低密度リポタンパクコレステロールの精度管理方法
【目的】ＬＤＬコレステロールの値が、どの試薬でも、同じ値がでる精度管理方法を提供する。
【構成】血清からＶＬＤＬを除去した血清に、基準分析法を用いてＬＤＬコレステロールの値を付し、それによって測定試薬を校正した後、検体を測定する。
【構成】血清からＶＬＤＬを除去した血清に、基準分析法を用いてＬＤＬコレステロールの値を付し、それによって測定試薬を校正した後、検体を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【００１】
本発明は、直接法による血清中低密度リポタンパクコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）測定の精度管理方法に関する。
【背景技術】
【００２】
血清中のＬＤＬ−Ｃは、メタボリックシンドロームの指標の一つとして、また動脈硬化、心臓血管病などの危険因子として、その測定は重要である。近年、ＬＤＬ−Ｃの測定法としては、直接法が開発され多くのメーカーからキットが市販されているが、その試薬間差、ロット間差が大きく、新しい精度管理方法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３】
直接法によるＬＤＬ−Ｃ測定において用いられている従来の校正用物質（キャリブレーター）、精度管理用物質（コントロール）は一般にＶＬＤＬの変性が生じており、それが、直接法によるＬＤＬの分画に影響を与えると考えられる。したがって従来の精度管理に関連する市販の試薬に付されているキャリブレーター、コントロールでは、そのＶＬＤＬの量や変性度合いによって、ＬＤＬ−Ｃの値が変動するため精度管理が難しいのではないかと想定された。このような状況においては、管理に用いる物質のＬＤＬ−Ｃが正しくないのであるから、値を求めようとする患者試料のＬＤＬ−Ｃが正しく測定されるわけがないことになる。そこで、精度管理に直接関係するキャリブレーター、コントロールに改良が求められている。
【発明が解決しようとする手段】
【００４】
本発明は、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を除去し、ＬＤＬ−Ｃの値を付した血清をキャリブレーター又はコントロールに用いて、測定試薬を用いた測定システムを管理（精度管理）することからなっている。
ＶＬＤＬの除去には、ＬＤＬが変性しやすいことから、超遠心分離法によることが最も好ましい。この方法によれば、カイロミクロンを含むＶＬＤＬを完璧に除去できる。しかし、完全性は必ずしも要求されないので、限外ろ過法、分取電気泳動法、ゲルクロマトグラフィーアフィニテイークロマトグラフィー、仏ノアフィニテイークロマトグラフィーなどを用いることができる。
【発明の実施態様】
【００５】
（１）血清１〜１００ｍｌを超遠心分離機の遠心管にとり、そこにＮａＣｌを主成分又はＮａＣｌとＫＢｒ（又はＮａＢｒ）を主成分とする密度液（密度１．００６〜１．０２ｇ．ｍｌ、好ましくは１．００６ｇ／ｍｌ）を重層し、約１０万Ｇにて、約２０時間超遠心する。中間の透明層をスライザーで切断するか、スピッツにて除去し、下層を取り出す。下層の血清について、市販の主要なＬＤＬ−Ｃ測定試薬（直接法）３〜４種にて、繰り返し測定を行い、得られたＬＤＬ−Ｃの平均値を表示値とする。もしくは最も好ましくは測定についてはＣＤＣ（米国疾病予防センター）の基準分析法（超遠心により、ＶＬＤＬとカイロミクロンを除いた後、総コレステロールを求め、次にヘパリン−マンガン沈殿法によりＨＤＬ−コレステロールを求める。両者からＬＤＬ−コレステロールを求める）により行い、それを表示値とする。かくして、値の付された血清を基にＬＤＬ−Ｃ測定試薬の校正もしくは補正を行い、次に未知の検体を測定し、その検体の精度管理されたＬＤＬ−Ｃ濃度を求める。
（２）血清２に対し、０．１５の割合で１０％ＳＤＳ液（０．１５Ｍ ＮａＣｌに溶解し、ＮａＯＨでｐＨ９．０としたもの）を加え３５℃で２時間放置後、１０，０００ｇで１０分間遠心する。上層の皮膜を除き、下層について、上記と同様にＬＤＬ−Ｃの値を付す。
ＶＬＤＬを除く方法として、０．０５μｍフィルターによるろ過、その他の方法を試みたが、上記超遠心法に優るものはなかった。フィルター除去はＶＬＤＬが不完全にしか除けなかった。ロスも大きかった。分取電気泳動法も不完全であった。大量に処理でき、他の混合物がほとんどなく、ＶＬＤＬの除去も完全である方法として、超遠心法が最も優れていた。又、密度液として、１．０１９〜１．０２ｇ／ｍｌを用いれば中間のリポタンパクのＩＤＬをも除去でき、さらに、精度管理は容易になる。
【実施例１】
