修飾成長ホルモンポリペプチド
我々は、修飾成長ホルモン融合タンパク質、及び前記の融合タンパク質を含有するダイマー、前記のタンパク質をコードする核酸分子、並びに、成長ホルモンの過剰による病状の処置における前記のタンパク質を用いる治療方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾成長成長ホルモン融合蛋白および該蛋白からなる二量体；該タンパクをコードする核酸分子および該タンパクを用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモン（ＧＨ）は、子供の成長および成人の正常な身体構成の上で重要な同化を促進するサイトカインホルモンである。ＧＨ活性の制御は複雑で、いくつもの相互に作用するペプチドやペプチド性作用薬および拮抗薬より構成されている。ＧＨは、成長ホルモン受容体に結合することにより直接その効果を仲介するか、インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の産生を間接的に刺激することで仲介することができる。それ故、ＧＨの主要な役割は、肝臓を刺激してＩＧＦ−１を産生させることである。なおまた、ＧＨの分泌は、対立する活性を有する２つのペプチドホルモンによって制御される。成長ホルモン分泌ホルモン（ＧＨＲＨ）は視床下部の後室周囲核において生産される４４アミノ酸からなるペプチドであり、脳下垂体前葉によるＧＨ産生を刺激するべく機能する。ソマトスタチンはＧＨＲＨの効果を妨害するペプチド性ホルモンであり、これは、より大きなプレプロペプチドから１４および２８アミノ酸からなる型に切断されることで形成される。ソマトスタチンは視床下部の脳室周囲核の神経内分泌細胞により分泌され、脳下垂体前葉と連絡する視床下部・下垂体門脈系に至り、ここでＧＨの分泌を阻害する。
【０００３】
ＧＨは２つの膜結合成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）と順次結合し、この結合は部位１および部位２として表わされるＧＨ上の別の２部位を介してなされる。部位１は抗親和性結合部位であり、部位２は低親和性部位である。１つのＧＨ分子は部位１を介して１つのＧＨＲと結合する。第二のＧＨＲは部位2を介してＧＨＲ：ＧＨ：ＧＨＲ複合体を形成し、この複合体は細胞内部に取り込まれて情報伝達カスケードを活性化し、遺伝子発現に変化を及ぼす。ＧＨＲの細胞外ドメインは、およそ１００アミノ酸からなる２つの連結したドメイン（ＳＤ−１００）、すなわち細胞表面に最も近接したＣ末端ＳＤ−１００領域と、それより遠位にあるＮ末端ＳＤ−１００領域、から構成されている。ＧＨＲがホルモンと結合し、ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲの三量体を形成する際には、これら二つのドメインの高次構造の変化が生じている。
【０００４】
過剰なＧＨは、数々の疾患状態と関係している；例えば、末端肥大症や下垂体性巨人症である。過剰なＧＨというケースのほとんどは、脳下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞における下垂体部腫瘍によるものである。これら腫瘍は悪性ではなく、徐々にＧＨの分泌を増加する。成長ホルモン過剰の兆候としては、顎、指およびつま先の骨の肥厚化、神経／筋への圧力上昇およびインシュリン耐性が挙げられる。ＧＨ過剰に関連する腫瘍に対する本来の治療法としては、下垂体部腫瘍を外科的に除去することである。近年、ＧＨ拮抗剤を用いたＧＨシグナルの阻害が、非侵襲的であるため、より好ましい治療法になりつつある。ＧＨ拮抗剤は、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類縁体（例えば、オクトレオチドやランレオチド）または修飾ＧＨのいずれかであってもよい。
【０００５】
修飾ＧＨ拮抗剤についての総説としては、Ｋｏｐｃｈｉｃｋ（２００３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４８；Ｓ２１−２５があるが、ここには、ペグビゾマントと呼称される商業的に入手可能なＧＨ拮抗剤について記載されており、該ＧＨ拮抗剤は、ヒトＧＨの１２０位をＧにするという修飾と、分子量を増加させるべく、ポリエチレングリコールを付加することが組み合わされている。成長ホルモン投与に関連する問題点としては、腎臓による濾過機能やタンパク分解により、これらが急激に消失する点である。ポリエチレングリコールの付加により、こうした消失は軽減される。しかしながら、ポリエチレングリコール付加はＧＨのＧＨＲに対する親和性も軽減することが知られており、このため、こうした親和性の低下を補うために、高用量の修飾ＧＨを投与する必要が生じ、これにより副作用が誘発される場合がある。低用量で投与しうる修飾ＧＨ拮抗剤を提供することで、ペグビソマントに伴う問題を回避することが望ましい。これは、投与用量の減少または投与頻度の減少のいずれかであってもよい。
【０００６】
我々の同時継続出願ＷＯ０３／０７０７６５において、我々はＧＨの部位１および部位２への修飾を含む修飾ＧＨ融合タンパクについて記載している。これら修飾ＧＨ分子はＧＨＲの細胞外ドメインと連合させている。我々はここに、血清中での半減期が大幅に延長された修飾ＧＨ融合タンパクを開示する。該融合タンパクは、二量体を形成することで、腎臓での除去軽減またはタンパク分解に対する抵抗性のいずれかにより、該タンパクの薬物動態的な改善がなされ得る。該成長ホルモン融合タンパクの薬物動態改善という特徴により、高頻度の投与を必要とせず、望ましくない副作用を軽減するという治療レジメが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０３／０７０７６５号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｏｐｃｈｉｃｋ（２００３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４８；Ｓ２１−２５
【発明の概要】
【０００９】
本発明の態様として、以下から選択される核酸配列を含む核酸分子を提供する：
ｉ）配列番号１に表記される核酸配列；
ｉｉ）配列番号２に表記される核酸配列；
ｉｉｉ）配列番号４に表記される核酸配列：
ｉｖ）配列番号５に表記される核酸配列：
ｖ）配列番号７に表記される核酸配列；
ｖｉ）配列番号８に表記される核酸配列：
ｖｉｉ）配列番号１０に表記される核酸配列：
ｖｉｉｉ）配列番号１１に表記される核酸配列；
ｖｉｉｉｉ）配列番号１３に表記される核酸配列：
ｘ）配列番号１４に表記される核酸配列：
ｘｉ）配列番号１６に表記される核酸配列；
ｘｉｉ）配列番号１７に表記される核酸配列：
ｘｉｉｉ）配列番号１９に表記される核酸配列：
ｘｉｖ）配列番号２０に表記される核酸配列；
ｘｖ）配列番号２２に表記される核酸配列：
ｘｖｉ）配列番号２３に表記される核酸配列：
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２または２３に、限定されたハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、成長ホルモン受容体拮抗剤活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【００１０】
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補する核酸分子が互いにある数の水素結合を伴う場合に生ずる。ハイブリダイゼーションの厳格さは、核酸を囲む環境条件やハイブリダイゼーション方法の性質および使用される核酸分子の組成および長さによって変動しうる。特定の程度の厳格さを達成するために必要なハイブリダイゼーション条件についての計算はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２００１）；およびＴｉｊｓｓｅｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ パート１、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒk，１９９３）において論じられている。Ｔｍは所定の核酸分子ストランドの５０％がこれと相補するストランドとハイブリダイズしている温度である。以下にハイブリダイゼーション条件を例示するが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
超高限定条件（少なくとも９０％の同一性を有する配列がハイブリダイズしうる条件）
ハイブリダイゼーション： ５ｘＳＳＣ、６５℃にて１６時間
洗浄２回： ２ｘＳＳＣ、室温（ＲＴ）にて各１５分
洗浄２回： ０．５ｘＳＳＣ、６５℃にて各２０分
高限定条件（少なくとも８０％の同一性を有する配列がハイブリダイズしうる条件）
ハイブリダイゼーション： ５−６ｘＳＳＣ、６５−７０℃にて１６−２０時間
洗浄２回： ２ｘＳＳＣ、ＲＴにて各５−２０分
洗浄２回： １ｘＳＳＣ、５５−７０℃にて各３０分
低限定条件（少なくとも５０％の同一性を有する配列がハイブリダイズしうる条件）
ハイブリダイゼーション： ６ｘＳＳＣ、ＲＴから５５℃にて１６−２０時間
洗浄最低２回： ２ｘ−３ｘＳＳＣ、ＲＴから５５℃にて各２０−３０分
【００１２】
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号２に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号４に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号５に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号７に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号８に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１０に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１１に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１３に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
【００１３】
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１４に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１６に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１７に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１９に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号２０に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号２２に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号２３に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の態様として、該発明に基づく核酸によってコードされたポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明の更なる態様として、以下より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する：
ｉ） 配列番号３に表記されるアミノ酸
ｉｉ） 配列番号６に表記されるアミノ酸
ｉｉｉ） 配列番号９に表記されるアミノ酸
ｉｖ） 配列番号１２に表記されるアミノ酸
ｖ） 配列番号１５に表記されるアミノ酸
ｖｉ） 配列番号１８に表記されるアミノ酸
ｖｉｉ） 配列番号２１に表記されるアミノ酸
ｖｉｉｉ） 配列番号２４に表記されるアミノ酸
ｉｘ） 配列番号２５に表記されるアミノ酸
ｘ） 配列番号２６に表記されるアミノ酸
ｘｉ） 配列番号２７に表記されるアミノ酸
ｘｉｉ） 配列番号２８に表記されるアミノ酸
ｘｉｉｉ） 配列番号２９に表記されるアミノ酸
ｘｉｖ） 配列番号３０に表記されるアミノ酸
ｘｖ） 配列番号３１に表記されるアミノ酸
ｘｖｉ） 配列番号３２に表記されるアミノ酸
ここで示したポリペプチドは成長ホルモン受容体拮抗剤活性を有する。
【００１５】
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号３に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号６に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号９に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号１２に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号１５に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号１８に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２１に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２４に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
