免疫反応性Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチド組成物
【課題】診断およびワクチンに有用な、多数のＨＣＶ単離体（特にこのウイルスの異質性ドメインに関して）と免疫学的に交差反応性であるポリペプチド組成物を提供すること。
【解決手段】少なくとも２つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）アミノ酸配列を含む免疫反応性ポリペプチド組成物であって、各アミノ酸配列が、ＨＣＶエンベロープポリペプチドの可変ドメイン中に存在する少なくとも１つのエピトープを含有し、ここで、該可変ドメインのアミノ酸配列が互いに異質性であり、別個のＨＣＶ単離体由来であり、そして各アミノ酸配列は全長のエンベロープタンパク質より長くない、組成物。
【解決手段】少なくとも２つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）アミノ酸配列を含む免疫反応性ポリペプチド組成物であって、各アミノ酸配列が、ＨＣＶエンベロープポリペプチドの可変ドメイン中に存在する少なくとも１つのエピトープを含有し、ここで、該可変ドメインのアミノ酸配列が互いに異質性であり、別個のＨＣＶ単離体由来であり、そして各アミノ酸配列は全長のエンベロープタンパク質より長くない、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、免疫反応性ポリペプチド組成物、この組成物を免疫学的な適用において用いる方法、ならびにこの組成物を製造するための物質および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルスは、最近では、輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の原因となる主な因子、および集団獲得（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ）ＮＡＮＢＨの重大な原因として同定されている。このウイルスのゲノム配列を得るための物質および方法は、公知である。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０４６６９号、第ＷＯ９０／１１０８９号、および第ＷＯ９０／１４４３６号を参照のこと。
【０００３】
ＨＣＶゲノムの分子的特徴は、約３０１１個のアミノ酸からなるポリタンパク質をコードする約１０,０００個のヌクレオチドを含有する正の極性のＲＮＡ分子であるというこ
とを示す。その証拠となる数種の系は、ＨＣＶがフラビウイルスおよびペスチウイルスを包含するフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルスと同様の遺伝子構成を有することを示唆する。そのペスチウイルスおよびフラビウイルスの系統と同様に、ＨＣＶは、個々のウイルスのタンパク質（構造および非構造の両者）がプロセッシングによって生じる、大きなポリタンパク質前駆体をコードすると考えられる。
【０００４】
ＲＮＡ含有ウイルスは、比較的高い割合の自然変異、すなわち報告によると、組み込まれているヌクレオチドあたりおよそ１０-3から１０-4の割合で自然変異を有する。従って、異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）および遺伝子型の流動率はＲＮＡウイルスでは共通であるので、多様なウイルスの単離体が存在し得る。その単離体は、ＨＣＶ種においてビルレントまたは非ビルレントであり得る。
【０００５】
ＨＣＶの異なる単離体の多くが、現在同定されている。これらの単離体の配列は、ＲＮＡウイルスの限定された異質性の特徴を示す。
【０００６】
単離体ＨＣＶ Ｊ１．１は、以下の刊行物に記載されている：Ｋｕｂｏ、Ｙ．ら（１９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋ．ら（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７−３０３３；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４６２６。
【０００７】
２つの独立した単離体（「ＨＣＶ−Ｊ」および「ＢＫ」）の５’−および３’−末端の配列を加えた完全コード配列は、それぞれ、ＫａｔｏらおよびＴａｋａｍｉｚａｗａらによって記載されている（Ｋａｔｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５２４−９５２８；Ｔａｋａｍｉｚａｗａら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３）。
【０００８】
ＨＣＶ単離体について記載されている他の刊行物は、以下のとおりである：
「ＨＣＶ−１」：Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５；Ｈａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔl．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８８：１７１１−１７１５；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．３１８,２１６。
【０００９】
「ＨＣ−Ｊ１」および「ＨＣ−Ｊ４」：Ｏｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７。
【００１０】
「ＨＣ−１８」、「ＨＣ−２３」、「Ｔｈ」、「ＨＣ−２７」、「ＥＣ１」および「ＥＣ１０」：Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８。
【００１１】
「Ｐｔ−１」、「ＨＣＶ−Ｋ１」および「ＨＣＶ−Ｋ２」：Ｅｎｏｍｏｔｏら、日本においては、２つの主要なタイプのＣ型肝炎がある。Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Iｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ、Ｋａｎａｚａｗａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｊａｐａｎ。
【００１２】
クローン「Ａ」、「Ｃ」、「Ｄ」および「Ｅ」：Ｔｓｕｋｉｙａｍａ Ｋｏｈａｒａら、肝炎ウイルスの第２群、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ。
【００１３】
診断およびワクチンの戦略に対する典型的なアプローチは、保存されたウイルスのドメインに注目することである。しかし、このアプローチは、可変ドメインにおいて存在し得る重要なエピトープを無視するという不利益を生む難点がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
診断およびワクチンに有用なポリペプチド組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的は、多数のＨＣＶ単離体（特にこのウイルスの異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）ドメインに関して）と免疫学的に交差反応性であるポリペプチド組成物を提供することである。
【００１６】
多くの重要なＨＣＶエピトープは、ウイルスの単離体の間では変化し、そしてこれらのエピトープは、特定のドメインに位置づけられ得ることが発見された。この発見は、（保存されたドメインよりもむしろ）可変ドメインに注目する免疫学的に交差反応性のポリペプチド組成物を製造するという戦略を可能にする。
【００１７】
従って、本発明の１実施態様は、ポリペプチドを含む免疫反応性組成物である。ここで、このポリペプチドは、ＨＣＶの第一の可変ドメイン中のエピトープのアミノ酸配列を含有し、そして別個のＨＣＶ単離体の第一の可変ドメイン由来の少なくとも２種の異質性アミノ酸配列が、この組成物中に存在する。
【００１８】
本発明の別の実施態様は、複数の抗原セットを含有する免疫反応性組成物である。ここで、（ａ）各抗原セットは、ＨＣＶ単離体の第一の可変ドメイン中に存在するエピトープのアミノ酸配列を含む複数の実質的に同一のポリペプチドからなり、そして（ｂ）１つのセットのエピトープのアミノ酸配列は、類似の配列を有する少なくとも１つの他のセットのアミノ酸配列に関して異質性である。
【００１９】
本発明の別の実施態様は、複数のポリペプチドを含有する免疫反応性組成物であって、ここで各ポリペプチドは次式を有する：
Ｒr−（ＳＶn）X−Ｒ’r'
ここで、
ＲおよびＲ’は、約１−２０００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、そしてそれらは同一であるかまたは異なり；
ｒおよびｒ’は、０または１であり、そしてそれらは同一であるかまたは異なり；Ｖは、
ＨＣＶ可変ドメインの配列を含有するアミノ酸配列であって、ここで、該可変ドメインは、少なくとも１個のエピトープを含有し；
Ｓは、１以上の整数であり、選択された可変ドメインを表し；そして
ｎは、１以上の整数であり、異なるｎの値を有する少なくとも１種の他の単離体に関して、所定のＳＶで選択された異質性ＨＣＶ単離体を表し、そしてｎは各ｘに対して独立して選択され；
ｘは、１以上の整数であり；そして
ただし、アミノ酸配列は、（ｉ）１Ｖ1および１Ｖ2、（ｉｉ）１Ｖ1および２Ｖ2、および（ｉｉｉ）１Ｖlおよび２Ｖlからなる群から選択される組合せを表す組成物中に存在する。
【００２０】
本発明のさらに別の実施態様は、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を包含する、ＨＣＶの処置のための免疫原性の薬剤組成物を調製する方法である：
（ａ）上記免疫反応性組成物を提供すること；
（ｂ）適切な賦形剤を提供すること；および
（ｃ）哺乳動物へ投与することにより免疫原性の応答を提供する割合で、（ａ）の免疫反応性組成物と（ｂ）の賦形剤とを混合すること。
【００２１】
本発明のさらに別の実施態様は、上記免疫反応性組成物の有効量を哺乳動物に投与することを包含する、抗ＨＣＶ抗体を産生する方法である。
【００２２】
本発明のさらに別の実施態様は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を包含する、生物学的試料中でＨＣＶに対する抗体を検出する方法である：
（ａ）ＨＣＶに対する抗体を含有すると推測される生物学的試料を提供すること；
（ｂ）上記免疫反応性組成物を提供すること；
（ｃ）抗原−抗体複合体が形成されるような条件下で、（ａ）の生物学的試料と（ｂ）の免疫反応性組成物とを反応させること；および
（ｄ）必要に応じて、（ａ）の免疫反応性組成物と（ｂ）の生物学的試料の抗体との間で形成される抗原−抗体複合体の形成を検出すること。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、適切な容器中に入れられた上記免疫反応性組成物を含有する生物学的試料中で、ＨＣＶに対する抗体を検出するためのキットである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の発明によれば、診断およびワクチンに有用な、多数のＨＣＶ単離体（特にこのウイルスの異質性ドメインに関して）と免疫学的に交差反応性であるポリペプチド組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の実施においては、指示されない限り、当該分野の技術範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学における従来の手法が採用される。このような手法は、文献中に詳しく説明されている。例えば、次の文献を参照のこと：Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版，１９８９）；ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＡＮＤ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６）；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ
ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５４およびＶｏ１．１５５（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、およびＷｕ編）、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）；ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｓｃｏｐｅｓ（１９８７）；ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、およびＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６）；ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ（Ｄ．Ｗ．Ｃｈａｎ編，１９８７）。本明細書中で述べられる前述および後述の全ての特許、特許出願および刊行物は、本明細書中に参考として援用されている。
【００２６】
ＨＣＶは、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科の新しいメンバーである。フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科には、ペスチウイルス（ブタコレラウイルスおよびウシウイルス性下痢性ウイルス）およびフラビウイルスが包含される。フラビウイルスの例には、デング熱ウイルスおよび黄熱病ウイルスがある。ＨＣＶの遺伝学的構成の図を図１に示す。フラビウイルスおよびペスチウイルスと同様に、ＨＣＶは、ウイルスのポリタンパク質のＮ末端の基本的なポリペプチドドメイン（「Ｃ」）、続いて２種の糖タンパク質ドメイン（「Ｅ１」，「Ｅ２／ＮＳ１」）を、コードすると考えられ、これらは非構造遺伝子ＮＳ２からＮＳ５の上流にある。この推定タンパク質ドメインのアミノ酸座標を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
上記のように、多数のＨＣＶ単離体が同定されている。完全および部分ＨＣＶ配列の比較配列分析により、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルでの相同性に基づいて、ＨＣＶ単離体が、少なくとも３つの基本群に広く細分され得ることが分かる（表２）。Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（１９９１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １４：３８１−３８８を参照のこと。しかし、ＩＩＩ群における単離体では、部分配列しか得られない。それゆえ、これらの単離体の配列がより明らかになると、これらの１つまたはそれ以上の単離体は、４番目となり得る群を含む別の群に分離されるべきである。表３は、ヌクレオチド配列から推定される種々のＨＣＶ単離体の個々のウイルスタンパク質の間での配列相同性を示す。同じウイルス群のタンパク質は、種々のウイルス群によりコードされる同じタンパク質よりも高い配列類似性を示すと考えられ得る（表３）。これに対する１つの例外は、現在まで全てのＩお
よびＩＩ群のウイルス単離体配列の間で高度に保存されているヌクレオキャプシドタンパク質である。（表３では、記号Ｎ／Ａは、比較により得られなかった配列を示す。）従って、本発明のためには、Ｉ群の単離体は、本明細書中でＩ群として分類される単離体に対して、アミノ酸レベルで約９０％またはそれ以上の相同性であるそれらのウイルスタンパク質、特に、Ｅ１およびＥ２／ＮＳ１タンパク質を有する単離体として定義され得る。ＩＩ群は類似の方法で定義される。それ以上の群については、同様に、始原型単離体に対してウイルスタンパク質の相同性によって定義され得る。下位群はまた、所定のタンパク質、例えば、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１またはＮＳ２タンパク質における相同性により、または単により高い相同性レベルにより定義され得る。
【００２９】
【表２】
【００３０】
【表３】
【００３１】
Ｅ１およびＥ２／ＮＳ１遺伝子によりコードされた推定ウイルスエンベロープタンパク質は、Ｉ群およびＩＩ群の間で実質的なアミノ酸配列の変異を示すことを注目すべきである。Ｃ、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５タンパク質が全て、両群の間でより高い配列保存性を示しているのに対し、ＮＳ２だけがかなりの割合の異質性を示す。Ｉ群およびＩＩ群の間での推定ビリオンエンベロープタンパク質で見られる配列変異により、２つの群間でのアミノ酸の特徴的な区別が可能になる。この例を図２および３に示す。この図２および３では、Ｅ１遺伝子産物の配列がＩ群およびＩＩ群のウイルス間で比較される。ＨＣＶのＩＩ群およびＩＩ群のヌクレオチド配列から推定されたＥ１アミノ酸配列が示される。これらの図では、横線はＨＣＶ−１と配列が同一であることを示す。星印は、アミノ酸の群特異的な区別を示す；群特異的残基は、明確に定義され得る。Ｉ群の配列は、ＨＣＶ−１、ＨＣＴ１８、ＨＣＴ２３、ＨＣＴ２７、およびＨＣ−Ｊ１である。ＩＩ群の配列は、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ Ｊ１．１、およびＢＫである。このようなアミノ酸の群特異的な区別はまた、Ｅ２／ＮＳ１遺伝子によりコードされたｇｐ７２を含む他の遺伝子産物中にも存在する。図４〜６は、Ｉ群とＩＩ群とを区別するＨＣＶ単離体の推定Ｅ２／ＮＳ１領域の比較アミノ酸配列を示す。後者のタンパク質はまた、ほとんどすべての単離体の間の大きな変異を示す約３０個のアミノ酸からなるＮ−末端超可変領域（「ＨＶ」）を含む。Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）上記を参照のこと。この領域は、ＨＣＶ−１のアミノ酸番号付けシステムを用いて、アミノ酸３８４位から４１４位までに生じる。
【００３２】
推定ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２／ＮＳ１は、ペスチウイルス属のｇｐ５３（ＢＶＤＶ）／ｇｐ５５（ブタコレラウイルス）エンベロープポリペプチドおよびフラビウイルス属のＮＳ１に相当し得る。この両ポリペプチドは、これらのポリペプチドでワクチン接種した宿主に防御免疫を与える。
【００３３】
超可変領域（「ＨＶ」）とＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｖ３ドメインとの間での配列変異度に関して著しい類似性、限定された二次構造の欠如、および推定抗体結合に関するアミノ酸変化の予期された効果により、ＨＶドメインが中和抗体をコードしていることが示唆される。
【００３４】
ドメインの免疫原性は、実施例に記載の抗体エピトープマッピング実験により示される。これらの研究の結果により、ＨＣＶの３つの主要群に加え、さらにＨＶ特異的部分群が存在することが示唆される。
【００３５】
ＨＣＶ誘導ＮＡＮＢＨの個体から得た生物学的試料を分析することより、個体は同時に２つまたはそれ以上のＨＣＶ変異体を保有し得ることが示される。２つの共在ＨＶ変異体は、１つの個体Ｊ１の血漿中で見い出された。さらに、肝炎の間欠性発赤になっている慢性ＮＡＮＢＨの個体の遺伝子の部分配列決定により、個体Ｑが２つのＨＣＶ変異体（Ｑ１またはＱ３）に感染していることが示された。各々の変異体は、この疾患の１つのエピソード（ｅｐｉｓｏｄｅ）にのみ関連していた。Ｑ１またはＱ３特異的ペプチド（アミノ酸３９６−４０７位）を用いるＥＬＩＳＡにより、Ｑは、Ｑ１ペプチドに反応する抗体を発生するが、対応するＱ３ペプチドに反応する抗体を発生しないことが示されたので、Ｑの疾患の再発は、ＨＶ変異体の出現のために起こることが示唆された。疾患の第２のエピソードの間、Ｑ１ペプチドに対する抗体は存在するが、Ｑ３ペプチドに対する体液性免疫応答が欠如していることにより、ＨＶドメインの変異が免疫選択の圧力から生じ得ることが示唆される。アミノ酸３９６〜４０７位は、ＨＶドメインにおける最も高い選択圧にかけられて得られたと思われる。これらの発見は、疾患に関連した高レベルの慢性度が、ＨＣＶ感染に対する不適当な免疫宿主応答および／または免疫回避の有効なウイルス機構に依存し得るという説を支持する。さらに、それらは、Ｅ２／ＮＳｌ ＨＶ領域がウイルスエスケープ機構および／または不適当な免疫応答機構に含まれる遺伝子領域であることを示している。
【００３６】
上記のように、ＨＣＶゲノム内にはいくつかの変異領域が存在する。これらの１つまたはそれ以上の領域は、おそらく、ウイルスエスケープ機構および／または不適当な免疫応答機構に含まれる。それゆえ、これらの変異体に対する免疫応答を誘導し得るＨＣＶポリペプチドを処置するための組成物中に含まれることが望ましい。
【００３７】
ゲノムのＥ１およびＥ２／ＮＳ１領域が推定エンベロープ型ポリペプチドをコードしているので、これらの領域は、免疫原性に関して特に重要である。このため、これらの領域は、ＨＣＶ感染に対して個体を防御する免疫応答を誘導および／または増強し、そして感染個体の疾患の慢性的な再発の予防を助けることが特に望ましい領域の中にある。さらに、これらの領域は、感染、さらに重複感染または２つまたはそれ以上の変異体による共感染の経過中に生じるＨＣＶ変異体を検出することが望ましい領域の中にある。
【００３８】
本発明は、ＨＣＶ感染、特に慢性ＨＣＶ感染の予防のために、個体を処置するための組成物および方法を記載している。さらに、本発明は、生物学的試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在を検出するための組成物および方法を記載している。この後者の方法は、免疫学的に異なるＨＣＶエピトープに対する応答で生じる抗ＨＣＶ抗体を同定するのに特に有用である。この方法はまた、感染個体内のＨＣＶの多様な変異体の進化を研究するのに用いられ得る。本発明の考察において、以下の定義が適用される。
【００３９】
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の重合体を意味し、特定の長さの生産物を意味しない。従って、ポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾物、例えば、グリコシル化物、アセチル化物、リン酸化物などを意味しないか、あるいは除外する。この定義に包含されるものは、例えば、アミノ酸（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）の１つかまたはそれ以上の類似体を含むポリペプチド、置換された結合ならびに当該技術分野で公知の天然に存在するおよび天然に存在しない他の改変を有するポリペプチドである。
【００４０】
本明細書中で用いられるように、Ａの重量が、ＡとＢとを合わせた重量の少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％であるとき、ＡはＢから「実質的に単離される」とする。本発明のポリペプチド組成物は、好ましくは、ヒトまたは他の霊長類の組織（これには血液、血清、細胞溶解物、細胞小器官、細胞のタンパク質などが包含される）および細胞培養培地を実質的に含まない。
【００４１】
「組換え体ポリヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、もしくは合成起源のポリヌクレオチドを意味し、その起源もしくは操作によって、（１）このポリヌクレオチドが天然で関連しているポリヌクレオチドの全体もしくは一部分と関連していないもの、（２）このポリヌクレオチドが天然で連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されているもの、または（３）天然に存在しないものを意味する。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さを持ったポリマー形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）である。この用語は、分子の一次構造のみを意味する。従って、この用語には、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡが含まれる。この用語にはまた、既知の型の改変、例えば当該分野において既知の標識、メチル化、「キャップ」、類似体による１つまたはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間の改変、例えば非荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、例えばタンパク質（例えば，ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）のようなペンダント部分を含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート化剤（例えば、金属、放射性金属など）を含むもの、アル
キル化剤を含むもの、修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸など）を有するもの、ならびに未修飾形態のポリヌクレオチドが含まれる。
【００４３】
単細胞因子として培養される微生物もしくは高等真核細胞系を示す「組換え体宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」などの用語は、組換え体ベクターもしくは他の転移ポリヌクレオチドの受容体として使用可能か、または使用されてきた細胞を意味し、トランスフェクトされた元の細胞の後代が含まれる。単一の親細胞の後代は、自然の、偶発的または故意の変異によって、形態、またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補性が元の親細胞と、必らずしも完全に同一でなくてもよい。
【００４４】
「レプリコン」には、例えばプラスミド、染色体、ウイルス、コスミッドなどのあらゆる遺伝的要素であり、それらは細胞内でポリヌクレオチドの複製の自律的な単位として挙動し、すなわち自ら制御しながら複製を行うことができる。
【００４５】
「ベクター」は、オープンリーディングフレームの複製および／または発現を提供する配列をさらに含むレプリコンである。
【００４６】
「制御配列」は、ある種のポリヌクレオチド配列を意味し、この配列が連結しているコード配列を発現させるのに必要なものである。このような制御配列の性質は、宿主の生物によって異なる。このような制御配列としては、原核細胞内では、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターが含まれ、真核細胞内では、一般に、プロモーター、ターミネーター、および場合によってはエンハンサーが含まれる。「制御配列」という用語は、最小限発現に必要なすべての要素を包含し、さらに発現に有利な追加の要素、例えば分泌を制御するリーダー配列を包含し得る。
【００４７】
「プロモーター」は、ＤＮＡテンプレートにＲＮＡポリメラーゼを結合させるコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列であり、その結合は、ｍＲＮＡの製造が、隣接する構造遺伝子の通常の転写開始部位で開始するような方法で行われる。
【００４８】
「作動可能に連結された」と用語は、上記のような要素が、意図した方式で機能し得るような関係に並置されていることを意味する。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列に適合した条件下でこのコード配列の発現が達成されるように、連結される。
【００４９】
「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり、この領域は、コード配列の一部またはコード配列全体を意味する。
【００５０】
「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、ｍＲＮＡに転写され、および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンと、３’末端の翻訳停止コドンとによって決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ（これにはｃＤＮＡが包含される）、および組換え体ポリヌクレオチド配列を包含し得るが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
本明細書中で用いられるように、「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫反応性のアミノ酸配列を意味する。一般的に、エピトープは、少なくとも３〜５個のアミノ酸で構成され、そしてより一般的には少なくとも約８個、またはさらには約１０個のアミノ酸で構成されている。本明細書中で用いられるように、所定のポリペプチドのエピトープは、その所定のポリペプチドにおけるエピトープと同様のアミノ酸配列を有するエピトープ、およびその免疫学的な等価物を意味する。
【００５２】
「抗原」は、１個またはそれ以上のエピトープを含有するポリペプチドである。
【００５３】
「免疫原性」とは、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を誘導する能力を意味する。免疫原性応答は、単独で免疫反応性のポリペプチドによって誘導され得るか、またはアジュバントの存在下または非存在下での担体の存在を必要とし得る。
【００５４】
「免疫反応性」は、（１）抗体および／またはリンパ球抗原リセプターに免疫学的に結合する能力、または（２）免疫原性である能力を意味する。
【００５５】
「抗体」は、特定のエピトープと結合する任意の免疫グロプリンであり、これには免疫グロブリンの抗体およびフラグメントが包含される。この用語は、とりわけ、ポリクローナル、モノクローナル、およびキメラ抗体を包含する。キメラ抗体の例は、米国特許第４,８１６,３９７号および第４,８１６,５６７号で論じられている。
【００５６】
「抗原セット」は、複数の実質的に同一のポリペプチドからなる組成物として定義され、ここでこのポリペプチドは、定義されたエピトープのアミノ酸配列を含む。
【００５７】
「実質的に同一のポリペプチド」とは、ポリペプチドの製造方法（例えば、組換え体発現、化学合成、組織培養など）が原因となる、配列またはサイズの変化の典型的な範囲に限定される変化以外は同一であるポリペプチドを意味する。この変化は、実質的に同一のポリペプチドの組成物（例えば、この組成物は同一のポリペプチドの組成物として免疫学的に作用する）の所望の機能的な性質を改変しない。この変化は、例えば、このポリペプチドの移送の間の分泌過程から、化学合成などにおいて１００％未満の効力を生じる改変によるものであり得る。
【００５８】
本明細書中で用いられるように、ウイルスのタンパク質の「可変ドメイン」または「ＶＤ」は、少なくとも２種のＨＣＶ単離体または亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の間で矛盾がないパターンのアミノ酸の変化を示すドメインである。好ましくは、このドメインは、少なくとも１個のエピトープを含有する。可変ドメインは、１個だけのアミノ酸変化により単離体から単離体へ変化し得る。これらの単離体は、同じまたは異なったＨＣＶ群または亜群に由来し得る。可変ドメインは、単離体中の配列の組成から容易に同定され得、そしてこれらの技法は下記のとおりである。本発明を説明するために、可変ドメインは、図１５〜３２に示されるようにＨＣＶ−１のゲノムによってコードされるポリタンパク質のアミノ酸番号に関して、１位で示されるイニシエーターのメチオニンと共に定義される。別のＨＣＶ単離体における対応の可変ドメインは、任意の可変ドメイン以外の保存ドメインを最大限に整列させる方法で２種の単離体の配列を整列させることにより決定される。これは、いかなる多くのコンピューターのソフトウエアパッケージ（例えば、ＡＬＩＧＮ１．０、これはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ から入手可能である（註：Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ））でなされ得る。Ｐｅａｒｓｏｎらの（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８を参照のこと。特定の可変ドメインによって定められるアミノ酸番号は、幾分主観的であり、かつ選択の問題であることが理解されるべきである。従って、可変ドメインの開始および終止は、他に指示がない限り、近似であり、および、ドメインまたはサブドメインと部分的に重複することを包含することが理解されるべきである。
【００５９】
エピトープは、所定のポリペプチドにおける別のエピトープに免疫学的に結合する抗体と交差反応するとき、その所定のポリペプチドにおけるそのエピトープの「免疫学的等価
物」である。
【００６０】
典型的に、エピトープは、位置づけられ、少なくとも約５個のアミノ酸、時折少なくとも約８個のアミノ酸、およびさらに、約１０個またはそれ以上のアミノ酸を含む。
【００６１】
ＨＣＶエピトープを含むアミノ酸配列は、別のポリペプチド（例えば、担体タンパク質）と、共有結合によってまたは融合ポリヌクレオチドを発現させて融合タンパク質を形成させることによって、そのいずれかにより、連結され得る。所望ならば、アミノ酸配列は、エピトープの多数の繰り返しを挿入し得るかまたは結合し得、および／または種々のエピトープを組み入れ得る。担体タンパク質は、いかなる源からでも誘導され得るが、一般に比較的大きい免疫原性タンパク質、例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨなどである。所望ならば、担体タンパク質は、実質的に完全な長さのＨＣＶタンパク質を担体として使用し得、免疫原性エピトープの数を増やす。あるいは、ＨＣＶエピトープ由来のアミノ酸配列は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端にて、非ＨＣＶアミノ酸配列と連結し得、従って、このポリペプチドは、「融合ポリペプチド」となる。類似型のポリペプチドは、他の所定のウイルスのタンパク質由来のエピトープを用いて、構築され得る。
【００６２】
所定のポリペプチドの「変異体」とは、その所定のポリペプチドのアミノ酸配列が、その配列において１個またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加または転位によって改変されたポリペプチドを意味する。変異体が生じる（例えば、組換えによって）または変異体が作られる（例えば、部位特異性変異誘発）方法は、当該分野において周知である。
【００６３】
「形質転換」とは、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを意味する。なお、挿入法は、どんな方法でもよく、例えば、直接取込み法、形質導入法（これにはウイルス感染が包含される）、ｆ−交配法，またはエレクトロポレーション法がある。外因性ポリヌクレオチドは、組込まれていないベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスのゲノムとして保持されていても、あるいは宿主ゲノムに組込まれていてもよい。
【００６４】
「個体」とは、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを意味し、げっ歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、および霊長類（チンパンジー、アフリカミドリザル、ヒヒ、オランウータン、およびヒト）を包含するが、これに限定されるものではない。
【００６５】
本明細書中で用いられるように、「処置」とは、（ｉ）伝統的なワクチンのような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の低減または排除、および（ｉｉｉ）ウイルスの実質的な排除または完全な排除、のいずれをも意味する。処置は、（感染前に）予防として、または（感染後に）治療として行われ得る。
【００６６】
「有効量」という用語は、投与される個体において免疫原性応答を誘導するか、または意図するシステム（例えば、イムノアッセイ）において別な方法で検出可能に免疫反応を起こすのに充分なエピトープを有するポリペプチドの量を意味する。好ましくは、この有効量は、上記のように処置をするのに充分である。必要な正確な量は、接種により変化する。ワクチン接種のために、またはポリクローナル抗血清／抗体の発生において、例えば、その有効量は、種、年齢、および個体の一般的な症状、処置される症状の重症度、選択される特定のポリペプチドおよび投与様式などに依存して変化する。有効量は、比較的広く、非臨界的な範囲にあることもまた、知られている。適切な有効量は、定型の実験だけを用いて容易に決定され得る。
【００６７】
本明細書中で用いられるように、「生物学的試料」とは、個体から単離された組織または液体の試料をいう。これには、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚と呼吸器
官と腸管と尿生殖器管の外側部分、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官、バイオプシー、およびさらに、インビトロでの細胞培養構成物（これには細胞培養培地で細胞を増殖させて得られる馴化培地、例えば、Ｍａｂ産生ミエローマ細胞、組換え細胞、および細胞成分を包含するが、それに限定されない）の試料を包含するが、それに限定されない。
【００６８】
本発明の免疫反応性ポリペプチド組成物は、少なくとも１種のＨＣＶ ＶＤ由来の単離体特異性エピトープと群特異性エピトープとの混合物を含有する。従って、少なくとも２種の異質性アミノ酸配列がＨＣＶタンパク質中に存在する。この異質性アミノ酸配列は、各々、同一かまたは実質的に同一の物理的な場所に位置する別個のＨＣＶ単離体において見い出されるエピトープを定義する。すなわち、各配列は、ＨＣＶゲノム／ポリペプチド内の同一の場所に位置づけられる。これらの配列は異質性であるので、その場所は可変ドメイン（ＶＤ）として言及される。
【００６９】
本発明をより良く理解するために、第一に、本発明の組成物を作り出す個別のアミノ酸配列を説明する。次いで、本発明の組成物において見い出される複数のこのような配列について論じる。
【００７０】
本発明のポリペプチドを特徴付けるアミノ酸配列は、以下のような基本的な構造を有する：
Ｌy−Ｚ−Ｌ’y' （Ｉ）
Ｚは、選択されたＨＣＶ単離体由来のタンパク質の領域由来のアミノ酸配列を表す。ここで、この領域は、少なくとも１個の可変ドメインを含み、そしてこの可変ドメインは、少なくとも１個のエピトープを含む。ＬおよびＬ’は、非ＨＣＶアミノ酸配列であるかまたは可変ドメインを含まないＨＣＶアミノ酸配列であり、ここで、ＬおよびＬ’は、同一または異なり得る。ｙおよびｙ’は、０または１であり、これらは同一または異なり得る。従って、式１は、ＨＣＶ ＶＤの配列を含むアミノ酸配列を表し、ここで、ＶＤは、エピトープを含む。
【００７１】
上記のように、Ｚにおけるエピトープは、通常、最小約５個のアミノ酸、より典型的には最小約８個のアミノ酸、およびさらに典型的には最小約１０個のアミノ酸を含む。
【００７２】
Ｚの可変ドメインは、１個より多いエピトープを含み得る。
Ｚの可変ドメインは、存在するエピトープの配列を組み合わせたサイズと少なくとも同程度のサイズである。従って、このドメインに、ただ１つのエピトープが存在するならば、このドメインは、典型的には最小約５個のアミノ酸で作られる。エピトープが部分的に重複するとき、この可変ドメインにおける組み合わされたエピトープの最小アミノ酸配列は、その個々のエピトープの配列の合計より小さい。
【００７３】
Ｚは、上記ＶＤを含むＨＣＶ単離体のアミノ酸配列である。従って、Ｚの最小のサイズはＶＤの最小のサイズである。Ｚは、ＶＤだけに比べて多くのＨＣＶのアミノ酸配列を含み、そして１個より多くのＶＤをさらに含み得る。Ｚの最大のサイズは、臨界的ではないが、完全なＨＣＶのポリタンパク質の長さを上回ることは明らかに不可能である。しかし、典型的には、Ｚは、完全なＨＣＶタンパク質（特に、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５）の配列であり、そしてより典型的にはこのようなＨＣＶタンパク質のフラグメントである。従って、Ｚは、好ましくは、最小約５個のアミノ酸（より好ましくは最小約８個または約１０個のアミノ酸）から最大約１１００個のアミノ酸（より好ましくは最大約５００個、さらに好ましくは最大約４００個、またはさらに好ましくは最大約２００個のアミノ酸）の範囲である。より一般的には、式Ｉおよび／またはＺのポリペプチドは、それらが例えば、化学合成により調製されるとき、最大約５０個のアミノ酸、より典型的には最大約４０個のアミノ酸、そしてさらに典型的には最大約３０個の
アミノ酸である。
【００７４】