血清５ｍｌを遠心管１０本にとり血清の上に、それぞれ１．００６ｍｇ／ｄｌ密度液（ＮａＣｌ １１．４ｇ、ＥＤＴＡ ０．１ｇ、 １ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液１ｍｌを水１ｌに溶かしたもの）、１ｍｌを重ねた。遠心管を超遠心分離機に入れ、１０℃、１０５，０００ｇにて１８時間超遠心を行った。遠心管を静かに取り出し、白濁層をスライサーを用いて切断して上部（ＶＬＤＬ及びカイロミクロンを含む）を捨てそれぞれ５ｍｌにメスアップした。このＬＤＬ−Ｃの値を、米国の基準分析法（ＣＤＣレファレンス法）で測定し、１１２．３ｍｇ／ｄＬを得た。これを小分けし、ＬＤＬ−Ｃ測定試薬として、Ｌ−タイプワコーＬＤＬ・Ｍ（和光純薬工業製）、デタミナＬＤＬ（協和メデックス製）、コレステストＬＤＬ（第一化学薬品）の３種類の測定試薬を校正した（値を１１２．３ｍｇ／ｄＬとなるように合わせた）。次に、別に患者の血清Ａ，Ｂ，Ｃについてこの校正した３種類の測定試薬で測定した。（ ）は、校正を行わない市販試薬自体による値を示した。
この表から、実際の検体Ａ，Ｂ，Ｃは３つの測定試薬とも非常によく一致している。しかし、（ ）で示した、本方法によらない値は、検体Ｂでは薬１０、検体Ｃでは約１４ｍｇ／ｄＬも開きがある。
【技術分野】
【００１】
本発明は、直接法による血清中低密度リポタンパクコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）測定の精度管理方法に関する。
【背景技術】
【００２】
血清中のＬＤＬ−Ｃは、メタボリックシンドロームの指標の一つとして、また動脈硬化、心臓血管病などの危険因子として、その測定は重要である。近年、ＬＤＬ−Ｃの測定法としては、直接法が開発され多くのメーカーからキットが市販されているが、その試薬間差、ロット間差が大きく、新しい精度管理方法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３】
直接法によるＬＤＬ−Ｃ測定において用いられている従来の校正用物質（キャリブレーター）、精度管理用物質（コントロール）は一般にＶＬＤＬの変性が生じており、それが、直接法によるＬＤＬの分画に影響を与えると考えられる。したがって従来の精度管理に関連する市販の試薬に付されているキャリブレーター、コントロールでは、そのＶＬＤＬの量や変性度合いによって、ＬＤＬ−Ｃの値が変動するため精度管理が難しいのではないかと想定された。このような状況においては、管理に用いる物質のＬＤＬ−Ｃが正しくないのであるから、値を求めようとする患者試料のＬＤＬ−Ｃが正しく測定されるわけがないことになる。そこで、精度管理に直接関係するキャリブレーター、コントロールに改良が求められている。
【発明が解決しようとする手段】
【００４】
本発明は、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を除去し、ＬＤＬ−Ｃの値を付した血清をキャリブレーター又はコントロールに用いて、測定試薬を用いた測定システムを管理（精度管理）することからなっている。
ＶＬＤＬの除去には、ＬＤＬが変性しやすいことから、超遠心分離法によることが最も好ましい。この方法によれば、カイロミクロンを含むＶＬＤＬを完璧に除去できる。しかし、完全性は必ずしも要求されないので、限外ろ過法、分取電気泳動法、ゲルクロマトグラフィーアフィニテイークロマトグラフィー、仏ノアフィニテイークロマトグラフィーなどを用いることができる。
【発明の実施態様】
【００５】
（１）血清１〜１００ｍｌを超遠心分離機の遠心管にとり、そこにＮａＣｌを主成分又はＮａＣｌとＫＢｒ（又はＮａＢｒ）を主成分とする密度液（密度１．００６〜１．０２ｇ．ｍｌ、好ましくは１．００６ｇ／ｍｌ）を重層し、約１０万Ｇにて、約２０時間超遠心する。中間の透明層をスライザーで切断するか、スピッツにて除去し、下層を取り出す。下層の血清について、市販の主要なＬＤＬ−Ｃ測定試薬（直接法）３〜４種にて、繰り返し測定を行い、得られたＬＤＬ−Ｃの平均値を表示値とする。もしくは最も好ましくは測定についてはＣＤＣ（米国疾病予防センター）の基準分析法（超遠心により、ＶＬＤＬとカイロミクロンを除いた後、総コレステロールを求め、次にヘパリン−マンガン沈殿法によりＨＤＬ−コレステロールを求める。両者からＬＤＬ−コレステロールを求める）により行い、それを表示値とする。かくして、値の付された血清を基にＬＤＬ−Ｃ測定試薬の校正もしくは補正を行い、次に未知の検体を測定し、その検体の精度管理されたＬＤＬ−Ｃ濃度を求める。
（２）血清２に対し、０．１５の割合で１０％ＳＤＳ液（０．１５Ｍ ＮａＣｌに溶解し、ＮａＯＨでｐＨ９．０としたもの）を加え３５℃で２時間放置後、１０，０００ｇで１０分間遠心する。上層の皮膜を除き、下層について、上記と同様にＬＤＬ−Ｃの値を付す。