【００１６】
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２５に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２６に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２７に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２８に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２９に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号３０に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号３１に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号３２に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
【００１７】
本発明の更なる態様として、配列番号３を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号６を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号９を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号１２を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号１５を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号１８を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２１を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２４を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
【００１８】
本発明の更なる態様として、配列番号２５を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２６を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２７を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２８を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２９を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号３０を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号３１を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号３２を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
【００１９】
本発明の更なる態様として、該発明に基づく核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明の好ましい実施例においては、該ベクターは該発明に基づく核酸分子を発現する様に構築された発現ベクターである。
該発明に基づいた核酸を含むベクターはプロモーターやその他の制御配列を含む必要はなく、特に該ベクターが、安定にトランスフェクションするべく、ゲノムへの組み替えのために細胞に核酸を導入するのに使用される場合が該当する。好ましくは、ベクター中の核酸は、宿主細胞内で、適当なプロモーターまたはその他の転写制御エレメントに実行可能な形で連結されている。該ベクターは、多くの宿主で機能する二機能性の発現ベクターであってもよい。「プロモーター」とは、転写開始部位から上流にある核酸配列であり、転写に必要な全ての制御領域を含んでいるものを意味する。適当なプロモーターとは、真核または原核細胞中での発現における、常時発現、組織特異的、誘導可能、発生時、またはその他のプロモーターを含む。「実施可能な形で連結されている」とは、同一の核酸分子の一部として、該プロモーターから転写が開始されるべく、適切な位置及び向きを有して結合していることを意味する。プロモーターに実施可能な形で連結しているＤＮＡは、該プロモーターの「転写開始制御下に」あることとなる。
好ましい実施例においては、該プロモーターは、常時発現、誘導可能、又は調節可能なプロモーターである。
【００２０】
本発明の更なる態様として、該発明に基づいて、核酸分子、又はベクターによりトランスフェクトした、又は、形質転換した細胞を提供する。
好ましくは、該細胞は真核細胞である。さもなくば、該細胞は原核細胞である。
本発明の好ましい実施例としては、該細胞が、菌細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ），哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）、植物細胞により構成されるグループから選択される。
【００２１】
本発明の更なる態様として、賦形剤又は担体を含めた、該発明に基づいたポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
本発明の好ましい実施例においては、該医薬組成物は更なる治療薬と組み合わせている。
投与時において、本発明の医薬組成物は製薬上容認しうる調製状態で投与される。このような調製は、通常、製薬上容認しうる濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性のある担体、及び随意にその他の治療薬を含んでいてもよい。
本発明の医薬組成物は、注射を含む、いかなる既存の経路によっても投与されうる。このような投与及び塗布は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、口腔内、関節内、皮下、局所（目）、皮膚（例えば、皮膚又は粘膜へのクリーム脂質溶性挿入物）、経皮、又は鼻腔内であってもよい。
【００２２】
本発明の医薬構成物は有効量投与される。「有効量」とは、単独で、又は、更なる用量又は相乗作用のある薬剤を伴うことにより、望まれる反応を生み出す医薬品／組成物の総量のことである。これは、病気進行の一時的な抑制にのみ関与しているのでもよいが、さらに望ましくは、永続的に病気の進行を停止させることに関与する。これは、通常の方法により、又は、診断方法に基づいて、モニターすることができる。
【００２３】
対象に投与される医薬構成物の用量は、異なる要素に従って選択することができ、特に、使用される投与形態や対象の状態（例えば、年齢、性別）に従って選択しうる。投与時に、本発明の医薬構成物は製薬上容認しうる用量や組成にて投与される。薬剤にて使用される際には、塩は製薬上容認しうるものでなければいけないが、製薬上容認し得ない塩を、その製薬上容認しうる塩を調製するために都合よく使用してもよく、該発明の適用範囲から除外はされない。このような薬理上および製薬上容認しうる塩には、以下の酸から調製されるものを含むが、それらに限定されない：塩化水素、臭化水素、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、蟻酸、マロン酸、サクシニル酸、およびその類縁体。また、製薬上容認しうる塩は、ナトリウム、カリウム、又はカルシウム塩のような、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製することもできる。
【００２４】
医薬構成物は、もし望まれるのであれば、製薬上容認しうる担体と組み合わせてもよい。ここで使用されている「製薬上容認しうる担体」とは、１又は２以上の、ヒトへの投与に適した、互換性のある個体又は液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル型物質を意味する。“担体”なる用語は、有機物または無機物からなる、天然又は合成された物質であり、活性のある物質と組み合わせることで、投与を容易にするものである。該医薬組成物の構成要素は、また、本発明の分子及び構成要素相互に混合することが可能であり、これによって、望まれる薬剤としての効力を実質的に減じるような相互作用は生じないものである。
【００２５】
医薬構成物は適当な緩衝剤を含んでいてもよく、これには以下のものが含まれる：酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、およびリン酸塩。
医薬構成物は、また、任意に、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンスおよびチメロサールといった、適当な保存剤を含んでいてもよい。
医薬組成物は、また、簡便のために、単位ごとの剤形になっていてもよく、製薬の当業者に周知のいかなる方法によって調製されてもよい。全ての方法は、活性物質を１または２以上の付属的な成分からなる担体と組み合わせるステップを含んでいる。一般に、該構成物は、活性物質と、液状担体、微細な粉末状の固形担体、またはその両方が、むらなく、緊密に組み合わされることにより調製され、その後、もし必要であれば、製剤として成形される。
【００２６】
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、トローチ剤といった分離した単位であってもよく、これらはそれぞれあらかじめ予定された量の活性化合物を含んでいる。その他の組成物としては、水溶性の液体またはシロップ、エリキシル、又は乳剤といった非水溶性の液体による懸濁物が含まれる。
非経口による投与に適した組成物は、簡便のため、滅菌済みの水溶性、又は非水溶性の調製物を含み、これらは、好ましくは、被投与者の血液と等張である。こうした調製物は、適当な分散剤又は湿潤剤および懸濁化剤を用いた公知の方法に従い、処方されてもよい。滅菌済みの注射可能な調製物は、また、滅菌済みの注射可能な溶液、又は、非毒性の非経口として容認しうる希釈剤又は溶媒、例えば、１，３−ブタンジオール溶液、による懸濁物であってもよい。利用可能な容認しうる溶媒としては、水、リンゲル液、および等張の食塩水がある。これに加えて、滅菌済みの不揮発性油は、従来、溶媒又は懸濁液として使用される。この目的のために、いかなる無菌の不揮発性油を使用してよく、これには合成モノ−又はジ−グリセリドが含まれる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を、注射可能なものに調製するのに使用してもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内等への投与に適当な担体の処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出しうる。
【００２７】
本発明のさらなる態様として、本発明に基づく少なくとも１つのポリペプチドを有効容量投与することを含む、成長ホルモン過剰で苦しむヒト被験者の治療方法を提供する。
本発明の好ましい方法としては、該ポリペプチドを静脈内に投与する。
これに代わる本発明の好ましい方法としては、該ポリペプチドを皮下に投与する。
【００２８】
本発明のさらに好ましい方法としては、該ポリペプチドを毎日、または２日置きに投与し、好ましくは、該ポリペプチドを毎週、隔週、又は毎月投与する。
本発明の好ましい方法としては、該成長ホルモン過剰は末端肥大症を引き起こす。
本発明のさらなる態様として、本発明に基づく少なくとも１つのポリペプチドを有効容量投与することを含む、癌で苦しむヒト被験者の治療方法を提供する。
【００２９】
ここでの使用において、「癌」という用語は、自律的増殖能力を有する細胞、すなわち、急激な細胞増殖によって特徴づけられる異常な状態又は状況を示す。該用語は、組織生理学的類型や侵襲段階に関係なく、あらゆるタイプの癌性の増殖や発癌プロセス、転移組織、又は悪性形質転換細胞、組織又は器官を含むものとする。「癌」なる用語は、様々な臓器系の悪性腫瘍を含み、これには、例えば、肺、乳腺、甲状腺、リンパ系、胃腸、および尿生殖路を冒すものが含まれ、また、ほとんどの大腸癌、腎細胞カルシノーマ、前立腺癌、及び／又は精巣癌、肺の非小細胞カルシノーマ、小腸癌、及び食道癌といった悪性腫瘍を包括する腺癌を含む。「カルシノーマ」という用語は、当分野で認められており、呼吸器系カルシノーマ、胃腸系カルシノーマ、泌尿生殖組織カルシノーマ、精巣カルシノーマ、乳腺カルシノーマ、前立腺カルシノーマ、内分泌系カルシノーマ、及び黒色腫を含む上皮又は内分泌組織の悪性腫瘍を示す。典型的なカルシノーマには、子宮、肺、前立腺、乳腺、頭頚部、大腸、及び卵巣組織から形成されるカルシノーマが含まれる。“カルシノーマ”なる用語は、また、癌肉腫、例えば、癌組織および肉腫組織から構成される悪性腫瘍を含むもの、をも含む。“腺癌”は、腺組織由来のカルシノーマ、言い換えると、腫瘍細胞が認識しうる腺構造を形成しているもの、を指す。“肉腫”という用語は、当分野で認められており、間葉由来の悪性腫瘍を指す。
