乳酸生産のための酵母菌株
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換され、そしてさらに、高い収率と生産性をもつ乳酸生産のために改変された酵母菌株が記述される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換され、そして高い収率と生産性をもつ乳酸生産のためにさらに改変された酵母菌株に関する。
【０００２】
発明の背景 乳酸およびその誘導体の応用は、多くの工業活動分野（すなわち、化学、化粧品および薬学）、ならびに食品製造と使用の重要な範囲を包含する。さらにまた、今日では、生分解性ポリマー材の合成のために直接使用されるそのような有機酸の製造における関心が高まりつつある。
【０００３】
乳酸は、化学合成によるか、または微生物を使用する炭水化物の発酵によって製造することができる。後者の方法は、化学合成によって生成されるラセミ混合物に対して、１種の異性体を独占的に生産する微生物が開発されたので、今や商業的に好適である。もっとも重要な工業用微生物。例えば属ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびリゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）は、Ｌ（＋）−乳酸を生産する。また、Ｄ（−）−乳酸もしくはＬ（＋）−およびＤ（−）−乳酸の混合物の発酵による生産も知られている。
【０００４】
典型的な乳酸発酵においては、生産微生物の代謝活性に対する生産された乳酸によって惹起される阻害効果が存在する。乳酸の存在に加えて、ｐＨ値を低下することも、また細胞増殖と代謝活性を阻害する。結果として、一般に、乳酸生産の程度が低下される。
【０００５】
それ故、乳酸を中和し、そしてｐＨ低下を防ぐためのＣａ（ＯＨ）2、ＣａＣＯ3、ＮａＯＨもしくはＮＨ4ＯＨの添加は、遊離の乳酸蓄積のネガティブ効果に対抗するための工業的工程における慣用の操作である。
【０００６】
これらの工程は、ｐＨを範囲約５〜７の一定値に維持することによって、乳酸塩の生産を可能にする；これは、十分に乳酸のｐＫa、３．８６以上である。
【０００７】
主要な欠点は、発酵中の乳酸の中和に関係している。主として、遊離の乳酸をその塩から再生し、そして中和する陽イオンの処理もしくは再利用するために、付加的操作が必要になる；これは、費用のかかる工程である。もし、遊離の乳酸が、低いｐＨ値において増殖する微生物によって蓄積でき、それによって、乳酸塩の生産を最小化することができれば、余分な操作と費用のすべてが排除できるであろう。
【０００８】
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する組み換え酵母の使用によって、解糖の流れを乳酸生産の方向へシフトさせることが提案された。
【０００９】
フランス特許出願公開第６９２ ５９１号（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ）は、乳酸菌由来の乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子であって、酵母においてその発現を調節している配列の制御下にある該遺伝子の少なくとも１個のコピーを含有する酵母菌株、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌株を開示している。
【００１０】
該菌株は、アルコールおよび乳酸発酵の両方を行うことができ、そしてこのいわゆる「中間的（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）」もしくは「均衡（ｂａｌａｎｃｅｄ）」発酵は、ビール醸造、ワイン醸造およびパン焼きのような領域において利用することができるであろう。
【００１１】
また、Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１，２９４−２９８，１９９５）は、ウシ乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子を用いるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換を報告した。
【００１２】
しかしながら、エタノールの高い生産のために、前記両方法の乳酸生産における収率は、乳酸菌の使用によって得られる収率に匹敵するとは見なされなかった。 過去の１０年間において、Ｓ．セレビシエ以外の「非慣用酵母」が、異種タンパク質の発現のための宿主としてかなり高い工業的関心を得た。例は、メタノール資化性酵母、例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）およびピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ラクトース資化性酵母、例えばクルイベロミセス ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）である。炭素およびエネルギー源として広範囲な基質の使用を可能にすることに加えて、他の議論は、「非慣用酵母」の工業的使用のために提案された。一般的に言えば、バイオマスおよび生産物収量は、これらの酵母のある種では、細胞環境の苛酷な条件によってもほとんど影響を受けない。高濃度の糖耐性（すなわち、５０〜８０％ｗ／ｖグルコース培地；トルラスポラ−異名チゴサッカロミセス−・デルブルッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ−ｓｙｎ．Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ− ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ）、チゴサッカロミセス・ルキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）およびチゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）；Ｏｋ Ｔ ａｎｄ Ｈａｓｈｉｎａｇａ Ｆ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ＆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４３（１）：３９−４７，１９９７）、ならびに酸および乳酸耐性（チゴサッカロミセス・ルキシイおよびチゴサッカロミセス・バイリイ；Ｈｏｕｔｓｍａ ＰＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ５９（１２），１３００−１３０４，１９９６）の「非慣用酵母」が利用しうる。既に強調されたように、もし発酵法が、前記の１つ以上の「苛酷な条件」下で実施されれば、下流処理の費用は、著しく削減することができるであろう。
【００１３】
発明の概要 第１の実施態様によれば、本発明は、エタノール生産能を欠いているか、または低いエタノール生産能をもち、そして酵母において乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株を提供する。
【００１４】
より具体的には、本発明は、低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性と低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性をもち、そして酵母において乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株を提供する。
【００１５】
その他の実施態様によれば、本発明は、クルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種の酵母菌株であって、該酵母において遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株を提供する。
【００１６】
さらなる実施態様によれば、本発明は、また、異種ＬＤＨ遺伝子により形質転換され、そして乳酸輸送体を過剰発現する酵母細胞を提供する。
【００１７】
他の実施態様は、酵母プロモーター配列に機能的に結合された乳酸デヒドロゲナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、および炭素源を含有する発酵培地において前記の代謝的に工作された酵母菌株を培養し、そして発酵培地から乳酸を回収することによるＤＬ−、Ｄ−もしくはＬ−乳酸の製造方法である。
【００１８】
さらにまた、本発明は、操作された発酵培地において該酵母菌株を培養し、そして発酵培地から乳酸を回収することによって、乳酸の炭素源における生産性（ｇ／ｌ／ｈｒ）、生産量（ｇ／ｌ）および収率（ｇ／ｇ）を改良する方法を提供する。
【００１９】
発明の記述 乳酸が、属クルイベロミセス、サッカロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスに属する代謝的に改変された酵母によって生産し得ることが見い出された。
【００２０】
より具体的には、乳酸生産における非常に高い収率が、少なくともエタノール発酵を乳酸発酵によって置換するように工作された酵母菌株によって得られることが見い出された。
【００２１】
乳酸生産において、なおより高い収率（＞８０％ｇ／ｇ）は、エタノール発酵とミトコンドリアによるピルビン酸の使用の両方を、乳酸発酵によって置換するように工作された酵母菌株によって得られるかも知れない。
【００２２】
この目的のために、また、本発明は、例えば、１細胞当たりの増加されたＬＤＨコピー数、またはＬＤＨ発現を制御するより強力なプロモーターの使用の結果として、増強されたＬＤＨ活性をもつ形質転換酵母細胞を提供する。
【００２３】
１細胞当たりの増加されたＬＤＨコピー数は、乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードしている核酸配列の少なくとも１個のコピー、好ましくは少なくとも２個のコピー、より好ましくは４個のコピー、なおより好ましくは、該核酸配列の１０〜５０個のコピーを意味する。
【００２４】
乳酸のもっとも高い生産のためには、本発明により形質転換された酵母細胞は、好ましくは、乳酸輸送体を過剰発現する。これは、乳酸輸送体のために必要な遺伝子の１個以上のコピーにより酵母細胞を形質転換することによって得ることができる。
【００２５】
本発明による菌株は、いくつかの方法によって、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の発現を標的とする遺伝子工学技術、およびエタノールの生産に関与する酵素活性、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼ活性の不活性化もしくは抑制、およびミトコンドリアによるピルビン酸の利用に関与する酵素活性の不活性化もしくは抑制によって得ることができる。
【００２６】
ピルビン酸デカルボキシラーゼは、アルコール経路における最初の段階を触媒するので、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性をもたないか実質的に低い活性をもち、そして異種の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する酵母菌株が好適である。
【００２７】
さらに、ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ミトコンドリアによるピルビン酸の利用における最初の段階を触媒するので、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）活性をもたないか実質的に低い活性をもち、そして異種の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する酵母菌株が、また好適である。
【００２８】
乳酸は、乳酸輸送体を介して培地中に分泌されるので、乳酸を生産し、そして乳酸輸送体を過剰発現する細胞が、また好適である。
【００２９】
酵母菌株におけるＬＤＨ遺伝子の発現は、遊離の酸が直接得られ、そして乳酸塩の面倒な転化と回収が最小化されるような酸性ｐＨ値における乳酸の生産を可能にする。本発明において、発酵培地のｐＨは、最初は４．５を超えていてもよいが、発酵の終了時には、ｐＨ４．５以下、好ましくは３以下まで低下するであろう。
【００３０】
いかなる種類の酵母菌株も、本発明により使用されてもよいが、クルイベロミセス、サッカロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種が好適である。何故なら、これらの菌株は、非常に低いｐＨにおいて、特にｐＨ４．５以下の範囲において増殖し、そして／または代謝できるからである；これらの菌株のための遺伝子工学法は、よく開発されている；そしてこれらの菌株は、食品関連の応用における使用のために広く受け入れられている。
【００３１】
乳酸の良好な収率は、さらに、「野生型」ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性をもつ乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子により形質転換されたクルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセス菌株によって得ることができる。
【００３２】
用語「低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性」は、細胞における減少された酵素濃度、または酵素の低いか全くない比触媒活性、のいずれかを意味する。
【００３３】
用語「低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」は、細胞における減少された酵素濃度、または酵素の低いか全くない比触媒活性、のいずれかを意味する。
【００３４】
本発明によれば、エタノール生産がゼロであるかそれに近いが、例えば、野生型菌株の正常値よりも少なくとも６０％低く、好ましくは少なくとも８０％低く、そしてなおより好ましくは少なくとも９０％低く、低い生産が受け入れられる菌株の使用が好適である。
【００３５】
本発明によれば、ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が、ゼロであるかそれに近いが、例えば、野生型菌株の正常値よりも少なくとも６０％低く、好ましくは少なくとも８０％低く、そしてさらにより好ましくは少なくとも９０％低く、低い活性が認められる菌株の使用が好適である。
【００３６】
ＰＤＣ活性をもたないＫ．ラクチスの例は、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９（１），２７−３６，１９９６において開示された。
【００３７】
低いＰＤＣ活性をもつサッカロミセス菌株の例は、Ａｃｃ．Ｎｏ．２０００２７および２０００２８を付してＡＴＣＣから入手できる。調節ＰＤＣ２遺伝子の欠失の結果として低いＰＤＣ活性をもつサッカロミセス菌株のさらなる例が、Ｈｏｈｍａｎｎ Ｓ （１９９３）（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４１：６５７−６６６）において記述された。
【００３８】
ＰＤＣ活性をもたないサッカロミセス菌株の例は、Ｆｌｉｋｗｅｅｒｔ Ｍ．Ｔ．らにより記述された（Ｙｅａｓｔ，１２：２４７−２５７，１９９６）。Ｓ．セレビシエにおける、ＰＤＣ活性の低下は、構造遺伝子（ＰＤＣ１，ＰＤＣ５，ＰＤＣ６）の欠失もしくは調節遺伝子（ＰＤＣ２）の欠失のいずれかによって得ることができる。
【００３９】
ＰＤＨ活性をもたないクルイベロミセス菌株の例は、Ｚｅｅｍａｎらにより記述された（Ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｋ．ｌａｃｔｉｓ；Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ １３ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｉｓｓｕｅ Ａｐｒｉｌ １９９７，Ｅｉｇｈｔｅｅｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ１４３）。
【００４０】
ＰＤＨ活性をもたないサッカロミセス菌株の例は、Ｐｒｏｎｋ ＪＴ．らにより記述された（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４０（Ｐｔ ３）：６０１−１０，１９９４）。
【００４１】
ＰＤＣ遺伝子は、種々の酵母の属中で高度に保存されている（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９（１）：２７−３６，１９９６；Ｌｕ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ＆ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６４（１）：９４−７，１９９８）。それ故、Ｌｕ Ｐら（前出）によって報告されたように、古典的分子アプローチにしたがって、両トルラスポラおよびチゴサッカロミセス酵母種からピルビン酸デカルボキシラーゼ活性に必要な遺伝子を、同定し、クローン化し、そして破壊することが可能であることは、容易に期待できる。さらに、Ｎｅｖｅｌｉｎｇ Ｕら（１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８０（６）：１５４０−８，１９９８）によって報告されたように、同じ古典的アプローチにしたがって、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの両酵母種においてＰＤＨ活性に必要な遺伝子を、単離し、クローン化し、そして破壊することが可能であることは、また容易に期待できる。
【００４２】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、既知の方法、例えばＵｌｂｒｉｃｈ Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８，ｐ．１０９−１１９，１９７０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによって測定できる。
【００４３】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えばＮｅｖｅｌｉｎｇ Ｕ．ら（前出）による既知の方法によって測定できる。
【００４４】
適当な菌株は、野生型もしくは保存菌株の選択的突然変異および／または遺伝子操作によって得ることができる。数百の変異株が、「高生産性スクリーン」アプローチによって選択できる。種々の解糖系流速を支持する栄養物質を使用することによるピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の調節（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１，２９４−２９８，１９９５）は、満足されないことが証明された。
【００４５】
本発明により酵母菌株におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ活性および／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下もしくは消滅する好適な方法は、対応する遺伝子もしくは遺伝子群の欠失にある。
【００４６】
これらの欠失は、Ｂｉａｎｃｈｉら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９（１），２７−３６，１９９６；Ｆｌｉｋｗｅｅｒｔ Ｍ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１２：２４７−２５７，１９９６およびＰｒｏｎｋ ＪＴ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０（Ｐｔ ３）：６０１−１０，１９９４）によって開示されたような既知の方法によって、選択マーカー、例えばＵＲＡ３マーカー、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３マーカーの手段による欠失もしくは挿入によって実施される。あるいはまた、欠失、点変異および／またはフレーム・シフト変異が、機能性プロモーターおよびＰＤＣおよび／またはＰＤＨ活性に必要な遺伝子中に導入できる。これらの技術は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３０５，３９１−３９７，１９８３において開示されている。これらの活性を低下する付加法は、ＰＤＣおよびＰＤＨｍＲＮＡの翻訳を阻害するための、遺伝子配列中の終止コドンの導入もしくはアンチセンスｍＲＮＡの発現であってもよい。
【００４７】
ＰＤＣ遺伝子が、Ｓ．セレビシエのＵＲＡ３遺伝子によって置換されたクルイベロミセス・ラクチス菌株は、既に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９（１），２７−３６，１９９６において記述された。
【００４８】
乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子は、いかなる種（例えば、ウシのような哺乳類もしくは細菌類）のものであってもよく、そしてそれは、Ｌ（＋）−ＬＤＨもしくはＤ（−）−ＬＤＨをコードしていてもよい。あるいはまた、両タイプのＬＤＨ遺伝子が、同時に発現されてもよい。さらに、ＬＤＨ ＤＮＡ配列をもついかなる天然もしくは合成変異体、野生型ＬＤＨ遺伝子と高い同一性をもついかなるＤＮＡ配列、正常なＬＤＨ活性を補足するいかなるＤＮＡ配列が、使用されてもよい。
【００４９】
輸送体遺伝子として、例えば、Ｓ．セレビシエの乳酸輸送体をコードしているＪＥＮ１遺伝子が使用できる。
【００５０】
酵母菌株の形質転換は、組み込みもしくは複製ベクター、直鎖状もしくはプラスミド状のいずれを用いても実施することができる。
【００５１】
本発明の組み換え細胞は、外来ＤＮＡを細胞中に導入させるすべての方法（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｊｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２８（５）：３２１−３３３，１９８８）、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、接合、プロトプラスト融合もしくはすべての他の既知技術によって得ることができる。形質転換に関して、種々の方法が記述された：特に、それは、Ｉｔｏ Ｈ．ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３，１９８３）による酢酸リチウムおよびポリエチレングリコールの存在下、またはＤｕｒｒｅｎｓ Ｐ．ら（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１８：７，１９９０）によるエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドの存在下で、全細胞を処理することによって実施することができる。また別の方法は、欧州特許第３６１９９１号において記述されている。エレクトロポレーションは、Ｂｅｃｋｅｒ Ｄ．Ｍ．およびＧｕａｒｅｎｔｅ Ｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８，１９９１）により実施することができる。
【００５２】
非細菌性組み込みベクターの使用は、酵母菌体が、発酵法の終了時点で、保存飼料として、または他の繁殖用、農業用もしくは食用目的に使用される場合には好適であろう。
【００５３】
本発明の特定の実施態様では、組み換えＤＮＡは、自律もしくは組み込み複製できる発現プラスミドの一部分である。
【００５４】
特に、両Ｓ．セレビシエおよびＫ．ラクチスでは、自律複製ベクターは、選ばれた宿主における自律複製配列を使用することによって得ることができる。特に、酵母においては、それらは、プラスミド（２μ，ｐＫＤ１など）もしくは染色体配列（ＡＲＳ）さえから得られる複製開始点であってもよい。
【００５５】
組み込みベクターは、相同組み換えによりベクターの組み込みを可能にする、宿主ゲノムのある領域における相同ＤＮＡ配列を使用することによって得ることができる。
【００５６】
遺伝子発現のための遺伝道具は、Ｓ．セレビシエに関して非常に良く開発されており、そしてＲｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，８：４２３，１９９２に記述されている。遺伝道具は、また、組み換えタンパク質生産のための宿主細胞として酵母クルイベロミセスおよびトルラスポラ種の使用を可能にするためにも開発されてきた（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｊｆ，ｅｔ ａｌ．，前出；Ｒｅｉｓｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．４３，７５−１０２，１９９０）。Ｋ．ラクチスにおいて自律的に複製するベクターの若干の例は、Ｋ．ラクチスの直鎖状プラスミドｐＫＧ１（ｄｅ Ｌｏｖｅｎｃｏｕｒｔ Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４：７３７，１９８２）に基づくか、または自己複製と正しい分離能をベクターに付与するＫ．ラクチスそれ自体の染色体配列（ＫＡＲＳ）（Ｄａｓ Ｓ．，Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ Ｃ．Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，６：１２３，１９８２）を含有しているかいずれかであると報告されている。さらにまた、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）に固有の２μ−様プラスミド（プラスミドｐＫＤ１−米国特許第５ １６６ ０７０号）の認識が、組み換えタンパク質の生産のための非常に有効な宿主／ベクター系を確立させた（欧州特許出願公開第３６１ ９９１号）。組み換え体ｐＫＤ１に基づくベクターは、適当な酵母および細菌マーカーに融合された完全な元の配列を含有する。あるいはまた、ｐＫＤ１の一部を、共通のＳ．セレビシエ発現ベクターと組み合わせることができる（Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｙｅａｓｔ，８：４２３，１９９２）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：９５，１９８９）。
【００５７】
Ｓ．セレビシエ由来の２μプラスミドが、トルラスポラにおいて複製し、そして安定に維持されることが知られている。この酵母において、異種タンパク質の発現は、同時形質転換操作、すなわち、Ｓ．セレビシエのための発現ベクターと全２μプラスミドの同時存在によって得られた（Ｃｏｍｐａｇｎｏ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．，３：１００３−１０１０，１９８９）。分子間および分子内組み換えの結果として、完全な２μ配列と異種遺伝子を担持しているハイブリッドプラスミドを単離することができる；そのようなプラスミドは、原則的には、トルラスポラを直接形質転換することができる。
【００５８】
さらに、Ｓ．セレビシエＡＲＳ１配列に基づくエピソームプラスミドも記述されているが、このプラスミドの安定性は非常に低い、Ｃｏｍｐａｇｎｏら（前出）。
【００５９】
近年、ｐＴＤ１と名付けられた内因性の２μ−様プラスミドが、トルラスポラにおいて単離された（Ｂｌａｉｓｏｎｎｅａｕ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，３８：２０２−２０９，１９９７）；現在Ｓ．セレビシエのために利用できる遺伝道具は、新規プラスミドに転移することができ、かくしてトルラスポラ酵母種に与えられる発現ベクターを得る。
【００６０】
トルラスポラ酵母のための遺伝マーカーは、例えば、ＵＲＡ３（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４５：４１５−４２０，１９９６），Ｇ４１８耐性（Ｃｏｍｐａｇｎｏ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．，３：１００３−１０１０，１９８９）およびシクロヘキシミド耐性（Ｎａｋａｔａ Ｋ．ｅｔ Ｏｋａｍｕｒａ ｋ．，Ｂｉｏｓｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０：１６８６−１６８９，１９９６）を含む。
【００６１】
チゴサッカロミセス種からの２μ−様プラスミドが知られており、そしてＺ．ルキシイ（ｐＳＲ１）、Ｚ．ビスポラス（Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）（ｐＳＢ３）、Ｚ．フェルメンタチ（Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）（ｐＳＭ１）およびＺ．バイリイ（ｐＳＢ２）において単離された（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｊｆ．ｅｔ ａｌ．，前出）。
【００６２】
プラスミドｐＳＲ１は、もっともよく知られている：それはＳ．セレビシエにおいて複製されるが、２μＡＲＳは、Ｚ．ルキシイにおいて認識されない（Ａｒａｋｉ Ｈ．ａｎｄ Ｈｏｓｈｉｍａ Ｙ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０７：７５７−７６９，１９８９）。
【００６３】
Ｓ．セレビシエＡＲＳ１に基づくエピソームベクターは、Ｚ．ルキシイのために記述されている（Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３８：１２０−１２８，１９９３）。
【００６４】
チゴサッカロミセスのための選択マーカーは、Ｇ４１８を含有する培地において増殖を可能にする遺伝子ＡＰＴ１である（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４：２５２１−２５２９，１９９０）。
