全身性遺伝子送達のための抗体フラグメント標的化イムノリポソーム
【課題】癌、例えば頭頚部癌、乳癌または前立腺癌の治療薬として有用な核酸−イムノリポソーム組成物の提供。
【解決手段】トランスフェリン受容体を発現する細胞、例えば癌細胞を標的とする(ｉ)カチオンリポソーム、（ｉｉ）トランスフェリン受容体に結合する単鎖抗体フラグメント、（ｉｉｉ）野生型ｐ５３をコードする核酸を含む組成物。
【解決手段】トランスフェリン受容体を発現する細胞、例えば癌細胞を標的とする(ｉ)カチオンリポソーム、（ｉｉ）トランスフェリン受容体に結合する単鎖抗体フラグメント、（ｉｉｉ）野生型ｐ５３をコードする核酸を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、リピドタグ抗体フラグメント標的化リポソームを含む抗体フラグメント標的化リポソーム（「イムノリポソーム」）を調製するための方法、イムノリポソームを使用するインビトロトランスフェクションのための方法、およびインビボにおける全身性遺伝子送達のための方法を提供するものである。本発明のリポソームは、標的化遺伝子送達を行うのに有用であり、全身投与後の効率的な遺伝子発現のために効果的である。送達系の特異性は、標的化抗体フラグメントから誘導される。
【０００２】
癌に対する理想的な治療は、腫瘍表現型の原因となる細胞経路を選択的に標的とし、正常細胞に関して非毒性のものである。遺伝子治療を含む癌治療は、かなり有望ではあるが、一方でこの有望性を実現し得る前に指向すべき多くの問題を抱えている。おそらく、高分子治療に関連する問題の中の最も主要なものは、体内で必要とされる部位への治療分子の効率的な送達である。ウイルスおよびリポソームを含む多様な送達系(別名「ベクター」)が試験されてきた。理想的な送達系ビヒクルは、全身的に投与されうるもの（局所とは反対に）であり、体内のどの場所に存在する腫瘍細胞も選択的に標的化し得るものである。
【０００３】
また、送達ベクターとしてウイルスを魅力的にする感染性は、同時に最も大きな欠点をもたらす。従って、分子治療上の送達のための非ウイルスベクターに対して多くの注目が向けられている。該リポソーム方法は、遺伝子送達のためのウイルスの諸方式に対して多くの利点を提供する。最も重要なことは、リポソームは、自己複製し得る感染性薬物ではないため、別の個体に移入する危険性を持たない。リポソームにより癌細胞を標的化することは、リポソームがその成分を腫瘍細胞へ選択的に送達するようにそれを修飾することによって達成し得る。ある癌細胞の外側表面に存在する特異的分子に関する重要な知識基盤が現在存在する。かかる細胞表面分子は、腫瘍細胞の外表面に存在する該分子が、正常細胞上にあるものとは異なるので、リポソームを腫瘍細胞に標的化するために使用することができる。
【０００４】
発明の背景を説明するため、もしくは実施に関して追加の説明を提供するために本明細書中で用いた文献および他の物質は、出典明示により本明細書の一部とする。
【背景技術】
【０００５】
現行の体細胞遺伝子治療のアプローチは、ウイルスまたは非ウイルスベクター系のいずれかを用いる。多くのウイルスベクターは、遺伝子移入の効率は高いが、ある領域においては不十分である（Ledley FD. et al. Hum. Gene Ther(1995) 6:1129-1144）。非ウイルス遺伝子移入ベクターは、ウイルスベクター使用時に付随するいくつかの問題を回避する。進歩は、インビボにおけるヒトの治療用遺伝子の、非ウイルス性、医薬製剤、特にカチオンリポソーム介在遺伝子導入系の開発に向けてなされた（Massing U. et al., Int.J.Clin. Pharmacol. Ther.(1997)35:87-90）。ＤＮＡ送達に関して、カチオンリポソームを融通性および魅力的にするそれらの特徴は以下を包含する：調製の簡易性；大量のＤＮＡを複合体化する能力；いかなるタイプおよびサイズのＤＮＡまたはＲＮＡの使用の際にも融通性があること；非分裂細胞を含む多くの異なるタイプの細胞をトランスフェクションする能力；免疫原性もしくは生物学的危険物質活性の欠如（Felgner PL, et al., Ann NY Sci.(1995)772:126-139;Lewis JG, et al.,Proc.Natl. Acad. Sci USA(1996)93:3176-3181）。ヒト癌治療に関する知見から、より重要性なことには、カチオンリポソームは、インビボ遺伝子送達に関して安全かつ効率的であることが証明されてきた（Aoki K et al., Cancer Res.(1997)55:3810-3816; Thierry AR, Proc. Natl. Acad. Sci.USA(1997)92:9742-9746）。３０以上の臨床試験が、現在遺伝子治療に関してカチオンリポソームを用いて行われており（Zhang W et al.,Adv. Pharmacology (1997)32:289-333;RAC Committee Report : Human Gene Therapy Protocols-December 1998）、小分子治療物質（例えば、抗菌剤および従来の化学療法剤）を送達するためのリポソームはすでに市販されている（Allen TM, et al., Drugs(1997)54 Suppl 4:8-14）。
【０００６】
カチオンリポソームのトランスフェクション効率は、細胞表面の受容体によって認識されるリガンドを持つ場合に、劇的に増加し得る。受容体介在エンドサイトーシスは、真核生物表面に存在する高効率の内在化経路を示す（Cristiano RJJ, et al., Cancer Gene Ther.(1996) 3:49-57, Cheng PW, Hum Gene Ther .(1996)7:275-282）。リポソーム上のリガンドの存在は、細胞表面上へのその受容体によるリガンドとの初期結合に続く結合複合体の内在化によって細胞へのＤＮＡ導入を助ける。トランスフェリンおよび葉酸を含む多様なリガンドが、そのリポソーム標的化能力に関して試験されてきた（Lee RJ, et al., J. Biol Chem.(1996)271:8481-8487）。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）レベルは、前立腺癌を含む種々の癌細胞タイプにおいて上昇するが、ヒトリンパ節および骨の転移から派生した前立腺癌細胞系でもそうである（Keer HN et al.,J. Urol(1990)143:381-385）; Chackal-Roy M et al., J.Clin. Invest.(1989)84:43-50;Rossi MC, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA(1992)89:6197-6201;Grayhack JT, et al., J. Urol.(1979)121:295-299)。また、上昇したＴｆＲレベルは、腫瘍細胞の攻撃性または増殖能と相関する。そのため、ＴｆＲレベルは、予後の腫瘍マーカーとして有用であると考えられ、ＴｆＲは悪性腫瘍細胞の治療の際に薬物送達に関する有力な標的である(Miyamoto T et al., Int J. Oral Maxillofac. Surg.(1994)23:430-433;Thorstensen K. et al., Scand J. Clin. Lab. Invest.Suppl(1993)215:113-120)。我々の研究室では、ＳＣＣＨＮでの腫瘍細胞トランスフェクション効率が、リガンドを持たないカチオンリポソームではわずか５〜２０％であるのと比較して、６０〜７０％であるトランスフェリン複合体カチオンリポソームを調製した（Xu L, et al., Hum. Gene Ther.(1997)8:467-475）。
【０００７】
腫瘍細胞上の受容体によって認識されるリガンドの使用に加えて、特異的抗体も、それらを特異的な腫瘍細胞表面抗原（これは受容体に制限するものではない）を指向しうるリポソーム表面（Allen TM et al.,(1995) Stealth Liposomes,pp.233-244）へ結合することができる（Allen TM, Biochim. Biohpys. Acta (1995)1237:99-108）。これらの「イムノリポソーム」、特に立体的に安定化したイムノリポソームは、特定の標的細胞群に治療薬物を送達することができる（Allen TM et al.,(1995) Stealth Liposomes,pp.233-244）。Parkら（Park JW, et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA(1995)92:1327-1331）は、リポソームに接合した抗ＨＥＲ-２モノクローナル抗体(Ｍａｂ)Ｆａｂフラグメントが、ＨＥＲ-２を過剰発現する乳癌細胞系ＳＫ-ＢＲ-３に特異的に結合し得ることを明かにした。イムノリポソームは、被覆ピット経路を介する受容体介在エンドサイトーシスによって、また膜融合によっても効率的に内在化することが見出された。さらに、抗ＨＥＲ−２Ｆａｂフラグメントのアンカリングによって、その阻害効果は増強した。ドキソルビシンを有する抗ＨＥＲ−２イムノリポソームは、インビボおよびインビトロにおける標的細胞に対して重要な特異的細胞毒性を示した（Park et al.,Proc. Natl Acad.Sci.USA(1995)92:1327-1331）。さらに、Suzuki et al.,(Suzuki S, et al.,J.Cancer (1997)76:83-89)は、インビトロにおいてヒト白血球細胞においてさらに効率よいドキソルビシンを送達するために抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体接合イムノリポソームを用いた。Huwyler J, ら(Huwyler J, et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:14164-14169)は、インビボにおいてラットグリオーマ細胞（ＲＴ２）に、ダウノマイシンを送達するために抗ＴｆＲモノクローナル抗体イムノリポソームを用いた。このペグ化(PEGlated)イムノリポソームは、正常組織および臓器において薬物の濃度低下を生じた。これらの研究は、腫瘍標的化薬物送達のためのイムノリポソームの有用性を示すものである。SuzukiらおよびHuwylerらによって使用されたイムノリポソーム複合体は、彼らが、アニオンリポソームを使用したこと、および彼らの方法では核酸を送達することができない点で、本発明に記載のものとは異なっていることに注意すべきである。
【０００８】
単鎖抗体フラグメント
生物工学における発展は、Ｍａｂからの特異的な認識ドメインの誘導を可能にした(Poon RY, (1997) Biotechnology International: International Developments in the Biotechnology Industry.pp.113-128)。重鎖および軽鎖の多様な領域の組換えと、そのシングルポリペプチド内への組込みは、標的化の目的のために単鎖抗体誘導体（ｓｃＦｖを設計）を使用することの可能性を提供する。癌胎児性抗原に対して指向したｓｃＦｖ、ＨＥＲ-２、ＣＤ３４、黒色腫関連抗原およびトランスフェリン受容体を提示するように作製したレトロウイルスベクターが開発された（Jiang A, et al.,J. Virol(1998)72:10148-10156, Konishi H. et al., Hum Gene Ther.(1994)9:235-248:Martin F, et al., Hum. Gene Ther.(1998)9:737-746）。ウイルスを指向したこれらのｓｃＦｖは、特別な抗原を発現する細胞のタイプに特異的に結合および感染する標的を示している。さらに、少なくとも癌胎児性抗原の場合、ｓｃＦｖは、親の抗体と同じ細胞特異性を持つことが示されている（Nicholson IC, Mol. Immunol.(1997)34:1157-1165）。
【０００９】
カチオンリポソーム遺伝子転移およびイムノリポソーム技術の組み合わせは、標的化遺伝子送達のための有望なシステムであると考えられる。
【発明の概要】
【００１０】
発明の要旨
我々は、ヒト遺伝子治療の際に使用するための、核酸の腫瘍を標的化した全身送達を可能にする多様なイムノリポソームを構築した。下記の実施態様に示したデータに基に、これらのＴｆＲｓｃＦｖを組込んだイムノリポソームＤＮＡ複合体は、完全なＴｆ分子を持つ同じリポソームＤＮＡ複合体より高いレベルのトランスフェクション効率をもたらし得る。そのため、本発明の一態様において、本発明のイムノリポソームは、トランスフェリン受容体を発現する多様な哺乳動物細胞型の高いトランスフェクション効率のためのキットを作製するために使用することが可能である。本発明の一態様において、我々は、リピドが細菌細胞によって自然に加えられ、ｓｃＦｖを不活性化させ得る化学反応を回避しながらリポソームへのｓｃＦｖの組込みを容易にするように、リピドタグを有するｓｃＦｖタンパク質を構築した。
【００１１】
リピドタグｓｃＦｖイムノリポソームは、基本的に２つの方法で調製される：脂質膜可溶化法およびダイレクト・アンカー法である。この脂質膜可溶化法は、界面活性剤の透析法を修飾したもので、Laukkanen ML, et al., (Laukkanen ML, et al., Biochemistry (1994)33:11664-11670)およびKruf et al.,(de Krurif et al.,FEBS Lett.(1996)399:232-236)によって、中性またはアニオンリポソームに関して記載されており、この両方法は出典明示により本明細書の一部とする。この方法は、リピドタグｓｃＦｖとカチオンリポソームとを結合するために適当である。脂質膜可溶化法において、クロロホルム中の脂質は、減圧下蒸発し、丸底ガラスフラスコ内に乾燥脂質膜を得る。次いで、脂質膜０.５〜４％、好ましくは１％のリピド修飾ｓｃＦｖを含むβ-Ｄ-グルコシド（ＯＧ）を用いて可溶化し、撹拌にかける。滅菌水で希釈後、該溶液を短時間音波処理し、透明にする。
【００１２】
リピド標的化抗体または抗体フラグメントを結合するための第２の方法は、ダダイレクト・アンカー法であり、これはＥ. Coliリポタンパク質Ｎ末端の９個のアミノ酸とｓｃＦｖ（ｌｐｐ-ｓｃＦｖ）または他のリピド修飾抗体またはフラグメントを結合するため、およびこれらを予め形成したリポソームに結合するために特に有用である。ｓｃＦｖと予め形成したリポソームを結合するために、1：３〜1：１０の体積比で、１％のＯＧ中リピド修飾ｓｃＦｖを撹拌しながら予め形成したリポソームに添加する。該混合物を、さらに５〜１０分間撹拌し、ｓｃＦｖイムノリポソームの透明溶液を得る。残存ＯＧおよび非複合体化ｓｃＦｖは、クロマトグラフィーで除去することができるが、後の過程でそれらが干渉することはほとんどない。分離実験、即ちCentricon-１００(Amicon)を用いる限外濾過、Ficoll−４００濾過（Shen DF, et al., Biochem. Biophys. Acta(1982)689:31-37）またはSepharose CL-4B（Pharmacia）クロマトグラフィーにより、添加された全リピドタグｓｃＦｖ分子は実質的にカチオンリポソームに結合または接続されていることが示された。これは、中性またはアニオンリポソームに対するｌｐｐ-ｓｃＦｖの非常に低い結合率を改善する。そのためこの改善は、非結合ｓｃＦｖを除去するためのさらなる精製工程を必要としない。
【００１３】
表面上に１以上のリピドタグを持つように修飾し得る全ての抗体、抗体フラグメントまたは別のペプチド/タンパク質リガンドは、本発明において有用である。他のリピド修飾方法は、Liposome Technology, 2nd Ed.Gregorisdis, G., Ed., CRC Press, Boca Raton, FL, 1992に記載の、リピド鎖と抗体もしくはフラグメントとの直接的接合を包含する。
【００１４】
本発明の別の態様において、システインはｓｃＦｖ配列のＣ末端に付加され、該タンパク質は、Ｅ. Coliの封入体で発現され、再折りたたみされ、活性ｓｃＦｖを生じる。Ｃ末端システインは、ｓｃＦｖとリポソームの接合を助ける遊離メルカプト基を提供する。２つの方法を、接合過程において使用し得る。１）前結合法：第一段階は、マレイミドイル（maleimidyl）基または別のメルカプト反応基を含むカチオンリポソームとｓｃＦｖ-ＳＨを接合させ、ｓｃＦｖリポソームを生成する。次いで、核酸をｓｃＦｖリポソームに添加し、ｓｃＦｖ-リポソーム-ＤＮＡ複合体を形成する。前結合法は、ｓｃＦＶがＤＮＡ複合体形成前に結合するように設計される。２）後結合法：この方法は、はじめに、核酸とカチオンリポソームを複合体化し、縮合構造（condensed structure）を形成する。次いで、ｓｃＦｖ-ＳＨを、ＤＮＡリポソーム複合体の表面上で結合させ、ｓｃＦｖ-リポソーム-ＤＮＡを生成する。後結合法は、ｓｃＦｖがＤＮＡ複合体化後に結合するように設計される。そのため、この方法は、標的化リガンドｓｃＦｖの使用および制御された複合体の内部構造を良好にしうる。
【００１５】
抗体または抗体フラグメントがリピドタグ付きであるかもしくはリポソームへ接合しているかに拘らず、核酸イムノリポソーム複合体は治療上使用することができる。好ましい複合体は、注目とする部位、好ましくは癌細胞である細胞、より好ましくはトランスフェリン受容体を発現する細胞を標的にする。標的化剤は、好ましくは、トランスフェリン受容体に結合する該抗体または該抗体フラグメントである。核酸は、治療薬であり、好ましくはＤＮＡ分子であり、より好ましくは野生型ｐ５３分子をコードする。核酸イムノリポソーム複合体は、好ましくは治療用組成物は、全身投与、好ましくは静脈注射することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ｓｃＦｖＴｆＲリピド−タグの構築を示す。
【図２】図２は、全身投与による腫瘍異種移植片におけるインビボのｓｃＦｖ−リポソーム標的化ｐ５３発現のウエスタン・ブロット分析を示す。
【図３】図３は、ｐＣＭＶｐ５３およびｐＣＭＶｐＲＯ構築物を示す。
【図４】図４は、ｐ５３−３’Ａｄの構築を示す。
【図５】図５は、Ｈｉｓ−タグを有するｓｃＦｖ−システインの構築を示す。
【図６】図６は、Ｈｉｓ−タグを有しないｓｃＦｖ−システインの構築を示す。
【図７】図７は、セルロース結合ドメイン(ＣＢＤ)タグおよびＳタグを有するｓｃＦｖ−システインの構築を示す。
【図８】図８は、接合法によって生成した精製ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質に関するクマシー・ブルー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。
【図９】図９は、全身投与による腫瘍異種移植片におけるインビボでのＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム標的化ｐ５３の発現を生じる接合法のウエスタン・ブロット分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明は、イムノリポソームを目的とし、該イムノリポソームを作製および使用する方法を目指すものである。様々なタグをつけたイムノリポソームおよびｓｃＦｖをリポソームに結合する多様な方法を含む多様な態様を開示する。イムノリポソームは、リピドタグを含むか、または還元基、好ましい態様においては遊離メルカプト基を介して結合してもよい。
【００１８】
腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の変異体は、乳癌の１５〜５０％と転移性の前立腺癌の２５〜７０％を含む、ヒト癌の５０％以上と関連がある。また、ｐ５３における異常は、多様なタイプの悪性腫瘍における予後の悪さに関連する。そのため、全身送達し、ｗｔｐ５３の機能を効果的に修復させるように腫瘍に対して特異的に遺伝子治療の標的とする能力は、癌治療における重要な治療態様であろう。即ち、本発明の方法によって生成されたイムノリポソームは、ｗｔｐ５３機能の修復のみならず他の治療薬剤遺伝子に関して腫瘍標的化全身性送達ビヒクルとしても効率的な新規癌治療モダリティとして有用であろう。
本発明を次の実施例で説明する。
【実施例】
【００１９】
実施例１
生合成的リピドタグｓｃＦｖの構築および発現