本発明の好ましい方法において、該癌は前立腺癌である。
【００３０】
本明細書の詳細な説明及び請求の範囲を通じて、「よりなる」及び「含む」及びその派生語、例えば、「含んでいる」や「構成する」という言葉は、「含んでいるが、これに限定されるものではない」という意味であり、その他の部分、追加分、成分、整数又は段階を除外することを意図されておらず、そして除外していない。
本明細書の詳細な説明及び請求の範囲を通して、単数表現は、文脈上、単数に限定することが求められていない限り、複数の場合も包含する。特に、不定冠詞が使われている場合は、該明細書は、文脈上、単数に限定することを求められていない限り、単数のみならず複数をも想定しているものと理解されるべきである。
本発明の特別な態様、実施例又は例と関連して描写される特徴、整数、特性、化合物、化学成分、又はグループは、それと共には両立しえない場合を除いて、ここで記載されているその他のいかなる態様、実施例又は例に応用できるものと理解されるべきである。
【００３１】
本発明の実施例は、以下の図に関連する例により記載されるものである：
表１は１Ｂ８ｖ２画分のＢｒａｄｆｏｒｄ法を示す。
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１ａ １Ｂ８ｖ０：Ｇ４Ｓｘ４リンカーを介してＧＨＲ細胞外（ドメイン１及び２）を結合したＧＨ（サイト１変異を含む）より構成：このコンストラクトはリンカー領域及び３‘末端周辺に制限酵素部位を含んでいる；図１ｂはコード化されたアミノ酸配列である。
【図２】図２ａ １Ｂ８ｖ１：本分子は１Ｂ８ｖ０由来であるが、５‘及び３’末端の外側配列を含まず、Ｇ４Ｓｘ４リンカーを含んでいる；図２ｂはコード化されたアミノ酸配列である。
【図３】図３ａ １Ｂ８ｖ２：本分子は１Ｂ８ｖ０由来であるが、外側配列を含まず、Ｇ４Ｓｘ５リンカーを含んでいる；図３ｂはコード化したアミノ酸配列である。
【図４】図４ａ １Ｂ８ｖ３：本分子は１Ｂ８ｖ０由来であるが、外側配列を含まず、リンカーも含んでいない；図４ｂはコード化したアミノ酸配列である。
【図５】図５ａ １Ｂ８９ｖ０：Ｇ４Ｓｘ４リンカーを介してＧＨＲ細胞外（ドメイン１及び２）を結合したＧＨ（サイト１及びサイト２変異を含む）より構成：このコンストラクトはリンカー領域及び３‘末端周辺に制限酵素部位を含んでいる；図５ｂはコード化されたアミノ酸配列である。
【図６】図６ａ １Ｂ９ｖ１：本分子は１Ｂ９ｖ０由来であるが、５‘及び３’末端の外側配列を含まず、Ｇ４Ｓｘ４リンカーを含んでいる；図６ｂはコード化されたアミノ酸配列である。
【図７】図７ａ １Ｂ９ｖ２：本分子は１Ｂ９ｖ０由来であるが、外側配列を含まず、Ｇ４Ｓｘ５リンカーを含んでいる；図７ｂはコード化したアミノ酸配列である。
【図８】図８ａ １Ｂ９ｖ３：本分子は１Ｂ９ｖ０由来であるが、外側配列を含まず、リンカーも含んでいない；図８ｂはコード化したアミノ酸配列である。
【図９】図９はＧ１２０Ｒ分子を哺乳類発現プラスミドにサブクローニングするための基本的なライゲーションのやり方を図示する。
【図１０】図１０は１Ｂ９ｖ０の構造を図示する。
【図１１】図１１は１Ｂ８ｖ２断片：Ｎａｒ１−Ａｖｒｉｌ（５２４ｂｐ）を図示する。新規なリンカー領域は太字にて示し、制限酵素部位は下腺にて表示する。該断片はｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ１プラスミドに繋がれ、ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ２プラスミドとなる。
【図１２】図１２は１Ｂ９ｖ２断片：Ｎａｒ１−Ａｖｒｉｌ（５２４ｂｐ）を図示する。新規なリンカー領域は太字にて示し、制限酵素部位は下腺にて表示する。該断片はｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ９ｖ１プラスミドに繋がれ、ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ９ｖ２プラスミドとなる。
【図１３】図１３は、安定化ＣＨＯＦｌｐ−Ｉｎ細胞株の細胞培養培地より１Ｂ８ｖ２（レーン１及び２）及び１Ｂ９ｖ２（レーン３）の発現を検出すべく行った、ＧＨ特異的抗体を用いたウエスタンブロットを示す。サンプルは各蛋白に予想される正確なサイズ（〜７５ｋＤａ）であり、分解物の兆候は認められない。
【図１４】図１４は、０．５ｎＭ ｒｈＧＨ存在下で、１Ｂ８ｖ２及び１Ｂ９ｖ２安定化細胞株からの培地サンプルは、共に、ｒｈＧＨ活性を抑制することができることを図示する。０．５ｎＭ ｒｈＧＨ非存在下では、両分子とも生物活性を示さない。ＧＨの標準曲線を示す（０−５ｎＭ）。
【図１５】図１５ａは、ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色による精製蛋白画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。画像は、精製蛋白（１Ｂ８ｖ２）は予想される正確なサイズ（〜７５ｋＤａ）であり、より低分子量の分解産物は認められないことを示している；図１５ｂは１Ｂ９ｖ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１６】図１６ａ 皮下投与後、１Ｂ８血清蛋白レベルは、投与後２４時間でピークに達する。１Ｂ８は投与後１０日においてもまだ検出可能である；図１６ｂ 静脈内投与後、１Ｂ８血清蛋白レベルは、投与後１時間でピークに達し、その後急激に減衰する。
【図１７】図１７ａ 未変性ＰＡＧＥサンプルのウエスタンブロット：１；１Ｂ７ｖ０未変性ＧＨ融合蛋白、２；１Ｂ７ｖ１未変性ＧＨ、３；１Ｂ７ｖ２未変性ＧＨ、４；１Ｂ７ｖ３未変性ＧＨ、５；１Ｂ８修飾ＧＨ融合蛋白。全てのサンプルは、単量体及び二量体形成に特徴的な、明確な二重のバンドを示している；図１７ｂ 対応するｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色ゲルであり、二量体形成を示している。
【図１８】図１８は、ペグビソマント５回投与と１Ｂ８及び１Ｂ９の単回投与比較におけるＮＺ白色ウサギの１２日経過後での％体重増加を図示する。
【図１９】図１９はＮＺ白色ウサギの２５０時間経過における１Ｂ８の薬物動態を図示する。
【００３３】
方法と物質
１Ｂ８拮抗剤分子の構築
該分子は、ＧＨ分子のサイト２（低親和性サイト）中の１２０位グリシンをアルギニンに変異させることにより構築される（Ｇ１２０Ｒ）。該ＧＨ分子の、抗親和性サイト１を介したＧＨ受容体への結合には影響はないが、ＧＨサイト２を介した受容体への結合は、アルギニン分子のかさばる側鎖により阻害される。
【００３４】
ＰＣＲの方法は、Ｇ１２０Ｒ変異を含むＧＨ分子を生産するために以前用いており、適当な制限酵素部位を用いて、該分子をｐＴｒｃ−Ｈｉｓ発現プラスミドにクローニングし、ｐＴｒｃ−Ｈｉｓ−１Ａ７クローンを産生した（Ｇ１２０ＲｗｏＧＨＲ細胞外Ｂドメインに連結）。
３００ｂｐのＢｓｕ３６１−Ｎｏｔ１断片をベクターから切り出し、哺乳類発現プラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ７につなぎ（ＧＨをＧＨＲ細胞外ドメインＡ及びＢに連結）、ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８を生産した（ＧＨ分泌シグナルにより分泌発現は誘導される）。図９参照。
【００３５】
１Ｂ９ｖ０拮抗剤分子の構築
該分子はＧＨ分子のサイト１及びサイト２の両方において、アミノ酸を変異することにより構築される。高親和性サイト１を介したＧＨ分子のＧＨ受容体への結合はこれら変異によって亢進されるが、ＧＨサイト２を介した該受容体との結合は１つのグリシンをアルギニンに置き換えることで阻害される。
単ストランドＤＮＡ特異的変異というやり方が、サイト１及びサイト２での変異を含むＧＨ分子を生産するのに使われた。適当な制限酵素部位を用いて、該分子のＴｒｃ−Ｈｉｓ及びｐＥＴ２１ａ（＋）発現プラスミドへのクローニングを行った。ＰＣＲを用いて、ＧＨシグナル配列（ＧＨｓｓ）を含み、Ｎｈｅ１及びＮｏｔ１サイトを側面に持つクローンを構築した。これを哺乳類発現プラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ０につなぎ（ＧＨをＧＨＲ細胞外ドメインＡ及びＢに連結）、ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ９ｖ０を産生した（ＧＨ分泌シグナルにより分泌発現は誘導される）。図１０参照。
【００３６】
１Ｂ８ｖ０及び１Ｂ９ｖ０の変異体クローンの構築
プラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ７ｖ３は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶを用いて切断され、該断片はプラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ０及び１Ｂ９ｖ０に連結され、プラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ１及び１Ｂ９ｖ１が構築された（これらの分子は３‘末端に外側配列を有していない）。次の段階で、リンカー領域の制限酵素部位は除去され、プラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ２及び１Ｂ９ｖ２が産生された。これは、人工遺伝子合成を用いて達成され、オリジナルのリンカーはＧ４Ｓｘ５リンカーにより置換された。
以下の断片は、側面に繋がる制限酵素部位、Ｎａｒｌ及びＡｖｒｉｌと共に、人工遺伝子合成により構築され、ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ１又は１Ｂ９ｖ１のいずれかにつなげられた；図１１及び１２参照。
【００３７】
拮抗剤変異分子の体外での生物活性
各キメラ分子の体外での生物活性を、ＧＨ特異的ルシフェラーゼ受容体アッセイを用いて評価した。基本的に、ヒト由来の細胞株は、安定にヒトＧＨ受容体を遺伝子導入し、一過的にルシフェラーゼシグナルレポーターを導入する。本アッセイはＧＨの生理的レベルを検出する。図１４参照。
【００３８】
拮抗剤分子の精製
分泌産物として１Ｂ８ｖ２及び１Ｂ９ｖ２の両方を発現するＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞株を蛋白不含培地にて培養した。培地を回収、濃縮し、アフィニティー精製前に浄化した。精製のために、２０ｍｌのＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂にｈＧＨに対する５Ｅ１モノクローン抗体を結合したものを調製した。通常は、培地サンプルを１０倍濃縮し、精製前に結合用緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にて１：１に希釈した。
試料をカラムに、流速２ｍｌ／分にてロードした。洗浄後、結合した蛋白を１ｍｌ／分
で２００ｍＭ グリシン、ｐＨ２．７にて溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ９．０にて中和した。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した（図１５ａ及び１５ｂ参照）。図１７ａ及び１７ｂは、未変性の成長ホルモンキメラ蛋白と比較して、１Ｂ９が二量体を形成していることを示している。
【００３９】
１Ｂ８の薬物動態研究
６匹の健康な正常ラットに、１ｎＭｏｌ（７５μｇ）の蛋白を皮下（ＳＣ、図１６ａ）又は静脈内（ＩＶ、図１６ｂ）より単回投与した。対照ラットは溶媒のみを投与した。サンプルを１０日の期間中、時間間隔を取って取得し、インハウスのＧＨ Ｅｌｉｓａアッセイを用いて１Ｂ８の有無を評価した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾成長成長ホルモン融合蛋白および該蛋白からなる二量体；該タンパクをコードする核酸分子および該タンパクを用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモン（ＧＨ）は、子供の成長および成人の正常な身体構成の上で重要な同化を促進するサイトカインホルモンである。ＧＨ活性の制御は複雑で、いくつもの相互に作用するペプチドやペプチド性作用薬および拮抗薬より構成されている。ＧＨは、成長ホルモン受容体に結合することにより直接その効果を仲介するか、インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の産生を間接的に刺激することで仲介することができる。それ故、ＧＨの主要な役割は、肝臓を刺激してＩＧＦ−１を産生させることである。なおまた、ＧＨの分泌は、対立する活性を有する２つのペプチドホルモンによって制御される。成長ホルモン分泌ホルモン（ＧＨＲＨ）は視床下部の後室周囲核において生産される４４アミノ酸からなるペプチドであり、脳下垂体前葉によるＧＨ産生を刺激するべく機能する。ソマトスタチンはＧＨＲＨの効果を妨害するペプチド性ホルモンであり、これは、より大きなプレプロペプチドから１４および２８アミノ酸からなる型に切断されることで形成される。ソマトスタチンは視床下部の脳室周囲核の神経内分泌細胞により分泌され、脳下垂体前葉と連絡する視床下部・下垂体門脈系に至り、ここでＧＨの分泌を阻害する。