【００６５】
誘導的であれ構成的であれ、いかなる酵母プロモーターが、本発明により使用されてもよい。今日まで、Ｓ．セレビシエにおけるタンパク質の発現に使用されたプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら（前出）によってよく記述されている。Ｋ．ラクチスにおいて外来タンパク質発現に普通に使用されるプロモーターは、Ｓ．セレビシエＰＧＫおよびＰＨＯ５であるか（Ｒｏｍａｎｏｓら、前出）、または相同プロモーター、例えばＬＡＣ４（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５，１９９０）およびＫｌＰＤＣ（米国特許第５ ６３１ １４３号）である。Ｋ．ラクチスのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター（ＫｌＰＤＣ）が特に好適である。
【００６６】
クルイベロミセス・ラクチス株の形質転換に特に有効である異種遺伝子発現のためのベクターは、米国特許第５ １６６ ０７０号に記述されており、引用によって本明細書に組み入れられる。
【００６７】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９（１），２７−３６，１９９６に開示されている、好ましくはクルイベロミセス種からの、なおより好ましくはクルイベロミセス・ラクチスからのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターが、特に好適である。また、好ましくはサッカロミセス種、なおより好ましくはサッカロミセス・セレビシエからのトリオースリン酸イソメラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが好適である（Ｒｏｍａｎｏｓら、前出）。
【００６８】
乳酸の生産のために、本発明の酵母菌株は、炭素源および他の必須栄養素を含有する培地において培養され、そして乳酸が、ｐＨ７以下、好ましくはｐＨ４．５以下、なおより好ましくはｐＨ３以下において回収される。培地のｐＨが低下されるので、比較的少量の中和剤が必要である。乳酸塩の形成は、対応して減じられ、そして乳酸を回収するためには遊離酸の比例的に少ない再生が必要になる。回収工程は、既知の方法のいずれを用いてもよい（Ｔ．Ｂ．Ｖｉｃｋｒｏｙ，Ｖｏｌｕｍｅ３，Ｃｈａｐｅｒ３８ ｏｆ ”Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”（ｅｄｉｔｏｒ：Ｍ．ＭｏｏＹｏｕｎｇ），Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）（Ｒ．Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６，２２１−２３１，１９９５）。典型的には、乳酸を回収する前に、微生物が濾過もしくは遠心によって除去される。乳酸回収の既知の方法は、例えば、非混和性溶媒相への乳酸の抽出、または乳酸もしくはそのエステルの蒸留を含む。炭素源に対するより高い収率（乳酸ｇ／消費グルコースｇ）およびより高い生産性（乳酸ｇ／ｌ／ｈ）が、Ｍｇ++およびＺｎ++を欠くか、または該イオンの低い利用能をもつ培地において増殖する酵母菌株、特にサッカロミセス菌株によって得られる。好ましくは、培地は、Ｍｇ++５ｍＭ未満および／またはＺｎ++０．０２ｍＭ未満を含有するであろう。
【００６９】
本発明は、乳酸の生産において次の利点を提供する：１． 発酵が、ｐＨ４．５以下で実施される場合、慣用の方法と比較して、外来の微生物による汚染の危険性が低い。さらに、発酵設備は単純化でき、そして発酵制御が容易に行うことができる。
２． より少ない中和剤が、中和のために培地中に添加されるので、対応して、乳酸塩を遊離乳酸へ転化するための鉱酸もしくは他の再生薬剤を使用する必要性が低い。したがって、生産コストが低減できる。
３． より少ない中和剤が培地に添加されるので、培養液の粘度が低下される。その結果、培養液は処理が容易である。
４． 本発明により分離された細胞は、新鮮な乳酸発酵のための種菌微生物として再び利用できる。
５． 細胞は、本発明にしたがって、乳酸発酵中に連続的に分離され、そして回収することができ、それ故、発酵が連続的に実施できる。
６． 組み換え酵母菌株は、エタノール生産能とピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を欠くか、または両低いエタノール生産と低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性をもつので、乳酸の生産は、野生型のエタノール生産能と野生型のミトコンドリアによるピルビン酸利用能の両方をもつ酵母菌株に比較して、より高い収率で実施することができる。
７． クルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種に属する代謝的に工作された非慣用酵母による乳酸の生産は、非慣用炭素源（すなわち、若干の例を示せば、ガラクトース−ラクトース−スクロース−ラフィノース−マルトース−セロビオース−アラビノース−キシロース）から、高糖濃度培地中で細胞を増殖させ、そして高濃度の乳酸の存在下で細胞を増殖させて得ることができる。
【００７０】
【発明の詳細な記述】
定義 次の定義は、本発明の詳細な記述を理解する際、当業者を助けるために提供される。
【００７１】
「増幅」は、所望の核酸分子のコピー数を増加することを指す。
【００７２】
「コドン」は、特定のアミノ酸配列を指定する３個のヌクレオチド配列を指す。
【００７３】
「欠失」は、核酸配列から１個以上のヌクレオチドを除去する変異を指す。
【００７４】
「ＤＮＡリガーゼ」は、２つの二本鎖ＤＮＡ片を共有結合する酵素を指す。
【００７５】
「エレクトロポレーション」は、宿主細胞を透過性にするよう短時間高電圧のｄｃ電荷を使用して、そこに染色体外ＤＮＡを取り込ませる、細胞中に外来ＤＮＡを導入する方法を指す。
【００７６】
用語「内因性」は、生物体もしくは細胞内から生じる物質を指す。
【００７７】
用語「エンドヌクレアーゼ」は、内部の位置において二本鎖ＤＮＡを加水分解する酵素を指す。
【００７８】
用語「発現」は、対応するｍＲＮＡを生産するための遺伝子の転写、および対応する遺伝子産物、すなわちペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を生産するためのこのｍＲＮＡの翻訳を指す。
【００７９】
用語「アンチセンスＲＮＡの発現」は、遺伝子産物、例えばタンパク質をコードしている第２のＲＮＡ分子にハイブリダイズできる第１のＲＮＡ分子を生産するためのＤＮＡの転写を指す。ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形成は、遺伝子産物を生産する第２のＲＮＡ分子の翻訳を阻害する。
【００８０】
句「機能的に結合された」は、コーディングもしくは構造配列の転写が、プロモーターもしくはプロモーター領域によって命令できるような方向および距離における、プロモーターもしくはプロモーター領域およびコーディングもしくは構造配列を指す。
【００８１】
用語「遺伝子」は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくはＲＮＡ分子をコードしている他のＤＮＡ、ならびに発現の制御に関与するコーディング配列に隣接している領域を指す。
【００８２】
用語「ゲノム」は、宿主細胞内の染色体およびプラスミドの両方を包含する。したがって、宿主細胞中に導入された本発明のコーディングＤＮＡは、染色体に組み込まれていても、またプラスミドに局在されていてもよい。
【００８３】
「異種ＤＮＡ」は、受容細胞のＤＮＡとは異なる起源からのＤＮＡを指す。
【００８４】
「相同ＤＮＡ」は、受容細胞のＤＮＡと同じ起源からのＤＮＡを指す。
【００８５】
「ハイブリダイゼーション」は、塩基対を介して相補的な鎖と結合する核酸鎖の機能を指す。ハイブリダイゼーションは、２本の核酸鎖における相補的配列が互いに結合する場合に起きる。
【００８６】
「乳酸デヒドロゲナーゼ」（ＬＤＨ）は、ピルビン酸およびＮＡＤＨの、乳酸およびＮＡＤ+への転化を触媒するタンパク質を指す。Ｌ（＋）−ＬＤＨは、Ｌ（＋）−乳酸を生成し；Ｄ（−）−ＬＤＨは、Ｄ（−）−乳酸を生成する。
【００８７】
用語「乳酸輸送体」は、細胞の内側から外側への乳酸の輸送を可能にするタンパク質を指す。
【００８８】
「変異」は、核酸配列におけるすべての変化もしくは変更を指す。ある種のタイプは、ポイント、フレームシフトおよびスプライシングを含んで存在する。変更は、特異的に（例えば部位特異的変異誘発）もしくはランダムに（例えば化学薬剤により、修復マイナス細菌株を通過して）遂行されてもよい。
【００８９】
核酸コード：Ａ＝アデノシン；Ｃ＝シトシン；Ｇ＝グアノシン；Ｔ＝チミジン；Ｎ＝等モルのＡ，Ｃ，ＧおよびＴ；Ｉ＝デオキシイノシン；Ｋ＝等モルのＧおよびＴ；Ｒ＝等モルのＡおよびＧ；Ｓ＝等モルのＣおよびＧ；Ｗ＝等モルのＡおよびＴ；Ｙ＝等モルのＣおよびＴ．
「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」は、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードしているＤＮＡもしくはＲＮＡの領域を指す。
【００９０】
「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」（ＰＤＣ）は、ピルビン酸のアセトアルデヒドへの転化を触媒するタンパク質を指す。
【００９１】
「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ」（ＰＤＨ）は、ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの転化を触媒するタンパク質複合体を指す。
【００９２】
「プラスミド」は、環状の、染色体外の、自己複製するＤＮＡ片を指す。
【００９３】
「点変異」は、核酸配列において単一ヌクレオチドの変更を指す。
【００９４】
「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」は、１つの核酸配列の多数のコピーを作成するための酵素的技術を指す。ＤＮＡ配列のコピーは、２つのアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）間でＤＮＡポリメラーゼを往復させることによって製造される。この増幅法の基礎は、変性し、次にアンプリマーを再アニールし、続いて伸長して、側面を接するアンプリマー間に位置する領域に新しいＤＮＡ鎖を合成するための多周期の温度変化である。
【００９５】
用語「プロモーター」もしくは「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼに対する認識部位を提供することによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生産を調節する要素および／または正しい部位における転写の開始に必須な他の因子を指す。
【００９６】
「組み換え細胞」もしくは「形質転換細胞」は、そのＤＮＡが、外因性核酸分子のその細胞への導入によって変えられた細胞を指す。
【００９７】
用語「組み換えＤＮＡ構築物」は、１種以上のＤＮＡ配列が機能的作動方式において結合されたＤＮＡ分子を含む、ゲノム組み込みもしくは自律複製できる、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律的に複製する配列、ファージ、または直鎖状もしくは環状一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチド配列を指す。そのような組み換えＤＮＡ構築物もしくはベクターは、ＤＮＡ配列が、翻訳され、したがって発現される機能的ｍＲＮＡに転写されるような様式で、細胞中に、５’調節配列もしくはプロモーター領域および選択される遺伝子産物のためのＤＮＡ配列を導入できる。組み換えＤＮＡ構築物もしくは組み換えベクターは、あるいはまた、興味ある特定のＲＮＡの翻訳を阻害するために、アンチセンスＲＮＡを発現できるように構築されてもよい。
【００９８】
「低い（酵素）活性」は、同種の野生型菌株から単離される測定酵素活性に較べて、形質転換もしくは変異菌株から単離されるより低い測定酵素活性を指す。低い酵素活性は、低い酵素濃度、酵素の低い比活性もしくはそれらの組み合わせの結果であろう。
【００９９】
「修復マイナス」もしくは「修復欠失」菌株は、低いか、または除去されたＤＮＡ修復経路をもつ生物体を指す。そのような菌株は、同種の野生型菌株の率に較べて、増大される変異率を現す。修復マイナス菌株を通しての核酸配列の伝播は、核酸配列を通したランダム変異の導入をもたらす。
【０１００】
「制限酵素」は、二本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチドの特定のパリンドローム配列を認識し、そして両鎖を切断する酵素を指す；また、制限エンドヌクレアーゼと呼ばれる。切断は、典型的には、制限部位内で起きる。
【０１０１】
「選択性マーカー」は、その発現が、核酸配列を含有する細胞の同定を容易にする表現型を与える核酸配列を指す。選択性マーカーは、毒性化学物質に対する耐性（例えばアンピシリン耐性、カナマイシン耐性）を示すか、栄養欠乏（例えばウラシル、ヒスチジン、ロイシン）を補足するか、または肉眼的に区別しうる特徴（例えば色彩変化、蛍光）を与えるものを含む。
【０１０２】
「転写」は、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡコピー生産する方法を指す。
【０１０３】
「形質転換」は、外因性核酸配列（例えばベクター、プラスミド、組み換え核酸分子）を、外因性核酸配列が染色体に組み込まれるか、または自律複製できる細胞中に導入する方法を指す。
【０１０４】
「翻訳」は、メッセンジャーＲＮＡからのタンパク質生産を指す。
【０１０５】
用語「収率」は、消費されたグルコース量（ｇｒ／ｌ）で除した生産された乳酸量（ｇｒ／ｌ）を指す。
【０１０６】
酵素の「単位」は、酵素活性を指し、そして１分間当たりの総細胞タンパク質１ｍｇ当たり変換された基質ミクロモル量を示す。
【０１０７】
「ベクター」は、核酸配列を宿主生物中に運搬するプラスミド、コスミド、バクテリオファージもしくはウイルスを指す。
【０１０８】
ウシ乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＬＤＨ−Ａ）の部位特異的変異誘発 ウシ酵素ＬＤＨ−Ａ（ＥＣ１．１．１．２７）のコーディング配列を完全な長さのｃＤＮＡから単離するために、古典的な部位特異的変異誘発（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１，１９７８，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９，１９８７）が遂行された。オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発は、合成オリゴヌクレオチドと一本鎖ＤＮＡ断片とのイン・ビトロのハイブリダイゼーションに基づき、このオリゴヌクレオチドは、変異誘発されるべきＤＮＡ配列と一致する、中心のミスマッチ領域を除くＤＮＡ断片と相補的である。
【０１０９】
ＡＴＧコドン１１ｂｐ前にＸｂａＩ制限酵素部位を導入するために、１７４３ｂｐウシＬＤＨｃＤＮＡが、プラスミドｐＬＤＨ１２（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，９１ ２８１−２８５，１９９１）から、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）による消化によってクローン化された。単離されたＤＮＡ断片は、次いで、ｐＡＬＴＥＲ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ＃９６２１０；ｌｏｔ＃４８６４５，１９９６）発現ベクターに挿入された。
【０１１０】
そのようなベクターは、Ｍ１３およびＲ４０８バクテリオファージ複製開始点および抗生物質耐性の２つの遺伝子を含有する。これらの遺伝子の１つ、テトラサイクリン耐性は機能性である。他（すなわちアンピシリン耐性）は、不活性化されていた。変異誘発反応の間に、変異鎖に対してアンピシリン耐性を回復するオリゴヌクレオチドが提供される（ｏｌｉｇｏＡＭＰ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ Ｔａｂ．１）。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鋳型にアニーリングされる。同時に、変異原性オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏＬＤＨ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）は、同様にアニーリングされた。ＤＮＡ合成および連結反応に続いて、ＤＮＡが、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の修復マイナス菌株（ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ；ｋｉｔ Ｐｒｏｍｅｇａ）中に形質転換される。選択は、ＬＢ＋アンピシリンにおいて行われた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。ＪＭ１０９（ｋｉｔ Ｐｒｏｍｅｇａ）Ｅ．コリ菌株における形質転換の第２ラウンドが、変異および野生型プラスミドの適当な分離を確実にした。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
表１： 部位特異的変異誘発のために使用された合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。ｏｌｉｇｏＬＤＨにおける下線の配列は、変異誘発によって導入されたＸｂａＩ制限部位を示す。
【０１１３】
使用された技術および材料（ｏｌｉｇｏＬＤＨ以外の）のさらなる詳細は、キットのデータシートにおいて見い出すことができる。
【０１１４】
ウシＬＤＨについて変異されたｃＤＮＡを含有する、得られたプラスミドは、ｐＶＣ１と命名された（図２）。
【０１１５】
ラクトバチルス・カゼイ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｙｌｕｓ）からの細菌乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＬＤＨ）のＰＣＲ変異誘発 ラクトバチルス・カゼイＬＤＨ遺伝子（ＧＴＧ）の元の開始（ｓｔａｒｔｉｎｇ）コドン（ＧＴＧ）（ＬＤＨ配列は，ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅｎｂａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＭ７６７０８において利用できる −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）は、Ｓ．セレビシエによって正しく認識されない。本発明者らは、プラスミドｐＳＴ２およびＬＤＨ配列を、Ｈｕｔｋｉｎｓ Ｒｏｂｅｒｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｂｒａｓｋａ，ＵＳＡ）から得た。ｐＳＴ２は、ｐＵＣ１９ベクター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．８８５８２７）に基づいており、そしてＬ．カゼイ６８６（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｂｒａｓｋａ）から増幅されたＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ ＬＤＨ−ｃＤＮＡ断片を含有する。
【０１１６】
普通の真核生物の最初のコドン（すなわち、ＡＴＧ）により開始するコーディング配列を得るために、ＬＤＨ配列が、ＰＣＲを介して変異誘発された。
【０１１７】
ＬＤＨ配列（ＧｅｎＢＡｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＭ７６７０８、前出）の位置１６３におけるＮｃｏＩ制限酵素部位の導入は、元のＧＴＧコドンのＡＴＧへの付随変化を与える。ＰＣＲ反応（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ５３３０，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、ｐＧＥＭ７Ｚ ｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ，ＵＳＡ，ｃａｔ．Ｐ２２５１）ベクターに基づくプラスミドｐＬＣ１から出発して遂行し、そしてＬ．カゼイの遺伝子（ｐＳＴ２から切り取られた断片ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ）を含有する。反応のプライマーとして使用されたオリゴヌクレオチドの配列は表２に報告される。
増幅サイクル：９４°；１’ （変性段階）
９４°３０” （変性段階）
５６°３０” ４回 （プライマーアニーリング段階）
６８°３’ （伸長段階）
９４°３０” （変性段階）
６０°３０” ２３回 （プライマーアニーリング段階）
６８°３’ （伸長段階）
６８°３’ （最終伸長段階）
反応の最後に、増幅され、そして変異された遺伝子に対応する単一バンドが単離された。次いで、ＤＮＡ断片は、平滑末端連結によりｐＭＯＳＢｌｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ；ｃｏｄ．ＲＰＮ５１１０）クローニングベクターのＥｃｏＲＶ部位において挿入され、ｐＬＣ３プラスミドが生じた。
【０１１８】
すべての他の変異誘発法が、同様に使用できる。
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
表２： ＰＣＲ増幅のために使用された合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。ｏｌｉｇｏＡＴＧにおける下線の配列は、変異誘発によって導入されたＮｃｏＩ制限部位、および結果として得られたＡＴＧ開始コドンを示す。
【０１２１】
また、本発明者らは、古典的なＰＣＲアプローチにしたがって、細菌バチルス・メガテリウムおよびバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１３９１）（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１１６７）からのＬ（＋）ＬＤＨ遺伝子（ＤＮＡ配列は，また、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅｎｂａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＭ２２３０５およびＭ１９３９６において利用できる −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を、酵母Ｓ．セレビシエのための発現ベクター（すなわち、それぞれｐＢＭＥ２およびｐＢＳＴ２、下記参照）中にクローン化した。
【０１２２】
ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびウシＬＤＨｃＤＮＡを含有するｐＥＰＬ２複製ベクターの構築 ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびコーディング配列は、Ｋ．ラクチスのｒａｇ６変異を相補するＫ．ラクチス・ゲノムライブラリークローン（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９：２７−３６，１９９６）から４ＫｂｐＨｉｎｄＩＩＩ断片としてサブクローン化された。プロモーター領域が、ベクターｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａ＃２１２２０５）のＳａｌＩおよびＸｂａＩ部位中に、分子クローニング標準操作（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，前出）を用いるＴ４ ＤＮＡリガーゼによりサブクローン化された。ｐＶＣ１ベクターから１６７５ｂｐをもつＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として単離されたウシＬＤＨ配列は、ベクターｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳの対応するクローニング部位においてクローン化された。ＧＭ８２ Ｅ．コリ菌株（ｄａｍ- ｄｃｍ-）（ＡＴＣＣもしくはＣＧＳＣコレクションから得られる）は、それぞれｐＫＳＭＤ８／７およびｐＫＳＥＸＨ／１６（図３Ａおよび３Ｂ）と呼ばれる２種の新ベクターにより形質転換された。
【０１２３】
それぞれｐＫＳＭＤ８／７およびｐＫＳＥＸＨ／１６からＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片として単離された、ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびウシＬＤＨ配列は、ＳａｌＩエンドヌクレアーゼの存在下、室温で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによりイン・ビトロで連結されて、ＸｂａＩ末端において連結された。連結反応産物は、ｐＥ１ベクター（Ｂｉａｎｃｈｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１８５−１９２，１９８７；Ｃｈｅｎ Ｘ． Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：９５−９８，１９８９およびＵＳ＃５１６６０７０）のＳａｌＩクローニング部位においてクローン化された。このプラスミドは、サッカロミセス・セレビシエ遺伝マーカーＵＲＡ３を含有するＹＩｐ５組み込みプラスミド、およびクルイベロミセス・ドロソフィラルムから単離されたｐＫＤ１プラスミド（ＵＳ＃５１６６０７０）に基づいている。プラスミドｐＥ１は、Ｓ．セレビシエ２μ ＤＮＡに類似する機能的構成をもち、そしてクルイベロミセス・ラクチス細胞（Ｃｈｅｎ Ｘ． Ｊ．ｅｔ ａｌ．，前出）において安定な進行で複製することができる。プラスミド上のＵＲＡ３マーカーは、Ｋ．ラクチスｕｒａＡ１−１変異を相補（ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７−７４２（１９８２））させ、したがって、ウラシルを含まない選択培地における形質転換細胞の増殖を可能にする。
【０１２４】
得られたベクターは、ｐＥＰＬ２（図４）と呼ばれ、そしてＥ．コリＤＨ５−ａｌｆａ菌株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＡ）を形質転換するために使用された。
【０１２５】
ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよび細菌ＬＤＨ遺伝子を含有するｐＥＰＬ４複製ベクターの構築 ｐＥＰＬ２プラスミドに関して記述されたウシＬＤＨ遺伝子が、本文を通して記述された古典的分子アプローチにしたがって、細菌ラクトバチルス・カゼイ遺伝子（前記参照）からのＬＤＨ ＤＮＡ配列と置き換えられて、プラスミドｐＥＰＬ４を得た。ウシもしくは細菌ＬＤＨを担持する形質転換Ｋ．ラクチス酵母細胞は、類似の結果を与えた。
【０１２６】
ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびウシＬＤＨｃＤＮＡを含有するｐＬＡＺ１０複製ベクターの構築 ベクターｐＬＡＺ１０は、ＫｌＰＤＣ１プロモーターとウシＬＤＨコーディング配列を担持するｐＥＰＬ２のＳａｌＩ断片を、ベクターｐ３Ｋ３１のユニークＳａｌＩ部位中にクローニングすることによって得られた。ベクターｐ３Ｋ３１は、市販ベクターｐＵＣ１９およびプラスミドｐＫＤ１のユニークＳｐｈＩ部位に挿入されたベクターｐＫａｎ７０７（Ｆｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９６８−９７４，１９９１）のＧ４１８耐性カセットからなる。
【０１２７】
ｐＬＣ５，ｐＬＣ７，ｐＢ１，ｐＢＭ２，ｐＢＳＴ２，ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸおよびｐＪＥＮ１組み込みベクターの構築 Ｌ．カゼイＬＤＨ遺伝子は、ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ消化によってｐＬＣ３（前記）から切り取られ、そしてｐＹＸ０１２もしくはｐＹＸ０２２組み込みベクター（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中に連結された。
【０１２８】
ＴＰＩプロモーターの制御下の細菌ＬＤＨ遺伝子について変異されたＤＮＡを含有し、そして栄養素要求性マーカーＵＲＡ３もしくはＨＩＳ３を担持する、得られた２種のプラスミドは、ｐＬＣ５（図５）およびｐＬＣ７とそれぞれ命名された。ｐＢ１、ｐＢＭ２およびｐＢＳＴ２の構築では、本発明者らは、ｐＬＣ５の構築について記述されたものと類似のアプローチを使用した；しかしながら、ウシＬＤＨ、Ｂ．メガテリウムＬＤＨおよびＢ．ステアロサーモフィルスＬＤＨ（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１３９１）（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１１６７）をそれぞれ使用した。最後に、プラスミドｐＦＡ６ａ−ＫａｎＭＸ（Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１９９４，１０：１７９３−１８０８）が、ＳａｃＩとＳｍａＩにより消化され、そして生じる断片が、同じ酵素で切断されたｐＬＣ５中に連結されて、プラスミドｐＬＣ５−ＫａｎＭＸを生成した。このプラスミドでは、ＬＤＨ遺伝子は、ＴＰＩプロモーターの制御下にある。
【０１２９】