ＴｆＲｓｃＦｖに関する発現ベクターの構築
Ｉ．発現ベクターを構築するために、Ｅ.coliリポプロテインシグナルペプチド（ssＬＰＰ）と該ｓｃＦｖクローニング部位との間のアミノ酸リンカー配列を含むベクターｐＬＰ１を使用した（de Kruif et al. FEBS Lett. (1996)399:232-236）。このベクターは、発現したｓｃＦｖの精製および検出のために使用し得るｃ−ｍｙｃとＨｉｓ６タグ配列の両方を含む（図１）。
【００２０】
我々は、プラスミド発現ベクターであるｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫを得た。この発現ベクターは、ＤＮＡ結合タンパク質と結合する５Ｅ９（Haynes, et al. J. Immunol(1981) 127:347-351）抗体に関する単鎖フラグメントを含み、ヒトトランスフェリン受容体（ＴfＲ）を認識する。このベクターは、ＤＮＡ結合タンパク質に関する配列を含み、ｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫ中のｓｃＦｖ配列を断片化する独特な制限酵素部位は存在しない。さらに、我々は、ＮotI部位を含む５’プライマー
【表１】
およびＮcoI部位を含む３’プライマー
【表２】
を用いて所望のフラグメントをＰＣＲ増幅して、ＶＨ−リンカーＶκｓｃＦｖをクローニングした。プライマーＲＢ５５１およびＲＢ５５２を用いるＰＣＲ増幅によって、８１塩基のＭｅｔから８２１塩基のＬｙｓのｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫ由来ＴfＲに関するｓｃＦｖを増幅した。ｐＬＰ１ベクターは、Laukkenen ML, et al (Laukkanen ML, et al., Biochemistry (1994)33:11664-11670) およびde Kruif et al(Kruif et al., FEBS Lett.(1996)399:232-236) によって述べられているように、Ｅ.coliリポプロテインシグナルペプチド（ssＬＰＰ）とＥ.coliリポプリテインＮ末端の９個のアミノ酸（ＬＰＰ）に関する配列も含む。これらの配列の挿入は、Ｅ.coli宿主において発現シグナルの脂肪酸アシル化を引き起こし、細菌膜内にその導入がおこる。該ベクターは、不可欠でない１０個のアミノ酸リンカー配列を有し、リピドタグ部位とｓｃＦｖとの間の空間を広げる。細菌膜由来のリピド修飾ｓｃＦｖ配列の精製によって、リポソーム中に結合するか挿入され得る活性分子となる。
【００２１】
２．ＴｆＲｓｃＦｖの発現および精製
我々は、Ｅ.coli発現宿主ＳＦ１１０Ｆ’を上記構築した発現ベクターを用いて形質転換した。宿主細胞は不安定ではないが、発現したｌａｃ受容体を含むのが好ましい。多くのクローンを選別し、最良の収率でｓｃＦｖを生成する一つのクローンが選択された。リピド修飾ｓｃＦｖ（ｌｐｐ-ｓｃＦｖ）を、Kruif ら(de Kruif et al., FEBS Lett.(1996)399:232-236)によって記載されたようにＴriton Ｘ-１００を使用する細菌膜から単離した。精製するために、単一コロニーを５％グルコースと適当な抗菌剤を含むＬＢ(２００μｌ)中で再懸濁した。該混合物を、５％グルコースと適当な抗菌剤を含む２枚のＬＢ寒天プレート(９０mm)上に塗布し、一晩増殖した。翌日、該細胞を、プレートから洗浄し、０.１％グルコースと適当な抗菌剤を含むＬＢ(全量５リットル)の播種に使用した。該培養物を、ＯＤ６００が０.５〜０.７に達するまで、６時間、２５℃、２００rpmで増殖した。ＩＰＴＧを、１ｍＭの終濃度まで添加し、該培養物をさらに一晩インキュベートした。翌日、該細菌培養物を、遠心分離で回収し、２００ｍｌの溶解緩衝液で、室温で３０分間溶解した。該試料を、氷上で冷やしながら２８ワットで５分間音波処理を行った。該分解緩衝液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４〜７.９）、０.５ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および０.１ｍＭ ＰＭＳＦを含む。引用したプロトコールからの逸脱は、各々２０および２００ｍＭ イミダゾールを含む、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４〜７.９）、０.５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０.１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコシド(ＯＧ)、そして１０％グリセロールを含む緩衝液でメタル・アフィニティーカラムの洗浄および溶出を行うことのみである。ｌｐｐ−ｓｃＦｖの溶出試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ｃ−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を用いてウエスタン・ブロットで分析し、精製ｓｃＦｖが約３０ｋＤａのバンドを示すことを確認した。
【００２２】
実施例２
脂質膜可溶化法によるリピドタグｓｃＦｖイムノリポソームの調製
この実施例は、リピドタグｓｃＦｖイムノリポソームを調製するために脂質膜可溶化法に関する詳細な方法を開示する。クロロホルム中のリピド(５μｍｏｌ、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、１:１モル比)を、減圧下で蒸発させ、丸底ガラスフラスコ中で乾燥リピド膜を得た。リピド膜に、０.５ｍｌの、リピド修飾ｓｃＦｖを含む１％ＯＧ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７.４)を添加した。これを、室温で、１０〜２０分間インキュベーションし、次いでリピド膜を撹拌で混合し、溶解した。次いで、滅菌水（２ｍｌ）を添加し、ｓｃＦｖリピド混合物を希釈した。該溶液を、２０℃で、バス型ソニケーターにより短時間音波処理し、透明にした。該ｓｃＦｖ−リポソームは限られた量の残存界面活性剤ＯＧを有する透明な溶液である。該ＯＧおよび非複合体ｓｃＦｖを、SepharoseCL-4BもしくはSephacrylＳ500を使用するクロマトグラフィーによって除去し得るが、それらは後の使用において干渉しない。
【００２３】
実施例３
ダイレクト・アンカー法によるリピドタグｓｃＦｖイムノリポソームの調製
この実施例は、リピドタグｓｃＦｖイムノリポソームを調製するためにダイレクト・アンカー法を提示する。丸底ガラスフラスコ内の乾燥リピド膜として調製したリピド（２０μmol、リピドＡ−Ｈ、組成および比は以下を参照）を、純水（１０ｍｌ）に添加し、バス型ソニケーターで、室温（リピドＡ、Ｂ、Ｃ）もしくは６５℃（リピドＤ、Ｅ、Ｇ、Ｈもしくは全てのコレステロール(Ｃhol)との任意の組成物）で、１０〜３０分間音波処理した。調製した該カチオンリポソームは、透明な溶液であり、その組成および比は以下である。
【表３】
予め形成したリポソームをｓｃＦｖに結合するために、１％ＯＧを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ(０.５ｍｌ、ｐＨ７.４)中の該リピド修飾ｓｃＦｖ(IPP−scFv)を、撹拌を行いながら、１:３〜１:１０の体積比で、予め形成したリポソームに添加する。該混合物を、さらに１〜５分間撹拌にかけ、ｓｃＦｖイムノリポソームの透明溶液を得た。残存ＯＧと非複合体ｓｃＦｖは、クロマトグラフィーによって除去し得るが、それらは後の使用において干渉しない。分離実験、すなわちCentricon−１００(Amicon)を用いる限外濾過、Ficoll−４００フローテション(Shen DF, et al.,Biochem Biophys Acta (1982)689：31-37)またはSepharose CL-4B(Pharmacia)クロマトグラフィーは、実際に、添加した全てのリピドタグscFvが、カチオンリポソームに結合またはアンカリングしていることを示した。これは、対照的に、アニオンもしくは中性リポソームとlpp-ｓｃＦｖとの結合速度より非常に遅い。そのため、非結合ｓｃＦｖを除去するために、さらなる精製工程は必要でない。
【００２４】
実施例４
ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよび免疫蛍光法によって示したリピドタグｓｃＦｖイムノリポソームの免疫活性
この実施例は、ＴｆＲ(＋)細胞への結合能に関する抗ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームの特徴を提供するものである。該ヒト前立腺癌細胞系ＤＵ１４５および頭部および頚部のヒト扁平上皮細胞癌細胞系ＪＳＱ−３は、これらの研究に対するＴｆＲ＋標的細胞として機能する。
【００２５】
間接的細胞系酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、リポソームに結合する前後のｌｐｐ−ｓｃＦｖの免疫活性を測定した。９６ウェルプレートにおける融合性ＪＳＱ−３細胞を、ＰＢＳ中の０.５％のグルタルアルデヒドを用いて、１０分間、室温で固定した。該プレートを、ＰＢＳ中の５％ウシ胎仔血清(ＦＢＳ）を用いて、３０℃で３０分間ブロッキングした。ｌｐｐ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−イムノリポソームおよびリポソームを、デュプリケートでウェルに添加し、４℃で一晩インキュベーションした。３回のＰＢＳ洗浄の後、抗−ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体を、ＰＢＳ中３％ＦＢＳの各ウェルに添加し、３７℃で、６０分間インキュベーションした。３回のＰＢＳ洗浄の後、３％ＦＢＳで希釈したＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ(Sigma)を各ウェルに添加し、３０分間３７℃でインキュベーションした。該プレートを、３回ＰＢＳで洗浄し、リン酸クエン酸緩衝液(Sigma)中の０．４ｍｇ／ｍｌＯＰＤ基質(１００μｌ)を各ウェルに添加した。発色を２Ｍ スルホン酸(１００μｌ)の各ウェルへの添加により停止した。該プレートを、４９０ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダー(Molecular Devices Corp)で読取った。間接的細胞ＥＬＩＳＡにより、抗ＴfＲ-scFvがリポソーム複合体中に組込まれた後にその免疫活性を保持することを示した(表１)。
表１：ＪＳＱ−３への抗ＴｆＲｓｃＦｖリポソームの結合
【表４】
【００２６】
ＦＡＣＳ分析に関して、抗ＴfＲ-ｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ分析は、４℃でＪＳＱ−３とＤＵ１４５細胞をインキュベーションし、次いでＦＩＴＣ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧと共に、４℃でインキュベーションした。ＪＳＱ−３細胞とｓｃＦｖ−ＬｉｐＡのインキュベーションは、非結合遊離抗ＴfＲ lpp-ｓｃＦｖ抗体によって観察されたものと同一の蛍光変化を示し、標的細胞に結合する量が非常に多いことを示した。対照的に、非標的リポソームは、細胞への結合が非常に少ないことを示した。類似の結果が、前立腺癌細胞系ＤＵ１４５で観察された。また、明細書中、該ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）複合体は、非標的化Ｌｉｐ（Ａ）と比較すると、腫瘍細胞への充分な結合を明確に示した。ＦＡＣＳデータは表２にまとめた。表２では、蛍光変化を、蛍光を示す細胞の百分率として表示する。これらの研究において、陽性細胞の百分率によって示した細胞への結合レベルは、非結合の遊離ｓｃＦｖのものと類似し、さらにリポソーム複合体中への挿入が、抗ＴｆＲ ｌｐｐ−ｓｃＦｖの免疫学的活性を不活性にしないことを示唆した。ＤＵ１４５を用いるこれらの初期実験に対して使用したリポソーム調製物が、ＪＳＱ細胞に至適化されたことを示すべきである。そのため、前立腺腫瘍細胞へのｓｃＦｖ標的化リポソーム複合体の結合は、さらにこの細胞型に対して至適化されたリポソーム複合体の使用によって増幅される。
表２：ＪＳＱ−３およびＤＵ１４５へのＴｆＲｓｃＦｖリポソーム結合のＦＡＣＳ分析
【表５】
【００２７】
ｓｃＦｖリポソーム（Ｌｉｐ（Ａ）が、ローダミンＤＯＰＥで標識されている）とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧの後に抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いる間接的免疫蛍光染色によって、ＪＳＱ−３細胞へのｓｃＦｖ標識リポソーム複合体の結合を確認した。形質移入細胞において赤色および緑色蛍光の一致は、抗ＴfＲｓｃＦｖ（緑色蛍光としてＦＩＴＣ標識抗ｃ−ｍｙｃ抗体によって示される）が、細胞への直接的なローダミン標識Ｌｉｐ（Ａ）を示す。さらに、ｓｃＦｖ Ｌｉｐ（Ａ）システムに関する細胞性結合の高いレベルは、高い％の赤／緑二重陽性蛍光細胞によって示される。
【００２８】
実施例５
インビボでの標的細胞のｓｃＦｖイムノリポソーム介在遺伝子トランスフェクションの至適化
我々は、レポーター遺伝子としてβガラクトシダーゼを用いるＪＳＱ−３細胞における抗ＴｆＲｓｃＦｖＬｉｐ（Ａ）複合体のトランスフェクション効率を測定した。これらの研究において、使用したレポーター遺伝子構築物は、ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶｂ）制御下でβガラクトシダーゼ遺伝子を含み、その同じプロモーターをｐＣＭＶｐ５３に使用した（図３）。トランスフェクションした細胞におけるβＧｌａ発現レベル(トランスフェクション効率と相関する)は、βＧａｌ酵素アッセイで評価した（XuL, et al.,Hum. Gene Ther.(1997)8:467-475）。表３に示したように、抗ＴfＲｓｃＦｖのＬｉｐＡへの結合は、非標的化リポソーム複合体と比較すると、ｓｃＦｖ-Ｌｉｐ（Ａ）-ｐＣＭＶｂトランスフェクションした細胞における酵素活性が２倍であった。この発現レベルは、トランスフェリン自身を標的化リガンド(Ｔｆ-Ｌｉｐ（Ａ）-ｐＣＭＶｂ)として使用した場合に観察される発現レベルと視覚的に実際に同一であった。さらに、遺伝子発現における増加は、レポーター遺伝子ＤＮＡ用量依存性であることが示された。表４は、ＪＳＱ-３細胞におけるｓｃＦｖリポソーム介在トランスフェクションの至適化を示す。
表３：抗ＴｆＲ−リポソームによるＪＳＱ−３細胞のトランスフェクション
【表６】
表４：ＪＳＱ−３へのｓｃＦｖ−リポソームトランスフェクションの至適化
【表７】
【００２９】
実施例６
化学療法薬への感受性を生じる腫瘍細胞を標的とするｓｃＦｖイムノリポソーム介在ｐ５３遺伝子トランスフェクション
１．インビボにおけるリポソーム介在ｗｔｐ５３遺伝子トランスフェクションを促進した抗−ＴfＲｓｃＦｖ
抗ＴfＲ−ｓｃＦｖ標的化Ｌｉｐ(Ａ)−ｐ５３−３’Ａｄによって遺伝子移入したＪＳＱ−３腫瘍細胞における外来性ｗｔｐ５３の発現を、ｐ５３応答性プロモーターの制御の下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む発現プラスミド（ｐＢＰ１００）のトランスフェクションによって評価した（Chen L.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1998)95:195-200）。結果として、外来性ｗｔｐ５３の発現レベルが高くなると、ルシフェラーゼ活性のレベルも高かった。このルシフェラーゼ酵素活性は、相対的光単位(ＲＵＬ)として表現した。上記に示したように、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子と、Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄ複合体への標的化剤としての抗ＴｆＲｓｃＦｖの添加は、非標的化Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄ複合体を超えるトランスフェクション効率とｗｔｐ５３タンパク質の発現の大きな増加をもたらした（ルシフェラーゼ活性のＲＬＵによって表現される）。再び、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄトランスフェクション細胞におけるｐ５３発現レベルは、トランスフェリンそれ自身を、標的化リガンド（Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄ）として使用した場合に観察されたレベルと非常に類似する。そのため、これらの知見は、抗ＴｆＲ単鎖抗体方法が、腫瘍細胞への標的化カチオンリポソーム複合体を標的化し、生物学的に活性なｗｔｐ５３遺伝子を送達する有用な方法であることを示す。
表５：ＪＳＱ−３細胞での異なるリポソームによって仲介されたインビトロでのｐ５３発現
【表８】
【００３０】
２．抗ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム介在ｐ５３遺伝子修復は、腫瘍細胞をシスプラチン（ＣＤＤＰ）の細胞毒性に感受性とした
ｐ５３誘導アポトーシスの研究に対して、マウス黒色腫細胞系Ｂ１６を、２セットの６ウェルプレートに、５μｇのＤＮＡ／２×１０５細胞の用量で、ｐ５３−３’Ａｄ（図４）またはｐＣＭＶｐＲｏプラスミド（図３）ＤＮＡ（それぞれ、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３およびｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐＲｏ）との抗ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム複合体でトランスフェクションを行った。比較のために、トランスフェリン−リポソーム−ＤＮＡ（ＬｉｐＴ−ｐ５３もしくはＬＩｐＴ−ｐＲｏ）も、５μｇＤＮＡ／２×１０５細胞の用量で遺伝子移入した。２４時間後、ＣＤＤＰを、一組のプレートに、終濃度１０μｌまで添加した。薬物添加後の２４および４８時間、付着および浮遊細胞の両方を、アポトーシスの染色のために回収した。細胞を、製造元プロトコールに従って、アネキシン（Annexin）Ｖ−ＦＩＴＣキットで染色した（Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD）。アネキシンＶは、リポコルチンであり、天然に存在する血液タンパク質と抗凝固薬ある。染色細胞は、ＦＡＣＳｔａｒサイトメーター上で測定した（Becton and Dickinson）。表６は、アポトーシス分析の結果のまとめである。
表６：リポソームｐ５３遺伝子修復およびＣＤＤＰによって誘導されたＢ１６細胞のアポトーシス
【表９】
【００３１】
ＣＤＤＰを含まない場合、リポソーム複合体単独によって誘導される量と比較すると、ｓｃＦｖリガンドの添加によって２４時間でアポトーシス細胞％の増加はなかった。しかし、４８時間までには、リポプレックスへの標的化ｓｃＦｖの添加により、アポトーシス細胞％が、２倍以上に増加した。ＣＤＤＰを有する場合、非標的化リポソーム複合体と比較して、２４時間であってもアポトーシス細胞の顕著な増加があった（約１.５倍）。さらに重要なことは、ＣＤＤＰを併用したアポトーシス細胞の増加は、Ｔｆ分子自身を用いる以上に標的リガンドとしてＴｆ受容体にｓｃＦｖを使用すると、さらに顕著であった。この増加は、トランスフェクション効率と相関する。
【００３２】
実施例７
全身投与による、インビボにおけるｓｃＦｖイムノリポソーム標的化ｗｔｐ５３遺伝子の送達および発現