【０００３】
ＧＨは２つの膜結合成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）と順次結合し、この結合は部位１および部位２として表わされるＧＨ上の別の２部位を介してなされる。部位１は抗親和性結合部位であり、部位２は低親和性部位である。１つのＧＨ分子は部位１を介して１つのＧＨＲと結合する。第二のＧＨＲは部位2を介してＧＨＲ：ＧＨ：ＧＨＲ複合体を形成し、この複合体は細胞内部に取り込まれて情報伝達カスケードを活性化し、遺伝子発現に変化を及ぼす。ＧＨＲの細胞外ドメインは、およそ１００アミノ酸からなる２つの連結したドメイン（ＳＤ−１００）、すなわち細胞表面に最も近接したＣ末端ＳＤ−１００領域と、それより遠位にあるＮ末端ＳＤ−１００領域、から構成されている。ＧＨＲがホルモンと結合し、ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲの三量体を形成する際には、これら二つのドメインの高次構造の変化が生じている。
【０００４】
過剰なＧＨは、数々の疾患状態と関係している；例えば、末端肥大症や下垂体性巨人症である。過剰なＧＨというケースのほとんどは、脳下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞における下垂体部腫瘍によるものである。これら腫瘍は悪性ではなく、徐々にＧＨの分泌を増加する。成長ホルモン過剰の兆候としては、顎、指およびつま先の骨の肥厚化、神経／筋への圧力上昇およびインシュリン耐性が挙げられる。ＧＨ過剰に関連する腫瘍に対する本来の治療法としては、下垂体部腫瘍を外科的に除去することである。近年、ＧＨ拮抗剤を用いたＧＨシグナルの阻害が、非侵襲的であるため、より好ましい治療法になりつつある。ＧＨ拮抗剤は、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類縁体（例えば、オクトレオチドやランレオチド）または修飾ＧＨのいずれかであってもよい。
【０００５】
修飾ＧＨ拮抗剤についての総説としては、Ｋｏｐｃｈｉｃｋ（２００３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４８；Ｓ２１−２５があるが、ここには、ペグビゾマントと呼称される商業的に入手可能なＧＨ拮抗剤について記載されており、該ＧＨ拮抗剤は、ヒトＧＨの１２０位をＧにするという修飾と、分子量を増加させるべく、ポリエチレングリコールを付加することが組み合わされている。成長ホルモン投与に関連する問題点としては、腎臓による濾過機能やタンパク分解により、これらが急激に消失する点である。ポリエチレングリコールの付加により、こうした消失は軽減される。しかしながら、ポリエチレングリコール付加はＧＨのＧＨＲに対する親和性も軽減することが知られており、このため、こうした親和性の低下を補うために、高用量の修飾ＧＨを投与する必要が生じ、これにより副作用が誘発される場合がある。低用量で投与しうる修飾ＧＨ拮抗剤を提供することで、ペグビソマントに伴う問題を回避することが望ましい。これは、投与用量の減少または投与頻度の減少のいずれかであってもよい。
【０００６】
我々の同時継続出願ＷＯ０３／０７０７６５において、我々はＧＨの部位１および部位２への修飾を含む修飾ＧＨ融合タンパクについて記載している。これら修飾ＧＨ分子はＧＨＲの細胞外ドメインと連合させている。我々はここに、血清中での半減期が大幅に延長された修飾ＧＨ融合タンパクを開示する。該融合タンパクは、二量体を形成することで、腎臓での除去軽減またはタンパク分解に対する抵抗性のいずれかにより、該タンパクの薬物動態的な改善がなされ得る。該成長ホルモン融合タンパクの薬物動態改善という特徴により、高頻度の投与を必要とせず、望ましくない副作用を軽減するという治療レジメが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０３／０７０７６５号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｏｐｃｈｉｃｋ（２００３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４８；Ｓ２１−２５
【発明の概要】
【０００９】
本発明の態様として、以下から選択される核酸配列を含む核酸分子を提供する：
ｉ）配列番号１に表記される核酸配列；
ｉｉ）配列番号２に表記される核酸配列；
ｉｉｉ）配列番号４に表記される核酸配列：
ｉｖ）配列番号５に表記される核酸配列：
ｖ）配列番号７に表記される核酸配列；
ｖｉ）配列番号８に表記される核酸配列：
ｖｉｉ）配列番号１０に表記される核酸配列：
ｖｉｉｉ）配列番号１１に表記される核酸配列；
ｖｉｉｉｉ）配列番号１３に表記される核酸配列：
ｘ）配列番号１４に表記される核酸配列：
ｘｉ）配列番号１６に表記される核酸配列；
ｘｉｉ）配列番号１７に表記される核酸配列：
ｘｉｉｉ）配列番号１９に表記される核酸配列：
ｘｉｖ）配列番号２０に表記される核酸配列；
ｘｖ）配列番号２２に表記される核酸配列：
ｘｖｉ）配列番号２３に表記される核酸配列：
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２または２３に、限定されたハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、成長ホルモン受容体拮抗剤活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【００１０】
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補する核酸分子が互いにある数の水素結合を伴う場合に生ずる。ハイブリダイゼーションの厳格さは、核酸を囲む環境条件やハイブリダイゼーション方法の性質および使用される核酸分子の組成および長さによって変動しうる。特定の程度の厳格さを達成するために必要なハイブリダイゼーション条件についての計算はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２００１）；およびＴｉｊｓｓｅｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ パート１、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒk，１９９３）において論じられている。Ｔｍは所定の核酸分子ストランドの５０％がこれと相補するストランドとハイブリダイズしている温度である。以下にハイブリダイゼーション条件を例示するが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
超高限定条件（少なくとも９０％の同一性を有する配列がハイブリダイズしうる条件）
ハイブリダイゼーション： ５ｘＳＳＣ、６５℃にて１６時間
洗浄２回： ２ｘＳＳＣ、室温（ＲＴ）にて各１５分
洗浄２回： ０．５ｘＳＳＣ、６５℃にて各２０分
高限定条件（少なくとも８０％の同一性を有する配列がハイブリダイズしうる条件）
ハイブリダイゼーション： ５−６ｘＳＳＣ、６５−７０℃にて１６−２０時間
洗浄２回： ２ｘＳＳＣ、ＲＴにて各５−２０分
洗浄２回： １ｘＳＳＣ、５５−７０℃にて各３０分
低限定条件（少なくとも５０％の同一性を有する配列がハイブリダイズしうる条件）
ハイブリダイゼーション： ６ｘＳＳＣ、ＲＴから５５℃にて１６−２０時間
洗浄最低２回： ２ｘ−３ｘＳＳＣ、ＲＴから５５℃にて各２０−３０分
【００１２】
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号２に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号４に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号５に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号７に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号８に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１０に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１１に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１３に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
【００１３】
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１４に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１６に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１７に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号１９に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号２０に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号２２に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該核酸分子は配列番号２３に表記される核酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の態様として、該発明に基づく核酸によってコードされたポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明の更なる態様として、以下より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する：
ｉ） 配列番号３に表記されるアミノ酸
ｉｉ） 配列番号６に表記されるアミノ酸
ｉｉｉ） 配列番号９に表記されるアミノ酸
ｉｖ） 配列番号１２に表記されるアミノ酸
ｖ） 配列番号１５に表記されるアミノ酸
ｖｉ） 配列番号１８に表記されるアミノ酸
ｖｉｉ） 配列番号２１に表記されるアミノ酸
ｖｉｉｉ） 配列番号２４に表記されるアミノ酸
ｉｘ） 配列番号２５に表記されるアミノ酸
ｘ） 配列番号２６に表記されるアミノ酸
ｘｉ） 配列番号２７に表記されるアミノ酸
ｘｉｉ） 配列番号２８に表記されるアミノ酸
ｘｉｉｉ） 配列番号２９に表記されるアミノ酸
ｘｉｖ） 配列番号３０に表記されるアミノ酸
ｘｖ） 配列番号３１に表記されるアミノ酸
ｘｖｉ） 配列番号３２に表記されるアミノ酸
ここで示したポリペプチドは成長ホルモン受容体拮抗剤活性を有する。
【００１５】
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号３に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号６に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号９に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号１２に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号１５に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号１８に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２１に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２４に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
【００１６】
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２５に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２６に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２７に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２８に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号２９に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号３０に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号３１に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
本発明の好ましい実施例において、該ポリペプチドは配列番号３２に表記されるアミノ酸配列を含む、または、より構成される。
