代謝改変光合成微生物を用いて二酸化炭素を炭化水素に直接変換する方法
【課題】
【解決手段】本発明は、代謝改変し、遺伝子改変光合成微生物を用いて、大気中二酸化炭素を直接変換することにより、イソプレンを生産するための方法に関する。本発明は、ＣＯ２からイソプレンを生産できるシアノバクテリア等の、遺伝子改変光合成微生物にも関する。
【解決手段】本発明は、代謝改変し、遺伝子改変光合成微生物を用いて、大気中二酸化炭素を直接変換することにより、イソプレンを生産するための方法に関する。本発明は、ＣＯ２からイソプレンを生産できるシアノバクテリア等の、遺伝子改変光合成微生物にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００７年５月１日出願の仮出願第６０／９２７１０２号、発明の名称「代謝改変光合成微生物を用いて二酸化炭素を炭化水素に直接変換する方法」の優先権を主張し、その全体を参照により本願明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀の社会に対する最も大きなチャレンジの一つは、輸送、加熱及び工業プロセスの増大する要求に応え、持続可能なやり方でこれらの産業に原料を提供することである。より重要なことには、将来のエネルギー及び原料供給は、温室効果ガスの排出を同時に削減することに答えなければならない。油、ガス及び石炭産業は、過去８０年のエネルギー市場だけでなく、炭素系化学製品産業も支配した。原油埋蔵量が低下すると、政治的混乱及び工業化学製品の基礎を形成する石油とその精製品（石油由来化学、石油化学製品としても知られる）への世界的需要により、エネルギー並びにこれらの重要な炭化水素誘導体とその下流製品のコストは、増大してきた。さらに、化石燃料の燃焼及び精製は、地球温暖化における温室効果ガス排出の効果に関する関心の火付け役となってきた。環境への関心及び生物工学研究の最近の進歩によって刺激を受け、合成生物学技術は、現在、化学工業の重要原料の生合成（再生可能）による製造を可能にする微生物工学に適用することができる。現在のところ、再生可能な植物資源由来の液体生物燃料としてのエタノール生産は、行われている主要な方法である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
エタノールは、ブラジル、米国及びいくつかのヨーロッパ諸国において、すでに大規模に導入されている。エタノールは、ガソリンと混合することも可能であり、専用エンジンにおいて無希釈アルコールとしても使用できる。現在、燃料市場向けエタノールは、糖（ブラジル）又はデンプン（米国）から生産される。デンプン含有材料からのエタノール生産は、液化ステップ（デンプンを可溶化する）及び加水分解ステップ（ブドウ糖を生産するため）を必要とする。生成したブドウ糖は、直ちに発酵される。しかしながら、この原料系は、動物飼料及び人間の需要にも用いられるため、燃料エタノールへの需要増加に十分に応えることにならず、糖又はデンプン系エタノールの使用から生じる温室効果ガス減少は、望まれるほどには高くない（Ｆａｒｒｅｌｌら、２００６）。
【０００４】
これらの両者の限界に対処するため、農業及び森林間伐材、並びに専用作物等のリグノセルロース原料の開発が、エタノール生産を目的として、探索されてきた。リグノセルロースからのエタノールプロセスは、多くの技術的経済的課題に直面している（Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌら、２００６）。
【０００５】
第一に、セルロース及びヘミセルロースは、生物分解によって可溶な糖に解重合されなければならない。酵素転換は、副産物の形成がなく基質特異的であり、後続プロセスへの抑制を低下する。しかしながら、バイオマスが前処理を受けない限り、酵素触媒によるセルロースからブドウ糖への転換は遅く、前処理にも、高収量の達成及び方法の商業的成功が求められる（Ｍｏｓｉｅｒら、２００５）。
【０００６】
第二に、セルロースの解重合は、効率的なアルコール発酵が求められる炭素数６の（ヘキソース）及び炭素数５の（ペントース）糖と共に、発酵を抑制する化合物、すなわち低分子量の有機酸、フラン誘導体、フェノール類及び前処理中に放出形成される無機化合物及び／又は原料の加水分解物を生産する（Ｌａｒｓｓｏｎら、２０００）。リグノセルロース原料は、特定の広葉樹及び農業原料において、ペントース糖であるキシロース及びアラビノースを５〜２０％（又はこれ以上）を含むことができるが、これらは、最も一般的に用いられる工業発酵微生物である酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによっては、エタノールに発酵されない。ペントース発酵微生物は、遺伝子改変が行われており、化学的又は物理的方法を用いて、有毒な抑制物質を除去する方法が開発されている（Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌら、２００６）。
【０００７】
第三に、処理エネルギーの要求を最小限とするために、セルロースの解重合及び生成する糖の発酵を統合する進歩した方法が、開発されなければならない。加水分解と発酵とを別個に行うこと（ＳＨＦ）、及び糖化とセルロース発酵とを同時に行うこと（ＳＳＦ）の二つの方法が取られてきた。ＳＨＦにおいては、最初にセルロースはブドウ糖に加水分解され、次いでブドウ糖は、エタノールに発酵される。ＳＨＦの主な利点は、加水分解及び発酵が最適条件で起きることであり、不利な点は、セルロース分解酵素が最終生成物により阻害され、ブドウ糖及びセルビオース（ｃｅｌｌｕｂｉｏｓｅ）が蓄積するときには加水分解速度が次第に減少することである（Ｔｅｎｇｂｏｒｇら、２００１）。ＳＳＦにおいては、加水分解及び発酵は同じ容器において同時に起こり、放出された糖を発酵生物体が直ちに消費するため、酵素の最終生成物に対する抑制は軽減される。さらにまた、発酵は、加水分解物に存在するいくつかの有毒な化合物を変換することにより、酵素抑制を軽減すると考えられる（Ｔｅｎｇｂｏｒｇら、２００１）。これにより、全体のエタノール生産性、エタノール濃度及び最終的なエタノール収量は、上昇する（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍら、２００５）。
【０００８】
生物燃料としてエタノールの生産及び使用を取り巻く話題性は高いが、この方法には多くの弱点がある。エタノールよりも効率的に燃料として用いることができる炭化水素の生産方法が求められている。この方法は、温室効果ガスを実質的に削減する手段を提供することも必要とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、二酸化炭素（ＣＯ２）からイソプレン等の炭化水素を生産できるシアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物に関する。本発明は、また、遺伝子改変光合成微生物（代謝改変した光合成微生物とも呼ぶ）を用いて二酸化炭素を直接的に変換することにより、イソプレンを生産する方法にも関する。
【００１０】
本発明の一実施形態は、実質的に水において非混合性の炭化水素化合物（炭化水素とも呼ぶ）を生産するよう遺伝子改変された、シアノバクテリア等の光合成微生物である。いくつかの実施形態において、炭化水素化合物は、ガス状、非混合性の液体状、又は沈澱性である。いくつかの実施形態において、炭化水素は、イソプレンであり、光合成微生物（例えば遺伝子改変シアノバクテリア）は、二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する。いくつかの実施形態において、二酸化炭素は、大気の二酸化炭素である。いくつかの実施形態において、シアノバクテリアは、化石燃料プラント又は煙突（スクラバー）から発生する二酸化炭素の存在中で培養される、いくつかの実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸代謝経路を介して発生する前駆体から、イソプレンを生産する。多種多様なシアノバクテリアは、本願明細書に記載の方法及び／又は当技術分野において公知の方法を用いて、遺伝子を組み換えることが可能である。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ（Ｔ．）ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１等の、好熱性シアノバクテリアである。いくつかの実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属である。特定の実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ ７１２０）である。
【００１１】
本発明の態様は、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子導入により遺伝子改変された、シアノバクテリア等の光合成微生物（例えば、好熱性シアノバクテリア、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１、アナベナ属の一員、アナベナ７１２０）である。コードされたイソプレン合成酵素は、導入される遺伝子改変微生物（例えば、シアノバクテリア）において機能的である（活性を示す）ならば、任意の源から由来することができる。源としては、植物、バクテリア、ウイルス、他の非哺乳類源及び哺乳類源が挙げられる。特定の実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、木のイソプレン合成酵素遺伝子等の、植物イソプレン合成酵素遺伝子である。一実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）イソプレン合成酵素遺伝子である。イソプレン合成酵素遺伝子は、シアノバクテリアにおける発現及び／又は酵素活性を最適化するために、シアノバクテリアへの導入の前又は後に、組み換えることができる。一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、シアノバクテリアのゲノムに組み込まれるが、別の実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、遺伝子改変光合成微生物（シアノバクテリア）に含まれるプラスミドに担持される。
【００１２】
本発明の態様は、遺伝子改変シアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物を容器内において二酸化炭素の存在中で培養すること、及び遺伝子改変光合成微生物の培養液のオフガスからイソプレンを集めることに関する。一実施形態において、遺伝子改変シアノバクテリアは、さらなる生合成のための基質としてイソプレンを利用できる天然又は合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の挿入によって、さらに組み換えられる。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含む遺伝子改変光合成微生物に関し、この遺伝子改変光合成微生物は、遺伝子改変光合成微生物が二酸化炭素の存在中で培養されるとき等に、二酸化炭素からイソプレンを生産することができる。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１等のシアノバクテリアである。いくつかの実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ７１２０等のアナベナ属である。一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）イソプレン合成酵素遺伝子等の、植物（例えば、木、花、潅木、草）イソプレン合成酵素遺伝子である。代替実施形態において、光合成微生物は、組み換えのない場合には、イソプレンを全く／実質的に全く生産せず、通常は無変化の内在性イソプレン合成酵素遺伝子が活性化されるよう遺伝子改変されると、結果としてイソプレンを生産するよう機能する。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、シアノバクテリアにおける発現及び／又は活性を最適化する目的で、シアノバクテリアへの導入の前又は後に組み換えられた、外来性イソプレン合成酵素を含むシアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物に関する。一実施形態において、シアノバクテリアは、シアノバクテリアのゲノムに組み込まれるイソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含み、別の実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、プラスミドに担持される。
【００１５】
本発明の態様は、容器の中で、二酸化炭素の存在中に培養され、シアノバクテリアの培養液のオフガスからイソプレンを集めることができる遺伝子改変光合成微生物（例えば、遺伝子改変シアノバクテリア）等の、遺伝子改変光合成微生物に関する。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、さらなる生合成のための基質としてイソプレンを利用することができる天然又は合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の挿入によって、さらに組み換えられる。
【００１６】
本発明の態様は、イソプレンを生産するよう遺伝子改変された光合成微生物を培養することと、適宜、イソプレンを生産するよう遺伝子改変された光合成微生物から生産されるイソプレンを集めることによる、イソプレンの生産方法に関する。遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素の存在中、及び遺伝子改変光合成微生物の成長及び／又は保守に適切な条件下（例えば、十分な光の存在中）で、培養される。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１等のシアノバクテリアである。いくつかの実施形態において、シアノバクテリアはアナベナ７１２０等のアナベナ属である。培養条件は、シアノバクテリアの保守及び／又は成長のための十分な光を含む。
【００１７】
イソプレン生産方法の一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子の導入を介してイソプレンを生産するよう遺伝子改変された、シアノバクテリア等の光合成微生物が使用される。一実施形態において、該シアノバクテリアは、木のポプラ（例えば、Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）等の植物由来のイソプレン合成酵素遺伝子を含むよう遺伝子改変される。この遺伝子は、他の種類の木又は植物（例えば、花、潅木、草）に由来することも可能である。
【００１８】
一実施形態において、本方法は、シアノバクテリアにおける発現及び／又は酵素活性を最適化する目的で、シアノバクテリアへの導入の前又は後のイソプレン合成酵素の組み換えにおけるシアノバクテリアの使用を含む。一実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、遺伝子改変光合成微生物のゲノムに組み込まれる。別の実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、プラスミドに担持される。
【００１９】
本発明の態様は、遺伝子改変シアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物を容器内において二酸化炭素の存在中で培養することと、適宜、遺伝子改変光合成微生物の培養液のオフガス（例えば、遺伝子改変シアノバクテリアの培養液のオフガス）からイソプレンを集めることとの方法に関する。一実施形態において、本方法は、さらなる生合成のための基質としてイソプレンを利用することができる一以上の付加的な天然及び／又は組み換え微生物と共に遺伝子改変光合成微生物を共培養することに関する。
【００２０】
本発明の態様は、イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含む遺伝子改変光合成微生物を培養することであって、該遺伝子改変光合成微生物は、イソプレンを二酸化炭素から生産することと、適宜、イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含む遺伝子改変光合成微生物から生産されるイソプレンを集めることと、を含むイソプレンの生産方法に関する。遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素の存在中、及び成長及び／又は保守のための適切な条件下（例えば、十分な光の存在中）で、培養される。一実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１等のシアノバクテリアが使われる。いくつかの実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ７１２０等のアナベナ属である。
【００２１】
一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子は、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）イソプレン合成酵素遺伝子である。一実施形態において、イソプレンを生産する方法は、シアノバクテリアにおけるイソプレン合成酵素の発現及び／又は酵素活性を最適化する目的で、シアノバクテリアへの導入の前又は後のイソプレン合成酵素の組み換えを含む。一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、遺伝子改変光合成微生物（例えばシアノバクテリア）のゲノムに組み込まれ、別の実施形態において、これは微生物のプラスミド上に担持される。
【００２２】
本発明の態様は、二酸化炭素の存在中において容器で遺伝子改変光合成微生物を培養することによりイソプレンを生産することと、適宜、遺伝子改変光合成微生物の培養液のオフガスからイソプレンを集めることとの方法に関する。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、さらなる生合成のための基質としてイソプレンを利用することができる一以上の付加的な天然及び／又は組み換え微生物と共に、二酸化炭素の存在中において容器で共培養される。
【００２３】
本発明の態様は、イソプレン生産のための遺伝子改変光合成微生物の最適化及びイソプレンを光合成微生物から生産する方法の最適化に関する。いくつかの実施形態において、イソプレン生産量は、遺伝子改変光合成微生物におけるイソプレン合成酵素発現の発現レベル及び制御を変更することにより改善される。他の実施形態において、イソプレン生産量は、熱安定性、イソプレン合成酵素遺伝子の特定の活性及び特異性を改善するためのタンパク工学技術により、遺伝子改変光合成微生物におけるイソプレン合成酵素遺伝子のコード領域を変更することによって、改善される。他の実施形態において、イソプレン生産量は、律速であることが知られているイソプレニル２リン酸塩又はジメチルアリル２リン酸塩合成の上流の酵素の過剰発現及び／又は遺伝子改変光合成微生物の内因性活性（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の強化によって、改善される。他の実施形態において、イソプレン生産量は、遺伝子改変光合成微生物におけるランダムな突然変異誘発（トランスポゾン又はトランスポゾン様の挿入によって、又は標準突然変異誘発による）及び生産に対する改良生物体のスクリーニングによって、改善される。他の実施形態において、イソプレン生産量は、同一又は関連生物体由来のゲノム断片のショットガンクローニングに続いて、生産に対する改良生物体のスクリーニングによって、変異における過剰発現要因によって追加又は強化が可能な不明経路を特定することで改善される。ある実施形態において、イソプレン生産量は、複数の突然変異を単一の生物体に組み込むことによって改善される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、イソプレン生産のための遺伝子改変光合成微生物の最適化、又は遺伝子改変光合成微生物からのイソプレン生産方法の最適化は、微生物バイオリアクタにおいてイソプレン生産量を改善された遺伝子改変光合成微生物を培養すること、及び微生物バイオリアクタにおける培養プロトコルを最適化することによって、さらに達成される。いくつかの実施形態において、イソプレン生産のための遺伝子改変光合成微生物の最適化、又は遺伝子改変光合成微生物からのイソプレン生産方法の最適化は、微生物バイオリアクタからイソプレンを集めるための回収プロトコルを最適化することによって、さらに達成される。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、核酸分子が提供される。核酸分子は、組み換えイソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２．１）の核酸配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、プロモータに作動可能に連結された組み換えイソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２．１）の核酸配列を含む発現ベクターが提供される。関連する態様において、このような発現ベクターを用いてトランスフォーム又はトランスフェクトされる宿主細胞も提供される。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、単離されたポリペプチド又はその変異体が提供される。単離されたポリペプチドは、組み換えイソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２．１）の核酸配列によってコードされる。
【００２８】
本発明又は本願のファイルは、少なくとも一つの有色処理された図面を含む。カラー図面を伴う本発明又は本出願公開のコピーは、要求及び必要料金の支払いに応じ、事務局から提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】イソプレンの構造及び物理的特性を示す図である。
【図２】プリンス反応の図である。図示の式において、加えられるアルデヒドは、ホルムアルデヒドである。アセトアルデヒドの代用は、２位及び６位のメチル置換を生じる。
【図３Ａ】ポプラの葉から分離されたイソプレン合成酵素遺伝子のアミノ酸及び核酸配列である（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。
【図３Ｂ】ポプラの葉から分離されたイソプレン合成酵素遺伝子のアミノ酸及び核酸配列である（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。
【図３Ｃ】ポプラの葉から分離されたイソプレン合成酵素遺伝子のアミノ酸及び核酸配列である（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。
【図３Ｄ】ポプラの葉から分離されたイソプレン合成酵素遺伝子のアミノ酸及び核酸配列である（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。
【図３Ｅ】ポプラの葉から分離されたイソプレン合成酵素遺伝子のアミノ酸及び核酸配列である（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。
【図４Ａ】カナダポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）属由来の４つのイソプレン合成酵素配列を示す図である。
【図４Ｂ】カナダポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）属由来の４つのイソプレン合成酵素配列を示す図である。
【図５】イソペンテニル２リン酸塩（ＩＰＰ）及びその異性体であるジメチルアリル２リン酸塩（ＤＭＡＰＰ）の生産に関与する合成経路及びキー酵素を示す、シアノバクテリアのＭＥＰ経路の図である。シアノバクテリアは、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰのイソプレン転換に関与する酵素であるイソプレン合成酵素を欠いている。略語を、以下に示す。ＤＸＳ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ；ＤＸＲ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ；ＭＣＴ、ＭＥＰシチジルトランスフェラーゼ；ＣＭＫ、４−（シチジン５’ホスホ−）２Ｃ−メチル・エリトリトール・キナーゼ；ＭＥＣＰＳ、ＭＥＣＰシンターゼ；ＩＰＩ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ。
