全血中の分子または薬物の検出のための診断検査
本発明は、細胞内リガンドによって結合されている分析物を検出するためのアッセイにおいて用いるための検査試料を調製する方法を提供する。この方法は、溶解試薬、および前記細胞内リガンドに対してタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含むアッセイ試薬と検査試料を接触させて、引き続く抽出ステップ無しに免疫アッセイで用いるのに適合する混合物を形成することを典型的に伴う。本発明の他の態様は、関連の免疫アッセイおよび検査キットを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アッセイ前に生物学的試料を凍結または貯蔵することによって生成される試料の偏りを低減または排除するための、診断アッセイ用の試料の調製における１つ以上のプロテアーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床対象となる分析物の多くは細胞によって吸収され、または検査試料の１つ以上の他の成分と複合されるようになる。したがって、試料に存在する分析物の量の正確な測定を得るには、分析物がアッセイにおいて検出されるために細胞または他の成分から放出されるような条件下で、試料を処理し、および／またはアッセイを行う必要がある。
【０００３】
例えば、タクロリムス、エベロリムス、テムソロリムス（ｔｅｍｓｏｒｏｌｉｍｕｓ）およびシクロスポリンなどの免疫抑制薬は、移植手術後の臓器または組織の拒絶反応の処置、移植片対宿主病の処置、およびヒトにおける自己免疫疾患の処置に効果的である。免疫抑制薬治療の間、免疫抑制薬の血中濃度レベルをモニターするのは臨床ケアの重要な局面であり、その理由は不十分な薬物レベルは移植片（臓器または組織）の拒絶反応をもたらし、過剰な薬物レベルは望ましくない副作用および毒性をもたらすからである。したがって、免疫抑制薬の血中レベルが測定され、そこで好適な濃度の薬物レベルを維持するように薬物投与量が調節され得る。免疫抑制薬の血中レベルを決定するための診断アッセイは、このように広範な臨床の使用を見出している。
【０００４】
最初に、免疫抑制薬が抽出され、患者の試料の他の成分から分離されなければならない。患者の試料における免疫抑制剤の大部分は、結合タンパク質など、様々な「担体」分子との複合体において存在する。シロリムス、タクロリムスおよびシクロスポリンは、患者検体の赤血球に優勢に見出され、シロリムスおよびタクロリムスではＦＫＢＰ、およびシクロスポリンではシクロフィリンである、特異的な結合タンパク質に関連している。検体における全薬物濃度を確実に正確に測定するには、結合タンパク質に結合している薬物が定量前に遊離されることが好ましい。これは、細胞を溶解するための界面活性剤、および／または試料のタンパク質を変性するための有機溶剤を用いることによって取り組まれている。
【０００５】
結合タンパク質から薬物を抽出した後、薬物は、吸光度または質量分析の検出と一緒の免疫アッセイまたはクロマトグラフィーを含めた数々の異なる方法において測定され得る。免疫抑制薬に対する免疫アッセイは様々なフォーマットにおいて利用可能であるが、全てが、免疫抑制薬に対する抗体または結合タンパク質（例えば、ＦＫＢＰ）の結合を用いている。一般的に用いられている免疫アッセイは、第１の抗体の免疫抑制薬への結合、および標識された免疫抑制薬（例えばアクリジニウム−シロリムス）の残りの遊離の抗体結合性部位への結合、および引き続く標識の検出による定量を伴うアッセイである。
【発明の概要】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、１つ以上のプロテアーゼが、非溶解の新鮮な試料（例えば、患者の血液試料）全体を用いたものと凍結−解凍溶解した試料（例えば、標準物質希釈液）の間に観察される分析物（例えば、薬物）濃度の偏りを解決するために、調製物（例えば、免疫アッセイ用の）中に組み込まれ得るという知見に関する。プロテアーゼは、結合タンパク質が時間とともにタンパク質分解し、したがってそのリガンド（分析物）に対する親和性を変更し、これは次に診断アッセイにおいて検出されるリガンドの濃度を変更する診断アッセイ用の試料の調製において特に有用であるということも見い出された。
【０００７】
したがって、ある実施形態において、本発明は、細胞内リガンドによって結合されている分析物を検出するためのアッセイにおいて用いるための検査試料を調製する方法を提供する。この方法は、溶解試薬（または１つ以上のその成分）を含むアッセイ試薬および細胞内リガンドに対してタンパク質分解活性を有するプロテアーゼと前記検査試料（例えば、生物学的試料）を接触させて、引き続く抽出ステップ無しに免疫アッセイで用いるのに適合する混合物を形成することを典型的に伴う。様々な実施形態において、検査試料は全血または血液分画（例えば、血清）を含む。様々な実施形態において、検査試料はヒト血液（例えば、免疫抑制薬で処置したヒトからの血液）を含む。様々な実施形態において、プロテアーゼはセリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼからなる群から選択される。ある実施形態において、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、ディスパーゼおよびトリプシンからなる群から選択される。様々な実施形態において、溶解試薬は、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなど）を含む。ある実施形態において、グリコール対アルコールの比率は約４：１から約１：４まで、より好ましくは約４：１から約１：２までの範囲にある。ある実施形態において、検査試料は、約２：１から約１：１０までの、好ましくは約２：１から約１：５までの、より好ましくは約２：１から約１：２までの範囲の比率の試料：溶解試薬の混合物を形成するように、溶解試薬（または溶解試薬の成分）に加えられる。ある実施形態において、この方法は、試料を遠心分離することを含まない。ある実施形態において、界面活性剤は、検査試料を溶解または可溶化するために用いられない。ある実施形態において、この方法は、検査試料を界面活性剤と接触させることを含まない。ある実施形態において、アッセイ試薬は、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合する競合物質をさらに含むが、アッセイ検出系におけるリガンド（分析物）捕捉系（例えば、抗体または他の捕捉リガンド）と実質的に交差反応性ではない。ある実施形態において、細胞内リガンドはイムノフィリンリガンドである。ある実施形態において、分析物は免疫抑制薬を含み、競合物質は、異なるが構造上類似の分子（例えば、類似体）（免疫抑制薬であってもよく、またはなくてもよい）を含む。ある実施形態において、分析物は、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬を含む。
【０００８】
ある実施形態において、本発明は、細胞内リガンドによって結合されている分析物を検出するためのアッセイにおいて用いるための検査試料を調製する方法を提供する。この方法は、界面活性剤を含まない溶解試薬、および細胞内リガンドに対してタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む試薬と検査試料を接触させることを典型的に伴う。様々な実施形態において、検査試料は全血または血液分画（例えば、血清）を含む。様々な実施形態において、検査試料はヒト血液（例えば、免疫抑制薬で処置したヒトからの血液）を含む。様々な実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼからなる群から選択される。ある実施形態において、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、ディスパーゼおよびトリプシンからなる群から選択される。様々な実施形態において、溶解試薬は、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなど）を含む。ある実施形態において、グリコール対アルコールの比率は、約４：１から約１：４まで、より好ましくは約４：１から約１：２までの範囲にある。ある実施形態において、検査試料は、約２：１から約１：１０まで、好ましくは約２：１から約１：５まで、より好ましくは約２：１から約１：２までの範囲における比率の試料：溶解試薬の混合物を形成するように、溶解試薬（または溶解試薬の成分）に加えられる。ある実施形態において、この方法は、試料を遠心分離することを含まない。ある実施形態において、界面活性剤は、検査試料を溶解または可溶化するために用いられない。ある実施形態において、この方法は、検査試料を界面活性剤と接触させることを含まない。ある実施形態において、アッセイ試薬は、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合する競合物質をさらに含むが、アッセイ検出系におけるリガンド（分析物）捕捉系（例えば、抗体または他の捕捉リガンド）と実質的に交差反応性ではない。ある実施形態において、細胞内リガンドはイムノフィリンリガンドである。ある実施形態において、分析物は免疫抑制薬を含み、競合物質が、異なるが構造上類似の分子（例えば、類似体）（免疫抑制薬であってもよく、またはなくてもよい）を含む。ある実施形態において、分析物は、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬を含む。
【０００９】
検査試料における分析物（例えば、免疫抑制薬）の濃度を評価するための方法も提供される。この方法は、アッセイ試薬と検査試料を接触させて、引き続く抽出ステップ無しに免疫アッセイにおける使用に適合するアッセイ混合物を生成すること（アッセイ試薬は溶解試薬（またはその成分）および分析物に結合する細胞内リガンドに対してタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む。）、分析物（例えば、免疫抑制薬）について溶解混合物をアッセイすることを典型的に伴う。ある実施形態において、アッセイ混合物は均一な混合物であり、および／またはアッセイは免疫アッセイを含む。ある実施形態において、免疫抑制薬は、シロリムス、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される。ある実施形態において、検査試料はヒト血液試料（例えば、全血または血液分画（例えば、血清））を含む。
【００１０】
ある実施形態において、この方法は試料を遠心分離することを含まない。ある実施形態において、界面活性剤は、検査試料を溶解または可溶化するために用いられない。ある実施形態において、この方法は、検査試料を界面活性剤と接触させることを含まない。ある実施形態において、アッセイ試薬は、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合する競合物質をさらに含むが、アッセイ検出系におけるリガンド（分析物）捕捉系（例えば、抗体または他の捕捉リガンド）と実質的に交差反応性ではない。ある実施形態において、細胞内リガンドはイムノフィリンリガンドである。ある実施形態において、分析物は免疫抑制薬を含み、競合物質は、異なるが構造上類似の分子（例えば、類似体）（免疫抑制薬であってもよく、またはなくてもよい）を含む。ある実施形態において、分析物は、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬を含む。
【００１１】
ある実施形態において、本発明は、少なくとも１つの免疫抑制薬（例えば、シロリムス、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびこれらの任意の化合物の類似体）と特異的に結合することができる少なくとも１つの抗体またはタンパク質、ならびに界面活性剤でない溶解試薬（例えば、本明細書に記載される通り）、ならびにイムノフィリンリガンドを分解するプロテアーゼを含むアッセイ試薬を含む検査キットを提供する。ある実施形態において、界面活性剤でない溶解試薬は、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコールを含む。キットは、場合により、免疫抑制薬を少なくとも１つ含む対照組成物をさらに含むことができる。ある実施形態において、キットは、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合する競合物質をさらに含むが、アッセイ検出系におけるリガンド（分析物）捕捉系（例えば、抗体または他の捕捉リガンド）と交差反応性ではない。ある実施形態において、細胞内リガンドはイムノフィリンリガンドである。ある実施形態において、分析物は免疫抑制薬を含み、競合物質は、異なるが構造上類似の分子（例えば、類似体）（免疫抑制薬であってもよく、またはなくてもよい）を含む。ある実施形態において、分析物は、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬を含む。ある実施形態において、競合物質はアッセイ試薬において提供される。ある実施形態において、細胞内リガンドはイムノフィリンリガンドである。様々な実施形態において、競合物質はアッセイされる免疫抑制薬とは異なるが、構造的には類似である免疫抑制薬を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本明細書に記載する試料調製方法の一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、アッセイ前に生物学的試料を凍結または貯蔵することによって生成される試料の偏りを低減または排除するための、診断アッセイ用の試料の調製における１つ以上のプロテアーゼの使用に概ね関する。
【００１４】
定義
特許請求の範囲および明細書において用いられる用語は、別段に特定しなければ以下に述べるように定義される。
【００１５】
本明細書で用いられる「免疫抑制薬（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ ｄｒｕｇ）」または「免疫抑制薬（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）」は、ラパマイシン（シロリムス）、またはシクロスポリンＡとしても知られているシクロスポリンのいずれかと同じまたは類似の化学構造を有する、小分子または抗体ベースいずれかの治療用化合物を意味する。ラパマイシンもしくはシクロスポリンいずれかの、任意の知られている類似体、または以降開発される類似体は、本明細書における免疫抑制薬とみなされる。好ましい免疫抑制剤は、シロリムス、タクロリムス、エベロリムス、テムソロリムス、ゾタロリムスおよびシクロスポリンを含む。タクロリムスおよびシクロスポリンは、インターロイキン２などのサイトカインの阻害によって免疫系のＴリンパ球の早期の活性化を抑制するカルシニューリン阻害薬である。これとは対照的に、シロリムス、エベロリムスおよびゾタロリムスの主な標的は、特異的な細胞周期調節タンパク質である、ラパマイシンの哺乳動物の標的（ｍＴＯＲ）である。ｍＴＯＲの阻害は、サイトカイン駆動性のＴリンパ球の増殖の抑制をもたらす。
【００１６】
シクロスポリンの化学式は、式Ａにある。シロリムス（ラパマイシン）の化学式は、式Ｂにある。エベロリムス（ＲＡＤ）のシロリムスとの構造上の違いの化学式は、式Ｃにある。
【００１７】
【化１】
【００１８】
シクロスポリンの多くの誘導体および類似体が調製されている。本発明は、シクロスポリンまたは任意のその類似体のための溶解試薬、溶解方法、アッセイおよびアッセイキットを含む。
【００１９】
ラパマイシンの多くの誘導体または類似体が調製されている。例えば、これらは、ラパマイシンのエステルのモノおよびジエステル誘導体（ＰＣＴ国際公開第９２／０５１７９号パンフレット）、ラパマイシンの２７−オキシム（欧州特許第０４６７６０６号明細書）、ラパマイシンの４２−オキソ類似体（米国特許第５，０２３，２６２号明細書）、二環式ラパマイシン（米国特許第５，１２０，７２５号明細書）、ラパマイシン二量体（米国特許第５，１２０，７２７号明細書）、ラパマイシンのシリルエーテル（米国特許第５，１２０，８４２号明細書）、ならびにアリールスルホネートおよびスルファメート（米国特許第５，１７７，２０３号明細書）の調製物を含んでいる。ラパマイシンは、その天然に存在するエナンチオマーの形態において最近合成された（Ｋ．Ｃ．Ｎｉｃｏｌａｏｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３年、１１５巻、４４１９−４４２０頁；Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３年、１１５巻、７９０６−７９０７頁；Ｓ．Ｊ．Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３年、１１５巻、９３４５−９３４６頁）。本発明は、ラパマイシンまたは任意のその類似体のための溶解試薬、溶解方法、アッセイおよびアッセイキットを含む。
【００２０】
ラパマイシンの別の免疫抑制薬の類似体は、Ｓ．ツクバエンシス（Ｓ．ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）株から単離された、タクロリムスとしても知られているＦＫ−５０６である。ＦＫ５０６の化学式は、欧州特許第０２９３８９２ Ｂ１号明細書において公開されている。ＦＫ−５０６の類似体は、それだけには限定されないが、関連の天然物であるＦＲ−９００５２０およびＦＲ−９００５２３を含み、これらはＣ−２１のそのアルキル置換基においてＦＫ−５０６と異なっており、Ｓ．ハイグロスコピカス・ヤクシムナエンシス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｙａｋｕｓｈｉｍｎａｅｎｓｉｓ）から単離された。Ｓ．ツクバエンシスによって生成される別の類似体であるＦＲ−９００５２５は、ピペコリン酸部分がプロリン基で置換されている点でＦＫ−５０６と異なる。ＦＫ５０６の基本構造および免疫学的性質を保持している多数の化合物が、数々の出版物（例えば、欧州特許第１８４１６２号、欧州特許第３１５９７３号、欧州特許第３２３０４２号、欧州特許第４２３７１４号、欧州特許第４２７６８０号、欧州特許第４６５４２６号、欧州特許第４８４９３６号、欧州特許第５３２０８８号および欧州特許第４７４１２６号明細書；ＰＣＴ国際公開第９１／１３８８９号パンフレット、第９１／１９４９５号パンフレットおよび第９３／５０５９号パンフレットなど）に記載されている。本発明は、ＦＫ−５０６または任意のその類似体のための溶解試薬、溶解方法、アッセイおよびアッセイキットを含む。テムソロリムスは、本発明でモニターされ得るシロリムスの別のエステル誘導体である。
【００２１】
今日ではゾタロリムスとしてより知られているＡＢＴ−５７８［４０−エピ−（１−テトラゾリル）−ラパマイシン］は、ラパマイシンに由来する、半合成のマクロライドトリエン抗生物質である。ゾタロリムスの構造を式Ｄに示す。
【００２２】
【化２】
【００２３】
免疫抑制薬に関して本明細書で用いられる、「構造的に類似する」の語は、薬物が少なくとも１つの共通の結合パートナー（例えば、結合タンパク質）に競合的に結合するのに十分類似している構造を薬物が有することを示す。
【００２４】
「検査試料」の語は、免疫抑制薬分析物の供給源である、動物の身体の成分、組織または液体を意味する。これらの成分、組織および液体は、ヒトおよび動物の体液（例えば、全血、血清、血漿、滑液、脳脊髄液、尿、リンパ液、ならびに呼吸器、腸管および尿生殖路の様々な外分泌、涙、唾液、乳汁、白血球、骨髄腫など）、生物学的液体（例えば、細胞培養上清）、固定された組織検体ならびに固定された細胞検体を含む。検査試料がヒト末梢血試料であるのが好ましい。
【００２５】
本明細書で用いられる「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。この語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびこれらのフラグメント、ならびに免疫グロブリン遺伝子配列から操作される分子を包含する。認められている免疫グロブリン遺伝子は、カッパー、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパーまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、これらは、今度はそれぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの免疫グロブリンのクラスを規定する。
【００２６】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含むことが知られている。各々の四量体は、各対が１個の「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１個の「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する、２本の同一のポリペプチド鎖対からなる。各鎖のＮ末端は、抗原の認識を主に担っている約１００から１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を規定している。「可変軽鎖（ＶＬ）」および「可変重鎖（ＶＨ）」の語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を意味する。
【００２７】
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして存在し、または様々なペプチダーゼで消化することによって生成された十分に特徴付けられた数々のフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結より下の抗体を消化して、それ自体が、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結している軽鎖であるＦａｂの二量体であるＦ（ａｂ’）２を生成する。Ｆ（ａｂ’）２は、穏やかな条件下で還元されてヒンジ領域におけるジスルフィド連結を分解し、それによって（Ｆａｂ’）２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換することがある。Ｆａｂ’モノマーは、本質的にはヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳しい記載には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、（１９９３年）を参照されたい）。様々な抗体フラグメントがインタクトな抗体の消化に関して定義されており、当業者であればこのようなＦａｂ’フラグメントは、化学的に、または組換えＤＮＡ法の利用によっていずれかで新たに合成され得ることを理解する。
【００２８】
したがって、本明細書で用いられる「抗体」の語は、抗体全体を修飾することによって生成される抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成される抗体フラグメントのいずれかも含む。「抗体」の語は、一本鎖抗体（一本鎖のポリペプチドとして存在する抗体）、より好ましくは一本鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）も包含し、一本鎖Ｆｖ抗体では可変重鎖および可変軽鎖が（直接またはペプチドリンカーによって）一緒に連結して連続したポリペプチドを形成する。一本鎖Ｆｖ抗体は、（直接連結しているまたはペプチドをコードするリンカーによって連結しているＶＨコード配列およびＶＬコード配列を含む核酸から発現され得る）共有結合しているＶＨ−ＶＬヘテロダイマーである（Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、５８７９−５８８３頁）。ＶＨとＶＬは一本鎖ポリペプチドとして各々に連結しており、ＶＨドメインとＶＬドメインは非共有結合している。ｓｃＦｖ抗体および数々の他の構造は、抗体Ｖ領域から天然では凝集しているが化学的には分離されている軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造に実質的に類似している３次元構造に折りたたむ分子に変換することが、当業者に知られている（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号明細書、第５，１３２，４０５号明細書および第４，９５６，７７８号明細書を参照されたい）。
【００２９】
本明細書で用いられる「分析物」は、検査試料に存在することが疑われ得る、検出されるべき物質を意味する。分析物は、それに対して天然に存在する特異的な結合パートナーが存在し、またはそれに対して特異的な結合パートナーが調製され得る任意の物質であってよい。したがって、分析物は、アッセイにおいて１つ以上の特異的な結合パートナーに結合することができる物質である。
【００３０】
本明細書で用いられる「結合パートナー」は、結合対のメンバーであり、すなわち分子の一方が第２の分子に結合している１対の分子である。特異的に結合している結合パートナーは、「特異的な結合パートナー」と呼ばれる。免疫アッセイにおいて通常用いられる抗原および抗体の結合パートナーの他に、他の特異的な結合パートナーは、ビオチンおよびアビジン、炭水化物およびレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクター分子およびレセプター分子、補助因子および酵素、酵素阻害物質および酵素などを含むことができる。免疫反応性の特異的な結合パートナーは、組換えＤＮＡ法によって形成されるものを含めて、抗原、抗原フラグメント、抗体および抗体フラグメント、モノクローナルおよびポリクローナルの両方ならびにそれらの複合体を含む。
【００３１】
「特異的な結合」の語は、本明細書において、特異的な部位での、結合パートナーの別のものへの優先的な結合（例えば、ポリペプチドおよびリガンド（分析物）、２つのポリペプチド、ポリペプチドおよび核酸分子、または２つの核酸分子）と定義される。「特異的な結合」の語は、標的の分子／配列に対する結合の優先度（例えば、親和性）が、非特異的な標的分子（例えば、特異的に認識される部位を欠く、ランダムに産生された分子）の少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０または２０倍上回ることを示している。
【００３２】
免疫抑制薬に特異的に結合する抗体は、その免疫抑制薬に「特異的」であるといわれる。
【００３３】