【００１７】
本発明の更なる態様として、配列番号３を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号６を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号９を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号１２を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号１５を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号１８を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２１を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２４を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
【００１８】
本発明の更なる態様として、配列番号２５を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２６を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２７を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２８を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号２９を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号３０を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号３１を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
本発明の更なる態様として、配列番号３２を含む、または、より構成される２つのポリペプチドよりなるホモダイマーを提供する。
【００１９】
本発明の更なる態様として、該発明に基づく核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明の好ましい実施例においては、該ベクターは該発明に基づく核酸分子を発現する様に構築された発現ベクターである。
該発明に基づいた核酸を含むベクターはプロモーターやその他の制御配列を含む必要はなく、特に該ベクターが、安定にトランスフェクションするべく、ゲノムへの組み替えのために細胞に核酸を導入するのに使用される場合が該当する。好ましくは、ベクター中の核酸は、宿主細胞内で、適当なプロモーターまたはその他の転写制御エレメントに実行可能な形で連結されている。該ベクターは、多くの宿主で機能する二機能性の発現ベクターであってもよい。「プロモーター」とは、転写開始部位から上流にある核酸配列であり、転写に必要な全ての制御領域を含んでいるものを意味する。適当なプロモーターとは、真核または原核細胞中での発現における、常時発現、組織特異的、誘導可能、発生時、またはその他のプロモーターを含む。「実施可能な形で連結されている」とは、同一の核酸分子の一部として、該プロモーターから転写が開始されるべく、適切な位置及び向きを有して結合していることを意味する。プロモーターに実施可能な形で連結しているＤＮＡは、該プロモーターの「転写開始制御下に」あることとなる。
好ましい実施例においては、該プロモーターは、常時発現、誘導可能、又は調節可能なプロモーターである。
【００２０】
本発明の更なる態様として、該発明に基づいて、核酸分子、又はベクターによりトランスフェクトした、又は、形質転換した細胞を提供する。
好ましくは、該細胞は真核細胞である。さもなくば、該細胞は原核細胞である。
本発明の好ましい実施例としては、該細胞が、菌細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ），哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）、植物細胞により構成されるグループから選択される。
【００２１】
本発明の更なる態様として、賦形剤又は担体を含めた、該発明に基づいたポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
本発明の好ましい実施例においては、該医薬組成物は更なる治療薬と組み合わせている。
投与時において、本発明の医薬組成物は製薬上容認しうる調製状態で投与される。このような調製は、通常、製薬上容認しうる濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性のある担体、及び随意にその他の治療薬を含んでいてもよい。
本発明の医薬組成物は、注射を含む、いかなる既存の経路によっても投与されうる。このような投与及び塗布は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、口腔内、関節内、皮下、局所（目）、皮膚（例えば、皮膚又は粘膜へのクリーム脂質溶性挿入物）、経皮、又は鼻腔内であってもよい。
【００２２】
本発明の医薬構成物は有効量投与される。「有効量」とは、単独で、又は、更なる用量又は相乗作用のある薬剤を伴うことにより、望まれる反応を生み出す医薬品／組成物の総量のことである。これは、病気進行の一時的な抑制にのみ関与しているのでもよいが、さらに望ましくは、永続的に病気の進行を停止させることに関与する。これは、通常の方法により、又は、診断方法に基づいて、モニターすることができる。
【００２３】
対象に投与される医薬構成物の用量は、異なる要素に従って選択することができ、特に、使用される投与形態や対象の状態（例えば、年齢、性別）に従って選択しうる。投与時に、本発明の医薬構成物は製薬上容認しうる用量や組成にて投与される。薬剤にて使用される際には、塩は製薬上容認しうるものでなければいけないが、製薬上容認し得ない塩を、その製薬上容認しうる塩を調製するために都合よく使用してもよく、該発明の適用範囲から除外はされない。このような薬理上および製薬上容認しうる塩には、以下の酸から調製されるものを含むが、それらに限定されない：塩化水素、臭化水素、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、蟻酸、マロン酸、サクシニル酸、およびその類縁体。また、製薬上容認しうる塩は、ナトリウム、カリウム、又はカルシウム塩のような、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製することもできる。
【００２４】
医薬構成物は、もし望まれるのであれば、製薬上容認しうる担体と組み合わせてもよい。ここで使用されている「製薬上容認しうる担体」とは、１又は２以上の、ヒトへの投与に適した、互換性のある個体又は液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル型物質を意味する。“担体”なる用語は、有機物または無機物からなる、天然又は合成された物質であり、活性のある物質と組み合わせることで、投与を容易にするものである。該医薬組成物の構成要素は、また、本発明の分子及び構成要素相互に混合することが可能であり、これによって、望まれる薬剤としての効力を実質的に減じるような相互作用は生じないものである。
【００２５】
医薬構成物は適当な緩衝剤を含んでいてもよく、これには以下のものが含まれる：酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、およびリン酸塩。
医薬構成物は、また、任意に、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンスおよびチメロサールといった、適当な保存剤を含んでいてもよい。
医薬組成物は、また、簡便のために、単位ごとの剤形になっていてもよく、製薬の当業者に周知のいかなる方法によって調製されてもよい。全ての方法は、活性物質を１または２以上の付属的な成分からなる担体と組み合わせるステップを含んでいる。一般に、該構成物は、活性物質と、液状担体、微細な粉末状の固形担体、またはその両方が、むらなく、緊密に組み合わされることにより調製され、その後、もし必要であれば、製剤として成形される。
【００２６】
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、トローチ剤といった分離した単位であってもよく、これらはそれぞれあらかじめ予定された量の活性化合物を含んでいる。その他の組成物としては、水溶性の液体またはシロップ、エリキシル、又は乳剤といった非水溶性の液体による懸濁物が含まれる。
非経口による投与に適した組成物は、簡便のため、滅菌済みの水溶性、又は非水溶性の調製物を含み、これらは、好ましくは、被投与者の血液と等張である。こうした調製物は、適当な分散剤又は湿潤剤および懸濁化剤を用いた公知の方法に従い、処方されてもよい。滅菌済みの注射可能な調製物は、また、滅菌済みの注射可能な溶液、又は、非毒性の非経口として容認しうる希釈剤又は溶媒、例えば、１，３−ブタンジオール溶液、による懸濁物であってもよい。利用可能な容認しうる溶媒としては、水、リンゲル液、および等張の食塩水がある。これに加えて、滅菌済みの不揮発性油は、従来、溶媒又は懸濁液として使用される。この目的のために、いかなる無菌の不揮発性油を使用してよく、これには合成モノ−又はジ−グリセリドが含まれる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を、注射可能なものに調製するのに使用してもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内等への投与に適当な担体の処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出しうる。
【００２７】
本発明のさらなる態様として、本発明に基づく少なくとも１つのポリペプチドを有効容量投与することを含む、成長ホルモン過剰で苦しむヒト被験者の治療方法を提供する。
本発明の好ましい方法としては、該ポリペプチドを静脈内に投与する。
これに代わる本発明の好ましい方法としては、該ポリペプチドを皮下に投与する。
【００２８】
本発明のさらに好ましい方法としては、該ポリペプチドを毎日、または２日置きに投与し、好ましくは、該ポリペプチドを毎週、隔週、又は毎月投与する。
本発明の好ましい方法としては、該成長ホルモン過剰は末端肥大症を引き起こす。
本発明のさらなる態様として、本発明に基づく少なくとも１つのポリペプチドを有効容量投与することを含む、癌で苦しむヒト被験者の治療方法を提供する。
【００２９】
ここでの使用において、「癌」という用語は、自律的増殖能力を有する細胞、すなわち、急激な細胞増殖によって特徴づけられる異常な状態又は状況を示す。該用語は、組織生理学的類型や侵襲段階に関係なく、あらゆるタイプの癌性の増殖や発癌プロセス、転移組織、又は悪性形質転換細胞、組織又は器官を含むものとする。「癌」なる用語は、様々な臓器系の悪性腫瘍を含み、これには、例えば、肺、乳腺、甲状腺、リンパ系、胃腸、および尿生殖路を冒すものが含まれ、また、ほとんどの大腸癌、腎細胞カルシノーマ、前立腺癌、及び／又は精巣癌、肺の非小細胞カルシノーマ、小腸癌、及び食道癌といった悪性腫瘍を包括する腺癌を含む。「カルシノーマ」という用語は、当分野で認められており、呼吸器系カルシノーマ、胃腸系カルシノーマ、泌尿生殖組織カルシノーマ、精巣カルシノーマ、乳腺カルシノーマ、前立腺カルシノーマ、内分泌系カルシノーマ、及び黒色腫を含む上皮又は内分泌組織の悪性腫瘍を示す。典型的なカルシノーマには、子宮、肺、前立腺、乳腺、頭頚部、大腸、及び卵巣組織から形成されるカルシノーマが含まれる。“カルシノーマ”なる用語は、また、癌肉腫、例えば、癌組織および肉腫組織から構成される悪性腫瘍を含むもの、をも含む。“腺癌”は、腺組織由来のカルシノーマ、言い換えると、腫瘍細胞が認識しうる腺構造を形成しているもの、を指す。“肉腫”という用語は、当分野で認められており、間葉由来の悪性腫瘍を指す。
本発明の好ましい方法において、該癌は前立腺癌である。
【００３０】
本明細書の詳細な説明及び請求の範囲を通じて、「よりなる」及び「含む」及びその派生語、例えば、「含んでいる」や「構成する」という言葉は、「含んでいるが、これに限定されるものではない」という意味であり、その他の部分、追加分、成分、整数又は段階を除外することを意図されておらず、そして除外していない。
本明細書の詳細な説明及び請求の範囲を通して、単数表現は、文脈上、単数に限定することが求められていない限り、複数の場合も包含する。特に、不定冠詞が使われている場合は、該明細書は、文脈上、単数に限定することを求められていない限り、単数のみならず複数をも想定しているものと理解されるべきである。
本発明の特別な態様、実施例又は例と関連して描写される特徴、整数、特性、化合物、化学成分、又はグループは、それと共には両立しえない場合を除いて、ここで記載されているその他のいかなる態様、実施例又は例に応用できるものと理解されるべきである。
【００３１】
本発明の実施例は、以下の図に関連する例により記載されるものである：
表１は１Ｂ８ｖ２画分のＢｒａｄｆｏｒｄ法を示す。
