分析チップ、分析システムおよび分析方法
【課題】競合反応による定量分析が可能な分析チップを提供する。
【解決手段】液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップであって、基体と、該基体の表面に形成された、上流側から下流側へ前記液体試料を流すための流路と、を備える。流路は、液体試料を流路に導入するための導入部と、該導入部の下流側に設けられた、液体試料を競合反応させるための反応部と、該反応部の下流側に設けられた排出部と、反応部と排出部との間に設けられた、反応部から排出部に前記液体試料が流れるのを抑制するための堰き止め部と、を含む。反応部は、測定対象物質が特異的に結合する特異的結合物質または測定対象物質の競合物質が予め固定化された担体を収納する。
【解決手段】液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップであって、基体と、該基体の表面に形成された、上流側から下流側へ前記液体試料を流すための流路と、を備える。流路は、液体試料を流路に導入するための導入部と、該導入部の下流側に設けられた、液体試料を競合反応させるための反応部と、該反応部の下流側に設けられた排出部と、反応部と排出部との間に設けられた、反応部から排出部に前記液体試料が流れるのを抑制するための堰き止め部と、を含む。反応部は、測定対象物質が特異的に結合する特異的結合物質または測定対象物質の競合物質が予め固定化された担体を収納する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析チップ、分析システムおよび分析方法に関し、特に、競合反応による定量分析が可能な分析チップ、分析システムおよび分析方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療、健康、食品および創薬などの分野で、ＤＮＡ、酵素、抗原、抗体、タンパク質、ウィルスおよび細胞などの生体物質、ならびに化学物質を検出して定量する重要性が増している。これに対応し、上記生体物質および化学物質などを簡便に測定するための様々なバイオチップおよびマイクロ化学チップ（以下、これらを総称して「分析チップ」と称する。）が提案されている。
【０００３】
分析チップは、実験室で行なわれている一連の分析操作を、数ｃｍ角で厚さ数ｍｍ〜１ｃｍ程度のチップ内で簡易に行なえるように作られているため、検体および試薬の使用量が微量で済む。このように、分析チップは、低コストで、ハイスループットな検査ができるため、検体を採取した現場で直ちに検査結果を得ることができるなどの多くの利点を有している。このような分析チップは、たとえば血液検査または唾液検査などの生化学検査用として好適に用いられている。
【０００４】
たとえば、特許文献１には、水性液体試料中の検体の存在または濃度を測定するための電気化学的試験デバイスが開示されている。特許文献１においては、かかる電気化学的試験デバイスを用いることで、血液のような水性液体試料中のグルコース濃度などを簡便な操作で測定することができるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００１−５１８６２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、タンパク質の化学反応系においては、低分子量の単純な分子が生成されることはまれであり、グルコースの化学反応系ように、酸化還元性の高いＨ2Ｏ2の生成やＯ2の消費に結び付けることが難しい。このため、多くのタンパク質は、酵素標識免疫測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）のような複雑な方法を介さなければ、分析することができない。
【０００７】
なかでも、コルチゾールのような分子量の小さいタンパク質を分析する場合には、競合法を用いる必要がある。しかし、競合法による分析は分析操作が複雑であるために、分析チップを用いた簡易な分析の実現はさらに困難となっている。このため、分析に競合法が必要となるタンパク質の分析は、ウェル内に特異的な処理を施したマイクロウェルを用いて行なうのが一般的である。
【０００８】
しかしながら、マイクロウェルを用いる方法では、特殊な器具、装置が必要であったため、たとえば、検体（液体試料）を採取した場所でのフローアッセイが難しいのが実情であった。また、その操作も複雑であったため、操作者の熟練性も必要であった。上記のような事情から、分析チップを用いた分析方法のような簡易な方法で、競合法による分析を行なうことは未だ困難であるのが実情である。
【０００９】
したがって、本発明は、競合法による分析を簡便に実現可能な分析チップ、分析システム、および分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップであって、基体と、該基体の表面に形成された、上流側から下流側へ液体試料を流すための流路と、を備え、流路は、液体試料を流路に導入するための導入部と、該導入部の下流側に設けられた、液体試料を競合反応させるための反応部と、該反応部の下流側に設けられた排出部と、反応部と排出部との間に設けられた、反応部から排出部に液体試料が流れるのを抑制するための堰き止め部と、を含み、反応部は、測定対象物質が特異的に結合する特異的結合物質または測定対象物質の競合物質が予め固定化された担体を収納する、分析チップである。
【００１１】
上記分析チップにおいて、堰き止め部の流路幅が反応部の流路幅よりも狭いことが好ましい。
【００１２】
