再狭窄の治療
【課題】血管再狭窄の予防または治療法の提供。
【解決手段】ビスホスホネート（ＢＰ）、ピロリン酸塩（ＰＰ）、ＢＰもしくはＰＰの複合体、ＢＰもしくはＰＰのポリマー、またはそれらの薬学的に許容し得る塩もしくはエステルを用いた、静脈内投与（i.v.）、筋肉内投与（i.m.）、又は皮下投与（s.c.）による、血管再狭窄の予防または治療。ビスホスホネート、ピロリン酸塩、ビスホスホネートのポリマー鎖及びピロリン酸塩のポリマー鎖からなる群から選択され、かつ不活性ポリマー粒子に埋め込まれている活性成分を含む製剤を包含する、血管再狭窄の予防又は治療用ステント。
【解決手段】ビスホスホネート（ＢＰ）、ピロリン酸塩（ＰＰ）、ＢＰもしくはＰＰの複合体、ＢＰもしくはＰＰのポリマー、またはそれらの薬学的に許容し得る塩もしくはエステルを用いた、静脈内投与（i.v.）、筋肉内投与（i.m.）、又は皮下投与（s.c.）による、血管再狭窄の予防または治療。ビスホスホネート、ピロリン酸塩、ビスホスホネートのポリマー鎖及びピロリン酸塩のポリマー鎖からなる群から選択され、かつ不活性ポリマー粒子に埋め込まれている活性成分を含む製剤を包含する、血管再狭窄の予防又は治療用ステント。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の属する技術分野］
本発明は、再狭窄（この分野において、ときには「促進性動脈硬化症（accelerated arteriosclerosis）」および「後血管形成狭窄（post-angioplasty narrowing）」とよばれる）を予防、阻害または減ずることができる化合物に関する。
【０００２】
［先行技術］
以下の参考文献は、本発明の背景を理解するために適切である。
1. Waller, B.F., Orr, C.M, VanTassel J., et al. Clin-Cardiol. 20(2):153-60,(1997).
2. Anderson, W.D, King, S.Br., Curr-Opin-Cardiol., 11(6):583-90,(1996).
3. Moorman, D.L., Kruyer, W.B., Jackson, W.G., Aviat-Space-Environ-Med. 67(10):990-6,(1996).
4. Laurent S, Vanhoutte P, CaveroI, et al., Fundam. Clin. Pharmacol., 10(3):243-57,(1996).
5. Walsh, K., Perlman, Semin-Interv-Cardiol., 1(3):173-9,(1996).
6. Schwartz, R.S., Semin-Interv-Cardiol., 2(2):83-8,(1997).
7. Allaire, E, Clowes, A.W. Ann. Thorac. Surg., 63:582-591,(1997).
8. Hamon. M., Bauters, C., McFadden, E.P, et al., Eur. Heart J., 16:33s-48s,(1995).
9. Gottsauner-Wolf, M., Moliterno, D.J, Lincoff, A.M., Topol, E.J., Clin. Cardiol., 19:347-356,(1996).
10. Herrman, J.P.R., Hermans, W.R.M., Vos, J., Serruys, P.W., Drugs, 46:18-52,(1993).
11. Leclerc, G., Voisine, P., Bouchard, M., Fleser, A., Martel, R. Elsevier Science, 722-724,(1995).
12. Topol, E., The NY Academy of Sciences, 225-277,(1997).
13. Fleisch, H., in: Bisphosphonatesin bone disease. Parthenon Publishing Group Inc., pp. 184-186(1997).
14. Moenkkoenen, J., Taskinen, M., Auriola, S., Urtti, J. Drug Target, 2:299-308,(1994).
15. Kramsche, D.M., and Chan, C.T., Circ. Res., 42:562-572,(1978).
16. Braunwald, E. Heart Disease in: A textbook of cardiovascular medicine; 5th Ed., W.B. Saunders Company: Philadelphia,(1997).
17. Gennaro Alfonso, R. Remington, in: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing, Easton PA, 19th ed.,(1995).
18. Moenkkoenen, J., and Heath, T.D., Calcif. Tissue Int., 53:139-145,(1993).
19. M. Donbrow in: Microencapsulationand Nanoparticles in Medicine and Pharmacy, CRC Press, Boca Raton, FL,p.347.
前記参考文献は、前記リストのナンバーを示す（括弧で示されている）ことによって、以下の本文中で知ることができるであろう。
【０００３】
［発明の背景］
過去１０年以上で、閉塞した動脈硬化の血管の血管再生を達成する機械的手段は、非常に改善されてきた。経皮的管腔透過性冠状動脈血管再生（percutaneous transluminal coronary angioplasty）（PTCA）法は、バルーン膨張、切除じゅく種切開（excisional atherectomy）、口径内ステント、腐敗切除（rotablation）およびレーザー切除を含むが、これらに限定されない。しかしながら、血管再生は、成功したバルーン血管再生後に冠状動脈の重要部分において、および大動脈冠状（aortacoronary）伏在静脈バイパス移植および他の冠状動脈移植において、再狭窄をつづいて生じさせる血栓形成および新生血管内膜の過形成を誘導する。さらには、動脈内膜の過形成は、多くの表面大腿部の血管形成、頸動脈血管内膜切除（carotid endarterectomies）および大腿端部静脈バイパス（femoro-distal vein bypasses）において再狭窄を生じさせる。血管内ステントの採用は再狭窄の発生率減少に寄与してきたが、今なおこの問題は重大である(1〜9)。現在までの、ヒトおよび動物モデルにおける該発生率、タイミング、機構および薬理学的な介入に関する広範な研究にもかかわらず、冠状動脈の再狭窄を一貫して予防する治療法は存在しない(10〜12)。再狭窄の減少または予防のための組成物および方法は、現在なお非常に望まれている。
【０００４】
ビスホスホネート（bisphosphonate）（ＢＰ）（以前はジホスホネートとよばれた）は、２つのＣ−Ｐ結合により特徴付けられる化合物である。その２つの結合が同じ炭素原子に位置する（Ｐ−Ｃ−Ｐ）と、それらはジェミナルビスホスホネートとよばれる。該ＢＰは、骨の形成および吸収の制御に関連する内生無機ピロリン酸塩のアナログである。用語ビスホスホネートは、一般に、ジェミナルおよび非ジェミナルビスホスホネートに使用する。該ＢＰおよびピロリン酸塩は、ときに、ともにポリマー鎖を形成し得る。ＢＰは、それらの骨のミネラルへの親和性から骨に作用し、骨吸収および異所性の石灰化の強力な阻害剤である。ＢＰまたはピロリン酸塩は、臨床で主に（ａ）増加された骨の破壊、とくにパジェット病、腫瘍骨疾患（tumor bone disease）および骨粗しょう症の患者における抗骨溶解薬（antiosteolytic agent）；（ｂ）診断目的の骨格マーカー（99mＴｃに結合される）；（ｃ）異所性の石灰化および骨化の患者における石灰化の阻害剤、ならびに（ｄ）練り歯磨きに添加される抗歯石薬として使用されてきた(13)。
【０００５】
［発明の要旨］
本発明によると、ＢＰまたはピロリン酸塩（本明細書中ではまとめて：「活性成分」）は、血管の治療または予防のために使用される。本明細書において使用される用語ビスホスホネート（ＢＰ）は、ジェミナルおよび非ジェミナルビスホスホネートを意味する。用語「活性成分」は、その範囲内に、ＢＰまたはピロリン酸塩のポリマー鎖、とくに４０以下のＢＰモノマーからなるような鎖をも包含する。好ましい活性成分は以下の式（Ｉ）：
【０００６】
【化４】
【０００７】
式中、ＲはＯまたはＣＲ1Ｒ2基；
Ｒ1はＨ、ＯＨまたはハロゲン基；および