「捕捉試薬」または「捕捉剤」の用語は、分析物に結合する結合パートナー、より詳しくは分析物に特異的に結合する結合パートナーを意味する。様々な実施形態において、捕捉剤は固相に付着していてよい。本明細書で用いられる、固相に固定されている捕捉剤の分析物に対する結合は、「固相に固定されている複合体」を形成する。
【００３４】
「標識されている検出剤」の語は、本明細書において用いられて、分析物に、好ましくは特異的に結合している結合パートナーを意味し、検出可能な標識で標識され、またはアッセイにおける使用の間に検出可能な標識で標識される結合パートナーである。
【００３５】
「検出可能な標識」は、検出可能である部分、または検出可能になされ得る部分を含む。
【００３６】
標識されている検出剤に関して用いられる「直接標識」は、任意の手段によって検出剤に付着している検出可能な標識である。
【００３７】
標識されている検出剤に関して用いられる「間接標識」は、検出剤に特異的に結合している検出可能な標識である。したがって、間接標識は、検出剤の部分の特異的な結合パートナーである部分を含む。ビオチンおよびアビジンは、例えば、ビオチン化された抗体を標識されたアビジンに接触させて間接的に標識された抗体を生成することによって用いられるこのような部分の例である。
【００３８】
本明細書で用いられる「指示薬」の語は、標識と接触して検出可能なシグナルを生成する任意の薬剤を意味する。したがって、例えば、従来の酵素標識において、酵素で標識された抗体は、基質（指示薬）と接触して検出可能なシグナル（例えば、着色した反応生成物）を生成することができる。
【００３９】
本明細書で用いられる「グリコール類似体」は、炭素原子２個から６個までを有する任意のグリコールである。
【００４０】
溶解混合物は、正確な、信頼できるピペット操作（手操作または自動化されたシステムの使用のいずれかで）を可能にするように、大型粒子が十分にない場合に「均一である」と言われる。
【００４１】
アッセイ混合物に関して用いられる場合の「引き続く抽出ステップ無しに」の語句は、アッセイ混合物が、（本明細書で記載される）免疫アッセイに関して「そのままで」用意ができていることを示す。したがって、分析前にさらなる遠心分離は必要とされない。混合物はそのままで分析器に適用する用意ができている。
【００４２】
Ｉ．アッセイの偏りを低減または排除するためのプロテアーゼの使用
本発明は、非溶解の新鮮全血（例えば、患者の検体）の使用と凍結−解凍した溶解した血液（例えば、標準物質希釈液）の間に観察される、分析物（例えば、薬物）濃度の偏りを解決するための、（例えば、免疫アッセイ用の）試料調製におけるプロテアーゼまたはプロテアーゼ（複数）の使用に関する。プロテアーゼは、結合タンパク質が時間とともにタンパク質分解し、したがってそのリガンド（分析物）に対する親和性を変更し、これは次に診断アッセイにおいて検出されるリガンドの濃度を変更する診断アッセイ用の試料の調製において特に有用である。
【００４３】
ホルモン受容体、Ｇタンパク質、タンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、イソメラーゼなどの細胞内結合タンパク質は、例えば診断アッセイにおいて、アッセイされるべき標的の分析物にしばしば結合する。したがって、例えば、イムノフィリンは、ラパマイシン（シロリムス）、タクロリムス、エベロリムス、テムソロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンなどの免疫抑制薬にしばしば結合する。細胞内結合タンパク質は、典型的には外部環境（例えば、細胞外マトリックス）から細胞膜によって保護されている。この膜が溶解するとプロテアーゼはこれらの細胞内結合タンパク質に接近できるようになり、関連する標的の分析物（例えば、薬物、小分子など）への結合親和性を変更することができる。
【００４４】
試料はしばしば凍結して貯蔵され、または長期間貯蔵され、その両方とも細胞の溶解および細胞内タンパク質のタンパク質分解をもたらすので、これらの溶解の事象は診断上の重大な問題となる。したがって、新鮮な試料においては、細胞内結合タンパク質は比較的インタクトであることがあり、貯蔵試料における細胞内結合タンパク質よりも分析物に対して大きな親和性を有することがあるので、検査の偏りが、このようなタンパク質によって結合される分析物に対するアッセイ中に導入される。
【００４５】
ある実施形態において、本発明は、特に分析物が非タンパク質分子である場合は、試料調製において１つ以上のプロテアーゼを用いてその結合タンパク質から分析物の放出を促進し、その結果この偏りを低減または排除することができるという発見に関する。これにより、分析物のより安定した測定が可能になる。
【００４６】
プロテアーゼは、界面活性剤（例えば、溶解界面活性剤）を使用せずに、および／または他の変性性の組成物もしくは方法（例えば、有機溶剤、低ｐＨ、高ｐＨ、カオトロープなど）を使用せずに、試料調製物におけるアッセイの偏り（例えば、細胞内リガンドによる分析物の結合による）を低減または排除するのに効果的であったのも、驚くべき発見であった。このような薬剤の使用を排除することは、分析物の測定における分散をやはり低減する、均一な検出方法の使用を促進する。
【００４７】
プロテアーゼは、診断アッセイ（結合タンパク質が時間とともにタンパク質分解し、したがってそのリガンド（分析物）に対する親和性を変更し、これが次に診断アッセイにおいて検出されるリガンドの濃度を変更する）用の試料の調製において特に有用である。試料調製におけるプロテアーゼの使用、および／またはある実施形態においてはアッセイ自体がこのプロセスを促進し、そのためリガンドは、常に、または主に、結合タンパク質のタンパク質分解された形態と相互作用する。したがって、リガンド（分析物）濃度は、実質的に一定のままであり、その結果アッセイにおける分散を低減し、および／またはアッセイ前に試料を貯蔵することによって生成される偏りを低減もしくは排除する。
【００４８】
ある実施形態において、プロテアーゼは、その結合タンパク質からのリガンド（分析物）の放出における助けとなるために、非交差反応性の競合物質と組み合わせて用いられ、そのため、競合物質を使用しなかった場合に他の方法では必要であるよりも結合タンパク質における変化が少ないことが必要である。
【００４９】
本明細書に提供される考察は、標的分析物として免疫抑制薬に注目しているが、この方法は、細胞内結合タンパク質によって結合されている他の分析物、好ましくは非タンパク質の分析物に対して等しく適用可能であることが注目される。
【００５０】
適切なプロテアーゼは、それだけには限定されない、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼなど）、メタロプロテアーゼ（例えば、ディスパーゼ、サーモリシンなど）、チオプロテアーゼ（例えば、パパイン、カテプシンなど）、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、プラスメプシン）、グルタミン酸プロテアーゼなど、およびこれらの組合せを含む。特定のアッセイ調製物において用いるために選択されるプロテアーゼは、典型的には結合タンパク質を分解し、その結果アッセイ用の分析物（例えば、免疫抑制薬）を放出することができるものである。ある実施形態において、実行されるアッセイの感度および正確さに有害な影響を及ぼさずに不活性化され得るプロテアーゼが選択される。プロテアーゼは、用いられる不活性化の方法によって不活性化されることがない他の汚染性の酵素を含まない形態で提供されるのが好ましい。さもなければ、任意の残留のタンパク質分解活性が、引き続く免疫アッセイで用いられる抗体を分解することがある。
【００５１】
プロテアーゼは、それだけには限定されない、Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍなどを含めた数々の供給業者から入手可能である。ある実施形態において、例示のプロテアーゼは、それだけには限定されない、プロテイナーゼＫ、サブチリシン、ペプシン、ディスパーゼ、サーモリシン、キモトリプシン（α−、β−、γ−、δ−またはπ−キモトリプシンを含む）、トリプシン、フィシン、ブロメラインなど、およびこれらの組合せを含む。
【００５２】
プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、熱（６５℃またはそれより高い）および特異的なプロテアーゼ阻害物質（それだけには限定されない、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ）またはジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ）を含む）によって不活性化され得る、非特異的な、Ｃａ依存性のプロテアーゼである。サブチリシン（Ｓｉｇｍａ）も、熱（５５℃またはそれより高い）によって不活性化され得る、非特異的な、Ｃａ依存性のプロテアーゼであるが、酸性のｐＨ、または特異的なプロテアーゼ阻害物質（例えば、ＰＭＳＦ、ＤＦＰもしくはアプロチニン）によって阻害され得る。
【００５３】
ディスパーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍまたはＳｉｇｍａまたはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびサーモリシン（ＳｉｇｍａまたはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）は、例えば約５ｍＭの濃度のＥＤＴＡによって不活性化され得る、Ｃａ依存性のメタロプロテアーゼである。ある実施形態において、ディスパーゼおよびサーモリシンをあわせてプロテアーゼとして用いる場合、タンパク質分解は、例えば、約４０ｍＭの濃度の、ＺｎＳＯ４などの亜鉛塩の存在下で、例えば約５ｍＭの濃度のＥＤＴＡなどの２価の陽イオンキレート剤を加えることによって不活性化され得る。
【００５４】
トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、Ｎ．Ｊ．）は、リジン残基またはアルギニン残基のカルボキシル側で特異的にタンパク質を切断し、熱（９０℃もしくはそれより高い）によって阻害され得、またはそれだけには限定されない、アプロチニン（アプロチニン注射は以前はＢａｙｅｒ、Ｗｅｓｔ Ｈａｖｅｎ、ＣＴによってＴｒａｓｙｌｏｌ（登録商標）として市販されており、阻害薬はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡおよび他の業者からいまだに入手可能である）、ロイペプチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯもしくはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ＰＭＳＦ、またはダイズ、ライマメもしくは卵白由来の特異的なトリプシン阻害物質（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、Ｎ．Ｊ．もしくはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含めた多くの薬剤によって特異的に阻害され得る。フィシンは、例えば、約２ｍＭの濃度のＨｇＣｌ２によって不活性化され得るチオールプロテアーゼである。ブロメラインもチオールプロテアーゼ（チオプロテアーゼ）であり、ブロメライン阻害物質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって不活性化され得る。
【００５５】
特定の実施形態において、プロテアーゼの濃度は、約２−４時間以内、好ましくは約１時間以内、より好ましくは約３０分以内、さらにより好ましくは約２０分または１０分以内に結合タンパク質を分解するのに十分高いが、酵素の効率的な不活性化を可能にするのに十分低い。したがって、プロテアーゼの濃度は、好ましくは約０．１単位／ｍＬから５．０単位／ｍＬまで、より好ましくは約０．３単位／ｍＬから約３単位／ｍＬまで、さらにより好ましくは約０．５単位／ｍＬから２．０単位／ｍまでＬ、最も好ましくは約１単位／ｍＬの範囲である。
【００５６】
上記に示したように、本明細書に記載するようにプロテアーゼを１つ以上使用することで、変性剤を使用する必要性がなくなる。変性剤を使用すると、沈澱した血液の成分を除去するのに（この手法の効率を低減する）引き続く遠心分離のステップが通常必要とされるので、これは有利である。さらに、必要とされる濃度の有機溶剤を使用すると、分析物の濃度に影響を及ぼすのに著しく十分である試料の蒸発をもたらし得る。
【００５７】
分析物（例えば、免疫抑制薬）が検査試料（例えば、イムノフィリン）における１つ以上の結合タンパク質に結合するある実施形態において、本明細書に記載する方法は、場合により、試料を結合タンパク質から分析物を放出する１つ以上の薬剤（プロテアーゼの他に）と接触させることをさらに伴うことがある。例えば、薬剤は、結合タンパク質への結合に対して分析物と競合する薬剤（競合物質）を含むことがある。薬剤は、一般的には、行われるアッセイの結果に影響を及ぼさないように選択される。したがって、薬剤は、分析物検出系（例えば、捕捉剤）に反応性ではない（例えば、それによって結合されない）もの、または分析物検出系（捕捉剤）と実質的に反応性が低い（例えば、少なくとも１０倍反応性が低い、好ましくは少なくとも１００倍反応性が低い、より好ましくは少なくとも１０００倍もしくは１００００倍反応性が低い）ものから選択されるのが好ましい。
【００５８】
したがって、例えば、アッセイが免疫アッセイである場合、薬剤（競合物質）は、典型的には、関連する抗体が実質的にそれと交差反応しないものである。分析物が免疫抑制薬である、ある実施形態において、薬剤は、異なるが構造的には類似の類似体（免疫抑制薬であってもよく、またはなくてもよい）であってよい。例えば、シロリムスおよびタクロリムスは両方ともＦＫＢＰに結合し、この理由から、シロリムスはＦＫＢＰからタクロリムスを放出するのに用いられることがあり、その逆もまた同様である。典型的には、このような場合において、引き続く免疫アッセイは、シロリムスとタクロリムスを区別する抗体を一般的に用いる。米国特許第６，１８７，５４７号明細書（２００１年２月１３日ＬｅｇａｙおよびＷｅｎｇｅｒに発行され、免疫抑制薬の競合に関するその教示に対してその全文を参照により本明細書に組み込む）は、結合タンパク質から免疫抑制薬を放出するのに有用な「結合競合物質」を記載している。例は、［Ｔｈｒ２，Ｌｅｕ５，Ｄ−Ｈｉｖ８，Ｌｅｕ１０］−シクロスポリンを含み、これはシクロスポリンを放出することができる。さらに、２００５年５月２６日に発行され、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願第２００５／１１２７７８ Ａ１号明細書は、ＦＫ５０６またはラパマイシンをそれらのイムノフィリン複合体から置換するための結合競合物質として働くことができるＦＫ５０６の誘導体を開示している。
【００５９】
ある実施形態において、本明細書に記載する方法は、界面活性剤を含まない溶解試薬の使用を伴う。迅速に溶解するのに必要とされる界面活性剤の量および分画の細胞は気泡を引き起こすことがあり、これはほとんどの自動化ピペッティングシステムによってピペット操作されなければならない試料にとって容認できないものであり、免疫アッセイによって分析される試料における免疫化学を妨害し得るという理由から、特定のフォーマットにおいて界面活性剤の使用は問題となり得る。界面活性剤を含まない溶解試薬の使用は、起泡しやすくない試料をもたらし、界面活性剤に対する必要性を排除し、したがってアッセイ免疫化学における界面活性剤がもたらす妨害を避ける。
【００６０】
特に界面活性剤を含まない溶解試薬と組み合わせた、本明細書に記載する１つ以上のプロテアーゼの使用は、遠心分離のステップを必要とせずに自動化ピペッティングシステムで用いるのに適する均一な混合物をもたらし、実質的な濃度の揮発性の有機溶剤の使用を排除する。
【００６１】
ＩＩ．試料回収および処理加工
本発明の方法は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する検査試料に対して一般的に行われる。ある場合（分析物が１つ以上の免疫抑制薬を含む）において、検査試料は、免疫抑制薬（例えば、移植臓器の拒絶反応、移植片拒絶反応を防止もしくは阻害するため、または自己免疫疾患の処置のため）で処置中のヒト（または、獣医学上の動物）からの検査試料である。
【００６２】
本発明の方法は、血液試料など、標的の分析物（例えば、免疫抑制薬）を含んでいることがある任意の試料を用いて行われ得る。ある実施形態において、検査試料は、全血または血液分画（例えば、血清）を含むことができる。
【００６３】
試料は、任意の標準の技術によって収集される。試料は、後の処理加工用に直ちに処理加工または貯蔵（例えば、乾燥、凍結、不活性ガス下の貯蔵など）され得る。所望により、試料は、本明細書に記載する１つ以上のプロテアーゼ、および溶解試薬（もしくはその成分）と直接接触してよい。様々な実施形態において、試料は、その代わりに、プロテアーゼおよび溶解試薬またはこれらの成分で処理する前に、処理加工（例えば、再構成、希釈、等張化、分画化など）されてもよい。様々な実施形態において、試料が溶解試薬またはその成分と接触する前に、それと同時に、またはその後に、プロテアーゼは試料と接触する。
【００６４】
一つの簡単な方法が図１に示され、この場合、試料（この場合は全血）は、１つ以上のプロテアーゼ（Ｐ）および１つ以上の非交差反応性の競合物質（Ｃ）を含む界面活性剤でない溶解試薬と接触する。このことは、溶解した全血、１つ以上のプロテアーゼ、非交差反応性の競合物質、内因性の結合タンパク質および対象の分析物（例えば、免疫抑制薬）を含む均一な混合物を生じさせる。混合物はアッセイする用意ができている。
【００６５】
ある実施形態において、界面活性剤を含まない溶解試薬が利用される。ある適切な溶解試薬は、炭素原子２個から６個までを有するグリコールを少なくとも１つ、および１０個以下の炭素原子、好ましくは８個以下の炭素原子、より好ましくは５個以下の炭素原子を有するアルコールを少なくとも１つを含んでいる。溶解試薬において用いるのに適するグリコールは、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体、ならびにこのようなグリコールの混合物を含む。溶解試薬において使用するのに適するアルコールは、ヒドロキシル基を１個有するアルコールを主に含む。このようなアルコールは、それだけには限定されない、１級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソブチルアルコールなど）、２級アルコール（例えば、イソプロパノール、シクロヘキサノールなど）および３級アルコール（例えば、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｔｅｒｔ−アミルアルコールなど）を含む。ある実施形態において、アルコールは、それだけには限定されない、メタノール、エタノールおよびＣ３−Ｃ１０アルコール（例えば、プロパノール、ペンタノール、ヘキサノール、セプタノール、オクタノールなど）ならびにこれらの混合物を含む。特定の実施形態において、グリコール対アルコールの比率は、約４：１から約１：４まで（体積：体積）の範囲にある。より特定の実施形態において、グリコール対アルコールの比率は、約４：１から約１：２まで、好ましくは約２：１から約１：２までの範囲にある。
【００６６】
溶解混合物は、任意の選択された量の試料を溶解試薬と接触させるのに望ましい任意の温度で、任意の混合技術によって形成され得る。試料を十分な体積の溶解試薬と接触させて、試料における細胞を溶解し、均一な混合物を生成する。上記に記載したようにグリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：４までの範囲にある溶解試薬では、溶解試薬の組成に応じて試料は溶解試薬に約２：１から約１：２までの範囲の比率（例えば約１：１（体積：体積））で加えられてよい。例えば、約１００μＬから約６００μＬまでの血液試料は、約５０μＬから約１２００μＬまでの溶解試薬と最高約５分間混合されてよい。ある実施形態において、溶解混合物は、血液試料１５０μＬを溶解試薬３００μＬと混合し、５−１０秒間激しくボルテックスにかけることによって形成される。好ましい実施形態において、溶解は、室温で１分未満で完了する。次いで、溶解混合物は、適切なアッセイを用いて分析物に対してアッセイされる。好ましい実施形態において、溶解混合物は、試料を遠心分離する必要なしに生成され、分析に備えられる。
【００６７】
様々な実施形態において、試料は「混合した」溶解試薬と接触する必要はないが、溶解試薬の１つの成分（例えば、アルコールまたはグリコール）と混合され、次いで他の成分が加えられて、上記に記載した完全な溶解試薬を生成することができる。
【００６８】
本発明の溶解試薬は、いかなる界面活性剤も加えずに用いられ得る。しかし、ある実施形態において、所望により１つ以上の界面活性剤が加えられてよい。界面活性剤は、上記に記載された溶解試薬の存在下では典型的には起泡せず、したがって本発明にしたがって調製された溶解混合液は、界面活性剤が含まれているか否かに関わらず自動化のピペット操作に適していてよい。界面活性剤が免疫アッセイに意図されている溶解混合液に含まれている場合は、免疫化学を妨害しない濃度で存在するのが好ましい。好ましくは、界面活性剤はサポニンなどの非イオン性の界面活性剤であり、約０．０１％から０．１％までの範囲で、より好ましくは約０．１％の濃度で用いられる。米国特許第５，６５０，２８８号明細書（１９９７年７月２２日ＭａｃＦａｒｌａｎｅおよびＪｅｎｓｅｎに発行され、界面活性剤の使用に関するその教示に対してその全文を参照により本明細書に組み込む）は、免疫アッセイにおける界面活性剤の使用を記載している。
【００６９】
溶解および結合タンパク質からの放出の後、適用可能であれば、分析物は、その分析物を検出するための任意の標準の技術（例えば、吸光度または質量分析による検出を伴う免疫アッセイまたはクロマトグラフィー）を用いて測定され得る。免疫抑制薬の検出には、免疫アッセイを用いると便利である。
【００７０】
ＩＩＩ．免疫アッセイ
Ａ．全般
本発明による免疫アッセイは、検査試料における分析物の定性的同定および／または定量に用いられ得る。これらの方法は、例えば、免疫抑制薬（例えば、ラパマイシン（シロリムス）、タクロリムス、エベロリムス、テムソロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびこれらの任意の化合物の類似体）の免疫アッセイに適用できる。
【００７１】
このような免疫アッセイは、本明細書に記載する１つ以上のプロテアーゼ、および場合により溶解試薬または１つ以上のその成分を検査試料と組み合わせて上記に記載する溶解混合物を形成することによって行われ得る。溶解混合液は、（存在する場合は）分析物に抗体を結合させてアッセイ混合物を形成するのに適する条件下で、分析物に特異的な抗体の少なくとも１つと接触してよく、次いで分析物への抗体の結合が検出される。
【００７２】
ある実施形態において、約０．４Ｍを超える塩濃度（例えば、約０．５Ｍから約５．０Ｍまで）の存在下で溶解混合物を抗体と接触させることによって、アッセイ感度の増強が達成され得る。特定の実施形態において、塩濃度は約０．４Ｍに等しく、またはそれ未満である（例えば、約０．５Ｍから約４．０Ｍまで）。例示的な実施形態において、塩濃度は約２．０Ｍ（例えば、約１．５Ｍから約２．５Ｍまで、詳しくは約１．８Ｍ、約１．９Ｍ、約２．０Ｍ、約２．１Ｍまたは約２．２Ｍ）である。適切な塩は、例えば、以下の任意の陰イオンを含むことができる：フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩および重硫酸塩。特定の実施形態において、塩は、例えばフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩および酢酸塩などの１価の陰イオンを含む。好ましい実施形態において、塩は、アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム）の塩化物塩などの塩化物を含む。一般的に、用いられる塩はアッセイ条件下で可溶性である。塩化ナトリウムは、ほとんどの条件下で高度に可溶性であり、したがって本発明による広範な免疫アッセイにおいてアッセイ感度を増強するために用いると好都合であり得る。
【００７３】
塩は、任意の好都合な様式においてアッセイ混合物に提供されてよく、溶解混合物と抗体の間の接触の前に存在してよく、または接触後に加えられてもよい。特定の実施形態において、塩はアッセイ希釈液において提供され、アッセイ希釈液は水（例えばバッファーなど）の他に１つ以上の他の成分を場合により含むこともできる。アッセイ希釈液における塩濃度は、所望の最終的な塩濃度に応じて、およびアッセイ混合物に加えられる希釈液の量に応じて変化する。例えば、約４．０Ｍの塩濃度を有するアッセイ希釈液は、等体積のアッセイ混合物に加えられて最終塩濃度約２．０Ｍをもたらすことができる。
【００７４】
Ｂ．抗体
検査試料において分析物を定性的または定量的に検出するための免疫アッセイにおいては、分析物に結合する少なくとも１つの抗体を、分析物を含むと疑われる溶解混合物と接触させて、抗体−分析物の免疫複合体を形成させる。免疫抑制薬を検出するために、特定の薬物に結合する任意の適切な抗体が本発明による免疫アッセイに用いられ得る。ラパマイシン（シロリムス）、タクロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびエベロリムスの各々に対する抗体は、当技術分野において知られており、および／または市販されており、これらの任意のものが用いられ得る。ある実施形態において、シロリムスを測定するためのＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの市販のＩＭｘ（登録商標）シロリムスアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）、またはＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって販売されている任意の他のシロリムスアッセイキット（例えば、様々な市販の自動化プラットホーム上で使用するための）の構成成分であるモノクローナル抗体を用いるのが好ましい。
【００７５】