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１ａ １Ｂ８ｖ０：Ｇ４Ｓｘ４リンカーを介してＧＨＲ細胞外（ドメイン１及び２）を結合したＧＨ（サイト１変異を含む）より構成：このコンストラクトはリンカー領域及び３‘末端周辺に制限酵素部位を含んでいる；図１ｂはコード化されたアミノ酸配列である。
【図２】図２ａ １Ｂ８ｖ１：本分子は１Ｂ８ｖ０由来であるが、５‘及び３’末端の外側配列を含まず、Ｇ４Ｓｘ４リンカーを含んでいる；図２ｂはコード化されたアミノ酸配列である。
【図３】図３ａ １Ｂ８ｖ２：本分子は１Ｂ８ｖ０由来であるが、外側配列を含まず、Ｇ４Ｓｘ５リンカーを含んでいる；図３ｂはコード化したアミノ酸配列である。
【図４】図４ａ １Ｂ８ｖ３：本分子は１Ｂ８ｖ０由来であるが、外側配列を含まず、リンカーも含んでいない；図４ｂはコード化したアミノ酸配列である。
【図５】図５ａ １Ｂ８９ｖ０：Ｇ４Ｓｘ４リンカーを介してＧＨＲ細胞外（ドメイン１及び２）を結合したＧＨ（サイト１及びサイト２変異を含む）より構成：このコンストラクトはリンカー領域及び３‘末端周辺に制限酵素部位を含んでいる；図５ｂはコード化されたアミノ酸配列である。
【図６】図６ａ １Ｂ９ｖ１：本分子は１Ｂ９ｖ０由来であるが、５‘及び３’末端の外側配列を含まず、Ｇ４Ｓｘ４リンカーを含んでいる；図６ｂはコード化されたアミノ酸配列である。
【図７】図７ａ １Ｂ９ｖ２：本分子は１Ｂ９ｖ０由来であるが、外側配列を含まず、Ｇ４Ｓｘ５リンカーを含んでいる；図７ｂはコード化したアミノ酸配列である。
【図８】図８ａ １Ｂ９ｖ３：本分子は１Ｂ９ｖ０由来であるが、外側配列を含まず、リンカーも含んでいない；図８ｂはコード化したアミノ酸配列である。
【図９】図９はＧ１２０Ｒ分子を哺乳類発現プラスミドにサブクローニングするための基本的なライゲーションのやり方を図示する。
【図１０】図１０は１Ｂ９ｖ０の構造を図示する。
【図１１】図１１は１Ｂ８ｖ２断片：Ｎａｒ１−Ａｖｒｉｌ（５２４ｂｐ）を図示する。新規なリンカー領域は太字にて示し、制限酵素部位は下腺にて表示する。該断片はｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ１プラスミドに繋がれ、ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ２プラスミドとなる。
【図１２】図１２は１Ｂ９ｖ２断片：Ｎａｒ１−Ａｖｒｉｌ（５２４ｂｐ）を図示する。新規なリンカー領域は太字にて示し、制限酵素部位は下腺にて表示する。該断片はｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ９ｖ１プラスミドに繋がれ、ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ９ｖ２プラスミドとなる。
【図１３】図１３は、安定化ＣＨＯＦｌｐ−Ｉｎ細胞株の細胞培養培地より１Ｂ８ｖ２（レーン１及び２）及び１Ｂ９ｖ２（レーン３）の発現を検出すべく行った、ＧＨ特異的抗体を用いたウエスタンブロットを示す。サンプルは各蛋白に予想される正確なサイズ（〜７５ｋＤａ）であり、分解物の兆候は認められない。
【図１４】図１４は、０．５ｎＭ ｒｈＧＨ存在下で、１Ｂ８ｖ２及び１Ｂ９ｖ２安定化細胞株からの培地サンプルは、共に、ｒｈＧＨ活性を抑制することができることを図示する。０．５ｎＭ ｒｈＧＨ非存在下では、両分子とも生物活性を示さない。ＧＨの標準曲線を示す（０−５ｎＭ）。
【図１５】図１５ａは、ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色による精製蛋白画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。画像は、精製蛋白（１Ｂ８ｖ２）は予想される正確なサイズ（〜７５ｋＤａ）であり、より低分子量の分解産物は認められないことを示している；図１５ｂは１Ｂ９ｖ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１６】図１６ａ 皮下投与後、１Ｂ８血清蛋白レベルは、投与後２４時間でピークに達する。１Ｂ８は投与後１０日においてもまだ検出可能である；図１６ｂ 静脈内投与後、１Ｂ８血清蛋白レベルは、投与後１時間でピークに達し、その後急激に減衰する。
【図１７】図１７ａ 未変性ＰＡＧＥサンプルのウエスタンブロット：１；１Ｂ７ｖ０未変性ＧＨ融合蛋白、２；１Ｂ７ｖ１未変性ＧＨ、３；１Ｂ７ｖ２未変性ＧＨ、４；１Ｂ７ｖ３未変性ＧＨ、５；１Ｂ８修飾ＧＨ融合蛋白。全てのサンプルは、単量体及び二量体形成に特徴的な、明確な二重のバンドを示している；図１７ｂ 対応するｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色ゲルであり、二量体形成を示している。
【図１８】図１８は、ペグビソマント５回投与と１Ｂ８及び１Ｂ９の単回投与比較におけるＮＺ白色ウサギの１２日経過後での％体重増加を図示する。
【図１９】図１９はＮＺ白色ウサギの２５０時間経過における１Ｂ８の薬物動態を図示する。
【００３３】
方法と物質
１Ｂ８拮抗剤分子の構築
該分子は、ＧＨ分子のサイト２（低親和性サイト）中の１２０位グリシンをアルギニンに変異させることにより構築される（Ｇ１２０Ｒ）。該ＧＨ分子の、抗親和性サイト１を介したＧＨ受容体への結合には影響はないが、ＧＨサイト２を介した受容体への結合は、アルギニン分子のかさばる側鎖により阻害される。
【００３４】
ＰＣＲの方法は、Ｇ１２０Ｒ変異を含むＧＨ分子を生産するために以前用いており、適当な制限酵素部位を用いて、該分子をｐＴｒｃ−Ｈｉｓ発現プラスミドにクローニングし、ｐＴｒｃ−Ｈｉｓ−１Ａ７クローンを産生した（Ｇ１２０ＲｗｏＧＨＲ細胞外Ｂドメインに連結）。
３００ｂｐのＢｓｕ３６１−Ｎｏｔ１断片をベクターから切り出し、哺乳類発現プラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ７につなぎ（ＧＨをＧＨＲ細胞外ドメインＡ及びＢに連結）、ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８を生産した（ＧＨ分泌シグナルにより分泌発現は誘導される）。図９参照。
【００３５】
１Ｂ９ｖ０拮抗剤分子の構築
該分子はＧＨ分子のサイト１及びサイト２の両方において、アミノ酸を変異することにより構築される。高親和性サイト１を介したＧＨ分子のＧＨ受容体への結合はこれら変異によって亢進されるが、ＧＨサイト２を介した該受容体との結合は１つのグリシンをアルギニンに置き換えることで阻害される。
単ストランドＤＮＡ特異的変異というやり方が、サイト１及びサイト２での変異を含むＧＨ分子を生産するのに使われた。適当な制限酵素部位を用いて、該分子のＴｒｃ−Ｈｉｓ及びｐＥＴ２１ａ（＋）発現プラスミドへのクローニングを行った。ＰＣＲを用いて、ＧＨシグナル配列（ＧＨｓｓ）を含み、Ｎｈｅ１及びＮｏｔ１サイトを側面に持つクローンを構築した。これを哺乳類発現プラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ０につなぎ（ＧＨをＧＨＲ細胞外ドメインＡ及びＢに連結）、ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ９ｖ０を産生した（ＧＨ分泌シグナルにより分泌発現は誘導される）。図１０参照。
【００３６】
１Ｂ８ｖ０及び１Ｂ９ｖ０の変異体クローンの構築
プラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ７ｖ３は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶを用いて切断され、該断片はプラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ０及び１Ｂ９ｖ０に連結され、プラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ１及び１Ｂ９ｖ１が構築された（これらの分子は３‘末端に外側配列を有していない）。次の段階で、リンカー領域の制限酵素部位は除去され、プラスミドｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ２及び１Ｂ９ｖ２が産生された。これは、人工遺伝子合成を用いて達成され、オリジナルのリンカーはＧ４Ｓｘ５リンカーにより置換された。
以下の断片は、側面に繋がる制限酵素部位、Ｎａｒｌ及びＡｖｒｉｌと共に、人工遺伝子合成により構築され、ｐＧＨｓｅｃＴａｇ−１Ｂ８ｖ１又は１Ｂ９ｖ１のいずれかにつなげられた；図１１及び１２参照。
【００３７】
拮抗剤変異分子の体外での生物活性
各キメラ分子の体外での生物活性を、ＧＨ特異的ルシフェラーゼ受容体アッセイを用いて評価した。基本的に、ヒト由来の細胞株は、安定にヒトＧＨ受容体を遺伝子導入し、一過的にルシフェラーゼシグナルレポーターを導入する。本アッセイはＧＨの生理的レベルを検出する。図１４参照。
【００３８】
拮抗剤分子の精製
分泌産物として１Ｂ８ｖ２及び１Ｂ９ｖ２の両方を発現するＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞株を蛋白不含培地にて培養した。培地を回収、濃縮し、アフィニティー精製前に浄化した。精製のために、２０ｍｌのＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂にｈＧＨに対する５Ｅ１モノクローン抗体を結合したものを調製した。通常は、培地サンプルを１０倍濃縮し、精製前に結合用緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にて１：１に希釈した。
試料をカラムに、流速２ｍｌ／分にてロードした。洗浄後、結合した蛋白を１ｍｌ／分
で２００ｍＭ グリシン、ｐＨ２．７にて溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ９．０にて中和した。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した（図１５ａ及び１５ｂ参照）。図１７ａ及び１７ｂは、未変性の成長ホルモンキメラ蛋白と比較して、１Ｂ９が二量体を形成していることを示している。
【００３９】
１Ｂ８の薬物動態研究
６匹の健康な正常ラットに、１ｎＭｏｌ（７５μｇ）の蛋白を皮下（ＳＣ、図１６ａ）又は静脈内（ＩＶ、図１６ｂ）より単回投与した。対照ラットは溶媒のみを投与した。サンプルを１０日の期間中、時間間隔を取って取得し、インハウスのＧＨ Ｅｌｉｓａアッセイを用いて１Ｂ８の有無を評価した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ｉ）配列番号１に表記される核酸配列；
ｉｉ）配列番号２に表記される核酸配列；
ｉｉｉ）配列番号４に表記される核酸配列；
ｉｖ）配列番号５に表記される核酸配列；
ｖ）配列番号７に表記される核酸配列；
ｖｉ）配列番号８に表記される核酸配列；
ｖｉｉ）配列番号１０に表記される核酸配列；
ｖｉｉｉ）配列番号１１に表記される核酸配列；
ｖｉｉｉｉ）配列番号１３に表記される核酸配列；
ｘ）配列番号１４に表記される核酸配列；
ｘｉ）配列番号１６に表記される核酸配列；
ｘｉｉ）配列番号１７に表記される核酸配列；
ｘｉｉｉ）配列番号１９に表記される核酸配列；
ｘｉｖ）配列番号２０に表記される核酸配列；
ｘｖ）配列番号２２に表記される核酸配列；
ｘｖｉ）配列番号２３に表記される核酸配列；
から選択される核酸配列、または、
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２または２３に、限定されたハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、成長ホルモン受容体拮抗剤活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、を含む核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が配列番号１に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子が配列番号２に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号２に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子が配列番号４に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号４に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が配列番号５に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号５に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子が配列番号７に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号７に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子が配列番号８に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号８に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子が配列番号１０に