リポソームを含有する抗ＴｆＲｓｃＦｖの能力を試験するために、ｗｔｐ５３をインビボにおいて腫瘍細胞へ特異的に送達するために、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）ｐ５３−３’Ａｄ（図４）または非標的化Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄ（図４）を、ＪＳＱ−３皮下異種移植片の腫瘍細胞を有するヌード・マウスに静脈注射した。注射２日後、腫瘍細胞を摘出し、ウエスタン・ブロット分析のために肝臓および皮膚に加えて該腫瘍細胞からタンパク質を単離した（Xu L, et al., Hum. Gene Ther.(1997)8:467-475）。等量のタンパク質（１００μｇ、濃度によって決定する場合）を、各々のレーンに流した。図２に示したように、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）ｐ５３−３’Ａｄ複合体で全身的に処置したマウス由来の腫瘍（図２の標識ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３）は、非常に強いｐ５３シグナルを示し、外来性のｗｔｐ５３の高い発現レベルに関するさらに追加の低いバンド表示を示し、一方で、外来性マウスｐ５３の非常に低い発現が、皮膚おび肝臓の双方においてのみであることが明らかとなった。対照的に、我々の初期段階の結果を基に期待していたように、非常低いレベルの外来性ｐ５３発現が非標的化Ｌｉｐ（Ａ）ｐ５３−３’Ａｄ注入マウス、図２中の標識化Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３から単離した腫瘍細胞において明らかである。すなわち、我々の新規でかつ独創的な抗ＴｆＲｌｐｐ−ｓｃＦｖリガンドによって標的化したリポソーム複合体は、外来性遺伝子を、インビボで腫瘍細胞に選択的に送達することができることは明らかである。これらの結果は、効率よく標的化する新規の方法の潜在性が、全身に、インビボで腫瘍に特異的にカチオンリポソーム複合体を送達したことを示すものである。
【００３３】
実施例８
接合（コンジュゲーション）法で使用するための３’システインを用いるＴｆＲｓｃＦｖの構築および精製
リピドタグの非存在下、別の方法を考案し、リポプレックスに精製ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質を結合した。このアプローチは、還元基、例えばメルカプト基によるカチオンリポソームへの単鎖タンパク質の接合を目的とする。好ましい態様において、システイン残基を、ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質の３’末端に付加する。このシステインの還元は、カチオンリポソームに接合し得る遊離のメルカプト基において生じ、すなわちトランスフェリン受容体を発現する細胞にリポプレックスを標的化するものである。一方、以下の実施例は、還元基としてシステインを用い、他の類似の還元基はこの方法で機能することもまた明らかである。
【００３４】
１．構築
Ａ．ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームを製造する接合法において使用するためにヒスチジンタグを有する３’システインを含む発現ベクターの構築
実施例１のように、ＴｆＲのためのＶＨ−リンカー−ＶκｓｃＦｖを、プラスミド発現ベクター、ｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫから得た（実施例１に記載）。ＰＣＲ増幅のための５’プライマー
【表１０】
を用いてＮｃｏＩ部位を、ｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫに導入した。
システイン残基に対するヌクレオチド配列に加えてＮｏｔｌ制限部位を、３’プライマー
【表１１】
を使用して導入した。ＰＣＲ産物を、市販のベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）（Novagen）のＮｃｏＩおよびＮｏｔｌ部位にクローンした。このベクターは、ＮｃｏＩ部位の５’、ｐｅｌＢリーダーシグナル配列も含む。発現ベクター中のこの配列の存在は、ペリプラスミック（peliplasmic）スペースへのタンパク質の輸送を可能にする。該タンパク質の精製を助けるために、ｐＥＴ２６ｂ（＋）ベクターもＮｏｔｌ部位のヒスチジンタグ配列３’を含む（図５）。
【００３５】
Ｂ．ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームを製造する接合法で使用するためのヒスチジンタグを持たない３’システインを含む発現ベクターの構築
ヒトが治療用送達ビヒクルとして使用するためには、ヒスチジンタグなしにＴｆＲｓｃＦｖが製造されることが好ましい。故に、実施例８、セクション１．Ａ．において記載した該構築を、最終タンパク質生成物においてこのタグを排除するために修飾した。これを達成するために、上記（実施例８、セクション１.Ａ）に記載した同じ５’プライマーを使用した。しかし、異なる３’プライマーを用いた。システイン残基およびＮｏｔｌ制限部位に対するヌクレオチド配列に加えて、このプライマー
【表１２】
は、システイン配列の隣で、Ｎｏｔｌ部位の前にＤＮＡストップコドンを導入した（図６）。即ち、この構築物のタンパク質生成物は、ヒスチジンタグを含まない。
【００３６】
Ｃ．ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームを製造する接合法における使用のための５’ＣＢＤＴＭタグを有する３’システインを含む発現ベクターの構築
接合法を用いるカチオンリポプレックスと結合するためにシステイン残基を含む３つの選択的構築物も作製した。この構築物のために、実施例８、セクション１.Ｂにおいて上記記載の２つの同じプライマーを使用した（図７）。即ち、ヒスチジンタグは、タンパク質生成物中には存在しなかった。しかし、これらの反応のＰＣＲ産物を、異なるベクター、ｐＥＴ３７ｂ（＋）（Novagen）中にクローン化した。このベクターは、セルロース結合ドメインタグ（ＣＢＤＴＭタグ）とＳタグ（両方とも、ベクター中のＮｃｏｌ部位の５’）を含む。該ＣＢＤＴＭタグ配列は、ミクロバイアルセルロースから誘導されたセルロース結合ドメインをコードする。そのため、このタグの存在は、高い特異性、タンパク質生成物の低コストアフィニティー精製のためのセルロースベースの支持体の使用を可能にする。この構築物中に存在するＳタグの存在は、ウスタン・ブロットでのタンパク質生成物の簡単な検出、およびタンパク質量の簡単な酵素的定量を可能にする。
【００３７】
２．システイン残基を含有するＴｆＲｓｃＦｖの精製
発現したｌａｃリプレッサーを含む市販入手し得るＥ.coli発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）を、実施例８、セクション１に記載した発現ベクター（３つ全てを個々に用いた)で形質転換した。多くのクローンを選択し、最も収率よくＴｆＲｓｃＦｖ産生するものを選抜した。ヒスチジンタグを有する実施例８、セクション１.Ａにおいて、上記の構築物由来のタンパク質の精製は、実施例に詳細に記載するが、同じ方法を、実施例８、セクション１で記載した３つ全ての構築物由来のＴｆＲｓｃＦｖタンパク質を含有するシステインの精製に使用した。主要なＴｆＲｓタンパク質（約９０％）は、可溶性で存在するのではなく、封入体中に存在することが明らかとなった。そのため、システインリンカーを含有するＴｆＲｓｃＦｖを、以下のように封入体から精製した。単一クローンを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ培地（５〜１０ｍｌ）で培種し、３７℃、２５０ｒｐｍで、０.５〜０.７のＯＤ６００になるまで（４〜５時間）増殖させた。この少量の培養物の３０ｍｌを沈殿させ、ＬＢ培地（ブロス）で懸濁し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ培地（１Ｌ）に添加し、３７℃、２５０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０.５〜０.７になるまで（４〜５時間）増殖させた。ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質の発現を誘導するために、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧをこの時点で添加し、さらに４時間インキュベーションを継続した。この時点がタンパク質発現の最高レベルをもたらすことを決定した。次いで、バクテリア培養物を遠心分離で回収し、１５分間、３０℃で、リゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）を含有する２０ｍＭの冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５、１００ｍｌ）で溶解した。試料を、氷上、１０ワットで５分間（３０秒のバースト）音波処理した。この封入体を、遠心分離（１３０００ｇ、１５分間）で単離した。得られた沈殿物を、２０ｍＭの冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.５）で３回洗浄した。封入体の精製度と量を、可溶化前にＳＤＳポリアミドゲル電気泳動によって決定した。
【００３８】
単離した封入体を、６Ｍ グアニジン−ＨＣｌと２００ｍＭ ＮａＣｌ(６Ｍ ＧｕＨＣｌ緩衝溶液)を含有する１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）に溶解し、遠心分離（１２,３００ｇ、１５分間）を行い、不溶性堆積物を除去した。２−メルカプトエタノールを、タンパク質濃度の約５０モル倍に等しい終濃度まで上清に添加し、１時間、室温で回転させながらインキュベーションした。このような高濃度のグアニジン−ＨＣｌと還元剤の存在により、全く折りたたまれていないタンパク質が生じる。ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質の再折りたたみは、４℃で、透析を行って、２−メルカプトエタノールの非存在下、グアニジン−ＨＣｌ濃度を低下させて行った。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pＨ８.０)および２００ｍＭ ＮａＣｌ中:６Ｍ、３Ｍ、２Ｍ、１Ｍおよび０．５Ｍのグアニジン−ＨＣｌ濃度に対して各々、２４時間、透析を行った。最後の透析は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pＨ８.０)および２００ｍＭ ＮａＣｌを３回取り替えた。４回目の透析溶液（１Ｍ グアニジン−ＨＣｌ）は、２ｍＭ グルタチオン（酸化型）と５００ｍＭ Ｌ-アルギニンも含有する。これらの試薬は、部分的に再折りたたみされたタンパク質を適切なジスルフィド結合を形成させ、正しいタンパク質構造を形成させる。該溶液を、凝集物を除去するために遠心分離（１３０００ｇ）によって精製した。該試料を、遠心分離用フィルター（Centrplus centrifugal filter）（Amicon）を用いて、約１.５倍に濃縮した（３０００g、９０分間）。ＳＤＳ-ＰＡＧＥは、ほんの微々たる混在物しか含まない、約２８−３０ｋＤａの分子量を有するＴｆＲｓｃＦｖを含む可溶化システインの単一バンドを示した（図８）。
【００３９】
実施例９
接合法によるｓｃＦｖリポソームの調製
１．ｓｃＦｖの還元
精製したＴｆＲｓｃＦｖを、ＤＴＴにより還元し、モノマーｓｃＦｖ-ＳＨを以下のように得た：ＨＢＳ(１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４)中のｓｃＦｖに、１Ｍ ＤＴＴを、１〜５０ｍＭ の終濃度になるまで添加した。室温で、５〜１０分間の回転後、該タンパク質を、１０−ＤＧカラム（Bio-Read）で脱塩した。遊離ＳＨ基を５,５’ジチオビス−（２−ニトロベンゼン酸）（ＤＴＮＢ、Ｅllman's 試薬）によって測定し（G.L. Ellman (1959)Arch. Biochem. Biophys. 82:70-77. P.W.Riddles, R.L.Blakely, B.Zeruer(1993)Methods Enzymol. 91:49-60）、ＳＨ／タンパク質モル比もしくは遊離ＳＨ／ｓｃＦｖ分子の数として計算した（表７）。この結果は、１〜１０ｍＭＤＴＴが、ｓｃＦｖ還元に供されたことを示す。
表７：ＴｆＲｓｃＦｖの還元
【表１３】
【００４０】
２．リポソーム調製
４−（p−マレイミドフェニル）ブチレート−ＤＯＰＥ（ＭＰＢ−ＤＯＰＥ）（Avanti Polar Lipids）は、リピド総量の５〜８％モルまで、実施例３に記載した７つのリポソーム製剤中に包含される。ＭＰＢリポソームを、実施例３に記載したのと同じ方法で調製した。他のリポソーム調製方法を、カチオンリポソームを調製するために使用することができる。例えば、Campbell MJ (Biotechniques 1995 Jun; 18(6):1027-32)によって記載された方法から改良されたエタノール注射法は、本発明において上手く使用された。簡単に言うと、全てのリピドを、エタノール中に可溶化し、混合し、ハミルトン（Hamilton）シリンジを用いて、５０〜６０℃の純水中に撹拌しながら注入した。該溶液を、さらに１０〜１５分間、撹拌した。この溶液の終濃度は、１〜２ｍＭの全リピドであった。エタノール注入方法は、敏速かつ容易で確実である。終濃度１０〜２０ｍＭになるまで、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５（ｐＨ７.０〜８.０）を添加した。我々は、マレイミド基が水溶液中（ｐＨ７.０以上）で不安定であるとわかったので、該リポソームを、水（ｐＨ５〜６.５）中で調製した。ｐＨは、後の被覆反応を容易にするために、ｓｃＦｖ−ＳＨに結合する前に、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.０〜８.０）を用いて７.０〜８.０に調整されるはずである。
【００４１】
３．前結合法
ｓｃＦｖ−ＳＨを、１／５〜１／４０のタンパク質／リピド（ｗ／ｗ）比、好ましくは１／１０〜１／２０の比で、ＭＰＢ−リポソームに添加した。該溶液をゆっくりと、３０分間、室温で回転して混合し、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐを生成した。ｓｃＦｖ−Ｌｉｐを精製せずに使用したが、Sepharose CL-4Bカラムクロマトグラフィーで精製することが可能である。プラスミドＤＮＡを水で希釈し、１／６〜１／２０、好ましくは１／１０〜１／１４のＤＮＡ／リピド（μｇ／ｎｍｏｌ）比でｓｃＦｖ−Ｌｉｐに添加した。該溶液を、数回反転させて、５−１５分間充分に混合し、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ複合体を生成した。ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡは精製せずに使用したが、Sepharose CL-4Bカラムクロマトグラフィーで精製することが可能である。８０〜１００％のｓｃＦｖがリポソームに接合していたことが分かった。
【００４２】
Ｂ．後結合法
プラスミドＤＮＡを水で希釈し、１／６〜１／２０、好ましくは１／１０〜１／１４のＤＮＡ／リピド（μｇ／ｎｍｏｌ）比で、ＭＰＢリポソームに添加した。該溶液を、数回反転させて、５〜１５分間充分に混合し、ＭＰＢ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ複合体を生成した。次いで、ｓｃＦｖ−ＳＨを、該複合体に１／５〜１／４０、好ましくは１／１０〜１／２０のタンパク質／リピド（ｗ／ｗ）比で添加した。該溶液を、ゆっくりと、３０分間、室温で回転させて混合し、最終的なｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ複合体を生成した。該ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡは精製せずに使用したが、Sepharose CL-4Bカラムクロマトグラフィーで精製することが可能である。８０〜１００％のｓｃＦｖがリポソームに接合していたことが分かった。
４．静脈注射のために、５０％のデキストロース溶液を、終濃度５％までｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡに添加した。
【００４３】
実施例１０
ＥＬＩＳＡアッセイによるシステイン含有ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームの免疫反応活性
この実施例は、インビトロでのＴｆＲ（＋）細胞への結合能に関して、本発明の接合法によって生成した抗ＴｆＲｓｃＦｖ−イムノリポソームの特性化を提供する。ヒト扁平上皮細胞の頭頚部癌細胞系ＪＳＱ−３は、これらの研究に関してＴｆＲ（＋）標的細胞として機能する。
【００４４】
実施例４に記載したように、間接的細胞系酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、リポソームに結合する前後のＴｆＲｓｃＦｖ免疫反応活性を測定した。９６ウェルプレート中コンフルエントのＪＳＱ−３細胞を、ＰＢＳ中０.５％グルタルアルデヒドを用いて、１０分間、室温で固定した。該プレートを、ＰＢＳ中５％ウシ胎仔血清(ＦＢＳ）を用いて、３０℃で３０分間ブロッキングした。システイン含有ＴｆＲｓｃＦｖ単独、カチオンリポソームに接合したＴｆＲｓｃＦｖ（ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームおよび非標的化リポソームを、トリプリケートでウェルに添加した。抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体（Ｈｂ２１、David Fitzgerald, NIHから入手）を陽性対照として、一連のウェルに使用した。該プレートを、４℃で一晩インキュベーションした。該ウェルを、３回ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中３％ＦＢＳ中抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Qiagen）を各ウェルに添加し、６０分間３７℃でインキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳで希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Sigma）を、各ウェルに添加し、３０分間３７℃でインキュベーションした。該プレートを、ＰＢＳで３回洗浄し、クエン酸リン酸緩衝液(Sigma)中の０．４ｍｇ／ｍｌＯＰＤ基質(１００μｌ)を各ウェルに添加した。発色は、各ウェルに２Ｍ スルホン酸(１００μｌ)を添加して停止した。該プレートを、４９０ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダー(Molecular Devices Corp)によって測定した。
【００４５】
間接的細胞系ＥＬＩＳＡは、Ｃ末端システインを含有する抗ＴfＲ-ｓｃＦｖが、該免疫活性を保持することを明確に示した。ＯＤ４９０値は、タンパク質（０.６μｇ）で０.０６０±０.００３５から、ＴｆＲｓｃＦｖ（１.５μｇ）で０.１００±０.００３８およびＴｆＲｓｃＦｖ（３μｇ）で０.１３２±０.００３１までＴｆＲｓｃＦｖタンパク質量の増加と共に増加した。さらに、このＴfＲ-ｓｃＦｖタンパク質は、陽性対照として使用した親のＨｂ２１抗トランスフェリン受容体以上にさらに高い結合活性を示すことが分かった。Ｈｂ２１（１００μｌ）の最高濃度に関するＯＤ４９０は、約２〜４倍低い（０.０３３±０.００８６）。
【００４６】
間接的細胞系ＥＬＩＳＡアッセイは、異なる２つのリポソーム複合体（Ｌｉｐ（Ａ）およびＬｉｐ（Ｂ））中に本発明の接合方法（実施例９）によって同じＴｆＲｓｃＦｖタンパク質を組み込んだ後に実施し、カチオンリポソームを用いるこの方法の万能性を示す。実施例９において詳細に記載されたリポソーム調製物の前および後結合法の両方を用いた。表８に示したように、接合法によって調製したＴｆＲｓｃＦｖの免疫反応活性は、２つのリポソーム組成物の両方と複合体化することによって失わない。これは、イムノリポソーム複合体を作製するために使用した前および後結合法の両方に当てはまる。該ＴｆＲｓｃＦｖ標的化リポプレックスも、細胞に結合することが示された。この結合は、ＴｆＲｓｃＦｖを含まないリポソームの結合以上に非常に高く、実際、細胞のトランスフェリン受容体へのＴｆＲｓｃＦｖの結合によって仲介されると考えられる。
