低密度リポプロテインからのコレステロールの室温での直接テストストリップ測定のための試薬組み合わせ、および方法
低密度リポプロテイン（ＬＤＬ−Ｃ）からのコレステロールは、ＬＤＬＣを選択的に測定可能にするためにＬＤＬと非−ＬＤＬの表面電荷密度を変化させるのに有益な試薬を使用したテストストリップにて、室温にて直接測定される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、一般的には、血漿、血清、または全血液サンプルのドライテストストリップを使用したインビトロ解析に関し、そしてより特定的には、サンプルに含まれる低密度リポプロテインからのコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の測定に関する。
【０００２】
血液中のコレステロースのレベルは、冠動脈性心疾患のリスクの重要な指標として認識されている。コレステロールは、血液中のリポプロテイン中に含まれて輸送される。“全コレステロール”は、低密度リポプロテイン由来のコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、中間型リポプロテイン由来のコレステロール（ＩＤＬ−Ｃ）、キロミクロン由来のコレステロール、超低比重リポプロテイン由来のコレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）、および高密度リポプロテイン由来のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）を含む。疫学及的及び臨床的研究により、ＬＤＬ−ＣのレベルとＬｐ（ａ）−Ｃの低い程度と冠動脈性心疾患との間の正の相関があることが立証されている。伝統的に、ＬＤＬ−Ｃは、“悪玉コレステロール”として認識されている。他方、臨床研究は、ＨＤＬ−Ｃ（“善玉コレステロール”）のレベルと冠動脈性心疾患との負の相関を確立している。また、血中のトータルコレステロールのレベル、つまりＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ及びキロミクロン−Ｃのトータル量の測定は、一般的には冠動脈性心疾患のリスクの適当な指標とは見なされていない。それは、トータルコレステロールの総合的なレベルは、それらの由来からのコレステロールの相対的な比率を表していないからである。心臓病のリスクをよりよく評価するために、サンプル中のトータルコレステロールに加えて、サンプル中のＬＤＬ−Ｃの量を測定するのが望ましい。
【０００３】
臨床ラボにおいてＬＤＬ−Ｃを測定する最も普遍的なアプローチは、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ式であり、それは総コレステロール、ＨＤＬ−Ｃおよびトリグリセリドの測定値からＬＤＬ−Ｃを推定する。Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ式は便利であるが、いくつかのよく知られた欠点がある（Ｎａｕｃｋらによる“Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation”Clin. Chem. 48.2(2002)）。例えば、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ式は、ＬＤＬ−Ｃ以外の測定を含むが、それは式中の他の脂質の測定からの潜在的な混合された不正確さの影響を受ける。さらに、その有用性は、４００ｍｇ／ｄＬ以下のレベルのトリグリセリドの生物的溶液に限定されることが知られており、そしてその正確性は２００ｍｇ／ｄＬ以上のレベルのトリグリセリドでは低下することが報告されている。
【０００４】
超遠心は、血清または血漿サンプルからの様々なリポプロテイン成分の分離と定量化のよく知られた技術である。しかし、超遠心は、退屈で、時間がかかり、そして高度に不安定なリポプロテインは、超遠心プロセスの一部である高塩濃度と遠心力により実質的に変性されうる。“さらに、多種の異なったタイプの装置やチューブを使用するので、それにより一つのラボと他のラボで再現性を得るのが難しく、そして一定した分離は技術者のスキルや注意深さに大いに依存する”ld.At238。
【０００５】
ＬＤＬ−Ｃを測定する他の技術は、電気泳動である。この技術もまた、いくつかの欠点がある。電気泳動ゲルアッセイは、自動化には向かず、そしてその正確性と再現性は少なくとも部分的に試験を行う者の技術に依存する。
【０００６】
非−ＬＤＬリポプロテインの沈殿、加熱および更なる工程を含む、他のいわゆるホモジニアス法は、近年利用可能となった。ＬＤＬ−Ｃを測定する一つのホモジニアス法がＵＳＰ５，８８８，８２７（Kayahara, Sugiuchi, et al.; Kyowa Medex Co. Japanに譲渡）に開示されている。その‘８２７特許には、体液サンプル中のＬＤＬ−Ｃ濃度を定量する２−ステージ液体フェーズ反応が開示されている。最初の工程では、ＬＤＬ−Ｃを含むサンプルは、糖化合物としてトリメチルβ−シクロデキストリン、タンパク可溶化剤としてポリオキシエチレンモノラウレート、ＥＭＳＥ（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’,サクシニルエチレンジアミン）およびトリスバッファーを含んだ第一試薬中に入れられる。その反応混合物を３７℃に加熱し、そして５分後に吸光度を測定する。コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびトリスバッファーを含む第二試薬を添加し、さらに５分経過後、再び同じ波長で吸光度を測定する。別にコレステロールの標準溶液を同じ手順で測定し、それぞれの吸光度の値を比較することによって、ＬＤＬ−Ｃが計算される。多くの適用では、加熱、複数の試薬および複数の読みのようなこの方法を行うにおいて必要な操作は、欠点であると考えられる。この方法は、ラボでの実施でさえ、複雑かつ長い時間を要するので、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）環境には適当ではないであろう。
【０００７】
他の２−ステージホモジニアスアッセイは、米国特許６，１９４，１６４（Matsui et al. Denke Seiken, Ltd. Japanに譲渡）に開示されている。第一ステージで、テストサンプル中のＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃおよびキロミクロン−Ｃが除去され、第二ステップでテストサンプル中に残存するコレステロール（すなわち、ＬＤＬ）が定量される。第一ステップで、ＬＤＬ−Ｃ以外のリポプロテイン（“非−ＬＤＬ”）に作用する界面活性剤の存在下で、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼがテストサンプルに作用する。それにより生成する過酸化水素は、カタラーゼの作用により、水と酸素に分解される。あるいは、フェノールベースまたはアニリンベースの水素供与体と過酸化水素を反応させて、それを色のない化合物に転換する。非−ＬＤＬに作用する好ましい界面活性剤には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル等が含まれる。‘１６４特許に開示されている第二反応では、テストサンプル中に残存するコレステロール（これは理論的にはＬＤＬ−Ｃのみを含有する）が定量される。第二ステップは、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤を添加すること、および第一ステップで添加されたコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼの作用によって、得られる過酸化水素を定量することによって実施することができる。
【０００８】
‘８２７特許に開示されている方法と同様に、‘１６４特許に開示される方法の一つの欠点は、その方法が３７℃への混合物の加熱が必要で、そして実験データは低温では試験の正確性に影響を与えることを示唆している。また、‘８２７特許に示されているように、‘１６４特許の方法は、異なる時期に複数の試薬を添加しなければならず、それは‘１６４特許の方法を同様にＰＯＣ試験またはオーバーザカウンター（“ＯＴＣ”）適用での使用には向かないものとする。
【０００９】
血清中のＬＤＬ−Ｃ測定のためのホモジニアスアッセイは、H. SugiuchiらによるClinical Chemistry 44:3 522-531(1998)に開示されている。この開示は、トリブロックコポリマーとα−シクロデキストリン硫酸（サルフェート）の組み合わせの使用と、ＬＤＬと非−ＬＤＬが液体アッセイ系中のその組み合わせと接触するときにＬＤＬ−Ｃの選択的酵素反応の間の相関を示している。Sugiuchiらの開示の好ましいポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、液体アッセイ反応条件下で限られた溶解性を示しており、その適用はドライストリップでは実行不可能である。
【００１０】
２００３年９月１６日に出願され、継続中でＵＳ特許出願番号１０／６６３，５５５がつけられた出願には、全血液中に存在するＬＤＬ−Ｃの量を総コレステロールと非−ＬＤＬ−Ｃの直接測定の結果から計算する、ワンステップ、室温、全血液、乾燥化学ＬＤＬ−Ｃアッセイが開示されている。その開示されているアッセイは、先行技術の多段ステップ、ウェット化学ＬＤＬコレステロールアッセイの問題の多くを克服するが、直接測定が好ましいという点は残される。このように、ＬＤＬ−Ｃを直接測定する、簡便で、使用しやすく、乾燥で、ワンステップで、室温診断試験が必要とされている。
発明の概要
ＬＤＬ−Ｃ測定の先行技術のこれらの問題および他の問題は、本発明によって解決される。本発明は、血漿、血清、または全血液サンプル中の低密度リポプロテインからのコレステロールの検出及び測定のための、直接、室温測定法である。その方法は、非−ＬＤＬ−Ｃの酵素転換が遅らせられるか、またはブロックされている間に、ＬＤＬ−Ｃの酵素転換は促進されるように、ＬＤＬと非−ＬＤＬの両方を含むサンプルを処理する工程を含む。そのサンプルは、ＬＤＬと非−ＬＤＬの異なった表面電荷密度の作用として、それらに異なって作用する試薬の組み合わせと接触させることにより処理される。リポプロテインによりもたらされる表面電荷密度の作用として、ＬＤＬによってもたらされるコレステロールの酵素転換を選択的に促進し、存在する他のタイプのリポプロテインコレステロールの転換をブロックするか遅らせるようにサンプル中の様々なリポプロテインと作用するいずれの試薬であっても使用することができる。
【００１１】
本発明は、部分的には、サンプル中のＬＤＬと非−ＬＤＬの異なった表面電荷密度を有利に使用することができるという発見に基づいている。キロミクロン、ＶＬＤＬおよびＩＤＬの生理的ｐＨでの、またはその付近で測定された、まばらなネガティブに荷電した表面特性は、それらをあるアニオン性ポリマーおよび特に硫酸体（sulfates）との結合を起こさせる。デキストラン硫酸、ポリアニオンで、分子量約５０００〜約５００００の範囲で、よい結果が得られたが、これまでの最良の結果は、それらのアニオン類がαシクロデキストリン硫酸または他のシクロデキストリン誘導体と共に使用したときに得られた。
【００１２】
ＨＤＬは、一般的には強くネガティブにチャージされており、そのような硫酸体の特定の組み合わせ、およびコポリマー性界面活性体と結合したときは、コレステロールを作ることから妨げられている、またはコレステロール産生酵素の活性から一時的に保護されていることが分かっている。単純なポリプロピレングリコールおよび／またはポリエチレングリコール分子がＨＤＬ−Ｃの酵素転換を阻害することも分かっているが、好ましいコポリマー性界面活性剤は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの混成物（hybrid）で、分子量が約２１００〜約６０００の範囲で、ポリオキシプロピレンを優位に含む物である。好ましくは、ポリオキシプロピレンは、コポリマー界面活性剤の８０〜９５％を構成する。
【００１３】
本発明の他の側面は、部分的には、ある低分子量界面活性剤が高分子量ブロックコポリマー界面活性剤の溶解性を高めるのに使用することができ、それはＬＤＬ−Ｃの直接測定のためのテストストリップアッセイに有益であるという発見に基づいている。本発明では、それらの好ましい化合物の低い溶解性を、３つの異なったレベルで部分的に作用する界面活性剤系の使用によって対処された。第一のレベルでは、本発明の界面活性剤は、サンプル中の非−ＬＤＬ−Ｃに対するＬＤＬ−Ｃの酵素転換の選択性を減ずることなく、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン混成物の溶解を手助けする。界面活性剤の第２のレベルは、部分的に、複数膜または複数層テストストリップ中に、トリブロックコポリマーと放出されたＬＤＬ−Ｃを試薬含有膜からコレステロール反応膜へ輸送する混合ミセルを調製する。界面活性剤の第３のレベルは、実際にはテストストリップのコレステロール反応膜に普通は直接近接しているか含浸されており、コレステロールがコレステロール反応膜の酵素系と反応するように、トリブロックコポリマーと他の界面活性剤を含む混合ミセルから放出されたコレステロールを可溶化するかまたは乳化するように作用する。
【００１４】
そのような試薬によるサンプル中の非−ＬＤＬの選択的な処置は、それらを非−ＬＤＬに選択的に結合するカチオン種の使用によって可能になる。本発明の一つの側面は、カチオン性種は２価の金属ブリッジである。２価金属ブリッジは、試薬と非−ＬＤＬの表面を連結することが観測されており、非−ＬＤＬは十分な密度のネガティブな表面電荷を有し、サンプル中のＬＤＬの表面電荷は相対的にわずかにポジティブである。マグネシウムでよい結果が得られているが、カルシウム、マンガン及びその他のような他の２価金属も使用することができるであろう。更に、リポプロテイン構造および／またはポリアニオンの表面のネガティブ電荷に静電的に結合することができるいずれの物質も、同様な酵素選択性を示すことができる。例として、トリエタノールアミン塩酸塩をブリッジングの成分としてのカチオン種として使用して、良い結果が得られた。
【００１５】
ＨＤＬからのコレステロールの産生をブロックする助けとなるコポリマー性界面活性剤と他のポリマー性アニオンは、ブロックされていないＬＤＬからのコレステロールの産生を起こすように、注意深く選択される。
【００１６】
血液サンプル中のＬＤＬから産生されたコレステロールの濃度の測定は、すでによく知られた方法と材料を使用して行うことができる。そのような方法と材料の典型的な例は、上述の２００２年９月１６日に出願され、米国特許出願番号１０／６６３，５５５が付与された継続中の出願で、仮出願６０／４１１，２０９が基となっている出願に述べられている、色の変化を生じる酵素反応でのトリンダー試薬の使用である。
【００１７】
他の側面では、本発明は、血清、血漿、全血液サンプル中の低密度リポプロテインからのコレステロールの直接測定における使用のための、垂直流テストストリップを含む。前記テストストリップは、サンプルに含まれる赤血球細胞の垂直流を止める、または遅らせるメカニズムを含む。いずれの有用なメカニズムを使用することができるが、これまでの最も良い結果は、不織のグラスファーバーを含む材料の層を使用した場合に得られた。グラスファイバーを含む層は、塗布部分周辺の領域に渡って血液が広がるのを容易にする拡散層で覆われていてもよい。反応膜表面への赤血球細胞の流れを止める、または少なくとも遅らせる目的は、テストの最後での化学検出での色の変化の検出への妨害を防ぐためである。
【００１８】
テストストリップはまた、血液サンプルの垂直流路に位置し、サンプル中で可溶でＬＤＬからのコレステロール生成を容易にしながら非−ＬＤＬからのコレステロール生成をブロックするか遅らせるように働く物質を含む、物質の供給部（supply）を含む。そのような物質の供給は、普通はその物質がサンプル中から赤血球細胞の分離に続いて溶液中にもたらされるように、血液サンプルの垂直流路中の１つ又はそれ以上の層に置かれる。しかし、物質の供給部はまた赤血球分離メカニズムの前に位置することもできる。
【００１９】
前記物質は、コレステロール生成からブロックされる非−ＬＤＬ成分の電気的特性にて働くように選択される。典型的には、前記物質は、ＬＤＬ中に普通に見られる減少されたアニオン性電気的表面特性のためにサンプル中のＬＤＬと保護成分との間のブリッジの形成を妨げながら、電気的にネガティブな成分間のブリッジを形成することができる上述の２価の金属イオン源を含む。
【００２０】
テストストリップは、また、血液サンプルの流路および塗布地点からは最も遠い位置に、生成したコレステロールの酵素転換に続いて検出可能な色の変化を生じるように選択された物資の供給部を含む。
【００２１】
体液中の分析物の濃度を化学的にテストするための乾燥フェーズテストストリップを提供することが、本発明の１つの一般的な目的である。より特定的な目的は、全血液または血漿中のＬＤＬ−Ｃの濃度を直接決定することができるドライテストストリップを提供することである。
【００２２】