Ｒ2はハロゲン；アミノが１級、２級または３級であるヘテロアリールもしくは複素環のＣ1〜Ｃ10アルキルアミノまたはＣ3〜Ｃ8シクロアルキルアミノにより任意に置換される直鎖もしくは分岐鎖のＣ1〜Ｃ10アルキルまたはＣ2〜Ｃ10アルケニル；Ｙが水素、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールである−ＮＨＹ、；またはＲ2はＺが塩素置換フェニルまたはピリジニルである−ＳＺ；で表わされる化合物である。
【０００８】
したがって、本発明は、血管再狭窄（vascular restenosis）の予防または治療のための医薬を製造するための、該活性成分、該活性成分の複合体またはその薬学的に許容し得る塩もしくはエステルの用途を提供する。
【０００９】
本発明はまた、該活性成分、その複合体またはその薬学的に許容し得る塩もしくはエステルの有効量を、必要とする個体（individual）に投与することからなる再狭窄の治療法を提供する。
【００１０】
さらに本発明は、任意に薬学的に許容し得る担体または希釈薬とともに、活性成分として、有効量の該活性成分、その薬学的に許容し得る遊離酸、複合体または塩を含有する、再狭窄の予防または治療のための医薬的な組成物を提供する。とくに好ましい担体は、リポソーム製剤である。
【００１１】
用語「有効量」は、所望の治療結果、すなわち血管再狭窄の予防または減少、を達成する際に効果的な活性成分の量を意味することを意図する。有効量は、治療を受ける個体の体重および性；医療手段のタイプ、たとえば、抑制すべき血管再狭窄がバルーン血管形成、すなわちステントを採用したのちのバルーン形成、のあとかどうかなど；活性成分の投与方式（すなわち、活性成分が全身に、または部位に直接的に投与されるかどうか）；使用される担体のタイプ（たとえば、担体が活性成分を速やかに放出する担体であるか、または時間をかけて放出するかどうか）；治療体制（たとえば、活性成分が毎日１回、１日数回または数日毎に１回投与されるかどうか）；糖尿病、喫煙、抗コレステロール血症、腎臓病などのように再狭窄の発現率に影響する臨床的な要因；危険な血管再生前（preangioplasty）の狭窄、全体の閉塞（total occlusion）、左頭部下垂冠状動脈部、伏在静脈移植病巣、多管もしくは多病巣PTCAがあるかどうかという解剖学的要因；組成物の剤形を含む多数の要因などに依存する。さらには、手順の変化は、PTCAに続くより大きな未解決の狭窄、危険な切開、血管内膜の裂傷、バルーンの適当な大きさおよび血栓の存在のような投薬にも関係するかもしれない。それぞれの場合における有効量を決定する際には、ルーチン型の実験により、技術者（artisan）は、実質的な困難を有さないであろう。
【００１２】
本発明は、血管再狭窄および主に、しかし限定はされないが、血管形成後の冠動脈の再狭窄の予防、減少または治療に適用することができる。血管移植狭窄に起因する（たとえば、バイパス手術につづく）再狭窄と同様に、血管再狭窄は、バルーン血管形成、血管内ステント注入または他の経皮的な血管形成法（冠動脈、頸動脈および血管形成にかかわる他の血管の血管形成を含む）を含む様々な血管形成手順に起因する(16)。さらに、本発明はまた、末梢の動脈および静脈における血管再狭窄の予防、減少または治療への使用に適用することができる。
【００１３】
本発明の典型的な適用は、ステントでの再狭窄（in-stentrestenosis）の予防および治療である。血管壁を支えるために、血管形成手段に、フレームワーク（framework）内の血管内にステントを配置することは、広く許容し得る医療手段である。しかしながら、血管内のステントの存在にもかかわらず、再狭窄は非常に頻繁に生じる。本発明によると、このような再狭窄を予防または阻害するために、前記活性成分は全身または部位に直接的に投与されてもよい。潜在的に、該活性成分は、実際に該活性成分の部位への直接的な投与を与えるステントに取り込ませる方法で処方してもよい。活性成分はその方法で、たとえばステントのコーティングに活性成分を含ませることにより、処方されてもよい。コーティングの例は、たとえばポリウレタンまたはゲルでつくられるポリマーコーティングである。
【００１４】
本発明により、使用される活性成分は、当業者に既知のあらゆる従来技術により、医薬的な組成物中に処方されてよい（実施例参照、アルホンソ（Alfonso）ら、１９９５(17)）。組成物は、ステントなどのような医療装置のコーティングとして（前記参照）、カプセル、錠剤、エアロゾル、液剤、懸濁剤などの様々な剤形で製造されてよい。くわえて、本発明の医薬的な組成物は、担体を用いる局所投与に適した剤形で、または全身に作用させるために、皮膚をとおして活性成分を体内に浸透させる送達形態で処方してもよい。それぞれの場合における好ましい投与様式は、患者の状態、患者が受ける他の治療の処置などにより、通常、最も生理的に適合性があるものである所望の送達様式に依存する。本発明の好ましい実施態様によると、該活性成分は粒子状の形態で処方される。これは、粒子、たとえばポリマー粒子、脂質小胞またはリポソームの中に、活性成分を包みこむことまたは含浸させることにより達成されてもよい。さらに、このような粒子は重合された活性成分の粒子であってよい（以下参照）。とくに好ましくは、該活性成分のリポソーム製剤である。このリポソームは、当分野で知られるいかなる方法によって製造されてもよい（リポソーム製造法に関しては、ミョンキョネン（Moenkkoenen）ら、１９９４年(14)およびミョンキョネン(18)参照）。リポソームは正に荷電、中性または負に荷電してもよく（一般に、負に荷電したリポソームが好ましい）、単層または多重ラメラであってよい。ときには、遊離活性成分（すなわち非被包性）およびリポソームに包み込まれた該活性成分の組み合わせからなる組成物を、使用してもよい。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様により、活性成分は、細胞内代謝を受けることができる化合物の群から選択されるのが好ましい。この群に対する１つの好ましい活性成分は、以下の式（II）：
【００１６】
【化５】
【００１７】
を有する化合物クロドロネート(13)である。
【００１８】
クロドロネートは、腫瘍関連骨溶解（tumor associated osteolysis）の治療の弊害に起因する高カルシウム血症の治療に使用するため(13)、およびマクロファージの阻害剤として、以前に記載された(14、18)。
【００１９】
このグループの他の好ましい活性成分は、それぞれ以下の式（III)および(IV)：
【００２０】
【化６】
【００２１】
を有するエチドロネート（Etidronate）およびチルドロネート（Tiludronate）である。
【００２２】
本発明によると、クロドロネートと同様の活性を有する追加のＢＰも好ましい。このようなＢＰは、クロドロネートの生物活性に似たそれらの能力に基いて選択してもよい。これは、たとえば：食細胞、たとえばマクロファージおよび線維芽細胞の食作用活性を阻害する際のインビトロ（in vitro）活性；マクロファージからのＩＬ−１および／またはＩＬ−６および／またはＴＮＦ−αの分泌の阻害；インビボ（in vivo）活性、たとえば、試験されるＢＰの、たとえば、以下の実施例１記載のラットもしくはウサギの頸動脈カテーテル傷害モデル、または狭窄のブタモデルのような、実験動物モデルにおける狭窄を予防または減じる能力；などを含む。
【００２３】
本発明による活性成分の他の好ましい群は、以下の一般式（Ｖ）を有するアミノ−ＢＰおよび他の窒素含有ＢＰであり、
【００２４】
【化７】
【００２５】
式中、ＸはＣ1〜Ｃ10アルキルアミノもしくはＣ3〜Ｃ8シクロアルキルアミノ、ここでアミノは１級、２級または３級でよく；またはＸは、Ｙが水素、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであるＮＨＹをあらわす。
【００２６】
この群に属するＢＰは、代謝されないと信じられており、比較的低濃度でインターロイキンＩＬ−１の分泌を誘導すること、および比較的高濃度でマクロファージにおいてアポトーシスを引き起こすことが示されている(18)。この群に属する好ましいＢＰは、たとえば、以下の式（VI）および（VII）をそれぞれ有するパミドロネートおよびアレンドロネートである。
【００２７】
【化８】
【００２８】
本発明による好ましいＢＰはジェミナルＢＰであるが、非ジェミナルＢＰ、ホスホネートとして一般によばれるＢＰのモノホスホネートもまた、本発明による活性成分として使用してよい。
【００２９】
ほかの好ましい活性成分は式（VIII）：
【００３０】
【化９】
【００３１】
を有するピロリン酸塩である。
【００３２】
好ましくは、ピロリン酸塩は、リポソームまたはポリマー粒子製剤にて処方および投与する。
【００３３】
本発明の組成物は、カルシウム、マグネシウムのような金属陽イオンまたは有機塩基と錯体を形成した遊離酸形態、または塩もしくはエステルの形態のいずれで該活性成分を含んでもよく、それらは４０モノマー以下のポリマーを生ずるために重合されてよい。塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウムもしくはカルシウム塩または他の適当な塩基性陽イオン（たとえば有機アミノ化合物）と形成される塩でよい。塩またはポリマーは、約０．０１〜１０μｍの範囲内、好ましくは約０．１〜５μｍの範囲内の直径を有する微紛化された微粒子であってよい。遊離酸形態または塩形態である本発明の組成物における活性成分は、結晶水を有してもまたは有しなくてもよい（水和性および無水性）。