表８：インビトロでの接合法によるＪＳＱ−３へのＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームの結合
【表１４】
【００４７】
実施例１１
インビボにおける標的細胞の接合ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム介在遺伝子トランスフェクション
我々は、プラスミドｐＬuc（これは、レポーター遺伝子として、ＣＭＶプロモータの制御の下、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む）を用いる細胞における接合法によって調製したＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム複合体のインビトロでのトランスフェクション効率を決定した。標的リガンドとしてＴｆＲｓｃＦｖの万能性を示すために、ここでもまた実施例１０のように、２つの異なるリポソーム複合体（ＬＩｐ（Ａ）とＬｉｐ（Ｂ））を、ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質に接合した。ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５および頭および頚部のヒト扁平上皮瘍細胞を、これらの研究で使用した。インビボでのトランスフェクションを、２４ウェルプレートで行った（Xu L, et al., Hum. Gene Yher.(1999)10:2941-2952）。トランスフェクション溶液を、１０％の血清存在下、細胞に添加した。２４時間後、細胞を洗浄し、ルシフェラーゼ活性およびタンパク質濃度を測定した。該結果は、表９Ａおよび９Ｂに示したように、溶解物中のμｇタンパク質あたりの相対的光単位（ＲＬＵ）として表した。
【表１５】
【表１６】
【００４８】
上記結果は、接合法によって調製したシステイン含有ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームが、非標的化リポソームよりも３〜６倍高く、トランスフェリン標的化リポソームよりも２〜３倍高い、インビトロで非常に高いトランスフェクション活性を有することを示す。これは、両方のヒト腫瘍細胞系および両方のリポソーム組成物に当てはまる。即ち、それらは、その免疫反応活性を保持し、標的受容体に結合することができる。表９Ａを基にすると、ｓｃＦｖリポソームを、インビトロにおける効率的遺伝子トランスフェクション薬物として使用することができ、市販入手し得るカチオンリポソーム（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥおよびＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびトランスフェリンリポソームよりも効率が良かった。本発明で開示した該ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームは、トランスフェリン受容体を有する哺乳類細胞のトランスフェクションに有用なインビトロ遺伝子トランスフェクションキットのために使用することができる。
【００４９】
ＴｆＲｓｃＦｖは、トランスフェリン自体よりも小さな分子である。そのため、得られた複合体はよりコンパクトで、細胞によって簡単に取り込まれ、高いトランスフェクション効率を示す。これらの結果は、ヒトに使用するための全身送達のためのＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム使用の利点を示す。小さいサイズは、微小管からの腫瘍細胞へのアクセスを増加させた。最も重要なことは、ＴｆＲｓｃＦｖはヒト血液産物ではなく、ＴｆＲ分子である。そのため、ヒトの治療用のトランスフェリン自体の使用に関連する懸念および技術的問題は回避される。
【００５０】
実施例１２
ヌード・マウス異種移植片モデルにおける全身送達後の野生型ｐ５３の接合ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム介在発現
この実施例において、本発明の接合法によって生じた全身送達後にインビボで腫瘍細胞に優先的に野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）遺伝子を持つリポプレックスを指向するＴｆＲｓｃＦｖの能力を示す。標的リガンドとしてＴｆＲｓｃＦｖの万能性を示すために、明細書中の実施例１０に示したように、２つの別のリポソーム組成物（Ｌｉｐ（Ａ）およびＬｉｐ（Ｂ））を、接合法によってシステイン含有ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質と複合体化した。実施例９において詳細に説明したような前接合法だけを、この研究で用いた。２.５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌細胞を、４−６週令のメス無胸腺ヌード・マウスに皮下注射した。Martrigel(登録商標)コラーゲン基部膜[Collaborative Biomedical Produsts]中に懸濁した１.１×１０７ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞も、４−６週令のメス無胸腺ヌード・マウスに皮下注射し、腫瘍を発生させた。５０−２００ｍｍ３の腫瘍を持つ動物を本実験で使用した(１個体／１試験試料)。ｗｔｐ５３遺伝子を持つ接合ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム、さらに非標的化Ｌｉｐ（Ｂ）およびｗｔｐ５３本来の（naked）ＤＮＡを動物の尾血管中に静脈注射した。追加対照として、ｐ５３含有ベクターの代わりに空ベクターを保持する接合ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）を、マウスに注入した。実施例７に示したように、注射の約６０時間後、該動物を殺し、腫瘍、および肝臓を採取した。タンパク質を組織から単離し、各々の試料(１００μｇ)（タンパク質濃度アッセイにより決定した）を、抗５３モノクローナル抗体を用いるウエスタン・ブロット分析のために１０％ポリアクリルアミドゲルに流した。これら両方の腫瘍細胞のタイプでは、外来性マウスと外来性ヒトｐ５３は、同じ位置で移動する。明細書においてこの結果は、実施例７における記載を反映するものであった。図９に示したように、接合法によって調製したＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐＣＭＶｐ５３リポプレクッスまたはＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ｂ）−ｐＣＭＶｐ５３リポプレックスによって静脈注射した動物由来のＤＵ１４５およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の両方は、ＤＵ１４５腫瘍細胞において最良の発現と共に、強いｐ５３シグナルとさらに低いバンドによって示されるような、外来性ｗｔｐ５３の高い発現レベルを示した。一方、両方の腫瘍細胞型において、Ｌｉｐ（Ａ)組成物はいくらかＬｉｐ（Ｂ）よりも良好であり、両方のリポソーム組成物はこの方法の万能性を示す。外来性マウスｐ５３タンパク質のみが、これらの動物の肝臓に顕性であった。対照的に、外来性マウスｐ５３タンパク質のみは、空のベクターを有する接合ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ｂ）または本来のｗｔｐ５３ＤＮＡを用いて注入したマウスから取り出した腫瘍に顕性であった。また、ｐ５３の発現における若干の増加を、非標的化Ｌｉｐ（Ｂ）−ｐ５３と共にＤＵ１４５腫瘍において観察した。即ち、接合ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームは、優先的に腫瘍細胞へｗｔｐ５３遺伝子を送達した。この腫瘍標的化は、２つの異なる腫瘍細胞において顕性であり、この発明の方法の広い有用性を示すことも重要である。そのため、実施例において記載した本発明の方法は、カチオンリポソームへの結合能を保持するだけでなく、インビボおよびインビトロにおいてもトランスフェリン受容体への結合能を保持するＴｆＲｓｃＦｖタンパク質を産生し、即ち、遺伝子治療用に、腫瘍特異性の、標的化イムノリポソームを作製する我々の目的を満たすものであった。
【００５１】
本発明は、本明細書中で、本発明の好ましい態様の詳細を引用して記載しているが、この記載は、本発明の精神および特許請求の範囲の範囲内で、修飾が当業者には容易になされるということが考えられるため、限定的意図よりむしろ説明的であることを意図することは理解されるべきである。
【００５２】
【表１７】
【００５３】
【表１８】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、リピドタグ抗体フラグメント標的化リポソームを含む抗体フラグメント標的化リポソーム（「イムノリポソーム」）を調製するための方法、イムノリポソームを使用するインビトロトランスフェクションのための方法、およびインビボにおける全身性遺伝子送達のための方法を提供するものである。本発明のリポソームは、標的化遺伝子送達を行うのに有用であり、全身投与後の効率的な遺伝子発現のために効果的である。送達系の特異性は、標的化抗体フラグメントから誘導される。
【０００２】
癌に対する理想的な治療は、腫瘍表現型の原因となる細胞経路を選択的に標的とし、正常細胞に関して非毒性のものである。遺伝子治療を含む癌治療は、かなり有望ではあるが、一方でこの有望性を実現し得る前に指向すべき多くの問題を抱えている。おそらく、高分子治療に関連する問題の中の最も主要なものは、体内で必要とされる部位への治療分子の効率的な送達である。ウイルスおよびリポソームを含む多様な送達系(別名「ベクター」)が試験されてきた。理想的な送達系ビヒクルは、全身的に投与されうるもの（局所とは反対に）であり、体内のどの場所に存在する腫瘍細胞も選択的に標的化し得るものである。
【０００３】
また、送達ベクターとしてウイルスを魅力的にする感染性は、同時に最も大きな欠点をもたらす。従って、分子治療上の送達のための非ウイルスベクターに対して多くの注目が向けられている。該リポソーム方法は、遺伝子送達のためのウイルスの諸方式に対して多くの利点を提供する。最も重要なことは、リポソームは、自己複製し得る感染性薬物ではないため、別の個体に移入する危険性を持たない。リポソームにより癌細胞を標的化することは、リポソームがその成分を腫瘍細胞へ選択的に送達するようにそれを修飾することによって達成し得る。ある癌細胞の外側表面に存在する特異的分子に関する重要な知識基盤が現在存在する。かかる細胞表面分子は、腫瘍細胞の外表面に存在する該分子が、正常細胞上にあるものとは異なるので、リポソームを腫瘍細胞に標的化するために使用することができる。
【０００４】
発明の背景を説明するため、もしくは実施に関して追加の説明を提供するために本明細書中で用いた文献および他の物質は、出典明示により本明細書の一部とする。
【背景技術】
【０００５】
現行の体細胞遺伝子治療のアプローチは、ウイルスまたは非ウイルスベクター系のいずれかを用いる。多くのウイルスベクターは、遺伝子移入の効率は高いが、ある領域においては不十分である（Ledley FD. et al. Hum. Gene Ther(1995) 6:1129-1144）。非ウイルス遺伝子移入ベクターは、ウイルスベクター使用時に付随するいくつかの問題を回避する。進歩は、インビボにおけるヒトの治療用遺伝子の、非ウイルス性、医薬製剤、特にカチオンリポソーム介在遺伝子導入系の開発に向けてなされた（Massing U. et al., Int.J.Clin. Pharmacol. Ther.(1997)35:87-90）。ＤＮＡ送達に関して、カチオンリポソームを融通性および魅力的にするそれらの特徴は以下を包含する：調製の簡易性；大量のＤＮＡを複合体化する能力；いかなるタイプおよびサイズのＤＮＡまたはＲＮＡの使用の際にも融通性があること；非分裂細胞を含む多くの異なるタイプの細胞をトランスフェクションする能力；免疫原性もしくは生物学的危険物質活性の欠如（Felgner PL, et al., Ann NY Sci.(1995)772:126-139;Lewis JG, et al.,Proc.Natl. Acad. Sci USA(1996)93:3176-3181）。ヒト癌治療に関する知見から、より重要性なことには、カチオンリポソームは、インビボ遺伝子送達に関して安全かつ効率的であることが証明されてきた（Aoki K et al., Cancer Res.(1997)55:3810-3816; Thierry AR, Proc. Natl. Acad. Sci.USA(1997)92:9742-9746）。３０以上の臨床試験が、現在遺伝子治療に関してカチオンリポソームを用いて行われており（Zhang W et al.,Adv. Pharmacology (1997)32:289-333;RAC Committee Report : Human Gene Therapy Protocols-December 1998）、小分子治療物質（例えば、抗菌剤および従来の化学療法剤）を送達するためのリポソームはすでに市販されている（Allen TM, et al., Drugs(1997)54 Suppl 4:8-14）。
【０００６】
カチオンリポソームのトランスフェクション効率は、細胞表面の受容体によって認識されるリガンドを持つ場合に、劇的に増加し得る。受容体介在エンドサイトーシスは、真核生物表面に存在する高効率の内在化経路を示す（Cristiano RJJ, et al., Cancer Gene Ther.(1996) 3:49-57, Cheng PW, Hum Gene Ther .(1996)7:275-282）。リポソーム上のリガンドの存在は、細胞表面上へのその受容体によるリガンドとの初期結合に続く結合複合体の内在化によって細胞へのＤＮＡ導入を助ける。トランスフェリンおよび葉酸を含む多様なリガンドが、そのリポソーム標的化能力に関して試験されてきた（Lee RJ, et al., J. Biol Chem.(1996)271:8481-8487）。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）レベルは、前立腺癌を含む種々の癌細胞タイプにおいて上昇するが、ヒトリンパ節および骨の転移から派生した前立腺癌細胞系でもそうである（Keer HN et al.,J. Urol(1990)143:381-385）; Chackal-Roy M et al., J.Clin. Invest.(1989)84:43-50;Rossi MC, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA(1992)89:6197-6201;Grayhack JT, et al., J. Urol.(1979)121:295-299)。また、上昇したＴｆＲレベルは、腫瘍細胞の攻撃性または増殖能と相関する。そのため、ＴｆＲレベルは、予後の腫瘍マーカーとして有用であると考えられ、ＴｆＲは悪性腫瘍細胞の治療の際に薬物送達に関する有力な標的である(Miyamoto T et al., Int J. Oral Maxillofac. Surg.(1994)23:430-433;Thorstensen K. et al., Scand J. Clin. Lab. Invest.Suppl(1993)215:113-120)。我々の研究室では、ＳＣＣＨＮでの腫瘍細胞トランスフェクション効率が、リガンドを持たないカチオンリポソームではわずか５〜２０％であるのと比較して、６０〜７０％であるトランスフェリン複合体カチオンリポソームを調製した（Xu L, et al., Hum. Gene Ther.(1997)8:467-475）。
【０００７】
腫瘍細胞上の受容体によって認識されるリガンドの使用に加えて、特異的抗体も、それらを特異的な腫瘍細胞表面抗原（これは受容体に制限するものではない）を指向しうるリポソーム表面（Allen TM et al.,(1995) Stealth Liposomes,pp.233-244）へ結合することができる（Allen TM, Biochim. Biohpys. Acta (1995)1237:99-108）。これらの「イムノリポソーム」、特に立体的に安定化したイムノリポソームは、特定の標的細胞群に治療薬物を送達することができる（Allen TM et al.,(1995) Stealth Liposomes,pp.233-244）。Parkら（Park JW, et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA(1995)92:1327-1331）は、リポソームに接合した抗ＨＥＲ-２モノクローナル抗体(Ｍａｂ)Ｆａｂフラグメントが、ＨＥＲ-２を過剰発現する乳癌細胞系ＳＫ-ＢＲ-３に特異的に結合し得ることを明かにした。イムノリポソームは、被覆ピット経路を介する受容体介在エンドサイトーシスによって、また膜融合によっても効率的に内在化することが見出された。さらに、抗ＨＥＲ−２Ｆａｂフラグメントのアンカリングによって、その阻害効果は増強した。ドキソルビシンを有する抗ＨＥＲ−２イムノリポソームは、インビボおよびインビトロにおける標的細胞に対して重要な特異的細胞毒性を示した（Park et al.,Proc. Natl Acad.Sci.USA(1995)92:1327-1331）。さらに、Suzuki et al.,(Suzuki S, et al.,J.Cancer (1997)76:83-89)は、インビトロにおいてヒト白血球細胞においてさらに効率よいドキソルビシンを送達するために抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体接合イムノリポソームを用いた。Huwyler J, ら(Huwyler J, et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:14164-14169)は、インビボにおいてラットグリオーマ細胞（ＲＴ２）に、ダウノマイシンを送達するために抗ＴｆＲモノクローナル抗体イムノリポソームを用いた。このペグ化(PEGlated)イムノリポソームは、正常組織および臓器において薬物の濃度低下を生じた。これらの研究は、腫瘍標的化薬物送達のためのイムノリポソームの有用性を示すものである。SuzukiらおよびHuwylerらによって使用されたイムノリポソーム複合体は、彼らが、アニオンリポソームを使用したこと、および彼らの方法では核酸を送達することができない点で、本発明に記載のものとは異なっていることに注意すべきである。
【０００８】
単鎖抗体フラグメント
生物工学における発展は、Ｍａｂからの特異的な認識ドメインの誘導を可能にした(Poon RY, (1997) Biotechnology International: International Developments in the Biotechnology Industry.pp.113-128)。重鎖および軽鎖の多様な領域の組換えと、そのシングルポリペプチド内への組込みは、標的化の目的のために単鎖抗体誘導体（ｓｃＦｖを設計）を使用することの可能性を提供する。癌胎児性抗原に対して指向したｓｃＦｖ、ＨＥＲ-２、ＣＤ３４、黒色腫関連抗原およびトランスフェリン受容体を提示するように作製したレトロウイルスベクターが開発された（Jiang A, et al.,J. Virol(1998)72:10148-10156, Konishi H. et al., Hum Gene Ther.(1994)9:235-248:Martin F, et al., Hum. Gene Ther.(1998)9:737-746）。ウイルスを指向したこれらのｓｃＦｖは、特別な抗原を発現する細胞のタイプに特異的に結合および感染する標的を示している。さらに、少なくとも癌胎児性抗原の場合、ｓｃＦｖは、親の抗体と同じ細胞特異性を持つことが示されている（Nicholson IC, Mol. Immunol.(1997)34:1157-1165）。
【０００９】
カチオンリポソーム遺伝子転移およびイムノリポソーム技術の組み合わせは、標的化遺伝子送達のための有望なシステムであると考えられる。
【発明の概要】
【００１０】
発明の要旨