免疫抑制薬に特異的な抗体を生成するための例示のプロトコールは以下の通りである。ＲＢｆ／Ｄｎｊメスマウスに、薬物−２７−ＣＭＯ−破傷風毒素免疫原を１カ月毎に３回ブースト投与し、その後４カ月目に薬物−４２−ＨＳ−破傷風毒素調製物で免疫化する。７カ月後、薬物−２７−ＣＭＯ−破傷風毒素免疫原を用いて、注入３日前に、動物に脾臓内プレ注入ブーストを投与する。次いで脾臓のＢ細胞を単離し、ＳＰ２／０ミエローマと一緒に標準ポリエチレン（ＰＥＧ）注入において用いる。１０−１４日後、コンフルエントの培養物を、マイクロタイターＥＩＡにおいて抗薬物活性についてスクリーニングし、次いでポジティブの培養物を、限界希釈クローニング技術を用いてクローニングする。得られたクローンを単離し、ＩＭＤＭｗ／ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）組織培養培地でスケールアップし、分泌された抗体を、プロテインＡを用いてアフィニティー精製する。薬物としてシロリムスを用いて産生された例示的な好ましい抗体はシロリムス、エベロリムスおよびゾタロリムスに対する免疫アッセイで用いることができる。
【００７６】
タクロリムスに対する免疫アッセイで用いる例示的な好ましい抗体は、Ｇｒｕｎｅ＆Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡによって出版された、１９８７年１０月、Ｔ．Ｓｔａｒｚｌ、Ｌ．ＭａｋｏｗｋａおよびＳ．Ｔｏｄｏ編集、「ＦＫ−５０６ Ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ａ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｒｅｐｒｉｎｔ、第ＸＩＸ巻、第６補完、２３−２９頁の、Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、「Ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ａｓｓａｙ ＦＫ−５０６ Ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ」に記載されている。
【００７７】
シクロスポリンに対する免疫アッセイにおいて使用する例示的な好ましい抗体は、シクロスポリン測定用の、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの市販のＡｘＳＹＭシクロスポリンアッセイの成分であるモノクローナル抗体である。
【００７８】
Ｃ．検出
次いで、抗体−分析物免疫複合体は、任意の適切な技術を用いて検出され得る。例えば、抗体は、抗体−分析物複合体の存在を検出および／または定量するための検出可能な標識で標識されていてよい。特定の標識の選択は決定的ではないが、選択された標識は、単独で、または１つ以上のさらなる物質と組み合わせてのいずれかで検出可能なシグナルを生成することができなければならない。
【００７９】
有用な検出可能な標識、これらの抗体への付着および検出技術は、したがって当技術分野では知られている。当技術分野では知られている任意の検出可能な標識が用いられ得る。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリ性ペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸脱水組成物酵素など）、化学発光標識（例えば、アクリジニウム誘導体、ルミノール、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステルなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど））、ローダミン、フィコビリンタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（硫化亜鉛キャップ化されたセレン化カドミウム）、温度測定標識または免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識であってよい。標識、標識化手順および標識の検出に対する入門書は、各々を参照により本明細書に組み込む、ＰｏｌａｋおよびＶａｎＮｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、（１９９７年）ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎによって発行されたハンドブックとカタログの組み合わされたものであるＨａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉ、（１９９６年）に見出される。本発明で用いるための好ましい標識は、アクリジニウム−９−カルボキサミドなどの化学発光標識を含む。さらなる詳細は、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｄｙｋｅ，Ｋ．Ｖ．編集）７７−１０５頁、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎにおける、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．およびＡｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．、（２００２年）Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｎ−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ−９−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｓａｙｓに見ることができる。
【００８０】
検出可能な標識は、直接またはカップリング剤いずれかによって、分析物または抗体に結合され得る。用いられ得るカップリング剤の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸）である。用いられ得る他のカップリング剤は、当技術分野では知られている。検出可能な標識を抗体に結合するための方法は、当技術分野では知られている。さらに、検出可能な標識の抗体へのカップリングを促進する末端基をすでに含んでいる多くの検出可能な標識（例えば、その他の点でＣＰＳＰ−アクリジニウムエステルとして知られているＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド、またはその他の点でＳＰＳＰ−アクリジニウムエステルとして知られているＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド）が購入または合成され得る。
【００８１】
あるいは、分析物に結合し、検出可能な標識を含む第２の抗体が溶解混合物に加えられてよく、抗体−分析物複合体の存在を検出するために用いられてよい。本実施形態において任意の適切な検出可能な標識が用いられてよい。
【００８２】
Ｄ．例示的なフォーマット
本発明の免疫アッセイは、当技術分野では知られている任意のフォーマット（それだけには限定されない、サンドイッチフォーマット、競合的阻害フォーマット（フォワードもしくはリバース両方の競合的阻害アッセイを含む）または蛍光偏光のフォーマットなどを含む）を用いて行われてよい。
【００８３】
好ましいサンドイッチ型のフォーマットなど、免疫抑制薬を定量分析するための免疫アッセイにおいては、溶解混合液における薬物を分離および定量するために少なくとも２つの抗体が用いられる。より具体的には、少なくとも２つの抗体が薬物の異なる部分に結合し、「サンドイッチ」と呼ばれる免疫複合体を形成する。一般的には、検査試料における分析物（例えば、免疫抑制薬）を捕捉（例えば、特異的に結合）するのに１つ以上の抗体が用いられ（これらの抗体は１つ以上の「捕捉」抗体と呼ばれることが多い）、検出可能な（すなわち、定量可能な）標識をサンドイッチに結合するのに１つ以上の抗体が用いられる（これらの抗体は１つ以上の「検出」抗体と呼ばれることが多い）。サンドイッチアッセイにおいては、アッセイにおける任意の他の抗体がそれぞれの結合部位に結合することによって、薬物に結合する両方の抗体が低減されないのが好ましい。
【００８４】
換言すると、抗体は、免疫抑制薬を含むと疑われる溶解混合物と接触した１つ以上の第１の抗体が第２の抗体または引き続く抗体によって認識される結合部位の全てまたは部分に結合せず、その結果１つ以上の第２の抗体または引き続く抗体が薬物に結合する能力を妨害するように選択されなければならない。サンドイッチアッセイにおいては、溶解混合物において期待される薬物の最大量に比べて過剰のモル量の抗体、好ましくは少なくとも１つの捕捉抗体が用いられる。例えば、固相含有溶液１ｍＬあたり約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬの抗体が用いられ得る。
【００８５】
一実施形態において、少なくとも１つの第１の捕捉抗体が、検査試料からの第１の抗体−薬物複合体の分離を促進する固体支持体に結合していてよい。本発明の免疫アッセイで用いられる固体支持体または「固相」は決定的ではなく、当業者によって選択されてよい。本明細書で用いられる固相または固体支持体は、不溶性である任意の材料を意味し、または引き続く反応によって不溶性にされてもよい。有用な固相または固体支持体は当業者には知られており、反応トレイのウェルの壁、検査管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースのストリップ、膜、ラテックス粒子などの微粒子、Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌ．の登録商標）（ヒツジ（または他の動物）の赤血球ならびにピルビン酸アルデヒドおよびホルムアルデヒドによって「固定されている」赤血球である）などを含む。ペプチドを固相に固定するのに適する方法は、イオン性の、疎水性の、共有結合性の相互作用などを含む。固相は、捕捉剤を引きつけ、固定化する、その固有の能力に対して選択されてよい。あるいは、固相は、捕捉剤を引きつけ、固定化する能力を有するさらなる受容体を含むことができる。さらなる受容体は、捕捉剤自体に関して、または捕捉剤に複合している荷電した物質に関して反対に荷電している、荷電した物質を含むことができる。さらに別の代替として、受容体は、固相上に固定化され（付着され）、特異的な結合反応によって捕捉剤を固定化する能力を有している任意の特異的な結合パートナーであってよい。受容体分子は、アッセイの遂行前またはアッセイの遂行の間に、捕捉剤の固相材料への間接的な結合を可能にする。
【００８６】
当技術分野では知られている任意の固体支持体（それだけには限定されないが、マトリクス、ゲル、ウェル、チューブまたはビーズの形態のポリマー材料からできている固体支持体を含む）が用いられ得る。このような結合が、抗体が薬物に結合する能力を妨害しなければ、抗体（以上の抗体）は、吸着によって、化学カップリング剤を用いた共有結合によって、または当技術分野では知られている他の手段によって固体支持体に結合していてよい。さらに、必要であれば、固体支持体は、抗体上の様々な官能基との反応性を可能にするように誘導体化されていてよい。このような誘導体化は、ある種のカップリング剤（例えば、それだけには限定されない、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の使用を典型的に伴う。
【００８７】
固相が、検出抗体による接近を可能にする十分に多孔性である任意の適切な多孔性の材料、および抗原に結合するのに適する表面の親和性を含み得るのも、本発明の範囲内である。微孔性の構造が一般的に好ましいが、水和状態のゲル構造を有する材料も同様に用いられ得る。このような有用な固体支持体は、それだけには限定されない、ニトロセルロースおよびナイロンを含む。本明細書に記載されるこのような多孔性の固体支持体は、厚さ約０．０１から０．５ｍｍまでの、好ましくは約０．１ｍｍのシートの形態であることが企図されている。孔のサイズは、広い限界内で変化することができ、好ましくは約０．０２５ミクロンから１５ミクロンまで、特に約０．１５ミクロンから１５ミクロンまでである。このような支持体の表面は、抗原または抗体の支持体への共有結合をもたらす化学的プロセスによって活性化され得る。しかし、一般的には疎水的な力による多孔性の材料上への吸着により、抗原または抗体の不可逆的な結合が得られる。
【００８８】
免疫抑制薬を含むことが疑われる、または含んでいる溶解混合物が、少なくとも１つの第１の捕捉抗体と接触した後、得られたアッセイ混合物はインキュベートされて第１の捕捉抗体（以上の抗体）−薬物複合体の形成を可能にする。インキュベートは、約４．５から約１０．０までのｐＨを含む任意の適切なｐＨで、約２℃から約４５℃までを含む任意の適切な温度で、および少なくとも約１分から約１８時間まで、好ましくは約４−２０分、最も好ましくは約１７−１９分の適切な時間行われてよい。
【００８９】
標識された複合体が形成した後、複合体における標識の量は、当技術分野では知られている技術を用いて定量され得る。例えば、酵素標識が用いられる場合、標識された複合体は、色の発色などの定量可能な反応をもたらす標識に対する基質と反応する。標識が放射性標識である場合、標識はシンチレーションカウンターを用いて定量される。標識が蛍光標識である場合、標識は、標識を１つの色の光（「励起波長」として知られている）で刺激し、刺激に反応して標識によって発光される別の色（「発光波長」として知られている）を検出することによって定量される。標識が化学発光標識である場合、標識は、肉眼的に、またはルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを用いてのいずれかによって、放出される光を検出して定量される。複合体における標識の量が定量されたら、検査試料における薬物の濃度は、例えば、既知濃度の免疫抑制薬の段階希釈を用いて生成された検量線を用いることによって決定され得る。薬物の段階希釈を用いる他に、検量線は、重量分析により、質量分析により、および当技術分野では知られている他の技術によって生成され得る。
【００９０】
好ましいフォワードの競合的なフォーマットにおいては、既知濃度の、標識されている薬物またはその類似体のアリコートが用いられて、検査試料に存在する薬物と、抗体への結合に対して競合する。フォワードの競合アッセイにおいては、固定化された抗体が、検査試料、および標識された薬物またはその薬物類似体と、逐次または同時のいずれかで接触し得る。薬物または薬物類似体は、先に論じた検出可能な標識を含めた任意の適切な検出可能な標識で標識されてよい。このアッセイにおいては、捕捉抗体は、本明細書で先に論じた技術を用いて固体支持体上に固定化されていてよい。あるいは、捕捉抗体は、微粒子などの固体支持体上に固定化されている抗種抗体などの抗体とカップリングされていてよい。
【００９１】
標識された薬物または薬物類似体、溶解混合物および抗体は、典型的には、サンドイッチアッセイのフォーマットに関して先に記載したものと類似の条件下でインキュベートされる。次いで、２つの異なる型の抗体−薬物複合体が産生される。具体的には、産生された抗体−薬物複合体の一方が検出可能な標識を含み、他方の抗体−薬物複合体は検出可能な標識を含まない。抗体−薬物複合体は、検出可能な標識の定量の前にアッセイ混合物の残りから分離されてよいが、必ず分離されなければならないわけではない。抗体−薬物複合体がアッセイ混合物の残りから分離されたか否かに関係なしに、抗体−薬物複合体における検出可能な標識の量を次いで定量する。次いで、検査試料における薬物濃度が、抗体−薬物複合体中の検出可能な標識の量を検量線に対して比較することによって決定され得る。検量線は、既知濃度の薬物の段階希釈を用いて、質量分析によって、重量分析によって、および当技術分野では知られている他の技術によって産生され得る。
【００９２】
抗体−薬物複合体は、サンドイッチアッセイのフォーマットに関連して先に論じた固体支持体などの固体支持体に抗体を結合し、次いでアッセイ混合物の残りを固体支持体との接触から除去することによってアッセイ混合物から分離され得る。
【００９３】
リバースの競合アッセイにおいては、固定化された免疫抑制薬またはその類似体が、溶解混合物および少なくとも１つの標識した抗体と逐次または同時のいずれかで接触してよい。抗体は、先に論じた検出可能な標識を含む、任意の適切な検出可能な標識で標識されてよい。薬物または薬物類似体は、サンドイッチアッセイのフォーマットに関連して先に論じた固体支持体などの固体支持体に結合されていてよい。
【００９４】
固定化された薬物または薬物類似体、溶解混合物、および少なくとも１つの標識された抗体は、サンドイッチアッセイのフォーマットに関連して先に論じたものと類似の条件下でインキュベートされる。次いで、２つの異なる型の抗体−薬物複合体が産生される。具体的には、産生された抗体−薬物複合体の一つは固定化され、検出可能な標識を含んでいるが、他の抗体−薬物複合体は固定化されておらず、検出可能な標識を含む。固定化されていない抗体−薬物複合体およびアッセイ混合物の残りは、洗浄などの当技術分野では知られている技術によって、固定化された抗体−薬物複合体の存在から除去される。固定化されていない抗体−薬物複合体が除去されたら、次いで固定化された抗体−薬物複合体における検出可能な標識の量を定量する。次いで、抗体−薬物複合体における検出可能な標識の量を検量線に対して比較することによって、検査試料における薬物の濃度が決定され得る。検量線は、既知濃度の薬物の段階希釈を用いて、質量分析によって、重量分析によって、および当技術分野では知られている他の技術によって産生され得る。
【００９５】
一実施形態において、蛍光偏光アッセイにおいては、抗体または機能的に活性なそのフラグメントが、免疫抑制薬を含む非標識の溶解混合物と最初に接触して、非標識の抗体−薬物複合体を形成する。非標識の抗体−薬物複合体は、次いで、蛍光標識された薬物またはその類似体と接触する。標識された薬物または薬物類似体は、アッセイ混合物における非標識の任意の薬物と、抗体または機能的に活性なそのフラグメントへの結合に対して競合する。形成された標識された抗体−薬物複合体の量が決定され、検査試料における薬物の量が検量線の使用によって決定される。
【００９６】
免疫アッセイに対する走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）の使用も、それに対して本発明の免疫アッセイ法が容易に適用可能な技術である。ＳＰＭ、特に原子間力顕微鏡においては、捕捉剤は、走査に適する表面を有する固相に固定されている。捕捉剤は、例えば、プラスチックまたは金属の表面に吸着され得る。あるいは、捕捉剤は、例えば、誘導体化されたプラスチック、金属、シリコンまたはガラスに、当業者には知られている方法にしたがって共有結合され得る。捕捉試薬の付着の後、溶解混合物は固相に接触し、走査型プローブ顕微鏡が用いられて固相に固定された複合体を検出および定量する。ＳＰＭの使用は、免疫アッセイ系で典型的に使用されている標識の必要性を排除する。このようなシステムは、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願第６６２，１４７号明細書に記載されている。
【００９７】
本発明による免疫アッセイは、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）を用いて行われてもよい。ＭＥＭＳは、機械的、光学的および流体の要素を電子工学と結びつけるシリコン上に組み込まれ、対象の分析物を好都合に検出させる顕微鏡的構造である。本発明で用いるのに適する例示のＭＥＭＳデバイスは、Ｐｒｏｔｉｖｅｒｉのマルチカンチレバーアレイである。このアレイは、特別にデザインされたシリコンのミクロカンチレバーの化学−機械的な作動、および引き続くミクロカンチレバーの偏向の肉眼的検出に基づいている。片側上が結合パートナーでコーティングされている場合、相補的な分子を含む溶液にミクロカンチレバーが曝露されるとミクロカンチレバーは曲がる。この屈曲は、結合の事象による表面エネルギーにおける変化によって引き起こされる。屈曲の程度（偏向）を肉眼的に検出することで、ミクロカンチレバーに結合している相補的な分子の量の測定が可能になる。
【００９８】
他の実施形態において、本発明による免疫アッセイは、電気化学的な検出を用いて行われる。電気化学的な検出のための基本的な手順は、Ｈｅｉｎｅｍａｎおよび共同研究者によって記載されている。これは、一次抗体（Ａｂ、ラット抗マウスＩｇＧ）の固定化、引き続く抗原（Ａｇ、マウスＩｇＧ）、酵素標識にコンジュゲートしている二次抗体（ＡＰ−Ａｂ、ラット抗マウスＩｇＧおよびアルカリ性ホスファターゼ）ならびにｐ−アミノフェニルホスファターゼ（ＰＡＰＰ）を含む溶液への配列の曝露を必然的に伴う。ＡＰはＰＡＰＰをｐ−アミノフェノール（ＰＡＰＲ、「Ｒ」は、キノンイミンである酸化型のＰＡＰＯと還元型を区別するよう意図されている）に変換し、ｐ−アミノフェノールは、ＡＰが最適の活性を表すｐＨ９．０で、酸素および水の還元を妨害しないポテンシャルで電気化学的に可逆的である。ＰＡＰＲは、フェノール（その前駆物質であるフェニルホスフェートが酵素基質としてしばしば用いられる）とは異なり、電極の付着物を引き起こさない。ＰＡＰＲは、空気酸化および光酸化を経験するが、これらは小規模で、および短い時間枠で容易に防止される。２０μＬから３６０μＬまでの範囲の体積のＰＡＰＰを用いたミクロ電気化学的な免疫アッセイにおいて実現される、ＰＡＰＲに対するピコモルの検出限界およびＩｇＧに対するフェムトグラムの検出限界は、以前に報告されていた。電気化学的検出と一緒のキャピラリー免疫アッセイにおいては、これまでに報告されている最小の検出限界は、７０μＬの体積および３０分または２５分のアッセイ時間を用いて、マウスＩｇＧ３０００分子である。
【００９９】
様々な電気化学的検出システムが、米国特許第７，０４５，３６４号明細書（２００６年５月１６日発行、参照により本明細書に組み込む）、第７，０４５，３１０号明細書（２００６年５月１６日発行、参照により本明細書に組み込む）、第６，８８７，７１４号明細書（２００５年５月３日発行、参照により本明細書に組み込む）、第６，６８２，６４８号明細書（２００４年１月２７日発行、参照により本明細書に組み込む）、第６，６７０，１１５号明細書（２００３年１２月３０日発行、参照により本明細書に組み込む）に記載されている。例えば、１つの検査試料において複数の分析物を同時にアッセイする有用な特定の実施形態において、固相は複数の異なる捕捉剤を含むことができる。したがって、例えば、固相はその上に複数の抗体を固定されていてよく、この場合各々が、試料における異なる分析物の存在に対して検査されることが意図される。例示的な実施形態において、固相は表面上の複数の異なる領域からなっていてよく、この場合各領域はそこに固定されている特定の抗体を有している。
【０１００】
多重のフォーマットは複数の標識を使用することができるが、必ずしも使用しなくてもよく、この場合各標識は特定の分析物を検出するために用いられる。例えば、多重の、異なる分析物が複数の標識（抗体などの複数の捕捉剤が、特異性に基づいて固相の異なる既知の位置に固定されている）を用いずに検出されてもよい。各位置の捕捉剤の特異性は知られているので、特定の位置でのシグナルの検出は、その位置で結合している分析物の存在に関連し得る。このフォーマットの例は、微小流体デバイスおよびキャピラリーアレイ（それぞれチャンネルまたはキャピラリーに沿って異なる位置で異なる捕捉剤を含んでいる）ならびにマイクロアレイ（固体支持体の表面上のスポットのマトリックス（「標的エレメント」）において配列された様々な捕捉剤を典型的に含む）を含む。特定の実施形態において、各々の異なる捕捉剤が、異なる電極（例えば、マイクロ流体デバイスのチャンネルにおける、またはキャピラリーにおける固体支持体の表面上に形成されていてよい）に固定されていてよい。
【０１０１】
ＩＩＩ．検査キット
本発明は、検査試料を分析物に対してアッセイするための検査キットも提供する。本発明による検査キットは、本発明にしたがって１つ以上の免疫アッセイを行うのに有用な１つ以上の試薬を含む。検査キットは、１つ以上の別々の組成物として、または場合により試薬の適合性が許す場合には混合物として、試薬を保持する１つ以上の容器を有する包装を一般的に含む。検査キットは、バッファー、希釈液、標準液、および／または試料の処理加工、洗浄もしくはアッセイの任意の他のステップを行うのに有用な任意の他の材料など、ユーザーの立場から望ましいことがある他の材料も含むことができる。
【０１０２】
ある実施形態において、本発明の検査キットは、（ａ）少なくとも１つの分析物に特異的に結合することができる、少なくとも１つの抗体または他のリガンド（例えば、結合タンパク質）、および（ｂ）本明細書に記載される１つ以上のプロテアーゼを含むことができる。例示的なプロテアーゼは、それだけには限定されない、プロテイナーゼＫ、サブチリシン、ディスパーゼ、サーモリシン、トリプシン、フィシン、ブロメラインおよびこれらの組合せを含む。キットは、（ｃ）エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに本明細書に記載される少なくとも１種のアルコール（例えば、５個以下の炭素を有するアルコール）、またはこのような溶解試薬の成分からなる溶解試薬を場合によりさらに含む。免疫抑制薬に対する免疫アッセイを行うのに有用である、例示的な実施形態において、抗体は、ラパマイシン（シロリムス）、タクロリムス、エベロリムス、テムソロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンまたはこれらの任意の化合物の類似体に特異的であり得る。
【０１０３】
ある実施形態において、溶解試薬は、メタノール、エタノール、プロパノールまたは任意のこれらのアルコールの混合物を含む。例示的な実施形態において、グリコールのアルコールに対する比率は、約４：１から約１：４までの範囲、より詳しくは約４：１から約１：２までの範囲である。
【０１０４】
所望により、検査キットは、アッセイされる免疫抑制薬を含む対照組成物をさらに含むことができる。
【０１０５】
特定の実施形態において、本発明による検査キットは、１つ以上の界面活性剤および／または検査試料における１つ以上の結合タンパク質から分析物を放出する薬剤を含むことができる。適切な界面活性剤または界面活性剤の組合せは、上記に記載したようなサポニンなどの非イオン性界面活性剤を含む。適切な放出剤は、上記に記載したように１つ以上の結合タンパク質への結合に対して分析物と競合する薬剤を含む。本発明のキットにおいて提供される任意の界面活性剤またはプロテアーゼは、上記に記載したように、適切な濃度の成分を含む溶解混合物の生成を促進する様式で提供されなければならない。
【０１０６】
本発明によるキットは、固相、および固相に固定されている捕捉剤またはアッセイの間に固相に固定される捕捉剤を含むことができる。例示的な実施形態において、固相は、１つ以上の微粒子または電極を含む。このようなキットがサンドイッチ免疫アッセイを行うように用いられようとする場合、キットは標識された検出剤をさらに含むことができる。ある実施形態において、検査キットは、アクリジニウム−９−カルボキサミドなどの直接標識を少なくとも１つ含む。本発明による検査キットは、少なくとも１つの間接標識も含むことができる。使用される標識が、検出可能なシグナルを生成するための指示薬を一般的に必要とする場合、検査キットは１つ以上の適切な指示薬を含むのが好ましい。
