乳酸の製造方法
【課題】
乳酸合成能力を有する酵母株を用いた乳酸の製造方法において、乳酸の収量を効率的に向上させることができる製造方法を提供する。
【解決手段】
乳酸合成能力を有する酵母株を、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸を含む培地を用いて培養する乳酸の製造方法であって、乳酸合成能力を有する酵母株としては乳酸合成酵素（乳酸脱水素酵素）遺伝子を導入することにより乳酸合成能力を獲得した酵母株が挙げられ、脂肪酸としてはオレイン酸、オレイン酸誘導体またはこれらと他の脂肪酸の混合物が挙げられる。
乳酸合成能力を有する酵母株を用いた乳酸の製造方法において、乳酸の収量を効率的に向上させることができる製造方法を提供する。
【解決手段】
乳酸合成能力を有する酵母株を、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸を含む培地を用いて培養する乳酸の製造方法であって、乳酸合成能力を有する酵母株としては乳酸合成酵素（乳酸脱水素酵素）遺伝子を導入することにより乳酸合成能力を獲得した酵母株が挙げられ、脂肪酸としてはオレイン酸、オレイン酸誘導体またはこれらと他の脂肪酸の混合物が挙げられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸合成能力を有する酵母株を用いてなる乳酸の製造方法において、乳酸の収量を効率的に向上させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、資源循環型社会構築に向け、生物資源由来の材料を用いた工業原料の生産が盛んに行われている。それらの中で生物由来材料である乳酸を原料とするポリ乳酸は、優れた性質を持つポリマーとして注目されており、その原料となる乳酸をいかに安価に供給するかが課題となっている。
【０００３】
乳酸の生産は、ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属やラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に代表される乳酸菌によって主に実施されているが、乳酸を培養液中に多量に蓄積させるためには、乳酸菌が酸性条件下で生育しないため、炭酸カルシウムやアンモニア、あるいは水酸化ナトリウムなどの中和剤を添加した培養を行わなければならず、中和工程や精製工程に多大なコストを要している。
一方、酸性条件下で生育可能な酵母株を用いた有機酸の製造法が、複数、提案されている（特許文献１〜３および非特許文献１、２参照。）。これらの提案によれば、本来乳酸生成能を持たない酵母株に乳酸生成酵素遺伝子を導入し乳酸を生産させることにより、中和操作を軽減し、低コストな乳酸製造工程を構築することが可能である。さらに、酵母株による乳酸を始めとする有機酸の生産能力を、遺伝子組み換え等の技術を用いて向上させることにより、より安価な有機酸の製造法を構築することが可能である。
【０００４】
しかしながら、酵母細胞は、培養液中に乳酸が存在することにより細胞膜に局在するプロトンエーティーピーエース（Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ）活性が阻害され、生存率が低下すると共に、脂質の構成脂肪酸の中で、不飽和脂肪酸の含有量が低下することが報告されている（非特許文献３参照。）。すなわち、より高く乳酸の生産能力を向上させるためには、酵母細胞の乳酸への耐性能力を向上させる必要がある。酵母細胞において脂肪酸の不飽和化に関与する酵素タンパク質としては、Ｓｔｅｒｏｙｌ−ＣｏＡ ９−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（ＯＬＥ１）が同定されている。そして、該酵素タンパク質もしくはその相同物を遺伝子工学的に高発現させることにより、形質転換酵母細胞の脂質を構成する不飽和脂肪酸含有量を向上させ、冷凍もしくはエタノールに対する耐性能力を向上させることが提案されている（特許文献４および非特許文献４、５参照。）が、乳酸耐性に関する知見は存在しておらず、脂質構成脂肪酸の組成が乳酸生産へ及ぼす効果については知られていない。
【０００５】
酵母細胞において脂質を構成する脂肪酸の組成比を変化させる方法としては、上記のようにデサチュラーゼタンパク質もしくはその相同物を遺伝子工学的に細胞内で高発現させる方法と、培養液中に脂肪酸を添加する方法（非特許文献６参照。）が提案されている。培養液中に脂肪酸を添加する方法では、培養液中に脂肪酸を添加することにより、培養された酵母細胞の脂質構成脂肪酸組成は添加された脂肪酸の含有量が増加すること、また脂質の含有率が増加することが提案されているが、乳酸耐性および乳酸の生産性への効果は知られていない。
【０００６】
また、微生物発酵を用いた物質生産において生産収率を向上させる方法としては、アミノ酸生産用細菌を用いたアミノ酸発酵においてアミノ酸の生産収率を向上させる添加剤として、脂肪酸と油脂を混合し、アルキレンオキシドを付加した添加剤が提案されている（特許文献５）が、これまでに行われている乳酸菌もしくは酵母株を用いた乳酸発酵への適用例はなく、さらに、乳酸発酵において乳酸生産収率を向上させ得る添加剤もしくは培地成分の提案は今までになされていない。
【特許文献１】特開２００１−２０４４６８号公報
【特許文献２】特表２００１−５１６５８４号パンフレット
【特許文献３】特開２００３−２５９８７８号公報
【特許文献４】特開２０００−３７１８５号公報
【特許文献５】特開２００１−２５２０６９号公報
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、７１、１９６４（２００５）
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、７１、２７８９（２００５）
【非特許文献３】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（ザ ジャーナル オブ ザ アメリカン ソサイエティ オブ ブリューイング ケミスツ）、５９、１８７（２００１）
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ジャーナル オブ バイオサイエンス アンド バイオエンジニアリング）、９９、５１２（２００５）
【非特許文献５】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、６９、１４９９（２００３）
【非特許文献６】Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （バイオサイエンス バイオテクノロジー アンド バイオケミストリー）、７０、６４６（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、乳酸合成能力を有する酵母株を用いた乳酸の製造方法において、乳酸の生産収率を効率的に向上させることができる製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、乳酸合成能力を持つ酵母株を糖質存在下で培養し、乳酸を生産させる過程において、脂肪酸（脂肪酸誘導体を含む）を培地に添加することにより、乳酸の生産収率を向上させることを見いだし、上記課題を解決するに至った。
【０００９】
上記の課題を解決する本発明の乳酸の製造方法は、乳酸合成能力を有する酵母株を脂肪酸を含む培地を用いて培養することを特徴とする乳酸の製造方法である。脂肪酸としては、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸のいずれも用いられ、また脂肪酸には脂肪酸誘導体も含まれる。