非ＨＣＶアミノ酸配列、ＬおよびＬ’は、それらがもし存在するならば、多くのタイプのこのような配列のいずれをも構成する。例えば、ＬおよびＬ’は、下記のように、Ｚが組換え体発現を促進するために融合される非ＨＣＶ配列（例えば、β−ガラクトシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インベルターゼ、α−因子、ＴＰＡリーダーなど）を表し得る。あるいは、ＬおよびＬ’は、他の病原体（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、テタヌストキソイド、ジフテリアなど）のエピトープを表して、多くのこれらの他の病原体に免疫反応的に関連する組成物を提供し得る。ＬおよびＬ’は、ペプチド合成の際の固体支持体、イムノアッセイの支持体、ワクチン担体のタンパク質などへの結合を促進するアミノ酸配列であり得る。実際、ＬおよびＬ’は、機能的な利点のない１種またはそれ以上の不必要なアミノ酸をさらに含み得る。ＬまたはＬ’に対する臨界的な最大のサイズはなく、その長さは、一般的に所望の機能によって決定される。典型的に、ＬおよびＬ’は、各々、最大約２０００個のアミノ酸、さらに典型的には最大約１０００個のアミノ酸である。有用な性質を有するＬおよびＬ’配列の多くは、最大約５００個のアミノ酸である。Ｚの免疫反応性をブロックしないようにＬおよびＬ’を選択することは、もちろん望ましい。
【００７５】
本発明に従って提供されるポリペプチドの組成物は、それぞれ以下の式ＩＩおよびＩＩＩよって定義される少なくとも２種のアミノ酸配列の組成物中に、（免疫反応的に有効量で）存在することによって特徴付けらる：
Ｌy−Ｚ1−Ｌ’y ' （ＩＩ）
Ｌy−Ｚ2−Ｌ’y ' （ＩＩＩ）
Ｌ、Ｌ’、ｙおよびｙ’は上記のように定義され、そしてそれらは独立して式ＩＩおよびＩＩＩの各々に対してもまた定義される。ＺlおよびＺ2は、各々、上記でＺについて定義されたようなＨＣＶアミノ酸配列であり、同一の可変ドメイン（すなわち、物理的な場所）を含むが、Ｚ1およびＺ2の共通の可変ドメインにおいて少なくとも１種の異質性エピトープをそれらの間に有する異なるＨＣＶ単離体から誘導される。例示的な実施例として、式ＩＩに従ったアミノ酸配列は、Ｚlとして、単離体ＨＣＶ−１のアミノ酸３８４−４１
４位（またはさらに特定すると３９６−４０７位または３９６−４０８位のアミノ酸）にわたる超可変ドメインのフラグメントを有し、一方、Ｚ2は、単離体ＨＣＶ−Ｊ１．１由
来の類似のフラグメントである。これらの２種の単離体は、このドメインにおいて異質性であり、これらのエピトープのアミノ酸配列は、有意に変化する。
【００７６】
本発明の組成物は、式１に従って丁度２個より多い別個のアミノ酸配列を含み得、そしてＺの配列は異なる可変ドメインを含む群に分割され得ることが理解されるべきである。例えば、本発明に従う組成物は、（式Ｉに従うアミノ酸配列と共に）ＨＣＶ配列の群を含み得る。この配列は、単離体ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ１．１、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４などに由来するアミノ酸３８４−４１１位のところで超可変ドメインを含む。この組成物はまた、（式１に従うアミノ酸と共に）ＨＣＶ配列のさらなる群を含み得る。この配列は、単離体ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ１．１、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４などにさらに由来するアミノ酸２１５−２５５位のところで可変ドメインを含む。従って、本発明の組成物の関係においては、式１の配列は以下のようにさらに定義され得る：
ＳＶn （ＩＶ）
Ｖは、ＨＣＶ可変ドメインの配列を含むアミノ酸配列を表し、ここで、この可変ドメインは、少なくとも１種のエピトープ；すなわち、式１を含む。Ｓおよびｎは、１またはそれ以上の整数である。Ｓは特定の可変ドメインを表し、そしてｎは特定の単離体を表す。例えば、Ｓ＝１はアミノ酸３８４−４１１位における可変ドメインを表し得；Ｓ＝２はアミノ酸２１５−２５５位における可変ドメインを表し得；そしてｎ＝１、２、３および４は、それぞれ、単離体ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ１．１、ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４を表し
得る。従って、上記の２つの群の配列は以下のように表され得る：
群１：１Ｖ1、１Ｖ2、１Ｖ3および１Ｖ4
群２：２Ｖ1、２Ｖ2、２Ｖ3および２Ｖ4 本発明に記載の組成物には、式ＩＶの少なくとも２種の別個の配列がある。すなわち、この組成物は、式ＩＶに従う２種の異なる配列を含有し、ここでＳおよびまたはｎの値は異なる。例えば、少なくとも１Ｖ1お
よび１Ｖ2が存在し、または少なくとも１Ｖlおよび
２Ｖ2が存在し、または少なくとも１Ｖlおよび２Ｖ1が存在する。
【００７７】
式ＩＶ中に含まれる別個の配列は、同一または異なるポリペ
プチド分子のいずれかにおける組成物中に存在する。１Ｖ1および１Ｖ2の最小の組み合わせを用いて、これらの２種の配列は、同一のポリペプチド分子（例えば、１Ｖl−１Ｖ2）または分離した分子中に存在し得る。本発明の組成物のこの特徴は、以下のようなポリペプチドの組成物として記載され得る：
Ｒｒ−（ＳＶn）x−Ｒ’r ' （Ｖ）
ここで、Ｓ、Ｖおよびｎは、上記で定義のとおりであり；ＲおよびＲ’は、約１−２０００個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、そして同一または異なり；ｒおよびｒ’は、０または１であり、そして同一または異なり；ｘは、１以上の整数であり；ｎは、各ｘに対して独立して選択され；ただし、これらのアミノ酸配列は、（ｉ）１Ｖ1および１Ｖ2、（ｉｉ）１ｖ1および２Ｖ2、および（ｉｉｉ）１Ｖ1および２Ｖ1からなる群より選択される組み合わせを表す組成物中に存在する。式ＩＶの別個の配列が異なるポリペプチド内にある実施態様においては、ｘは１であり得るが、所望であるなら１をさらに越え得る；例えば、ポリペプチド１Ｖ1−１Ｖ2と１Ｖl−２Ｖ2との混合物。ｘが１であるとき、ｒおよびｒ’は好ましくは共に０であり、ＬｙおよびＬ’y'の重複を避ける。これは、Ｖが式Ｉによる好ましい実施態様によって記載され得るからである。ｘが１より大きいとき、Ｒとその隣接するＬとを組み合わせた長さ、およびＲ’とその隣接するＬ’とを組み合わせた長さは、好ましくは、ＬおよびＬ’に関して上記の典型的な最大長より長くはない。
【００７８】
この組成物の別個のＶ配列中に含まれるＨＣＶのアミノ酸配列の選択は、この配列の意図する適用に依存し、そして本発明の開示による当業者の範囲内である。第一に、本発明に関するＨＣＶエピトープは、２種のタイプに分かれ得ることが認められるべきである。エピトープの第一のタイプは、「群特異性」であるものであり、すなわち、ＨＣＶ単離体の群中の全てのまたは実質的に全ての単離体における対応のエピトープは、互いに免疫学的に交差反応性であるが、他の群の実質的に全ての単離体の対応するエピトープを有しない。好ましくは、群特異性のクラスにおけるエピトープは、この群内に実質的に保存されるが、この群間またはこの群中には保存されない。エピトープの第二のタイプは、「単離体特異性」であるものであり、すなわち、このエピトープは、実質的に同一の単離体と免疫学的に交差反応し、そして全てのまたは実質的に全ての別個の単離体とは交差反応しない。
【００７９】
これらの群特異性エピトープおよび単離体特異性エピトープは、本発明の開示によって容易に同定され得る。第一に、数種のＨＣＶ単離体の配列が、本明細書中に記載されているように、比較され、そして配列異質性の領域が同定される。通常、異質性のパターンは、群特異性または単離体特異性を示す。同定された領域が１個またはそれ以上のエピトープを含むことが周知であるならば、次いで、所望のエピトープを含むのに充分なサイズの配列は、本発明の組成物に含まれ得る可変ドメインとして選択される。所定の異質性領域の免疫反応性が周知でないならば、種々のＨＣＶ単離体のその領域内に見い出される配列を表すペプチドは、調製され得、そしてスクリーニングされ得る。スクリーニングは含まれ得るが、抗ＨＣＶ抗体の種々の源（例えば、患者の血清、中和化Ｍａｂなど）によるイムノアッセイまたは抗体の発生、およびインビトロでウィルスを中和するためのそのような抗体の能力、に限定されない。あるいは、下記のようなスクリーニングのプロトコール
で同定されるエピトープの遺伝子座は、種々の単離体の異質性およびスクローニングされた対応の異質性配列の免疫学的な性質について試験され得る。
【００８０】
ワクチンの適用には、Ｅ１および／またはＥ２／ＮＳ１ドメイン由来の可変ドメインが、特に重要であると考えられる。特に、アミノ酸２１５−２５５内のＥ１可変ドメイン（図２および３参照）、およびアミノ酸３８４−４１４内のＥ２／ＮＳ１可変ドメイン（図４〜６参照）は、重要な免疫反応性ドメインであるとして同定されている。予備的な証拠により、これらのドメインの片方または両方が、慢性ＨＣＶ感染に通じるエスケープ変異体に反応し得る異質性の遺伝子座であり得ることが示唆される。従って、Ｖの可変ドメインがこれらの可変ドメインの片方または両方であるような、上記のようなポリペプチド組成物は、特に好ましい。さらに、本発明のポリペプチド組成物は、特に可変ドメイン中の一般的な線形エピトープに関連するが、配座エピトープもまた含有し得る。例えば、この組成物は、組換え体系（例えば、昆虫または哺乳動物細胞）で発現される、（異なる単離体の可変ドメインを示す）組換え体Ｅｌおよび／またはＥ２／ＮＳ１タンパク質の混合物を含み得る。この組換え体系は、可変ドメインの内側または外側のいずれかに配座エピトープを維持している。あるいは、配座エピトープを維持する単一の単離体由来のＥ１および／またはＥ２／ＮＳ１サブユニット抗原が、本発明に従って、ポリペプチド組成物と組み合わされ得る（例えば、合成ペプチドまたは変性させた組換え体ポリペプチドの混合物）。ワクチンに対する別の好ましい適用では、本明細書中に記載のポリペプチド組成物を他のＨＣＶサブユニット抗原と組み合わせ得る。例えば、同一人の所有する米国特許出願第
号に記載の抗原である。この出願のタイトルは、Ｒｏｂｅｒｔ Ｏ．Ｒａｌｓｔｏｎ，Ｆｒａｎｋ Ｍａｒｃｕｓ，Ｋｅｎｔ Ｂ．Ｔｈｕｄｉｕｍ，Ｂａｒｂａｒａ ＧｅｒｖａｓｅおよびＪｏｈｎ Ｈａｌｌにより、「Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質」（アトーニィドケット番号０１５４．００２）であって、本願と共に同日で出願しており、本明細書中に参考として援用されている。
【００８１】
診断の適用には、抗原として本発明の組成物を用い、それにより、別個のＨＣＶ単離体に対する抗体を検出する能力を改善するのに有用であり得る。典型的には、このポリペプチド混合物は、均質なまたは不均質なイムノアッセイ形式において直接用いられ得、後者では、好ましくは、ポリペプチドを固体基質（例えば、マイクロタイタープレートウェル、プラスチックビーズ、ニトロセルロースなど）上に固定することを包含する。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０８９；欧州公開公報第３６０,０８８号；ＩＭＭＵＮＯＡ
ＳＳＡＹ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ、上記を参照のこと。あるいは、本発明のポリペプチド組成物を作り出す実質的に同一の各ポリペプチドを別個の遺伝子座で同一の支持体上に固定し得、それにより抗体が産生される単離体または群についての情報が提供される。このことは、種々の単離体が、肝炎、癌、または種々の臨床予後を必要とする他の疾患を引き起こすならば、診断に特に重要である。好ましい形式は、Ｃｈｉｒｏｎ ＲＩＢＡTMストリップイムノアッセイ形式であり、これは、同一人の所有する米国特許出願第０７／１３８,８９４号および米国特許出願第０７／４５６,６３７号に記載されており、その開示内容は本明細書中に参考として援用されている。
【００８２】
本発明の組成物の製造に有用なポリペプチドは、組換えによって、合成によって、または組織培養中で、製造され得る。切形型ＨＣＶ配列または全長ＨＣＶタンパク質を含む組換え体ポリペプチドは、ＨＣＶ配列（１個またはそれ以上のエピトープ、隣接しているかまたは隣接していないかのいずれかである）、または融合タンパク質中の配列から完全に製造され得る。融合タンパク質では、有用な異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）配列は、組換え宿主からの分泌を提供するか、ＨＣＶエピトープの免疫反応性を高めるか、またはポリペプチドの支持体またはワクチン担体への結合を促進する配列を包含する。例えば、欧州公開公報第１１６,２０１号；米国特許第４,７２２８４０号；欧州公開公報第２５９
,１４９号；米国特許第４,６２９,７８３号を参照のこと。これらの開示内容は、本明細
書中に参考として援用されている。
【００８３】
全長ポリペプチド、および切形型ＨＣＶ配列を含むポリペプチド、およびそれらの変異体は、化学合成によって調製され得る。化学合成によってポリペプチドを調製する方法は、当該分野において周知である。それらはまた、組換え技術によっても調製され得る。ＨＣＶ−１をコードするＤＮＡ配列、および他のＨＣＶ単離体由来の可変領域のＤＮＡ配列が、本明細書中に記載および／または参照されている。これらの配列の入手により、ＨＣＶポリペプチドの免疫反応性領域をコードするポリヌクレオチドの構築が可能である。
【００８４】
ＨＣＶの可変ドメイン由来の１個またはそれ以上の免疫反応性ＨＣＶエピトープを含む所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されるか、または単離され、そして発現ベクター中に挿入され得る。このベクターは、β−ガラクトシダーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のような融合配列の部分を含み得るか、または含み得ない。ＳＯＤの融合配列を含むポリペプチドの産生に有用な方法およびベクターは、１９８６年１０月１日に公開された欧州公開公報第０１９６０５６号に記載されている。
【００８５】
所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、融合または成熟形態のどちらであっても、そして分泌を可能にするシグナル配列を含有するかまたは含有しなくても、任意の都合のよい宿主に対して適切な発現ベクター内に連結され得る。次いで、宿主は、発現ベクターで形質転換される。原核宿主細胞系および真核宿主細胞系の両方が、現在、組換え体ポリペプチドを形成するのに用いられており、そしてより一般的な制御系および宿主細胞系の要約を以下に示す。宿主細胞は、所望のポリペプチドを発現させる条件下でインキュベートされる。次いで、このポリペプチドは、溶解細胞または培地から単離され、その意図された用途に必要な程度まで精製する。
【００８６】
ウイルス由来のＨＣＶゲノムの抽出、ＤＮＡライブラリーの調製および探索、クローンの配列決定、発現ベクターの構築、細胞の形質転換、免疫学的アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイ）の実施、培養中の増殖細胞において用いられる一般的な方法は、当該分野において周知である（例えば、上記「背景」の部に引用された文献、および上記のこの「発明の実施態様」の部の初めに引用された文献を参照のこと）。
【００８７】
所望の配列を含むベクターの適切な宿主内への形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する周知のいずれの方法によっても行われ得、この導入方法には、ウイルス中のポリヌクレオチドのパッケージング、および、ウイルスによる、またはポリヌクレオチドの直接取り込みによる宿主細胞の形質導入が包含される。用いられる形質転換の方法は、形質転換される宿主に依存する。直接取り込みによる細菌の形質転換は、一般に、塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理を使用し得る（Ｃｏｈｅｎ（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０）。直接取り込みによる酵母の形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら、（１９７８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１９２９の方法を用いて行われ得る。直接取り込みによる哺乳動物の形質転換は、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ（１９７８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱法、またはその種々の周知の改変法を用いて行われ得る。細胞（特に、哺乳動物細胞）内への組換え体ポリヌクレオチドの導入に対して、当該分野において周知である他の方法は、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、リポソーム中のポリヌクレオチドの被包化、および核内へのポリヌクレオチドの直接マイクロインジェクションを包含する。
【００８８】
所望のコード配列の発現を得るために、宿主細胞は（発現ベクターであり得る）ポリヌクレオチドで形質転換される。このポリヌクレオチドは、所望のコード配列に作動可能に連結された制御配列からなる。この制御配列は、所定の宿主に適合し得る。原核宿主の間では、Ｅ．ｃｏｌｉが最もよく用いられる。原核生物の発現制御配列は、プロモーター、必要に応じて含有されるオペレーター部位、およびリボソーム結合部位を含む。原核宿主に適合し得る転移ベクターは、一般に、例えば、ｐＢＲ３２２（アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含むプラスミド）、および種々のｐＵＣベクター（抗生物質耐性マーカーを付与する配列をまた含む）から得られる。プロモーター配列は、天然に存在する、例えば、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）（Ｗｅｉｓｓｍａｎ（１９８１）Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）中の「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ」）、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら、（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）およびトリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．８：４０５７）、およびλ由来ＰLプロモーター系およびＮ遺伝子リボゾーム
結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）であり得る。さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、１つのプロモーターの転写活性化配列は、他のプロモーターのオペロン配列に結合して、合成ハイブリッドプロモーターを形成し得る（例えば、ｔａｃプロモーター（これは、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターの配列由来である）（Ｄｅ Ｂｏｅｒら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１）。上記の系は、特にＥ．ｃｏｌｉに適合し得る；所望であれば、他の原核宿主（例えば、バチリス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の株が、対応する制御配列で用いられ得る。
【００８９】
真核宿主は、培養系における酵母および哺乳動物細胞を包含する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓは、最も一般的に用いられる酵母宿主であり、そして好都合な菌類宿主である。酵母適合性ベクターは、一般に、栄養要求性突然変異体に原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｙ）を、または野生株に重金属耐性を付与することにより、生育した形質転換体の選別を可能にするマーカーを有する。酵母適合性ベクターは、２ミクロンの複製起点（Ｂｒｏａｃｈら（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：３０７）、ＣＥＮ３およびＡＲＳ１の組合せ、または複製を確実に行うような他の手段（例えば、宿主細胞ゲノムに適切なフラグメントを取り込ませ得る配列）を用い得る。酵母ベクターの制御配列は、当該分野において周知であり、解糖系酵素の合成のプロモーターを含む（Ｈｅｓｓら（１９６８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９）；例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州公開公報第２８４０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−グリセロリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州公開公報第３２９３０３号）。酵母ＰＨ０５遺伝子（これは酸ホスファターゼをコードする）もまた、有用なプロモーター配列を提供する。さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能する。例えば、１つの酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、他の酵母プロモーターの転写活性化領域に連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを創製する。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域に連結したＡＤＨ調節配列（米国特許第４,８７６,１９７号および第４,８８０,７３４号）を包含する。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖系酵素の転写活性化領域と結合したＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨ０５遺伝子のいずれかの制御配列からなるプロモーターであって、プロモーターを包含する（欧州公開公報第１６４５５６号）。さらに、酵母プロモーターは、適当な転写開始のための酵母ＲＮＡポ
リメラーゼに結合する能力を有する、酵母以外の起源の天然に存在するプロモーターを包含する。
【００９０】
酵母発現ベクターに含まれ得る他の制御要素には、ターミネーター（例えば、ＧＡＰＤＨ由来、およびエノラーゼ遺伝子由来（Ｈｏｌｌａｎｄ（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１３８５）、およびリーダー配列がある。リーダー配列フラグメントは、典型的には、細胞からタンパク質を分泌させる疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌酵母タンパク質に対する遺伝子（例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（欧州公開公報第１２,８７３号）およびα
−因子遺伝子（米国特許第４,５８８,６８４号））に由来し得る。あるいは、非酵母起源のリーダー（例えば、インターフェロンリーダー）もまた、酵母における分泌を提供する（欧州公開公報第６００５７号）。分泌リーダーの好ましいクラスは、酵母α−因子遺伝子のフラグメントを使用し、このフラグメントは、「プレ」シグナル配列と「プロ」領域との両方を含んでいる。用いられ得るα−因子フラグメントのタイプは、完全長プレ−プロα−因子リーダー、および不完全α−因子リーダー（米国特許第４,５４６,０８３号および第４,８７０,００８号；欧州公開公報第３２４２７４号）を包含する。分泌を提供するα−因子リーダーフラグメントを用いる別のリーダーは、第２の酵母α−因子由来のプロ−領域ではなく、第１の酵母のプレ配列で作られたハイブリッドα−因子リーダーを包含する（例えば、ＰＣＴ ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
【００９１】
染色体外レプリコンまたは組込みベクターである発現ベクターが、多種の酵母中への形質転換用に開発されている。例えば、発現ベクターは、以下の種に用いるために開発されている；Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｈａｎｚｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７）、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）上記）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４,８３７,１４８号および第４,９２９,５５５号））、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９）。
【００９２】
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当該分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多種の不死化された細胞系、例えばＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、シリアンハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳサル細胞、および多数の他の細胞系を含む。当該分野において、哺乳動物細胞に対して適切なプロモーターが周知であり、それらは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）およびウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）に由来するようなウイルスプロモーターを含む（適切なプロモーターの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）を参照のこと）。哺乳動物細胞は、ターミネーター配列およびポリＡ付加配列を必要とし得；発現を増大するエンハンサー配列をもまた含まれ得、そして、遺伝子の増幅を引き起こす配列もまた望ましくあり得る。これらの配列は、当該分野で周知である。
【００９３】
哺乳動物細胞で複製に適するベクターが、当該分野で周知であり、そして、それらは、ウイルスのレプリコン、または所望のポリペプチドをコードする適切な配列の宿主ゲノム
中への組込みを確実にする配列を含み得る。
【００９４】
外来ＤＮＡの発現に使用され、ワクチン調製において使用され得るベクターは、ワクシニアウイルスである。この場合、異種ＤＮＡがワクシニアゲノム中へ挿入される。ワクシニアウイルスゲノム中へ外来ＤＮＡを挿入する技術は、当該分野で周知であり、例えば相同的組換えを利用する。異種ＤＮＡは、一般的に、選択マーカーの提供も行うチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のような、天然には非必須の遺伝子中に挿入される。組換えウイルスの構築を非常に容易にするプラスミドベクターが、記載されている（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら（１９８４）「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｖｏｌ．ＩＩ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９１頁中、Ｃｈａｋａｒａｂａｒｔｉら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３４０３；Ｍｏｓｓ（１９８７）「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、１０頁）を参照のこと）。次いで、免疫反応性領域を含む所望のポリペプチドの発現が、生存している組換えワクシニアウイルスで感染しおよび／または免疫化された細胞または個体で起こる。
【００９５】
ポリペプチドの発現のための他のシステムは、昆虫細胞およびこれらの細胞中での使用に適切なベクターを含む。これらのシステムは、当該分野で周知であり、例えば、バキュロウイルス Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヘドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現転移ベクターを含む。このベクターは、ヘルパー非依存ウイルス発現ベクターである。このシステムから得られる発現ベクターは、通常、強力なウイルスポリヘドロン遺伝子プロモーターを用いて、異種遺伝子の発現を起こす。現在、ＡｃＮＰＶ中へ外来遺伝子を導入するために最も一般的に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に周知の多種の他のベクターもまた、発現を増進するために設計されている。これらは、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリヘドロン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更し、そして、ＡＴＴから３２塩基対の下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７：３１を参照のこと）を含む。非融合外来タンパク質の良好な発現は、通常、理想的にはＡＴＧ開始シグナルの前方に適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を有する外来遺伝子を必要とする。プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での選択および増殖のために、ポリヘドロンポリアデニル化シグナルおよびアンピリシン抵抗性（ａｍｐ）遺伝子および複製起点をも含む。
【００９６】
異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入する方法は、当該分野で周知である（以下を参照のこと：ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５；Ｊｕら（１９８７）「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）中に記載；Ｓｍｉｔｈら（１９８３）、Ｍｏｌ．＆Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；および、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）上記）。例えば、この挿入は、相同的組換えにより、ポリヘドロン遺伝子のような遺伝子中に行われ得；所望のバキュロウイルス遺伝子中に作られた制限酵素部位中にもまた行われ得る。挿入される配列は、可変ドメイン由来の少なくとも１つのエピトープを含む所望のＨＣＶポリペプチドのすべてのまたは様々のセグメントをコードするものであり得る。
【００９７】
シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化のような、翻訳後改変のためのシグナルは、昆虫細胞により認識されると考えられる。また、分泌および核での蓄積（ｎｕｃｌｅａｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）に必要なシグナルは、無脊椎動物と脊椎動物細胞との間で保存されていると考えられている。無脊椎動物の細胞中で有効な脊椎動物細胞由来のシグナル配列の例は、当該分野で周知である。例えば、昆虫細胞中では
、ヒトインターロイキン２シグナル（ＩＬ２）は、細胞が認識されると外部へ輸送するシグナルとなり、完全に除去される。
【００９８】
上記宿主細胞およびベクターを用いて調製されたポリペプチドは、しばしば、融合ポリペプチドであることが望ましい。非融合ポリペプチドと同様に、融合ポリペプチドは発現後に細胞内に留まり得る。あるいは、融合ポリペプチドが、リーダー配列フラグメントを含む場合、この融合ポリペプチドはまた、細胞から増殖培地中に分泌され得る。好適には、外来遺伝子のリーダーフラグメントと残りの部分との間に、インビボまたはインビトロで切断され得るプロセシング部位がある。
【００９９】
ＨＣＶの処置に組成物が使用される場合、その組成物は免疫原性であることが望ましい。合成ポリペプチドは、正しいエピトープを提供するために正しく構造化されるが、免疫原性になるには小さすぎる場合、ポリペプチドは適切な担体に結合され得る。このような結合を得るための多数の技術が、当該分野で周知であり、これらには、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（ペプチドにスルフヒドリル基がなければ、システイン残基の付加により提供され得る）を用いるジスルフィド結合の形成が含まれる。これらの試薬は、その試薬自身とあるタンパク質中のペプチドシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成し、そして、リジンのε−アミノ基または他のアミノ酸の他の遊離アミノ基によるアミド結合を形成する。このような種々のジスルフィド／アミド−形成剤が知られている。例えば、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．（１９８２）６２：１８５を参照のこと。他の二官能カップリング剤は、ジスルフィド結合よりもむしろチオエーテル結合のためである。これらのチオエーテル形成試薬の多くは、市販で入手可能であり、６−マレイミドヘキサン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルを含む。これらのカルボキシル基は、そのカルボキシル基をコハク酸イミドまたは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸のナトリウム塩と組み合わせることで、活性化され得る。抗原をカップリングするためのさらなる方法には、欧州公開公報第２５９,
１４９号に記載のロタウイルス／「結合ペプチド」システムが用いられる。上記の列挙は、それがすべてであるわけではなく、列挙された化合物の改変物もまた、明らかに使用され得る。
【０１００】
担体としては、宿主に対して有害な抗体の産生をそれ自体が引き起こさなければ、どのような担体でも使用され得る。適切な担体は、典型的には、タンパク質のような大きくて徐々に代謝される高分子；ラテックス機能付与セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどのような多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのような重合アミノ酸；アミノ酸共重合体；および不活性ウイルス粒子（以下を参照のこと）である。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵白アルブミン、テタヌストキシン、および当業者に良く知られた他のタンパク質である。
【０１０１】
ＨＣＶ可変ドメイン（特にＥ１およびＥ２／ＮＳ１）のエピトープの免疫原性は、粒子形成タンパク質（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原に関連するタンパク質）と融合されたまたは組み立てられた真核細胞系において、それらを調製することによっても増強され得る。例えば、米国特許第４,７２２,８４０号を参照のこと。可変ドメイン由来のＨＣＶエピトープを含有するポリペプチドが粒子形成タンパク質コード配列に直接結合する構築物は、ＨＣＶエピトープに関して免疫原性であるハイブリッドを生成する。さらに、調製したすべてのベクターは、例えば、プレ−Ｓペプチドのような種々の程度の免疫原性を有し、ＨＢＶに特異的なエピトープを含む。このように、粒子形成タンパク質から構築され、ＨＣＶ配列を含む粒子は、ＨＣＶおよびＨＢＶに関して免疫原性である。
【０１０２】
肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９８：３４４）、および、例えば哺乳動物細胞（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９８４）「Ｂ型肝炎」Ｍｉｌｌｍａｎ Ｉ．ら編に記載）中で形成され、そして粒子に組み立てられることが示されている。このような粒子の形成は、モノマーサブユニットの免疫原性を増強することが示された。構築物はまた、プレ表面（プレ−Ｓ）領域の５５のアミノ酸を含むＨＢＳＡｇの免疫優性エピトープを含み得る。Ｎｅｕｒａｔｈら（１９８４）。酵母中で発現され得るプレ−Ｓ−ＨＢＳＡｇ粒子の構築物は、欧州公開公報第１７４,４４４号に開示されている；酵母での発現のための異種ウイルス配
列を含むハイブリッドは、欧州公開公報第１７５,２６１号に開示されている。これらの
構築物は、ＳＶ４０−ジヒドロ葉酸還元酵素ベクターを用いて、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞中でも発現され得る（Ｍｉｃｈｅｌｌｅら（１９８４））。
【０１０３】
さらに、粒子形成タンパク質コード配列の一部は、ＨＣＶ可変ドメイン由来のエピトープをコードするコドンで置換され得る。この置換において、酵母または哺乳動物で免疫原性粒子を形成する単位の集合を媒介するのに必要とされない領域が削除され得、このようにして、ＨＣＶエピトープと競合する部分から余分なＨＢＶ抗原部位を除去する。
【０１０４】
活性成分として免疫原性ポリペプチドを含むワクチンの調製は、当業者に公知である。典型的には、このようなワクチンは、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能なように調製される；注射前に、液体に溶解または懸濁させるのに適当な固形物の形態としても調製され得る。この調製物はまた、乳化することも可能であり、すなわち、リポソーム中でカプセル化されたポリペプチドであってもよい。この活性免疫原性成分は、薬学的に受容され得る賦形剤であって、この活性成分と適合し得る賦形剤と混合されることが多い。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。さらに、必要であれば、このワクチンには、少量の補助物質が含まれ得る。この補助物質としては、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効果を増強するアジュバントが挙げられる。効果的なアジュバントの例は、以下を含むが、それだけには限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（（ＣＧＰ １１６３７）、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、およびＲＩＢＩ。ここで、ＲＩＢＩは、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳濁液中に、細菌から抽出される３成分、すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含んでいる。アジュバントの効力は、可変ドメイン由来のＨＣＶエピトープを含む免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定することにより決定され得る。この抗体は、種々のアジュバントもまた含むワクチン中でこのポリペプチドを投与することによって生じる。
【０１０５】
タンパク質は、中性または塩の形態でワクチンに処方され得る。薬学的に受容され得る塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成される）が含まれ、この塩は、無機酸（例えば、塩酸、リン酸）、または有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸など）を用いて形成される。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニア、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）および有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）からも誘導され得る。
【０１０６】
ワクチンは、従来、非経口的に投与され、その形態は、例えば、皮下または筋肉注射で
ある。他の投与形態に適したさらなる処方物には、坐剤があり、場合によっては経口処方物を含む。坐剤には、従来のバインダーおよび担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み得る；このような坐剤は、活性成分を含む混合物から０.