Ｓ．セレビシエの乳酸輸送体をコードしているＪＥＮ１（Ｄａｖｉｓ Ｅ．Ｓ．，Ｔｈｅｓｉｓ，１９９４−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｄａｖｉｓ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（２３），１１１６９，１９９２）（Ａｎｄｒｅ，Ｂ．Ｙｅａｓｔ（１１），１５７５，１９９５）のＤＮＡ配列（ＤＮＡ配列は，また、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅｎｂａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＵ２４１５５において利用できる −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）は、Ｅ．Ｓ．Ｄａｖｉｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）から得られた。ＪＥＮ１コーディング配列は、本文を通して記述された古典的ＰＣＲアプローチによって増幅され、そしてプラスミドｐＹＸ０２２（前記）中にクローン化された。組み込みプラスミドでは、ＪＥＮ１過剰発現は、ＴＰＩプロモーターの制御下にある。
【０１３０】
ＡＤＨ１プロモーターおよびウシＬＤＨｃＤＮＡを含有するｐＬＡＴ−ＡＤＨ複製ベクターの構築 第１に、ｐＬＤＨ−Ｋａｎプラスミドが、ｐＦＡ６−ＫａｎＭＸ４ベクター（Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ １０：１７９３−１８０８（１９９４））のＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ消化から誘導されたゲネチシン（Ｇ４１８）耐性を付与するＡＰＴ１遺伝子を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ，ＵＳＡ，ｃａｔ．２１２２０８）クローニングベクターのＥｃｏＲＶ部位にクローニングして構築された。
【０１３１】
第２に、ウシＬＤＨ遺伝子のコーディング領域が、前述のｐＶＣ１プラスミドからのＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＶＴ１０２−Ｕベクター（Ｖｅｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５２：２２５−２３３（１９８７））中にサブクローニングすることによって、Ｓ．セレビシエのＡＤＨ１プロモーターとターミネーター配列の制御下でクローン化された。
【０１３２】
最後に、全発現カセット（ＡＤＨ１プロモーター−ＬＤＨ遺伝子−ＡＤＨ１ターミネーター）が、ＳｐｈＩ消化によって切り取られ、ｐＬＤＨ−Ｋａｎと連結され、ＳｐｈＩで直鎖状にされて、ｐＬＡＴ−ＡＤＨベクター（図６）を得た。
【０１３３】
Ｋ．ラクチスＰＭＩ／Ｃ１菌株の単離 ＰＭ６−７Ａ酵母菌株（ＭＡＴ ａ，ａｄｅＴ−６００，ｕｒａＡ１−１）（Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ １９９２，８：７１１）におけるＫｌＰＤＣＡ遺伝子の欠失が、菌株ＰＭＩを生じた。欠失は、Ｓ．セレビシエのＵＲＡ３マーカーの挿入によって実施された。菌株ＰＭＩは、グルコース含有培地で増殖する；ＰＤＣ活性は検出されず、そして菌株はエタノールを生産しない（Ｂｉａｎｃｈｉ Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）、前出）。いかなる検出しうるＰＤＣ活性ももたないＳ．セレビシエ細胞は、グルコース無機質培地では増殖しない（Ｆｌｉｋｗｅｅｒｔ Ｍ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｙｅａｓｔ，１２：２４７−２５７，１９９６）ということを強調することが重要である。
【０１３４】
ＰＭＩ酵母細胞の定常期の培養からの１ｘ１０7〜３ｘ１０7細胞が、５−フルオロオロチン酸を含有する合成培地上に平板塗布された。５−フルオロオロチン酸含有培地における酵母細胞の増殖は、ウラシル合成において損傷された細胞の選択を可能にする（ＭｃＣｕｓｋｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｙｅａｓｔ ７：６０７−６０８（１９９１））。２８℃で５日培養後、数株のｕｒａ−変異株が単離された。得られたこれらの変異株の１株は、ＰＭＩ／Ｃ１と呼ばれ、組み込み形質転換によって予め導入されたＵＲＡ３遺伝子における変異を生じたが、それは、ＵＲＡ３遺伝子を含有するプラスミド（Ｋｅｐ６ベクター；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２１１−２２０（１９８８））を用いる形質転換による相補試験から証明された。ＰＭＩ／Ｃ１の遺伝子型は、次のとおりである：ＭＡＴａ，ａｄｅＴ−６００，ｕｒａＡ１−１，ｐｄｃＡ：：ｕｒａ３。
【０１３５】
ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２およびＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２菌株の単離 一般的戦略は、最初に、各ＰＤＣ遺伝子（ＰＤＣ１、ＰＤＣ２、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６）の単一欠失変異株を作成することであった。遺伝子欠失は、Ｗａｃｈら（１９９４；Ｙｅａｓｔ １０、１７９３−１８０８）およびＧｕｅｌｄｅｎｅｒら（１９９６；Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，２５１９−２５２４）によって記述されたショートフランキングホモロジー（ＳＦＨ）ＰＣＲ法を用いて、対応するＰＤＣ遺伝子の座における相同性組み換えによりｌｏｘＰ−ＫａｎSRD−ｌｏｘＰカセットの組み込みによって行われた。続いて、欠失カセットは、欠失座におけるｌｏｘＰ部位の単一コピーをリーディング ビハインド（ｌｅａｄｉｎｇ ｂｅｈｉｎｄ）するｃｒｅ−リコンビナーゼを発現することによって除かれた。ｐｄｃ１ ｐｄｃ５ ｐｄｃ６三重欠失変異株は、続いて、単一の一倍体欠失株を交雑することによって作成された。
【０１３６】
ＰＣＲ反応は、ある種のシュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子（機密）の調節配列（プロモーター／ターミネーター）に融合されたカナマイシン耐性（Ｅ．コリ トランスポゾンＴｎ９０３のオープンリーディングフレーム）の遺伝子を含有するＤＮＡ鋳型において実施された。この選択カセットは、ｌｏｘＰ配列（ｌｏｘＰ−ＫａｎSRD−ｌｏｘＰ）によって両端において隣接されており、ＳＲＤ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）によって開発された。ｌｏｘＰ−ＫａｎSRD−ｌｏｘＰカセットを増幅するために使用されるプライマーは、センスプライマーのＤＮＡ配列が、選択カセット配列の５’末端と相同であるように、そしてプライマーが、ある種のサッカロミセス・セレビシエＰＤＣ遺伝子の５’末端配列に対応する、その５’末端領域４０ヌクレオチドにおける付加において存在するように、設計される。アンチセンスプライマーは、類似の方法で構築され、それは、選択カセットの３’末端と相補的であり、この場合、このプライマーは、ある種のサッカロミセス・セレビシエＰＤＣ遺伝子の３’末端配列に対応する、また好ましくは４０ヌクレオチドをその５’末端領域において含有する。
【０１３７】
次の表は、ＳＦＨ ＰＣＲ法による対応するＰＤＣ遺伝子の遺伝子欠失のために使用されるプライマーを示す。下線の配列は、対応するＰＤＣ遺伝子と相同性であり、そしてｌｏｘＰ−ＫａｎSRD−ｌｏｘＰカセットに相補的な配列は、太字で存在する。
【０１３８】
【表３】
【０１３９】
ＰＣＲ増幅された欠失カセットは、ＳＲＤによって開発された原栄養性二倍体サッカロミセス・セレビシエ菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１２の形質転換のために使用された。
【０１４０】
ＣＥＮ．ＰＫ１１２（Ｍａｔａ，ａｌｐｈａ，ＵＲＡ３，ＵＲＡ３，ＨＩＳ３，ＨＩＳ３，ＬＥＵ２，ＬＥＵ２，ＴＲＰ１，ＴＲＰ１，ＭＡＬ２−８C，ＭＡＬ２−８C，ＳＵＣ２，ＳＵＣ２）
形質転換株の選択のために、ゲネチシン（硫酸Ｇ−４１８，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が、最終濃度２００ｍｇ／ｌにおいて添加された。四分子分析後、続いて、Ｇ４１８耐性胞子が、診断的ＰＣＲによって解析されて、対応するＰＤＣ遺伝子の正しい欠失を確認し、そして一倍体菌株の交配型を決定した。
【０１４１】
３個のＰＤＣ遺伝子、ＰＤＣ１，ＰＤＣ５おいてＰＤＣ６について欠失された菌株を得るために、一倍体欠失株が、続いて交雑された。２個の二重欠失株、ｐｄｃ１：：ＫａｎSRD ｐｄｃ６：：ＫａｎSRDおよびｐｄｃ５：：ＫａｎSRD ｐｄｃ６：：ＫａｎSRDを得るために、対応する一倍体株が交雑された。四分子分析後、ＫａｎSRDマーカーに関して非親系二型（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔａｌ ｄｉｔｙｐｅ）を示す胞子が、続いて、診断的ＰＣＲによって解析されて、両遺伝子の正しい欠失を確認し、そして交配型を決定した。得られる二重欠失株が交雑されて、三重欠失株を得た。四分子分析後、診断的ＰＣＲによって、３個のＰＤＣ遺伝子について欠失された胞子が探された。
【０１４２】
破壊に成功した遺伝子からＫａｎSRDマーカーを除去するために、一倍体欠失株（単一、二重および三重変異株）が、ｃｒｅ−リコンビナーゼ・プラスミド、ｐＰＫ−ＩＬＶ２SMR（ＳＲＤによって開発された）により形質転換された。プラスミドｐＰＫ−ＩＬＶ２SMRは、ＧＡＬ１プロモーター制御下のｃｒｅ−リコンビナーゼ、および優性選択マーカーとして、プラスミドプラスミドｐＰＫ−ＩＬＶ２SMRにより形質転換された酵母細胞をスルホメツロンメチル（３０ｍｇ／ｌ）の存在下で増殖可能にさせるＩＬＶ２耐性遺伝子を含有する。続いて、ＫａｎSRDマーカーの正確な切除が、全酵母細胞に関して診断的ＰＣＲによって解析された。プラスミドｐＰＫ−ＩＬＶ２SMRを除去するために、酵母細胞は、培地中スルホメツロンメチルなしで適当な時間培養され、続いて、スルホメツロンメチル感受性細胞が探索された。
【０１４３】
次の表は、得られた酵母菌株を示す。括弧内の数字は、対応する遺伝子の欠失ヌクレオチド（ＡＴＧ＝１）を指す。ネガティブ数字の場合は、最初の数字は、ＡＴＧの上流の欠失ヌクレオチドを意味し、そして第２の数字は、終始コドンの下流の欠失ヌクレオチドを意味する。
【０１４４】
【表４】
【０１４５】
主として、本発明者らは、得られたデータを総括している表において、またＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６と名付けられる菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１２およびＣＥＮ．ＰＫ１８２を使用した。
【０１４６】
同様のアプローチを使用して、ＰＤＣ２遺伝子に欠失を担持しているＳ．セレビシエＧＲＦ１８Ｕ株（Ｍａｔ ａｌｐｈａ，ｈｉｓ３，ｌｅｕ２，ｕｒａ３）が構築された（ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２；Ｍａｔ ａｌｐｈａ，ｈｉｓ３，ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｐｄｃ２：：ＡＰＴ１）。本発明者らは、プラスミドｐＦＡ６ａ−ＫａｎＭＸ（Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．前出）から単離された、組み込みのマーカーとしてのＧ４１８耐性を付与するＡＰＴ１遺伝子を使用した；ＰＤＣ１，ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子において欠失を担持している菌株では、ＰＤＣ活性はゼロである。ＰＤＣ２遺伝子に欠失を担持している菌株では、ＰＤＣ活性は野生型菌株で測定されるレベルの約２０〜４０％である。
【０１４７】
Ｋ．ラクチスＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］の単離 二重欠失菌株Ｋｌｐｄｃ１△／Ｋｌｐｄａ１△は、菌株ＭＷ３４１−５／Ｋｌｐｄｃ１△（ＭＡＴα，ｌａｃ４−８，ｌｅｕ２，ｌｙｓＡ１−１，ｕｒａＡ１−１，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９（１）、２７−３６において既述のように得られた；Ｄｅｓｔｒｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，提供）を、菌株ＣＢＳ２３５９／Ｋｌｐｄａ１△（ＭＡＴａ，ＵＲＡ３−４８，Ｋｌｐｄａ１：：Ｔｎ５ＢＬＥ）と交雑することによって得られた二倍体菌株の一倍体分離集団から選択された。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体Ｅ１−ａｌｐｈａサブユニット（ＥＣ．１．２．４．１）（ＤＮＡ配列は、Ｓｔｅｅｎｓｍａ Ｈ．Ｙ．；Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｕｓｉｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄによって得られた−ＤＮＡ配列は，また、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅｎｂａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＡＦ０２３９２０において利用できる −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）をコードしているＰＤＡ１遺伝子の欠失は、酵母菌株ＣＢＳ２３５９において、古典的ＰＣＲアプローチおよび本文を通じて記された酵母形質転換にしたがって得られた。本発明者らは、組み込みのマーカーとしてフレオマイシン耐性を付与するマーカーＴｎ５Ｂｌｅ（Ｇａｔｉｎｇｎｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，９１：３５，１９９０）を使用した。
【０１４８】
ＢＭ１−３Ｃ（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｋｌｐｄａ１：：Ｔｎ５ＢＬＥ）と呼ばれる二重欠失菌株は、フレオマイシン耐性／アンチマイシン感受性分離菌株として選択された。次いで、ベクターｐＬＡＺ１０が、遺伝的に、次のように二重欠失菌株に転移された。
【０１４９】
Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３菌株のｐＬＡＺ１０形質転換株ＰＭＩ／８（ＭＡＴａ，ａｄｅＴ−６００，ｕｒａＡ１−１，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９：２７−３６，１９９６）が、菌株ＭＷ１０９−８Ｃ（ＭＡＴα，ｌｙｓＡ１−１，ｔｒｐＡ１−１）と交雑された。得られる二倍体菌株の胞子形成後、菌株７Ｃ（ＭＡＴα，ａｄｅＴ−６００，ｌｙｓＡ１−１，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３，ｐＬＡＺ１０+）と呼ばれるゲネチシン耐性／アンチマイシン感受性菌株が選択された。
【０１５０】
菌株ＢＭ１−３Ｃおよび菌株７Ｃが交雑され、そして得られた二倍体菌株の胞子形成後、フレオマイシン耐性／ゲネチシン耐性の一倍体分離菌株が選択された。すべての一倍体分離株はアンチマイシン感受性であった。原栄養株ＢＭ３−１２Ｄ（Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｋｌｐｄａ１：：Ｔｎ５ＢＬＥ、ｐＬＡＺ１０+）が、さらなる実験のために選ばれた。
【０１５１】
ベクターｐＥＰＬ２およびｐＥＰＬ４を用いるクルイベロミセス酵母ＰＭ６−７ＡおよびＰＭＩ／Ｃ１の形質転換 ＰＭ６−７ＡおよびＰＭＩ／Ｃ１細胞が、ＹＰＤ培地において濃度０．５ｘ１０8細胞／ｍｌまで増殖され、収穫され、水中で１回、１Ｍソルビトール中で２回洗浄され、そして１Ｍソルビトール中濃度２ｘ１０9細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞は、ｐＥＰＬ２もしくはｐＥＰＬ４５〜１０μｇの存在下でエレクトロポレーション（７．５ＫＶ／ｃｍ，２５μＦ，２００Ω：ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ）された。ＵＲＡ+形質転換株の選択は、ウラシルを含まない合成固形培地（０．７％ｗ／ｖ酵母窒素源、２ｗ／ｖ％グルコース、２００ｍｇ／ｌアデニン、２ｗ／ｖ％寒天）において実施された。
【０１５２】
ベクターｐＬＡＴ−ＡＤＨを用いるトルラスポラ酵母の形質転換 ＣＢＳ８１７細胞が、ＹＰＤ培地において濃度６ｘ１０7細胞／ｍｌまで増殖され、収穫され、水中で１回、１Ｍソルビトール中で２回洗浄され、そして１Ｍソルビトール中濃度２ｘ１０9細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞は、ｐＬＡＴ−ＡＤＨ １μｇの存在下でエレクトロポレーション（１．５ｋＶ，７．５ＫＶ／ｃｍ，２５μＦ，２００Ω：ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ）された。
【０１５３】
細胞は、ＹＥＰＤ ５ｍｌ、ソルビトール１Ｍを含有する滅菌微生物用チューブにおいて一夜増殖された。Ｇ４１８r形質転換株の選択は、固形培地（２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％ペプトン、１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％寒天，２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ｃａｔ．１１８１１−０３１））において実施された。
【０１５４】
ベクターｐＬＡＴ−ＡＤＨを用いるチゴサッカロミセス酵母の形質転換 ＡＴＴＣ３６９４７およびＡＴＴＣ６０４８３細胞が、ＹＰＤ培地において濃度２ｘ１０8細胞／ｍｌまで増殖され、収穫され、そして０．１Ｍ酢酸リチウム、１０ｍＭジチオトレイトール、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７，５中濃度４ｘ１０8細胞／ｍｌにおいて、室温で１時間再懸濁された。細胞は、水中で１回、１Ｍソルビトール中で２回洗浄され、そして１Ｍソルビトール中濃度５ｘ１０9細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞は、ｐＬＡＴ−ＡＤＨ ３μｇの存在下でエレクトロポレーション（１．５ｋＶ，７．５ＫＶ／ｃｍ，２５μＦ，２００Ω：ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ）された。
【０１５５】
細胞は、ＹＥＰＤ ５ｍｌ、ソルビトール１Ｍを含有する滅菌微生物用チューブにおいて一夜増殖された。Ｇ４１８r形質転換株の選択は、固形培地（２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％ペプトン、１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％寒天，２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ｃａｔ．１１８１１−０３１））において実施された。
【０１５６】
ベクターｐＬＣ５，ｐＬＣ７，ｐＢ１，ｐＢＳＴ２，ｐＢＭＥ２，ｐＬＡＴ−ＡＤＨ，ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸおよびｐＪＥＮ１を用いるサッカロミセス酵母細胞の形質転換 ＧＲＦ１８Ｕ（前記）、ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２（前記）、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］（Ｍａｔ ａｌｐｈａ，ｈｉｓ３，ｌｅｕ２，ｕｒａ３：：ＴＰＩ−ＬＤＨ）、ＣＥＮＰＫ１１３（Ｍａｔ ａ；ＣＢＳ８３４０）、ＣＥＮＰＫ−１（Ｍａｔ ａ，ｕｒａ３）、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６（前記）およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２（前記）酵母細胞が、富栄養ＹＰＤ完全培地（２ｗ／ｖ％酵母エキス、１ｗ／ｖ％ペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース）において濃度２ｘ１０7細胞／ｍｌまで増殖され、０．１Ｍ酢酸リチウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中で１回洗浄され、そして０．１Ｍ酢酸リチウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中に濃度２ｘ１０9細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞懸濁液１００μｌは、ベクター（すなわち、ｐＬＣ５，ｐＬＣ７，ｐＢ１，ｐＢＳＴ２，ｐＢＭＥ２，ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ，ｐＪＥＮ１の場合には、栄養要求マーカーにおいて予め直鎖化された）５〜１０μｇと５分インキュベートされた。ＰＥＧ４０００ ２８０μｌの添加後、細胞は、３０℃で少なくとも４５分間インキュベートされた。ＤＭＳＯ４３μｌを添加し、そして懸濁液が４２℃で５分間インキュベートされた。細胞は、水で２回洗浄され、選択培地上に平板塗布された。ＣＥＮＰＫ−１菌株（ｕｒａ３）の単離のために、ＣＥＮＰＫ１１３細胞が、５−フルオロオロチン酸を含有する培地（上記参照）で増殖された。
【０１５７】
単一形質転換細胞は、０．７％ｗ／ｖ酵母窒素源、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％寒天，プラス指標として適当な補充物質もしくはＧ４１８においてスコアーされた。Ｇ４１８R形質転換株の選択では、また細胞は、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％ペプトン、１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％寒天，２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ｃａｔ．１１８１１−０３１）においてスコアーされた。
【０１５８】
形質転換株：補充物質ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］：ウラシル２００ｍｇ／ｌ、ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢ１］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ。ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＭＥ２］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＳＴ２］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＪＥＮ１］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ。
ＣＥＮＰＫ−１［ｐＬＣ５］：補充物質なしＣＥＮＰＫ１１３［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］：Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ。
ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］：Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ。
ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］：Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ。
【０１５９】
【表５】
【０１６０】
ＫＬ＝Ｋ．ラクチスのプロモーターＳＣ＝Ｓ．セレビシエのプロモーターＢ．Ｓｔｅ．＝バチルス・ステアロサーモフィルス ｐＪＥＮ１は、ＪＥＮ１遺伝子の発現のために使用された。
【０１６１】
バッチ試験 クルイベロミセスＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ２］、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］、ＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ４］およびＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ４］形質転換細胞のバッチ解析 上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、アデニン２００ｍｇ／ｌ、グルコース５０ｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された。使用された培地は、２００ｍＭリン酸バッファーによりｐＨ５．６に緩衝化されるか、されないか両方であった。
【０１６２】
細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的な時点でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された（図７および８、および表３）。
【０１６３】
クルイベロミセスＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］形質転換細胞のバッチ解析 上記操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース５０ｇ／ｌ、エタノール２０ｇｒ／ｌ、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された。使用された培地は、２００ｍＭリン酸バッファーによりｐＨ５．６に緩衝化された。
【０１６４】
細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された。最初、細胞はエタノールを使用し、次いで、非常に高い収率でグルコースを乳酸に変換した（＞０．７５；乳酸ｇ／消費グルコースｇ）（表３）。
【０１６５】
トルラスポラＣＢＳ８１７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換細胞のバッチ解析 上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース２０ｇ／ｌ、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された。使用された培地は、緩衝化されなかった。
【０１６６】
細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された。（図１０および表３）。
【０１６７】
チゴサッカロミセスＡＴＣＣ３６９４７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］およびＡＴＣＣ６０４８３［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換細胞のバッチ解析 上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース５０ｇ／ｌ、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された。使用された培地は、緩衝化されなかった。
【０１６８】
細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された（図１１および表３）。
【０１６９】
サッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢ１］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＭ２］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＳＴ２］、ＣＥＮＰＫ−１［ｐＬＣ５］形質転換細胞のバッチ解析 上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース５０ｇ／ｌおよび適当な補充物質（上記参照））における増殖のバッチ培養において試験された。使用された培地は、緩衝化されなかった。細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された（表３）。
【０１７０】
サッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５］、ＣＥＮＰＫ１１３［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］形質転換細胞のバッチ解析−回転フラスコ− 上記操作によって得られたクローンが、富栄養培地（１．０％ｗ／ｖ酵母エキス、２％ｗ／ｖペプトン、グルコース１００ｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された。培地は、緩衝化されなかった。
【０１７１】
細胞は、酵母エキス−ペプトン＋エタノール（５ｇ／ｌ）培地において前培養された。１００ｍｌが、回転フラスコ中に接種された（１．５ ｌ作業容量；始発ｐＨ＝５．７）。回転フラスコは３０℃で培養された、撹拌：５５ｒｐｍ。発酵が規則的間隔でモニターされた（表Ａ，Ｂ，Ｃおよび表３）。
【０１７２】
種々の形質転換株由来のＬＤＨ比活性は、５Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
【０１７３】
ＬＤＨ活性用量（ｄｏｓａｇｅ）