また、上記分析チップにおいて、堰き止め部を構成する流路が撥液性であることが好ましい。
【００１３】
また、上記分析チップにおいて、導入部の流路幅が反応部の流路幅よりも狭いことが好ましい。
【００１４】
また、上記分析チップにおいて、排出部は、反応部から流出する液体試料を吸収するための吸収体を収納することが好ましい。
【００１５】
また、本発明は、上記分析チップと、該分析チップの反応部で発生する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答に基づいて、測定対象物質を分析するための分析装置と、を備える分析システムである。
【００１６】
また、本発明は、上記分析チップを用いて、液体試料中の測定対象物質を分析する分析方法であって、標識部を有する特異的結合物質または標識部を有する競合物質と、液体試料とを含有する反応液を反応部内に導入する工程と、反応部内で、反応液と、担体に予め固定化された特異的結合物質または競合物質とを競合反応させる工程と、競合反応させる工程の後に、反応液を排出部に流出させる工程と、流出させる工程の後に、反応部内に残存する標識部を有する競合物質または標識部を有する特異的結合物質に由来する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答に基づいて、測定対象物質を分析する工程と、を含む、分析方法である。
【００１７】
上記分析方法において、導入する工程は、反応液を導入部から導入する工程を含むことが好ましい。
【００１８】
また、上記分析方法において、流出させる工程は、反応部に洗浄液を流入させる工程を含むことが好ましい。
【００１９】
また、上記分析方法において、標識部が蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を発することが好ましい。
【００２０】
また、上記分析方法において、分析する工程は、標識部と酵素反応する基質を含有する基質溶液を反応部に流入させる工程を含み、基質は、標識部と酵素反応することによって、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を引き起こす物質であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の分析チップ、分析システムおよび分析方法によれば、簡便に、競合法による分析を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施の形態における分析チップの模式的な平面図である。
【図２】図１の基体の模式的な平面図である。
【図３】図１の基体の模式的な斜視図である。
【図４】担体の構成の一例を説明するための模式図である。
【図５】実施の形態における分析方法を示すフローチャートである。
【図６】（ａ）〜（ｄ）は、実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す平面図である。
【図７】（ａ）〜（ｄ）は、実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す断面図である。
【図８】（ａ）〜（ｃ）は、反応部における競合反応を説明するための模式図である。
【図９】実施の形態における分析システムを示す模式図である。
【図１０】実施例で分析されたコルチゾール濃度と蛍光強度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、図面に基づいて本発明の実施の形態を説明する。なお、以下の図面において同一または相当する部分には、同一の参照符号を付し、その説明は繰り返さない。なお、本明細書において、「液体」とは、液体試料、反応液、洗浄液および基質溶液のそれぞれを含み得る概念である。
【００２４】
＜分析チップ＞
図１に、実施の形態における分析チップの模式的な平面図を示す。
【００２５】
図１に示す分析チップ１００は、競合反応を用いることによって液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップである。本実施の形態においては、測定対象物質として、コルチコイドの一種であってストレスによって体内濃度が変化するホルモンとして知られているコルチゾールを用いる場合について説明するが、これに限られるものではない。
【００２６】
図１を参照し、分析チップ１００は、基体１０と、該基体１０の表面に形成された流路１１と、流路１１内に配置された担体２１および吸収体２２とを備えている。
【００２７】
図２および図３に、図１の基体の模式的な平面図および斜視図を示す。
図２および図３を参照し、基体１０の材質は特に限定されないが、透明基板であることが好ましい。透明基板としては、たとえば、アクリル系樹脂などの樹脂基板、または、ガラス、シリコン、あるいは石英などの無機材料基板を用いることができる。基体１０の形状は特に限定されず、たとえば、図１中左右方向の長さが７５〜９０ｍｍ、図１中の上下方向の幅が１４〜１８ｍｍ、厚みが３〜１０ｍｍの直方体とすることができる。
【００２８】
基体１０の表面に形成された流路１１は、上流側の導入部１２と、導入部１２の下流側に設けられた反応部１３と、反応部１３の下流側に設けられた排出部１４と、反応部１３と排出部１４との間に設けられた堰き止め部１５とから構成される。なお、各図の流路１１は、図中左側（導入部１２側）が上流側、右側（排出部１５側）が下流側となる。
【００２９】