５％〜１０％、好適には１％〜２％の範囲で形成され得る。経口処方物には、通常用いられる賦形剤が含まれており、この賦形剤には、例えば、薬学的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどがある。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方物または粉末の形態をとり、そして１０％〜９５％の、好適には２５％〜７０％の活性成分を含む。
【０１０７】
上記に加えて、ＨＣＶ抗原セットの組換えポリペプチドを発現する弱毒化微生物の生ワクチンを調製することも可能である。適切な弱毒化微生物が、当該分野で周知であり、例えばウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）および細菌を含む。
【０１０８】
ワクチンは、投薬処方と適合する様式で、そして予防効果および／または治療効果が得られる量で投与される。投与されるべき量は、一般的に１回の投与当り抗原５μｇ〜２５０μｇの範囲であるが、処置される個体、この個体の免疫系が抗体を合成する能力、および望まれる保護の程度に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、医師の判断によるものであり、各個体に特有であり得る。
【０１０９】
ワクチンは、１回の投与スケジュールで与えられるか、または好適には複数回の投与スケジュールで与えられ得る。複数投与スケジュールでは、最初のワクチン投与は、１〜１０回に分けて行われ、以後の投与は引続き免疫応答を維持および／または増強するために必要とされる時間間隔で行われ得る。例えば、２回目の投与では１〜４ヵ月で行われ、そして必要であれば数カ月後に引続き投与が行われ得る。投与法は、少なくとも部分的には、個体の必要量よっても決定され、医師の判断による。
【０１１０】
さらに、上述のＨＣＶポリペプチドを含む抗原セットを含むワクチンは、他の免疫制御剤、例えば免疫グロブリンと共に投与され得る。
【０１１１】
本発明の組成物は、個体に投与されて、多数の用途に使用され得る（従来技術を用いて、血清から精製または単離された）ポリクローナル抗体を生成し得る。例えば、ポリクローナル抗体は、個体を受動免疫化することに、または免疫化学試薬として用いられ得る。
【０１１２】
本発明の他の実施態様では、複数のＨＣＶ抗原セットを含む上記の免疫反応性組成物が、例えば血液または血清試料を含む生物学的試料中の抗−ＨＣＶ抗体を検出するために用いられる。イムノアッセイの設計は、変化に富み、多様なものが当該分野で周知である。しかしながら、イムノアッセイは抗原セットを用い、ここで各抗原セットは、ＨＣＶ単離体の第１可変ドメイン中にエピトープのアミノ酸配列を含む複数の実質的に同一のポリペプチドからなり、１セットのアミノ酸配列は、少なくとも１つの他のセットのアミノ酸配列について異質性である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合、または直接反応、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。このプロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得、または免疫沈降法によるものであり得る。ほとんどのアッセイは、標識化抗体またはポリペプチドの使用を含む；この標識は、例えば、蛍光性、化学発光性、放射性、または染料分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた知られている；それらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイのような、酵素標識されそして酵素に介されるイムノアッセイである。
【０１１３】
免疫学的診断に適し、そして適切な標識試薬を含むキットが、可変ドメイン由来のＨＣＶエピトープを含有する本発明の組成物を含む適切な材料を、アッセイの実施に必要とさ
れる残りの試薬および材料（例えば、適当な緩衝液、塩類溶液など）および適当なアッセイの説明書のセットと共に、適当な容器中にパッケージすることで構成される。
【実施例】
【０１１４】
以下の記載は本発明の実施例であり、説明の目的のためにだけ提供するもので、本発明の範囲を限定するものではない。本開示を考えると、特許請求の範囲内で非常に多数の実施例が当業者に明らかである。
【０１１５】
実施例において、以下の材料および方法を用いた。
【０１１６】
（被験体試料およびＲＮＡの抽出）
無症候性のＨＣＶ保菌者であるＨＣＴ１８およびＨＣＶＪ１、および慢性的に感染しているＨＣＶ被験体のＴｈは、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８中に、以前に記載されている。被験体Ｑは、肝臓バイオプシーに基づいて、慢性活性肝炎であると診断され、６ヶ月間、アルファ−２ｂインターフェロン治療を施された（毎週３回、３百万単位）。製造者により示されるように１０μｇ／ｍｌのＭＳ２保菌者ＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，１６５−９４８）を含むＲＮＡｚｏｌTMＢ試薬（Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてＣｈｏｍｃｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９の方法に従い、ＲＮＡを血漿０.２ｍｌから抽出した。ＲＮＡを、蒸留水で処
理したジエチルピロカーボネート２００μｌ中に再懸濁し、そして、最終濃度０.２Ｍの
酢酸ナトリウムおよび２.５倍容量の１００％エタノール（−２０℃）中で再沈澱させた
。
【０１１７】
（ｃＤＮＡおよびポリメラーゼー連鎖反応）
すべての反応を、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ ３３５：１−５に従い実施した。Ｍ１３配列決定は、Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０−３７に従い実施した。少なくとも４つのクローン化挿入フラグメントの共通配列が、２つのクローン由来のＨＣＶ Ｊ１．２ Ｅ２／ＮＳ１配列を除いて与えられた。
【０１１８】
ＨＣＴ１８およびＴｈのクローニングおよび配列決定を、上記のＷｅｉｎｅｒら（１９９１）の報告の通りに行った。被験体ＱのＥ２／ＮＳ１のアミノ末端セグメントおよびカルボキシ近位セグメントをクローニングするために用いた組み込まれたＰＣＲプライマーは以下であった：
【０１１９】
【化１】
【０１２０】
ＨＣＶ Ｊｌ Ｅ２／ＮＳ１遺伝子をクローニングするために用いたＰＣＲプライマーは以下であった：
【０１２１】
【化２】
【０１２２】
＊は、Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４６２６からのｎｔ配列である；＊＊は、Ｋａｔｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｊｐｎ．Ａｃａｄ．６５Ｂ：２１９−２２３からのｎｔ配列である。センス（Ｓ）またはアンチセンス（Ａ）ＰＣＲプライマーを、参考文献中のヌクレオチド番号に従い、５’から３’の向きに示した。
【０１２３】
（ビオチン化ペプチドの合成）
ＨＣＶの３つの株の超可変領域に対する重複オクタペプチド（８ペプチド）を、切断可能なリンカー上で合成し、誘導し、ポリエチレンのピンを、本質的にＭａｅｊｉら（１９
９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３４：２３−３３による記載のように、各ペプチドのＮ−末端にカップリングした。最後に、４０ｍＭのビオチン、４０ｍＭの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、４０ｍＭのべンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ，ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ）および６０ｍＭのＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を含む１５０μｌのジメチルホルムアミド溶液を用いて一晩２０℃で反応させ、ビオチンをＮ−末端にカップリングした。
【０１２４】
ビオチン化の後、ペプチドの側鎖を脱保護し、洗浄し、そして各ピンから得られるペプチドを、２００μｌの０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）中で切断した。切断ペプチド溶液を含むマイクロタイタープレートを、必要とされるまで−２０℃で貯蔵した。
【０１２５】
（ビオチン化ペプチドのＥＬＩＳＡ試験）
ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ ｍａｘｉｓｏｒｂ Ｆ９６）を、一晩４℃で、０.１ｍｌ／ウェルの５μｇ／ｍ１ストレプトアビジン（Ｓｉｇ
ｍａ カタログ番号Ｓ４７６２）溶液と共に、ｐＨ９.６の０.１Ｍ炭酸緩衝液中でインキュベートすることにより、ストレプトアビジンでコートした。ストレプトアビジン溶液除去の後、ウェルを、ＰＢＳ中のＴｗｅｅｎ２０の０.１％溶液で４回洗浄した。ＰＢＳ中
で、０.２ｍｌの２％ＢＳＡと共に１時間２０℃で、各ウェルをインキュベートすること
により、非特異的結合を遮断した。ウェルを、再びＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。プレートを風乾し、要求されるまで、４℃で貯蔵した。各ウェル中のストレプトアビジンを、０.１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に０.１％のＢＳＡを伴う切断ペプチド溶液の１：１００希釈液１００μｌと、２０℃で１時間のインキュベートすることにより、切断されたペプチドにカップリングした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で４回洗浄した。各ウェルを、血清の適切な希釈液（０.１％のア
ジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の２％ＢＳＡで希釈）１００μｌと共に、２０℃で１時間または４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で４回洗浄した。結合した抗体を、コンジュゲート０.１ｍｌ中で、２０℃で１時間反応させることにより検
出した。これは、ＣＡＳＳ（０.１ＭのＰＢＳ中に希釈した０.１％ヒツジ血清、０.１％
Ｔｗｅｅｎ ２０、０.１％ナトリウムカゼイネート、ｐＨ７.２）中の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｋｉｒｋｅ ｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）０.２５ｍｌ／ｌ（飽和レベル）
から構成されていた。ウェルを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で２回洗浄し、引続きＰＢＳだけで２回洗浄した。酵素の存在は、１００ｍｌの０.１Ｍリン酸／０.０８Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４.０中に５０ｍｇのアンモニウム２,２’−アジノ−ビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート（ＡＢＴＳ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ カタログ番号１２２６６１）および０.０３ｍｌの３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素溶液を含
む０.１ｍｌの新たに調製された溶液と、２０℃で４５分間反応させることにより検出し
た。発色を、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＭＣプレートリーダー中で、４９２ｎｍの対照波長に対して４０５ｎｍのデュアル波長モードで測定した。
【０１２６】
（コンピューターで生成された抗原性プロフィール）
ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１タンパク質およびＨＩＶ−１ ｇｐ１２０超可変領域Ｖ３（ａａ３０３−３３８）に対する抗原性プロフィールを、Ｋａｂａｔ［免疫学的に重要なタンパク質の配列、米国厚生省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ
Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、公共保健サービス（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）、国立衛生研究所（１９８３）］により最初に提案されたようにして、配列変異の程度に基づいて、コンピュータープログラムから誘導した。この抗原性プロフィールを用いて、各々の可能な対をなすアミノ酸に対して抗体結合が保持される個々の確率の平均を乗じて免疫グロブリンの超可変ループを同定した。与えられたアミノ酸の変化
に関連する抗体結合の保持の確率は、１０３個の特徴化された線形エピトープに対するすべての可能なアミノ酸置換基の抗体結合における効果を評価することにより、実験的に決定される値であった。Ｇｅｙｓｅｎら（１９８８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃ．１：３２−４１。このようにして、このアルゴリズムは、変異指数に加重価を与え、抗体の結合に大きな影響があると考えられるアミノ酸の変化により重みを与えた。すなわち、保存的なアミノ酸の変化に対して補正を行った。１５のＨＣＶ配列［ＨＣＶ−１，Ｑ３．２，ＨＣＴ２３，ＥＣ１０，ＨＣ−Ｊ１，ＨＣＶＥ１，ＴＨ，ＨＣＴ２７，Ｑ１．２，ＨＣＴ１８，ＨＣ−Ｊ４，ＨＣＶ Ｊ１．２／ＨＣＶ Ｊ１．１，ＨＣＶ Ｊ，ＨＣＶ ＢＫ］をＨＣＶに対する抗原性プロフィールの測定に用いた。ＨＩＶ−１ Ｖ３プロフィールを、ユニークＨＩＶ−１配列のより多数のデータベースからランダムに選択した１５配列の２４２の個プロフィールを平均することで得た。ＬａＲｏｓａら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：９３２−９３５およびＣｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）８１１頁。これらの単離体のいくつかのａａ３８４と４２０との間のアミノ酸配列を図４〜６に示す。
【０１２７】
（コンピューターで生成される２次構造予測）
アミノ末端領域（３８４−４２０）がαヘリックス、βシート、βターン２次構造を含む確率は、３つの上記２次構造特徴のそれぞれに対する確率を、各残基に割り当てるアルゴリズムを用いて決定し得る。アルゴリズムに用いられる係数は、構造データベースの残基のすべての対合様式の組合せに対して得られた。ＬｅｖｉｔｔおよびＧｒｅｅｒ（１９７７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１４：１８１−２９３。これらの係数から得られた予想パラメーターは、与えられた残基が３つの定義された２次構造特徴の１つに見出される確率を得るためにアルゴリズムをデータベースに適応し直して、観察結果と合致させた。
【０１２８】
（実施例１）
（ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶおよびＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ドメインの２次構造およびアミノ酸配列変異の比較）
１５のＨＣＶおよびＨＩＶ−１単離体由来のアミノ酸配列を、ＨＣＶ Ｅ２ ＨＶドメインまたはＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｖ３ドメイン中でアミノ酸配列の異質性が観察された位置の数について比較した（それぞれ、図７、ＡおよびＢ）。アミノ酸の異質性は、Ｅ２ ＨＶ領域では３０のアミノ酸位置のうち２５の位置、そして、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｖ３ドメインでは３５のアミノ酸位置のうち２３の位置で生じていた。図７ＡおよびＢのｘ軸上のダッシュは、可変アミノ酸残基が生じるアミノ酸位置を表し、そして、非変異アミノ酸は１文字のアミノ酸コードで示している。図７中に示された抗原性プロフィールにより、ＨＩＶ−１ ＧＰ１２０タンパク質のＶ３ループ（図７Ｂ）と同様に、ＨＣＶ
Ｅ２中の１ブロックのアミノ酸残基（図７Ａ中のアミノ酸３８４−４１４）において、その変異は抗体結合における予想通りの逆の効果を有することが認められたことが示される。図７中のデータにより、ＨＣＶ Ｅ２ドメインは、ウイルス中和エピトープをコードすることで知られるＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｖ３ドメインと、観察されたアミノ酸変異の程度および期待重みの両方において類似することが示され、Ｅ２ ＨＶドメインは、ｇｐ１２０ Ｖ３ドメインと同様の機能を有し得ることが示唆される。
【０１２９】
線形エピトープは、タンパク質（特にタンパク質の末端）のあまり構造化されていない領域に、または伸長した表面ループに、より関連していると思われる。コンピューター分析を用いて、個々の残基が残基３８４〜４２０間の１５のＥ２
ＨＶアミノ酸配列についての定義された２次構造特徴に関連する確率を予測した。図７から、Ｅ２アミノ末端残基３８４と、非常に期待され顕著に保存されたβターン（残基４１５−４１８）との間の領域は、αヘリックス、βシート、βターンの確率が５０％以下であることから示されるように、比較的構造化されていないことが示される。Ｅ２ ＨＶドメイン中の期待構造の欠如は、単離体間でみられる広範囲の配列変異に対する許容性と
一致し、タンパク質の３次元的折り畳みに寄与する顕著に構造化された領域と対照的である。Ｖ３は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０の主要中和ドメインであり、β鎖−ＩＩ型βターン−β鎖−αヘリックス特徴を含むことが報告されており、アミノ酸の変異において、ＨＣＶ Ｅ２ＨＶドメインよりも強い構造的制限を有し得る。ＨＣＶ Ｅ２ ＨＶドメインは、このＶ３よりも構造化されていないようにさえ見える。まとめると、この事実は、Ｅ２
ＨＶドメインが、線形中和エピトープと考えられる部位を含むタンパク質ドメインに特徴的な特性を有するように思われることを示唆する。
【０１３０】
（実施例２）
（ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメインのエピトープマッピング）
ＨＣＴ１８（Ａ，Ｄ）、Ｔｈ（Ｂ，Ｅ）およびＨＣＶ Ｊ１（Ｃ，Ｆ）のＥ２／ＮＳ１
ＨＶドメイン（アミノ酸３８４〜４１６位）に対応し、そしてそれを越えて伸長する重複ビオチン化８量体ペプチドを、ストレプトアビジンでコートしたプレートに結合し、ＨＣＴ １８（Ａ−Ｃ）またはＴｈ（Ｄ−Ｆ）のいずれかに由来の血漿と反応させた。ＨＣＶ単離体ＨＣＴ １８（図９）、Ｔｈ（図１０）、およびＨＣＶＪ１（図１１）についての結果を図９〜１１に示す。ＨＣＴ １８血漿を１：２００に希釈し、Ｔｈ血漿を１：５００に希釈した。ＨＶＥ−１、−２、−３、−４、および−５は単離体に特異的なエピトープを示す。
【０１３１】
図９〜１１から分かるように、ＨＣＴ １８配列（図９Ａ中のＨＶＥ−Ｉ）から誘導されたペプチドで試験すると、ＨＣＴ１８血漿は線形エピトープ（407ＰＫＱＮＶ411）を同定したが、２つの異なる株ＴｈおよびＨＣＶＪ１のＨＶドメインに対応するペプチドとは反応しなかった（図１０および１１）。対照的に、Ｔｈ血漿は、ＴｈのＨＶドメイン中の線形エピトープＨＶＥ−ＩＶ（409ＱＮＩＱＬＩ414、図１０）を同定し、そして株ＨＣＴ
１８（399ＩＶＲＦＦＡＰ405、図９）およびＨＣＶ Ｊ１中のエピトープをもまた同定した。ＩＶの薬剤の使用者であるＴｈは、ＨＣＶの複数の株に対して感染可能状態に置かれ得た。
【０１３２】
Ｔｈ血漿およびＨＣＴ １８血漿は両方とも、ＥＬＩＳＡにおいて各単離体由来のピン合成された重複８量体ペプチドと共に使用された場合、３つの単離体すべてに共通なエピトープ（アミノ酸４１３−４１９位）とそれぞれ反応した（データを示していない）。
【０１３３】
抗体結合の特異性を確認するために、アミノ酸４０３−４０７位を含むビオテン化ペプチドに結合している抗体を評価し、これを用いて、ＨＣＴ １８血漿の反応性を、ＨＣＴ
１８ＨＶドメインに対する重複８量体を含むピンで遮断した。これらのデータにより、以下のことが示される：１）Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメインが免疫原性であること、２）この領域をマップする複数のエピトープがあること、そして、３）ＨＶドメイン中のエピトープのサブセット（図９〜１１中のＨＶＥ−１、−２、−３、−４または−５）が単離体特異的であること。
【０１３４】
（実施例３）
（可変Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメインが、肝炎の発赤と関連し得ることの決定）
慢性ＨＣＶ感染にしばしば見出される肝炎の間欠性発赤に関連するＨＣＶ変異体を発見する可能性を調べるために、慢性肝炎の被験体Ｑから、約２年間隔の肝炎の２つの別個のエピソード（それぞれ、Ｑ１およびＱ３）の際に得たＥ２／ＮＳ１遺伝子を部分的に配列決定した。肝炎の第２のエピソードは、インターフェロン治療を終了して１年半後に起こった。
【０１３５】
Ｑ１およびＱ３のＥ２／ＮＳ１領域の推定アミノ酸配列の差異は、３９１−４０８の間でだけ著しく異なっており、８つの変化のうち７つをアミノ酸３９８と４０７との間に生
じていた（図１２）。図１２は、Ｑ１およびＱ３単離体のＥ２／ＮＳ１ポリペプチドの２つの領域、つまりアミノ酸３８４−４１４および５４７−６４７の推定アミノ酸配列を示す。Ｑ１配列上のアミノ酸（Ｅ）が、４つのＱ１クローンのうちの１つに見出された。ボックスで囲まれたアミノ酸は、Ｑｌ
ＨＶＥまたはＱ３ ＨＶＥの１２量体ペプチドの位置を表す。Ｑ１とＱ３との間に見出されるアミノ酸配列の相違は、太字で示した。
【０１３６】
Ｑ１およびＱ３のＥ２／ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸５４７と６４７との間では、アミノ酸異質性が１カ所でだけ観察された（図１２）。
【０１３７】
Ｑ１およびＱ３のＥ２ ＨＶドメイン中に観察されるアミノ酸置換の抗体結合における効果を調べるため、アミノ酸３９６から４０７（図１２のＨＶＥＱ１またはＱ３）をもとにＱ１およびＱ３に特異的な１２量体ペプチドを合成し、ＥＬＩＳＡにおいてＱ１およびＱ３の血漿と各ペプチドとを別々に反応させた。図７から、Ｑ１およびＱ３の両血漿中の抗体は、Ｑ１ペプチドと反応したが、Ｑ３ペプチドとは反応しないことが示される。統計解析（スチューデントの検定）により、Ｑ１／Ｑ３血漿のＱ１ペプチドヘの結合は、これらの血漿のランダムに選択された１区画の１２の対照ペプチドに対するバックグラウンド結合を有意に越えている（Ｐ＜０.００１）ことが示されたが、一方Ｑ１またはＱ３の血
漿のＱ３ペプチドヘの結合は、統計上有意ではなかった。このデータは、被験体Ｑは、ＨＣＶ Ｑｌ ＨＶドメインに対する抗体を発生し、この抗体は、２年後のＱ３時点でもまだ検出し得たが、検出し得る体液性応答は、肝炎の第２のエピソードの間に優性であるＱ３ Ｅ２ ＨＶ変異体に対して全く発生されなかったことを示している。
【０１３８】
【表４】
【０１３９】
（実施例４）
（ＨＣＶ感染固体における異なるＥ２／ＮＳ１ ＨＶドメインを伴う共存Ｅ２／ＮＳ１遺伝子の検出）
図１３は、日本人のボランティアの供血者ＨＣＶ Ｊ１の１つの漿試料からクローンニングしたＨＣＶ Ｊ１の２つの単離体（Ｊ１．１およびＪ１．２）から推定されたアミノ酸配列を示す。Ｋｕｂｏら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２。ＨＣＶ Ｊ１．１とＨＣＶ Ｊ１．２との間の全部で２３のアミノ酸の変化のうち、太字で示した９つの相違が、３０のアミノ酸のＥ２／ＮＳ１ＨＶドメインに集中している。Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメイン中の９つのアミノ酸の置換のうち５つは、非保存的アミノ酸変化を表す。ＨＣＶ Ｊ１は、本発明者らの実験室でクローニングされた唯一のＩＩ群ＨＣＶゲノムであるため、これらの相違がＨＣＶ Ｊ１血漿の交叉汚染によるものではないと考えられる。２つの別個のＰＣＲ反応から作製した７つのクローン化配
列から、２つのＥ２／ＮＳｌＨＶ変異体配列だけが同定されたので、ＨＣＶＪ１．２配列は、ＨＣＶＪ１の血液中の少数配列（ｍｉｎｏｒｉｔｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を表す。
【０１４０】
興味深いことに、ＨＣＴ２７単離体およびＨＣＶ Ｅ１単離体は、これらは異なる実験室で配列決定され、おそらく無関係な個体から得られたが、両者を比較することにより、これらの単離体中のＥ２／ＮＳｌＨＶドメイン中のアミノ酸の相違の数が、同一個体由来の単離体の間で観察された相違の数より少ないことが示された（図１４）。
【０１４１】
上記の結果により、個体および個体群中でＨＣＶゲノムが急速に進化しているという示唆が導かれる。
【０１４２】
（実施例５）
（ワクチンの製剤と調製）
（ジフテリアトキソイド担体タンパク質のＭＣＳへのカップリング）
（必要な材料）
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ Ｎａ2・２Ｈ2Ｏ）（ＭＷ ３７２）
６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＣＳ）（Ｓｉｇｍａ）−純度９５％
リン酸二水素一ナトリウム（ＮａＨ2Ｐ０4）
窒素
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
Ｍｉｌｌｉ Ｑ水
５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.６６）
０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）
０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）
コハク酸ナトリウム［（ＣＨ2ＣＯＯＮａ）2・６Ｈ2Ｏ］
システイン
塩酸（２％溶液）
０.１Ｍコハク酸ナトリウム／０.１ ＥＤＴＡ、ｐＨ５.６
精製されたジフテリアトキソイド（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、以下に記載の方法によりＭＣＳにカップリングした：Ｌｅｅら（１９８０）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ１．１７：７４９；Ｐａｒｔｉｓら（１９８３）Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２：２６３；Ｐｅｅｔｅｒｓら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２０：１３３；Ｊｏｎｅｓら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２３：２１１。１００ｍｌのジフテリアトキソイドをＧ２５セファデックスカラム（１７ｃｍ×４ｃｍ）に通し、チオメルサールを除去した。トキソイドを、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）で溶出し、溶出液のタンパク質容量をＢＣＡタンパク質測定法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてアッセイした。得られた溶液を、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０１４３】
１ｍ１のトキソイド溶液を、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）で透析し、次いで２００μｌＤＭＦ中の１.５ｍｇ ＭＣＳの溶液と混合した。得られた溶液を、暗所において
室温で１時間時々撹拝しながらインキュベートした。ＭＣＳトキソイドからカップリングされていないＭＣＳを分離するため、溶液を、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.６６）で平衡化されたセファデックスＰＤ１０カラムに通過させ、タンパク質画分を採集した。
【０１４４】
カップリングされたマレイミド基の担体分子当りの数を、そこにＨＣＶペプチドがカップリングする前に測定した。３０ｍｌのコハク酸／ＥＤＴＡ緩衝液に窒素を２分間吹き込んだ。５ｍｇのシステインを、２５ｍｌメスフラスコ中に移し、最終体積が２５ｍｌであ
る吹き込まれた緩衝液中に溶解した。表５中に示した溶液の分量を、２連で、２５ｍｌスクリューキャップボトルに移した。別々のピペットを用いて、各分量中へ窒素を通気した。次いで各ボトルを密封し、暗所において室温で４０分間時々かきまぜながらインキュベートした。
【０１４５】
【表５】
【０１４６】
＊：３溶液のそれぞれの０.１ｍｌ分量を、エルマンの測定法に用いるために採取した。
【０１４７】
（スルフヒドリルの定量測定のためのエルマン試験）
（必要な材料）
リン酸緩衝液、ｐＨ８.０
１５.６ｇのＮａＨ2ＰＯ4または１２.０ｇのＮａＨ2ＰＯ4無水物を、約７００ｍｌのＭｉｌｌｉ Ｑ水に溶解する。５０％ＮａＯＨを用いてｐＨを８.０に調節する。Ｍｉｌｌ
ｉ Ｑ水を最終体積が１０００ｍｌになるように加え、次いで必要に応じてｐＨを調整する。
エルマン試薬
１０.０ｍｇの５,５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を、２.５ｍｌ
のリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）中に溶解する。
【０１４８】
０.１ｍｌのエルマン試薬を、上記のように調製した溶液、すなわち試料、標準溶液、
およびブランク溶液の０.１ｍｌ分量のそれぞれに加えた。次いで、５ｍｌのリン酸緩衝
液（ｐＨ８.０）を、各分量に加えてよく混合し、１５分間そのままおいた。各分量の吸
光度を１ｃｍ路長のセル中で４１２ｎｍで測定した。
【０１４９】
担体タンパク質上に存在するマレイミド基の数を、次の方法によって測定した。ｍｌ当り０.０１μモルの−ＳＨの溶液は、１ｃｍ光路において４１２ｎｍで０.１３６の吸光度を生じた。標準または試料（Ａ）の吸光度は、活性化担体タンパク質上のカップリングされたマレイミド基と反応したシステインの量と等しかった。１モルの有効な−ＳＨが、１モルのマレイミドと反応するので、試験された分量中に存在するマレイミド基のμモルにおける濃度は、Ａ（０.０１）／０.１３６μモル／ｍｌである。溶液の全体積は、５.２
ｍｌであった。そのため、存在する総μモル数は、Ａ（０.０１）（５.２）／０.１３６
であった。試料溶液は、全体積が１.３ｍｌであり、その内０.３ｍｌが活性化担体タンパク質から構成された。試料溶液中に存在するマレイミド基の量は、Ａ（０.０１）（５.２）（１.３）／（０.１３６）（０.１）（０.３）＝Ａ（１６.５７）μモル／ｍ１である
と計算された。ＭＣＳ活性化担体タンパク質は、−２０℃で貯蔵した。
【０１５０】
（ＨＣＶペプチドの還元）
ＨＣＶペプチドをＭＣＳ活性化担体タンパク質にカップリングする前に、ペプチドを還元し、ペプチド上に存在するチオール基が完全に還元された−ＳＨ形であることを確実にした。
【０１５１】
（必要な材料）
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
炭酸水素アンモニウム（ＮＨ4ＨＣＯ3）
メタノール
ＳＥＰ−ＰＡＫｓ（Ｃ１８カートリッジ、水）、各８ｍｇのペプチドに１カートリッジ
０.1Ｍ炭酸水素アンモニウム緩衝液
１Ｌ Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中に７.９ｇのＮＨ4ＨＣ０3を溶解
緩衝液Ａ、Ｍｉ１１ｉ Ｑ水中、０.１％Ｖ／Ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
緩衝液Ｂ、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中、６０％Ｖ／Ｖアセトニトリル、０.１％Ｖ／ＶＴＦＡ
ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４−４１１および２２５−２６０にそれぞれ対応する２つの各ＨＣＶペプチド１５ｍｇを、１０倍過剰量のＤＴＴを含む２.５ｍ１の０.１Ｍ炭酸水素アンモニウムに加えた。生成した溶液をペプチドが溶解するまで撹拝し、次いで室温で１時間そのままおいた。２対のＳＥＰ−ＰＡＫｓを連結し、約２０ｍｌのメタノール、次いで２０ｍｌの緩衝液Ａを各対のＳＥＰ−ＰＡＫｓに通すことにより活性化した。各ペプチド／ＤＴＴ試料を、ゆっくりと１対のＳＥＰ−ＰＡＫｓに通した。ＤＴＴを２０ｍｌの緩衝液Ａで溶出した。還元されたペプチドを、７ｍｌの緩衝液Ｂで事前に重さを量ったボトル中に溶出し、次いで一晩凍結乾燥した。次いでこのボトルの重さを量り、回収されたポリペプチドの量を測定した。次いで、還元されたペプチドを、ＭＣＳ活性化担体タンパク質に即座にカップリングした。
【０１５２】
（ＨＣＶペプチドのＭＣＳ活生ヒタンパクヘのカップリング）
５ｍＭのＥＤＴＡを伴う約１００ｍ１の０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.６６）を、真空下で脱気し、次いで１０分間窒素を吹き込んだ。ＭＣＳ活性化担体タンパク質の１０ｍｇ／ｍｌ溶液２伽１に、過剰の発泡を防ぐために窒素を注意深く吹き込んだ。各５ｍｇの還元ペプチドを、約０.２ｍｌの脱気され吹き込まれたリン酸／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６.６６）中に溶解し、次いでＭＣＳ活性化担体タンパク質溶液と混合した。得られた混合物を、スクリューキャップボトル中に移し、次いで窒素を充満させ密封した。この溶液を、Ｂｒａｎｓｏｎ ２０００R音波処理バス中に２分間おいてさらに脱気した。このボトルを
、アルミホイルで被い、振とうテーブル上で緩やかに撹拝しながら室温で一晩インキュベートした。
【０１５３】
得られたコンジュゲートは可溶性であり、カップリングされなかったペプチドは、この混合物をリン酸／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６.６６）で平衡化したセファデックスＰＤ１０
カラムに通すことにより除去した。タンパク質画分を採集した。担体タンパク質に結合したペプチドの量を、アミノ酸分析により測定した。
【０１５４】
コンジュゲートおよび担体タンパク質の両方の１５０μ１分量のアミノ酸分析を行った。担体タンパク質だけの寄与によるアミノ酸のレベルの平均割合を測定し、生成した結合ペプチドの量を計算した。セリン、スレオニン、トリプトファン、メチオニン、チロシンおよびシステインは、標準加水分解条件下で改変されるので、これらのアミノ酸のレベルは、測定されなかった。これらの計算で得られた典型的な結果を、表６中に示す。
【０１５５】
【表６】
【０１５６】
コンジュゲートの太字の値は、ペプチド中にも存在していたアミノ酸である。アラニンおよびプロリンを含むコンジュゲートについては、結果を標準化するために、因子（１９３＋１７９＋１８０＋５６）／（２１２）＋１９４＋１５３＋６０＝０.８６５９に、ア
ミノ酸レベルの量を掛けてある。
【０１５７】
（ワクチン組成物の調製）
注射組成物は、上記のように調製されたＭＣＳ活性化ジフテリアトキソイド担体タンパク質に結合したＨＣＶペプチド、および本明細書中に参考として援用された１９９０年１２月１３日に公開されたＰＣＴ国際公開番号第Ｗ０９０４８３７号に記載のサブミクロンの水中油乳化型アジュバントを構成成分とした。さらに、ＨＣＶ結合ペプチドおよびアジュバントに加え、免疫賦活剤である親油性ムラミルペプチド（ＭＴＰ−ＰＥ、ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む注射組成物を調製した。ワクチン組成物は、一般的に５０％のタンパク質および５％の免疫賦活剤から構成された。
【０１５８】
（ＭＴＰ−ＰＥを含むワクチン組成物の処方）
注射ワクチン組成物１０ｍｌの調製：
２.５ｍｌのスクアレン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
Ｍｏ．）
０.２５ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）
０.２５ｍｌ ＳＰＡＮ ８５（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）
１０００μｇ ＭＴＰ−ＰＥ
１０００μｇ ＭＣＳ−活性化ジフテリアトキソイド担体タンパク質に結合したＨＣＶペプチド
（ＭＴＰ−ＰＥを含まないワクチン組成物の処方箋）
注射ワクチン組成物１０ｍｌの調製：
２.５ｍｌのスクアレン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
Ｍｏ．）
０.２５ｍｌ Ｔｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）
０.２５ｍｌ ＳＰＡＮ ８５（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）
１０００μｇ ＭＣＳ−活性化ジフテリアトキソイド担体タンパク質に結合したＨＣＶペプチド
（実施例６）
（ワクチン調製物の毒性についての試験方法）
実施例５の方法により調製したワクチンを、毒性について小動物で試験した。１ｋｇ当り５０μｇのワクチンを、モルモット、マウスおよびウサギに腹腔内注射して投与した。
アカゲザルおよび霊長類にも、腹腔内注射によりワクチンを投与した。アカゲザルおよび霊長類の試験個体群の半数には、５μｇ／ｋｇで投与したが、一方他の半数には、５０μｇ／ｋｇで投与した。各研究で用いた対照動物には、ウイルスペプチドを含まないワクチン調製物の成分からなる同等量の組成物を注射した。
【０１５９】
実施例５の方法により調製したワクチンを、毒性について小動物で試験した。１ｋｇ当り５０μｇのワクチンを、モルモット、マウスおよびウサギに腹腔内注射して投与した。アカゲザルおよび霊長類にも、腹腔内注射によりワクチンを投与した。アカゲザルおよび霊長類の試験個体群の半数には、５μｇ／ｋｇで投与したが、一方他の半数には、５０μｇ／ｋｇで投与した。各研究で用いた対照動物には、ウイルスペプチドを含まないワクチン調製物の成分からなる同等量の組成物を注射した。
【０１６０】
（実施例７）
（ワクチンにおける投与動物における中和抗体の産生の証明）
実施例５の方法により調製したワクチンを、ワクチン投与した被験体におけるウイルス中和抗体の産生を誘起するワクチンの効果を測定するために、チンパンジーで試験した。チンパンジーに、実施例５の方法により調製したワクチンを５μｇ／ｋｇの投与量で、６ヵ月の期間にわたり０、１、３、および６カ月の間隔をおいて投与した。対照のチンパンジーには、ウイルスペプチドを含まないワクチンの成分からなる同等量の組成物を注射した。最後のワクチン投与を行ってから２週間後、試験および対照の各チンパンジーに、１０ ＣＩＵ50（チンパンジー感染単位）の投与量のＣＤＣ／９１０血漿接種材料で刺激した。ウイルス刺激の１週間後から始めて、各チンパンジーを、ウイルス血症について毎週ベースでモニターした。
【０１６１】
ウイルス血症を検出するために、血液試料および肝臓バイオプシー標本を、数ヵ月間毎週ベースで、対照および試験動物から採取した。肝臓バイオプシーにより採取された組織を、壊死および／または炎症の徴候について組織学的に検査した。さらに、バイオプシー材料由来の肝細胞を、ＨＣＶ感染に特有の細管の存在について電子顕微鏡で検査した。血液試料はまた、ワクチンの調製に使用されなかったウイルスポリペプチドのセグメントに対する抗体の存在について、上記のＥＬＩＳＡアッセイによっても分析された。特に、各血液試料を、ＮＳ3、ＮＳ4、およびＮＳ5ペプチドに対する抗体の存在について、ＥＬＩ
ＳＡによりスクリーニングした。チンパンジーの血清中におけるこれらのペプチドに対する抗体の存在は、ＨＣＶ感染を示した。
【０１６２】
以下の方法を用いて、チンパンジーから採取した血漿中に循環するまたは肝臓バイオプシー組織中に存在するウイルスＲＮＡを検出した。
【０１６３】
（肝臓および血清中のＨＣＶ ＲＮＡを検出するｃＰＣＲ法）
ｃＰＣＲアッセイにおいて、試料中の推定ウイルスＲＮＡを、逆転写酵素でｃＤＮＡに逆転写し、次いで、得られたｃＤＮＡのセグメントを、Ｓａｉｋｉら（１９８６）により記載のＰＣＲ技術の改変法を用いて増幅する。ｃＰＣＲ法に用いるプライマーは、ＨＣＶ
ＲＮＡから誘導する。これは本明細書で提供されるＨＣＶ ｃＤＮＡのファミリーにより同定され得る。ＨＣＶ−ＲＮＡに対応する増幅生成物を、本明細書で提供されるＨＣＶ
ｃＤＮＡのファミリーから誘導されるプローブを使用して検出する。
【０１６４】
これらの研究に用いたｃＰＣＲ／ＨＣＶアッセイは、ＲＮＡの調製、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写、ＰＣＲによるｃＤＮＡの特異的セグメントの増幅、およびＰＣＲ生成物の分析のための以下の方法を使用して実施した。
【０１６５】
全ＲＮＡを調製するために、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載のグアニジウムイ
ソチオシアネート法を使用して、ＲＮＡを肝臓から抽出した。
【０１６６】
全ＲＮＡを血漿から単離するために、血漿をＴＥＮＢ（０.１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ
トリス−ＨＣ１（ｐＨ８.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で５〜１０倍に希釈し、そして、プ
ロティナーゼＫ／ＳＤＳ溶液（０.５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、２０マ
イクログラム／ｍｌポリＡ担体）中で６０〜９０分間３７℃でインキュベートした。試料を、フェノール（ｐＨ６.５）で１回抽出し、得られた有機相を０.１％ＳＤＳ含有ＴＥＮＢで再び１回抽出し、そして、両抽出の水相をプールして、同体積のフェノール／ＣＨＣｌ3／イソアミルアルコール［１：１（９９：１）］で２回抽出した。得られた水相を、
同体積のＣＨＣｌ3／イソアミルアルコール（９９：１）で２回抽出し、そして、０.２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６.５）、および２.５倍容量の１００％エタノールを用いてエタノール沈澱した；沈澱は、−２０℃で一晩行った。
【０１６７】
ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用したｃＤＮＡは、対応するｃＤＮＡの調製のために選抜された試料を使用して調製した。各ＲＮＡ試料（２マイクログラムのチンパンジー肝臓の熱変性全ＲＮＡまたは２マイクロリットルの血漿から得たＲＮＡを含む）を、１マイクロモルの各プライマー、１ミリリットルの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５ミリモルのＭｇＣｌ2、５ミリモルのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、７３ミリモルのＫＣｌ、４０単位のＲＮアーゼインヒビター（ＲＮＡＳＩＮ）、および５単位のＡＭＶ逆転写酵素を含む２５マイクロリットル反応物中でインキュベートした。このインキュベーションは、３７℃で６０分間行った。ｃＤＮＡ合成に続いて、反応物を５０マイクロリットルの脱イオン水（ＤＩＷ）で希釈し、１０分間沸騰し、氷上で冷却した。
【０１６８】
ＨＣＶ ｃＤＮＡのセグメントの増幅は、それらの配列がＨＣＶ ｃＤＮＡクローン３６（アンチ−センス）および３７ｂ（センス）から誘導される２つの合成オリゴマー１６量体プライマーを使用して実施した。クローン３６由来のプライマーの配列は以下であった：
【０１６９】
【化３】
【０１７０】
クローン３７ｂ由来のプライマーの配列は以下であった：
【０１７１】
【化４】
【０１７２】
各プライマーは、最終濃度１マイクロモルで用いた。プライマーに隣接するＨＣＶ ｃＤＮＡのセグメントを増幅するために、ｃＤＮＡ試料を、０.１マイクログラムのＲＮア
ーゼＡおよびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＰＣＲキット（Ｎ８０１−００４３またはＮ８０１−００５５）のＰＣＲ反応物を用いて、製造者の指示に従ってインキュベートした。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ熱サイクラーで、３０サイクルまたは６０サイクルいずれかで実施した。各サイクルは、９４℃１分での変性段階、３７℃２分でのアニーリング段階、および７２℃３分での伸長段階で構成された。しかしながら、最終サイクル（３０または６０）における伸長段階は、３分ではなく７分であった。増幅後、試料を同体積のフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出
し、次いで同体積のクロロホルムで抽出し、次いで試料を０.２Ｍの酢酸ナトリウム含有
エタノールで沈澱させた。
【０１７３】
ｃＰＣＲ生成物を、次のようにして分析した。生成物を、Ｍｕｒａｋａｗａら（１９８８）に従って１.８％アルカリ性アガロースゲル電気泳動にかけ、そして、０.４ＭのＮａＯＨ中でゲルを一晩ブロッティングすることにより、ＺＥＴＡTMＰｒｏｂｅ紙（ＢｉｏＲａｄ Ｃｏｒｐ．）上に移した。ブロットを、２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０.１５Ｍ
ＮａＣｌ、０.０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）中で中和し、０.３ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.８、１５ｍＭのＥＤＴＡ、１.０％のＳＤＳ、０.