本発明による１つの顕著な利益は、ＬＤＬ−Ｃ濃度が一段階のアッセイで直接決定することができることである。他の利益は、診断テストが室温で実施できることである。本発明の他の利益および目的は、以下の発明の詳細な説明を考慮して理解されるであろう。
好ましい態様の説明
本発明の思想の理解を助けるために、図面に示された態様、および以下の詳細な説明を参照してほしい。本発明の範囲はそれによって何ら制限される意図ではないことは理解されるべきである。本発明は、示された態様の変更および修正を含むこと、および本発明が関係する当業者が普通に考える本発明の思想のさらなる適用を含むことは、さらに理解されるべきである。
【００２３】
本発明の１つの有益な態様は、図１に示されている。層Ｍ−１、Ｍ−２、Ｍ−３、Ｍ−４およびＭ−５の構成部分は、サンプル塗布部１と読み部４の間に置かれ、サンプル塗布部１での血清、血漿または全血液の塗布後にサンプルが通る垂直の通路となる。
【００２４】
この態様では、サンプルはまず図１には示されていないが、Ｍ−１層の上に直に配置される任意の拡散層にぶつかる。拡散層が存在する場合の目的は、塗布部分よりも大きい部分１のエリア全体に相対的に均一にサンプルを広げることである。さらに、拡散層には、上述の試薬を染み込ませることができる。存在する場合の拡散層に染み込ませる目的は、塗布されたサンプルと試薬間のより長い接触時間を与えることである。
【００２５】
この態様では、血液分離層Ｍ−１は、少なくとも赤血球の流れをブロックする、または遅らせるメカニズムの一部である。特定の態様では、層Ｍ−１は、Ahlstroem Corporationから“タフグラス（TuffGlass）144”の商標にて販売されている不織のグラスファイバー層である。層Ｍ−１は、デキストラン硫酸、２価金属またはその均等物、シクロデキストリン分子、緩衝液、ソルビトールあるいはスクロースのような安定剤、および界面活性剤（制限的ではないがＬＤＬあるいは非−ＬＤＬ選択性を示すコポリマーあるいはトリブロックポリマー界面活性剤を含む）含むことができる。
【００２６】
層Ｍ−１と同様に、層Ｍ−２もまたテストストリップと付随する膜を通しての赤血球の動きを制限する、あるいは遅らせるように作用することができる。Ｍ−２は、典型的には非対称度の高い非対称（asymmetry）ポリスルホン膜である。本発明の好ましい態様では、前記膜はPall Life Sciencesから入手可能なBTS SP-300である。この層はまた、Ｍ−１で述べた成分のそれぞれを、Ｍ−１とは顕著に異なる濃度の試薬の添加にて含む。さらに、界面活性剤は、リポプロテイン構造から放出されたコレステロールの運動性を高めるために存在させることができる。特に、Ｍ−２は、デキストラン硫酸のようなポリアニオンのすべて又はその一部、非−ＬＤＬの適当なブロックのために必要は２価または他のカチオン種、シクロデキストリン分子のすべて又はその一部、界面活性剤、および特にＨＤＬ−Ｃをブロックし、そして／またはＬＤＬ−Ｃを利用可能にするために使用されるコポリマーまたはトリブロックポリマーのすべてまたはその一部を含むことができる。Ｍ−１層のように、Ｍ−２層もソルビトールやスクロースのような安定剤を含むことができる。
【００２７】
二価金属または他のカチオン種の供給は、好ましい場所はＭ−２又は追加的にＭ−４であるが、Ｍ−１、Ｍ−２または拡散メッシュのいずれかから始めることができる。二価金属は、例えばカルシウム、マグネシウム、またはマンガンである。最も好ましいカチオンは、低コスト、入手性、ハンドリングの容易性の理由から選択される、マグネシウムである。カチオンは、リポプロテインと結合可能な正電荷を帯びたアミンであってもよい。一つの好ましいアミンは、トリエタノールアミンのような三級アミンである。
【００２８】
図１に示した態様では、層Ｍ−２もまた血液分離層である。それは、サンプル受け側は孔径３００ミクロン、検出側は孔径約３ミクロンの非対称物質である。赤血球細胞の流れをブロックするか遅らせるのを手助けするのに加えて、それはまたサンプルと試薬の接触時間を増すために、縦の路にそっての全血液サンプルの流れをゆっくりとする。
【００２９】
Ｍ−２のように、Ｍ−３として図１に示されている成分は、リポプロテイン選択性を持たせるためにデザインされた試薬で処理されるのはまれであるが、サンプルが試薬膜と接触する時間を増加させるために縦の配置を通っての塗布サンプルの流速を遅らせる膜である。Ｍ−３の設計目的は、テストストリップを通してのサンプル物質の流れを減ずるために、親水性と孔径サイズをコントロールすることである。選択される膜は、Pall Life Sciencesから入手可能なSupor 1200という商品名の親水性ポリエーテルサルホンであるが、多くの異なった膜がこの目的において有効である。また、特に有効な構成要素Ｍ−３膜は、Osmonics Inc. から入手可能なPoretics 0.4 Micronのようなトラックエッチングポリカーボネート膜である。ほとんどの場合では、この膜は、膜表面にサンプルの拡散を容易にする界面活性剤または他の湿潤剤で処理されている以外は何ら処理されていない。
【００３０】
図１にＭ−４として示されている要素もまた、異なった割合ではあるが、場合によりＭ−２と同じ試薬を含むことができる試薬膜層である。Ｍ−２のように好ましい膜は、Pall Life Sciencesから入手可能なBTS SP-300のような非対称ポリサルホンである。本発明のいくつかの例では、Ｍ−４は、要素Ｍ−１、Ｍ−２、Ｍ−３と図１には示されていない任意の拡散メッシュの組成、試薬及び配置に少なくとも部分的に依存して任意である。
【００３１】
図１のＭ−５として示されている層は、コレステロール検出膜で、２００３年９月１６日に出願されＵＳ特許出願番号１０／６６３５５５が付与された継続中の出願に述べられている膜であってもよい。
実施例１
ドライストリップは、以下の膜と図１に示す配置に基づいて構成された：
層Ｍ−１；“部分Ａ”に記載されているように、染み込ませたタフグラス（Tuffglass）。
【００３２】
層Ｍ−２；“部分Ｂ”に記載されているように、染み込ませたBTS-300
層Ｍ−３；処置されていないSupor 1200
層Ｍ−４；部分Ｂ”に記載されているように、染み込ませたBTS-300
層Ｍ−５；２００３年９月１６日に出願されＵＳ特許出願番号１０／６６３５５５が付与された継続中の出願に述べられているビオダインＡ（Biodyne A）。
【００３３】
Ｍ−１のタフグラス（TuffGlass）は、“部分Ａ”溶液に浸され、そして３８度ファーレンハイト（°Ｆ）±２．５℃にて空気流にて乾燥した。
部分Ａ
実験室の脱イオン水３００ｍｌに、以下を添加した：ＭＥＳ緩衝液３．５０ｇ、ソルビトール９．０ｇ、スクロース９．０ｇ、ポリエチレングリコール２００ｍｗｔ７．０ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋmｗｔ１０．０３ｇ、塩化ナトリウム２．０１ｇ。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウムにて５．９０＋／−０．１に調整した。トータル５Ｎ水酸化ナトリウムを２．８０ｍｌ添加して、最終ｐＨは５．８５となった。
【００３４】
このストック溶液から、１６９．８９グラムを採取し、２５０ｍｌビーカーに入れた。このビーカーに２．０グラムデキストラン硫酸１０Ｋｍｗｔを溶解した。ｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウム７６０μリットルにて最終ｐＨ５．９５に調整した。タフグラス（TuffGlass）をこの溶液に浸し、そして過剰な溶液を膜から落とすために垂直に吊るした。その膜をクリップボードに置き、標準的な加熱条件下で乾燥トンネルにて水平にして乾燥した。
【００３５】
部分Ｂ
実験室の脱イオン水２００．１５ｇに、以下を順に添加した：ＭＥＳ緩衝液２．０ｇ、ソルビトール９．０６ｇ、塩化マグネシウム６水和物７．０４ｇ。ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．０２５ｍｌにて６．０３に調整した。溶液を５℃に冷却し、続いて以下を添加した：α−シクロデキストリン硫酸１．３８ｇ、Silwet l-77 ０．７３ｇ、プルロニック（Pluronic）L121 １．６６ｇ、プルロニックL43 ０．４５ｇ。すべてを添加する間、溶液を冷却した。膜を浸すのに使用されるパイレックスガラスディッシュを、試薬混合液に浸す前にフリーザーにて冷却した。“部分Ｂ”溶液約７０ｍｌを、冷却したガラス容器に添加した。膜を浸し、そして乾燥のために垂直に吊るした。過剰な試薬を膜から落とし、加熱や空気流を使用することなく乾燥した。
【００３６】
図２は、実施例１の構成のストリップを使用して得たデータで、１２の異なった血液サンプルにおける、それぞれのサンプルの６ストリップでの結果の平均による結果を示している。同じサンプルのコントロールの値は、ゲル電気泳動にてＬＤＬ−Ｃを測定した。それらのコントロール値と、本発明の方法とデバイスにより実施したアッセイの相関は、図２に示されるように良好であった。
【００３７】
実施例２
ドライストリップは、以下の膜と図１に示す配置に基づいて構成された：
層Ｍ−１；“部分Ｃ”に記載されているように、染み込ませたタフグラス（Tuff Glass）。
【００３８】
層Ｍ−２；存在しない。
層Ｍ−３；処置されていないSupor 1200
層Ｍ−４；“部分Ｄ”に記載されているように、染み込ませたBTS-SP300
層Ｍ−５；ビオダインＡ（Biodyne A）。
【００３９】
部分Ｃ
アモルファスファイバー、またはガラス、ポリマーもしくはランダム複合マトリックスのいずれかの複合材料を含むことができる深さフィルター（depth filter）に、以下の溶液を染み込ませた。染み込ませは、ドライストリップの上部試薬層を調製するために、浸漬、スプレーまたは凍結乾燥のような知られたいずれの方法によってもよい。
【００４０】
実験室の脱イオン水５０ｍｌに、以下を添加した：ＭＯＰＳ緩衝液１．２３ｇ、平均分子量１００００のデキストラン硫酸１．５ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．５ｇ、ソルビトール２．９９ｇ、スクロース３．０ｇ、および塩化マグネシウム０．６ｇをすべて脱イオン水５０ｍｌに添加した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム１ｍｌにて７．１７に調整した。
【００４１】
部分Ｄ
全血液から赤血球を分離して、血漿または血清のいずれかを検出層Ｍ−５へ生じさせるために、ならびにここで処理された膜または続いて試薬処理される膜または他の物質のいずれかの試薬再構成をコントロールするために部分的に利用されることができる膜に、以下の溶液を染み込ませた。
【００４２】
実験室の脱イオン水３００ｍｌに、以下の試薬を添加した：６．０１ｇのプルロニック L121、塩化マグネシウム４．３２ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液３．０ｇ、α−シクロデキストリン硫酸４．１３ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液０．６３ｇ、ソルビトール１．０８ｇ、スクロース１．１１ｇ、０．４７ｍｇSilwet L-77。溶液のｐＨは６．９５でそのままとした。溶液の曇点は２０℃であった。前記層を本溶液６０．０９ｇで処理した。
【００４３】
実施例３
ドライストリップは、以下の膜と図１に示す配置に基づいて構成された：
層Ｍ−１；“部分Ｅ”に記載されているように、染み込ませたタフグラス（TuffGlass）。
【００４４】
層Ｍ−２；“部分Ｆ”に記載されているように、染み込ませたBTS SP300。
層Ｍ−３；処置されていないSupor 1200
層Ｍ−４；存在しない。
【００４５】
層Ｍ−５；ビオダインＡ（Biodyne A）。
部分Ｅ
脱イオン水５０ｍｌに、以下を添加した：ＭＯＰＳ緩衝液１．２ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ２．５ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．５ｇ、ソルビトール２．０１ｇ、スクロース２．０ｇ、および塩化マグネシウム０．６ｇ。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム１ｍｌにて７．１６に調整した。
【００４６】
部分Ｆ
実験室の脱イオン水３００ｍｌに、以下の試薬を添加した：６．１９ｇのプルロニック L121、塩化マグネシウム３．２２ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液３．０ｇ、α−シクロデキストリン硫酸４．０ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液０．５５ｇ、ソルビトール１．１ｇ、スクロース１．１２ｇ、１．８８ｇSilwet L-77、１．０５ｇのプルロニック L121。調整していない溶液の最終ｐＨは７．０であった。前記層を本溶液６０．０９ｇで処理した。
【００４７】
実施例４
本実施例のドライストリップは、実施例３と同じ膜、すなわちタフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール反応膜（Ｍ−５）で構成された。
【００４８】
タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水１６８．３３ｇ中のＭＯＰＳ緩衝液４．３２ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ８．８７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．５ｇ、ソルビトール９．９ｇ、スクロース１１．２５ｇ、および塩化マグネシウム２．２８ｇ、ポリエチレングリコール７．４ｇにて処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム０．４ｍｌにて７．１１に調整した。
【００４９】
BTS SP300層（Ｍ−２）を以下の溶液３０．０２ｇで処理した：脱イオン水１００ｍｌ中の５．４２ｇのプルロニック L121、塩化マグネシウム７．０５ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液２．０ｇ、α−シクロデキストリン硫酸４．５９２ｇ、ソルビトール９．０１ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース０．７５ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１．３８ｇ、２．４７ｇSilwet L-77の溶液に、ＭＯＰＳ緩衝液０．３３ｇ、ソルビトール０．６５ｇ、スクロース０．６７ｇ、〜２９ｍｇSilwet L-77、０．０９ｇのテトロニック（Tetronic）１１０７を添加した溶液。溶液の最終ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム０．１ｍｌにて７．２７であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００５０】
実施例５
本実施例のドライストリップは、実施例３と同じ膜、すなわちタフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール反応膜（Ｍ−５）で構成された。
【００５１】
タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水７５．０ｇ中の０．３５ｇのプルロニック L121、０．０６ｇのテトロニック 304、ＭＥＳ緩衝液１．５６ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ３．１１ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．７６８７ｇ、ソルビトール２．５１ｇ、スクロース１．１７ｇ、および塩化マグネシウム１．１ｇ、０．１ｍｌSilwet L-77にて処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム０．４ｍｌにて６．１４に調整した。
【００５２】
BTS SP300層（Ｍ−２）を、脱イオン水７５ｍｌ中に１．８０ｇのプルロニックL121、デキストラン硫酸１０Ｋ０．９１ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．７４７７ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液０．８ｇ、ソルビトール２．０ｇ、スクロース０．６１ｇ、塩化マグネシウム０．９ｇ、０．２９ｇのテトロニック１１０７をすべて添加した溶液で処理した。溶液の最終ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム０．１５ｍｌにて７．１７であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００５３】
実施例６
ドライストリップは、以下の膜と図１に示す配置に基づいて構成された：
層Ｍ−１；“部分Ｇ”に記載されているように染み込ませ、続いて“部分Ｈ”に記載されているように染み込ませ、そして“部分Ｉ”に記載されているように処理されたタフグラス（TuffGlass）。