【０１０７】
本発明による検査キットは、本発明の１つ以上の免疫アッセイを行うための指示書を含むのが好ましい。本発明のキットに含まれている指示書は、包装材料に固定されていてもよく、または包装挿入物として含まれていてもよい。指示書は典型的には書面または印刷物であるが、そのようなものに限定されない。このような指示書を保管することができ、エンドユーザーにこれらを伝えることができる任意の媒体が、本発明によって企図される。このような媒体は、例えば、それだけには限定されない、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ）などを含むコンピュータ媒体を含む。本明細書で用いられる「指示書」の語は、指示書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【０１０８】
もちろん、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号明細書および第５，００６，３０９号明細書に記載されるように、ならびに例えば、それだけには限定されない、Ａｂｂｏｔｔ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭＸ（登録商標）、ＡＢＢＯＴＴ ＰＲＩＳＭ（登録商標）、およびＱｕａｎｔｕｍ ＩＩプラットホームならびに他のプラットホームを含めた、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）によって市販されているものなど、本明細書における任意の例示のフォーマット、および本発明による任意のアッセイまたはキットが、自動化されたシステムおよび半自動化されたシステム（微粒子を含む固相が存在するものを含む）で用いるために適用または最適化され得ることは言うまでもない。
【０１０９】
さらに、本発明のアッセイおよびキットは、Ａｂｂｏｔｔ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学的免疫アッセイシステムを含めた、ポイントオブケアアッセイシステム（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ）に対して、場合により適合または最適化され得る。免疫センサー、ならびに免疫センサーを製造し、使い捨て検査装置において操作する方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００３０１７０８８１号、第２００４００１８５７７号、第２００５００５４０７８号および第２００６０１６０１６４号（同じものに関するそれらの教示に対して、参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０１１０】
（実施例）
以下の実施例は、請求される発明を限定するためではなく、例示するために提供される。
【実施例１】
【０１１１】
プロテアーゼの比較
以下のプロテアーゼ：アルファ−キモトリプシン（ＣＨ）；ＰＥ＝ペプシン（ＰＥ）；プロテイナーゼＫ（ＰＫ）およびサーモリシン（ＴＨ）を、溶解した全血希釈液（すなわち「標準物質希釈液」）または非溶解の新鮮な全血検体（すなわち、患者検体もしくは「新鮮血」）のいずれかからなる、本明細書に記載するアッセイ混合物において検査した。
【０１１２】
これらの試験には、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）シロリムスアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬによって引き続き市販されている、均一のコンセプトフェーズ（ｃｏｎｃｅｐｔ−ｐｈａｓｅ）アッセイ）を使用した。キャリブレートしたシロリムススタンダードを、溶解した全血希釈液（ＩＭｘ（登録商標）タクロリムスＩＩ血液希釈液、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）すなわちシロリムス（Ｗｙｅｔｈ−Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｓｔｅｒ、ドイツ）０ｎｇ／ｍＬおよび３０ｎｇ／ｍＬをそれぞれ含むＣＡＬ ＡおよびＦ ＣＡＬで調製した。
【０１１３】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）シロリムスアッセイでは、試料（典型的には引き続くアッセイ）によって生成される光（またはシグナル）の量を、相対光単位（ＲＬＵ）として測定する。ＲＬＵは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システムおよび他の機器上で用いられる光学測定の単位に対する呼称である。ＲＬＵの語は、アクリジニウムなどのシグナル生成性のスタンダードのある量を計測する光子の関係に由来する。各光学モジュールは１セットのスタンダード（例えば、アクリジニウムのスタンダード）でキャリブレートされる。化学発光反応が起こると、光が放射され、ある期間にわたって（例えば、３秒の期間）光子が測定される。光電子増倍管（ＰＭＴ）は、計数された光子をデジタルシグナルに変換し、デジタルシグナルは次いで処理加工のために回路基板に送られる。光学の回路基板は、ＰＭＴからのデジタルシグナルを、計数された光子に比例するアナログシグナルに変換し、アナログシグナルは、今度は存在するシグナル生成性の分子（例えば、アクリジニウム）の量に比例する。次いで、このアナログシグナルはさらに処理加工されてＲＬＵ値を生成する。この関係は確立されて、光学モジュールをキャリブレートするためのスタンダードを生成し、この場合異なるスタンダードがそれらに割り当てられたＲＬＵ値を有する。したがって、ＲＬＵ単位自体は任意であるが、ある量のスタンダード（例えば、アクリジニウム）に対して比例する（すなわち、相関がある）。
【０１１４】
これらの試験において、「偏り」は、アッセイ希釈液（すなわち「アッセイ希釈液試料」）で調製された標準物質のシロリムス濃度に等しいシロリムス濃度（例えば、３０ｎｇ／ｍＬまたは０ｎｇ／ｍＬ）でスパイクした新鮮血試料（すなわち「新鮮血試料」）からのシグナル（ＲＬＵ）における相違％として計算した。換言すると、偏りは、溶解した全血標準物質（凍結−解凍したもの、全血の約８０％、＞１カ月経過）と比べた場合の、新鮮血検体の標準物質（例えば、非溶解）によって表されるシグナルにおける相違として計算された。このような値は、同様の濃度の患者検体において見られる偏りをおそらく表しており、これを室温で貯蔵し、長時間均一なシロリムスアッセイ（例えば、市販のＡｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）シロリムスアッセイ）によってアッセイした場合に観察される患者検体における大きな（例えば、＞５０％）変化の説明となる。
【０１１５】
全てのプロテアーゼが偏りに対して影響をいくらか有していたと思われるが、明らかにプロテイナーゼＫおよびサーモリシンは最大の影響を有していた（データは示さず）。サーモリシンは、アッセイ希釈液試料および新鮮血試料におけるＦ ＣＡＬ ＲＬＵ値を増大し、５００μｇ／ｍＬでは（遊離のシロリムスを測定するためにＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）によってサンプリングする前には、前処理した均一の検体／試料における量）Ｆ ＣＡＬの偏りは約３０％まで低減した。しかし、５００μｇ／ｍＬ（前処理した均一の検体／試料における量）のＣＡＬ Ａは逆方向に移動し、−２４％の偏りを作り出した。
【０１１６】
プロテイナーゼＫもアッセイ希釈液試料におけるＦ ＣＡＬ ＲＬＵ値を増大したが、新鮮血試料ではＲＬＵ値を低減した。ＣＡＬ Ａの偏りは、５０μｇ／ｍＬ（−１５％）では少々劣ったが、５００μｇ／ｍＬでは偏りは６−７％に改善した。
【０１１７】
プロテアーゼは、このように新鮮血試料対アッセイ希釈液試料の偏りに対して影響を有する。観察された偏りは、シロリムスの濃度に依存していた。シロリムスの濃度が低いほど観察された偏りは小さく、ＣＡＬ Ａ（０ｎｇ／ｍＬ）レベルでは本質的に偏りは観察されなかった。問題がインターフェラント（ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｔ）または非特異的な結合であったならば、この発見は予想外であろう。アッセイは競合的なフォーマットで行われたので、ＣＡＬ Ａは最高のＲＬＵシグナルを有する。最高レベルのシグナルにおいて偏りがないのは珍しいことであるが、親和性（例えば、新鮮全血対貯蔵した溶解した全血におけるシロリムスに対するＦＫＢＰ１２の親和性）における違いが存在しなければシグナルが低いほど偏りは大きくなる（例えば、シロリムスレベルがより高くなる）。機序がプロテアーゼＦＫＰＢ１２の切り取りである場合、これはシロリムス依存性の様式で偏りに影響を及ぼす非特異的な薬剤（例えば、ＨＳＡまたはリポタンパク質の結合剤）を見出す上での困難さを説明している。ＦＫＢＰ１２の結合親和性における変更は、他の手段によって一致させるのが非常に困難である。まとめると、このデータ、すなわち新鮮血試料の安定性データ、およびシロリムス濃度の依存性は、偏りに対する機序として、タンパク質分解性の切断を支持している。
【実施例２】
【０１１８】
シロリムスアッセイにおけるプロテイナーゼＫまたはサーモリシンの比較
この実験では、シロリムス標準物質であるＴＡおよびＦＡを、溶解した（凍結−解凍によって）全血において保存剤と一緒に作成し、１カ月を超えて４℃で貯蔵した（すなわち、「標準物質希釈液」）。これらのいわゆるアッセイ希釈液試料である、ＴＡおよびＦＡは、それぞれシロリムス０ｎｇ／ｍＬおよび３０ｎｇ／ｍＬを含んでいた。非溶解の新鮮な全血検体（すなわち、患者検体、または「新鮮血」）標準物質であるＷＡおよびＷＦ（いわゆる新鮮血試料）は、それぞれシロリムス０ｎｇ／ｍＬおよび３０ｎｇ／ｍＬを含んでいた。
【０１１９】
アッセイ希釈液試料および全血試料を、５０、２５０または５００μｇ／ｍＬの濃度の増大レベルのプロテイナーゼＫまたはサーモリシンのいずれかで処理した。対照は、他の点では全てアッセイ希釈液試料および新鮮血試料と同一の試料であったが、これらは処理しないままであった。プロテアーゼを、有機溶剤２部：試料１部の体積比の５％プロピレングリコール／５％エタノール中溶液試料（すなわち、試料はアッセイ希釈液試料、新鮮血試料または対応する対照である）に全て加えた。次いで、試料をボルテックスにかけ、遅延型の１ステップ競合的フォーマットにおける検査用にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器上に直ちに配置した。
【０１２０】
以下表１−３における略語の手がかり：
Ａ：標準物質Ａ、０ｎｇ／ｍＬ
Ｆ：標準物質Ｆ、３０ｎｇ／ｍＬ
Ｔ：貯蔵した溶解した全血希釈液
Ｗ：新鮮全血
ＰＫ（数字）：５０、２５０または５００μｇ／ｍＬの濃度で加えたプロテイナーゼＫ
ＴＨ（数字）：５０、２５０または５００μｇ／ｍＬの濃度で加えたサーモリシン
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
表１から見ることができる通り、存在するシロリムス０ｎｇ／ｍＬで産生されるシグナルにおける、新鮮血標準物質（新鮮血試料ＷＡおよびＷＦ）と貯蔵した溶解した血液標準物質（アッセイ希釈液試料ＴＡおよびＴＦ）の間には−１０％の偏りが存在する。表２から見ることができる通り、プロテイナーゼＫ５００μｇ／ｍＬでは、この偏りは約−６％に低減される。
【０１２５】
存在するシロリムス３０ｎｇ／ｍＬで産生されるシグナルにおける、新鮮血標準物質（ＷＡおよびＷＦ）と貯蔵した溶解した血液標準物質（アッセイ希釈液試料ＴＡおよびＴＦ）の間には８５％の偏りが存在する（表１）。プロテイナーゼＫ５００μｇ／ｍＬでは、この偏りは約６％に低減され（表２）、サーモリシン５００μｇ／ｍＬではこの偏りは約２９％に低減される（表３）。
【０１２６】
前述のデータに基づくと、プロテアーゼは、競合的フォーマットのシロリムスアッセイにおいて新鮮血と溶解した全血の標準物質の間に産生されるシグナルにおける偏りに直接的な影響を有しており、これは標準物質Ｆの場合、遊離のシロリムスの測定可能な濃度の標準化を示している。
【０１２７】
本明細書に記載される実施例および実施形態は例示の目的のためにすぎず、これらに照らした様々な修飾または変更が、当業者に対して示唆され、本出願の精神および権限、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【０１２８】
共同所有の、同時係属中の出願である、２００６年１２月２９日出願の米国仮出願番号第６０／８７８，０１７号は、溶液中捕捉の免疫アッセイで用いるための非変性性の溶解試薬に関するその教示に対して、その全文が参照により明らかに組み込まれる。
【０１２９】
共同所有の、同時係属中の出願である、２００６年１２月２９日出願の米国非仮出願番号第１１／６１８，４９５号は、非変性性の溶解試薬に関するその教示に対して、その全文が参照により明らかに組み込まれる。
【０１３０】
共同所有の、同時係属中の出願である、２００６年１２月２９日出願の米国仮出願番号第６０／８８２，８６３号は、免疫抑制薬に対する改善されたアッセイに関するその教示に対して、その全文が参照により明らかに組み込まれる。
【０１３１】
共同所有の、同時係属中の出願である、２００６年７月２１日出願の米国非仮出願番号第１１／４９０，６２４号は、抽出用試薬の組成に関するその教示に対して、その全文が参照により明らかに組み込まれる。
【０１３２】
さらに、本明細書に引用される他の出版物、特許および特許出願は全て、全目的に対して、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アッセイ前に生物学的試料を凍結または貯蔵することによって生成される試料の偏りを低減または排除するための、診断アッセイ用の試料の調製における１つ以上のプロテアーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床対象となる分析物の多くは細胞によって吸収され、または検査試料の１つ以上の他の成分と複合されるようになる。したがって、試料に存在する分析物の量の正確な測定を得るには、分析物がアッセイにおいて検出されるために細胞または他の成分から放出されるような条件下で、試料を処理し、および／またはアッセイを行う必要がある。
【０００３】
例えば、タクロリムス、エベロリムス、テムソロリムス（ｔｅｍｓｏｒｏｌｉｍｕｓ）およびシクロスポリンなどの免疫抑制薬は、移植手術後の臓器または組織の拒絶反応の処置、移植片対宿主病の処置、およびヒトにおける自己免疫疾患の処置に効果的である。免疫抑制薬治療の間、免疫抑制薬の血中濃度レベルをモニターするのは臨床ケアの重要な局面であり、その理由は不十分な薬物レベルは移植片（臓器または組織）の拒絶反応をもたらし、過剰な薬物レベルは望ましくない副作用および毒性をもたらすからである。したがって、免疫抑制薬の血中レベルが測定され、そこで好適な濃度の薬物レベルを維持するように薬物投与量が調節され得る。免疫抑制薬の血中レベルを決定するための診断アッセイは、このように広範な臨床の使用を見出している。
【０００４】
最初に、免疫抑制薬が抽出され、患者の試料の他の成分から分離されなければならない。患者の試料における免疫抑制剤の大部分は、結合タンパク質など、様々な「担体」分子との複合体において存在する。シロリムス、タクロリムスおよびシクロスポリンは、患者検体の赤血球に優勢に見出され、シロリムスおよびタクロリムスではＦＫＢＰ、およびシクロスポリンではシクロフィリンである、特異的な結合タンパク質に関連している。検体における全薬物濃度を確実に正確に測定するには、結合タンパク質に結合している薬物が定量前に遊離されることが好ましい。これは、細胞を溶解するための界面活性剤、および／または試料のタンパク質を変性するための有機溶剤を用いることによって取り組まれている。
【０００５】
結合タンパク質から薬物を抽出した後、薬物は、吸光度または質量分析の検出と一緒の免疫アッセイまたはクロマトグラフィーを含めた数々の異なる方法において測定され得る。免疫抑制薬に対する免疫アッセイは様々なフォーマットにおいて利用可能であるが、全てが、免疫抑制薬に対する抗体または結合タンパク質（例えば、ＦＫＢＰ）の結合を用いている。一般的に用いられている免疫アッセイは、第１の抗体の免疫抑制薬への結合、および標識された免疫抑制薬（例えばアクリジニウム−シロリムス）の残りの遊離の抗体結合性部位への結合、および引き続く標識の検出による定量を伴うアッセイである。
【発明の概要】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、１つ以上のプロテアーゼが、非溶解の新鮮な試料（例えば、患者の血液試料）全体を用いたものと凍結−解凍溶解した試料（例えば、標準物質希釈液）の間に観察される分析物（例えば、薬物）濃度の偏りを解決するために、調製物（例えば、免疫アッセイ用の）中に組み込まれ得るという知見に関する。プロテアーゼは、結合タンパク質が時間とともにタンパク質分解し、したがってそのリガンド（分析物）に対する親和性を変更し、これは次に診断アッセイにおいて検出されるリガンドの濃度を変更する診断アッセイ用の試料の調製において特に有用であるということも見い出された。
【０００７】
したがって、ある実施形態において、本発明は、細胞内リガンドによって結合されている分析物を検出するためのアッセイにおいて用いるための検査試料を調製する方法を提供する。この方法は、溶解試薬（または１つ以上のその成分）を含むアッセイ試薬および細胞内リガンドに対してタンパク質分解活性を有するプロテアーゼと前記検査試料（例えば、生物学的試料）を接触させて、引き続く抽出ステップ無しに免疫アッセイで用いるのに適合する混合物を形成することを典型的に伴う。様々な実施形態において、検査試料は全血または血液分画（例えば、血清）を含む。様々な実施形態において、検査試料はヒト血液（例えば、免疫抑制薬で処置したヒトからの血液）を含む。様々な実施形態において、プロテアーゼはセリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼからなる群から選択される。ある実施形態において、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、ディスパーゼおよびトリプシンからなる群から選択される。様々な実施形態において、溶解試薬は、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなど）を含む。ある実施形態において、グリコール対アルコールの比率は約４：１から約１：４まで、より好ましくは約４：１から約１：２までの範囲にある。ある実施形態において、検査試料は、約２：１から約１：１０までの、好ましくは約２：１から約１：５までの、より好ましくは約２：１から約１：２までの範囲の比率の試料：溶解試薬の混合物を形成するように、溶解試薬（または溶解試薬の成分）に加えられる。ある実施形態において、この方法は、試料を遠心分離することを含まない。ある実施形態において、界面活性剤は、検査試料を溶解または可溶化するために用いられない。ある実施形態において、この方法は、検査試料を界面活性剤と接触させることを含まない。ある実施形態において、アッセイ試薬は、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合する競合物質をさらに含むが、アッセイ検出系におけるリガンド（分析物）捕捉系（例えば、抗体または他の捕捉リガンド）と実質的に交差反応性ではない。ある実施形態において、細胞内リガンドはイムノフィリンリガンドである。ある実施形態において、分析物は免疫抑制薬を含み、競合物質は、異なるが構造上類似の分子（例えば、類似体）（免疫抑制薬であってもよく、またはなくてもよい）を含む。ある実施形態において、分析物は、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬を含む。
【０００８】
ある実施形態において、本発明は、細胞内リガンドによって結合されている分析物を検出するためのアッセイにおいて用いるための検査試料を調製する方法を提供する。この方法は、界面活性剤を含まない溶解試薬、および細胞内リガンドに対してタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む試薬と検査試料を接触させることを典型的に伴う。様々な実施形態において、検査試料は全血または血液分画（例えば、血清）を含む。様々な実施形態において、検査試料はヒト血液（例えば、免疫抑制薬で処置したヒトからの血液）を含む。様々な実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼからなる群から選択される。ある実施形態において、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、ディスパーゼおよびトリプシンからなる群から選択される。様々な実施形態において、溶解試薬は、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなど）を含む。ある実施形態において、グリコール対アルコールの比率は、約４：１から約１：４まで、より好ましくは約４：１から約１：２までの範囲にある。ある実施形態において、検査試料は、約２：１から約１：１０まで、好ましくは約２：１から約１：５まで、より好ましくは約２：１から約１：２までの範囲における比率の試料：溶解試薬の混合物を形成するように、溶解試薬（または溶解試薬の成分）に加えられる。ある実施形態において、この方法は、試料を遠心分離することを含まない。ある実施形態において、界面活性剤は、検査試料を溶解または可溶化するために用いられない。ある実施形態において、この方法は、検査試料を界面活性剤と接触させることを含まない。ある実施形態において、アッセイ試薬は、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合する競合物質をさらに含むが、アッセイ検出系におけるリガンド（分析物）捕捉系（例えば、抗体または他の捕捉リガンド）と実質的に交差反応性ではない。ある実施形態において、細胞内リガンドはイムノフィリンリガンドである。ある実施形態において、分析物は免疫抑制薬を含み、競合物質が、異なるが構造上類似の分子（例えば、類似体）（免疫抑制薬であってもよく、またはなくてもよい）を含む。ある実施形態において、分析物は、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬を含む。
【０００９】
検査試料における分析物（例えば、免疫抑制薬）の濃度を評価するための方法も提供される。この方法は、アッセイ試薬と検査試料を接触させて、引き続く抽出ステップ無しに免疫アッセイにおける使用に適合するアッセイ混合物を生成すること（アッセイ試薬は溶解試薬（またはその成分）および分析物に結合する細胞内リガンドに対してタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む。）、分析物（例えば、免疫抑制薬）について溶解混合物をアッセイすることを典型的に伴う。ある実施形態において、アッセイ混合物は均一な混合物であり、および／またはアッセイは免疫アッセイを含む。ある実施形態において、免疫抑制薬は、シロリムス、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される。ある実施形態において、検査試料はヒト血液試料（例えば、全血または血液分画（例えば、血清））を含む。
【００１０】
ある実施形態において、この方法は試料を遠心分離することを含まない。ある実施形態において、界面活性剤は、検査試料を溶解または可溶化するために用いられない。ある実施形態において、この方法は、検査試料を界面活性剤と接触させることを含まない。ある実施形態において、アッセイ試薬は、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合する競合物質をさらに含むが、アッセイ検出系におけるリガンド（分析物）捕捉系（例えば、抗体または他の捕捉リガンド）と実質的に交差反応性ではない。ある実施形態において、細胞内リガンドはイムノフィリンリガンドである。ある実施形態において、分析物は免疫抑制薬を含み、競合物質は、異なるが構造上類似の分子（例えば、類似体）（免疫抑制薬であってもよく、またはなくてもよい）を含む。ある実施形態において、分析物は、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬を含む。
【００１１】
ある実施形態において、本発明は、少なくとも１つの免疫抑制薬（例えば、シロリムス、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびこれらの任意の化合物の類似体）と特異的に結合することができる少なくとも１つの抗体またはタンパク質、ならびに界面活性剤でない溶解試薬（例えば、本明細書に記載される通り）、ならびにイムノフィリンリガンドを分解するプロテアーゼを含むアッセイ試薬を含む検査キットを提供する。ある実施形態において、界面活性剤でない溶解試薬は、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコールを含む。キットは、場合により、免疫抑制薬を少なくとも１つ含む対照組成物をさらに含むことができる。ある実施形態において、キットは、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合する競合物質をさらに含むが、アッセイ検出系におけるリガンド（分析物）捕捉系（例えば、抗体または他の捕捉リガンド）と交差反応性ではない。ある実施形態において、細胞内リガンドはイムノフィリンリガンドである。ある実施形態において、分析物は免疫抑制薬を含み、競合物質は、異なるが構造上類似の分子（例えば、類似体）（免疫抑制薬であってもよく、またはなくてもよい）を含む。ある実施形態において、分析物は、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬を含む。ある実施形態において、競合物質はアッセイ試薬において提供される。ある実施形態において、細胞内リガンドはイムノフィリンリガンドである。様々な実施形態において、競合物質はアッセイされる免疫抑制薬とは異なるが、構造的には類似である免疫抑制薬を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本明細書に記載する試料調製方法の一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、アッセイ前に生物学的試料を凍結または貯蔵することによって生成される試料の偏りを低減または排除するための、診断アッセイ用の試料の調製における１つ以上のプロテアーゼの使用に概ね関する。