流路１１は、液体試料、その他競合反応に用いられる洗浄液、基質溶液などの液体を上流側から下流側へ流すための流路であり、流路１１中における隣接する各部は互いに連通している。このような流路１１は、たとえば、基体１０の表面を切削することによって形成することができる。流路１１の深さは特に限定されないが、たとえば、１〜５ｍｍとすることができる。なお、流路１１は、少なくとも、導入部１２、反応部１３、排出部１４および堰き止め部１５を含んでいればよい。
【００３０】
流路１１のうちの導入部１２は、狭い流路幅を有する直線状に形成されており、液体試料を流路１１に導入するために用いることができる部分である。導入部１２から液体試料を導入することにより、液体試料は、導入部１２の下流側に位置する反応部１３へと流れることができる。液体試料の導入部１２への導入方法としては、たとえば、導入部１２よりもさらに上流側の基体１０の表面に液体試料を配置する方法がある。このように液体試料を配置することによって、液体試料を自重によって導入部１２内に落ち込ませることができるため、結果的に、流路１１内に液体試料を導入することができる。また、導入部１２の流路幅Ｗ12を狭くすることにより、毛細管現象によって液体試料を導入部１２内に早い速度で導入することができ、さらに反応部１３に向けて流れさせることができる。
【００３１】
なかでも、図１〜３に示すように、導入部１２の流路幅Ｗ12を反応部１３の流路幅Ｗ13よりも狭くし、導入部１２の上流側を閉塞させ、導入部１２の流路長（図１〜３中の左右方向）を流路幅Ｗ12よりも十分に長くすることが好ましい。導入部１２がこのような形状を有することによって、基体１０の表面に液体試料を配置した際の液体試料の速度などの運動状態の影響を、流路壁との摩擦で平坦化（均一化）することができるため、反応部１３内での競合反応のばらつきを抑制することができる。たとえば、導入部１２は、流路長が１０ｍｍ、流路幅Ｗ12が１ｍｍの直線形状とすることができる。なお、本明細書において、流路幅とは、流路１１の上流側から下流側に向かう方向に直交する方向における流路１１の幅である。
【００３２】
流路１１のうちの反応部１３は、図１〜図３に示すように、上流側から下流側にかけて流路幅が連続的に増大した後に引き続き連続的に減少する形状に形成されており、液体試料中の測定対象物質を競合反応させることができる部分である。反応部１３は、図１〜図３に示すような形状を有することにより、導入部１２側から流入した液体試料を反応部１３内に均一に分散させることができる。たとえば、反応部１３は、流路長１２〜１５ｍｍで、流路幅が、上流側から下流側にかけて１ｍｍ（導入部１２の流路幅Ｗ12）から連続的に増大して最大となる部分の流路幅Ｗ13が６ｍｍとなった後、連続的に減少して１ｍｍ（堰き止め部１５の流路幅Ｗ15）まで狭くなる形状とすることが好ましい。また、反応部１３は、たとえば、流路長１２〜１５ｍｍで、流路幅が、上流側から下流側にかけて１ｍｍから連続的に増大して６ｍｍに到達した後、その最大流路幅の部分を所定長さ、たとえば３ｍｍ維持し、引き続き連続的に減少して１ｍｍまで狭くなる形状に形成されてもよい。
【００３３】
流路１１のうちの堰き止め部１５は、液体試料が、反応部１３から排出部１４に流出するのを抑制することのできる部分である。堰き止め部１５を反応部１３の下流側に隣接して配置させることにより、堰き止め部１５の上流側に液体試料を留めおくことができるため、反応部１３内での均一な競合反応を促進させることができる。
【００３４】
堰き止め部１５の流路幅Ｗ15は、反応部１３の流路幅Ｗ13よりも狭いことが好ましい。この形状により、反応部１３から排出部１４に液体試料が流出するのを抑制することができる。この場合、図１〜図３に示すように、堰き止め部１５は反応部１３の下流側を狭窄した構造となる。たとえば、堰き止め部１５の形状は、流路長が１ｍｍ、流路幅Ｗ15が１ｍｍの形状することができる。また、堰き止め部１５を構成する流路を、液体試料を流路の表面ではじくことが可能な撥液性にすることによっても、反応部１３から排出部１４に反応液が流出するのを抑制することができる。この場合、たとえば、堰き止め部１５を構成する基体１０の壁部をフッ素コートすることによって撥液性の堰き止め部１５を構成できる。特に、図１〜図３に示すように、堰き止め部１５を狭窄してその流路幅Ｗ15を反応部１３の流路幅Ｗ13よりも十分に狭くし、さらに、堰き止め部１５を構成する流路を撥液性とすることによって、液体試料の排出部１４への流出を抑制する効果を高めることができる。
【００３５】
このように、堰き止め部１５は、たとえば、開閉可能なバルブ構造のような複雑な構造ではなく、狭窄構造および／または撥液性を付与した構造のような簡素な構造とすることによって、反応部１３から排出部１４への液体試料の流れを抑制することができる。また、堰き止め部１５の構造をこのような構造とすることにより、堰き止め部１５より上流側の流路１１内の液量が所定量（堰き止め部１５が流出を抑制可能な液量）を超えた場合には、反応部１３から排出部１４への液体の流出を可能とする。このように、堰き止め部１５においては、反応部１３から排出部１４への液体試料の流出の有無を容易に制御することができる。したがって、堰き止め部１５が反応部１３から排出部１４への液体試料の流出を抑制する（無とする）ことによって、反応部１３内において均一な競合反応を促進させることができる。一方、堰き止め部１５が反応部１３から排出部１４への液体試料の流出を可能とする（有とする）ことによって、競合反応後の液体試料を排出部１４へ容易に流出させることができるため、反応部１３内の液体を、競合反応後の定量分析に必要な液体に容易に置換することができる。
【００３６】