【００５４】
層Ｍ−２；“部分Ｊ”に記載されているように染み込ませ、続いて“部分Ｋ”に記載されているように染み込ませ、そして“部分Ｉ”に記載されているように処理されたBTS-SP300。
【００５５】
層Ｍ−３；処置されていないSupor 1200
層Ｍ−４；存在しない。
層Ｍ−５；ビオダインＡ（Biodyne A）。
【００５６】
部分Ｇ
脱イオン水１８７５．０ｇに、以下を添加した：８．９５ｇのプルロニックL121、１７．８５ｇのテトロニック３０４、ＭＥＳ緩衝液３９．１ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ７７．６４ｇ、α−シクロデキストリン硫酸１９．２ｇ、ソルビトール６２．５ｇ、スクロース２９．１１ｇ、および塩化マグネシウム２７．３５ｇ、２．５ｇSilwet L-77。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム０．４ｍｌにて６．１４に調整した。
【００５７】
部分Ｈ
部分Ｇで染み込ませた膜を処理するために、以下の溶液を使用した。脱イオン水１９９．６ｍｌ中に以下を添加した：デキストラン硫酸１０Ｋ８．１６ｇ、α−シクロデキストリン硫酸１．４１ｇ、塩化マグネシウム１．８５ｇ、ＭＥＳ緩衝液３．４５ｇ、ソルビトール３．１４ｇ。ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．４ｍｌにて６．２４に調整した。
【００５８】
部分Ｉ
２．０％ポリビニルアルコール溶液を、層Ｍ−１と層Ｍ−２の両方を続いて処理するために調製した。
【００５９】
部分Ｊ
脱イオン水７４９．８ｇに、以下の化学物質を添加した：１６．１ｇのプルロニック L121、デキストラン硫酸１０Ｋ９．０ｇ、α−シクロデキストリン硫酸５．０ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液７．９ｇ、ソルビトール１２．８ｇ、スクロース４．７ｇ、塩化マグネシウム７．０ｇ、３．４２ｇのテトロニック１１０７、２．２ｇSilwet L-77。溶液の最終ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム３．０ｍｌにて７．２２であった。
【００６０】
部分Ｋ
脱イオン水１００ｇに、以下の化学物質を添加した。：１．５ｇSilwet L-77、１．０５ｇのプルロニックL121。
【００６１】
実施例７
ドライテストストリップは、実施例３と同じ膜、すなわち：タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール反応膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水５９９．６３ｇ中の６４．６ｇのプルロニックL121、５．７９ｇのテトロニック304、ＭＥＳ緩衝液１２．５８ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ２４．９７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸６．１６ｇ、ソルビトール２０．０ｇ、スクロース９．３ｇ、および塩化マグネシウム８．７７ｇ、０．７９ｇSilwet L-77にて処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム５．５ｍｌにて６．２１に調整した。
【００６２】
本実施例のBTS SP300層（Ｍ−２）を、脱イオン水２０１．５ｇ中に３．６ｇのプルロニック L121、デキストラン硫酸１０Ｋ２．０２ｇ、α−シクロデキストリン硫酸１．５３ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液１．７８ｇ、ソルビトール１．２１ｇ、スクロース１．２９ｇ、塩化マグネシウム１．８１ｇ、０．６２ｇのテトロニック１１０７、エマルゲン（Emulgen）210P１．０３ｇ、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン１．５１ｇをすべて添加した溶液で処理した。それらの膜（Ｍ−１およびＭ−２）の両方を、乾燥トンネルに通した。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００６３】
実施例８
ドライテストストリップは、実施例３と同じ膜、すなわち：タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール反応膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水７５．０ｇ中の０．３５ｇのプルロニック L121、０．０６ｇのテトロニック304、ＭＥＳ緩衝液１．５６ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ３．１１ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．７６８７ｇ、ソルビトール２．５１ｇ、スクロース１．１７ｇ、および塩化マグネシウム１．１ｇ、０．１ｍｌSilwet L-77にて処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム０．４ｍｌにて６．１４に調整した。
【００６４】
BTS SP300層（Ｍ−２）を、脱イオン水７５ｇ中に１．８０ｇのプルロニックL121、デキストラン硫酸１０Ｋ０．９１ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．７４７７ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液０．８ｇ、ソルビトール２．０ｇ、スクロース０．６１ｇ、塩化マグネシウム０．９ｇ、０．２９ｇのテトロニック１１０７をすべて添加した溶液で処理した。溶液の最終ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム０．１５ｍｌにて７．１７であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００６５】
実施例９
本実施例のドライテストストリップは、非−グラスファイバー最上層（Ｍ−１）、すなわちAccuwick Ultra、BTS SP300層（Ｍ−２）、BTS SP300層（Ｍ−４）、およびコレステロール検出膜（Ｍ−５）で構成された。Accuwick Ultra層を、脱イオン水３７５ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：ＭＥＳ緩衝液７．８０ｇ、デキストラン硫酸１００００mwt１５．５７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．８５ｇ、Ｄ−ソルビトール１２．５ｇ、スクロース５．８２ｇ、塩化マグネシウム５．４７ｇ、１．７９ｇのプルロニックL121、３．５９ｇのテトロニック３０４、および０．５ｇSilwet L-77。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム２ｍｌにて６．１６に調整した。
【００６６】
最初のBTS SP300層（Ｍ−２）を、以下の溶液に浸漬し、そして過剰の液を振り落とし、染み込ませた：脱イオン水１８７．５ｇ中に以下の化学物質を溶解した；２．１８ｇのＰＶＡ30-70Kmwt、１．７５ｇのテトロニック３０４、ＭＥＳ緩衝液４．０２ｇ、７．７７ｇのDextralip15、α−シクロデキストリン硫酸１．９６ｇ、Ｄ−ソルビトール７．３１ｇ、スクロース１．４０ｇ、硫酸マグネシウム３．５２ｇ、２．５ｇのポリエチレングリコール6000mwt、５７ｍｇのAntifoam C。上記液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌにて６．２７に調整した。
【００６７】
2番目のBTS SP300層（Ｍ−４）を、2つの溶液中に溶解した以下の化学物質からなる溶液で処理した。最初の溶液は２０．３５ｇの４％ＰＶＡ ３０−７０Ｋmwt溶液と、５０．０１ｇの脱イオン水に溶解した以下の化学物質をからなる溶液：２．０４８ｇのＰＶＡ30-70Kmwt、２．３１ｇのプルロニックL121、デキストラン硫酸１００００mwt１．２０ｇ、塩化マグネシウム１．２ｇ、１．３１ｇのBis Tris 緩衝液、α−シクロデキストリン硫酸１．０４ｇ、Ｄ−ソルビトール３．７５ｇ、０．０２５６ｇSilwet L-77、および０．０３ｇのテトロニック ３０、０．４７ｇのＣＨＡＰＳ。上記液のｐＨは、３．２５Ｎ塩酸〜２．５ｍｌを添加した後は６．４８であった。
【００６８】
コントロール値と実施例９のテストストリップを使用した１６のアッセイの間の相関は、図３に示すように良かった。
実施例１０
本実施例のドライストリップは、タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール検出膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：ＭＥＳ緩衝液６．２７ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．４１ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０６ｇ、Ｄ−ソルビトール１０．０１ｇ、スクロース４．６５ｇ、硫酸マグネシウム４．３７ｇ、１．４３ｇのプルロニックL121、２．９０ｇのテトロニック３０４、および０．４ｇのSilwet L-77。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム１．８ｍｌにて６．１５に調整した。BTS SP300層を、脱イオン水２９６．５ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：７．２０ｇのプルロニックL121、デキストラン硫酸１０Ｋ３．６ｇ、硫酸マグネシウム３．５８ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液３．１５ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．２０ｇ、Ｄ−ソルビトール８．１３ｇ、スクロース２．３８ｇ、および１．２ｇのテトロニック３０４。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１ｍｌ添加後に７．１２であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００６９】
コントロール値と実施例１０のテストストリップを使用した１４のアッセイの間の相関は、図４に示すように良かった。
実施例１１
本実施例のドライストリップは、タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール検出膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：ＭＥＳ緩衝液６．６７ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．５７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０７ｇ、Ｄ−ソルビトール１０．０８ｇ、スクロース５．３３ｇ、硫酸マグネシウム４．４１ｇ、２．８６ｇのテトロニック３０４、および０．０７１０ｇのアジ化ナトリウム。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム２．２５ｍｌにて６．２２に調整した。膜をこの溶液に浸すことによりこの溶液で処理し、続いて２つのローラーの間を回転させ、そしてオープンファイバーマトリックス（open fiber matrix）上で空気乾燥させた。
【００７０】
BTS SP300（Ｍ−２）を、脱イオン水５００ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：１２ｇのプルロニック L121、デキストラン硫酸１０Ｋ５．９９ｇ、硫酸マグネシウム５．９９ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液５．１８ｇ、α−シクロデキストリン硫酸５．１９ｇ、Ｄ−ソルビトール４．０１ｇ、スクロース４．０１ｇ、および１．９ｇのテトロニック ３０４。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌ添加後に７．１９であった。最後に、BTS SP300を脱イオン水１００．１ｇ中にデキストラン硫酸１０Ｋ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびＤ−ソルビトール２．０ｇを溶解した液をスプレー処理した。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌ添加後に６．３１であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００７１】
コントロール値と実施例１１のテストストリップを使用した２１のアッセイの間の相関は、図５に示すように良かった。
実施例１２
本実施例のドライストリップは、タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール検出膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｍｌ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：ＭＥＳ緩衝液６．６７ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．５７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０７ｇ、ソルビトール１０．０８ｇ、スクロース５．３３ｇ、硫酸マグネシウム４．４１ｇ、２．８６ｇのテトロニック ３０４、および０．０７１０ｇのアジ化ナトリウム。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム２．２５ｍｌにて６．２２に調整した。
【００７２】
BTS SP300（Ｍ−２）を、脱イオン水５００ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：１２ｇのプルロニック L121、硫酸マグネシウム５．９９ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液５．１８ｇ、α−シクロデキストリン硫酸５．１９ｇ、ソルビトール４．０１ｇ、スクロース４．０１ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ５．９９ｇおよび１．９ｇのテトロニック ３０４。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌ添加後に７．１９であった。さらに、以下を含む溶液０．５０ｇを浸漬前にBTS SP300溶液に添加した：９．９９ｇのプルロニック L123、１０．０１ｇのプルロニック L101、５．０５ｇのプルロニックL103、９．９９ｇのプルロニックL61、１０．０２ｇのプルロニックL64および２．７５ｇのSilwet L-77。膜を乾燥後、脱イオン水１００ｇ中に以下の化学物質を溶解した液をスプレーした：デキストラン硫酸１０Ｋｍｗｔ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびＤ−ソルビトール２．０ｇ。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌ添加後に６．３１であった。最後に、BTS SP300を、デキストラン硫酸１０Ｋ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびソルビトール２．０ｇを含む液をスプレー処理した。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌ添加後に７．１９であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００７３】
コントロール値と実施例１２のテストストリップを使用した２１のアッセイの間の相関は、図６に示すように良かった。
実施例１３
本実施例のドライストリップは、タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｍｌ中に、ＭＥＳ緩衝液６．６７ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．５７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０７ｇ、ソルビトール１０．０８ｇ、スクロース５．３３ｇ、硫酸マグネシウム４．４１ｇ、２．８６ｇのテトロニック３０４、および０．０７１０ｇのアジ化ナトリウムをすべて溶解した液で処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム２．２５ｍｌにて６．２２に調整した。膜を乾燥後、脱イオン水１００ｇ中に、デキストラン硫酸１０Ｋ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびＤ−ソルビトール２．０ｇすべてを含んだ液をスプレー処理した。ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌで６．３１に調整した。