【図６Ａ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｂ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｃ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｄ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｅ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｆ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｇ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図７】組み換えイソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２．１）の核酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の態様は、光合成微生物の遺伝子改変を通じて、ＣＯ２からイソプレンを生産する方法及び組成物に関する。シアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物は、最後から２番目のイソプレン前駆体、すなわち２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸経路を介するイソペンテニル２リン酸塩及びジメチルアリル２リン酸塩を合成するが、植物においてこの前駆体からイソプレンの生合成の最終ステップを実行する、イソプレン合成をコードする遺伝子を欠いている。植物と同様に、シアノバクテリアは、自家栄養生物であり、光の存在中におけるイソペンテニル２リン酸塩及びジメチルアリル２リン酸塩に対する最終的な炭素源は、大気のＣＯ２の光合成による固定である。そのため、シアノバクテリアは、発現可能なイソプレン合成酵素遺伝子を組み込むよう代謝改変され、光の存在中において、二酸化炭素及び水から直接的にイソプレンを生成することができる。
【００３１】
イソプレンは、沸点３４℃の揮発性化合物であり、単純な濃縮によって、細菌発酵のオフガスから回収できる。遺伝子改変微生物からのイソプレン生産を最大化する観点から、生成物が培養液から連続的に除去され、したがって律速因子（生成物の抑制）を生じる蓄積が決してないため、この揮発性は極めて魅力的な特徴である。光合成細菌培養液由来イソプレン生成物の動向は、ガソリン添加物／代替物の工業合成のための有用な出発物質、及び「生物燃料」の新形式であろう。このような添加物への複数の工業合成経路が想像できるが、そうした経路は、以下に例示する。
【００３２】
イソプレンは、反応容器内で適切なアルデヒド（セルロースのエタノールに由来するアセトアルデヒドを含む）及び適切な触媒と混合でき、水系プリンス反応により、高収量でアルキル置換１，３−ジオキサンに変換できる（Ａｒｕｎｄａｌｅ及びＭｉｋｅｓｋａ（１９５２）、図２、化合物５）。潜在的には、１，３−ジオキサン生成物は、単純な相分離によって反応容器から連続的に回収でき、さらなる軽微な改良だけで、ガソリン添加物として直接的に使用できる。様々な１，３−ジオキサンは、高いオクタン価を与える沸点を有し、５０：５０（ｖ／ｖ）の比率でガソリンと混合して内燃機関燃料を生産できる（Ａｒｕｎｄａｌｅ及びＭｉｋｅｓｋａ（１９５２））。１，３−ジオキサン添加物は、混合ガソリンを燃焼させるクリーナも生成し、これにより大気汚染に関与するエンジン沈着物及び炭化水素排出を削減する（Ｎｉｅｂｙｌｓｋｉ、１９８０）。１，３−ジオキサンは、環状エーテルであり、ガソリン添加物であるＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）等のエーテルを取扱う石油工業における実績は１０年以上あるので、潜在的な課題（例えば、経時的な過酸化物の集積）はすでに対処されてきた。
【００３３】
本発明は、イソプレン合成酵素を発現する光合成微生物を代謝改変するための方法及び組成物を提供する。本発明は、代謝改変された光合成微生物を二酸化炭素の存在中で培養することによりイソプレンを集めるための方法を、さらに提供する。
【００３４】
本発明の態様は、遺伝子改変光合成微生物の使用に関する。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、シアノバクテリアである。イソプレン合成酵素前駆体である、イソペンテニル２リン酸塩及びジメチルアリル２リン酸塩は、全ての公知のシアノバクテリアで合成される（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｊｒ．ら、２０００；Ｅｒｓｈｏｖら、２００２；Ｏｋａｄａ及びＨａｓｅ（２００５））。したがって、使用するシアノバクテリアは、下記のシアノバクテリア属（Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ、２００１）のメンバから選択できるが、限定されない。サブセクションＩ：Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、サブセクションＩＩ：Ｃｙａｎｏｃｙｓｔｉｓ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ、サブセクションＩＩＩ：Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ、Ｂｏｒｚｉａ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ、Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍａ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ、Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｌｙｎｇｂｙａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｔａｒｒｉａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｙｃｈｏｎｅｍａ、サブセクションＩＶ：Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ、Ｃｙａｎｏｓｐｉｒａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ、サブセクションＶ：Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｇｅｉｔｌｅｒｉａ、Ｉｙｅｎｇａｒｉｅｌｌａ、Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ、Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｌｗｅｂ．ｏｒｇ／ｔｒｅｅ？ｇｒｏｕｐ＝Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ；Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ（２００１））。シアノバクテリアに対する命名法は、修正中である（Ｏｒｅｎ、２００４）。
【００３５】
一実施形態において、使用するシアノバクテリア種は、以下を含む、より高温での成長に適する種から選択されるが、限定されない。Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）及びＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属の耐熱菌株（Ｍｉｌｌｅｒ及びＣａｓｔｅｎｈｏｌｚ（２０００）；Ｙａｍａｏｋａら、１９７８）。別の実施形態において、使用するシアノバクテリア種は、以下を含む、天然において外来性ＤＮＡを取ることが示されている種から選択されるが、限定されない。Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ａｌｐｉｃｏｌａ、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ ６８０３、及びＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖａ及びＳｈｅｓｔａｋｏｖ、１９８２；Ｓｈｅｓｔａｋｏｖら、２００４；Ｓｚａｌａｙ及びＳｈｅｓｔａｋｏｖ、１９８８）。別の実施形態において、使用するシアノバクテリア種は、以下を含む、エレクトロポレーションが外来ＤＮＡを導入する有効な方法であることが示されている種から選択されるが、限定されない。Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ． Ｍ１３１、Ｆｒｅｍｙｅｌｌａ ｄｉｐｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｎｏｓｔｏｃ ＰＣＣ ７１２１、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ Ｃ１、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ＭＫＵ ２７７、及びＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（Ｂｉｌｌｉら、２００１； Ｂｒｕｎｓら、１９８９； Ｉｗａｉら、２００４； Ｋａｗａｔａら、２００４； Ｍｏｓｅｒら、１９９３； Ｒａｖｉｎｄｒａｎら、２００６； Ｔｈｉｅｌ及びＰｏｏ、１９８９）。
【００３６】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ属である特定の実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ７１２０である。
【００３７】
本発明の態様は、光合成微生物の遺伝子工学に関する。一実施形態において、これは、遺伝子改変光合成微生物にイソプレン合成酵素をコードする遺伝子を導入することに関する。一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、植物遺伝子であり、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）由来の遺伝子を含むが、限定されない。
【００３８】
本発明の態様は、シアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物における、イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子の発現に関する。ある実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、シアノバクテリアの染色体に統合される。他の実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、プラスミド上で発現される。イソプレン合成酵素遺伝子は、当業者に公知の標準方法によって、シアノバクテリアに導入できる。これは、化学変換及びエレクトロポレーションを含む変換のための標準プロトコル、及び種間接合と染色体組み換えのための標準プロトコルを含むが、限定されない（Ｔｓｉｎｏｒｅｍａｓら、１９９４；Ｍｕｈｌｅｎｈｏｆｆ及びＣｈａｕｖａｔ、１９９６）。形質転換の一つの形式としては、受容するシアノバクテリア細胞の染色体において隣接する、ＤＮＡの二つの側方部分に挿入される、関心の外来（外来性）遺伝子又は複数遺伝子を含むプラスミドを生成することを含む。受容する染色体ＤＮＡの側方部分の長さは、それぞれ少なくとも１００塩基対（Ｓｚａｌａｙ及びＷｉｌｌｉａｍｓ、１９８８）でなければならない。染色体挿入の適切な部位は、染色体断片のショットガンライブラリからランダムに選択でき、頑強な成長又は他の所望の表現系を表すものについてのインサータント（ｉｎｓｅｒｔａｎｔ）コロニーのスクリーニングに続く（Ｓｚａｌａｙ及びＷｉｌｌｉａｍｓ、１９８８）。あるいは、挿入は、挿入を目標とする染色体ＤＮＡの特定領域を分離する、ＰＣＲ又は別の方法を用いて、特定の部位で行うことができる（Ｉｗａｉら、２００４）。二重交差（遺伝子置換を伴う挿入）又は単一の交差（部分的な遺伝子重複を伴う挿入）の事象（同書）のいずれかをプロモートするコンストラクトが、作製される。挿入ＤＮＡにおいて、関心遺伝子と共に抗生物質耐性マーカを組み入れることにより、形質転換体の選択が可能になる。
【００３９】
本発明の一実施形態において、プラスミドは、イソプレン合成酵素遺伝子の発現に用いられる。プラスミドベクターは、選択宿主において複製できるか、できないかの、いずれかである。いずれの種類の挙動にも、実験的な用途がある。ベクターの複製は、潜在的には、新規宿主において外来性遺伝子を発現できる。このようなベクターは、宿主の範囲が広いか狭いかのいずれかである場合がある。例えば、プラスミドＲＳＦ１０１０の派生物は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら、１９９４；Ｍｅｒｍｅｔ−Ｂｏｕｖｉｅｒら、１９９３）並びにアナベナ７１２０（Ｔｈｉｅｌ、１９９４）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ（好熱性菌種を含む）及びＰｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ（Ｍｕｈｌｅｎｈｏｆｆ及びＣｈａｕｖａｔ、１９９６；Ｓｏｄｅら、１９９２）において複製でき、遺伝子解析に対して新規な種における複製についての保証試験を行うことができる。対照的に、Ｎｏｓｔｏｃ７５２４由来６．３ｋｂプラスミドｐＤＵ１に基づくプラスミドは、いくつかの第ＩＶ種（（Ｒｉｐｐｋａら、１９７９）、表１の意味を指す）及び第ＩＩ種（Ｂｉｌｌｉら、２００１）において複製できるが、第Ｉ種では複製することは報告されていない。新規宿主に移植できるが、その中で複製できないプラスミドベクターは、安定維持を目的として、置き換え（例えば、突然変異誘発に用いられるトランスポゾン）又は統合（例えば、相同的組み換えにより）が行われなければならないＤＮＡを移植するためには、理想的である。Ｔｈｉｅｌ（１９９４）の文献は、シアノバクテリア用の各種類を様々に記載している。
【００４０】
本発明の態様は、シアノバクテリアにおける、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子の発現に関する。いくつかの実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、植物遺伝子である。多くの遺伝子工学ツールがシアノバクテリアに対して利用可能であり（Ｋｏｋｓｈａｒｏｖａ及びＷｏｌｋ（２００２）に総説がある）、したがって、シアノバクテリアにおけるイソプレン合成酵素の発現を最適化するための、多くのオプションが存在する。イソプレン合成酵素遺伝子は、シアノバクテリアへの導入前に組み換えることができる。一実施形態において、これは、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ又はアナベナ７１２０等のシアノバクテリア種における発現のために最適化したコドンを提供するよう、配列を組み換えることを含む。全遺伝子合成により、タンパクをコードする遺伝子は、一つの遺伝コードを用いて、異なる遺伝コードを利用する宿主生物体において発現することができる。これは、コードの異なる所望のタンパクにおける各アミノ酸位置に対して適切な宿主のコドンが用いられるように、合成遺伝子を設計することによって行われる。したがって、合成遺伝子から転写されるメッセージが組み換え宿主で発現されるときには、天然の宿主において発現されるタンパクと同一のアミノ酸を有して、ポリペプチドが生産されることになる。同様にして、適切なヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入の選択をガイドするための宿主の遺伝子コードを用いて、設計した遺伝子（及びタンパク）の中に、所望の変異を意図的に改変することができる。一実施形態において、コドン使用の最適化は、シアノバクテリア種Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（Ｎａｋａｍｕｒａら、２００２）又はアナベナ７１２０に対する遺伝情報及びコドン使用テーブルを基礎とすることになる。多くの他の生物体のためのコドン使用は、コドン利用データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）に見出すことができる。
【００４１】
別の実施形態において、シアノバクテリアの発現の最適化は、シアノバクテリアの制限部位を回避することに関する。シアノバクテリア宿主に対するゲノム配列情報が利用できる場合には、ｈｓｄＲＭＳ遺伝子によってコードされる制限系サブユニット（Ｂｉｃｋｌｅ及びＫｒｕｇｅｒ、１９９３；Ｍｕｒｒａｙ、２０００）は、他の細菌ｈｓｄＲＭＳ遺伝子に対する配列相同性によって識別できる。Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓのｔｌｌ２２２８、ｔｌｌ２２２９及びｔｌｌ２２３０遺伝子は、この方法によって認識され、この情報は、ｔｔｌ２２３０遺伝子が挿入突然変異によって破壊された場合には、菌株を設計及び構築するために用いられた。この菌株は、形質転換効率の強化が見られた（Ｉｗａｉら、２００４）。Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓのＩＩ型制限系は、制限酵素であるＳｅｌＩが細胞内に存在すること含み、これはＣＧＣＧ配列を切断し（Ｍｉｙａｋｅら、１９９２）、ＲＧＡＴＣＹ配列においてゲノムＤＮＡをメチル化する（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ及びＩｋｅｕｃｈｉ、未発表の観察、Ｉｗａｉら（２００４）に収録）。全遺伝子合成により、及びシアノバクテリア宿主（上記）の遺伝コードを知ることにより、関心タンパクを正確にコードし、しかも形質転換するＤＮＡにおいてＣＧＣＧ又はＲＧＡＴＣＹの存在を生じるであろうコドン又は他の制限部位の使用を最小化する、合成遺伝子を構築することができる。
【００４２】
別の実施形態において、シアノバクテリアの発現の最適化は、シアノバクテリアの転写開始を最適化することに関する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて良好に発現する多くの遺伝子は、シアノバクテリアにおいても発現する。これは、これらの遺伝子の発現を支配している転写制御配列が、シアノバクテリアにおいても活性を有することを示している。例えば、プラスミドｐＲＬ４５３及びクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）カセット由来のストレプトマイシン／スペクチノマイシンアデニリルトランスフェラーゼ遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（Ｉｗａｉら、２００４）において効率的に発現することが見出された。Ａｎａｃｙｓｔｉｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ Ｒ２フェレドキシンＩ遺伝子（ｐｅｔＦ１）のプロモータは、単離され、以下の配列を有している（ＡＴＧ開始コドンの１２０ヌクレオチド上流から、５’から３’方向に読む。当該プロモータの−３５及び−１０領域、並びに転写開始部位を、下線で示す）（Ｒｅｉｔｈら、１９８６）。
【化１】
この特定のプロモータにおいて、−１０のボックスはＥ．ｃｏｌｉの共通配列と類似しているが、−３５のボックスは異なる。このプロモータと、関連するｐｅｔＦ１リボソーム結合部位及び開始コドンとを、非相同的遺伝子であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｃｒｙＩＶＢ遺伝子と融合し、融合コンストラクトを用いて形質転換されるＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株ＰＣＣ７９４２細胞において、この遺伝子の発現を駆動するために用いた（Ｓｏｌｔｅｓ−Ｒａｋら、１９９３）。同様に、ｒｂｃＬＳプロモータは、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ６３０１において、リボース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼオペロンの発現を支配し、シアノバクテリア宿主であるＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株ＰＣＣ７９４２において、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコール脱水素酵素ＩＩ型遺伝子を発現するために用いた。（Ｄｅｎｇ及びＣｏｌｅｍａｎ、１９９９）シアノバクテリアの発現において効果的な多数の他のプロモータは、公知である。ヒト炭酸脱水酵素ＩＩ（ＨＣＡＩＩ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のハイブリッドｔａｃプロモータ及びｌａｃＩｑリプレッサの制御下において、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ ７９４２で発現し、誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を外因的に添加することにより、ＨＣＡＩＩ発現レベルを調節することができる（Ｐｒｉｃｅ及びＢａｄｇｅｒ、１９８９）。さらにまた、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコール脱水素酵素ＩＩ型遺伝子は、ｃＩ８５７温度感受性リプレッサの制御下において、ｌａｍｂｄａｐｈａｇｅ ｃＩ ＰＬプロモータを用い、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ ７９４２の温度により誘導可能な制御下で発現した。
【００４３】
本発明は、このように、一態様において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、ポプライソプレン合成酵素遺伝子である。本発明のイソプレン合成酵素の核酸の相同体及び対立遺伝子は、従来の技術によって識別できることを考慮すべきである。したがって、本発明の態様は、イソプレン合成酵素をコードする核酸配列である。
【００４４】
一般に、相同体及び対立遺伝子は、通常は、イソプレン合成酵素及びポリペプチドの核酸配列に対して、少なくとも７５％のヌクレオチド同一性及び／又は少なくとも９０％のアミノ酸同一性を、それぞれ共有し、いくつかの例においては、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性及び／又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有し、さらに他の例においては、少なくとも９５％のヌクレオチド同一性及び／又は少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有する。相同性は、ＮＣＢＩ（米国メリーランド州のベセズダ）によって開発され、一般公開されている様々なソフトウェアツールを使用して算出でき、これらはＮＣＢＩインターネットサイトから得ることができる。例示的ツールとしては、ＮＣＢＩインターネットサイトで同様に利用可能なＢＬＡＳＴソフトウェアが挙げられる。１対１及びＣｌｕｓｔａｌＷ整列（ＢＬＯＳＵＭ３０マトリクス設定）並びにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー分析は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）配列解析ソフトウェア（オックスフォードモレキュラグループ）を使用して得ることができる。前述の核酸のワトソン・クリック相補性も、本発明に包含される。
【００４５】
本発明は、天然材料に存在するものに対する代替コドンを含む、変性した核酸も含む。例えば、セリン残基は、ＴＣＡ、ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ及びＡＧＣというコドンによってコードされる。６つのコドンのそれぞれは、セリン残基をコードする目的に対して等価である。したがって、セリンをコードするヌクレオチドトリプレットが、いずれも、伸長イソプレン合成酵素にセリンを組み込むよう、生体外又は生体内で、タンパク合成装置に指示するために使用できることは、当業者であれば明らかである。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとしては、以下が挙げられるが、限定されない。ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ及びＣＣＴ（プロリン・コドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡ及びＡＧＧ（アルギニン・コドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ及びＡＣＴ（トレオニン・コドン）；ＡＡＣ及びＡＡＴ（アスパラギン・コドン）；ＡＴＡ、ＡＴＣ及びＡＴＴ（イソロイシン・コドン）。他のアミノ酸残基は、同様に複数のヌクレオチド配列によってコードできる。このように、本発明は、遺伝コードの変性によって、生物学的に単離された核酸とはコドン配列において異なる、変性された核酸を包含する。
【００４６】
