二量体及び多量体ＦＶＩＩａ化合物
本発明はＦＶＩＩａポリペプチドの本来備わっている触媒活性を保持するように、少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合で接続される二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、新規なＦＶＩＩａ化合物、それらの合成方法、新規な化合物を含有する医薬組成物、加えて凝固障害の治療におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
血液凝固第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）は、止血の重要な開始因子である。該因子は機能的な循環半減期が約１−３時間である５０ｋＤａの血漿タンパク質である。チモーゲンであるＦＶＩＩは触媒として不活性な単鎖タンパク質であって、内部のＡｒｇ１５２-Ｉｌｅ１５３ペプチド結合の切断により触媒として活性な二本鎖チモーゲンＦＶＩＩａへ変換される。ＦＶＩＩａは、凝血因子欠乏または凝血因子阻害剤によって生じる多様な凝固障害の治療のための治療用タンパク質として広く使われている。また、ＦＶＩＩａは正常に機能する血液凝固カスケードで患者に起こった過度の出血を制御するためにも用いられている。このような出血は、外科手術中や組織障害の他の病状に加えて、例えば欠陥のある血小板機能、血小板減少症、フォンウィルブランド病によっても引き起こされることがある。
【０００３】
ＦＶＩＩａの治療適用の多くで、天然ＦＶＩＩａに対する改良された特性を有するＦＶＩＩａ変異体を使用して治療を行うことが望ましい。増強された生物学的活性を有するＦＶＩＩａ変異体が望ましい分野の一つは、ＦＶＩＩａの効果が最適状態に及ばないために、従来のｒＦＶＩＩａに部分的にまたは完全に難治性の制御されない出血の治療である。現在、これらのいわゆるスーパーアクティブＦＶＩＩａ変異体は、それらの作用機序によって２つのクラスに分けることができる。１つのグループは、触媒能のある状態に向かってタンパク質の高次構造上の平衡をシフトさせることにより生じた上昇したタンパク質分解活性を有する変異体を含む。例えば、Persson等(2001a)、(2001b)、(2002)、(2004) 及び Soejima等(2002)を参照。他方のグループは、主に、アニオン性リン脂質膜に対し上昇した親和性を呈する最適化されたＧＬＡドメインを有する変異体である（Shah等(1998)、Nelsestuen等(2001) 及び Harvey等(2003))。上昇したリン脂質結合性が、血管損傷部位で、活性化された血小板膜上にＦＶＩＩａを局所化して集中させるのに役立ち、それによって止血を促進していると考えられている。
【０００４】
例えばＰＥＧ化または脂質連結などの共有結合による修飾は、いくつかのタンパク質を基礎とする薬剤学に成功裏に適用され、それらの薬物動態学的および薬力学的プロファイルを改善している。天然または改変されたシステイン結合は、タンパク質の表面、特に細胞によって分泌されたものの表面上にこのアミノ酸が稀であることと、加えてチオールカップリング化学剤の高い選択性のおかげで、部位特異的修飾の魅力的な手段を提供する。天然ＦＶＩＩａにおける遊離チオールの欠如は、循環半減期の延長が改変された溶媒-露出性システインの修飾、例えばＰＥＧ化によって達成できるかもしれないという提案を導いている（例えば、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１およびＷＯ０１／５８９３５Ａ２を参照）。
【０００５】
したがって、ＷＯ０１／５８９３５Ａ２は、非ポリペプチド部分とのＦＶＩＩａコンジュゲートおよびそれらの調製法を開示する。とりわけ、非ポリペプチド部分が１つのシステインを介してＦＶＩＩａポリペプチドに結合することが示唆されている。同様に、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１は、化学基とのＦＶＩＩａポリペプチドコンジュゲートおよびそれらの調製法を開示している。とりわけ、化学基が１つのシステインを介してＦＶＩＩａポリペプチドに結合することが示唆されている。
【０００６】
しかしながら、実際にはこの方法が薬物動態学的および薬力学的プロファイルの最適な適合、例えば高い活性や延長された循環半減期などを有するＦＶＩＩａ化合物を必ずしも保証するというわけではない。
【０００７】
したがって、製造、取扱、及び製剤に関する許容可能な生理化学的特性と同様に、高い特異的活性、延長された血漿半減期を呈する改良されたＦＶＩＩａ化合物が必要である。
【０００８】
ＷＯ０３/０７６４６１は二量体組織因子アンタゴニストと、例えば血管性疾患および炎症性疾患の治療におけるそれらの使用を開示する。
【０００９】
ＳＥ９５０１２８５Ａは、タンパク質ジスルフィド酸化還元酵素（例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ））、グルタレドキシンおよび酸化還元バッファーの混合液を使った、適正に折り畳まれた生物学的に活性なジスルフィド架橋結合タンパク質の生体外産生方法を開示する。この文献は、分子内ジスルフィド結合に含まれるシステインに焦点を置いている。
【００１０】
（発明の概要）
既知のＦＶＩＩａ化合物の上記の限界を克服するために、本発明は、ここで、ＦＶＩＩａポリペプチドの本来備わっている触媒活性を保持するために、少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合により連結して成る二量体および多量体ＦＶＩＩａ化合物を提供する。驚くべきことに、そのようなＦＶＩＩａ化合物はスーパー活性を示し、これは２つ以上のＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合により連結される時に結合活性効果が起こり、結果として増強した膜親和性が呈されると考えられている。
【００１１】
一態様では、本発明は、２つのＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合で連結し二量体ＦＶＩＩａ化合物を形成して、ＦＶＩＩａ化合物を提供する。一実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、前記ＦＶＩＩａポリペプチドの改変されたシステインを介して共有結合により連結される。別の実施態様では、２つの同一のＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合により連結され、二量体ＦＶＩＩａ化合物を形成する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、構成要素ＦＶＩＩａポリペプチド間にリンカーを含有する二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物を提供する。
【００１３】
「本来備わっている触媒活性を保持する」なる用語は、二量体または多量体ＦＶＩＩａポリペプチドが、構成要素のＦＶＩＩａポリペプチドと実質的に同等（例えば、本願明細書において開示される分析による測定で、活性部位濃度が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％）のペプチド分解活性を有する特性を指す。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、上記のように、ＦＶＩＩａポリペプチドの本来備わっている触媒活性を保持するために、少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合で連結された二量体および多量体ＦＶＩＩａ化合物を提供する。一実施態様において、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、本願明細書において開示される分析で測定されるように（参照、実施例１）、構成要素のＦＶＩＩａポリペプチドの活性部位濃度の少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%の活性部位濃度を有する。別の実施態様では、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、構成要素のＦＶＩＩａポリペプチドの生物学的活性と比較して増強した生物学的活性を有する。
【００１５】
本発明の好ましい態様において、２つのＦＶＩＩａポリペプチドは共有結合で連結し、二量体ＦＶＩＩａ化合物を形成する。したがって、二量体ＦＶＩＩａは、通常約１００ｋＤａより大きい分子量を有する。
【００１６】
別の態様において、本発明はＦＶＩＩａポリペプチドの本来備わっている触媒活性を保持するために、例えば少なくとも３つのＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合で連結して成る多量体ＦＶＩＩａ化合物を提供する。
【００１７】
ＦＶＩＩａポリペプチド
多数の異なるＦＶＩＩａポリペプチドは、本発明に従って共有結合で連結され、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物を形成してもよい。
【００１８】
本願明細書において使用する「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」または「ＦＶＩＩポリペプチド」なる用語は、不活性な一本鎖チモーゲン第ＶＩＩ因子分子およびその変異体を意味する。一本鎖チモーゲン第ＶＩＩ因子は４０６のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、そのうちの１０はγ-カルボキシル化グルタミン酸残基、Ｎ-グリコシル化アスパラギン残基（番号１４５および番号３２２）、５２と６０の位置のＯ-グリコシル化セリン残基である。ＦＶＩＩ変異体の型は、一つ以上のアミノ酸が置換、付加、または欠失している分子、ＧＬＡ残基の数が異なる分子、修飾されたまたは不完全なグリコシル化パターンを有する分子を含む。アミノ酸残基の修飾の非制限的な例は、アミド化、アルキル化、アシル化およびＰＥＧ化である。
【００１９】
本願明細書で使用する「第ＶＩＩａ因子ポリペプチド」または「ＦＶＩＩａポリペプチド」なる用語は、活性な２本鎖のＦＶＩＩａおよびその変異体を意味する。２本鎖のＦＶＩＩａは、ＦＶＩＩのＡｒｇ１５２-Ｉｌｅ１５３ペプチド結合の加水分解によって、ＦＶＩＩから産生されるポリペプチドである。ＦＶＩＩａも、また４０６のアミノ酸残基を含み、そのうちの１０はγ-カルボキシル化グルタミン酸残基、Ｎ-グリコシル化アスパラギン残基（番号１４５および番号３２２）、５２と６０の位置のＯ-グリコシル化セリン残基である。ＦＶＩＩａ変異体の型には、一つ以上のアミノ酸が置換、付加、または欠失している分子、ＧＬＡ残基の数が異なる分子、修飾されたまたは不完全なグリコシル化パターンを有する分子を含む。
【００２０】
本願明細書で使用する「ＧＬＡ」なる用語は、４-カルボキシグルタミン酸（γ-カルボキシグルタメート）を意味する。
【００２１】
本願明細書で使用する「ポリペプチド」なる用語は、共有結合でポリペプチド結合によって連結する少なくとも５つの構成要素アミノ酸残基を含んでなる化合物を意味する。構成要素アミノ酸が遺伝コードによってコードされるアミノ酸のグループに由来してもよく、遺伝コードによってコードされていない天然アミノ酸であってもよく、加えて合成アミノ酸でもよい。遺伝コードによってコードされていない天然アミノ酸は、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキ-シグルタミン酸、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ-アラニン、Ｄ-グルタミン酸である。合成アミノ酸は、有機合成によって製造されるアミノ酸、例えば遺伝コードによってコードされるアミノ酸のＤ-異性体およびＡｉｂ（α-アミノイソ酪酸）、Ａｂｕ（α-アミノ酪酸）、Ｔｌｅ（tert-ブチルグリシン）およびβ-アラニンを含む。ポリペプチドは、一本鎖であるＦＶＩＩおよび二本鎖がジスルフィド結合によって連結したＦＶＩＩａのように、単一のペプチド鎖を含んでもよく、または複数のポリペプチド鎖を含んでもよい。
【００２２】
本願明細書で使用する「第ＶＩＩａ因子誘導体」または「ＦＶＩＩａ誘導体」なる用語は、例えばアルキル化、グリコシル化、脱グリコシル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成またはアミド形成等々によって、親ペプチドの一つ以上のアミノ酸が遺伝的におよび／または化学的におよび／または酵素的に修飾された、野生型の第ＶＩＩａ因子と比較して実質的に同等か改良された生物学的活性を呈するＦＶＩＩａポリペプチドを示す。これは、ＰＥＧ化第ＶＩＩａ因子、システイン-ＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子およびその変異体を含むが、これに限定されるものではない。
【００２３】
「ＰＥＧ化第ＶＩＩａ因子」等の用語は、ＰＥＧ分子が結合した第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを意味する。ＰＥＧ分子が、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基または糖鎖を含む任意の部分に付加できることが分かっている。「システイン-ＰＥＧ化第ＶＩＩａ因子」なる用語は、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの非天然システインのスルフヒドリル基に結合するＰＥＧ分子を有する第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを意味する。
【００２４】
ＦＶＩＩａ誘導体の非制限的な例は、ＷＯ０３／３１４６４および米国特許出願ＵＳ２００４００４３４４６、ＵＳ２００４００６３９１１、ＵＳ２００４０１４２８５６、ＵＳ２００４０１３７５５７、およびＵＳ２００４０１３２６４０（Neose Technologies社）に記載されているような糖・ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ誘導体と、ＷＯ０１／０４２８７、ＵＳ２００３０１６５９９６、ＷＯ０１／５８９３５、ＷＯ０３／９３４６５（マキシジェンApS社）およびＷＯ０２／０２７６４、ＵＳ２００３０２１１０９４（ミネソタ大学））に記載されているようなＦＶＩＩａコンジュゲートを含む。
【００２５】
「改良された生物学的活性」なる用語は、ｉ)組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同程度あるいは増加したタンパク分解活性を有するＦＶＩＩａポリペプチドを、またはｉｉ)組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同程度あるいは増加したＴＦ結合活性を有するＦＶＩＩａポリペプチドを、またはｉｉｉ)組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同程度あるいは増加した血漿半減期を有するＦＶＩＩａポリペプチドを指す。
【００２６】
「ＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子」なる用語は、ヒト第ＶＩＩａ因子ポリペプチドに結合したＰＥＧ分子を有するヒト第ＶＩＩａ因子を意味する。ＰＥＧ分子が、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基または糖鎖を含む任意の部分に付加できることが分かっている。「システイン-ＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子」なる用語は、ヒト第ＶＩＩａ因子に導入したシステインのスルフヒドリル基に結合するＰＥＧ分子を有する第ＶＩＩａ因子を意味する。
【００２７】
組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同程度あるいは増加したタンパク分解活性を有する第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの非制限的な例は、Ｓ５２Ａ-ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ-ＦＶＩＩａ ( Lino等、Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192、1998);米国特許第５５８０５６０号にて開示されているタンパク分解の安定性が増加したＦＶＩＩａ変異体；残基２９０と２９１の間で、または残基３１５と３１６の間でタンパク質加水分解で切断されている第ＶＩＩａ因子(Mollerup等, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；酸化型第ＶＩＩａ因子（Kornfelt等, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９（ＷＯ０２／０７７２１８に対応）にて開示されているＦＶＩＩａ変異体；ＷＯ０２／３８１６２（スクリップス研究所）にて開示されているタンパク分解の安定性が増加したＦＶＩＩａ変異体；ＷＯ９９／２０７６７、米国特許第６０１７８８２号および第６７４７００３号、ＵＳ２００３０１００５０６ (ミネソタ大学) およびＷＯ００／６６７５３、ＵＳ２００１００１８４１４、ＵＳ２００４２２０１０６、およびＵＳ２００１３１００５、米国特許第６７６２２８６号および第６６９３０７５号(ミネソタ大学)にて開示されている修飾されたＧｌａ-ドメインを有し増強された膜結合を呈するＦＶＩＩａ変異体；ＷＯ０１／５８９３５、米国特許第６８０６０６３号、ＵＳ２００３００９６３３８(マキシジェンApS社)、ＷＯ０３／９３４６５(マキシジェンApS社)、ＷＯ０４／０２９０９１(マキシジェンApS社)、ＷＯ０４／０８３３６１(マキシジェンApS社)、およびＷＯ０４／１１１２４２(マキシジェンApS社)、加えてＷＯ０４／１０８７６３(カナダ血液サービス)で開示されているＦＶＩＩａ変異体を含む。
【００２８】
野生型ヒトＦＶＩＩａと比較して、増加した生物学的活性を有するＦＶＩＩａポリペプチドの非制限的な例は、ＷＯ０１／８３７２５、ＷＯ０２／２２７７６、ＷＯ０２／０７７２１８、ＰＣＴ／ＤＫ０２／００６３５（ＷＯ０３／０２７１４７に対応する）、デンマーク特許出願ＰＡ２００２０１４２３（ＷＯ０４／０２９０９０に対応する）、デンマーク特許出願ＰＡ２００１０１６２７（ＷＯ０３／０２７１４７に対応する）にて開示されているＦＶＩＩａ変異体；ＷＯ０２／３８１６２（スクリップス研究所）；およびＪＰ２００１０６１４７９(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)にて開示されている、増強された活性を有するＦＶＩＩａ変異体を含む。
【００２９】
興味深い「改変された」ＦＶＩＩａポリペプチドの特異的な具体例は、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１（ノボ・ノルディスクA/S社）およびＷＯ０１／５８９３５Ａ２（マキシジェンApS社）の２１-２４ページにおいて開示されている第ＶＩＩａ因子ポリペプチドである。
【００３０】
特に興味深いのは、システイン残基が導入されたＦＶＩＩａポリペプチドである。システイン残基が導入される部位の例は、タンパク分解性が低下する部位かまたはその周辺を含むが、これに限定されるものではない。このように、本発明の興味深い実施態様において、好ましくは置換によって、導入されるシステイン残基は、Ｉ３０Ｃ、Ｋ３２Ｃ、Ｄ３３Ｃ、Ａ３４Ｃ、Ｔ３７Ｃ、Ｋ３８Ｃ、Ｗ４１Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｓ４５Ｃ、Ｄ４６Ｃ、Ｌ１４１Ｃ、Ｅ１４２Ｃ、Ｋ１４３Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、Ｌ２８８Ｃ、Ｄ２８９Ｃ、Ｒ２９０Ｃ、Ｇ２９１Ｃ、Ａ２９２Ｃ、Ｓ３１４Ｃ、Ｒ３１５Ｃ、Ｋ３１６Ｃ、Ｖ３１７Ｃ、Ｌ３９０Ｃ、Ｍ３９１Ｃ、Ｒ３９２Ｃ、Ｓ３９３Ｃ、Ｅ３９４Ｃ、Ｐ３９５Ｃ、Ｒ３９６Ｃ、Ｐ３９７Ｃ、Ｇ３９８Ｃ、Ｖ３９９Ｃ、Ｌ４０１Ｃ、Ｒ４０２Ｃ、Ａ４０３Ｃ、Ｐ４０４Ｃおよびその組合せからなる群から選択され、そして特にＫ３２Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｋ１４３Ｃ、Ｒ２９０Ｃ、Ｒ３１５Ｃ、Ｋ３４１Ｃ、Ｒ３９２Ｃ、Ｒ３９６Ｃ、Ｒ４０２Ｃおよびその組合せから成る群から選択される。本発明の更なる興味深い実施態様において、システイン残基は、野生型ｈＦＶＩＩにおいて、少なくともその側鎖の２５％が表面にさらさているスレオニンまたはセリン残基によって占められる位置に導入される。例えば、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドにおいて、好ましくは置換によって、導入されるシステイン残基は、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｔ２３３、Ｔ２３８、Ｔ２３９、Ｔ２５５、Ｔ２６７、Ｔ２９３、Ｔ３０７、Ｓ３２０、Ｔ３２４、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＳ３９３からなる群から選択される少なくとも一つの位置に導入される。さらにより好ましくは、システイン残基はＳ残基を含むヒトｈＦＶＩＩの少なくとも一つの位置に導入され、その位置はＳ１２、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３からなる群から選択される。本発明の更なる興味深い実施態様において、システイン残基は、野生型ｈＦＶＩＩにおいて、少なくともその側鎖の５０％が表面にさらされているスレオニンまたはセリン残基によって占められる位置に導入される。例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドにおいて、好ましくは置換によって、導入されるシステイン残基は、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｔ２３８、Ｔ２６７およびＴ２９３からなる群から選択される少なくとも一つの位置に導入され、さらにより好ましくは、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７およびＳ２１４からなる群から選択される位置である。より更なる実施態様において、システイン残基は上記の位置のいずれかから選ばれる少なくとも一つの位置に導入され、それは活性部位領域ではない。好ましくは、該位置はＴ残基またはＳ残基によって占められている。例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｔ２５５、Ｔ２６７、Ｔ３０７、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＳ３９３（その側鎖の２５％以上が表面にさらされている）からなる群から選択される少なくとも一つの位置に導入されるシステイン残基を含んで成り、特に、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１ １９、Ｓ １２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３（Ｓ残基によって占められている）、より好ましくはＳ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４およびＴ２６７（その側鎖の５０％以上が表面にさらされている）からなる群から選択され、特にＳ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７およびＳ２１４（Ｓ残基によって占められている）からなる群から選択される。より更なる実施態様において、システイン残基は上記リストのいずれかから選ばれる少なくとも一つの位置に導入され、それは組織因子結合部位領域ではない。好ましくは、該位置はＴ残基またはＳ残基によって占められている。例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｔ２３３、Ｔ２３８、Ｔ２３９、Ｔ２５５、Ｔ２６７、Ｔ２９３、Ｓ３２０、Ｔ３２４、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＳ３９３（その２５％以上が表面にさらされる側鎖を有する）からなる群から選択される少なくとも一つの位置に導入されるシステイン残基を含んで成り、特にＳ１２、Ｓ２３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３（Ｓ残基によって占められている）からなる群から選択され、より好ましくはＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｔ２３８、Ｔ２６７およびＴ２９３（その側鎖の５０％以上が表面にさらされている）からなる群から選択され、特にＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７およびＳ２１４（Ｓ残基によって占められている）からなる群から選択される。より更なる実施態様において、システイン残基が少なくとも上記リストのいずれかから選ばれる少なくとも１つの位置に導入され、それは組織因子結合部位領域あるいは活性部位領域のどちらにも位置しない。好ましくは、該位置はＴ残基またはＳ残基によって占められている。例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｔ２５５、Ｔ２６７、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＳ３９３（その側鎖の２５％以上が表面にさらされている）からなる群から選択される少なくとも一つの位置に導入されるシステイン残基を含んで成り、特にＳ１２、Ｓ２３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３（Ｓ残基によって占められている）からなる群から選択されて、より好ましくはＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４およびＴ２６７（その側鎖の５０％以上が表面にさらされている）からなる群から選択され、特にＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７およびＳ２１４（Ｓ残基によって占められている）からなる群から選択される。
【００３１】
第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの他の有用な例は、２４７−２６０、３９３−４０５または４０６、特にＲ３９６、Ｑ２５０またはＰ４０６またはＫ１５７、Ｖ１５８、Ｍ２９８、Ｌ３０５、Ｄ３３４、Ｓ３３６、Ｋ３３７またはＦ３７４から選択される位置のアミノ酸がシステインによって置換されているかまたはシステインが端末に導入されたもの（例えばＦＶＩＩａ４０７Ｃ）を含む。
【００３２】
好適な一連の実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＰ４０６Ｃ、ＦＶＩＩａＰ４０６Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ、ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＱ２５０ＣまたはＦＶＩＩａＱ２５０Ｃ変異体である。
【００３３】
別の実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、最適化されたＧＬＡドメインを有するＦＶＩＩａ変異体であり、例えばＹ４（挿入）、Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｄ３３Ｆ、Ｄ３３ＥおよびＡ３４Ｅの組合せである。
【００３４】
さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、本来備わっているタンパク分解活性が増加されたＦＶＩＩａ変異体であり、例えばＭ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑおよびそれらの４０７Ｃ変異体からなる群から選択される置換を含む。
【００３５】
さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、ＦＶＩＩａ変異体であり、Ｌ３０５Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ１５７Ａ、Ｅ２９６Ｖ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ、Ｓ３３６Ｇ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａおよびそれらの４０７Ｃ変異体から成る群から選択される置換を含む。
【００３６】
さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドはＰＥＧ化である。ＰＥＧ化が二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の形成前に実施できること、または二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の形成後に実施できることが分かっている。
【００３７】
さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａ化合物は、２つのＦＶＩＩａポリペプチドを含む二量体である。さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａ化合物は、３つのＦＶＩＩａポリペプチドを含む三量体である。さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａ化合物は、４つのＦＶＩＩａポリペプチドを含む四量体である。
【００３８】
二量体および多量体ＦＶＩＩａ化合物
一連のカップリング剤を、リンカー部分を任意に含んでもよい二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物を産生するために使用できる。
【００３９】
好ましい実施態様において、共有結合で連結し二量体または多量体ＦＶＩＩａを形成するＦＶＩＩａ化合物は同一のＦＶＩＩａポリペプチドである。別の実施態様において、共有結合で連結し二量体または多量体ＦＶＩＩａを形成するＦＶＩＩａ化合物は２つの異なるＦＶＩＩａポリペプチドである。
【００４０】
特に好適な実施態様において、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、前記ＦＶＩＩａポリペプチドの改変されたシステインを介して共有結合で連結される少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドを含む。システインを介して連結されるＦＶＩＩａポリペプチドから成る該二量体または多量体の合成には、下記に開示する選択的に還元したＦＶＩＩａポリペプチドを産生する方法が有用である。別の実施態様において、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、構成要素ＦＶＩＩａポリペプチド間のリンカーを含む。このようなリンカーの一クラスは、二価のシステイン反応性ＰＥＧを含む反応から生じる構造を有するリンカーである。好適なこのようなリンカーは、マレイミド-ＰＥＧ-マレイミドを含む反応から生じる構造を有する。例えばマレイミド-ＰＥＧ２ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ３.４ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ５ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ１０ｋＤ-マレイミドおよびマレイミド-ＰＥＧ２０ｋＤ-マレイミドである。別の実施態様では、前記リンカーはアミノ酸配列を含む。
【００４１】
さらに別の実施態様において、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、遊離アミンを介して共有結合で連結するＦＶＩＩａポリペプチドを含む。
【００４２】
さらに別の実施態様において、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、天然または改変されたグリカンを介して該ＦＶＩＩａポリペプチドに共有結合で連結するＦＶＩＩａポリペプチドを含む。
【００４３】
さらに別の実施態様において、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、例えばトランスグルタミナーゼまたはソートアーゼによる、酵素で触媒されるカップリング反応から生じる化学構造を介して共有結合で連結する少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドを含む。
【００４４】
二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物が改変されたシステインを介して共有結合で連結するＦＶＩＩａポリペプチドを含む場合において、好適なＦＶＩＩａポリペプチドは、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＰ４０６Ｃ、ＦＶＩＩａＰ４０６Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ、ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＱ２５０Ｃ、およびＦＶＩＩａＱ２５０Ｃ変異体から選択される。
【００４５】
本発明の範囲内には、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物とプロトラクター基（例えば、ヒト血清アルブミンまたはその変異体、ＰＥＧ部分、親油性部分など）の間のコンジュゲートがある。
【００４６】
一般に、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、以下の工程を含む方法によって調製されることが望ましい：
ａ) 前記ＦＶＩＩａポリペプチドの合成および精製;
ｂ) 前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカップリングによる前記化合物の合成;