【００３４】
好ましい態様により、活性成分は、当分野で知られるあらゆる方法によって製造されるリポソーム内に包まれる。本発明によると、適当なリポソームは、無毒性リポソーム、たとえば以下に記載したような、たとえばホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールおよびコレステロールから製造されるものが好ましい。多くの場合において、リポソームに包まれた活性成分の使用は、細胞によりエンドサイトーシスを介して活性成分の取り込みを促進する結果となる(14、18)（このような取り込みは治療効果においてある役割を果たすかもしれない）。以下の実施例にて使用されるリポソームの直径は、０．１５から３００ｎｍの間であった。しかしながら、これは限定するものではなく単なる例であり、他のサイズ範囲のリポソームも使用してよい。
【００３５】
さらに、活性成分は、たとえば、当業者に既知のあらゆるマイクロカプセル、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、ミクロスフェア、微粒子などのような、不活性のポリマー粒子に包まれてもよく、または埋め込まれてもよい(19)。このような粒子からの活性成分の放出は制御された放出であり、ある場合においては、該活性成分の効果および取り込みを延長および促進する結果となる。
【００３６】
本発明の組成物に使用される薬学的な担体または希釈剤は、当分野で知られる従来のいずれの固体または液体の担体であってもよい。固体の担体は、たとえば、ラクトース、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天などであってよい。担体が液体の担体であるとき、担体は、たとえば、落花生油、リン脂質、水などであってよい。固体の担体が経口投与に使用される場合、組成物は錠剤の剤形、ハードカプセルの剤形（たとえばゼラチンカプセル）、散剤の剤形またはペレット剤の剤形でよい。液体の担体が使用される場合、製剤は、シロップ剤、乳剤、リポソーム、軟セラチンカプセル、またはリポソーム製剤、水性もしくは非水性の液体懸濁剤もしくは液剤のような無菌の注射可能な液剤の剤形でよい(17)。
【００３７】
注射に使用される本発明の組成物は、適当な添加剤を含有する乳剤、液剤、懸濁剤、コロイド状の液剤などでよい。
【００３８】
本発明の組成物は、作用に適当なまたは所望の部位に、活性化合物を効果的に輸送するあらゆる経路により、投与されてよい。本発明の好ましい実施態様により、投与様式は、静脈内（i.v.）および動脈内（i.a.）である（とくに、オンライン（on-line）投与に適する）。投与の他の様式は、筋肉内（i.m.）または皮下（s.c.）を含む。このような投与は、ボーラス注射または注入でよい。組成物は、動脈の病的部位に、たとえば当分野で知られる適当な分泌／滲出バルーン（oozing／sweaing balloon）により、局所的に投与してもよい。投与の他の様式は、脈管周囲性（perivascular）送達、バルーンもしくはステントに関する送達システムのコーティング、または当分野で知られる心血管の薬物送達システムのあらゆる他の手段であってよい。本発明によると、投与の前記経路のいかなる組み合わせも、使用してよい。
【００３９】
また、使用される活性成分の服用量は、使用した活性成分の特異的な活性、投与様式（たとえば、全身投与または局所的な送達）、活性成分の形態（たとえば、活性成分が薬物のかたちであるか、ポリマーのかたちであるか、活性成分がリポソームのような微粒子に包まれているかなど）、およびそれ自体が知られている他の因子に依存する。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様によると、活性成分での個体の治療は、狭窄が生じる前にそれを予防する目的であってよい。予防のために、活性成分は、処置上の投与の前、間または後の組み合わせだけでなく、血管再生法の前、該手法の間または該手法の後にも個体に投与されてよい。
【００４１】
本発明の他の実施態様によると、活性成分は、再狭窄を減じるまたは治療する目的で、再狭窄に苦しむ個体に投与される。このような場合、活性成分は、再狭窄が明らかになった後に、さまざまな期間で、単独または他の種類の治療と組み合わせて個体に投与されてもよい。
【００４２】
さらに、活性成分は、該手法が状態のさらなる進行を阻害しはじめた直後のみならず、促進性動脈硬化症を生じさせるあらゆる状態の前に投与されてもよい。
【００４３】
［実施例］
ここで本発明を、添付の図面を参照しながら非限定的な実施例で論証する。
【００４４】
実施例１
材料および方法
クロドロネートのリポソーム
クロドロネートの保存溶液を、０．１１Ｍの濃度、ｐＨ＝７で脱イオン水に該薬物を溶解することにより製造した。
【００４５】
リポソーム製剤
ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）３８．９ｍｇ、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）１１８．５ｍｇおよびコレステロール３８．７ｍｇを正確に量り、丸底バイアルにて、クロロホルム：メタノール（９：１）２０ｍｌに溶解させた。該バイアルを穏かに温めた。ついで、該溶媒をロータベイパー（rotavapor）にて蒸発させた。ついで、水和ジイソプロピルエーテル（hydrated diisopropylether）２０ｍｌを添加し、内容物が溶解するまでウォーターバスに置いた。ついで、前記のように製造されたクロドロネート溶液８ｍｌを添加し、該溶液を５５℃にて４５分間超音波処理した。ついで、ロータベイパー（５５℃、１００ｒｐｍ）にて有機相を蒸発させた。同様に、ほかの薬物含有リポソームを製造することができる。
【００４６】
製造したリポソームの精製
セファデックスゲルは、２．６ｇｒのセファデックスＧ−５０を水４０ｍｌに溶解させることにより製造し、一晩安定させた。カラムを緩衝液（５０ｍＭ Ｍｅｓ＋５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌですすいだ。該リポソームをカラムにかけ、該カラムに該緩衝液を流した。該リポソームは、その色により、カラムにとどまるバンドとして観察される。それぞれのチューブにカラムから約２０滴を集めた。
【００４７】
動物
動物を購入し、エルサレム（Jerusalem）のヘブル（Hebrew）大学の実験動物の世話および使用の基準にしたがって、エルサレムのヘブル大学医学部の動物舎に収容した。体重３５０〜４２０ｇのサブラ株（Sabra strain）の雄ラットを使用した。動物は、標準の実験用の餌および任意になま水を与えられた。すべてのインビボ実験は、i.p.で投与された８０ｍｇ／ｋｇケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇキシラジン（xylazine）で成し遂げられる一般的な麻酔のもとでなされた。
【００４８】
ラット頸動脈のカテーテル障害モデル
末梢左総および外頸動脈を、首中央切開により露出させた。左総頸動脈は、外頸動脈から導入された２Ｆバルーンカテーテルの管腔通過により、内皮をはぎ取られた。該カテーテルは、わずかな抵抗を発生させるために生理食塩水により充分に膨張させたバルーンとともに３回通させた。ついで該カテーテルを取り除き、外頸動脈を結紮して、傷を外科的なステープルでとじた。
【００４９】
７匹のラットをコントロール群として、６匹のラットを処置群として（任意に選択）供した。動脈の損傷１日前に、リポソームクロドロネートを「処置群」に静脈注射し（ラット当たりクロドロネート６ｍｇ）、６日目に繰り返した。コントロール群においては、「空の」リポソーム（クロドロネートなし）を用いた以外は同様の注射を投与した。
【００５０】
すべての動物を、ペントバルビタールの服用過多による傷害後１４日で犠牲にした。動脈は、１００ｍｍＨｇでｐＨ７．４の４％ホルムアルデヒド溶液１５０ｍｌで潅流−固定した。右の動脈を切開し、潅流システムに連結した１８Ｇカテーテルを左心室に挿入した。該動脈部分を切開し、切断し、緩やかにポリマーから分離して、少なくとも４８時間、同じ固定液で後固定（postfixed）した。動脈部分をパラフィンに埋め込み、６００μｍ離れて８〜１０の位置で切断し、６μｍの部分を取り付け、ヒスタロッグ試験（histalogic examination）のためにバーヘフ弾性染色法で染色した。
【００５１】
形態測定分析