【００１４】
定義
特許請求の範囲および明細書において用いられる用語は、別段に特定しなければ以下に述べるように定義される。
【００１５】
本明細書で用いられる「免疫抑制薬（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ ｄｒｕｇ）」または「免疫抑制薬（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）」は、ラパマイシン（シロリムス）、またはシクロスポリンＡとしても知られているシクロスポリンのいずれかと同じまたは類似の化学構造を有する、小分子または抗体ベースいずれかの治療用化合物を意味する。ラパマイシンもしくはシクロスポリンいずれかの、任意の知られている類似体、または以降開発される類似体は、本明細書における免疫抑制薬とみなされる。好ましい免疫抑制剤は、シロリムス、タクロリムス、エベロリムス、テムソロリムス、ゾタロリムスおよびシクロスポリンを含む。タクロリムスおよびシクロスポリンは、インターロイキン２などのサイトカインの阻害によって免疫系のＴリンパ球の早期の活性化を抑制するカルシニューリン阻害薬である。これとは対照的に、シロリムス、エベロリムスおよびゾタロリムスの主な標的は、特異的な細胞周期調節タンパク質である、ラパマイシンの哺乳動物の標的（ｍＴＯＲ）である。ｍＴＯＲの阻害は、サイトカイン駆動性のＴリンパ球の増殖の抑制をもたらす。
【００１６】
シクロスポリンの化学式は、式Ａにある。シロリムス（ラパマイシン）の化学式は、式Ｂにある。エベロリムス（ＲＡＤ）のシロリムスとの構造上の違いの化学式は、式Ｃにある。
【００１７】
【化１】
【００１８】
シクロスポリンの多くの誘導体および類似体が調製されている。本発明は、シクロスポリンまたは任意のその類似体のための溶解試薬、溶解方法、アッセイおよびアッセイキットを含む。
【００１９】
ラパマイシンの多くの誘導体または類似体が調製されている。例えば、これらは、ラパマイシンのエステルのモノおよびジエステル誘導体（ＰＣＴ国際公開第９２／０５１７９号パンフレット）、ラパマイシンの２７−オキシム（欧州特許第０４６７６０６号明細書）、ラパマイシンの４２−オキソ類似体（米国特許第５，０２３，２６２号明細書）、二環式ラパマイシン（米国特許第５，１２０，７２５号明細書）、ラパマイシン二量体（米国特許第５，１２０，７２７号明細書）、ラパマイシンのシリルエーテル（米国特許第５，１２０，８４２号明細書）、ならびにアリールスルホネートおよびスルファメート（米国特許第５，１７７，２０３号明細書）の調製物を含んでいる。ラパマイシンは、その天然に存在するエナンチオマーの形態において最近合成された（Ｋ．Ｃ．Ｎｉｃｏｌａｏｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３年、１１５巻、４４１９−４４２０頁；Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３年、１１５巻、７９０６−７９０７頁；Ｓ．Ｊ．Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３年、１１５巻、９３４５−９３４６頁）。本発明は、ラパマイシンまたは任意のその類似体のための溶解試薬、溶解方法、アッセイおよびアッセイキットを含む。
【００２０】
ラパマイシンの別の免疫抑制薬の類似体は、Ｓ．ツクバエンシス（Ｓ．ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）株から単離された、タクロリムスとしても知られているＦＫ−５０６である。ＦＫ５０６の化学式は、欧州特許第０２９３８９２ Ｂ１号明細書において公開されている。ＦＫ−５０６の類似体は、それだけには限定されないが、関連の天然物であるＦＲ−９００５２０およびＦＲ−９００５２３を含み、これらはＣ−２１のそのアルキル置換基においてＦＫ−５０６と異なっており、Ｓ．ハイグロスコピカス・ヤクシムナエンシス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｙａｋｕｓｈｉｍｎａｅｎｓｉｓ）から単離された。Ｓ．ツクバエンシスによって生成される別の類似体であるＦＲ−９００５２５は、ピペコリン酸部分がプロリン基で置換されている点でＦＫ−５０６と異なる。ＦＫ５０６の基本構造および免疫学的性質を保持している多数の化合物が、数々の出版物（例えば、欧州特許第１８４１６２号、欧州特許第３１５９７３号、欧州特許第３２３０４２号、欧州特許第４２３７１４号、欧州特許第４２７６８０号、欧州特許第４６５４２６号、欧州特許第４８４９３６号、欧州特許第５３２０８８号および欧州特許第４７４１２６号明細書；ＰＣＴ国際公開第９１／１３８８９号パンフレット、第９１／１９４９５号パンフレットおよび第９３／５０５９号パンフレットなど）に記載されている。本発明は、ＦＫ−５０６または任意のその類似体のための溶解試薬、溶解方法、アッセイおよびアッセイキットを含む。テムソロリムスは、本発明でモニターされ得るシロリムスの別のエステル誘導体である。
【００２１】
今日ではゾタロリムスとしてより知られているＡＢＴ−５７８［４０−エピ−（１−テトラゾリル）−ラパマイシン］は、ラパマイシンに由来する、半合成のマクロライドトリエン抗生物質である。ゾタロリムスの構造を式Ｄに示す。
【００２２】
【化２】
【００２３】
免疫抑制薬に関して本明細書で用いられる、「構造的に類似する」の語は、薬物が少なくとも１つの共通の結合パートナー（例えば、結合タンパク質）に競合的に結合するのに十分類似している構造を薬物が有することを示す。
【００２４】
「検査試料」の語は、免疫抑制薬分析物の供給源である、動物の身体の成分、組織または液体を意味する。これらの成分、組織および液体は、ヒトおよび動物の体液（例えば、全血、血清、血漿、滑液、脳脊髄液、尿、リンパ液、ならびに呼吸器、腸管および尿生殖路の様々な外分泌、涙、唾液、乳汁、白血球、骨髄腫など）、生物学的液体（例えば、細胞培養上清）、固定された組織検体ならびに固定された細胞検体を含む。検査試料がヒト末梢血試料であるのが好ましい。
【００２５】
本明細書で用いられる「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。この語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびこれらのフラグメント、ならびに免疫グロブリン遺伝子配列から操作される分子を包含する。認められている免疫グロブリン遺伝子は、カッパー、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパーまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、これらは、今度はそれぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの免疫グロブリンのクラスを規定する。
【００２６】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含むことが知られている。各々の四量体は、各対が１個の「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１個の「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する、２本の同一のポリペプチド鎖対からなる。各鎖のＮ末端は、抗原の認識を主に担っている約１００から１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を規定している。「可変軽鎖（ＶＬ）」および「可変重鎖（ＶＨ）」の語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を意味する。
【００２７】
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして存在し、または様々なペプチダーゼで消化することによって生成された十分に特徴付けられた数々のフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結より下の抗体を消化して、それ自体が、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結している軽鎖であるＦａｂの二量体であるＦ（ａｂ’）２を生成する。Ｆ（ａｂ’）２は、穏やかな条件下で還元されてヒンジ領域におけるジスルフィド連結を分解し、それによって（Ｆａｂ’）２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換することがある。Ｆａｂ’モノマーは、本質的にはヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳しい記載には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、（１９９３年）を参照されたい）。様々な抗体フラグメントがインタクトな抗体の消化に関して定義されており、当業者であればこのようなＦａｂ’フラグメントは、化学的に、または組換えＤＮＡ法の利用によっていずれかで新たに合成され得ることを理解する。
【００２８】
したがって、本明細書で用いられる「抗体」の語は、抗体全体を修飾することによって生成される抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成される抗体フラグメントのいずれかも含む。「抗体」の語は、一本鎖抗体（一本鎖のポリペプチドとして存在する抗体）、より好ましくは一本鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）も包含し、一本鎖Ｆｖ抗体では可変重鎖および可変軽鎖が（直接またはペプチドリンカーによって）一緒に連結して連続したポリペプチドを形成する。一本鎖Ｆｖ抗体は、（直接連結しているまたはペプチドをコードするリンカーによって連結しているＶＨコード配列およびＶＬコード配列を含む核酸から発現され得る）共有結合しているＶＨ−ＶＬヘテロダイマーである（Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、５８７９−５８８３頁）。ＶＨとＶＬは一本鎖ポリペプチドとして各々に連結しており、ＶＨドメインとＶＬドメインは非共有結合している。ｓｃＦｖ抗体および数々の他の構造は、抗体Ｖ領域から天然では凝集しているが化学的には分離されている軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造に実質的に類似している３次元構造に折りたたむ分子に変換することが、当業者に知られている（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号明細書、第５，１３２，４０５号明細書および第４，９５６，７７８号明細書を参照されたい）。
【００２９】
本明細書で用いられる「分析物」は、検査試料に存在することが疑われ得る、検出されるべき物質を意味する。分析物は、それに対して天然に存在する特異的な結合パートナーが存在し、またはそれに対して特異的な結合パートナーが調製され得る任意の物質であってよい。したがって、分析物は、アッセイにおいて１つ以上の特異的な結合パートナーに結合することができる物質である。
【００３０】
本明細書で用いられる「結合パートナー」は、結合対のメンバーであり、すなわち分子の一方が第２の分子に結合している１対の分子である。特異的に結合している結合パートナーは、「特異的な結合パートナー」と呼ばれる。免疫アッセイにおいて通常用いられる抗原および抗体の結合パートナーの他に、他の特異的な結合パートナーは、ビオチンおよびアビジン、炭水化物およびレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクター分子およびレセプター分子、補助因子および酵素、酵素阻害物質および酵素などを含むことができる。免疫反応性の特異的な結合パートナーは、組換えＤＮＡ法によって形成されるものを含めて、抗原、抗原フラグメント、抗体および抗体フラグメント、モノクローナルおよびポリクローナルの両方ならびにそれらの複合体を含む。
【００３１】
「特異的な結合」の語は、本明細書において、特異的な部位での、結合パートナーの別のものへの優先的な結合（例えば、ポリペプチドおよびリガンド（分析物）、２つのポリペプチド、ポリペプチドおよび核酸分子、または２つの核酸分子）と定義される。「特異的な結合」の語は、標的の分子／配列に対する結合の優先度（例えば、親和性）が、非特異的な標的分子（例えば、特異的に認識される部位を欠く、ランダムに産生された分子）の少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０または２０倍上回ることを示している。
【００３２】
免疫抑制薬に特異的に結合する抗体は、その免疫抑制薬に「特異的」であるといわれる。
【００３３】
「捕捉試薬」または「捕捉剤」の用語は、分析物に結合する結合パートナー、より詳しくは分析物に特異的に結合する結合パートナーを意味する。様々な実施形態において、捕捉剤は固相に付着していてよい。本明細書で用いられる、固相に固定されている捕捉剤の分析物に対する結合は、「固相に固定されている複合体」を形成する。
【００３４】
「標識されている検出剤」の語は、本明細書において用いられて、分析物に、好ましくは特異的に結合している結合パートナーを意味し、検出可能な標識で標識され、またはアッセイにおける使用の間に検出可能な標識で標識される結合パートナーである。
【００３５】
「検出可能な標識」は、検出可能である部分、または検出可能になされ得る部分を含む。
【００３６】
標識されている検出剤に関して用いられる「直接標識」は、任意の手段によって検出剤に付着している検出可能な標識である。
【００３７】
標識されている検出剤に関して用いられる「間接標識」は、検出剤に特異的に結合している検出可能な標識である。したがって、間接標識は、検出剤の部分の特異的な結合パートナーである部分を含む。ビオチンおよびアビジンは、例えば、ビオチン化された抗体を標識されたアビジンに接触させて間接的に標識された抗体を生成することによって用いられるこのような部分の例である。
【００３８】
本明細書で用いられる「指示薬」の語は、標識と接触して検出可能なシグナルを生成する任意の薬剤を意味する。したがって、例えば、従来の酵素標識において、酵素で標識された抗体は、基質（指示薬）と接触して検出可能なシグナル（例えば、着色した反応生成物）を生成することができる。
【００３９】
本明細書で用いられる「グリコール類似体」は、炭素原子２個から６個までを有する任意のグリコールである。
【００４０】
溶解混合物は、正確な、信頼できるピペット操作（手操作または自動化されたシステムの使用のいずれかで）を可能にするように、大型粒子が十分にない場合に「均一である」と言われる。
【００４１】
アッセイ混合物に関して用いられる場合の「引き続く抽出ステップ無しに」の語句は、アッセイ混合物が、（本明細書で記載される）免疫アッセイに関して「そのままで」用意ができていることを示す。したがって、分析前にさらなる遠心分離は必要とされない。混合物はそのままで分析器に適用する用意ができている。
【００４２】
Ｉ．アッセイの偏りを低減または排除するためのプロテアーゼの使用
本発明は、非溶解の新鮮全血（例えば、患者の検体）の使用と凍結−解凍した溶解した血液（例えば、標準物質希釈液）の間に観察される、分析物（例えば、薬物）濃度の偏りを解決するための、（例えば、免疫アッセイ用の）試料調製におけるプロテアーゼまたはプロテアーゼ（複数）の使用に関する。プロテアーゼは、結合タンパク質が時間とともにタンパク質分解し、したがってそのリガンド（分析物）に対する親和性を変更し、これは次に診断アッセイにおいて検出されるリガンドの濃度を変更する診断アッセイ用の試料の調製において特に有用である。
【００４３】
ホルモン受容体、Ｇタンパク質、タンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、イソメラーゼなどの細胞内結合タンパク質は、例えば診断アッセイにおいて、アッセイされるべき標的の分析物にしばしば結合する。したがって、例えば、イムノフィリンは、ラパマイシン（シロリムス）、タクロリムス、エベロリムス、テムソロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンなどの免疫抑制薬にしばしば結合する。細胞内結合タンパク質は、典型的には外部環境（例えば、細胞外マトリックス）から細胞膜によって保護されている。この膜が溶解するとプロテアーゼはこれらの細胞内結合タンパク質に接近できるようになり、関連する標的の分析物（例えば、薬物、小分子など）への結合親和性を変更することができる。
【００４４】
試料はしばしば凍結して貯蔵され、または長期間貯蔵され、その両方とも細胞の溶解および細胞内タンパク質のタンパク質分解をもたらすので、これらの溶解の事象は診断上の重大な問題となる。したがって、新鮮な試料においては、細胞内結合タンパク質は比較的インタクトであることがあり、貯蔵試料における細胞内結合タンパク質よりも分析物に対して大きな親和性を有することがあるので、検査の偏りが、このようなタンパク質によって結合される分析物に対するアッセイ中に導入される。
【００４５】
ある実施形態において、本発明は、特に分析物が非タンパク質分子である場合は、試料調製において１つ以上のプロテアーゼを用いてその結合タンパク質から分析物の放出を促進し、その結果この偏りを低減または排除することができるという発見に関する。これにより、分析物のより安定した測定が可能になる。
【００４６】
プロテアーゼは、界面活性剤（例えば、溶解界面活性剤）を使用せずに、および／または他の変性性の組成物もしくは方法（例えば、有機溶剤、低ｐＨ、高ｐＨ、カオトロープなど）を使用せずに、試料調製物におけるアッセイの偏り（例えば、細胞内リガンドによる分析物の結合による）を低減または排除するのに効果的であったのも、驚くべき発見であった。このような薬剤の使用を排除することは、分析物の測定における分散をやはり低減する、均一な検出方法の使用を促進する。
【００４７】
プロテアーゼは、診断アッセイ（結合タンパク質が時間とともにタンパク質分解し、したがってそのリガンド（分析物）に対する親和性を変更し、これが次に診断アッセイにおいて検出されるリガンドの濃度を変更する）用の試料の調製において特に有用である。試料調製におけるプロテアーゼの使用、および／またはある実施形態においてはアッセイ自体がこのプロセスを促進し、そのためリガンドは、常に、または主に、結合タンパク質のタンパク質分解された形態と相互作用する。したがって、リガンド（分析物）濃度は、実質的に一定のままであり、その結果アッセイにおける分散を低減し、および／またはアッセイ前に試料を貯蔵することによって生成される偏りを低減もしくは排除する。
【００４８】
ある実施形態において、プロテアーゼは、その結合タンパク質からのリガンド（分析物）の放出における助けとなるために、非交差反応性の競合物質と組み合わせて用いられ、そのため、競合物質を使用しなかった場合に他の方法では必要であるよりも結合タンパク質における変化が少ないことが必要である。
【００４９】
本明細書に提供される考察は、標的分析物として免疫抑制薬に注目しているが、この方法は、細胞内結合タンパク質によって結合されている他の分析物、好ましくは非タンパク質の分析物に対して等しく適用可能であることが注目される。
【００５０】
適切なプロテアーゼは、それだけには限定されない、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼなど）、メタロプロテアーゼ（例えば、ディスパーゼ、サーモリシンなど）、チオプロテアーゼ（例えば、パパイン、カテプシンなど）、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、プラスメプシン）、グルタミン酸プロテアーゼなど、およびこれらの組合せを含む。特定のアッセイ調製物において用いるために選択されるプロテアーゼは、典型的には結合タンパク質を分解し、その結果アッセイ用の分析物（例えば、免疫抑制薬）を放出することができるものである。ある実施形態において、実行されるアッセイの感度および正確さに有害な影響を及ぼさずに不活性化され得るプロテアーゼが選択される。プロテアーゼは、用いられる不活性化の方法によって不活性化されることがない他の汚染性の酵素を含まない形態で提供されるのが好ましい。さもなければ、任意の残留のタンパク質分解活性が、引き続く免疫アッセイで用いられる抗体を分解することがある。
【００５１】
プロテアーゼは、それだけには限定されない、Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍなどを含めた数々の供給業者から入手可能である。ある実施形態において、例示のプロテアーゼは、それだけには限定されない、プロテイナーゼＫ、サブチリシン、ペプシン、ディスパーゼ、サーモリシン、キモトリプシン（α−、β−、γ−、δ−またはπ−キモトリプシンを含む）、トリプシン、フィシン、ブロメラインなど、およびこれらの組合せを含む。
【００５２】
プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、熱（６５℃またはそれより高い）および特異的なプロテアーゼ阻害物質（それだけには限定されない、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ）またはジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ）を含む）によって不活性化され得る、非特異的な、Ｃａ依存性のプロテアーゼである。サブチリシン（Ｓｉｇｍａ）も、熱（５５℃またはそれより高い）によって不活性化され得る、非特異的な、Ｃａ依存性のプロテアーゼであるが、酸性のｐＨ、または特異的なプロテアーゼ阻害物質（例えば、ＰＭＳＦ、ＤＦＰもしくはアプロチニン）によって阻害され得る。
【００５３】
ディスパーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍまたはＳｉｇｍａまたはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびサーモリシン（ＳｉｇｍａまたはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）は、例えば約５ｍＭの濃度のＥＤＴＡによって不活性化され得る、Ｃａ依存性のメタロプロテアーゼである。ある実施形態において、ディスパーゼおよびサーモリシンをあわせてプロテアーゼとして用いる場合、タンパク質分解は、例えば、約４０ｍＭの濃度の、ＺｎＳＯ４などの亜鉛塩の存在下で、例えば約５ｍＭの濃度のＥＤＴＡなどの２価の陽イオンキレート剤を加えることによって不活性化され得る。
【００５４】
トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、Ｎ．Ｊ．）は、リジン残基またはアルギニン残基のカルボキシル側で特異的にタンパク質を切断し、熱（９０℃もしくはそれより高い）によって阻害され得、またはそれだけには限定されない、アプロチニン（アプロチニン注射は以前はＢａｙｅｒ、Ｗｅｓｔ Ｈａｖｅｎ、ＣＴによってＴｒａｓｙｌｏｌ（登録商標）として市販されており、阻害薬はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡおよび他の業者からいまだに入手可能である）、ロイペプチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯもしくはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ＰＭＳＦ、またはダイズ、ライマメもしくは卵白由来の特異的なトリプシン阻害物質（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、Ｎ．Ｊ．もしくはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含めた多くの薬剤によって特異的に阻害され得る。フィシンは、例えば、約２ｍＭの濃度のＨｇＣｌ２によって不活性化され得るチオールプロテアーゼである。ブロメラインもチオールプロテアーゼ（チオプロテアーゼ）であり、ブロメライン阻害物質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって不活性化され得る。
【００５５】
特定の実施形態において、プロテアーゼの濃度は、約２−４時間以内、好ましくは約１時間以内、より好ましくは約３０分以内、さらにより好ましくは約２０分または１０分以内に結合タンパク質を分解するのに十分高いが、酵素の効率的な不活性化を可能にするのに十分低い。したがって、プロテアーゼの濃度は、好ましくは約０．１単位／ｍＬから５．０単位／ｍＬまで、より好ましくは約０．３単位／ｍＬから約３単位／ｍＬまで、さらにより好ましくは約０．５単位／ｍＬから２．０単位／ｍまでＬ、最も好ましくは約１単位／ｍＬの範囲である。
【００５６】
上記に示したように、本明細書に記載するようにプロテアーゼを１つ以上使用することで、変性剤を使用する必要性がなくなる。変性剤を使用すると、沈澱した血液の成分を除去するのに（この手法の効率を低減する）引き続く遠心分離のステップが通常必要とされるので、これは有利である。さらに、必要とされる濃度の有機溶剤を使用すると、分析物の濃度に影響を及ぼすのに著しく十分である試料の蒸発をもたらし得る。
【００５７】
分析物（例えば、免疫抑制薬）が検査試料（例えば、イムノフィリン）における１つ以上の結合タンパク質に結合するある実施形態において、本明細書に記載する方法は、場合により、試料を結合タンパク質から分析物を放出する１つ以上の薬剤（プロテアーゼの他に）と接触させることをさらに伴うことがある。例えば、薬剤は、結合タンパク質への結合に対して分析物と競合する薬剤（競合物質）を含むことがある。薬剤は、一般的には、行われるアッセイの結果に影響を及ぼさないように選択される。したがって、薬剤は、分析物検出系（例えば、捕捉剤）に反応性ではない（例えば、それによって結合されない）もの、または分析物検出系（捕捉剤）と実質的に反応性が低い（例えば、少なくとも１０倍反応性が低い、好ましくは少なくとも１００倍反応性が低い、より好ましくは少なくとも１０００倍もしくは１００００倍反応性が低い）ものから選択されるのが好ましい。
【００５８】