ｃ) 前記二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の単離。
【００４７】
システインカップリング剤を使用する場合は、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、以下の工程を含む方法によって調製されることが望ましい：
ａ) 前記ＦＶＩＩａポリペプチドの合成および精製;
ｂ) 連結されるＦＶＩＩａポリペプチド上のシステイン残基の選択還元;
ｃ) 活性リンカーの存在下で、前記ＦＶＩＩａポリペプチドと還元されたシステイン残基のカップリングによる前記二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の合成;
ｄ) 前記二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の単離。
【００４８】
この方法の好ましい実施態様において、工程ｂ)は、酸化還元バッファーまたはトリアリールホスフィン還元剤（選択還元の下記のセクションを参照）を伴う反応によるＦＶＩＩａポリペプチド上のシステイン残基の選択還元を含む。
【００４９】
ＦＶＩＩａ単量体の非天然システインの選択還元
上記のように、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物を構成要素ＦＶＩＩａ分子またはＦＶＩＩ分子から非天然システインを介して合成するときは、カップリングの前にＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチドの非天然システインを選択的に還元することが必要であろう。ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩポリペプチドは、通常は低分子量チオール（ＲＳ-Ｃｙｓ）にジスルフィド架橋を介して結合する一つ以上のシステイン部分を含み、該部分はＦＶＩＩａポリペプチドがその活性型である時に、分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に含まれていない。
【００５０】
酸化還元バッファーを使用する選択還元
選択還元の一方法は、低分子量チオール結合ＦＶＩＩａポリペプチドを酸化還元バッファーを含む混合液と反応させる工程を含む。
【００５１】
本願明細書において使われる場合「酸化還元バッファー」なる用語は、ＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチド-低分子量チオール混合ジスルフィド（ＲＳ-Ｃｙｓ）を崩壊させるための十分な還元と同時に、ＦＶＩＩａポリペプチドの天然ジスルフィド結合の完全性を保存するための十分な酸化の比率のチオール/ジスルフィドの酸化還元ペアを意味するものである。
【００５２】
好ましくは、酸化還元バッファーは、低分子量チオール/ジスルフィド酸化還元ペアを含む。「低分子量」なる用語は、酸化還元ペアのチオール型が多くても５００グラム/モルの分子量を有することを意味する。このような酸化還元ペアの具体例は、(i)還元型および酸化型グルタチオン、および(ii)還元型および酸化型γ-グルタミルシステイン、(iii)還元型および酸化型システイニルグリシン、(iv)還元型および酸化型システイン、（v）還元型および酸化型Ｎ-アセチルシステイン、（vi）システアミン、および（vii）ジヒドロリポアミド/リポアミドから選択され、より好ましくは(i)還元型および酸化型グルタチオンから選択される。
【００５３】
最適な酸化還元状態は、当業者に知られているように、および図２、３および４において示されるように、タンパク質の酸化還元滴定を実施することによって推定することができる;Gilbert (1995)も参照。
【００５４】
一実施態様において、酸化還元バッファーは還元型および酸化型グルタチオンの酸化還元ペアであり、還元型グルタチオンの濃度は０−１００ｍＭの範囲であり、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオン間の比率は２−２００の範囲である。
【００５５】
別の実施態様では、酸化還元バッファーは還元型および酸化型グルタチオンの酸化還元ペアであり、還元型グルタチオンの濃度は０−１００ｍＭの範囲であって、例えば０.０１−５０ｍＭであり、酸化型グルタチオンの濃度は０−５ｍＭの範囲であって、例えば０.００１−５ｍＭである。第ＶＩＩ因子ポリペプチドのために、還元型グルタチオンの濃度は好ましくは０−５ｍＭの範囲であって、例えば０.０１−２ｍＭであり、酸化型グルタチオンの濃度は０.００１−２ｍＭの範囲であって、例えば０.００１−０.２００ｍＭである。
【００５６】
グルタチオンおよび他の低分子量チオールが通常、反応速度論的には劣った還元剤／酸化剤であるので、最も好ましくは、チオール/ジスルフィド酸化還元触媒が反応速度を改良するために酸化還元バッファーと組み合わせて混合液に含まれる。
【００５７】
混合液に含まれる適切なチオール/ジスルフィド酸化還元触媒は、ジチオール型およびモノチオール型グルタレドキシンを含む。グルタレドキシンおよびそれらの機能は、概してFernandes等(2004)に記載されている。グルタレドキシンの有用な例は、大腸菌由来のＧｒｘ１、Ｇｒｘ２またはＧｒｘ３ (Holmgren等, 1995)、酵母由来のＧｒｘ１ｐ、Ｇｒｘ２ｐ、Ｇｒｘ３ｐ、Ｇｒｘ４ｐおよびＧｒｘ５ｐ (Luikenhuis 等 1998; Rodriguez-Manzaneque等, 1999; Grant, 2001), ヒト由来のＧｒｘ１およびＧｒｘ２(Padilla等1995; Lundberg等, 2001)およびそれらの変異体から選択されるものである。変異体は、他のアミノ酸、典型的にはセリンと置換されたＣＸＸＣモティーフのＣ末端のシステインがあるジチオール型グルタレドキシンを含むがこれに限定されるものではない（参照、Yang等,1998）。
【００５８】
酸化還元触媒（特にグルタレドキシン）は、好ましくは０.００１−２０μＭの濃度で使用される。
【００５９】
混合液がタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を含まないことが好ましい。
【００６０】
酸化還元バッファーは、塩類、ｐＨバッファー等の他の構成要素を更に含んでもよく、本発明の方法は、問題のＦＶＩＩａタンパク質に適している任意の温度で実施してもよく、例えば−５℃から５０℃の範囲で、０℃から２５℃の範囲の温度であって、当然所与の条件下でタンパク質の安定性に依存する。
【００６１】
トリアリールホスフィン還元剤を使用する選択還元
選択還元のための別の方法は、低分子量チオール結合ＦＶＩＩａタンパク質をトリアリールホスフィン還元剤と反応させることを含む。
【００６２】
「トリアリールホスフィン還元剤」なる用語は、一つ以上の置換基によって任意に置換されるトリアリールホスフィンを意味するものである。
【００６３】
トリアリールホスフィン還元剤のアリール基は、好ましくはフェニル、ナフチル、１,２,３,４-テトラヒドロナフチル、アントラシル、フェナントラシル、ピレニル、ベンゾピレニル、フルオレニルおよびキサンテニル、特にフェニルから選ばれ、現在選択されている実施態様においてアリール基が好ましくは同一である。目下の最も興味深い実施態様において、全３つのアリール基はフェニルである。アリール基に、特にフェニル基に存在する置換基の例は、概してスルホン酸、カルボキシル酸、Ｃ１-６-アルキル、Ｃ１-６-アルコキシ、およびＣ１-６-アルコキシ-Ｃ１-６-アルキル、またはＣ３-６-アルキレン（２つの隣接するアリール炭素原子を有する環を表す）またはＣ２-６-アルキレンオキシ（２つの隣接するアリール炭素原子を有する環を表す）またはＣ１-４-アルキレン-オキシ-Ｃ１-４-アルキレン（２つの隣接するアリール炭素原子を有する環を表す）から選択されるものである。
【００６４】
一実施態様において、少なくとも一つのアリール（例えばフェニル）は、スルホン酸およびカルボキシル酸、特にスルホン酸から選ばれる少なくとも一つの置換基を有する；該置換は好ましくはリン光体原子の結合と比較してメタ位に配置されている。
【００６５】
好ましくは全３つのアリール基はスルホン酸置換基を有し、例えば全３つのアリール基はスルホン酸置換基および更に少なくとも１つの置換基を有し、特に少なくともリン光体原子の結合と比較してパラ位の置換基、特にこのパラ位に酸素置換基を有する。
【００６６】
好適な還元剤のアリール基はリン光体原子の結合と比較してオルト位にいかなる置換基も有しないと現在考えている。
【００６７】
「Ｃ１-６-アルキル」なる用語は、１−６の炭素原子を有する、線形または分枝飽和炭化水素残基を含むことを意味する。特定の例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチルおよびn-ヘキシルである。同様に、「Ｃ１-４アルキル」なる用語は１−４の炭素原子を有する線形または分枝飽和炭化水素残基を含むことを意味する。「Ｃ１-６-アルキレン」、「Ｃ２-６-アルキレン」などの用語は、それぞれ「Ｃ１-６-アルキル」、「Ｃ２-６-アルキル」に対応する二価基をあらわす。
【００６８】
適切なトリアリールホスフィン還元剤は、還元電位および立体障害の間で有用なバランスを有するものである。トリアリールホスフィン還元剤の化学的性質は、タンパク質の天然ジスルフィド結合の完全性を保存すると共に、タンパク質-低分子量チオール混合ジスルフィド（ＲＳ-Ｃｙｓ）を切断するその能力によって記される。現在非常に興味深い化合物は、トリアリールホスフィントリスルホン酸、例えばトリフェニルホスフィン-３,３',３''-トリスルホン酸およびその類似体である。この具体例は、トリアリールホスフィン還元剤はトリフェニルホスフィン-３,３',３''-トリスルホン酸およびその類似体から選択されており、例えば下記の化合物９−１１：
【化１】
の一つから選択される。
【００６９】
トリアリールホスフィン還元剤は、好ましくは０.００１−１００ｍＭ、例えば０.０１−５０ｍＭまたは０.１−２５ｍＭの濃度で使用される。
【００７０】
興味深い一実施態様において、トリアリールホスフィン還元剤は担体に固定される。これは、タンパク質から還元剤の簡単な分離に役立つ。一般に、トリアリールホスフィン還元剤（例えば化合物９−１１）は、当業者にとって知られている方法によって、例えばアリール基のうちの１つにリンカー基を導入することによって固定してもよい。トリアリールホスフィン試料１２は、１のリンク可能な変異体の例である。
【化２】
【００７１】
反応は、典型的には０−４０℃の範囲の温度で、例えば外界温度で、５秒から場合によっては数日の期間の間で行われる。反応後には、その変換を確認するためにＨＰＬＣを後に続けてもよい。適切な溶媒は望ましくは、ＤＭＳＯまたはＤＭＦのような共溶媒を任意に含む水性バッファーである。また、溶媒は塩類、例えばカルシウム塩を含んでもよい。
【００７２】
ある変異体において、トリアリールホスフィン還元剤はタンパク質の阻害剤（例えば活性部位Ｓ１ポケット阻害剤）と組合せて使用される（更に下を参照）。
【００７３】
現在の好適な一実施態様において、低分子量チオールにジスルフィド架橋を介して連結した１つ以上のシステイン部分（ＲＳ-Ｃｙｓ）を含み、ＦＶＩＩａポリペプチドがその活性型の時に該部分／部分が分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に含まれていないＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチドの選択還元のための方法であって、低分子量チオール結合ＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチドを酸化型および還元型グルタチオンおよびグルタレドキシンを含む混合液と反応させる工程と、化学基を有する選択還元型システイン（ＨＳ-Ｃｙｓ）部分のうちの少なくとも１つを結合させる同時のおよび／または後に続く工程を含んでなる方法である。
【００７４】
現在の好適な別の実施態様において、低分子量チオールにジスルフィド架橋を介して連結した１つ以上のシステイン部分（ＲＳ-Ｃｙｓ）を含み、ＦＶＩＩａポリペプチドがその活性型の時に該部分／部分が分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に含まれていないＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチドの選択還元のための方法であって、低分子量チオール結合ＦＶＩＩａポリペプチドをトリアリールホスフィン-３,３',３''-トルスルホン酸化合物および活性部位Ｓ１ポケット阻害剤を含む混合液と反応させる工程、化学基を有する選択還元型システイン（ＨＳ-Ｃｙｓ）部分のうちの少なくとも１つを結合させる同時のおよび／または後に続く工程を含んでなる方法である。
【００７５】
ＦＶＩＩａポリペプチド
上記のように酸化還元バッファーを用いた選択還元ストラテジーは、通常、少なくとも一つの非天然システインを含む改変されたＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチドに、特にタンパク質がその活性型の時に分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に含まれていない改変されたシステインを有する、したがって低分子量チオール接合型になる可能性がある該タンパク質に適用できると考えられている。
【００７６】
「低分子量チオール結合（ＲＳ-Ｃｙｓ）型」なる用語および類似した用語は、問題のＦＶＩＩａポリペプチドのシステインのチオール基がチオール基を有する化合物に結合することを意味するものであり、前記化合物は５００Ｄａ未満の分子量を有する。該化合物の例はグルタチオン、ガンマ-グルタミルシステイン、システイニルグリシン、システイン、ホモシステイン、Ｎ-アセチルシステイン、システアミン等である。
【００７７】
「活性型」なる用語は、例えば触媒（酵素）、チモーゲン、またはコファクターとして望ましい働きを行うことができるタンパク質の型を指す。「活性型」は「正しく折り畳まれた形態」と呼ばれることもある。
【００７８】
興味深い一実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドの実質部分（すなわち少なくとも５０％）は、選択還元反応が実施される時に活性型にある。
【００７９】
ＦＶＩＩａポリペプチドは、通常少なくとも一つの非天然システインを含む天然ＦＶＩＩａと比較して「改変された」ポリペプチドである。前記「改変された」ポリペプチドは、好ましくは当業者には明らかである組換え技術によって調製される; ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１およびＷＯ０１／５８９３５Ａ２を参照。
【００８０】
タンパク質阻害剤
興味深い一実施態様において、混合液はＦＶＩＩａポリペプチドの阻害剤を更に含む。混合液に阻害剤を含むことによって、タンパク質の立体構造がいくらか安定し、それによって分子内ジスルフィド結合は酸化還元バッファーによって還元される低い傾向がと考えられる。好ましくは、タンパク質の阻害剤は活性部位阻害剤である。
【００８１】
ＦＶＩＩａポリペプチドの場合、選択還元反応の間、Ｓ１結合ポケットに及ぶ活性部位阻害剤の存在が、活性部位領域の内部ジスルフィド結合を還元から保護するために必要である。この目的に有用な阻害剤は、例えば４-アミノベンズアミジンなどのベンズアミジン、アルギニン、その他のより有力な類似体を含む。例えば、ＷＯ０５／０１６３６５Ａ３に開示されているもの、ＥＰ１１６２１９４Ａ１（Aventis）に開示されているもの（特に請求項１−６およびセクション［０００９］−［００５２］において定義されているもの）、ＥＰ１２７０５５１Ａ１に開示されているもの（特に請求項１および２およびセクション［００１０］−［００３２］）である。
【００８２】
コンジュゲート
上に記載されている選択還元法の１つの重要な目的は、化学基（例えば非ポリペプチド部分）の結合（コンジュゲーション）に使うことができるシステイン基を解放することである。したがって、重要な一実施態様において、方法は化学基を有する選択的に還元されたシステイン（ＨＳ-Ｃｙｓ）部分のうちの少なくとも１つを結合させる同時のおよび／または続く工程をさらに含んでなる。
【００８３】
化学基を有する少なくとも一つの選択的に還元されたシステイン部分のコンジュゲーションは、同時にすなわち酸化還元バッファーを含む混合液にコンジュゲーションを導く一つ以上の試料を加えることによって実施してもよく、または、例えば選択的に還元したタンパク質の精製および／または単離の後のような後に続く工程で実施してもよいと考えられる。
【００８４】
また、コンジュゲーションは、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の合成前に、ＦＶＩＩａポリペプチドに実施してもよく、または二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物が合成された後に実施してもよいと考えられる。
【００８５】
一実施態様において、化学基はプロトラクター基であり、すなわち、非修飾ポリペプチドと比較した時、ＦＶＩＩａポリペプチドのコンジュゲーションに応じて、上記ＦＶＩＩａポリペプチドの循環半減期を増加させる基である。引き延ばし効果の裏側の特異的原理は、増加したサイズ、ペプチダーゼまたは抗体によって認識され得るペプチド配列のシールド、または例えば肝臓またはマクロファージ上に存在するグリカン特異的レセプターによっては認識されないようにするグリカンのマスキング、クリアランスの防止または減少によって生じるのかもしれない。また、プロトラクター基の引き延ばし効果は、例えばアルブミンのような血液成分に対する結合性または血管組織に対する非特異的粘着力によって生じることがありえる。結合した糖タンパク質は、その生物学的活性を実質的に保たなければならない。
【００８６】
本発明の一実施態様において、プロトラクター基は以下を含む群から選択される：
（ａ） 低分子性有機荷電基（１５−１,０００Ｄａ）であって、一つ以上のカルボキシル酸、アミン、スルホン酸、テトラゾール、アシルスルホンアミド、ホスホン酸またはそれらの組合せを含んでもよい。
（ｂ） 低分子性（１５−１,０００Ｄａ）中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、または任意に分枝したポリエチレン鎖。
（ｃ） 低分子性（１５−１,０００Ｄａ）疎水性分子、例えばその脂肪酸またはコール酸またはそれらの誘導体。
（ｄ） ２,０００−６０,０００Ｄａの平均分子量を有するポリエチレングリコール。
（ｅ） ７００から２０,０００Ｄａの範囲の、またはより好ましくは７００−１０,０００Ｄａの間の正確な分子質量を有するデンドリマーのような明確な精度を有するポリマー。
（ｆ） 実質的に非免疫原性のポリペプチド、例えばアルブミンまたは抗体または任意にＦｃ-ドメインを含む抗体の一部。
（ｇ） 高分子量有機ポリマー、例えばデキストラン。
【００８７】
本発明の別の実施態様において、プロトラクター基は、デンドリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のようなポリアルキレン・グリコール（ＰＡＧ）を含むポリアルキレン酸化物（ＰＡＯ）、分枝ＰＥＧ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレイト、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン／無水マレイン酸、ポリスチレン／無水マレイン酸およびカルボキシメチルデキストランを含むデキストランから成る群から選択される。本発明の特に興味深い一実施態様において、プロトラクター基はＰＥＧ基である。
【００８８】
「分枝ポリマー」、または互換可能な「樹状ポリマー」、「デンドリマー」または「樹状構造」なる用語は、それらのモノマーの構築ブロック（いくつかは分枝を含む）の選択から組み立てられる有機ポリマーを意味する。
【００８９】
本発明の一実施態様において、プロトラクター基は血清タンパク質結合性リガンドからなる群から選択されるものであり、例えばアルブミンと結合する化合物で、脂肪酸の類のＣ５−Ｃ２４脂肪酸、脂肪族二酸（例えばＣ５−Ｃ２４）である。プロトラクター基の別の例は、生理学的条件下の荷電特性を変える部分、例えばカルボキシル酸またはアミン、またはより小さいアルキル置換基（例えばＣ１−Ｃ５アルキル）のようなグリカン特異的な認識を防止する中性の置換基を含む小有機分子を含む。本発明の一実施態様において、プロトラクター基はアルブミンである。
【００９０】
一実施態様において、化学基は非ポリペプチドである。
【００９１】
興味深い一実施態様において、化学基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、特に５００−１００,０００の範囲の平均分子量を有するもの、例えば１,０００−７５,０００または２,０００−６０,０００のものである。
【００９２】
コンジュゲーションは、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１およびＷＯ０１／５８９３５Ａ２にて開示されているように行うことができる。
【００９３】
タンパク質にコンジュゲーションするための化学基としてのＰＥＧの使用は、特に興味深い。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」なる用語は、ポリエチレングリコール化合物またはそれの誘導体を意味し、カップリング剤、結合または活性化部分（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジルジン（azirdine）、オキシラン、ピリジルジチオ、ビニルスルホン、または好ましくはマレイミド部分）の有無にかかわらない。マレイミドモノメトキシＰＥＧのような化合物は、本発明の活性化ＰＥＧ化合物の典型例である。
【００９４】
ＰＥＧは適切なポリマー分子であり、それはデキストランのような多糖と比較して、架橋結合ができる反応基をほんのわずかしか有しない為である。特に、単官能基のＰＥＧ（例えばメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が興味深く、それはそのカップリング化学が比較的シンプルである為である（一つの反応基だけが、ＦＶＩＩａポリペプチド上の結合基によって結合に利用できる）。従って、架橋結合の危険がないので、得られるＦＶＩＩａコンジュゲートはより均質であって、ＦＶＩＩａポリペプチドを有するポリマー分子の反応が制御し易い。
【００９５】
ＦＶＩＩａポリペプチドにポリマー分子の共有結合による付加を達成するために、ポリマー分子のヒドロキシ末端基は活性型、すなわち活性な官能基で与えられる。適切な活性ポリマー分子は、例えばShearwater社（ハンツヴィル、アラバマ、米国）またはPolyMASC Pharmaceuticals社（英国）から購入できる。あるいは、ポリマー分子は、例えばＷＯ９０／１３５４０にて開示されているような当該分野で知られている通常方法によって活性化することができる。本発明に用いられる活性化線形分子または分枝ポリマー分子の具体例は、Shearwater社の１９９７年および２０００年のカタログ（Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals、Polyethylene Glycol and Derivatives、出典明記により本願明細書に援用）に記載されている。活性化ＰＥＧポリマーの具体的例としては、以下の線形ＰＥＧがあげられる：ＮＨＳ−ＰＥＧ（例えばＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧおよびＳＣＭ−ＰＥＧ、そしてＮＯＲ−ＰＥＧ）、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧ、およびＭＡＬ−ＰＥＧ、およびＰＥＧ２−ＮＨＳおよび米国特許第５９３２４６２号および米国特許第５６４３５７５号（両者を出典明記により本願明細書に援用）で開示されているような分枝ＰＥＧ。さらに、以下の文献（出典明記により本願明細書に援用）は、役立つポリマー分子および／またはＰＥＧ化の化学を開示する：米国特許第５８２４７７８号、米国特許第５４７６６５３号、ＷＯ９７／３２６０７、ＥＰ２２９１０８、ＥＰ４０２３７８、米国特許第４９０２５０２号、米国特許第５２８１６９８号、米国特許第５１２２６１４号、米国特許第５２１９５６４号、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９５／００１６２、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９７／１８８３２、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３２１３９、ＷＯ９９／３２１４０、ＷＯ９６／４０７９１、ＷＯ９８／３２４６６、ＷＯ９５／０６０５８、ＥＰ４３９５０８、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９５／１３３１２、ＥＰ９２１１３１、米国特許第５７３６６２５号、ＷＯ９８／０５３６３、ＥＰ８０９９９６、米国特許第５６２９３８４号、ＷＯ９６／４１８１３、ＷＯ９６／０７６７０、米国特許第５４７３０３４号、米国特許第５５１６６７３号、ＥＰ６０５９６３、米国特許第５３８２６５７号、ＥＰ５１０３５６、ＥＰ４００４７２、ＥＰ１８３５０３およびＥＰ１５４３１６。
【００９６】
ＦＶＩＩａポリペプチドおよび活性ポリマー分子のコンジュゲート化は、例えば以下の文献に記載されているような任意の従来法を用いて行われる（参照には、ポリマー分子の活性化のための適切な方法も記載されている）：R. F. Taylor, (1991), 「Protein immobilisation. Fundamental and applications」, マーセル・デッカー, ニューヨーク; S. S. Wong, (1992), 「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC 出版, ボカ・ラートン; G. T. Hermanson 等, (1993), 「Immobilized Affinity Ligand Techniques」, アカデミックプレス, ニューヨーク)。熟練した当業者であれば、使用するポリペプチドの結合基（その例は上記した）と共にポリマーの官能基（例えばアミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフィドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンまたはハロアセテイトである）に依存して、活性化法および／またはコンジュゲーション化学が使用されることを理解するであろう。ＰＥＧ化は、ＦＶＩＩａポリペプチド上の全ての利用できる結合基（すなわちＦＶＩＩａポリペプチドの表に露出した該付加基）に対してコンジュゲーションを行ってもよく、または一つ以上の特異的な結合基に対して行ってもよい（例えばＮ末端基アミノ基（米国特許第５９８５２６５号））。さらにまた、コンジュゲーションは一段階でまたは段階的方法で達成してもよい（例えばＷＯ９９／５５３７７に記載されている）。
【００９７】
ＰＥＧ化は、結合されたＰＥＧの数、分子のサイズと形状（例えば、それらが線形かまたは分枝か）、ポリペプチドのどこに該分子が結合されるかに関して最適分子を産生するために設計されると理解される。使用するポリマーの分子量は、達成される所望の効果を考慮に入れて選択される。例えば、コンジュゲーションの主要な目的が高分子量およびより大きいサイズ（例えば、腎臓クリアランスを減らすため）を有するコンジュゲートの達成であれば、所望の効果を得るために、１つあるいは少数の高分子量ポリマー分子か、多数のより分子量の小さいポリマー分子のどちらかを結合することを選択してもよい。しかしながら、好ましくは低分子量を有するいくつかのポリマー分子が使われる。
【００９８】
本発明のコンジュゲートの少なくとも大部分の見かけのサイズ（「見かけの分子量」または「見かけの質量」でもよい）が少なくとも約５０ｋＤａ、例えば少なくとも約５５ｋＤａ、少なくとも約６０ｋＤａ、例えば少なくとも約６６ｋＤａであるときに、有利な結果が得られることが更に分かっている。これは、腎臓クリアランスが十分に大きな見かけのサイズを有するコンジュゲートを実質的に除去するという事実によると考えられている。本状況において、ＦＶＩＩａポリペプチドの「見かけのサイズ」は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動方法で測定される。
【００９９】
さらにまた、過剰ポリマー・コンジュゲーションが化学基（例えば非ポリペプチド部分）が結合するＦＶＩＩａポリペプチドの活性の損失を導くことがあると報告されている。この問題は、例えば機能部位に位置する結合基を取り除くことによって、またはコンジュゲーション前に機能部位を可逆的にブロッキングすること、つまりコンジュゲーションの間にＦＶＩＩａポリペプチドの機能部位がブロックされることによって解決できる。具体的には、ＦＶＩＩａポリペプチドと化学基（例えば非ポリペプチド部分）間のコンジュゲーションは、ＦＶＩＩａポリペプチドの機能部位がヘルパー分子（例えばＦＶＩＩａポリペプチドまたはセリンプロテアーゼ阻害剤の機能部位に結合可能な組織因子）によってブロックされる状況下で行うことができる。好ましくは、ヘルパー分子は特定の組織因子において、ＦＶＩＩａポリペプチド（例えば受容体）の機能的部位を特に認識するもので、完全長組織因子または最適に短縮された形態の組織因子、または一方が組織因子で他方がペプチドである２つの分子、または結合して触媒性トリアド（好ましくは、触媒性トリアドの任意の原子の１０Å以内のアミノ酸残基として定義される）周辺の領域を保護しているペプチド阻害剤である。
【０１００】
あるいは、ヘルパー分子は抗体であってもよく、特にＦＶＩＩａポリペプチドを認識するモノクローナル抗体であってもよい。特に、ヘルパー分子は無効化モノクローン抗体であってもよい。
【０１０１】
ＦＶＩＩａポリペプチドは好ましくはコンジュゲーションを遂行する前にヘルパー分子と相互に作用する（しばしば、混合ジスルフィドが還元される工程で使用するものと同じヘルパー分子（例えば阻害剤）を使用することは有利でさえある）。これは、ＦＶＩＩａポリペプチドの機能部位がシールドされているかまたは保護されていることを確実にする。従ってポリマーのような化学基（例えば非ポリペプチド部分）による誘導体化に利用されない。
【０１０２】
ヘルパー分子からの解離に続いて、化学基とタンパク質のコンジュゲートは、少なくとも部分的に保存された機能部位が再生され得る。
【０１０３】
医薬品組成物
本発明に従った二量体および多量体ＦＶＩＩａ化合物は、出血性疾患または出血症状発現の患者の治療ために、または正常な止血系の強化のための医薬組成物として適用できる。上記治療を必要とする患者の例は、すなわち血友病Ａまたは血友病Ｂの治療を受けている患者である。
【０１０４】
別の態様においては、本発明はその範囲に、活性成分として、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物、または製薬的に許容可能な担体または希釈液と共に、製薬的に許容可能なその塩を含む医薬組成物を含む。
【０１０５】
任意には、本発明の医薬組成物は、抗凝固活性を呈する一つ以上の他の化合物（例えば血小板凝集阻害薬）と組み合わせて、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物を含んでなってもよい。
【０１０６】
本発明の化合物は、化合物および製薬的に許容可能な担体または希釈液から成る医薬組成物に調剤されてもよい。上記担体は水、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリンまたはプロピレングリコール、植物油）を含む。本願明細書で使用する「製薬的に許容可能な担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗カビ剤、防腐剤、等張剤およびその類を含む。任意の従来の媒体は活性成分およびその所望の用途と適合しない場合を除いて、本発明の組成物に使用されることが考えられる。
【０１０７】
組成物は従来の技術によって調製することができて、従来の形態（例えばカプセル、錠剤、溶液または懸濁液）で市場に出される。使用される薬剤担体は、従来の固体または液体担体であってもよい。固体担体の例としては、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸があげられる。液体担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油および水である。同様に、担体または希釈剤は、当業者に知られているあらゆる徐放性物質（グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートなど)を単独か、もしくはワックスと混合した形で含有してよい。製剤はまた、湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤、保存剤、甘味料または香味料を含んでもよい。本発明の製剤は、当該分野で知られている手順を使用することによって、患者への投与後の活性成分の速効性、持続性、後発性放出を提供するために処方することができる。
【０１０８】
医薬品組成物は殺菌することができて、必要に応じて、活性な化合物と有害な反応をしない補助剤、乳化剤、浸透圧を調節する塩、バッファーおよび／または染色剤などを混合することができる。
【０１０９】
投与ルートは経口投与または非経口投与（例えば直腸投与、経皮投与、皮下投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、局所的投与、静脈内投与、尿道内投与、眼内投与または軟膏剤）のような、効果的に活性化合物を適当なまたは所望の作用点へ効果的に輸送する任意のルートであってもよく、経口投与が好ましい。
【０１１０】
固体担体を経口投与に用いる場合は、錠剤またはハードゼラチンカプセル内に入った粉末もしくはペレット形態に調剤するか、あるいはトローチまたはロゼンジの形態に調剤してもよい。固体担体の量は、広い範囲内で様々であるが、通常は約２５ｍｇ〜約１ｇである。
【０１１１】
液体担体が用いられる場合、製剤がシロップ、乳化剤、ソフトゼラチンカプセルまたは無菌の注射可能な液体（例えば水性であるか非水溶液懸濁剤または溶液）の形状であってもよい。
【０１１２】