【００１０】
本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の乳酸合成能力を有する酵母株は、乳酸合成酵素遺伝子を有する酵母株であり、その乳酸合成能力を有する酵母株としては、乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより乳酸合成能力を獲得した酵母株があり、これらの乳酸合成酵素として乳酸脱水素酵素が用いられる。
【００１１】
本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の培地中の脂肪酸の濃度は２５ｍｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌである。
【００１２】
本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の脂肪酸の炭素数は８〜２０であり、好ましい脂肪酸としては、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸が挙げられ、特に、オレイン酸が好適である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、乳酸合成能力を持つ酵母株を用いて効率的に乳酸を製造することができる。酵母株を用いた乳酸発酵において、生産収率を向上させる培地成分はこれまでに限定されていない。しかしながら、本発明によれば、乳酸合成能力を持つ酵母株を培養し乳酸を生産させる培地に脂肪酸もしくは脂肪酸誘導体を添加することにより、培地中に投入する炭素源あたりの乳酸生産量を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の乳酸の製造法において用いられる酵母株は、乳酸合成能力をもつ酵母株であればいずれの酵母株であってもよく、乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより乳酸合成能力を獲得した酵母株も用いられる。このような乳酸合成酵素として、例えば乳酸脱水素酵素が用いられる。
【００１５】
より好ましい酵母株としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母株などを挙げることができる。上記のサッカロマイセス属に属する好ましい酵母株としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などを挙げることができる。
【００１６】
導入する乳酸合成酵素をコードする遺伝子は、酵母株において生産され得る乳酸合成酵素をコードするＤＮＡであれば特に限定されないが、酵素活性が強化された乳酸合成酵素をコードするＤＮＡが好ましい。酵素活性が強化された乳酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、例えば、部位特異的変異導入法を用いた変異手法によって得られる酵素活性が強い乳酸合成酵素をコードするＤＮＡや、強力なプロモーターの支配下に乳酸合成酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡなどが挙げられる。
【００１７】
本発明の乳酸の製造法に用いられる酵母株は、乳酸合成酵素（乳酸脱水素酵素、Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて導入することにより製造することができるが、該酵母株が既に目的とする乳酸合成酵素をコードする遺伝子を有している場合は、必ずしも該遺伝子を導入する必要はない。乳酸合成酵素としては、例えば、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＬ−乳酸合成酵素遺伝子またはボス・トウラス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）由来のＬ−乳酸合成酵素遺伝子にコードされるタンパク質からなる酵素を挙げることができる。
【００１８】
本発明の乳酸の製造法に用いられる酵母株の培養は、以下に記載した通常の方法に従って行うことができる。本発明の乳酸の製造法に用いられる酵母株を培養する培地は、該酵母株が資化し得る炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該酵母株の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地および合成培地のいずれを用いても良い。
【００１９】
上記の炭素源としては、該酵母株が資化し得るものであればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物などの炭水化物を用いることができる。
【００２０】
また、上記の窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物および各種醗酵菌体消化物等を用いることができる。
【００２１】
また、上記の無機塩としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウムなどを用いることができる。
【００２２】
前記の炭素源は、培養開始時に一括して添加してもよいし、培養中分割してあるいは連続的に添加することもでき、好ましくは５０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００２３】
本発明の乳酸の製造法において、培養は脂肪酸を含有する培地を用いて行われる。
【００２４】
本発明の乳酸の製造法で用いられる脂肪酸の炭素数は、好ましくは８〜２０であり、より好ましくは１４〜２０であり、特に好ましくは１６〜１８である。
【００２５】
本発明の乳酸の製造法で用いられる脂肪酸としては、例えば、カプリル酸、２−エチルヘキサン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、エルカ酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコセン酸等の単独脂肪酸、牛脂脂肪酸、ヤシ油脂肪酸等の混合脂肪酸、回収油由来の脂肪酸およびこれらの脂肪酸の２種以上の混合物が挙げられ、より好ましい脂肪酸としては、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸が挙げられ、特に好ましくはオレイン酸、オレイン酸誘導体またはこれらと他の脂肪酸の混合物が挙げられる。
本発明において脂肪酸は、脂肪酸誘導体の形で培地中に含まれていてもよい。例えば、グリセロールや高級アルコール等とのエステルである油脂や、脂肪酸を分子骨格にもつ界面活性剤などの脂肪酸誘導体も、本発明における脂肪酸に含まれる。
用いられる油脂としては、例えば、ヤシ油、パーム油、オリーブ油、大豆油、菜種油、アマニ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ヒマシ油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油、綿実油等の植物油、豚脂、牛脂および魚油等の動物油のほか、これらの油脂の硬化油、半硬化油、さらにこれら油脂の精製油や精製工程で副生する回収油等の油脂が挙げられ、これらを単独で用いても良いし、これら油脂の２種以上を混合して用いても良い。また、これら油脂１種類以上と上記脂肪酸１種類以上を混合して用いても良いが、上記油脂の構成脂肪酸の中でオレイン酸が主な脂肪酸であることが望ましい。
【００２６】