【００７４】
BTS SP300（Ｍ−２）を、脱イオン水７４９．５ｇ中に、１８．８ｇのプルロニック L121、硫酸マグネシウム２．９０ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液７．３７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸８．９６ｇ、ソルビトール７．３８ｇ、スクロース６．００ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１０．１１ｇ、７．１２ｇのテトロニック３０４、２．９０ｇのSilwet L-77、および０．１５ｇのアジ化ナトリウムを全て溶解した液で処理した。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム２．５ｍｌ添加後に７．１５であった。さらに、以下の溶液１．５０ｇを浸漬前に上述の液に添加した：９．９９ｇのプルロニックL123、１０．０１ｇのプルロニックL101、５．０５ｇのプルロニックL103、９．９９ｇのプルロニックL61、１０．０２ｇのプルロニックL64および２．７５ｇのSilwet L-77。膜を乾燥後、脱イオン水１００ｇ中に以下の化学物質を溶解した液をスプレーした：デキストラン硫酸１０Ｋｍｗｔ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびソルビトール２．０ｇ。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００７５】
コントロール値と実施例１３のテストストリップを使用した１５のアッセイの間の相関は、図７に示すように良かった。
実施例１４
本実施例のドライストリップは、タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｍｌ中に、ＭＥＳ緩衝液６．６ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．５７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０７ｇ、ソルビトール１０．０８ｇ、スクロース５．３３ｇ、硫酸マグネシウム４．４１ｇ、２．８６ｇのテトロニック ３０４、および０．０７１０ｇのアジ化ナトリウムをすべて溶解した液で処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム２．２５ｍｌにて６．２２に調整した。膜を乾燥後、脱イオン水１００ｇ中に、デキストラン硫酸１０Ｋ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびソルビトール２．０ｇを溶解した液でスプレー処理した。ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５０ｍｌで６．３１に調整した。タフグラス（TuffGlass）層に、次にＰＶＡ２％溶液をスプレーした。
【００７６】
BTS SP300（Ｍ−２）を、脱イオン水７４９．５ｇ中に、１８．８ｇのプルロニック L121、硫酸マグネシウム２．９０ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液７．３７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸８．９６ｇ、ソルビトール７．３８ｇ、スクロース６．００ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１０．１１ｇ、２．９０ｇのSilwet L-77、７．１２ｇのテトロニック ３０４、および０．１５ｇのアジ化ナトリウムを全て含む液で処理した。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム２．５ｍｌにて７．１５に調整した。乾燥してから、BTS SP300を、脱イオン水６００ｇ中に、デキストラン硫酸１０Ｋ２４．００ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．５７ｇ、硫酸マグネシウム３．５８ｇ、ＭＥＳ緩衝液１０．７８ｇ、およびＤ−ソルビトール１１．８２ｇを溶解した液でスプレー処理した。ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム２．０ｍｌにて６．２０に調整した。最後に、BTS SP300を、０．１５％Silwet L-77と１．０％ プルロニック L121にてスプレー処理した。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００７７】
コントロール値と実施例１４のテストストリップを使用した１４のアッセイの間の相関は、図８に示すように良かった。
実施例１５
本実施例のドライストリップは、非−グラスファイバー層Accuwick Ultra（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール膜（Ｍ−５）で構成された。Accuwick Ultra層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｇ中に以下の化学物質を溶解した者で処理した：ＭＥＳ緩衝液６．３０ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．４３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０８ｇ、ソルビトール１０．０４ｇ、スクロース４．６３ｇ、硫酸マグネシウム４．３７ｇ、２．８６ｇのテトロニック３０４、０．４ｇSilwet L-77、および以下を含む１．４７ｇの溶液：１．０３ｇのβ−シクロデキストリンポリマー、０．９９ｇのランダムにメチル化されたβ−シクロデキストリン。その層をさらに、以下を含む２．９８ｇの溶液で処理した：２．９９ｇエマルゲン（Emulgen）210P、９．００ｇのプルロニックL121、１．９８ｇのポリプロピレングリコール3,500mwt。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム１．７５ｍｌにて６．２２に調整した。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００７８】
BTS SP300を、脱イオン水３００ｇ中に以下の化学物質を溶解することにより得た溶液で処理した：５．４３ｇのプルロニック L121、硫酸マグネシウム２．７５ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液２．３９ｇ、α−シクロデキストリン硫酸２．３９ｇ、ソルビトール１．８０ｇ、スクロース１．８２ｇ、１．５０ｇエマルゲン（Emulgen）210P、０．４５ｇのテトロニック３０４、０．４７ｇのテトロニック １５０Ｒ１、０．４６ｇのテトロニック ９０１、２．３３ｇのヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウムを〜０．９ｍｌ添加後に７．２１であった。
【００７９】
コントロール値と実施例１５のテストストリップを使用した１４のアッセイの間の相関は、図９に示すように良かった。
本発明は、図面および上述の記載により詳細に示され、そして記載されているが、同時に例示であると考えるべきで、特徴を限定的に解釈すべきではない。好ましい態様のみが示されていて、本発明の精神の範囲内の全ての変化、修正、およびさらなる応用は保護されることが望ましいことは理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、本発明のテストストリップを示す。
【図２】図２は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１にて特定された本発明の１つの態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図３】図３は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例９にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図４】図４は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１０にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図５】図５は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１１にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図６】図６は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１２にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図７】図７は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１３にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図８】図８は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１４にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図９】図９は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１５にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、一般的には、血漿、血清、または全血液サンプルのドライテストストリップを使用したインビトロ解析に関し、そしてより特定的には、サンプルに含まれる低密度リポプロテインからのコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の測定に関する。
【０００２】
血液中のコレステロースのレベルは、冠動脈性心疾患のリスクの重要な指標として認識されている。コレステロールは、血液中のリポプロテイン中に含まれて輸送される。“全コレステロール”は、低密度リポプロテイン由来のコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、中間型リポプロテイン由来のコレステロール（ＩＤＬ−Ｃ）、キロミクロン由来のコレステロール、超低比重リポプロテイン由来のコレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）、および高密度リポプロテイン由来のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）を含む。疫学及的及び臨床的研究により、ＬＤＬ−ＣのレベルとＬｐ（ａ）−Ｃの低い程度と冠動脈性心疾患との間の正の相関があることが立証されている。伝統的に、ＬＤＬ−Ｃは、“悪玉コレステロール”として認識されている。他方、臨床研究は、ＨＤＬ−Ｃ（“善玉コレステロール”）のレベルと冠動脈性心疾患との負の相関を確立している。また、血中のトータルコレステロールのレベル、つまりＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ及びキロミクロン−Ｃのトータル量の測定は、一般的には冠動脈性心疾患のリスクの適当な指標とは見なされていない。それは、トータルコレステロールの総合的なレベルは、それらの由来からのコレステロールの相対的な比率を表していないからである。心臓病のリスクをよりよく評価するために、サンプル中のトータルコレステロールに加えて、サンプル中のＬＤＬ−Ｃの量を測定するのが望ましい。
【０００３】
臨床ラボにおいてＬＤＬ−Ｃを測定する最も普遍的なアプローチは、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ式であり、それは総コレステロール、ＨＤＬ−Ｃおよびトリグリセリドの測定値からＬＤＬ−Ｃを推定する。Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ式は便利であるが、いくつかのよく知られた欠点がある（Ｎａｕｃｋらによる“Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation”Clin. Chem. 48.2(2002)）。例えば、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ式は、ＬＤＬ−Ｃ以外の測定を含むが、それは式中の他の脂質の測定からの潜在的な混合された不正確さの影響を受ける。さらに、その有用性は、４００ｍｇ／ｄＬ以下のレベルのトリグリセリドの生物的溶液に限定されることが知られており、そしてその正確性は２００ｍｇ／ｄＬ以上のレベルのトリグリセリドでは低下することが報告されている。
【０００４】
超遠心は、血清または血漿サンプルからの様々なリポプロテイン成分の分離と定量化のよく知られた技術である。しかし、超遠心は、退屈で、時間がかかり、そして高度に不安定なリポプロテインは、超遠心プロセスの一部である高塩濃度と遠心力により実質的に変性されうる。“さらに、多種の異なったタイプの装置やチューブを使用するので、それにより一つのラボと他のラボで再現性を得るのが難しく、そして一定した分離は技術者のスキルや注意深さに大いに依存する”ld.At238。
【０００５】
ＬＤＬ−Ｃを測定する他の技術は、電気泳動である。この技術もまた、いくつかの欠点がある。電気泳動ゲルアッセイは、自動化には向かず、そしてその正確性と再現性は少なくとも部分的に試験を行う者の技術に依存する。
【０００６】
非−ＬＤＬリポプロテインの沈殿、加熱および更なる工程を含む、他のいわゆるホモジニアス法は、近年利用可能となった。ＬＤＬ−Ｃを測定する一つのホモジニアス法がＵＳＰ５，８８８，８２７（Kayahara, Sugiuchi, et al.; Kyowa Medex Co. Japanに譲渡）に開示されている。その‘８２７特許には、体液サンプル中のＬＤＬ−Ｃ濃度を定量する２−ステージ液体フェーズ反応が開示されている。最初の工程では、ＬＤＬ−Ｃを含むサンプルは、糖化合物としてトリメチルβ−シクロデキストリン、タンパク可溶化剤としてポリオキシエチレンモノラウレート、ＥＭＳＥ（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’,サクシニルエチレンジアミン）およびトリスバッファーを含んだ第一試薬中に入れられる。その反応混合物を３７℃に加熱し、そして５分後に吸光度を測定する。コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびトリスバッファーを含む第二試薬を添加し、さらに５分経過後、再び同じ波長で吸光度を測定する。別にコレステロールの標準溶液を同じ手順で測定し、それぞれの吸光度の値を比較することによって、ＬＤＬ−Ｃが計算される。多くの適用では、加熱、複数の試薬および複数の読みのようなこの方法を行うにおいて必要な操作は、欠点であると考えられる。この方法は、ラボでの実施でさえ、複雑かつ長い時間を要するので、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）環境には適当ではないであろう。
【０００７】
他の２−ステージホモジニアスアッセイは、米国特許６，１９４，１６４（Matsui et al. Denke Seiken, Ltd. Japanに譲渡）に開示されている。第一ステージで、テストサンプル中のＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃおよびキロミクロン−Ｃが除去され、第二ステップでテストサンプル中に残存するコレステロール（すなわち、ＬＤＬ）が定量される。第一ステップで、ＬＤＬ−Ｃ以外のリポプロテイン（“非−ＬＤＬ”）に作用する界面活性剤の存在下で、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼがテストサンプルに作用する。それにより生成する過酸化水素は、カタラーゼの作用により、水と酸素に分解される。あるいは、フェノールベースまたはアニリンベースの水素供与体と過酸化水素を反応させて、それを色のない化合物に転換する。非−ＬＤＬに作用する好ましい界面活性剤には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル等が含まれる。‘１６４特許に開示されている第二反応では、テストサンプル中に残存するコレステロール（これは理論的にはＬＤＬ−Ｃのみを含有する）が定量される。第二ステップは、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤を添加すること、および第一ステップで添加されたコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼの作用によって、得られる過酸化水素を定量することによって実施することができる。