鼻腔内投与のために、製剤は、エアゾールアプリケーションのための液体担体、特に水性担体に溶解するかまたは懸濁した化学式(I)の化合物を含んでもよい。担体は、可溶化剤（例えばプロピレングリコール）、表面活性薬、吸収促進薬（例えばレシチン（ホスファチジルコリン）またはシクロデキストリン）または防腐剤（例えばパラベン））のような添加物を含んでもよい。
【０１１３】
非経口投与のためには、注射可能な溶液または懸濁液が特に適切であって、好ましくはポリヒドロキシル化されたヒマシ油に溶解した活性化合物の水性溶液である。
【０１１４】
タルクおよび／または糖質の担体または製剤結合剤またはその類を含む錠剤、糖剤またはカプセルは特に内服に適している。錠剤、糖剤またはカプセル用の好ましい担体は、ラクトース、コーンスターチおよび／またはジャガイモスターチを含む。加糖賦形薬が用いられる場合は、シロップまたはエリクシルが使用できる。
【０１１５】
従来の錠剤化技法により調製される典型的錠剤は、
コア：
活性化合物（本発明の化合物の遊離型または塩） １０ｍｇ
コロイド状二酸化ケイ素（Aerosil（登録商標)) １.５ｍｇ
微結晶性セルロース（Avicel（登録商標)) ７０ｍｇ
変性セルロースガム（Ac-Di-Sol（登録商標)) ７.５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム
コーティング：
ＨＰＭＣ 約９ｍｇ
*Ｍｙｗａｃｅｔｔ（登録商標)９−４０Ｔ 約０.９ｍｇ
*フィルムコーティングの可塑剤として用いるアセチル化モノグリセリド
を含んでよい。
【０１１６】
本発明の化合物は、上記したような血栓溶解性または血液凝固性疾患または傷害の該治療、予防、除去、緩和または改善を必要とする哺乳類、特にヒトに投与することができる。上記哺乳類は、例えば家庭のペットのような家畜および野生生物のような非家畜の両方の動物を含む。
【０１１７】
通常、経口投与、鼻腔内投与、肺投与または経皮投与に適している投与形態は、製薬的に許容可能な担体または希釈液に、化学式Ｉの化合物を約０.００１ｍｇから約１００ｍｇを、好ましくは約０.０１ｍｇから約５０ｍｇを含む。
【０１１８】
経口投与、直腸投与、非経口投与（皮下投与を含む）の経路に関係なく、製薬的に許容可能な担体または希釈液と同時に、並行して、共に投与することができる。化合物は、しばしば、および好ましくは、それのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩の形である。
【０１１９】
適切な用量範囲は、正確な投与様式、投与形態、投与が向けられる適応症、関与する患者およびその体重、そして担当医又は獣医の好み及び経験に応じて、上記のように変化する。
【０１２０】
本発明は以下の実施例で更に例示されるが、これは保護の範囲を制限するものとして解釈されるものではない。前述の説明および以下の実施例において開示される特徴は、その両方を別々でまたはいかなる組合せでも、本発明が多様な形態をとることを理解するための材料である。
【実施例】
【０１２１】
実施例1
材料−還元型および酸化型グルタチオン（それぞれ、ＧＳＨおよびＧＳＳＧ）、システイン（Ｃｙｓ）、ＤＬ-ホモシステイン（ｈＣｙ）、システイニルグリシン（ＣＧ）およびγ-グルタミルシステイン（γ-ＧＣ）は、シグマ社から購入した。システアミン（Ｃｙａ）および７-フルオロベンゾフラザン-４-スルホン酸アンモニウム塩（ＳＢＤ-ｆ）は、Ｆｌｕｋａ社より得た。トリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）から購入した。クロモジェニックＳ-２２８８基質は、クロモジェニック社（ミラノ、イタリア）から得た。ＰＥＧ５ｋ-マレイミド（２Ｅ２Ｍ０Ｈ０１）、ＰＥＧ２０ｋ-マレイミド（２Ｅ２Ｍ０Ｐ０１）、ＰＥＧ４０ｋ-マレイミド（２Ｄ３Ｙ０Ｔ０１）およびマレイミド-ＰＥＧ３.４ｋ-マレイミド（２Ｅ２Ｅ０Ｆ０２）は、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（ハンツヴィレ、アラバマ州）から購入した。ｄ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅ-Ａｒｇ-クロロメチルケトンは、Ｂａｃｈｅｍから購入した。トリフェニルホスフィン-３,３',３"-トリスルホン酸は、アルドリッチ社から得た。ヒト血漿由来ＦＸおよびＦＸａは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（サウスベンド、インディアナ州）から得た。ビオチン-ポリエチレンオキサイド-ヨードアセトアミド（ビオチン-ＰＥＯ-ヨードアセトアミド）は、シグマ社（ミズーリ、米国）のものである。可溶性組織因子１-２１９（ｓＴＦ）は、公表されている手順（Freskgard等、1996）に従って調製した。ｓＴＦ（１-２１９）Ｇｌｕ２１９→Ｃｙｓ（Ｅ２１９Ｃ）は、基本的に以前の記載に従って調製した（Owenius等、1999）。組換えＦＶＩＩａの発現および精製は、以前の記載に従って行った（Thim等、1988；PerssonとNielsen，1996）。他の全ての化学薬品は、分析用等級以上であった。
【０１２２】
濃度測定−原液のＧＳＳＧの濃度は、３８１Ｍ-１ｃｍ-１の吸光係数を使用して２４８ｎｍの吸収から測定した（ChauとNelson，1991）。ＧＳＨおよび他の低分子量のチオールの濃度は、エルマン試薬（５,５'-ジチオビス（２-ニトロ安息香酸））および１４１５０Ｍ-１ｃｍ-１を使用して、４１２ｎｍで２-ニトロ-５-チオ安息香酸のモル吸光係数として測定した（Riddles等、1979）。
【０１２３】
ＨＰＬＣによるＧＳＳＧの定量化−ＧＳＳＧの定量化は、基本的に他の文献の記載に従ってに実施した（TakahashiとCreighton，1996）。簡潔には、酸で反応停止した５０μｌサンプルを、３０℃に維持したＣ１８逆相カラム（Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）１００Å，３μｍ粒径，４.６×５０ｍｍ；Phenomenex Inc.、トランス、カリフォルニア州）へロードした。１００％溶出液Ａ（０.１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液）で５分間均一濃度で泳動後、ＧＳＳＧは１ｍｌ／ｍｉｎの流速で５分間０−５％の溶出液Ｂ（０.０８５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡアセトニトリル溶液）の直線濃度勾配によって溶出し、２１４ｎｍの吸収によって検出した。ＧＳＳＧの濃度は、算出ピーク面積（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ ｖ４.０ソフトウェア、Waters）を、ＧＳＳＧの既知量によって作った標準曲線と比較して測定した。直線性は、ＧＳＳＧの２−２５ｎｍｏｌの範囲で観察された。
【０１２４】
ＨＰＬＣによるチオール修飾ＦＶＩＩａ４０７Ｃの分析−遊離およびチオール修飾ＦＶＩＩａ４０７Ｃ種は、４５℃に保ったＣ３逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ-Ｃ３，２.１×１５０ｍｍ，５-μｍ粒径；Agilent Technologies，デンマーク）を用いたＨＰＬＣによって分析した。流速は０.５ｍｌ／ｍｉｎであり、移動相は０.１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液（溶出液Ａ）および０.０８５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡアセトニトリル溶液（溶出液Ｂ）を含む。酸で反応停止した２５μｌサンプルの注入後、システムは５分間の３０％均一濃度の溶出液Ｂの後に、２０分にわたる３８−４１.５％の直線濃度勾配の溶出液Ｂおよび２０分にわたる４１.５−５５％の溶出液Ｂを続けて流した。溶出は蛍光によってモニタした（励起波長および蛍光波長は、それぞれ２８０および３４８ｎｍ）。
【０１２５】
ＦＶＩＩ４０７Ｃ突然変異体をコードするＤＮＡのコンストラクト−ＦＶＩＩａ４０７ＣをコードするＤＮＡコンストラクトは、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１に記載されているように構築した。
【０１２６】
ＦＶＩＩＱ２５０Ｃ突然変異体をコードするＤＮＡのコンストラクト−ＦＶＩＩａＱ２５０ＣをコードするＤＮＡコンストラクトは、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１に記載されているように構築した。
【０１２７】
ＦＶＩＩＲ３９６Ｃ突然変異体コードするＤＮＡのコンストラクト−ＦＶＩＩａＲ３９６ＣをコードするＤＮＡコンストラクトは、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１に記載されているように構築した。
【０１２８】
ＦＶＩＩ４０７Ｃの発現および精製−ＢＨＫ細胞は、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ変異体の発現を得るために、基本的に以前に記載されているように（Thim等，1988；PerssonとNielsen，1996）形質移入した。ＦＶＩＩポリペプチドは、以下に従って精製した：
熟成した培地は、５ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００および１０ｍＭのトリスを加え、ｐＨ８.０に調製し、伝導率１０−１１ｍＳ／ｃｍに水添加で調製した後、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの２５ｍｌのカラム（アマシャム・バイオサイエンス社，ＧＥヘルスケア）にロードした。タンパク質の溶出は、１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（ｐＨ８.０）から１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（ｐＨ７.５）までの勾配によって達成した。ＦＶＩＩａ４０７Ｃを含む分画をプールし、ＣＮＢｒ活性セファロース４Ｂ（アマシャム・バイオサイエンス社，ＧＥヘルスケア）に結合させたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２（ノボ・ノルディスクA／Ｓ社、Bagsvard、デンマーク）を含む２５ｍｌカラムにアプライした。カラムは１０ｍＭのＣａＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０.０２％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.５）によって平衡化した。平衡化バッファーおよび２ＭのＮａＣｌを含む平衡化バッファーで洗った後、結合した物質をＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭのＥＤＴＡを含む平衡化バッファーで溶出させた。保存の前に、ＦＶＩＩａ４０７Ｃは透析によって５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０のバッファーへ移した。各工程の収量は第ＶＩＩ因子ＥＬＩＳＡ測定により求め、精製したタンパク質はＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１２９】
ＦＶＩＩＱ２５０Ｃの発現と精製−ＢＨＫ細胞は、ＦＶＩＩａＱ２５０Ｃ変異体の発現を得るために、基本的に以前に記載されているように（Thim等，1988；PerssonとNielsen，1996）形質移入した。ＦＶＩＩポリペプチドは、以下に従って精製した：
熟成した培地は、５ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００および１０ｍＭのトリスを加え、ｐＨ８.０に調製し、伝導率１０−１１ｍＳ／ｃｍに水添加で調製した後、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの２５ｍｌのカラム（アマシャム・バイオサイエンス社，ＧＥヘルスケア）にロードした。タンパク質の溶出は、１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（ｐＨ８.０）から１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（ｐＨ７.５）までの勾配によって達成した。ＦＶＩＩａＱ２５０Ｃを含む分画をプールし、ＣＮＢｒ活性セファロース４Ｂ（アマシャム・バイオサイエンス社，ＧＥヘルスケア）に結合させたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２（ノボ・ノルディスクA／Ｓ社、Bagsvard、デンマーク）を含む２５ｍｌカラムにアプライした。カラムは１０ｍＭのＣａＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０.０２％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.５）によって平衡化した。平衡化バッファーおよび２ＭのＮａＣｌを含む平衡化バッファーで洗った後、結合した物質をＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭのＥＤＴＡを含む平衡化バッファーで溶出させた。保存の前に、ＦＶＩＩａＱ２５０Ｃは透析によって５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０のバッファーへ移した。各工程の収量は第ＶＩＩ因子ＥＬＩＳＡ測定により求め、精製したタンパク質はＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１３０】
ＦＶＩＩＲ３９６Ｃの発現と精製−ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃの発現と精製は、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１に記載に従って行った。
【０１３１】
グルタレドキシンのクローニングと発現−大腸菌グルタレドキシン２（Ｇｒｘ２）および酵母グルタレドキシン１（ｙＧｒｘ１ｐ）の配列をコードしているＤＮＡは、プライマー対ｏＨＯＪ９８-ｆ／ｏＨＯＪ９８-ｒおよびｏＨＯＪ１１-ｆ／ｏＨＯＪ１１-ｒをそれぞれ使用して、それぞれの側近にＮｄｅＩとＸｈｏＩの制限サイトが導入されるように、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム （ロシュ・ダイアグノスティックス社，インディアナポリス、インディアナ州）を使用して製造業者の推奨法に従ってＰＣＲ増幅した（プライマー配列は表１に示す）。
【０１３２】
表１−それぞれ大腸菌グルタレドキシン２（Ｇｒｘ２）、酵母グルタレドキシン１（ｙＧｒｘ１ｐ）およびｙＧｒｘ１ｐ Ｃ３０Ｓを発現するプラスミドｐＨＯＪ２９４、２１０および２８６の構築に使用したＤＮＡオリゴ。ＮｄｅＩとＸｈｏＩの制限サイトは太字で表す。
【表１】
【０１３３】
ＰＣＲ反応のためのゲノム鋳型ＤＮＡは、公開されている手順に従ってＥ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから調製した（Grimberg等，1989；HoffmanとWinston，1987）。精製したＰＣＲ産物は、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切った後、ｐＥＴ-２４ａ（＋）（ノバジェン）の対応するサイトに連結し、それぞれｐＨＯＪ２９４およびｐＨＯＪ２１０を作った。終止コドンがベクターによって生じたので、２つの遺伝子に３'ベクター由来のＣ末端ＬＥＨＨＨＨＨＨアフィニティタグをコードするエクステンションを加えた。ｙＧｒｘ１ｐ Ｃｙｓ３０→Ｓｅｒ（ｙＧｒｘ１ｐ Ｃ３０Ｓ）をコードするプラスミドｐＨＯＪ２８６は、製造業者の指示書（ストラタジェン，ラホイヤ, カリフォルニア州）に従って、プライマーｏＨＯＪ８８-ｆ／ｏＨＯＪ８８-ｒおよびテンプレートとしてｐＨＯＪ２１０を用いたＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ 突然変異生成によって構築した。全クローン配列の同一性の正確性は、ＤＮＡ塩基配列決定によって検証した。
【０１３４】
発現のために、ｐＨＯＪ２１０、２８６および２９４のプラスミドは、ケミカルコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）セル（ストラタジェン，ラホイヤ, カリフォルニア州）に導入した。新鮮なオーバーナイト形質転換体は、当初のＯＤ６００が０.０２で、３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５００ｍｌのテリフィック培養液（Sambrook等、1989）に接種した。培養株は、対数増殖期（ＯＤ６００ ３−４）まで、バッフル付フラスコで２３０ｒｐｍ、３７℃でインキュベートし、対数増殖期に温度を２５℃まで下げてタンパク発現を０.１ｍＭのイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＴＰＧ）で誘導した。オーバーナイトで発現させた後、細胞を遠心によって集めて５０ｍｌ溶解バッファー（５０ｍＭのリン酸カリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.０）に再懸濁し、３回の凍結融解サイクルで溶解した。透明な溶菌液は、溶解バッファーによって平衡化した２０ｍｌのＮｉ-ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（キアゲン ＧｍｂＨ社 Hilden,ドイツ）カラムに５ｍｌ／ｍｉｎの流速でロードした。溶解バッファーで洗った後に、結合したタンパク質は、溶解バッファーに０−２００ｍＭの直線濃度勾配イミダゾールによって溶出した。ピーク分画をプールし、５０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８.０に対する広範囲な透析の前に２０分間の２０ｍＭのジチオスレイトールによって処理した。タンパク質は、−８０℃で保存し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって純粋（＞９０％）であると判断した。濃度は、５２４０Ｍ-１ｃｍ-１（ｙＧｒｘ１ｐおよびｙＧｒｘ１ｐ Ｃ３０Ｓ）および２１７４０Ｍ-１ｃｍ-１（Ｇｒｘ２）の吸光係数を使用して２８０ｎｍの吸光指数によって推定した。
【０１３５】
ＦＶＩＩａ４０７Ｃと混合ジスルフィドで結合している低分子量チオールの同定−
蛍光ＳＢＤ誘導体化低分子量チオールのＨＰＬＣ検出は、Ｏｅ等（１９９８）の記載に、マイナーな変更を加えて実施した。簡潔に述べると、ジスルフィド還元とその後の遊離チオールの誘導体化は、２５μｌの１０μＭのＦＶＩＩａ４０７Ｃ（または野生型ＦＶＩＩａ）を５μｌの１４ｍＭのＴＣＥＰ（水溶物）と１０μｌの０.３％ＳＢＤ-ｆ（水溶物）を含む１６０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、８ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ９.６）バッファー中で６０分間６０℃でインキュベートすることで実施した。その後、誘導体化は２μｌの５ＭのＨＣｌの添加によって停止させ、サンプルは更なる分析まで４℃に置いた（２４時間以内）。ＨＰＬＣ分析は、逆相Ｃ１８（２）カラム（Ｌｕｎａ，１００Å，３.５μｍ粒径，１５０×４.６ｍｍ；Phenomenex Inc., トランス, カリフォルニア州）にサンプルの２５-μｌ分割量を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で注入することによって実施した。カラムの温度は３０℃に維持した。ＳＢＤ誘導体化チオールは７５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ２.９０および２％メタノールを含む移動相を使用して一定濃度溶出によって分離し、３８６ｎｍ励起により５１６ｎｍで発する蛍光によって検出した。ピークの同定は、ＦＶＩＩａ４０７Ｃの上記した手順に従って調製した既知の低分子量チオール化合物の一連との保持時間の比較によって行った。ＧＳＨ、γ-ＧＣ、ＧＣ、Ｃｙｓ、ＨｃｙおよびＣｙａの定量化のための較正曲線は、最終反応混合物中の各チオール濃度を０.４から３.５μＭまで変化させることによって得た。
【０１３６】
この分析から、ＦＶＩＩａ４０７Ｃに結合する主要な低分子量チオールがグルタチオン、システインおよびホモシステインであると結論することができる。結果は、図１に示す。
【０１３７】
ＦＶＩＩａの酸化還元滴定−ＦＶＩＩａＣｙｓ変異体の選択還元に適する条件を同定するために、ＦＶＩＩａの構造安定性を、基本的に他の文献の記載に従って（Loferer等、1995）、ＧＳＨおよびＧＳＳＧの濃度を変化させることによって得られた規定済みの酸化還元能力を有するバッファーにおいて評価した。ＦＶＩＩａの２つの最も不安定なジスルフィド結合の還元がアｓＴＦ結合性およびミド分解活性の損失（Higashi等、1997）と関係していることが示されているので、ＦＶＩＩａの構造の保全性は、ｓＴＦの存在下で発色体基質Ｓ-２２８８を加水分解するその能力によってモニタした。
【０１３８】
ＦＶＩＩａ（１μＭ）の酸化還元滴定は、５０μＭのＧＳＳＧを含み、様々なＧＳＨ濃度（０−３４ｍＭ）の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０のバッファー（徹底的に窒素をパージしたもの）で行った。さらに、一連のサンプルは、２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジン（Ｓ１ポケットを占有しているＦＶＩＩａの活性部位阻害剤）を含む（Sichler等，2002；Persson等，2004）。平衡に達するまでに要する時間を減らすために、反応は酸化還元触媒として作用する１μＭのｙＧｒｘ１ｐの存在下で行った（Ostergaard等，2004）。窒素雰囲気下３０℃で３.５時間のサンプルの平衡化の後、残余アミド分解活性は、後述するように測定した。同時に、反応混合物のアリコートは、等量の１００ｍＭのＨＣｌで反応停止し、材料および方法において記載したようにＧＳＳＧの平衡濃度はＨＰＬＣで測定した。
【０１３９】
残余アミド分解活性の測定のために、平衡化サンプルの２０μｌは、遊離チオールを急速にアルキル化し、続くチオール酸化を防止するために、１０ｍＭのヨードアセトアミドを含む分析バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７.４）で２０倍希釈した。活性分析は、８０ｎＭのｓＴＦおよび最終濃度１０ｎＭのＦＶＩＩａの反応停止させたサンプルを含む最終容量２００μｌの分析バッファーでポリスチレンマイクロタイタープレート（ヌンク，デンマーク）において行った。室温で１５分のプレインキュベーションの後、１ｍＭの発色体基質Ｓ-２２８８を加え、吸光度はＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯソフトウェア（ｖ２．２；Molecular Devices Corp.,サニーベール、カリフォルニア州）を装備したＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ３４０マイクロプレート分光光度計で２０分間の４０５ｎｍで連続的にモニタした。アミド分解活性は、ブランク補正後、リニア反応進行曲線の傾斜として報告した。
【０１４０】
データは以下の反応（式１）によって分析した。ここで、ＦＶＩＩａは一つの分子内ジスルフィド結合の可逆的還元によって不活性ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａｉと表す）に変化する：
【数１】
逆反応（Ｋｏｘ）の推定平衡定数は、以下の関係（式２）から推定することができる
【数２】
[上式中、ｆは所与の［ＧＳＨ］２／［ＧＳＳＧ］における残余アミド分解活性であり、ａｍａｘは低［ＧＳＨ］２／［ＧＳＳＧ］時の極限アミド分解活性である]。
【０１４１】
カレイドグラフソフトウェア（ｖ３.６、シナジーソフトウェア）を使用して非線形最小２乗法回帰によって酸化還元滴定データを式２に当てはめることにより、２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジンの非存在下または存在下において、それぞれ見かけのＫｏｘ９３±６ｍＭおよび１６６±１６ｍＭを得た。
【０１４２】
ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-グルタチオン混合ジスルフィドの酸化還元滴定−グルタチオンとＣｙｓ４０７の間の混合ジスルフィドの安定性は、１３μＭのＦＶＩＩａ４０７Ｃを、０.５ｍＭのＧＳＨを含む、様々なＧＳＳＧ濃度（５−５００μＭ）の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０でインキュベートすることで測定した。更に、全サンプルは、反応を触媒するために１０μＭのＧｒｘ２を含む。３０℃、５時間の平衡化の後、５０μｌアリコートは１００ｍＭのＨＣｌで反応停止させ、材料および方法にて説明したように、ＧＳＳＧの平衡濃度はＨＰＬＣで測定した。脱グルタチオン化ＦＶＩＩａ４０７Ｃの相対量を測定するために、各サンプル２０μｌを１５μｌの１.６ｍＭのＰＥＧ５ｋ-マレイミドと結合させることによって、遊離チオールをＰＥＧ５ｋ標識した。室温で１８分のインキュベート後、更なる（非特異的）タンパク質のＰＥＧ化を競争的に抑制するために、次の処理の間、Ｎ-エチルマレイミドを最終濃度２５ｍＭで加えた。各サンプルのＰＥＧ５ｋ修飾ＦＶＩＩａ４０７Ｃは、材料および方法にて説明したように、ＨＰＬＣによって検出し定量化した。
【０１４３】
データは以下の反応（式３）に従って分析し、グルタチオン化ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＧＳＨ）はＧＳＨと反応し、遊離ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＧＳＳＧを生じる。
【数３】
逆反応の推定平衡定数（Ｋｓｃｏｘと表す）は、以下の関係式（式４）から推定することができる。
【数４】
[上式中、Ａ４０７Ｃ−ＰＥＧ５ｋは、既知の［ＧＳＨ］／［ＧＳＳＧ］比における５ｋ-ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ４０７Ｃのピーク面積であり、Ａｍａｘは高［ＧＳＨ］／［ＧＳＳＧ］時の極限ピーク面積である。]
【０１４４】
平衡時の［ＧＳＨ］／［ＧＳＳＧ］比に対する測定されたピーク面積のプロットを図３に示す。カレイドグラフソフトウェア（ｖ３.６、シナジーソフトウェア）を使用して非線形最小２乗法回帰によってデータを式４に当てはめることにより見かけのＫｓｃｏｘ値１.０が得られ、これは他のグルタチオン化タンパク質の範囲で測定された値と非常に類似していた（Gilbert，1995）。
【０１４５】
最適還元条件の特定−ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-混合ジスルフィドの選択還元を支える最適なグルタチオン酸化還元条件は、［ＧＳＳＧ］の作用として以下のパラメータのプロットから特定した：（１）式２および見かけのＫｏｘ値を用いたｐ-アミノベンズアミジンの存在下または非存在下の残余アミド分解活性、および（２）式４およびＫｓｃｏｘからの選択的に還元したタンパク質の分数。実際的な理由のために、ＧＳＨ濃度は０.５ｍＭに設定した。図４に示すように、０.５ｍＭのＧＳＨ存在下でＧＳＳＧ濃度がおよそ１５と６０μＭの間は、残余活性が＞９０％および遊離Ｃｙｓ４０７が＞９０％という結果である。［ＧＳＳＧ］の最適作用範囲は、（図３−５に例示するように）ＧＳＨ濃度、ＫｏｘおよびＫｓｃｏｘ（図示せず）の値および還元反応中のアミド分解活性の許容損失を含むいくつかのパラメータに依存する。
【０１４６】
選択還元およびＦＶＩＩａ４０７ＣのＰＥＧ５ｋ、ＰＥＧ２０ｋ、およびＰＥＧ４０ｋ修飾-ＦＶＩＩａ４０７Ｃのチオール修飾は、３つの連続的な工程に分けることができる：（Ａ）グルタレドキシン触媒還元反応、（Ｂ）チオール特異性アルキル化、および（Ｃ）精製。各工程の終了後、反応混合液の少量のアリコートは、１０％（ｖ／ｖ）ギ酸によって反応停止し、材料および方法にて説明および図７において例示するように、ＨＰＬＣによって分析した。
【０１４７】
（Ａ）ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（４.８ｍｇ）は、０.５ｍＭのＧＳＨ、１５μＭのＧＳＳＧ、２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジンおよび１０μＭのＧｒｘ２を含む、総体積４.４ｍｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０のバッファーで、３０℃４.５時間インキュベートした。ＧＳＳＧの当初濃度は、反応の間、ＧＳＳＧ形成を補償するために、最適作用範囲（図４の影をつけた面積）の下端にした。（Ｂ）その後、遊離チオールは、最終濃度０.８ｍＭに、ＰＥＧ５ｋ-マレイミド、ＰＥＧ２０ｋ-マレイミドまたはＰＥＧ４０ｋ-マレイミド（水溶物）の付加によって修飾した。チオールアルキル化は、０.５ｍＭのシステインによる反応停止まで、室温で１５分間進行させた。（Ｃ）ＥＤＴＡを過剰カルシウム（最終濃度２０ｍＭ）として加え、ＦＶＩＩａ４０７Ｃを捕獲するために、バッファーＡ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.０）で平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦカラム（アマシャム・バイオサイエンス社, ＧＥヘルスケア）に全容量をロードした。バッファーＡによる洗浄後、結合したタンパク質のワンステップ溶出を、ＨｉＴｒａｐカラムの前に取り付けたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １６／６０ｐｇカラム（アマシャム・バイオサイエンス社）上で直接に、バッファーＢ（１０ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０.０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７.０）によって行った。ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化種は、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で分離し、２８０ｎｍの吸収によって検出した。
【０１４８】
選択還元およびＦＶＩＩａ４０７ＣのＰＥＧ３.４またはＰＥＧ２０ｋ架橋−選択還元は、０.５ｍＭのＧＳＨを含み、１０μＭのＧＳＳＧ、２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジンおよび１０μＭのＧｒｘ２を含む、総体積４.４ｍｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ７.０のバッファーで４.５時間、３０℃でインキュベートすることで行った。その後、ＥＤＴＡを過剰カルシウム（最終濃度２０ｍＭ）として加え、ＦＶＩＩａ４０７Ｃを捕獲するために、バッファーＡ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.０）で平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦカラム（アマシャム・バイオサイエンス社, ＧＥヘルスケア）に全量をロードした。結合していないグルタチオン・バッファーおよびＧｒｘ２ｐを除去するためにバッファーＡによる洗浄後、ＦＶＩＩａ４０７ＣはバッファーＢ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０）でワンステップで溶出させた。該溶出液中のＦＶＩＩａ４０７Ｃの濃度は、６２・１０３Ｍ-１ｃｍ-１の吸光係数を使用して２８０ｎｍの吸光度で測定した。架橋結合は、約０.６相当のマレイミド-ＰＥＧ３.４ｋ-マレイミドまたはマレイミド-ＰＥＧ２０ｋ-マレイミドの存在下で、室温で１.５時間行った。（Ｃ）ＥＤＴＡを過剰カルシウム（最終濃度２０ｍＭ）として加え、ＦＶＩＩａ４０７Ｃを捕獲するために、バッファーＡ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.０）で平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦカラム（アマシャム・バイオサイエンス社, ＧＥヘルスケア）に全容量をロードした。バッファーＡによる洗浄後、ＰＥＧ化で非ＰＥＧ化種を分離するために、結合したタンパク質のワンステップ溶出を、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １６／６０ｐｇカラム（アマシャム・バイオサイエンス社)上で直接、バッファーＢ（１０ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０.０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７.０）によって実施した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎで、タンパク質は２８０ｎｍの吸収によって検出した。
【０１４９】
ＦＶＩＩａ４０７Ｃ，ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ５ｋ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ４０ｋおよびＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７ＣのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析−ＦＶＩＩａ４０７Ｃ、および５ｋ、２０ｋ、４０ｋおよび３.４ｋＰＥＧ化化合物（各約１.５μｇ）は、製造業者の推奨に従って、４−１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社，カールスバット、カリフォルニア州）上で、ＭＥＳバッファー（インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社，カールスバット、カリフォルニア州）により２００Ｖで３５分間泳動する還元および非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。ゲルは、水で洗浄し、製造業者の推奨に従ってＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社，カールスバット、カリフォルニア州）で染色した。ゲルは、図８に示す。