スライドは、実験群のタイプを知らない調査員により、微視的に検査された。それぞれのスライドにおける６から８部分を、コンピュータ化された形態測定分析により評価し、さらに、平均した部分のデータ（avarager section data）を、群間の比較のために全スライドの典型として使用した。残りの管腔、内部の弾性膜（elastic lamina）により区切られた該領域（元の管腔）、および外側の弾性膜により囲まれた領域（全動脈領域）を、直接測定した。新内膜が厚くなる程度を、新内膜の領域と元の管腔との割合（狭窄％）、および中膜（media）の領域に対する新内膜の領域の割合（Ｎ／Ｍ）として表わした。中膜領域（medial area）、すなわち、ＳＭＣ生存能力の間接指標は、全動脈領域と元の管腔領域との間の差として決定した。
【００５２】
結果
外科的手法および処置は、動物の死亡または明らかな病的状態を生じさせなかった。
【００５３】
図１にみられるように、リポソームに包み込まれたクロドロネートによる処置ののち、平均の新内膜の形成および平均中膜に対する新内膜の比（Ｎ／Ｍ）の程度は、著しく減じられた。クロドロネート処置ラットにおいて、Ｎ／Ｍ比は、コントロール群における１．４２±０．２６と比較し、０．２８±０．２３であった（平均±ＳＤ、ｐ＜０．０１）。同様に図２においてみられるように、狭窄％の著しい阻害が処置群において達成された：処置およびコントロール群それぞれ９．８±７．７６対４１．５３±７．９（平均±ＳＤ、ｐ＜０．０１）。図３にみられるように、明らかな系統だった副作用や体成長（somatic growth）における任意の作用はなかった。
【００５４】
結論：クロドロネート含有リポソームでのラットの処置は、頸動脈のバルーンによる傷害（balloon-injury）に続く新内膜形成としてみられる再狭窄を著しく減少させた。
【００５５】
実施例２
材料および手法
リポソームのクロドロネート注射の抗再狭窄効果を、バルーンにより傷つけられたラットおよびアテローム硬化症のウサギの頸動脈モデルにおいて研究した。ラットをクロドロネート含有リポソーム、空のリポソーム（コントロール）、および溶液中のクロドロネート（追加のコントロール）により処置した。注射されたクロドロネートの用量は１．５および１５ｍｇ／ｋｇであり、手順の１日前（−１）および／または損傷ののち６日後（＋６）に投与した。ウサギは、（３０日間のアテローム硬化症食（atherosclerotic diet）に続き）バルーン血管形成の１日前に、リポソームのクロドロネート（１０ｍｇ／ｋｇ）により処置した。管腔、新内膜、中膜および血管領域ならびに体積は、ラットおよびウサギのモデルそれぞれにおいて、組織部分のデジタル面積計（digital planimetry）により、処置およびコントロール動物群において、傷害後１４および３０日に測定された。
【００５６】
結果
つぎの表１に結果を示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
見られるように、著しい新内膜形成を示す空のリポソームと溶液中の遊離したクロドロネートでの処置に著しい差はみられなかった（表参照）。平均新内膜形成の範囲、平均の中膜に対する新内膜（Ｎ／Ｍ）の比、およびクロドロネートを含むリポソーム（clodronate-laden liposomes）での処置に続く狭窄％が、著しく減じられた。中膜領域は、休止細胞において有害な影響を示さない様々な処置によって影響されなかった。さらには、明らかな全身の副作用や、骨および体成長における作用はなかった。意味深いことに、１×１５ｍｇ／ｋｇ（−１）および２×１５ｍｇ／ｋｇ（−１および＋６）注射は、より強力な処置であり、それらのあいだに著しい差はない。有害作用のない同様の成果が、ウサギの研究において観察された。リポソームのクロドロネートは、新内膜形成および狭窄％の減少に関し、著しい効果があった。
【００５９】
シリカ粒子の注射もまた、内膜形成を減じた（表１）。この効果は、マクロファージにおけるシリカの既知の阻害効果に起因すると考えられる。
【００６０】
これらの結果は、ラットおよびウサギの両モデルにおいて、クロドロネート含有リポソームによる処置がバルーンによる傷害ののちの新内膜形成を著しく減じることを示す。明らかな全身性および局所的副作用や体成長における作用はなかった。ＢＰは骨に影響することが知られるが、クロドロネートのリポソーム製剤での処置後、骨や骨中のカルシウムおよびリンのレベルにおける作用は観察されなかった。
【００６１】
図１〜３は、実験用ラットの頸動脈カテーテル傷害モデルに関し、同種のラットにおけるクロドロネートを含有しないコントロールリポソームの効果と比較して、再狭窄の減少に対するリポソームに包まれたクロドロネートの効果を示す結果の棒グラフである。これらの図において：
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、コントロールリポソームで治療したラットと比較して、クロドロネート含有リポソームで治療したラットにおける媒体率（media ratio）に対する平均管腔初期形成および平均新生血管内膜の程度を示す図である。
【図２】図２は、コントロールリポソームで治療したラットにおける狭窄の％と比較して、クロドロネート含有リポソームで治療したラットにおける狭窄の％を示す図である。
【図３】図３は、コントロールリポソームのみで治療したラットと比較し、クロドロネート含有リポソームで治療したラットにおいて、平滑筋細胞の生存能力の間接的な指標となり、全動脈領域と元の管腔領域とのあいだの差として測定された中側領域の範囲を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の属する技術分野］
本発明は、再狭窄（この分野において、ときには「促進性動脈硬化症（accelerated arteriosclerosis）」および「後血管形成狭窄（post-angioplasty narrowing）」とよばれる）を予防、阻害または減ずることができる化合物に関する。
【０００２】
［先行技術］
以下の参考文献は、本発明の背景を理解するために適切である。
1. Waller, B.F., Orr, C.M, VanTassel J., et al. Clin-Cardiol. 20(2):153-60,(1997).
2. Anderson, W.D, King, S.Br., Curr-Opin-Cardiol., 11(6):583-90,(1996).
3. Moorman, D.L., Kruyer, W.B., Jackson, W.G., Aviat-Space-Environ-Med. 67(10):990-6,(1996).
4. Laurent S, Vanhoutte P, CaveroI, et al., Fundam. Clin. Pharmacol., 10(3):243-57,(1996).
5. Walsh, K., Perlman, Semin-Interv-Cardiol., 1(3):173-9,(1996).
6. Schwartz, R.S., Semin-Interv-Cardiol., 2(2):83-8,(1997).
7. Allaire, E, Clowes, A.W. Ann. Thorac. Surg., 63:582-591,(1997).
8. Hamon. M., Bauters, C., McFadden, E.P, et al., Eur. Heart J., 16:33s-48s,(1995).
9. Gottsauner-Wolf, M., Moliterno, D.J, Lincoff, A.M., Topol, E.J., Clin. Cardiol., 19:347-356,(1996).
10. Herrman, J.P.R., Hermans, W.R.M., Vos, J., Serruys, P.W., Drugs, 46:18-52,(1993).
11. Leclerc, G., Voisine, P., Bouchard, M., Fleser, A., Martel, R. Elsevier Science, 722-724,(1995).
12. Topol, E., The NY Academy of Sciences, 225-277,(1997).
13. Fleisch, H., in: Bisphosphonatesin bone disease. Parthenon Publishing Group Inc., pp. 184-186(1997).
14. Moenkkoenen, J., Taskinen, M., Auriola, S., Urtti, J. Drug Target, 2:299-308,(1994).
15. Kramsche, D.M., and Chan, C.T., Circ. Res., 42:562-572,(1978).
16. Braunwald, E. Heart Disease in: A textbook of cardiovascular medicine; 5th Ed., W.B. Saunders Company: Philadelphia,(1997).
17. Gennaro Alfonso, R. Remington, in: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing, Easton PA, 19th ed.,(1995).