【０００８】
‘８２７特許に開示されている方法と同様に、‘１６４特許に開示される方法の一つの欠点は、その方法が３７℃への混合物の加熱が必要で、そして実験データは低温では試験の正確性に影響を与えることを示唆している。また、‘８２７特許に示されているように、‘１６４特許の方法は、異なる時期に複数の試薬を添加しなければならず、それは‘１６４特許の方法を同様にＰＯＣ試験またはオーバーザカウンター（“ＯＴＣ”）適用での使用には向かないものとする。
【０００９】
血清中のＬＤＬ−Ｃ測定のためのホモジニアスアッセイは、H. SugiuchiらによるClinical Chemistry 44:3 522-531(1998)に開示されている。この開示は、トリブロックコポリマーとα−シクロデキストリン硫酸（サルフェート）の組み合わせの使用と、ＬＤＬと非−ＬＤＬが液体アッセイ系中のその組み合わせと接触するときにＬＤＬ−Ｃの選択的酵素反応の間の相関を示している。Sugiuchiらの開示の好ましいポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、液体アッセイ反応条件下で限られた溶解性を示しており、その適用はドライストリップでは実行不可能である。
【００１０】
２００３年９月１６日に出願され、継続中でＵＳ特許出願番号１０／６６３，５５５がつけられた出願には、全血液中に存在するＬＤＬ−Ｃの量を総コレステロールと非−ＬＤＬ−Ｃの直接測定の結果から計算する、ワンステップ、室温、全血液、乾燥化学ＬＤＬ−Ｃアッセイが開示されている。その開示されているアッセイは、先行技術の多段ステップ、ウェット化学ＬＤＬコレステロールアッセイの問題の多くを克服するが、直接測定が好ましいという点は残される。このように、ＬＤＬ−Ｃを直接測定する、簡便で、使用しやすく、乾燥で、ワンステップで、室温診断試験が必要とされている。
発明の概要
ＬＤＬ−Ｃ測定の先行技術のこれらの問題および他の問題は、本発明によって解決される。本発明は、血漿、血清、または全血液サンプル中の低密度リポプロテインからのコレステロールの検出及び測定のための、直接、室温測定法である。その方法は、非−ＬＤＬ−Ｃの酵素転換が遅らせられるか、またはブロックされている間に、ＬＤＬ−Ｃの酵素転換は促進されるように、ＬＤＬと非−ＬＤＬの両方を含むサンプルを処理する工程を含む。そのサンプルは、ＬＤＬと非−ＬＤＬの異なった表面電荷密度の作用として、それらに異なって作用する試薬の組み合わせと接触させることにより処理される。リポプロテインによりもたらされる表面電荷密度の作用として、ＬＤＬによってもたらされるコレステロールの酵素転換を選択的に促進し、存在する他のタイプのリポプロテインコレステロールの転換をブロックするか遅らせるようにサンプル中の様々なリポプロテインと作用するいずれの試薬であっても使用することができる。
【００１１】
本発明は、部分的には、サンプル中のＬＤＬと非−ＬＤＬの異なった表面電荷密度を有利に使用することができるという発見に基づいている。キロミクロン、ＶＬＤＬおよびＩＤＬの生理的ｐＨでの、またはその付近で測定された、まばらなネガティブに荷電した表面特性は、それらをあるアニオン性ポリマーおよび特に硫酸体（sulfates）との結合を起こさせる。デキストラン硫酸、ポリアニオンで、分子量約５０００〜約５００００の範囲で、よい結果が得られたが、これまでの最良の結果は、それらのアニオン類がαシクロデキストリン硫酸または他のシクロデキストリン誘導体と共に使用したときに得られた。
【００１２】
ＨＤＬは、一般的には強くネガティブにチャージされており、そのような硫酸体の特定の組み合わせ、およびコポリマー性界面活性体と結合したときは、コレステロールを作ることから妨げられている、またはコレステロール産生酵素の活性から一時的に保護されていることが分かっている。単純なポリプロピレングリコールおよび／またはポリエチレングリコール分子がＨＤＬ−Ｃの酵素転換を阻害することも分かっているが、好ましいコポリマー性界面活性剤は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの混成物（hybrid）で、分子量が約２１００〜約６０００の範囲で、ポリオキシプロピレンを優位に含む物である。好ましくは、ポリオキシプロピレンは、コポリマー界面活性剤の８０〜９５％を構成する。
【００１３】
本発明の他の側面は、部分的には、ある低分子量界面活性剤が高分子量ブロックコポリマー界面活性剤の溶解性を高めるのに使用することができ、それはＬＤＬ−Ｃの直接測定のためのテストストリップアッセイに有益であるという発見に基づいている。本発明では、それらの好ましい化合物の低い溶解性を、３つの異なったレベルで部分的に作用する界面活性剤系の使用によって対処された。第一のレベルでは、本発明の界面活性剤は、サンプル中の非−ＬＤＬ−Ｃに対するＬＤＬ−Ｃの酵素転換の選択性を減ずることなく、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン混成物の溶解を手助けする。界面活性剤の第２のレベルは、部分的に、複数膜または複数層テストストリップ中に、トリブロックコポリマーと放出されたＬＤＬ−Ｃを試薬含有膜からコレステロール反応膜へ輸送する混合ミセルを調製する。界面活性剤の第３のレベルは、実際にはテストストリップのコレステロール反応膜に普通は直接近接しているか含浸されており、コレステロールがコレステロール反応膜の酵素系と反応するように、トリブロックコポリマーと他の界面活性剤を含む混合ミセルから放出されたコレステロールを可溶化するかまたは乳化するように作用する。
【００１４】
そのような試薬によるサンプル中の非−ＬＤＬの選択的な処置は、それらを非−ＬＤＬに選択的に結合するカチオン種の使用によって可能になる。本発明の一つの側面は、カチオン性種は２価の金属ブリッジである。２価金属ブリッジは、試薬と非−ＬＤＬの表面を連結することが観測されており、非−ＬＤＬは十分な密度のネガティブな表面電荷を有し、サンプル中のＬＤＬの表面電荷は相対的にわずかにポジティブである。マグネシウムでよい結果が得られているが、カルシウム、マンガン及びその他のような他の２価金属も使用することができるであろう。更に、リポプロテイン構造および／またはポリアニオンの表面のネガティブ電荷に静電的に結合することができるいずれの物質も、同様な酵素選択性を示すことができる。例として、トリエタノールアミン塩酸塩をブリッジングの成分としてのカチオン種として使用して、良い結果が得られた。
【００１５】
ＨＤＬからのコレステロールの産生をブロックする助けとなるコポリマー性界面活性剤と他のポリマー性アニオンは、ブロックされていないＬＤＬからのコレステロールの産生を起こすように、注意深く選択される。
【００１６】
血液サンプル中のＬＤＬから産生されたコレステロールの濃度の測定は、すでによく知られた方法と材料を使用して行うことができる。そのような方法と材料の典型的な例は、上述の２００２年９月１６日に出願され、米国特許出願番号１０／６６３，５５５が付与された継続中の出願で、仮出願６０／４１１，２０９が基となっている出願に述べられている、色の変化を生じる酵素反応でのトリンダー試薬の使用である。
【００１７】
他の側面では、本発明は、血清、血漿、全血液サンプル中の低密度リポプロテインからのコレステロールの直接測定における使用のための、垂直流テストストリップを含む。前記テストストリップは、サンプルに含まれる赤血球細胞の垂直流を止める、または遅らせるメカニズムを含む。いずれの有用なメカニズムを使用することができるが、これまでの最も良い結果は、不織のグラスファーバーを含む材料の層を使用した場合に得られた。グラスファイバーを含む層は、塗布部分周辺の領域に渡って血液が広がるのを容易にする拡散層で覆われていてもよい。反応膜表面への赤血球細胞の流れを止める、または少なくとも遅らせる目的は、テストの最後での化学検出での色の変化の検出への妨害を防ぐためである。
【００１８】
テストストリップはまた、血液サンプルの垂直流路に位置し、サンプル中で可溶でＬＤＬからのコレステロール生成を容易にしながら非−ＬＤＬからのコレステロール生成をブロックするか遅らせるように働く物質を含む、物質の供給部（supply）を含む。そのような物質の供給は、普通はその物質がサンプル中から赤血球細胞の分離に続いて溶液中にもたらされるように、血液サンプルの垂直流路中の１つ又はそれ以上の層に置かれる。しかし、物質の供給部はまた赤血球分離メカニズムの前に位置することもできる。
【００１９】
前記物質は、コレステロール生成からブロックされる非−ＬＤＬ成分の電気的特性にて働くように選択される。典型的には、前記物質は、ＬＤＬ中に普通に見られる減少されたアニオン性電気的表面特性のためにサンプル中のＬＤＬと保護成分との間のブリッジの形成を妨げながら、電気的にネガティブな成分間のブリッジを形成することができる上述の２価の金属イオン源を含む。
【００２０】
テストストリップは、また、血液サンプルの流路および塗布地点からは最も遠い位置に、生成したコレステロールの酵素転換に続いて検出可能な色の変化を生じるように選択された物資の供給部を含む。
【００２１】
体液中の分析物の濃度を化学的にテストするための乾燥フェーズテストストリップを提供することが、本発明の１つの一般的な目的である。より特定的な目的は、全血液または血漿中のＬＤＬ−Ｃの濃度を直接決定することができるドライテストストリップを提供することである。
【００２２】
本発明による１つの顕著な利益は、ＬＤＬ−Ｃ濃度が一段階のアッセイで直接決定することができることである。他の利益は、診断テストが室温で実施できることである。本発明の他の利益および目的は、以下の発明の詳細な説明を考慮して理解されるであろう。
好ましい態様の説明
本発明の思想の理解を助けるために、図面に示された態様、および以下の詳細な説明を参照してほしい。本発明の範囲はそれによって何ら制限される意図ではないことは理解されるべきである。本発明は、示された態様の変更および修正を含むこと、および本発明が関係する当業者が普通に考える本発明の思想のさらなる適用を含むことは、さらに理解されるべきである。
【００２３】
本発明の１つの有益な態様は、図１に示されている。層Ｍ−１、Ｍ−２、Ｍ−３、Ｍ−４およびＭ−５の構成部分は、サンプル塗布部１と読み部４の間に置かれ、サンプル塗布部１での血清、血漿または全血液の塗布後にサンプルが通る垂直の通路となる。
【００２４】
この態様では、サンプルはまず図１には示されていないが、Ｍ−１層の上に直に配置される任意の拡散層にぶつかる。拡散層が存在する場合の目的は、塗布部分よりも大きい部分１のエリア全体に相対的に均一にサンプルを広げることである。さらに、拡散層には、上述の試薬を染み込ませることができる。存在する場合の拡散層に染み込ませる目的は、塗布されたサンプルと試薬間のより長い接触時間を与えることである。
【００２５】
この態様では、血液分離層Ｍ−１は、少なくとも赤血球の流れをブロックする、または遅らせるメカニズムの一部である。特定の態様では、層Ｍ−１は、Ahlstroem Corporationから“タフグラス（TuffGlass）144”の商標にて販売されている不織のグラスファイバー層である。層Ｍ−１は、デキストラン硫酸、２価金属またはその均等物、シクロデキストリン分子、緩衝液、ソルビトールあるいはスクロースのような安定剤、および界面活性剤（制限的ではないがＬＤＬあるいは非−ＬＤＬ選択性を示すコポリマーあるいはトリブロックポリマー界面活性剤を含む）含むことができる。
【００２６】
層Ｍ−１と同様に、層Ｍ−２もまたテストストリップと付随する膜を通しての赤血球の動きを制限する、あるいは遅らせるように作用することができる。Ｍ−２は、典型的には非対称度の高い非対称（asymmetry）ポリスルホン膜である。本発明の好ましい態様では、前記膜はPall Life Sciencesから入手可能なBTS SP-300である。この層はまた、Ｍ−１で述べた成分のそれぞれを、Ｍ−１とは顕著に異なる濃度の試薬の添加にて含む。さらに、界面活性剤は、リポプロテイン構造から放出されたコレステロールの運動性を高めるために存在させることができる。特に、Ｍ−２は、デキストラン硫酸のようなポリアニオンのすべて又はその一部、非−ＬＤＬの適当なブロックのために必要は２価または他のカチオン種、シクロデキストリン分子のすべて又はその一部、界面活性剤、および特にＨＤＬ−Ｃをブロックし、そして／またはＬＤＬ−Ｃを利用可能にするために使用されるコポリマーまたはトリブロックポリマーのすべてまたはその一部を含むことができる。Ｍ−１層のように、Ｍ−２層もソルビトールやスクロースのような安定剤を含むことができる。
【００２７】
二価金属または他のカチオン種の供給は、好ましい場所はＭ−２又は追加的にＭ−４であるが、Ｍ−１、Ｍ−２または拡散メッシュのいずれかから始めることができる。二価金属は、例えばカルシウム、マグネシウム、またはマンガンである。最も好ましいカチオンは、低コスト、入手性、ハンドリングの容易性の理由から選択される、マグネシウムである。カチオンは、リポプロテインと結合可能な正電荷を帯びたアミンであってもよい。一つの好ましいアミンは、トリエタノールアミンのような三級アミンである。
【００２８】
図１に示した態様では、層Ｍ−２もまた血液分離層である。それは、サンプル受け側は孔径３００ミクロン、検出側は孔径約３ミクロンの非対称物質である。赤血球細胞の流れをブロックするか遅らせるのを手助けするのに加えて、それはまたサンプルと試薬の接触時間を増すために、縦の路にそっての全血液サンプルの流れをゆっくりとする。
【００２９】
Ｍ−２のように、Ｍ−３として図１に示されている成分は、リポプロテイン選択性を持たせるためにデザインされた試薬で処理されるのはまれであるが、サンプルが試薬膜と接触する時間を増加させるために縦の配置を通っての塗布サンプルの流速を遅らせる膜である。Ｍ−３の設計目的は、テストストリップを通してのサンプル物質の流れを減ずるために、親水性と孔径サイズをコントロールすることである。選択される膜は、Pall Life Sciencesから入手可能なSupor 1200という商品名の親水性ポリエーテルサルホンであるが、多くの異なった膜がこの目的において有効である。また、特に有効な構成要素Ｍ−３膜は、Osmonics Inc. から入手可能なPoretics 0.4 Micronのようなトラックエッチングポリカーボネート膜である。ほとんどの場合では、この膜は、膜表面にサンプルの拡散を容易にする界面活性剤または他の湿潤剤で処理されている以外は何ら処理されていない。
【００３０】
図１にＭ−４として示されている要素もまた、異なった割合ではあるが、場合によりＭ−２と同じ試薬を含むことができる試薬膜層である。Ｍ−２のように好ましい膜は、Pall Life Sciencesから入手可能なBTS SP-300のような非対称ポリサルホンである。本発明のいくつかの例では、Ｍ−４は、要素Ｍ−１、Ｍ−２、Ｍ−３と図１には示されていない任意の拡散メッシュの組成、試薬及び配置に少なくとも部分的に依存して任意である。
【００３１】
図１のＭ−５として示されている層は、コレステロール検出膜で、２００３年９月１６日に出願されＵＳ特許出願番号１０／６６３５５５が付与された継続中の出願に述べられている膜であってもよい。
実施例１
ドライストリップは、以下の膜と図１に示す配置に基づいて構成された：
層Ｍ−１；“部分Ａ”に記載されているように、染み込ませたタフグラス（Tuffglass）。
【００３２】
層Ｍ−２；“部分Ｂ”に記載されているように、染み込ませたBTS-300
層Ｍ−３；処置されていないSupor 1200
層Ｍ−４；部分Ｂ”に記載されているように、染み込ませたBTS-300
層Ｍ−５；２００３年９月１６日に出願されＵＳ特許出願番号１０／６６３５５５が付与された継続中の出願に述べられているビオダインＡ（Biodyne A）。
【００３３】
Ｍ−１のタフグラス（TuffGlass）は、“部分Ａ”溶液に浸され、そして３８度ファーレンハイト（°Ｆ）±２．５℃にて空気流にて乾燥した。
部分Ａ
実験室の脱イオン水３００ｍｌに、以下を添加した：ＭＥＳ緩衝液３．５０ｇ、ソルビトール９．０ｇ、スクロース９．０ｇ、ポリエチレングリコール２００ｍｗｔ７．０ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋmｗｔ１０．０３ｇ、塩化ナトリウム２．０１ｇ。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウムにて５．９０＋／−０．１に調整した。トータル５Ｎ水酸化ナトリウムを２．８０ｍｌ添加して、最終ｐＨは５．８５となった。
【００３４】
このストック溶液から、１６９．８９グラムを採取し、２５０ｍｌビーカーに入れた。このビーカーに２．０グラムデキストラン硫酸１０Ｋｍｗｔを溶解した。ｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウム７６０μリットルにて最終ｐＨ５．９５に調整した。タフグラス（TuffGlass）をこの溶液に浸し、そして過剰な溶液を膜から落とすために垂直に吊るした。その膜をクリップボードに置き、標準的な加熱条件下で乾燥トンネルにて水平にして乾燥した。