【０１５０】
ＦＶＩＩａ４０７Ｃ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃ、およびＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ-ＦＶＩＩａ４０７ＣのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析−タンパク質（各約１μｇ）は、製造業者の推奨に従って、４−１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル(インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社, カールスバット、カリフォルニア州)上で、ＭＥＳバッファー(インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社, カールスバット、カリフォルニア州)により２００Ｖで３５分間泳動する、還元および非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。ゲル類は、水で洗い、製造業者の推奨に従ってＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ(インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社, カールスバット、カリフォルニア州) で染色した。ゲルは、図９に示す。
【０１５１】
ＦＶＩＩａ４０７Ｃ，ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ５ｋ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ４０ｋ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃの活性部位滴定−基本的に他の文献（Bock, 1992)の記載に従って、ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＰＥＧ化化合物の活性部位濃度はｄ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅ-Ａｒｇ-クロロメチルケトン（ＦＦＲ-ｃｍｋ）の半化学量論的レベルによる滴定におけるアミド分解活性の不可逆性の損失から推定した。簡潔に述べると、各タンパク質は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７.０バッファーに、２８０ｎｍで６２・１０３Ｍ-１ｃｍ-１の吸光係数を使用して約３００ｎＭの濃度にに希釈した。希釈したタンパク質（２０μｌ）は、その後２０μｌの１.５μＭのｓＴＦおよび２０μｌの０−１.２μＭのＦＦＲ-ｃｍｋ（ＤＭＳＯに溶解したＦＦＲ-ｃｍｋストックから新しく調製し、−８０℃で保存したもの）と結合させた。室温で一晩インキュベート後、残余アミド分解活性を測定した。
【０１５２】
活性分析は、５０ｎＭのｓＴＦおよび約１０ｎＭのＦＶＩＩａを含むサンプルの１０倍の希釈に相当する最終量２００μｌの分析バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０.０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７.４）で、ポリスチレン・マイクロタイタープレート（ヌンク, デンマーク）上で行った。室温で１５分のプレインキュベーションの後、１ｍＭの発色体基質Ｓ-２２８８を加え、吸光度はＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯソフトウェア（ｖ２.２；Molecular Devices Corp., サニーベール、カリフォルニア州）を装備したＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ３４０マイクロプレート分光光度計で２０分間の４０５ｎｍで連続的にモニタした。アミド分解活性は、ブランク補正後、リニア反応進行曲線の傾斜として報告した。アミド分解活性が完全に消滅しているＦＦＲ-ｃｍｋを最小濃度として、活性部位濃度は外挿法で測定した。
【０１５３】
表２に、２８０ｎｍのタンパク質の吸光度を比例する測定された活性部位濃度を示す。値は、ＦＶＩＩａ４０７Ｃを１００％に正規化している。
表２−ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＰＥＧ化変異体の特異的な活性部位濃度。特異的な活性部位濃度は、２８０ｎｍのタンパク質の吸光度に対するＦＦＲ-ｃｍｋ滴定よる活性部位濃度として測定した。値は、ＦＶＩＩａ４０７Ｃを１００％に正規化している。
【表２】
【０１５４】
固定化された可溶組織因子に結合するＦＶＩＩａ４０７Ｃ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃの表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分析−ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＰＥＧ化変異体の固定された可溶な組織因子に対する結合性は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００計測器（ビアコアＡＢ社, ウプサラ, スウェーデン)上の表面プラスモン共鳴分析によって分析した。固定化の前に、ｓＴＦ Ｅ２１９Ｃは、２０分間ｐＨ７.０でタンパク質を２ｍＭのビオチン-ＰＥＯ-ヨードアセトアミドと作用させることによって、その遊離システインでビオチン化した。続いて、５ｍＭのＣａＣｌ２を含むＨＢＳ-Ｐバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０,００５％Ｐ２０；ビアコアＡＢ社, ウプサラ, スウェーデン)で平衡化したＮＡＰＴＭ５カラム(アマシャム・バイオサイエンスＡＢ社, ウプサラ、スウェーデン)でゲル濾過によって、過剰な試薬は除去した。ビオチン化されたｓＴＦ Ｅ１９Ｃは、ＳＡセンサーチップ（ビアコアAB社, ウプサラ, スウェーデン）のフローセル２に２.２ｆｍｏｌ／ｍｍ２（〜５０ＲＵ）の密度で固定した。接触分析は、自動インライン対照減算のための無処置のフローセル１を使用して、泳動バッファー（５ｍＭのＣａＣｌ２を含むＨＢＳ-Ｐバッファー）で、３０μｌ／ｍｉｎの流速で実施した。１００ｎＭから約５ｎＭまでのタンパク質の連続希釈を分析した。泳動バッファー中でのフローセルの３分間の平衡化後、ＫＩＮＪＥＣＴコマンドを使用して、９０μｌのタンパク質サンプルを注入した。溶出相は９分持続し、再生はＨＢＳ-Ｐバッファーの２０ｍＭのＥＤＴＡの３分間パルスによって実施した。ＳＰＲデータは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４.１ソフトウェア（ビアコア社、ウプサラ、スウェーデン）を使用して、１：１ラングミュア結合モデルに合てはめた。結果は、表３に示す。
【０１５５】
表３−ＦＶＩＩａ４０７Ｃおよび二量体変異体の固定されたｓＴＦに対する結合性の表面プラスモン共鳴分析。解離定数（ＫＤ）は、測定された対合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）化学反応速度定数から算出した。
【表３】
【０１５６】
トリフェニルホスフィン-３,３',３"トリスルホン酸を使用するＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ-混合ジスルフィドの還元−トリフェニルホスフィン-３,３',３"トリスルホン酸を使用するＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ-混合ジスルフィドの小スケールの還元は、以下に従って行った：ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ（４.４μＭ）は、５０ｍＭのｐ-アミノベンズアミジンを含む総体積５０μｌの反応バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７.０）中で、２.５または５.０ｍＭどちらかのＰＰｈ３Ｓ３で処理した。室温で１６.３時間のインキュベーションの後、過剰な還元体を取り除くために、製造業者の指示に従って、反応混合液（３０μｌ）は、再水和したＰｒｏ・ＳｐｉｎＴＭスピンカラムで脱塩した。その後、遊離チオールは、室温で１０分間、０.２ｍＭのＰＥＧ５ｋ-マレイミドでアルキル化した。ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃは、製造業者の推奨に従って４−１２％のビストリスゲル（インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社，カールスバット、カリフォルニア州）をＭＥＳバッファーで３５分間２００Ｖ泳動する還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離した。製造業者の指示に従って、Ｓｉｍｐｌｙ ＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ (インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社, カールスバット、カリフォルニア州)によるゲル染色を行った。ゲルは、図１０Ａに示す。
【０１５７】
ＰＰｈ３Ｓ３によるインキュベーション前後のＦＶＩＩａＲ３９６Ｃのアミド分解活性は、２００μｌ（総体積）の５０ｍＭのｓＴＦを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７.４である３２０倍希釈の反応混合液によって測定した。室温で、１５分のプレインキュベーション後、１ｍＭの発色体基質Ｓ-２２８８を加え、吸光度はＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯソフトウェア（ｖ２.２；Molecular Devices Corp., サニーベール、カリフォルニア州)を装備したＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ３４０マイクロプレート分光光度計で２０分間の４０５ｎｍで連続的にモニタした。アミド分解活性は、ブランク補正後、リニア反応進行曲線の傾斜として報告した。結果は、図１０Ｂに示す。
【０１５８】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの露出したジスルフィドの選択還元−トリアリールホスフィン１（アルドリッチ社製のトリフェニルホスフィン-３,３',３"トリスルホン酸の三ナトリウム塩）は、対応する３,３'-ビス-スルホン酸２のほぼ５％を含む。従って、１は０.１％トリフルオロ酢酸の存在下で、アセトニトリル水溶液の濃度勾配によって溶出する標準の逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【化７】
【０１５９】
トリフェニルホスフィン-３,３',３"トリスルホン酸（２.５ｍＭ）は、活性化部位阻害剤４-アミノベンズアミジンと組合わせて、グルタチオンとＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ間の露出したジスルフィド結合を基本的にアミド分解活性の損失なしに還元するために用いることができることが分かっている。混合ジスルフィド結合の還元分解反応は、ＰＥＧ５ｋ-マレイミドで遊離したシステインの後に続く修飾によって示された。
【０１６０】
トリアリールホスフィン１−３（１０ｍＭ）は、個々に室温で１時間、ｒＦＶＩＩａと共にインキュベートした。１の存在下では、ｒＦＶＩＩａはその活性の大部分を保持した。対照的に、３,３'-ビス-スルホン酸２は、非常に類似した４,４'-ビス-スルホン酸３（アルドリッチ社製の二カリウム塩）のように、酵素のアミド分解活性の急速な減少を引き起こしたので、ｒＦＶＩＩａの還元に最適であるとみなされなかった。
【０１６１】
さらにまた、１のシスチンジメチルエステル５を還元する能力を試験した。反応は室温で１の１５ｍＭ濃度の水溶液で行った。基質は、５ｍＭ濃度で存在した。ＬＣ-ＭＳ分析によって、５のジスルフィド結合が所与の条件下で還元することを証明した。
【化８】
【０１６２】
より多くの立体障害型トリアリールホスフィン４（Ｓｔｒｅｍ製の三ナトリウム塩）がｒＦＶＩＩａに対しほぼ不活性であるとわかり、より選択的な還元剤を開発する可能性を示唆した。化合物９−１１は、選択的なジスルフィド還元剤であると期待されるトリアリールホスフィンの非制限的な例を示す。
【０１６３】
実施例２
材料−ＦＶＩＩＩ欠乏血漿は、ジョージ・キング・バイオメディカル社（カンサス、米国；製品番号０８００）より入手した。凍結乾燥されたヒト血小板は、ヘレナ・バイオサイエンス社（英国、製品番号５３７１）から購入した。血小板還元バッファー：トリスバッファー生理食塩水は、ヘレナ・バイオサイエンス社（英国、製品番号５３６５）より入手した。イノビンは、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ社（Liederbach，ドイツ；製品番号Ｂ４２１２-５０）より入手した。トロンビン特異的基質：Ｚ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ-ＡＭＣ ＨＣｌフルオロフォアはＢａｃｈｅｍ社（Weil am Rhein、ドイツ；製品番号Ｉ−１１４０）より入手した。組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）の発現および精製は、以前に記載したとおりに行った（Thim等，1988；PerssonとNielsen，1996）。他の全ての化学製品は、分析用グレード以上である。
【０１６４】
内因性トロンビン産性能（ＥＴＰ）バイオアッセイを使用したＦＶＩＩ類似体のｒＦＶＩＩａ様活性の測定−内因性トロンビン産性能（ＥＴＰ）アッセイは、選択した血漿サンプルのトロンビン生成のリアルタイム測定に基づく。血漿サンプルはＸａｓｅのアセンブリーのための生理的脂質表面源として凍結乾燥した血小板、および凝固カスケードのプロトロンビナーゼ複合体を含む。リアルタイム・トロンビン活性は、トロンビン特異的基質由来の発生した蛍光生成物の連続検出で測定した（Hemker等，2000；HemkerとBeguin，2000）。
【０１６５】
ＦＶＩＩａおよびＰＥＧ化変異体の濃度は、２８０ｎｍので吸光度測定値で測定した。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液（Ｅ０.１％）の吸光度として、１.３６の値を得た。
【０１６６】
凍結乾燥された血小板の１つのバイアルは、０.７３ｍｌの還元バッファー（トリス緩衝化サリン）において分解されて、ＦＶＩＩＩ欠乏性血漿の７５．０００の血小板／μｌに更に希釈した。イノビン、組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）およびテストサンプルを分析バッファー（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.３５、１.５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に希釈した。トロンビン特異的基質（Ｚ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ-ＡＭＣ）を６０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、カルシウム含有分析バッファー（１００ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.３５）で更に希釈した。コスターマイクロタイタープレート（９６穴、製品番号３６３１）において、１０μｌのｒＦＶＩＩａ（最終０―１００００ｎｇ／ｍｌ）、またはテストサンプル、またはブランク（分析バッファー）（１０μｌ）をそれぞれのウェルに加えた。イノビン（１０μｌ、最終０.１２ｐＭ）、および血漿を含む血小板（８０μｌ、最終５０.０００血小板／μｌ）をコスタープレートのそれぞれのウェルに加えた（９６穴、製品番号３６３１）。プレートは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ（Thermo Electron Corporation, ケンブリッジ、英国)で３７℃で１０分間インキュベートした。基質（２０μｌ、最終濃度：０.４ｍＭのトロンビン特異的基質、０.５％ＤＭＳＯおよび１６.７ｍＭのＣａＣｌ２）を即時に加え、蛍光を６０分間連続的に記録した（励起３９０ｎｍ，蛍光４６０ｎｍ）。
【０１６７】
濃度反応曲線は、シグナルに基づいて、ｒＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩ類似体で作製した（６０分間の蛍光単位時間曲線下の面積）。ＦＶＩＩａに関する類似体のＥＴＰ活性は、カーブから算出し表４に示した。
【０１６８】
表４−ｒＦＶＩＩａに関する二量体ＦＶＩＩａ４０７Ｃ分子のＥＴＰ活性。相対活性はＦＶＩＩａ４０７Ｃのプロトマーごとに与えられるので、二量体分子の総活性は報告された値の２倍である。
【表４】
【非特許文献１】Bock,P.E. (1992). Active-site-selective labeling of blood coagulation proteinases with fluorescence probes by the use of thioester peptide chloromethyl ketones. I. Specificity of thrombin labeling. J Biol Chem 267, 14963-14973.
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【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】混合ジスルフィドでＦＶＩＩａ４０７Ｃと結合した低分子量チオールの同定。タンパク質をＴＣＥＰおよびＳＢＤ-ｆ存在下でインキュベートし、ＦＶＩＩａ４０７Ｃの調製において、改変したＣｙｓ４０７に付加したチオールを解放し誘導体化した。ＳＢＤ誘導体化チオールを逆転相ＨＰＬＣによって分離し、蛍光（励起波長および蛍光波長が各々３８６および５１６ｎｍ）によって検出した。野生型ＦＶＩＩａおよび一連の低分子量のチオール化合物（各々の１０ｐｍｏｌ；標準と表す）のＨＰＬＣトレースを比較のために示す。１つの星印で印をつけたピークは、市販のシステアミンの不純物に起因する。２つの星印は、ＦＶＩＩａ４０７ＣのＨＰＬＣトレースの同定不明のピークを示す。各々のピーク上のパーセントは、分析したＦＶＩＩａ４０７Ｃの量に対する（その保持時間から同定された）既知のチオール種の量を示す。保持時間に基づいて、ＦＶＩＩａ４０７Ｃに結合する主要チオールがグルタチオン、システインおよびホモシステインであると結論づけることができる。略語：ＧＳＨ（グルタチオン）、γ-ＧＣ（γ-グルタミルシステイン）、ＣＧ（システイニルグリシン）、Ｃｙｓ（システイン）、Ｈｃｙ（ホモシステイン）およびＣｙａ（システアミン）。
【図２】ｐＨ７における多様な濃度の還元型および酸化型グルタチオン（［ＧＳＨ］２／［ＧＳＳＧ］比によって表す）、１μＭの酵母グルタレドキシン１（ｙＧｒｘ１ｐ）、無（中空の丸）または２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジン（中空の四角）の存在下でインキュベートしたＦＶＩＩａの残余アミド分解活性。全サンプルは、アミド分解活性を測定する前に３０℃で３.５時間平衡化した。アミド分解活性は、完全に活性なＦＶＩＩａを１として正規化されている。
【図３】ＦＶＩＩａＣｙｓ４０７およびグルタチオン間の混合ジスルフィドの酸化還元滴定。ＦＶＩＩａ４０７ＣはｐＨ７における多様な濃度の還元型および酸化型グルタチオン（［ＧＳＨ］／［ＧＳＳＧ］比で表す）および１０μＭの大腸菌グルタレドキシン２（Ｇｒｘ２）を含むバッファーで平衡化されている。３０℃５時間の平衡化後の、遊離ＦＶＩＩａを検出し、ＰＥＧ５ｋ-マレイミドでアルキル化後にＨＰＬＣによって定量化した。ピーク面積は、完全な５ｋ-ＰＥＧ化活性化ＦＶＩＩａを１として正規化した。
【図４】０．５ｍＭのＧＳＨ、多様な濃度のＧＳＳＧ、および無（−ＰＡＢＡ）または２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジン（＋ＰＡＢＡ）のどちらかを含む酸化還元バッファー中で平衡時の、残余アミド分解活性（点線）および遊離Ｃｙｓ４０７チオール基を有する活性化ＦＶＩＩａ４０７Ｃの比（実線）。カーブは式２および４（それぞれＫｏｘ値９３ｍＭ（−ＰＡＢＡ）および１６６ｍＭ（＋ＰＡＢＡ）、およびＫｓｃｏｘ値１.０２）を使用して描いた。陰をつけた領域は＞９０％の残余活性および＞９０％の遊離４０７ＣチオールとなるＧＳＳＧの濃度範囲を示す。
【図５】図４で代わりに０.５ｍＭのＧＳＨを有するもの。陰をつけた領域は＞９０％の残余活性および＞９０％の遊離ＦＶＩＩａ４０７ＣチオールとなるＧＳＳＧの濃度範囲を示す。
【図６】図４で代わりに１.０ｍＭのＧＳＨを有するもの。陰をつけた領域は＞９０％の残余活性および＞９０％の遊離ＦＶＩＩａ４０７ＣチオールとなるＧＳＳＧの濃度範囲を示す。
【図７】選択還元の前（点線）および後（破線の点線）、およびＰＥＧ２０ｋ-マレイミド修飾後（実線）のＦＶＩＩａ４０７ＣのＨＰＬＣ分析。４０７Ｃ、４０７Ｃ-ＳＲおよび４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋは、それぞれ、遊離の、低分子量チオール結合した、および２０ｋ-ＰＥＧ化したＦＶＩＩａ４０７Ｃのピークを示す。星印は、おそらくハイパーＰＥＧ化種である未同定のピークを示す。ピーク積分は、未処理の材料の１１％に対して、還元工程の最終時の遊離ＦＶＩＩａ４０７Ｃの８９％となった。チオール・アルキル化後、８５％のＦＶＩＩａ４０７Ｃは、モノＰＥＧ化種に変換した。
【図８】還元（右パネル）および非還元（左パネル）ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析：ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（レーンＡ）、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ５ｋ（レーンＢ）、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ（レーンＣ）、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ４０ｋ（レーンＤ）およびＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（レーンＥ）。
【図９】還元（右パネル）および非還元（左パネル）ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析：ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（レーンＡ）、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（レーンＢ）、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（レーンＣ）。
【図１０】（Ａ）２.５ｍＭ（レーンＡ）または５.０ｍＭの（レーンＢ）トリフェニルホスフィン-３,３',３"トリスルホン酸（ＰＰｈ３Ｓ３）で１６.３時間室温で処理し、その後ＰＥＧ２０ｋ-マレイミドで標識したＦＶＩＩａＲ３９６Ｃの還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析。レーンＣに、対照として無処置のＦＶＩＩａを含む。（Ｂ）ＰＰｈ３Ｓ３による１６.３時間のインキュベーション前（１００％活性）と後のＦＶＩＩａＲ３９６Ｃの相対アミド分解活性。
【発明の開示】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、新規なＦＶＩＩａ化合物、それらの合成方法、新規な化合物を含有する医薬組成物、加えて凝固障害の治療におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
血液凝固第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）は、止血の重要な開始因子である。該因子は機能的な循環半減期が約１−３時間である５０ｋＤａの血漿タンパク質である。チモーゲンであるＦＶＩＩは触媒として不活性な単鎖タンパク質であって、内部のＡｒｇ１５２-Ｉｌｅ１５３ペプチド結合の切断により触媒として活性な二本鎖チモーゲンＦＶＩＩａへ変換される。ＦＶＩＩａは、凝血因子欠乏または凝血因子阻害剤によって生じる多様な凝固障害の治療のための治療用タンパク質として広く使われている。また、ＦＶＩＩａは正常に機能する血液凝固カスケードで患者に起こった過度の出血を制御するためにも用いられている。このような出血は、外科手術中や組織障害の他の病状に加えて、例えば欠陥のある血小板機能、血小板減少症、フォンウィルブランド病によっても引き起こされることがある。
【０００３】
ＦＶＩＩａの治療適用の多くで、天然ＦＶＩＩａに対する改良された特性を有するＦＶＩＩａ変異体を使用して治療を行うことが望ましい。増強された生物学的活性を有するＦＶＩＩａ変異体が望ましい分野の一つは、ＦＶＩＩａの効果が最適状態に及ばないために、従来のｒＦＶＩＩａに部分的にまたは完全に難治性の制御されない出血の治療である。現在、これらのいわゆるスーパーアクティブＦＶＩＩａ変異体は、それらの作用機序によって２つのクラスに分けることができる。１つのグループは、触媒能のある状態に向かってタンパク質の高次構造上の平衡をシフトさせることにより生じた上昇したタンパク質分解活性を有する変異体を含む。例えば、Persson等(2001a)、(2001b)、(2002)、(2004) 及び Soejima等(2002)を参照。他方のグループは、主に、アニオン性リン脂質膜に対し上昇した親和性を呈する最適化されたＧＬＡドメインを有する変異体である（Shah等(1998)、Nelsestuen等(2001) 及び Harvey等(2003))。上昇したリン脂質結合性が、血管損傷部位で、活性化された血小板膜上にＦＶＩＩａを局所化して集中させるのに役立ち、それによって止血を促進していると考えられている。
【０００４】
例えばＰＥＧ化または脂質連結などの共有結合による修飾は、いくつかのタンパク質を基礎とする薬剤学に成功裏に適用され、それらの薬物動態学的および薬力学的プロファイルを改善している。天然または改変されたシステイン結合は、タンパク質の表面、特に細胞によって分泌されたものの表面上にこのアミノ酸が稀であることと、加えてチオールカップリング化学剤の高い選択性のおかげで、部位特異的修飾の魅力的な手段を提供する。天然ＦＶＩＩａにおける遊離チオールの欠如は、循環半減期の延長が改変された溶媒-露出性システインの修飾、例えばＰＥＧ化によって達成できるかもしれないという提案を導いている（例えば、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１およびＷＯ０１／５８９３５Ａ２を参照）。
【０００５】
したがって、ＷＯ０１／５８９３５Ａ２は、非ポリペプチド部分とのＦＶＩＩａコンジュゲートおよびそれらの調製法を開示する。とりわけ、非ポリペプチド部分が１つのシステインを介してＦＶＩＩａポリペプチドに結合することが示唆されている。同様に、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１は、化学基とのＦＶＩＩａポリペプチドコンジュゲートおよびそれらの調製法を開示している。とりわけ、化学基が１つのシステインを介してＦＶＩＩａポリペプチドに結合することが示唆されている。
【０００６】
しかしながら、実際にはこの方法が薬物動態学的および薬力学的プロファイルの最適な適合、例えば高い活性や延長された循環半減期などを有するＦＶＩＩａ化合物を必ずしも保証するというわけではない。
【０００７】
したがって、製造、取扱、及び製剤に関する許容可能な生理化学的特性と同様に、高い特異的活性、延長された血漿半減期を呈する改良されたＦＶＩＩａ化合物が必要である。
【０００８】
ＷＯ０３/０７６４６１は二量体組織因子アンタゴニストと、例えば血管性疾患および炎症性疾患の治療におけるそれらの使用を開示する。
【０００９】
ＳＥ９５０１２８５Ａは、タンパク質ジスルフィド酸化還元酵素（例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ））、グルタレドキシンおよび酸化還元バッファーの混合液を使った、適正に折り畳まれた生物学的に活性なジスルフィド架橋結合タンパク質の生体外産生方法を開示する。この文献は、分子内ジスルフィド結合に含まれるシステインに焦点を置いている。
【００１０】
（発明の概要）
既知のＦＶＩＩａ化合物の上記の限界を克服するために、本発明は、ここで、ＦＶＩＩａポリペプチドの本来備わっている触媒活性を保持するために、少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合により連結して成る二量体および多量体ＦＶＩＩａ化合物を提供する。驚くべきことに、そのようなＦＶＩＩａ化合物はスーパー活性を示し、これは２つ以上のＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合により連結される時に結合活性効果が起こり、結果として増強した膜親和性が呈されると考えられている。
【００１１】
一態様では、本発明は、２つのＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合で連結し二量体ＦＶＩＩａ化合物を形成して、ＦＶＩＩａ化合物を提供する。一実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、前記ＦＶＩＩａポリペプチドの改変されたシステインを介して共有結合により連結される。別の実施態様では、２つの同一のＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合により連結され、二量体ＦＶＩＩａ化合物を形成する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、構成要素ＦＶＩＩａポリペプチド間にリンカーを含有する二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物を提供する。
【００１３】
「本来備わっている触媒活性を保持する」なる用語は、二量体または多量体ＦＶＩＩａポリペプチドが、構成要素のＦＶＩＩａポリペプチドと実質的に同等（例えば、本願明細書において開示される分析による測定で、活性部位濃度が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％）のペプチド分解活性を有する特性を指す。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、上記のように、ＦＶＩＩａポリペプチドの本来備わっている触媒活性を保持するために、少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合で連結された二量体および多量体ＦＶＩＩａ化合物を提供する。一実施態様において、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、本願明細書において開示される分析で測定されるように（参照、実施例１）、構成要素のＦＶＩＩａポリペプチドの活性部位濃度の少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%の活性部位濃度を有する。別の実施態様では、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、構成要素のＦＶＩＩａポリペプチドの生物学的活性と比較して増強した生物学的活性を有する。
【００１５】
本発明の好ましい態様において、２つのＦＶＩＩａポリペプチドは共有結合で連結し、二量体ＦＶＩＩａ化合物を形成する。したがって、二量体ＦＶＩＩａは、通常約１００ｋＤａより大きい分子量を有する。
【００１６】
別の態様において、本発明はＦＶＩＩａポリペプチドの本来備わっている触媒活性を保持するために、例えば少なくとも３つのＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合で連結して成る多量体ＦＶＩＩａ化合物を提供する。
【００１７】
ＦＶＩＩａポリペプチド
多数の異なるＦＶＩＩａポリペプチドは、本発明に従って共有結合で連結され、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物を形成してもよい。
【００１８】
本願明細書において使用する「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」または「ＦＶＩＩポリペプチド」なる用語は、不活性な一本鎖チモーゲン第ＶＩＩ因子分子およびその変異体を意味する。一本鎖チモーゲン第ＶＩＩ因子は４０６のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、そのうちの１０はγ-カルボキシル化グルタミン酸残基、Ｎ-グリコシル化アスパラギン残基（番号１４５および番号３２２）、５２と６０の位置のＯ-グリコシル化セリン残基である。ＦＶＩＩ変異体の型は、一つ以上のアミノ酸が置換、付加、または欠失している分子、ＧＬＡ残基の数が異なる分子、修飾されたまたは不完全なグリコシル化パターンを有する分子を含む。アミノ酸残基の修飾の非制限的な例は、アミド化、アルキル化、アシル化およびＰＥＧ化である。
【００１９】
本願明細書で使用する「第ＶＩＩａ因子ポリペプチド」または「ＦＶＩＩａポリペプチド」なる用語は、活性な２本鎖のＦＶＩＩａおよびその変異体を意味する。２本鎖のＦＶＩＩａは、ＦＶＩＩのＡｒｇ１５２-Ｉｌｅ１５３ペプチド結合の加水分解によって、ＦＶＩＩから産生されるポリペプチドである。ＦＶＩＩａも、また４０６のアミノ酸残基を含み、そのうちの１０はγ-カルボキシル化グルタミン酸残基、Ｎ-グリコシル化アスパラギン残基（番号１４５および番号３２２）、５２と６０の位置のＯ-グリコシル化セリン残基である。ＦＶＩＩａ変異体の型には、一つ以上のアミノ酸が置換、付加、または欠失している分子、ＧＬＡ残基の数が異なる分子、修飾されたまたは不完全なグリコシル化パターンを有する分子を含む。