我々は、ヒト遺伝子治療の際に使用するための、核酸の腫瘍を標的化した全身送達を可能にする多様なイムノリポソームを構築した。下記の実施態様に示したデータに基に、これらのＴｆＲｓｃＦｖを組込んだイムノリポソームＤＮＡ複合体は、完全なＴｆ分子を持つ同じリポソームＤＮＡ複合体より高いレベルのトランスフェクション効率をもたらし得る。そのため、本発明の一態様において、本発明のイムノリポソームは、トランスフェリン受容体を発現する多様な哺乳動物細胞型の高いトランスフェクション効率のためのキットを作製するために使用することが可能である。本発明の一態様において、我々は、リピドが細菌細胞によって自然に加えられ、ｓｃＦｖを不活性化させ得る化学反応を回避しながらリポソームへのｓｃＦｖの組込みを容易にするように、リピドタグを有するｓｃＦｖタンパク質を構築した。
【００１１】
リピドタグｓｃＦｖイムノリポソームは、基本的に２つの方法で調製される：脂質膜可溶化法およびダイレクト・アンカー法である。この脂質膜可溶化法は、界面活性剤の透析法を修飾したもので、Laukkanen ML, et al., (Laukkanen ML, et al., Biochemistry (1994)33:11664-11670)およびKruf et al.,(de Krurif et al.,FEBS Lett.(1996)399:232-236)によって、中性またはアニオンリポソームに関して記載されており、この両方法は出典明示により本明細書の一部とする。この方法は、リピドタグｓｃＦｖとカチオンリポソームとを結合するために適当である。脂質膜可溶化法において、クロロホルム中の脂質は、減圧下蒸発し、丸底ガラスフラスコ内に乾燥脂質膜を得る。次いで、脂質膜０.５〜４％、好ましくは１％のリピド修飾ｓｃＦｖを含むβ-Ｄ-グルコシド（ＯＧ）を用いて可溶化し、撹拌にかける。滅菌水で希釈後、該溶液を短時間音波処理し、透明にする。
【００１２】
リピド標的化抗体または抗体フラグメントを結合するための第２の方法は、ダダイレクト・アンカー法であり、これはＥ. Coliリポタンパク質Ｎ末端の９個のアミノ酸とｓｃＦｖ（ｌｐｐ-ｓｃＦｖ）または他のリピド修飾抗体またはフラグメントを結合するため、およびこれらを予め形成したリポソームに結合するために特に有用である。ｓｃＦｖと予め形成したリポソームを結合するために、1：３〜1：１０の体積比で、１％のＯＧ中リピド修飾ｓｃＦｖを撹拌しながら予め形成したリポソームに添加する。該混合物を、さらに５〜１０分間撹拌し、ｓｃＦｖイムノリポソームの透明溶液を得る。残存ＯＧおよび非複合体化ｓｃＦｖは、クロマトグラフィーで除去することができるが、後の過程でそれらが干渉することはほとんどない。分離実験、即ちCentricon-１００(Amicon)を用いる限外濾過、Ficoll−４００濾過（Shen DF, et al., Biochem. Biophys. Acta(1982)689:31-37）またはSepharose CL-4B（Pharmacia）クロマトグラフィーにより、添加された全リピドタグｓｃＦｖ分子は実質的にカチオンリポソームに結合または接続されていることが示された。これは、中性またはアニオンリポソームに対するｌｐｐ-ｓｃＦｖの非常に低い結合率を改善する。そのためこの改善は、非結合ｓｃＦｖを除去するためのさらなる精製工程を必要としない。
【００１３】
表面上に１以上のリピドタグを持つように修飾し得る全ての抗体、抗体フラグメントまたは別のペプチド/タンパク質リガンドは、本発明において有用である。他のリピド修飾方法は、Liposome Technology, 2nd Ed.Gregorisdis, G., Ed., CRC Press, Boca Raton, FL, 1992に記載の、リピド鎖と抗体もしくはフラグメントとの直接的接合を包含する。
【００１４】
本発明の別の態様において、システインはｓｃＦｖ配列のＣ末端に付加され、該タンパク質は、Ｅ. Coliの封入体で発現され、再折りたたみされ、活性ｓｃＦｖを生じる。Ｃ末端システインは、ｓｃＦｖとリポソームの接合を助ける遊離メルカプト基を提供する。２つの方法を、接合過程において使用し得る。１）前結合法：第一段階は、マレイミドイル（maleimidyl）基または別のメルカプト反応基を含むカチオンリポソームとｓｃＦｖ-ＳＨを接合させ、ｓｃＦｖリポソームを生成する。次いで、核酸をｓｃＦｖリポソームに添加し、ｓｃＦｖ-リポソーム-ＤＮＡ複合体を形成する。前結合法は、ｓｃＦＶがＤＮＡ複合体形成前に結合するように設計される。２）後結合法：この方法は、はじめに、核酸とカチオンリポソームを複合体化し、縮合構造（condensed structure）を形成する。次いで、ｓｃＦｖ-ＳＨを、ＤＮＡリポソーム複合体の表面上で結合させ、ｓｃＦｖ-リポソーム-ＤＮＡを生成する。後結合法は、ｓｃＦｖがＤＮＡ複合体化後に結合するように設計される。そのため、この方法は、標的化リガンドｓｃＦｖの使用および制御された複合体の内部構造を良好にしうる。
【００１５】
抗体または抗体フラグメントがリピドタグ付きであるかもしくはリポソームへ接合しているかに拘らず、核酸イムノリポソーム複合体は治療上使用することができる。好ましい複合体は、注目とする部位、好ましくは癌細胞である細胞、より好ましくはトランスフェリン受容体を発現する細胞を標的にする。標的化剤は、好ましくは、トランスフェリン受容体に結合する該抗体または該抗体フラグメントである。核酸は、治療薬であり、好ましくはＤＮＡ分子であり、より好ましくは野生型ｐ５３分子をコードする。核酸イムノリポソーム複合体は、好ましくは治療用組成物は、全身投与、好ましくは静脈注射することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ｓｃＦｖＴｆＲリピド−タグの構築を示す。
【図２】図２は、全身投与による腫瘍異種移植片におけるインビボのｓｃＦｖ−リポソーム標的化ｐ５３発現のウエスタン・ブロット分析を示す。
【図３】図３は、ｐＣＭＶｐ５３およびｐＣＭＶｐＲＯ構築物を示す。
【図４】図４は、ｐ５３−３’Ａｄの構築を示す。
【図５】図５は、Ｈｉｓ−タグを有するｓｃＦｖ−システインの構築を示す。
【図６】図６は、Ｈｉｓ−タグを有しないｓｃＦｖ−システインの構築を示す。
【図７】図７は、セルロース結合ドメイン(ＣＢＤ)タグおよびＳタグを有するｓｃＦｖ−システインの構築を示す。
【図８】図８は、接合法によって生成した精製ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質に関するクマシー・ブルー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。
【図９】図９は、全身投与による腫瘍異種移植片におけるインビボでのＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム標的化ｐ５３の発現を生じる接合法のウエスタン・ブロット分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明は、イムノリポソームを目的とし、該イムノリポソームを作製および使用する方法を目指すものである。様々なタグをつけたイムノリポソームおよびｓｃＦｖをリポソームに結合する多様な方法を含む多様な態様を開示する。イムノリポソームは、リピドタグを含むか、または還元基、好ましい態様においては遊離メルカプト基を介して結合してもよい。
【００１８】
腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の変異体は、乳癌の１５〜５０％と転移性の前立腺癌の２５〜７０％を含む、ヒト癌の５０％以上と関連がある。また、ｐ５３における異常は、多様なタイプの悪性腫瘍における予後の悪さに関連する。そのため、全身送達し、ｗｔｐ５３の機能を効果的に修復させるように腫瘍に対して特異的に遺伝子治療の標的とする能力は、癌治療における重要な治療態様であろう。即ち、本発明の方法によって生成されたイムノリポソームは、ｗｔｐ５３機能の修復のみならず他の治療薬剤遺伝子に関して腫瘍標的化全身性送達ビヒクルとしても効率的な新規癌治療モダリティとして有用であろう。
本発明を次の実施例で説明する。
【実施例】
【００１９】
実施例１
生合成的リピドタグｓｃＦｖの構築および発現
ＴｆＲｓｃＦｖに関する発現ベクターの構築
Ｉ．発現ベクターを構築するために、Ｅ.coliリポプロテインシグナルペプチド（ssＬＰＰ）と該ｓｃＦｖクローニング部位との間のアミノ酸リンカー配列を含むベクターｐＬＰ１を使用した（de Kruif et al. FEBS Lett. (1996)399:232-236）。このベクターは、発現したｓｃＦｖの精製および検出のために使用し得るｃ−ｍｙｃとＨｉｓ６タグ配列の両方を含む（図１）。
【００２０】
我々は、プラスミド発現ベクターであるｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫを得た。この発現ベクターは、ＤＮＡ結合タンパク質と結合する５Ｅ９（Haynes, et al. J. Immunol(1981) 127:347-351）抗体に関する単鎖フラグメントを含み、ヒトトランスフェリン受容体（ＴfＲ）を認識する。このベクターは、ＤＮＡ結合タンパク質に関する配列を含み、ｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫ中のｓｃＦｖ配列を断片化する独特な制限酵素部位は存在しない。さらに、我々は、ＮotI部位を含む５’プライマー
【表１】
およびＮcoI部位を含む３’プライマー
【表２】
を用いて所望のフラグメントをＰＣＲ増幅して、ＶＨ−リンカーＶκｓｃＦｖをクローニングした。プライマーＲＢ５５１およびＲＢ５５２を用いるＰＣＲ増幅によって、８１塩基のＭｅｔから８２１塩基のＬｙｓのｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫ由来ＴfＲに関するｓｃＦｖを増幅した。ｐＬＰ１ベクターは、Laukkenen ML, et al (Laukkanen ML, et al., Biochemistry (1994)33:11664-11670) およびde Kruif et al(Kruif et al., FEBS Lett.(1996)399:232-236) によって述べられているように、Ｅ.coliリポプロテインシグナルペプチド（ssＬＰＰ）とＥ.coliリポプリテインＮ末端の９個のアミノ酸（ＬＰＰ）に関する配列も含む。これらの配列の挿入は、Ｅ.coli宿主において発現シグナルの脂肪酸アシル化を引き起こし、細菌膜内にその導入がおこる。該ベクターは、不可欠でない１０個のアミノ酸リンカー配列を有し、リピドタグ部位とｓｃＦｖとの間の空間を広げる。細菌膜由来のリピド修飾ｓｃＦｖ配列の精製によって、リポソーム中に結合するか挿入され得る活性分子となる。
【００２１】
２．ＴｆＲｓｃＦｖの発現および精製
我々は、Ｅ.coli発現宿主ＳＦ１１０Ｆ’を上記構築した発現ベクターを用いて形質転換した。宿主細胞は不安定ではないが、発現したｌａｃ受容体を含むのが好ましい。多くのクローンを選別し、最良の収率でｓｃＦｖを生成する一つのクローンが選択された。リピド修飾ｓｃＦｖ（ｌｐｐ-ｓｃＦｖ）を、Kruif ら(de Kruif et al., FEBS Lett.(1996)399:232-236)によって記載されたようにＴriton Ｘ-１００を使用する細菌膜から単離した。精製するために、単一コロニーを５％グルコースと適当な抗菌剤を含むＬＢ(２００μｌ)中で再懸濁した。該混合物を、５％グルコースと適当な抗菌剤を含む２枚のＬＢ寒天プレート(９０mm)上に塗布し、一晩増殖した。翌日、該細胞を、プレートから洗浄し、０.１％グルコースと適当な抗菌剤を含むＬＢ(全量５リットル)の播種に使用した。該培養物を、ＯＤ６００が０.５〜０.７に達するまで、６時間、２５℃、２００rpmで増殖した。ＩＰＴＧを、１ｍＭの終濃度まで添加し、該培養物をさらに一晩インキュベートした。翌日、該細菌培養物を、遠心分離で回収し、２００ｍｌの溶解緩衝液で、室温で３０分間溶解した。該試料を、氷上で冷やしながら２８ワットで５分間音波処理を行った。該分解緩衝液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４〜７.９）、０.５ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および０.１ｍＭ ＰＭＳＦを含む。引用したプロトコールからの逸脱は、各々２０および２００ｍＭ イミダゾールを含む、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４〜７.９）、０.５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０.１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコシド(ＯＧ)、そして１０％グリセロールを含む緩衝液でメタル・アフィニティーカラムの洗浄および溶出を行うことのみである。ｌｐｐ−ｓｃＦｖの溶出試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ｃ−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を用いてウエスタン・ブロットで分析し、精製ｓｃＦｖが約３０ｋＤａのバンドを示すことを確認した。
【００２２】
実施例２
脂質膜可溶化法によるリピドタグｓｃＦｖイムノリポソームの調製
この実施例は、リピドタグｓｃＦｖイムノリポソームを調製するために脂質膜可溶化法に関する詳細な方法を開示する。クロロホルム中のリピド(５μｍｏｌ、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、１:１モル比)を、減圧下で蒸発させ、丸底ガラスフラスコ中で乾燥リピド膜を得た。リピド膜に、０.５ｍｌの、リピド修飾ｓｃＦｖを含む１％ＯＧ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７.４)を添加した。これを、室温で、１０〜２０分間インキュベーションし、次いでリピド膜を撹拌で混合し、溶解した。次いで、滅菌水（２ｍｌ）を添加し、ｓｃＦｖリピド混合物を希釈した。該溶液を、２０℃で、バス型ソニケーターにより短時間音波処理し、透明にした。該ｓｃＦｖ−リポソームは限られた量の残存界面活性剤ＯＧを有する透明な溶液である。該ＯＧおよび非複合体ｓｃＦｖを、SepharoseCL-4BもしくはSephacrylＳ500を使用するクロマトグラフィーによって除去し得るが、それらは後の使用において干渉しない。
【００２３】
実施例３
ダイレクト・アンカー法によるリピドタグｓｃＦｖイムノリポソームの調製
この実施例は、リピドタグｓｃＦｖイムノリポソームを調製するためにダイレクト・アンカー法を提示する。丸底ガラスフラスコ内の乾燥リピド膜として調製したリピド（２０μmol、リピドＡ−Ｈ、組成および比は以下を参照）を、純水（１０ｍｌ）に添加し、バス型ソニケーターで、室温（リピドＡ、Ｂ、Ｃ）もしくは６５℃（リピドＤ、Ｅ、Ｇ、Ｈもしくは全てのコレステロール(Ｃhol)との任意の組成物）で、１０〜３０分間音波処理した。調製した該カチオンリポソームは、透明な溶液であり、その組成および比は以下である。
【表３】
予め形成したリポソームをｓｃＦｖに結合するために、１％ＯＧを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ(０.５ｍｌ、ｐＨ７.４)中の該リピド修飾ｓｃＦｖ(IPP−scFv)を、撹拌を行いながら、１:３〜１:１０の体積比で、予め形成したリポソームに添加する。該混合物を、さらに１〜５分間撹拌にかけ、ｓｃＦｖイムノリポソームの透明溶液を得た。残存ＯＧと非複合体ｓｃＦｖは、クロマトグラフィーによって除去し得るが、それらは後の使用において干渉しない。分離実験、すなわちCentricon−１００(Amicon)を用いる限外濾過、Ficoll−４００フローテション(Shen DF, et al.,Biochem Biophys Acta (1982)689：31-37)またはSepharose CL-4B(Pharmacia)クロマトグラフィーは、実際に、添加した全てのリピドタグscFvが、カチオンリポソームに結合またはアンカリングしていることを示した。これは、対照的に、アニオンもしくは中性リポソームとlpp-ｓｃＦｖとの結合速度より非常に遅い。そのため、非結合ｓｃＦｖを除去するために、さらなる精製工程は必要でない。
【００２４】
実施例４
ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよび免疫蛍光法によって示したリピドタグｓｃＦｖイムノリポソームの免疫活性
この実施例は、ＴｆＲ(＋)細胞への結合能に関する抗ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームの特徴を提供するものである。該ヒト前立腺癌細胞系ＤＵ１４５および頭部および頚部のヒト扁平上皮細胞癌細胞系ＪＳＱ−３は、これらの研究に対するＴｆＲ＋標的細胞として機能する。
【００２５】
間接的細胞系酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、リポソームに結合する前後のｌｐｐ−ｓｃＦｖの免疫活性を測定した。９６ウェルプレートにおける融合性ＪＳＱ−３細胞を、ＰＢＳ中の０.５％のグルタルアルデヒドを用いて、１０分間、室温で固定した。該プレートを、ＰＢＳ中の５％ウシ胎仔血清(ＦＢＳ）を用いて、３０℃で３０分間ブロッキングした。ｌｐｐ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−イムノリポソームおよびリポソームを、デュプリケートでウェルに添加し、４℃で一晩インキュベーションした。３回のＰＢＳ洗浄の後、抗−ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体を、ＰＢＳ中３％ＦＢＳの各ウェルに添加し、３７℃で、６０分間インキュベーションした。３回のＰＢＳ洗浄の後、３％ＦＢＳで希釈したＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ(Sigma)を各ウェルに添加し、３０分間３７℃でインキュベーションした。該プレートを、３回ＰＢＳで洗浄し、リン酸クエン酸緩衝液(Sigma)中の０．４ｍｇ／ｍｌＯＰＤ基質(１００μｌ)を各ウェルに添加した。発色を２Ｍ スルホン酸(１００μｌ)の各ウェルへの添加により停止した。該プレートを、４９０ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダー(Molecular Devices Corp)で読取った。間接的細胞ＥＬＩＳＡにより、抗ＴfＲ-scFvがリポソーム複合体中に組込まれた後にその免疫活性を保持することを示した(表１)。
表１：ＪＳＱ−３への抗ＴｆＲｓｃＦｖリポソームの結合
【表４】
【００２６】
ＦＡＣＳ分析に関して、抗ＴfＲ-ｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ分析は、４℃でＪＳＱ−３とＤＵ１４５細胞をインキュベーションし、次いでＦＩＴＣ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧと共に、４℃でインキュベーションした。ＪＳＱ−３細胞とｓｃＦｖ−ＬｉｐＡのインキュベーションは、非結合遊離抗ＴfＲ lpp-ｓｃＦｖ抗体によって観察されたものと同一の蛍光変化を示し、標的細胞に結合する量が非常に多いことを示した。対照的に、非標的リポソームは、細胞への結合が非常に少ないことを示した。類似の結果が、前立腺癌細胞系ＤＵ１４５で観察された。また、明細書中、該ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）複合体は、非標的化Ｌｉｐ（Ａ）と比較すると、腫瘍細胞への充分な結合を明確に示した。ＦＡＣＳデータは表２にまとめた。表２では、蛍光変化を、蛍光を示す細胞の百分率として表示する。これらの研究において、陽性細胞の百分率によって示した細胞への結合レベルは、非結合の遊離ｓｃＦｖのものと類似し、さらにリポソーム複合体中への挿入が、抗ＴｆＲ ｌｐｐ−ｓｃＦｖの免疫学的活性を不活性にしないことを示唆した。ＤＵ１４５を用いるこれらの初期実験に対して使用したリポソーム調製物が、ＪＳＱ細胞に至適化されたことを示すべきである。そのため、前立腺腫瘍細胞へのｓｃＦｖ標的化リポソーム複合体の結合は、さらにこの細胞型に対して至適化されたリポソーム複合体の使用によって増幅される。