ウシＬＤＨ 約１０8細胞が回収され、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．
５中で洗浄され、そして同じバッファーに懸濁された。細胞は、ガラスの微小ビーズ（直径４００μｍ、ＳＩＧＭＡ，Ｇ−８７７２）の存在下の強い渦の５サイクルによって４℃において溶解された。細胞破片は、遠心（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｄ ５４１５ Ｃ，１３６００ ＲＣＦ，１０分）によって除去され、そしてタンパク質抽出液の濃度が、Ｍｙｃｒｏ Ａｓｓａｙ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ（ｃａｔ．５００−０００６）によって測定された。
【０１７４】
抽出液約０．２ｍｇが、ＳＩＧＭＡ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）キットＤＧ１３４０−ＵＶを使用して、製造者の指示にしたがってＬＤＨ活性を試験された。
【０１７５】
細菌ＬＤＨ 約１０8細胞が回収され、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．
５中で洗浄され、そして同じバッファーに懸濁された。細胞は、ガラスの微小ビーズ（直径４００μｍ、ＳＩＧＭＡ，Ｇ−８７７２）の存在下の強い渦の５サイクルによって４℃において溶菌された。細胞破片は、遠心（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｄ ５４１５ Ｃ，１３６００ ＲＣＦ，１０分）によって除去され、そしてタンパク質抽出液の濃度が、Ｍｙｃｒｏ Ａｓｓａｙ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ（ｃａｔ．５００−０００６）によって測定された。
【０１７６】
細胞抽出液は、１２．８ｍＭ ＮＡＤＨ０．０１ｍｌ、２ｍＭフルクトース１，６−二リン酸０．１ｍｌ、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ＝５．６）０．７４ｍｌ、適当に希釈された細胞抽出液０．０５ｍｌおよび１００ｍＭピルビン酸０．１ｍｌ：を用いて、ＬＤＨ活性を試験された。
【０１７７】
ＬＤＨ活性は、３４０ｎｍ、２５℃において、総細胞抽出液１ｍｇ当たりの、１分間に酸化されるＮＡＤＨミクロモル数としてアッセイされた。
【０１７８】
増殖培地における代謝物用量 遠心によって細胞を除去した後得られた、増殖培地からのサンプルが、グルコース、エタノール、Ｌ（＋）−およびＤ（−）−乳酸の存在に関して、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＤＥからのキット（それぞれ＃．７１６２５１，１７６２９０および１１１２８２１）を用い、製造者の指示にしたがって分析された。
【０１７９】
クルイベロミセスＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ２］およびＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］形質転換酵母に関する実験バッチ試験は、図７Ａ，７Ｂおよび図８Ａ，８Ｂにおいて示される。
【０１８０】
トルラスポラＣＢＳ８１７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換酵母に関する実験データは、図１０に示される。
【０１８１】
チゴサッカロミセスＡＴＣＣ６０４８３［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換酵母に関する実験データは、図１１に示される。
【０１８２】
回転フラスコ中で増殖するサッカロミセスＣＥＮＰＫ１１３［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］形質転換酵母に関する実験データは、表Ａ，Ｂ，Ｃにおいて示される。
【０１８３】
【表６】
【０１８４】
【表７】
【０１８５】
【表８】
【０１８６】
形質転換クルイベロミセス、トルラスポラ、チゴサッカロミセスおよびサッカロミセス酵母から得られたすべての結果は、表３において総括され、そして比較される。収率は、消費グルコース量（ｇｒ／ｌ）によって除された生産乳酸量（ｇｒ／ｌ）である。遊離乳酸パーセントは、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式：ｐＨ＝ｐＫa＋ｌｏｇ［（乳酸％）／（遊離乳酸％）］から得られ、この場合、乳酸のｐＫaは３．８６である。
【０１８７】
表３Ａと表３Ｂにおいて報告されたデータの比較により、異なる酵母の属において、グルコースにおいて、より高い収率をもつ乳酸生産は、ＬＤＨとＰＤＣ活性の相対比率−細胞レベルにおいて−を変化することによって得ることができることが、明らかに分かる。そのような結論は、次のような少なくとも２種の異なるアプローチ：（１）ＰＤＣ活性を低下させること（形質転換Ｋ．ラクチス宿主：ＰＭ６−７Ａ対ＰＭＩ／Ｃ１からのデータを比較する；形質転換Ｓ．セレビシエ宿主：ＧＲＦ１８Ｕ対ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２、そしてＣＥＮＰＫ１１３対ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６からのデータを比較する）、（２）ＬＤＨ遺伝子コピー数と、したがってＬＤＨ活性を増加すること（Ｓ．セレビシエ宿主：ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］対ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］からのデータを比較する；２つの菌株におけるＬＤＨ非相同の活性は、それぞれ５〜６および７〜８Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇ）、によって得ることができる。
【０１８８】
さらに、より高い収率は、増殖培地の組成を操作することによって得ることができる。また、この場合には、低いエタノール生産が観察された（また表４参照）。
【０１８９】
【表９】
【０１９０】
【表１０】
【０１９１】
【表１１】
【０１９２】
操作された無機質培地において増殖するサッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］に関する実験データ（表４） サッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］形質転換細胞による乳酸生産が、また、合成培地において細胞を増殖して実施された（Ｄ．Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐＨ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｂｕｄｄｉｎｇ ｙｅａｓｔ．Ｒｅｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４２，５３５−５３９，１９９１）。使用された合成培地において、ＭｇおよびＺｎ塩源は、それぞれＭｇＳＯ4（５ｍＭ）およびＺｎＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ（０．０２ｍＭ）である。生産は、他の形質転換サッカロミセス細胞のために前述されたような好気的バッチ培養（グルコース濃度５０ｇｒ／ｌ）において試験された。両ＭｇＳＯ4およびＺｎＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏの欠落は、より高い収率とより高い乳酸生産性を生じた。事実、これらの無機質は、エタノール生産に導く酵素活性のためのコファクターとして要求されるであろう。データは表４に示される。
【０１９３】
【表１２】
【０１９４】
注釈： 対照：完全合成培地（Ｒｅｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４２，５３５−５３９，１９９１；別記）
−Ｍｇ：ＭｇＳＯ4無添加以外は対照と同じ −Ｚｎ：ＺｎＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ無添加以外は対照と同じ 全試験では、最終ｐＨ値は、３．０以下であり、したがって遊離乳酸％は、８８％以上であった。
【０１９５】
ＪＥＮ１遺伝子を過剰発現する酵母細胞による乳酸生産 より良好な乳酸生産とより低いエタノール生産は、乳酸輸送体をコードしているＪＥＮ１遺伝子の過剰発現によって得られた。
【０１９６】
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］（すなわち、ネガティブコントロール）およびＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＪＥＮ１］が、２％グルコース、０．６７％ＹＮＢｗ／ｖおよび補充物質（すなわち、それぞれ、ロイシン−ヒスチジン１００ｍｇ／ｌおよびロイシン１００ｍｇ／ｌ）を含有する培地において増殖された。
【０１９７】
細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された。
【０１９８】
【表１３】
【０１９９】
連続乳酸生産 乳酸の連続的で安定な生産が、形質転換Ｋ．ラクチスＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ２］、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］および形質転換Ｓ．セレビシエＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］両菌株を用いる、古典的なケモスタット培養（新鮮培地のバイオリアクターへの連続流入が、範囲０．０１〜０．３ｈｒ-1の比増殖速度を支持した）の手段によって２週以上にわたって得られた。
【０２００】
フィード・バッチ試験 撹拌タンク発酵槽におけるＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］による乳酸生産 さらに、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］による乳酸生産が、栄養培地（３０ｇ乾物／Ｌ ライトコーンスチープウォーター、Ａ．Ｅ．Ｓｔａｌｅｙ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＩＬ；１０ｇ／Ｌ Ｄｉｆｃｏ酵母エキス、Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ；２００ｍｇ／Ｌ アデニン、５０ｇ／Ｌ グルコース）８リッターを含有する１４リッター撹拌タンク発酵槽における培養によって試験された。発酵槽は、終始３０℃に維持され、４００ｒｐｍで撹拌され、そして２リッター／ｍｉｎで通気された。消泡剤（Ａｎｔｉｆｏｒｍ１５２０，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）が、発泡を制御するために必要に応じて添加された。グルコースは、発酵培地における残濃度約２５〜５０ｇ／Ｌを維持するために必要に応じてフィードされた。制御される場合、ｐＨは、１４．８Ｍ水酸化アンモニウム水溶液の自動添加によって維持された。酸性ｐＨにおける乳酸生産は、次のように試験された：（１）発酵ｐＨが発酵を通じて４．５に制御された。（２）初期発酵ｐＨが、１４．８Ｍ水酸化アンモニウム８０ｍＬが添加されるまで、４．０に制御された。次いで、ｐＨ制御は中止された。（３）初期発酵ｐＨが５．０であり、そして発酵中、中和剤が添加されなかった。結果は表６に示される。経過時間は接種時間以降測定された。濾過により細胞を除去した後得られた発酵からのサンプルは、ＹＳＩ Ｍｏｄｅｌ２７００ Ｓｅｌｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を用いて、グルコースおよびＬ（＋）−乳酸について分析された。ガスクロマトグラフィーによって測定されたエタノールは、いずれの発酵においても検出されなかった。収率および遊離乳酸は、前記のように計算された。発酵のための種菌は、２５０ｍＬ容バッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、アデニン２００ｍｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、グルコース５０ｇ／Ｌ）５０ｍＬにおいて、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］を、培養振盪機（Ｍｏｄｅｌ Ｇ−２４，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）において３０℃、３００ｒｐｍで３０時間前培養することによって調製された。
【０２０１】
同様な結果が、細菌ＬＤＨ遺伝子を用いて得られた（プラスミドｐＥＰＬ４；データ未掲載）。
【０２０２】
【表１４】
【０２０３】
撹拌タンク発酵槽におけるＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］による乳酸生産 さらに、ＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］による乳酸生産が、栄養培地（６．７ｇｒ／ ＹＮＢ／酵母窒素源−Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ、グルコース４５ｇ／Ｌ，２％ｗ／ｖエタノール、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ）０．８リッターを含有する１リッター撹拌タンク発酵槽における培養によって試験された。発酵槽は、終始３０℃に維持され、４００ｒｐｍで撹拌され、そして０．８リッター／ｍｉｎで通気された。消泡剤（Ａｎｔｉｆｏｒｍ１５２０，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）が、発泡を制御するために必要に応じて添加された。形質転換細胞は、最初は、菌体生産のためにエタノールを使用（増殖の最初の５０時間）し、次いで、グルコースをＬ（＋）−乳酸に変換した。ｐＨは、２ＭＫＯＨの自動添加によって４．５に維持された。グルコースは、発酵培地における残濃度約３５〜４５ｇ／Ｌを維持するために必要に応じてフィードされた。
【０２０４】
結果は図９および表７に示される（ケース１）。経過時間は接種時間以降測定された。濾過により細胞を除去した後得られた発酵からのサンプルは、Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．１９９５（前出）に記載のように標準酵素分析を用いて、グルコース、エタノールおよびＬ（＋）−乳酸について分析された。Ｔ＝５０ｈｒ後、エタノールは、サンプル試験のいずれにおいても検出されなかった。収率および遊離乳酸は、前記のように計算された。
【０２０５】
発酵のための種菌は、２５０ｍＬ容バッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、２％ｗ／ｖエタノール、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ）５０ｍＬにおいて、ＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］を、培養振盪機（Ｍｏｄｅｌ Ｇ−２４，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）において３０℃、３００ｒｐｍで４０時間前培養することによって調製された。
【０２０６】
異なる実験（表７、ケース２）では、始発発酵ｐＨは５．４であり、そして中和剤は、発酵を通じて添加されなかった。
【０２０７】
【表１５】
【０２０８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングが、解糖の流れを乳酸生産の方向へシフトする。
ピルビン酸分岐点における鍵の酵素反応は、次の酵素：（１）：ピルビン酸デカルボキシラーゼ；（２）：アルコールデヒドロゲナーゼ；（３）：アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ；（４）：アセチル−ＣｏＡシンテターゼ；（５）；サイトゾルからミトコンドリアへのアセチル−ＣｏＡシャトル；（６）：ミトコンドリアからサイトゾルへのアセチル−ＣｏＡシャトル；（７）：異種の乳酸デヒドロゲナーゼ；（８）：ピルビン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。補充合成に関与する酵素反応は省略された。
【図２】
プラスミドｐＶＣ１の図。
【図３Ａ】
プラスミドｐＫＳＭＤ８／７の図。
【図３Ｂ】
ｐＫＳＥＸＨ／１６の図。
【図４】
プラスミドｐＥＰＬ２の図。
【図５】
プラスミドｐＬＣ５の図。
【図６】
プラスミドｐＬＡＴ−ＡＤＨの図。
【図７Ａ】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラクチスＰＭ６−７ａ［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。Ｔ＝４９における残グルコース濃度は検出されなかった。Ｄ（−）−乳酸の生産も、また検出されなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）ＬＤＨを用いて得られた（データ未掲載）。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。
【図７Ｂ】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラクチスＰＭ６−７ａ［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。培地は、２００ｍＭリン酸バッファーを用いて、時間Ｔ＝０において緩衝化された（ｐＨ＝５．６）。このテキストバッチでは、ｐＨ値は、図７Ａに示したテキストバッチにおけるよりも、ずっと遅く低下する。Ｔ＝４９における残グルコース濃度は検出されなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイＬＤＨを用いて得られた（データ未掲載）。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。
【図８Ａ】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラクチスＰＭ１／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。Ｔ＝６０における残グルコース濃度は、１２，０１ｇ／ｌであった。より長い培養時間は、菌体およびＬ（＋）−乳酸両方のより高い生産をもたらさなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）ＬＤＨを用いて得られた（データ未掲載）。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。
【図８Ｂ】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラクチスＰＭ１／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。培地は、２００ｍＭリン酸バッファーを用いて、時間Ｔ＝０において緩衝化された（ｐＨ＝５．６）。このテキストバッチでは、ｐＨ値は、図８Ａに示したテキストバッチにおけるよりも、ずっと遅く低下する。Ｔ＝８７における残グルコース濃度はゼロであった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ 同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイＬＤＨを用いて得られた（データ未掲載）。
【図９Ａ】
撹拌タンクバイオリアクター（またテキスト参照）における形質転換クルイベロミセスＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］細胞からのＬ（＋）−乳酸生産。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）グルコース濃度、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。
【図９Ｂ】
撹拌タンクバイオリアクターにおける形質転換クルイベロミセスＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］細胞からのＬ（＋）−乳酸収率。
グルコース対乳酸生産。収率（ｇ／ｇ）は８５．４６％であった。
【図１０】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換トルラスポラ（異名チゴサッカロミセス）・デルブルッキイＣＢＳ８１７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］からのＬ（＋）−乳酸生産。Ｔ＝１３０における残グルコース濃度は、３ｇ／ｌであった。より長い培養時間は、菌体およびＬ（＋）−乳酸両方のより高い生産をもたらさなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って０．５Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ
【図１１】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換チゴサッカロミセス・バイリイＡＴＣＣ６０４８３［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］からのＬ（＋）−乳酸生産。Ｔ＝６０における残グルコース濃度は、８ｇ／ｌであった。より長い培養時間は、菌体およびＬ（＋）−乳酸両方のより高い生産をもたらさなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って０．５Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。同様な結果が、異なる菌株を用いて得られた（ＡＴＣＣ３６９４７，データ未掲載）。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。
【０００１】
【技術分野】
本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換され、そして高い収率と生産性をもつ乳酸生産のためにさらに改変された酵母菌株に関する。
【０００２】
発明の背景 乳酸およびその誘導体の応用は、多くの工業活動分野（すなわち、化学、化粧品および薬学）、ならびに食品製造と使用の重要な範囲を包含する。さらにまた、今日では、生分解性ポリマー材の合成のために直接使用されるそのような有機酸の製造における関心が高まりつつある。
【０００３】
乳酸は、化学合成によるか、または微生物を使用する炭水化物の発酵によって製造することができる。後者の方法は、化学合成によって生成されるラセミ混合物に対して、１種の異性体を独占的に生産する微生物が開発されたので、今や商業的に好適である。もっとも重要な工業用微生物。例えば属ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびリゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）は、Ｌ（＋）−乳酸を生産する。また、Ｄ（−）−乳酸もしくはＬ（＋）−およびＤ（−）−乳酸の混合物の発酵による生産も知られている。
【０００４】
典型的な乳酸発酵においては、生産微生物の代謝活性に対する生産された乳酸によって惹起される阻害効果が存在する。乳酸の存在に加えて、ｐＨ値を低下することも、また細胞増殖と代謝活性を阻害する。結果として、一般に、乳酸生産の程度が低下される。
【０００５】
それ故、乳酸を中和し、そしてｐＨ低下を防ぐためのＣａ（ＯＨ）2、ＣａＣＯ3、ＮａＯＨもしくはＮＨ4ＯＨの添加は、遊離の乳酸蓄積のネガティブ効果に対抗するための工業的工程における慣用の操作である。
【０００６】
これらの工程は、ｐＨを範囲約５〜７の一定値に維持することによって、乳酸塩の生産を可能にする；これは、十分に乳酸のｐＫa、３．８６以上である。
【０００７】
主要な欠点は、発酵中の乳酸の中和に関係している。主として、遊離の乳酸をその塩から再生し、そして中和する陽イオンの処理もしくは再利用するために、付加的操作が必要になる；これは、費用のかかる工程である。もし、遊離の乳酸が、低いｐＨ値において増殖する微生物によって蓄積でき、それによって、乳酸塩の生産を最小化することができれば、余分な操作と費用のすべてが排除できるであろう。
【０００８】
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する組み換え酵母の使用によって、解糖の流れを乳酸生産の方向へシフトさせることが提案された。
【０００９】
フランス特許出願公開第６９２ ５９１号（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ）は、乳酸菌由来の乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子であって、酵母においてその発現を調節している配列の制御下にある該遺伝子の少なくとも１個のコピーを含有する酵母菌株、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌株を開示している。
【００１０】
該菌株は、アルコールおよび乳酸発酵の両方を行うことができ、そしてこのいわゆる「中間的（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）」もしくは「均衡（ｂａｌａｎｃｅｄ）」発酵は、ビール醸造、ワイン醸造およびパン焼きのような領域において利用することができるであろう。
【００１１】
また、Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１，２９４−２９８，１９９５）は、ウシ乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子を用いるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換を報告した。
【００１２】
しかしながら、エタノールの高い生産のために、前記両方法の乳酸生産における収率は、乳酸菌の使用によって得られる収率に匹敵するとは見なされなかった。 過去の１０年間において、Ｓ．セレビシエ以外の「非慣用酵母」が、異種タンパク質の発現のための宿主としてかなり高い工業的関心を得た。例は、メタノール資化性酵母、例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）およびピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ラクトース資化性酵母、例えばクルイベロミセス ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）である。炭素およびエネルギー源として広範囲な基質の使用を可能にすることに加えて、他の議論は、「非慣用酵母」の工業的使用のために提案された。一般的に言えば、バイオマスおよび生産物収量は、これらの酵母のある種では、細胞環境の苛酷な条件によってもほとんど影響を受けない。高濃度の糖耐性（すなわち、５０〜８０％ｗ／ｖグルコース培地；トルラスポラ−異名チゴサッカロミセス−・デルブルッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ−ｓｙｎ．Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ− ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ）、チゴサッカロミセス・ルキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）およびチゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）；Ｏｋ Ｔ ａｎｄ Ｈａｓｈｉｎａｇａ Ｆ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ＆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４３（１）：３９−４７，１９９７）、ならびに酸および乳酸耐性（チゴサッカロミセス・ルキシイおよびチゴサッカロミセス・バイリイ；Ｈｏｕｔｓｍａ ＰＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ５９（１２），１３００−１３０４，１９９６）の「非慣用酵母」が利用しうる。既に強調されたように、もし発酵法が、前記の１つ以上の「苛酷な条件」下で実施されれば、下流処理の費用は、著しく削減することができるであろう。
【００１３】
発明の概要 第１の実施態様によれば、本発明は、エタノール生産能を欠いているか、または低いエタノール生産能をもち、そして酵母において乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株を提供する。
【００１４】
より具体的には、本発明は、低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性と低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性をもち、そして酵母において乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株を提供する。
【００１５】
その他の実施態様によれば、本発明は、クルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種の酵母菌株であって、該酵母において遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株を提供する。
【００１６】
さらなる実施態様によれば、本発明は、また、異種ＬＤＨ遺伝子により形質転換され、そして乳酸輸送体を過剰発現する酵母細胞を提供する。
【００１７】