流路１１のうちの排出部１４は、広い流路幅を有する直線状に形成されており、反応部１３から流出してきた液体試料を内部に留めて逆流させないようにするための部分である。反応部１３から堰き止め部１５を介して排出部１４に流入した液体試料は排出部１４内に留めおかれる。このため、排出部１４の形状は特に限定されないが、液体試料の逆流を抑制することのできる形状であることが好ましい。たとえば、排出部１４は、流路長が４７〜５９ｍｍ、流路幅Ｗ14が８〜１２ｍｍの長方形状とすることができる。この場合、排出部１４は反応部１３と比較して大きな容量を有するため、一度排出部１４に流入してきた液体試料などの液体が反応部１３に逆流するのを抑制することができる。
【００３７】
また、流路１１は、基体１０の上面に載置される蓋体（図示せず）などによって、閉塞されていてもよい。この場合、蓋体の導入部１２に対応する領域の一部に導入口を設けることによって、液体試料などの液体を流路１１内へ簡便に導入することができる。分析チップ１００が、基体１０の上面（流路１１が形成されている面）に蓋体を有することによって、クリーンな環境での分析が可能となり、分析の制度を向上させることができる。
【００３８】
また、図１に示すように、反応部１３には、測定対象物質であるコルチゾールの競合物質が予め固定化された担体２１が収納される。これにより、反応部１３は、反応部１３内に流入した液体試料中のコルチゾールの競合反応の場として機能することができる。
【００３９】
図４に、担体２１の構成の一例を説明するための模式図を示す。担体２１の表面には、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）３２が固定されており、ＢＳＡ３２に競合物質としてのコルチゾール３１が固定されている。このような担体２１は、たとえば、以下のように作製することができる。
【００４０】
すなわち、まず、担体２１の一例としてのメンブレンを準備する。次に、準備したメンブレンを、コルチゾールとＢＳＡとを結合させたＢＳＡ−ＣＯＲＴ結合体を含む溶液に浸漬してインキュベーションし、さらに、このメンブレンを５％ＦＢＳ（非働化ウシ胎仔血清）溶液などに浸漬してインキュベーションする。そして、浸漬後のメンブレンをリン酸バッファーなどで洗浄した後、室温環境下などで乾燥させる。なお、ＢＳＡ−ＣＯＲＴ結合体は、市販品を用いてもよく、適宜作製してもよい。以上の処理により、図４に示すように、リンカーであるＢＳＡ３２を介して、コルチゾール３１が固定化された担体２１が作製される。
【００４１】
担体２１の材料は特に限定されないが、タンパク質の吸着能に優れたメンブレン、たとえば、ポリスチレン、塩化ビニル、ニトロセルロースなどからなるメンブレンを好適に用いることができる。また、担体２１の形状も特に限定されないが、反応部１３内における液体の流れに影響を及ぼさない形状、たとえば、円、楕円状であることが好ましい。なお、担体２１は、反応部１３内に固定されていてもよく、反応部１３内に交換可能に配置されてもよい。担体２１を交換可能な状態で反応部１３内に配置することにより、分析チップ１００の繰り返しの利用が可能となり、分析コストの低減に繋がる。
【００４２】
また、図１に示すように、排出部１４には、吸収体２２が収納されていることが好ましい。吸収体２２は、液体試料などの液体を吸収することができる部材であればよく、たとえば、吸収性繊維、多孔性樹脂、高分子吸収体、または海綿により構成される部材が好ましい。とくに、ポリスチレン、塩化ビニルなどを好適に用いることができる。排出部１４内への吸収体２２の配置は必要不可欠ではないが、このような吸収体２２を排出部１４に収納させることにより、排出部１４の液体の吸収性能を高めることができる。また、吸収体２２を収納することにより、排出部１４に流入した液体を吸収体２２に留めおくことができるため、一度排出部１４に流入した液体が堰き止め部１５を介して反応部１３に逆流するのを効果的に抑制することができる。なお、吸収体２２は、排出部１４に固定されていてもよく、交換可能に配置されていてもよい。
【００４３】
以上説明したように、本実施の形態の分析チップ１００によれば、反応部１３から排出部１４への液体試料の流れを抑制することが可能な堰き止め部１５を備えることにより、反応部１３内に液体試料を留めおいて、反応部１３内での競合反応を十分かつ均一的に行わせることができる。また、競合反応後は、反応部１３内の液体試料を容易に排出部１４に流出させることができるため、競合反応を利用した定量分析を容易に実現することが可能となる。
【００４４】
＜分析方法＞
図５は、本発明の実施の形態における分析方法を示すフローチャートである。図６（ａ）〜（ｄ）は、本発明の実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す平面図である。図７（ａ）〜（ｄ）は、本発明の実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す断面図である。図８（ａ）〜（ｃ）は、反応部における競合反応を説明するための模式図である。以下、図５〜図８を参照して、一実施の形態における分析チップ１００を用いた分析方法、より具体的には、液体試料中のコルチゾールの濃度を測定する分析方法について説明する。なお、図７には、図１に一点破線で示す中心線に沿った断面を示している。
【００４５】
まず、図５に示すように、調製された反応液を反応部１３内に導入する（ステップＳ１）。なお、本実施の形態において、反応液とは、コルチゾールの濃度が不明である液体試料と、標識部を有する特異的結合物質（以下、「標識化特異的結合物質」という。）とを含有する液体を示す。