【００３５】
部分Ｂ
実験室の脱イオン水２００．１５ｇに、以下を順に添加した：ＭＥＳ緩衝液２．０ｇ、ソルビトール９．０６ｇ、塩化マグネシウム６水和物７．０４ｇ。ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．０２５ｍｌにて６．０３に調整した。溶液を５℃に冷却し、続いて以下を添加した：α−シクロデキストリン硫酸１．３８ｇ、Silwet l-77 ０．７３ｇ、プルロニック（Pluronic）L121 １．６６ｇ、プルロニックL43 ０．４５ｇ。すべてを添加する間、溶液を冷却した。膜を浸すのに使用されるパイレックスガラスディッシュを、試薬混合液に浸す前にフリーザーにて冷却した。“部分Ｂ”溶液約７０ｍｌを、冷却したガラス容器に添加した。膜を浸し、そして乾燥のために垂直に吊るした。過剰な試薬を膜から落とし、加熱や空気流を使用することなく乾燥した。
【００３６】
図２は、実施例１の構成のストリップを使用して得たデータで、１２の異なった血液サンプルにおける、それぞれのサンプルの６ストリップでの結果の平均による結果を示している。同じサンプルのコントロールの値は、ゲル電気泳動にてＬＤＬ−Ｃを測定した。それらのコントロール値と、本発明の方法とデバイスにより実施したアッセイの相関は、図２に示されるように良好であった。
【００３７】
実施例２
ドライストリップは、以下の膜と図１に示す配置に基づいて構成された：
層Ｍ−１；“部分Ｃ”に記載されているように、染み込ませたタフグラス（Tuff Glass）。
【００３８】
層Ｍ−２；存在しない。
層Ｍ−３；処置されていないSupor 1200
層Ｍ−４；“部分Ｄ”に記載されているように、染み込ませたBTS-SP300
層Ｍ−５；ビオダインＡ（Biodyne A）。
【００３９】
部分Ｃ
アモルファスファイバー、またはガラス、ポリマーもしくはランダム複合マトリックスのいずれかの複合材料を含むことができる深さフィルター（depth filter）に、以下の溶液を染み込ませた。染み込ませは、ドライストリップの上部試薬層を調製するために、浸漬、スプレーまたは凍結乾燥のような知られたいずれの方法によってもよい。
【００４０】
実験室の脱イオン水５０ｍｌに、以下を添加した：ＭＯＰＳ緩衝液１．２３ｇ、平均分子量１００００のデキストラン硫酸１．５ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．５ｇ、ソルビトール２．９９ｇ、スクロース３．０ｇ、および塩化マグネシウム０．６ｇをすべて脱イオン水５０ｍｌに添加した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム１ｍｌにて７．１７に調整した。
【００４１】
部分Ｄ
全血液から赤血球を分離して、血漿または血清のいずれかを検出層Ｍ−５へ生じさせるために、ならびにここで処理された膜または続いて試薬処理される膜または他の物質のいずれかの試薬再構成をコントロールするために部分的に利用されることができる膜に、以下の溶液を染み込ませた。
【００４２】
実験室の脱イオン水３００ｍｌに、以下の試薬を添加した：６．０１ｇのプルロニック L121、塩化マグネシウム４．３２ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液３．０ｇ、α−シクロデキストリン硫酸４．１３ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液０．６３ｇ、ソルビトール１．０８ｇ、スクロース１．１１ｇ、０．４７ｍｇSilwet L-77。溶液のｐＨは６．９５でそのままとした。溶液の曇点は２０℃であった。前記層を本溶液６０．０９ｇで処理した。
【００４３】
実施例３
ドライストリップは、以下の膜と図１に示す配置に基づいて構成された：
層Ｍ−１；“部分Ｅ”に記載されているように、染み込ませたタフグラス（TuffGlass）。
【００４４】
層Ｍ−２；“部分Ｆ”に記載されているように、染み込ませたBTS SP300。
層Ｍ−３；処置されていないSupor 1200
層Ｍ−４；存在しない。
【００４５】
層Ｍ−５；ビオダインＡ（Biodyne A）。
部分Ｅ
脱イオン水５０ｍｌに、以下を添加した：ＭＯＰＳ緩衝液１．２ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ２．５ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．５ｇ、ソルビトール２．０１ｇ、スクロース２．０ｇ、および塩化マグネシウム０．６ｇ。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム１ｍｌにて７．１６に調整した。
【００４６】
部分Ｆ
実験室の脱イオン水３００ｍｌに、以下の試薬を添加した：６．１９ｇのプルロニック L121、塩化マグネシウム３．２２ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液３．０ｇ、α−シクロデキストリン硫酸４．０ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液０．５５ｇ、ソルビトール１．１ｇ、スクロース１．１２ｇ、１．８８ｇSilwet L-77、１．０５ｇのプルロニック L121。調整していない溶液の最終ｐＨは７．０であった。前記層を本溶液６０．０９ｇで処理した。
【００４７】
実施例４
本実施例のドライストリップは、実施例３と同じ膜、すなわちタフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール反応膜（Ｍ−５）で構成された。
【００４８】
タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水１６８．３３ｇ中のＭＯＰＳ緩衝液４．３２ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ８．８７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．５ｇ、ソルビトール９．９ｇ、スクロース１１．２５ｇ、および塩化マグネシウム２．２８ｇ、ポリエチレングリコール７．４ｇにて処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム０．４ｍｌにて７．１１に調整した。
【００４９】
BTS SP300層（Ｍ−２）を以下の溶液３０．０２ｇで処理した：脱イオン水１００ｍｌ中の５．４２ｇのプルロニック L121、塩化マグネシウム７．０５ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液２．０ｇ、α−シクロデキストリン硫酸４．５９２ｇ、ソルビトール９．０１ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース０．７５ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１．３８ｇ、２．４７ｇSilwet L-77の溶液に、ＭＯＰＳ緩衝液０．３３ｇ、ソルビトール０．６５ｇ、スクロース０．６７ｇ、〜２９ｍｇSilwet L-77、０．０９ｇのテトロニック（Tetronic）１１０７を添加した溶液。溶液の最終ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム０．１ｍｌにて７．２７であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００５０】
実施例５
本実施例のドライストリップは、実施例３と同じ膜、すなわちタフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール反応膜（Ｍ−５）で構成された。
【００５１】
タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水７５．０ｇ中の０．３５ｇのプルロニック L121、０．０６ｇのテトロニック 304、ＭＥＳ緩衝液１．５６ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ３．１１ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．７６８７ｇ、ソルビトール２．５１ｇ、スクロース１．１７ｇ、および塩化マグネシウム１．１ｇ、０．１ｍｌSilwet L-77にて処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム０．４ｍｌにて６．１４に調整した。
【００５２】
BTS SP300層（Ｍ−２）を、脱イオン水７５ｍｌ中に１．８０ｇのプルロニックL121、デキストラン硫酸１０Ｋ０．９１ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．７４７７ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液０．８ｇ、ソルビトール２．０ｇ、スクロース０．６１ｇ、塩化マグネシウム０．９ｇ、０．２９ｇのテトロニック１１０７をすべて添加した溶液で処理した。溶液の最終ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム０．１５ｍｌにて７．１７であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００５３】
実施例６
ドライストリップは、以下の膜と図１に示す配置に基づいて構成された：
層Ｍ−１；“部分Ｇ”に記載されているように染み込ませ、続いて“部分Ｈ”に記載されているように染み込ませ、そして“部分Ｉ”に記載されているように処理されたタフグラス（TuffGlass）。
【００５４】
層Ｍ−２；“部分Ｊ”に記載されているように染み込ませ、続いて“部分Ｋ”に記載されているように染み込ませ、そして“部分Ｉ”に記載されているように処理されたBTS-SP300。
【００５５】
層Ｍ−３；処置されていないSupor 1200
層Ｍ−４；存在しない。
層Ｍ−５；ビオダインＡ（Biodyne A）。
【００５６】
部分Ｇ
脱イオン水１８７５．０ｇに、以下を添加した：８．９５ｇのプルロニックL121、１７．８５ｇのテトロニック３０４、ＭＥＳ緩衝液３９．１ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ７７．６４ｇ、α−シクロデキストリン硫酸１９．２ｇ、ソルビトール６２．５ｇ、スクロース２９．１１ｇ、および塩化マグネシウム２７．３５ｇ、２．５ｇSilwet L-77。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム０．４ｍｌにて６．１４に調整した。
【００５７】
部分Ｈ
部分Ｇで染み込ませた膜を処理するために、以下の溶液を使用した。脱イオン水１９９．６ｍｌ中に以下を添加した：デキストラン硫酸１０Ｋ８．１６ｇ、α−シクロデキストリン硫酸１．４１ｇ、塩化マグネシウム１．８５ｇ、ＭＥＳ緩衝液３．４５ｇ、ソルビトール３．１４ｇ。ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．４ｍｌにて６．２４に調整した。
【００５８】
部分Ｉ
２．０％ポリビニルアルコール溶液を、層Ｍ−１と層Ｍ−２の両方を続いて処理するために調製した。
【００５９】
部分Ｊ
脱イオン水７４９．８ｇに、以下の化学物質を添加した：１６．１ｇのプルロニック L121、デキストラン硫酸１０Ｋ９．０ｇ、α−シクロデキストリン硫酸５．０ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液７．９ｇ、ソルビトール１２．８ｇ、スクロース４．７ｇ、塩化マグネシウム７．０ｇ、３．４２ｇのテトロニック１１０７、２．２ｇSilwet L-77。溶液の最終ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム３．０ｍｌにて７．２２であった。
【００６０】
部分Ｋ
脱イオン水１００ｇに、以下の化学物質を添加した。：１．５ｇSilwet L-77、１．０５ｇのプルロニックL121。
【００６１】
実施例７
ドライテストストリップは、実施例３と同じ膜、すなわち：タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール反応膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水５９９．６３ｇ中の６４．６ｇのプルロニックL121、５．７９ｇのテトロニック304、ＭＥＳ緩衝液１２．５８ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ２４．９７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸６．１６ｇ、ソルビトール２０．０ｇ、スクロース９．３ｇ、および塩化マグネシウム８．７７ｇ、０．７９ｇSilwet L-77にて処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム５．５ｍｌにて６．２１に調整した。
【００６２】
本実施例のBTS SP300層（Ｍ−２）を、脱イオン水２０１．５ｇ中に３．６ｇのプルロニック L121、デキストラン硫酸１０Ｋ２．０２ｇ、α−シクロデキストリン硫酸１．５３ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液１．７８ｇ、ソルビトール１．２１ｇ、スクロース１．２９ｇ、塩化マグネシウム１．８１ｇ、０．６２ｇのテトロニック１１０７、エマルゲン（Emulgen）210P１．０３ｇ、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン１．５１ｇをすべて添加した溶液で処理した。それらの膜（Ｍ−１およびＭ−２）の両方を、乾燥トンネルに通した。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００６３】
実施例８
ドライテストストリップは、実施例３と同じ膜、すなわち：タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール反応膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水７５．０ｇ中の０．３５ｇのプルロニック L121、０．０６ｇのテトロニック304、ＭＥＳ緩衝液１．５６ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ３．１１ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．７６８７ｇ、ソルビトール２．５１ｇ、スクロース１．１７ｇ、および塩化マグネシウム１．１ｇ、０．１ｍｌSilwet L-77にて処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム０．４ｍｌにて６．１４に調整した。
【００６４】
BTS SP300層（Ｍ−２）を、脱イオン水７５ｇ中に１．８０ｇのプルロニックL121、デキストラン硫酸１０Ｋ０．９１ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．７４７７ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液０．８ｇ、ソルビトール２．０ｇ、スクロース０．６１ｇ、塩化マグネシウム０．９ｇ、０．２９ｇのテトロニック１１０７をすべて添加した溶液で処理した。溶液の最終ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム０．１５ｍｌにて７．１７であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００６５】
実施例９
本実施例のドライテストストリップは、非−グラスファイバー最上層（Ｍ−１）、すなわちAccuwick Ultra、BTS SP300層（Ｍ−２）、BTS SP300層（Ｍ−４）、およびコレステロール検出膜（Ｍ−５）で構成された。Accuwick Ultra層を、脱イオン水３７５ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：ＭＥＳ緩衝液７．８０ｇ、デキストラン硫酸１００００mwt１５．５７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．８５ｇ、Ｄ−ソルビトール１２．５ｇ、スクロース５．８２ｇ、塩化マグネシウム５．４７ｇ、１．７９ｇのプルロニックL121、３．５９ｇのテトロニック３０４、および０．５ｇSilwet L-77。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム２ｍｌにて６．１６に調整した。
【００６６】