【００２０】
本願明細書で使用する「ＧＬＡ」なる用語は、４-カルボキシグルタミン酸（γ-カルボキシグルタメート）を意味する。
【００２１】
本願明細書で使用する「ポリペプチド」なる用語は、共有結合でポリペプチド結合によって連結する少なくとも５つの構成要素アミノ酸残基を含んでなる化合物を意味する。構成要素アミノ酸が遺伝コードによってコードされるアミノ酸のグループに由来してもよく、遺伝コードによってコードされていない天然アミノ酸であってもよく、加えて合成アミノ酸でもよい。遺伝コードによってコードされていない天然アミノ酸は、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキ-シグルタミン酸、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ-アラニン、Ｄ-グルタミン酸である。合成アミノ酸は、有機合成によって製造されるアミノ酸、例えば遺伝コードによってコードされるアミノ酸のＤ-異性体およびＡｉｂ（α-アミノイソ酪酸）、Ａｂｕ（α-アミノ酪酸）、Ｔｌｅ（tert-ブチルグリシン）およびβ-アラニンを含む。ポリペプチドは、一本鎖であるＦＶＩＩおよび二本鎖がジスルフィド結合によって連結したＦＶＩＩａのように、単一のペプチド鎖を含んでもよく、または複数のポリペプチド鎖を含んでもよい。
【００２２】
本願明細書で使用する「第ＶＩＩａ因子誘導体」または「ＦＶＩＩａ誘導体」なる用語は、例えばアルキル化、グリコシル化、脱グリコシル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成またはアミド形成等々によって、親ペプチドの一つ以上のアミノ酸が遺伝的におよび／または化学的におよび／または酵素的に修飾された、野生型の第ＶＩＩａ因子と比較して実質的に同等か改良された生物学的活性を呈するＦＶＩＩａポリペプチドを示す。これは、ＰＥＧ化第ＶＩＩａ因子、システイン-ＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子およびその変異体を含むが、これに限定されるものではない。
【００２３】
「ＰＥＧ化第ＶＩＩａ因子」等の用語は、ＰＥＧ分子が結合した第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを意味する。ＰＥＧ分子が、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基または糖鎖を含む任意の部分に付加できることが分かっている。「システイン-ＰＥＧ化第ＶＩＩａ因子」なる用語は、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの非天然システインのスルフヒドリル基に結合するＰＥＧ分子を有する第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを意味する。
【００２４】
ＦＶＩＩａ誘導体の非制限的な例は、ＷＯ０３／３１４６４および米国特許出願ＵＳ２００４００４３４４６、ＵＳ２００４００６３９１１、ＵＳ２００４０１４２８５６、ＵＳ２００４０１３７５５７、およびＵＳ２００４０１３２６４０（Neose Technologies社）に記載されているような糖・ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ誘導体と、ＷＯ０１／０４２８７、ＵＳ２００３０１６５９９６、ＷＯ０１／５８９３５、ＷＯ０３／９３４６５（マキシジェンApS社）およびＷＯ０２／０２７６４、ＵＳ２００３０２１１０９４（ミネソタ大学））に記載されているようなＦＶＩＩａコンジュゲートを含む。
【００２５】
「改良された生物学的活性」なる用語は、ｉ)組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同程度あるいは増加したタンパク分解活性を有するＦＶＩＩａポリペプチドを、またはｉｉ)組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同程度あるいは増加したＴＦ結合活性を有するＦＶＩＩａポリペプチドを、またはｉｉｉ)組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同程度あるいは増加した血漿半減期を有するＦＶＩＩａポリペプチドを指す。
【００２６】
「ＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子」なる用語は、ヒト第ＶＩＩａ因子ポリペプチドに結合したＰＥＧ分子を有するヒト第ＶＩＩａ因子を意味する。ＰＥＧ分子が、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基または糖鎖を含む任意の部分に付加できることが分かっている。「システイン-ＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子」なる用語は、ヒト第ＶＩＩａ因子に導入したシステインのスルフヒドリル基に結合するＰＥＧ分子を有する第ＶＩＩａ因子を意味する。
【００２７】
組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同程度あるいは増加したタンパク分解活性を有する第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの非制限的な例は、Ｓ５２Ａ-ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ-ＦＶＩＩａ ( Lino等、Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192、1998);米国特許第５５８０５６０号にて開示されているタンパク分解の安定性が増加したＦＶＩＩａ変異体；残基２９０と２９１の間で、または残基３１５と３１６の間でタンパク質加水分解で切断されている第ＶＩＩａ因子(Mollerup等, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；酸化型第ＶＩＩａ因子（Kornfelt等, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９（ＷＯ０２／０７７２１８に対応）にて開示されているＦＶＩＩａ変異体；ＷＯ０２／３８１６２（スクリップス研究所）にて開示されているタンパク分解の安定性が増加したＦＶＩＩａ変異体；ＷＯ９９／２０７６７、米国特許第６０１７８８２号および第６７４７００３号、ＵＳ２００３０１００５０６ (ミネソタ大学) およびＷＯ００／６６７５３、ＵＳ２００１００１８４１４、ＵＳ２００４２２０１０６、およびＵＳ２００１３１００５、米国特許第６７６２２８６号および第６６９３０７５号(ミネソタ大学)にて開示されている修飾されたＧｌａ-ドメインを有し増強された膜結合を呈するＦＶＩＩａ変異体；ＷＯ０１／５８９３５、米国特許第６８０６０６３号、ＵＳ２００３００９６３３８(マキシジェンApS社)、ＷＯ０３／９３４６５(マキシジェンApS社)、ＷＯ０４／０２９０９１(マキシジェンApS社)、ＷＯ０４／０８３３６１(マキシジェンApS社)、およびＷＯ０４／１１１２４２(マキシジェンApS社)、加えてＷＯ０４／１０８７６３(カナダ血液サービス)で開示されているＦＶＩＩａ変異体を含む。
【００２８】
野生型ヒトＦＶＩＩａと比較して、増加した生物学的活性を有するＦＶＩＩａポリペプチドの非制限的な例は、ＷＯ０１／８３７２５、ＷＯ０２／２２７７６、ＷＯ０２／０７７２１８、ＰＣＴ／ＤＫ０２／００６３５（ＷＯ０３／０２７１４７に対応する）、デンマーク特許出願ＰＡ２００２０１４２３（ＷＯ０４／０２９０９０に対応する）、デンマーク特許出願ＰＡ２００１０１６２７（ＷＯ０３／０２７１４７に対応する）にて開示されているＦＶＩＩａ変異体；ＷＯ０２／３８１６２（スクリップス研究所）；およびＪＰ２００１０６１４７９(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)にて開示されている、増強された活性を有するＦＶＩＩａ変異体を含む。
【００２９】
興味深い「改変された」ＦＶＩＩａポリペプチドの特異的な具体例は、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１（ノボ・ノルディスクA/S社）およびＷＯ０１／５８９３５Ａ２（マキシジェンApS社）の２１-２４ページにおいて開示されている第ＶＩＩａ因子ポリペプチドである。
【００３０】
特に興味深いのは、システイン残基が導入されたＦＶＩＩａポリペプチドである。システイン残基が導入される部位の例は、タンパク分解性が低下する部位かまたはその周辺を含むが、これに限定されるものではない。このように、本発明の興味深い実施態様において、好ましくは置換によって、導入されるシステイン残基は、Ｉ３０Ｃ、Ｋ３２Ｃ、Ｄ３３Ｃ、Ａ３４Ｃ、Ｔ３７Ｃ、Ｋ３８Ｃ、Ｗ４１Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｓ４５Ｃ、Ｄ４６Ｃ、Ｌ１４１Ｃ、Ｅ１４２Ｃ、Ｋ１４３Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、Ｌ２８８Ｃ、Ｄ２８９Ｃ、Ｒ２９０Ｃ、Ｇ２９１Ｃ、Ａ２９２Ｃ、Ｓ３１４Ｃ、Ｒ３１５Ｃ、Ｋ３１６Ｃ、Ｖ３１７Ｃ、Ｌ３９０Ｃ、Ｍ３９１Ｃ、Ｒ３９２Ｃ、Ｓ３９３Ｃ、Ｅ３９４Ｃ、Ｐ３９５Ｃ、Ｒ３９６Ｃ、Ｐ３９７Ｃ、Ｇ３９８Ｃ、Ｖ３９９Ｃ、Ｌ４０１Ｃ、Ｒ４０２Ｃ、Ａ４０３Ｃ、Ｐ４０４Ｃおよびその組合せからなる群から選択され、そして特にＫ３２Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｋ１４３Ｃ、Ｒ２９０Ｃ、Ｒ３１５Ｃ、Ｋ３４１Ｃ、Ｒ３９２Ｃ、Ｒ３９６Ｃ、Ｒ４０２Ｃおよびその組合せから成る群から選択される。本発明の更なる興味深い実施態様において、システイン残基は、野生型ｈＦＶＩＩにおいて、少なくともその側鎖の２５％が表面にさらさているスレオニンまたはセリン残基によって占められる位置に導入される。例えば、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドにおいて、好ましくは置換によって、導入されるシステイン残基は、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｔ２３３、Ｔ２３８、Ｔ２３９、Ｔ２５５、Ｔ２６７、Ｔ２９３、Ｔ３０７、Ｓ３２０、Ｔ３２４、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＳ３９３からなる群から選択される少なくとも一つの位置に導入される。さらにより好ましくは、システイン残基はＳ残基を含むヒトｈＦＶＩＩの少なくとも一つの位置に導入され、その位置はＳ１２、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３からなる群から選択される。本発明の更なる興味深い実施態様において、システイン残基は、野生型ｈＦＶＩＩにおいて、少なくともその側鎖の５０％が表面にさらされているスレオニンまたはセリン残基によって占められる位置に導入される。例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドにおいて、好ましくは置換によって、導入されるシステイン残基は、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｔ２３８、Ｔ２６７およびＴ２９３からなる群から選択される少なくとも一つの位置に導入され、さらにより好ましくは、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７およびＳ２１４からなる群から選択される位置である。より更なる実施態様において、システイン残基は上記の位置のいずれかから選ばれる少なくとも一つの位置に導入され、それは活性部位領域ではない。好ましくは、該位置はＴ残基またはＳ残基によって占められている。例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｔ２５５、Ｔ２６７、Ｔ３０７、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＳ３９３（その側鎖の２５％以上が表面にさらされている）からなる群から選択される少なくとも一つの位置に導入されるシステイン残基を含んで成り、特に、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１ １９、Ｓ １２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３（Ｓ残基によって占められている）、より好ましくはＳ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４およびＴ２６７（その側鎖の５０％以上が表面にさらされている）からなる群から選択され、特にＳ２３、Ｓ４３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６０、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７およびＳ２１４（Ｓ残基によって占められている）からなる群から選択される。より更なる実施態様において、システイン残基は上記リストのいずれかから選ばれる少なくとも一つの位置に導入され、それは組織因子結合部位領域ではない。好ましくは、該位置はＴ残基またはＳ残基によって占められている。例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｔ２３３、Ｔ２３８、Ｔ２３９、Ｔ２５５、Ｔ２６７、Ｔ２９３、Ｓ３２０、Ｔ３２４、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＳ３９３（その２５％以上が表面にさらされる側鎖を有する）からなる群から選択される少なくとも一つの位置に導入されるシステイン残基を含んで成り、特にＳ１２、Ｓ２３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ２３２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３（Ｓ残基によって占められている）からなる群から選択され、より好ましくはＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｔ２３８、Ｔ２６７およびＴ２９３（その側鎖の５０％以上が表面にさらされている）からなる群から選択され、特にＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７およびＳ２１４（Ｓ残基によって占められている）からなる群から選択される。より更なる実施態様において、システイン残基が少なくとも上記リストのいずれかから選ばれる少なくとも１つの位置に導入され、それは組織因子結合部位領域あるいは活性部位領域のどちらにも位置しない。好ましくは、該位置はＴ残基またはＳ残基によって占められている。例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、Ｓ１２、Ｓ２３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ８３、Ｓ１０３、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｔ１２８、Ｔ１３０、Ｓ１４７、Ｔ１８５、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｔ２５５、Ｔ２６７、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６、Ｔ３７０およびＳ３９３（その側鎖の２５％以上が表面にさらされている）からなる群から選択される少なくとも一つの位置に導入されるシステイン残基を含んで成り、特にＳ１２、Ｓ２３、Ｓ４５、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１０３、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１２６、Ｓ１４７、Ｓ２１４、Ｓ２２２、Ｓ３２０、Ｓ３３３、Ｓ３３６およびＳ３９３（Ｓ残基によって占められている）からなる群から選択されて、より好ましくはＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｔ１０６、Ｔ１０８、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７、Ｓ２１４およびＴ２６７（その側鎖の５０％以上が表面にさらされている）からなる群から選択され、特にＳ２３、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｓ６７、Ｓ１１１、Ｓ１１９、Ｓ１４７およびＳ２１４（Ｓ残基によって占められている）からなる群から選択される。
【００３１】
第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの他の有用な例は、２４７−２６０、３９３−４０５または４０６、特にＲ３９６、Ｑ２５０またはＰ４０６またはＫ１５７、Ｖ１５８、Ｍ２９８、Ｌ３０５、Ｄ３３４、Ｓ３３６、Ｋ３３７またはＦ３７４から選択される位置のアミノ酸がシステインによって置換されているかまたはシステインが端末に導入されたもの（例えばＦＶＩＩａ４０７Ｃ）を含む。
【００３２】
好適な一連の実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＰ４０６Ｃ、ＦＶＩＩａＰ４０６Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ、ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＱ２５０ＣまたはＦＶＩＩａＱ２５０Ｃ変異体である。
【００３３】
別の実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、最適化されたＧＬＡドメインを有するＦＶＩＩａ変異体であり、例えばＹ４（挿入）、Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｄ３３Ｆ、Ｄ３３ＥおよびＡ３４Ｅの組合せである。
【００３４】
さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、本来備わっているタンパク分解活性が増加されたＦＶＩＩａ変異体であり、例えばＭ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑおよびそれらの４０７Ｃ変異体からなる群から選択される置換を含む。
【００３５】
さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドは、ＦＶＩＩａ変異体であり、Ｌ３０５Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ１５７Ａ、Ｅ２９６Ｖ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ、Ｓ３３６Ｇ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａおよびそれらの４０７Ｃ変異体から成る群から選択される置換を含む。
【００３６】
さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドはＰＥＧ化である。ＰＥＧ化が二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の形成前に実施できること、または二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の形成後に実施できることが分かっている。
【００３７】
さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａ化合物は、２つのＦＶＩＩａポリペプチドを含む二量体である。さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａ化合物は、３つのＦＶＩＩａポリペプチドを含む三量体である。さらに別の実施態様において、ＦＶＩＩａ化合物は、４つのＦＶＩＩａポリペプチドを含む四量体である。
【００３８】
二量体および多量体ＦＶＩＩａ化合物
一連のカップリング剤を、リンカー部分を任意に含んでもよい二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物を産生するために使用できる。
【００３９】
好ましい実施態様において、共有結合で連結し二量体または多量体ＦＶＩＩａを形成するＦＶＩＩａ化合物は同一のＦＶＩＩａポリペプチドである。別の実施態様において、共有結合で連結し二量体または多量体ＦＶＩＩａを形成するＦＶＩＩａ化合物は２つの異なるＦＶＩＩａポリペプチドである。
【００４０】
特に好適な実施態様において、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、前記ＦＶＩＩａポリペプチドの改変されたシステインを介して共有結合で連結される少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドを含む。システインを介して連結されるＦＶＩＩａポリペプチドから成る該二量体または多量体の合成には、下記に開示する選択的に還元したＦＶＩＩａポリペプチドを産生する方法が有用である。別の実施態様において、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、構成要素ＦＶＩＩａポリペプチド間のリンカーを含む。このようなリンカーの一クラスは、二価のシステイン反応性ＰＥＧを含む反応から生じる構造を有するリンカーである。好適なこのようなリンカーは、マレイミド-ＰＥＧ-マレイミドを含む反応から生じる構造を有する。例えばマレイミド-ＰＥＧ２ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ３.４ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ５ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ１０ｋＤ-マレイミドおよびマレイミド-ＰＥＧ２０ｋＤ-マレイミドである。別の実施態様では、前記リンカーはアミノ酸配列を含む。
【００４１】
さらに別の実施態様において、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、遊離アミンを介して共有結合で連結するＦＶＩＩａポリペプチドを含む。
【００４２】
さらに別の実施態様において、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、天然または改変されたグリカンを介して該ＦＶＩＩａポリペプチドに共有結合で連結するＦＶＩＩａポリペプチドを含む。
【００４３】
さらに別の実施態様において、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、例えばトランスグルタミナーゼまたはソートアーゼによる、酵素で触媒されるカップリング反応から生じる化学構造を介して共有結合で連結する少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドを含む。
【００４４】
二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物が改変されたシステインを介して共有結合で連結するＦＶＩＩａポリペプチドを含む場合において、好適なＦＶＩＩａポリペプチドは、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＰ４０６Ｃ、ＦＶＩＩａＰ４０６Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ、ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ変異体、ＦＶＩＩａＱ２５０Ｃ、およびＦＶＩＩａＱ２５０Ｃ変異体から選択される。
【００４５】
本発明の範囲内には、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物とプロトラクター基（例えば、ヒト血清アルブミンまたはその変異体、ＰＥＧ部分、親油性部分など）の間のコンジュゲートがある。
【００４６】
一般に、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、以下の工程を含む方法によって調製されることが望ましい：
ａ) 前記ＦＶＩＩａポリペプチドの合成および精製;
ｂ) 前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカップリングによる前記化合物の合成;
ｃ) 前記二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の単離。
【００４７】
システインカップリング剤を使用する場合は、本発明による二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物は、以下の工程を含む方法によって調製されることが望ましい：
ａ) 前記ＦＶＩＩａポリペプチドの合成および精製;
ｂ) 連結されるＦＶＩＩａポリペプチド上のシステイン残基の選択還元;
ｃ) 活性リンカーの存在下で、前記ＦＶＩＩａポリペプチドと還元されたシステイン残基のカップリングによる前記二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の合成;
ｄ) 前記二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の単離。
【００４８】
この方法の好ましい実施態様において、工程ｂ)は、酸化還元バッファーまたはトリアリールホスフィン還元剤（選択還元の下記のセクションを参照）を伴う反応によるＦＶＩＩａポリペプチド上のシステイン残基の選択還元を含む。
【００４９】
ＦＶＩＩａ単量体の非天然システインの選択還元
上記のように、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物を構成要素ＦＶＩＩａ分子またはＦＶＩＩ分子から非天然システインを介して合成するときは、カップリングの前にＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチドの非天然システインを選択的に還元することが必要であろう。ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩポリペプチドは、通常は低分子量チオール（ＲＳ-Ｃｙｓ）にジスルフィド架橋を介して結合する一つ以上のシステイン部分を含み、該部分はＦＶＩＩａポリペプチドがその活性型である時に、分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に含まれていない。
【００５０】
酸化還元バッファーを使用する選択還元
選択還元の一方法は、低分子量チオール結合ＦＶＩＩａポリペプチドを酸化還元バッファーを含む混合液と反応させる工程を含む。
【００５１】
本願明細書において使われる場合「酸化還元バッファー」なる用語は、ＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチド-低分子量チオール混合ジスルフィド（ＲＳ-Ｃｙｓ）を崩壊させるための十分な還元と同時に、ＦＶＩＩａポリペプチドの天然ジスルフィド結合の完全性を保存するための十分な酸化の比率のチオール/ジスルフィドの酸化還元ペアを意味するものである。
【００５２】
好ましくは、酸化還元バッファーは、低分子量チオール/ジスルフィド酸化還元ペアを含む。「低分子量」なる用語は、酸化還元ペアのチオール型が多くても５００グラム/モルの分子量を有することを意味する。このような酸化還元ペアの具体例は、(i)還元型および酸化型グルタチオン、および(ii)還元型および酸化型γ-グルタミルシステイン、(iii)還元型および酸化型システイニルグリシン、(iv)還元型および酸化型システイン、（v）還元型および酸化型Ｎ-アセチルシステイン、（vi）システアミン、および（vii）ジヒドロリポアミド/リポアミドから選択され、より好ましくは(i)還元型および酸化型グルタチオンから選択される。
【００５３】
最適な酸化還元状態は、当業者に知られているように、および図２、３および４において示されるように、タンパク質の酸化還元滴定を実施することによって推定することができる;Gilbert (1995)も参照。
【００５４】
一実施態様において、酸化還元バッファーは還元型および酸化型グルタチオンの酸化還元ペアであり、還元型グルタチオンの濃度は０−１００ｍＭの範囲であり、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオン間の比率は２−２００の範囲である。
【００５５】
別の実施態様では、酸化還元バッファーは還元型および酸化型グルタチオンの酸化還元ペアであり、還元型グルタチオンの濃度は０−１００ｍＭの範囲であって、例えば０.０１−５０ｍＭであり、酸化型グルタチオンの濃度は０−５ｍＭの範囲であって、例えば０.００１−５ｍＭである。第ＶＩＩ因子ポリペプチドのために、還元型グルタチオンの濃度は好ましくは０−５ｍＭの範囲であって、例えば０.０１−２ｍＭであり、酸化型グルタチオンの濃度は０.００１−２ｍＭの範囲であって、例えば０.００１−０.２００ｍＭである。
【００５６】
グルタチオンおよび他の低分子量チオールが通常、反応速度論的には劣った還元剤／酸化剤であるので、最も好ましくは、チオール/ジスルフィド酸化還元触媒が反応速度を改良するために酸化還元バッファーと組み合わせて混合液に含まれる。
【００５７】
混合液に含まれる適切なチオール/ジスルフィド酸化還元触媒は、ジチオール型およびモノチオール型グルタレドキシンを含む。グルタレドキシンおよびそれらの機能は、概してFernandes等(2004)に記載されている。グルタレドキシンの有用な例は、大腸菌由来のＧｒｘ１、Ｇｒｘ２またはＧｒｘ３ (Holmgren等, 1995)、酵母由来のＧｒｘ１ｐ、Ｇｒｘ２ｐ、Ｇｒｘ３ｐ、Ｇｒｘ４ｐおよびＧｒｘ５ｐ (Luikenhuis 等 1998; Rodriguez-Manzaneque等, 1999; Grant, 2001), ヒト由来のＧｒｘ１およびＧｒｘ２(Padilla等1995; Lundberg等, 2001)およびそれらの変異体から選択されるものである。変異体は、他のアミノ酸、典型的にはセリンと置換されたＣＸＸＣモティーフのＣ末端のシステインがあるジチオール型グルタレドキシンを含むがこれに限定されるものではない（参照、Yang等,1998）。
【００５８】
酸化還元触媒（特にグルタレドキシン）は、好ましくは０.００１−２０μＭの濃度で使用される。
【００５９】
混合液がタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を含まないことが好ましい。
【００６０】
酸化還元バッファーは、塩類、ｐＨバッファー等の他の構成要素を更に含んでもよく、本発明の方法は、問題のＦＶＩＩａタンパク質に適している任意の温度で実施してもよく、例えば−５℃から５０℃の範囲で、０℃から２５℃の範囲の温度であって、当然所与の条件下でタンパク質の安定性に依存する。
【００６１】
トリアリールホスフィン還元剤を使用する選択還元
選択還元のための別の方法は、低分子量チオール結合ＦＶＩＩａタンパク質をトリアリールホスフィン還元剤と反応させることを含む。
【００６２】
「トリアリールホスフィン還元剤」なる用語は、一つ以上の置換基によって任意に置換されるトリアリールホスフィンを意味するものである。
【００６３】
トリアリールホスフィン還元剤のアリール基は、好ましくはフェニル、ナフチル、１,２,３,４-テトラヒドロナフチル、アントラシル、フェナントラシル、ピレニル、ベンゾピレニル、フルオレニルおよびキサンテニル、特にフェニルから選ばれ、現在選択されている実施態様においてアリール基が好ましくは同一である。目下の最も興味深い実施態様において、全３つのアリール基はフェニルである。アリール基に、特にフェニル基に存在する置換基の例は、概してスルホン酸、カルボキシル酸、Ｃ１-６-アルキル、Ｃ１-６-アルコキシ、およびＣ１-６-アルコキシ-Ｃ１-６-アルキル、またはＣ３-６-アルキレン（２つの隣接するアリール炭素原子を有する環を表す）またはＣ２-６-アルキレンオキシ（２つの隣接するアリール炭素原子を有する環を表す）またはＣ１-４-アルキレン-オキシ-Ｃ１-４-アルキレン（２つの隣接するアリール炭素原子を有する環を表す）から選択されるものである。
【００６４】
一実施態様において、少なくとも一つのアリール（例えばフェニル）は、スルホン酸およびカルボキシル酸、特にスルホン酸から選ばれる少なくとも一つの置換基を有する；該置換は好ましくはリン光体原子の結合と比較してメタ位に配置されている。
【００６５】
好ましくは全３つのアリール基はスルホン酸置換基を有し、例えば全３つのアリール基はスルホン酸置換基および更に少なくとも１つの置換基を有し、特に少なくともリン光体原子の結合と比較してパラ位の置換基、特にこのパラ位に酸素置換基を有する。
【００６６】
好適な還元剤のアリール基はリン光体原子の結合と比較してオルト位にいかなる置換基も有しないと現在考えている。
【００６７】
「Ｃ１-６-アルキル」なる用語は、１−６の炭素原子を有する、線形または分枝飽和炭化水素残基を含むことを意味する。特定の例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチルおよびn-ヘキシルである。同様に、「Ｃ１-４アルキル」なる用語は１−４の炭素原子を有する線形または分枝飽和炭化水素残基を含むことを意味する。「Ｃ１-６-アルキレン」、「Ｃ２-６-アルキレン」などの用語は、それぞれ「Ｃ１-６-アルキル」、「Ｃ２-６-アルキル」に対応する二価基をあらわす。
【００６８】