本発明は、一以上のヌクレオチドの追加、置換及び欠失を含む、組み換え核酸分子も提供する。いくつかの実施形態において、それらがコードする、これらの組み換え核酸分子及び／又はポリペプチドは、抗原性、酵素活性、錯体形成等の、組み換えのない核酸分子及び／又はポリペプチドの少なくとも一つの活性又は機能を保持する。ある実施形態において、組み換え核酸分子は、本願明細書において別途記載のように、組み換えポリペプチド、好適には保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。組み換え核酸分子は、組み換えのない核酸分子に構造的に関連し、好適な実施形態においては、組み換えのない核酸分子に十分に構造的に関連するので、組み換えられた及び組み換えのない核酸分子は、当業者に公知の厳密な条件下においてハイブリダイズする。
【００４７】
本願明細書に用いる「厳密な条件」という用語は、当業者によく知られているパラメータを指す。核酸ハイブリダイゼーションのパラメータは、当該方法を蓄積する、例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、研究所マニュアル、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９年、又は“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、ジョン・ワイリー社、ニューヨーク等の参考文献に見出すことができる。より具体的には、本願明細書に用いる厳しい条件とは、例えば、ハイブリダイゼーションバッファ（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％フィコール（登録商標）、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中、６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）であり、ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムであり、ＥＤＴＡは、エチレンジアミン４酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜は、例えば、室温中、２ｘＳＳＣ、次いで６８℃以下の温度で０．１〜０．５ｘＳＳＣ／０．１ｘＳＤＳで洗浄される。
【００４８】
他の条件、試薬等を用いることも可能であり、同様の厳密さが得られる。熟練者であれば、このような条件に精通しているため、本願明細書には示さない。しかしながら、熟練者であれば、本発明のイソプレン合成酵素核酸の相同体及び対立遺伝子を明確に識別できる様式で、これらの条件を操作できる（例えば、厳密さがより低い条件を用いて）ことを理解されたい。熟練者は、細胞をスクリーニングするための方法論、及びルーチン的に単離されるこれらの分子の発現と、これに続く関連核酸分子の単離と塩基配列決定のためのライブラリにも精通している。
【００４９】
例えば、単一のアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を、調製することができる。本願明細書に記載のように、これらの核酸分子のそれぞれは、遺伝コードの変性に対応するヌクレオチド変化を除き、１個、２個又は３個のヌクレオチド置換を有することができる。同様に、２個のアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする、例えば２〜６個のヌクレオチド変化を有する組み換え核酸分子を、調製することができる。これらのような多数の組み換え核酸分子は、例えば、アミノ酸２及び３、２及び４、２及び５、２及び６をコードするコドンにおけるヌクレオチドの置換等を含み、当業者であれば直ちに想定されるものである。前述の例において、２個のアミノ酸の組み合わせは、それぞれ、組み換え核酸分子の組、並びにアミノ酸置換をコードする全てのヌクレオチド置換に含まれる。追加的な置換（例えば、３以上）、追加又は欠損（例えば、停止コドン又はスプライス部位の導入により）を有するポリペプチドをコードする、追加の核酸分子も、当業者であれば直ちに想定されるように、本発明により調製でき、包含することが可能である。前述の核酸又はポリペプチドは、いずれも、本願明細書に開示の核酸及び／又はポリペプチドに対する構造的関連性又は活性の保持についてのルーチン試験により、試験できる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、核酸に対して行われる組み換え又は突然変異は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない。いくつかの実施形態において、核酸に対して行われる組み換え又は突然変異は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変更するが、コードされたポリペプチドの活性（例えば、機能的又は生理的活性）を変更しない。
【００５１】
本発明は、本願明細書に記載のイソプレン合成酵素ポリペプチドの変異体を包含する。本願明細書に使用のように、イソプレン合成酵素ポリペプチドの「変異体」は、イソプレン合成酵素の主要なアミノ酸配列に対する一以上の組み換えを含むポリペプチドである。イソプレン合成酵素変異体を作成する組み換えは、発現系におけるタンパクの安定性又はタンパクとタンパクとの結合の安定性等のイソプレン合成酵素ポリペプチドの特性を強化するために、イソプレン合成酵素ポリペプチドに対して行うことができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドに対する組み換えは、通常は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする核酸に対して行われ、欠失、ポイントミューテーション、トランケーション、アミノ酸置換及びアミノ酸又は非アミノ酸部分の追加を含むことができる。あるいは、組み換えは、切断、リンカ分子の追加、ビオチン等の検出可能部分の追加、脂肪酸の追加等によって、ポリペプチドに直接的に行うことができる。組み換えは、イソプレン合成酵素のアミノ酸配列の全体又は一部を含む、融合タンパクも包含する。当業者であれば、タンパク配列内変化のタンパクのコンホメーション作用を予測する方法に精通しているので、公知の方法にしたがって、変異体イソプレン合成酵素ポリペプチドを「設計」することができる。このような方法の一例は、Ｄａｈｉｙａｔ及びＭａｙｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７８巻、８２−８７ページ、１９９７年に記載され、タンパクは新規に設計可能である。この方法は、公知のタンパクに適用でき、ポリペプチド配列の一部のみを変化させる。Ｄａｈｉｙａｔ及びＭａｙｏの計算方法を適用することにより、イソプレン合成酵素ポリペプチドの特定の変異体を提案し、該変異体が所望の形態を保持するかどうかを決定するよう試験を行うことができる。
【００５２】
一般的に、変異体は、その所望の生理的活性とは無関係なポリペプチドの特徴を変更するよう、特異的に組み換えられるイソプレン合成酵素ポリペプチドを含む。例えば、システイン残基は、不要なジスルフィド結合を防ぐために、置換又は欠失することができる。同様に、あるアミノ酸は、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク分解（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性の存在する酵母発現系における二塩基性アミノ酸残基）を除くことにより、イソプレン合成酵素ポリペプチドの発現を強化するよう変化させることができる。
【００５３】
イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする核酸の突然変異は、好適には、コード配列のアミノ酸読み取り枠を保存し、好適には、ハイブリダイズして、変異体ポリペプチドの発現に有害となりうるヘアピン又はループ等の２次構造を形成すると思われる核酸中の領域を生成しない。
【００５４】
突然変異は、アミノ酸置換を選択することによって、又はポリペプチドをコードする核酸における選択部位のランダムな突然変異誘発によって、行うことができる。次いで、変異体ポリペプチドは、発現され、いずれの突然変異が変異体ポリペプチドに所望の特性をもたらすかを決定確定するために、一以上の活性について試験される。さらなる突然変異は、ポリペプチドのアミノ酸配列に関しては無変化であるが、特定の宿主における翻訳について好適なコドンを提供する変異体に対して（又は変異体ではないイソプレン合成酵素ポリペプチドに対して）行うことができる。また他の突然変異は、イソプレン合成酵素遺伝子又はｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して、ポリペプチドの発現を強化するために行うことができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドの変異体の活性は、本願明細書に開示のように、適切な発現ベクターに変異体イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングすることと、該ベクターを適切な宿主細胞に導入することと、変異体イソプレン合成酵素ポリペプチドを発現することと、イソプレン合成酵素ポリペプチドの機能的な能力について試験することと、によって試験できる。当業者に公知のように、変異体ポリペプチドの調製が異なれば、他の活性試験が好まれる場合がある。
【００５５】
熟練者であれば、保存的アミノ酸置換は、前述のポリペプチドの機能的に等価な変異体を提供するためにイソプレン合成酵素ポリペプチドにおいて行われてもよい、すなわち、この変異体は、イソプレン合成酵素ポリペプチドの機能的能力を保持することも理解する。本願明細書において用いる「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換が行われるタンパクの相対的な電荷又はサイズの特徴を変更しない、アミノ酸置換を指す。変異体は、当業者に公知のポリペプチド配列を変更する方法にしたがって調製でき、そのような方法を累積する、例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ”、研究所マニュアル、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９年、又は“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、ジョン・ワイリー社、ニューヨーク等の参考文献に見出すことができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドの機能的に等価な例示的変異体としては、本願明細書に開示のタンパクのアミノ酸配列における、保存的アミノ酸置換が挙げられる。アミノ酸の保存的置換は、以下の官能基内でアミノ酸の間に行われる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００５６】
一般的に、変異体ポリペプチドを調製するときに、アミノ酸の全てよりも少数が変化することが好ましい。特定のアミノ酸残基が機能を与えることが知られている場合には、そのようなアミノ酸は置換されないか、あるいは、保存的アミノ酸置換によっては置き換えられない。好適には、変異体ポリペプチドを調製するときに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個等を変化させる。通常、最小数の置換が行われることが好ましい。このように、生成変異体ポリペプチド生成の一つの方法は、特定のアミノ酸に対して全ての他のアミノ酸を置き換え、次いで変異体の活性を検定し、次いで最良の活性を有する一以上のポリペプチドを用いて処理を繰り返すことである。
【００５７】
イソプレン合成酵素ポリペプチドと機能的に等価な変異体を生産するための、イソプレン合成酵素ポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、通常、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする核酸の変更によって行われる。このような置換は、当業者に公知の様々な方法によって行うことができる。例えば、アミノ酸置換は、キュンケルの方法（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８２巻、４８８−４９２ページ、１９８５年）にしたがって部位特異的突然変異により、又はイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成により、行うことができる。いくつかの実施形態において、置換は、直接的にペプチドを合成することによって行うことができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドの機能的に等価な断片の活動は、本願明細書に開示のように、変更したイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする遺伝子を適切な発現ベクターにクローニングすることと、該ベクターを適切な宿主細胞に導入することと、変更したイソプレン合成酵素ポリペプチドを発現することと、イソプレン合成酵素ポリペプチドの機能的な能力について試験することと、によって試験できる。化学合成されるペプチドは、例えば、イソプレン合成酵素機能等の機能について、直接的に試験することができる。
【００５８】
本発明の態様は、遺伝子改変光合成微生物由来のイソプレン生産を増加することを目的とする、最適化戦略を取り入れる。本願明細書で用いるイソプレン生産の増加とは、一以上の最適化戦略以前の遺伝子改変光合成微生物から生産されるイソプレンの量と比較して、より多量のイソプレンが、一以上の最適化戦略の後に遺伝子改変光合成微生物から生産されることを指す。
【００５９】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、イソプレン合成酵素の発現レベルを変更することにより、及びイソプレン合成酵素の発現に対する制御の実施を通じて、増加することになる。シアノバクテリアにおける動作が示されてきた数多くのプロモータ及びリボソーム結合部位の多く、例えば、（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて比較的強力な）ｔａｃＩＩプロモータ、（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて比較的弱い）ｌａｃプロモータ、関連するリボソーム結合部位とｌａｃオペレータ配列との組み合わせ（ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９８３；Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、１９８０）が試されことになる。共発現されるｌａｃリプレッサが存在しない場合、これらの二つのプロモータは、生産される生成物（イソプレン）の量及びバイオリアクタ中のパフォーマンスに関して、定量化及び比較が可能な二つの異なるレベルで、この酵素を恒常的に発現するはずである。恒常的プロモータの制御下において共発現可能なｌａｃＩｑリプレッサのコンストラクトへの追加は、非代謝性の誘導物質であるイソプロピルβ−Ｄ−チオ・ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を培地中で濃縮することにより、発現レベルの調節を可能とする。これにより、生産性及びバイオリアクタのパフォーマンスにおける効果に関して、イソプレン合成酵素の可能なレベル変化を調査できる。これにより、調節可能なイソプレン合成酵素の発現が所望のものであるか、不要であるかに関する決定も行うことになる。不要であれば、発現の最適レベルが決定されるときには、そのレベルと競合する「不変な」恒常的発現コンストラクトは、プロモータ配列、リボソーム結合部位シーケンス、リボソーム結合部位間の間隔及び開始コドン等を変化させることにより、実験的に生成できる。ｌａｃＩｑを含む実験は、ｌａｃリプレッサが折り畳まれ、活性のあった温度で行われなければならないことに注意されたい。野生型のｌａｃリプレッサは、５０℃まで安定であり、必要であれば、ｌａｃリプレッサの熱安定型突然変異体も使用できる（Ｂｅｌｌら、２００１；Ｇｅｒｋら、２０００）。
【００６０】
イソプレン合成酵素発現の最適化に対する組み換え可能遺伝子発現において、さらなるステップは、転写の終了である。ステムループ構造をコードする配列は、潜在的な転写ターミネータの性質を有し、アナベナ及びＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ由来のものを含む、いくつかのシアノバクテリア遺伝子の停止コドンに後続することも見出されている（Ｌｉ及びＴａｂｉｔａ、１９９４；Ｐｌａｎｓａｎｇｋａｔｅら、２００４）。
【００６１】
別の実施形態において、シアノバクテリアの発現の最適化は、シアノバクテリアの翻訳開始の最適化に関する。シアノバクテリアは、グラム陰性生物体であって、Ｅ．ｃｏｌｉ．と類似の開始部位を有する傾向がある。シアノバクテリアのｍＲＮＡは、プリンリッチなリボソーム結合部位を有することが見出され（シャイン・ダルガノ配列）、様々なヌクレオチドが基準開始コドンの上流にある。例えば、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ Ｒ２のフェレドキシン遺伝子に対しては、メチオニン開始コドンの７ヌクレオチド上流に、ＧＡＧＧＡが見出される（Ｒｅｉｔｈら、１９８６）。また、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのフラボドキシンのメッセージにおいて、ＧＧＡＡＧが、ＡＵＧ開始コドンの９ヌクレオチド上流に、ＧＡＧＧＡが見出される（Ｌａｕｄｅｎｂａｃｈら、１９８８）。他の例は、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のシアノバクテリア・ゲノム配列で見出すことができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアにおけるイソプレン生産は、イソプレン合成酵素のタンパク工学により増加する。イソプレン合成酵素の３次元ホモロジーモデルは、５−エピ−アリストロチェン合成酵素及びボルニル２リン酸合成酵素等の、相同的なテルペンシクラーゼの、実験的に決定された３次元構造との比較により、構築できる（Ｓｔａｒｋｓら、１９９７；Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎら、２００２）。同時に、Ｘ線結晶学又はＮＭＲ分光法により、基質又は基質類似物の結合のある場合とない場合の両方について、ポプライソプレン合成酵素の実際の３次元構造を実験的に決定する努力が、開始された。ポプライソプレン合成酵素は、至適活性温度が５０℃であり、すでに極めて熱安定的である（Ｍｏｎｓｏｎら、１９９２）。しかしながら、さらなる温度安定化が望ましい場合には、構造に準拠した突然変異誘発を用いることができ、例えば、αへリックス中グリシンをアラニンに置換することは、通常、突然変異あたり１ｋｃａｌを超える安定化自由エネルギーに寄与する。さらなる安定化が必要であれば、試験管内進化を含む、コンビナトリアルな突然変異の戦略が用いられることになる（Ｍａｒｔｉｎら、２００１；Ｍａｘら、２００７）。イソプレン合成酵素の特定の活性及び特異性を改良するために、基質結合を有する酵素の３次元モデル（又は、上述の実験的構造）が生成される。遷移状態の錯体に結合する酵素モデルも、有用である。これらのモデルに基づき、基質又は遷移状態との相互作用が予測される活性部位領域内の残基において、一連の部位特異的アミノ酸置換の突然変異が生成され、これらの変異体についてのｋｃａｔ及びＫｍ値が測定され、それぞれの野生型の値と比較される。これらの結果に基づき、さらなる単一部位突然変異、並びに最良の単一部位突然変異の全ての可能な組み合わせが生成され（Ｂａｎｔａら、２００２）、試験される。この選別から出現する改良された突然変異体は、バイオリアクタ培養下での組み換えシアノバクテリア宿主におけるイソプレン生産の強化について、試験される。これらの生体内試験は、宿主生物体に対して有害な改変酵素の特性変化も、全て明らかにする。
【００６３】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、律速であるイソプレニル２リン酸塩又はジメチルアリル２リン酸塩合成の上流にある酵素の過剰発現及び／又は内因性活性（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）の強化によって増加する。イソプレン合成酵素の基質であるＩＰＰ及びＤＭＡＰＰは、シアノバクテリアの２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸経路により生成されることが知られている（Ｏｋａｄａ及びＨａｓｅ、２００５）。この経路における酵素ステップの多くは、公知であり、その構成要素はクローニング及び過剰発現することができる（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１；Ｈｏｅｆｆｌｅｒら、２００２；Ｈｕｎｔｅｒら、２００３；Ｏｋａｄａ及びＨａｓｅ（２００５））。
【００６４】
原理的には、組み換え宿主生物体の当該経路を介する炭素フラックスは、速度を制約するステップを特定し、次いでこの特定のステップに含まれる酵素（及び、必要であれば補助因子）を、特定の活性（上述）の増強のために過剰発現すること又は改変することにより、増加させることが可能である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのイソプレン生産は、１−デオキシ・キシルロース５−リン酸合成酵素遺伝子を過剰発現させることによって強化されることが示され、これは、Ｓ．ｌｅｏｐｏｌｉｅｎｓｉｓのジメチルアリル２リン酸塩合成の「上流」である（Ｍｉｌｌｅｒら、２０００；Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。同様に、細胞のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を、一以上の活性酵素を過剰発現すること又は改変することのいずれかにより増加させることにより、細胞内のイソペンテニル２リン酸及びジメチルアリル２リン酸貯蔵の容易な平衡化及び釣り合いを促進することが可能であり（Ｂａｒｋｌｅｙら、２００４）、又はイソプレン合成酵素が触媒する反応の、イソプレンに伴う生成物である無機ピロリン酸塩を分解することにより、この過程を「引き上げる」目的で無機ピロホスファターゼを過剰発現することが可能である。
【００６５】
一つのボトルネックが取り除かれ、ある経路の代謝速度が増加するときには、その経路中に新たな律速ステップが現れるため、通常、これは反復的な方法である。イソプレン生産性シアノバクテリア生物体の新規な組み換えのそれぞれから生じる代謝炭素フラックスの変化は、１３ＣＯ２の存在中で細胞を培養し、２次元核磁気共鳴分光法による細胞内容物の分析を通じ、炭素含有代謝物レベルを定量的にモニタすることによって評価できる（Ｅｍｍｅｒｌｉｎｇら、２００２）。次いで、例えば、特異的活性を増加するための、構成要素の過剰発現及び／又はタンパク工学等、最初のボトルネックに対処するために用いたものと同様の手段により、新規なボトルネックからの解放を探求できる。続くいずれのボトルネックも、外在する要因（例えば、拡散支配される細胞内へのＣＯ２の質量移動、光の利用可能性）によって制約されたこの経路を介する炭素フラックスが最大化となるまで、同様の様式で攻略することが可能である。形質転換される宿主のシアノバクテリア生物体において、選択された遺伝子の過剰発現は、マルチコピープラスミド上での遺伝子クローニング、宿主の染色体への統合を介する遺伝子の追加的コピー又は複数コピーの挿入、上方制御を目的とした宿主の染色体の天然存在遺伝子に隣接するシス作用制御エレメント（例えば、プロモータ）の挿入、及び他の同様の戦略、という多くの手段によって達成できることに注意されたい。