用いられる界面活性剤としては、脂肪酸を分子骨格に含む化学構造をもつものであれば、エステル型（例えば、脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリンエステルなど）、エーテル型（例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルなど）、エステル・エーテル型（例えば、モノオレイン酸ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなど）、ポリオキシエチレングリセリルエーテル脂肪酸エステル（例えば、トリオレイン酸ポリオキシエチレングリセリルなど）、ポリグリセリン脂肪酸エステルなどの化学構造特徴を持つ界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明における培地中の脂肪酸濃度は、乳酸合成能力を有する酵母株が正常に生育する濃度であれば特に限定されないが、好ましくは２５ｍｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌであり、より好ましくは２５ｍｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌであり、特に好ましくは２５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌである。脂肪酸濃度が２５ｍｇ／Ｌ未満では乳酸の生産収率向上が十分ではないため好ましくはなく、また脂肪酸濃度は１０ｇ／Ｌを超えて添加しても効果はあまり変わらず、コスト的にも好ましくない。また、脂肪酸の培地への添加時期は、培養前でも培養開始後でもよく、添加回数も１回でも２回以上であっても良い。
【００２８】
培地中の脂肪酸濃度は、培地から脂肪酸および脂肪酸誘導体を有機溶媒により抽出し、抽出物を加水分解し、メチルエステル化し、ガスクロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）分析を用いる方法で定量することができる。例えば、培養液を５ｍＬ採取し、これにクロロホルム６．２５ｍＬとメタノール１２．５ｍＬを加え十分撹拌する。撹拌した混合液に、さらにクロロホルム６．２５ｍＬを加え３０秒間撹拌する。これに、さらに純水６．２５ｍＬを加え３０秒間撹拌した後遠心分離を行い、クロロホルム層を回収する。上層を再度クロロホルム抽出し、先に回収したクロロホルム抽出液と併せて溶媒除去し、５％塩酸−メタノール溶液１ｍＬに溶解し７０℃の温度で３時間加熱反応を行い、脂肪酸のメチルエステル化を行った後、ヘキサン抽出を行い回収したヘキサン層を乾固させ、クロロホルムに再溶解し、ＧＣ−ＭＳ分析に供することにより、脂肪酸の種類の同定と定量ができる。
【００２９】
本発明において、培養は、振とう培養もしくは撹拌培養などで行い、好気的条件下、微好気条件下または嫌気的条件下で行うことができる。培養温度は２５〜３５℃が好ましく、培養時間は通常２４時間〜３日間である。また、培養中のｐＨは、２．５〜５．０に保持することが望ましい。ｐＨの調整は、アルカリ溶液、アンモニアおよび炭酸カルシウムなどを用いて行うことができる。
【００３０】
培養液中の乳酸濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法で定量することができ、例えば、培養液を遠心分離して培養液上清を調製し、該培養液上清を分析サンプルとして有機酸分析用陰イオン交換カラムを用い、電気伝導度を測定することにより培養液中の、例えば、乳酸や酢酸等の有機酸濃度を定量することができる。
【００３１】
培養液中で生成された乳酸は、培養終了後、培養物から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法および塩析法などを併用することにより、培養物から目的とする乳酸を単離し、精製することができる。例えば、特開２００１−２０４４６４号公報および特開平９−１３５６９８号公報などに公開されているような電気透析法や、蒸留法により精製することが可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の乳酸の製造方法で得られた乳酸は、ポリマー原料などの工業用途および 食品添加物などに好適に用いられる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらの実施例は単なる例示であり、本発明を何等制限するものではない。
【００３４】
（実施例１）乳酸合成能力を持つ酵母株の作製とオレイン酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
乳酸合成能力を持つ酵母株を、下記のようにして造成した。具体的には、ヒト由来乳酸合成酵素（乳酸脱水素酵素、Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、Ｌ−ＬＤＨ）遺伝子を、酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸合成能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【００３５】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた逆転写反応により、ｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【００３６】
上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（宝酒造社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素Ｈｉｎｃ ＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）に、ライゲーションした。ライゲーションは、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより、各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図１）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにして、ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。
【００３７】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、およびサッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．２ｋｂのサッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子およびＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片でサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を、常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【００３８】
得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
・カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）
・移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・カラムオーブン温度：４５℃。