18. Moenkkoenen, J., and Heath, T.D., Calcif. Tissue Int., 53:139-145,(1993).
19. M. Donbrow in: Microencapsulationand Nanoparticles in Medicine and Pharmacy, CRC Press, Boca Raton, FL,p.347.
前記参考文献は、前記リストのナンバーを示す（括弧で示されている）ことによって、以下の本文中で知ることができるであろう。
【０００３】
［発明の背景］
過去１０年以上で、閉塞した動脈硬化の血管の血管再生を達成する機械的手段は、非常に改善されてきた。経皮的管腔透過性冠状動脈血管再生（percutaneous transluminal coronary angioplasty）（PTCA）法は、バルーン膨張、切除じゅく種切開（excisional atherectomy）、口径内ステント、腐敗切除（rotablation）およびレーザー切除を含むが、これらに限定されない。しかしながら、血管再生は、成功したバルーン血管再生後に冠状動脈の重要部分において、および大動脈冠状（aortacoronary）伏在静脈バイパス移植および他の冠状動脈移植において、再狭窄をつづいて生じさせる血栓形成および新生血管内膜の過形成を誘導する。さらには、動脈内膜の過形成は、多くの表面大腿部の血管形成、頸動脈血管内膜切除（carotid endarterectomies）および大腿端部静脈バイパス（femoro-distal vein bypasses）において再狭窄を生じさせる。血管内ステントの採用は再狭窄の発生率減少に寄与してきたが、今なおこの問題は重大である(1〜9)。現在までの、ヒトおよび動物モデルにおける該発生率、タイミング、機構および薬理学的な介入に関する広範な研究にもかかわらず、冠状動脈の再狭窄を一貫して予防する治療法は存在しない(10〜12)。再狭窄の減少または予防のための組成物および方法は、現在なお非常に望まれている。
【０００４】
ビスホスホネート（bisphosphonate）（ＢＰ）（以前はジホスホネートとよばれた）は、２つのＣ−Ｐ結合により特徴付けられる化合物である。その２つの結合が同じ炭素原子に位置する（Ｐ−Ｃ−Ｐ）と、それらはジェミナルビスホスホネートとよばれる。該ＢＰは、骨の形成および吸収の制御に関連する内生無機ピロリン酸塩のアナログである。用語ビスホスホネートは、一般に、ジェミナルおよび非ジェミナルビスホスホネートに使用する。該ＢＰおよびピロリン酸塩は、ときに、ともにポリマー鎖を形成し得る。ＢＰは、それらの骨のミネラルへの親和性から骨に作用し、骨吸収および異所性の石灰化の強力な阻害剤である。ＢＰまたはピロリン酸塩は、臨床で主に（ａ）増加された骨の破壊、とくにパジェット病、腫瘍骨疾患（tumor bone disease）および骨粗しょう症の患者における抗骨溶解薬（antiosteolytic agent）；（ｂ）診断目的の骨格マーカー（99mＴｃに結合される）；（ｃ）異所性の石灰化および骨化の患者における石灰化の阻害剤、ならびに（ｄ）練り歯磨きに添加される抗歯石薬として使用されてきた(13)。
【０００５】
［発明の要旨］
本発明によると、ＢＰまたはピロリン酸塩（本明細書中ではまとめて：「活性成分」）は、血管の治療または予防のために使用される。本明細書において使用される用語ビスホスホネート（ＢＰ）は、ジェミナルおよび非ジェミナルビスホスホネートを意味する。用語「活性成分」は、その範囲内に、ＢＰまたはピロリン酸塩のポリマー鎖、とくに４０以下のＢＰモノマーからなるような鎖をも包含する。好ましい活性成分は以下の式（Ｉ）：
【０００６】
【化４】
【０００７】
式中、ＲはＯまたはＣＲ1Ｒ2基；
Ｒ1はＨ、ＯＨまたはハロゲン基；および
Ｒ2はハロゲン；アミノが１級、２級または３級であるヘテロアリールもしくは複素環のＣ1〜Ｃ10アルキルアミノまたはＣ3〜Ｃ8シクロアルキルアミノにより任意に置換される直鎖もしくは分岐鎖のＣ1〜Ｃ10アルキルまたはＣ2〜Ｃ10アルケニル；Ｙが水素、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールである−ＮＨＹ、；またはＲ2はＺが塩素置換フェニルまたはピリジニルである−ＳＺ；で表わされる化合物である。
【０００８】
したがって、本発明は、血管再狭窄（vascular restenosis）の予防または治療のための医薬を製造するための、該活性成分、該活性成分の複合体またはその薬学的に許容し得る塩もしくはエステルの用途を提供する。
【０００９】
本発明はまた、該活性成分、その複合体またはその薬学的に許容し得る塩もしくはエステルの有効量を、必要とする個体（individual）に投与することからなる再狭窄の治療法を提供する。
【００１０】
さらに本発明は、任意に薬学的に許容し得る担体または希釈薬とともに、活性成分として、有効量の該活性成分、その薬学的に許容し得る遊離酸、複合体または塩を含有する、再狭窄の予防または治療のための医薬的な組成物を提供する。とくに好ましい担体は、リポソーム製剤である。
【００１１】
用語「有効量」は、所望の治療結果、すなわち血管再狭窄の予防または減少、を達成する際に効果的な活性成分の量を意味することを意図する。有効量は、治療を受ける個体の体重および性；医療手段のタイプ、たとえば、抑制すべき血管再狭窄がバルーン血管形成、すなわちステントを採用したのちのバルーン形成、のあとかどうかなど；活性成分の投与方式（すなわち、活性成分が全身に、または部位に直接的に投与されるかどうか）；使用される担体のタイプ（たとえば、担体が活性成分を速やかに放出する担体であるか、または時間をかけて放出するかどうか）；治療体制（たとえば、活性成分が毎日１回、１日数回または数日毎に１回投与されるかどうか）；糖尿病、喫煙、抗コレステロール血症、腎臓病などのように再狭窄の発現率に影響する臨床的な要因；危険な血管再生前（preangioplasty）の狭窄、全体の閉塞（total occlusion）、左頭部下垂冠状動脈部、伏在静脈移植病巣、多管もしくは多病巣PTCAがあるかどうかという解剖学的要因；組成物の剤形を含む多数の要因などに依存する。さらには、手順の変化は、PTCAに続くより大きな未解決の狭窄、危険な切開、血管内膜の裂傷、バルーンの適当な大きさおよび血栓の存在のような投薬にも関係するかもしれない。それぞれの場合における有効量を決定する際には、ルーチン型の実験により、技術者（artisan）は、実質的な困難を有さないであろう。
【００１２】
本発明は、血管再狭窄および主に、しかし限定はされないが、血管形成後の冠動脈の再狭窄の予防、減少または治療に適用することができる。血管移植狭窄に起因する（たとえば、バイパス手術につづく）再狭窄と同様に、血管再狭窄は、バルーン血管形成、血管内ステント注入または他の経皮的な血管形成法（冠動脈、頸動脈および血管形成にかかわる他の血管の血管形成を含む）を含む様々な血管形成手順に起因する(16)。さらに、本発明はまた、末梢の動脈および静脈における血管再狭窄の予防、減少または治療への使用に適用することができる。
【００１３】
本発明の典型的な適用は、ステントでの再狭窄（in-stentrestenosis）の予防および治療である。血管壁を支えるために、血管形成手段に、フレームワーク（framework）内の血管内にステントを配置することは、広く許容し得る医療手段である。しかしながら、血管内のステントの存在にもかかわらず、再狭窄は非常に頻繁に生じる。本発明によると、このような再狭窄を予防または阻害するために、前記活性成分は全身または部位に直接的に投与されてもよい。潜在的に、該活性成分は、実際に該活性成分の部位への直接的な投与を与えるステントに取り込ませる方法で処方してもよい。活性成分はその方法で、たとえばステントのコーティングに活性成分を含ませることにより、処方されてもよい。コーティングの例は、たとえばポリウレタンまたはゲルでつくられるポリマーコーティングである。
【００１４】
本発明により、使用される活性成分は、当業者に既知のあらゆる従来技術により、医薬的な組成物中に処方されてよい（実施例参照、アルホンソ（Alfonso）ら、１９９５(17)）。組成物は、ステントなどのような医療装置のコーティングとして（前記参照）、カプセル、錠剤、エアロゾル、液剤、懸濁剤などの様々な剤形で製造されてよい。くわえて、本発明の医薬的な組成物は、担体を用いる局所投与に適した剤形で、または全身に作用させるために、皮膚をとおして活性成分を体内に浸透させる送達形態で処方してもよい。それぞれの場合における好ましい投与様式は、患者の状態、患者が受ける他の治療の処置などにより、通常、最も生理的に適合性があるものである所望の送達様式に依存する。本発明の好ましい実施態様によると、該活性成分は粒子状の形態で処方される。これは、粒子、たとえばポリマー粒子、脂質小胞またはリポソームの中に、活性成分を包みこむことまたは含浸させることにより達成されてもよい。さらに、このような粒子は重合された活性成分の粒子であってよい（以下参照）。とくに好ましくは、該活性成分のリポソーム製剤である。このリポソームは、当分野で知られるいかなる方法によって製造されてもよい（リポソーム製造法に関しては、ミョンキョネン（Moenkkoenen）ら、１９９４年(14)およびミョンキョネン(18)参照）。リポソームは正に荷電、中性または負に荷電してもよく（一般に、負に荷電したリポソームが好ましい）、単層または多重ラメラであってよい。ときには、遊離活性成分（すなわち非被包性）およびリポソームに包み込まれた該活性成分の組み合わせからなる組成物を、使用してもよい。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様により、活性成分は、細胞内代謝を受けることができる化合物の群から選択されるのが好ましい。この群に対する１つの好ましい活性成分は、以下の式（II）：