５％の脱脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ Ｃｏ．）、および０.５ｍｇ／ｍｌの超音波処理さ
れ変性されたサケ精子ＤＮＡ中でプレハイブリダイズした。ＨＣＶｃＤＮＡフラグメントについて分析すべきブロットを、米国出願番号０７／４５６,６３７に記載のクローン３
５のＨＣＶ ｃＤＮＡ挿入配列のニックトランスレーションにより生成された32標識化プローブに、ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、ブロットを１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０１Ｍのクエン酸ナトリウム）中で６５℃で洗浄し、乾燥し、そしてオートラジオグラフを記録した。生成物の期待サイズは、５８６ヌクレオチド長である；プローブとハイブリダイズされて、このサイズの範囲でゲル中を移動した生成物は、ウイルスＲＮＡについて陽性であると評価された。
【０１７４】
分析される各試料中のＲＮＡの存在を立証するために、対照として、アルファ−１抗トリプシンｍＲＮＡを増幅するために設計されたｃＰＣＲプライマーを用いるｃＰＣＲを実施した。アルファ−１抗トリプシン遺伝子のコード領域は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８４）中に記載されている。アルファ−抗トリプシン遺伝子のコード領域の３６５ヌクレオチドのフラグメントを増幅するために設計された合成オリゴマー１６量体プライマーを、ヌクレオチド２２−３７位（センス）およびヌクレオチド３７２−３８７位（アンチセンス）から誘導した。ｃＤＮＡ／ＰＣＲプライマー配列の間にあるがそれを含まない32Ｐニックトランスレーションプローブを用いて、ＰＣＲ生成物を検出した。
【０１７５】
ＰＣＲ反応の極感受性のため、すべての試料を少なくとも３回試みた。次の予防措置を取ってあらゆる偽陽性シグナルを取り除いた：１）Ｏ−リングゴム栓を有するスクリューキャップ管を用いてエアロゾルを除去；２）ディスポーザブルピストン／キャピラリーを有するＲａｎｉｎ ＭＩＣＲＯＭＡＮRの陽圧ピペッター（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｓｐ
ｌａｃｅｍｅｎｔ ｐｉｐｅｔｔｅｒｓ）でピペッティング；および３）２つの非連続的ｃＤＮＡクローンからのｃＤＮＡおよびＰＣＲプライマーに対するオリゴヌクレオチド配列の選択。
【産業上の利用可能性】
【０１７６】
本発明の免疫反応性組成物は、例えば、ＨＣＶ感染、特に慢性ＨＣＶ感染に対する個体の処置にも使用し得るワクチンのような材料の調製において有用である。さらに、この組成物は、生物学的試料におけるＨＣＶの多数の変異体の検出に用いる材料を調製するために使用し得る。例えば、本発明の免疫反応性組成物は、１つ以上のＨＣＶ単離体を認識するポリクローナル抗体組成物を生成するために使用され得、または抗ＨＣＶ抗体イムノアッセイの抗原として使用され得る。後者の方法は、血液生成物をＨＣＶ汚染の可能性についてスクリーニングするために使用され得る。ポリクローナル抗血清または抗体は、個体の受動免疫のために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、ＨＣＶゲノムの遺伝学的な構築を模式図的に示す。
【図２】図２は、Ｉ群およびＩＩ群のＨＣＶ単離体によってコードされるＥ１タンパク質の推定アミノ酸配列の比較を示す。
【図３】図３は図２の続きである。
【図４】図４は、ＨＣＶ単離体の推定Ｅ２／ＮＳ１領域のアミノ酸配列の比較を示す。
【図５】図５は図４の続きである。
【図６】図６は図５の続きである。
【図７】図７は、推定ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１タンパク質（アミノ酸３８４−４２０位）のアミノ末端領域、およびＨＩＶ−１のｇｐ１２０ Ｖ３超可変領域に関する抗原性プロフィールを示すグラフである。
【図８】図８は、ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１タンパク質（アミノ酸３８４−４２０位）のアミノ末端領域由来の所定の残基が、α−ヘリックス、β−シートまたはβ−ターンのいずれかの二次構造的特徴において見い出される確率の百分率を表す一連のグラフを示す。
【図９】図９は、ＨＣＶ １８（パネルＡ）またはＴｈ（パネルＤ）由来の血漿中の抗体と、ＨＣＶ単離体ＨＣＴ １８の３８４から４１５または４１６までのアミノ酸から誘導される部分的に重複するビオチニル化８量体ペプチドとの反応性を表す棒グラフである。
【図１０】図１０は、ＨＣＶ １８（パネルＢ）またはＴｈ（パネルＥ）由来の血漿中の抗体と、ＨＣＶ単離体Ｔｈの３８４から４１５または４１６までのアミノ酸から誘導される部分的に重複するビオチニル化８量体ペプチドとの反応性を表す棒グラフである。
【図１１】図１１は、ＨＣＶ １８（パネルＣ）またはＴｈ（パネルＦ）由来の血漿中の抗体と、ＨＣＶ単離体ＨＣＶ Ｊ１の３８４から４１５または４１６までのアミノ酸から誘導される部分的に重複するビオチニル化８量体ペプチドとの反応性を表す棒グラフである。
【図１２】図１２は、Ｑ１およびＱ３の単離体に対して与えられたＥ２／ＮＳ１ポリペプチドの２つの領域の推定アミノ酸配列、すなわち３８４−４１４位のアミノ酸および５４７−６４７位のアミノ酸を示す。
【図１３】図１３は、単離体ＨＣＶ Ｊ１．１およびＪ１．２の推定アミノ酸配列の３８４位から６４７位のアミノ酸を示す。
【図１４】図１４は、単離体ＨＣＴ２７およびＨＣＶＥ１の推定アミノ酸配列の３８４位から６５１位のアミノ酸を示す。
【図１５】図１５は、単離体ＨＣＶ−１の完全ポリタンパク質配列を示す。
【図１６】図１６は図１５の続きである。
【図１７】図１７は図１６の続きである。
【図１８】図１８は図１７の続きである。
【図１９】図１９は図１８の続きである。
【図２０】図２０は図１９の続きである。
【図２１】図２１は図２０の続きである。
【図２２】図２２は図２１の続きである。
【図２３】図２３は図２２の続きである。
【図２４】図２４は図２３の続きである。
【図２５】図２５は図２４の続きである。
【図２６】図２６は図２５の続きである。
【図２７】図２７は図２６の続きである。
【図２８】図２８は図２７の続きである。
【図２９】図２９は図２８の続きである。
【図３０】図３０は図２９の続きである。
【図３１】図３１は図３０の続きである。
【図３２】図３２は図３１の続きである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、免疫反応性ポリペプチド組成物、この組成物を免疫学的な適用において用いる方法、ならびにこの組成物を製造するための物質および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルスは、最近では、輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の原因となる主な因子、および集団獲得（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ）ＮＡＮＢＨの重大な原因として同定されている。このウイルスのゲノム配列を得るための物質および方法は、公知である。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０４６６９号、第ＷＯ９０／１１０８９号、および第ＷＯ９０／１４４３６号を参照のこと。
【０００３】
ＨＣＶゲノムの分子的特徴は、約３０１１個のアミノ酸からなるポリタンパク質をコードする約１０,０００個のヌクレオチドを含有する正の極性のＲＮＡ分子であるというこ
とを示す。その証拠となる数種の系は、ＨＣＶがフラビウイルスおよびペスチウイルスを包含するフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルスと同様の遺伝子構成を有することを示唆する。そのペスチウイルスおよびフラビウイルスの系統と同様に、ＨＣＶは、個々のウイルスのタンパク質（構造および非構造の両者）がプロセッシングによって生じる、大きなポリタンパク質前駆体をコードすると考えられる。
【０００４】
ＲＮＡ含有ウイルスは、比較的高い割合の自然変異、すなわち報告によると、組み込まれているヌクレオチドあたりおよそ１０-3から１０-4の割合で自然変異を有する。従って、異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）および遺伝子型の流動率はＲＮＡウイルスでは共通であるので、多様なウイルスの単離体が存在し得る。その単離体は、ＨＣＶ種においてビルレントまたは非ビルレントであり得る。
【０００５】
ＨＣＶの異なる単離体の多くが、現在同定されている。これらの単離体の配列は、ＲＮＡウイルスの限定された異質性の特徴を示す。
【０００６】
単離体ＨＣＶ Ｊ１．１は、以下の刊行物に記載されている：Ｋｕｂｏ、Ｙ．ら（１９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋ．ら（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７−３０３３；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４６２６。
【０００７】
２つの独立した単離体（「ＨＣＶ−Ｊ」および「ＢＫ」）の５’−および３’−末端の配列を加えた完全コード配列は、それぞれ、ＫａｔｏらおよびＴａｋａｍｉｚａｗａらによって記載されている（Ｋａｔｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５２４−９５２８；Ｔａｋａｍｉｚａｗａら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３）。
【０００８】
ＨＣＶ単離体について記載されている他の刊行物は、以下のとおりである：
「ＨＣＶ−１」：Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５；Ｈａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔl．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８８：１７１１−１７１５；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．３１８,２１６。
【０００９】
「ＨＣ−Ｊ１」および「ＨＣ−Ｊ４」：Ｏｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７。
【００１０】
「ＨＣ−１８」、「ＨＣ−２３」、「Ｔｈ」、「ＨＣ−２７」、「ＥＣ１」および「ＥＣ１０」：Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８。
【００１１】
「Ｐｔ−１」、「ＨＣＶ−Ｋ１」および「ＨＣＶ−Ｋ２」：Ｅｎｏｍｏｔｏら、日本においては、２つの主要なタイプのＣ型肝炎がある。Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Iｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ、Ｋａｎａｚａｗａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｊａｐａｎ。
【００１２】
クローン「Ａ」、「Ｃ」、「Ｄ」および「Ｅ」：Ｔｓｕｋｉｙａｍａ Ｋｏｈａｒａら、肝炎ウイルスの第２群、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ。
【００１３】
診断およびワクチンの戦略に対する典型的なアプローチは、保存されたウイルスのドメインに注目することである。しかし、このアプローチは、可変ドメインにおいて存在し得る重要なエピトープを無視するという不利益を生む難点がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
診断およびワクチンに有用なポリペプチド組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的は、多数のＨＣＶ単離体（特にこのウイルスの異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）ドメインに関して）と免疫学的に交差反応性であるポリペプチド組成物を提供することである。
【００１６】
多くの重要なＨＣＶエピトープは、ウイルスの単離体の間では変化し、そしてこれらのエピトープは、特定のドメインに位置づけられ得ることが発見された。この発見は、（保存されたドメインよりもむしろ）可変ドメインに注目する免疫学的に交差反応性のポリペプチド組成物を製造するという戦略を可能にする。
【００１７】
従って、本発明の１実施態様は、ポリペプチドを含む免疫反応性組成物である。ここで、このポリペプチドは、ＨＣＶの第一の可変ドメイン中のエピトープのアミノ酸配列を含有し、そして別個のＨＣＶ単離体の第一の可変ドメイン由来の少なくとも２種の異質性アミノ酸配列が、この組成物中に存在する。
【００１８】
本発明の別の実施態様は、複数の抗原セットを含有する免疫反応性組成物である。ここで、（ａ）各抗原セットは、ＨＣＶ単離体の第一の可変ドメイン中に存在するエピトープのアミノ酸配列を含む複数の実質的に同一のポリペプチドからなり、そして（ｂ）１つのセットのエピトープのアミノ酸配列は、類似の配列を有する少なくとも１つの他のセットのアミノ酸配列に関して異質性である。
【００１９】
本発明の別の実施態様は、複数のポリペプチドを含有する免疫反応性組成物であって、ここで各ポリペプチドは次式を有する：
Ｒr−（ＳＶn）X−Ｒ’r'
ここで、
ＲおよびＲ’は、約１−２０００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、そしてそれらは同一であるかまたは異なり；
ｒおよびｒ’は、０または１であり、そしてそれらは同一であるかまたは異なり；Ｖは、
ＨＣＶ可変ドメインの配列を含有するアミノ酸配列であって、ここで、該可変ドメインは、少なくとも１個のエピトープを含有し；
Ｓは、１以上の整数であり、選択された可変ドメインを表し；そして
ｎは、１以上の整数であり、異なるｎの値を有する少なくとも１種の他の単離体に関して、所定のＳＶで選択された異質性ＨＣＶ単離体を表し、そしてｎは各ｘに対して独立して選択され；
ｘは、１以上の整数であり；そして
ただし、アミノ酸配列は、（ｉ）１Ｖ1および１Ｖ2、（ｉｉ）１Ｖ1および２Ｖ2、および（ｉｉｉ）１Ｖlおよび２Ｖlからなる群から選択される組合せを表す組成物中に存在する。
【００２０】
本発明のさらに別の実施態様は、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を包含する、ＨＣＶの処置のための免疫原性の薬剤組成物を調製する方法である：
（ａ）上記免疫反応性組成物を提供すること；
（ｂ）適切な賦形剤を提供すること；および
（ｃ）哺乳動物へ投与することにより免疫原性の応答を提供する割合で、（ａ）の免疫反応性組成物と（ｂ）の賦形剤とを混合すること。
【００２１】
本発明のさらに別の実施態様は、上記免疫反応性組成物の有効量を哺乳動物に投与することを包含する、抗ＨＣＶ抗体を産生する方法である。
【００２２】
本発明のさらに別の実施態様は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を包含する、生物学的試料中でＨＣＶに対する抗体を検出する方法である：
（ａ）ＨＣＶに対する抗体を含有すると推測される生物学的試料を提供すること；
（ｂ）上記免疫反応性組成物を提供すること；
（ｃ）抗原−抗体複合体が形成されるような条件下で、（ａ）の生物学的試料と（ｂ）の免疫反応性組成物とを反応させること；および
（ｄ）必要に応じて、（ａ）の免疫反応性組成物と（ｂ）の生物学的試料の抗体との間で形成される抗原−抗体複合体の形成を検出すること。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、適切な容器中に入れられた上記免疫反応性組成物を含有する生物学的試料中で、ＨＣＶに対する抗体を検出するためのキットである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の発明によれば、診断およびワクチンに有用な、多数のＨＣＶ単離体（特にこのウイルスの異質性ドメインに関して）と免疫学的に交差反応性であるポリペプチド組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の実施においては、指示されない限り、当該分野の技術範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学における従来の手法が採用される。このような手法は、文献中に詳しく説明されている。例えば、次の文献を参照のこと：Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版，１９８９）；ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＡＮＤ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６）；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ
ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５４およびＶｏ１．１５５（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、およびＷｕ編）、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）；ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｓｃｏｐｅｓ（１９８７）；ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、およびＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６）；ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ（Ｄ．Ｗ．Ｃｈａｎ編，１９８７）。本明細書中で述べられる前述および後述の全ての特許、特許出願および刊行物は、本明細書中に参考として援用されている。
【００２６】
ＨＣＶは、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科の新しいメンバーである。フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科には、ペスチウイルス（ブタコレラウイルスおよびウシウイルス性下痢性ウイルス）およびフラビウイルスが包含される。フラビウイルスの例には、デング熱ウイルスおよび黄熱病ウイルスがある。ＨＣＶの遺伝学的構成の図を図１に示す。フラビウイルスおよびペスチウイルスと同様に、ＨＣＶは、ウイルスのポリタンパク質のＮ末端の基本的なポリペプチドドメイン（「Ｃ」）、続いて２種の糖タンパク質ドメイン（「Ｅ１」，「Ｅ２／ＮＳ１」）を、コードすると考えられ、これらは非構造遺伝子ＮＳ２からＮＳ５の上流にある。この推定タンパク質ドメインのアミノ酸座標を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
上記のように、多数のＨＣＶ単離体が同定されている。完全および部分ＨＣＶ配列の比較配列分析により、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルでの相同性に基づいて、ＨＣＶ単離体が、少なくとも３つの基本群に広く細分され得ることが分かる（表２）。Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（１９９１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １４：３８１−３８８を参照のこと。しかし、ＩＩＩ群における単離体では、部分配列しか得られない。それゆえ、これらの単離体の配列がより明らかになると、これらの１つまたはそれ以上の単離体は、４番目となり得る群を含む別の群に分離されるべきである。表３は、ヌクレオチド配列から推定される種々のＨＣＶ単離体の個々のウイルスタンパク質の間での配列相同性を示す。同じウイルス群のタンパク質は、種々のウイルス群によりコードされる同じタンパク質よりも高い配列類似性を示すと考えられ得る（表３）。これに対する１つの例外は、現在まで全てのＩお
よびＩＩ群のウイルス単離体配列の間で高度に保存されているヌクレオキャプシドタンパク質である。（表３では、記号Ｎ／Ａは、比較により得られなかった配列を示す。）従って、本発明のためには、Ｉ群の単離体は、本明細書中でＩ群として分類される単離体に対して、アミノ酸レベルで約９０％またはそれ以上の相同性であるそれらのウイルスタンパク質、特に、Ｅ１およびＥ２／ＮＳ１タンパク質を有する単離体として定義され得る。ＩＩ群は類似の方法で定義される。それ以上の群については、同様に、始原型単離体に対してウイルスタンパク質の相同性によって定義され得る。下位群はまた、所定のタンパク質、例えば、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１またはＮＳ２タンパク質における相同性により、または単により高い相同性レベルにより定義され得る。
【００２９】
【表２】
【００３０】
【表３】
【００３１】
Ｅ１およびＥ２／ＮＳ１遺伝子によりコードされた推定ウイルスエンベロープタンパク質は、Ｉ群およびＩＩ群の間で実質的なアミノ酸配列の変異を示すことを注目すべきである。Ｃ、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５タンパク質が全て、両群の間でより高い配列保存性を示しているのに対し、ＮＳ２だけがかなりの割合の異質性を示す。Ｉ群およびＩＩ群の間での推定ビリオンエンベロープタンパク質で見られる配列変異により、２つの群間でのアミノ酸の特徴的な区別が可能になる。この例を図２および３に示す。この図２および３では、Ｅ１遺伝子産物の配列がＩ群およびＩＩ群のウイルス間で比較される。ＨＣＶのＩＩ群およびＩＩ群のヌクレオチド配列から推定されたＥ１アミノ酸配列が示される。これらの図では、横線はＨＣＶ−１と配列が同一であることを示す。星印は、アミノ酸の群特異的な区別を示す；群特異的残基は、明確に定義され得る。Ｉ群の配列は、ＨＣＶ−１、ＨＣＴ１８、ＨＣＴ２３、ＨＣＴ２７、およびＨＣ−Ｊ１である。ＩＩ群の配列は、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ Ｊ１．１、およびＢＫである。このようなアミノ酸の群特異的な区別はまた、Ｅ２／ＮＳ１遺伝子によりコードされたｇｐ７２を含む他の遺伝子産物中にも存在する。図４〜６は、Ｉ群とＩＩ群とを区別するＨＣＶ単離体の推定Ｅ２／ＮＳ１領域の比較アミノ酸配列を示す。後者のタンパク質はまた、ほとんどすべての単離体の間の大きな変異を示す約３０個のアミノ酸からなるＮ−末端超可変領域（「ＨＶ」）を含む。Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）上記を参照のこと。この領域は、ＨＣＶ−１のアミノ酸番号付けシステムを用いて、アミノ酸３８４位から４１４位までに生じる。
【００３２】
推定ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２／ＮＳ１は、ペスチウイルス属のｇｐ５３（ＢＶＤＶ）／ｇｐ５５（ブタコレラウイルス）エンベロープポリペプチドおよびフラビウイルス属のＮＳ１に相当し得る。この両ポリペプチドは、これらのポリペプチドでワクチン接種した宿主に防御免疫を与える。
【００３３】
超可変領域（「ＨＶ」）とＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｖ３ドメインとの間での配列変異度に関して著しい類似性、限定された二次構造の欠如、および推定抗体結合に関するアミノ酸変化の予期された効果により、ＨＶドメインが中和抗体をコードしていることが示唆される。
【００３４】
ドメインの免疫原性は、実施例に記載の抗体エピトープマッピング実験により示される。これらの研究の結果により、ＨＣＶの３つの主要群に加え、さらにＨＶ特異的部分群が存在することが示唆される。
【００３５】
ＨＣＶ誘導ＮＡＮＢＨの個体から得た生物学的試料を分析することより、個体は同時に２つまたはそれ以上のＨＣＶ変異体を保有し得ることが示される。２つの共在ＨＶ変異体は、１つの個体Ｊ１の血漿中で見い出された。さらに、肝炎の間欠性発赤になっている慢性ＮＡＮＢＨの個体の遺伝子の部分配列決定により、個体Ｑが２つのＨＣＶ変異体（Ｑ１またはＱ３）に感染していることが示された。各々の変異体は、この疾患の１つのエピソード（ｅｐｉｓｏｄｅ）にのみ関連していた。Ｑ１またはＱ３特異的ペプチド（アミノ酸３９６−４０７位）を用いるＥＬＩＳＡにより、Ｑは、Ｑ１ペプチドに反応する抗体を発生するが、対応するＱ３ペプチドに反応する抗体を発生しないことが示されたので、Ｑの疾患の再発は、ＨＶ変異体の出現のために起こることが示唆された。疾患の第２のエピソードの間、Ｑ１ペプチドに対する抗体は存在するが、Ｑ３ペプチドに対する体液性免疫応答が欠如していることにより、ＨＶドメインの変異が免疫選択の圧力から生じ得ることが示唆される。アミノ酸３９６〜４０７位は、ＨＶドメインにおける最も高い選択圧にかけられて得られたと思われる。これらの発見は、疾患に関連した高レベルの慢性度が、ＨＣＶ感染に対する不適当な免疫宿主応答および／または免疫回避の有効なウイルス機構に依存し得るという説を支持する。さらに、それらは、Ｅ２／ＮＳｌ ＨＶ領域がウイルスエスケープ機構および／または不適当な免疫応答機構に含まれる遺伝子領域であることを示している。
【００３６】
上記のように、ＨＣＶゲノム内にはいくつかの変異領域が存在する。これらの１つまたはそれ以上の領域は、おそらく、ウイルスエスケープ機構および／または不適当な免疫応答機構に含まれる。それゆえ、これらの変異体に対する免疫応答を誘導し得るＨＣＶポリペプチドを処置するための組成物中に含まれることが望ましい。
【００３７】
ゲノムのＥ１およびＥ２／ＮＳ１領域が推定エンベロープ型ポリペプチドをコードしているので、これらの領域は、免疫原性に関して特に重要である。このため、これらの領域は、ＨＣＶ感染に対して個体を防御する免疫応答を誘導および／または増強し、そして感染個体の疾患の慢性的な再発の予防を助けることが特に望ましい領域の中にある。さらに、これらの領域は、感染、さらに重複感染または２つまたはそれ以上の変異体による共感染の経過中に生じるＨＣＶ変異体を検出することが望ましい領域の中にある。
【００３８】
本発明は、ＨＣＶ感染、特に慢性ＨＣＶ感染の予防のために、個体を処置するための組成物および方法を記載している。さらに、本発明は、生物学的試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在を検出するための組成物および方法を記載している。この後者の方法は、免疫学的に異なるＨＣＶエピトープに対する応答で生じる抗ＨＣＶ抗体を同定するのに特に有用である。この方法はまた、感染個体内のＨＣＶの多様な変異体の進化を研究するのに用いられ得る。本発明の考察において、以下の定義が適用される。
【００３９】
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の重合体を意味し、特定の長さの生産物を意味しない。従って、ポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾物、例えば、グリコシル化物、アセチル化物、リン酸化物などを意味しないか、あるいは除外する。この定義に包含されるものは、例えば、アミノ酸（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）の１つかまたはそれ以上の類似体を含むポリペプチド、置換された結合ならびに当該技術分野で公知の天然に存在するおよび天然に存在しない他の改変を有するポリペプチドである。
【００４０】
本明細書中で用いられるように、Ａの重量が、ＡとＢとを合わせた重量の少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％であるとき、ＡはＢから「実質的に単離される」とする。本発明のポリペプチド組成物は、好ましくは、ヒトまたは他の霊長類の組織（これには血液、血清、細胞溶解物、細胞小器官、細胞のタンパク質などが包含される）および細胞培養培地を実質的に含まない。
【００４１】