表２：ＪＳＱ−３およびＤＵ１４５へのＴｆＲｓｃＦｖリポソーム結合のＦＡＣＳ分析
【表５】
【００２７】
ｓｃＦｖリポソーム（Ｌｉｐ（Ａ）が、ローダミンＤＯＰＥで標識されている）とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧの後に抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いる間接的免疫蛍光染色によって、ＪＳＱ−３細胞へのｓｃＦｖ標識リポソーム複合体の結合を確認した。形質移入細胞において赤色および緑色蛍光の一致は、抗ＴfＲｓｃＦｖ（緑色蛍光としてＦＩＴＣ標識抗ｃ−ｍｙｃ抗体によって示される）が、細胞への直接的なローダミン標識Ｌｉｐ（Ａ）を示す。さらに、ｓｃＦｖ Ｌｉｐ（Ａ）システムに関する細胞性結合の高いレベルは、高い％の赤／緑二重陽性蛍光細胞によって示される。
【００２８】
実施例５
インビボでの標的細胞のｓｃＦｖイムノリポソーム介在遺伝子トランスフェクションの至適化
我々は、レポーター遺伝子としてβガラクトシダーゼを用いるＪＳＱ−３細胞における抗ＴｆＲｓｃＦｖＬｉｐ（Ａ）複合体のトランスフェクション効率を測定した。これらの研究において、使用したレポーター遺伝子構築物は、ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶｂ）制御下でβガラクトシダーゼ遺伝子を含み、その同じプロモーターをｐＣＭＶｐ５３に使用した（図３）。トランスフェクションした細胞におけるβＧｌａ発現レベル(トランスフェクション効率と相関する)は、βＧａｌ酵素アッセイで評価した（XuL, et al.,Hum. Gene Ther.(1997)8:467-475）。表３に示したように、抗ＴfＲｓｃＦｖのＬｉｐＡへの結合は、非標的化リポソーム複合体と比較すると、ｓｃＦｖ-Ｌｉｐ（Ａ）-ｐＣＭＶｂトランスフェクションした細胞における酵素活性が２倍であった。この発現レベルは、トランスフェリン自身を標的化リガンド(Ｔｆ-Ｌｉｐ（Ａ）-ｐＣＭＶｂ)として使用した場合に観察される発現レベルと視覚的に実際に同一であった。さらに、遺伝子発現における増加は、レポーター遺伝子ＤＮＡ用量依存性であることが示された。表４は、ＪＳＱ-３細胞におけるｓｃＦｖリポソーム介在トランスフェクションの至適化を示す。
表３：抗ＴｆＲ−リポソームによるＪＳＱ−３細胞のトランスフェクション
【表６】
表４：ＪＳＱ−３へのｓｃＦｖ−リポソームトランスフェクションの至適化
【表７】
【００２９】
実施例６
化学療法薬への感受性を生じる腫瘍細胞を標的とするｓｃＦｖイムノリポソーム介在ｐ５３遺伝子トランスフェクション
１．インビボにおけるリポソーム介在ｗｔｐ５３遺伝子トランスフェクションを促進した抗−ＴfＲｓｃＦｖ
抗ＴfＲ−ｓｃＦｖ標的化Ｌｉｐ(Ａ)−ｐ５３−３’Ａｄによって遺伝子移入したＪＳＱ−３腫瘍細胞における外来性ｗｔｐ５３の発現を、ｐ５３応答性プロモーターの制御の下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む発現プラスミド（ｐＢＰ１００）のトランスフェクションによって評価した（Chen L.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1998)95:195-200）。結果として、外来性ｗｔｐ５３の発現レベルが高くなると、ルシフェラーゼ活性のレベルも高かった。このルシフェラーゼ酵素活性は、相対的光単位(ＲＵＬ)として表現した。上記に示したように、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子と、Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄ複合体への標的化剤としての抗ＴｆＲｓｃＦｖの添加は、非標的化Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄ複合体を超えるトランスフェクション効率とｗｔｐ５３タンパク質の発現の大きな増加をもたらした（ルシフェラーゼ活性のＲＬＵによって表現される）。再び、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄトランスフェクション細胞におけるｐ５３発現レベルは、トランスフェリンそれ自身を、標的化リガンド（Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄ）として使用した場合に観察されたレベルと非常に類似する。そのため、これらの知見は、抗ＴｆＲ単鎖抗体方法が、腫瘍細胞への標的化カチオンリポソーム複合体を標的化し、生物学的に活性なｗｔｐ５３遺伝子を送達する有用な方法であることを示す。
表５：ＪＳＱ−３細胞での異なるリポソームによって仲介されたインビトロでのｐ５３発現
【表８】
【００３０】
２．抗ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム介在ｐ５３遺伝子修復は、腫瘍細胞をシスプラチン（ＣＤＤＰ）の細胞毒性に感受性とした
ｐ５３誘導アポトーシスの研究に対して、マウス黒色腫細胞系Ｂ１６を、２セットの６ウェルプレートに、５μｇのＤＮＡ／２×１０５細胞の用量で、ｐ５３−３’Ａｄ（図４）またはｐＣＭＶｐＲｏプラスミド（図３）ＤＮＡ（それぞれ、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３およびｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐＲｏ）との抗ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム複合体でトランスフェクションを行った。比較のために、トランスフェリン−リポソーム−ＤＮＡ（ＬｉｐＴ−ｐ５３もしくはＬＩｐＴ−ｐＲｏ）も、５μｇＤＮＡ／２×１０５細胞の用量で遺伝子移入した。２４時間後、ＣＤＤＰを、一組のプレートに、終濃度１０μｌまで添加した。薬物添加後の２４および４８時間、付着および浮遊細胞の両方を、アポトーシスの染色のために回収した。細胞を、製造元プロトコールに従って、アネキシン（Annexin）Ｖ−ＦＩＴＣキットで染色した（Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD）。アネキシンＶは、リポコルチンであり、天然に存在する血液タンパク質と抗凝固薬ある。染色細胞は、ＦＡＣＳｔａｒサイトメーター上で測定した（Becton and Dickinson）。表６は、アポトーシス分析の結果のまとめである。
表６：リポソームｐ５３遺伝子修復およびＣＤＤＰによって誘導されたＢ１６細胞のアポトーシス
【表９】
【００３１】
ＣＤＤＰを含まない場合、リポソーム複合体単独によって誘導される量と比較すると、ｓｃＦｖリガンドの添加によって２４時間でアポトーシス細胞％の増加はなかった。しかし、４８時間までには、リポプレックスへの標的化ｓｃＦｖの添加により、アポトーシス細胞％が、２倍以上に増加した。ＣＤＤＰを有する場合、非標的化リポソーム複合体と比較して、２４時間であってもアポトーシス細胞の顕著な増加があった（約１.５倍）。さらに重要なことは、ＣＤＤＰを併用したアポトーシス細胞の増加は、Ｔｆ分子自身を用いる以上に標的リガンドとしてＴｆ受容体にｓｃＦｖを使用すると、さらに顕著であった。この増加は、トランスフェクション効率と相関する。
【００３２】
実施例７
全身投与による、インビボにおけるｓｃＦｖイムノリポソーム標的化ｗｔｐ５３遺伝子の送達および発現
リポソームを含有する抗ＴｆＲｓｃＦｖの能力を試験するために、ｗｔｐ５３をインビボにおいて腫瘍細胞へ特異的に送達するために、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）ｐ５３−３’Ａｄ（図４）または非標的化Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３−３’Ａｄ（図４）を、ＪＳＱ−３皮下異種移植片の腫瘍細胞を有するヌード・マウスに静脈注射した。注射２日後、腫瘍細胞を摘出し、ウエスタン・ブロット分析のために肝臓および皮膚に加えて該腫瘍細胞からタンパク質を単離した（Xu L, et al., Hum. Gene Ther.(1997)8:467-475）。等量のタンパク質（１００μｇ、濃度によって決定する場合）を、各々のレーンに流した。図２に示したように、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）ｐ５３−３’Ａｄ複合体で全身的に処置したマウス由来の腫瘍（図２の標識ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３）は、非常に強いｐ５３シグナルを示し、外来性のｗｔｐ５３の高い発現レベルに関するさらに追加の低いバンド表示を示し、一方で、外来性マウスｐ５３の非常に低い発現が、皮膚おび肝臓の双方においてのみであることが明らかとなった。対照的に、我々の初期段階の結果を基に期待していたように、非常低いレベルの外来性ｐ５３発現が非標的化Ｌｉｐ（Ａ）ｐ５３−３’Ａｄ注入マウス、図２中の標識化Ｌｉｐ（Ａ）−ｐ５３から単離した腫瘍細胞において明らかである。すなわち、我々の新規でかつ独創的な抗ＴｆＲｌｐｐ−ｓｃＦｖリガンドによって標的化したリポソーム複合体は、外来性遺伝子を、インビボで腫瘍細胞に選択的に送達することができることは明らかである。これらの結果は、効率よく標的化する新規の方法の潜在性が、全身に、インビボで腫瘍に特異的にカチオンリポソーム複合体を送達したことを示すものである。
【００３３】
実施例８
接合（コンジュゲーション）法で使用するための３’システインを用いるＴｆＲｓｃＦｖの構築および精製
リピドタグの非存在下、別の方法を考案し、リポプレックスに精製ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質を結合した。このアプローチは、還元基、例えばメルカプト基によるカチオンリポソームへの単鎖タンパク質の接合を目的とする。好ましい態様において、システイン残基を、ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質の３’末端に付加する。このシステインの還元は、カチオンリポソームに接合し得る遊離のメルカプト基において生じ、すなわちトランスフェリン受容体を発現する細胞にリポプレックスを標的化するものである。一方、以下の実施例は、還元基としてシステインを用い、他の類似の還元基はこの方法で機能することもまた明らかである。
【００３４】
１．構築
Ａ．ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームを製造する接合法において使用するためにヒスチジンタグを有する３’システインを含む発現ベクターの構築
実施例１のように、ＴｆＲのためのＶＨ−リンカー−ＶκｓｃＦｖを、プラスミド発現ベクター、ｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫから得た（実施例１に記載）。ＰＣＲ増幅のための５’プライマー
【表１０】
を用いてＮｃｏＩ部位を、ｐＤＦＨ２Ｔ−vecＯＫに導入した。
システイン残基に対するヌクレオチド配列に加えてＮｏｔｌ制限部位を、３’プライマー
【表１１】
を使用して導入した。ＰＣＲ産物を、市販のベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）（Novagen）のＮｃｏＩおよびＮｏｔｌ部位にクローンした。このベクターは、ＮｃｏＩ部位の５’、ｐｅｌＢリーダーシグナル配列も含む。発現ベクター中のこの配列の存在は、ペリプラスミック（peliplasmic）スペースへのタンパク質の輸送を可能にする。該タンパク質の精製を助けるために、ｐＥＴ２６ｂ（＋）ベクターもＮｏｔｌ部位のヒスチジンタグ配列３’を含む（図５）。
【００３５】
Ｂ．ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームを製造する接合法で使用するためのヒスチジンタグを持たない３’システインを含む発現ベクターの構築
ヒトが治療用送達ビヒクルとして使用するためには、ヒスチジンタグなしにＴｆＲｓｃＦｖが製造されることが好ましい。故に、実施例８、セクション１．Ａ．において記載した該構築を、最終タンパク質生成物においてこのタグを排除するために修飾した。これを達成するために、上記（実施例８、セクション１.Ａ）に記載した同じ５’プライマーを使用した。しかし、異なる３’プライマーを用いた。システイン残基およびＮｏｔｌ制限部位に対するヌクレオチド配列に加えて、このプライマー
【表１２】
は、システイン配列の隣で、Ｎｏｔｌ部位の前にＤＮＡストップコドンを導入した（図６）。即ち、この構築物のタンパク質生成物は、ヒスチジンタグを含まない。
【００３６】
Ｃ．ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームを製造する接合法における使用のための５’ＣＢＤＴＭタグを有する３’システインを含む発現ベクターの構築
接合法を用いるカチオンリポプレックスと結合するためにシステイン残基を含む３つの選択的構築物も作製した。この構築物のために、実施例８、セクション１.Ｂにおいて上記記載の２つの同じプライマーを使用した（図７）。即ち、ヒスチジンタグは、タンパク質生成物中には存在しなかった。しかし、これらの反応のＰＣＲ産物を、異なるベクター、ｐＥＴ３７ｂ（＋）（Novagen）中にクローン化した。このベクターは、セルロース結合ドメインタグ（ＣＢＤＴＭタグ）とＳタグ（両方とも、ベクター中のＮｃｏｌ部位の５’）を含む。該ＣＢＤＴＭタグ配列は、ミクロバイアルセルロースから誘導されたセルロース結合ドメインをコードする。そのため、このタグの存在は、高い特異性、タンパク質生成物の低コストアフィニティー精製のためのセルロースベースの支持体の使用を可能にする。この構築物中に存在するＳタグの存在は、ウスタン・ブロットでのタンパク質生成物の簡単な検出、およびタンパク質量の簡単な酵素的定量を可能にする。
【００３７】
２．システイン残基を含有するＴｆＲｓｃＦｖの精製
発現したｌａｃリプレッサーを含む市販入手し得るＥ.coli発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）を、実施例８、セクション１に記載した発現ベクター（３つ全てを個々に用いた)で形質転換した。多くのクローンを選択し、最も収率よくＴｆＲｓｃＦｖ産生するものを選抜した。ヒスチジンタグを有する実施例８、セクション１.Ａにおいて、上記の構築物由来のタンパク質の精製は、実施例に詳細に記載するが、同じ方法を、実施例８、セクション１で記載した３つ全ての構築物由来のＴｆＲｓｃＦｖタンパク質を含有するシステインの精製に使用した。主要なＴｆＲｓタンパク質（約９０％）は、可溶性で存在するのではなく、封入体中に存在することが明らかとなった。そのため、システインリンカーを含有するＴｆＲｓｃＦｖを、以下のように封入体から精製した。単一クローンを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ培地（５〜１０ｍｌ）で培種し、３７℃、２５０ｒｐｍで、０.５〜０.７のＯＤ６００になるまで（４〜５時間）増殖させた。この少量の培養物の３０ｍｌを沈殿させ、ＬＢ培地（ブロス）で懸濁し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ培地（１Ｌ）に添加し、３７℃、２５０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０.５〜０.７になるまで（４〜５時間）増殖させた。ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質の発現を誘導するために、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧをこの時点で添加し、さらに４時間インキュベーションを継続した。この時点がタンパク質発現の最高レベルをもたらすことを決定した。次いで、バクテリア培養物を遠心分離で回収し、１５分間、３０℃で、リゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）を含有する２０ｍＭの冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５、１００ｍｌ）で溶解した。試料を、氷上、１０ワットで５分間（３０秒のバースト）音波処理した。この封入体を、遠心分離（１３０００ｇ、１５分間）で単離した。得られた沈殿物を、２０ｍＭの冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.５）で３回洗浄した。封入体の精製度と量を、可溶化前にＳＤＳポリアミドゲル電気泳動によって決定した。
【００３８】
単離した封入体を、６Ｍ グアニジン−ＨＣｌと２００ｍＭ ＮａＣｌ(６Ｍ ＧｕＨＣｌ緩衝溶液)を含有する１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）に溶解し、遠心分離（１２,３００ｇ、１５分間）を行い、不溶性堆積物を除去した。２−メルカプトエタノールを、タンパク質濃度の約５０モル倍に等しい終濃度まで上清に添加し、１時間、室温で回転させながらインキュベーションした。このような高濃度のグアニジン−ＨＣｌと還元剤の存在により、全く折りたたまれていないタンパク質が生じる。ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質の再折りたたみは、４℃で、透析を行って、２−メルカプトエタノールの非存在下、グアニジン−ＨＣｌ濃度を低下させて行った。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pＨ８.０)および２００ｍＭ ＮａＣｌ中:６Ｍ、３Ｍ、２Ｍ、１Ｍおよび０．５Ｍのグアニジン−ＨＣｌ濃度に対して各々、２４時間、透析を行った。最後の透析は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pＨ８.０)および２００ｍＭ ＮａＣｌを３回取り替えた。４回目の透析溶液（１Ｍ グアニジン−ＨＣｌ）は、２ｍＭ グルタチオン（酸化型）と５００ｍＭ Ｌ-アルギニンも含有する。これらの試薬は、部分的に再折りたたみされたタンパク質を適切なジスルフィド結合を形成させ、正しいタンパク質構造を形成させる。該溶液を、凝集物を除去するために遠心分離（１３０００ｇ）によって精製した。該試料を、遠心分離用フィルター（Centrplus centrifugal filter）（Amicon）を用いて、約１.５倍に濃縮した（３０００g、９０分間）。ＳＤＳ-ＰＡＧＥは、ほんの微々たる混在物しか含まない、約２８−３０ｋＤａの分子量を有するＴｆＲｓｃＦｖを含む可溶化システインの単一バンドを示した（図８）。
【００３９】
実施例９
接合法によるｓｃＦｖリポソームの調製
１．ｓｃＦｖの還元
精製したＴｆＲｓｃＦｖを、ＤＴＴにより還元し、モノマーｓｃＦｖ-ＳＨを以下のように得た：ＨＢＳ(１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４)中のｓｃＦｖに、１Ｍ ＤＴＴを、１〜５０ｍＭ の終濃度になるまで添加した。室温で、５〜１０分間の回転後、該タンパク質を、１０−ＤＧカラム（Bio-Read）で脱塩した。遊離ＳＨ基を５,５’ジチオビス−（２−ニトロベンゼン酸）（ＤＴＮＢ、Ｅllman's 試薬）によって測定し（G.L. Ellman (1959)Arch. Biochem. Biophys. 82:70-77. P.W.Riddles, R.L.Blakely, B.Zeruer(1993)Methods Enzymol. 91:49-60）、ＳＨ／タンパク質モル比もしくは遊離ＳＨ／ｓｃＦｖ分子の数として計算した（表７）。この結果は、１〜１０ｍＭＤＴＴが、ｓｃＦｖ還元に供されたことを示す。
表７：ＴｆＲｓｃＦｖの還元
【表１３】
【００４０】
２．リポソーム調製