最初のBTS SP300層（Ｍ−２）を、以下の溶液に浸漬し、そして過剰の液を振り落とし、染み込ませた：脱イオン水１８７．５ｇ中に以下の化学物質を溶解した；２．１８ｇのＰＶＡ30-70Kmwt、１．７５ｇのテトロニック３０４、ＭＥＳ緩衝液４．０２ｇ、７．７７ｇのDextralip15、α−シクロデキストリン硫酸１．９６ｇ、Ｄ−ソルビトール７．３１ｇ、スクロース１．４０ｇ、硫酸マグネシウム３．５２ｇ、２．５ｇのポリエチレングリコール6000mwt、５７ｍｇのAntifoam C。上記液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌにて６．２７に調整した。
【００６７】
2番目のBTS SP300層（Ｍ−４）を、2つの溶液中に溶解した以下の化学物質からなる溶液で処理した。最初の溶液は２０．３５ｇの４％ＰＶＡ ３０−７０Ｋmwt溶液と、５０．０１ｇの脱イオン水に溶解した以下の化学物質をからなる溶液：２．０４８ｇのＰＶＡ30-70Kmwt、２．３１ｇのプルロニックL121、デキストラン硫酸１００００mwt１．２０ｇ、塩化マグネシウム１．２ｇ、１．３１ｇのBis Tris 緩衝液、α−シクロデキストリン硫酸１．０４ｇ、Ｄ−ソルビトール３．７５ｇ、０．０２５６ｇSilwet L-77、および０．０３ｇのテトロニック ３０、０．４７ｇのＣＨＡＰＳ。上記液のｐＨは、３．２５Ｎ塩酸〜２．５ｍｌを添加した後は６．４８であった。
【００６８】
コントロール値と実施例９のテストストリップを使用した１６のアッセイの間の相関は、図３に示すように良かった。
実施例１０
本実施例のドライストリップは、タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール検出膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：ＭＥＳ緩衝液６．２７ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．４１ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０６ｇ、Ｄ−ソルビトール１０．０１ｇ、スクロース４．６５ｇ、硫酸マグネシウム４．３７ｇ、１．４３ｇのプルロニックL121、２．９０ｇのテトロニック３０４、および０．４ｇのSilwet L-77。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム１．８ｍｌにて６．１５に調整した。BTS SP300層を、脱イオン水２９６．５ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：７．２０ｇのプルロニックL121、デキストラン硫酸１０Ｋ３．６ｇ、硫酸マグネシウム３．５８ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液３．１５ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．２０ｇ、Ｄ−ソルビトール８．１３ｇ、スクロース２．３８ｇ、および１．２ｇのテトロニック３０４。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１ｍｌ添加後に７．１２であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００６９】
コントロール値と実施例１０のテストストリップを使用した１４のアッセイの間の相関は、図４に示すように良かった。
実施例１１
本実施例のドライストリップは、タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール検出膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：ＭＥＳ緩衝液６．６７ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．５７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０７ｇ、Ｄ−ソルビトール１０．０８ｇ、スクロース５．３３ｇ、硫酸マグネシウム４．４１ｇ、２．８６ｇのテトロニック３０４、および０．０７１０ｇのアジ化ナトリウム。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム２．２５ｍｌにて６．２２に調整した。膜をこの溶液に浸すことによりこの溶液で処理し、続いて２つのローラーの間を回転させ、そしてオープンファイバーマトリックス（open fiber matrix）上で空気乾燥させた。
【００７０】
BTS SP300（Ｍ−２）を、脱イオン水５００ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：１２ｇのプルロニック L121、デキストラン硫酸１０Ｋ５．９９ｇ、硫酸マグネシウム５．９９ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液５．１８ｇ、α−シクロデキストリン硫酸５．１９ｇ、Ｄ−ソルビトール４．０１ｇ、スクロース４．０１ｇ、および１．９ｇのテトロニック ３０４。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌ添加後に７．１９であった。最後に、BTS SP300を脱イオン水１００．１ｇ中にデキストラン硫酸１０Ｋ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびＤ−ソルビトール２．０ｇを溶解した液をスプレー処理した。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌ添加後に６．３１であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００７１】
コントロール値と実施例１１のテストストリップを使用した２１のアッセイの間の相関は、図５に示すように良かった。
実施例１２
本実施例のドライストリップは、タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール検出膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｍｌ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：ＭＥＳ緩衝液６．６７ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．５７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０７ｇ、ソルビトール１０．０８ｇ、スクロース５．３３ｇ、硫酸マグネシウム４．４１ｇ、２．８６ｇのテトロニック ３０４、および０．０７１０ｇのアジ化ナトリウム。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム２．２５ｍｌにて６．２２に調整した。
【００７２】
BTS SP300（Ｍ−２）を、脱イオン水５００ｇ中に以下の化学物質を溶解した溶液で処理した：１２ｇのプルロニック L121、硫酸マグネシウム５．９９ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液５．１８ｇ、α−シクロデキストリン硫酸５．１９ｇ、ソルビトール４．０１ｇ、スクロース４．０１ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ５．９９ｇおよび１．９ｇのテトロニック ３０４。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌ添加後に７．１９であった。さらに、以下を含む溶液０．５０ｇを浸漬前にBTS SP300溶液に添加した：９．９９ｇのプルロニック L123、１０．０１ｇのプルロニック L101、５．０５ｇのプルロニックL103、９．９９ｇのプルロニックL61、１０．０２ｇのプルロニックL64および２．７５ｇのSilwet L-77。膜を乾燥後、脱イオン水１００ｇ中に以下の化学物質を溶解した液をスプレーした：デキストラン硫酸１０Ｋｍｗｔ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびＤ−ソルビトール２．０ｇ。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌ添加後に６．３１であった。最後に、BTS SP300を、デキストラン硫酸１０Ｋ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびソルビトール２．０ｇを含む液をスプレー処理した。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌ添加後に７．１９であった。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００７３】
コントロール値と実施例１２のテストストリップを使用した２１のアッセイの間の相関は、図６に示すように良かった。
実施例１３
本実施例のドライストリップは、タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｍｌ中に、ＭＥＳ緩衝液６．６７ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．５７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０７ｇ、ソルビトール１０．０８ｇ、スクロース５．３３ｇ、硫酸マグネシウム４．４１ｇ、２．８６ｇのテトロニック３０４、および０．０７１０ｇのアジ化ナトリウムをすべて溶解した液で処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム２．２５ｍｌにて６．２２に調整した。膜を乾燥後、脱イオン水１００ｇ中に、デキストラン硫酸１０Ｋ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびＤ−ソルビトール２．０ｇすべてを含んだ液をスプレー処理した。ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌで６．３１に調整した。
【００７４】
BTS SP300（Ｍ−２）を、脱イオン水７４９．５ｇ中に、１８．８ｇのプルロニック L121、硫酸マグネシウム２．９０ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液７．３７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸８．９６ｇ、ソルビトール７．３８ｇ、スクロース６．００ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１０．１１ｇ、７．１２ｇのテトロニック３０４、２．９０ｇのSilwet L-77、および０．１５ｇのアジ化ナトリウムを全て溶解した液で処理した。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム２．５ｍｌ添加後に７．１５であった。さらに、以下の溶液１．５０ｇを浸漬前に上述の液に添加した：９．９９ｇのプルロニックL123、１０．０１ｇのプルロニックL101、５．０５ｇのプルロニックL103、９．９９ｇのプルロニックL61、１０．０２ｇのプルロニックL64および２．７５ｇのSilwet L-77。膜を乾燥後、脱イオン水１００ｇ中に以下の化学物質を溶解した液をスプレーした：デキストラン硫酸１０Ｋｍｗｔ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびソルビトール２．０ｇ。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００７５】
コントロール値と実施例１３のテストストリップを使用した１５のアッセイの間の相関は、図７に示すように良かった。
実施例１４
本実施例のドライストリップは、タフグラス（TuffGlass）（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール膜（Ｍ−５）で構成された。タフグラス（TuffGlass）層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｍｌ中に、ＭＥＳ緩衝液６．６ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．５７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０７ｇ、ソルビトール１０．０８ｇ、スクロース５．３３ｇ、硫酸マグネシウム４．４１ｇ、２．８６ｇのテトロニック ３０４、および０．０７１０ｇのアジ化ナトリウムをすべて溶解した液で処理した。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム２．２５ｍｌにて６．２２に調整した。膜を乾燥後、脱イオン水１００ｇ中に、デキストラン硫酸１０Ｋ４．０３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸０．６ｇ、硫酸マグネシウム０．５７ｇ、ＭＥＳ緩衝液１．７５ｇ、およびソルビトール２．０ｇを溶解した液でスプレー処理した。ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム１．５０ｍｌで６．３１に調整した。タフグラス（TuffGlass）層に、次にＰＶＡ２％溶液をスプレーした。
【００７６】
BTS SP300（Ｍ−２）を、脱イオン水７４９．５ｇ中に、１８．８ｇのプルロニック L121、硫酸マグネシウム２．９０ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液７．３７ｇ、α−シクロデキストリン硫酸８．９６ｇ、ソルビトール７．３８ｇ、スクロース６．００ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１０．１１ｇ、２．９０ｇのSilwet L-77、７．１２ｇのテトロニック ３０４、および０．１５ｇのアジ化ナトリウムを全て含む液で処理した。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム２．５ｍｌにて７．１５に調整した。乾燥してから、BTS SP300を、脱イオン水６００ｇ中に、デキストラン硫酸１０Ｋ２４．００ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．５７ｇ、硫酸マグネシウム３．５８ｇ、ＭＥＳ緩衝液１０．７８ｇ、およびＤ−ソルビトール１１．８２ｇを溶解した液でスプレー処理した。ｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウム２．０ｍｌにて６．２０に調整した。最後に、BTS SP300を、０．１５％Silwet L-77と１．０％ プルロニック L121にてスプレー処理した。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００７７】
コントロール値と実施例１４のテストストリップを使用した１４のアッセイの間の相関は、図８に示すように良かった。
実施例１５
本実施例のドライストリップは、非−グラスファイバー層Accuwick Ultra（Ｍ−１）、BTS SP300（Ｍ−２）、Supor 1200（Ｍ−３）、およびコレステロール膜（Ｍ−５）で構成された。Accuwick Ultra層（Ｍ−１）を、脱イオン水３００ｇ中に以下の化学物質を溶解した者で処理した：ＭＥＳ緩衝液６．３０ｇ、デキストラン硫酸１０Ｋ１２．４３ｇ、α−シクロデキストリン硫酸３．０８ｇ、ソルビトール１０．０４ｇ、スクロース４．６３ｇ、硫酸マグネシウム４．３７ｇ、２．８６ｇのテトロニック３０４、０．４ｇSilwet L-77、および以下を含む１．４７ｇの溶液：１．０３ｇのβ−シクロデキストリンポリマー、０．９９ｇのランダムにメチル化されたβ−シクロデキストリン。その層をさらに、以下を含む２．９８ｇの溶液で処理した：２．９９ｇエマルゲン（Emulgen）210P、９．００ｇのプルロニックL121、１．９８ｇのポリプロピレングリコール3,500mwt。ｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム１．７５ｍｌにて６．２２に調整した。Supor 1200には何ら処理しなかった。
【００７８】
BTS SP300を、脱イオン水３００ｇ中に以下の化学物質を溶解することにより得た溶液で処理した：５．４３ｇのプルロニック L121、硫酸マグネシウム２．７５ｇ、ＭＯＰＳ緩衝液２．３９ｇ、α−シクロデキストリン硫酸２．３９ｇ、ソルビトール１．８０ｇ、スクロース１．８２ｇ、１．５０ｇエマルゲン（Emulgen）210P、０．４５ｇのテトロニック３０４、０．４７ｇのテトロニック １５０Ｒ１、０．４６ｇのテトロニック ９０１、２．３３ｇのヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン。溶液のｐＨは、５Ｎ水酸化ナトリウムを〜０．９ｍｌ添加後に７．２１であった。
【００７９】
コントロール値と実施例１５のテストストリップを使用した１４のアッセイの間の相関は、図９に示すように良かった。