他の実施態様は、酵母プロモーター配列に機能的に結合された乳酸デヒドロゲナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、および炭素源を含有する発酵培地において前記の代謝的に工作された酵母菌株を培養し、そして発酵培地から乳酸を回収することによるＤＬ−、Ｄ−もしくはＬ−乳酸の製造方法である。
【００１８】
さらにまた、本発明は、操作された発酵培地において該酵母菌株を培養し、そして発酵培地から乳酸を回収することによって、乳酸の炭素源における生産性（ｇ／ｌ／ｈｒ）、生産量（ｇ／ｌ）および収率（ｇ／ｇ）を改良する方法を提供する。
【００１９】
発明の記述 乳酸が、属クルイベロミセス、サッカロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスに属する代謝的に改変された酵母によって生産し得ることが見い出された。
【００２０】
より具体的には、乳酸生産における非常に高い収率が、少なくともエタノール発酵を乳酸発酵によって置換するように工作された酵母菌株によって得られることが見い出された。
【００２１】
乳酸生産において、なおより高い収率（＞８０％ｇ／ｇ）は、エタノール発酵とミトコンドリアによるピルビン酸の使用の両方を、乳酸発酵によって置換するように工作された酵母菌株によって得られるかも知れない。
【００２２】
この目的のために、また、本発明は、例えば、１細胞当たりの増加されたＬＤＨコピー数、またはＬＤＨ発現を制御するより強力なプロモーターの使用の結果として、増強されたＬＤＨ活性をもつ形質転換酵母細胞を提供する。
【００２３】
１細胞当たりの増加されたＬＤＨコピー数は、乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードしている核酸配列の少なくとも１個のコピー、好ましくは少なくとも２個のコピー、より好ましくは４個のコピー、なおより好ましくは、該核酸配列の１０〜５０個のコピーを意味する。
【００２４】
乳酸のもっとも高い生産のためには、本発明により形質転換された酵母細胞は、好ましくは、乳酸輸送体を過剰発現する。これは、乳酸輸送体のために必要な遺伝子の１個以上のコピーにより酵母細胞を形質転換することによって得ることができる。
【００２５】
本発明による菌株は、いくつかの方法によって、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の発現を標的とする遺伝子工学技術、およびエタノールの生産に関与する酵素活性、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼ活性の不活性化もしくは抑制、およびミトコンドリアによるピルビン酸の利用に関与する酵素活性の不活性化もしくは抑制によって得ることができる。
【００２６】
ピルビン酸デカルボキシラーゼは、アルコール経路における最初の段階を触媒するので、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性をもたないか実質的に低い活性をもち、そして異種の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する酵母菌株が好適である。
【００２７】
さらに、ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ミトコンドリアによるピルビン酸の利用における最初の段階を触媒するので、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）活性をもたないか実質的に低い活性をもち、そして異種の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する酵母菌株が、また好適である。
【００２８】
乳酸は、乳酸輸送体を介して培地中に分泌されるので、乳酸を生産し、そして乳酸輸送体を過剰発現する細胞が、また好適である。
【００２９】
酵母菌株におけるＬＤＨ遺伝子の発現は、遊離の酸が直接得られ、そして乳酸塩の面倒な転化と回収が最小化されるような酸性ｐＨ値における乳酸の生産を可能にする。本発明において、発酵培地のｐＨは、最初は４．５を超えていてもよいが、発酵の終了時には、ｐＨ４．５以下、好ましくは３以下まで低下するであろう。
【００３０】
いかなる種類の酵母菌株も、本発明により使用されてもよいが、クルイベロミセス、サッカロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種が好適である。何故なら、これらの菌株は、非常に低いｐＨにおいて、特にｐＨ４．５以下の範囲において増殖し、そして／または代謝できるからである；これらの菌株のための遺伝子工学法は、よく開発されている；そしてこれらの菌株は、食品関連の応用における使用のために広く受け入れられている。
【００３１】
乳酸の良好な収率は、さらに、「野生型」ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性をもつ乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子により形質転換されたクルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセス菌株によって得ることができる。
【００３２】
用語「低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性」は、細胞における減少された酵素濃度、または酵素の低いか全くない比触媒活性、のいずれかを意味する。
【００３３】
用語「低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」は、細胞における減少された酵素濃度、または酵素の低いか全くない比触媒活性、のいずれかを意味する。
【００３４】
本発明によれば、エタノール生産がゼロであるかそれに近いが、例えば、野生型菌株の正常値よりも少なくとも６０％低く、好ましくは少なくとも８０％低く、そしてなおより好ましくは少なくとも９０％低く、低い生産が受け入れられる菌株の使用が好適である。
【００３５】
本発明によれば、ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が、ゼロであるかそれに近いが、例えば、野生型菌株の正常値よりも少なくとも６０％低く、好ましくは少なくとも８０％低く、そしてさらにより好ましくは少なくとも９０％低く、低い活性が認められる菌株の使用が好適である。
【００３６】
ＰＤＣ活性をもたないＫ．ラクチスの例は、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９（１），２７−３６，１９９６において開示された。
【００３７】
低いＰＤＣ活性をもつサッカロミセス菌株の例は、Ａｃｃ．Ｎｏ．２０００２７および２０００２８を付してＡＴＣＣから入手できる。調節ＰＤＣ２遺伝子の欠失の結果として低いＰＤＣ活性をもつサッカロミセス菌株のさらなる例が、Ｈｏｈｍａｎｎ Ｓ （１９９３）（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４１：６５７−６６６）において記述された。
【００３８】
ＰＤＣ活性をもたないサッカロミセス菌株の例は、Ｆｌｉｋｗｅｅｒｔ Ｍ．Ｔ．らにより記述された（Ｙｅａｓｔ，１２：２４７−２５７，１９９６）。Ｓ．セレビシエにおける、ＰＤＣ活性の低下は、構造遺伝子（ＰＤＣ１，ＰＤＣ５，ＰＤＣ６）の欠失もしくは調節遺伝子（ＰＤＣ２）の欠失のいずれかによって得ることができる。
【００３９】
ＰＤＨ活性をもたないクルイベロミセス菌株の例は、Ｚｅｅｍａｎらにより記述された（Ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｋ．ｌａｃｔｉｓ；Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ １３ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｉｓｓｕｅ Ａｐｒｉｌ １９９７，Ｅｉｇｈｔｅｅｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ１４３）。
【００４０】
ＰＤＨ活性をもたないサッカロミセス菌株の例は、Ｐｒｏｎｋ ＪＴ．らにより記述された（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４０（Ｐｔ ３）：６０１−１０，１９９４）。
【００４１】
ＰＤＣ遺伝子は、種々の酵母の属中で高度に保存されている（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９（１）：２７−３６，１９９６；Ｌｕ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ＆ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６４（１）：９４−７，１９９８）。それ故、Ｌｕ Ｐら（前出）によって報告されたように、古典的分子アプローチにしたがって、両トルラスポラおよびチゴサッカロミセス酵母種からピルビン酸デカルボキシラーゼ活性に必要な遺伝子を、同定し、クローン化し、そして破壊することが可能であることは、容易に期待できる。さらに、Ｎｅｖｅｌｉｎｇ Ｕら（１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８０（６）：１５４０−８，１９９８）によって報告されたように、同じ古典的アプローチにしたがって、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの両酵母種においてＰＤＨ活性に必要な遺伝子を、単離し、クローン化し、そして破壊することが可能であることは、また容易に期待できる。
【００４２】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、既知の方法、例えばＵｌｂｒｉｃｈ Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８，ｐ．１０９−１１９，１９７０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによって測定できる。
【００４３】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えばＮｅｖｅｌｉｎｇ Ｕ．ら（前出）による既知の方法によって測定できる。
【００４４】
適当な菌株は、野生型もしくは保存菌株の選択的突然変異および／または遺伝子操作によって得ることができる。数百の変異株が、「高生産性スクリーン」アプローチによって選択できる。種々の解糖系流速を支持する栄養物質を使用することによるピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の調節（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１，２９４−２９８，１９９５）は、満足されないことが証明された。
【００４５】
本発明により酵母菌株におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ活性および／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下もしくは消滅する好適な方法は、対応する遺伝子もしくは遺伝子群の欠失にある。
【００４６】
これらの欠失は、Ｂｉａｎｃｈｉら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９（１），２７−３６，１９９６；Ｆｌｉｋｗｅｅｒｔ Ｍ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１２：２４７−２５７，１９９６およびＰｒｏｎｋ ＪＴ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０（Ｐｔ ３）：６０１−１０，１９９４）によって開示されたような既知の方法によって、選択マーカー、例えばＵＲＡ３マーカー、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３マーカーの手段による欠失もしくは挿入によって実施される。あるいはまた、欠失、点変異および／またはフレーム・シフト変異が、機能性プロモーターおよびＰＤＣおよび／またはＰＤＨ活性に必要な遺伝子中に導入できる。これらの技術は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３０５，３９１−３９７，１９８３において開示されている。これらの活性を低下する付加法は、ＰＤＣおよびＰＤＨｍＲＮＡの翻訳を阻害するための、遺伝子配列中の終止コドンの導入もしくはアンチセンスｍＲＮＡの発現であってもよい。
【００４７】
ＰＤＣ遺伝子が、Ｓ．セレビシエのＵＲＡ３遺伝子によって置換されたクルイベロミセス・ラクチス菌株は、既に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９（１），２７−３６，１９９６において記述された。
【００４８】
乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子は、いかなる種（例えば、ウシのような哺乳類もしくは細菌類）のものであってもよく、そしてそれは、Ｌ（＋）−ＬＤＨもしくはＤ（−）−ＬＤＨをコードしていてもよい。あるいはまた、両タイプのＬＤＨ遺伝子が、同時に発現されてもよい。さらに、ＬＤＨ ＤＮＡ配列をもついかなる天然もしくは合成変異体、野生型ＬＤＨ遺伝子と高い同一性をもついかなるＤＮＡ配列、正常なＬＤＨ活性を補足するいかなるＤＮＡ配列が、使用されてもよい。
【００４９】
輸送体遺伝子として、例えば、Ｓ．セレビシエの乳酸輸送体をコードしているＪＥＮ１遺伝子が使用できる。
【００５０】
酵母菌株の形質転換は、組み込みもしくは複製ベクター、直鎖状もしくはプラスミド状のいずれを用いても実施することができる。
【００５１】
本発明の組み換え細胞は、外来ＤＮＡを細胞中に導入させるすべての方法（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｊｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２８（５）：３２１−３３３，１９８８）、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、接合、プロトプラスト融合もしくはすべての他の既知技術によって得ることができる。形質転換に関して、種々の方法が記述された：特に、それは、Ｉｔｏ Ｈ．ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３，１９８３）による酢酸リチウムおよびポリエチレングリコールの存在下、またはＤｕｒｒｅｎｓ Ｐ．ら（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１８：７，１９９０）によるエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドの存在下で、全細胞を処理することによって実施することができる。また別の方法は、欧州特許第３６１９９１号において記述されている。エレクトロポレーションは、Ｂｅｃｋｅｒ Ｄ．Ｍ．およびＧｕａｒｅｎｔｅ Ｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８，１９９１）により実施することができる。
【００５２】
非細菌性組み込みベクターの使用は、酵母菌体が、発酵法の終了時点で、保存飼料として、または他の繁殖用、農業用もしくは食用目的に使用される場合には好適であろう。
【００５３】
本発明の特定の実施態様では、組み換えＤＮＡは、自律もしくは組み込み複製できる発現プラスミドの一部分である。
【００５４】
特に、両Ｓ．セレビシエおよびＫ．ラクチスでは、自律複製ベクターは、選ばれた宿主における自律複製配列を使用することによって得ることができる。特に、酵母においては、それらは、プラスミド（２μ，ｐＫＤ１など）もしくは染色体配列（ＡＲＳ）さえから得られる複製開始点であってもよい。
【００５５】
組み込みベクターは、相同組み換えによりベクターの組み込みを可能にする、宿主ゲノムのある領域における相同ＤＮＡ配列を使用することによって得ることができる。
【００５６】
遺伝子発現のための遺伝道具は、Ｓ．セレビシエに関して非常に良く開発されており、そしてＲｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，８：４２３，１９９２に記述されている。遺伝道具は、また、組み換えタンパク質生産のための宿主細胞として酵母クルイベロミセスおよびトルラスポラ種の使用を可能にするためにも開発されてきた（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｊｆ，ｅｔ ａｌ．，前出；Ｒｅｉｓｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．４３，７５−１０２，１９９０）。Ｋ．ラクチスにおいて自律的に複製するベクターの若干の例は、Ｋ．ラクチスの直鎖状プラスミドｐＫＧ１（ｄｅ Ｌｏｖｅｎｃｏｕｒｔ Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４：７３７，１９８２）に基づくか、または自己複製と正しい分離能をベクターに付与するＫ．ラクチスそれ自体の染色体配列（ＫＡＲＳ）（Ｄａｓ Ｓ．，Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ Ｃ．Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，６：１２３，１９８２）を含有しているかいずれかであると報告されている。さらにまた、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）に固有の２μ−様プラスミド（プラスミドｐＫＤ１−米国特許第５ １６６ ０７０号）の認識が、組み換えタンパク質の生産のための非常に有効な宿主／ベクター系を確立させた（欧州特許出願公開第３６１ ９９１号）。組み換え体ｐＫＤ１に基づくベクターは、適当な酵母および細菌マーカーに融合された完全な元の配列を含有する。あるいはまた、ｐＫＤ１の一部を、共通のＳ．セレビシエ発現ベクターと組み合わせることができる（Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｙｅａｓｔ，８：４２３，１９９２）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：９５，１９８９）。
【００５７】
Ｓ．セレビシエ由来の２μプラスミドが、トルラスポラにおいて複製し、そして安定に維持されることが知られている。この酵母において、異種タンパク質の発現は、同時形質転換操作、すなわち、Ｓ．セレビシエのための発現ベクターと全２μプラスミドの同時存在によって得られた（Ｃｏｍｐａｇｎｏ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．，３：１００３−１０１０，１９８９）。分子間および分子内組み換えの結果として、完全な２μ配列と異種遺伝子を担持しているハイブリッドプラスミドを単離することができる；そのようなプラスミドは、原則的には、トルラスポラを直接形質転換することができる。
【００５８】
さらに、Ｓ．セレビシエＡＲＳ１配列に基づくエピソームプラスミドも記述されているが、このプラスミドの安定性は非常に低い、Ｃｏｍｐａｇｎｏら（前出）。
【００５９】
近年、ｐＴＤ１と名付けられた内因性の２μ−様プラスミドが、トルラスポラにおいて単離された（Ｂｌａｉｓｏｎｎｅａｕ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，３８：２０２−２０９，１９９７）；現在Ｓ．セレビシエのために利用できる遺伝道具は、新規プラスミドに転移することができ、かくしてトルラスポラ酵母種に与えられる発現ベクターを得る。
【００６０】
トルラスポラ酵母のための遺伝マーカーは、例えば、ＵＲＡ３（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４５：４１５−４２０，１９９６），Ｇ４１８耐性（Ｃｏｍｐａｇｎｏ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．，３：１００３−１０１０，１９８９）およびシクロヘキシミド耐性（Ｎａｋａｔａ Ｋ．ｅｔ Ｏｋａｍｕｒａ ｋ．，Ｂｉｏｓｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０：１６８６−１６８９，１９９６）を含む。
【００６１】
チゴサッカロミセス種からの２μ−様プラスミドが知られており、そしてＺ．ルキシイ（ｐＳＲ１）、Ｚ．ビスポラス（Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）（ｐＳＢ３）、Ｚ．フェルメンタチ（Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）（ｐＳＭ１）およびＺ．バイリイ（ｐＳＢ２）において単離された（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｊｆ．ｅｔ ａｌ．，前出）。
【００６２】
プラスミドｐＳＲ１は、もっともよく知られている：それはＳ．セレビシエにおいて複製されるが、２μＡＲＳは、Ｚ．ルキシイにおいて認識されない（Ａｒａｋｉ Ｈ．ａｎｄ Ｈｏｓｈｉｍａ Ｙ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０７：７５７−７６９，１９８９）。
【００６３】
Ｓ．セレビシエＡＲＳ１に基づくエピソームベクターは、Ｚ．ルキシイのために記述されている（Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３８：１２０−１２８，１９９３）。
【００６４】
チゴサッカロミセスのための選択マーカーは、Ｇ４１８を含有する培地において増殖を可能にする遺伝子ＡＰＴ１である（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４：２５２１−２５２９，１９９０）。
【００６５】
誘導的であれ構成的であれ、いかなる酵母プロモーターが、本発明により使用されてもよい。今日まで、Ｓ．セレビシエにおけるタンパク質の発現に使用されたプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら（前出）によってよく記述されている。Ｋ．ラクチスにおいて外来タンパク質発現に普通に使用されるプロモーターは、Ｓ．セレビシエＰＧＫおよびＰＨＯ５であるか（Ｒｏｍａｎｏｓら、前出）、または相同プロモーター、例えばＬＡＣ４（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５，１９９０）およびＫｌＰＤＣ（米国特許第５ ６３１ １４３号）である。Ｋ．ラクチスのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター（ＫｌＰＤＣ）が特に好適である。
【００６６】
クルイベロミセス・ラクチス株の形質転換に特に有効である異種遺伝子発現のためのベクターは、米国特許第５ １６６ ０７０号に記述されており、引用によって本明細書に組み入れられる。
【００６７】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９（１），２７−３６，１９９６に開示されている、好ましくはクルイベロミセス種からの、なおより好ましくはクルイベロミセス・ラクチスからのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターが、特に好適である。また、好ましくはサッカロミセス種、なおより好ましくはサッカロミセス・セレビシエからのトリオースリン酸イソメラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが好適である（Ｒｏｍａｎｏｓら、前出）。
【００６８】
乳酸の生産のために、本発明の酵母菌株は、炭素源および他の必須栄養素を含有する培地において培養され、そして乳酸が、ｐＨ７以下、好ましくはｐＨ４．５以下、なおより好ましくはｐＨ３以下において回収される。培地のｐＨが低下されるので、比較的少量の中和剤が必要である。乳酸塩の形成は、対応して減じられ、そして乳酸を回収するためには遊離酸の比例的に少ない再生が必要になる。回収工程は、既知の方法のいずれを用いてもよい（Ｔ．Ｂ．Ｖｉｃｋｒｏｙ，Ｖｏｌｕｍｅ３，Ｃｈａｐｅｒ３８ ｏｆ ”Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”（ｅｄｉｔｏｒ：Ｍ．ＭｏｏＹｏｕｎｇ），Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）（Ｒ．Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６，２２１−２３１，１９９５）。典型的には、乳酸を回収する前に、微生物が濾過もしくは遠心によって除去される。乳酸回収の既知の方法は、例えば、非混和性溶媒相への乳酸の抽出、または乳酸もしくはそのエステルの蒸留を含む。炭素源に対するより高い収率（乳酸ｇ／消費グルコースｇ）およびより高い生産性（乳酸ｇ／ｌ／ｈ）が、Ｍｇ++およびＺｎ++を欠くか、または該イオンの低い利用能をもつ培地において増殖する酵母菌株、特にサッカロミセス菌株によって得られる。好ましくは、培地は、Ｍｇ++５ｍＭ未満および／またはＺｎ++０．０２ｍＭ未満を含有するであろう。
【００６９】
本発明は、乳酸の生産において次の利点を提供する：１． 発酵が、ｐＨ４．５以下で実施される場合、慣用の方法と比較して、外来の微生物による汚染の危険性が低い。さらに、発酵設備は単純化でき、そして発酵制御が容易に行うことができる。
２． より少ない中和剤が、中和のために培地中に添加されるので、対応して、乳酸塩を遊離乳酸へ転化するための鉱酸もしくは他の再生薬剤を使用する必要性が低い。したがって、生産コストが低減できる。
３． より少ない中和剤が培地に添加されるので、培養液の粘度が低下される。その結果、培養液は処理が容易である。
４． 本発明により分離された細胞は、新鮮な乳酸発酵のための種菌微生物として再び利用できる。
５． 細胞は、本発明にしたがって、乳酸発酵中に連続的に分離され、そして回収することができ、それ故、発酵が連続的に実施できる。
６． 組み換え酵母菌株は、エタノール生産能とピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を欠くか、または両低いエタノール生産と低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性をもつので、乳酸の生産は、野生型のエタノール生産能と野生型のミトコンドリアによるピルビン酸利用能の両方をもつ酵母菌株に比較して、より高い収率で実施することができる。
７． クルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種に属する代謝的に工作された非慣用酵母による乳酸の生産は、非慣用炭素源（すなわち、若干の例を示せば、ガラクトース−ラクトース−スクロース−ラフィノース−マルトース−セロビオース−アラビノース−キシロース）から、高糖濃度培地中で細胞を増殖させ、そして高濃度の乳酸の存在下で細胞を増殖させて得ることができる。
【００７０】
【発明の詳細な記述】
定義 次の定義は、本発明の詳細な記述を理解する際、当業者を助けるために提供される。
【００７１】
「増幅」は、所望の核酸分子のコピー数を増加することを指す。
【００７２】
「コドン」は、特定のアミノ酸配列を指定する３個のヌクレオチド配列を指す。
【００７３】
「欠失」は、核酸配列から１個以上のヌクレオチドを除去する変異を指す。
【００７４】
「ＤＮＡリガーゼ」は、２つの二本鎖ＤＮＡ片を共有結合する酵素を指す。
【００７５】
「エレクトロポレーション」は、宿主細胞を透過性にするよう短時間高電圧のｄｃ電荷を使用して、そこに染色体外ＤＮＡを取り込ませる、細胞中に外来ＤＮＡを導入する方法を指す。
【００７６】
用語「内因性」は、生物体もしくは細胞内から生じる物質を指す。
【００７７】
用語「エンドヌクレアーゼ」は、内部の位置において二本鎖ＤＮＡを加水分解する酵素を指す。
【００７８】
用語「発現」は、対応するｍＲＮＡを生産するための遺伝子の転写、および対応する遺伝子産物、すなわちペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を生産するためのこのｍＲＮＡの翻訳を指す。
【００７９】
用語「アンチセンスＲＮＡの発現」は、遺伝子産物、例えばタンパク質をコードしている第２のＲＮＡ分子にハイブリダイズできる第１のＲＮＡ分子を生産するためのＤＮＡの転写を指す。ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形成は、遺伝子産物を生産する第２のＲＮＡ分子の翻訳を阻害する。
【００８０】
句「機能的に結合された」は、コーディングもしくは構造配列の転写が、プロモーターもしくはプロモーター領域によって命令できるような方向および距離における、プロモーターもしくはプロモーター領域およびコーディングもしくは構造配列を指す。
【００８１】
用語「遺伝子」は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくはＲＮＡ分子をコードしている他のＤＮＡ、ならびに発現の制御に関与するコーディング配列に隣接している領域を指す。
【００８２】
用語「ゲノム」は、宿主細胞内の染色体およびプラスミドの両方を包含する。したがって、宿主細胞中に導入された本発明のコーディングＤＮＡは、染色体に組み込まれていても、またプラスミドに局在されていてもよい。
【００８３】
「異種ＤＮＡ」は、受容細胞のＤＮＡとは異なる起源からのＤＮＡを指す。
【００８４】
「相同ＤＮＡ」は、受容細胞のＤＮＡと同じ起源からのＤＮＡを指す。
【００８５】
「ハイブリダイゼーション」は、塩基対を介して相補的な鎖と結合する核酸鎖の機能を指す。ハイブリダイゼーションは、２本の核酸鎖における相補的配列が互いに結合する場合に起きる。
【００８６】
「乳酸デヒドロゲナーゼ」（ＬＤＨ）は、ピルビン酸およびＮＡＤＨの、乳酸およびＮＡＤ+への転化を触媒するタンパク質を指す。Ｌ（＋）−ＬＤＨは、Ｌ（＋）−乳酸を生成し；Ｄ（−）−ＬＤＨは、Ｄ（−）−乳酸を生成する。