【００６６】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、ランダムな突然変異誘発（トランスポゾン又はトランスポゾン様の挿入を用いて、又は標準的な変異原を用いて）及び生物体による生産の改良のためのスクリーニングによって増加する。イソプレンの生産は、内在的な宿主の要因によって宿主生物体の特定の代謝経路が抑制されることにより、いくつかの条件下で制限される場合もある。これらの場合、サプレッサとして作用している宿主の要因又は配列を「不活性化」又は下方制御することは、イソプレンへの経路を通じて炭素フラックスを増加させると考えられる。このようなサプレッサが公知である場合には、二重組み換えによる抗生物質耐性カセットの挿入を介した遺伝子破壊を用いて、ヌル変異体を生成することが直接的である（Ｉｗａｉら、２００４）。遺伝子活性の完全なノックアウトが、例えば致死性のために望ましくない場合には、抑制活性の「不活性化」は、遺伝子を下方制御することのできるシス作用制御エレメントを挿入することによって探求できる。しかしながら、多くの場合、生産性を抑制する宿主生物体の遺伝子の同一性は、直ちに明らかでないが、それでもなお、ランダムな突然変異誘発及びスクリーニングを介して、このような遺伝子の活性を変更することは可能である。このような活性、すなわち化学的な変異原による飽和突然変異誘発の後に、何万もの細菌コロニーのスクリーニングが望まれる場合がある活性に対する生命線は、規模縮小され、高度に並列化が可能な検定法である。ランダムな突然変異誘発を実行するための適切な変異原は、ニトロソグアニジン及び紫外線である。トランスポゾン挿入を介するランダムな突然変異誘発も、実行できる（Ｔｏｌｏｎｅｎら、２００６；Ｚｈａｎｇら、２００４）。突然変異誘発されたコロニーは、適切な培地を少量含む９６穴（又は４８若しくは２４穴）の深いウェルのマイクロタイタープレートに入れられ、プレートはガス透過膜で覆われ、細胞が飽和に達するまで、プレートは照明下で振とうしながらインキュベートされる。次いで、イソプレン合成酵素の誘導（必要に応じて）後に、プレートはガス不透膜でシールされ、インキュベーションが継続され、各ミクロ培養液から放出されるガス状イソプレンは、培養液上方の上部空間に蓄積することができる。次いで、ガスクロマトグラフィ／質量分析機器に適合するオートサンプラにより、各ミクロ培養液からのイソプレンを集め、定量化できる。再度のストリークによるクローン精製後のイソプレン生産の増加が表れる変異体クローンのミクロ培養は、振とうフラスコ及びバイオリアクタ（３−１０Ｌ）スケールでの改良イソプレン生産表現型の再現性を確認する。化学的な突然変異誘発の場合には、検証された高生産性の菌株は、完全なゲノムの塩基配列の再決定が行われ、この配列は、突然変異誘発部位を確認するために野生型ゲノムのものと比較される。突然変異誘発の複数の部位が単独の菌株に見られる場合には、これらは、突然変異した遺伝子を生体外で精製し、「ノックイン」法によって野生型の染色体に導入することにより、単独に特徴分析することができる（すなわち、野生型の遺伝子を対照として）。トランスポゾンによる突然変異誘発の場合には、ゲノムの突然変異部位は、「逆ＰＣＲ」を用いて塩基配列決定のための識別及び分離を行うことができる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、同一又は関連生物体由来のゲノム断片のショットガンクローニングに続いて、変異における過剰発現要因によって追加又は強化が可能な不明経路を識別することを目的とする、生産に対する改良生物体のスクリーニングによって増加する。イソプレン生産を刺激するよう変異において作用する律速因子は、同一の生物体（多くの遺伝子コピー数が望ましい場合）、又は関連性はあるが潜在的にはより有効な遺伝子が存在するかもしれない他の菌種（特に、シアノバクテリアの）等の他の生物体のいずれかから、ショットガンクローニングによって、イソプレン生産性生物体のゲノム配列に供給（及び識別）することができる。唯一の必要条件は、ゲノム配列が宿主生物体において発現できるという状況で供給されなければならないということであり、これは、内在性の制御配列（例えば、プロモータ）により、又は必要であればクローニングベクター上に供給される発現制御配列により、多くの場合で満足できる。イソプレン生産のためのクローンのスクリーニングは、上述と同一のランダムに突然変異させたクローンをスクリーニングするための、マイクロタイタープレートアッセイを用いて、同様の様式で実行される。振とうフラスコ及びバイオリアクタスケールでのイソプレン生産において増加が実証されたクローンは、挿入されたゲノム断片をＰＣＲにより増幅するための側方ベクター配列を用いた後に、ＤＮＡ塩基配列決定により、特徴分析される。
【００６８】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、単一の生物体に突然変異を組み込むことによって増加する。２以上の新しい突然変異、新規遺伝子の挿入。又は他の遺伝子組み換えが、再現性を有して生物体の生産性の強化を示すときには、これらの組み換えの全ての可能な組み合わせが試験される。それぞれの場合における実際の遺伝子組み換えは、ＤＮＡ塩基配列決定により特徴分析されたと仮定し、標準的な分子遺伝子操作を用いて、複数の独立した「上方」突然変異を単一のゲノムに改変することが可能である。次いで、このような二重の突然変異、三重の突然変異等が行われたそれぞれの生物体は、それぞれの独立した遺伝子組み換えの相加性、相乗効果、又は拮抗作用について、他のそれぞれとの関連において試験することができる。ビルディングブロックとしての相加性又は相乗効果が表れる遺伝子組み換えを用い、これらを組み合わせることにより、さらに生産性を強化したイソプレン生産性生物体を生成できる。
【００６９】
本発明の態様は、シアノバクテリアを培養することに関する。特徴分析された全てのシアノバクテリア種は、少なくとも研究所スケールでうまく培養されてきた。これらの多くは、ＢＧ−１１（ＡＴＣＣ培地６１６）等の「ラン藻（ｂｌｕｅ ｇｒｅｅｎ ａｌｇａｅ）」用標準培地上で成長する。多くの専用培地も開発されている。このように、シアノバクテリアは、次のような標準又は専用培地中で培養できるが、限定されない。Ａｉｂａ−Ｏｇａｗａ（ＡＯ）培地、硝酸塩添加Ａｌｌｅｎ−Ａｒｎｏｎ培地：ＡＴＣＣ培地１１４２、Ａｎｔｉａの（ＡＮＴ）培地、Ａｑｕｉｌ培地、Ａｓｈｂｅｙの窒素フリー寒天培地、ＡＳＮ−ＩＩＩ培地、ＡＳＰ２培地、ＡＳＷ培地：人工海水及び派生物、ＡＴＣＣ培地６１７：海洋性ラン藻用ＢＧ−１１；組み換えＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ＡＴＣＣ培地８１９：ラン藻用窒素固定培地；ＮＯ３非含有ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ＡＴＣＣ培地８５４：ビタミンＢ１２含有ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ＡＴＣＣ培地１０４７：ビタミンＢ１２含有ＡＴＣＣ培地９５７［ＭＮ海洋性培地］、ＡＴＣＣ培地１０７７：窒素固定海洋性培地；ＮＯ３非含有ＡＴＣＣ培地９５７［ＭＮ海洋性培地］、ＡＴＣＣ培地１２３４：ＢＧ−１１ウラシル培地；ウラシル含有ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、Ｂｅｇｇｉａｔｏａ培地：ＡＴＣＣ培地１３８、Ｂｅｇｇｉａｔｏａ培地２：ＡＴＣＣ培地１１９３、ラン藻用ＢＧ−１１培地：ＡＴＣＣ培地６１６、ラン藻（ＢＧ）培地、ＢｏｌｄのＢａｓａｌ（ＢＢ）培地、ＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚＤ培地、修正ＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚＤ培地：好塩性シアノバクテリア、ＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚＤＧ培地、ＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚＤＧＮ培地、ＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚＮＤ培地、ＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓＢｒｏｔｈ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ培地：ＡＴＣＣ培地９２０、Ｃｈｕの＃１０培地：ＡＴＣＣ培地３４１、Ｃｈｕの修正＃１０培地、Ｃｈｕの修正＃１１培地、ＤＣＭ培地、ＤＹＩＶ培地、Ｅ２７培地、Ｅ３１培地及び派生物、ｆ／２培地、ｆ／２培地派生物、Ｆｒａｑｕｉｌ培地：淡水微量金属緩衝培地、ラン藻用Ｇｏｒｈａｍの培地：ＡＴＣＣ培地６２５、ｈ／２培地、Ｊａｗｏｒｓｋｉの（ＪＭ）培地、Ｋ培地、Ｌ１培地及び派生物（ＭＮ海洋性培地）：ＡＴＣＣ培地９５７、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｅｒｄｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（ＰＥ）培地、ＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓＰＣ培地、ＰｒｏｔｅｏｓｅＰｅｐｔｏｎｅ（ＰＰ）培地、Ｐｒｏｖ培地、Ｐｒｏｖ培地派生物、ビタミン添加Ｓ７７培地、ビタミン添加Ｓ８８培地、塩水栄養寒天（ＳＮＡ）培地及び派生物、ＳＥＳ培地、ＳＮ培地、修正ＳＮ培地、ＳＮＡＸ培地、土壌／水２相（Ｓ／Ｗ）培地及び派生物、スピルリナ用ＳＯＴ培地：ＡＴＣＣ培地１６７９、スピルリナ（ＳＰ）培地、ｖａｎ Ｒｉｊｎ及びＣｏｈｅｎ（ＲＣ）培地、Ｗａｌｓｂｙの培地、Ｙｏｐｐ培地、Ｚ８培地（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｃｙａｎｏｓｉｔｅ．ｂｉｏ．ｐｕｒｄｕｅ．ｅｄｕ／ｍｅｄｉａ／ｔａｂｌｅ／ｍｅｄｉａ．ｈｔｍｌ、（Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ、１９９８））。シアノバクテリアの培養は、標準方法にしたがって実行され、当業者に公知である（Ｒｏｇｅｒｓ及びＧａｌｌｏｎ、１９８８；Ｂｕｒｌｅｗ、１９６１；Ｒｏｕｎｄ、１９６５）。微生物は、遺伝子改変した光合成微生物であるため、これらの条件は十分な光を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、シアノバクテリアバイオリアクタで培養するプロトコルを改良することにより、増加する。所与の菌株及び所与の条件セットに対して再現性のあるイソプレン生産を行う、標準化プロトコルは、重要である。一般的に、新しい菌株ごとに記録保管用バイアルロットが生成され、番号付け及び日付記録が行われ、液体窒素中−８０℃で格納される。再現性について、その菌株での新規な実験培養は、それぞれ、新規なバイアルロットの解凍と、これを使用して培養液に蒔くこととによって開始される。標準的な培地及び条件（例えば、Ｂｕｒｌｅｗ、１９６１）は、培養液を最適化するための出発点として利用される。組み換え生物体成長の最適プロトコルを確立する目的で、生産相に先立ち、培養条件が調査される。所与のバイオリアクタ構成に対して独立して変化させて最適化されるいくつかの培養条件としては、以下が挙げられる。照明光の波長対強度スペクトル；ｐＨ；温度；微量金属；複合的な窒素源（例えば、イースト抽出物）を有する培地サプリメント；溶存ＣＯ２濃度（Ｆｒｉｃｋ及びＪｕｎｋｅｒ（１９９９）を参照、発酵ブロス溶存ＣＯ２に関する問題の説明がある）；溶存Ｏ２濃度；溶存Ｎ２濃度；インペラ設計及び振とう速度（注：エアリフト機構による振とうを含む）；消泡剤の存在；有機共溶媒の存在（Ｄａｕｇｕｌｉｓ、２００１）；栄養限定状態での最終的な光学濃度；その他。最適化は、時間の関数又は培養液の最適濃度の関数として、これらの変数のいずれか又は全てを変化させることも含むことができる。イソプレンの出力を最大にする目的で、生産相の間に付加的な最適化を実行する必要のある場合がある。これは、特に、イソプレン合成酵素のための誘導可能な発現系、及び／又はイソプレン合成酵素基質を合成する代謝経路の他の遺伝子の場合に正しく、最適な導入後（生産相）の細胞培養プロトコルは、最適な誘導前（成長相）プロトコルとは大きく異なる場合がある。同様に、新しい組み換え菌株の試験、又はバイオリアクタのスケール若しくはジオメトリが変わるときには、いつも、全てのプロトコルは、再び最適化を要する場合がある。
【００７１】
本発明の態様は、代謝改変された光合成微生物からイソプレンを集めることに関する。光合成生物体は、発酵槽で培養することができる。３４℃を超える細菌培養において、イソプレンは、ガス状である。したがって、イソプレンは、単純な濃縮により、発酵のオフガス中で集めることができる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、回収プロトコルの改良によって増加する。細菌培養によって生産される揮発性有機化合物は、ガス状の化合物を再び液化する冷却濃縮装置を用いて、培養のオフガスから回収することができる（Ｍｉｌｌｅｒら、２０００；Ｎｅｗｍａｎら、２００６）。オフガス中で蒸発した水も、この手順によりトラップされる。所望であれば、多少揮発的な構成要素の中に濃縮物を分別する目的で、一連の濃縮器又は冷却トラップは、温度を低下させるように設定することができる（Ｎｅｗｍａｎら、２００６）。このような濃縮器の設計、動作温度及び数は、実験的に確立することができる。しかしながら、分別なしでも、イソプレンは、比較的非混合性であり、低密度であり、二相の凝縮物の上相から比較的純粋なイソプレンを回収することが可能であるため、共に凝縮した水から容易に分離することができる。あるいは、バイオリアクタ自体において、ｎ−ドデカン等の非混合性の有機系共溶媒は、所望であれば非水相に、イソプレンをトラップするために添加することができ、ここから後に分離することができる（Ｄａｕｇｕｌｉｓ、２００１；Ｊａｎｉｋｏｗｓｋｉら、２００２；Ｎｅｗｍａｎら、２００６）。
【００７３】
本発明は、以下の実施例により示されるが、いかなるやり方においても制限する意図はない。
【実施例】
【００７４】
実施例１：イソプレン合成酵素（ｖ２．２）のための遺伝子合成
イソプレン合成酵素のためのｃＤＮＡクローンは、ポプラからクローニングした（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。Ｅ．ｃｏｌｉにおける当該外来遺伝子の発現、及び組み換え生物体からのイソプレンの生産も、説明が行われている（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。イソプレン合成酵素が属する酵素クラスであるテルペンシクラーゼは、比較的よく研究されており（相同体５−エピ−アリストロチェン合成酵素（Ｓｔａｒｋｓら、１９９７）及びボルニル２リン酸合成酵素（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎら、２００２）の３次元構造決定を含む）、酵素の最適化を目的とする将来のタンパク工学実験の非常な助力となるはずである。
【００７５】
イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、ポプラの配列をガイドとして使用し、（ａ）シーケンスを組み換えすることを総合したＴ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓにおける発現のための至適コドンを提供し、（ｂ）ある制限部位を除去又は挿入し（例えば、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ制限酵素系により認識される部位（Ｉｗａｉら、２００４）又は分子生物学操作に必要な部位）、及び／又はイソプレン合成酵素タンパク自体の物理的性質（例えば、より高い熱安定性の提供）を有利に変更するためにアミノ酸配列を変異させる。
【００７６】
実施例２：イソプレン合成酵素を発現させるためのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１の改変。
Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１は、イソプレン合成酵素の発現を評価するための、特に良好なシアノバクテリア菌株である。この微生物の光合成機構には大規模な特徴分析が行われ（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ及びＢｏｕｓｓａｃ、２００４）、そのゲノムの完全なＤＮＡ配列の決定及びアノテーションが行われてきた（中村ら、２００２）。さらに、エレクトロポレーションを介したプラスミドによる形質転換及び外来遺伝子の発現が示されてきた（Ｉｗａｉら、２００４）。このように、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ．を用いる代謝組み換えに対して、全ての基本ツールが存在する。最終的な効果として、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓは、イソプレンの沸点よりも２０℃上の、５５℃の至適成長温度を有し、生きている細胞からのイソプレン揮発の反応速度が極めて有利であり、反応を進行方向に「引く」ことを意味する。
【００７７】
合成イソプレン合成酵素遺伝子は、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓにおいて転写活性を有するプロモータの後方でベクターに挿入され、このようなベクターは、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓのポジティブな形質転換体を選択することもできる（Ｉｗａｉら、２００４）。
【００７８】
実施例３：試験培養
微量金属を含有するが炭素源のない（ＣＯ２を除き）最少培地における組み換え菌株の試験培養を、次の三つの基準にしたがって実施し、二酸化炭素からのイソプレンの光合成生産を確立した。（ｉ）オフガスとしてのイソプレン検出量が、非組み換え対照細胞からのオフガス中に見出されるものよりも顕著に高いこと、（ｉｉ）イソプレン合成の光誘導性及び光依存性の実証、及び（ｉｉｉ）１３ＣＯ２が存在する組み換え生物体の培養によりイソプレンが同位体標識できることの実証。
【００７９】
実施例４：シアノバクテリアのイソプレン合成酵素（ｖ２．２．１）の合成と発現、及び培養液由来のイソプレンの検出
簡潔には、合成イソプレン合成酵素遺伝子は、ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ断片（図６）としてベクターｐＵＣ５７中にクローニングして構築した。特定の制限酵素部位を除去するための、及びレアコドン（Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１コドンの使用を基礎とする）をより一般的なもの、並びに他の塩基変化に置き換えるための、ポプラ酵素コード配列について選択した変更箇所を、下線で示す。開始（ＡＴＧ）及び停止（ＴＡＡ）コドンは、太字で示す。
【００８０】
組み換え酵素の検出及び／又は精製を容易にするため、開始コドン直後の酵素コード配列に対する５’位に、Ｈｉｓ６タグのコード配列を融合した。このタグにより、ＩｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）染色（インビトロゲン、インク社）を用いるＳＤＳゲル上での組み換え酵素のインサイツ検出、及び／又は固定化された金属アフィニティクロマトグラフィを用いる細胞抽出物からの組み換え酵素の精製が容易になる。開始コドンのすぐ上流は、ｔａｃＩＩプロモータが先行するリボソーム結合部位配列であり（ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９８３）、開始コドンとリボソーム結合部位との間の固有ＥｃｏＲＩサイトは、これらの上流の制御配列を含む断片が、必要に応じて、コード配列から分離できるようにする。このコード配列は、両端のさらなる「適合化」の有無にかかわらず、硝酸還元酵素をコードする遺伝子の発現を駆動するアナベナｐＮｉｒプロモータの制御下で配置された（Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ，Ｄ．ら、２００５）。
【００８１】
Ｄｅｓｐｌａｎｃｑらの文献は、ｈｅｔＲ遺伝子の転写を駆動するｐＮｉｒプロモータを有するｐ５０５の構造を含む。発明者らは、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを有するｈｅｔｒ遺伝子を取り除き、これを、増幅したイソプレン合成酵素遺伝子に置き換えた。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位を取り付けたイソプレン合成酵素遺伝子を増幅するために用いたプライマを、以下に示す。
【化２】
【００８２】
このプロモータは、窒素源としてのアンモニアで成長する細胞中ではオフ状態であるが、硝酸塩で成長する細胞中では強いオン状態である。遺伝子工学応用に対し、このプロモータは、短期のバッチ応用に有用であるが、成長の間に硝酸塩が消費されるため、一般的には適用できない。
【００８３】
このコンストラクトは、２５℃でのネオマイシン中の連続選択により、アナベナ７１２０においてプラスミドとして維持された。１０日後に、可視コロニーを採取し、ネオマイシンを有するが窒素との組み合わせのないＢＧ−１１又はＢＧ−１１のいずれかの液体培地に移した。１０日の成長の後、ＢＧ−１１０培養液に硝酸塩を加え、イソプレン合成酵素の転写を誘導した。イソプレン合成酵素の転写は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出した。数日後、細胞培養液の温度を３７℃に上昇させ、全ての生産されたイソプレンが気相に転換できるようにした。
【００８４】
微量元素を含有するが炭素源のない（ＣＯ２を除く）最少培地上で形質転換した菌株の試験発酵を実施し、二酸化炭素からのイソプレンの光合成生産を確立した。組み換えシアノバクテリアにおけるイソプレン合成酵素遺伝子の発現の成功例は、以下の結果によって示された。
（ａ）適切な制御菌株との比較により、形質転換した細胞は、ＰＣＲによってＩＳ ｍＲＮＡを転写する能力を有することを示した。
（ｂ）組み換え細胞培養物からのイソプレンの生合成生産は、細菌培養液により放出されるイソプレンを検出するために開発されたプロトコル使用いて、ガスクロマトグラフィ／質量分析により示された（Ｋｕｚｍａら、１９９５、下記参照）。アウトガス化したイソプレンの濃度は、非組み換え対照細胞からのアウトガス中に見られるものよりも高かった。列挙した条件下で計算されたイソプレン収量は、ＯＤ７００＝０．２３の培養液について、３０分あたり１リットルにつき２５マイクログラムだった。
【００８５】
イソプレン生成物は、オフガスを濃縮器に通し、次いで溶媒ジクロロエタンを用いて濃縮器から洗い出すことにより、回収した。（濃縮した）ＤＣＥ溶液は、定量目的でＧＣに注入した。
【００８６】
細菌細胞培養液により生産されるイソプレンの検定（Ｋｕｚｍａら、１９９５）。
【００８７】
ガスクロマトグラフィ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によるイソプレンの同定。バクテリアは、１０ｍｌのリッチな培地に接種し、Ａ６００がほぼ１．５となるまで成長させた。次いで、２ｍｌの培養液は、テフロンライニングした隔壁で密封した４．８ｍｌのガラスバイアル中で、約６時間インキュベートした。試料のヘッドスペース（１．２ｍｌ）は、ガラスビーズと共に液体アルゴン（−１８６℃）に浸漬して詰めたニッケルループ中で集めた。その後に、このループを１５０℃に加熱してＤＢ−１カラム（長さ３０ｍｍ、直径０．２５ｍｍ、膜厚１μｍ）（Ｊ＆Ｗサイエンティフィック社、米国カリフォルニア州のフォルサム）に注入し、ヒューレット・パッカード社質量選択検出器（電子イオンか、全イオンモード動作）又は同等の装置に接続した。各ＧＣ−ＭＳランに対する温度プログラムは、１分間−６５℃に維持した後に、毎分４℃の速度で加温することを含む。ヘリウムキャリアガス及び毎分約０．７ｍｌの流速を用いた。このシステムは、Ｃｉｃｅｒｏｎら（１９８８）の文献にさらに詳細に記載されている。細菌性イソプレン生産の陽性識別のため、細菌のヘッドスペースから得られたピーク保持時間及び質量スペクトルは、純正のイソプレン標準の保持時間及び質量スペクトルと比較した。「ベクターのみ」の組み換え対照培養液からのヘッドスペースは、ネガティブコントロールとして、ランに用いた。
【００８８】
ルーチン的イソプレン検定。細菌株は、Ａ６００が１．０から６．０となるまで成長させた。２ｍｌの培養液は、密封バイアル中で振とうを伴って適切な温度で約３時間インキュベートし、ヘッドスペースは、イソプレンに対して高感度なガスクロマトグラフィを用いて分析した（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９９３、Ｓｉｌｖｅｒ及びＦａｌｌ、１９９１を参照）。このシステムは、ｎ−オクタン／ポラシルＣカラム（ｐｏｒａｃｉｌ（登録商標））（オールテック・アソシエーション・インク社、米国イリノイ州のディアフィールド）と共に等温動作（８５℃）させ、ＲＧＤ２酸化第二水銀還元ガス検知器（トレース・アナリティカル社、米国カリフォルニア州のメンローパーク）又は同等品に連結させた。イソプレンは、３．６分で溶出した。イソプレン生産速度（ｎｍｏｌ／ｇ／時間）は、次のように算出できる。ＧＣ面積の単位を、標準のイソプレン濃度較正曲線に対するｎｍｏｌイソプレンに変換する。試料のＡ６００値を取り、既知のＡ６００を用いて細胞培養液に対するウェット重量を得ることにより、細胞グラム数（ｇ）に変換する。２〜５個の別個の測定を取り、検定箇所ごとに平均する。ネガティブコントロールは、上記の通りである。
【００８９】
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Yamaoka, T., Satoh, K., and Kotoh, S. (1978), "Photosynthetic activities of a thermophilic blue-green alga.", Plant Cell Physiol., 19, 943-954.
Zhang,S., Laborde,S.M., Frankel,L.K., and Bricker,T.M. (2004), "Four novel genes required for optimal photoautotrophic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 identified by in vitro transposon mutagenesis.", J. Bacteriol., 186, 875-879.