したがって、例えば、アッセイが免疫アッセイである場合、薬剤（競合物質）は、典型的には、関連する抗体が実質的にそれと交差反応しないものである。分析物が免疫抑制薬である、ある実施形態において、薬剤は、異なるが構造的には類似の類似体（免疫抑制薬であってもよく、またはなくてもよい）であってよい。例えば、シロリムスおよびタクロリムスは両方ともＦＫＢＰに結合し、この理由から、シロリムスはＦＫＢＰからタクロリムスを放出するのに用いられることがあり、その逆もまた同様である。典型的には、このような場合において、引き続く免疫アッセイは、シロリムスとタクロリムスを区別する抗体を一般的に用いる。米国特許第６，１８７，５４７号明細書（２００１年２月１３日ＬｅｇａｙおよびＷｅｎｇｅｒに発行され、免疫抑制薬の競合に関するその教示に対してその全文を参照により本明細書に組み込む）は、結合タンパク質から免疫抑制薬を放出するのに有用な「結合競合物質」を記載している。例は、［Ｔｈｒ２，Ｌｅｕ５，Ｄ−Ｈｉｖ８，Ｌｅｕ１０］−シクロスポリンを含み、これはシクロスポリンを放出することができる。さらに、２００５年５月２６日に発行され、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願第２００５／１１２７７８ Ａ１号明細書は、ＦＫ５０６またはラパマイシンをそれらのイムノフィリン複合体から置換するための結合競合物質として働くことができるＦＫ５０６の誘導体を開示している。
【００５９】
ある実施形態において、本明細書に記載する方法は、界面活性剤を含まない溶解試薬の使用を伴う。迅速に溶解するのに必要とされる界面活性剤の量および分画の細胞は気泡を引き起こすことがあり、これはほとんどの自動化ピペッティングシステムによってピペット操作されなければならない試料にとって容認できないものであり、免疫アッセイによって分析される試料における免疫化学を妨害し得るという理由から、特定のフォーマットにおいて界面活性剤の使用は問題となり得る。界面活性剤を含まない溶解試薬の使用は、起泡しやすくない試料をもたらし、界面活性剤に対する必要性を排除し、したがってアッセイ免疫化学における界面活性剤がもたらす妨害を避ける。
【００６０】
特に界面活性剤を含まない溶解試薬と組み合わせた、本明細書に記載する１つ以上のプロテアーゼの使用は、遠心分離のステップを必要とせずに自動化ピペッティングシステムで用いるのに適する均一な混合物をもたらし、実質的な濃度の揮発性の有機溶剤の使用を排除する。
【００６１】
ＩＩ．試料回収および処理加工
本発明の方法は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する検査試料に対して一般的に行われる。ある場合（分析物が１つ以上の免疫抑制薬を含む）において、検査試料は、免疫抑制薬（例えば、移植臓器の拒絶反応、移植片拒絶反応を防止もしくは阻害するため、または自己免疫疾患の処置のため）で処置中のヒト（または、獣医学上の動物）からの検査試料である。
【００６２】
本発明の方法は、血液試料など、標的の分析物（例えば、免疫抑制薬）を含んでいることがある任意の試料を用いて行われ得る。ある実施形態において、検査試料は、全血または血液分画（例えば、血清）を含むことができる。
【００６３】
試料は、任意の標準の技術によって収集される。試料は、後の処理加工用に直ちに処理加工または貯蔵（例えば、乾燥、凍結、不活性ガス下の貯蔵など）され得る。所望により、試料は、本明細書に記載する１つ以上のプロテアーゼ、および溶解試薬（もしくはその成分）と直接接触してよい。様々な実施形態において、試料は、その代わりに、プロテアーゼおよび溶解試薬またはこれらの成分で処理する前に、処理加工（例えば、再構成、希釈、等張化、分画化など）されてもよい。様々な実施形態において、試料が溶解試薬またはその成分と接触する前に、それと同時に、またはその後に、プロテアーゼは試料と接触する。
【００６４】
一つの簡単な方法が図１に示され、この場合、試料（この場合は全血）は、１つ以上のプロテアーゼ（Ｐ）および１つ以上の非交差反応性の競合物質（Ｃ）を含む界面活性剤でない溶解試薬と接触する。このことは、溶解した全血、１つ以上のプロテアーゼ、非交差反応性の競合物質、内因性の結合タンパク質および対象の分析物（例えば、免疫抑制薬）を含む均一な混合物を生じさせる。混合物はアッセイする用意ができている。
【００６５】
ある実施形態において、界面活性剤を含まない溶解試薬が利用される。ある適切な溶解試薬は、炭素原子２個から６個までを有するグリコールを少なくとも１つ、および１０個以下の炭素原子、好ましくは８個以下の炭素原子、より好ましくは５個以下の炭素原子を有するアルコールを少なくとも１つを含んでいる。溶解試薬において用いるのに適するグリコールは、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体、ならびにこのようなグリコールの混合物を含む。溶解試薬において使用するのに適するアルコールは、ヒドロキシル基を１個有するアルコールを主に含む。このようなアルコールは、それだけには限定されない、１級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソブチルアルコールなど）、２級アルコール（例えば、イソプロパノール、シクロヘキサノールなど）および３級アルコール（例えば、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｔｅｒｔ−アミルアルコールなど）を含む。ある実施形態において、アルコールは、それだけには限定されない、メタノール、エタノールおよびＣ３−Ｃ１０アルコール（例えば、プロパノール、ペンタノール、ヘキサノール、セプタノール、オクタノールなど）ならびにこれらの混合物を含む。特定の実施形態において、グリコール対アルコールの比率は、約４：１から約１：４まで（体積：体積）の範囲にある。より特定の実施形態において、グリコール対アルコールの比率は、約４：１から約１：２まで、好ましくは約２：１から約１：２までの範囲にある。
【００６６】
溶解混合物は、任意の選択された量の試料を溶解試薬と接触させるのに望ましい任意の温度で、任意の混合技術によって形成され得る。試料を十分な体積の溶解試薬と接触させて、試料における細胞を溶解し、均一な混合物を生成する。上記に記載したようにグリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：４までの範囲にある溶解試薬では、溶解試薬の組成に応じて試料は溶解試薬に約２：１から約１：２までの範囲の比率（例えば約１：１（体積：体積））で加えられてよい。例えば、約１００μＬから約６００μＬまでの血液試料は、約５０μＬから約１２００μＬまでの溶解試薬と最高約５分間混合されてよい。ある実施形態において、溶解混合物は、血液試料１５０μＬを溶解試薬３００μＬと混合し、５−１０秒間激しくボルテックスにかけることによって形成される。好ましい実施形態において、溶解は、室温で１分未満で完了する。次いで、溶解混合物は、適切なアッセイを用いて分析物に対してアッセイされる。好ましい実施形態において、溶解混合物は、試料を遠心分離する必要なしに生成され、分析に備えられる。
【００６７】
様々な実施形態において、試料は「混合した」溶解試薬と接触する必要はないが、溶解試薬の１つの成分（例えば、アルコールまたはグリコール）と混合され、次いで他の成分が加えられて、上記に記載した完全な溶解試薬を生成することができる。
【００６８】
本発明の溶解試薬は、いかなる界面活性剤も加えずに用いられ得る。しかし、ある実施形態において、所望により１つ以上の界面活性剤が加えられてよい。界面活性剤は、上記に記載された溶解試薬の存在下では典型的には起泡せず、したがって本発明にしたがって調製された溶解混合液は、界面活性剤が含まれているか否かに関わらず自動化のピペット操作に適していてよい。界面活性剤が免疫アッセイに意図されている溶解混合液に含まれている場合は、免疫化学を妨害しない濃度で存在するのが好ましい。好ましくは、界面活性剤はサポニンなどの非イオン性の界面活性剤であり、約０．０１％から０．１％までの範囲で、より好ましくは約０．１％の濃度で用いられる。米国特許第５，６５０，２８８号明細書（１９９７年７月２２日ＭａｃＦａｒｌａｎｅおよびＪｅｎｓｅｎに発行され、界面活性剤の使用に関するその教示に対してその全文を参照により本明細書に組み込む）は、免疫アッセイにおける界面活性剤の使用を記載している。
【００６９】
溶解および結合タンパク質からの放出の後、適用可能であれば、分析物は、その分析物を検出するための任意の標準の技術（例えば、吸光度または質量分析による検出を伴う免疫アッセイまたはクロマトグラフィー）を用いて測定され得る。免疫抑制薬の検出には、免疫アッセイを用いると便利である。
【００７０】
ＩＩＩ．免疫アッセイ
Ａ．全般
本発明による免疫アッセイは、検査試料における分析物の定性的同定および／または定量に用いられ得る。これらの方法は、例えば、免疫抑制薬（例えば、ラパマイシン（シロリムス）、タクロリムス、エベロリムス、テムソロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびこれらの任意の化合物の類似体）の免疫アッセイに適用できる。
【００７１】
このような免疫アッセイは、本明細書に記載する１つ以上のプロテアーゼ、および場合により溶解試薬または１つ以上のその成分を検査試料と組み合わせて上記に記載する溶解混合物を形成することによって行われ得る。溶解混合液は、（存在する場合は）分析物に抗体を結合させてアッセイ混合物を形成するのに適する条件下で、分析物に特異的な抗体の少なくとも１つと接触してよく、次いで分析物への抗体の結合が検出される。
【００７２】
ある実施形態において、約０．４Ｍを超える塩濃度（例えば、約０．５Ｍから約５．０Ｍまで）の存在下で溶解混合物を抗体と接触させることによって、アッセイ感度の増強が達成され得る。特定の実施形態において、塩濃度は約０．４Ｍに等しく、またはそれ未満である（例えば、約０．５Ｍから約４．０Ｍまで）。例示的な実施形態において、塩濃度は約２．０Ｍ（例えば、約１．５Ｍから約２．５Ｍまで、詳しくは約１．８Ｍ、約１．９Ｍ、約２．０Ｍ、約２．１Ｍまたは約２．２Ｍ）である。適切な塩は、例えば、以下の任意の陰イオンを含むことができる：フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩および重硫酸塩。特定の実施形態において、塩は、例えばフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩および酢酸塩などの１価の陰イオンを含む。好ましい実施形態において、塩は、アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム）の塩化物塩などの塩化物を含む。一般的に、用いられる塩はアッセイ条件下で可溶性である。塩化ナトリウムは、ほとんどの条件下で高度に可溶性であり、したがって本発明による広範な免疫アッセイにおいてアッセイ感度を増強するために用いると好都合であり得る。
【００７３】
塩は、任意の好都合な様式においてアッセイ混合物に提供されてよく、溶解混合物と抗体の間の接触の前に存在してよく、または接触後に加えられてもよい。特定の実施形態において、塩はアッセイ希釈液において提供され、アッセイ希釈液は水（例えばバッファーなど）の他に１つ以上の他の成分を場合により含むこともできる。アッセイ希釈液における塩濃度は、所望の最終的な塩濃度に応じて、およびアッセイ混合物に加えられる希釈液の量に応じて変化する。例えば、約４．０Ｍの塩濃度を有するアッセイ希釈液は、等体積のアッセイ混合物に加えられて最終塩濃度約２．０Ｍをもたらすことができる。
【００７４】
Ｂ．抗体
検査試料において分析物を定性的または定量的に検出するための免疫アッセイにおいては、分析物に結合する少なくとも１つの抗体を、分析物を含むと疑われる溶解混合物と接触させて、抗体−分析物の免疫複合体を形成させる。免疫抑制薬を検出するために、特定の薬物に結合する任意の適切な抗体が本発明による免疫アッセイに用いられ得る。ラパマイシン（シロリムス）、タクロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびエベロリムスの各々に対する抗体は、当技術分野において知られており、および／または市販されており、これらの任意のものが用いられ得る。ある実施形態において、シロリムスを測定するためのＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの市販のＩＭｘ（登録商標）シロリムスアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）、またはＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって販売されている任意の他のシロリムスアッセイキット（例えば、様々な市販の自動化プラットホーム上で使用するための）の構成成分であるモノクローナル抗体を用いるのが好ましい。
【００７５】
免疫抑制薬に特異的な抗体を生成するための例示のプロトコールは以下の通りである。ＲＢｆ／Ｄｎｊメスマウスに、薬物−２７−ＣＭＯ−破傷風毒素免疫原を１カ月毎に３回ブースト投与し、その後４カ月目に薬物−４２−ＨＳ−破傷風毒素調製物で免疫化する。７カ月後、薬物−２７−ＣＭＯ−破傷風毒素免疫原を用いて、注入３日前に、動物に脾臓内プレ注入ブーストを投与する。次いで脾臓のＢ細胞を単離し、ＳＰ２／０ミエローマと一緒に標準ポリエチレン（ＰＥＧ）注入において用いる。１０−１４日後、コンフルエントの培養物を、マイクロタイターＥＩＡにおいて抗薬物活性についてスクリーニングし、次いでポジティブの培養物を、限界希釈クローニング技術を用いてクローニングする。得られたクローンを単離し、ＩＭＤＭｗ／ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）組織培養培地でスケールアップし、分泌された抗体を、プロテインＡを用いてアフィニティー精製する。薬物としてシロリムスを用いて産生された例示的な好ましい抗体はシロリムス、エベロリムスおよびゾタロリムスに対する免疫アッセイで用いることができる。
【００７６】
タクロリムスに対する免疫アッセイで用いる例示的な好ましい抗体は、Ｇｒｕｎｅ＆Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡによって出版された、１９８７年１０月、Ｔ．Ｓｔａｒｚｌ、Ｌ．ＭａｋｏｗｋａおよびＳ．Ｔｏｄｏ編集、「ＦＫ−５０６ Ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ａ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｒｅｐｒｉｎｔ、第ＸＩＸ巻、第６補完、２３−２９頁の、Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、「Ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ａｓｓａｙ ＦＫ−５０６ Ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ」に記載されている。
【００７７】
シクロスポリンに対する免疫アッセイにおいて使用する例示的な好ましい抗体は、シクロスポリン測定用の、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの市販のＡｘＳＹＭシクロスポリンアッセイの成分であるモノクローナル抗体である。
【００７８】
Ｃ．検出
次いで、抗体−分析物免疫複合体は、任意の適切な技術を用いて検出され得る。例えば、抗体は、抗体−分析物複合体の存在を検出および／または定量するための検出可能な標識で標識されていてよい。特定の標識の選択は決定的ではないが、選択された標識は、単独で、または１つ以上のさらなる物質と組み合わせてのいずれかで検出可能なシグナルを生成することができなければならない。
【００７９】
有用な検出可能な標識、これらの抗体への付着および検出技術は、したがって当技術分野では知られている。当技術分野では知られている任意の検出可能な標識が用いられ得る。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリ性ペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸脱水組成物酵素など）、化学発光標識（例えば、アクリジニウム誘導体、ルミノール、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステルなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど））、ローダミン、フィコビリンタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（硫化亜鉛キャップ化されたセレン化カドミウム）、温度測定標識または免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識であってよい。標識、標識化手順および標識の検出に対する入門書は、各々を参照により本明細書に組み込む、ＰｏｌａｋおよびＶａｎＮｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、（１９９７年）ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎによって発行されたハンドブックとカタログの組み合わされたものであるＨａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉ、（１９９６年）に見出される。本発明で用いるための好ましい標識は、アクリジニウム−９−カルボキサミドなどの化学発光標識を含む。さらなる詳細は、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｄｙｋｅ，Ｋ．Ｖ．編集）７７−１０５頁、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎにおける、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．およびＡｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．、（２００２年）Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｎ−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ−９−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｓａｙｓに見ることができる。
【００８０】
検出可能な標識は、直接またはカップリング剤いずれかによって、分析物または抗体に結合され得る。用いられ得るカップリング剤の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸）である。用いられ得る他のカップリング剤は、当技術分野では知られている。検出可能な標識を抗体に結合するための方法は、当技術分野では知られている。さらに、検出可能な標識の抗体へのカップリングを促進する末端基をすでに含んでいる多くの検出可能な標識（例えば、その他の点でＣＰＳＰ−アクリジニウムエステルとして知られているＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド、またはその他の点でＳＰＳＰ−アクリジニウムエステルとして知られているＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド）が購入または合成され得る。
【００８１】
あるいは、分析物に結合し、検出可能な標識を含む第２の抗体が溶解混合物に加えられてよく、抗体−分析物複合体の存在を検出するために用いられてよい。本実施形態において任意の適切な検出可能な標識が用いられてよい。
【００８２】
Ｄ．例示的なフォーマット
本発明の免疫アッセイは、当技術分野では知られている任意のフォーマット（それだけには限定されない、サンドイッチフォーマット、競合的阻害フォーマット（フォワードもしくはリバース両方の競合的阻害アッセイを含む）または蛍光偏光のフォーマットなどを含む）を用いて行われてよい。
【００８３】
好ましいサンドイッチ型のフォーマットなど、免疫抑制薬を定量分析するための免疫アッセイにおいては、溶解混合液における薬物を分離および定量するために少なくとも２つの抗体が用いられる。より具体的には、少なくとも２つの抗体が薬物の異なる部分に結合し、「サンドイッチ」と呼ばれる免疫複合体を形成する。一般的には、検査試料における分析物（例えば、免疫抑制薬）を捕捉（例えば、特異的に結合）するのに１つ以上の抗体が用いられ（これらの抗体は１つ以上の「捕捉」抗体と呼ばれることが多い）、検出可能な（すなわち、定量可能な）標識をサンドイッチに結合するのに１つ以上の抗体が用いられる（これらの抗体は１つ以上の「検出」抗体と呼ばれることが多い）。サンドイッチアッセイにおいては、アッセイにおける任意の他の抗体がそれぞれの結合部位に結合することによって、薬物に結合する両方の抗体が低減されないのが好ましい。
【００８４】
換言すると、抗体は、免疫抑制薬を含むと疑われる溶解混合物と接触した１つ以上の第１の抗体が第２の抗体または引き続く抗体によって認識される結合部位の全てまたは部分に結合せず、その結果１つ以上の第２の抗体または引き続く抗体が薬物に結合する能力を妨害するように選択されなければならない。サンドイッチアッセイにおいては、溶解混合物において期待される薬物の最大量に比べて過剰のモル量の抗体、好ましくは少なくとも１つの捕捉抗体が用いられる。例えば、固相含有溶液１ｍＬあたり約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬの抗体が用いられ得る。
【００８５】
一実施形態において、少なくとも１つの第１の捕捉抗体が、検査試料からの第１の抗体−薬物複合体の分離を促進する固体支持体に結合していてよい。本発明の免疫アッセイで用いられる固体支持体または「固相」は決定的ではなく、当業者によって選択されてよい。本明細書で用いられる固相または固体支持体は、不溶性である任意の材料を意味し、または引き続く反応によって不溶性にされてもよい。有用な固相または固体支持体は当業者には知られており、反応トレイのウェルの壁、検査管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースのストリップ、膜、ラテックス粒子などの微粒子、Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌ．の登録商標）（ヒツジ（または他の動物）の赤血球ならびにピルビン酸アルデヒドおよびホルムアルデヒドによって「固定されている」赤血球である）などを含む。ペプチドを固相に固定するのに適する方法は、イオン性の、疎水性の、共有結合性の相互作用などを含む。固相は、捕捉剤を引きつけ、固定化する、その固有の能力に対して選択されてよい。あるいは、固相は、捕捉剤を引きつけ、固定化する能力を有するさらなる受容体を含むことができる。さらなる受容体は、捕捉剤自体に関して、または捕捉剤に複合している荷電した物質に関して反対に荷電している、荷電した物質を含むことができる。さらに別の代替として、受容体は、固相上に固定化され（付着され）、特異的な結合反応によって捕捉剤を固定化する能力を有している任意の特異的な結合パートナーであってよい。受容体分子は、アッセイの遂行前またはアッセイの遂行の間に、捕捉剤の固相材料への間接的な結合を可能にする。
【００８６】
当技術分野では知られている任意の固体支持体（それだけには限定されないが、マトリクス、ゲル、ウェル、チューブまたはビーズの形態のポリマー材料からできている固体支持体を含む）が用いられ得る。このような結合が、抗体が薬物に結合する能力を妨害しなければ、抗体（以上の抗体）は、吸着によって、化学カップリング剤を用いた共有結合によって、または当技術分野では知られている他の手段によって固体支持体に結合していてよい。さらに、必要であれば、固体支持体は、抗体上の様々な官能基との反応性を可能にするように誘導体化されていてよい。このような誘導体化は、ある種のカップリング剤（例えば、それだけには限定されない、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の使用を典型的に伴う。
【００８７】
固相が、検出抗体による接近を可能にする十分に多孔性である任意の適切な多孔性の材料、および抗原に結合するのに適する表面の親和性を含み得るのも、本発明の範囲内である。微孔性の構造が一般的に好ましいが、水和状態のゲル構造を有する材料も同様に用いられ得る。このような有用な固体支持体は、それだけには限定されない、ニトロセルロースおよびナイロンを含む。本明細書に記載されるこのような多孔性の固体支持体は、厚さ約０．０１から０．５ｍｍまでの、好ましくは約０．１ｍｍのシートの形態であることが企図されている。孔のサイズは、広い限界内で変化することができ、好ましくは約０．０２５ミクロンから１５ミクロンまで、特に約０．１５ミクロンから１５ミクロンまでである。このような支持体の表面は、抗原または抗体の支持体への共有結合をもたらす化学的プロセスによって活性化され得る。しかし、一般的には疎水的な力による多孔性の材料上への吸着により、抗原または抗体の不可逆的な結合が得られる。
【００８８】
免疫抑制薬を含むことが疑われる、または含んでいる溶解混合物が、少なくとも１つの第１の捕捉抗体と接触した後、得られたアッセイ混合物はインキュベートされて第１の捕捉抗体（以上の抗体）−薬物複合体の形成を可能にする。インキュベートは、約４．５から約１０．０までのｐＨを含む任意の適切なｐＨで、約２℃から約４５℃までを含む任意の適切な温度で、および少なくとも約１分から約１８時間まで、好ましくは約４−２０分、最も好ましくは約１７−１９分の適切な時間行われてよい。
【００８９】
標識された複合体が形成した後、複合体における標識の量は、当技術分野では知られている技術を用いて定量され得る。例えば、酵素標識が用いられる場合、標識された複合体は、色の発色などの定量可能な反応をもたらす標識に対する基質と反応する。標識が放射性標識である場合、標識はシンチレーションカウンターを用いて定量される。標識が蛍光標識である場合、標識は、標識を１つの色の光（「励起波長」として知られている）で刺激し、刺激に反応して標識によって発光される別の色（「発光波長」として知られている）を検出することによって定量される。標識が化学発光標識である場合、標識は、肉眼的に、またはルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを用いてのいずれかによって、放出される光を検出して定量される。複合体における標識の量が定量されたら、検査試料における薬物の濃度は、例えば、既知濃度の免疫抑制薬の段階希釈を用いて生成された検量線を用いることによって決定され得る。薬物の段階希釈を用いる他に、検量線は、重量分析により、質量分析により、および当技術分野では知られている他の技術によって生成され得る。
【００９０】
