、前記乳癌患者について腫瘍転移のリスクの決定に用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記乳癌患者が、リンパ節において検出可能な腫瘍細胞を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記乳癌患者が、腫瘍転移を発症するリスクが増加している、請求項１に記載方法。
【請求項７】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、ホルマリン固定されたパラフィン包埋された切片に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、腫瘍生検由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、凍結腫瘍組織由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子のｍＲＮＡが、エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞から得られ、ｃＤＮＡに逆転写され、前記ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍＲＮＡが、逆転写およびＰＣＲ増幅前に濃縮される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子の各々のｍＲＮＡが、逆転写され、表３の配列番号１〜３０に示される対応する遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子の発現レベルが、あるハウスキーピング遺伝子または２以上のハウスキーピング遺伝子の平均の発現レベルに対して標準化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７で構成される群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡが、逆転写され、表３に列挙される、配列番号２９〜３４の前記ハウスキーピング遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現レベルが、マイクロアレイによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数８】
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルであり、ａ０は０．０２２であり、ａｉは前記遺伝子の各々について表２にある値に対応する）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記各々の遺伝子（ｉ）の発現レベルが、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
（式中、
Ｃｔは指数関数的な標的増幅のＰＣＲ閾値サイクルであり、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ＥＣは内在性対照であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者の試料ＲＮＡであり、ｒｅｆ ＲＮＡは参照ＲＮＡである）
によって遺伝子発現値Ｇｉに算定される、請求項１7に記載の方法。
【請求項１９】
ａ０が０であり、ａｉが１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数９】
（式中、
Ｍが１４であり、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の基準化された発現レベルであり、ａ０が０．０２２であり、ｂが−０．２５１であり、ａｉが前記遺伝子の各々について表２に示される値に対応する）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数１０】
（式中、
Ｍが１４であり、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルであり、ａ０が０．８６５７であり、ｂが−０．０４７７８であり、ａｉが前記遺伝子の各々について１である）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数１１】
（式中、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルである）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記転移スコア（ＭＳ）が、１４個の前記遺伝子の各遺伝子の発現レベルを一緒に加えることによって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを検出するための試薬（複数）、および酵素；並びにバッファーを含むキット。
【請求項２５】
１以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルを検出するための試薬（複数）またはその組み合せをさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７で構成される群から選択される、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ。
【請求項２８】
ハウスキーピング遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２７に記載のマイクロアレイ。
【請求項２９】
前記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７からなる群から選択される、請求項２８に記載のマイクロアレイ。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【図４ｆ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【図４ｆ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５１６２９２（Ｐ２０１０−５１６２９２Ａ）
【公表日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４８３１３（Ｐ２００９−５４８３１３）
【出願日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１３３９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９４６７８
【国際公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【出願人】（５０８３５６０６５）セレラ コーポレーション (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１３３９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９４６７８
【国際公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【出願人】（５０８３５６０６５）セレラ コーポレーション (11)
【Ｆターム（参考）】
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