本願明細書において全ての引例の教示は、参照により本願明細書に援用する。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００７年５月１日出願の仮出願第６０／９２７１０２号、発明の名称「代謝改変光合成微生物を用いて二酸化炭素を炭化水素に直接変換する方法」の優先権を主張し、その全体を参照により本願明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀の社会に対する最も大きなチャレンジの一つは、輸送、加熱及び工業プロセスの増大する要求に応え、持続可能なやり方でこれらの産業に原料を提供することである。より重要なことには、将来のエネルギー及び原料供給は、温室効果ガスの排出を同時に削減することに答えなければならない。油、ガス及び石炭産業は、過去８０年のエネルギー市場だけでなく、炭素系化学製品産業も支配した。原油埋蔵量が低下すると、政治的混乱及び工業化学製品の基礎を形成する石油とその精製品（石油由来化学、石油化学製品としても知られる）への世界的需要により、エネルギー並びにこれらの重要な炭化水素誘導体とその下流製品のコストは、増大してきた。さらに、化石燃料の燃焼及び精製は、地球温暖化における温室効果ガス排出の効果に関する関心の火付け役となってきた。環境への関心及び生物工学研究の最近の進歩によって刺激を受け、合成生物学技術は、現在、化学工業の重要原料の生合成（再生可能）による製造を可能にする微生物工学に適用することができる。現在のところ、再生可能な植物資源由来の液体生物燃料としてのエタノール生産は、行われている主要な方法である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
エタノールは、ブラジル、米国及びいくつかのヨーロッパ諸国において、すでに大規模に導入されている。エタノールは、ガソリンと混合することも可能であり、専用エンジンにおいて無希釈アルコールとしても使用できる。現在、燃料市場向けエタノールは、糖（ブラジル）又はデンプン（米国）から生産される。デンプン含有材料からのエタノール生産は、液化ステップ（デンプンを可溶化する）及び加水分解ステップ（ブドウ糖を生産するため）を必要とする。生成したブドウ糖は、直ちに発酵される。しかしながら、この原料系は、動物飼料及び人間の需要にも用いられるため、燃料エタノールへの需要増加に十分に応えることにならず、糖又はデンプン系エタノールの使用から生じる温室効果ガス減少は、望まれるほどには高くない（Ｆａｒｒｅｌｌら、２００６）。
【０００４】
これらの両者の限界に対処するため、農業及び森林間伐材、並びに専用作物等のリグノセルロース原料の開発が、エタノール生産を目的として、探索されてきた。リグノセルロースからのエタノールプロセスは、多くの技術的経済的課題に直面している（Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌら、２００６）。
【０００５】
第一に、セルロース及びヘミセルロースは、生物分解によって可溶な糖に解重合されなければならない。酵素転換は、副産物の形成がなく基質特異的であり、後続プロセスへの抑制を低下する。しかしながら、バイオマスが前処理を受けない限り、酵素触媒によるセルロースからブドウ糖への転換は遅く、前処理にも、高収量の達成及び方法の商業的成功が求められる（Ｍｏｓｉｅｒら、２００５）。
【０００６】
第二に、セルロースの解重合は、効率的なアルコール発酵が求められる炭素数６の（ヘキソース）及び炭素数５の（ペントース）糖と共に、発酵を抑制する化合物、すなわち低分子量の有機酸、フラン誘導体、フェノール類及び前処理中に放出形成される無機化合物及び／又は原料の加水分解物を生産する（Ｌａｒｓｓｏｎら、２０００）。リグノセルロース原料は、特定の広葉樹及び農業原料において、ペントース糖であるキシロース及びアラビノースを５〜２０％（又はこれ以上）を含むことができるが、これらは、最も一般的に用いられる工業発酵微生物である酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによっては、エタノールに発酵されない。ペントース発酵微生物は、遺伝子改変が行われており、化学的又は物理的方法を用いて、有毒な抑制物質を除去する方法が開発されている（Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌら、２００６）。
【０００７】
第三に、処理エネルギーの要求を最小限とするために、セルロースの解重合及び生成する糖の発酵を統合する進歩した方法が、開発されなければならない。加水分解と発酵とを別個に行うこと（ＳＨＦ）、及び糖化とセルロース発酵とを同時に行うこと（ＳＳＦ）の二つの方法が取られてきた。ＳＨＦにおいては、最初にセルロースはブドウ糖に加水分解され、次いでブドウ糖は、エタノールに発酵される。ＳＨＦの主な利点は、加水分解及び発酵が最適条件で起きることであり、不利な点は、セルロース分解酵素が最終生成物により阻害され、ブドウ糖及びセルビオース（ｃｅｌｌｕｂｉｏｓｅ）が蓄積するときには加水分解速度が次第に減少することである（Ｔｅｎｇｂｏｒｇら、２００１）。ＳＳＦにおいては、加水分解及び発酵は同じ容器において同時に起こり、放出された糖を発酵生物体が直ちに消費するため、酵素の最終生成物に対する抑制は軽減される。さらにまた、発酵は、加水分解物に存在するいくつかの有毒な化合物を変換することにより、酵素抑制を軽減すると考えられる（Ｔｅｎｇｂｏｒｇら、２００１）。これにより、全体のエタノール生産性、エタノール濃度及び最終的なエタノール収量は、上昇する（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍら、２００５）。
【０００８】
生物燃料としてエタノールの生産及び使用を取り巻く話題性は高いが、この方法には多くの弱点がある。エタノールよりも効率的に燃料として用いることができる炭化水素の生産方法が求められている。この方法は、温室効果ガスを実質的に削減する手段を提供することも必要とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、二酸化炭素（ＣＯ２）からイソプレン等の炭化水素を生産できるシアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物に関する。本発明は、また、遺伝子改変光合成微生物（代謝改変した光合成微生物とも呼ぶ）を用いて二酸化炭素を直接的に変換することにより、イソプレンを生産する方法にも関する。
【００１０】
本発明の一実施形態は、実質的に水において非混合性の炭化水素化合物（炭化水素とも呼ぶ）を生産するよう遺伝子改変された、シアノバクテリア等の光合成微生物である。いくつかの実施形態において、炭化水素化合物は、ガス状、非混合性の液体状、又は沈澱性である。いくつかの実施形態において、炭化水素は、イソプレンであり、光合成微生物（例えば遺伝子改変シアノバクテリア）は、二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する。いくつかの実施形態において、二酸化炭素は、大気の二酸化炭素である。いくつかの実施形態において、シアノバクテリアは、化石燃料プラント又は煙突（スクラバー）から発生する二酸化炭素の存在中で培養される、いくつかの実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸代謝経路を介して発生する前駆体から、イソプレンを生産する。多種多様なシアノバクテリアは、本願明細書に記載の方法及び／又は当技術分野において公知の方法を用いて、遺伝子を組み換えることが可能である。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ（Ｔ．）ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１等の、好熱性シアノバクテリアである。いくつかの実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属である。特定の実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ ７１２０）である。
【００１１】
本発明の態様は、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子導入により遺伝子改変された、シアノバクテリア等の光合成微生物（例えば、好熱性シアノバクテリア、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１、アナベナ属の一員、アナベナ７１２０）である。コードされたイソプレン合成酵素は、導入される遺伝子改変微生物（例えば、シアノバクテリア）において機能的である（活性を示す）ならば、任意の源から由来することができる。源としては、植物、バクテリア、ウイルス、他の非哺乳類源及び哺乳類源が挙げられる。特定の実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、木のイソプレン合成酵素遺伝子等の、植物イソプレン合成酵素遺伝子である。一実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）イソプレン合成酵素遺伝子である。イソプレン合成酵素遺伝子は、シアノバクテリアにおける発現及び／又は酵素活性を最適化するために、シアノバクテリアへの導入の前又は後に、組み換えることができる。一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、シアノバクテリアのゲノムに組み込まれるが、別の実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、遺伝子改変光合成微生物（シアノバクテリア）に含まれるプラスミドに担持される。
【００１２】
本発明の態様は、遺伝子改変シアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物を容器内において二酸化炭素の存在中で培養すること、及び遺伝子改変光合成微生物の培養液のオフガスからイソプレンを集めることに関する。一実施形態において、遺伝子改変シアノバクテリアは、さらなる生合成のための基質としてイソプレンを利用できる天然又は合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の挿入によって、さらに組み換えられる。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含む遺伝子改変光合成微生物に関し、この遺伝子改変光合成微生物は、遺伝子改変光合成微生物が二酸化炭素の存在中で培養されるとき等に、二酸化炭素からイソプレンを生産することができる。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１等のシアノバクテリアである。いくつかの実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ７１２０等のアナベナ属である。一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）イソプレン合成酵素遺伝子等の、植物（例えば、木、花、潅木、草）イソプレン合成酵素遺伝子である。代替実施形態において、光合成微生物は、組み換えのない場合には、イソプレンを全く／実質的に全く生産せず、通常は無変化の内在性イソプレン合成酵素遺伝子が活性化されるよう遺伝子改変されると、結果としてイソプレンを生産するよう機能する。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、シアノバクテリアにおける発現及び／又は活性を最適化する目的で、シアノバクテリアへの導入の前又は後に組み換えられた、外来性イソプレン合成酵素を含むシアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物に関する。一実施形態において、シアノバクテリアは、シアノバクテリアのゲノムに組み込まれるイソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含み、別の実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、プラスミドに担持される。
【００１５】
本発明の態様は、容器の中で、二酸化炭素の存在中に培養され、シアノバクテリアの培養液のオフガスからイソプレンを集めることができる遺伝子改変光合成微生物（例えば、遺伝子改変シアノバクテリア）等の、遺伝子改変光合成微生物に関する。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、さらなる生合成のための基質としてイソプレンを利用することができる天然又は合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の挿入によって、さらに組み換えられる。
【００１６】
本発明の態様は、イソプレンを生産するよう遺伝子改変された光合成微生物を培養することと、適宜、イソプレンを生産するよう遺伝子改変された光合成微生物から生産されるイソプレンを集めることによる、イソプレンの生産方法に関する。遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素の存在中、及び遺伝子改変光合成微生物の成長及び／又は保守に適切な条件下（例えば、十分な光の存在中）で、培養される。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１等のシアノバクテリアである。いくつかの実施形態において、シアノバクテリアはアナベナ７１２０等のアナベナ属である。培養条件は、シアノバクテリアの保守及び／又は成長のための十分な光を含む。
【００１７】
イソプレン生産方法の一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子の導入を介してイソプレンを生産するよう遺伝子改変された、シアノバクテリア等の光合成微生物が使用される。一実施形態において、該シアノバクテリアは、木のポプラ（例えば、Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）等の植物由来のイソプレン合成酵素遺伝子を含むよう遺伝子改変される。この遺伝子は、他の種類の木又は植物（例えば、花、潅木、草）に由来することも可能である。
【００１８】
一実施形態において、本方法は、シアノバクテリアにおける発現及び／又は酵素活性を最適化する目的で、シアノバクテリアへの導入の前又は後のイソプレン合成酵素の組み換えにおけるシアノバクテリアの使用を含む。一実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、遺伝子改変光合成微生物のゲノムに組み込まれる。別の実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、プラスミドに担持される。
【００１９】
本発明の態様は、遺伝子改変シアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物を容器内において二酸化炭素の存在中で培養することと、適宜、遺伝子改変光合成微生物の培養液のオフガス（例えば、遺伝子改変シアノバクテリアの培養液のオフガス）からイソプレンを集めることとの方法に関する。一実施形態において、本方法は、さらなる生合成のための基質としてイソプレンを利用することができる一以上の付加的な天然及び／又は組み換え微生物と共に遺伝子改変光合成微生物を共培養することに関する。
【００２０】
本発明の態様は、イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含む遺伝子改変光合成微生物を培養することであって、該遺伝子改変光合成微生物は、イソプレンを二酸化炭素から生産することと、適宜、イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含む遺伝子改変光合成微生物から生産されるイソプレンを集めることと、を含むイソプレンの生産方法に関する。遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素の存在中、及び成長及び／又は保守のための適切な条件下（例えば、十分な光の存在中）で、培養される。一実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１等のシアノバクテリアが使われる。いくつかの実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ７１２０等のアナベナ属である。
【００２１】
一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子は、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）イソプレン合成酵素遺伝子である。一実施形態において、イソプレンを生産する方法は、シアノバクテリアにおけるイソプレン合成酵素の発現及び／又は酵素活性を最適化する目的で、シアノバクテリアへの導入の前又は後のイソプレン合成酵素の組み換えを含む。一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、遺伝子改変光合成微生物（例えばシアノバクテリア）のゲノムに組み込まれ、別の実施形態において、これは微生物のプラスミド上に担持される。
【００２２】
本発明の態様は、二酸化炭素の存在中において容器で遺伝子改変光合成微生物を培養することによりイソプレンを生産することと、適宜、遺伝子改変光合成微生物の培養液のオフガスからイソプレンを集めることとの方法に関する。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、さらなる生合成のための基質としてイソプレンを利用することができる一以上の付加的な天然及び／又は組み換え微生物と共に、二酸化炭素の存在中において容器で共培養される。
【００２３】
本発明の態様は、イソプレン生産のための遺伝子改変光合成微生物の最適化及びイソプレンを光合成微生物から生産する方法の最適化に関する。いくつかの実施形態において、イソプレン生産量は、遺伝子改変光合成微生物におけるイソプレン合成酵素発現の発現レベル及び制御を変更することにより改善される。他の実施形態において、イソプレン生産量は、熱安定性、イソプレン合成酵素遺伝子の特定の活性及び特異性を改善するためのタンパク工学技術により、遺伝子改変光合成微生物におけるイソプレン合成酵素遺伝子のコード領域を変更することによって、改善される。他の実施形態において、イソプレン生産量は、律速であることが知られているイソプレニル２リン酸塩又はジメチルアリル２リン酸塩合成の上流の酵素の過剰発現及び／又は遺伝子改変光合成微生物の内因性活性（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の強化によって、改善される。他の実施形態において、イソプレン生産量は、遺伝子改変光合成微生物におけるランダムな突然変異誘発（トランスポゾン又はトランスポゾン様の挿入によって、又は標準突然変異誘発による）及び生産に対する改良生物体のスクリーニングによって、改善される。他の実施形態において、イソプレン生産量は、同一又は関連生物体由来のゲノム断片のショットガンクローニングに続いて、生産に対する改良生物体のスクリーニングによって、変異における過剰発現要因によって追加又は強化が可能な不明経路を特定することで改善される。ある実施形態において、イソプレン生産量は、複数の突然変異を単一の生物体に組み込むことによって改善される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、イソプレン生産のための遺伝子改変光合成微生物の最適化、又は遺伝子改変光合成微生物からのイソプレン生産方法の最適化は、微生物バイオリアクタにおいてイソプレン生産量を改善された遺伝子改変光合成微生物を培養すること、及び微生物バイオリアクタにおける培養プロトコルを最適化することによって、さらに達成される。いくつかの実施形態において、イソプレン生産のための遺伝子改変光合成微生物の最適化、又は遺伝子改変光合成微生物からのイソプレン生産方法の最適化は、微生物バイオリアクタからイソプレンを集めるための回収プロトコルを最適化することによって、さらに達成される。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、核酸分子が提供される。核酸分子は、組み換えイソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２．１）の核酸配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、プロモータに作動可能に連結された組み換えイソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２．１）の核酸配列を含む発現ベクターが提供される。関連する態様において、このような発現ベクターを用いてトランスフォーム又はトランスフェクトされる宿主細胞も提供される。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、単離されたポリペプチド又はその変異体が提供される。単離されたポリペプチドは、組み換えイソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２．１）の核酸配列によってコードされる。
【００２８】
本発明又は本願のファイルは、少なくとも一つの有色処理された図面を含む。カラー図面を伴う本発明又は本出願公開のコピーは、要求及び必要料金の支払いに応じ、事務局から提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】イソプレンの構造及び物理的特性を示す図である。
【図２】プリンス反応の図である。図示の式において、加えられるアルデヒドは、ホルムアルデヒドである。アセトアルデヒドの代用は、２位及び６位のメチル置換を生じる。
【図３Ａ】ポプラの葉から分離されたイソプレン合成酵素遺伝子のアミノ酸及び核酸配列である（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。
【図３Ｂ】ポプラの葉から分離されたイソプレン合成酵素遺伝子のアミノ酸及び核酸配列である（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。
【図３Ｃ】ポプラの葉から分離されたイソプレン合成酵素遺伝子のアミノ酸及び核酸配列である（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。
【図３Ｄ】ポプラの葉から分離されたイソプレン合成酵素遺伝子のアミノ酸及び核酸配列である（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。
【図３Ｅ】ポプラの葉から分離されたイソプレン合成酵素遺伝子のアミノ酸及び核酸配列である（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。
【図４Ａ】カナダポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）属由来の４つのイソプレン合成酵素配列を示す図である。
【図４Ｂ】カナダポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）属由来の４つのイソプレン合成酵素配列を示す図である。
【図５】イソペンテニル２リン酸塩（ＩＰＰ）及びその異性体であるジメチルアリル２リン酸塩（ＤＭＡＰＰ）の生産に関与する合成経路及びキー酵素を示す、シアノバクテリアのＭＥＰ経路の図である。シアノバクテリアは、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰのイソプレン転換に関与する酵素であるイソプレン合成酵素を欠いている。略語を、以下に示す。ＤＸＳ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ；ＤＸＲ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ；ＭＣＴ、ＭＥＰシチジルトランスフェラーゼ；ＣＭＫ、４−（シチジン５’ホスホ−）２Ｃ−メチル・エリトリトール・キナーゼ；ＭＥＣＰＳ、ＭＥＣＰシンターゼ；ＩＰＩ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ。
【図６Ａ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｂ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｃ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｄ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｅ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｆ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図６Ｇ】合成イソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２）、及び合成イソプレン合成酵素遺伝子の核酸配列である。
【図７】組み換えイソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２．１）の核酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の態様は、光合成微生物の遺伝子改変を通じて、ＣＯ２からイソプレンを生産する方法及び組成物に関する。シアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物は、最後から２番目のイソプレン前駆体、すなわち２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸経路を介するイソペンテニル２リン酸塩及びジメチルアリル２リン酸塩を合成するが、植物においてこの前駆体からイソプレンの生合成の最終ステップを実行する、イソプレン合成をコードする遺伝子を欠いている。植物と同様に、シアノバクテリアは、自家栄養生物であり、光の存在中におけるイソペンテニル２リン酸塩及びジメチルアリル２リン酸塩に対する最終的な炭素源は、大気のＣＯ２の光合成による固定である。そのため、シアノバクテリアは、発現可能なイソプレン合成酵素遺伝子を組み込むよう代謝改変され、光の存在中において、二酸化炭素及び水から直接的にイソプレンを生成することができる。
【００３１】
イソプレンは、沸点３４℃の揮発性化合物であり、単純な濃縮によって、細菌発酵のオフガスから回収できる。遺伝子改変微生物からのイソプレン生産を最大化する観点から、生成物が培養液から連続的に除去され、したがって律速因子（生成物の抑制）を生じる蓄積が決してないため、この揮発性は極めて魅力的な特徴である。光合成細菌培養液由来イソプレン生成物の動向は、ガソリン添加物／代替物の工業合成のための有用な出発物質、及び「生物燃料」の新形式であろう。このような添加物への複数の工業合成経路が想像できるが、そうした経路は、以下に例示する。
【００３２】
イソプレンは、反応容器内で適切なアルデヒド（セルロースのエタノールに由来するアセトアルデヒドを含む）及び適切な触媒と混合でき、水系プリンス反応により、高収量でアルキル置換１，３−ジオキサンに変換できる（Ａｒｕｎｄａｌｅ及びＭｉｋｅｓｋａ（１９５２）、図２、化合物５）。潜在的には、１，３−ジオキサン生成物は、単純な相分離によって反応容器から連続的に回収でき、さらなる軽微な改良だけで、ガソリン添加物として直接的に使用できる。様々な１，３−ジオキサンは、高いオクタン価を与える沸点を有し、５０：５０（ｖ／ｖ）の比率でガソリンと混合して内燃機関燃料を生産できる（Ａｒｕｎｄａｌｅ及びＭｉｋｅｓｋａ（１９５２））。１，３−ジオキサン添加物は、混合ガソリンを燃焼させるクリーナも生成し、これにより大気汚染に関与するエンジン沈着物及び炭化水素排出を削減する（Ｎｉｅｂｙｌｓｋｉ、１９８０）。１，３−ジオキサンは、環状エーテルであり、ガソリン添加物であるＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）等のエーテルを取扱う石油工業における実績は１０年以上あるので、潜在的な課題（例えば、経時的な過酸化物の集積）はすでに対処されてきた。
【００３３】
本発明は、イソプレン合成酵素を発現する光合成微生物を代謝改変するための方法及び組成物を提供する。本発明は、代謝改変された光合成微生物を二酸化炭素の存在中で培養することによりイソプレンを集めるための方法を、さらに提供する。
【００３４】
本発明の態様は、遺伝子改変光合成微生物の使用に関する。一実施形態において、遺伝子改変光合成微生物は、シアノバクテリアである。イソプレン合成酵素前駆体である、イソペンテニル２リン酸塩及びジメチルアリル２リン酸塩は、全ての公知のシアノバクテリアで合成される（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｊｒ．ら、２０００；Ｅｒｓｈｏｖら、２００２；Ｏｋａｄａ及びＨａｓｅ（２００５））。したがって、使用するシアノバクテリアは、下記のシアノバクテリア属（Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ、２００１）のメンバから選択できるが、限定されない。サブセクションＩ：Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、サブセクションＩＩ：Ｃｙａｎｏｃｙｓｔｉｓ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ、サブセクションＩＩＩ：Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ、Ｂｏｒｚｉａ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ、Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍａ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ、Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｌｙｎｇｂｙａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｔａｒｒｉａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｙｃｈｏｎｅｍａ、サブセクションＩＶ：Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ、Ｃｙａｎｏｓｐｉｒａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ、サブセクションＶ：Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｇｅｉｔｌｅｒｉａ、Ｉｙｅｎｇａｒｉｅｌｌａ、Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ、Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｌｗｅｂ．ｏｒｇ／ｔｒｅｅ？ｇｒｏｕｐ＝Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ；Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ（２００１））。シアノバクテリアに対する命名法は、修正中である（Ｏｒｅｎ、２００４）。
【００３５】
一実施形態において、使用するシアノバクテリア種は、以下を含む、より高温での成長に適する種から選択されるが、限定されない。Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）及びＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属の耐熱菌株（Ｍｉｌｌｅｒ及びＣａｓｔｅｎｈｏｌｚ（２０００）；Ｙａｍａｏｋａら、１９７８）。別の実施形態において、使用するシアノバクテリア種は、以下を含む、天然において外来性ＤＮＡを取ることが示されている種から選択されるが、限定されない。Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ａｌｐｉｃｏｌａ、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ ６８０３、及びＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖａ及びＳｈｅｓｔａｋｏｖ、１９８２；Ｓｈｅｓｔａｋｏｖら、２００４；Ｓｚａｌａｙ及びＳｈｅｓｔａｋｏｖ、１９８８）。別の実施形態において、使用するシアノバクテリア種は、以下を含む、エレクトロポレーションが外来ＤＮＡを導入する有効な方法であることが示されている種から選択されるが、限定されない。Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ． Ｍ１３１、Ｆｒｅｍｙｅｌｌａ ｄｉｐｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｎｏｓｔｏｃ ＰＣＣ ７１２１、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ Ｃ１、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ＭＫＵ ２７７、及びＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（Ｂｉｌｌｉら、２００１； Ｂｒｕｎｓら、１９８９； Ｉｗａｉら、２００４； Ｋａｗａｔａら、２００４； Ｍｏｓｅｒら、１９９３； Ｒａｖｉｎｄｒａｎら、２００６； Ｔｈｉｅｌ及びＰｏｏ、１９８９）。