【００８７】
用語「乳酸輸送体」は、細胞の内側から外側への乳酸の輸送を可能にするタンパク質を指す。
【００８８】
「変異」は、核酸配列におけるすべての変化もしくは変更を指す。ある種のタイプは、ポイント、フレームシフトおよびスプライシングを含んで存在する。変更は、特異的に（例えば部位特異的変異誘発）もしくはランダムに（例えば化学薬剤により、修復マイナス細菌株を通過して）遂行されてもよい。
【００８９】
核酸コード：Ａ＝アデノシン；Ｃ＝シトシン；Ｇ＝グアノシン；Ｔ＝チミジン；Ｎ＝等モルのＡ，Ｃ，ＧおよびＴ；Ｉ＝デオキシイノシン；Ｋ＝等モルのＧおよびＴ；Ｒ＝等モルのＡおよびＧ；Ｓ＝等モルのＣおよびＧ；Ｗ＝等モルのＡおよびＴ；Ｙ＝等モルのＣおよびＴ．
「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」は、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードしているＤＮＡもしくはＲＮＡの領域を指す。
【００９０】
「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」（ＰＤＣ）は、ピルビン酸のアセトアルデヒドへの転化を触媒するタンパク質を指す。
【００９１】
「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ」（ＰＤＨ）は、ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの転化を触媒するタンパク質複合体を指す。
【００９２】
「プラスミド」は、環状の、染色体外の、自己複製するＤＮＡ片を指す。
【００９３】
「点変異」は、核酸配列において単一ヌクレオチドの変更を指す。
【００９４】
「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」は、１つの核酸配列の多数のコピーを作成するための酵素的技術を指す。ＤＮＡ配列のコピーは、２つのアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）間でＤＮＡポリメラーゼを往復させることによって製造される。この増幅法の基礎は、変性し、次にアンプリマーを再アニールし、続いて伸長して、側面を接するアンプリマー間に位置する領域に新しいＤＮＡ鎖を合成するための多周期の温度変化である。
【００９５】
用語「プロモーター」もしくは「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼに対する認識部位を提供することによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生産を調節する要素および／または正しい部位における転写の開始に必須な他の因子を指す。
【００９６】
「組み換え細胞」もしくは「形質転換細胞」は、そのＤＮＡが、外因性核酸分子のその細胞への導入によって変えられた細胞を指す。
【００９７】
用語「組み換えＤＮＡ構築物」は、１種以上のＤＮＡ配列が機能的作動方式において結合されたＤＮＡ分子を含む、ゲノム組み込みもしくは自律複製できる、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律的に複製する配列、ファージ、または直鎖状もしくは環状一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチド配列を指す。そのような組み換えＤＮＡ構築物もしくはベクターは、ＤＮＡ配列が、翻訳され、したがって発現される機能的ｍＲＮＡに転写されるような様式で、細胞中に、５’調節配列もしくはプロモーター領域および選択される遺伝子産物のためのＤＮＡ配列を導入できる。組み換えＤＮＡ構築物もしくは組み換えベクターは、あるいはまた、興味ある特定のＲＮＡの翻訳を阻害するために、アンチセンスＲＮＡを発現できるように構築されてもよい。
【００９８】
「低い（酵素）活性」は、同種の野生型菌株から単離される測定酵素活性に較べて、形質転換もしくは変異菌株から単離されるより低い測定酵素活性を指す。低い酵素活性は、低い酵素濃度、酵素の低い比活性もしくはそれらの組み合わせの結果であろう。
【００９９】
「修復マイナス」もしくは「修復欠失」菌株は、低いか、または除去されたＤＮＡ修復経路をもつ生物体を指す。そのような菌株は、同種の野生型菌株の率に較べて、増大される変異率を現す。修復マイナス菌株を通しての核酸配列の伝播は、核酸配列を通したランダム変異の導入をもたらす。
【０１００】
「制限酵素」は、二本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチドの特定のパリンドローム配列を認識し、そして両鎖を切断する酵素を指す；また、制限エンドヌクレアーゼと呼ばれる。切断は、典型的には、制限部位内で起きる。
【０１０１】
「選択性マーカー」は、その発現が、核酸配列を含有する細胞の同定を容易にする表現型を与える核酸配列を指す。選択性マーカーは、毒性化学物質に対する耐性（例えばアンピシリン耐性、カナマイシン耐性）を示すか、栄養欠乏（例えばウラシル、ヒスチジン、ロイシン）を補足するか、または肉眼的に区別しうる特徴（例えば色彩変化、蛍光）を与えるものを含む。
【０１０２】
「転写」は、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡコピー生産する方法を指す。
【０１０３】
「形質転換」は、外因性核酸配列（例えばベクター、プラスミド、組み換え核酸分子）を、外因性核酸配列が染色体に組み込まれるか、または自律複製できる細胞中に導入する方法を指す。
【０１０４】
「翻訳」は、メッセンジャーＲＮＡからのタンパク質生産を指す。
【０１０５】
用語「収率」は、消費されたグルコース量（ｇｒ／ｌ）で除した生産された乳酸量（ｇｒ／ｌ）を指す。
【０１０６】
酵素の「単位」は、酵素活性を指し、そして１分間当たりの総細胞タンパク質１ｍｇ当たり変換された基質ミクロモル量を示す。
【０１０７】
「ベクター」は、核酸配列を宿主生物中に運搬するプラスミド、コスミド、バクテリオファージもしくはウイルスを指す。
【０１０８】
ウシ乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＬＤＨ−Ａ）の部位特異的変異誘発 ウシ酵素ＬＤＨ−Ａ（ＥＣ１．１．１．２７）のコーディング配列を完全な長さのｃＤＮＡから単離するために、古典的な部位特異的変異誘発（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１，１９７８，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９，１９８７）が遂行された。オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発は、合成オリゴヌクレオチドと一本鎖ＤＮＡ断片とのイン・ビトロのハイブリダイゼーションに基づき、このオリゴヌクレオチドは、変異誘発されるべきＤＮＡ配列と一致する、中心のミスマッチ領域を除くＤＮＡ断片と相補的である。
【０１０９】
ＡＴＧコドン１１ｂｐ前にＸｂａＩ制限酵素部位を導入するために、１７４３ｂｐウシＬＤＨｃＤＮＡが、プラスミドｐＬＤＨ１２（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，９１ ２８１−２８５，１９９１）から、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）による消化によってクローン化された。単離されたＤＮＡ断片は、次いで、ｐＡＬＴＥＲ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ＃９６２１０；ｌｏｔ＃４８６４５，１９９６）発現ベクターに挿入された。
【０１１０】
そのようなベクターは、Ｍ１３およびＲ４０８バクテリオファージ複製開始点および抗生物質耐性の２つの遺伝子を含有する。これらの遺伝子の１つ、テトラサイクリン耐性は機能性である。他（すなわちアンピシリン耐性）は、不活性化されていた。変異誘発反応の間に、変異鎖に対してアンピシリン耐性を回復するオリゴヌクレオチドが提供される（ｏｌｉｇｏＡＭＰ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ Ｔａｂ．１）。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鋳型にアニーリングされる。同時に、変異原性オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏＬＤＨ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）は、同様にアニーリングされた。ＤＮＡ合成および連結反応に続いて、ＤＮＡが、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の修復マイナス菌株（ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ；ｋｉｔ Ｐｒｏｍｅｇａ）中に形質転換される。選択は、ＬＢ＋アンピシリンにおいて行われた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。ＪＭ１０９（ｋｉｔ Ｐｒｏｍｅｇａ）Ｅ．コリ菌株における形質転換の第２ラウンドが、変異および野生型プラスミドの適当な分離を確実にした。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
表１： 部位特異的変異誘発のために使用された合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。ｏｌｉｇｏＬＤＨにおける下線の配列は、変異誘発によって導入されたＸｂａＩ制限部位を示す。
【０１１３】
使用された技術および材料（ｏｌｉｇｏＬＤＨ以外の）のさらなる詳細は、キットのデータシートにおいて見い出すことができる。
【０１１４】
ウシＬＤＨについて変異されたｃＤＮＡを含有する、得られたプラスミドは、ｐＶＣ１と命名された（図２）。
【０１１５】
ラクトバチルス・カゼイ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｙｌｕｓ）からの細菌乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＬＤＨ）のＰＣＲ変異誘発 ラクトバチルス・カゼイＬＤＨ遺伝子（ＧＴＧ）の元の開始（ｓｔａｒｔｉｎｇ）コドン（ＧＴＧ）（ＬＤＨ配列は，ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅｎｂａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＭ７６７０８において利用できる −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）は、Ｓ．セレビシエによって正しく認識されない。本発明者らは、プラスミドｐＳＴ２およびＬＤＨ配列を、Ｈｕｔｋｉｎｓ Ｒｏｂｅｒｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｂｒａｓｋａ，ＵＳＡ）から得た。ｐＳＴ２は、ｐＵＣ１９ベクター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．８８５８２７）に基づいており、そしてＬ．カゼイ６８６（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｂｒａｓｋａ）から増幅されたＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ ＬＤＨ−ｃＤＮＡ断片を含有する。
【０１１６】
普通の真核生物の最初のコドン（すなわち、ＡＴＧ）により開始するコーディング配列を得るために、ＬＤＨ配列が、ＰＣＲを介して変異誘発された。
【０１１７】
ＬＤＨ配列（ＧｅｎＢＡｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＭ７６７０８、前出）の位置１６３におけるＮｃｏＩ制限酵素部位の導入は、元のＧＴＧコドンのＡＴＧへの付随変化を与える。ＰＣＲ反応（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ５３３０，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、ｐＧＥＭ７Ｚ ｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ，ＵＳＡ，ｃａｔ．Ｐ２２５１）ベクターに基づくプラスミドｐＬＣ１から出発して遂行し、そしてＬ．カゼイの遺伝子（ｐＳＴ２から切り取られた断片ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ）を含有する。反応のプライマーとして使用されたオリゴヌクレオチドの配列は表２に報告される。
増幅サイクル：９４°；１’ （変性段階）
９４°３０” （変性段階）
５６°３０” ４回 （プライマーアニーリング段階）
６８°３’ （伸長段階）
９４°３０” （変性段階）
６０°３０” ２３回 （プライマーアニーリング段階）
６８°３’ （伸長段階）
６８°３’ （最終伸長段階）
反応の最後に、増幅され、そして変異された遺伝子に対応する単一バンドが単離された。次いで、ＤＮＡ断片は、平滑末端連結によりｐＭＯＳＢｌｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ；ｃｏｄ．ＲＰＮ５１１０）クローニングベクターのＥｃｏＲＶ部位において挿入され、ｐＬＣ３プラスミドが生じた。
【０１１８】
すべての他の変異誘発法が、同様に使用できる。
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
表２： ＰＣＲ増幅のために使用された合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。ｏｌｉｇｏＡＴＧにおける下線の配列は、変異誘発によって導入されたＮｃｏＩ制限部位、および結果として得られたＡＴＧ開始コドンを示す。
【０１２１】
また、本発明者らは、古典的なＰＣＲアプローチにしたがって、細菌バチルス・メガテリウムおよびバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１３９１）（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１１６７）からのＬ（＋）ＬＤＨ遺伝子（ＤＮＡ配列は，また、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅｎｂａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＭ２２３０５およびＭ１９３９６において利用できる −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を、酵母Ｓ．セレビシエのための発現ベクター（すなわち、それぞれｐＢＭＥ２およびｐＢＳＴ２、下記参照）中にクローン化した。
【０１２２】
ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびウシＬＤＨｃＤＮＡを含有するｐＥＰＬ２複製ベクターの構築 ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびコーディング配列は、Ｋ．ラクチスのｒａｇ６変異を相補するＫ．ラクチス・ゲノムライブラリークローン（Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９：２７−３６，１９９６）から４ＫｂｐＨｉｎｄＩＩＩ断片としてサブクローン化された。プロモーター領域が、ベクターｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａ＃２１２２０５）のＳａｌＩおよびＸｂａＩ部位中に、分子クローニング標準操作（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，前出）を用いるＴ４ ＤＮＡリガーゼによりサブクローン化された。ｐＶＣ１ベクターから１６７５ｂｐをもつＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として単離されたウシＬＤＨ配列は、ベクターｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳの対応するクローニング部位においてクローン化された。ＧＭ８２ Ｅ．コリ菌株（ｄａｍ- ｄｃｍ-）（ＡＴＣＣもしくはＣＧＳＣコレクションから得られる）は、それぞれｐＫＳＭＤ８／７およびｐＫＳＥＸＨ／１６（図３Ａおよび３Ｂ）と呼ばれる２種の新ベクターにより形質転換された。
【０１２３】
それぞれｐＫＳＭＤ８／７およびｐＫＳＥＸＨ／１６からＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片として単離された、ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびウシＬＤＨ配列は、ＳａｌＩエンドヌクレアーゼの存在下、室温で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによりイン・ビトロで連結されて、ＸｂａＩ末端において連結された。連結反応産物は、ｐＥ１ベクター（Ｂｉａｎｃｈｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１８５−１９２，１９８７；Ｃｈｅｎ Ｘ． Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：９５−９８，１９８９およびＵＳ＃５１６６０７０）のＳａｌＩクローニング部位においてクローン化された。このプラスミドは、サッカロミセス・セレビシエ遺伝マーカーＵＲＡ３を含有するＹＩｐ５組み込みプラスミド、およびクルイベロミセス・ドロソフィラルムから単離されたｐＫＤ１プラスミド（ＵＳ＃５１６６０７０）に基づいている。プラスミドｐＥ１は、Ｓ．セレビシエ２μ ＤＮＡに類似する機能的構成をもち、そしてクルイベロミセス・ラクチス細胞（Ｃｈｅｎ Ｘ． Ｊ．ｅｔ ａｌ．，前出）において安定な進行で複製することができる。プラスミド上のＵＲＡ３マーカーは、Ｋ．ラクチスｕｒａＡ１−１変異を相補（ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７−７４２（１９８２））させ、したがって、ウラシルを含まない選択培地における形質転換細胞の増殖を可能にする。
【０１２４】
得られたベクターは、ｐＥＰＬ２（図４）と呼ばれ、そしてＥ．コリＤＨ５−ａｌｆａ菌株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＡ）を形質転換するために使用された。
【０１２５】
ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよび細菌ＬＤＨ遺伝子を含有するｐＥＰＬ４複製ベクターの構築 ｐＥＰＬ２プラスミドに関して記述されたウシＬＤＨ遺伝子が、本文を通して記述された古典的分子アプローチにしたがって、細菌ラクトバチルス・カゼイ遺伝子（前記参照）からのＬＤＨ ＤＮＡ配列と置き換えられて、プラスミドｐＥＰＬ４を得た。ウシもしくは細菌ＬＤＨを担持する形質転換Ｋ．ラクチス酵母細胞は、類似の結果を与えた。
【０１２６】
ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびウシＬＤＨｃＤＮＡを含有するｐＬＡＺ１０複製ベクターの構築 ベクターｐＬＡＺ１０は、ＫｌＰＤＣ１プロモーターとウシＬＤＨコーディング配列を担持するｐＥＰＬ２のＳａｌＩ断片を、ベクターｐ３Ｋ３１のユニークＳａｌＩ部位中にクローニングすることによって得られた。ベクターｐ３Ｋ３１は、市販ベクターｐＵＣ１９およびプラスミドｐＫＤ１のユニークＳｐｈＩ部位に挿入されたベクターｐＫａｎ７０７（Ｆｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９６８−９７４，１９９１）のＧ４１８耐性カセットからなる。
【０１２７】
ｐＬＣ５，ｐＬＣ７，ｐＢ１，ｐＢＭ２，ｐＢＳＴ２，ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸおよびｐＪＥＮ１組み込みベクターの構築 Ｌ．カゼイＬＤＨ遺伝子は、ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ消化によってｐＬＣ３（前記）から切り取られ、そしてｐＹＸ０１２もしくはｐＹＸ０２２組み込みベクター（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中に連結された。
【０１２８】
ＴＰＩプロモーターの制御下の細菌ＬＤＨ遺伝子について変異されたＤＮＡを含有し、そして栄養素要求性マーカーＵＲＡ３もしくはＨＩＳ３を担持する、得られた２種のプラスミドは、ｐＬＣ５（図５）およびｐＬＣ７とそれぞれ命名された。ｐＢ１、ｐＢＭ２およびｐＢＳＴ２の構築では、本発明者らは、ｐＬＣ５の構築について記述されたものと類似のアプローチを使用した；しかしながら、ウシＬＤＨ、Ｂ．メガテリウムＬＤＨおよびＢ．ステアロサーモフィルスＬＤＨ（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１３９１）（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１１６７）をそれぞれ使用した。最後に、プラスミドｐＦＡ６ａ−ＫａｎＭＸ（Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１９９４，１０：１７９３−１８０８）が、ＳａｃＩとＳｍａＩにより消化され、そして生じる断片が、同じ酵素で切断されたｐＬＣ５中に連結されて、プラスミドｐＬＣ５−ＫａｎＭＸを生成した。このプラスミドでは、ＬＤＨ遺伝子は、ＴＰＩプロモーターの制御下にある。
【０１２９】
Ｓ．セレビシエの乳酸輸送体をコードしているＪＥＮ１（Ｄａｖｉｓ Ｅ．Ｓ．，Ｔｈｅｓｉｓ，１９９４−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｄａｖｉｓ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（２３），１１１６９，１９９２）（Ａｎｄｒｅ，Ｂ．Ｙｅａｓｔ（１１），１５７５，１９９５）のＤＮＡ配列（ＤＮＡ配列は，また、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅｎｂａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＵ２４１５５において利用できる −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）は、Ｅ．Ｓ．Ｄａｖｉｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）から得られた。ＪＥＮ１コーディング配列は、本文を通して記述された古典的ＰＣＲアプローチによって増幅され、そしてプラスミドｐＹＸ０２２（前記）中にクローン化された。組み込みプラスミドでは、ＪＥＮ１過剰発現は、ＴＰＩプロモーターの制御下にある。
【０１３０】
ＡＤＨ１プロモーターおよびウシＬＤＨｃＤＮＡを含有するｐＬＡＴ−ＡＤＨ複製ベクターの構築 第１に、ｐＬＤＨ−Ｋａｎプラスミドが、ｐＦＡ６−ＫａｎＭＸ４ベクター（Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ １０：１７９３−１８０８（１９９４））のＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ消化から誘導されたゲネチシン（Ｇ４１８）耐性を付与するＡＰＴ１遺伝子を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ，ＵＳＡ，ｃａｔ．２１２２０８）クローニングベクターのＥｃｏＲＶ部位にクローニングして構築された。
【０１３１】
第２に、ウシＬＤＨ遺伝子のコーディング領域が、前述のｐＶＣ１プラスミドからのＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＶＴ１０２−Ｕベクター（Ｖｅｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５２：２２５−２３３（１９８７））中にサブクローニングすることによって、Ｓ．セレビシエのＡＤＨ１プロモーターとターミネーター配列の制御下でクローン化された。
【０１３２】
最後に、全発現カセット（ＡＤＨ１プロモーター−ＬＤＨ遺伝子−ＡＤＨ１ターミネーター）が、ＳｐｈＩ消化によって切り取られ、ｐＬＤＨ−Ｋａｎと連結され、ＳｐｈＩで直鎖状にされて、ｐＬＡＴ−ＡＤＨベクター（図６）を得た。
【０１３３】
Ｋ．ラクチスＰＭＩ／Ｃ１菌株の単離 ＰＭ６−７Ａ酵母菌株（ＭＡＴ ａ，ａｄｅＴ−６００，ｕｒａＡ１−１）（Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ １９９２，８：７１１）におけるＫｌＰＤＣＡ遺伝子の欠失が、菌株ＰＭＩを生じた。欠失は、Ｓ．セレビシエのＵＲＡ３マーカーの挿入によって実施された。菌株ＰＭＩは、グルコース含有培地で増殖する；ＰＤＣ活性は検出されず、そして菌株はエタノールを生産しない（Ｂｉａｎｃｈｉ Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）、前出）。いかなる検出しうるＰＤＣ活性ももたないＳ．セレビシエ細胞は、グルコース無機質培地では増殖しない（Ｆｌｉｋｗｅｅｒｔ Ｍ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｙｅａｓｔ，１２：２４７−２５７，１９９６）ということを強調することが重要である。
【０１３４】
ＰＭＩ酵母細胞の定常期の培養からの１ｘ１０7〜３ｘ１０7細胞が、５−フルオロオロチン酸を含有する合成培地上に平板塗布された。５−フルオロオロチン酸含有培地における酵母細胞の増殖は、ウラシル合成において損傷された細胞の選択を可能にする（ＭｃＣｕｓｋｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｙｅａｓｔ ７：６０７−６０８（１９９１））。２８℃で５日培養後、数株のｕｒａ−変異株が単離された。得られたこれらの変異株の１株は、ＰＭＩ／Ｃ１と呼ばれ、組み込み形質転換によって予め導入されたＵＲＡ３遺伝子における変異を生じたが、それは、ＵＲＡ３遺伝子を含有するプラスミド（Ｋｅｐ６ベクター；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２１１−２２０（１９８８））を用いる形質転換による相補試験から証明された。ＰＭＩ／Ｃ１の遺伝子型は、次のとおりである：ＭＡＴａ，ａｄｅＴ−６００，ｕｒａＡ１−１，ｐｄｃＡ：：ｕｒａ３。
【０１３５】
ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２およびＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２菌株の単離 一般的戦略は、最初に、各ＰＤＣ遺伝子（ＰＤＣ１、ＰＤＣ２、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６）の単一欠失変異株を作成することであった。遺伝子欠失は、Ｗａｃｈら（１９９４；Ｙｅａｓｔ １０、１７９３−１８０８）およびＧｕｅｌｄｅｎｅｒら（１９９６；Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，２５１９−２５２４）によって記述されたショートフランキングホモロジー（ＳＦＨ）ＰＣＲ法を用いて、対応するＰＤＣ遺伝子の座における相同性組み換えによりｌｏｘＰ−ＫａｎSRD−ｌｏｘＰカセットの組み込みによって行われた。続いて、欠失カセットは、欠失座におけるｌｏｘＰ部位の単一コピーをリーディング ビハインド（ｌｅａｄｉｎｇ ｂｅｈｉｎｄ）するｃｒｅ−リコンビナーゼを発現することによって除かれた。ｐｄｃ１ ｐｄｃ５ ｐｄｃ６三重欠失変異株は、続いて、単一の一倍体欠失株を交雑することによって作成された。
【０１３６】
ＰＣＲ反応は、ある種のシュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子（機密）の調節配列（プロモーター／ターミネーター）に融合されたカナマイシン耐性（Ｅ．コリ トランスポゾンＴｎ９０３のオープンリーディングフレーム）の遺伝子を含有するＤＮＡ鋳型において実施された。この選択カセットは、ｌｏｘＰ配列（ｌｏｘＰ−ＫａｎSRD−ｌｏｘＰ）によって両端において隣接されており、ＳＲＤ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）によって開発された。ｌｏｘＰ−ＫａｎSRD−ｌｏｘＰカセットを増幅するために使用されるプライマーは、センスプライマーのＤＮＡ配列が、選択カセット配列の５’末端と相同であるように、そしてプライマーが、ある種のサッカロミセス・セレビシエＰＤＣ遺伝子の５’末端配列に対応する、その５’末端領域４０ヌクレオチドにおける付加において存在するように、設計される。アンチセンスプライマーは、類似の方法で構築され、それは、選択カセットの３’末端と相補的であり、この場合、このプライマーは、ある種のサッカロミセス・セレビシエＰＤＣ遺伝子の３’末端配列に対応する、また好ましくは４０ヌクレオチドをその５’末端領域において含有する。
【０１３７】
次の表は、ＳＦＨ ＰＣＲ法による対応するＰＤＣ遺伝子の遺伝子欠失のために使用されるプライマーを示す。下線の配列は、対応するＰＤＣ遺伝子と相同性であり、そしてｌｏｘＰ−ＫａｎSRD−ｌｏｘＰカセットに相補的な配列は、太字で存在する。
【０１３８】
【表３】
【０１３９】
ＰＣＲ増幅された欠失カセットは、ＳＲＤによって開発された原栄養性二倍体サッカロミセス・セレビシエ菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１２の形質転換のために使用された。
【０１４０】
ＣＥＮ．ＰＫ１１２（Ｍａｔａ，ａｌｐｈａ，ＵＲＡ３，ＵＲＡ３，ＨＩＳ３，ＨＩＳ３，ＬＥＵ２，ＬＥＵ２，ＴＲＰ１，ＴＲＰ１，ＭＡＬ２−８C，ＭＡＬ２−８C，ＳＵＣ２，ＳＵＣ２）