【００４６】
このような反応液を反応部１３内に導入する方法としては、たとえば、図６（ａ）および図７（ａ）に示すように、予め調製された、液体試料に標識化特異的結合物質を混合させた反応液４０を導入部１２上に配置する方法がある。これにより、導入部１２上の反応液４０は、反応液４０の自重により、導入部１２内に導入される。導入部１２内に導入された反応液４０は、たとえば、図６（ｂ）および図７（ｂ）に示すように反応部１３内に流入する。
【００４７】
導入部１２から反応部１３内に流入する際の反応液４０の流速は、導入部１２の流路幅Ｗ12が狭いことによって、比較的大きな速度となる。反応液４０の速度は、導入部１２よりも広い流路幅Ｗ13を有する反応部１３内で減速する。このとき、反応部１３の下流側には、堰き止め部１５が隣接しているため、反応部１３から排出部１４へと向かう流れは、堰き止め部１５によって抑制される。したがって、反応液４０は、反応部１３内に均一に分散されるとともに、反応部１３内に留めおかれる。
【００４８】
また、液体試料と、標識化特異的結合物質を含有する液体とを、それぞれ別々に導入部１２上にマウントしてもよい。この場合、導入部１２内に順に導入された液体試料と標識化特異的結合物質を含有する液体とが流路１１内で混合されるため、図６（ｂ）および図７（ｂ）に示すように、反応部１３内において、反応液４０として存在することができる。なお、堰き止め部１５が流出を抑制できる反応液４０の容量は、反応部１３の容量および堰き止め部１５の形状などによって適宜変化するため、あらかじめ、堰き止め部１５によって流出を抑制することが可能な反応液４０の液量を調べておくことが好ましい。
【００４９】
次に、図５に示すように、反応部１３内において、競合反応を行なう（ステップＳ２）。この競合反応について、図８（ａ）および（ｂ）を用いて説明する。
【００５０】
図８（ａ）を参照し、本工程において、反応部１３内には、担体２１の表面にＢＳＡ３２を介して固定化されたコルチゾール（以下、「固定化コルチゾール」という。）３１と、反応液４０中の液体試料に由来するコルチゾール３３と、標識化特異的結合物質３４とが存在している。なお、標識化特異的結合物質３４としては、たとえば、特異的結合物質としてのコルチゾール抗体３４ａに、標識としてのＨＲＰ（西洋わさび由来のHorseradish Peroxidase）３４ｂが結合された物質を用いることができる。固定化コルチゾール３１、コルチゾール３３、コルチゾール抗体３４ａが反応部１３内に存在することにより、図８（ｂ）に示すように、固定化コルチゾール３１とコルチゾール３３とが競合してコルチゾール抗体３４ａと結合する競合反応が起こる。
【００５１】
上述のように、本工程においては、反応液４０が存在する反応部１３内で、コルチゾール抗体３４ａを、固定化コルチゾール３１とコルチゾール３３とに均一に競合反応させることができる。なお、この競合反応を反応部１３内でより均一に行なうためには、反応液４０を反応部１３内に３０秒以上留めておくことが好ましく、１分以上留めておくことがより好ましい。
【００５２】
次に、図５に示すように、反応部１３内の反応液４０を排出部１４に排出する（ステップＳ３）。具体的には、図６（ｃ）および図７（ｃ）に示すように、流路１１のうちの堰き止め部１５の上流側の液量が、堰き止め部１５が抑制可能な液量より多くなるように、導入部１２から洗浄液４１を導入する。洗浄液４１を流路１１内に流入させて、堰き止め部１５の上流側に存在する液体の容量を堰き止め部１５が抑制可能な液量を超えさせることによって、反応部１３内の反応液４０を排出部１４へと排出させることができる。
【００５３】
堰き止め部１５から流出した反応液４０は、排出部１４の流路幅Ｗ14が堰き止め部１５の流路幅Ｗ15よりも十分に広いことにより、大きな流速で排出部１４に流入させることができる。また、排出部１４に流入した反応液４０は吸収体２２で吸収されるため、反応液３０の逆流を効果的に抑制することができる。なお、図７（ｃ）中に、吸収体２２に吸収された液体２２ａを概念的に示している。
【００５４】
本工程により、反応部１３内の反応液４０を排出部１４に流出させることができるため、図８（ｃ）に示すように、標識化特異的結合物質３４と結合したコルチゾール３３や、未結合の標識化特異的結合物質３４を反応部１３から除去することができる。なお、このとき、堰き止め部１５よりも上流側には洗浄液４１が存在していることになる（図６（ｃ）および図７（ｃ）参照）。
【００５５】
次に、図５に示すように、標識化特異的結合物質３４のＨＲＰ３４ｂに由来する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を測定する（ステップＳ４）。本工程は、たとえば、以下のように行なうことができる。
【００５６】
すなわち、図６（ｄ）および図７（ｄ）に示すように、標識部であるＨＲＰ３４ｂの基質を含有する基質溶液４２を反応部１３に導入する。具体的には、導入部１２から流路１１内へ基質溶液４２を導入することによって、反応部１３内の洗浄液４１が排出部１４へ流出させられるとともに、反応部１３内に基質溶液４２が満たされる。反応部１３内において、基質溶液４２中の基質は、固定化コルチゾール３１に結合した標識化特異的結合物質３４のＨＲＰ３４ｂとの酵素反応によって、蛍光を発する化合物、特異的な波長の光を発光する化合物、および特異的な波長を吸光する化合物のいずれか１種に変化する。
【００５７】