【００３９】
上記において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、オレイン酸（炭素数：１８）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地［１００ｇ／ｌ グルコース、６．７ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ディフコ社製）、３．８４ｇ／Ｌ Ｄｒｏｐ―ｏｕｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｕｒａｃｉｌ（シグマ社製）、１５２ｍｇ／Ｌ Ｕｒａｃｉｌ］に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。添加する脂肪酸にはオレイン酸を用い、ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、オレイン酸をそれぞれ０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／Ｌ添加した。ミニジャーファーメンターを用いた培養は、下記の条件に従った。
・発酵装置：Ｂｉｏｎｅｅｒ−Ｎ（丸菱バイオエンジ社製）
・培養温度：３０℃
・通気量：０．１ｍｌ／ｍｉｎ．
・撹拌速度：１２０ｒｐｍ
・ｐＨ：５．０
・中和剤：１Ｎ ＮａＯＨ溶液
その結果、表１に示すように、オレイン酸を培養に用いる培地に添加することにより、乳酸の生産収率が向上した。
【００４０】
【表１】
【００４１】
（実施例２）オリーブ油を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
実施例１において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、オリーブ油（主構成脂肪酸（オレイン酸）の炭素数：１８）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、オリーブ油を５００ｍｇ／Ｌ添加し、醗酵試験を行った。培養条件は実施例１と同条件で行った。その結果、オリーブ油非添加条件下では乳酸の生産収率が３３．６％であるのに対し、オリーブ油添加条件下では、乳酸の生産収率は４２．０％まで向上した。オリーブ油の添加が乳酸の生産収率に効果的であった。
【００４２】
（実施例３）リノール酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
実施例１において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、リノール酸（炭素数：１８）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、リノール酸を５００ｍｇ／Ｌ添加し、醗酵試験を行った。培養条件は実施例１と同条件で行った。その結果、リノール酸非添加条件下では乳酸の生産収率が３３．６％であるのに対し、リノール酸添加条件下では、乳酸の生産収率は４１．５％まで向上した。リノール酸の添加が乳酸の生産収率に効果的であった。
【００４３】
（実施例４）リノレン酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
実施例１において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、リノレン酸（炭素数：１８）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、リノレン酸を５００ｍｇ／Ｌ添加し、醗酵試験を行った。培養条件は実施例１と同条件で行った。その結果、リノレン酸非添加条件下では乳酸の生産収率が３３．６％であるのに対し、リノレン酸添加条件下では、乳酸の生産収率が４１．９％まで向上した。リノレン酸の添加が乳酸の生産収率に効果的であった。
【００４４】
（実施例５）パルミチン酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
実施例１において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、パルミチン酸（炭素数：１６）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、パルミチン酸５００ｍｇをエタノール５ｍｌに溶解し、全量上記ＳＣ２培地に添加し、発酵試験を行った。培養条件は実施例１と同条件で行った。その結果、パルミチン酸非添加条件下では乳酸の生産収率が３３．６％であるのに対し、パルミチン酸添加条件下では、乳酸の生産収率が４４．２％まで向上した。パルミチン酸の添加が乳酸の生産収率に効果的であった。
【００４５】
（実施例６）パルミトレイン酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
実施例１において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、パルミトレイン酸（炭素数：１６）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、パルミトレイン酸を５００ｍｇ／Ｌ添加し、発酵試験を行った。培養条件は実施例１と同条件で行った。その結果、パルミトレイン酸非添加条件下では乳酸の生産収率が３３．６％であるのに対し、パルミトレイン酸添加条件下では、乳酸の生産収率が４３．５％まで向上した。パルミトレイン酸の添加が乳酸の生産収率に効果的であった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、乳酸合成能力を持つ酵母株を用いて効率的に乳酸を製造することができる。また、本発明によれば、乳酸合成能力を持つ酵母株を培養し乳酸を生産させる培地に脂肪酸もしくは脂肪酸誘導体を添加することにより、培地中に投入する炭素源あたりの乳酸生産量を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、本発明で用いられるプラスミドｐＴＲＳ１１の構築図である。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号１―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸合成能力を有する酵母株を用いてなる乳酸の製造方法において、乳酸の収量を効率的に向上させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、資源循環型社会構築に向け、生物資源由来の材料を用いた工業原料の生産が盛んに行われている。それらの中で生物由来材料である乳酸を原料とするポリ乳酸は、優れた性質を持つポリマーとして注目されており、その原料となる乳酸をいかに安価に供給するかが課題となっている。
【０００３】
乳酸の生産は、ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属やラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に代表される乳酸菌によって主に実施されているが、乳酸を培養液中に多量に蓄積させるためには、乳酸菌が酸性条件下で生育しないため、炭酸カルシウムやアンモニア、あるいは水酸化ナトリウムなどの中和剤を添加した培養を行わなければならず、中和工程や精製工程に多大なコストを要している。