好ましいフォワードの競合的なフォーマットにおいては、既知濃度の、標識されている薬物またはその類似体のアリコートが用いられて、検査試料に存在する薬物と、抗体への結合に対して競合する。フォワードの競合アッセイにおいては、固定化された抗体が、検査試料、および標識された薬物またはその薬物類似体と、逐次または同時のいずれかで接触し得る。薬物または薬物類似体は、先に論じた検出可能な標識を含めた任意の適切な検出可能な標識で標識されてよい。このアッセイにおいては、捕捉抗体は、本明細書で先に論じた技術を用いて固体支持体上に固定化されていてよい。あるいは、捕捉抗体は、微粒子などの固体支持体上に固定化されている抗種抗体などの抗体とカップリングされていてよい。
【００９１】
標識された薬物または薬物類似体、溶解混合物および抗体は、典型的には、サンドイッチアッセイのフォーマットに関して先に記載したものと類似の条件下でインキュベートされる。次いで、２つの異なる型の抗体−薬物複合体が産生される。具体的には、産生された抗体−薬物複合体の一方が検出可能な標識を含み、他方の抗体−薬物複合体は検出可能な標識を含まない。抗体−薬物複合体は、検出可能な標識の定量の前にアッセイ混合物の残りから分離されてよいが、必ず分離されなければならないわけではない。抗体−薬物複合体がアッセイ混合物の残りから分離されたか否かに関係なしに、抗体−薬物複合体における検出可能な標識の量を次いで定量する。次いで、検査試料における薬物濃度が、抗体−薬物複合体中の検出可能な標識の量を検量線に対して比較することによって決定され得る。検量線は、既知濃度の薬物の段階希釈を用いて、質量分析によって、重量分析によって、および当技術分野では知られている他の技術によって産生され得る。
【００９２】
抗体−薬物複合体は、サンドイッチアッセイのフォーマットに関連して先に論じた固体支持体などの固体支持体に抗体を結合し、次いでアッセイ混合物の残りを固体支持体との接触から除去することによってアッセイ混合物から分離され得る。
【００９３】
リバースの競合アッセイにおいては、固定化された免疫抑制薬またはその類似体が、溶解混合物および少なくとも１つの標識した抗体と逐次または同時のいずれかで接触してよい。抗体は、先に論じた検出可能な標識を含む、任意の適切な検出可能な標識で標識されてよい。薬物または薬物類似体は、サンドイッチアッセイのフォーマットに関連して先に論じた固体支持体などの固体支持体に結合されていてよい。
【００９４】
固定化された薬物または薬物類似体、溶解混合物、および少なくとも１つの標識された抗体は、サンドイッチアッセイのフォーマットに関連して先に論じたものと類似の条件下でインキュベートされる。次いで、２つの異なる型の抗体−薬物複合体が産生される。具体的には、産生された抗体−薬物複合体の一つは固定化され、検出可能な標識を含んでいるが、他の抗体−薬物複合体は固定化されておらず、検出可能な標識を含む。固定化されていない抗体−薬物複合体およびアッセイ混合物の残りは、洗浄などの当技術分野では知られている技術によって、固定化された抗体−薬物複合体の存在から除去される。固定化されていない抗体−薬物複合体が除去されたら、次いで固定化された抗体−薬物複合体における検出可能な標識の量を定量する。次いで、抗体−薬物複合体における検出可能な標識の量を検量線に対して比較することによって、検査試料における薬物の濃度が決定され得る。検量線は、既知濃度の薬物の段階希釈を用いて、質量分析によって、重量分析によって、および当技術分野では知られている他の技術によって産生され得る。
【００９５】
一実施形態において、蛍光偏光アッセイにおいては、抗体または機能的に活性なそのフラグメントが、免疫抑制薬を含む非標識の溶解混合物と最初に接触して、非標識の抗体−薬物複合体を形成する。非標識の抗体−薬物複合体は、次いで、蛍光標識された薬物またはその類似体と接触する。標識された薬物または薬物類似体は、アッセイ混合物における非標識の任意の薬物と、抗体または機能的に活性なそのフラグメントへの結合に対して競合する。形成された標識された抗体−薬物複合体の量が決定され、検査試料における薬物の量が検量線の使用によって決定される。
【００９６】
免疫アッセイに対する走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）の使用も、それに対して本発明の免疫アッセイ法が容易に適用可能な技術である。ＳＰＭ、特に原子間力顕微鏡においては、捕捉剤は、走査に適する表面を有する固相に固定されている。捕捉剤は、例えば、プラスチックまたは金属の表面に吸着され得る。あるいは、捕捉剤は、例えば、誘導体化されたプラスチック、金属、シリコンまたはガラスに、当業者には知られている方法にしたがって共有結合され得る。捕捉試薬の付着の後、溶解混合物は固相に接触し、走査型プローブ顕微鏡が用いられて固相に固定された複合体を検出および定量する。ＳＰＭの使用は、免疫アッセイ系で典型的に使用されている標識の必要性を排除する。このようなシステムは、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願第６６２，１４７号明細書に記載されている。
【００９７】
本発明による免疫アッセイは、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）を用いて行われてもよい。ＭＥＭＳは、機械的、光学的および流体の要素を電子工学と結びつけるシリコン上に組み込まれ、対象の分析物を好都合に検出させる顕微鏡的構造である。本発明で用いるのに適する例示のＭＥＭＳデバイスは、Ｐｒｏｔｉｖｅｒｉのマルチカンチレバーアレイである。このアレイは、特別にデザインされたシリコンのミクロカンチレバーの化学−機械的な作動、および引き続くミクロカンチレバーの偏向の肉眼的検出に基づいている。片側上が結合パートナーでコーティングされている場合、相補的な分子を含む溶液にミクロカンチレバーが曝露されるとミクロカンチレバーは曲がる。この屈曲は、結合の事象による表面エネルギーにおける変化によって引き起こされる。屈曲の程度（偏向）を肉眼的に検出することで、ミクロカンチレバーに結合している相補的な分子の量の測定が可能になる。
【００９８】
他の実施形態において、本発明による免疫アッセイは、電気化学的な検出を用いて行われる。電気化学的な検出のための基本的な手順は、Ｈｅｉｎｅｍａｎおよび共同研究者によって記載されている。これは、一次抗体（Ａｂ、ラット抗マウスＩｇＧ）の固定化、引き続く抗原（Ａｇ、マウスＩｇＧ）、酵素標識にコンジュゲートしている二次抗体（ＡＰ−Ａｂ、ラット抗マウスＩｇＧおよびアルカリ性ホスファターゼ）ならびにｐ−アミノフェニルホスファターゼ（ＰＡＰＰ）を含む溶液への配列の曝露を必然的に伴う。ＡＰはＰＡＰＰをｐ−アミノフェノール（ＰＡＰＲ、「Ｒ」は、キノンイミンである酸化型のＰＡＰＯと還元型を区別するよう意図されている）に変換し、ｐ−アミノフェノールは、ＡＰが最適の活性を表すｐＨ９．０で、酸素および水の還元を妨害しないポテンシャルで電気化学的に可逆的である。ＰＡＰＲは、フェノール（その前駆物質であるフェニルホスフェートが酵素基質としてしばしば用いられる）とは異なり、電極の付着物を引き起こさない。ＰＡＰＲは、空気酸化および光酸化を経験するが、これらは小規模で、および短い時間枠で容易に防止される。２０μＬから３６０μＬまでの範囲の体積のＰＡＰＰを用いたミクロ電気化学的な免疫アッセイにおいて実現される、ＰＡＰＲに対するピコモルの検出限界およびＩｇＧに対するフェムトグラムの検出限界は、以前に報告されていた。電気化学的検出と一緒のキャピラリー免疫アッセイにおいては、これまでに報告されている最小の検出限界は、７０μＬの体積および３０分または２５分のアッセイ時間を用いて、マウスＩｇＧ３０００分子である。
【００９９】
様々な電気化学的検出システムが、米国特許第７，０４５，３６４号明細書（２００６年５月１６日発行、参照により本明細書に組み込む）、第７，０４５，３１０号明細書（２００６年５月１６日発行、参照により本明細書に組み込む）、第６，８８７，７１４号明細書（２００５年５月３日発行、参照により本明細書に組み込む）、第６，６８２，６４８号明細書（２００４年１月２７日発行、参照により本明細書に組み込む）、第６，６７０，１１５号明細書（２００３年１２月３０日発行、参照により本明細書に組み込む）に記載されている。例えば、１つの検査試料において複数の分析物を同時にアッセイする有用な特定の実施形態において、固相は複数の異なる捕捉剤を含むことができる。したがって、例えば、固相はその上に複数の抗体を固定されていてよく、この場合各々が、試料における異なる分析物の存在に対して検査されることが意図される。例示的な実施形態において、固相は表面上の複数の異なる領域からなっていてよく、この場合各領域はそこに固定されている特定の抗体を有している。
【０１００】
多重のフォーマットは複数の標識を使用することができるが、必ずしも使用しなくてもよく、この場合各標識は特定の分析物を検出するために用いられる。例えば、多重の、異なる分析物が複数の標識（抗体などの複数の捕捉剤が、特異性に基づいて固相の異なる既知の位置に固定されている）を用いずに検出されてもよい。各位置の捕捉剤の特異性は知られているので、特定の位置でのシグナルの検出は、その位置で結合している分析物の存在に関連し得る。このフォーマットの例は、微小流体デバイスおよびキャピラリーアレイ（それぞれチャンネルまたはキャピラリーに沿って異なる位置で異なる捕捉剤を含んでいる）ならびにマイクロアレイ（固体支持体の表面上のスポットのマトリックス（「標的エレメント」）において配列された様々な捕捉剤を典型的に含む）を含む。特定の実施形態において、各々の異なる捕捉剤が、異なる電極（例えば、マイクロ流体デバイスのチャンネルにおける、またはキャピラリーにおける固体支持体の表面上に形成されていてよい）に固定されていてよい。
【０１０１】
ＩＩＩ．検査キット
本発明は、検査試料を分析物に対してアッセイするための検査キットも提供する。本発明による検査キットは、本発明にしたがって１つ以上の免疫アッセイを行うのに有用な１つ以上の試薬を含む。検査キットは、１つ以上の別々の組成物として、または場合により試薬の適合性が許す場合には混合物として、試薬を保持する１つ以上の容器を有する包装を一般的に含む。検査キットは、バッファー、希釈液、標準液、および／または試料の処理加工、洗浄もしくはアッセイの任意の他のステップを行うのに有用な任意の他の材料など、ユーザーの立場から望ましいことがある他の材料も含むことができる。
【０１０２】
ある実施形態において、本発明の検査キットは、（ａ）少なくとも１つの分析物に特異的に結合することができる、少なくとも１つの抗体または他のリガンド（例えば、結合タンパク質）、および（ｂ）本明細書に記載される１つ以上のプロテアーゼを含むことができる。例示的なプロテアーゼは、それだけには限定されない、プロテイナーゼＫ、サブチリシン、ディスパーゼ、サーモリシン、トリプシン、フィシン、ブロメラインおよびこれらの組合せを含む。キットは、（ｃ）エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに本明細書に記載される少なくとも１種のアルコール（例えば、５個以下の炭素を有するアルコール）、またはこのような溶解試薬の成分からなる溶解試薬を場合によりさらに含む。免疫抑制薬に対する免疫アッセイを行うのに有用である、例示的な実施形態において、抗体は、ラパマイシン（シロリムス）、タクロリムス、エベロリムス、テムソロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンまたはこれらの任意の化合物の類似体に特異的であり得る。
【０１０３】
ある実施形態において、溶解試薬は、メタノール、エタノール、プロパノールまたは任意のこれらのアルコールの混合物を含む。例示的な実施形態において、グリコールのアルコールに対する比率は、約４：１から約１：４までの範囲、より詳しくは約４：１から約１：２までの範囲である。
【０１０４】
所望により、検査キットは、アッセイされる免疫抑制薬を含む対照組成物をさらに含むことができる。
【０１０５】
特定の実施形態において、本発明による検査キットは、１つ以上の界面活性剤および／または検査試料における１つ以上の結合タンパク質から分析物を放出する薬剤を含むことができる。適切な界面活性剤または界面活性剤の組合せは、上記に記載したようなサポニンなどの非イオン性界面活性剤を含む。適切な放出剤は、上記に記載したように１つ以上の結合タンパク質への結合に対して分析物と競合する薬剤を含む。本発明のキットにおいて提供される任意の界面活性剤またはプロテアーゼは、上記に記載したように、適切な濃度の成分を含む溶解混合物の生成を促進する様式で提供されなければならない。
【０１０６】
本発明によるキットは、固相、および固相に固定されている捕捉剤またはアッセイの間に固相に固定される捕捉剤を含むことができる。例示的な実施形態において、固相は、１つ以上の微粒子または電極を含む。このようなキットがサンドイッチ免疫アッセイを行うように用いられようとする場合、キットは標識された検出剤をさらに含むことができる。ある実施形態において、検査キットは、アクリジニウム−９−カルボキサミドなどの直接標識を少なくとも１つ含む。本発明による検査キットは、少なくとも１つの間接標識も含むことができる。使用される標識が、検出可能なシグナルを生成するための指示薬を一般的に必要とする場合、検査キットは１つ以上の適切な指示薬を含むのが好ましい。
【０１０７】
本発明による検査キットは、本発明の１つ以上の免疫アッセイを行うための指示書を含むのが好ましい。本発明のキットに含まれている指示書は、包装材料に固定されていてもよく、または包装挿入物として含まれていてもよい。指示書は典型的には書面または印刷物であるが、そのようなものに限定されない。このような指示書を保管することができ、エンドユーザーにこれらを伝えることができる任意の媒体が、本発明によって企図される。このような媒体は、例えば、それだけには限定されない、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ）などを含むコンピュータ媒体を含む。本明細書で用いられる「指示書」の語は、指示書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【０１０８】
もちろん、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号明細書および第５，００６，３０９号明細書に記載されるように、ならびに例えば、それだけには限定されない、Ａｂｂｏｔｔ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭＸ（登録商標）、ＡＢＢＯＴＴ ＰＲＩＳＭ（登録商標）、およびＱｕａｎｔｕｍ ＩＩプラットホームならびに他のプラットホームを含めた、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）によって市販されているものなど、本明細書における任意の例示のフォーマット、および本発明による任意のアッセイまたはキットが、自動化されたシステムおよび半自動化されたシステム（微粒子を含む固相が存在するものを含む）で用いるために適用または最適化され得ることは言うまでもない。
【０１０９】
さらに、本発明のアッセイおよびキットは、Ａｂｂｏｔｔ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学的免疫アッセイシステムを含めた、ポイントオブケアアッセイシステム（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ）に対して、場合により適合または最適化され得る。免疫センサー、ならびに免疫センサーを製造し、使い捨て検査装置において操作する方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００３０１７０８８１号、第２００４００１８５７７号、第２００５００５４０７８号および第２００６０１６０１６４号（同じものに関するそれらの教示に対して、参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０１１０】
（実施例）
以下の実施例は、請求される発明を限定するためではなく、例示するために提供される。
【実施例１】
【０１１１】
プロテアーゼの比較
以下のプロテアーゼ：アルファ−キモトリプシン（ＣＨ）；ＰＥ＝ペプシン（ＰＥ）；プロテイナーゼＫ（ＰＫ）およびサーモリシン（ＴＨ）を、溶解した全血希釈液（すなわち「標準物質希釈液」）または非溶解の新鮮な全血検体（すなわち、患者検体もしくは「新鮮血」）のいずれかからなる、本明細書に記載するアッセイ混合物において検査した。
【０１１２】
これらの試験には、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）シロリムスアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬによって引き続き市販されている、均一のコンセプトフェーズ（ｃｏｎｃｅｐｔ−ｐｈａｓｅ）アッセイ）を使用した。キャリブレートしたシロリムススタンダードを、溶解した全血希釈液（ＩＭｘ（登録商標）タクロリムスＩＩ血液希釈液、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）すなわちシロリムス（Ｗｙｅｔｈ−Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｓｔｅｒ、ドイツ）０ｎｇ／ｍＬおよび３０ｎｇ／ｍＬをそれぞれ含むＣＡＬ ＡおよびＦ ＣＡＬで調製した。
【０１１３】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）シロリムスアッセイでは、試料（典型的には引き続くアッセイ）によって生成される光（またはシグナル）の量を、相対光単位（ＲＬＵ）として測定する。ＲＬＵは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システムおよび他の機器上で用いられる光学測定の単位に対する呼称である。ＲＬＵの語は、アクリジニウムなどのシグナル生成性のスタンダードのある量を計測する光子の関係に由来する。各光学モジュールは１セットのスタンダード（例えば、アクリジニウムのスタンダード）でキャリブレートされる。化学発光反応が起こると、光が放射され、ある期間にわたって（例えば、３秒の期間）光子が測定される。光電子増倍管（ＰＭＴ）は、計数された光子をデジタルシグナルに変換し、デジタルシグナルは次いで処理加工のために回路基板に送られる。光学の回路基板は、ＰＭＴからのデジタルシグナルを、計数された光子に比例するアナログシグナルに変換し、アナログシグナルは、今度は存在するシグナル生成性の分子（例えば、アクリジニウム）の量に比例する。次いで、このアナログシグナルはさらに処理加工されてＲＬＵ値を生成する。この関係は確立されて、光学モジュールをキャリブレートするためのスタンダードを生成し、この場合異なるスタンダードがそれらに割り当てられたＲＬＵ値を有する。したがって、ＲＬＵ単位自体は任意であるが、ある量のスタンダード（例えば、アクリジニウム）に対して比例する（すなわち、相関がある）。
【０１１４】
これらの試験において、「偏り」は、アッセイ希釈液（すなわち「アッセイ希釈液試料」）で調製された標準物質のシロリムス濃度に等しいシロリムス濃度（例えば、３０ｎｇ／ｍＬまたは０ｎｇ／ｍＬ）でスパイクした新鮮血試料（すなわち「新鮮血試料」）からのシグナル（ＲＬＵ）における相違％として計算した。換言すると、偏りは、溶解した全血標準物質（凍結−解凍したもの、全血の約８０％、＞１カ月経過）と比べた場合の、新鮮血検体の標準物質（例えば、非溶解）によって表されるシグナルにおける相違として計算された。このような値は、同様の濃度の患者検体において見られる偏りをおそらく表しており、これを室温で貯蔵し、長時間均一なシロリムスアッセイ（例えば、市販のＡｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）シロリムスアッセイ）によってアッセイした場合に観察される患者検体における大きな（例えば、＞５０％）変化の説明となる。
【０１１５】
全てのプロテアーゼが偏りに対して影響をいくらか有していたと思われるが、明らかにプロテイナーゼＫおよびサーモリシンは最大の影響を有していた（データは示さず）。サーモリシンは、アッセイ希釈液試料および新鮮血試料におけるＦ ＣＡＬ ＲＬＵ値を増大し、５００μｇ／ｍＬでは（遊離のシロリムスを測定するためにＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）によってサンプリングする前には、前処理した均一の検体／試料における量）Ｆ ＣＡＬの偏りは約３０％まで低減した。しかし、５００μｇ／ｍＬ（前処理した均一の検体／試料における量）のＣＡＬ Ａは逆方向に移動し、−２４％の偏りを作り出した。
【０１１６】
プロテイナーゼＫもアッセイ希釈液試料におけるＦ ＣＡＬ ＲＬＵ値を増大したが、新鮮血試料ではＲＬＵ値を低減した。ＣＡＬ Ａの偏りは、５０μｇ／ｍＬ（−１５％）では少々劣ったが、５００μｇ／ｍＬでは偏りは６−７％に改善した。
【０１１７】
プロテアーゼは、このように新鮮血試料対アッセイ希釈液試料の偏りに対して影響を有する。観察された偏りは、シロリムスの濃度に依存していた。シロリムスの濃度が低いほど観察された偏りは小さく、ＣＡＬ Ａ（０ｎｇ／ｍＬ）レベルでは本質的に偏りは観察されなかった。問題がインターフェラント（ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｔ）または非特異的な結合であったならば、この発見は予想外であろう。アッセイは競合的なフォーマットで行われたので、ＣＡＬ Ａは最高のＲＬＵシグナルを有する。最高レベルのシグナルにおいて偏りがないのは珍しいことであるが、親和性（例えば、新鮮全血対貯蔵した溶解した全血におけるシロリムスに対するＦＫＢＰ１２の親和性）における違いが存在しなければシグナルが低いほど偏りは大きくなる（例えば、シロリムスレベルがより高くなる）。機序がプロテアーゼＦＫＰＢ１２の切り取りである場合、これはシロリムス依存性の様式で偏りに影響を及ぼす非特異的な薬剤（例えば、ＨＳＡまたはリポタンパク質の結合剤）を見出す上での困難さを説明している。ＦＫＢＰ１２の結合親和性における変更は、他の手段によって一致させるのが非常に困難である。まとめると、このデータ、すなわち新鮮血試料の安定性データ、およびシロリムス濃度の依存性は、偏りに対する機序として、タンパク質分解性の切断を支持している。
【実施例２】
【０１１８】
シロリムスアッセイにおけるプロテイナーゼＫまたはサーモリシンの比較
この実験では、シロリムス標準物質であるＴＡおよびＦＡを、溶解した（凍結−解凍によって）全血において保存剤と一緒に作成し、１カ月を超えて４℃で貯蔵した（すなわち、「標準物質希釈液」）。これらのいわゆるアッセイ希釈液試料である、ＴＡおよびＦＡは、それぞれシロリムス０ｎｇ／ｍＬおよび３０ｎｇ／ｍＬを含んでいた。非溶解の新鮮な全血検体（すなわち、患者検体、または「新鮮血」）標準物質であるＷＡおよびＷＦ（いわゆる新鮮血試料）は、それぞれシロリムス０ｎｇ／ｍＬおよび３０ｎｇ／ｍＬを含んでいた。
【０１１９】
アッセイ希釈液試料および全血試料を、５０、２５０または５００μｇ／ｍＬの濃度の増大レベルのプロテイナーゼＫまたはサーモリシンのいずれかで処理した。対照は、他の点では全てアッセイ希釈液試料および新鮮血試料と同一の試料であったが、これらは処理しないままであった。プロテアーゼを、有機溶剤２部：試料１部の体積比の５％プロピレングリコール／５％エタノール中溶液試料（すなわち、試料はアッセイ希釈液試料、新鮮血試料または対応する対照である）に全て加えた。次いで、試料をボルテックスにかけ、遅延型の１ステップ競合的フォーマットにおける検査用にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器上に直ちに配置した。
【０１２０】
以下表１−３における略語の手がかり：
Ａ：標準物質Ａ、０ｎｇ／ｍＬ
Ｆ：標準物質Ｆ、３０ｎｇ／ｍＬ
Ｔ：貯蔵した溶解した全血希釈液
Ｗ：新鮮全血
ＰＫ（数字）：５０、２５０または５００μｇ／ｍＬの濃度で加えたプロテイナーゼＫ
ＴＨ（数字）：５０、２５０または５００μｇ／ｍＬの濃度で加えたサーモリシン
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
表１から見ることができる通り、存在するシロリムス０ｎｇ／ｍＬで産生されるシグナルにおける、新鮮血標準物質（新鮮血試料ＷＡおよびＷＦ）と貯蔵した溶解した血液標準物質（アッセイ希釈液試料ＴＡおよびＴＦ）の間には−１０％の偏りが存在する。表２から見ることができる通り、プロテイナーゼＫ５００μｇ／ｍＬでは、この偏りは約−６％に低減される。
【０１２５】
存在するシロリムス３０ｎｇ／ｍＬで産生されるシグナルにおける、新鮮血標準物質（ＷＡおよびＷＦ）と貯蔵した溶解した血液標準物質（アッセイ希釈液試料ＴＡおよびＴＦ）の間には８５％の偏りが存在する（表１）。プロテイナーゼＫ５００μｇ／ｍＬでは、この偏りは約６％に低減され（表２）、サーモリシン５００μｇ／ｍＬではこの偏りは約２９％に低減される（表３）。
【０１２６】
前述のデータに基づくと、プロテアーゼは、競合的フォーマットのシロリムスアッセイにおいて新鮮血と溶解した全血の標準物質の間に産生されるシグナルにおける偏りに直接的な影響を有しており、これは標準物質Ｆの場合、遊離のシロリムスの測定可能な濃度の標準化を示している。
【０１２７】
本明細書に記載される実施例および実施形態は例示の目的のためにすぎず、これらに照らした様々な修飾または変更が、当業者に対して示唆され、本出願の精神および権限、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【０１２８】
共同所有の、同時係属中の出願である、２００６年１２月２９日出願の米国仮出願番号第６０／８７８，０１７号は、溶液中捕捉の免疫アッセイで用いるための非変性性の溶解試薬に関するその教示に対して、その全文が参照により明らかに組み込まれる。
【０１２９】
共同所有の、同時係属中の出願である、２００６年１２月２９日出願の米国非仮出願番号第１１／６１８，４９５号は、非変性性の溶解試薬に関するその教示に対して、その全文が参照により明らかに組み込まれる。
【０１３０】
共同所有の、同時係属中の出願である、２００６年１２月２９日出願の米国仮出願番号第６０／８８２，８６３号は、免疫抑制薬に対する改善されたアッセイに関するその教示に対して、その全文が参照により明らかに組み込まれる。
【０１３１】
共同所有の、同時係属中の出願である、２００６年７月２１日出願の米国非仮出願番号第１１／４９０，６２４号は、抽出用試薬の組成に関するその教示に対して、その全文が参照により明らかに組み込まれる。
【０１３２】