このような基質の化学変化に由来する蛍光、発光および吸光の少なくとも１つの応答を、分光光度計、フルオロメーターなどを用いて検出し、定量化することによって、固定化コルチゾール３１に結合したコルチゾール抗体３４ａの量を算出することができる。そして、このコルチゾール抗体３４ａの量から、液体試料中のコルチゾール３３の量を算出することができる。
【００５８】
ＨＲＰ３４ｂの基質としては、たとえば、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＲＥＤを用いることができる。Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＲＥＤは非蛍光物質であり、ＨＲＰによって化学変化することによって、蛍光物質であるレゾルフィンへと変化する。このため、レゾルフィン由来の蛍光を測定することによって、固定化コルチゾール３１に結合したコルチゾール抗体３４ａの量を算出することができ、これに基づいて液体試料中のコルチゾール３３の濃度を算出することができる。
【００５９】
また、標識部自体が、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を発する化合物であってもよい。たとえば、フルオレセインなどの蛍光物質を標識部として用いることによって、上述のような基質溶液を用いなくても、固定化コルチゾール３１に結合したコルチゾール抗体３４ａの量を、標識部自体の蛍光の強度から算出することができる。
【００６０】
また、本実施の形態の分析方法において、洗浄液４１を導入する工程を行わなくても良い。この場合、基質溶液４２を反応部１３内に過剰に流入させて、反応液４０を反応部１３から排出させるとともに、反応部１３内に基質溶液４２を満たすことによって、ステップＳ４とステップＳ５を同時に行なうことができる。この場合には、ステップＳ４とステップＳ５とを１つの工程で行なうことができるため、分析方法をより簡易にすることができる。
【００６１】
以上説明したように、本実施の形態の分析方法によれば、競合法を用いた定量分析を、上述の分析チップ１００を用いて簡便に行なうことができる。
【００６２】
＜分析システム＞
図９は、本実施の形態における分析システムを示す模式図である。以下、図９を参照して、一実施の形態における分析システムを説明する。
【００６３】
図９を参照し、分析システム２００は、分析チップ１００と、測定装置５０とを備える。測定装置５０は、分析チップ１００の反応部１３からの蛍光、発光および吸光からなる群から選択されたいずれか１つの応答に基づいて、液体試料中のコルチゾール３３を定量分析できる装置であれば特に限定されない。たとえば、上述のように、ＨＲＰ３４ｂの基質として、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＲＥＤを用いた場合、測定装置５０は、レゾルフィンの励起波長を出射する光出射器５１と、レゾルフィンから発生する蛍光を測定する検出器５２とを含む構成であればよい。この場合、たとえば、検出器５２が検出した蛍光の強度とレゾルフィンの検量線とを比較することによって、液体試料中のコルチゾールの濃度を測定することができる。
【００６４】
また、図９に示すように、分析システム２００は、測定結果を示すモニター５３を備えていてもよい。モニター５３を備えることにより、測定者が測定結果を容易に確認することができる。また、分析システム２００は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）と接続される構成であってもよい。この場合、分析システム２００の分析結果を容易にＰＣで処理することができる。
【００６５】
以上、本発明の分析チップの一実施形態、本発明の分析方法の一実施形態、および本発明の分析システムの一実施形態について、図１〜図９を用いて説明した。
【００６６】
本発明の分析チップによれば、反応部１３が、競合物質が予め固定化された担体２１を収納することができ、また、反応部１３の下流側に隣接する堰き止め部１５が、液体試料を含有する反応液を反応部１３内に留めおくことができる。これにより、反応部１３内での均一な競合反応が可能となる。また、堰き止め部１５は、堰き止め部１５よりも上流側に留めおかれている液量が堰き止め部１５がその下流側への流出を抑制できる液量を超えた場合に、反応部１３から下流側への液体の流出を許すことができる。これにより、反応部１３内の液体の置換が容易となり、競合反応に基づく蛍光、発光および吸光からなる群から選択されたいずれか１種を測定することができる。したがって、本発明の分析チップによれば、競合法を利用した測定対象物質の定量が容易となる。
【００６７】
また、本発明の分析方法によれば、本発明の分析チップを用いて、簡便に、競合法を用いた測定対象物質の定量を行なうことができる。また、マイクロウェルを用いた分析方法では、洗浄処理などの操作が複雑であり、高い定量性を維持するためには、その操作に熟練性が必要とされていたが、本発明の分析方法によれば、少なくとも、反応液の液量を調節することによって、簡便に高い定量性を維持することができる。
【００６８】
また、本発明の分析システムによれば、本発明の分析チップおよび分析方法を用いて、競合法を用いた定量が可能となる。また、蛍光、発光および吸光からなる群から選択される少なくとも１種を測定する分光光度計、フルオロメーターのような測定装置は小さく設計することが可能であるため、本発明の分析システムは容易に持ち運び可能な構成とすることができる。したがって、たとえば、液体試料を採取した場所でのフローアッセイを容易に行なうことができる。
【００６９】