一方、酸性条件下で生育可能な酵母株を用いた有機酸の製造法が、複数、提案されている（特許文献１〜３および非特許文献１、２参照。）。これらの提案によれば、本来乳酸生成能を持たない酵母株に乳酸生成酵素遺伝子を導入し乳酸を生産させることにより、中和操作を軽減し、低コストな乳酸製造工程を構築することが可能である。さらに、酵母株による乳酸を始めとする有機酸の生産能力を、遺伝子組み換え等の技術を用いて向上させることにより、より安価な有機酸の製造法を構築することが可能である。
【０００４】
しかしながら、酵母細胞は、培養液中に乳酸が存在することにより細胞膜に局在するプロトンエーティーピーエース（Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ）活性が阻害され、生存率が低下すると共に、脂質の構成脂肪酸の中で、不飽和脂肪酸の含有量が低下することが報告されている（非特許文献３参照。）。すなわち、より高く乳酸の生産能力を向上させるためには、酵母細胞の乳酸への耐性能力を向上させる必要がある。酵母細胞において脂肪酸の不飽和化に関与する酵素タンパク質としては、Ｓｔｅｒｏｙｌ−ＣｏＡ ９−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（ＯＬＥ１）が同定されている。そして、該酵素タンパク質もしくはその相同物を遺伝子工学的に高発現させることにより、形質転換酵母細胞の脂質を構成する不飽和脂肪酸含有量を向上させ、冷凍もしくはエタノールに対する耐性能力を向上させることが提案されている（特許文献４および非特許文献４、５参照。）が、乳酸耐性に関する知見は存在しておらず、脂質構成脂肪酸の組成が乳酸生産へ及ぼす効果については知られていない。
【０００５】
酵母細胞において脂質を構成する脂肪酸の組成比を変化させる方法としては、上記のようにデサチュラーゼタンパク質もしくはその相同物を遺伝子工学的に細胞内で高発現させる方法と、培養液中に脂肪酸を添加する方法（非特許文献６参照。）が提案されている。培養液中に脂肪酸を添加する方法では、培養液中に脂肪酸を添加することにより、培養された酵母細胞の脂質構成脂肪酸組成は添加された脂肪酸の含有量が増加すること、また脂質の含有率が増加することが提案されているが、乳酸耐性および乳酸の生産性への効果は知られていない。
【０００６】
また、微生物発酵を用いた物質生産において生産収率を向上させる方法としては、アミノ酸生産用細菌を用いたアミノ酸発酵においてアミノ酸の生産収率を向上させる添加剤として、脂肪酸と油脂を混合し、アルキレンオキシドを付加した添加剤が提案されている（特許文献５）が、これまでに行われている乳酸菌もしくは酵母株を用いた乳酸発酵への適用例はなく、さらに、乳酸発酵において乳酸生産収率を向上させ得る添加剤もしくは培地成分の提案は今までになされていない。
【特許文献１】特開２００１−２０４４６８号公報
【特許文献２】特表２００１−５１６５８４号パンフレット
【特許文献３】特開２００３−２５９８７８号公報
【特許文献４】特開２０００−３７１８５号公報
【特許文献５】特開２００１−２５２０６９号公報
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、７１、１９６４（２００５）
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、７１、２７８９（２００５）
【非特許文献３】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（ザ ジャーナル オブ ザ アメリカン ソサイエティ オブ ブリューイング ケミスツ）、５９、１８７（２００１）
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ジャーナル オブ バイオサイエンス アンド バイオエンジニアリング）、９９、５１２（２００５）
【非特許文献５】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー）、６９、１４９９（２００３）
【非特許文献６】Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （バイオサイエンス バイオテクノロジー アンド バイオケミストリー）、７０、６４６（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、乳酸合成能力を有する酵母株を用いた乳酸の製造方法において、乳酸の生産収率を効率的に向上させることができる製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、乳酸合成能力を持つ酵母株を糖質存在下で培養し、乳酸を生産させる過程において、脂肪酸（脂肪酸誘導体を含む）を培地に添加することにより、乳酸の生産収率を向上させることを見いだし、上記課題を解決するに至った。
【０００９】
上記の課題を解決する本発明の乳酸の製造方法は、乳酸合成能力を有する酵母株を脂肪酸を含む培地を用いて培養することを特徴とする乳酸の製造方法である。脂肪酸としては、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸のいずれも用いられ、また脂肪酸には脂肪酸誘導体も含まれる。
【００１０】
本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の乳酸合成能力を有する酵母株は、乳酸合成酵素遺伝子を有する酵母株であり、その乳酸合成能力を有する酵母株としては、乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより乳酸合成能力を獲得した酵母株があり、これらの乳酸合成酵素として乳酸脱水素酵素が用いられる。
【００１１】
本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の培地中の脂肪酸の濃度は２５ｍｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌである。
【００１２】
本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の脂肪酸の炭素数は８〜２０であり、好ましい脂肪酸としては、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸が挙げられ、特に、オレイン酸が好適である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、乳酸合成能力を持つ酵母株を用いて効率的に乳酸を製造することができる。酵母株を用いた乳酸発酵において、生産収率を向上させる培地成分はこれまでに限定されていない。しかしながら、本発明によれば、乳酸合成能力を持つ酵母株を培養し乳酸を生産させる培地に脂肪酸もしくは脂肪酸誘導体を添加することにより、培地中に投入する炭素源あたりの乳酸生産量を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の乳酸の製造法において用いられる酵母株は、乳酸合成能力をもつ酵母株であればいずれの酵母株であってもよく、乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより乳酸合成能力を獲得した酵母株も用いられる。このような乳酸合成酵素として、例えば乳酸脱水素酵素が用いられる。
【００１５】
より好ましい酵母株としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母株などを挙げることができる。上記のサッカロマイセス属に属する好ましい酵母株としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などを挙げることができる。