【００３６】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ属である特定の実施形態において、シアノバクテリアは、アナベナ７１２０である。
【００３７】
本発明の態様は、光合成微生物の遺伝子工学に関する。一実施形態において、これは、遺伝子改変光合成微生物にイソプレン合成酵素をコードする遺伝子を導入することに関する。一実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、植物遺伝子であり、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）由来の遺伝子を含むが、限定されない。
【００３８】
本発明の態様は、シアノバクテリア等の遺伝子改変光合成微生物における、イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子の発現に関する。ある実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、シアノバクテリアの染色体に統合される。他の実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、プラスミド上で発現される。イソプレン合成酵素遺伝子は、当業者に公知の標準方法によって、シアノバクテリアに導入できる。これは、化学変換及びエレクトロポレーションを含む変換のための標準プロトコル、及び種間接合と染色体組み換えのための標準プロトコルを含むが、限定されない（Ｔｓｉｎｏｒｅｍａｓら、１９９４；Ｍｕｈｌｅｎｈｏｆｆ及びＣｈａｕｖａｔ、１９９６）。形質転換の一つの形式としては、受容するシアノバクテリア細胞の染色体において隣接する、ＤＮＡの二つの側方部分に挿入される、関心の外来（外来性）遺伝子又は複数遺伝子を含むプラスミドを生成することを含む。受容する染色体ＤＮＡの側方部分の長さは、それぞれ少なくとも１００塩基対（Ｓｚａｌａｙ及びＷｉｌｌｉａｍｓ、１９８８）でなければならない。染色体挿入の適切な部位は、染色体断片のショットガンライブラリからランダムに選択でき、頑強な成長又は他の所望の表現系を表すものについてのインサータント（ｉｎｓｅｒｔａｎｔ）コロニーのスクリーニングに続く（Ｓｚａｌａｙ及びＷｉｌｌｉａｍｓ、１９８８）。あるいは、挿入は、挿入を目標とする染色体ＤＮＡの特定領域を分離する、ＰＣＲ又は別の方法を用いて、特定の部位で行うことができる（Ｉｗａｉら、２００４）。二重交差（遺伝子置換を伴う挿入）又は単一の交差（部分的な遺伝子重複を伴う挿入）の事象（同書）のいずれかをプロモートするコンストラクトが、作製される。挿入ＤＮＡにおいて、関心遺伝子と共に抗生物質耐性マーカを組み入れることにより、形質転換体の選択が可能になる。
【００３９】
本発明の一実施形態において、プラスミドは、イソプレン合成酵素遺伝子の発現に用いられる。プラスミドベクターは、選択宿主において複製できるか、できないかの、いずれかである。いずれの種類の挙動にも、実験的な用途がある。ベクターの複製は、潜在的には、新規宿主において外来性遺伝子を発現できる。このようなベクターは、宿主の範囲が広いか狭いかのいずれかである場合がある。例えば、プラスミドＲＳＦ１０１０の派生物は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら、１９９４；Ｍｅｒｍｅｔ−Ｂｏｕｖｉｅｒら、１９９３）並びにアナベナ７１２０（Ｔｈｉｅｌ、１９９４）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ（好熱性菌種を含む）及びＰｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ（Ｍｕｈｌｅｎｈｏｆｆ及びＣｈａｕｖａｔ、１９９６；Ｓｏｄｅら、１９９２）において複製でき、遺伝子解析に対して新規な種における複製についての保証試験を行うことができる。対照的に、Ｎｏｓｔｏｃ７５２４由来６．３ｋｂプラスミドｐＤＵ１に基づくプラスミドは、いくつかの第ＩＶ種（（Ｒｉｐｐｋａら、１９７９）、表１の意味を指す）及び第ＩＩ種（Ｂｉｌｌｉら、２００１）において複製できるが、第Ｉ種では複製することは報告されていない。新規宿主に移植できるが、その中で複製できないプラスミドベクターは、安定維持を目的として、置き換え（例えば、突然変異誘発に用いられるトランスポゾン）又は統合（例えば、相同的組み換えにより）が行われなければならないＤＮＡを移植するためには、理想的である。Ｔｈｉｅｌ（１９９４）の文献は、シアノバクテリア用の各種類を様々に記載している。
【００４０】
本発明の態様は、シアノバクテリアにおける、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子の発現に関する。いくつかの実施形態において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、植物遺伝子である。多くの遺伝子工学ツールがシアノバクテリアに対して利用可能であり（Ｋｏｋｓｈａｒｏｖａ及びＷｏｌｋ（２００２）に総説がある）、したがって、シアノバクテリアにおけるイソプレン合成酵素の発現を最適化するための、多くのオプションが存在する。イソプレン合成酵素遺伝子は、シアノバクテリアへの導入前に組み換えることができる。一実施形態において、これは、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ又はアナベナ７１２０等のシアノバクテリア種における発現のために最適化したコドンを提供するよう、配列を組み換えることを含む。全遺伝子合成により、タンパクをコードする遺伝子は、一つの遺伝コードを用いて、異なる遺伝コードを利用する宿主生物体において発現することができる。これは、コードの異なる所望のタンパクにおける各アミノ酸位置に対して適切な宿主のコドンが用いられるように、合成遺伝子を設計することによって行われる。したがって、合成遺伝子から転写されるメッセージが組み換え宿主で発現されるときには、天然の宿主において発現されるタンパクと同一のアミノ酸を有して、ポリペプチドが生産されることになる。同様にして、適切なヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入の選択をガイドするための宿主の遺伝子コードを用いて、設計した遺伝子（及びタンパク）の中に、所望の変異を意図的に改変することができる。一実施形態において、コドン使用の最適化は、シアノバクテリア種Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（Ｎａｋａｍｕｒａら、２００２）又はアナベナ７１２０に対する遺伝情報及びコドン使用テーブルを基礎とすることになる。多くの他の生物体のためのコドン使用は、コドン利用データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）に見出すことができる。
【００４１】
別の実施形態において、シアノバクテリアの発現の最適化は、シアノバクテリアの制限部位を回避することに関する。シアノバクテリア宿主に対するゲノム配列情報が利用できる場合には、ｈｓｄＲＭＳ遺伝子によってコードされる制限系サブユニット（Ｂｉｃｋｌｅ及びＫｒｕｇｅｒ、１９９３；Ｍｕｒｒａｙ、２０００）は、他の細菌ｈｓｄＲＭＳ遺伝子に対する配列相同性によって識別できる。Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓのｔｌｌ２２２８、ｔｌｌ２２２９及びｔｌｌ２２３０遺伝子は、この方法によって認識され、この情報は、ｔｔｌ２２３０遺伝子が挿入突然変異によって破壊された場合には、菌株を設計及び構築するために用いられた。この菌株は、形質転換効率の強化が見られた（Ｉｗａｉら、２００４）。Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓのＩＩ型制限系は、制限酵素であるＳｅｌＩが細胞内に存在すること含み、これはＣＧＣＧ配列を切断し（Ｍｉｙａｋｅら、１９９２）、ＲＧＡＴＣＹ配列においてゲノムＤＮＡをメチル化する（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ及びＩｋｅｕｃｈｉ、未発表の観察、Ｉｗａｉら（２００４）に収録）。全遺伝子合成により、及びシアノバクテリア宿主（上記）の遺伝コードを知ることにより、関心タンパクを正確にコードし、しかも形質転換するＤＮＡにおいてＣＧＣＧ又はＲＧＡＴＣＹの存在を生じるであろうコドン又は他の制限部位の使用を最小化する、合成遺伝子を構築することができる。
【００４２】
別の実施形態において、シアノバクテリアの発現の最適化は、シアノバクテリアの転写開始を最適化することに関する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて良好に発現する多くの遺伝子は、シアノバクテリアにおいても発現する。これは、これらの遺伝子の発現を支配している転写制御配列が、シアノバクテリアにおいても活性を有することを示している。例えば、プラスミドｐＲＬ４５３及びクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）カセット由来のストレプトマイシン／スペクチノマイシンアデニリルトランスフェラーゼ遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（Ｉｗａｉら、２００４）において効率的に発現することが見出された。Ａｎａｃｙｓｔｉｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ Ｒ２フェレドキシンＩ遺伝子（ｐｅｔＦ１）のプロモータは、単離され、以下の配列を有している（ＡＴＧ開始コドンの１２０ヌクレオチド上流から、５’から３’方向に読む。当該プロモータの−３５及び−１０領域、並びに転写開始部位を、下線で示す）（Ｒｅｉｔｈら、１９８６）。
【化１】
この特定のプロモータにおいて、−１０のボックスはＥ．ｃｏｌｉの共通配列と類似しているが、−３５のボックスは異なる。このプロモータと、関連するｐｅｔＦ１リボソーム結合部位及び開始コドンとを、非相同的遺伝子であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｃｒｙＩＶＢ遺伝子と融合し、融合コンストラクトを用いて形質転換されるＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株ＰＣＣ７９４２細胞において、この遺伝子の発現を駆動するために用いた（Ｓｏｌｔｅｓ−Ｒａｋら、１９９３）。同様に、ｒｂｃＬＳプロモータは、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ６３０１において、リボース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼオペロンの発現を支配し、シアノバクテリア宿主であるＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株ＰＣＣ７９４２において、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコール脱水素酵素ＩＩ型遺伝子を発現するために用いた。（Ｄｅｎｇ及びＣｏｌｅｍａｎ、１９９９）シアノバクテリアの発現において効果的な多数の他のプロモータは、公知である。ヒト炭酸脱水酵素ＩＩ（ＨＣＡＩＩ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のハイブリッドｔａｃプロモータ及びｌａｃＩｑリプレッサの制御下において、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ ７９４２で発現し、誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を外因的に添加することにより、ＨＣＡＩＩ発現レベルを調節することができる（Ｐｒｉｃｅ及びＢａｄｇｅｒ、１９８９）。さらにまた、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコール脱水素酵素ＩＩ型遺伝子は、ｃＩ８５７温度感受性リプレッサの制御下において、ｌａｍｂｄａｐｈａｇｅ ｃＩ ＰＬプロモータを用い、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ ７９４２の温度により誘導可能な制御下で発現した。
【００４３】
本発明は、このように、一態様において、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、イソプレン合成酵素遺伝子は、ポプライソプレン合成酵素遺伝子である。本発明のイソプレン合成酵素の核酸の相同体及び対立遺伝子は、従来の技術によって識別できることを考慮すべきである。したがって、本発明の態様は、イソプレン合成酵素をコードする核酸配列である。
【００４４】
一般に、相同体及び対立遺伝子は、通常は、イソプレン合成酵素及びポリペプチドの核酸配列に対して、少なくとも７５％のヌクレオチド同一性及び／又は少なくとも９０％のアミノ酸同一性を、それぞれ共有し、いくつかの例においては、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性及び／又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有し、さらに他の例においては、少なくとも９５％のヌクレオチド同一性及び／又は少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有する。相同性は、ＮＣＢＩ（米国メリーランド州のベセズダ）によって開発され、一般公開されている様々なソフトウェアツールを使用して算出でき、これらはＮＣＢＩインターネットサイトから得ることができる。例示的ツールとしては、ＮＣＢＩインターネットサイトで同様に利用可能なＢＬＡＳＴソフトウェアが挙げられる。１対１及びＣｌｕｓｔａｌＷ整列（ＢＬＯＳＵＭ３０マトリクス設定）並びにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー分析は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）配列解析ソフトウェア（オックスフォードモレキュラグループ）を使用して得ることができる。前述の核酸のワトソン・クリック相補性も、本発明に包含される。
【００４５】
本発明は、天然材料に存在するものに対する代替コドンを含む、変性した核酸も含む。例えば、セリン残基は、ＴＣＡ、ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ及びＡＧＣというコドンによってコードされる。６つのコドンのそれぞれは、セリン残基をコードする目的に対して等価である。したがって、セリンをコードするヌクレオチドトリプレットが、いずれも、伸長イソプレン合成酵素にセリンを組み込むよう、生体外又は生体内で、タンパク合成装置に指示するために使用できることは、当業者であれば明らかである。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとしては、以下が挙げられるが、限定されない。ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ及びＣＣＴ（プロリン・コドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡ及びＡＧＧ（アルギニン・コドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ及びＡＣＴ（トレオニン・コドン）；ＡＡＣ及びＡＡＴ（アスパラギン・コドン）；ＡＴＡ、ＡＴＣ及びＡＴＴ（イソロイシン・コドン）。他のアミノ酸残基は、同様に複数のヌクレオチド配列によってコードできる。このように、本発明は、遺伝コードの変性によって、生物学的に単離された核酸とはコドン配列において異なる、変性された核酸を包含する。
【００４６】
本発明は、一以上のヌクレオチドの追加、置換及び欠失を含む、組み換え核酸分子も提供する。いくつかの実施形態において、それらがコードする、これらの組み換え核酸分子及び／又はポリペプチドは、抗原性、酵素活性、錯体形成等の、組み換えのない核酸分子及び／又はポリペプチドの少なくとも一つの活性又は機能を保持する。ある実施形態において、組み換え核酸分子は、本願明細書において別途記載のように、組み換えポリペプチド、好適には保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。組み換え核酸分子は、組み換えのない核酸分子に構造的に関連し、好適な実施形態においては、組み換えのない核酸分子に十分に構造的に関連するので、組み換えられた及び組み換えのない核酸分子は、当業者に公知の厳密な条件下においてハイブリダイズする。
【００４７】
本願明細書に用いる「厳密な条件」という用語は、当業者によく知られているパラメータを指す。核酸ハイブリダイゼーションのパラメータは、当該方法を蓄積する、例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、研究所マニュアル、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９年、又は“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、ジョン・ワイリー社、ニューヨーク等の参考文献に見出すことができる。より具体的には、本願明細書に用いる厳しい条件とは、例えば、ハイブリダイゼーションバッファ（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％フィコール（登録商標）、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中、６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）であり、ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムであり、ＥＤＴＡは、エチレンジアミン４酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜は、例えば、室温中、２ｘＳＳＣ、次いで６８℃以下の温度で０．１〜０．５ｘＳＳＣ／０．１ｘＳＤＳで洗浄される。
【００４８】
他の条件、試薬等を用いることも可能であり、同様の厳密さが得られる。熟練者であれば、このような条件に精通しているため、本願明細書には示さない。しかしながら、熟練者であれば、本発明のイソプレン合成酵素核酸の相同体及び対立遺伝子を明確に識別できる様式で、これらの条件を操作できる（例えば、厳密さがより低い条件を用いて）ことを理解されたい。熟練者は、細胞をスクリーニングするための方法論、及びルーチン的に単離されるこれらの分子の発現と、これに続く関連核酸分子の単離と塩基配列決定のためのライブラリにも精通している。
【００４９】
例えば、単一のアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を、調製することができる。本願明細書に記載のように、これらの核酸分子のそれぞれは、遺伝コードの変性に対応するヌクレオチド変化を除き、１個、２個又は３個のヌクレオチド置換を有することができる。同様に、２個のアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする、例えば２〜６個のヌクレオチド変化を有する組み換え核酸分子を、調製することができる。これらのような多数の組み換え核酸分子は、例えば、アミノ酸２及び３、２及び４、２及び５、２及び６をコードするコドンにおけるヌクレオチドの置換等を含み、当業者であれば直ちに想定されるものである。前述の例において、２個のアミノ酸の組み合わせは、それぞれ、組み換え核酸分子の組、並びにアミノ酸置換をコードする全てのヌクレオチド置換に含まれる。追加的な置換（例えば、３以上）、追加又は欠損（例えば、停止コドン又はスプライス部位の導入により）を有するポリペプチドをコードする、追加の核酸分子も、当業者であれば直ちに想定されるように、本発明により調製でき、包含することが可能である。前述の核酸又はポリペプチドは、いずれも、本願明細書に開示の核酸及び／又はポリペプチドに対する構造的関連性又は活性の保持についてのルーチン試験により、試験できる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、核酸に対して行われる組み換え又は突然変異は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない。いくつかの実施形態において、核酸に対して行われる組み換え又は突然変異は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変更するが、コードされたポリペプチドの活性（例えば、機能的又は生理的活性）を変更しない。
【００５１】
本発明は、本願明細書に記載のイソプレン合成酵素ポリペプチドの変異体を包含する。本願明細書に使用のように、イソプレン合成酵素ポリペプチドの「変異体」は、イソプレン合成酵素の主要なアミノ酸配列に対する一以上の組み換えを含むポリペプチドである。イソプレン合成酵素変異体を作成する組み換えは、発現系におけるタンパクの安定性又はタンパクとタンパクとの結合の安定性等のイソプレン合成酵素ポリペプチドの特性を強化するために、イソプレン合成酵素ポリペプチドに対して行うことができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドに対する組み換えは、通常は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする核酸に対して行われ、欠失、ポイントミューテーション、トランケーション、アミノ酸置換及びアミノ酸又は非アミノ酸部分の追加を含むことができる。あるいは、組み換えは、切断、リンカ分子の追加、ビオチン等の検出可能部分の追加、脂肪酸の追加等によって、ポリペプチドに直接的に行うことができる。組み換えは、イソプレン合成酵素のアミノ酸配列の全体又は一部を含む、融合タンパクも包含する。当業者であれば、タンパク配列内変化のタンパクのコンホメーション作用を予測する方法に精通しているので、公知の方法にしたがって、変異体イソプレン合成酵素ポリペプチドを「設計」することができる。このような方法の一例は、Ｄａｈｉｙａｔ及びＭａｙｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７８巻、８２−８７ページ、１９９７年に記載され、タンパクは新規に設計可能である。この方法は、公知のタンパクに適用でき、ポリペプチド配列の一部のみを変化させる。Ｄａｈｉｙａｔ及びＭａｙｏの計算方法を適用することにより、イソプレン合成酵素ポリペプチドの特定の変異体を提案し、該変異体が所望の形態を保持するかどうかを決定するよう試験を行うことができる。
【００５２】
一般的に、変異体は、その所望の生理的活性とは無関係なポリペプチドの特徴を変更するよう、特異的に組み換えられるイソプレン合成酵素ポリペプチドを含む。例えば、システイン残基は、不要なジスルフィド結合を防ぐために、置換又は欠失することができる。同様に、あるアミノ酸は、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク分解（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性の存在する酵母発現系における二塩基性アミノ酸残基）を除くことにより、イソプレン合成酵素ポリペプチドの発現を強化するよう変化させることができる。
【００５３】
イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする核酸の突然変異は、好適には、コード配列のアミノ酸読み取り枠を保存し、好適には、ハイブリダイズして、変異体ポリペプチドの発現に有害となりうるヘアピン又はループ等の２次構造を形成すると思われる核酸中の領域を生成しない。
【００５４】
突然変異は、アミノ酸置換を選択することによって、又はポリペプチドをコードする核酸における選択部位のランダムな突然変異誘発によって、行うことができる。次いで、変異体ポリペプチドは、発現され、いずれの突然変異が変異体ポリペプチドに所望の特性をもたらすかを決定確定するために、一以上の活性について試験される。さらなる突然変異は、ポリペプチドのアミノ酸配列に関しては無変化であるが、特定の宿主における翻訳について好適なコドンを提供する変異体に対して（又は変異体ではないイソプレン合成酵素ポリペプチドに対して）行うことができる。また他の突然変異は、イソプレン合成酵素遺伝子又はｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して、ポリペプチドの発現を強化するために行うことができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドの変異体の活性は、本願明細書に開示のように、適切な発現ベクターに変異体イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングすることと、該ベクターを適切な宿主細胞に導入することと、変異体イソプレン合成酵素ポリペプチドを発現することと、イソプレン合成酵素ポリペプチドの機能的な能力について試験することと、によって試験できる。当業者に公知のように、変異体ポリペプチドの調製が異なれば、他の活性試験が好まれる場合がある。
【００５５】
熟練者であれば、保存的アミノ酸置換は、前述のポリペプチドの機能的に等価な変異体を提供するためにイソプレン合成酵素ポリペプチドにおいて行われてもよい、すなわち、この変異体は、イソプレン合成酵素ポリペプチドの機能的能力を保持することも理解する。本願明細書において用いる「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換が行われるタンパクの相対的な電荷又はサイズの特徴を変更しない、アミノ酸置換を指す。変異体は、当業者に公知のポリペプチド配列を変更する方法にしたがって調製でき、そのような方法を累積する、例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ”、研究所マニュアル、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９年、又は“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、ジョン・ワイリー社、ニューヨーク等の参考文献に見出すことができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドの機能的に等価な例示的変異体としては、本願明細書に開示のタンパクのアミノ酸配列における、保存的アミノ酸置換が挙げられる。アミノ酸の保存的置換は、以下の官能基内でアミノ酸の間に行われる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００５６】
一般的に、変異体ポリペプチドを調製するときに、アミノ酸の全てよりも少数が変化することが好ましい。特定のアミノ酸残基が機能を与えることが知られている場合には、そのようなアミノ酸は置換されないか、あるいは、保存的アミノ酸置換によっては置き換えられない。好適には、変異体ポリペプチドを調製するときに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個等を変化させる。通常、最小数の置換が行われることが好ましい。このように、生成変異体ポリペプチド生成の一つの方法は、特定のアミノ酸に対して全ての他のアミノ酸を置き換え、次いで変異体の活性を検定し、次いで最良の活性を有する一以上のポリペプチドを用いて処理を繰り返すことである。
【００５７】
イソプレン合成酵素ポリペプチドと機能的に等価な変異体を生産するための、イソプレン合成酵素ポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、通常、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする核酸の変更によって行われる。このような置換は、当業者に公知の様々な方法によって行うことができる。例えば、アミノ酸置換は、キュンケルの方法（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８２巻、４８８−４９２ページ、１９８５年）にしたがって部位特異的突然変異により、又はイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成により、行うことができる。いくつかの実施形態において、置換は、直接的にペプチドを合成することによって行うことができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドの機能的に等価な断片の活動は、本願明細書に開示のように、変更したイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする遺伝子を適切な発現ベクターにクローニングすることと、該ベクターを適切な宿主細胞に導入することと、変更したイソプレン合成酵素ポリペプチドを発現することと、イソプレン合成酵素ポリペプチドの機能的な能力について試験することと、によって試験できる。化学合成されるペプチドは、例えば、イソプレン合成酵素機能等の機能について、直接的に試験することができる。
【００５８】
本発明の態様は、遺伝子改変光合成微生物由来のイソプレン生産を増加することを目的とする、最適化戦略を取り入れる。本願明細書で用いるイソプレン生産の増加とは、一以上の最適化戦略以前の遺伝子改変光合成微生物から生産されるイソプレンの量と比較して、より多量のイソプレンが、一以上の最適化戦略の後に遺伝子改変光合成微生物から生産されることを指す。
【００５９】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、イソプレン合成酵素の発現レベルを変更することにより、及びイソプレン合成酵素の発現に対する制御の実施を通じて、増加することになる。シアノバクテリアにおける動作が示されてきた数多くのプロモータ及びリボソーム結合部位の多く、例えば、（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて比較的強力な）ｔａｃＩＩプロモータ、（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて比較的弱い）ｌａｃプロモータ、関連するリボソーム結合部位とｌａｃオペレータ配列との組み合わせ（ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９８３；Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、１９８０）が試されことになる。共発現されるｌａｃリプレッサが存在しない場合、これらの二つのプロモータは、生産される生成物（イソプレン）の量及びバイオリアクタ中のパフォーマンスに関して、定量化及び比較が可能な二つの異なるレベルで、この酵素を恒常的に発現するはずである。恒常的プロモータの制御下において共発現可能なｌａｃＩｑリプレッサのコンストラクトへの追加は、非代謝性の誘導物質であるイソプロピルβ−Ｄ−チオ・ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を培地中で濃縮することにより、発現レベルの調節を可能とする。これにより、生産性及びバイオリアクタのパフォーマンスにおける効果に関して、イソプレン合成酵素の可能なレベル変化を調査できる。これにより、調節可能なイソプレン合成酵素の発現が所望のものであるか、不要であるかに関する決定も行うことになる。不要であれば、発現の最適レベルが決定されるときには、そのレベルと競合する「不変な」恒常的発現コンストラクトは、プロモータ配列、リボソーム結合部位シーケンス、リボソーム結合部位間の間隔及び開始コドン等を変化させることにより、実験的に生成できる。ｌａｃＩｑを含む実験は、ｌａｃリプレッサが折り畳まれ、活性のあった温度で行われなければならないことに注意されたい。野生型のｌａｃリプレッサは、５０℃まで安定であり、必要であれば、ｌａｃリプレッサの熱安定型突然変異体も使用できる（Ｂｅｌｌら、２００１；Ｇｅｒｋら、２０００）。
【００６０】
イソプレン合成酵素発現の最適化に対する組み換え可能遺伝子発現において、さらなるステップは、転写の終了である。ステムループ構造をコードする配列は、潜在的な転写ターミネータの性質を有し、アナベナ及びＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ由来のものを含む、いくつかのシアノバクテリア遺伝子の停止コドンに後続することも見出されている（Ｌｉ及びＴａｂｉｔａ、１９９４；Ｐｌａｎｓａｎｇｋａｔｅら、２００４）。
【００６１】