４−（p−マレイミドフェニル）ブチレート−ＤＯＰＥ（ＭＰＢ−ＤＯＰＥ）（Avanti Polar Lipids）は、リピド総量の５〜８％モルまで、実施例３に記載した７つのリポソーム製剤中に包含される。ＭＰＢリポソームを、実施例３に記載したのと同じ方法で調製した。他のリポソーム調製方法を、カチオンリポソームを調製するために使用することができる。例えば、Campbell MJ (Biotechniques 1995 Jun; 18(6):1027-32)によって記載された方法から改良されたエタノール注射法は、本発明において上手く使用された。簡単に言うと、全てのリピドを、エタノール中に可溶化し、混合し、ハミルトン（Hamilton）シリンジを用いて、５０〜６０℃の純水中に撹拌しながら注入した。該溶液を、さらに１０〜１５分間、撹拌した。この溶液の終濃度は、１〜２ｍＭの全リピドであった。エタノール注入方法は、敏速かつ容易で確実である。終濃度１０〜２０ｍＭになるまで、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５（ｐＨ７.０〜８.０）を添加した。我々は、マレイミド基が水溶液中（ｐＨ７.０以上）で不安定であるとわかったので、該リポソームを、水（ｐＨ５〜６.５）中で調製した。ｐＨは、後の被覆反応を容易にするために、ｓｃＦｖ−ＳＨに結合する前に、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.０〜８.０）を用いて７.０〜８.０に調整されるはずである。
【００４１】
３．前結合法
ｓｃＦｖ−ＳＨを、１／５〜１／４０のタンパク質／リピド（ｗ／ｗ）比、好ましくは１／１０〜１／２０の比で、ＭＰＢ−リポソームに添加した。該溶液をゆっくりと、３０分間、室温で回転して混合し、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐを生成した。ｓｃＦｖ−Ｌｉｐを精製せずに使用したが、Sepharose CL-4Bカラムクロマトグラフィーで精製することが可能である。プラスミドＤＮＡを水で希釈し、１／６〜１／２０、好ましくは１／１０〜１／１４のＤＮＡ／リピド（μｇ／ｎｍｏｌ）比でｓｃＦｖ−Ｌｉｐに添加した。該溶液を、数回反転させて、５−１５分間充分に混合し、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ複合体を生成した。ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡは精製せずに使用したが、Sepharose CL-4Bカラムクロマトグラフィーで精製することが可能である。８０〜１００％のｓｃＦｖがリポソームに接合していたことが分かった。
【００４２】
Ｂ．後結合法
プラスミドＤＮＡを水で希釈し、１／６〜１／２０、好ましくは１／１０〜１／１４のＤＮＡ／リピド（μｇ／ｎｍｏｌ）比で、ＭＰＢリポソームに添加した。該溶液を、数回反転させて、５〜１５分間充分に混合し、ＭＰＢ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ複合体を生成した。次いで、ｓｃＦｖ−ＳＨを、該複合体に１／５〜１／４０、好ましくは１／１０〜１／２０のタンパク質／リピド（ｗ／ｗ）比で添加した。該溶液を、ゆっくりと、３０分間、室温で回転させて混合し、最終的なｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ複合体を生成した。該ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡは精製せずに使用したが、Sepharose CL-4Bカラムクロマトグラフィーで精製することが可能である。８０〜１００％のｓｃＦｖがリポソームに接合していたことが分かった。
４．静脈注射のために、５０％のデキストロース溶液を、終濃度５％までｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡに添加した。
【００４３】
実施例１０
ＥＬＩＳＡアッセイによるシステイン含有ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームの免疫反応活性
この実施例は、インビトロでのＴｆＲ（＋）細胞への結合能に関して、本発明の接合法によって生成した抗ＴｆＲｓｃＦｖ−イムノリポソームの特性化を提供する。ヒト扁平上皮細胞の頭頚部癌細胞系ＪＳＱ−３は、これらの研究に関してＴｆＲ（＋）標的細胞として機能する。
【００４４】
実施例４に記載したように、間接的細胞系酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、リポソームに結合する前後のＴｆＲｓｃＦｖ免疫反応活性を測定した。９６ウェルプレート中コンフルエントのＪＳＱ−３細胞を、ＰＢＳ中０.５％グルタルアルデヒドを用いて、１０分間、室温で固定した。該プレートを、ＰＢＳ中５％ウシ胎仔血清(ＦＢＳ）を用いて、３０℃で３０分間ブロッキングした。システイン含有ＴｆＲｓｃＦｖ単独、カチオンリポソームに接合したＴｆＲｓｃＦｖ（ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームおよび非標的化リポソームを、トリプリケートでウェルに添加した。抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体（Ｈｂ２１、David Fitzgerald, NIHから入手）を陽性対照として、一連のウェルに使用した。該プレートを、４℃で一晩インキュベーションした。該ウェルを、３回ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中３％ＦＢＳ中抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Qiagen）を各ウェルに添加し、６０分間３７℃でインキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳで希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Sigma）を、各ウェルに添加し、３０分間３７℃でインキュベーションした。該プレートを、ＰＢＳで３回洗浄し、クエン酸リン酸緩衝液(Sigma)中の０．４ｍｇ／ｍｌＯＰＤ基質(１００μｌ)を各ウェルに添加した。発色は、各ウェルに２Ｍ スルホン酸(１００μｌ)を添加して停止した。該プレートを、４９０ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダー(Molecular Devices Corp)によって測定した。
【００４５】
間接的細胞系ＥＬＩＳＡは、Ｃ末端システインを含有する抗ＴfＲ-ｓｃＦｖが、該免疫活性を保持することを明確に示した。ＯＤ４９０値は、タンパク質（０.６μｇ）で０.０６０±０.００３５から、ＴｆＲｓｃＦｖ（１.５μｇ）で０.１００±０.００３８およびＴｆＲｓｃＦｖ（３μｇ）で０.１３２±０.００３１までＴｆＲｓｃＦｖタンパク質量の増加と共に増加した。さらに、このＴfＲ-ｓｃＦｖタンパク質は、陽性対照として使用した親のＨｂ２１抗トランスフェリン受容体以上にさらに高い結合活性を示すことが分かった。Ｈｂ２１（１００μｌ）の最高濃度に関するＯＤ４９０は、約２〜４倍低い（０.０３３±０.００８６）。
【００４６】
間接的細胞系ＥＬＩＳＡアッセイは、異なる２つのリポソーム複合体（Ｌｉｐ（Ａ）およびＬｉｐ（Ｂ））中に本発明の接合方法（実施例９）によって同じＴｆＲｓｃＦｖタンパク質を組み込んだ後に実施し、カチオンリポソームを用いるこの方法の万能性を示す。実施例９において詳細に記載されたリポソーム調製物の前および後結合法の両方を用いた。表８に示したように、接合法によって調製したＴｆＲｓｃＦｖの免疫反応活性は、２つのリポソーム組成物の両方と複合体化することによって失わない。これは、イムノリポソーム複合体を作製するために使用した前および後結合法の両方に当てはまる。該ＴｆＲｓｃＦｖ標的化リポプレックスも、細胞に結合することが示された。この結合は、ＴｆＲｓｃＦｖを含まないリポソームの結合以上に非常に高く、実際、細胞のトランスフェリン受容体へのＴｆＲｓｃＦｖの結合によって仲介されると考えられる。
表８：インビトロでの接合法によるＪＳＱ−３へのＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームの結合
【表１４】
【００４７】
実施例１１
インビボにおける標的細胞の接合ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム介在遺伝子トランスフェクション
我々は、プラスミドｐＬuc（これは、レポーター遺伝子として、ＣＭＶプロモータの制御の下、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む）を用いる細胞における接合法によって調製したＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム複合体のインビトロでのトランスフェクション効率を決定した。標的リガンドとしてＴｆＲｓｃＦｖの万能性を示すために、ここでもまた実施例１０のように、２つの異なるリポソーム複合体（ＬＩｐ（Ａ）とＬｉｐ（Ｂ））を、ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質に接合した。ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５および頭および頚部のヒト扁平上皮瘍細胞を、これらの研究で使用した。インビボでのトランスフェクションを、２４ウェルプレートで行った（Xu L, et al., Hum. Gene Yher.(1999)10:2941-2952）。トランスフェクション溶液を、１０％の血清存在下、細胞に添加した。２４時間後、細胞を洗浄し、ルシフェラーゼ活性およびタンパク質濃度を測定した。該結果は、表９Ａおよび９Ｂに示したように、溶解物中のμｇタンパク質あたりの相対的光単位（ＲＬＵ）として表した。
【表１５】
【表１６】
【００４８】
上記結果は、接合法によって調製したシステイン含有ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームが、非標的化リポソームよりも３〜６倍高く、トランスフェリン標的化リポソームよりも２〜３倍高い、インビトロで非常に高いトランスフェクション活性を有することを示す。これは、両方のヒト腫瘍細胞系および両方のリポソーム組成物に当てはまる。即ち、それらは、その免疫反応活性を保持し、標的受容体に結合することができる。表９Ａを基にすると、ｓｃＦｖリポソームを、インビトロにおける効率的遺伝子トランスフェクション薬物として使用することができ、市販入手し得るカチオンリポソーム（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥおよびＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびトランスフェリンリポソームよりも効率が良かった。本発明で開示した該ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームは、トランスフェリン受容体を有する哺乳類細胞のトランスフェクションに有用なインビトロ遺伝子トランスフェクションキットのために使用することができる。
【００４９】
ＴｆＲｓｃＦｖは、トランスフェリン自体よりも小さな分子である。そのため、得られた複合体はよりコンパクトで、細胞によって簡単に取り込まれ、高いトランスフェクション効率を示す。これらの結果は、ヒトに使用するための全身送達のためのＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム使用の利点を示す。小さいサイズは、微小管からの腫瘍細胞へのアクセスを増加させた。最も重要なことは、ＴｆＲｓｃＦｖはヒト血液産物ではなく、ＴｆＲ分子である。そのため、ヒトの治療用のトランスフェリン自体の使用に関連する懸念および技術的問題は回避される。
【００５０】
実施例１２
ヌード・マウス異種移植片モデルにおける全身送達後の野生型ｐ５３の接合ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム介在発現
この実施例において、本発明の接合法によって生じた全身送達後にインビボで腫瘍細胞に優先的に野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）遺伝子を持つリポプレックスを指向するＴｆＲｓｃＦｖの能力を示す。標的リガンドとしてＴｆＲｓｃＦｖの万能性を示すために、明細書中の実施例１０に示したように、２つの別のリポソーム組成物（Ｌｉｐ（Ａ）およびＬｉｐ（Ｂ））を、接合法によってシステイン含有ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質と複合体化した。実施例９において詳細に説明したような前接合法だけを、この研究で用いた。２.５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌細胞を、４−６週令のメス無胸腺ヌード・マウスに皮下注射した。Martrigel(登録商標)コラーゲン基部膜[Collaborative Biomedical Produsts]中に懸濁した１.１×１０７ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞も、４−６週令のメス無胸腺ヌード・マウスに皮下注射し、腫瘍を発生させた。５０−２００ｍｍ３の腫瘍を持つ動物を本実験で使用した(１個体／１試験試料)。ｗｔｐ５３遺伝子を持つ接合ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソーム、さらに非標的化Ｌｉｐ（Ｂ）およびｗｔｐ５３本来の（naked）ＤＮＡを動物の尾血管中に静脈注射した。追加対照として、ｐ５３含有ベクターの代わりに空ベクターを保持する接合ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）を、マウスに注入した。実施例７に示したように、注射の約６０時間後、該動物を殺し、腫瘍、および肝臓を採取した。タンパク質を組織から単離し、各々の試料(１００μｇ)（タンパク質濃度アッセイにより決定した）を、抗５３モノクローナル抗体を用いるウエスタン・ブロット分析のために１０％ポリアクリルアミドゲルに流した。これら両方の腫瘍細胞のタイプでは、外来性マウスと外来性ヒトｐ５３は、同じ位置で移動する。明細書においてこの結果は、実施例７における記載を反映するものであった。図９に示したように、接合法によって調製したＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ａ）−ｐＣＭＶｐ５３リポプレクッスまたはＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ｂ）−ｐＣＭＶｐ５３リポプレックスによって静脈注射した動物由来のＤＵ１４５およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の両方は、ＤＵ１４５腫瘍細胞において最良の発現と共に、強いｐ５３シグナルとさらに低いバンドによって示されるような、外来性ｗｔｐ５３の高い発現レベルを示した。一方、両方の腫瘍細胞型において、Ｌｉｐ（Ａ)組成物はいくらかＬｉｐ（Ｂ）よりも良好であり、両方のリポソーム組成物はこの方法の万能性を示す。外来性マウスｐ５３タンパク質のみが、これらの動物の肝臓に顕性であった。対照的に、外来性マウスｐ５３タンパク質のみは、空のベクターを有する接合ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ（Ｂ）または本来のｗｔｐ５３ＤＮＡを用いて注入したマウスから取り出した腫瘍に顕性であった。また、ｐ５３の発現における若干の増加を、非標的化Ｌｉｐ（Ｂ）−ｐ５３と共にＤＵ１４５腫瘍において観察した。即ち、接合ＴｆＲｓｃＦｖイムノリポソームは、優先的に腫瘍細胞へｗｔｐ５３遺伝子を送達した。この腫瘍標的化は、２つの異なる腫瘍細胞において顕性であり、この発明の方法の広い有用性を示すことも重要である。そのため、実施例において記載した本発明の方法は、カチオンリポソームへの結合能を保持するだけでなく、インビボおよびインビトロにおいてもトランスフェリン受容体への結合能を保持するＴｆＲｓｃＦｖタンパク質を産生し、即ち、遺伝子治療用に、腫瘍特異性の、標的化イムノリポソームを作製する我々の目的を満たすものであった。
【００５１】
本発明は、本明細書中で、本発明の好ましい態様の詳細を引用して記載しているが、この記載は、本発明の精神および特許請求の範囲の範囲内で、修飾が当業者には容易になされるということが考えられるため、限定的意図よりむしろ説明的であることを意図することは理解されるべきである。
【００５２】
【表１７】
【００５３】
【表１８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)カチオンリポソーム、ii）抗体もしくは抗体フラグメント、およびiii)核酸を含むイムノリポソーム。
【請求項２】
該抗体もしくは抗体フラグメントがトランスフェリン受容体に結合し得る、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項３】
該核酸がＤＮＡである、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項４】
該核酸が野生型ｐ５３をコードする、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項５】
該抗体もしくは抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項６】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、該抗体もしくは抗体フラグメント上のカルボキシ末端でメルカプト基の一部であった硫黄原子を介して該カチオンリポソームに共有結合する、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項７】
該硫黄原子がシステイン残基の一部である、請求項６記載のイムノリポソーム。
【請求項８】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、ＭＰＢまたは別のメルカプト反応基に結合したＤＯＰＥと共有結合する、請求項６記載のイムノリポソーム。
【請求項９】
該抗体フラグメントが単鎖である、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項１０】
該抗体もしくは抗体フラグメントおよび該カチオンリポソームが、１：５〜１：４０の範囲内のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で存在する、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項１１】
該核酸および該カチオンリポソームが、１：６〜１：２０の範囲内の核酸：リピド比（μｇ：ｎｍｏｌ）で存在する、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項１２】
請求項１記載のイムノリポソームを含む医薬組成物。
【請求項１３】
以下の工程：
ａ）野生型ｐ５３をコードする核酸とカチオンリポソームを混合し、核酸リポソーム複合体を作製し；
ｂ）トランスフェリン受容体に結合し得る抗体もしくは抗体フラグメントを調製し；そして
ｃ）該核酸リポソーム複合体と該抗体もしくは抗体フラグメントを混合し、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体を形成する、
を含む核酸カチオンイムノリポソーム複合体を調製するための方法。
【請求項１４】
該抗体もしくは抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、該核酸リポソーム複合体と混合する前にカルボキシ末端で還元基を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
該還元基がメルカプト基である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該メルカプト基がシステイン残基の一部である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該カチオンリポソームがＭＰＢに結合したＤＯＰＥもしくは別のメルカプト反応基を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