【００１６】
導入する乳酸合成酵素をコードする遺伝子は、酵母株において生産され得る乳酸合成酵素をコードするＤＮＡであれば特に限定されないが、酵素活性が強化された乳酸合成酵素をコードするＤＮＡが好ましい。酵素活性が強化された乳酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、例えば、部位特異的変異導入法を用いた変異手法によって得られる酵素活性が強い乳酸合成酵素をコードするＤＮＡや、強力なプロモーターの支配下に乳酸合成酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡなどが挙げられる。
【００１７】
本発明の乳酸の製造法に用いられる酵母株は、乳酸合成酵素（乳酸脱水素酵素、Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて導入することにより製造することができるが、該酵母株が既に目的とする乳酸合成酵素をコードする遺伝子を有している場合は、必ずしも該遺伝子を導入する必要はない。乳酸合成酵素としては、例えば、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＬ−乳酸合成酵素遺伝子またはボス・トウラス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）由来のＬ−乳酸合成酵素遺伝子にコードされるタンパク質からなる酵素を挙げることができる。
【００１８】
本発明の乳酸の製造法に用いられる酵母株の培養は、以下に記載した通常の方法に従って行うことができる。本発明の乳酸の製造法に用いられる酵母株を培養する培地は、該酵母株が資化し得る炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該酵母株の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地および合成培地のいずれを用いても良い。
【００１９】
上記の炭素源としては、該酵母株が資化し得るものであればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物などの炭水化物を用いることができる。
【００２０】
また、上記の窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物および各種醗酵菌体消化物等を用いることができる。
【００２１】
また、上記の無機塩としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウムなどを用いることができる。
【００２２】
前記の炭素源は、培養開始時に一括して添加してもよいし、培養中分割してあるいは連続的に添加することもでき、好ましくは５０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００２３】
本発明の乳酸の製造法において、培養は脂肪酸を含有する培地を用いて行われる。
【００２４】
本発明の乳酸の製造法で用いられる脂肪酸の炭素数は、好ましくは８〜２０であり、より好ましくは１４〜２０であり、特に好ましくは１６〜１８である。
【００２５】
本発明の乳酸の製造法で用いられる脂肪酸としては、例えば、カプリル酸、２−エチルヘキサン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、エルカ酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコセン酸等の単独脂肪酸、牛脂脂肪酸、ヤシ油脂肪酸等の混合脂肪酸、回収油由来の脂肪酸およびこれらの脂肪酸の２種以上の混合物が挙げられ、より好ましい脂肪酸としては、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸が挙げられ、特に好ましくはオレイン酸、オレイン酸誘導体またはこれらと他の脂肪酸の混合物が挙げられる。
本発明において脂肪酸は、脂肪酸誘導体の形で培地中に含まれていてもよい。例えば、グリセロールや高級アルコール等とのエステルである油脂や、脂肪酸を分子骨格にもつ界面活性剤などの脂肪酸誘導体も、本発明における脂肪酸に含まれる。
用いられる油脂としては、例えば、ヤシ油、パーム油、オリーブ油、大豆油、菜種油、アマニ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ヒマシ油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油、綿実油等の植物油、豚脂、牛脂および魚油等の動物油のほか、これらの油脂の硬化油、半硬化油、さらにこれら油脂の精製油や精製工程で副生する回収油等の油脂が挙げられ、これらを単独で用いても良いし、これら油脂の２種以上を混合して用いても良い。また、これら油脂１種類以上と上記脂肪酸１種類以上を混合して用いても良いが、上記油脂の構成脂肪酸の中でオレイン酸が主な脂肪酸であることが望ましい。
【００２６】
用いられる界面活性剤としては、脂肪酸を分子骨格に含む化学構造をもつものであれば、エステル型（例えば、脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリンエステルなど）、エーテル型（例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルなど）、エステル・エーテル型（例えば、モノオレイン酸ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなど）、ポリオキシエチレングリセリルエーテル脂肪酸エステル（例えば、トリオレイン酸ポリオキシエチレングリセリルなど）、ポリグリセリン脂肪酸エステルなどの化学構造特徴を持つ界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明における培地中の脂肪酸濃度は、乳酸合成能力を有する酵母株が正常に生育する濃度であれば特に限定されないが、好ましくは２５ｍｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌであり、より好ましくは２５ｍｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌであり、特に好ましくは２５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌである。脂肪酸濃度が２５ｍｇ／Ｌ未満では乳酸の生産収率向上が十分ではないため好ましくはなく、また脂肪酸濃度は１０ｇ／Ｌを超えて添加しても効果はあまり変わらず、コスト的にも好ましくない。また、脂肪酸の培地への添加時期は、培養前でも培養開始後でもよく、添加回数も１回でも２回以上であっても良い。
【００２８】
培地中の脂肪酸濃度は、培地から脂肪酸および脂肪酸誘導体を有機溶媒により抽出し、抽出物を加水分解し、メチルエステル化し、ガスクロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）分析を用いる方法で定量することができる。例えば、培養液を５ｍＬ採取し、これにクロロホルム６．２５ｍＬとメタノール１２．５ｍＬを加え十分撹拌する。撹拌した混合液に、さらにクロロホルム６．２５ｍＬを加え３０秒間撹拌する。これに、さらに純水６．２５ｍＬを加え３０秒間撹拌した後遠心分離を行い、クロロホルム層を回収する。上層を再度クロロホルム抽出し、先に回収したクロロホルム抽出液と併せて溶媒除去し、５％塩酸−メタノール溶液１ｍＬに溶解し７０℃の温度で３時間加熱反応を行い、脂肪酸のメチルエステル化を行った後、ヘキサン抽出を行い回収したヘキサン層を乾固させ、クロロホルムに再溶解し、ＧＣ−ＭＳ分析に供することにより、脂肪酸の種類の同定と定量ができる。