形質転換株の選択のために、ゲネチシン（硫酸Ｇ−４１８，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が、最終濃度２００ｍｇ／ｌにおいて添加された。四分子分析後、続いて、Ｇ４１８耐性胞子が、診断的ＰＣＲによって解析されて、対応するＰＤＣ遺伝子の正しい欠失を確認し、そして一倍体菌株の交配型を決定した。
【０１４１】
３個のＰＤＣ遺伝子、ＰＤＣ１，ＰＤＣ５おいてＰＤＣ６について欠失された菌株を得るために、一倍体欠失株が、続いて交雑された。２個の二重欠失株、ｐｄｃ１：：ＫａｎSRD ｐｄｃ６：：ＫａｎSRDおよびｐｄｃ５：：ＫａｎSRD ｐｄｃ６：：ＫａｎSRDを得るために、対応する一倍体株が交雑された。四分子分析後、ＫａｎSRDマーカーに関して非親系二型（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔａｌ ｄｉｔｙｐｅ）を示す胞子が、続いて、診断的ＰＣＲによって解析されて、両遺伝子の正しい欠失を確認し、そして交配型を決定した。得られる二重欠失株が交雑されて、三重欠失株を得た。四分子分析後、診断的ＰＣＲによって、３個のＰＤＣ遺伝子について欠失された胞子が探された。
【０１４２】
破壊に成功した遺伝子からＫａｎSRDマーカーを除去するために、一倍体欠失株（単一、二重および三重変異株）が、ｃｒｅ−リコンビナーゼ・プラスミド、ｐＰＫ−ＩＬＶ２SMR（ＳＲＤによって開発された）により形質転換された。プラスミドｐＰＫ−ＩＬＶ２SMRは、ＧＡＬ１プロモーター制御下のｃｒｅ−リコンビナーゼ、および優性選択マーカーとして、プラスミドプラスミドｐＰＫ−ＩＬＶ２SMRにより形質転換された酵母細胞をスルホメツロンメチル（３０ｍｇ／ｌ）の存在下で増殖可能にさせるＩＬＶ２耐性遺伝子を含有する。続いて、ＫａｎSRDマーカーの正確な切除が、全酵母細胞に関して診断的ＰＣＲによって解析された。プラスミドｐＰＫ−ＩＬＶ２SMRを除去するために、酵母細胞は、培地中スルホメツロンメチルなしで適当な時間培養され、続いて、スルホメツロンメチル感受性細胞が探索された。
【０１４３】
次の表は、得られた酵母菌株を示す。括弧内の数字は、対応する遺伝子の欠失ヌクレオチド（ＡＴＧ＝１）を指す。ネガティブ数字の場合は、最初の数字は、ＡＴＧの上流の欠失ヌクレオチドを意味し、そして第２の数字は、終始コドンの下流の欠失ヌクレオチドを意味する。
【０１４４】
【表４】
【０１４５】
主として、本発明者らは、得られたデータを総括している表において、またＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６と名付けられる菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１２およびＣＥＮ．ＰＫ１８２を使用した。
【０１４６】
同様のアプローチを使用して、ＰＤＣ２遺伝子に欠失を担持しているＳ．セレビシエＧＲＦ１８Ｕ株（Ｍａｔ ａｌｐｈａ，ｈｉｓ３，ｌｅｕ２，ｕｒａ３）が構築された（ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２；Ｍａｔ ａｌｐｈａ，ｈｉｓ３，ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｐｄｃ２：：ＡＰＴ１）。本発明者らは、プラスミドｐＦＡ６ａ−ＫａｎＭＸ（Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．前出）から単離された、組み込みのマーカーとしてのＧ４１８耐性を付与するＡＰＴ１遺伝子を使用した；ＰＤＣ１，ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子において欠失を担持している菌株では、ＰＤＣ活性はゼロである。ＰＤＣ２遺伝子に欠失を担持している菌株では、ＰＤＣ活性は野生型菌株で測定されるレベルの約２０〜４０％である。
【０１４７】
Ｋ．ラクチスＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］の単離 二重欠失菌株Ｋｌｐｄｃ１△／Ｋｌｐｄａ１△は、菌株ＭＷ３４１−５／Ｋｌｐｄｃ１△（ＭＡＴα，ｌａｃ４−８，ｌｅｕ２，ｌｙｓＡ１−１，ｕｒａＡ１−１，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９（１）、２７−３６において既述のように得られた；Ｄｅｓｔｒｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，提供）を、菌株ＣＢＳ２３５９／Ｋｌｐｄａ１△（ＭＡＴａ，ＵＲＡ３−４８，Ｋｌｐｄａ１：：Ｔｎ５ＢＬＥ）と交雑することによって得られた二倍体菌株の一倍体分離集団から選択された。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体Ｅ１−ａｌｐｈａサブユニット（ＥＣ．１．２．４．１）（ＤＮＡ配列は、Ｓｔｅｅｎｓｍａ Ｈ．Ｙ．；Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｕｓｉｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄによって得られた−ＤＮＡ配列は，また、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅｎｂａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＡＦ０２３９２０において利用できる −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）をコードしているＰＤＡ１遺伝子の欠失は、酵母菌株ＣＢＳ２３５９において、古典的ＰＣＲアプローチおよび本文を通じて記された酵母形質転換にしたがって得られた。本発明者らは、組み込みのマーカーとしてフレオマイシン耐性を付与するマーカーＴｎ５Ｂｌｅ（Ｇａｔｉｎｇｎｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，９１：３５，１９９０）を使用した。
【０１４８】
ＢＭ１−３Ｃ（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｋｌｐｄａ１：：Ｔｎ５ＢＬＥ）と呼ばれる二重欠失菌株は、フレオマイシン耐性／アンチマイシン感受性分離菌株として選択された。次いで、ベクターｐＬＡＺ１０が、遺伝的に、次のように二重欠失菌株に転移された。
【０１４９】
Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３菌株のｐＬＡＺ１０形質転換株ＰＭＩ／８（ＭＡＴａ，ａｄｅＴ−６００，ｕｒａＡ１−１，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９：２７−３６，１９９６）が、菌株ＭＷ１０９−８Ｃ（ＭＡＴα，ｌｙｓＡ１−１，ｔｒｐＡ１−１）と交雑された。得られる二倍体菌株の胞子形成後、菌株７Ｃ（ＭＡＴα，ａｄｅＴ−６００，ｌｙｓＡ１−１，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３，ｐＬＡＺ１０+）と呼ばれるゲネチシン耐性／アンチマイシン感受性菌株が選択された。
【０１５０】
菌株ＢＭ１−３Ｃおよび菌株７Ｃが交雑され、そして得られた二倍体菌株の胞子形成後、フレオマイシン耐性／ゲネチシン耐性の一倍体分離菌株が選択された。すべての一倍体分離株はアンチマイシン感受性であった。原栄養株ＢＭ３−１２Ｄ（Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｋｌｐｄａ１：：Ｔｎ５ＢＬＥ、ｐＬＡＺ１０+）が、さらなる実験のために選ばれた。
【０１５１】
ベクターｐＥＰＬ２およびｐＥＰＬ４を用いるクルイベロミセス酵母ＰＭ６−７ＡおよびＰＭＩ／Ｃ１の形質転換 ＰＭ６−７ＡおよびＰＭＩ／Ｃ１細胞が、ＹＰＤ培地において濃度０．５ｘ１０8細胞／ｍｌまで増殖され、収穫され、水中で１回、１Ｍソルビトール中で２回洗浄され、そして１Ｍソルビトール中濃度２ｘ１０9細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞は、ｐＥＰＬ２もしくはｐＥＰＬ４５〜１０μｇの存在下でエレクトロポレーション（７．５ＫＶ／ｃｍ，２５μＦ，２００Ω：ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ）された。ＵＲＡ+形質転換株の選択は、ウラシルを含まない合成固形培地（０．７％ｗ／ｖ酵母窒素源、２ｗ／ｖ％グルコース、２００ｍｇ／ｌアデニン、２ｗ／ｖ％寒天）において実施された。
【０１５２】
ベクターｐＬＡＴ−ＡＤＨを用いるトルラスポラ酵母の形質転換 ＣＢＳ８１７細胞が、ＹＰＤ培地において濃度６ｘ１０7細胞／ｍｌまで増殖され、収穫され、水中で１回、１Ｍソルビトール中で２回洗浄され、そして１Ｍソルビトール中濃度２ｘ１０9細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞は、ｐＬＡＴ−ＡＤＨ １μｇの存在下でエレクトロポレーション（１．５ｋＶ，７．５ＫＶ／ｃｍ，２５μＦ，２００Ω：ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ）された。
【０１５３】
細胞は、ＹＥＰＤ ５ｍｌ、ソルビトール１Ｍを含有する滅菌微生物用チューブにおいて一夜増殖された。Ｇ４１８r形質転換株の選択は、固形培地（２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％ペプトン、１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％寒天，２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ｃａｔ．１１８１１−０３１））において実施された。
【０１５４】
ベクターｐＬＡＴ−ＡＤＨを用いるチゴサッカロミセス酵母の形質転換 ＡＴＴＣ３６９４７およびＡＴＴＣ６０４８３細胞が、ＹＰＤ培地において濃度２ｘ１０8細胞／ｍｌまで増殖され、収穫され、そして０．１Ｍ酢酸リチウム、１０ｍＭジチオトレイトール、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７，５中濃度４ｘ１０8細胞／ｍｌにおいて、室温で１時間再懸濁された。細胞は、水中で１回、１Ｍソルビトール中で２回洗浄され、そして１Ｍソルビトール中濃度５ｘ１０9細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞は、ｐＬＡＴ−ＡＤＨ ３μｇの存在下でエレクトロポレーション（１．５ｋＶ，７．５ＫＶ／ｃｍ，２５μＦ，２００Ω：ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ）された。
【０１５５】
細胞は、ＹＥＰＤ ５ｍｌ、ソルビトール１Ｍを含有する滅菌微生物用チューブにおいて一夜増殖された。Ｇ４１８r形質転換株の選択は、固形培地（２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％ペプトン、１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％寒天，２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ｃａｔ．１１８１１−０３１））において実施された。
【０１５６】
ベクターｐＬＣ５，ｐＬＣ７，ｐＢ１，ｐＢＳＴ２，ｐＢＭＥ２，ｐＬＡＴ−ＡＤＨ，ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸおよびｐＪＥＮ１を用いるサッカロミセス酵母細胞の形質転換 ＧＲＦ１８Ｕ（前記）、ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２（前記）、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］（Ｍａｔ ａｌｐｈａ，ｈｉｓ３，ｌｅｕ２，ｕｒａ３：：ＴＰＩ−ＬＤＨ）、ＣＥＮＰＫ１１３（Ｍａｔ ａ；ＣＢＳ８３４０）、ＣＥＮＰＫ−１（Ｍａｔ ａ，ｕｒａ３）、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６（前記）およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２（前記）酵母細胞が、富栄養ＹＰＤ完全培地（２ｗ／ｖ％酵母エキス、１ｗ／ｖ％ペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース）において濃度２ｘ１０7細胞／ｍｌまで増殖され、０．１Ｍ酢酸リチウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中で１回洗浄され、そして０．１Ｍ酢酸リチウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中に濃度２ｘ１０9細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞懸濁液１００μｌは、ベクター（すなわち、ｐＬＣ５，ｐＬＣ７，ｐＢ１，ｐＢＳＴ２，ｐＢＭＥ２，ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ，ｐＪＥＮ１の場合には、栄養要求マーカーにおいて予め直鎖化された）５〜１０μｇと５分インキュベートされた。ＰＥＧ４０００ ２８０μｌの添加後、細胞は、３０℃で少なくとも４５分間インキュベートされた。ＤＭＳＯ４３μｌを添加し、そして懸濁液が４２℃で５分間インキュベートされた。細胞は、水で２回洗浄され、選択培地上に平板塗布された。ＣＥＮＰＫ−１菌株（ｕｒａ３）の単離のために、ＣＥＮＰＫ１１３細胞が、５−フルオロオロチン酸を含有する培地（上記参照）で増殖された。
【０１５７】
単一形質転換細胞は、０．７％ｗ／ｖ酵母窒素源、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％寒天，プラス指標として適当な補充物質もしくはＧ４１８においてスコアーされた。Ｇ４１８R形質転換株の選択では、また細胞は、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％ペプトン、１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％寒天，２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ｃａｔ．１１８１１−０３１）においてスコアーされた。
【０１５８】
形質転換株：補充物質ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］：ウラシル２００ｍｇ／ｌ、ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢ１］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ。ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＭＥ２］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＳＴ２］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＪＥＮ１］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ。
ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ。
ＣＥＮＰＫ−１［ｐＬＣ５］：補充物質なしＣＥＮＰＫ１１３［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］：Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ。
ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］：Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ。
ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］：Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ。
【０１５９】
【表５】
【０１６０】
ＫＬ＝Ｋ．ラクチスのプロモーターＳＣ＝Ｓ．セレビシエのプロモーターＢ．Ｓｔｅ．＝バチルス・ステアロサーモフィルス ｐＪＥＮ１は、ＪＥＮ１遺伝子の発現のために使用された。
【０１６１】
バッチ試験 クルイベロミセスＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ２］、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］、ＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ４］およびＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ４］形質転換細胞のバッチ解析 上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、アデニン２００ｍｇ／ｌ、グルコース５０ｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された。使用された培地は、２００ｍＭリン酸バッファーによりｐＨ５．６に緩衝化されるか、されないか両方であった。
【０１６２】
細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的な時点でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された（図７および８、および表３）。
【０１６３】
クルイベロミセスＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］形質転換細胞のバッチ解析 上記操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース５０ｇ／ｌ、エタノール２０ｇｒ／ｌ、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された。使用された培地は、２００ｍＭリン酸バッファーによりｐＨ５．６に緩衝化された。
【０１６４】
細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された。最初、細胞はエタノールを使用し、次いで、非常に高い収率でグルコースを乳酸に変換した（＞０．７５；乳酸ｇ／消費グルコースｇ）（表３）。
【０１６５】
トルラスポラＣＢＳ８１７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換細胞のバッチ解析 上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース２０ｇ／ｌ、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された。使用された培地は、緩衝化されなかった。
【０１６６】
細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された。（図１０および表３）。
【０１６７】
チゴサッカロミセスＡＴＣＣ３６９４７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］およびＡＴＣＣ６０４８３［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換細胞のバッチ解析 上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース５０ｇ／ｌ、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された。使用された培地は、緩衝化されなかった。
【０１６８】
細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された（図１１および表３）。
【０１６９】
サッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢ１］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＭ２］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＳＴ２］、ＣＥＮＰＫ−１［ｐＬＣ５］形質転換細胞のバッチ解析 上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース５０ｇ／ｌおよび適当な補充物質（上記参照））における増殖のバッチ培養において試験された。使用された培地は、緩衝化されなかった。細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された（表３）。
【０１７０】
サッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５］、ＣＥＮＰＫ１１３［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］形質転換細胞のバッチ解析−回転フラスコ− 上記操作によって得られたクローンが、富栄養培地（１．０％ｗ／ｖ酵母エキス、２％ｗ／ｖペプトン、グルコース１００ｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された。培地は、緩衝化されなかった。
【０１７１】
細胞は、酵母エキス−ペプトン＋エタノール（５ｇ／ｌ）培地において前培養された。１００ｍｌが、回転フラスコ中に接種された（１．５ ｌ作業容量；始発ｐＨ＝５．７）。回転フラスコは３０℃で培養された、撹拌：５５ｒｐｍ。発酵が規則的間隔でモニターされた（表Ａ，Ｂ，Ｃおよび表３）。
【０１７２】
種々の形質転換株由来のＬＤＨ比活性は、５Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
【０１７３】
ＬＤＨ活性用量（ｄｏｓａｇｅ）
ウシＬＤＨ 約１０8細胞が回収され、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．
５中で洗浄され、そして同じバッファーに懸濁された。細胞は、ガラスの微小ビーズ（直径４００μｍ、ＳＩＧＭＡ，Ｇ−８７７２）の存在下の強い渦の５サイクルによって４℃において溶解された。細胞破片は、遠心（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｄ ５４１５ Ｃ，１３６００ ＲＣＦ，１０分）によって除去され、そしてタンパク質抽出液の濃度が、Ｍｙｃｒｏ Ａｓｓａｙ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ（ｃａｔ．５００−０００６）によって測定された。
【０１７４】
抽出液約０．２ｍｇが、ＳＩＧＭＡ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）キットＤＧ１３４０−ＵＶを使用して、製造者の指示にしたがってＬＤＨ活性を試験された。
【０１７５】
細菌ＬＤＨ 約１０8細胞が回収され、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．
５中で洗浄され、そして同じバッファーに懸濁された。細胞は、ガラスの微小ビーズ（直径４００μｍ、ＳＩＧＭＡ，Ｇ−８７７２）の存在下の強い渦の５サイクルによって４℃において溶菌された。細胞破片は、遠心（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｄ ５４１５ Ｃ，１３６００ ＲＣＦ，１０分）によって除去され、そしてタンパク質抽出液の濃度が、Ｍｙｃｒｏ Ａｓｓａｙ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ（ｃａｔ．５００−０００６）によって測定された。
【０１７６】
細胞抽出液は、１２．８ｍＭ ＮＡＤＨ０．０１ｍｌ、２ｍＭフルクトース１，６−二リン酸０．１ｍｌ、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ＝５．６）０．７４ｍｌ、適当に希釈された細胞抽出液０．０５ｍｌおよび１００ｍＭピルビン酸０．１ｍｌ：を用いて、ＬＤＨ活性を試験された。
【０１７７】
ＬＤＨ活性は、３４０ｎｍ、２５℃において、総細胞抽出液１ｍｇ当たりの、１分間に酸化されるＮＡＤＨミクロモル数としてアッセイされた。
【０１７８】
増殖培地における代謝物用量 遠心によって細胞を除去した後得られた、増殖培地からのサンプルが、グルコース、エタノール、Ｌ（＋）−およびＤ（−）−乳酸の存在に関して、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＤＥからのキット（それぞれ＃．７１６２５１，１７６２９０および１１１２８２１）を用い、製造者の指示にしたがって分析された。
【０１７９】
クルイベロミセスＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ２］およびＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］形質転換酵母に関する実験バッチ試験は、図７Ａ，７Ｂおよび図８Ａ，８Ｂにおいて示される。
【０１８０】
トルラスポラＣＢＳ８１７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換酵母に関する実験データは、図１０に示される。
【０１８１】
チゴサッカロミセスＡＴＣＣ６０４８３［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換酵母に関する実験データは、図１１に示される。
【０１８２】
回転フラスコ中で増殖するサッカロミセスＣＥＮＰＫ１１３［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］形質転換酵母に関する実験データは、表Ａ，Ｂ，Ｃにおいて示される。
【０１８３】
【表６】
【０１８４】
【表７】
【０１８５】
【表８】
【０１８６】
形質転換クルイベロミセス、トルラスポラ、チゴサッカロミセスおよびサッカロミセス酵母から得られたすべての結果は、表３において総括され、そして比較される。収率は、消費グルコース量（ｇｒ／ｌ）によって除された生産乳酸量（ｇｒ／ｌ）である。遊離乳酸パーセントは、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式：ｐＨ＝ｐＫa＋ｌｏｇ［（乳酸％）／（遊離乳酸％）］から得られ、この場合、乳酸のｐＫaは３．８６である。
【０１８７】
表３Ａと表３Ｂにおいて報告されたデータの比較により、異なる酵母の属において、グルコースにおいて、より高い収率をもつ乳酸生産は、ＬＤＨとＰＤＣ活性の相対比率−細胞レベルにおいて−を変化することによって得ることができることが、明らかに分かる。そのような結論は、次のような少なくとも２種の異なるアプローチ：（１）ＰＤＣ活性を低下させること（形質転換Ｋ．ラクチス宿主：ＰＭ６−７Ａ対ＰＭＩ／Ｃ１からのデータを比較する；形質転換Ｓ．セレビシエ宿主：ＧＲＦ１８Ｕ対ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２、そしてＣＥＮＰＫ１１３対ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６からのデータを比較する）、（２）ＬＤＨ遺伝子コピー数と、したがってＬＤＨ活性を増加すること（Ｓ．セレビシエ宿主：ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］対ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］からのデータを比較する；２つの菌株におけるＬＤＨ非相同の活性は、それぞれ５〜６および７〜８Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇ）、によって得ることができる。
【０１８８】
さらに、より高い収率は、増殖培地の組成を操作することによって得ることができる。また、この場合には、低いエタノール生産が観察された（また表４参照）。
【０１８９】
【表９】
【０１９０】
【表１０】
【０１９１】
【表１１】
【０１９２】
操作された無機質培地において増殖するサッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］に関する実験データ（表４） サッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］形質転換細胞による乳酸生産が、また、合成培地において細胞を増殖して実施された（Ｄ．Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐＨ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｂｕｄｄｉｎｇ ｙｅａｓｔ．Ｒｅｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４２，５３５−５３９，１９９１）。使用された合成培地において、ＭｇおよびＺｎ塩源は、それぞれＭｇＳＯ4（５ｍＭ）およびＺｎＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ（０．０２ｍＭ）である。生産は、他の形質転換サッカロミセス細胞のために前述されたような好気的バッチ培養（グルコース濃度５０ｇｒ／ｌ）において試験された。両ＭｇＳＯ4およびＺｎＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏの欠落は、より高い収率とより高い乳酸生産性を生じた。事実、これらの無機質は、エタノール生産に導く酵素活性のためのコファクターとして要求されるであろう。データは表４に示される。
【０１９３】
【表１２】
【０１９４】
注釈： 対照：完全合成培地（Ｒｅｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４２，５３５−５３９，１９９１；別記）