適切なトリアリールホスフィン還元剤は、還元電位および立体障害の間で有用なバランスを有するものである。トリアリールホスフィン還元剤の化学的性質は、タンパク質の天然ジスルフィド結合の完全性を保存すると共に、タンパク質-低分子量チオール混合ジスルフィド（ＲＳ-Ｃｙｓ）を切断するその能力によって記される。現在非常に興味深い化合物は、トリアリールホスフィントリスルホン酸、例えばトリフェニルホスフィン-３,３',３''-トリスルホン酸およびその類似体である。この具体例は、トリアリールホスフィン還元剤はトリフェニルホスフィン-３,３',３''-トリスルホン酸およびその類似体から選択されており、例えば下記の化合物９−１１：
【化１】
の一つから選択される。
【００６９】
トリアリールホスフィン還元剤は、好ましくは０.００１−１００ｍＭ、例えば０.０１−５０ｍＭまたは０.１−２５ｍＭの濃度で使用される。
【００７０】
興味深い一実施態様において、トリアリールホスフィン還元剤は担体に固定される。これは、タンパク質から還元剤の簡単な分離に役立つ。一般に、トリアリールホスフィン還元剤（例えば化合物９−１１）は、当業者にとって知られている方法によって、例えばアリール基のうちの１つにリンカー基を導入することによって固定してもよい。トリアリールホスフィン試料１２は、１のリンク可能な変異体の例である。
【化２】
【００７１】
反応は、典型的には０−４０℃の範囲の温度で、例えば外界温度で、５秒から場合によっては数日の期間の間で行われる。反応後には、その変換を確認するためにＨＰＬＣを後に続けてもよい。適切な溶媒は望ましくは、ＤＭＳＯまたはＤＭＦのような共溶媒を任意に含む水性バッファーである。また、溶媒は塩類、例えばカルシウム塩を含んでもよい。
【００７２】
ある変異体において、トリアリールホスフィン還元剤はタンパク質の阻害剤（例えば活性部位Ｓ１ポケット阻害剤）と組合せて使用される（更に下を参照）。
【００７３】
現在の好適な一実施態様において、低分子量チオールにジスルフィド架橋を介して連結した１つ以上のシステイン部分（ＲＳ-Ｃｙｓ）を含み、ＦＶＩＩａポリペプチドがその活性型の時に該部分／部分が分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に含まれていないＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチドの選択還元のための方法であって、低分子量チオール結合ＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチドを酸化型および還元型グルタチオンおよびグルタレドキシンを含む混合液と反応させる工程と、化学基を有する選択還元型システイン（ＨＳ-Ｃｙｓ）部分のうちの少なくとも１つを結合させる同時のおよび／または後に続く工程を含んでなる方法である。
【００７４】
現在の好適な別の実施態様において、低分子量チオールにジスルフィド架橋を介して連結した１つ以上のシステイン部分（ＲＳ-Ｃｙｓ）を含み、ＦＶＩＩａポリペプチドがその活性型の時に該部分／部分が分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に含まれていないＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチドの選択還元のための方法であって、低分子量チオール結合ＦＶＩＩａポリペプチドをトリアリールホスフィン-３,３',３''-トルスルホン酸化合物および活性部位Ｓ１ポケット阻害剤を含む混合液と反応させる工程、化学基を有する選択還元型システイン（ＨＳ-Ｃｙｓ）部分のうちの少なくとも１つを結合させる同時のおよび／または後に続く工程を含んでなる方法である。
【００７５】
ＦＶＩＩａポリペプチド
上記のように酸化還元バッファーを用いた選択還元ストラテジーは、通常、少なくとも一つの非天然システインを含む改変されたＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩポリペプチドに、特にタンパク質がその活性型の時に分子内Ｓ-Ｓ架橋（Ｃｙｓ-Ｓ-Ｓ-Ｃｙｓ）に含まれていない改変されたシステインを有する、したがって低分子量チオール接合型になる可能性がある該タンパク質に適用できると考えられている。
【００７６】
「低分子量チオール結合（ＲＳ-Ｃｙｓ）型」なる用語および類似した用語は、問題のＦＶＩＩａポリペプチドのシステインのチオール基がチオール基を有する化合物に結合することを意味するものであり、前記化合物は５００Ｄａ未満の分子量を有する。該化合物の例はグルタチオン、ガンマ-グルタミルシステイン、システイニルグリシン、システイン、ホモシステイン、Ｎ-アセチルシステイン、システアミン等である。
【００７７】
「活性型」なる用語は、例えば触媒（酵素）、チモーゲン、またはコファクターとして望ましい働きを行うことができるタンパク質の型を指す。「活性型」は「正しく折り畳まれた形態」と呼ばれることもある。
【００７８】
興味深い一実施態様において、ＦＶＩＩａポリペプチドの実質部分（すなわち少なくとも５０％）は、選択還元反応が実施される時に活性型にある。
【００７９】
ＦＶＩＩａポリペプチドは、通常少なくとも一つの非天然システインを含む天然ＦＶＩＩａと比較して「改変された」ポリペプチドである。前記「改変された」ポリペプチドは、好ましくは当業者には明らかである組換え技術によって調製される; ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１およびＷＯ０１／５８９３５Ａ２を参照。
【００８０】
タンパク質阻害剤
興味深い一実施態様において、混合液はＦＶＩＩａポリペプチドの阻害剤を更に含む。混合液に阻害剤を含むことによって、タンパク質の立体構造がいくらか安定し、それによって分子内ジスルフィド結合は酸化還元バッファーによって還元される低い傾向がと考えられる。好ましくは、タンパク質の阻害剤は活性部位阻害剤である。
【００８１】
ＦＶＩＩａポリペプチドの場合、選択還元反応の間、Ｓ１結合ポケットに及ぶ活性部位阻害剤の存在が、活性部位領域の内部ジスルフィド結合を還元から保護するために必要である。この目的に有用な阻害剤は、例えば４-アミノベンズアミジンなどのベンズアミジン、アルギニン、その他のより有力な類似体を含む。例えば、ＷＯ０５／０１６３６５Ａ３に開示されているもの、ＥＰ１１６２１９４Ａ１（Aventis）に開示されているもの（特に請求項１−６およびセクション［０００９］−［００５２］において定義されているもの）、ＥＰ１２７０５５１Ａ１に開示されているもの（特に請求項１および２およびセクション［００１０］−［００３２］）である。
【００８２】
コンジュゲート
上に記載されている選択還元法の１つの重要な目的は、化学基（例えば非ポリペプチド部分）の結合（コンジュゲーション）に使うことができるシステイン基を解放することである。したがって、重要な一実施態様において、方法は化学基を有する選択的に還元されたシステイン（ＨＳ-Ｃｙｓ）部分のうちの少なくとも１つを結合させる同時のおよび／または続く工程をさらに含んでなる。
【００８３】
化学基を有する少なくとも一つの選択的に還元されたシステイン部分のコンジュゲーションは、同時にすなわち酸化還元バッファーを含む混合液にコンジュゲーションを導く一つ以上の試料を加えることによって実施してもよく、または、例えば選択的に還元したタンパク質の精製および／または単離の後のような後に続く工程で実施してもよいと考えられる。
【００８４】
また、コンジュゲーションは、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の合成前に、ＦＶＩＩａポリペプチドに実施してもよく、または二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物が合成された後に実施してもよいと考えられる。
【００８５】
一実施態様において、化学基はプロトラクター基であり、すなわち、非修飾ポリペプチドと比較した時、ＦＶＩＩａポリペプチドのコンジュゲーションに応じて、上記ＦＶＩＩａポリペプチドの循環半減期を増加させる基である。引き延ばし効果の裏側の特異的原理は、増加したサイズ、ペプチダーゼまたは抗体によって認識され得るペプチド配列のシールド、または例えば肝臓またはマクロファージ上に存在するグリカン特異的レセプターによっては認識されないようにするグリカンのマスキング、クリアランスの防止または減少によって生じるのかもしれない。また、プロトラクター基の引き延ばし効果は、例えばアルブミンのような血液成分に対する結合性または血管組織に対する非特異的粘着力によって生じることがありえる。結合した糖タンパク質は、その生物学的活性を実質的に保たなければならない。
【００８６】
本発明の一実施態様において、プロトラクター基は以下を含む群から選択される：
（ａ） 低分子性有機荷電基（１５−１,０００Ｄａ）であって、一つ以上のカルボキシル酸、アミン、スルホン酸、テトラゾール、アシルスルホンアミド、ホスホン酸またはそれらの組合せを含んでもよい。
（ｂ） 低分子性（１５−１,０００Ｄａ）中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、または任意に分枝したポリエチレン鎖。
（ｃ） 低分子性（１５−１,０００Ｄａ）疎水性分子、例えばその脂肪酸またはコール酸またはそれらの誘導体。
（ｄ） ２,０００−６０,０００Ｄａの平均分子量を有するポリエチレングリコール。
（ｅ） ７００から２０,０００Ｄａの範囲の、またはより好ましくは７００−１０,０００Ｄａの間の正確な分子質量を有するデンドリマーのような明確な精度を有するポリマー。
（ｆ） 実質的に非免疫原性のポリペプチド、例えばアルブミンまたは抗体または任意にＦｃ-ドメインを含む抗体の一部。
（ｇ） 高分子量有機ポリマー、例えばデキストラン。
【００８７】
本発明の別の実施態様において、プロトラクター基は、デンドリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のようなポリアルキレン・グリコール（ＰＡＧ）を含むポリアルキレン酸化物（ＰＡＯ）、分枝ＰＥＧ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレイト、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン／無水マレイン酸、ポリスチレン／無水マレイン酸およびカルボキシメチルデキストランを含むデキストランから成る群から選択される。本発明の特に興味深い一実施態様において、プロトラクター基はＰＥＧ基である。
【００８８】
「分枝ポリマー」、または互換可能な「樹状ポリマー」、「デンドリマー」または「樹状構造」なる用語は、それらのモノマーの構築ブロック（いくつかは分枝を含む）の選択から組み立てられる有機ポリマーを意味する。
【００８９】
本発明の一実施態様において、プロトラクター基は血清タンパク質結合性リガンドからなる群から選択されるものであり、例えばアルブミンと結合する化合物で、脂肪酸の類のＣ５−Ｃ２４脂肪酸、脂肪族二酸（例えばＣ５−Ｃ２４）である。プロトラクター基の別の例は、生理学的条件下の荷電特性を変える部分、例えばカルボキシル酸またはアミン、またはより小さいアルキル置換基（例えばＣ１−Ｃ５アルキル）のようなグリカン特異的な認識を防止する中性の置換基を含む小有機分子を含む。本発明の一実施態様において、プロトラクター基はアルブミンである。
【００９０】
一実施態様において、化学基は非ポリペプチドである。
【００９１】
興味深い一実施態様において、化学基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、特に５００−１００,０００の範囲の平均分子量を有するもの、例えば１,０００−７５,０００または２,０００−６０,０００のものである。
【００９２】
コンジュゲーションは、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１およびＷＯ０１／５８９３５Ａ２にて開示されているように行うことができる。
【００９３】
タンパク質にコンジュゲーションするための化学基としてのＰＥＧの使用は、特に興味深い。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」なる用語は、ポリエチレングリコール化合物またはそれの誘導体を意味し、カップリング剤、結合または活性化部分（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジルジン（azirdine）、オキシラン、ピリジルジチオ、ビニルスルホン、または好ましくはマレイミド部分）の有無にかかわらない。マレイミドモノメトキシＰＥＧのような化合物は、本発明の活性化ＰＥＧ化合物の典型例である。
【００９４】
ＰＥＧは適切なポリマー分子であり、それはデキストランのような多糖と比較して、架橋結合ができる反応基をほんのわずかしか有しない為である。特に、単官能基のＰＥＧ（例えばメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が興味深く、それはそのカップリング化学が比較的シンプルである為である（一つの反応基だけが、ＦＶＩＩａポリペプチド上の結合基によって結合に利用できる）。従って、架橋結合の危険がないので、得られるＦＶＩＩａコンジュゲートはより均質であって、ＦＶＩＩａポリペプチドを有するポリマー分子の反応が制御し易い。
【００９５】
ＦＶＩＩａポリペプチドにポリマー分子の共有結合による付加を達成するために、ポリマー分子のヒドロキシ末端基は活性型、すなわち活性な官能基で与えられる。適切な活性ポリマー分子は、例えばShearwater社（ハンツヴィル、アラバマ、米国）またはPolyMASC Pharmaceuticals社（英国）から購入できる。あるいは、ポリマー分子は、例えばＷＯ９０／１３５４０にて開示されているような当該分野で知られている通常方法によって活性化することができる。本発明に用いられる活性化線形分子または分枝ポリマー分子の具体例は、Shearwater社の１９９７年および２０００年のカタログ（Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals、Polyethylene Glycol and Derivatives、出典明記により本願明細書に援用）に記載されている。活性化ＰＥＧポリマーの具体的例としては、以下の線形ＰＥＧがあげられる：ＮＨＳ−ＰＥＧ（例えばＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧおよびＳＣＭ−ＰＥＧ、そしてＮＯＲ−ＰＥＧ）、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧ、およびＭＡＬ−ＰＥＧ、およびＰＥＧ２−ＮＨＳおよび米国特許第５９３２４６２号および米国特許第５６４３５７５号（両者を出典明記により本願明細書に援用）で開示されているような分枝ＰＥＧ。さらに、以下の文献（出典明記により本願明細書に援用）は、役立つポリマー分子および／またはＰＥＧ化の化学を開示する：米国特許第５８２４７７８号、米国特許第５４７６６５３号、ＷＯ９７／３２６０７、ＥＰ２２９１０８、ＥＰ４０２３７８、米国特許第４９０２５０２号、米国特許第５２８１６９８号、米国特許第５１２２６１４号、米国特許第５２１９５６４号、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９５／００１６２、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９７／１８８３２、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３２１３９、ＷＯ９９／３２１４０、ＷＯ９６／４０７９１、ＷＯ９８／３２４６６、ＷＯ９５／０６０５８、ＥＰ４３９５０８、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９５／１３３１２、ＥＰ９２１１３１、米国特許第５７３６６２５号、ＷＯ９８／０５３６３、ＥＰ８０９９９６、米国特許第５６２９３８４号、ＷＯ９６／４１８１３、ＷＯ９６／０７６７０、米国特許第５４７３０３４号、米国特許第５５１６６７３号、ＥＰ６０５９６３、米国特許第５３８２６５７号、ＥＰ５１０３５６、ＥＰ４００４７２、ＥＰ１８３５０３およびＥＰ１５４３１６。
【００９６】
ＦＶＩＩａポリペプチドおよび活性ポリマー分子のコンジュゲート化は、例えば以下の文献に記載されているような任意の従来法を用いて行われる（参照には、ポリマー分子の活性化のための適切な方法も記載されている）：R. F. Taylor, (1991), 「Protein immobilisation. Fundamental and applications」, マーセル・デッカー, ニューヨーク; S. S. Wong, (1992), 「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC 出版, ボカ・ラートン; G. T. Hermanson 等, (1993), 「Immobilized Affinity Ligand Techniques」, アカデミックプレス, ニューヨーク)。熟練した当業者であれば、使用するポリペプチドの結合基（その例は上記した）と共にポリマーの官能基（例えばアミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフィドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンまたはハロアセテイトである）に依存して、活性化法および／またはコンジュゲーション化学が使用されることを理解するであろう。ＰＥＧ化は、ＦＶＩＩａポリペプチド上の全ての利用できる結合基（すなわちＦＶＩＩａポリペプチドの表に露出した該付加基）に対してコンジュゲーションを行ってもよく、または一つ以上の特異的な結合基に対して行ってもよい（例えばＮ末端基アミノ基（米国特許第５９８５２６５号））。さらにまた、コンジュゲーションは一段階でまたは段階的方法で達成してもよい（例えばＷＯ９９／５５３７７に記載されている）。
【００９７】
ＰＥＧ化は、結合されたＰＥＧの数、分子のサイズと形状（例えば、それらが線形かまたは分枝か）、ポリペプチドのどこに該分子が結合されるかに関して最適分子を産生するために設計されると理解される。使用するポリマーの分子量は、達成される所望の効果を考慮に入れて選択される。例えば、コンジュゲーションの主要な目的が高分子量およびより大きいサイズ（例えば、腎臓クリアランスを減らすため）を有するコンジュゲートの達成であれば、所望の効果を得るために、１つあるいは少数の高分子量ポリマー分子か、多数のより分子量の小さいポリマー分子のどちらかを結合することを選択してもよい。しかしながら、好ましくは低分子量を有するいくつかのポリマー分子が使われる。
【００９８】
本発明のコンジュゲートの少なくとも大部分の見かけのサイズ（「見かけの分子量」または「見かけの質量」でもよい）が少なくとも約５０ｋＤａ、例えば少なくとも約５５ｋＤａ、少なくとも約６０ｋＤａ、例えば少なくとも約６６ｋＤａであるときに、有利な結果が得られることが更に分かっている。これは、腎臓クリアランスが十分に大きな見かけのサイズを有するコンジュゲートを実質的に除去するという事実によると考えられている。本状況において、ＦＶＩＩａポリペプチドの「見かけのサイズ」は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動方法で測定される。
【００９９】
さらにまた、過剰ポリマー・コンジュゲーションが化学基（例えば非ポリペプチド部分）が結合するＦＶＩＩａポリペプチドの活性の損失を導くことがあると報告されている。この問題は、例えば機能部位に位置する結合基を取り除くことによって、またはコンジュゲーション前に機能部位を可逆的にブロッキングすること、つまりコンジュゲーションの間にＦＶＩＩａポリペプチドの機能部位がブロックされることによって解決できる。具体的には、ＦＶＩＩａポリペプチドと化学基（例えば非ポリペプチド部分）間のコンジュゲーションは、ＦＶＩＩａポリペプチドの機能部位がヘルパー分子（例えばＦＶＩＩａポリペプチドまたはセリンプロテアーゼ阻害剤の機能部位に結合可能な組織因子）によってブロックされる状況下で行うことができる。好ましくは、ヘルパー分子は特定の組織因子において、ＦＶＩＩａポリペプチド（例えば受容体）の機能的部位を特に認識するもので、完全長組織因子または最適に短縮された形態の組織因子、または一方が組織因子で他方がペプチドである２つの分子、または結合して触媒性トリアド（好ましくは、触媒性トリアドの任意の原子の１０Å以内のアミノ酸残基として定義される）周辺の領域を保護しているペプチド阻害剤である。
【０１００】
あるいは、ヘルパー分子は抗体であってもよく、特にＦＶＩＩａポリペプチドを認識するモノクローナル抗体であってもよい。特に、ヘルパー分子は無効化モノクローン抗体であってもよい。
【０１０１】
ＦＶＩＩａポリペプチドは好ましくはコンジュゲーションを遂行する前にヘルパー分子と相互に作用する（しばしば、混合ジスルフィドが還元される工程で使用するものと同じヘルパー分子（例えば阻害剤）を使用することは有利でさえある）。これは、ＦＶＩＩａポリペプチドの機能部位がシールドされているかまたは保護されていることを確実にする。従ってポリマーのような化学基（例えば非ポリペプチド部分）による誘導体化に利用されない。
【０１０２】
ヘルパー分子からの解離に続いて、化学基とタンパク質のコンジュゲートは、少なくとも部分的に保存された機能部位が再生され得る。
【０１０３】
医薬品組成物
本発明に従った二量体および多量体ＦＶＩＩａ化合物は、出血性疾患または出血症状発現の患者の治療ために、または正常な止血系の強化のための医薬組成物として適用できる。上記治療を必要とする患者の例は、すなわち血友病Ａまたは血友病Ｂの治療を受けている患者である。
【０１０４】
別の態様においては、本発明はその範囲に、活性成分として、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物、または製薬的に許容可能な担体または希釈液と共に、製薬的に許容可能なその塩を含む医薬組成物を含む。
【０１０５】
任意には、本発明の医薬組成物は、抗凝固活性を呈する一つ以上の他の化合物（例えば血小板凝集阻害薬）と組み合わせて、二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物を含んでなってもよい。
【０１０６】
本発明の化合物は、化合物および製薬的に許容可能な担体または希釈液から成る医薬組成物に調剤されてもよい。上記担体は水、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリンまたはプロピレングリコール、植物油）を含む。本願明細書で使用する「製薬的に許容可能な担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗カビ剤、防腐剤、等張剤およびその類を含む。任意の従来の媒体は活性成分およびその所望の用途と適合しない場合を除いて、本発明の組成物に使用されることが考えられる。
【０１０７】
組成物は従来の技術によって調製することができて、従来の形態（例えばカプセル、錠剤、溶液または懸濁液）で市場に出される。使用される薬剤担体は、従来の固体または液体担体であってもよい。固体担体の例としては、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸があげられる。液体担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油および水である。同様に、担体または希釈剤は、当業者に知られているあらゆる徐放性物質（グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートなど)を単独か、もしくはワックスと混合した形で含有してよい。製剤はまた、湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤、保存剤、甘味料または香味料を含んでもよい。本発明の製剤は、当該分野で知られている手順を使用することによって、患者への投与後の活性成分の速効性、持続性、後発性放出を提供するために処方することができる。
【０１０８】
医薬品組成物は殺菌することができて、必要に応じて、活性な化合物と有害な反応をしない補助剤、乳化剤、浸透圧を調節する塩、バッファーおよび／または染色剤などを混合することができる。
【０１０９】
投与ルートは経口投与または非経口投与（例えば直腸投与、経皮投与、皮下投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、局所的投与、静脈内投与、尿道内投与、眼内投与または軟膏剤）のような、効果的に活性化合物を適当なまたは所望の作用点へ効果的に輸送する任意のルートであってもよく、経口投与が好ましい。
【０１１０】
固体担体を経口投与に用いる場合は、錠剤またはハードゼラチンカプセル内に入った粉末もしくはペレット形態に調剤するか、あるいはトローチまたはロゼンジの形態に調剤してもよい。固体担体の量は、広い範囲内で様々であるが、通常は約２５ｍｇ〜約１ｇである。
【０１１１】
液体担体が用いられる場合、製剤がシロップ、乳化剤、ソフトゼラチンカプセルまたは無菌の注射可能な液体（例えば水性であるか非水溶液懸濁剤または溶液）の形状であってもよい。
【０１１２】
鼻腔内投与のために、製剤は、エアゾールアプリケーションのための液体担体、特に水性担体に溶解するかまたは懸濁した化学式(I)の化合物を含んでもよい。担体は、可溶化剤（例えばプロピレングリコール）、表面活性薬、吸収促進薬（例えばレシチン（ホスファチジルコリン）またはシクロデキストリン）または防腐剤（例えばパラベン））のような添加物を含んでもよい。
【０１１３】
非経口投与のためには、注射可能な溶液または懸濁液が特に適切であって、好ましくはポリヒドロキシル化されたヒマシ油に溶解した活性化合物の水性溶液である。
【０１１４】
タルクおよび／または糖質の担体または製剤結合剤またはその類を含む錠剤、糖剤またはカプセルは特に内服に適している。錠剤、糖剤またはカプセル用の好ましい担体は、ラクトース、コーンスターチおよび／またはジャガイモスターチを含む。加糖賦形薬が用いられる場合は、シロップまたはエリクシルが使用できる。
【０１１５】
従来の錠剤化技法により調製される典型的錠剤は、
コア：
活性化合物（本発明の化合物の遊離型または塩） １０ｍｇ
コロイド状二酸化ケイ素（Aerosil（登録商標)) １.５ｍｇ
微結晶性セルロース（Avicel（登録商標)) ７０ｍｇ
変性セルロースガム（Ac-Di-Sol（登録商標)) ７.５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム
コーティング：
ＨＰＭＣ 約９ｍｇ
*Ｍｙｗａｃｅｔｔ（登録商標)９−４０Ｔ 約０.９ｍｇ
*フィルムコーティングの可塑剤として用いるアセチル化モノグリセリド
を含んでよい。
【０１１６】
本発明の化合物は、上記したような血栓溶解性または血液凝固性疾患または傷害の該治療、予防、除去、緩和または改善を必要とする哺乳類、特にヒトに投与することができる。上記哺乳類は、例えば家庭のペットのような家畜および野生生物のような非家畜の両方の動物を含む。
【０１１７】
通常、経口投与、鼻腔内投与、肺投与または経皮投与に適している投与形態は、製薬的に許容可能な担体または希釈液に、化学式Ｉの化合物を約０.００１ｍｇから約１００ｍｇを、好ましくは約０.０１ｍｇから約５０ｍｇを含む。
【０１１８】
経口投与、直腸投与、非経口投与（皮下投与を含む）の経路に関係なく、製薬的に許容可能な担体または希釈液と同時に、並行して、共に投与することができる。化合物は、しばしば、および好ましくは、それのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩の形である。
【０１１９】
適切な用量範囲は、正確な投与様式、投与形態、投与が向けられる適応症、関与する患者およびその体重、そして担当医又は獣医の好み及び経験に応じて、上記のように変化する。
【０１２０】
本発明は以下の実施例で更に例示されるが、これは保護の範囲を制限するものとして解釈されるものではない。前述の説明および以下の実施例において開示される特徴は、その両方を別々でまたはいかなる組合せでも、本発明が多様な形態をとることを理解するための材料である。
【実施例】
【０１２１】
実施例1
材料−還元型および酸化型グルタチオン（それぞれ、ＧＳＨおよびＧＳＳＧ）、システイン（Ｃｙｓ）、ＤＬ-ホモシステイン（ｈＣｙ）、システイニルグリシン（ＣＧ）およびγ-グルタミルシステイン（γ-ＧＣ）は、シグマ社から購入した。システアミン（Ｃｙａ）および７-フルオロベンゾフラザン-４-スルホン酸アンモニウム塩（ＳＢＤ-ｆ）は、Ｆｌｕｋａ社より得た。トリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）から購入した。クロモジェニックＳ-２２８８基質は、クロモジェニック社（ミラノ、イタリア）から得た。ＰＥＧ５ｋ-マレイミド（２Ｅ２Ｍ０Ｈ０１）、ＰＥＧ２０ｋ-マレイミド（２Ｅ２Ｍ０Ｐ０１）、ＰＥＧ４０ｋ-マレイミド（２Ｄ３Ｙ０Ｔ０１）およびマレイミド-ＰＥＧ３.４ｋ-マレイミド（２Ｅ２Ｅ０Ｆ０２）は、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（ハンツヴィレ、アラバマ州）から購入した。ｄ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅ-Ａｒｇ-クロロメチルケトンは、Ｂａｃｈｅｍから購入した。トリフェニルホスフィン-３,３',３"-トリスルホン酸は、アルドリッチ社から得た。ヒト血漿由来ＦＸおよびＦＸａは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（サウスベンド、インディアナ州）から得た。ビオチン-ポリエチレンオキサイド-ヨードアセトアミド（ビオチン-ＰＥＯ-ヨードアセトアミド）は、シグマ社（ミズーリ、米国）のものである。可溶性組織因子１-２１９（ｓＴＦ）は、公表されている手順（Freskgard等、1996）に従って調製した。ｓＴＦ（１-２１９）Ｇｌｕ２１９→Ｃｙｓ（Ｅ２１９Ｃ）は、基本的に以前の記載に従って調製した（Owenius等、1999）。組換えＦＶＩＩａの発現および精製は、以前の記載に従って行った（Thim等、1988；PerssonとNielsen，1996）。他の全ての化学薬品は、分析用等級以上であった。
【０１２２】
濃度測定−原液のＧＳＳＧの濃度は、３８１Ｍ-１ｃｍ-１の吸光係数を使用して２４８ｎｍの吸収から測定した（ChauとNelson，1991）。ＧＳＨおよび他の低分子量のチオールの濃度は、エルマン試薬（５,５'-ジチオビス（２-ニトロ安息香酸））および１４１５０Ｍ-１ｃｍ-１を使用して、４１２ｎｍで２-ニトロ-５-チオ安息香酸のモル吸光係数として測定した（Riddles等、1979）。
【０１２３】
ＨＰＬＣによるＧＳＳＧの定量化−ＧＳＳＧの定量化は、基本的に他の文献の記載に従ってに実施した（TakahashiとCreighton，1996）。簡潔には、酸で反応停止した５０μｌサンプルを、３０℃に維持したＣ１８逆相カラム（Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）１００Å，３μｍ粒径，４.６×５０ｍｍ；Phenomenex Inc.、トランス、カリフォルニア州）へロードした。１００％溶出液Ａ（０.１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液）で５分間均一濃度で泳動後、ＧＳＳＧは１ｍｌ／ｍｉｎの流速で５分間０−５％の溶出液Ｂ（０.０８５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡアセトニトリル溶液）の直線濃度勾配によって溶出し、２１４ｎｍの吸収によって検出した。ＧＳＳＧの濃度は、算出ピーク面積（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ ｖ４.０ソフトウェア、Waters）を、ＧＳＳＧの既知量によって作った標準曲線と比較して測定した。直線性は、ＧＳＳＧの２−２５ｎｍｏｌの範囲で観察された。
【０１２４】
ＨＰＬＣによるチオール修飾ＦＶＩＩａ４０７Ｃの分析−遊離およびチオール修飾ＦＶＩＩａ４０７Ｃ種は、４５℃に保ったＣ３逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ-Ｃ３，２.１×１５０ｍｍ，５-μｍ粒径；Agilent Technologies，デンマーク）を用いたＨＰＬＣによって分析した。流速は０.５ｍｌ／ｍｉｎであり、移動相は０.１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液（溶出液Ａ）および０.０８５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡアセトニトリル溶液（溶出液Ｂ）を含む。酸で反応停止した２５μｌサンプルの注入後、システムは５分間の３０％均一濃度の溶出液Ｂの後に、２０分にわたる３８−４１.５％の直線濃度勾配の溶出液Ｂおよび２０分にわたる４１.５−５５％の溶出液Ｂを続けて流した。溶出は蛍光によってモニタした（励起波長および蛍光波長は、それぞれ２８０および３４８ｎｍ）。
【０１２５】
ＦＶＩＩ４０７Ｃ突然変異体をコードするＤＮＡのコンストラクト−ＦＶＩＩａ４０７ＣをコードするＤＮＡコンストラクトは、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１に記載されているように構築した。
【０１２６】
ＦＶＩＩＱ２５０Ｃ突然変異体をコードするＤＮＡのコンストラクト−ＦＶＩＩａＱ２５０ＣをコードするＤＮＡコンストラクトは、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１に記載されているように構築した。
【０１２７】
ＦＶＩＩＲ３９６Ｃ突然変異体コードするＤＮＡのコンストラクト−ＦＶＩＩａＲ３９６ＣをコードするＤＮＡコンストラクトは、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１に記載されているように構築した。
【０１２８】
ＦＶＩＩ４０７Ｃの発現および精製−ＢＨＫ細胞は、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ変異体の発現を得るために、基本的に以前に記載されているように（Thim等，1988；PerssonとNielsen，1996）形質移入した。ＦＶＩＩポリペプチドは、以下に従って精製した：