【００２９】
本発明において、培養は、振とう培養もしくは撹拌培養などで行い、好気的条件下、微好気条件下または嫌気的条件下で行うことができる。培養温度は２５〜３５℃が好ましく、培養時間は通常２４時間〜３日間である。また、培養中のｐＨは、２．５〜５．０に保持することが望ましい。ｐＨの調整は、アルカリ溶液、アンモニアおよび炭酸カルシウムなどを用いて行うことができる。
【００３０】
培養液中の乳酸濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法で定量することができ、例えば、培養液を遠心分離して培養液上清を調製し、該培養液上清を分析サンプルとして有機酸分析用陰イオン交換カラムを用い、電気伝導度を測定することにより培養液中の、例えば、乳酸や酢酸等の有機酸濃度を定量することができる。
【００３１】
培養液中で生成された乳酸は、培養終了後、培養物から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法および塩析法などを併用することにより、培養物から目的とする乳酸を単離し、精製することができる。例えば、特開２００１−２０４４６４号公報および特開平９−１３５６９８号公報などに公開されているような電気透析法や、蒸留法により精製することが可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の乳酸の製造方法で得られた乳酸は、ポリマー原料などの工業用途および 食品添加物などに好適に用いられる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらの実施例は単なる例示であり、本発明を何等制限するものではない。
【００３４】
（実施例１）乳酸合成能力を持つ酵母株の作製とオレイン酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
乳酸合成能力を持つ酵母株を、下記のようにして造成した。具体的には、ヒト由来乳酸合成酵素（乳酸脱水素酵素、Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、Ｌ−ＬＤＨ）遺伝子を、酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸合成能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【００３５】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた逆転写反応により、ｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【００３６】
上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（宝酒造社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素Ｈｉｎｃ ＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）に、ライゲーションした。ライゲーションは、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより、各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図１）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにして、ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。
【００３７】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、およびサッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．２ｋｂのサッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子およびＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片でサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を、常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【００３８】
得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
・カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）
・移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・カラムオーブン温度：４５℃。
【００３９】
上記において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、オレイン酸（炭素数：１８）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地［１００ｇ／ｌ グルコース、６．７ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ディフコ社製）、３．８４ｇ／Ｌ Ｄｒｏｐ―ｏｕｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｕｒａｃｉｌ（シグマ社製）、１５２ｍｇ／Ｌ Ｕｒａｃｉｌ］に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。添加する脂肪酸にはオレイン酸を用い、ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、オレイン酸をそれぞれ０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、および５００ｍｇ／Ｌ添加した。ミニジャーファーメンターを用いた培養は、下記の条件に従った。
・発酵装置：Ｂｉｏｎｅｅｒ−Ｎ（丸菱バイオエンジ社製）
・培養温度：３０℃
・通気量：０．１ｍｌ／ｍｉｎ．
・撹拌速度：１２０ｒｐｍ
・ｐＨ：５．０
・中和剤：１Ｎ ＮａＯＨ溶液
その結果、表１に示すように、オレイン酸を培養に用いる培地に添加することにより、乳酸の生産収率が向上した。
【００４０】
【表１】
【００４１】
（実施例２）オリーブ油を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
実施例１において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、オリーブ油（主構成脂肪酸（オレイン酸）の炭素数：１８）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、オリーブ油を５００ｍｇ／Ｌ添加し、醗酵試験を行った。培養条件は実施例１と同条件で行った。その結果、オリーブ油非添加条件下では乳酸の生産収率が３３．６％であるのに対し、オリーブ油添加条件下では、乳酸の生産収率は４２．０％まで向上した。オリーブ油の添加が乳酸の生産収率に効果的であった。
【００４２】
（実施例３）リノール酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