また、本発明の分析チップ、分析方法および分析システムは、試験紙上の発色の有無基づいて、測定対象物質の有無を分析するような技術と異なり、液体中での蛍光、発光または吸光を測定して測定対象物質の濃度を分析することができる。このため、たとえば、分光測定の際のバックグラウンドを十分に低くすることができ、より高い定量性を維持することができる。特に、標識物質との反応によって蛍光を発する化合物へと変化する基質を用いることにより、感度の高い酵素反応を短時間で行なうことができ、もって、感度の高い迅速な定量分析が可能となる。また、試験紙を用いた場合と異なり、競合反応や酵素反応を液体中で行なうことができるため、各反応時のばらつきを低減することができ、もってよりばらつきのない正確な定量分析が可能となる。
【００７０】
なお、本実施の形態では、液体試料中の測定対象物質（濃度不明のコルチゾール）の競合物質（濃度既知のコルチゾール）を担体２１に固定化し、特異的結合物質（濃度既知の標識化されたコルチゾール抗体）と液体試料とを含有する反応液を流路１１内に導入した場合について説明したが、本発明はこれに限られない。たとえば、液体試料中の測定対象物質（濃度不明のコルチゾール）の特定的結合物質（濃度既知のコルチゾール抗体）を担体２１に固定化し、競合物質（濃度既知の標識化されたコルチゾール）と液体試料とを含有する反応液を流路１１内に導入してもよい。この場合、担体２１と結合した競合物質の標識部に由来する発光などを測定することにより、液体試料中のコルチゾールの濃度を分析することができる。
【００７１】
また、上述の本発明の説明では、コルチゾールを分析する場合について詳細に説明したが、反応部１３内の担体２１に固定化する物質を入れ替えることにより、競合法で分析可能な他のタンパク質を測定することができる。
【実施例】
【００７２】
（分析チップ）
基体１０として、幅１４ｍｍ、長さ７５ｍｍ、厚さ３ｍｍの直方体のアクリル樹脂基板を用いた。基体１０の表面には、長さ１０ｍｍ、流路幅１ｍｍの導入部１２、長さ１２ｍｍ、最大流路幅６ｍｍの反応部１３、長さ４７ｍｍ、流路幅９ｍｍの排出部１４、および長さ１ｍｍ、流路幅１ｍｍの部１５から構成される、図１〜図３に示すような流路１１を形フッ素コートが施された堰き止め成した。なお、流路１１の深さは２ｍｍとした。
【００７３】
担体２１として、直径６ｍｍのポリスチレンメンブレンを用い、その一方の表面に、ＢＳＡ−ＣＯＲＴ結合体を固定化したメンブレンを用い、吸収体として、幅１２ｍｍ、長さ５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのセルロースからなる吸収体２２を用いた。なお、担体２１は、以下のようにして作製した。
【００７４】
すなわち、まず、ポリスチレンメンブレンを、ＢＳＡ−ＣＯＲＴ結合体（Fitzgerald社製）を０．８μｇ／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳバッファーに浸漬して３７℃で１２時間インキュベートした。次に、このポリスチレンメンブレンを、５％ＦＢＳ溶液に浸漬して３７℃で３０分インキュベートした。次に、このポリスチレンメンブレンをＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄し、３７℃で静置乾燥させて、担体２１を作製した。
【００７５】
上記担体２１を反応部１３内に収納し、上記吸収体２２を排出部１４内に収納し、この基体１０の上面に、蓋体として、幅１４ｍｍ、長さ７５ｍｍ、厚さ３ｍｍの直方体のアクリル樹脂基板を設置し、基体１０と蓋体がずれないように、両者を接着剤で接着させた。なお、蓋体のうち、導入部１２の最上流側に対応する部分に、導入口として直径１ｍｍの孔を設けた。以上の操作により、分析チップ１００を準備した。
【００７６】
（反応液）
液体試料として、コルチゾール（シグマアルドリッチ社製）の濃度が、それぞれ０ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を準備した。また、標識化特異的結合物質３４として、ＨＲＰ３４ｂが標識されたコルチゾール抗体３４ａを０．６μｇ／ｍｌの濃度で含有するＰＢＳバッファーを準備した。そして、各溶液（コルチゾール含有のＰＢＳ溶液およびコルチゾール抗体含有のＰＢＳバッファー）を１：１で混合することによって、反応液を調製した。
【００７７】
（洗浄液および基質溶液）
洗浄液として、ＰＢＳ−Ｔを準備した。また、基質溶液として、２６０ｍｇのＡｍｐｌｅｘ（登録商標）ＲＥＤを５ｍｌのＰＢＳ溶液に含有させた第１溶液と、２ｍＭの過酸化水素を含むＰＢＳ溶液からなる第２溶液とを準備した。なお、基質溶液は、導入口から流路内に導入させる直前に第１溶液と第２溶液とを混合して調製した。
【００７８】
（分析方法）
まず、分析チップ１００の蓋体の導入口上に１００μｌの反応液をマウントし、流路１１内に反応液を導入させた。導入後、反応液は迅速に反応部１３内に流入し、反応部１３内に溜まった（ステップＳ１）。その状態で分析チップ１００を１分間静置して、反応部１３内での競合反応を行なった後（ステップＳ２）、洗浄液を導入口から５００μｌ導入して、反応部１３内の反応液を排出部１４に排出させた（ステップＳ３）。そして、第１溶液と第２溶液とを１：１で混合した基質溶液を導入口から２００μｌ導入して、反応部１３内でのＨＲＰと基質の酵素反応を３分間行い、この反応部１３に向けて、フルオロメーターを用いて、波長５６０ｎｍの励起光を照射して、波長５９０ｎｍの蛍光を測定した（ステップＳ４）。なお、反応液の導入開始から酵素反応の終了までの操作は５分間以内で行うことができた。