ＶＬＤＬを除く方法として、０．０５μｍフィルターによるろ過、その他の方法を試みたが、上記超遠心法に優るものはなかった。フィルター除去はＶＬＤＬが不完全にしか除けなかった。ロスも大きかった。分取電気泳動法も不完全であった。大量に処理でき、他の混合物がほとんどなく、ＶＬＤＬの除去も完全である方法として、超遠心法が最も優れていた。又、密度液として、１．０１９〜１．０２ｇ／ｍｌを用いれば中間のリポタンパクのＩＤＬをも除去でき、さらに、精度管理は容易になる。
【実施例１】
血清５ｍｌを遠心管１０本にとり血清の上に、それぞれ１．００６ｍｇ／ｄｌ密度液（ＮａＣｌ １１．４ｇ、ＥＤＴＡ ０．１ｇ、 １ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液１ｍｌを水１ｌに溶かしたもの）、１ｍｌを重ねた。遠心管を超遠心分離機に入れ、１０℃、１０５，０００ｇにて１８時間超遠心を行った。遠心管を静かに取り出し、白濁層をスライサーを用いて切断して上部（ＶＬＤＬ及びカイロミクロンを含む）を捨てそれぞれ５ｍｌにメスアップした。このＬＤＬ−Ｃの値を、米国の基準分析法（ＣＤＣレファレンス法）で測定し、１１２．３ｍｇ／ｄＬを得た。これを小分けし、ＬＤＬ−Ｃ測定試薬として、Ｌ−タイプワコーＬＤＬ・Ｍ（和光純薬工業製）、デタミナＬＤＬ（協和メデックス製）、コレステストＬＤＬ（第一化学薬品）の３種類の測定試薬を校正した（値を１１２．３ｍｇ／ｄＬとなるように合わせた）。次に、別に患者の血清Ａ，Ｂ，Ｃについてこの校正した３種類の測定試薬で測定した。（ ）は、校正を行わない市販試薬自体による値を示した。
この表から、実際の検体Ａ，Ｂ，Ｃは３つの測定試薬とも非常によく一致している。しかし、（ ）で示した、本方法によらない値は、検体Ｂでは薬１０、検体Ｃでは約１４ｍｇ／ｄＬも開きがある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清から、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を除去した血清に低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の値を付し、この値を直接法ＬＤＬ−Ｃ測定試薬での測定値との差を求めて補正係数とするか、もしくはそれを当該測定試薬の校正物質に用い、次に、実際の試料（患者検体）を測定することを特徴とする、直接法ＬＤＬ−Ｃの精度管理方法。
【請求項２】
ＶＬＤＬの除去方法が超遠心分離法である請求項１記載のＬＤＬ−Ｃの精度管理方法。
【請求項３】
請求項１において、ＬＤＬ−Ｃの値を付す方法が、基準分析法であることを特徴とするＬＤＬ−Ｃの精度管理方法。
【請求項４】
請求項３において、基準分析法によりＬＤＬ−Ｃの値を付した、ＶＬＤＬを除去した血清。
【請求項１】
血清から、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を除去した血清に低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の値を付し、この値を直接法ＬＤＬ−Ｃ測定試薬での測定値との差を求めて補正係数とするか、もしくはそれを当該測定試薬の校正物質に用い、次に、実際の試料（患者検体）を測定することを特徴とする、直接法ＬＤＬ−Ｃの精度管理方法。
【請求項２】
ＶＬＤＬの除去方法が超遠心分離法である請求項１記載のＬＤＬ−Ｃの精度管理方法。
【請求項３】
請求項１において、ＬＤＬ−Ｃの値を付す方法が、基準分析法であることを特徴とするＬＤＬ−Ｃの精度管理方法。
【請求項４】
請求項３において、基準分析法によりＬＤＬ−Ｃの値を付した、ＶＬＤＬを除去した血清。
【公開番号】特開２００９−１１５７７３（Ｐ２００９−１１５７７３Ａ）
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１３９９２（Ｐ２００７−３１３９９２）
【出願日】平成１９年１１月６日（２００７．１１．６）
【出願人】（５０４３９０３６６）有限責任中間法人 検査医学標準物質機構 (5)
【出願人】（５９８０４９４３６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月６日（２００７．１１．６）
【出願人】（５０４３９０３６６）有限責任中間法人 検査医学標準物質機構 (5)
【出願人】（５９８０４９４３６）
【Ｆターム（参考）】
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