実施例１において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、リノール酸（炭素数：１８）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、リノール酸を５００ｍｇ／Ｌ添加し、醗酵試験を行った。培養条件は実施例１と同条件で行った。その結果、リノール酸非添加条件下では乳酸の生産収率が３３．６％であるのに対し、リノール酸添加条件下では、乳酸の生産収率は４１．５％まで向上した。リノール酸の添加が乳酸の生産収率に効果的であった。
【００４３】
（実施例４）リノレン酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
実施例１において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、リノレン酸（炭素数：１８）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、リノレン酸を５００ｍｇ／Ｌ添加し、醗酵試験を行った。培養条件は実施例１と同条件で行った。その結果、リノレン酸非添加条件下では乳酸の生産収率が３３．６％であるのに対し、リノレン酸添加条件下では、乳酸の生産収率が４１．９％まで向上した。リノレン酸の添加が乳酸の生産収率に効果的であった。
【００４４】
（実施例５）パルミチン酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
実施例１において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、パルミチン酸（炭素数：１６）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、パルミチン酸５００ｍｇをエタノール５ｍｌに溶解し、全量上記ＳＣ２培地に添加し、発酵試験を行った。培養条件は実施例１と同条件で行った。その結果、パルミチン酸非添加条件下では乳酸の生産収率が３３．６％であるのに対し、パルミチン酸添加条件下では、乳酸の生産収率が４４．２％まで向上した。パルミチン酸の添加が乳酸の生産収率に効果的であった。
【００４５】
（実施例６）パルミトレイン酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験
実施例１において作製したΔｐｄｃ１−ｌｄｈ株を用いて、次のように、パルミトレイン酸（炭素数：１６）を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。１０ｍｌＳＣ２培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を１．０ＬのＳＣ２培地に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し乳酸の生産量を定量した。ミニジャーファーメンターを用いた培養開始時に、パルミトレイン酸を５００ｍｇ／Ｌ添加し、発酵試験を行った。培養条件は実施例１と同条件で行った。その結果、パルミトレイン酸非添加条件下では乳酸の生産収率が３３．６％であるのに対し、パルミトレイン酸添加条件下では、乳酸の生産収率が４３．５％まで向上した。パルミトレイン酸の添加が乳酸の生産収率に効果的であった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、乳酸合成能力を持つ酵母株を用いて効率的に乳酸を製造することができる。また、本発明によれば、乳酸合成能力を持つ酵母株を培養し乳酸を生産させる培地に脂肪酸もしくは脂肪酸誘導体を添加することにより、培地中に投入する炭素源あたりの乳酸生産量を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、本発明で用いられるプラスミドｐＴＲＳ１１の構築図である。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号１―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９―人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸合成能力を有する酵母株を、脂肪酸を含む培地を用いて培養することを特徴とする乳酸の製造方法。
【請求項２】
乳酸合成能力を有する酵母株が、乳酸合成酵素遺伝子を有する酵母株である請求項１記載の乳酸の製造方法。
【請求項３】
乳酸合成能力を有する酵母株が、乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより乳酸合成能力を獲得した酵母株である請求項１記載の乳酸の製造方法。
【請求項４】
乳酸合成酵素が乳酸脱水素酵素である請求項２または３記載の乳酸の製造方法。
【請求項５】
培地中の脂肪酸の濃度が２５ｍｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項６】
脂肪酸の炭素数が８〜２０である請求項１〜５のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項７】
脂肪酸が、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸またはリノレン酸のいずれかである請求項１〜６のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項８】
脂肪酸が、オレイン酸である請求項１〜６のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項１】
乳酸合成能力を有する酵母株を、脂肪酸を含む培地を用いて培養することを特徴とする乳酸の製造方法。
【請求項２】
乳酸合成能力を有する酵母株が、乳酸合成酵素遺伝子を有する酵母株である請求項１記載の乳酸の製造方法。
【請求項３】
乳酸合成能力を有する酵母株が、乳酸合成酵素遺伝子を導入することにより乳酸合成能力を獲得した酵母株である請求項１記載の乳酸の製造方法。
【請求項４】
乳酸合成酵素が乳酸脱水素酵素である請求項２または３記載の乳酸の製造方法。
【請求項５】
培地中の脂肪酸の濃度が２５ｍｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項６】
脂肪酸の炭素数が８〜２０である請求項１〜５のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項７】
脂肪酸が、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸またはリノレン酸のいずれかである請求項１〜６のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項８】
脂肪酸が、オレイン酸である請求項１〜６のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００８−７２９８６（Ｐ２００８−７２９８６Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５７７７４（Ｐ２００６−２５７７７４）
【出願日】平成１８年９月２２日（２００６．９．２２）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２２日（２００６．９．２２）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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