さらに、本明細書に引用される他の出版物、特許および特許出願は全て、全目的に対して、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内リガンドによって結合されている分析物を検出するためのアッセイにおいて用いるための検査試料を調製するための方法であって、
溶解試薬、および
細胞内リガンドに対するタンパク質分解活性を有するプロテアーゼ
を含むアッセイ試薬と検査試料を接触させて、
引き続く抽出ステップ無しに免疫アッセイにおいて用いるのに適合する混合物を形成することを含む、方法。
【請求項２】
前記検査試料が全血または血液分画である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記検査試料がヒト血液を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
前記検査試料が、自己免疫疾患に対する処置中、または異種移植もしくは臓器移植を有する対象から採取したヒト血液を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、ペプシン、プロテイナーゼＫ、サーモリシン、ディスパーゼ、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項７】
前記溶解試薬が、
エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに
５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール
を含む、請求項１から７のいずれかの方法。
【請求項８】
アルコールが、メタノール、エタノールおよびプロパノールからなる群から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：４までの範囲にある、請求項７の方法。
【請求項１０】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：２までの範囲にある、請求項９の方法。
【請求項１１】
検査試料が約２：１から約１：１０までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項７の方法。
【請求項１２】
検査試料が約２：１から約１：２までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項１１の方法。
【請求項１３】
試料を遠心分離することを含まない、請求項７の方法。
【請求項１４】
界面活性剤が、検査試料を溶解または可溶化するために用いられない、請求項７の方法。
【請求項１５】
前記アッセイ試薬が、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合するが、アッセイ検出系において捕捉剤と交差反応性ではない競合物質をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記細胞内リガンドがイムノフィリンリガンドである、請求項１または１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
分析物が免疫抑制薬を含み、ならびに競合物質が、異なるが構造上類似の類似体を含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記細胞内リガンドが、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬に結合する、請求項１６の方法。
【請求項１９】
細胞内リガンドによって結合されている分析物を検出するためのアッセイにおいて用いるための検査試料を調製するための方法であって、
界面活性剤を含まない溶解試薬、および
細胞内リガンドに対してタンパク質分解活性を有するプロテアーゼ
を含む試薬と検査試料を接触させることを含む、方法。
【請求項２０】
前記検査試料が全血または血液分画を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記検査試料が血液の成分分画を含む、請求項１９の方法。
【請求項２２】
前記検査試料がヒト血液を含む、請求項１９の方法。
【請求項２３】
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼからなる群から選択される、請求項１９から２２のいずれかの方法。
【請求項２４】
前記プロテアーゼが、ペプシン、プロテイナーゼＫ、サーモリシン、ディスパーゼ、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群から選択される、請求項１９から２２のいずれかの方法。
【請求項２５】
前記溶解試薬が、
エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに
５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール
を含む、請求項２３または２４の方法。
【請求項２６】
アルコールがメタノール、エタノールおよびプロパノールからなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項２７】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：４までの範囲にある、請求項２５の方法。
【請求項２８】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：２までの範囲にある、請求項２５の方法。
【請求項２９】
検査試料が約２：１から約１：１０までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項２５の方法。
【請求項３０】
検査試料が約２：１から約１：２までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項２５の方法。
【請求項３１】
試料を遠心分離することを含まない、請求項２５の方法。
【請求項３２】
前記アッセイ試薬が、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合するが、アッセイ検出系において分析物と交差反応性ではない競合物質をさらに含む、請求項１９から３２のいずれかの方法。
【請求項３３】
前記細胞内リガンドがイムノフィリンリガンドである、請求項３２のいずれかの方法。
【請求項３４】
分析物が免疫抑制薬を含み、ならびに競合物質が、異なるが構造上類似の類似体を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記細胞内リガンドが、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬に結合する、請求項３３の方法。
【請求項３６】
検査試料における免疫抑制薬の濃度を評価するための方法であって、
アッセイ試薬と検査試料を接触させて、引き続く抽出ステップ無しに免疫アッセイにおける使用に適合するアッセイ混合物を生成すること（アッセイ試薬は、
溶解試薬、および
免疫抑制薬に結合する細胞内リガンドに対してタンパク質分解活性を有するプロテアーゼ
を含む。）、および
前記免疫抑制薬について溶解混合物をアッセイすること
を含む、方法。
【請求項３７】
アッセイ混合物が均一な混合物である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
アッセイが免疫アッセイを含む、請求項３６の方法。
【請求項３９】
免疫抑制薬が、シロリムス、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される、請求項３６の方法。
【請求項４０】
検査試料がヒト血液試料を含む、請求項３６の方法。
【請求項４１】
検査試料が全血または血液分画を含む、請求項３６の方法。
【請求項４２】
溶解混合物を遠心分離することを含まない、請求項３６の方法。
【請求項４３】
検査試料を界面活性剤と接触させることを含まない、請求項３６の方法。
【請求項４４】
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼからなる群から選択される、請求項３６から４３のいずれかの方法。
【請求項４５】
前記プロテアーゼが、ペプシン、プロテイナーゼＫ、サーモリシン、ディスパーゼ、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群から選択される、請求項３６から４３のいずれかの方法。
【請求項４６】
前記溶解試薬が、
エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに
５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール
を含む、請求項４４または４５の方法。
【請求項４７】
アルコールがメタノール、エタノールおよびプロパノールからなる群から選択される、請求項４６の方法。
【請求項４８】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：４までの範囲にある、請求項４７の方法。
【請求項４９】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：２までの範囲にある、請求項４７の方法。
【請求項５０】
検査試料が約２：１から約１：１０までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項４７の方法。
【請求項５１】
検査試料が約２：１から約１：２までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項４７の方法。
【請求項５２】
試料を遠心分離することを含まない、請求項４７の方法。
【請求項５３】
検査試料を界面活性剤と接触させることを含まない、請求項４７の方法。
【請求項５４】
前記アッセイ試薬が、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合するが、アッセイ検出系において捕捉剤と交差反応性ではない競合物質をさらに含む、請求項３６の方法。
【請求項５５】
分析物が免疫抑制薬を含み、競合物質が、異なるが構造上類似の免疫抑制薬を含む、請求項３６または５４のいずれかの方法。
【請求項５６】
検査キットであって
（ａ）シロリムス、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される少なくとも１つの免疫抑制薬と特異的に結合することができる、少なくとも１つの抗体またはタンパク質、ならびに
（ｂ）界面活性剤でない溶解試薬、および
イムノフィリンリガンドを分解するプロテアーゼ
を含むアッセイ試薬
を含む検査キット。
【請求項５７】
前記プロテアーゼが、ペプシン、プロテイナーゼＫ、サーモリシン、ディスパーゼ、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群から選択される、請求項５６のキット。
【請求項５８】
前記界面活性剤でない溶解試薬が、
エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに
５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール
を含む、請求項５６のキット。
【請求項５９】
（ａ）の免疫抑制薬を少なくとも１つ含む対照組成物をさらに含む、請求項５６の検査キット。
【請求項６０】
アルコールが、メタノール、エタノールおよびプロパノールからなる群から選択される、請求項５６の検査キット。
【請求項６１】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：４までの範囲にある、請求項５６の検査キット。
【請求項６２】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：２までの範囲にある、請求項５６の検査キット。
【請求項６３】
キットが、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合するが、アッセイ検出系において分析物と交差反応性ではない競合物質をさらに含む、請求項５６から６２のいずれかの検査キット。
【請求項６４】
前記競合物質がアッセイ試薬において提供される、請求項６３の検査キット。
【請求項６５】
前記細胞内リガンドがイムノフィリンリガンドである、請求項１９または３２のいずれかの方法。
【請求項６６】
競合物質が、アッセイされる免疫抑制薬と異なるが構造上類似の類似体を含む、請求項６３の検査キット。
【請求項１】
細胞内リガンドによって結合されている分析物を検出するためのアッセイにおいて用いるための検査試料を調製するための方法であって、
溶解試薬、および
細胞内リガンドに対するタンパク質分解活性を有するプロテアーゼ
を含むアッセイ試薬と検査試料を接触させて、
引き続く抽出ステップ無しに免疫アッセイにおいて用いるのに適合する混合物を形成することを含む、方法。
【請求項２】
前記検査試料が全血または血液分画である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記検査試料がヒト血液を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
前記検査試料が、自己免疫疾患に対する処置中、または異種移植もしくは臓器移植を有する対象から採取したヒト血液を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、ペプシン、プロテイナーゼＫ、サーモリシン、ディスパーゼ、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項７】
前記溶解試薬が、
エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに
５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール
を含む、請求項１から７のいずれかの方法。
【請求項８】
アルコールが、メタノール、エタノールおよびプロパノールからなる群から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：４までの範囲にある、請求項７の方法。
【請求項１０】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：２までの範囲にある、請求項９の方法。
【請求項１１】
検査試料が約２：１から約１：１０までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項７の方法。
【請求項１２】
検査試料が約２：１から約１：２までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項１１の方法。
【請求項１３】
試料を遠心分離することを含まない、請求項７の方法。
【請求項１４】
界面活性剤が、検査試料を溶解または可溶化するために用いられない、請求項７の方法。
【請求項１５】
前記アッセイ試薬が、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合するが、アッセイ検出系において捕捉剤と交差反応性ではない競合物質をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記細胞内リガンドがイムノフィリンリガンドである、請求項１または１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
分析物が免疫抑制薬を含み、ならびに競合物質が、異なるが構造上類似の類似体を含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記細胞内リガンドが、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬に結合する、請求項１６の方法。
【請求項１９】
細胞内リガンドによって結合されている分析物を検出するためのアッセイにおいて用いるための検査試料を調製するための方法であって、
界面活性剤を含まない溶解試薬、および
細胞内リガンドに対してタンパク質分解活性を有するプロテアーゼ
を含む試薬と検査試料を接触させることを含む、方法。
【請求項２０】
前記検査試料が全血または血液分画を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記検査試料が血液の成分分画を含む、請求項１９の方法。
【請求項２２】
前記検査試料がヒト血液を含む、請求項１９の方法。
【請求項２３】
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼからなる群から選択される、請求項１９から２２のいずれかの方法。
【請求項２４】
前記プロテアーゼが、ペプシン、プロテイナーゼＫ、サーモリシン、ディスパーゼ、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群から選択される、請求項１９から２２のいずれかの方法。
【請求項２５】
前記溶解試薬が、
エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに
５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール
を含む、請求項２３または２４の方法。
【請求項２６】
アルコールがメタノール、エタノールおよびプロパノールからなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項２７】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：４までの範囲にある、請求項２５の方法。
【請求項２８】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：２までの範囲にある、請求項２５の方法。
【請求項２９】
検査試料が約２：１から約１：１０までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項２５の方法。
【請求項３０】
検査試料が約２：１から約１：２までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項２５の方法。
【請求項３１】
試料を遠心分離することを含まない、請求項２５の方法。
【請求項３２】
前記アッセイ試薬が、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合するが、アッセイ検出系において分析物と交差反応性ではない競合物質をさらに含む、請求項１９から３２のいずれかの方法。
【請求項３３】
前記細胞内リガンドがイムノフィリンリガンドである、請求項３２のいずれかの方法。
【請求項３４】
分析物が免疫抑制薬を含み、ならびに競合物質が、異なるが構造上類似の類似体を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記細胞内リガンドが、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリン、およびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される免疫抑制薬に結合する、請求項３３の方法。
【請求項３６】
検査試料における免疫抑制薬の濃度を評価するための方法であって、
アッセイ試薬と検査試料を接触させて、引き続く抽出ステップ無しに免疫アッセイにおける使用に適合するアッセイ混合物を生成すること（アッセイ試薬は、
溶解試薬、および
免疫抑制薬に結合する細胞内リガンドに対してタンパク質分解活性を有するプロテアーゼ
を含む。）、および
前記免疫抑制薬について溶解混合物をアッセイすること
を含む、方法。
【請求項３７】
アッセイ混合物が均一な混合物である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
アッセイが免疫アッセイを含む、請求項３６の方法。
【請求項３９】
免疫抑制薬が、シロリムス、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される、請求項３６の方法。
【請求項４０】
検査試料がヒト血液試料を含む、請求項３６の方法。
【請求項４１】
検査試料が全血または血液分画を含む、請求項３６の方法。
【請求項４２】
溶解混合物を遠心分離することを含まない、請求項３６の方法。
【請求項４３】
検査試料を界面活性剤と接触させることを含まない、請求項３６の方法。
【請求項４４】
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼからなる群から選択される、請求項３６から４３のいずれかの方法。
【請求項４５】
前記プロテアーゼが、ペプシン、プロテイナーゼＫ、サーモリシン、ディスパーゼ、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群から選択される、請求項３６から４３のいずれかの方法。
【請求項４６】
前記溶解試薬が、
エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに
５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール
を含む、請求項４４または４５の方法。
【請求項４７】
アルコールがメタノール、エタノールおよびプロパノールからなる群から選択される、請求項４６の方法。
【請求項４８】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：４までの範囲にある、請求項４７の方法。
【請求項４９】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：２までの範囲にある、請求項４７の方法。
【請求項５０】
検査試料が約２：１から約１：１０までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項４７の方法。
【請求項５１】
検査試料が約２：１から約１：２までの範囲における比率で溶解試薬に加えられる、請求項４７の方法。
【請求項５２】
試料を遠心分離することを含まない、請求項４７の方法。
【請求項５３】
検査試料を界面活性剤と接触させることを含まない、請求項４７の方法。
【請求項５４】
前記アッセイ試薬が、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合するが、アッセイ検出系において捕捉剤と交差反応性ではない競合物質をさらに含む、請求項３６の方法。
【請求項５５】
分析物が免疫抑制薬を含み、競合物質が、異なるが構造上類似の免疫抑制薬を含む、請求項３６または５４のいずれかの方法。
【請求項５６】
検査キットであって
（ａ）シロリムス、タクロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、シクロスポリンおよびこれらの任意の化合物の類似体からなる群から選択される少なくとも１つの免疫抑制薬と特異的に結合することができる、少なくとも１つの抗体またはタンパク質、ならびに
（ｂ）界面活性剤でない溶解試薬、および
イムノフィリンリガンドを分解するプロテアーゼ
を含むアッセイ試薬
を含む検査キット。
【請求項５７】
前記プロテアーゼが、ペプシン、プロテイナーゼＫ、サーモリシン、ディスパーゼ、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群から選択される、請求項５６のキット。
【請求項５８】
前記界面活性剤でない溶解試薬が、
エチレングリコール、プロピレングリコールおよびこれらの類似体からなる群から選択されるグリコール、ならびに
５個以下の炭素を有する少なくとも１種のアルコール
を含む、請求項５６のキット。
【請求項５９】
（ａ）の免疫抑制薬を少なくとも１つ含む対照組成物をさらに含む、請求項５６の検査キット。
【請求項６０】
アルコールが、メタノール、エタノールおよびプロパノールからなる群から選択される、請求項５６の検査キット。
【請求項６１】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：４までの範囲にある、請求項５６の検査キット。
【請求項６２】
グリコール対アルコールの比率が約４：１から約１：２までの範囲にある、請求項５６の検査キット。
【請求項６３】
キットが、細胞内リガンドによる結合に対して分析物と競合するが、アッセイ検出系において分析物と交差反応性ではない競合物質をさらに含む、請求項５６から６２のいずれかの検査キット。
【請求項６４】
前記競合物質がアッセイ試薬において提供される、請求項６３の検査キット。
【請求項６５】
前記細胞内リガンドがイムノフィリンリガンドである、請求項１９または３２のいずれかの方法。
【請求項６６】
競合物質が、アッセイされる免疫抑制薬と異なるが構造上類似の類似体を含む、請求項６３の検査キット。
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５１５０６３（Ｐ２０１０−５１５０６３Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４４１９２（Ｐ２００９−５４４１９２）
【出願日】平成１９年１２月１９日（２００７．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８０８７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８２９７９
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【出願人】（３１００００４８４）
【出願人】（３１００００４９５）
【出願人】（３１００００５０９）
【出願人】（３１００００５１０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１９日（２００７．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８０８７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８２９７９
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【出願人】（３１００００４８４）
【出願人】（３１００００４９５）
【出願人】（３１００００５０９）
【出願人】（３１００００５１０）
【Ｆターム（参考）】
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