別の実施形態において、シアノバクテリアの発現の最適化は、シアノバクテリアの翻訳開始の最適化に関する。シアノバクテリアは、グラム陰性生物体であって、Ｅ．ｃｏｌｉ．と類似の開始部位を有する傾向がある。シアノバクテリアのｍＲＮＡは、プリンリッチなリボソーム結合部位を有することが見出され（シャイン・ダルガノ配列）、様々なヌクレオチドが基準開始コドンの上流にある。例えば、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ Ｒ２のフェレドキシン遺伝子に対しては、メチオニン開始コドンの７ヌクレオチド上流に、ＧＡＧＧＡが見出される（Ｒｅｉｔｈら、１９８６）。また、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのフラボドキシンのメッセージにおいて、ＧＧＡＡＧが、ＡＵＧ開始コドンの９ヌクレオチド上流に、ＧＡＧＧＡが見出される（Ｌａｕｄｅｎｂａｃｈら、１９８８）。他の例は、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のシアノバクテリア・ゲノム配列で見出すことができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアにおけるイソプレン生産は、イソプレン合成酵素のタンパク工学により増加する。イソプレン合成酵素の３次元ホモロジーモデルは、５−エピ−アリストロチェン合成酵素及びボルニル２リン酸合成酵素等の、相同的なテルペンシクラーゼの、実験的に決定された３次元構造との比較により、構築できる（Ｓｔａｒｋｓら、１９９７；Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎら、２００２）。同時に、Ｘ線結晶学又はＮＭＲ分光法により、基質又は基質類似物の結合のある場合とない場合の両方について、ポプライソプレン合成酵素の実際の３次元構造を実験的に決定する努力が、開始された。ポプライソプレン合成酵素は、至適活性温度が５０℃であり、すでに極めて熱安定的である（Ｍｏｎｓｏｎら、１９９２）。しかしながら、さらなる温度安定化が望ましい場合には、構造に準拠した突然変異誘発を用いることができ、例えば、αへリックス中グリシンをアラニンに置換することは、通常、突然変異あたり１ｋｃａｌを超える安定化自由エネルギーに寄与する。さらなる安定化が必要であれば、試験管内進化を含む、コンビナトリアルな突然変異の戦略が用いられることになる（Ｍａｒｔｉｎら、２００１；Ｍａｘら、２００７）。イソプレン合成酵素の特定の活性及び特異性を改良するために、基質結合を有する酵素の３次元モデル（又は、上述の実験的構造）が生成される。遷移状態の錯体に結合する酵素モデルも、有用である。これらのモデルに基づき、基質又は遷移状態との相互作用が予測される活性部位領域内の残基において、一連の部位特異的アミノ酸置換の突然変異が生成され、これらの変異体についてのｋｃａｔ及びＫｍ値が測定され、それぞれの野生型の値と比較される。これらの結果に基づき、さらなる単一部位突然変異、並びに最良の単一部位突然変異の全ての可能な組み合わせが生成され（Ｂａｎｔａら、２００２）、試験される。この選別から出現する改良された突然変異体は、バイオリアクタ培養下での組み換えシアノバクテリア宿主におけるイソプレン生産の強化について、試験される。これらの生体内試験は、宿主生物体に対して有害な改変酵素の特性変化も、全て明らかにする。
【００６３】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、律速であるイソプレニル２リン酸塩又はジメチルアリル２リン酸塩合成の上流にある酵素の過剰発現及び／又は内因性活性（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）の強化によって増加する。イソプレン合成酵素の基質であるＩＰＰ及びＤＭＡＰＰは、シアノバクテリアの２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸経路により生成されることが知られている（Ｏｋａｄａ及びＨａｓｅ、２００５）。この経路における酵素ステップの多くは、公知であり、その構成要素はクローニング及び過剰発現することができる（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１；Ｈｏｅｆｆｌｅｒら、２００２；Ｈｕｎｔｅｒら、２００３；Ｏｋａｄａ及びＨａｓｅ（２００５））。
【００６４】
原理的には、組み換え宿主生物体の当該経路を介する炭素フラックスは、速度を制約するステップを特定し、次いでこの特定のステップに含まれる酵素（及び、必要であれば補助因子）を、特定の活性（上述）の増強のために過剰発現すること又は改変することにより、増加させることが可能である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのイソプレン生産は、１−デオキシ・キシルロース５−リン酸合成酵素遺伝子を過剰発現させることによって強化されることが示され、これは、Ｓ．ｌｅｏｐｏｌｉｅｎｓｉｓのジメチルアリル２リン酸塩合成の「上流」である（Ｍｉｌｌｅｒら、２０００；Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。同様に、細胞のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を、一以上の活性酵素を過剰発現すること又は改変することのいずれかにより増加させることにより、細胞内のイソペンテニル２リン酸及びジメチルアリル２リン酸貯蔵の容易な平衡化及び釣り合いを促進することが可能であり（Ｂａｒｋｌｅｙら、２００４）、又はイソプレン合成酵素が触媒する反応の、イソプレンに伴う生成物である無機ピロリン酸塩を分解することにより、この過程を「引き上げる」目的で無機ピロホスファターゼを過剰発現することが可能である。
【００６５】
一つのボトルネックが取り除かれ、ある経路の代謝速度が増加するときには、その経路中に新たな律速ステップが現れるため、通常、これは反復的な方法である。イソプレン生産性シアノバクテリア生物体の新規な組み換えのそれぞれから生じる代謝炭素フラックスの変化は、１３ＣＯ２の存在中で細胞を培養し、２次元核磁気共鳴分光法による細胞内容物の分析を通じ、炭素含有代謝物レベルを定量的にモニタすることによって評価できる（Ｅｍｍｅｒｌｉｎｇら、２００２）。次いで、例えば、特異的活性を増加するための、構成要素の過剰発現及び／又はタンパク工学等、最初のボトルネックに対処するために用いたものと同様の手段により、新規なボトルネックからの解放を探求できる。続くいずれのボトルネックも、外在する要因（例えば、拡散支配される細胞内へのＣＯ２の質量移動、光の利用可能性）によって制約されたこの経路を介する炭素フラックスが最大化となるまで、同様の様式で攻略することが可能である。形質転換される宿主のシアノバクテリア生物体において、選択された遺伝子の過剰発現は、マルチコピープラスミド上での遺伝子クローニング、宿主の染色体への統合を介する遺伝子の追加的コピー又は複数コピーの挿入、上方制御を目的とした宿主の染色体の天然存在遺伝子に隣接するシス作用制御エレメント（例えば、プロモータ）の挿入、及び他の同様の戦略、という多くの手段によって達成できることに注意されたい。
【００６６】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、ランダムな突然変異誘発（トランスポゾン又はトランスポゾン様の挿入を用いて、又は標準的な変異原を用いて）及び生物体による生産の改良のためのスクリーニングによって増加する。イソプレンの生産は、内在的な宿主の要因によって宿主生物体の特定の代謝経路が抑制されることにより、いくつかの条件下で制限される場合もある。これらの場合、サプレッサとして作用している宿主の要因又は配列を「不活性化」又は下方制御することは、イソプレンへの経路を通じて炭素フラックスを増加させると考えられる。このようなサプレッサが公知である場合には、二重組み換えによる抗生物質耐性カセットの挿入を介した遺伝子破壊を用いて、ヌル変異体を生成することが直接的である（Ｉｗａｉら、２００４）。遺伝子活性の完全なノックアウトが、例えば致死性のために望ましくない場合には、抑制活性の「不活性化」は、遺伝子を下方制御することのできるシス作用制御エレメントを挿入することによって探求できる。しかしながら、多くの場合、生産性を抑制する宿主生物体の遺伝子の同一性は、直ちに明らかでないが、それでもなお、ランダムな突然変異誘発及びスクリーニングを介して、このような遺伝子の活性を変更することは可能である。このような活性、すなわち化学的な変異原による飽和突然変異誘発の後に、何万もの細菌コロニーのスクリーニングが望まれる場合がある活性に対する生命線は、規模縮小され、高度に並列化が可能な検定法である。ランダムな突然変異誘発を実行するための適切な変異原は、ニトロソグアニジン及び紫外線である。トランスポゾン挿入を介するランダムな突然変異誘発も、実行できる（Ｔｏｌｏｎｅｎら、２００６；Ｚｈａｎｇら、２００４）。突然変異誘発されたコロニーは、適切な培地を少量含む９６穴（又は４８若しくは２４穴）の深いウェルのマイクロタイタープレートに入れられ、プレートはガス透過膜で覆われ、細胞が飽和に達するまで、プレートは照明下で振とうしながらインキュベートされる。次いで、イソプレン合成酵素の誘導（必要に応じて）後に、プレートはガス不透膜でシールされ、インキュベーションが継続され、各ミクロ培養液から放出されるガス状イソプレンは、培養液上方の上部空間に蓄積することができる。次いで、ガスクロマトグラフィ／質量分析機器に適合するオートサンプラにより、各ミクロ培養液からのイソプレンを集め、定量化できる。再度のストリークによるクローン精製後のイソプレン生産の増加が表れる変異体クローンのミクロ培養は、振とうフラスコ及びバイオリアクタ（３−１０Ｌ）スケールでの改良イソプレン生産表現型の再現性を確認する。化学的な突然変異誘発の場合には、検証された高生産性の菌株は、完全なゲノムの塩基配列の再決定が行われ、この配列は、突然変異誘発部位を確認するために野生型ゲノムのものと比較される。突然変異誘発の複数の部位が単独の菌株に見られる場合には、これらは、突然変異した遺伝子を生体外で精製し、「ノックイン」法によって野生型の染色体に導入することにより、単独に特徴分析することができる（すなわち、野生型の遺伝子を対照として）。トランスポゾンによる突然変異誘発の場合には、ゲノムの突然変異部位は、「逆ＰＣＲ」を用いて塩基配列決定のための識別及び分離を行うことができる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、同一又は関連生物体由来のゲノム断片のショットガンクローニングに続いて、変異における過剰発現要因によって追加又は強化が可能な不明経路を識別することを目的とする、生産に対する改良生物体のスクリーニングによって増加する。イソプレン生産を刺激するよう変異において作用する律速因子は、同一の生物体（多くの遺伝子コピー数が望ましい場合）、又は関連性はあるが潜在的にはより有効な遺伝子が存在するかもしれない他の菌種（特に、シアノバクテリアの）等の他の生物体のいずれかから、ショットガンクローニングによって、イソプレン生産性生物体のゲノム配列に供給（及び識別）することができる。唯一の必要条件は、ゲノム配列が宿主生物体において発現できるという状況で供給されなければならないということであり、これは、内在性の制御配列（例えば、プロモータ）により、又は必要であればクローニングベクター上に供給される発現制御配列により、多くの場合で満足できる。イソプレン生産のためのクローンのスクリーニングは、上述と同一のランダムに突然変異させたクローンをスクリーニングするための、マイクロタイタープレートアッセイを用いて、同様の様式で実行される。振とうフラスコ及びバイオリアクタスケールでのイソプレン生産において増加が実証されたクローンは、挿入されたゲノム断片をＰＣＲにより増幅するための側方ベクター配列を用いた後に、ＤＮＡ塩基配列決定により、特徴分析される。
【００６８】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、単一の生物体に突然変異を組み込むことによって増加する。２以上の新しい突然変異、新規遺伝子の挿入。又は他の遺伝子組み換えが、再現性を有して生物体の生産性の強化を示すときには、これらの組み換えの全ての可能な組み合わせが試験される。それぞれの場合における実際の遺伝子組み換えは、ＤＮＡ塩基配列決定により特徴分析されたと仮定し、標準的な分子遺伝子操作を用いて、複数の独立した「上方」突然変異を単一のゲノムに改変することが可能である。次いで、このような二重の突然変異、三重の突然変異等が行われたそれぞれの生物体は、それぞれの独立した遺伝子組み換えの相加性、相乗効果、又は拮抗作用について、他のそれぞれとの関連において試験することができる。ビルディングブロックとしての相加性又は相乗効果が表れる遺伝子組み換えを用い、これらを組み合わせることにより、さらに生産性を強化したイソプレン生産性生物体を生成できる。
【００６９】
本発明の態様は、シアノバクテリアを培養することに関する。特徴分析された全てのシアノバクテリア種は、少なくとも研究所スケールでうまく培養されてきた。これらの多くは、ＢＧ−１１（ＡＴＣＣ培地６１６）等の「ラン藻（ｂｌｕｅ ｇｒｅｅｎ ａｌｇａｅ）」用標準培地上で成長する。多くの専用培地も開発されている。このように、シアノバクテリアは、次のような標準又は専用培地中で培養できるが、限定されない。Ａｉｂａ−Ｏｇａｗａ（ＡＯ）培地、硝酸塩添加Ａｌｌｅｎ−Ａｒｎｏｎ培地：ＡＴＣＣ培地１１４２、Ａｎｔｉａの（ＡＮＴ）培地、Ａｑｕｉｌ培地、Ａｓｈｂｅｙの窒素フリー寒天培地、ＡＳＮ−ＩＩＩ培地、ＡＳＰ２培地、ＡＳＷ培地：人工海水及び派生物、ＡＴＣＣ培地６１７：海洋性ラン藻用ＢＧ−１１；組み換えＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ＡＴＣＣ培地８１９：ラン藻用窒素固定培地；ＮＯ３非含有ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ＡＴＣＣ培地８５４：ビタミンＢ１２含有ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、ＡＴＣＣ培地１０４７：ビタミンＢ１２含有ＡＴＣＣ培地９５７［ＭＮ海洋性培地］、ＡＴＣＣ培地１０７７：窒素固定海洋性培地；ＮＯ３非含有ＡＴＣＣ培地９５７［ＭＮ海洋性培地］、ＡＴＣＣ培地１２３４：ＢＧ−１１ウラシル培地；ウラシル含有ＡＴＣＣ培地６１６［ＢＧ−１１培地］、Ｂｅｇｇｉａｔｏａ培地：ＡＴＣＣ培地１３８、Ｂｅｇｇｉａｔｏａ培地２：ＡＴＣＣ培地１１９３、ラン藻用ＢＧ−１１培地：ＡＴＣＣ培地６１６、ラン藻（ＢＧ）培地、ＢｏｌｄのＢａｓａｌ（ＢＢ）培地、ＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚＤ培地、修正ＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚＤ培地：好塩性シアノバクテリア、ＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚＤＧ培地、ＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚＤＧＮ培地、ＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚＮＤ培地、ＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓＢｒｏｔｈ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ培地：ＡＴＣＣ培地９２０、Ｃｈｕの＃１０培地：ＡＴＣＣ培地３４１、Ｃｈｕの修正＃１０培地、Ｃｈｕの修正＃１１培地、ＤＣＭ培地、ＤＹＩＶ培地、Ｅ２７培地、Ｅ３１培地及び派生物、ｆ／２培地、ｆ／２培地派生物、Ｆｒａｑｕｉｌ培地：淡水微量金属緩衝培地、ラン藻用Ｇｏｒｈａｍの培地：ＡＴＣＣ培地６２５、ｈ／２培地、Ｊａｗｏｒｓｋｉの（ＪＭ）培地、Ｋ培地、Ｌ１培地及び派生物（ＭＮ海洋性培地）：ＡＴＣＣ培地９５７、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｅｒｄｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（ＰＥ）培地、ＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓＰＣ培地、ＰｒｏｔｅｏｓｅＰｅｐｔｏｎｅ（ＰＰ）培地、Ｐｒｏｖ培地、Ｐｒｏｖ培地派生物、ビタミン添加Ｓ７７培地、ビタミン添加Ｓ８８培地、塩水栄養寒天（ＳＮＡ）培地及び派生物、ＳＥＳ培地、ＳＮ培地、修正ＳＮ培地、ＳＮＡＸ培地、土壌／水２相（Ｓ／Ｗ）培地及び派生物、スピルリナ用ＳＯＴ培地：ＡＴＣＣ培地１６７９、スピルリナ（ＳＰ）培地、ｖａｎ Ｒｉｊｎ及びＣｏｈｅｎ（ＲＣ）培地、Ｗａｌｓｂｙの培地、Ｙｏｐｐ培地、Ｚ８培地（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｃｙａｎｏｓｉｔｅ．ｂｉｏ．ｐｕｒｄｕｅ．ｅｄｕ／ｍｅｄｉａ／ｔａｂｌｅ／ｍｅｄｉａ．ｈｔｍｌ、（Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ、１９９８））。シアノバクテリアの培養は、標準方法にしたがって実行され、当業者に公知である（Ｒｏｇｅｒｓ及びＧａｌｌｏｎ、１９８８；Ｂｕｒｌｅｗ、１９６１；Ｒｏｕｎｄ、１９６５）。微生物は、遺伝子改変した光合成微生物であるため、これらの条件は十分な光を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、シアノバクテリアバイオリアクタで培養するプロトコルを改良することにより、増加する。所与の菌株及び所与の条件セットに対して再現性のあるイソプレン生産を行う、標準化プロトコルは、重要である。一般的に、新しい菌株ごとに記録保管用バイアルロットが生成され、番号付け及び日付記録が行われ、液体窒素中−８０℃で格納される。再現性について、その菌株での新規な実験培養は、それぞれ、新規なバイアルロットの解凍と、これを使用して培養液に蒔くこととによって開始される。標準的な培地及び条件（例えば、Ｂｕｒｌｅｗ、１９６１）は、培養液を最適化するための出発点として利用される。組み換え生物体成長の最適プロトコルを確立する目的で、生産相に先立ち、培養条件が調査される。所与のバイオリアクタ構成に対して独立して変化させて最適化されるいくつかの培養条件としては、以下が挙げられる。照明光の波長対強度スペクトル；ｐＨ；温度；微量金属；複合的な窒素源（例えば、イースト抽出物）を有する培地サプリメント；溶存ＣＯ２濃度（Ｆｒｉｃｋ及びＪｕｎｋｅｒ（１９９９）を参照、発酵ブロス溶存ＣＯ２に関する問題の説明がある）；溶存Ｏ２濃度；溶存Ｎ２濃度；インペラ設計及び振とう速度（注：エアリフト機構による振とうを含む）；消泡剤の存在；有機共溶媒の存在（Ｄａｕｇｕｌｉｓ、２００１）；栄養限定状態での最終的な光学濃度；その他。最適化は、時間の関数又は培養液の最適濃度の関数として、これらの変数のいずれか又は全てを変化させることも含むことができる。イソプレンの出力を最大にする目的で、生産相の間に付加的な最適化を実行する必要のある場合がある。これは、特に、イソプレン合成酵素のための誘導可能な発現系、及び／又はイソプレン合成酵素基質を合成する代謝経路の他の遺伝子の場合に正しく、最適な導入後（生産相）の細胞培養プロトコルは、最適な誘導前（成長相）プロトコルとは大きく異なる場合がある。同様に、新しい組み換え菌株の試験、又はバイオリアクタのスケール若しくはジオメトリが変わるときには、いつも、全てのプロトコルは、再び最適化を要する場合がある。
【００７１】
本発明の態様は、代謝改変された光合成微生物からイソプレンを集めることに関する。光合成生物体は、発酵槽で培養することができる。３４℃を超える細菌培養において、イソプレンは、ガス状である。したがって、イソプレンは、単純な濃縮により、発酵のオフガス中で集めることができる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、シアノバクテリアのイソプレン生産は、回収プロトコルの改良によって増加する。細菌培養によって生産される揮発性有機化合物は、ガス状の化合物を再び液化する冷却濃縮装置を用いて、培養のオフガスから回収することができる（Ｍｉｌｌｅｒら、２０００；Ｎｅｗｍａｎら、２００６）。オフガス中で蒸発した水も、この手順によりトラップされる。所望であれば、多少揮発的な構成要素の中に濃縮物を分別する目的で、一連の濃縮器又は冷却トラップは、温度を低下させるように設定することができる（Ｎｅｗｍａｎら、２００６）。このような濃縮器の設計、動作温度及び数は、実験的に確立することができる。しかしながら、分別なしでも、イソプレンは、比較的非混合性であり、低密度であり、二相の凝縮物の上相から比較的純粋なイソプレンを回収することが可能であるため、共に凝縮した水から容易に分離することができる。あるいは、バイオリアクタ自体において、ｎ−ドデカン等の非混合性の有機系共溶媒は、所望であれば非水相に、イソプレンをトラップするために添加することができ、ここから後に分離することができる（Ｄａｕｇｕｌｉｓ、２００１；Ｊａｎｉｋｏｗｓｋｉら、２００２；Ｎｅｗｍａｎら、２００６）。
【００７３】
本発明は、以下の実施例により示されるが、いかなるやり方においても制限する意図はない。
【実施例】
【００７４】
実施例１：イソプレン合成酵素（ｖ２．２）のための遺伝子合成
イソプレン合成酵素のためのｃＤＮＡクローンは、ポプラからクローニングした（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。Ｅ．ｃｏｌｉにおける当該外来遺伝子の発現、及び組み換え生物体からのイソプレンの生産も、説明が行われている（Ｍｉｌｌｅｒら、２００１）。イソプレン合成酵素が属する酵素クラスであるテルペンシクラーゼは、比較的よく研究されており（相同体５−エピ−アリストロチェン合成酵素（Ｓｔａｒｋｓら、１９９７）及びボルニル２リン酸合成酵素（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎら、２００２）の３次元構造決定を含む）、酵素の最適化を目的とする将来のタンパク工学実験の非常な助力となるはずである。
【００７５】
イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、ポプラの配列をガイドとして使用し、（ａ）シーケンスを組み換えすることを総合したＴ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓにおける発現のための至適コドンを提供し、（ｂ）ある制限部位を除去又は挿入し（例えば、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ制限酵素系により認識される部位（Ｉｗａｉら、２００４）又は分子生物学操作に必要な部位）、及び／又はイソプレン合成酵素タンパク自体の物理的性質（例えば、より高い熱安定性の提供）を有利に変更するためにアミノ酸配列を変異させる。
【００７６】
実施例２：イソプレン合成酵素を発現させるためのＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１の改変。
Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１は、イソプレン合成酵素の発現を評価するための、特に良好なシアノバクテリア菌株である。この微生物の光合成機構には大規模な特徴分析が行われ（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ及びＢｏｕｓｓａｃ、２００４）、そのゲノムの完全なＤＮＡ配列の決定及びアノテーションが行われてきた（中村ら、２００２）。さらに、エレクトロポレーションを介したプラスミドによる形質転換及び外来遺伝子の発現が示されてきた（Ｉｗａｉら、２００４）。このように、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ．を用いる代謝組み換えに対して、全ての基本ツールが存在する。最終的な効果として、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓは、イソプレンの沸点よりも２０℃上の、５５℃の至適成長温度を有し、生きている細胞からのイソプレン揮発の反応速度が極めて有利であり、反応を進行方向に「引く」ことを意味する。
【００７７】
合成イソプレン合成酵素遺伝子は、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓにおいて転写活性を有するプロモータの後方でベクターに挿入され、このようなベクターは、Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓのポジティブな形質転換体を選択することもできる（Ｉｗａｉら、２００４）。
【００７８】
実施例３：試験培養
微量金属を含有するが炭素源のない（ＣＯ２を除き）最少培地における組み換え菌株の試験培養を、次の三つの基準にしたがって実施し、二酸化炭素からのイソプレンの光合成生産を確立した。（ｉ）オフガスとしてのイソプレン検出量が、非組み換え対照細胞からのオフガス中に見出されるものよりも顕著に高いこと、（ｉｉ）イソプレン合成の光誘導性及び光依存性の実証、及び（ｉｉｉ）１３ＣＯ２が存在する組み換え生物体の培養によりイソプレンが同位体標識できることの実証。
【００７９】
実施例４：シアノバクテリアのイソプレン合成酵素（ｖ２．２．１）の合成と発現、及び培養液由来のイソプレンの検出
簡潔には、合成イソプレン合成酵素遺伝子は、ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ断片（図６）としてベクターｐＵＣ５７中にクローニングして構築した。特定の制限酵素部位を除去するための、及びレアコドン（Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１コドンの使用を基礎とする）をより一般的なもの、並びに他の塩基変化に置き換えるための、ポプラ酵素コード配列について選択した変更箇所を、下線で示す。開始（ＡＴＧ）及び停止（ＴＡＡ）コドンは、太字で示す。
【００８０】
組み換え酵素の検出及び／又は精製を容易にするため、開始コドン直後の酵素コード配列に対する５’位に、Ｈｉｓ６タグのコード配列を融合した。このタグにより、ＩｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）染色（インビトロゲン、インク社）を用いるＳＤＳゲル上での組み換え酵素のインサイツ検出、及び／又は固定化された金属アフィニティクロマトグラフィを用いる細胞抽出物からの組み換え酵素の精製が容易になる。開始コドンのすぐ上流は、ｔａｃＩＩプロモータが先行するリボソーム結合部位配列であり（ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９８３）、開始コドンとリボソーム結合部位との間の固有ＥｃｏＲＩサイトは、これらの上流の制御配列を含む断片が、必要に応じて、コード配列から分離できるようにする。このコード配列は、両端のさらなる「適合化」の有無にかかわらず、硝酸還元酵素をコードする遺伝子の発現を駆動するアナベナｐＮｉｒプロモータの制御下で配置された（Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ，Ｄ．ら、２００５）。
【００８１】
Ｄｅｓｐｌａｎｃｑらの文献は、ｈｅｔＲ遺伝子の転写を駆動するｐＮｉｒプロモータを有するｐ５０５の構造を含む。発明者らは、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを有するｈｅｔｒ遺伝子を取り除き、これを、増幅したイソプレン合成酵素遺伝子に置き換えた。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位を取り付けたイソプレン合成酵素遺伝子を増幅するために用いたプライマを、以下に示す。
【化２】
【００８２】
このプロモータは、窒素源としてのアンモニアで成長する細胞中ではオフ状態であるが、硝酸塩で成長する細胞中では強いオン状態である。遺伝子工学応用に対し、このプロモータは、短期のバッチ応用に有用であるが、成長の間に硝酸塩が消費されるため、一般的には適用できない。
【００８３】
このコンストラクトは、２５℃でのネオマイシン中の連続選択により、アナベナ７１２０においてプラスミドとして維持された。１０日後に、可視コロニーを採取し、ネオマイシンを有するが窒素との組み合わせのないＢＧ−１１又はＢＧ−１１のいずれかの液体培地に移した。１０日の成長の後、ＢＧ−１１０培養液に硝酸塩を加え、イソプレン合成酵素の転写を誘導した。イソプレン合成酵素の転写は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出した。数日後、細胞培養液の温度を３７℃に上昇させ、全ての生産されたイソプレンが気相に転換できるようにした。
【００８４】
微量元素を含有するが炭素源のない（ＣＯ２を除く）最少培地上で形質転換した菌株の試験発酵を実施し、二酸化炭素からのイソプレンの光合成生産を確立した。組み換えシアノバクテリアにおけるイソプレン合成酵素遺伝子の発現の成功例は、以下の結果によって示された。
（ａ）適切な制御菌株との比較により、形質転換した細胞は、ＰＣＲによってＩＳ ｍＲＮＡを転写する能力を有することを示した。
（ｂ）組み換え細胞培養物からのイソプレンの生合成生産は、細菌培養液により放出されるイソプレンを検出するために開発されたプロトコル使用いて、ガスクロマトグラフィ／質量分析により示された（Ｋｕｚｍａら、１９９５、下記参照）。アウトガス化したイソプレンの濃度は、非組み換え対照細胞からのアウトガス中に見られるものよりも高かった。列挙した条件下で計算されたイソプレン収量は、ＯＤ７００＝０．２３の培養液について、３０分あたり１リットルにつき２５マイクログラムだった。
【００８５】
イソプレン生成物は、オフガスを濃縮器に通し、次いで溶媒ジクロロエタンを用いて濃縮器から洗い出すことにより、回収した。（濃縮した）ＤＣＥ溶液は、定量目的でＧＣに注入した。
【００８６】
細菌細胞培養液により生産されるイソプレンの検定（Ｋｕｚｍａら、１９９５）。
【００８７】
ガスクロマトグラフィ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によるイソプレンの同定。バクテリアは、１０ｍｌのリッチな培地に接種し、Ａ６００がほぼ１．５となるまで成長させた。次いで、２ｍｌの培養液は、テフロンライニングした隔壁で密封した４．８ｍｌのガラスバイアル中で、約６時間インキュベートした。試料のヘッドスペース（１．２ｍｌ）は、ガラスビーズと共に液体アルゴン（−１８６℃）に浸漬して詰めたニッケルループ中で集めた。その後に、このループを１５０℃に加熱してＤＢ−１カラム（長さ３０ｍｍ、直径０．２５ｍｍ、膜厚１μｍ）（Ｊ＆Ｗサイエンティフィック社、米国カリフォルニア州のフォルサム）に注入し、ヒューレット・パッカード社質量選択検出器（電子イオンか、全イオンモード動作）又は同等の装置に接続した。各ＧＣ−ＭＳランに対する温度プログラムは、１分間−６５℃に維持した後に、毎分４℃の速度で加温することを含む。ヘリウムキャリアガス及び毎分約０．７ｍｌの流速を用いた。このシステムは、Ｃｉｃｅｒｏｎら（１９８８）の文献にさらに詳細に記載されている。細菌性イソプレン生産の陽性識別のため、細菌のヘッドスペースから得られたピーク保持時間及び質量スペクトルは、純正のイソプレン標準の保持時間及び質量スペクトルと比較した。「ベクターのみ」の組み換え対照培養液からのヘッドスペースは、ネガティブコントロールとして、ランに用いた。
【００８８】
ルーチン的イソプレン検定。細菌株は、Ａ６００が１．０から６．０となるまで成長させた。２ｍｌの培養液は、密封バイアル中で振とうを伴って適切な温度で約３時間インキュベートし、ヘッドスペースは、イソプレンに対して高感度なガスクロマトグラフィを用いて分析した（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９９３、Ｓｉｌｖｅｒ及びＦａｌｌ、１９９１を参照）。このシステムは、ｎ−オクタン／ポラシルＣカラム（ｐｏｒａｃｉｌ（登録商標））（オールテック・アソシエーション・インク社、米国イリノイ州のディアフィールド）と共に等温動作（８５℃）させ、ＲＧＤ２酸化第二水銀還元ガス検知器（トレース・アナリティカル社、米国カリフォルニア州のメンローパーク）又は同等品に連結させた。イソプレンは、３．６分で溶出した。イソプレン生産速度（ｎｍｏｌ／ｇ／時間）は、次のように算出できる。ＧＣ面積の単位を、標準のイソプレン濃度較正曲線に対するｎｍｏｌイソプレンに変換する。試料のＡ６００値を取り、既知のＡ６００を用いて細胞培養液に対するウェット重量を得ることにより、細胞グラム数（ｇ）に変換する。２〜５個の別個の測定を取り、検定箇所ごとに平均する。ネガティブコントロールは、上記の通りである。
【００８９】
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本願明細書において全ての引例の教示は、参照により本願明細書に援用する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に水と非混合性の炭化水素化合物を生産するように遺伝子改変された光合成微生物。
【請求項２】
前記光合成微生物は、イソプレンを生産するように遺伝子改変された、請求項１に記載の光合成微生物。
【請求項３】
前記遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素の存在下での培養時に、イソプレンを生産する、請求項２に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項４】
前記遺伝子改変光合成微生物は、大気の二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する、請求項２又は３に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項５】
前記遺伝子改変光合成微生物は、化石燃料プラント又は煙突（スクラバー）から発生する二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する、請求項２又は３に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項６】
前記遺伝子改変光合成微生物は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸代謝経路を介して生成される前駆体からイソプレンを生産する、請求項２又は３に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項７】