「組換え体ポリヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、もしくは合成起源のポリヌクレオチドを意味し、その起源もしくは操作によって、（１）このポリヌクレオチドが天然で関連しているポリヌクレオチドの全体もしくは一部分と関連していないもの、（２）このポリヌクレオチドが天然で連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されているもの、または（３）天然に存在しないものを意味する。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さを持ったポリマー形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）である。この用語は、分子の一次構造のみを意味する。従って、この用語には、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡが含まれる。この用語にはまた、既知の型の改変、例えば当該分野において既知の標識、メチル化、「キャップ」、類似体による１つまたはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間の改変、例えば非荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、例えばタンパク質（例えば，ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）のようなペンダント部分を含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート化剤（例えば、金属、放射性金属など）を含むもの、アル
キル化剤を含むもの、修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸など）を有するもの、ならびに未修飾形態のポリヌクレオチドが含まれる。
【００４３】
単細胞因子として培養される微生物もしくは高等真核細胞系を示す「組換え体宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」などの用語は、組換え体ベクターもしくは他の転移ポリヌクレオチドの受容体として使用可能か、または使用されてきた細胞を意味し、トランスフェクトされた元の細胞の後代が含まれる。単一の親細胞の後代は、自然の、偶発的または故意の変異によって、形態、またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補性が元の親細胞と、必らずしも完全に同一でなくてもよい。
【００４４】
「レプリコン」には、例えばプラスミド、染色体、ウイルス、コスミッドなどのあらゆる遺伝的要素であり、それらは細胞内でポリヌクレオチドの複製の自律的な単位として挙動し、すなわち自ら制御しながら複製を行うことができる。
【００４５】
「ベクター」は、オープンリーディングフレームの複製および／または発現を提供する配列をさらに含むレプリコンである。
【００４６】
「制御配列」は、ある種のポリヌクレオチド配列を意味し、この配列が連結しているコード配列を発現させるのに必要なものである。このような制御配列の性質は、宿主の生物によって異なる。このような制御配列としては、原核細胞内では、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターが含まれ、真核細胞内では、一般に、プロモーター、ターミネーター、および場合によってはエンハンサーが含まれる。「制御配列」という用語は、最小限発現に必要なすべての要素を包含し、さらに発現に有利な追加の要素、例えば分泌を制御するリーダー配列を包含し得る。
【００４７】
「プロモーター」は、ＤＮＡテンプレートにＲＮＡポリメラーゼを結合させるコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列であり、その結合は、ｍＲＮＡの製造が、隣接する構造遺伝子の通常の転写開始部位で開始するような方法で行われる。
【００４８】
「作動可能に連結された」と用語は、上記のような要素が、意図した方式で機能し得るような関係に並置されていることを意味する。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列に適合した条件下でこのコード配列の発現が達成されるように、連結される。
【００４９】
「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり、この領域は、コード配列の一部またはコード配列全体を意味する。
【００５０】
「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、ｍＲＮＡに転写され、および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンと、３’末端の翻訳停止コドンとによって決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ（これにはｃＤＮＡが包含される）、および組換え体ポリヌクレオチド配列を包含し得るが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
本明細書中で用いられるように、「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫反応性のアミノ酸配列を意味する。一般的に、エピトープは、少なくとも３〜５個のアミノ酸で構成され、そしてより一般的には少なくとも約８個、またはさらには約１０個のアミノ酸で構成されている。本明細書中で用いられるように、所定のポリペプチドのエピトープは、その所定のポリペプチドにおけるエピトープと同様のアミノ酸配列を有するエピトープ、およびその免疫学的な等価物を意味する。
【００５２】
「抗原」は、１個またはそれ以上のエピトープを含有するポリペプチドである。
【００５３】
「免疫原性」とは、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を誘導する能力を意味する。免疫原性応答は、単独で免疫反応性のポリペプチドによって誘導され得るか、またはアジュバントの存在下または非存在下での担体の存在を必要とし得る。
【００５４】
「免疫反応性」は、（１）抗体および／またはリンパ球抗原リセプターに免疫学的に結合する能力、または（２）免疫原性である能力を意味する。
【００５５】
「抗体」は、特定のエピトープと結合する任意の免疫グロプリンであり、これには免疫グロブリンの抗体およびフラグメントが包含される。この用語は、とりわけ、ポリクローナル、モノクローナル、およびキメラ抗体を包含する。キメラ抗体の例は、米国特許第４,８１６,３９７号および第４,８１６,５６７号で論じられている。
【００５６】
「抗原セット」は、複数の実質的に同一のポリペプチドからなる組成物として定義され、ここでこのポリペプチドは、定義されたエピトープのアミノ酸配列を含む。
【００５７】
「実質的に同一のポリペプチド」とは、ポリペプチドの製造方法（例えば、組換え体発現、化学合成、組織培養など）が原因となる、配列またはサイズの変化の典型的な範囲に限定される変化以外は同一であるポリペプチドを意味する。この変化は、実質的に同一のポリペプチドの組成物（例えば、この組成物は同一のポリペプチドの組成物として免疫学的に作用する）の所望の機能的な性質を改変しない。この変化は、例えば、このポリペプチドの移送の間の分泌過程から、化学合成などにおいて１００％未満の効力を生じる改変によるものであり得る。
【００５８】
本明細書中で用いられるように、ウイルスのタンパク質の「可変ドメイン」または「ＶＤ」は、少なくとも２種のＨＣＶ単離体または亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の間で矛盾がないパターンのアミノ酸の変化を示すドメインである。好ましくは、このドメインは、少なくとも１個のエピトープを含有する。可変ドメインは、１個だけのアミノ酸変化により単離体から単離体へ変化し得る。これらの単離体は、同じまたは異なったＨＣＶ群または亜群に由来し得る。可変ドメインは、単離体中の配列の組成から容易に同定され得、そしてこれらの技法は下記のとおりである。本発明を説明するために、可変ドメインは、図１５〜３２に示されるようにＨＣＶ−１のゲノムによってコードされるポリタンパク質のアミノ酸番号に関して、１位で示されるイニシエーターのメチオニンと共に定義される。別のＨＣＶ単離体における対応の可変ドメインは、任意の可変ドメイン以外の保存ドメインを最大限に整列させる方法で２種の単離体の配列を整列させることにより決定される。これは、いかなる多くのコンピューターのソフトウエアパッケージ（例えば、ＡＬＩＧＮ１．０、これはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ から入手可能である（註：Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ））でなされ得る。Ｐｅａｒｓｏｎらの（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８を参照のこと。特定の可変ドメインによって定められるアミノ酸番号は、幾分主観的であり、かつ選択の問題であることが理解されるべきである。従って、可変ドメインの開始および終止は、他に指示がない限り、近似であり、および、ドメインまたはサブドメインと部分的に重複することを包含することが理解されるべきである。
【００５９】
エピトープは、所定のポリペプチドにおける別のエピトープに免疫学的に結合する抗体と交差反応するとき、その所定のポリペプチドにおけるそのエピトープの「免疫学的等価
物」である。
【００６０】
典型的に、エピトープは、位置づけられ、少なくとも約５個のアミノ酸、時折少なくとも約８個のアミノ酸、およびさらに、約１０個またはそれ以上のアミノ酸を含む。
【００６１】
ＨＣＶエピトープを含むアミノ酸配列は、別のポリペプチド（例えば、担体タンパク質）と、共有結合によってまたは融合ポリヌクレオチドを発現させて融合タンパク質を形成させることによって、そのいずれかにより、連結され得る。所望ならば、アミノ酸配列は、エピトープの多数の繰り返しを挿入し得るかまたは結合し得、および／または種々のエピトープを組み入れ得る。担体タンパク質は、いかなる源からでも誘導され得るが、一般に比較的大きい免疫原性タンパク質、例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨなどである。所望ならば、担体タンパク質は、実質的に完全な長さのＨＣＶタンパク質を担体として使用し得、免疫原性エピトープの数を増やす。あるいは、ＨＣＶエピトープ由来のアミノ酸配列は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端にて、非ＨＣＶアミノ酸配列と連結し得、従って、このポリペプチドは、「融合ポリペプチド」となる。類似型のポリペプチドは、他の所定のウイルスのタンパク質由来のエピトープを用いて、構築され得る。
【００６２】
所定のポリペプチドの「変異体」とは、その所定のポリペプチドのアミノ酸配列が、その配列において１個またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加または転位によって改変されたポリペプチドを意味する。変異体が生じる（例えば、組換えによって）または変異体が作られる（例えば、部位特異性変異誘発）方法は、当該分野において周知である。
【００６３】
「形質転換」とは、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを意味する。なお、挿入法は、どんな方法でもよく、例えば、直接取込み法、形質導入法（これにはウイルス感染が包含される）、ｆ−交配法，またはエレクトロポレーション法がある。外因性ポリヌクレオチドは、組込まれていないベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスのゲノムとして保持されていても、あるいは宿主ゲノムに組込まれていてもよい。
【００６４】
「個体」とは、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを意味し、げっ歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、および霊長類（チンパンジー、アフリカミドリザル、ヒヒ、オランウータン、およびヒト）を包含するが、これに限定されるものではない。
【００６５】
本明細書中で用いられるように、「処置」とは、（ｉ）伝統的なワクチンのような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の低減または排除、および（ｉｉｉ）ウイルスの実質的な排除または完全な排除、のいずれをも意味する。処置は、（感染前に）予防として、または（感染後に）治療として行われ得る。
【００６６】
「有効量」という用語は、投与される個体において免疫原性応答を誘導するか、または意図するシステム（例えば、イムノアッセイ）において別な方法で検出可能に免疫反応を起こすのに充分なエピトープを有するポリペプチドの量を意味する。好ましくは、この有効量は、上記のように処置をするのに充分である。必要な正確な量は、接種により変化する。ワクチン接種のために、またはポリクローナル抗血清／抗体の発生において、例えば、その有効量は、種、年齢、および個体の一般的な症状、処置される症状の重症度、選択される特定のポリペプチドおよび投与様式などに依存して変化する。有効量は、比較的広く、非臨界的な範囲にあることもまた、知られている。適切な有効量は、定型の実験だけを用いて容易に決定され得る。
【００６７】
本明細書中で用いられるように、「生物学的試料」とは、個体から単離された組織または液体の試料をいう。これには、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚と呼吸器
官と腸管と尿生殖器管の外側部分、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官、バイオプシー、およびさらに、インビトロでの細胞培養構成物（これには細胞培養培地で細胞を増殖させて得られる馴化培地、例えば、Ｍａｂ産生ミエローマ細胞、組換え細胞、および細胞成分を包含するが、それに限定されない）の試料を包含するが、それに限定されない。
【００６８】
本発明の免疫反応性ポリペプチド組成物は、少なくとも１種のＨＣＶ ＶＤ由来の単離体特異性エピトープと群特異性エピトープとの混合物を含有する。従って、少なくとも２種の異質性アミノ酸配列がＨＣＶタンパク質中に存在する。この異質性アミノ酸配列は、各々、同一かまたは実質的に同一の物理的な場所に位置する別個のＨＣＶ単離体において見い出されるエピトープを定義する。すなわち、各配列は、ＨＣＶゲノム／ポリペプチド内の同一の場所に位置づけられる。これらの配列は異質性であるので、その場所は可変ドメイン（ＶＤ）として言及される。
【００６９】
本発明をより良く理解するために、第一に、本発明の組成物を作り出す個別のアミノ酸配列を説明する。次いで、本発明の組成物において見い出される複数のこのような配列について論じる。
【００７０】
本発明のポリペプチドを特徴付けるアミノ酸配列は、以下のような基本的な構造を有する：
Ｌy−Ｚ−Ｌ’y' （Ｉ）
Ｚは、選択されたＨＣＶ単離体由来のタンパク質の領域由来のアミノ酸配列を表す。ここで、この領域は、少なくとも１個の可変ドメインを含み、そしてこの可変ドメインは、少なくとも１個のエピトープを含む。ＬおよびＬ’は、非ＨＣＶアミノ酸配列であるかまたは可変ドメインを含まないＨＣＶアミノ酸配列であり、ここで、ＬおよびＬ’は、同一または異なり得る。ｙおよびｙ’は、０または１であり、これらは同一または異なり得る。従って、式１は、ＨＣＶ ＶＤの配列を含むアミノ酸配列を表し、ここで、ＶＤは、エピトープを含む。
【００７１】
上記のように、Ｚにおけるエピトープは、通常、最小約５個のアミノ酸、より典型的には最小約８個のアミノ酸、およびさらに典型的には最小約１０個のアミノ酸を含む。
【００７２】
Ｚの可変ドメインは、１個より多いエピトープを含み得る。
Ｚの可変ドメインは、存在するエピトープの配列を組み合わせたサイズと少なくとも同程度のサイズである。従って、このドメインに、ただ１つのエピトープが存在するならば、このドメインは、典型的には最小約５個のアミノ酸で作られる。エピトープが部分的に重複するとき、この可変ドメインにおける組み合わされたエピトープの最小アミノ酸配列は、その個々のエピトープの配列の合計より小さい。
【００７３】
Ｚは、上記ＶＤを含むＨＣＶ単離体のアミノ酸配列である。従って、Ｚの最小のサイズはＶＤの最小のサイズである。Ｚは、ＶＤだけに比べて多くのＨＣＶのアミノ酸配列を含み、そして１個より多くのＶＤをさらに含み得る。Ｚの最大のサイズは、臨界的ではないが、完全なＨＣＶのポリタンパク質の長さを上回ることは明らかに不可能である。しかし、典型的には、Ｚは、完全なＨＣＶタンパク質（特に、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５）の配列であり、そしてより典型的にはこのようなＨＣＶタンパク質のフラグメントである。従って、Ｚは、好ましくは、最小約５個のアミノ酸（より好ましくは最小約８個または約１０個のアミノ酸）から最大約１１００個のアミノ酸（より好ましくは最大約５００個、さらに好ましくは最大約４００個、またはさらに好ましくは最大約２００個のアミノ酸）の範囲である。より一般的には、式Ｉおよび／またはＺのポリペプチドは、それらが例えば、化学合成により調製されるとき、最大約５０個のアミノ酸、より典型的には最大約４０個のアミノ酸、そしてさらに典型的には最大約３０個の
アミノ酸である。
【００７４】
非ＨＣＶアミノ酸配列、ＬおよびＬ’は、それらがもし存在するならば、多くのタイプのこのような配列のいずれをも構成する。例えば、ＬおよびＬ’は、下記のように、Ｚが組換え体発現を促進するために融合される非ＨＣＶ配列（例えば、β−ガラクトシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インベルターゼ、α−因子、ＴＰＡリーダーなど）を表し得る。あるいは、ＬおよびＬ’は、他の病原体（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、テタヌストキソイド、ジフテリアなど）のエピトープを表して、多くのこれらの他の病原体に免疫反応的に関連する組成物を提供し得る。ＬおよびＬ’は、ペプチド合成の際の固体支持体、イムノアッセイの支持体、ワクチン担体のタンパク質などへの結合を促進するアミノ酸配列であり得る。実際、ＬおよびＬ’は、機能的な利点のない１種またはそれ以上の不必要なアミノ酸をさらに含み得る。ＬまたはＬ’に対する臨界的な最大のサイズはなく、その長さは、一般的に所望の機能によって決定される。典型的に、ＬおよびＬ’は、各々、最大約２０００個のアミノ酸、さらに典型的には最大約１０００個のアミノ酸である。有用な性質を有するＬおよびＬ’配列の多くは、最大約５００個のアミノ酸である。Ｚの免疫反応性をブロックしないようにＬおよびＬ’を選択することは、もちろん望ましい。
【００７５】
本発明に従って提供されるポリペプチドの組成物は、それぞれ以下の式ＩＩおよびＩＩＩよって定義される少なくとも２種のアミノ酸配列の組成物中に、（免疫反応的に有効量で）存在することによって特徴付けらる：
Ｌy−Ｚ1−Ｌ’y ' （ＩＩ）
Ｌy−Ｚ2−Ｌ’y ' （ＩＩＩ）
Ｌ、Ｌ’、ｙおよびｙ’は上記のように定義され、そしてそれらは独立して式ＩＩおよびＩＩＩの各々に対してもまた定義される。ＺlおよびＺ2は、各々、上記でＺについて定義されたようなＨＣＶアミノ酸配列であり、同一の可変ドメイン（すなわち、物理的な場所）を含むが、Ｚ1およびＺ2の共通の可変ドメインにおいて少なくとも１種の異質性エピトープをそれらの間に有する異なるＨＣＶ単離体から誘導される。例示的な実施例として、式ＩＩに従ったアミノ酸配列は、Ｚlとして、単離体ＨＣＶ−１のアミノ酸３８４−４１
４位（またはさらに特定すると３９６−４０７位または３９６−４０８位のアミノ酸）にわたる超可変ドメインのフラグメントを有し、一方、Ｚ2は、単離体ＨＣＶ−Ｊ１．１由
来の類似のフラグメントである。これらの２種の単離体は、このドメインにおいて異質性であり、これらのエピトープのアミノ酸配列は、有意に変化する。
【００７６】
本発明の組成物は、式１に従って丁度２個より多い別個のアミノ酸配列を含み得、そしてＺの配列は異なる可変ドメインを含む群に分割され得ることが理解されるべきである。例えば、本発明に従う組成物は、（式Ｉに従うアミノ酸配列と共に）ＨＣＶ配列の群を含み得る。この配列は、単離体ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ１．１、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４などに由来するアミノ酸３８４−４１１位のところで超可変ドメインを含む。この組成物はまた、（式１に従うアミノ酸と共に）ＨＣＶ配列のさらなる群を含み得る。この配列は、単離体ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ１．１、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４などにさらに由来するアミノ酸２１５−２５５位のところで可変ドメインを含む。従って、本発明の組成物の関係においては、式１の配列は以下のようにさらに定義され得る：
ＳＶn （ＩＶ）
Ｖは、ＨＣＶ可変ドメインの配列を含むアミノ酸配列を表し、ここで、この可変ドメインは、少なくとも１種のエピトープ；すなわち、式１を含む。Ｓおよびｎは、１またはそれ以上の整数である。Ｓは特定の可変ドメインを表し、そしてｎは特定の単離体を表す。例えば、Ｓ＝１はアミノ酸３８４−４１１位における可変ドメインを表し得；Ｓ＝２はアミノ酸２１５−２５５位における可変ドメインを表し得；そしてｎ＝１、２、３および４は、それぞれ、単離体ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ１．１、ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４を表し
得る。従って、上記の２つの群の配列は以下のように表され得る：
群１：１Ｖ1、１Ｖ2、１Ｖ3および１Ｖ4
群２：２Ｖ1、２Ｖ2、２Ｖ3および２Ｖ4 本発明に記載の組成物には、式ＩＶの少なくとも２種の別個の配列がある。すなわち、この組成物は、式ＩＶに従う２種の異なる配列を含有し、ここでＳおよびまたはｎの値は異なる。例えば、少なくとも１Ｖ1お
よび１Ｖ2が存在し、または少なくとも１Ｖlおよび
２Ｖ2が存在し、または少なくとも１Ｖlおよび２Ｖ1が存在する。
【００７７】
式ＩＶ中に含まれる別個の配列は、同一または異なるポリペ
プチド分子のいずれかにおける組成物中に存在する。１Ｖ1および１Ｖ2の最小の組み合わせを用いて、これらの２種の配列は、同一のポリペプチド分子（例えば、１Ｖl−１Ｖ2）または分離した分子中に存在し得る。本発明の組成物のこの特徴は、以下のようなポリペプチドの組成物として記載され得る：
Ｒｒ−（ＳＶn）x−Ｒ’r ' （Ｖ）
ここで、Ｓ、Ｖおよびｎは、上記で定義のとおりであり；ＲおよびＲ’は、約１−２０００個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、そして同一または異なり；ｒおよびｒ’は、０または１であり、そして同一または異なり；ｘは、１以上の整数であり；ｎは、各ｘに対して独立して選択され；ただし、これらのアミノ酸配列は、（ｉ）１Ｖ1および１Ｖ2、（ｉｉ）１ｖ1および２Ｖ2、および（ｉｉｉ）１Ｖ1および２Ｖ1からなる群より選択される組み合わせを表す組成物中に存在する。式ＩＶの別個の配列が異なるポリペプチド内にある実施態様においては、ｘは１であり得るが、所望であるなら１をさらに越え得る；例えば、ポリペプチド１Ｖ1−１Ｖ2と１Ｖl−２Ｖ2との混合物。ｘが１であるとき、ｒおよびｒ’は好ましくは共に０であり、ＬｙおよびＬ’y'の重複を避ける。これは、Ｖが式Ｉによる好ましい実施態様によって記載され得るからである。ｘが１より大きいとき、Ｒとその隣接するＬとを組み合わせた長さ、およびＲ’とその隣接するＬ’とを組み合わせた長さは、好ましくは、ＬおよびＬ’に関して上記の典型的な最大長より長くはない。
【００７８】
この組成物の別個のＶ配列中に含まれるＨＣＶのアミノ酸配列の選択は、この配列の意図する適用に依存し、そして本発明の開示による当業者の範囲内である。第一に、本発明に関するＨＣＶエピトープは、２種のタイプに分かれ得ることが認められるべきである。エピトープの第一のタイプは、「群特異性」であるものであり、すなわち、ＨＣＶ単離体の群中の全てのまたは実質的に全ての単離体における対応のエピトープは、互いに免疫学的に交差反応性であるが、他の群の実質的に全ての単離体の対応するエピトープを有しない。好ましくは、群特異性のクラスにおけるエピトープは、この群内に実質的に保存されるが、この群間またはこの群中には保存されない。エピトープの第二のタイプは、「単離体特異性」であるものであり、すなわち、このエピトープは、実質的に同一の単離体と免疫学的に交差反応し、そして全てのまたは実質的に全ての別個の単離体とは交差反応しない。
【００７９】
これらの群特異性エピトープおよび単離体特異性エピトープは、本発明の開示によって容易に同定され得る。第一に、数種のＨＣＶ単離体の配列が、本明細書中に記載されているように、比較され、そして配列異質性の領域が同定される。通常、異質性のパターンは、群特異性または単離体特異性を示す。同定された領域が１個またはそれ以上のエピトープを含むことが周知であるならば、次いで、所望のエピトープを含むのに充分なサイズの配列は、本発明の組成物に含まれ得る可変ドメインとして選択される。所定の異質性領域の免疫反応性が周知でないならば、種々のＨＣＶ単離体のその領域内に見い出される配列を表すペプチドは、調製され得、そしてスクリーニングされ得る。スクリーニングは含まれ得るが、抗ＨＣＶ抗体の種々の源（例えば、患者の血清、中和化Ｍａｂなど）によるイムノアッセイまたは抗体の発生、およびインビトロでウィルスを中和するためのそのような抗体の能力、に限定されない。あるいは、下記のようなスクリーニングのプロトコール
で同定されるエピトープの遺伝子座は、種々の単離体の異質性およびスクローニングされた対応の異質性配列の免疫学的な性質について試験され得る。
【００８０】
ワクチンの適用には、Ｅ１および／またはＥ２／ＮＳ１ドメイン由来の可変ドメインが、特に重要であると考えられる。特に、アミノ酸２１５−２５５内のＥ１可変ドメイン（図２および３参照）、およびアミノ酸３８４−４１４内のＥ２／ＮＳ１可変ドメイン（図４〜６参照）は、重要な免疫反応性ドメインであるとして同定されている。予備的な証拠により、これらのドメインの片方または両方が、慢性ＨＣＶ感染に通じるエスケープ変異体に反応し得る異質性の遺伝子座であり得ることが示唆される。従って、Ｖの可変ドメインがこれらの可変ドメインの片方または両方であるような、上記のようなポリペプチド組成物は、特に好ましい。さらに、本発明のポリペプチド組成物は、特に可変ドメイン中の一般的な線形エピトープに関連するが、配座エピトープもまた含有し得る。例えば、この組成物は、組換え体系（例えば、昆虫または哺乳動物細胞）で発現される、（異なる単離体の可変ドメインを示す）組換え体Ｅｌおよび／またはＥ２／ＮＳ１タンパク質の混合物を含み得る。この組換え体系は、可変ドメインの内側または外側のいずれかに配座エピトープを維持している。あるいは、配座エピトープを維持する単一の単離体由来のＥ１および／またはＥ２／ＮＳ１サブユニット抗原が、本発明に従って、ポリペプチド組成物と組み合わされ得る（例えば、合成ペプチドまたは変性させた組換え体ポリペプチドの混合物）。ワクチンに対する別の好ましい適用では、本明細書中に記載のポリペプチド組成物を他のＨＣＶサブユニット抗原と組み合わせ得る。例えば、同一人の所有する米国特許出願第
号に記載の抗原である。この出願のタイトルは、Ｒｏｂｅｒｔ Ｏ．Ｒａｌｓｔｏｎ，Ｆｒａｎｋ Ｍａｒｃｕｓ，Ｋｅｎｔ Ｂ．Ｔｈｕｄｉｕｍ，Ｂａｒｂａｒａ ＧｅｒｖａｓｅおよびＪｏｈｎ Ｈａｌｌにより、「Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質」（アトーニィドケット番号０１５４．００２）であって、本願と共に同日で出願しており、本明細書中に参考として援用されている。
【００８１】
診断の適用には、抗原として本発明の組成物を用い、それにより、別個のＨＣＶ単離体に対する抗体を検出する能力を改善するのに有用であり得る。典型的には、このポリペプチド混合物は、均質なまたは不均質なイムノアッセイ形式において直接用いられ得、後者では、好ましくは、ポリペプチドを固体基質（例えば、マイクロタイタープレートウェル、プラスチックビーズ、ニトロセルロースなど）上に固定することを包含する。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０８９；欧州公開公報第３６０,０８８号；ＩＭＭＵＮＯＡ
ＳＳＡＹ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ、上記を参照のこと。あるいは、本発明のポリペプチド組成物を作り出す実質的に同一の各ポリペプチドを別個の遺伝子座で同一の支持体上に固定し得、それにより抗体が産生される単離体または群についての情報が提供される。このことは、種々の単離体が、肝炎、癌、または種々の臨床予後を必要とする他の疾患を引き起こすならば、診断に特に重要である。好ましい形式は、Ｃｈｉｒｏｎ ＲＩＢＡTMストリップイムノアッセイ形式であり、これは、同一人の所有する米国特許出願第０７／１３８,８９４号および米国特許出願第０７／４５６,６３７号に記載されており、その開示内容は本明細書中に参考として援用されている。
【００８２】