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１０に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記核酸分子が配列番号１１に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１１に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子が配列番号１３に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１３に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記核酸分子が配列番号１４に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１４に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸分子が配列番号１６に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１６に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記核酸分子が配列番号１７に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１７に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記核酸分子が配列番号１９に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１９に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記核酸分子が配列番号２０に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号２０に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記核酸分子が配列番号２２に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号２２に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記核酸分子が配列番号２３に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号２３に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載される核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項１９】
以下：
ｉ） 配列番号３に表記されるアミノ酸
ｉｉ） 配列番号６に表記されるアミノ酸
ｉｉｉ） 配列番号９に表記されるアミノ酸
ｉｖ） 配列番号１２に表記されるアミノ酸
ｖ） 配列番号１５に表記されるアミノ酸
ｖｉ） 配列番号１８に表記されるアミノ酸
ｖｉｉ） 配列番号２１に表記されるアミノ酸
ｖｉｉｉ） 配列番号２４に表記されるアミノ酸
ｉｘ） 配列番号２５に表記されるアミノ酸
ｘ） 配列番号２６に表記されるアミノ酸
ｘｉ） 配列番号２７に表記されるアミノ酸
ｘｉｉ） 配列番号２８に表記されるアミノ酸
ｘｉｉｉ） 配列番号２９に表記されるアミノ酸
ｘｉｖ） 配列番号３０に表記されるアミノ酸
ｘｖ） 配列番号３１に表記されるアミノ酸
ｘｖｉ） 配列番号３２に表記されるアミノ酸
から選択されるアミノ酸配列を含み、成長ホルモン受容体拮抗剤活性を有するポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが配列番号３に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが配列番号６に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号６に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが配列番号９に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号９に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが配列番号１２に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号１２に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが配列番号１５に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号１５に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが配列番号１８に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号１８に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが配列番号２１に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２１に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが配列番号２４に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２４に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが配列番号２５に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２５に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが配列番号２６に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２６に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが配列番号２７に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２７に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが配列番号２８に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２８に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが配列番号２９に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２９に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが配列番号３０に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３０に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。より構成される請求項１９に記載のポリペプチド
【請求項３４】
前記ポリペプチドが配列番号３１に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３１に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが配列番号３２に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３２に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号３、又は、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、又は、配列番号２１、又は配列番号２４、又は配列番号２５、又は配列番号２６、又は配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、又は、配列番号３０、又は、配列番号３１、又は、配列番号３２を含む、または、配列番号３、又は、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、又は、配列番号２１、又は配列番号２４、又は配列番号２５、又は配列番号２６、又は配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、又は、配列番号３０、又は、配列番号３１、又は、配列番号３２からなる２つのポリペプチドよりなるホモダイマー。
【請求項３７】
請求項１から１７のいずれかに記載される核酸分子を含むベクター。
【請求項３８】
請求項１から１７のいずれかに記載される核酸分子、又は、請求項３７に記載されるベクターによりトランスフェクト又は形質転換された細胞。
【請求項３９】
賦形剤又は担体を含み、請求項１８−３６のいずれかに記載されるポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４０】
前記組成物が更なる治療薬と組み合わされた請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１８から３６のいずれかに記載されるポリペプチドの少なくとも１つを、有効容量投与することからなる、成長ホルモン過剰を患うヒト患者の治療方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが静脈内に投与される請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが皮下に投与される請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが毎日、又は隔日投与される請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが毎週投与される請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが隔週投与される請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが毎月投与される請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記成長ホルモン過剰が末端肥大症を引き起こす請求項４１から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記成長ホルモン過剰が巨人症を引き起こす請求項４１から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
請求項１８から３６のいずれかに記載されるポリペプチドの少なくとも１つを、有効容量投与することからなる、癌を患うヒト患者の治療方法。
【請求項５１】
前記癌が前立腺癌である請求項５０に記載の方法。
【請求項１】
以下：
ｉ）配列番号１に表記される核酸配列；
ｉｉ）配列番号２に表記される核酸配列；
ｉｉｉ）配列番号４に表記される核酸配列；
ｉｖ）配列番号５に表記される核酸配列；
ｖ）配列番号７に表記される核酸配列；
ｖｉ）配列番号８に表記される核酸配列；
ｖｉｉ）配列番号１０に表記される核酸配列；
ｖｉｉｉ）配列番号１１に表記される核酸配列；
ｖｉｉｉｉ）配列番号１３に表記される核酸配列；
ｘ）配列番号１４に表記される核酸配列；
ｘｉ）配列番号１６に表記される核酸配列；
ｘｉｉ）配列番号１７に表記される核酸配列；
ｘｉｉｉ）配列番号１９に表記される核酸配列；
ｘｉｖ）配列番号２０に表記される核酸配列；
ｘｖ）配列番号２２に表記される核酸配列；
ｘｖｉ）配列番号２３に表記される核酸配列；
から選択される核酸配列、または、