前記遺伝子改変光合成微生物は、シアノバクテリアである、請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項８】
前記遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ１である、請求項１から７のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項９】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ属である、請求項１から７のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１０】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ７１２０である、請求項９に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１１】
前記光合成微生物は、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子を含むよう遺伝子改変された、請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１２】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、植物イソプレン合成酵素遺伝子である、請求項１から１１のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１３】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）イソプレン合成酵素遺伝子である、請求項１から１２のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１４】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける発現のために最適化された、遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１５】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける酵素活性のために最適化された、請求項１から１４のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１６】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、前記遺伝子改変光合成微生物のゲノムに組み込まれている、請求項１から１５のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１７】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、プラスミド上に担持されている、請求項１から１６のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１８】
前記遺伝子改変光合成微生物は、容器で培養され、前記イソプレンは、前記遺伝子改変光合成微生物の前記培養液のオフガスから回収される、請求項１から１７のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１９】
前記遺伝子改変光合成微生物は、さらなる生合成に対する基質としてイソプレンを利用できる天然又は合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の挿入によってさらに組み換えられる、請求項１から１８のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２０】
イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含む、遺伝子改変光合成微生物であって、前記遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素からイソプレンを生成できる、微生物。
【請求項２１】
前記遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する、請求項１６に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２２】
前記遺伝子改変光合成微生物は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸代謝経路を介して生成される前駆体からイソプレンを生産する、請求項２０又は２１に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２３】
前記遺伝子改変光合成微生物は、シアノバクテリアである、請求項２０から２２のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２４】
前記遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ１である、請求項２０から２３のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２５】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ属である、請求項２０から２３のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２６】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ７１２０である、請求項２５に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２７】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、植物イソプレン合成酵素遺伝子である、請求項２０から２６のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２８】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、ポプライソプレン合成酵素遺伝子である、請求項２０から２７のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２９】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける発現のために最適化された、請求項２０から２８のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項３０】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける酵素活性のために最適化された、請求項２０から２９のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項３１】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、前記遺伝子改変光合成微生物のゲノムに組み込まれている、請求項２０から３０のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項３２】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、プラスミド上に担持されている、請求項２０から３１のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項３３】
前記遺伝子改変光合成微生物は、容器で培養され、前記イソプレンは、前記遺伝子改変光合成微生物の前記培養液のオフガスから回収される、請求項２０から３２のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項３４】
前記遺伝子改変光合成微生物は、さらなる生合成に対する基質としてイソプレンを利用できる、天然又は合成酵素に対する少なくとも一つの遺伝子コードの挿入によってさらに組み換えられる、請求項２０から３３のいずれかに記載の遺伝子改変された光合成微生物。
【請求項３５】
イソプレンの生産のための方法であって、前記方法は、イソプレンを生産するように遺伝子改変された遺伝子改変光合成微生物を培養することと、適宜、イソプレンを生産するように遺伝子改変された前記光合成微生物から生産されるイソプレンを回収することと、を含む方法。
【請求項３６】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸代謝経路を介して生成される前駆体からイソプレンを生産する、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、シアノバクテリアである、請求項３５から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ１である、請求項３５から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、アナベナ属である、請求項３５から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、アナベナ７１２０である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記光合成微生物は、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子の導入を通じてイソプレンを生産するよう遺伝子改変される、請求項３５から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、植物イソプレン合成酵素遺伝子である、請求項３５から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、ポプライソプレン合成酵素遺伝子である、請求項３５から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける発現のために最適化された、請求項３５から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける酵素活性のために最適化された、請求項３５から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、前記遺伝子改変された光合成微生物のゲノムに組み込まれる、請求項３５から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、プラスミド上に担持される、請求項３５から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、容器で培養され、前記イソプレンは、前記遺伝子改変された光合成微生物の前記培養液の前記オフガスから回収される、請求項３５から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、さらなる生合成に対する基質としてイソプレンを利用できる、一以上の天然又は組み換え微生物と共に容器で共培養される、請求項３５から４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含み、遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素からイソプレンを生産できる遺伝子改変光合成微生物を培養することと、適宜、イソプレンを生産するよう遺伝子改変された前記光合成微生物から生産されるイソプレンを回収することと、を含む、イソプレンの生産のための方法。
【請求項５２】
前記遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝子改変光合成微生物は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸代謝経路を介して生成される前駆体からイソプレンを生産する、請求項５１又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記遺伝子改変光合成微生物は、シアノバクテリアである、請求項５１から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１である、請求項５１から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ属である、請求項５１から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ７１２０である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、植物イソプレン合成酵素遺伝子である、請求項５１から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、ポプライソプレン合成酵素遺伝子である、請求項５１から５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける発現のために最適化された、請求項５１から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける酵素活性のために最適化された、請求項５１から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、前記遺伝子改変光合成微生物のゲノムに組み込まれる、請求項５１から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、プラスミド上に運ばれる、請求項５１から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記遺伝子改変光合成微生物は、容器で培養され、前記イソプレンは、前記遺伝子改変光合成微生物の培養液の前記オフガスから回収される、請求項５１から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記遺伝子改変光合成微生物は、さらなる生合成に対する基質としてイソプレンを利用できる、一以上の追加的な天然及び／又は組み換え微生物と共に、容器で共培養される、請求項５１から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
組み換えイソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２．１）の核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６７】
プロモータと作動可能に連結されている、請求項６６の前記単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項６８】
請求項６７の前記発現ベクターを用いてトランスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６９】
請求項６６の前記単離された核酸分子又はその変異体によってコードされる、単離されたタンパク。
【請求項１】
実質的に水と非混合性の炭化水素化合物を生産するように遺伝子改変された光合成微生物。
【請求項２】
前記光合成微生物は、イソプレンを生産するように遺伝子改変された、請求項１に記載の光合成微生物。
【請求項３】
前記遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素の存在下での培養時に、イソプレンを生産する、請求項２に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項４】
前記遺伝子改変光合成微生物は、大気の二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する、請求項２又は３に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項５】
前記遺伝子改変光合成微生物は、化石燃料プラント又は煙突（スクラバー）から発生する二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する、請求項２又は３に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項６】
前記遺伝子改変光合成微生物は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸代謝経路を介して生成される前駆体からイソプレンを生産する、請求項２又は３に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項７】
前記遺伝子改変光合成微生物は、シアノバクテリアである、請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項８】
前記遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ１である、請求項１から７のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項９】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ属である、請求項１から７のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１０】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ７１２０である、請求項９に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１１】
前記光合成微生物は、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子を含むよう遺伝子改変された、請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１２】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、植物イソプレン合成酵素遺伝子である、請求項１から１１のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１３】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）イソプレン合成酵素遺伝子である、請求項１から１２のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１４】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける発現のために最適化された、遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１５】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける酵素活性のために最適化された、請求項１から１４のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１６】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、前記遺伝子改変光合成微生物のゲノムに組み込まれている、請求項１から１５のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１７】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、プラスミド上に担持されている、請求項１から１６のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１８】
前記遺伝子改変光合成微生物は、容器で培養され、前記イソプレンは、前記遺伝子改変光合成微生物の前記培養液のオフガスから回収される、請求項１から１７のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項１９】
前記遺伝子改変光合成微生物は、さらなる生合成に対する基質としてイソプレンを利用できる天然又は合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の挿入によってさらに組み換えられる、請求項１から１８のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２０】
イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含む、遺伝子改変光合成微生物であって、前記遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素からイソプレンを生成できる、微生物。
【請求項２１】
前記遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する、請求項１６に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２２】
前記遺伝子改変光合成微生物は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸代謝経路を介して生成される前駆体からイソプレンを生産する、請求項２０又は２１に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２３】
前記遺伝子改変光合成微生物は、シアノバクテリアである、請求項２０から２２のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２４】
前記遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ１である、請求項２０から２３のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２５】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ属である、請求項２０から２３のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２６】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ７１２０である、請求項２５に記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２７】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、植物イソプレン合成酵素遺伝子である、請求項２０から２６のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２８】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、ポプライソプレン合成酵素遺伝子である、請求項２０から２７のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項２９】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける発現のために最適化された、請求項２０から２８のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項３０】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける酵素活性のために最適化された、請求項２０から２９のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項３１】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、前記遺伝子改変光合成微生物のゲノムに組み込まれている、請求項２０から３０のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項３２】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、プラスミド上に担持されている、請求項２０から３１のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項３３】
前記遺伝子改変光合成微生物は、容器で培養され、前記イソプレンは、前記遺伝子改変光合成微生物の前記培養液のオフガスから回収される、請求項２０から３２のいずれかに記載の遺伝子改変光合成微生物。
【請求項３４】
前記遺伝子改変光合成微生物は、さらなる生合成に対する基質としてイソプレンを利用できる、天然又は合成酵素に対する少なくとも一つの遺伝子コードの挿入によってさらに組み換えられる、請求項２０から３３のいずれかに記載の遺伝子改変された光合成微生物。
【請求項３５】
イソプレンの生産のための方法であって、前記方法は、イソプレンを生産するように遺伝子改変された遺伝子改変光合成微生物を培養することと、適宜、イソプレンを生産するように遺伝子改変された前記光合成微生物から生産されるイソプレンを回収することと、を含む方法。
【請求項３６】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸代謝経路を介して生成される前駆体からイソプレンを生産する、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、シアノバクテリアである、請求項３５から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ１である、請求項３５から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、アナベナ属である、請求項３５から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、アナベナ７１２０である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記光合成微生物は、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子の導入を通じてイソプレンを生産するよう遺伝子改変される、請求項３５から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、植物イソプレン合成酵素遺伝子である、請求項３５から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、ポプライソプレン合成酵素遺伝子である、請求項３５から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける発現のために最適化された、請求項３５から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける酵素活性のために最適化された、請求項３５から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、前記遺伝子改変された光合成微生物のゲノムに組み込まれる、請求項３５から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、プラスミド上に担持される、請求項３５から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、容器で培養され、前記イソプレンは、前記遺伝子改変された光合成微生物の前記培養液の前記オフガスから回収される、請求項３５から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記遺伝子改変された光合成微生物は、さらなる生合成に対する基質としてイソプレンを利用できる、一以上の天然又は組み換え微生物と共に容器で共培養される、請求項３５から４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
イソプレン合成酵素をコードする外来性遺伝子を含み、遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素からイソプレンを生産できる遺伝子改変光合成微生物を培養することと、適宜、イソプレンを生産するよう遺伝子改変された前記光合成微生物から生産されるイソプレンを回収することと、を含む、イソプレンの生産のための方法。
【請求項５２】
前記遺伝子改変光合成微生物は、二酸化炭素が存在する培養時に、イソプレンを生産する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝子改変光合成微生物は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸代謝経路を介して生成される前駆体からイソプレンを生産する、請求項５１又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記遺伝子改変光合成微生物は、シアノバクテリアである、請求項５１から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記遺伝子改変光合成微生物は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１である、請求項５１から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ属である、請求項５１から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子改変光合成微生物は、アナベナ７１２０である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、植物イソプレン合成酵素遺伝子である、請求項５１から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、ポプライソプレン合成酵素遺伝子である、請求項５１から５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける発現のために最適化された、請求項５１から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、シアノバクテリアにおける酵素活性のために最適化された、請求項５１から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、前記遺伝子改変光合成微生物のゲノムに組み込まれる、請求項５１から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
イソプレン合成酵素をコードする前記遺伝子は、プラスミド上に運ばれる、請求項５１から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記遺伝子改変光合成微生物は、容器で培養され、前記イソプレンは、前記遺伝子改変光合成微生物の培養液の前記オフガスから回収される、請求項５１から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記遺伝子改変光合成微生物は、さらなる生合成に対する基質としてイソプレンを利用できる、一以上の追加的な天然及び／又は組み換え微生物と共に、容器で共培養される、請求項５１から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
組み換えイソプレン合成酵素遺伝子（ｖ２．２．１）の核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６７】
プロモータと作動可能に連結されている、請求項６６の前記単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項６８】
請求項６７の前記発現ベクターを用いてトランスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６９】
請求項６６の前記単離された核酸分子又はその変異体によってコードされる、単離されたタンパク。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図７】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５２５８１６（Ｐ２０１０−５２５８１６Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０６３３３（Ｐ２０１０−５０６３３３）
【出願日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００５７０７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３７０９２
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３１０００７２９８）アシドフィル，エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００５７０７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３７０９２
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３１０００７２９８）アシドフィル，エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
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