本発明の組成物の製造に有用なポリペプチドは、組換えによって、合成によって、または組織培養中で、製造され得る。切形型ＨＣＶ配列または全長ＨＣＶタンパク質を含む組換え体ポリペプチドは、ＨＣＶ配列（１個またはそれ以上のエピトープ、隣接しているかまたは隣接していないかのいずれかである）、または融合タンパク質中の配列から完全に製造され得る。融合タンパク質では、有用な異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）配列は、組換え宿主からの分泌を提供するか、ＨＣＶエピトープの免疫反応性を高めるか、またはポリペプチドの支持体またはワクチン担体への結合を促進する配列を包含する。例えば、欧州公開公報第１１６,２０１号；米国特許第４,７２２８４０号；欧州公開公報第２５９
,１４９号；米国特許第４,６２９,７８３号を参照のこと。これらの開示内容は、本明細
書中に参考として援用されている。
【００８３】
全長ポリペプチド、および切形型ＨＣＶ配列を含むポリペプチド、およびそれらの変異体は、化学合成によって調製され得る。化学合成によってポリペプチドを調製する方法は、当該分野において周知である。それらはまた、組換え技術によっても調製され得る。ＨＣＶ−１をコードするＤＮＡ配列、および他のＨＣＶ単離体由来の可変領域のＤＮＡ配列が、本明細書中に記載および／または参照されている。これらの配列の入手により、ＨＣＶポリペプチドの免疫反応性領域をコードするポリヌクレオチドの構築が可能である。
【００８４】
ＨＣＶの可変ドメイン由来の１個またはそれ以上の免疫反応性ＨＣＶエピトープを含む所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されるか、または単離され、そして発現ベクター中に挿入され得る。このベクターは、β−ガラクトシダーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のような融合配列の部分を含み得るか、または含み得ない。ＳＯＤの融合配列を含むポリペプチドの産生に有用な方法およびベクターは、１９８６年１０月１日に公開された欧州公開公報第０１９６０５６号に記載されている。
【００８５】
所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、融合または成熟形態のどちらであっても、そして分泌を可能にするシグナル配列を含有するかまたは含有しなくても、任意の都合のよい宿主に対して適切な発現ベクター内に連結され得る。次いで、宿主は、発現ベクターで形質転換される。原核宿主細胞系および真核宿主細胞系の両方が、現在、組換え体ポリペプチドを形成するのに用いられており、そしてより一般的な制御系および宿主細胞系の要約を以下に示す。宿主細胞は、所望のポリペプチドを発現させる条件下でインキュベートされる。次いで、このポリペプチドは、溶解細胞または培地から単離され、その意図された用途に必要な程度まで精製する。
【００８６】
ウイルス由来のＨＣＶゲノムの抽出、ＤＮＡライブラリーの調製および探索、クローンの配列決定、発現ベクターの構築、細胞の形質転換、免疫学的アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイ）の実施、培養中の増殖細胞において用いられる一般的な方法は、当該分野において周知である（例えば、上記「背景」の部に引用された文献、および上記のこの「発明の実施態様」の部の初めに引用された文献を参照のこと）。
【００８７】
所望の配列を含むベクターの適切な宿主内への形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する周知のいずれの方法によっても行われ得、この導入方法には、ウイルス中のポリヌクレオチドのパッケージング、および、ウイルスによる、またはポリヌクレオチドの直接取り込みによる宿主細胞の形質導入が包含される。用いられる形質転換の方法は、形質転換される宿主に依存する。直接取り込みによる細菌の形質転換は、一般に、塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理を使用し得る（Ｃｏｈｅｎ（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０）。直接取り込みによる酵母の形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら、（１９７８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１９２９の方法を用いて行われ得る。直接取り込みによる哺乳動物の形質転換は、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ（１９７８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱法、またはその種々の周知の改変法を用いて行われ得る。細胞（特に、哺乳動物細胞）内への組換え体ポリヌクレオチドの導入に対して、当該分野において周知である他の方法は、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、リポソーム中のポリヌクレオチドの被包化、および核内へのポリヌクレオチドの直接マイクロインジェクションを包含する。
【００８８】
所望のコード配列の発現を得るために、宿主細胞は（発現ベクターであり得る）ポリヌクレオチドで形質転換される。このポリヌクレオチドは、所望のコード配列に作動可能に連結された制御配列からなる。この制御配列は、所定の宿主に適合し得る。原核宿主の間では、Ｅ．ｃｏｌｉが最もよく用いられる。原核生物の発現制御配列は、プロモーター、必要に応じて含有されるオペレーター部位、およびリボソーム結合部位を含む。原核宿主に適合し得る転移ベクターは、一般に、例えば、ｐＢＲ３２２（アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含むプラスミド）、および種々のｐＵＣベクター（抗生物質耐性マーカーを付与する配列をまた含む）から得られる。プロモーター配列は、天然に存在する、例えば、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）（Ｗｅｉｓｓｍａｎ（１９８１）Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）中の「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ」）、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら、（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）およびトリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．８：４０５７）、およびλ由来ＰLプロモーター系およびＮ遺伝子リボゾーム
結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）であり得る。さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、１つのプロモーターの転写活性化配列は、他のプロモーターのオペロン配列に結合して、合成ハイブリッドプロモーターを形成し得る（例えば、ｔａｃプロモーター（これは、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターの配列由来である）（Ｄｅ Ｂｏｅｒら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１）。上記の系は、特にＥ．ｃｏｌｉに適合し得る；所望であれば、他の原核宿主（例えば、バチリス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の株が、対応する制御配列で用いられ得る。
【００８９】
真核宿主は、培養系における酵母および哺乳動物細胞を包含する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓは、最も一般的に用いられる酵母宿主であり、そして好都合な菌類宿主である。酵母適合性ベクターは、一般に、栄養要求性突然変異体に原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｙ）を、または野生株に重金属耐性を付与することにより、生育した形質転換体の選別を可能にするマーカーを有する。酵母適合性ベクターは、２ミクロンの複製起点（Ｂｒｏａｃｈら（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：３０７）、ＣＥＮ３およびＡＲＳ１の組合せ、または複製を確実に行うような他の手段（例えば、宿主細胞ゲノムに適切なフラグメントを取り込ませ得る配列）を用い得る。酵母ベクターの制御配列は、当該分野において周知であり、解糖系酵素の合成のプロモーターを含む（Ｈｅｓｓら（１９６８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９）；例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州公開公報第２８４０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−グリセロリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州公開公報第３２９３０３号）。酵母ＰＨ０５遺伝子（これは酸ホスファターゼをコードする）もまた、有用なプロモーター配列を提供する。さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能する。例えば、１つの酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、他の酵母プロモーターの転写活性化領域に連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを創製する。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域に連結したＡＤＨ調節配列（米国特許第４,８７６,１９７号および第４,８８０,７３４号）を包含する。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖系酵素の転写活性化領域と結合したＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨ０５遺伝子のいずれかの制御配列からなるプロモーターであって、プロモーターを包含する（欧州公開公報第１６４５５６号）。さらに、酵母プロモーターは、適当な転写開始のための酵母ＲＮＡポ
リメラーゼに結合する能力を有する、酵母以外の起源の天然に存在するプロモーターを包含する。
【００９０】
酵母発現ベクターに含まれ得る他の制御要素には、ターミネーター（例えば、ＧＡＰＤＨ由来、およびエノラーゼ遺伝子由来（Ｈｏｌｌａｎｄ（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１３８５）、およびリーダー配列がある。リーダー配列フラグメントは、典型的には、細胞からタンパク質を分泌させる疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌酵母タンパク質に対する遺伝子（例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（欧州公開公報第１２,８７３号）およびα
−因子遺伝子（米国特許第４,５８８,６８４号））に由来し得る。あるいは、非酵母起源のリーダー（例えば、インターフェロンリーダー）もまた、酵母における分泌を提供する（欧州公開公報第６００５７号）。分泌リーダーの好ましいクラスは、酵母α−因子遺伝子のフラグメントを使用し、このフラグメントは、「プレ」シグナル配列と「プロ」領域との両方を含んでいる。用いられ得るα−因子フラグメントのタイプは、完全長プレ−プロα−因子リーダー、および不完全α−因子リーダー（米国特許第４,５４６,０８３号および第４,８７０,００８号；欧州公開公報第３２４２７４号）を包含する。分泌を提供するα−因子リーダーフラグメントを用いる別のリーダーは、第２の酵母α−因子由来のプロ−領域ではなく、第１の酵母のプレ配列で作られたハイブリッドα−因子リーダーを包含する（例えば、ＰＣＴ ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
【００９１】
染色体外レプリコンまたは組込みベクターである発現ベクターが、多種の酵母中への形質転換用に開発されている。例えば、発現ベクターは、以下の種に用いるために開発されている；Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｈａｎｚｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７）、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）上記）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４,８３７,１４８号および第４,９２９,５５５号））、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９）。
【００９２】
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当該分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多種の不死化された細胞系、例えばＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、シリアンハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳサル細胞、および多数の他の細胞系を含む。当該分野において、哺乳動物細胞に対して適切なプロモーターが周知であり、それらは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）およびウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）に由来するようなウイルスプロモーターを含む（適切なプロモーターの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）を参照のこと）。哺乳動物細胞は、ターミネーター配列およびポリＡ付加配列を必要とし得；発現を増大するエンハンサー配列をもまた含まれ得、そして、遺伝子の増幅を引き起こす配列もまた望ましくあり得る。これらの配列は、当該分野で周知である。
【００９３】
哺乳動物細胞で複製に適するベクターが、当該分野で周知であり、そして、それらは、ウイルスのレプリコン、または所望のポリペプチドをコードする適切な配列の宿主ゲノム
中への組込みを確実にする配列を含み得る。
【００９４】
外来ＤＮＡの発現に使用され、ワクチン調製において使用され得るベクターは、ワクシニアウイルスである。この場合、異種ＤＮＡがワクシニアゲノム中へ挿入される。ワクシニアウイルスゲノム中へ外来ＤＮＡを挿入する技術は、当該分野で周知であり、例えば相同的組換えを利用する。異種ＤＮＡは、一般的に、選択マーカーの提供も行うチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）のような、天然には非必須の遺伝子中に挿入される。組換えウイルスの構築を非常に容易にするプラスミドベクターが、記載されている（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら（１９８４）「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｖｏｌ．ＩＩ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９１頁中、Ｃｈａｋａｒａｂａｒｔｉら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３４０３；Ｍｏｓｓ（１９８７）「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、１０頁）を参照のこと）。次いで、免疫反応性領域を含む所望のポリペプチドの発現が、生存している組換えワクシニアウイルスで感染しおよび／または免疫化された細胞または個体で起こる。
【００９５】
ポリペプチドの発現のための他のシステムは、昆虫細胞およびこれらの細胞中での使用に適切なベクターを含む。これらのシステムは、当該分野で周知であり、例えば、バキュロウイルス Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヘドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現転移ベクターを含む。このベクターは、ヘルパー非依存ウイルス発現ベクターである。このシステムから得られる発現ベクターは、通常、強力なウイルスポリヘドロン遺伝子プロモーターを用いて、異種遺伝子の発現を起こす。現在、ＡｃＮＰＶ中へ外来遺伝子を導入するために最も一般的に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に周知の多種の他のベクターもまた、発現を増進するために設計されている。これらは、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリヘドロン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更し、そして、ＡＴＴから３２塩基対の下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７：３１を参照のこと）を含む。非融合外来タンパク質の良好な発現は、通常、理想的にはＡＴＧ開始シグナルの前方に適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を有する外来遺伝子を必要とする。プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での選択および増殖のために、ポリヘドロンポリアデニル化シグナルおよびアンピリシン抵抗性（ａｍｐ）遺伝子および複製起点をも含む。
【００９６】
異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入する方法は、当該分野で周知である（以下を参照のこと：ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５；Ｊｕら（１９８７）「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）中に記載；Ｓｍｉｔｈら（１９８３）、Ｍｏｌ．＆Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；および、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）上記）。例えば、この挿入は、相同的組換えにより、ポリヘドロン遺伝子のような遺伝子中に行われ得；所望のバキュロウイルス遺伝子中に作られた制限酵素部位中にもまた行われ得る。挿入される配列は、可変ドメイン由来の少なくとも１つのエピトープを含む所望のＨＣＶポリペプチドのすべてのまたは様々のセグメントをコードするものであり得る。
【００９７】
シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化のような、翻訳後改変のためのシグナルは、昆虫細胞により認識されると考えられる。また、分泌および核での蓄積（ｎｕｃｌｅａｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）に必要なシグナルは、無脊椎動物と脊椎動物細胞との間で保存されていると考えられている。無脊椎動物の細胞中で有効な脊椎動物細胞由来のシグナル配列の例は、当該分野で周知である。例えば、昆虫細胞中では
、ヒトインターロイキン２シグナル（ＩＬ２）は、細胞が認識されると外部へ輸送するシグナルとなり、完全に除去される。
【００９８】
上記宿主細胞およびベクターを用いて調製されたポリペプチドは、しばしば、融合ポリペプチドであることが望ましい。非融合ポリペプチドと同様に、融合ポリペプチドは発現後に細胞内に留まり得る。あるいは、融合ポリペプチドが、リーダー配列フラグメントを含む場合、この融合ポリペプチドはまた、細胞から増殖培地中に分泌され得る。好適には、外来遺伝子のリーダーフラグメントと残りの部分との間に、インビボまたはインビトロで切断され得るプロセシング部位がある。
【００９９】
ＨＣＶの処置に組成物が使用される場合、その組成物は免疫原性であることが望ましい。合成ポリペプチドは、正しいエピトープを提供するために正しく構造化されるが、免疫原性になるには小さすぎる場合、ポリペプチドは適切な担体に結合され得る。このような結合を得るための多数の技術が、当該分野で周知であり、これらには、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（ペプチドにスルフヒドリル基がなければ、システイン残基の付加により提供され得る）を用いるジスルフィド結合の形成が含まれる。これらの試薬は、その試薬自身とあるタンパク質中のペプチドシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成し、そして、リジンのε−アミノ基または他のアミノ酸の他の遊離アミノ基によるアミド結合を形成する。このような種々のジスルフィド／アミド−形成剤が知られている。例えば、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．（１９８２）６２：１８５を参照のこと。他の二官能カップリング剤は、ジスルフィド結合よりもむしろチオエーテル結合のためである。これらのチオエーテル形成試薬の多くは、市販で入手可能であり、６−マレイミドヘキサン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルを含む。これらのカルボキシル基は、そのカルボキシル基をコハク酸イミドまたは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸のナトリウム塩と組み合わせることで、活性化され得る。抗原をカップリングするためのさらなる方法には、欧州公開公報第２５９,
１４９号に記載のロタウイルス／「結合ペプチド」システムが用いられる。上記の列挙は、それがすべてであるわけではなく、列挙された化合物の改変物もまた、明らかに使用され得る。
【０１００】
担体としては、宿主に対して有害な抗体の産生をそれ自体が引き起こさなければ、どのような担体でも使用され得る。適切な担体は、典型的には、タンパク質のような大きくて徐々に代謝される高分子；ラテックス機能付与セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどのような多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのような重合アミノ酸；アミノ酸共重合体；および不活性ウイルス粒子（以下を参照のこと）である。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵白アルブミン、テタヌストキシン、および当業者に良く知られた他のタンパク質である。
【０１０１】
ＨＣＶ可変ドメイン（特にＥ１およびＥ２／ＮＳ１）のエピトープの免疫原性は、粒子形成タンパク質（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原に関連するタンパク質）と融合されたまたは組み立てられた真核細胞系において、それらを調製することによっても増強され得る。例えば、米国特許第４,７２２,８４０号を参照のこと。可変ドメイン由来のＨＣＶエピトープを含有するポリペプチドが粒子形成タンパク質コード配列に直接結合する構築物は、ＨＣＶエピトープに関して免疫原性であるハイブリッドを生成する。さらに、調製したすべてのベクターは、例えば、プレ−Ｓペプチドのような種々の程度の免疫原性を有し、ＨＢＶに特異的なエピトープを含む。このように、粒子形成タンパク質から構築され、ＨＣＶ配列を含む粒子は、ＨＣＶおよびＨＢＶに関して免疫原性である。
【０１０２】
肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９８：３４４）、および、例えば哺乳動物細胞（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９８４）「Ｂ型肝炎」Ｍｉｌｌｍａｎ Ｉ．ら編に記載）中で形成され、そして粒子に組み立てられることが示されている。このような粒子の形成は、モノマーサブユニットの免疫原性を増強することが示された。構築物はまた、プレ表面（プレ−Ｓ）領域の５５のアミノ酸を含むＨＢＳＡｇの免疫優性エピトープを含み得る。Ｎｅｕｒａｔｈら（１９８４）。酵母中で発現され得るプレ−Ｓ−ＨＢＳＡｇ粒子の構築物は、欧州公開公報第１７４,４４４号に開示されている；酵母での発現のための異種ウイルス配
列を含むハイブリッドは、欧州公開公報第１７５,２６１号に開示されている。これらの
構築物は、ＳＶ４０−ジヒドロ葉酸還元酵素ベクターを用いて、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞中でも発現され得る（Ｍｉｃｈｅｌｌｅら（１９８４））。
【０１０３】
さらに、粒子形成タンパク質コード配列の一部は、ＨＣＶ可変ドメイン由来のエピトープをコードするコドンで置換され得る。この置換において、酵母または哺乳動物で免疫原性粒子を形成する単位の集合を媒介するのに必要とされない領域が削除され得、このようにして、ＨＣＶエピトープと競合する部分から余分なＨＢＶ抗原部位を除去する。
【０１０４】
活性成分として免疫原性ポリペプチドを含むワクチンの調製は、当業者に公知である。典型的には、このようなワクチンは、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能なように調製される；注射前に、液体に溶解または懸濁させるのに適当な固形物の形態としても調製され得る。この調製物はまた、乳化することも可能であり、すなわち、リポソーム中でカプセル化されたポリペプチドであってもよい。この活性免疫原性成分は、薬学的に受容され得る賦形剤であって、この活性成分と適合し得る賦形剤と混合されることが多い。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。さらに、必要であれば、このワクチンには、少量の補助物質が含まれ得る。この補助物質としては、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効果を増強するアジュバントが挙げられる。効果的なアジュバントの例は、以下を含むが、それだけには限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（（ＣＧＰ １１６３７）、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、およびＲＩＢＩ。ここで、ＲＩＢＩは、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳濁液中に、細菌から抽出される３成分、すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含んでいる。アジュバントの効力は、可変ドメイン由来のＨＣＶエピトープを含む免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定することにより決定され得る。この抗体は、種々のアジュバントもまた含むワクチン中でこのポリペプチドを投与することによって生じる。
【０１０５】
タンパク質は、中性または塩の形態でワクチンに処方され得る。薬学的に受容され得る塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成される）が含まれ、この塩は、無機酸（例えば、塩酸、リン酸）、または有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸など）を用いて形成される。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニア、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）および有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）からも誘導され得る。
【０１０６】
ワクチンは、従来、非経口的に投与され、その形態は、例えば、皮下または筋肉注射で
ある。他の投与形態に適したさらなる処方物には、坐剤があり、場合によっては経口処方物を含む。坐剤には、従来のバインダーおよび担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み得る；このような坐剤は、活性成分を含む混合物から０.