該核酸がＤＮＡである、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
該抗体もしくは抗体フラグメントおよび該カチオンリポソームが、１：５〜１：４０の範囲内のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体中に存在する、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
該核酸および該カチオンリポソームが、１：６〜１：２０の範囲内の核酸：リピド比（μｇ：ｎｍｏｌ）で、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体中に存在する、請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
該抗体フラグメントが単鎖である、請求項１３記載の方法。
【請求項２３】
以下の工程：
ａ）トランスフェリン受容体に結合し得る抗体もしくは抗体フラグメントを調製し；
ｂ）該抗体もしくは抗体フラグメントとカチオンリポソームを混合し、カチオンイムノリポソームを形成し；そして
ｃ）該カチオンイムノリポソームと野生型ｐ５３をコードする核酸を混合し、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体を形成する；
を含む核酸カチオンイムノリポソーム複合体を調製するための方法。
【請求項２４】
該抗体もしくは抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、該核酸リポソーム複合体と混合する前にカルボキシ末端で還元基を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
該還元基がメルカプト基である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該メルカプト基がシステイン残基の一部である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該カチオンリポソームがＭＰＢ-ＤＯＰＥを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
該核酸がＤＮＡである、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
該抗体もしくは抗体フラグメントおよび該カチオンリポソームが、１：５〜１：４０の範囲内のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体中に存在する、請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
該核酸および該カチオンリポソームが、１：６〜１：２０の範囲の核酸：リピド比（μｇ：ｎｍｏｌ）で、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体中に存在する、請求項２３記載の方法。
【請求項３２】
該抗体フラグメントが単鎖である、請求項２３記載の方法。
【請求項３３】
治療分子を必要とする動物にそれを提供するための方法であって、i)カチオンリポソーム、ii）抗体もしくは抗体フラグメント、およびiii)核酸を含む治療上有効量の核酸カチオンイムノリポソーム複合体を、該動物に投与する方法。
【請求項３４】
該複合体が全身投与される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
該複合体が静脈投与される、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
該抗体もしくは抗体フラグメントがトランスフェリン受容体に結合し得る、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
該抗体フラグメントが単鎖である、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
該核酸がＤＮＡである、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
該核酸が野生型ｐ５３をコードする、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
該抗体もしくは抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、該抗体もしくは抗体フラグメント上のカルボキシ末端で還元基の一部である硫黄原子を介して該カチオンリポソームに共有結合する、請求項３３記載の方法。
【請求項４２】
該還元基がメルカプト基である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
該メルカプト基がシステイン残基の一部である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、ＭＰＢに結合したＤＯＰＥもしくは別のメルカプト反応基と共有結合する、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
該抗体もしくは抗体フラグメントおよび該カチオンリポソームが、１：５〜１：４０の範囲のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で、該核酸イムノリポソーム複合体中に存在する、請求項３３記載の方法。
【請求項４６】
該核酸および該カチオンリポソームが、１：６〜１：２０の範囲内の核酸：リピド比（μｇ：ｎｍｏｌ）で該核酸カチオンイムノリポソーム複合体中に存在する、請求項３３記載の方法。
【請求項４７】
該動物がヒトである、請求項３３記載の方法。
【請求項４８】
該動物が癌を有する、請求項３３記載の方法。
【請求項４９】
該癌が、ｉ）頭頚部癌、ii）乳癌、iii）前立腺癌からなる群から選択される、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
カチオンイムノリポソームが、トランスフェリン受容体結合抗体フラグメントを含む、カチオンイムノリポソームを含むキット。
【請求項５１】
該抗体フラグメントが単鎖である、請求項５０記載のキット。
【請求項５２】
該抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求項５０記載のキット。
【請求項５３】
該抗体フラグメントがカチオンリポソームに接合する、請求項５０記載のキット。
【請求項５４】
該抗体フラグメントおよびカチオンリピドが、１：５〜１：４０の範囲のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で存在する、請求項５０記載のキット。
【請求項５５】
該カチオンイムノリポソームが水溶液中に存在する、請求項５０記載のキット。
【請求項５６】
該カチオンイムノリポソームから分けた容器において陽性対照として使用するための核酸をさらに含む、請求項５０記載のキット。
【請求項５７】
該核酸がルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質からなる群から選択されるレポーター遺伝子をコードする、請求項５６記載のキット。
【請求項１】
i)カチオンリポソーム、ii）抗体もしくは抗体フラグメント、およびiii)核酸を含むイムノリポソーム。
【請求項２】
該抗体もしくは抗体フラグメントがトランスフェリン受容体に結合し得る、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項３】
該核酸がＤＮＡである、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項４】
該核酸が野生型ｐ５３をコードする、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項５】
該抗体もしくは抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項６】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、該抗体もしくは抗体フラグメント上のカルボキシ末端でメルカプト基の一部であった硫黄原子を介して該カチオンリポソームに共有結合する、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項７】
該硫黄原子がシステイン残基の一部である、請求項６記載のイムノリポソーム。
【請求項８】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、ＭＰＢまたは別のメルカプト反応基に結合したＤＯＰＥと共有結合する、請求項６記載のイムノリポソーム。
【請求項９】
該抗体フラグメントが単鎖である、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項１０】
該抗体もしくは抗体フラグメントおよび該カチオンリポソームが、１：５〜１：４０の範囲内のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で存在する、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項１１】
該核酸および該カチオンリポソームが、１：６〜１：２０の範囲内の核酸：リピド比（μｇ：ｎｍｏｌ）で存在する、請求項１記載のイムノリポソーム。
【請求項１２】
請求項１記載のイムノリポソームを含む医薬組成物。
【請求項１３】
以下の工程：
ａ）野生型ｐ５３をコードする核酸とカチオンリポソームを混合し、核酸リポソーム複合体を作製し；
ｂ）トランスフェリン受容体に結合し得る抗体もしくは抗体フラグメントを調製し；そして
ｃ）該核酸リポソーム複合体と該抗体もしくは抗体フラグメントを混合し、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体を形成する、
を含む核酸カチオンイムノリポソーム複合体を調製するための方法。
【請求項１４】
該抗体もしくは抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、該核酸リポソーム複合体と混合する前にカルボキシ末端で還元基を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
該還元基がメルカプト基である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該メルカプト基がシステイン残基の一部である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該カチオンリポソームがＭＰＢに結合したＤＯＰＥもしくは別のメルカプト反応基を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
該核酸がＤＮＡである、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
該抗体もしくは抗体フラグメントおよび該カチオンリポソームが、１：５〜１：４０の範囲内のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体中に存在する、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
該核酸および該カチオンリポソームが、１：６〜１：２０の範囲内の核酸：リピド比（μｇ：ｎｍｏｌ）で、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体中に存在する、請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
該抗体フラグメントが単鎖である、請求項１３記載の方法。
【請求項２３】
以下の工程：
ａ）トランスフェリン受容体に結合し得る抗体もしくは抗体フラグメントを調製し；
ｂ）該抗体もしくは抗体フラグメントとカチオンリポソームを混合し、カチオンイムノリポソームを形成し；そして
ｃ）該カチオンイムノリポソームと野生型ｐ５３をコードする核酸を混合し、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体を形成する；
を含む核酸カチオンイムノリポソーム複合体を調製するための方法。
【請求項２４】
該抗体もしくは抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、該核酸リポソーム複合体と混合する前にカルボキシ末端で還元基を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
該還元基がメルカプト基である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該メルカプト基がシステイン残基の一部である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該カチオンリポソームがＭＰＢ-ＤＯＰＥを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
該核酸がＤＮＡである、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
該抗体もしくは抗体フラグメントおよび該カチオンリポソームが、１：５〜１：４０の範囲内のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体中に存在する、請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
該核酸および該カチオンリポソームが、１：６〜１：２０の範囲の核酸：リピド比（μｇ：ｎｍｏｌ）で、該核酸カチオンイムノリポソーム複合体中に存在する、請求項２３記載の方法。
【請求項３２】
該抗体フラグメントが単鎖である、請求項２３記載の方法。
【請求項３３】
治療分子を必要とする動物にそれを提供するための方法であって、i)カチオンリポソーム、ii）抗体もしくは抗体フラグメント、およびiii)核酸を含む治療上有効量の核酸カチオンイムノリポソーム複合体を、該動物に投与する方法。
【請求項３４】
該複合体が全身投与される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
該複合体が静脈投与される、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
該抗体もしくは抗体フラグメントがトランスフェリン受容体に結合し得る、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
該抗体フラグメントが単鎖である、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
該核酸がＤＮＡである、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
該核酸が野生型ｐ５３をコードする、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
該抗体もしくは抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、該抗体もしくは抗体フラグメント上のカルボキシ末端で還元基の一部である硫黄原子を介して該カチオンリポソームに共有結合する、請求項３３記載の方法。
【請求項４２】
該還元基がメルカプト基である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
該メルカプト基がシステイン残基の一部である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該抗体もしくは抗体フラグメントが、ＭＰＢに結合したＤＯＰＥもしくは別のメルカプト反応基と共有結合する、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
該抗体もしくは抗体フラグメントおよび該カチオンリポソームが、１：５〜１：４０の範囲のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で、該核酸イムノリポソーム複合体中に存在する、請求項３３記載の方法。
【請求項４６】
該核酸および該カチオンリポソームが、１：６〜１：２０の範囲内の核酸：リピド比（μｇ：ｎｍｏｌ）で該核酸カチオンイムノリポソーム複合体中に存在する、請求項３３記載の方法。
【請求項４７】
該動物がヒトである、請求項３３記載の方法。
【請求項４８】
該動物が癌を有する、請求項３３記載の方法。
【請求項４９】
該癌が、ｉ）頭頚部癌、ii）乳癌、iii）前立腺癌からなる群から選択される、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
カチオンイムノリポソームが、トランスフェリン受容体結合抗体フラグメントを含む、カチオンイムノリポソームを含むキット。
【請求項５１】
該抗体フラグメントが単鎖である、請求項５０記載のキット。
【請求項５２】
該抗体フラグメントがリピドタグを含む、請求項５０記載のキット。
【請求項５３】
該抗体フラグメントがカチオンリポソームに接合する、請求項５０記載のキット。
【請求項５４】
該抗体フラグメントおよびカチオンリピドが、１：５〜１：４０の範囲のタンパク質：リピド比（ｗ：ｗ）で存在する、請求項５０記載のキット。
【請求項５５】
該カチオンイムノリポソームが水溶液中に存在する、請求項５０記載のキット。
【請求項５６】
該カチオンイムノリポソームから分けた容器において陽性対照として使用するための核酸をさらに含む、請求項５０記載のキット。
【請求項５７】
該核酸がルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質からなる群から選択されるレポーター遺伝子をコードする、請求項５６記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−１１５１６７（Ｐ２０１１−１１５１６７Ａ）
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−２８６３６６（Ｐ２０１０−２８６３６６）
【出願日】平成２２年１２月２２日（２０１０．１２．２２）
【分割の表示】特願２０００−６００６２０（Ｐ２０００−６００６２０）の分割
【原出願日】平成１２年２月２２日（２０００．２．２２）
【出願人】（５９４１４０９１５）ジョージタウン・ユニバーシティ (11)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＯＲＧＥＴＯＷＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【出願人】（５０１２０１７２０）シナージーン・セラピューティックス・インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＳｙｎｅｒＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８６３６６（Ｐ２０１０−２８６３６６）
【出願日】平成２２年１２月２２日（２０１０．１２．２２）
【分割の表示】特願２０００−６００６２０（Ｐ２０００−６００６２０）の分割
【原出願日】平成１２年２月２２日（２０００．２．２２）
【出願人】（５９４１４０９１５）ジョージタウン・ユニバーシティ (11)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＯＲＧＥＴＯＷＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【出願人】（５０１２０１７２０）シナージーン・セラピューティックス・インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＳｙｎｅｒＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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