ｘｖｉｉ）配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２または２３に、限定されたハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、成長ホルモン受容体拮抗剤活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、を含む核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が配列番号１に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子が配列番号２に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号２に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子が配列番号４に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号４に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が配列番号５に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号５に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子が配列番号７に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号７に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子が配列番号８に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号８に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子が配列番号１０に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１０に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記核酸分子が配列番号１１に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１１に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子が配列番号１３に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１３に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記核酸分子が配列番号１４に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１４に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸分子が配列番号１６に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１６に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記核酸分子が配列番号１７に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１７に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記核酸分子が配列番号１９に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号１９に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記核酸分子が配列番号２０に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号２０に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記核酸分子が配列番号２２に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号２２に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記核酸分子が配列番号２３に表記される核酸配列を含む、又は、配列番号２３に表記される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載される核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項１９】
以下：
ｉ） 配列番号３に表記されるアミノ酸
ｉｉ） 配列番号６に表記されるアミノ酸
ｉｉｉ） 配列番号９に表記されるアミノ酸
ｉｖ） 配列番号１２に表記されるアミノ酸
ｖ） 配列番号１５に表記されるアミノ酸
ｖｉ） 配列番号１８に表記されるアミノ酸
ｖｉｉ） 配列番号２１に表記されるアミノ酸
ｖｉｉｉ） 配列番号２４に表記されるアミノ酸
ｉｘ） 配列番号２５に表記されるアミノ酸
ｘ） 配列番号２６に表記されるアミノ酸
ｘｉ） 配列番号２７に表記されるアミノ酸
ｘｉｉ） 配列番号２８に表記されるアミノ酸
ｘｉｉｉ） 配列番号２９に表記されるアミノ酸
ｘｉｖ） 配列番号３０に表記されるアミノ酸
ｘｖ） 配列番号３１に表記されるアミノ酸
ｘｖｉ） 配列番号３２に表記されるアミノ酸
から選択されるアミノ酸配列を含み、成長ホルモン受容体拮抗剤活性を有するポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが配列番号３に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが配列番号６に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号６に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが配列番号９に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号９に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが配列番号１２に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号１２に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが配列番号１５に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号１５に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが配列番号１８に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号１８に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが配列番号２１に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２１に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが配列番号２４に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２４に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが配列番号２５に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２５に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが配列番号２６に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２６に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが配列番号２７に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２７に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが配列番号２８に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２８に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが配列番号２９に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２９に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが配列番号３０に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３０に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。より構成される請求項１９に記載のポリペプチド
【請求項３４】
前記ポリペプチドが配列番号３１に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３１に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが配列番号３２に表記されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３２に表記されるアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号３、又は、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、又は、配列番号２１、又は配列番号２４、又は配列番号２５、又は配列番号２６、又は配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、又は、配列番号３０、又は、配列番号３１、又は、配列番号３２を含む、または、配列番号３、又は、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、又は、配列番号２１、又は配列番号２４、又は配列番号２５、又は配列番号２６、又は配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、又は、配列番号３０、又は、配列番号３１、又は、配列番号３２からなる２つのポリペプチドよりなるホモダイマー。
【請求項３７】
請求項１から１７のいずれかに記載される核酸分子を含むベクター。
【請求項３８】
請求項１から１７のいずれかに記載される核酸分子、又は、請求項３７に記載されるベクターによりトランスフェクト又は形質転換された細胞。
【請求項３９】
賦形剤又は担体を含み、請求項１８−３６のいずれかに記載されるポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４０】
前記組成物が更なる治療薬と組み合わされた請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１８から３６のいずれかに記載されるポリペプチドの少なくとも１つを、有効容量投与することからなる、成長ホルモン過剰を患うヒト患者の治療方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが静脈内に投与される請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが皮下に投与される請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが毎日、又は隔日投与される請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが毎週投与される請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが隔週投与される請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが毎月投与される請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記成長ホルモン過剰が末端肥大症を引き起こす請求項４１から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記成長ホルモン過剰が巨人症を引き起こす請求項４１から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
請求項１８から３６のいずれかに記載されるポリペプチドの少なくとも１つを、有効容量投与することからなる、癌を患うヒト患者の治療方法。
【請求項５１】
前記癌が前立腺癌である請求項５０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２０１１−５０７４８７（Ｐ２０１１−５０７４８７Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２８４６８（Ｐ２０１０−５２８４６８）
【出願日】平成２０年９月１０日（２００８．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３０５６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４７４７４
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５０２４５２９７８）アステリオン・リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１０日（２００８．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３０５６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４７４７４
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５０２４５２９７８）アステリオン・リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
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