熟成した培地は、５ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００および１０ｍＭのトリスを加え、ｐＨ８.０に調製し、伝導率１０−１１ｍＳ／ｃｍに水添加で調製した後、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの２５ｍｌのカラム（アマシャム・バイオサイエンス社，ＧＥヘルスケア）にロードした。タンパク質の溶出は、１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（ｐＨ８.０）から１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（ｐＨ７.５）までの勾配によって達成した。ＦＶＩＩａ４０７Ｃを含む分画をプールし、ＣＮＢｒ活性セファロース４Ｂ（アマシャム・バイオサイエンス社，ＧＥヘルスケア）に結合させたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２（ノボ・ノルディスクA／Ｓ社、Bagsvard、デンマーク）を含む２５ｍｌカラムにアプライした。カラムは１０ｍＭのＣａＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０.０２％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.５）によって平衡化した。平衡化バッファーおよび２ＭのＮａＣｌを含む平衡化バッファーで洗った後、結合した物質をＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭのＥＤＴＡを含む平衡化バッファーで溶出させた。保存の前に、ＦＶＩＩａ４０７Ｃは透析によって５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０のバッファーへ移した。各工程の収量は第ＶＩＩ因子ＥＬＩＳＡ測定により求め、精製したタンパク質はＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１２９】
ＦＶＩＩＱ２５０Ｃの発現と精製−ＢＨＫ細胞は、ＦＶＩＩａＱ２５０Ｃ変異体の発現を得るために、基本的に以前に記載されているように（Thim等，1988；PerssonとNielsen，1996）形質移入した。ＦＶＩＩポリペプチドは、以下に従って精製した：
熟成した培地は、５ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００および１０ｍＭのトリスを加え、ｐＨ８.０に調製し、伝導率１０−１１ｍＳ／ｃｍに水添加で調製した後、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの２５ｍｌのカラム（アマシャム・バイオサイエンス社，ＧＥヘルスケア）にロードした。タンパク質の溶出は、１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（ｐＨ８.０）から１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（ｐＨ７.５）までの勾配によって達成した。ＦＶＩＩａＱ２５０Ｃを含む分画をプールし、ＣＮＢｒ活性セファロース４Ｂ（アマシャム・バイオサイエンス社，ＧＥヘルスケア）に結合させたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２（ノボ・ノルディスクA／Ｓ社、Bagsvard、デンマーク）を含む２５ｍｌカラムにアプライした。カラムは１０ｍＭのＣａＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０.０２％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.５）によって平衡化した。平衡化バッファーおよび２ＭのＮａＣｌを含む平衡化バッファーで洗った後、結合した物質をＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭのＥＤＴＡを含む平衡化バッファーで溶出させた。保存の前に、ＦＶＩＩａＱ２５０Ｃは透析によって５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０のバッファーへ移した。各工程の収量は第ＶＩＩ因子ＥＬＩＳＡ測定により求め、精製したタンパク質はＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１３０】
ＦＶＩＩＲ３９６Ｃの発現と精製−ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃの発現と精製は、ＷＯ０２／０７７２１８Ａ１に記載に従って行った。
【０１３１】
グルタレドキシンのクローニングと発現−大腸菌グルタレドキシン２（Ｇｒｘ２）および酵母グルタレドキシン１（ｙＧｒｘ１ｐ）の配列をコードしているＤＮＡは、プライマー対ｏＨＯＪ９８-ｆ／ｏＨＯＪ９８-ｒおよびｏＨＯＪ１１-ｆ／ｏＨＯＪ１１-ｒをそれぞれ使用して、それぞれの側近にＮｄｅＩとＸｈｏＩの制限サイトが導入されるように、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム （ロシュ・ダイアグノスティックス社，インディアナポリス、インディアナ州）を使用して製造業者の推奨法に従ってＰＣＲ増幅した（プライマー配列は表１に示す）。
【０１３２】
表１−それぞれ大腸菌グルタレドキシン２（Ｇｒｘ２）、酵母グルタレドキシン１（ｙＧｒｘ１ｐ）およびｙＧｒｘ１ｐ Ｃ３０Ｓを発現するプラスミドｐＨＯＪ２９４、２１０および２８６の構築に使用したＤＮＡオリゴ。ＮｄｅＩとＸｈｏＩの制限サイトは太字で表す。
【表１】
【０１３３】
ＰＣＲ反応のためのゲノム鋳型ＤＮＡは、公開されている手順に従ってＥ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから調製した（Grimberg等，1989；HoffmanとWinston，1987）。精製したＰＣＲ産物は、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切った後、ｐＥＴ-２４ａ（＋）（ノバジェン）の対応するサイトに連結し、それぞれｐＨＯＪ２９４およびｐＨＯＪ２１０を作った。終止コドンがベクターによって生じたので、２つの遺伝子に３'ベクター由来のＣ末端ＬＥＨＨＨＨＨＨアフィニティタグをコードするエクステンションを加えた。ｙＧｒｘ１ｐ Ｃｙｓ３０→Ｓｅｒ（ｙＧｒｘ１ｐ Ｃ３０Ｓ）をコードするプラスミドｐＨＯＪ２８６は、製造業者の指示書（ストラタジェン，ラホイヤ, カリフォルニア州）に従って、プライマーｏＨＯＪ８８-ｆ／ｏＨＯＪ８８-ｒおよびテンプレートとしてｐＨＯＪ２１０を用いたＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ 突然変異生成によって構築した。全クローン配列の同一性の正確性は、ＤＮＡ塩基配列決定によって検証した。
【０１３４】
発現のために、ｐＨＯＪ２１０、２８６および２９４のプラスミドは、ケミカルコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）セル（ストラタジェン，ラホイヤ, カリフォルニア州）に導入した。新鮮なオーバーナイト形質転換体は、当初のＯＤ６００が０.０２で、３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５００ｍｌのテリフィック培養液（Sambrook等、1989）に接種した。培養株は、対数増殖期（ＯＤ６００ ３−４）まで、バッフル付フラスコで２３０ｒｐｍ、３７℃でインキュベートし、対数増殖期に温度を２５℃まで下げてタンパク発現を０.１ｍＭのイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＴＰＧ）で誘導した。オーバーナイトで発現させた後、細胞を遠心によって集めて５０ｍｌ溶解バッファー（５０ｍＭのリン酸カリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.０）に再懸濁し、３回の凍結融解サイクルで溶解した。透明な溶菌液は、溶解バッファーによって平衡化した２０ｍｌのＮｉ-ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（キアゲン ＧｍｂＨ社 Hilden,ドイツ）カラムに５ｍｌ／ｍｉｎの流速でロードした。溶解バッファーで洗った後に、結合したタンパク質は、溶解バッファーに０−２００ｍＭの直線濃度勾配イミダゾールによって溶出した。ピーク分画をプールし、５０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８.０に対する広範囲な透析の前に２０分間の２０ｍＭのジチオスレイトールによって処理した。タンパク質は、−８０℃で保存し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって純粋（＞９０％）であると判断した。濃度は、５２４０Ｍ-１ｃｍ-１（ｙＧｒｘ１ｐおよびｙＧｒｘ１ｐ Ｃ３０Ｓ）および２１７４０Ｍ-１ｃｍ-１（Ｇｒｘ２）の吸光係数を使用して２８０ｎｍの吸光指数によって推定した。
【０１３５】
ＦＶＩＩａ４０７Ｃと混合ジスルフィドで結合している低分子量チオールの同定−
蛍光ＳＢＤ誘導体化低分子量チオールのＨＰＬＣ検出は、Ｏｅ等（１９９８）の記載に、マイナーな変更を加えて実施した。簡潔に述べると、ジスルフィド還元とその後の遊離チオールの誘導体化は、２５μｌの１０μＭのＦＶＩＩａ４０７Ｃ（または野生型ＦＶＩＩａ）を５μｌの１４ｍＭのＴＣＥＰ（水溶物）と１０μｌの０.３％ＳＢＤ-ｆ（水溶物）を含む１６０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、８ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ９.６）バッファー中で６０分間６０℃でインキュベートすることで実施した。その後、誘導体化は２μｌの５ＭのＨＣｌの添加によって停止させ、サンプルは更なる分析まで４℃に置いた（２４時間以内）。ＨＰＬＣ分析は、逆相Ｃ１８（２）カラム（Ｌｕｎａ，１００Å，３.５μｍ粒径，１５０×４.６ｍｍ；Phenomenex Inc., トランス, カリフォルニア州）にサンプルの２５-μｌ分割量を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で注入することによって実施した。カラムの温度は３０℃に維持した。ＳＢＤ誘導体化チオールは７５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ２.９０および２％メタノールを含む移動相を使用して一定濃度溶出によって分離し、３８６ｎｍ励起により５１６ｎｍで発する蛍光によって検出した。ピークの同定は、ＦＶＩＩａ４０７Ｃの上記した手順に従って調製した既知の低分子量チオール化合物の一連との保持時間の比較によって行った。ＧＳＨ、γ-ＧＣ、ＧＣ、Ｃｙｓ、ＨｃｙおよびＣｙａの定量化のための較正曲線は、最終反応混合物中の各チオール濃度を０.４から３.５μＭまで変化させることによって得た。
【０１３６】
この分析から、ＦＶＩＩａ４０７Ｃに結合する主要な低分子量チオールがグルタチオン、システインおよびホモシステインであると結論することができる。結果は、図１に示す。
【０１３７】
ＦＶＩＩａの酸化還元滴定−ＦＶＩＩａＣｙｓ変異体の選択還元に適する条件を同定するために、ＦＶＩＩａの構造安定性を、基本的に他の文献の記載に従って（Loferer等、1995）、ＧＳＨおよびＧＳＳＧの濃度を変化させることによって得られた規定済みの酸化還元能力を有するバッファーにおいて評価した。ＦＶＩＩａの２つの最も不安定なジスルフィド結合の還元がアｓＴＦ結合性およびミド分解活性の損失（Higashi等、1997）と関係していることが示されているので、ＦＶＩＩａの構造の保全性は、ｓＴＦの存在下で発色体基質Ｓ-２２８８を加水分解するその能力によってモニタした。
【０１３８】
ＦＶＩＩａ（１μＭ）の酸化還元滴定は、５０μＭのＧＳＳＧを含み、様々なＧＳＨ濃度（０−３４ｍＭ）の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０のバッファー（徹底的に窒素をパージしたもの）で行った。さらに、一連のサンプルは、２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジン（Ｓ１ポケットを占有しているＦＶＩＩａの活性部位阻害剤）を含む（Sichler等，2002；Persson等，2004）。平衡に達するまでに要する時間を減らすために、反応は酸化還元触媒として作用する１μＭのｙＧｒｘ１ｐの存在下で行った（Ostergaard等，2004）。窒素雰囲気下３０℃で３.５時間のサンプルの平衡化の後、残余アミド分解活性は、後述するように測定した。同時に、反応混合物のアリコートは、等量の１００ｍＭのＨＣｌで反応停止し、材料および方法において記載したようにＧＳＳＧの平衡濃度はＨＰＬＣで測定した。
【０１３９】
残余アミド分解活性の測定のために、平衡化サンプルの２０μｌは、遊離チオールを急速にアルキル化し、続くチオール酸化を防止するために、１０ｍＭのヨードアセトアミドを含む分析バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７.４）で２０倍希釈した。活性分析は、８０ｎＭのｓＴＦおよび最終濃度１０ｎＭのＦＶＩＩａの反応停止させたサンプルを含む最終容量２００μｌの分析バッファーでポリスチレンマイクロタイタープレート（ヌンク，デンマーク）において行った。室温で１５分のプレインキュベーションの後、１ｍＭの発色体基質Ｓ-２２８８を加え、吸光度はＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯソフトウェア（ｖ２．２；Molecular Devices Corp.,サニーベール、カリフォルニア州）を装備したＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ３４０マイクロプレート分光光度計で２０分間の４０５ｎｍで連続的にモニタした。アミド分解活性は、ブランク補正後、リニア反応進行曲線の傾斜として報告した。
【０１４０】
データは以下の反応（式１）によって分析した。ここで、ＦＶＩＩａは一つの分子内ジスルフィド結合の可逆的還元によって不活性ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａｉと表す）に変化する：
【数１】
逆反応（Ｋｏｘ）の推定平衡定数は、以下の関係（式２）から推定することができる
【数２】
[上式中、ｆは所与の［ＧＳＨ］２／［ＧＳＳＧ］における残余アミド分解活性であり、ａｍａｘは低［ＧＳＨ］２／［ＧＳＳＧ］時の極限アミド分解活性である]。
【０１４１】
カレイドグラフソフトウェア（ｖ３.６、シナジーソフトウェア）を使用して非線形最小２乗法回帰によって酸化還元滴定データを式２に当てはめることにより、２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジンの非存在下または存在下において、それぞれ見かけのＫｏｘ９３±６ｍＭおよび１６６±１６ｍＭを得た。
【０１４２】
ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-グルタチオン混合ジスルフィドの酸化還元滴定−グルタチオンとＣｙｓ４０７の間の混合ジスルフィドの安定性は、１３μＭのＦＶＩＩａ４０７Ｃを、０.５ｍＭのＧＳＨを含む、様々なＧＳＳＧ濃度（５−５００μＭ）の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０でインキュベートすることで測定した。更に、全サンプルは、反応を触媒するために１０μＭのＧｒｘ２を含む。３０℃、５時間の平衡化の後、５０μｌアリコートは１００ｍＭのＨＣｌで反応停止させ、材料および方法にて説明したように、ＧＳＳＧの平衡濃度はＨＰＬＣで測定した。脱グルタチオン化ＦＶＩＩａ４０７Ｃの相対量を測定するために、各サンプル２０μｌを１５μｌの１.６ｍＭのＰＥＧ５ｋ-マレイミドと結合させることによって、遊離チオールをＰＥＧ５ｋ標識した。室温で１８分のインキュベート後、更なる（非特異的）タンパク質のＰＥＧ化を競争的に抑制するために、次の処理の間、Ｎ-エチルマレイミドを最終濃度２５ｍＭで加えた。各サンプルのＰＥＧ５ｋ修飾ＦＶＩＩａ４０７Ｃは、材料および方法にて説明したように、ＨＰＬＣによって検出し定量化した。
【０１４３】
データは以下の反応（式３）に従って分析し、グルタチオン化ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＧＳＨ）はＧＳＨと反応し、遊離ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＧＳＳＧを生じる。
【数３】
逆反応の推定平衡定数（Ｋｓｃｏｘと表す）は、以下の関係式（式４）から推定することができる。
【数４】
[上式中、Ａ４０７Ｃ−ＰＥＧ５ｋは、既知の［ＧＳＨ］／［ＧＳＳＧ］比における５ｋ-ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ４０７Ｃのピーク面積であり、Ａｍａｘは高［ＧＳＨ］／［ＧＳＳＧ］時の極限ピーク面積である。]
【０１４４】
平衡時の［ＧＳＨ］／［ＧＳＳＧ］比に対する測定されたピーク面積のプロットを図３に示す。カレイドグラフソフトウェア（ｖ３.６、シナジーソフトウェア）を使用して非線形最小２乗法回帰によってデータを式４に当てはめることにより見かけのＫｓｃｏｘ値１.０が得られ、これは他のグルタチオン化タンパク質の範囲で測定された値と非常に類似していた（Gilbert，1995）。
【０１４５】
最適還元条件の特定−ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-混合ジスルフィドの選択還元を支える最適なグルタチオン酸化還元条件は、［ＧＳＳＧ］の作用として以下のパラメータのプロットから特定した：（１）式２および見かけのＫｏｘ値を用いたｐ-アミノベンズアミジンの存在下または非存在下の残余アミド分解活性、および（２）式４およびＫｓｃｏｘからの選択的に還元したタンパク質の分数。実際的な理由のために、ＧＳＨ濃度は０.５ｍＭに設定した。図４に示すように、０.５ｍＭのＧＳＨ存在下でＧＳＳＧ濃度がおよそ１５と６０μＭの間は、残余活性が＞９０％および遊離Ｃｙｓ４０７が＞９０％という結果である。［ＧＳＳＧ］の最適作用範囲は、（図３−５に例示するように）ＧＳＨ濃度、ＫｏｘおよびＫｓｃｏｘ（図示せず）の値および還元反応中のアミド分解活性の許容損失を含むいくつかのパラメータに依存する。
【０１４６】
選択還元およびＦＶＩＩａ４０７ＣのＰＥＧ５ｋ、ＰＥＧ２０ｋ、およびＰＥＧ４０ｋ修飾-ＦＶＩＩａ４０７Ｃのチオール修飾は、３つの連続的な工程に分けることができる：（Ａ）グルタレドキシン触媒還元反応、（Ｂ）チオール特異性アルキル化、および（Ｃ）精製。各工程の終了後、反応混合液の少量のアリコートは、１０％（ｖ／ｖ）ギ酸によって反応停止し、材料および方法にて説明および図７において例示するように、ＨＰＬＣによって分析した。
【０１４７】
（Ａ）ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（４.８ｍｇ）は、０.５ｍＭのＧＳＨ、１５μＭのＧＳＳＧ、２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジンおよび１０μＭのＧｒｘ２を含む、総体積４.４ｍｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０のバッファーで、３０℃４.５時間インキュベートした。ＧＳＳＧの当初濃度は、反応の間、ＧＳＳＧ形成を補償するために、最適作用範囲（図４の影をつけた面積）の下端にした。（Ｂ）その後、遊離チオールは、最終濃度０.８ｍＭに、ＰＥＧ５ｋ-マレイミド、ＰＥＧ２０ｋ-マレイミドまたはＰＥＧ４０ｋ-マレイミド（水溶物）の付加によって修飾した。チオールアルキル化は、０.５ｍＭのシステインによる反応停止まで、室温で１５分間進行させた。（Ｃ）ＥＤＴＡを過剰カルシウム（最終濃度２０ｍＭ）として加え、ＦＶＩＩａ４０７Ｃを捕獲するために、バッファーＡ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.０）で平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦカラム（アマシャム・バイオサイエンス社, ＧＥヘルスケア）に全容量をロードした。バッファーＡによる洗浄後、結合したタンパク質のワンステップ溶出を、ＨｉＴｒａｐカラムの前に取り付けたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １６／６０ｐｇカラム（アマシャム・バイオサイエンス社）上で直接に、バッファーＢ（１０ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０.０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７.０）によって行った。ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化種は、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で分離し、２８０ｎｍの吸収によって検出した。
【０１４８】
選択還元およびＦＶＩＩａ４０７ＣのＰＥＧ３.４またはＰＥＧ２０ｋ架橋−選択還元は、０.５ｍＭのＧＳＨを含み、１０μＭのＧＳＳＧ、２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジンおよび１０μＭのＧｒｘ２を含む、総体積４.４ｍｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ７.０のバッファーで４.５時間、３０℃でインキュベートすることで行った。その後、ＥＤＴＡを過剰カルシウム（最終濃度２０ｍＭ）として加え、ＦＶＩＩａ４０７Ｃを捕獲するために、バッファーＡ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.０）で平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦカラム（アマシャム・バイオサイエンス社, ＧＥヘルスケア）に全量をロードした。結合していないグルタチオン・バッファーおよびＧｒｘ２ｐを除去するためにバッファーＡによる洗浄後、ＦＶＩＩａ４０７ＣはバッファーＢ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７.０）でワンステップで溶出させた。該溶出液中のＦＶＩＩａ４０７Ｃの濃度は、６２・１０３Ｍ-１ｃｍ-１の吸光係数を使用して２８０ｎｍの吸光度で測定した。架橋結合は、約０.６相当のマレイミド-ＰＥＧ３.４ｋ-マレイミドまたはマレイミド-ＰＥＧ２０ｋ-マレイミドの存在下で、室温で１.５時間行った。（Ｃ）ＥＤＴＡを過剰カルシウム（最終濃度２０ｍＭ）として加え、ＦＶＩＩａ４０７Ｃを捕獲するために、バッファーＡ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.０）で平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦカラム（アマシャム・バイオサイエンス社, ＧＥヘルスケア）に全容量をロードした。バッファーＡによる洗浄後、ＰＥＧ化で非ＰＥＧ化種を分離するために、結合したタンパク質のワンステップ溶出を、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １６／６０ｐｇカラム（アマシャム・バイオサイエンス社)上で直接、バッファーＢ（１０ｍＭのＧｌｙＧｌｙ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０.０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７.０）によって実施した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎで、タンパク質は２８０ｎｍの吸収によって検出した。
【０１４９】
ＦＶＩＩａ４０７Ｃ，ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ５ｋ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ４０ｋおよびＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７ＣのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析−ＦＶＩＩａ４０７Ｃ、および５ｋ、２０ｋ、４０ｋおよび３.４ｋＰＥＧ化化合物（各約１.５μｇ）は、製造業者の推奨に従って、４−１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社，カールスバット、カリフォルニア州）上で、ＭＥＳバッファー（インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社，カールスバット、カリフォルニア州）により２００Ｖで３５分間泳動する還元および非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。ゲルは、水で洗浄し、製造業者の推奨に従ってＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社，カールスバット、カリフォルニア州）で染色した。ゲルは、図８に示す。
【０１５０】
ＦＶＩＩａ４０７Ｃ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃ、およびＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ-ＦＶＩＩａ４０７ＣのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析−タンパク質（各約１μｇ）は、製造業者の推奨に従って、４−１２％のビストリスＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル(インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社, カールスバット、カリフォルニア州)上で、ＭＥＳバッファー(インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社, カールスバット、カリフォルニア州)により２００Ｖで３５分間泳動する、還元および非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。ゲル類は、水で洗い、製造業者の推奨に従ってＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ(インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社, カールスバット、カリフォルニア州) で染色した。ゲルは、図９に示す。
【０１５１】
ＦＶＩＩａ４０７Ｃ，ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ５ｋ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ４０ｋ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃの活性部位滴定−基本的に他の文献（Bock, 1992)の記載に従って、ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＰＥＧ化化合物の活性部位濃度はｄ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅ-Ａｒｇ-クロロメチルケトン（ＦＦＲ-ｃｍｋ）の半化学量論的レベルによる滴定におけるアミド分解活性の不可逆性の損失から推定した。簡潔に述べると、各タンパク質は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７.０バッファーに、２８０ｎｍで６２・１０３Ｍ-１ｃｍ-１の吸光係数を使用して約３００ｎＭの濃度にに希釈した。希釈したタンパク質（２０μｌ）は、その後２０μｌの１.５μＭのｓＴＦおよび２０μｌの０−１.２μＭのＦＦＲ-ｃｍｋ（ＤＭＳＯに溶解したＦＦＲ-ｃｍｋストックから新しく調製し、−８０℃で保存したもの）と結合させた。室温で一晩インキュベート後、残余アミド分解活性を測定した。
【０１５２】
活性分析は、５０ｎＭのｓＴＦおよび約１０ｎＭのＦＶＩＩａを含むサンプルの１０倍の希釈に相当する最終量２００μｌの分析バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０.０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７.４）で、ポリスチレン・マイクロタイタープレート（ヌンク, デンマーク）上で行った。室温で１５分のプレインキュベーションの後、１ｍＭの発色体基質Ｓ-２２８８を加え、吸光度はＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯソフトウェア（ｖ２.２；Molecular Devices Corp., サニーベール、カリフォルニア州）を装備したＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ３４０マイクロプレート分光光度計で２０分間の４０５ｎｍで連続的にモニタした。アミド分解活性は、ブランク補正後、リニア反応進行曲線の傾斜として報告した。アミド分解活性が完全に消滅しているＦＦＲ-ｃｍｋを最小濃度として、活性部位濃度は外挿法で測定した。
【０１５３】
表２に、２８０ｎｍのタンパク質の吸光度を比例する測定された活性部位濃度を示す。値は、ＦＶＩＩａ４０７Ｃを１００％に正規化している。
表２−ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＰＥＧ化変異体の特異的な活性部位濃度。特異的な活性部位濃度は、２８０ｎｍのタンパク質の吸光度に対するＦＦＲ-ｃｍｋ滴定よる活性部位濃度として測定した。値は、ＦＶＩＩａ４０７Ｃを１００％に正規化している。
【表２】
【０１５４】
固定化された可溶組織因子に結合するＦＶＩＩａ４０７Ｃ、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃの表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分析−ＦＶＩＩａ４０７ＣおよびＰＥＧ化変異体の固定された可溶な組織因子に対する結合性は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００計測器（ビアコアＡＢ社, ウプサラ, スウェーデン)上の表面プラスモン共鳴分析によって分析した。固定化の前に、ｓＴＦ Ｅ２１９Ｃは、２０分間ｐＨ７.０でタンパク質を２ｍＭのビオチン-ＰＥＯ-ヨードアセトアミドと作用させることによって、その遊離システインでビオチン化した。続いて、５ｍＭのＣａＣｌ２を含むＨＢＳ-Ｐバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０,００５％Ｐ２０；ビアコアＡＢ社, ウプサラ, スウェーデン)で平衡化したＮＡＰＴＭ５カラム(アマシャム・バイオサイエンスＡＢ社, ウプサラ、スウェーデン)でゲル濾過によって、過剰な試薬は除去した。ビオチン化されたｓＴＦ Ｅ１９Ｃは、ＳＡセンサーチップ（ビアコアAB社, ウプサラ, スウェーデン）のフローセル２に２.２ｆｍｏｌ／ｍｍ２（〜５０ＲＵ）の密度で固定した。接触分析は、自動インライン対照減算のための無処置のフローセル１を使用して、泳動バッファー（５ｍＭのＣａＣｌ２を含むＨＢＳ-Ｐバッファー）で、３０μｌ／ｍｉｎの流速で実施した。１００ｎＭから約５ｎＭまでのタンパク質の連続希釈を分析した。泳動バッファー中でのフローセルの３分間の平衡化後、ＫＩＮＪＥＣＴコマンドを使用して、９０μｌのタンパク質サンプルを注入した。溶出相は９分持続し、再生はＨＢＳ-Ｐバッファーの２０ｍＭのＥＤＴＡの３分間パルスによって実施した。ＳＰＲデータは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４.１ソフトウェア（ビアコア社、ウプサラ、スウェーデン）を使用して、１：１ラングミュア結合モデルに合てはめた。結果は、表３に示す。
【０１５５】
表３−ＦＶＩＩａ４０７Ｃおよび二量体変異体の固定されたｓＴＦに対する結合性の表面プラスモン共鳴分析。解離定数（ＫＤ）は、測定された対合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）化学反応速度定数から算出した。
【表３】
【０１５６】
トリフェニルホスフィン-３,３',３"トリスルホン酸を使用するＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ-混合ジスルフィドの還元−トリフェニルホスフィン-３,３',３"トリスルホン酸を使用するＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ-混合ジスルフィドの小スケールの還元は、以下に従って行った：ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ（４.４μＭ）は、５０ｍＭのｐ-アミノベンズアミジンを含む総体積５０μｌの反応バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７.０）中で、２.５または５.０ｍＭどちらかのＰＰｈ３Ｓ３で処理した。室温で１６.３時間のインキュベーションの後、過剰な還元体を取り除くために、製造業者の指示に従って、反応混合液（３０μｌ）は、再水和したＰｒｏ・ＳｐｉｎＴＭスピンカラムで脱塩した。その後、遊離チオールは、室温で１０分間、０.２ｍＭのＰＥＧ５ｋ-マレイミドでアルキル化した。ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＦＶＩＩａＲ３９６Ｃは、製造業者の推奨に従って４−１２％のビストリスゲル（インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社，カールスバット、カリフォルニア州）をＭＥＳバッファーで３５分間２００Ｖ泳動する還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離した。製造業者の指示に従って、Ｓｉｍｐｌｙ ＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ (インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社, カールスバット、カリフォルニア州)によるゲル染色を行った。ゲルは、図１０Ａに示す。