【００１６】
【化５】
【００１７】
を有する化合物クロドロネート(13)である。
【００１８】
クロドロネートは、腫瘍関連骨溶解（tumor associated osteolysis）の治療の弊害に起因する高カルシウム血症の治療に使用するため(13)、およびマクロファージの阻害剤として、以前に記載された(14、18)。
【００１９】
このグループの他の好ましい活性成分は、それぞれ以下の式（III)および(IV)：
【００２０】
【化６】
【００２１】
を有するエチドロネート（Etidronate）およびチルドロネート（Tiludronate）である。
【００２２】
本発明によると、クロドロネートと同様の活性を有する追加のＢＰも好ましい。このようなＢＰは、クロドロネートの生物活性に似たそれらの能力に基いて選択してもよい。これは、たとえば：食細胞、たとえばマクロファージおよび線維芽細胞の食作用活性を阻害する際のインビトロ（in vitro）活性；マクロファージからのＩＬ−１および／またはＩＬ−６および／またはＴＮＦ−αの分泌の阻害；インビボ（in vivo）活性、たとえば、試験されるＢＰの、たとえば、以下の実施例１記載のラットもしくはウサギの頸動脈カテーテル傷害モデル、または狭窄のブタモデルのような、実験動物モデルにおける狭窄を予防または減じる能力；などを含む。
【００２３】
本発明による活性成分の他の好ましい群は、以下の一般式（Ｖ）を有するアミノ−ＢＰおよび他の窒素含有ＢＰであり、
【００２４】
【化７】
【００２５】
式中、ＸはＣ1〜Ｃ10アルキルアミノもしくはＣ3〜Ｃ8シクロアルキルアミノ、ここでアミノは１級、２級または３級でよく；またはＸは、Ｙが水素、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであるＮＨＹをあらわす。
【００２６】
この群に属するＢＰは、代謝されないと信じられており、比較的低濃度でインターロイキンＩＬ−１の分泌を誘導すること、および比較的高濃度でマクロファージにおいてアポトーシスを引き起こすことが示されている(18)。この群に属する好ましいＢＰは、たとえば、以下の式（VI）および（VII）をそれぞれ有するパミドロネートおよびアレンドロネートである。
【００２７】
【化８】
【００２８】
本発明による好ましいＢＰはジェミナルＢＰであるが、非ジェミナルＢＰ、ホスホネートとして一般によばれるＢＰのモノホスホネートもまた、本発明による活性成分として使用してよい。
【００２９】
ほかの好ましい活性成分は式（VIII）：
【００３０】
【化９】
【００３１】
を有するピロリン酸塩である。
【００３２】
好ましくは、ピロリン酸塩は、リポソームまたはポリマー粒子製剤にて処方および投与する。
【００３３】
本発明の組成物は、カルシウム、マグネシウムのような金属陽イオンまたは有機塩基と錯体を形成した遊離酸形態、または塩もしくはエステルの形態のいずれで該活性成分を含んでもよく、それらは４０モノマー以下のポリマーを生ずるために重合されてよい。塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウムもしくはカルシウム塩または他の適当な塩基性陽イオン（たとえば有機アミノ化合物）と形成される塩でよい。塩またはポリマーは、約０．０１〜１０μｍの範囲内、好ましくは約０．１〜５μｍの範囲内の直径を有する微紛化された微粒子であってよい。遊離酸形態または塩形態である本発明の組成物における活性成分は、結晶水を有してもまたは有しなくてもよい（水和性および無水性）。
【００３４】
好ましい態様により、活性成分は、当分野で知られるあらゆる方法によって製造されるリポソーム内に包まれる。本発明によると、適当なリポソームは、無毒性リポソーム、たとえば以下に記載したような、たとえばホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールおよびコレステロールから製造されるものが好ましい。多くの場合において、リポソームに包まれた活性成分の使用は、細胞によりエンドサイトーシスを介して活性成分の取り込みを促進する結果となる(14、18)（このような取り込みは治療効果においてある役割を果たすかもしれない）。以下の実施例にて使用されるリポソームの直径は、０．１５から３００ｎｍの間であった。しかしながら、これは限定するものではなく単なる例であり、他のサイズ範囲のリポソームも使用してよい。
【００３５】
さらに、活性成分は、たとえば、当業者に既知のあらゆるマイクロカプセル、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、ミクロスフェア、微粒子などのような、不活性のポリマー粒子に包まれてもよく、または埋め込まれてもよい(19)。このような粒子からの活性成分の放出は制御された放出であり、ある場合においては、該活性成分の効果および取り込みを延長および促進する結果となる。
【００３６】
本発明の組成物に使用される薬学的な担体または希釈剤は、当分野で知られる従来のいずれの固体または液体の担体であってもよい。固体の担体は、たとえば、ラクトース、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天などであってよい。担体が液体の担体であるとき、担体は、たとえば、落花生油、リン脂質、水などであってよい。固体の担体が経口投与に使用される場合、組成物は錠剤の剤形、ハードカプセルの剤形（たとえばゼラチンカプセル）、散剤の剤形またはペレット剤の剤形でよい。液体の担体が使用される場合、製剤は、シロップ剤、乳剤、リポソーム、軟セラチンカプセル、またはリポソーム製剤、水性もしくは非水性の液体懸濁剤もしくは液剤のような無菌の注射可能な液剤の剤形でよい(17)。
【００３７】
注射に使用される本発明の組成物は、適当な添加剤を含有する乳剤、液剤、懸濁剤、コロイド状の液剤などでよい。
【００３８】
本発明の組成物は、作用に適当なまたは所望の部位に、活性化合物を効果的に輸送するあらゆる経路により、投与されてよい。本発明の好ましい実施態様により、投与様式は、静脈内（i.v.）および動脈内（i.a.）である（とくに、オンライン（on-line）投与に適する）。投与の他の様式は、筋肉内（i.m.）または皮下（s.c.）を含む。このような投与は、ボーラス注射または注入でよい。組成物は、動脈の病的部位に、たとえば当分野で知られる適当な分泌／滲出バルーン（oozing／sweaing balloon）により、局所的に投与してもよい。投与の他の様式は、脈管周囲性（perivascular）送達、バルーンもしくはステントに関する送達システムのコーティング、または当分野で知られる心血管の薬物送達システムのあらゆる他の手段であってよい。本発明によると、投与の前記経路のいかなる組み合わせも、使用してよい。
【００３９】
また、使用される活性成分の服用量は、使用した活性成分の特異的な活性、投与様式（たとえば、全身投与または局所的な送達）、活性成分の形態（たとえば、活性成分が薬物のかたちであるか、ポリマーのかたちであるか、活性成分がリポソームのような微粒子に包まれているかなど）、およびそれ自体が知られている他の因子に依存する。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様によると、活性成分での個体の治療は、狭窄が生じる前にそれを予防する目的であってよい。予防のために、活性成分は、処置上の投与の前、間または後の組み合わせだけでなく、血管再生法の前、該手法の間または該手法の後にも個体に投与されてよい。
【００４１】
本発明の他の実施態様によると、活性成分は、再狭窄を減じるまたは治療する目的で、再狭窄に苦しむ個体に投与される。このような場合、活性成分は、再狭窄が明らかになった後に、さまざまな期間で、単独または他の種類の治療と組み合わせて個体に投与されてもよい。
【００４２】
さらに、活性成分は、該手法が状態のさらなる進行を阻害しはじめた直後のみならず、促進性動脈硬化症を生じさせるあらゆる状態の前に投与されてもよい。
【００４３】
［実施例］
ここで本発明を、添付の図面を参照しながら非限定的な実施例で論証する。
【００４４】
実施例１
材料および方法
クロドロネートのリポソーム
クロドロネートの保存溶液を、０．１１Ｍの濃度、ｐＨ＝７で脱イオン水に該薬物を溶解することにより製造した。
【００４５】
リポソーム製剤
ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）３８．９ｍｇ、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）１１８．５ｍｇおよびコレステロール３８．７ｍｇを正確に量り、丸底バイアルにて、クロロホルム：メタノール（９：１）２０ｍｌに溶解させた。該バイアルを穏かに温めた。ついで、該溶媒をロータベイパー（rotavapor）にて蒸発させた。ついで、水和ジイソプロピルエーテル（hydrated diisopropylether）２０ｍｌを添加し、内容物が溶解するまでウォーターバスに置いた。ついで、前記のように製造されたクロドロネート溶液８ｍｌを添加し、該溶液を５５℃にて４５分間超音波処理した。ついで、ロータベイパー（５５℃、１００ｒｐｍ）にて有機相を蒸発させた。同様に、ほかの薬物含有リポソームを製造することができる。