−Ｍｇ：ＭｇＳＯ4無添加以外は対照と同じ −Ｚｎ：ＺｎＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ無添加以外は対照と同じ 全試験では、最終ｐＨ値は、３．０以下であり、したがって遊離乳酸％は、８８％以上であった。
【０１９５】
ＪＥＮ１遺伝子を過剰発現する酵母細胞による乳酸生産 より良好な乳酸生産とより低いエタノール生産は、乳酸輸送体をコードしているＪＥＮ１遺伝子の過剰発現によって得られた。
【０１９６】
ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］（すなわち、ネガティブコントロール）およびＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＪＥＮ１］が、２％グルコース、０．６７％ＹＮＢｗ／ｖおよび補充物質（すなわち、それぞれ、ロイシン−ヒスチジン１００ｍｇ／ｌおよびロイシン１００ｍｇ／ｌ）を含有する培地において増殖された。
【０１９７】
細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｆｉｓｈｅｒ ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｈａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）により測定された。
【０１９８】
【表１３】
【０１９９】
連続乳酸生産 乳酸の連続的で安定な生産が、形質転換Ｋ．ラクチスＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ２］、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］および形質転換Ｓ．セレビシエＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］両菌株を用いる、古典的なケモスタット培養（新鮮培地のバイオリアクターへの連続流入が、範囲０．０１〜０．３ｈｒ-1の比増殖速度を支持した）の手段によって２週以上にわたって得られた。
【０２００】
フィード・バッチ試験 撹拌タンク発酵槽におけるＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］による乳酸生産 さらに、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］による乳酸生産が、栄養培地（３０ｇ乾物／Ｌ ライトコーンスチープウォーター、Ａ．Ｅ．Ｓｔａｌｅｙ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＩＬ；１０ｇ／Ｌ Ｄｉｆｃｏ酵母エキス、Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ；２００ｍｇ／Ｌ アデニン、５０ｇ／Ｌ グルコース）８リッターを含有する１４リッター撹拌タンク発酵槽における培養によって試験された。発酵槽は、終始３０℃に維持され、４００ｒｐｍで撹拌され、そして２リッター／ｍｉｎで通気された。消泡剤（Ａｎｔｉｆｏｒｍ１５２０，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）が、発泡を制御するために必要に応じて添加された。グルコースは、発酵培地における残濃度約２５〜５０ｇ／Ｌを維持するために必要に応じてフィードされた。制御される場合、ｐＨは、１４．８Ｍ水酸化アンモニウム水溶液の自動添加によって維持された。酸性ｐＨにおける乳酸生産は、次のように試験された：（１）発酵ｐＨが発酵を通じて４．５に制御された。（２）初期発酵ｐＨが、１４．８Ｍ水酸化アンモニウム８０ｍＬが添加されるまで、４．０に制御された。次いで、ｐＨ制御は中止された。（３）初期発酵ｐＨが５．０であり、そして発酵中、中和剤が添加されなかった。結果は表６に示される。経過時間は接種時間以降測定された。濾過により細胞を除去した後得られた発酵からのサンプルは、ＹＳＩ Ｍｏｄｅｌ２７００ Ｓｅｌｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を用いて、グルコースおよびＬ（＋）−乳酸について分析された。ガスクロマトグラフィーによって測定されたエタノールは、いずれの発酵においても検出されなかった。収率および遊離乳酸は、前記のように計算された。発酵のための種菌は、２５０ｍＬ容バッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、アデニン２００ｍｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、グルコース５０ｇ／Ｌ）５０ｍＬにおいて、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］を、培養振盪機（Ｍｏｄｅｌ Ｇ−２４，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）において３０℃、３００ｒｐｍで３０時間前培養することによって調製された。
【０２０１】
同様な結果が、細菌ＬＤＨ遺伝子を用いて得られた（プラスミドｐＥＰＬ４；データ未掲載）。
【０２０２】
【表１４】
【０２０３】
撹拌タンク発酵槽におけるＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］による乳酸生産 さらに、ＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］による乳酸生産が、栄養培地（６．７ｇｒ／ ＹＮＢ／酵母窒素源−Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ、グルコース４５ｇ／Ｌ，２％ｗ／ｖエタノール、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ）０．８リッターを含有する１リッター撹拌タンク発酵槽における培養によって試験された。発酵槽は、終始３０℃に維持され、４００ｒｐｍで撹拌され、そして０．８リッター／ｍｉｎで通気された。消泡剤（Ａｎｔｉｆｏｒｍ１５２０，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）が、発泡を制御するために必要に応じて添加された。形質転換細胞は、最初は、菌体生産のためにエタノールを使用（増殖の最初の５０時間）し、次いで、グルコースをＬ（＋）−乳酸に変換した。ｐＨは、２ＭＫＯＨの自動添加によって４．５に維持された。グルコースは、発酵培地における残濃度約３５〜４５ｇ／Ｌを維持するために必要に応じてフィードされた。
【０２０４】
結果は図９および表７に示される（ケース１）。経過時間は接種時間以降測定された。濾過により細胞を除去した後得られた発酵からのサンプルは、Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ．１９９５（前出）に記載のように標準酵素分析を用いて、グルコース、エタノールおよびＬ（＋）−乳酸について分析された。Ｔ＝５０ｈｒ後、エタノールは、サンプル試験のいずれにおいても検出されなかった。収率および遊離乳酸は、前記のように計算された。
【０２０５】
発酵のための種菌は、２５０ｍＬ容バッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、２％ｗ／ｖエタノール、Ｇ４１８ ２００ｍｇ／ｌ）５０ｍＬにおいて、ＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］を、培養振盪機（Ｍｏｄｅｌ Ｇ−２４，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）において３０℃、３００ｒｐｍで４０時間前培養することによって調製された。
【０２０６】
異なる実験（表７、ケース２）では、始発発酵ｐＨは５．４であり、そして中和剤は、発酵を通じて添加されなかった。
【０２０７】
【表１５】
【０２０８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングが、解糖の流れを乳酸生産の方向へシフトする。
ピルビン酸分岐点における鍵の酵素反応は、次の酵素：（１）：ピルビン酸デカルボキシラーゼ；（２）：アルコールデヒドロゲナーゼ；（３）：アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ；（４）：アセチル−ＣｏＡシンテターゼ；（５）；サイトゾルからミトコンドリアへのアセチル−ＣｏＡシャトル；（６）：ミトコンドリアからサイトゾルへのアセチル−ＣｏＡシャトル；（７）：異種の乳酸デヒドロゲナーゼ；（８）：ピルビン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。補充合成に関与する酵素反応は省略された。
【図２】
プラスミドｐＶＣ１の図。
【図３Ａ】
プラスミドｐＫＳＭＤ８／７の図。
【図３Ｂ】
ｐＫＳＥＸＨ／１６の図。
【図４】
プラスミドｐＥＰＬ２の図。
【図５】
プラスミドｐＬＣ５の図。
【図６】
プラスミドｐＬＡＴ−ＡＤＨの図。
【図７Ａ】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラクチスＰＭ６−７ａ［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。Ｔ＝４９における残グルコース濃度は検出されなかった。Ｄ（−）−乳酸の生産も、また検出されなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）ＬＤＨを用いて得られた（データ未掲載）。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。
【図７Ｂ】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラクチスＰＭ６−７ａ［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。培地は、２００ｍＭリン酸バッファーを用いて、時間Ｔ＝０において緩衝化された（ｐＨ＝５．６）。このテキストバッチでは、ｐＨ値は、図７Ａに示したテキストバッチにおけるよりも、ずっと遅く低下する。Ｔ＝４９における残グルコース濃度は検出されなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイＬＤＨを用いて得られた（データ未掲載）。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。
【図８Ａ】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラクチスＰＭ１／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。Ｔ＝６０における残グルコース濃度は、１２，０１ｇ／ｌであった。より長い培養時間は、菌体およびＬ（＋）−乳酸両方のより高い生産をもたらさなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）ＬＤＨを用いて得られた（データ未掲載）。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。
【図８Ｂ】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラクチスＰＭ１／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。培地は、２００ｍＭリン酸バッファーを用いて、時間Ｔ＝０において緩衝化された（ｐＨ＝５．６）。このテキストバッチでは、ｐＨ値は、図８Ａに示したテキストバッチにおけるよりも、ずっと遅く低下する。Ｔ＝８７における残グルコース濃度はゼロであった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ 同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイＬＤＨを用いて得られた（データ未掲載）。
【図９Ａ】
撹拌タンクバイオリアクター（またテキスト参照）における形質転換クルイベロミセスＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］細胞からのＬ（＋）−乳酸生産。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）グルコース濃度、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。
【図９Ｂ】
撹拌タンクバイオリアクターにおける形質転換クルイベロミセスＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］細胞からのＬ（＋）−乳酸収率。
グルコース対乳酸生産。収率（ｇ／ｇ）は８５．４６％であった。
【図１０】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換トルラスポラ（異名チゴサッカロミセス）・デルブルッキイＣＢＳ８１７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］からのＬ（＋）−乳酸生産。Ｔ＝１３０における残グルコース濃度は、３ｇ／ｌであった。より長い培養時間は、菌体およびＬ（＋）−乳酸両方のより高い生産をもたらさなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って０．５Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ
【図１１】
Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換チゴサッカロミセス・バイリイＡＴＣＣ６０４８３［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］からのＬ（＋）−乳酸生産。Ｔ＝６０における残グルコース濃度は、８ｇ／ｌであった。より長い培養時間は、菌体およびＬ（＋）−乳酸両方のより高い生産をもたらさなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って０．５Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。同様な結果が、異なる菌株を用いて得られた（ＡＴＣＣ３６９４７，データ未掲載）。
（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 エタノール生産能を欠いているか、または同じ菌株の野生型酵母に較べて低いエタノール生産能をもち、そして酵母において乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列が機能的に結合した該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株。
【請求項２】 同じ菌株の野生型酵母に較べて約６０％未満であるエタノール生産能をもつ、請求項１記載の酵母菌株。
【請求項３】 低いピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／または低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性、ならびに乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードしている核酸配列の少なくとも１個のコピーをもつ、請求項１もしくは２記載の酵母菌株。
【請求項４】 低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性をもつ、請求項３記載の酵母菌株。
【請求項５】 低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性をもつ、請求項３記載の酵母菌株。
【請求項６】 低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性と低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性とももつ、請求項３記載の酵母菌株。
【請求項７】 ピルビン酸デカルボキシラーゼもしくはピルビン酸デヒドロゲナーゼ、または両方をコードしている遺伝子もしくは遺伝子群が、選択マーカーによる欠失もしくは挿入によって破壊されている、請求項１〜６のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項８】 選択マーカーがＵＲＡ３マーカーである、請求項７記載の酵母菌株。
【請求項９】 選択マーカーが、サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３マーカーである、請求項８記載の酵母菌株。
【請求項１０】 選択マーカーが、毒性化合物に対する耐性をコードしている優性マーカーである、請求項７記載の酵母菌株。
【請求項１１】 サッカロミセス、クルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種から選ばれる、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項１２】 サッカロミセス・セレビシエの菌株である、請求項１１記載の酵母菌株。
【請求項１３】 クルイベロミセス・ラクチスの菌株である、請求項１１記載の酵母菌株。
【請求項１４】 トルラスポラ・デルブルッキイの菌株である、請求項１１記載の酵母菌株。
【請求項１５】 チゴサッカロミセス・バイリイの菌株である、請求項１１記載の酵母菌株。
【請求項１６】 クルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種から選ばれる酵母菌株であって、該酵母において乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株。
【請求項１７】 ウシ乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子により形質転換された、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項１８】 細菌乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子により形質転換された、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項１９】 乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子が酵母ゲノムに組み込まれる、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項２０】 プロモーター配列および該プロモーター配列の制御下の乳酸デヒドロゲナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含有する発現ベクターによって形質転換された、請求項１〜１９のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項２１】 プロモーター配列がピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２０記載の酵母菌株。
【請求項２２】 プロモーター配列が、クルイベロミセス・ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２１記載の酵母菌株。
【請求項２３】 乳酸輸送体を過剰発現する、上記請求項のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項２４】 乳酸輸送体がＪＥＮ１である、請求項２３記載の酵母菌株。
【請求項２５】 ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターに機能的に結合された乳酸デヒドロゲナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含有するベクター。
【請求項２６】 プロモーター配列が、クルイベロミセス・ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２５記載のベクター。
【請求項２７】 プロモーター配列が、クルイベロミセス・ラクチス・ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２６記載のベクター。
【請求項２８】 炭素源を含有する発酵培地における請求項１〜２４の組み換え酵母菌株の増殖、および発酵培地からの乳酸の回収を含む、乳酸の製造方法。
【請求項２９】 炭素源が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、スクロース、ラフィノース、マルトース、セロビオース、アラビノース、キシロースの１種以上から選ばれる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】 発酵培地が、Ｍｇ++５ｍＭ未満および／またはＺｎ++０．０２ｍＭ未満を含有する、請求項２８もしくは２９記載の乳酸の製造方法。
【請求項３１】 発酵培地がｐＨ７以下をもつ、請求項２８〜３０記載の方法。
【請求項３２】 ｐＨが４．５以下である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】 ｐＨが３以下である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】 Ｄ−もしくはＬ−乳酸または２種の混合物の製造のための請求項２８記載の方法。
【請求項１】 エタノール生産能を欠いているか、または同じ菌株の野生型酵母に較べて低いエタノール生産能をもち、そして酵母において乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列が機能的に結合した該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株。
【請求項２】 同じ菌株の野生型酵母に較べて約６０％未満であるエタノール生産能をもつ、請求項１記載の酵母菌株。
【請求項３】 低いピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／または低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性、ならびに乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードしている核酸配列の少なくとも１個のコピーをもつ、請求項１もしくは２記載の酵母菌株。
【請求項４】 低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性をもつ、請求項３記載の酵母菌株。
【請求項５】 低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性をもつ、請求項３記載の酵母菌株。
【請求項６】 低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性と低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性とももつ、請求項３記載の酵母菌株。
【請求項７】 ピルビン酸デカルボキシラーゼもしくはピルビン酸デヒドロゲナーゼ、または両方をコードしている遺伝子もしくは遺伝子群が、選択マーカーによる欠失もしくは挿入によって破壊されている、請求項１〜６のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項８】 選択マーカーがＵＲＡ３マーカーである、請求項７記載の酵母菌株。
【請求項９】 選択マーカーが、サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３マーカーである、請求項８記載の酵母菌株。
【請求項１０】 選択マーカーが、毒性化合物に対する耐性をコードしている優性マーカーである、請求項７記載の酵母菌株。
【請求項１１】 サッカロミセス、クルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種から選ばれる、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項１２】 サッカロミセス・セレビシエの菌株である、請求項１１記載の酵母菌株。
【請求項１３】 クルイベロミセス・ラクチスの菌株である、請求項１１記載の酵母菌株。
【請求項１４】 トルラスポラ・デルブルッキイの菌株である、請求項１１記載の酵母菌株。
【請求項１５】 チゴサッカロミセス・バイリイの菌株である、請求項１１記載の酵母菌株。
【請求項１６】 クルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種から選ばれる酵母菌株であって、該酵母において乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株。
【請求項１７】 ウシ乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子により形質転換された、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項１８】 細菌乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子により形質転換された、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項１９】 乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子が酵母ゲノムに組み込まれる、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項２０】 プロモーター配列および該プロモーター配列の制御下の乳酸デヒドロゲナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含有する発現ベクターによって形質転換された、請求項１〜１９のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項２１】 プロモーター配列がピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２０記載の酵母菌株。
【請求項２２】 プロモーター配列が、クルイベロミセス・ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２１記載の酵母菌株。
【請求項２３】 乳酸輸送体を過剰発現する、上記請求項のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項２４】 乳酸輸送体がＪＥＮ１である、請求項２３記載の酵母菌株。
【請求項２５】 ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターに機能的に結合された乳酸デヒドロゲナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含有するベクター。
【請求項２６】 プロモーター配列が、クルイベロミセス・ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２５記載のベクター。
【請求項２７】 プロモーター配列が、クルイベロミセス・ラクチス・ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２６記載のベクター。
【請求項２８】 炭素源を含有する発酵培地における請求項１〜２４の組み換え酵母菌株の増殖、および発酵培地からの乳酸の回収を含む、乳酸の製造方法。
【請求項２９】 炭素源が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、スクロース、ラフィノース、マルトース、セロビオース、アラビノース、キシロースの１種以上から選ばれる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】 発酵培地が、Ｍｇ++５ｍＭ未満および／またはＺｎ++０．０２ｍＭ未満を含有する、請求項２８もしくは２９記載の乳酸の製造方法。
【請求項３１】 発酵培地がｐＨ７以下をもつ、請求項２８〜３０記載の方法。
【請求項３２】 ｐＨが４．５以下である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】 ｐＨが３以下である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】 Ｄ−もしくはＬ−乳酸または２種の混合物の製造のための請求項２８記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００１−５１６５８４（Ｐ２００１−５１６５８４Ａ）
【公表日】平成１３年１０月２日（２００１．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０００−５１１８７３（Ｐ２０００−５１１８７３）
【出願日】平成１０年９月１１日（１９９８．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５７５８
【国際公開番号】ＷＯ９９／１４３３５
【国際公開日】平成１１年３月２５日（１９９９．３．２５）
【出願人】
【氏名又は名称】エイ・イー・スタリー・マニユフアクチヤリング・カンパニー
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１３年１０月２日（２００１．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１０年９月１１日（１９９８．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５７５８
【国際公開番号】ＷＯ９９／１４３３５
【国際公開日】平成１１年３月２５日（１９９９．３．２５）
【出願人】
【氏名又は名称】エイ・イー・スタリー・マニユフアクチヤリング・カンパニー
【Ｆターム（参考）】
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