【０１５７】
ＰＰｈ３Ｓ３によるインキュベーション前後のＦＶＩＩａＲ３９６Ｃのアミド分解活性は、２００μｌ（総体積）の５０ｍＭのｓＴＦを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７.４である３２０倍希釈の反応混合液によって測定した。室温で、１５分のプレインキュベーション後、１ｍＭの発色体基質Ｓ-２２８８を加え、吸光度はＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯソフトウェア（ｖ２.２；Molecular Devices Corp., サニーベール、カリフォルニア州)を装備したＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ３４０マイクロプレート分光光度計で２０分間の４０５ｎｍで連続的にモニタした。アミド分解活性は、ブランク補正後、リニア反応進行曲線の傾斜として報告した。結果は、図１０Ｂに示す。
【０１５８】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの露出したジスルフィドの選択還元−トリアリールホスフィン１（アルドリッチ社製のトリフェニルホスフィン-３,３',３"トリスルホン酸の三ナトリウム塩）は、対応する３,３'-ビス-スルホン酸２のほぼ５％を含む。従って、１は０.１％トリフルオロ酢酸の存在下で、アセトニトリル水溶液の濃度勾配によって溶出する標準の逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【化７】
【０１５９】
トリフェニルホスフィン-３,３',３"トリスルホン酸（２.５ｍＭ）は、活性化部位阻害剤４-アミノベンズアミジンと組合わせて、グルタチオンとＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ間の露出したジスルフィド結合を基本的にアミド分解活性の損失なしに還元するために用いることができることが分かっている。混合ジスルフィド結合の還元分解反応は、ＰＥＧ５ｋ-マレイミドで遊離したシステインの後に続く修飾によって示された。
【０１６０】
トリアリールホスフィン１−３（１０ｍＭ）は、個々に室温で１時間、ｒＦＶＩＩａと共にインキュベートした。１の存在下では、ｒＦＶＩＩａはその活性の大部分を保持した。対照的に、３,３'-ビス-スルホン酸２は、非常に類似した４,４'-ビス-スルホン酸３（アルドリッチ社製の二カリウム塩）のように、酵素のアミド分解活性の急速な減少を引き起こしたので、ｒＦＶＩＩａの還元に最適であるとみなされなかった。
【０１６１】
さらにまた、１のシスチンジメチルエステル５を還元する能力を試験した。反応は室温で１の１５ｍＭ濃度の水溶液で行った。基質は、５ｍＭ濃度で存在した。ＬＣ-ＭＳ分析によって、５のジスルフィド結合が所与の条件下で還元することを証明した。
【化８】
【０１６２】
より多くの立体障害型トリアリールホスフィン４（Ｓｔｒｅｍ製の三ナトリウム塩）がｒＦＶＩＩａに対しほぼ不活性であるとわかり、より選択的な還元剤を開発する可能性を示唆した。化合物９−１１は、選択的なジスルフィド還元剤であると期待されるトリアリールホスフィンの非制限的な例を示す。
【０１６３】
実施例２
材料−ＦＶＩＩＩ欠乏血漿は、ジョージ・キング・バイオメディカル社（カンサス、米国；製品番号０８００）より入手した。凍結乾燥されたヒト血小板は、ヘレナ・バイオサイエンス社（英国、製品番号５３７１）から購入した。血小板還元バッファー：トリスバッファー生理食塩水は、ヘレナ・バイオサイエンス社（英国、製品番号５３６５）より入手した。イノビンは、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ社（Liederbach，ドイツ；製品番号Ｂ４２１２-５０）より入手した。トロンビン特異的基質：Ｚ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ-ＡＭＣ ＨＣｌフルオロフォアはＢａｃｈｅｍ社（Weil am Rhein、ドイツ；製品番号Ｉ−１１４０）より入手した。組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）の発現および精製は、以前に記載したとおりに行った（Thim等，1988；PerssonとNielsen，1996）。他の全ての化学製品は、分析用グレード以上である。
【０１６４】
内因性トロンビン産性能（ＥＴＰ）バイオアッセイを使用したＦＶＩＩ類似体のｒＦＶＩＩａ様活性の測定−内因性トロンビン産性能（ＥＴＰ）アッセイは、選択した血漿サンプルのトロンビン生成のリアルタイム測定に基づく。血漿サンプルはＸａｓｅのアセンブリーのための生理的脂質表面源として凍結乾燥した血小板、および凝固カスケードのプロトロンビナーゼ複合体を含む。リアルタイム・トロンビン活性は、トロンビン特異的基質由来の発生した蛍光生成物の連続検出で測定した（Hemker等，2000；HemkerとBeguin，2000）。
【０１６５】
ＦＶＩＩａおよびＰＥＧ化変異体の濃度は、２８０ｎｍので吸光度測定値で測定した。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液（Ｅ０.１％）の吸光度として、１.３６の値を得た。
【０１６６】
凍結乾燥された血小板の１つのバイアルは、０.７３ｍｌの還元バッファー（トリス緩衝化サリン）において分解されて、ＦＶＩＩＩ欠乏性血漿の７５．０００の血小板／μｌに更に希釈した。イノビン、組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）およびテストサンプルを分析バッファー（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.３５、１.５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に希釈した。トロンビン特異的基質（Ｚ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ-ＡＭＣ）を６０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、カルシウム含有分析バッファー（１００ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.３５）で更に希釈した。コスターマイクロタイタープレート（９６穴、製品番号３６３１）において、１０μｌのｒＦＶＩＩａ（最終０―１００００ｎｇ／ｍｌ）、またはテストサンプル、またはブランク（分析バッファー）（１０μｌ）をそれぞれのウェルに加えた。イノビン（１０μｌ、最終０.１２ｐＭ）、および血漿を含む血小板（８０μｌ、最終５０.０００血小板／μｌ）をコスタープレートのそれぞれのウェルに加えた（９６穴、製品番号３６３１）。プレートは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ（Thermo Electron Corporation, ケンブリッジ、英国)で３７℃で１０分間インキュベートした。基質（２０μｌ、最終濃度：０.４ｍＭのトロンビン特異的基質、０.５％ＤＭＳＯおよび１６.７ｍＭのＣａＣｌ２）を即時に加え、蛍光を６０分間連続的に記録した（励起３９０ｎｍ，蛍光４６０ｎｍ）。
【０１６７】
濃度反応曲線は、シグナルに基づいて、ｒＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩ類似体で作製した（６０分間の蛍光単位時間曲線下の面積）。ＦＶＩＩａに関する類似体のＥＴＰ活性は、カーブから算出し表４に示した。
【０１６８】
表４−ｒＦＶＩＩａに関する二量体ＦＶＩＩａ４０７Ｃ分子のＥＴＰ活性。相対活性はＦＶＩＩａ４０７Ｃのプロトマーごとに与えられるので、二量体分子の総活性は報告された値の２倍である。
【表４】
【非特許文献１】Bock,P.E. (1992). Active-site-selective labeling of blood coagulation proteinases with fluorescence probes by the use of thioester peptide chloromethyl ketones. I. Specificity of thrombin labeling. J Biol Chem 267, 14963-14973.
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【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】混合ジスルフィドでＦＶＩＩａ４０７Ｃと結合した低分子量チオールの同定。タンパク質をＴＣＥＰおよびＳＢＤ-ｆ存在下でインキュベートし、ＦＶＩＩａ４０７Ｃの調製において、改変したＣｙｓ４０７に付加したチオールを解放し誘導体化した。ＳＢＤ誘導体化チオールを逆転相ＨＰＬＣによって分離し、蛍光（励起波長および蛍光波長が各々３８６および５１６ｎｍ）によって検出した。野生型ＦＶＩＩａおよび一連の低分子量のチオール化合物（各々の１０ｐｍｏｌ；標準と表す）のＨＰＬＣトレースを比較のために示す。１つの星印で印をつけたピークは、市販のシステアミンの不純物に起因する。２つの星印は、ＦＶＩＩａ４０７ＣのＨＰＬＣトレースの同定不明のピークを示す。各々のピーク上のパーセントは、分析したＦＶＩＩａ４０７Ｃの量に対する（その保持時間から同定された）既知のチオール種の量を示す。保持時間に基づいて、ＦＶＩＩａ４０７Ｃに結合する主要チオールがグルタチオン、システインおよびホモシステインであると結論づけることができる。略語：ＧＳＨ（グルタチオン）、γ-ＧＣ（γ-グルタミルシステイン）、ＣＧ（システイニルグリシン）、Ｃｙｓ（システイン）、Ｈｃｙ（ホモシステイン）およびＣｙａ（システアミン）。
【図２】ｐＨ７における多様な濃度の還元型および酸化型グルタチオン（［ＧＳＨ］２／［ＧＳＳＧ］比によって表す）、１μＭの酵母グルタレドキシン１（ｙＧｒｘ１ｐ）、無（中空の丸）または２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジン（中空の四角）の存在下でインキュベートしたＦＶＩＩａの残余アミド分解活性。全サンプルは、アミド分解活性を測定する前に３０℃で３.５時間平衡化した。アミド分解活性は、完全に活性なＦＶＩＩａを１として正規化されている。
【図３】ＦＶＩＩａＣｙｓ４０７およびグルタチオン間の混合ジスルフィドの酸化還元滴定。ＦＶＩＩａ４０７ＣはｐＨ７における多様な濃度の還元型および酸化型グルタチオン（［ＧＳＨ］／［ＧＳＳＧ］比で表す）および１０μＭの大腸菌グルタレドキシン２（Ｇｒｘ２）を含むバッファーで平衡化されている。３０℃５時間の平衡化後の、遊離ＦＶＩＩａを検出し、ＰＥＧ５ｋ-マレイミドでアルキル化後にＨＰＬＣによって定量化した。ピーク面積は、完全な５ｋ-ＰＥＧ化活性化ＦＶＩＩａを１として正規化した。
【図４】０．５ｍＭのＧＳＨ、多様な濃度のＧＳＳＧ、および無（−ＰＡＢＡ）または２５ｍＭのｐ-アミノベンズアミジン（＋ＰＡＢＡ）のどちらかを含む酸化還元バッファー中で平衡時の、残余アミド分解活性（点線）および遊離Ｃｙｓ４０７チオール基を有する活性化ＦＶＩＩａ４０７Ｃの比（実線）。カーブは式２および４（それぞれＫｏｘ値９３ｍＭ（−ＰＡＢＡ）および１６６ｍＭ（＋ＰＡＢＡ）、およびＫｓｃｏｘ値１.０２）を使用して描いた。陰をつけた領域は＞９０％の残余活性および＞９０％の遊離４０７ＣチオールとなるＧＳＳＧの濃度範囲を示す。
【図５】図４で代わりに０.５ｍＭのＧＳＨを有するもの。陰をつけた領域は＞９０％の残余活性および＞９０％の遊離ＦＶＩＩａ４０７ＣチオールとなるＧＳＳＧの濃度範囲を示す。
【図６】図４で代わりに１.０ｍＭのＧＳＨを有するもの。陰をつけた領域は＞９０％の残余活性および＞９０％の遊離ＦＶＩＩａ４０７ＣチオールとなるＧＳＳＧの濃度範囲を示す。
【図７】選択還元の前（点線）および後（破線の点線）、およびＰＥＧ２０ｋ-マレイミド修飾後（実線）のＦＶＩＩａ４０７ＣのＨＰＬＣ分析。４０７Ｃ、４０７Ｃ-ＳＲおよび４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋは、それぞれ、遊離の、低分子量チオール結合した、および２０ｋ-ＰＥＧ化したＦＶＩＩａ４０７Ｃのピークを示す。星印は、おそらくハイパーＰＥＧ化種である未同定のピークを示す。ピーク積分は、未処理の材料の１１％に対して、還元工程の最終時の遊離ＦＶＩＩａ４０７Ｃの８９％となった。チオール・アルキル化後、８５％のＦＶＩＩａ４０７Ｃは、モノＰＥＧ化種に変換した。
【図８】還元（右パネル）および非還元（左パネル）ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析：ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（レーンＡ）、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ５ｋ（レーンＢ）、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ（レーンＣ）、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ４０ｋ（レーンＤ）およびＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（レーンＥ）。
【図９】還元（右パネル）および非還元（左パネル）ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析：ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（レーンＡ）、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ３.４ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（レーンＢ）、ＦＶＩＩａ４０７Ｃ-ＰＥＧ２０ｋ-ＦＶＩＩａ４０７Ｃ（レーンＣ）。
【図１０】（Ａ）２.５ｍＭ（レーンＡ）または５.０ｍＭの（レーンＢ）トリフェニルホスフィン-３,３',３"トリスルホン酸（ＰＰｈ３Ｓ３）で１６.３時間室温で処理し、その後ＰＥＧ２０ｋ-マレイミドで標識したＦＶＩＩａＲ３９６Ｃの還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析。レーンＣに、対照として無処置のＦＶＩＩａを含む。（Ｂ）ＰＰｈ３Ｓ３による１６.３時間のインキュベーション前（１００％活性）と後のＦＶＩＩａＲ３９６Ｃの相対アミド分解活性。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＶＩＩａポリペプチドの本来備わっている触媒活性を保持するように共有結合により連結された少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドを含んで成る二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物。
【請求項２】
上記化合物が、本願明細書において開示される分析で測定して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の活性部位濃度を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
構成要素のＦＶＩＩａポリペプチドの生物学的活性と比較したとき、上記化合物の生物学的活性が上昇している請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
２つのＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合により連結して二量体ＦＶＩＩａ化合物を形成している請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
上記少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが上記ＦＶＩＩａポリペプチドの改変されたシステインを介して共有結合で連結される請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
共有結合で連結された上記ＦＶＩＩａポリペプチドが同一のＦＶＩＩａポリペプチドである請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
少なくとも２つの異なるＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合で連結される請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
上記二量体または多量体ＦＶＩＩａが構成要素ＦＶＩＩａポリペプチド間にリンカーを含む請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
上記リンカーが二価のシステイン反応性ＰＥＧを伴う反応から生じる構造を有する請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
上記リンカーがマレイミド-ＰＥＧ-マレイミドを伴う反応から生じる構造を有する請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
上記マレイミド-ＰＥＧ-マレイミドが、マレイミド-ＰＥＧ２ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ３.４ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ５ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ１０ｋＤ-マレイミドおよびマレイミド-ＰＥＧ２０ｋＤ-マレイミドからなる群から選択される請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
上記リンカーがアミノ酸配列を含んで成る請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
上記少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが上記ＦＶＩＩａポリペプチドの遊離アミンを介して共有結合で連結する請求項１から１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
上記少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが上記ＦＶＩＩａポリペプチドに結合した天然のまたは改変されたグリカンを介して共有結合で連結する請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが、例えばトランスグルタミナーゼまたはソルターゼによって、酵素触媒カップリング反応から生じる化学構造を介して共有結合で連結する請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＦＶＩＩａ４０７Ｃである請求項１から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＦＶＩＩａ４０７Ｃ変異体である請求項１から１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＦＶＩＩａＰ４０６ＣまたはＦＶＩＩａＰ４０６Ｃ変異体である請求項１から１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＦＶＩＩａＲ３９６ＣまたはＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ変異体である請求項１から１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＦＶＩＩａＱ２５０ＣまたはＦＶＩＩａＱ２５０Ｃ変異体である請求項１から１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドが、最適化されたＧＬＡドメイン（例えばＹ４挿入、Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｄ３３Ｆ、Ｄ３３ＥおよびＡ３４Ｅの組み合わせ）を有するＦＶＩＩａ変異体である請求項１から２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
上記ＦＶＩＩａが、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑおよびこれらの４０７Ｃ変異体からなる群から選択される置換を含んで成る、本来備わっているタンパク分解活性が上昇しているＦＶＩＩａ変異体である請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
上記ＦＶＩＩａ変異体が、Ｌ３０５Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ１５７Ａ、Ｅ２９６Ｖ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ、Ｓ３３６Ｇ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａおよびこれらの４０７Ｃ変異体からなる群から選択される置換を含んで成る請求項１から２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＰＥＧ化されている請求項１から２３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
ヒト血清アルブミンまたはその変異体と請求項１から２４のいずれか一項に記載の二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の間のコンジュゲートである化合物。
【請求項２６】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の化合物と製薬的に許容可能な担体または賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項２７】
患者の出血障害または出血症状の発現の治療のためまたは正常な止血系の強化のための医薬の製造のための請求項１から２５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２８】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の化合物の調製方法であって、以下の工程を含んで成る方法：
ａ) 上記ＦＶＩＩａポリペプチドの合成および精製;
ｂ) 上記ＦＶＩＩａポリペプチドのカップリングによる上記化合物の合成;
ｃ) 上記二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の単離。
【請求項２９】
請求項５、９から１１および１５から２５のいずれか一項に記載の化合物の調製方法であって、以下の工程を含んで成る方法：
ａ) 上記ＦＶＩＩａポリペプチドの合成および精製;
ｂ) 連結されるＦＶＩＩａポリペプチド上のシステイン残基の選択還元;
ｃ) 活性型リンカーの存在下において、還元型システイン残基で上記ＦＶＩＩａポリペプチドをカップリングさせることよる上記二量体および多量体ＦＶＩＩａ化合物の合成;
ｄ) 上記二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の単離。
【請求項３０】
工程ｂ)が、酸化還元バッファーまたはトリアリールホスフィン還元剤による反応によるＦＶＩＩａポリペプチド上のシステイン残基の選択還元を含んで成る請求項２９に記載の方法。
【請求項１】
ＦＶＩＩａポリペプチドの本来備わっている触媒活性を保持するように共有結合により連結された少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドを含んで成る二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物。
【請求項２】
上記化合物が、本願明細書において開示される分析で測定して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の活性部位濃度を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
構成要素のＦＶＩＩａポリペプチドの生物学的活性と比較したとき、上記化合物の生物学的活性が上昇している請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
２つのＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合により連結して二量体ＦＶＩＩａ化合物を形成している請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
上記少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが上記ＦＶＩＩａポリペプチドの改変されたシステインを介して共有結合で連結される請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
共有結合で連結された上記ＦＶＩＩａポリペプチドが同一のＦＶＩＩａポリペプチドである請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
少なくとも２つの異なるＦＶＩＩａポリペプチドが共有結合で連結される請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
上記二量体または多量体ＦＶＩＩａが構成要素ＦＶＩＩａポリペプチド間にリンカーを含む請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
上記リンカーが二価のシステイン反応性ＰＥＧを伴う反応から生じる構造を有する請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
上記リンカーがマレイミド-ＰＥＧ-マレイミドを伴う反応から生じる構造を有する請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
上記マレイミド-ＰＥＧ-マレイミドが、マレイミド-ＰＥＧ２ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ３.４ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ５ｋＤ-マレイミド、マレイミド-ＰＥＧ１０ｋＤ-マレイミドおよびマレイミド-ＰＥＧ２０ｋＤ-マレイミドからなる群から選択される請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
上記リンカーがアミノ酸配列を含んで成る請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
上記少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが上記ＦＶＩＩａポリペプチドの遊離アミンを介して共有結合で連結する請求項１から１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
上記少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが上記ＦＶＩＩａポリペプチドに結合した天然のまたは改変されたグリカンを介して共有結合で連結する請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
少なくとも２つのＦＶＩＩａポリペプチドが、例えばトランスグルタミナーゼまたはソルターゼによって、酵素触媒カップリング反応から生じる化学構造を介して共有結合で連結する請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＦＶＩＩａ４０７Ｃである請求項１から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＦＶＩＩａ４０７Ｃ変異体である請求項１から１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＦＶＩＩａＰ４０６ＣまたはＦＶＩＩａＰ４０６Ｃ変異体である請求項１から１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＦＶＩＩａＲ３９６ＣまたはＦＶＩＩａＲ３９６Ｃ変異体である請求項１から１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＦＶＩＩａＱ２５０ＣまたはＦＶＩＩａＱ２５０Ｃ変異体である請求項１から１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドが、最適化されたＧＬＡドメイン（例えばＹ４挿入、Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｄ３３Ｆ、Ｄ３３ＥおよびＡ３４Ｅの組み合わせ）を有するＦＶＩＩａ変異体である請求項１から２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
上記ＦＶＩＩａが、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑおよびこれらの４０７Ｃ変異体からなる群から選択される置換を含んで成る、本来備わっているタンパク分解活性が上昇しているＦＶＩＩａ変異体である請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
上記ＦＶＩＩａ変異体が、Ｌ３０５Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ１５７Ａ、Ｅ２９６Ｖ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ、Ｓ３３６Ｇ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａおよびこれらの４０７Ｃ変異体からなる群から選択される置換を含んで成る請求項１から２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
上記ＦＶＩＩａポリペプチドがＰＥＧ化されている請求項１から２３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
ヒト血清アルブミンまたはその変異体と請求項１から２４のいずれか一項に記載の二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の間のコンジュゲートである化合物。
【請求項２６】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の化合物と製薬的に許容可能な担体または賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項２７】
患者の出血障害または出血症状の発現の治療のためまたは正常な止血系の強化のための医薬の製造のための請求項１から２５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２８】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の化合物の調製方法であって、以下の工程を含んで成る方法：
ａ) 上記ＦＶＩＩａポリペプチドの合成および精製;
ｂ) 上記ＦＶＩＩａポリペプチドのカップリングによる上記化合物の合成;
ｃ) 上記二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の単離。
【請求項２９】
請求項５、９から１１および１５から２５のいずれか一項に記載の化合物の調製方法であって、以下の工程を含んで成る方法：
ａ) 上記ＦＶＩＩａポリペプチドの合成および精製;
ｂ) 連結されるＦＶＩＩａポリペプチド上のシステイン残基の選択還元;
ｃ) 活性型リンカーの存在下において、還元型システイン残基で上記ＦＶＩＩａポリペプチドをカップリングさせることよる上記二量体および多量体ＦＶＩＩａ化合物の合成;
ｄ) 上記二量体または多量体ＦＶＩＩａ化合物の単離。
【請求項３０】
工程ｂ)が、酸化還元バッファーまたはトリアリールホスフィン還元剤による反応によるＦＶＩＩａポリペプチド上のシステイン残基の選択還元を含んで成る請求項２９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５４６６７１（Ｐ２００８−５４６６７１Ａ）
【公表日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１６３３９（Ｐ２００８−５１６３３９）
【出願日】平成１８年６月１９日（２００６．６．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６３３１１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３４１７４
【国際公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【出願人】（５０７３８３８６２）ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー (42)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１９日（２００６．６．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６３３１１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３４１７４
【国際公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【出願人】（５０７３８３８６２）ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー (42)
【Ｆターム（参考）】
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