５％〜１０％、好適には１％〜２％の範囲で形成され得る。経口処方物には、通常用いられる賦形剤が含まれており、この賦形剤には、例えば、薬学的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどがある。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方物または粉末の形態をとり、そして１０％〜９５％の、好適には２５％〜７０％の活性成分を含む。
【０１０７】
上記に加えて、ＨＣＶ抗原セットの組換えポリペプチドを発現する弱毒化微生物の生ワクチンを調製することも可能である。適切な弱毒化微生物が、当該分野で周知であり、例えばウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）および細菌を含む。
【０１０８】
ワクチンは、投薬処方と適合する様式で、そして予防効果および／または治療効果が得られる量で投与される。投与されるべき量は、一般的に１回の投与当り抗原５μｇ〜２５０μｇの範囲であるが、処置される個体、この個体の免疫系が抗体を合成する能力、および望まれる保護の程度に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、医師の判断によるものであり、各個体に特有であり得る。
【０１０９】
ワクチンは、１回の投与スケジュールで与えられるか、または好適には複数回の投与スケジュールで与えられ得る。複数投与スケジュールでは、最初のワクチン投与は、１〜１０回に分けて行われ、以後の投与は引続き免疫応答を維持および／または増強するために必要とされる時間間隔で行われ得る。例えば、２回目の投与では１〜４ヵ月で行われ、そして必要であれば数カ月後に引続き投与が行われ得る。投与法は、少なくとも部分的には、個体の必要量よっても決定され、医師の判断による。
【０１１０】
さらに、上述のＨＣＶポリペプチドを含む抗原セットを含むワクチンは、他の免疫制御剤、例えば免疫グロブリンと共に投与され得る。
【０１１１】
本発明の組成物は、個体に投与されて、多数の用途に使用され得る（従来技術を用いて、血清から精製または単離された）ポリクローナル抗体を生成し得る。例えば、ポリクローナル抗体は、個体を受動免疫化することに、または免疫化学試薬として用いられ得る。
【０１１２】
本発明の他の実施態様では、複数のＨＣＶ抗原セットを含む上記の免疫反応性組成物が、例えば血液または血清試料を含む生物学的試料中の抗−ＨＣＶ抗体を検出するために用いられる。イムノアッセイの設計は、変化に富み、多様なものが当該分野で周知である。しかしながら、イムノアッセイは抗原セットを用い、ここで各抗原セットは、ＨＣＶ単離体の第１可変ドメイン中にエピトープのアミノ酸配列を含む複数の実質的に同一のポリペプチドからなり、１セットのアミノ酸配列は、少なくとも１つの他のセットのアミノ酸配列について異質性である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合、または直接反応、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。このプロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得、または免疫沈降法によるものであり得る。ほとんどのアッセイは、標識化抗体またはポリペプチドの使用を含む；この標識は、例えば、蛍光性、化学発光性、放射性、または染料分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた知られている；それらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイのような、酵素標識されそして酵素に介されるイムノアッセイである。
【０１１３】
免疫学的診断に適し、そして適切な標識試薬を含むキットが、可変ドメイン由来のＨＣＶエピトープを含有する本発明の組成物を含む適切な材料を、アッセイの実施に必要とさ
れる残りの試薬および材料（例えば、適当な緩衝液、塩類溶液など）および適当なアッセイの説明書のセットと共に、適当な容器中にパッケージすることで構成される。
【実施例】
【０１１４】
以下の記載は本発明の実施例であり、説明の目的のためにだけ提供するもので、本発明の範囲を限定するものではない。本開示を考えると、特許請求の範囲内で非常に多数の実施例が当業者に明らかである。
【０１１５】
実施例において、以下の材料および方法を用いた。
【０１１６】
（被験体試料およびＲＮＡの抽出）
無症候性のＨＣＶ保菌者であるＨＣＴ１８およびＨＣＶＪ１、および慢性的に感染しているＨＣＶ被験体のＴｈは、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８中に、以前に記載されている。被験体Ｑは、肝臓バイオプシーに基づいて、慢性活性肝炎であると診断され、６ヶ月間、アルファ−２ｂインターフェロン治療を施された（毎週３回、３百万単位）。製造者により示されるように１０μｇ／ｍｌのＭＳ２保菌者ＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，１６５−９４８）を含むＲＮＡｚｏｌTMＢ試薬（Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてＣｈｏｍｃｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９の方法に従い、ＲＮＡを血漿０.２ｍｌから抽出した。ＲＮＡを、蒸留水で処
理したジエチルピロカーボネート２００μｌ中に再懸濁し、そして、最終濃度０.２Ｍの
酢酸ナトリウムおよび２.５倍容量の１００％エタノール（−２０℃）中で再沈澱させた
。
【０１１７】
（ｃＤＮＡおよびポリメラーゼー連鎖反応）
すべての反応を、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ ３３５：１−５に従い実施した。Ｍ１３配列決定は、Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０−３７に従い実施した。少なくとも４つのクローン化挿入フラグメントの共通配列が、２つのクローン由来のＨＣＶ Ｊ１．２ Ｅ２／ＮＳ１配列を除いて与えられた。
【０１１８】
ＨＣＴ１８およびＴｈのクローニングおよび配列決定を、上記のＷｅｉｎｅｒら（１９９１）の報告の通りに行った。被験体ＱのＥ２／ＮＳ１のアミノ末端セグメントおよびカルボキシ近位セグメントをクローニングするために用いた組み込まれたＰＣＲプライマーは以下であった：
【０１１９】
【化１】
【０１２０】
ＨＣＶ Ｊｌ Ｅ２／ＮＳ１遺伝子をクローニングするために用いたＰＣＲプライマーは以下であった：
【０１２１】
【化２】
【０１２２】
＊は、Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４６２６からのｎｔ配列である；＊＊は、Ｋａｔｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｊｐｎ．Ａｃａｄ．６５Ｂ：２１９−２２３からのｎｔ配列である。センス（Ｓ）またはアンチセンス（Ａ）ＰＣＲプライマーを、参考文献中のヌクレオチド番号に従い、５’から３’の向きに示した。
【０１２３】
（ビオチン化ペプチドの合成）
ＨＣＶの３つの株の超可変領域に対する重複オクタペプチド（８ペプチド）を、切断可能なリンカー上で合成し、誘導し、ポリエチレンのピンを、本質的にＭａｅｊｉら（１９
９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３４：２３−３３による記載のように、各ペプチドのＮ−末端にカップリングした。最後に、４０ｍＭのビオチン、４０ｍＭの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、４０ｍＭのべンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ，ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ）および６０ｍＭのＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を含む１５０μｌのジメチルホルムアミド溶液を用いて一晩２０℃で反応させ、ビオチンをＮ−末端にカップリングした。
【０１２４】
ビオチン化の後、ペプチドの側鎖を脱保護し、洗浄し、そして各ピンから得られるペプチドを、２００μｌの０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）中で切断した。切断ペプチド溶液を含むマイクロタイタープレートを、必要とされるまで−２０℃で貯蔵した。
【０１２５】
（ビオチン化ペプチドのＥＬＩＳＡ試験）
ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ ｍａｘｉｓｏｒｂ Ｆ９６）を、一晩４℃で、０.１ｍｌ／ウェルの５μｇ／ｍ１ストレプトアビジン（Ｓｉｇ
ｍａ カタログ番号Ｓ４７６２）溶液と共に、ｐＨ９.６の０.１Ｍ炭酸緩衝液中でインキュベートすることにより、ストレプトアビジンでコートした。ストレプトアビジン溶液除去の後、ウェルを、ＰＢＳ中のＴｗｅｅｎ２０の０.１％溶液で４回洗浄した。ＰＢＳ中
で、０.２ｍｌの２％ＢＳＡと共に１時間２０℃で、各ウェルをインキュベートすること
により、非特異的結合を遮断した。ウェルを、再びＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。プレートを風乾し、要求されるまで、４℃で貯蔵した。各ウェル中のストレプトアビジンを、０.１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に０.１％のＢＳＡを伴う切断ペプチド溶液の１：１００希釈液１００μｌと、２０℃で１時間のインキュベートすることにより、切断されたペプチドにカップリングした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で４回洗浄した。各ウェルを、血清の適切な希釈液（０.１％のア
ジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の２％ＢＳＡで希釈）１００μｌと共に、２０℃で１時間または４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で４回洗浄した。結合した抗体を、コンジュゲート０.１ｍｌ中で、２０℃で１時間反応させることにより検
出した。これは、ＣＡＳＳ（０.１ＭのＰＢＳ中に希釈した０.１％ヒツジ血清、０.１％
Ｔｗｅｅｎ ２０、０.１％ナトリウムカゼイネート、ｐＨ７.２）中の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｋｉｒｋｅ ｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）０.２５ｍｌ／ｌ（飽和レベル）
から構成されていた。ウェルを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で２回洗浄し、引続きＰＢＳだけで２回洗浄した。酵素の存在は、１００ｍｌの０.１Ｍリン酸／０.０８Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４.０中に５０ｍｇのアンモニウム２,２’−アジノ−ビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート（ＡＢＴＳ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ カタログ番号１２２６６１）および０.０３ｍｌの３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素溶液を含
む０.１ｍｌの新たに調製された溶液と、２０℃で４５分間反応させることにより検出し
た。発色を、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＭＣプレートリーダー中で、４９２ｎｍの対照波長に対して４０５ｎｍのデュアル波長モードで測定した。
【０１２６】
（コンピューターで生成された抗原性プロフィール）
ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１タンパク質およびＨＩＶ−１ ｇｐ１２０超可変領域Ｖ３（ａａ３０３−３３８）に対する抗原性プロフィールを、Ｋａｂａｔ［免疫学的に重要なタンパク質の配列、米国厚生省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ
Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、公共保健サービス（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）、国立衛生研究所（１９８３）］により最初に提案されたようにして、配列変異の程度に基づいて、コンピュータープログラムから誘導した。この抗原性プロフィールを用いて、各々の可能な対をなすアミノ酸に対して抗体結合が保持される個々の確率の平均を乗じて免疫グロブリンの超可変ループを同定した。与えられたアミノ酸の変化
に関連する抗体結合の保持の確率は、１０３個の特徴化された線形エピトープに対するすべての可能なアミノ酸置換基の抗体結合における効果を評価することにより、実験的に決定される値であった。Ｇｅｙｓｅｎら（１９８８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃ．１：３２−４１。このようにして、このアルゴリズムは、変異指数に加重価を与え、抗体の結合に大きな影響があると考えられるアミノ酸の変化により重みを与えた。すなわち、保存的なアミノ酸の変化に対して補正を行った。１５のＨＣＶ配列［ＨＣＶ−１，Ｑ３．２，ＨＣＴ２３，ＥＣ１０，ＨＣ−Ｊ１，ＨＣＶＥ１，ＴＨ，ＨＣＴ２７，Ｑ１．２，ＨＣＴ１８，ＨＣ−Ｊ４，ＨＣＶ Ｊ１．２／ＨＣＶ Ｊ１．１，ＨＣＶ Ｊ，ＨＣＶ ＢＫ］をＨＣＶに対する抗原性プロフィールの測定に用いた。ＨＩＶ−１ Ｖ３プロフィールを、ユニークＨＩＶ−１配列のより多数のデータベースからランダムに選択した１５配列の２４２の個プロフィールを平均することで得た。ＬａＲｏｓａら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：９３２−９３５およびＣｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）８１１頁。これらの単離体のいくつかのａａ３８４と４２０との間のアミノ酸配列を図４〜６に示す。
【０１２７】
（コンピューターで生成される２次構造予測）
アミノ末端領域（３８４−４２０）がαヘリックス、βシート、βターン２次構造を含む確率は、３つの上記２次構造特徴のそれぞれに対する確率を、各残基に割り当てるアルゴリズムを用いて決定し得る。アルゴリズムに用いられる係数は、構造データベースの残基のすべての対合様式の組合せに対して得られた。ＬｅｖｉｔｔおよびＧｒｅｅｒ（１９７７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１４：１８１−２９３。これらの係数から得られた予想パラメーターは、与えられた残基が３つの定義された２次構造特徴の１つに見出される確率を得るためにアルゴリズムをデータベースに適応し直して、観察結果と合致させた。
【０１２８】
（実施例１）
（ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶおよびＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ドメインの２次構造およびアミノ酸配列変異の比較）
１５のＨＣＶおよびＨＩＶ−１単離体由来のアミノ酸配列を、ＨＣＶ Ｅ２ ＨＶドメインまたはＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｖ３ドメイン中でアミノ酸配列の異質性が観察された位置の数について比較した（それぞれ、図７、ＡおよびＢ）。アミノ酸の異質性は、Ｅ２ ＨＶ領域では３０のアミノ酸位置のうち２５の位置、そして、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｖ３ドメインでは３５のアミノ酸位置のうち２３の位置で生じていた。図７ＡおよびＢのｘ軸上のダッシュは、可変アミノ酸残基が生じるアミノ酸位置を表し、そして、非変異アミノ酸は１文字のアミノ酸コードで示している。図７中に示された抗原性プロフィールにより、ＨＩＶ−１ ＧＰ１２０タンパク質のＶ３ループ（図７Ｂ）と同様に、ＨＣＶ
Ｅ２中の１ブロックのアミノ酸残基（図７Ａ中のアミノ酸３８４−４１４）において、その変異は抗体結合における予想通りの逆の効果を有することが認められたことが示される。図７中のデータにより、ＨＣＶ Ｅ２ドメインは、ウイルス中和エピトープをコードすることで知られるＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｖ３ドメインと、観察されたアミノ酸変異の程度および期待重みの両方において類似することが示され、Ｅ２ ＨＶドメインは、ｇｐ１２０ Ｖ３ドメインと同様の機能を有し得ることが示唆される。
【０１２９】
線形エピトープは、タンパク質（特にタンパク質の末端）のあまり構造化されていない領域に、または伸長した表面ループに、より関連していると思われる。コンピューター分析を用いて、個々の残基が残基３８４〜４２０間の１５のＥ２
ＨＶアミノ酸配列についての定義された２次構造特徴に関連する確率を予測した。図７から、Ｅ２アミノ末端残基３８４と、非常に期待され顕著に保存されたβターン（残基４１５−４１８）との間の領域は、αヘリックス、βシート、βターンの確率が５０％以下であることから示されるように、比較的構造化されていないことが示される。Ｅ２ ＨＶドメイン中の期待構造の欠如は、単離体間でみられる広範囲の配列変異に対する許容性と
一致し、タンパク質の３次元的折り畳みに寄与する顕著に構造化された領域と対照的である。Ｖ３は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０の主要中和ドメインであり、β鎖−ＩＩ型βターン−β鎖−αヘリックス特徴を含むことが報告されており、アミノ酸の変異において、ＨＣＶ Ｅ２ＨＶドメインよりも強い構造的制限を有し得る。ＨＣＶ Ｅ２ ＨＶドメインは、このＶ３よりも構造化されていないようにさえ見える。まとめると、この事実は、Ｅ２
ＨＶドメインが、線形中和エピトープと考えられる部位を含むタンパク質ドメインに特徴的な特性を有するように思われることを示唆する。
【０１３０】
（実施例２）
（ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメインのエピトープマッピング）
ＨＣＴ１８（Ａ，Ｄ）、Ｔｈ（Ｂ，Ｅ）およびＨＣＶ Ｊ１（Ｃ，Ｆ）のＥ２／ＮＳ１
ＨＶドメイン（アミノ酸３８４〜４１６位）に対応し、そしてそれを越えて伸長する重複ビオチン化８量体ペプチドを、ストレプトアビジンでコートしたプレートに結合し、ＨＣＴ １８（Ａ−Ｃ）またはＴｈ（Ｄ−Ｆ）のいずれかに由来の血漿と反応させた。ＨＣＶ単離体ＨＣＴ １８（図９）、Ｔｈ（図１０）、およびＨＣＶＪ１（図１１）についての結果を図９〜１１に示す。ＨＣＴ １８血漿を１：２００に希釈し、Ｔｈ血漿を１：５００に希釈した。ＨＶＥ−１、−２、−３、−４、および−５は単離体に特異的なエピトープを示す。
【０１３１】
図９〜１１から分かるように、ＨＣＴ １８配列（図９Ａ中のＨＶＥ−Ｉ）から誘導されたペプチドで試験すると、ＨＣＴ１８血漿は線形エピトープ（407ＰＫＱＮＶ411）を同定したが、２つの異なる株ＴｈおよびＨＣＶＪ１のＨＶドメインに対応するペプチドとは反応しなかった（図１０および１１）。対照的に、Ｔｈ血漿は、ＴｈのＨＶドメイン中の線形エピトープＨＶＥ−ＩＶ（409ＱＮＩＱＬＩ414、図１０）を同定し、そして株ＨＣＴ
１８（399ＩＶＲＦＦＡＰ405、図９）およびＨＣＶ Ｊ１中のエピトープをもまた同定した。ＩＶの薬剤の使用者であるＴｈは、ＨＣＶの複数の株に対して感染可能状態に置かれ得た。
【０１３２】
Ｔｈ血漿およびＨＣＴ １８血漿は両方とも、ＥＬＩＳＡにおいて各単離体由来のピン合成された重複８量体ペプチドと共に使用された場合、３つの単離体すべてに共通なエピトープ（アミノ酸４１３−４１９位）とそれぞれ反応した（データを示していない）。
【０１３３】
抗体結合の特異性を確認するために、アミノ酸４０３−４０７位を含むビオテン化ペプチドに結合している抗体を評価し、これを用いて、ＨＣＴ １８血漿の反応性を、ＨＣＴ
１８ＨＶドメインに対する重複８量体を含むピンで遮断した。これらのデータにより、以下のことが示される：１）Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメインが免疫原性であること、２）この領域をマップする複数のエピトープがあること、そして、３）ＨＶドメイン中のエピトープのサブセット（図９〜１１中のＨＶＥ−１、−２、−３、−４または−５）が単離体特異的であること。
【０１３４】
（実施例３）
（可変Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメインが、肝炎の発赤と関連し得ることの決定）
慢性ＨＣＶ感染にしばしば見出される肝炎の間欠性発赤に関連するＨＣＶ変異体を発見する可能性を調べるために、慢性肝炎の被験体Ｑから、約２年間隔の肝炎の２つの別個のエピソード（それぞれ、Ｑ１およびＱ３）の際に得たＥ２／ＮＳ１遺伝子を部分的に配列決定した。肝炎の第２のエピソードは、インターフェロン治療を終了して１年半後に起こった。
【０１３５】
Ｑ１およびＱ３のＥ２／ＮＳ１領域の推定アミノ酸配列の差異は、３９１−４０８の間でだけ著しく異なっており、８つの変化のうち７つをアミノ酸３９８と４０７との間に生
じていた（図１２）。図１２は、Ｑ１およびＱ３単離体のＥ２／ＮＳ１ポリペプチドの２つの領域、つまりアミノ酸３８４−４１４および５４７−６４７の推定アミノ酸配列を示す。Ｑ１配列上のアミノ酸（Ｅ）が、４つのＱ１クローンのうちの１つに見出された。ボックスで囲まれたアミノ酸は、Ｑｌ
ＨＶＥまたはＱ３ ＨＶＥの１２量体ペプチドの位置を表す。Ｑ１とＱ３との間に見出されるアミノ酸配列の相違は、太字で示した。
【０１３６】
Ｑ１およびＱ３のＥ２／ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸５４７と６４７との間では、アミノ酸異質性が１カ所でだけ観察された（図１２）。
【０１３７】
Ｑ１およびＱ３のＥ２ ＨＶドメイン中に観察されるアミノ酸置換の抗体結合における効果を調べるため、アミノ酸３９６から４０７（図１２のＨＶＥＱ１またはＱ３）をもとにＱ１およびＱ３に特異的な１２量体ペプチドを合成し、ＥＬＩＳＡにおいてＱ１およびＱ３の血漿と各ペプチドとを別々に反応させた。図７から、Ｑ１およびＱ３の両血漿中の抗体は、Ｑ１ペプチドと反応したが、Ｑ３ペプチドとは反応しないことが示される。統計解析（スチューデントの検定）により、Ｑ１／Ｑ３血漿のＱ１ペプチドヘの結合は、これらの血漿のランダムに選択された１区画の１２の対照ペプチドに対するバックグラウンド結合を有意に越えている（Ｐ＜０.００１）ことが示されたが、一方Ｑ１またはＱ３の血
漿のＱ３ペプチドヘの結合は、統計上有意ではなかった。このデータは、被験体Ｑは、ＨＣＶ Ｑｌ ＨＶドメインに対する抗体を発生し、この抗体は、２年後のＱ３時点でもまだ検出し得たが、検出し得る体液性応答は、肝炎の第２のエピソードの間に優性であるＱ３ Ｅ２ ＨＶ変異体に対して全く発生されなかったことを示している。
【０１３８】
【表４】
【０１３９】
（実施例４）
（ＨＣＶ感染固体における異なるＥ２／ＮＳ１ ＨＶドメインを伴う共存Ｅ２／ＮＳ１遺伝子の検出）
図１３は、日本人のボランティアの供血者ＨＣＶ Ｊ１の１つの漿試料からクローンニングしたＨＣＶ Ｊ１の２つの単離体（Ｊ１．１およびＪ１．２）から推定されたアミノ酸配列を示す。Ｋｕｂｏら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２。ＨＣＶ Ｊ１．１とＨＣＶ Ｊ１．２との間の全部で２３のアミノ酸の変化のうち、太字で示した９つの相違が、３０のアミノ酸のＥ２／ＮＳ１ＨＶドメインに集中している。Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメイン中の９つのアミノ酸の置換のうち５つは、非保存的アミノ酸変化を表す。ＨＣＶ Ｊ１は、本発明者らの実験室でクローニングされた唯一のＩＩ群ＨＣＶゲノムであるため、これらの相違がＨＣＶ Ｊ１血漿の交叉汚染によるものではないと考えられる。２つの別個のＰＣＲ反応から作製した７つのクローン化配
列から、２つのＥ２／ＮＳｌＨＶ変異体配列だけが同定されたので、ＨＣＶＪ１．２配列は、ＨＣＶＪ１の血液中の少数配列（ｍｉｎｏｒｉｔｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を表す。
【０１４０】
興味深いことに、ＨＣＴ２７単離体およびＨＣＶ Ｅ１単離体は、これらは異なる実験室で配列決定され、おそらく無関係な個体から得られたが、両者を比較することにより、これらの単離体中のＥ２／ＮＳｌＨＶドメイン中のアミノ酸の相違の数が、同一個体由来の単離体の間で観察された相違の数より少ないことが示された（図１４）。
【０１４１】
上記の結果により、個体および個体群中でＨＣＶゲノムが急速に進化しているという示唆が導かれる。
【０１４２】
（実施例５）
（ワクチンの製剤と調製）
（ジフテリアトキソイド担体タンパク質のＭＣＳへのカップリング）
（必要な材料）
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ Ｎａ2・２Ｈ2Ｏ）（ＭＷ ３７２）
６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＣＳ）（Ｓｉｇｍａ）−純度９５％
リン酸二水素一ナトリウム（ＮａＨ2Ｐ０4）
窒素
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
Ｍｉｌｌｉ Ｑ水
５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.６６）
０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）
０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）
コハク酸ナトリウム［（ＣＨ2ＣＯＯＮａ）2・６Ｈ2Ｏ］
システイン
塩酸（２％溶液）
０.１Ｍコハク酸ナトリウム／０.１ ＥＤＴＡ、ｐＨ５.６