【００４６】
製造したリポソームの精製
セファデックスゲルは、２．６ｇｒのセファデックスＧ−５０を水４０ｍｌに溶解させることにより製造し、一晩安定させた。カラムを緩衝液（５０ｍＭ Ｍｅｓ＋５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌですすいだ。該リポソームをカラムにかけ、該カラムに該緩衝液を流した。該リポソームは、その色により、カラムにとどまるバンドとして観察される。それぞれのチューブにカラムから約２０滴を集めた。
【００４７】
動物
動物を購入し、エルサレム（Jerusalem）のヘブル（Hebrew）大学の実験動物の世話および使用の基準にしたがって、エルサレムのヘブル大学医学部の動物舎に収容した。体重３５０〜４２０ｇのサブラ株（Sabra strain）の雄ラットを使用した。動物は、標準の実験用の餌および任意になま水を与えられた。すべてのインビボ実験は、i.p.で投与された８０ｍｇ／ｋｇケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇキシラジン（xylazine）で成し遂げられる一般的な麻酔のもとでなされた。
【００４８】
ラット頸動脈のカテーテル障害モデル
末梢左総および外頸動脈を、首中央切開により露出させた。左総頸動脈は、外頸動脈から導入された２Ｆバルーンカテーテルの管腔通過により、内皮をはぎ取られた。該カテーテルは、わずかな抵抗を発生させるために生理食塩水により充分に膨張させたバルーンとともに３回通させた。ついで該カテーテルを取り除き、外頸動脈を結紮して、傷を外科的なステープルでとじた。
【００４９】
７匹のラットをコントロール群として、６匹のラットを処置群として（任意に選択）供した。動脈の損傷１日前に、リポソームクロドロネートを「処置群」に静脈注射し（ラット当たりクロドロネート６ｍｇ）、６日目に繰り返した。コントロール群においては、「空の」リポソーム（クロドロネートなし）を用いた以外は同様の注射を投与した。
【００５０】
すべての動物を、ペントバルビタールの服用過多による傷害後１４日で犠牲にした。動脈は、１００ｍｍＨｇでｐＨ７．４の４％ホルムアルデヒド溶液１５０ｍｌで潅流−固定した。右の動脈を切開し、潅流システムに連結した１８Ｇカテーテルを左心室に挿入した。該動脈部分を切開し、切断し、緩やかにポリマーから分離して、少なくとも４８時間、同じ固定液で後固定（postfixed）した。動脈部分をパラフィンに埋め込み、６００μｍ離れて８〜１０の位置で切断し、６μｍの部分を取り付け、ヒスタロッグ試験（histalogic examination）のためにバーヘフ弾性染色法で染色した。
【００５１】
形態測定分析
スライドは、実験群のタイプを知らない調査員により、微視的に検査された。それぞれのスライドにおける６から８部分を、コンピュータ化された形態測定分析により評価し、さらに、平均した部分のデータ（avarager section data）を、群間の比較のために全スライドの典型として使用した。残りの管腔、内部の弾性膜（elastic lamina）により区切られた該領域（元の管腔）、および外側の弾性膜により囲まれた領域（全動脈領域）を、直接測定した。新内膜が厚くなる程度を、新内膜の領域と元の管腔との割合（狭窄％）、および中膜（media）の領域に対する新内膜の領域の割合（Ｎ／Ｍ）として表わした。中膜領域（medial area）、すなわち、ＳＭＣ生存能力の間接指標は、全動脈領域と元の管腔領域との間の差として決定した。
【００５２】
結果
外科的手法および処置は、動物の死亡または明らかな病的状態を生じさせなかった。
【００５３】
図１にみられるように、リポソームに包み込まれたクロドロネートによる処置ののち、平均の新内膜の形成および平均中膜に対する新内膜の比（Ｎ／Ｍ）の程度は、著しく減じられた。クロドロネート処置ラットにおいて、Ｎ／Ｍ比は、コントロール群における１．４２±０．２６と比較し、０．２８±０．２３であった（平均±ＳＤ、ｐ＜０．０１）。同様に図２においてみられるように、狭窄％の著しい阻害が処置群において達成された：処置およびコントロール群それぞれ９．８±７．７６対４１．５３±７．９（平均±ＳＤ、ｐ＜０．０１）。図３にみられるように、明らかな系統だった副作用や体成長（somatic growth）における任意の作用はなかった。
【００５４】
結論：クロドロネート含有リポソームでのラットの処置は、頸動脈のバルーンによる傷害（balloon-injury）に続く新内膜形成としてみられる再狭窄を著しく減少させた。
【００５５】
実施例２
材料および手法
リポソームのクロドロネート注射の抗再狭窄効果を、バルーンにより傷つけられたラットおよびアテローム硬化症のウサギの頸動脈モデルにおいて研究した。ラットをクロドロネート含有リポソーム、空のリポソーム（コントロール）、および溶液中のクロドロネート（追加のコントロール）により処置した。注射されたクロドロネートの用量は１．５および１５ｍｇ／ｋｇであり、手順の１日前（−１）および／または損傷ののち６日後（＋６）に投与した。ウサギは、（３０日間のアテローム硬化症食（atherosclerotic diet）に続き）バルーン血管形成の１日前に、リポソームのクロドロネート（１０ｍｇ／ｋｇ）により処置した。管腔、新内膜、中膜および血管領域ならびに体積は、ラットおよびウサギのモデルそれぞれにおいて、組織部分のデジタル面積計（digital planimetry）により、処置およびコントロール動物群において、傷害後１４および３０日に測定された。
【００５６】
結果
つぎの表１に結果を示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
見られるように、著しい新内膜形成を示す空のリポソームと溶液中の遊離したクロドロネートでの処置に著しい差はみられなかった（表参照）。平均新内膜形成の範囲、平均の中膜に対する新内膜（Ｎ／Ｍ）の比、およびクロドロネートを含むリポソーム（clodronate-laden liposomes）での処置に続く狭窄％が、著しく減じられた。中膜領域は、休止細胞において有害な影響を示さない様々な処置によって影響されなかった。さらには、明らかな全身の副作用や、骨および体成長における作用はなかった。意味深いことに、１×１５ｍｇ／ｋｇ（−１）および２×１５ｍｇ／ｋｇ（−１および＋６）注射は、より強力な処置であり、それらのあいだに著しい差はない。有害作用のない同様の成果が、ウサギの研究において観察された。リポソームのクロドロネートは、新内膜形成および狭窄％の減少に関し、著しい効果があった。
【００５９】
シリカ粒子の注射もまた、内膜形成を減じた（表１）。この効果は、マクロファージにおけるシリカの既知の阻害効果に起因すると考えられる。
【００６０】
これらの結果は、ラットおよびウサギの両モデルにおいて、クロドロネート含有リポソームによる処置がバルーンによる傷害ののちの新内膜形成を著しく減じることを示す。明らかな全身性および局所的副作用や体成長における作用はなかった。ＢＰは骨に影響することが知られるが、クロドロネートのリポソーム製剤での処置後、骨や骨中のカルシウムおよびリンのレベルにおける作用は観察されなかった。
【００６１】
図１〜３は、実験用ラットの頸動脈カテーテル傷害モデルに関し、同種のラットにおけるクロドロネートを含有しないコントロールリポソームの効果と比較して、再狭窄の減少に対するリポソームに包まれたクロドロネートの効果を示す結果の棒グラフである。これらの図において：
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、コントロールリポソームで治療したラットと比較して、クロドロネート含有リポソームで治療したラットにおける媒体率（media ratio）に対する平均管腔初期形成および平均新生血管内膜の程度を示す図である。
【図２】図２は、コントロールリポソームで治療したラットにおける狭窄の％と比較して、クロドロネート含有リポソームで治療したラットにおける狭窄の％を示す図である。
【図３】図３は、コントロールリポソームのみで治療したラットと比較し、クロドロネート含有リポソームで治療したラットにおいて、平滑筋細胞の生存能力の間接的な指標となり、全動脈領域と元の管腔領域とのあいだの差として測定された中側領域の範囲を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビスホスホネート、ピロリン酸塩、ビスホスホネートのポリマー鎖及びピロリン酸塩のポリマー鎖からなる群より選択され、かつ０．０１〜１０μｍのサイズを有する不活性ポリマー粒子に埋め込まれている活性成分を含む、血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項２】
静脈内投与（i.v.）、筋肉内投与（i.m.）、又は皮下投与（s.c.）用である、請求項１に記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項３】
活性成分が、以下の一般式を有する、請求項１に記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【化１】