本発明は、図面および上述の記載により詳細に示され、そして記載されているが、同時に例示であると考えるべきで、特徴を限定的に解釈すべきではない。好ましい態様のみが示されていて、本発明の精神の範囲内の全ての変化、修正、およびさらなる応用は保護されることが望ましいことは理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、本発明のテストストリップを示す。
【図２】図２は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１にて特定された本発明の１つの態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図３】図３は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例９にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図４】図４は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１０にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図５】図５は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１１にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図６】図６は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１２にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図７】図７は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１３にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図８】図８は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１４にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【図９】図９は、ゲル電気泳動により決定されたＬＤＬ−Ｃと、実施例１５にて特定された本発明の他の態様により調製されたドライテストストリップによって得られた測定された％Ｒとの間の相関を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血液、血漿、または血清中のＬＤＬコレステロールの濃度を直接測定するための室温測定方法であって、サンプルとＬＤＬ−Ｃを選択的に検出可能とする試薬とを接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、前記試薬が、サンプル中のＬＤＬと非−ＬＤＬの相対的な表面電荷密度の作用としてＬＤＬと非−ＬＤＬに異なって反応する、前記方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、前記試薬がカチオン、ポリアニオン、シクロデキストリン誘導体、コポリマー界面活性剤、および前記コポリマー界面活性剤のための界面活性剤を含む、前記方法。
【請求項４】
請求項３の方法であって、前記カチオンが２価金属を含む、前記方法。
【請求項５】
請求項４の方法であって、前記２価金属がマグネシウムである、前記方法。
【請求項６】
請求項３の方法であって、前記カチオンがリポプロテインに結合するのに有効な正に荷電されたアミンを含む、前記方法。
【請求項７】
請求項６の方法であって、前記アミンがトリエタノールアミン塩酸塩である、前記方法。
【請求項８】
請求項３の方法であって、前記ポリアニオンがデキストラン硫酸である、前記方法。
【請求項９】
請求項３の方法であって、前記シクロデキストリン誘導体がα−シクロデキストリン硫酸である、前記方法。
【請求項１０】
請求項３の方法であって、前記コポリマー界面活性剤が、分子量約２１００〜約６０００であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの混成物（hybrid）でポリオキシプロピレンを優位に含む、前記方法。
【請求項１１】
選択的にＬＤＬ−Ｃを測定可能にすることができるテストストリップでの使用に適した試薬の組み合わせ。
【請求項１２】
請求項１１の試薬の組み合わせであって、カチオン、ポリアニオン、シクロデキストリン誘導体、コポリマー界面活性剤、および前記コポリマー界面活性剤のための界面活性剤を含む、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１３】
請求項１２の試薬の組み合わせであって、前記カチオンが２価金属を含む、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１４】
請求項１２の試薬の組み合わせであって、前記２価金属がマグネシウムである、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１５】
請求項１２の試薬の組み合わせであって、前記カチオンがリポプロテインに結合するのに有効な正に荷電されたアミンを含む、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１６】
請求項１５の試薬の組み合わせであって、前記アミンがトリエタノールアミン塩酸塩である、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１７】
請求項１１の試薬の組み合わせであって、前記ポリアニオンがデキストラン硫酸である、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１８】
請求項１１の試薬の組み合わせであって、前記シクロデキストリン誘導体がα−シクロデキストリン硫酸である、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１９】
請求項１１の試薬の組み合わせであって、前記コポリマー界面活性剤が、分子量約２１００〜約６０００であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの混成物（hybrid）でポリオキシプロピレンを優位に含む、前記試薬の組み合わせ。
【請求項２０】
請求項１１の試薬の組み合わせであって、前記試薬が非−ＬＤＬと結合するのに有効な高分子量のブロッキングコポリマー界面活性剤と前記ブロッキングコポリマー界面活性剤の溶解性を高めるのに有効な低分子量界面活性剤を含む、前記試薬の組み合わせ。
【請求項２１】
全血液、血漿、または血清サンプル中の低密度リポプロテインから生じるコレステロールの直接検出に使用するための垂直流テストストリップであって、前記テストストリップが：
ａ）テストストリップにおける赤血球細胞の移動をブロックするか減速させるための膜；
ｂ）選択的にＬＤＬ−Ｃを測定可能にすることができる試薬の組み合わせの供給部；および
ｃ）コレステロール検出膜、
を含む、前記テストストリップ。
【請求項２２】
請求項２１のテストストリップであって、カチオン、ポリアニオン、シクロデキストリン誘導体、コポリマー界面活性剤、および前記コポリマー界面活性剤のための界面活性剤を含む、前記テストストリップ。
【請求項２３】
請求項２２のテストストリップであって、前記カチオンが２価金属を含む、前記テストストリップ。
【請求項２４】
請求項２２のテストストリップであって、前記２価金属がマグネシウムである、前記テストストリップ。
【請求項２５】
請求項２２のテストストリップであって、前記カチオンがリポプロテインに結合するのに有効な正に荷電されたアミンを含む、前記テストストリップ。
【請求項２６】
請求項２５のテストストリップであって、前記アミンがトリエタノールアミン塩酸塩である、前記テストストリップ。
【請求項２７】
請求項２１のテストストリップであって、前記ポリアニオンがデキストラン硫酸である、前記テストストリップ。
【請求項２８】
請求項２１のテストストリップであって、前記シクロデキストリン誘導体がα−シクロデキストリン硫酸である、前記テストストリップ。
【請求項２９】
請求項２１のテストストリップであって、前記コポリマー界面活性剤が、分子量約２１００〜約６０００であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの混成物（hybrid）でポリオキシプロピレンを優位に含む、前記テストストリップ。
【請求項３０】
請求項２１のテストストリップであって、前記試薬が非−ＬＤＬと結合するのに有効な高分子量のブロッキングコポリマー界面活性剤と前記ブロッキングコポリマー界面活性剤の溶解性を高めるのに有効な低分子量界面活性剤を含む、前記テストストリップ。
【請求項３１】
請求項２１のテストストリップであって、前記ブロッキング膜が、試薬の組み合わせの供給部の少なくともいくつかで染み込まされる、前記テストストリップ。
【請求項３２】
請求項２１のテストストリップであって、さらに試薬の組み合わせの供給部の少なくともいくつかで染み込まされた、少なくとも１つの中間膜を含む、前記テストストリップ。
【請求項１】
全血液、血漿、または血清中のＬＤＬコレステロールの濃度を直接測定するための室温測定方法であって、サンプルとＬＤＬ−Ｃを選択的に検出可能とする試薬とを接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、前記試薬が、サンプル中のＬＤＬと非−ＬＤＬの相対的な表面電荷密度の作用としてＬＤＬと非−ＬＤＬに異なって反応する、前記方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、前記試薬がカチオン、ポリアニオン、シクロデキストリン誘導体、コポリマー界面活性剤、および前記コポリマー界面活性剤のための界面活性剤を含む、前記方法。
【請求項４】
請求項３の方法であって、前記カチオンが２価金属を含む、前記方法。
【請求項５】
請求項４の方法であって、前記２価金属がマグネシウムである、前記方法。
【請求項６】
請求項３の方法であって、前記カチオンがリポプロテインに結合するのに有効な正に荷電されたアミンを含む、前記方法。
【請求項７】
請求項６の方法であって、前記アミンがトリエタノールアミン塩酸塩である、前記方法。
【請求項８】
請求項３の方法であって、前記ポリアニオンがデキストラン硫酸である、前記方法。
【請求項９】
請求項３の方法であって、前記シクロデキストリン誘導体がα−シクロデキストリン硫酸である、前記方法。
【請求項１０】
請求項３の方法であって、前記コポリマー界面活性剤が、分子量約２１００〜約６０００であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの混成物（hybrid）でポリオキシプロピレンを優位に含む、前記方法。
【請求項１１】
選択的にＬＤＬ−Ｃを測定可能にすることができるテストストリップでの使用に適した試薬の組み合わせ。
【請求項１２】
請求項１１の試薬の組み合わせであって、カチオン、ポリアニオン、シクロデキストリン誘導体、コポリマー界面活性剤、および前記コポリマー界面活性剤のための界面活性剤を含む、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１３】
請求項１２の試薬の組み合わせであって、前記カチオンが２価金属を含む、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１４】
請求項１２の試薬の組み合わせであって、前記２価金属がマグネシウムである、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１５】
請求項１２の試薬の組み合わせであって、前記カチオンがリポプロテインに結合するのに有効な正に荷電されたアミンを含む、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１６】
請求項１５の試薬の組み合わせであって、前記アミンがトリエタノールアミン塩酸塩である、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１７】
請求項１１の試薬の組み合わせであって、前記ポリアニオンがデキストラン硫酸である、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１８】
請求項１１の試薬の組み合わせであって、前記シクロデキストリン誘導体がα−シクロデキストリン硫酸である、前記試薬の組み合わせ。
【請求項１９】
請求項１１の試薬の組み合わせであって、前記コポリマー界面活性剤が、分子量約２１００〜約６０００であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの混成物（hybrid）でポリオキシプロピレンを優位に含む、前記試薬の組み合わせ。
【請求項２０】
請求項１１の試薬の組み合わせであって、前記試薬が非−ＬＤＬと結合するのに有効な高分子量のブロッキングコポリマー界面活性剤と前記ブロッキングコポリマー界面活性剤の溶解性を高めるのに有効な低分子量界面活性剤を含む、前記試薬の組み合わせ。
【請求項２１】
全血液、血漿、または血清サンプル中の低密度リポプロテインから生じるコレステロールの直接検出に使用するための垂直流テストストリップであって、前記テストストリップが：
ａ）テストストリップにおける赤血球細胞の移動をブロックするか減速させるための膜；
ｂ）選択的にＬＤＬ−Ｃを測定可能にすることができる試薬の組み合わせの供給部；および
ｃ）コレステロール検出膜、
を含む、前記テストストリップ。
【請求項２２】
請求項２１のテストストリップであって、カチオン、ポリアニオン、シクロデキストリン誘導体、コポリマー界面活性剤、および前記コポリマー界面活性剤のための界面活性剤を含む、前記テストストリップ。
【請求項２３】
請求項２２のテストストリップであって、前記カチオンが２価金属を含む、前記テストストリップ。
【請求項２４】
請求項２２のテストストリップであって、前記２価金属がマグネシウムである、前記テストストリップ。
【請求項２５】
請求項２２のテストストリップであって、前記カチオンがリポプロテインに結合するのに有効な正に荷電されたアミンを含む、前記テストストリップ。
【請求項２６】
請求項２５のテストストリップであって、前記アミンがトリエタノールアミン塩酸塩である、前記テストストリップ。
【請求項２７】
請求項２１のテストストリップであって、前記ポリアニオンがデキストラン硫酸である、前記テストストリップ。
【請求項２８】
請求項２１のテストストリップであって、前記シクロデキストリン誘導体がα−シクロデキストリン硫酸である、前記テストストリップ。
【請求項２９】
請求項２１のテストストリップであって、前記コポリマー界面活性剤が、分子量約２１００〜約６０００であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの混成物（hybrid）でポリオキシプロピレンを優位に含む、前記テストストリップ。
【請求項３０】
請求項２１のテストストリップであって、前記試薬が非−ＬＤＬと結合するのに有効な高分子量のブロッキングコポリマー界面活性剤と前記ブロッキングコポリマー界面活性剤の溶解性を高めるのに有効な低分子量界面活性剤を含む、前記テストストリップ。
【請求項３１】
請求項２１のテストストリップであって、前記ブロッキング膜が、試薬の組み合わせの供給部の少なくともいくつかで染み込まされる、前記テストストリップ。
【請求項３２】
請求項２１のテストストリップであって、さらに試薬の組み合わせの供給部の少なくともいくつかで染み込まされた、少なくとも１つの中間膜を含む、前記テストストリップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５２３３２５（Ｐ２００７−５２３３２５Ａ）
【公表日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５２２０９（Ｐ２００６−５５２２０９）
【出願日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００３２３４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７４６０９
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．パイレックス
【出願人】（５０４４０５６０４）ポリマー テクノロジー システムズ インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００３２３４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７４６０９
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．パイレックス
【出願人】（５０４４０５６０４）ポリマー テクノロジー システムズ インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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