精製されたジフテリアトキソイド（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、以下に記載の方法によりＭＣＳにカップリングした：Ｌｅｅら（１９８０）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ１．１７：７４９；Ｐａｒｔｉｓら（１９８３）Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２：２６３；Ｐｅｅｔｅｒｓら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２０：１３３；Ｊｏｎｅｓら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２３：２１１。１００ｍｌのジフテリアトキソイドをＧ２５セファデックスカラム（１７ｃｍ×４ｃｍ）に通し、チオメルサールを除去した。トキソイドを、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）で溶出し、溶出液のタンパク質容量をＢＣＡタンパク質測定法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてアッセイした。得られた溶液を、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０１４３】
１ｍ１のトキソイド溶液を、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）で透析し、次いで２００μｌＤＭＦ中の１.５ｍｇ ＭＣＳの溶液と混合した。得られた溶液を、暗所において
室温で１時間時々撹拝しながらインキュベートした。ＭＣＳトキソイドからカップリングされていないＭＣＳを分離するため、溶液を、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.６６）で平衡化されたセファデックスＰＤ１０カラムに通過させ、タンパク質画分を採集した。
【０１４４】
カップリングされたマレイミド基の担体分子当りの数を、そこにＨＣＶペプチドがカップリングする前に測定した。３０ｍｌのコハク酸／ＥＤＴＡ緩衝液に窒素を２分間吹き込んだ。５ｍｇのシステインを、２５ｍｌメスフラスコ中に移し、最終体積が２５ｍｌであ
る吹き込まれた緩衝液中に溶解した。表５中に示した溶液の分量を、２連で、２５ｍｌスクリューキャップボトルに移した。別々のピペットを用いて、各分量中へ窒素を通気した。次いで各ボトルを密封し、暗所において室温で４０分間時々かきまぜながらインキュベートした。
【０１４５】
【表５】
【０１４６】
＊：３溶液のそれぞれの０.１ｍｌ分量を、エルマンの測定法に用いるために採取した。
【０１４７】
（スルフヒドリルの定量測定のためのエルマン試験）
（必要な材料）
リン酸緩衝液、ｐＨ８.０
１５.６ｇのＮａＨ2ＰＯ4または１２.０ｇのＮａＨ2ＰＯ4無水物を、約７００ｍｌのＭｉｌｌｉ Ｑ水に溶解する。５０％ＮａＯＨを用いてｐＨを８.０に調節する。Ｍｉｌｌ
ｉ Ｑ水を最終体積が１０００ｍｌになるように加え、次いで必要に応じてｐＨを調整する。
エルマン試薬
１０.０ｍｇの５,５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を、２.５ｍｌ
のリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）中に溶解する。
【０１４８】
０.１ｍｌのエルマン試薬を、上記のように調製した溶液、すなわち試料、標準溶液、
およびブランク溶液の０.１ｍｌ分量のそれぞれに加えた。次いで、５ｍｌのリン酸緩衝
液（ｐＨ８.０）を、各分量に加えてよく混合し、１５分間そのままおいた。各分量の吸
光度を１ｃｍ路長のセル中で４１２ｎｍで測定した。
【０１４９】
担体タンパク質上に存在するマレイミド基の数を、次の方法によって測定した。ｍｌ当り０.０１μモルの−ＳＨの溶液は、１ｃｍ光路において４１２ｎｍで０.１３６の吸光度を生じた。標準または試料（Ａ）の吸光度は、活性化担体タンパク質上のカップリングされたマレイミド基と反応したシステインの量と等しかった。１モルの有効な−ＳＨが、１モルのマレイミドと反応するので、試験された分量中に存在するマレイミド基のμモルにおける濃度は、Ａ（０.０１）／０.１３６μモル／ｍｌである。溶液の全体積は、５.２
ｍｌであった。そのため、存在する総μモル数は、Ａ（０.０１）（５.２）／０.１３６
であった。試料溶液は、全体積が１.３ｍｌであり、その内０.３ｍｌが活性化担体タンパク質から構成された。試料溶液中に存在するマレイミド基の量は、Ａ（０.０１）（５.２）（１.３）／（０.１３６）（０.１）（０.３）＝Ａ（１６.５７）μモル／ｍ１である
と計算された。ＭＣＳ活性化担体タンパク質は、−２０℃で貯蔵した。
【０１５０】
（ＨＣＶペプチドの還元）
ＨＣＶペプチドをＭＣＳ活性化担体タンパク質にカップリングする前に、ペプチドを還元し、ペプチド上に存在するチオール基が完全に還元された−ＳＨ形であることを確実にした。
【０１５１】
（必要な材料）
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
炭酸水素アンモニウム（ＮＨ4ＨＣＯ3）
メタノール
ＳＥＰ−ＰＡＫｓ（Ｃ１８カートリッジ、水）、各８ｍｇのペプチドに１カートリッジ
０.1Ｍ炭酸水素アンモニウム緩衝液
１Ｌ Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中に７.９ｇのＮＨ4ＨＣ０3を溶解
緩衝液Ａ、Ｍｉ１１ｉ Ｑ水中、０.１％Ｖ／Ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
緩衝液Ｂ、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中、６０％Ｖ／Ｖアセトニトリル、０.１％Ｖ／ＶＴＦＡ
ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４−４１１および２２５−２６０にそれぞれ対応する２つの各ＨＣＶペプチド１５ｍｇを、１０倍過剰量のＤＴＴを含む２.５ｍ１の０.１Ｍ炭酸水素アンモニウムに加えた。生成した溶液をペプチドが溶解するまで撹拝し、次いで室温で１時間そのままおいた。２対のＳＥＰ−ＰＡＫｓを連結し、約２０ｍｌのメタノール、次いで２０ｍｌの緩衝液Ａを各対のＳＥＰ−ＰＡＫｓに通すことにより活性化した。各ペプチド／ＤＴＴ試料を、ゆっくりと１対のＳＥＰ−ＰＡＫｓに通した。ＤＴＴを２０ｍｌの緩衝液Ａで溶出した。還元されたペプチドを、７ｍｌの緩衝液Ｂで事前に重さを量ったボトル中に溶出し、次いで一晩凍結乾燥した。次いでこのボトルの重さを量り、回収されたポリペプチドの量を測定した。次いで、還元されたペプチドを、ＭＣＳ活性化担体タンパク質に即座にカップリングした。
【０１５２】
（ＨＣＶペプチドのＭＣＳ活生ヒタンパクヘのカップリング）
５ｍＭのＥＤＴＡを伴う約１００ｍ１の０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.６６）を、真空下で脱気し、次いで１０分間窒素を吹き込んだ。ＭＣＳ活性化担体タンパク質の１０ｍｇ／ｍｌ溶液２伽１に、過剰の発泡を防ぐために窒素を注意深く吹き込んだ。各５ｍｇの還元ペプチドを、約０.２ｍｌの脱気され吹き込まれたリン酸／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６.６６）中に溶解し、次いでＭＣＳ活性化担体タンパク質溶液と混合した。得られた混合物を、スクリューキャップボトル中に移し、次いで窒素を充満させ密封した。この溶液を、Ｂｒａｎｓｏｎ ２０００R音波処理バス中に２分間おいてさらに脱気した。このボトルを
、アルミホイルで被い、振とうテーブル上で緩やかに撹拝しながら室温で一晩インキュベートした。
【０１５３】
得られたコンジュゲートは可溶性であり、カップリングされなかったペプチドは、この混合物をリン酸／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６.６６）で平衡化したセファデックスＰＤ１０
カラムに通すことにより除去した。タンパク質画分を採集した。担体タンパク質に結合したペプチドの量を、アミノ酸分析により測定した。
【０１５４】
コンジュゲートおよび担体タンパク質の両方の１５０μ１分量のアミノ酸分析を行った。担体タンパク質だけの寄与によるアミノ酸のレベルの平均割合を測定し、生成した結合ペプチドの量を計算した。セリン、スレオニン、トリプトファン、メチオニン、チロシンおよびシステインは、標準加水分解条件下で改変されるので、これらのアミノ酸のレベルは、測定されなかった。これらの計算で得られた典型的な結果を、表６中に示す。
【０１５５】
【表６】
【０１５６】
コンジュゲートの太字の値は、ペプチド中にも存在していたアミノ酸である。アラニンおよびプロリンを含むコンジュゲートについては、結果を標準化するために、因子（１９３＋１７９＋１８０＋５６）／（２１２）＋１９４＋１５３＋６０＝０.８６５９に、ア
ミノ酸レベルの量を掛けてある。
【０１５７】
（ワクチン組成物の調製）
注射組成物は、上記のように調製されたＭＣＳ活性化ジフテリアトキソイド担体タンパク質に結合したＨＣＶペプチド、および本明細書中に参考として援用された１９９０年１２月１３日に公開されたＰＣＴ国際公開番号第Ｗ０９０４８３７号に記載のサブミクロンの水中油乳化型アジュバントを構成成分とした。さらに、ＨＣＶ結合ペプチドおよびアジュバントに加え、免疫賦活剤である親油性ムラミルペプチド（ＭＴＰ−ＰＥ、ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む注射組成物を調製した。ワクチン組成物は、一般的に５０％のタンパク質および５％の免疫賦活剤から構成された。
【０１５８】
（ＭＴＰ−ＰＥを含むワクチン組成物の処方）
注射ワクチン組成物１０ｍｌの調製：
２.５ｍｌのスクアレン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
Ｍｏ．）
０.２５ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）
０.２５ｍｌ ＳＰＡＮ ８５（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）
１０００μｇ ＭＴＰ−ＰＥ
１０００μｇ ＭＣＳ−活性化ジフテリアトキソイド担体タンパク質に結合したＨＣＶペプチド
（ＭＴＰ−ＰＥを含まないワクチン組成物の処方箋）
注射ワクチン組成物１０ｍｌの調製：
２.５ｍｌのスクアレン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
Ｍｏ．）
０.２５ｍｌ Ｔｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）
０.２５ｍｌ ＳＰＡＮ ８５（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）
１０００μｇ ＭＣＳ−活性化ジフテリアトキソイド担体タンパク質に結合したＨＣＶペプチド
（実施例６）
（ワクチン調製物の毒性についての試験方法）
実施例５の方法により調製したワクチンを、毒性について小動物で試験した。１ｋｇ当り５０μｇのワクチンを、モルモット、マウスおよびウサギに腹腔内注射して投与した。
アカゲザルおよび霊長類にも、腹腔内注射によりワクチンを投与した。アカゲザルおよび霊長類の試験個体群の半数には、５μｇ／ｋｇで投与したが、一方他の半数には、５０μｇ／ｋｇで投与した。各研究で用いた対照動物には、ウイルスペプチドを含まないワクチン調製物の成分からなる同等量の組成物を注射した。
【０１５９】
実施例５の方法により調製したワクチンを、毒性について小動物で試験した。１ｋｇ当り５０μｇのワクチンを、モルモット、マウスおよびウサギに腹腔内注射して投与した。アカゲザルおよび霊長類にも、腹腔内注射によりワクチンを投与した。アカゲザルおよび霊長類の試験個体群の半数には、５μｇ／ｋｇで投与したが、一方他の半数には、５０μｇ／ｋｇで投与した。各研究で用いた対照動物には、ウイルスペプチドを含まないワクチン調製物の成分からなる同等量の組成物を注射した。
【０１６０】
（実施例７）
（ワクチンにおける投与動物における中和抗体の産生の証明）
実施例５の方法により調製したワクチンを、ワクチン投与した被験体におけるウイルス中和抗体の産生を誘起するワクチンの効果を測定するために、チンパンジーで試験した。チンパンジーに、実施例５の方法により調製したワクチンを５μｇ／ｋｇの投与量で、６ヵ月の期間にわたり０、１、３、および６カ月の間隔をおいて投与した。対照のチンパンジーには、ウイルスペプチドを含まないワクチンの成分からなる同等量の組成物を注射した。最後のワクチン投与を行ってから２週間後、試験および対照の各チンパンジーに、１０ ＣＩＵ50（チンパンジー感染単位）の投与量のＣＤＣ／９１０血漿接種材料で刺激した。ウイルス刺激の１週間後から始めて、各チンパンジーを、ウイルス血症について毎週ベースでモニターした。
【０１６１】
ウイルス血症を検出するために、血液試料および肝臓バイオプシー標本を、数ヵ月間毎週ベースで、対照および試験動物から採取した。肝臓バイオプシーにより採取された組織を、壊死および／または炎症の徴候について組織学的に検査した。さらに、バイオプシー材料由来の肝細胞を、ＨＣＶ感染に特有の細管の存在について電子顕微鏡で検査した。血液試料はまた、ワクチンの調製に使用されなかったウイルスポリペプチドのセグメントに対する抗体の存在について、上記のＥＬＩＳＡアッセイによっても分析された。特に、各血液試料を、ＮＳ3、ＮＳ4、およびＮＳ5ペプチドに対する抗体の存在について、ＥＬＩ
ＳＡによりスクリーニングした。チンパンジーの血清中におけるこれらのペプチドに対する抗体の存在は、ＨＣＶ感染を示した。
【０１６２】
以下の方法を用いて、チンパンジーから採取した血漿中に循環するまたは肝臓バイオプシー組織中に存在するウイルスＲＮＡを検出した。
【０１６３】
（肝臓および血清中のＨＣＶ ＲＮＡを検出するｃＰＣＲ法）
ｃＰＣＲアッセイにおいて、試料中の推定ウイルスＲＮＡを、逆転写酵素でｃＤＮＡに逆転写し、次いで、得られたｃＤＮＡのセグメントを、Ｓａｉｋｉら（１９８６）により記載のＰＣＲ技術の改変法を用いて増幅する。ｃＰＣＲ法に用いるプライマーは、ＨＣＶ
ＲＮＡから誘導する。これは本明細書で提供されるＨＣＶ ｃＤＮＡのファミリーにより同定され得る。ＨＣＶ−ＲＮＡに対応する増幅生成物を、本明細書で提供されるＨＣＶ
ｃＤＮＡのファミリーから誘導されるプローブを使用して検出する。
【０１６４】
これらの研究に用いたｃＰＣＲ／ＨＣＶアッセイは、ＲＮＡの調製、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写、ＰＣＲによるｃＤＮＡの特異的セグメントの増幅、およびＰＣＲ生成物の分析のための以下の方法を使用して実施した。
【０１６５】
全ＲＮＡを調製するために、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載のグアニジウムイ
ソチオシアネート法を使用して、ＲＮＡを肝臓から抽出した。
【０１６６】
全ＲＮＡを血漿から単離するために、血漿をＴＥＮＢ（０.１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ
トリス−ＨＣ１（ｐＨ８.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で５〜１０倍に希釈し、そして、プ
ロティナーゼＫ／ＳＤＳ溶液（０.５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、２０マ
イクログラム／ｍｌポリＡ担体）中で６０〜９０分間３７℃でインキュベートした。試料を、フェノール（ｐＨ６.５）で１回抽出し、得られた有機相を０.１％ＳＤＳ含有ＴＥＮＢで再び１回抽出し、そして、両抽出の水相をプールして、同体積のフェノール／ＣＨＣｌ3／イソアミルアルコール［１：１（９９：１）］で２回抽出した。得られた水相を、
同体積のＣＨＣｌ3／イソアミルアルコール（９９：１）で２回抽出し、そして、０.２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６.５）、および２.５倍容量の１００％エタノールを用いてエタノール沈澱した；沈澱は、−２０℃で一晩行った。
【０１６７】
ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用したｃＤＮＡは、対応するｃＤＮＡの調製のために選抜された試料を使用して調製した。各ＲＮＡ試料（２マイクログラムのチンパンジー肝臓の熱変性全ＲＮＡまたは２マイクロリットルの血漿から得たＲＮＡを含む）を、１マイクロモルの各プライマー、１ミリリットルの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５ミリモルのＭｇＣｌ2、５ミリモルのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、７３ミリモルのＫＣｌ、４０単位のＲＮアーゼインヒビター（ＲＮＡＳＩＮ）、および５単位のＡＭＶ逆転写酵素を含む２５マイクロリットル反応物中でインキュベートした。このインキュベーションは、３７℃で６０分間行った。ｃＤＮＡ合成に続いて、反応物を５０マイクロリットルの脱イオン水（ＤＩＷ）で希釈し、１０分間沸騰し、氷上で冷却した。
【０１６８】
ＨＣＶ ｃＤＮＡのセグメントの増幅は、それらの配列がＨＣＶ ｃＤＮＡクローン３６（アンチ−センス）および３７ｂ（センス）から誘導される２つの合成オリゴマー１６量体プライマーを使用して実施した。クローン３６由来のプライマーの配列は以下であった：
【０１６９】
【化３】
【０１７０】
クローン３７ｂ由来のプライマーの配列は以下であった：
【０１７１】
【化４】
【０１７２】
各プライマーは、最終濃度１マイクロモルで用いた。プライマーに隣接するＨＣＶ ｃＤＮＡのセグメントを増幅するために、ｃＤＮＡ試料を、０.１マイクログラムのＲＮア
ーゼＡおよびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＰＣＲキット（Ｎ８０１−００４３またはＮ８０１−００５５）のＰＣＲ反応物を用いて、製造者の指示に従ってインキュベートした。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ熱サイクラーで、３０サイクルまたは６０サイクルいずれかで実施した。各サイクルは、９４℃１分での変性段階、３７℃２分でのアニーリング段階、および７２℃３分での伸長段階で構成された。しかしながら、最終サイクル（３０または６０）における伸長段階は、３分ではなく７分であった。増幅後、試料を同体積のフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出
し、次いで同体積のクロロホルムで抽出し、次いで試料を０.２Ｍの酢酸ナトリウム含有
エタノールで沈澱させた。
【０１７３】
ｃＰＣＲ生成物を、次のようにして分析した。生成物を、Ｍｕｒａｋａｗａら（１９８８）に従って１.８％アルカリ性アガロースゲル電気泳動にかけ、そして、０.４ＭのＮａＯＨ中でゲルを一晩ブロッティングすることにより、ＺＥＴＡTMＰｒｏｂｅ紙（ＢｉｏＲａｄ Ｃｏｒｐ．）上に移した。ブロットを、２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０.１５Ｍ
ＮａＣｌ、０.０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）中で中和し、０.３ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.８、１５ｍＭのＥＤＴＡ、１.０％のＳＤＳ、０.
５％の脱脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ Ｃｏ．）、および０.５ｍｇ／ｍｌの超音波処理さ
れ変性されたサケ精子ＤＮＡ中でプレハイブリダイズした。ＨＣＶｃＤＮＡフラグメントについて分析すべきブロットを、米国出願番号０７／４５６,６３７に記載のクローン３
５のＨＣＶ ｃＤＮＡ挿入配列のニックトランスレーションにより生成された32標識化プローブに、ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、ブロットを１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０１Ｍのクエン酸ナトリウム）中で６５℃で洗浄し、乾燥し、そしてオートラジオグラフを記録した。生成物の期待サイズは、５８６ヌクレオチド長である；プローブとハイブリダイズされて、このサイズの範囲でゲル中を移動した生成物は、ウイルスＲＮＡについて陽性であると評価された。
【０１７４】
分析される各試料中のＲＮＡの存在を立証するために、対照として、アルファ−１抗トリプシンｍＲＮＡを増幅するために設計されたｃＰＣＲプライマーを用いるｃＰＣＲを実施した。アルファ−１抗トリプシン遺伝子のコード領域は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８４）中に記載されている。アルファ−抗トリプシン遺伝子のコード領域の３６５ヌクレオチドのフラグメントを増幅するために設計された合成オリゴマー１６量体プライマーを、ヌクレオチド２２−３７位（センス）およびヌクレオチド３７２−３８７位（アンチセンス）から誘導した。ｃＤＮＡ／ＰＣＲプライマー配列の間にあるがそれを含まない32Ｐニックトランスレーションプローブを用いて、ＰＣＲ生成物を検出した。
【０１７５】
ＰＣＲ反応の極感受性のため、すべての試料を少なくとも３回試みた。次の予防措置を取ってあらゆる偽陽性シグナルを取り除いた：１）Ｏ−リングゴム栓を有するスクリューキャップ管を用いてエアロゾルを除去；２）ディスポーザブルピストン／キャピラリーを有するＲａｎｉｎ ＭＩＣＲＯＭＡＮRの陽圧ピペッター（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｓｐ
ｌａｃｅｍｅｎｔ ｐｉｐｅｔｔｅｒｓ）でピペッティング；および３）２つの非連続的ｃＤＮＡクローンからのｃＤＮＡおよびＰＣＲプライマーに対するオリゴヌクレオチド配列の選択。
【産業上の利用可能性】
【０１７６】
本発明の免疫反応性組成物は、例えば、ＨＣＶ感染、特に慢性ＨＣＶ感染に対する個体の処置にも使用し得るワクチンのような材料の調製において有用である。さらに、この組成物は、生物学的試料におけるＨＣＶの多数の変異体の検出に用いる材料を調製するために使用し得る。例えば、本発明の免疫反応性組成物は、１つ以上のＨＣＶ単離体を認識するポリクローナル抗体組成物を生成するために使用され得、または抗ＨＣＶ抗体イムノアッセイの抗原として使用され得る。後者の方法は、血液生成物をＨＣＶ汚染の可能性についてスクリーニングするために使用され得る。ポリクローナル抗血清または抗体は、個体の受動免疫のために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、ＨＣＶゲノムの遺伝学的な構築を模式図的に示す。
【図２】図２は、Ｉ群およびＩＩ群のＨＣＶ単離体によってコードされるＥ１タンパク質の推定アミノ酸配列の比較を示す。
【図３】図３は図２の続きである。
【図４】図４は、ＨＣＶ単離体の推定Ｅ２／ＮＳ１領域のアミノ酸配列の比較を示す。
【図５】図５は図４の続きである。
【図６】図６は図５の続きである。
【図７】図７は、推定ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１タンパク質（アミノ酸３８４−４２０位）のアミノ末端領域、およびＨＩＶ−１のｇｐ１２０ Ｖ３超可変領域に関する抗原性プロフィールを示すグラフである。
【図８】図８は、ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１タンパク質（アミノ酸３８４−４２０位）のアミノ末端領域由来の所定の残基が、α−ヘリックス、β−シートまたはβ−ターンのいずれかの二次構造的特徴において見い出される確率の百分率を表す一連のグラフを示す。
【図９】図９は、ＨＣＶ １８（パネルＡ）またはＴｈ（パネルＤ）由来の血漿中の抗体と、ＨＣＶ単離体ＨＣＴ １８の３８４から４１５または４１６までのアミノ酸から誘導される部分的に重複するビオチニル化８量体ペプチドとの反応性を表す棒グラフである。
【図１０】図１０は、ＨＣＶ １８（パネルＢ）またはＴｈ（パネルＥ）由来の血漿中の抗体と、ＨＣＶ単離体Ｔｈの３８４から４１５または４１６までのアミノ酸から誘導される部分的に重複するビオチニル化８量体ペプチドとの反応性を表す棒グラフである。
【図１１】図１１は、ＨＣＶ １８（パネルＣ）またはＴｈ（パネルＦ）由来の血漿中の抗体と、ＨＣＶ単離体ＨＣＶ Ｊ１の３８４から４１５または４１６までのアミノ酸から誘導される部分的に重複するビオチニル化８量体ペプチドとの反応性を表す棒グラフである。
【図１２】図１２は、Ｑ１およびＱ３の単離体に対して与えられたＥ２／ＮＳ１ポリペプチドの２つの領域の推定アミノ酸配列、すなわち３８４−４１４位のアミノ酸および５４７−６４７位のアミノ酸を示す。
【図１３】図１３は、単離体ＨＣＶ Ｊ１．１およびＪ１．２の推定アミノ酸配列の３８４位から６４７位のアミノ酸を示す。
【図１４】図１４は、単離体ＨＣＴ２７およびＨＣＶＥ１の推定アミノ酸配列の３８４位から６５１位のアミノ酸を示す。
【図１５】図１５は、単離体ＨＣＶ−１の完全ポリタンパク質配列を示す。
【図１６】図１６は図１５の続きである。
【図１７】図１７は図１６の続きである。
【図１８】図１８は図１７の続きである。
【図１９】図１９は図１８の続きである。
【図２０】図２０は図１９の続きである。
【図２１】図２１は図２０の続きである。
【図２２】図２２は図２１の続きである。
【図２３】図２３は図２２の続きである。
【図２４】図２４は図２３の続きである。
【図２５】図２５は図２４の続きである。
【図２６】図２６は図２５の続きである。
【図２７】図２７は図２６の続きである。
【図２８】図２８は図２７の続きである。
【図２９】図２９は図２８の続きである。
【図３０】図３０は図２９の続きである。
【図３１】図３１は図３０の続きである。
【図３２】図３２は図３１の続きである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【公開番号】特開２００８−１３３３０１（Ｐ２００８−１３３３０１Ａ）
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３８７９９（Ｐ２００８−３８７９９）
【出願日】平成２０年２月２０日（２００８．２．２０）
【分割の表示】特願２００５−２０４５４（Ｐ２００５−２０４５４）の分割
【原出願日】平成４年９月１１日（１９９２．９．１１）
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２０日（２００８．２．２０）
【分割の表示】特願２００５−２０４５４（Ｐ２００５−２０４５４）の分割
【原出願日】平成４年９月１１日（１９９２．９．１１）
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
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