（式中、Ｒ1はＨ、ＯＨ又はハロゲン基；及びＲ2はハロゲン；アミノが１級、２級又は３級であってもよいヘテロアリール若しくは複素環のＣ1〜Ｃ10アルキルアミノ又はＣ3〜Ｃ8シクロアルキルアミノにより任意に置換される直鎖若しくは分岐鎖のＣ1〜Ｃ10アルキル又はＣ2〜Ｃ10アルケニル；Ｙが水素、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである−ＮＨＹ；又はＲ2はＺがクロロ置換されたフェニル又はピリジニルである−ＳＺ；である）
【請求項４】
活性成分がクロドロネート、エチドロネート、チルドロネート、パミドロネート及びアレンドロネートからなる群から選択される、請求項１又は２記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項５】
再狭窄が動脈再狭窄である、請求項１〜３のいずれかに記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項６】
非経口投与用である、請求項１〜５のいずれかに記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項７】
ビスホスホネート、ピロリン酸塩、ビスホスホネートのポリマー鎖及びピロリン酸塩のポリマー鎖からなる群から選択され、かつ不活性ポリマー粒子に埋め込まれている活性成分を含む製剤を包含する、血管再狭窄の予防又は治療用ステント。
【請求項８】
ビスホスホネート、ピロリン酸塩、ビスホスホネートのポリマー鎖及びピロリン酸塩のポリマー鎖からなる群から選択され、かつ０．０１〜１０μｍのサイズを有する不活性ポリマー粒子に、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に埋め込まれている活性成分を含む、血管再狭窄の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項９】
静脈内投与（i.v.）、筋肉内投与（i.m.）、又は皮下投与（s.c.）用である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
活性成分が、以下の一般式を有する、請求項８に記載の医薬組成物。
【化２】
（式中、Ｒ1はＨ、ＯＨ又はハロゲン基；及びＲ2はハロゲン；アミノが１級、２級又は３級であってもよいヘテロアリール若しくは複素環のＣ1〜Ｃ10アルキルアミノ又はＣ3〜Ｃ8シクロアルキルアミノにより任意に置換される直鎖若しくは分岐鎖のＣ1〜Ｃ10アルキル又はＣ2〜Ｃ10アルケニル；Ｙが水素、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである−ＮＨＹ；又はＲ2はＺがクロロ置換されたフェニル又はピリジニルである−ＳＺ；である）
【請求項１１】
活性成分がクロドロネート、エチドロネート、チルドロネート、パミドロネート又はアレンドロネートである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
再狭窄が冠状動脈再狭窄である、請求項８〜１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
活性成分が、０．１〜５μｍのサイズを有する不活性ポリマー粒子に埋め込まれている、請求項１〜６のいずれかに記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項１４】
活性成分が、０．１〜５μｍのサイズを有する不活性ポリマー粒子に埋め込まれている、請求項８〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１】
ビスホスホネート、ピロリン酸塩、ビスホスホネートのポリマー鎖及びピロリン酸塩のポリマー鎖からなる群より選択され、かつ０．０１〜１０μｍのサイズを有する不活性ポリマー粒子に埋め込まれている活性成分を含む、血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項２】
静脈内投与（i.v.）、筋肉内投与（i.m.）、又は皮下投与（s.c.）用である、請求項１に記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項３】
活性成分が、以下の一般式を有する、請求項１に記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【化１】
（式中、Ｒ1はＨ、ＯＨ又はハロゲン基；及びＲ2はハロゲン；アミノが１級、２級又は３級であってもよいヘテロアリール若しくは複素環のＣ1〜Ｃ10アルキルアミノ又はＣ3〜Ｃ8シクロアルキルアミノにより任意に置換される直鎖若しくは分岐鎖のＣ1〜Ｃ10アルキル又はＣ2〜Ｃ10アルケニル；Ｙが水素、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである−ＮＨＹ；又はＲ2はＺがクロロ置換されたフェニル又はピリジニルである−ＳＺ；である）
【請求項４】
活性成分がクロドロネート、エチドロネート、チルドロネート、パミドロネート及びアレンドロネートからなる群から選択される、請求項１又は２記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項５】
再狭窄が動脈再狭窄である、請求項１〜３のいずれかに記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項６】
非経口投与用である、請求項１〜５のいずれかに記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項７】
ビスホスホネート、ピロリン酸塩、ビスホスホネートのポリマー鎖及びピロリン酸塩のポリマー鎖からなる群から選択され、かつ不活性ポリマー粒子に埋め込まれている活性成分を含む製剤を包含する、血管再狭窄の予防又は治療用ステント。
【請求項８】
ビスホスホネート、ピロリン酸塩、ビスホスホネートのポリマー鎖及びピロリン酸塩のポリマー鎖からなる群から選択され、かつ０．０１〜１０μｍのサイズを有する不活性ポリマー粒子に、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に埋め込まれている活性成分を含む、血管再狭窄の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項９】
静脈内投与（i.v.）、筋肉内投与（i.m.）、又は皮下投与（s.c.）用である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
活性成分が、以下の一般式を有する、請求項８に記載の医薬組成物。
【化２】
（式中、Ｒ1はＨ、ＯＨ又はハロゲン基；及びＲ2はハロゲン；アミノが１級、２級又は３級であってもよいヘテロアリール若しくは複素環のＣ1〜Ｃ10アルキルアミノ又はＣ3〜Ｃ8シクロアルキルアミノにより任意に置換される直鎖若しくは分岐鎖のＣ1〜Ｃ10アルキル又はＣ2〜Ｃ10アルケニル；Ｙが水素、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである−ＮＨＹ；又はＲ2はＺがクロロ置換されたフェニル又はピリジニルである−ＳＺ；である）
【請求項１１】
活性成分がクロドロネート、エチドロネート、チルドロネート、パミドロネート又はアレンドロネートである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
再狭窄が冠状動脈再狭窄である、請求項８〜１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
活性成分が、０．１〜５μｍのサイズを有する不活性ポリマー粒子に埋め込まれている、請求項１〜６のいずれかに記載の血管再狭窄の予防又は治療剤。
【請求項１４】
活性成分が、０．１〜５μｍのサイズを有する不活性ポリマー粒子に埋め込まれている、請求項８〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−３７８７１（Ｐ２０１１−３７８７１Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２３６１０（Ｐ２０１０−２２３６１０）
【出願日】平成２２年１０月１日（２０１０．１０．１）
【分割の表示】特願２０００−５５９８１２（Ｐ２０００−５５９８１２）の分割
【原出願日】平成１１年７月１４日（１９９９．７．１４）
【出願人】（５９８０２５７０６）イッスム・リサーチ・デベロプメント・カムパニー・オブ・ザ・ヘブリュー・ユニバシティー・オブ・エルサレム リミテッド (1)
【出願人】（５００２５４８０４）ハダシット メディカル リサーチ サービシーズ アンド ディベロップメント リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１日（２０１０．１０．１）
【分割の表示】特願２０００−５５９８１２（Ｐ２０００−５５９８１２）の分割
【原出願日】平成１１年７月１４日（１９９９．７．１４）
【出願人】（５９８０２５７０６）イッスム・リサーチ・デベロプメント・カムパニー・オブ・ザ・ヘブリュー・ユニバシティー・オブ・エルサレム リミテッド (1)
【出願人】（５００２５４８０４）ハダシット メディカル リサーチ サービシーズ アンド ディベロップメント リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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