【００７９】
（測定結果）
各反応液の競合反応後の測定結果を図１０のグラフに示す。図１０において、各反応液中のコルチゾール濃度が増加するに連れて、測定されたレゾルフィン由来の蛍光の強度が相対的に低下していることがわかった。したがって、競合反応を用いて、短期間で、高い感度でコルチゾールの濃度を測定することができた。また、たとえば、コルチゾールの各濃度に対応した検量線などを予め作成しておくことで、コルチゾールの濃度が未知の液体試料中のコルチゾール濃度を分析することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の分析チップ、分析方法及び分析システムは、競合法による測定対象物質の定量に好適に利用することができる。
【符号の説明】
【００８１】
１０ 基体、１１ 流路、１２ 導入部、１３ 反応部、１４ 排出部、１５ 堰き止め部、２１ 担体、２２ 吸収体、３１ 固定化コルチゾール、３２ ＢＳＡ、３３ コルチゾール、３４ 標識化特異的結合物質、３４ａ コルチゾール抗体、３４ｂ ＨＲＰ、４０ 反応液、４１ 洗浄液、４２ 基質溶液、５０ 測定装置、５１ 光出射器、５２ 検出器、５３ モニター、１００ 分析チップ、２００ 分析システム。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析チップ、分析システムおよび分析方法に関し、特に、競合反応による定量分析が可能な分析チップ、分析システムおよび分析方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療、健康、食品および創薬などの分野で、ＤＮＡ、酵素、抗原、抗体、タンパク質、ウィルスおよび細胞などの生体物質、ならびに化学物質を検出して定量する重要性が増している。これに対応し、上記生体物質および化学物質などを簡便に測定するための様々なバイオチップおよびマイクロ化学チップ（以下、これらを総称して「分析チップ」と称する。）が提案されている。
【０００３】
分析チップは、実験室で行なわれている一連の分析操作を、数ｃｍ角で厚さ数ｍｍ〜１ｃｍ程度のチップ内で簡易に行なえるように作られているため、検体および試薬の使用量が微量で済む。このように、分析チップは、低コストで、ハイスループットな検査ができるため、検体を採取した現場で直ちに検査結果を得ることができるなどの多くの利点を有している。このような分析チップは、たとえば血液検査または唾液検査などの生化学検査用として好適に用いられている。
【０００４】
たとえば、特許文献１には、水性液体試料中の検体の存在または濃度を測定するための電気化学的試験デバイスが開示されている。特許文献１においては、かかる電気化学的試験デバイスを用いることで、血液のような水性液体試料中のグルコース濃度などを簡便な操作で測定することができるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００１−５１８６２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、タンパク質の化学反応系においては、低分子量の単純な分子が生成されることはまれであり、グルコースの化学反応系ように、酸化還元性の高いＨ2Ｏ2の生成やＯ2の消費に結び付けることが難しい。このため、多くのタンパク質は、酵素標識免疫測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）のような複雑な方法を介さなければ、分析することができない。
【０００７】
なかでも、コルチゾールのような分子量の小さいタンパク質を分析する場合には、競合法を用いる必要がある。しかし、競合法による分析は分析操作が複雑であるために、分析チップを用いた簡易な分析の実現はさらに困難となっている。このため、分析に競合法が必要となるタンパク質の分析は、ウェル内に特異的な処理を施したマイクロウェルを用いて行なうのが一般的である。
【０００８】
しかしながら、マイクロウェルを用いる方法では、特殊な器具、装置が必要であったため、たとえば、検体（液体試料）を採取した場所でのフローアッセイが難しいのが実情であった。また、その操作も複雑であったため、操作者の熟練性も必要であった。上記のような事情から、分析チップを用いた分析方法のような簡易な方法で、競合法による分析を行なうことは未だ困難であるのが実情である。
【０００９】
したがって、本発明は、競合法による分析を簡便に実現可能な分析チップ、分析システム、および分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップであって、基体と、該基体の表面に形成された、上流側から下流側へ液体試料を流すための流路と、を備え、流路は、液体試料を流路に導入するための導入部と、該導入部の下流側に設けられた、液体試料を競合反応させるための反応部と、該反応部の下流側に設けられた排出部と、反応部と排出部との間に設けられた、反応部から排出部に液体試料が流れるのを抑制するための堰き止め部と、を含み、反応部は、測定対象物質が特異的に結合する特異的結合物質または測定対象物質の競合物質が予め固定化された担体を収納する、分析チップである。
【００１１】
上記分析チップにおいて、堰き止め部の流路幅が反応部の流路幅よりも狭いことが好ましい。
【００１２】
また、上記分析チップにおいて、堰き止め部を構成する流路が撥液性であることが好ましい。
【００１３】
また、上記分析チップにおいて、導入部の流路幅が反応部の流路幅よりも狭いことが好ましい。
【００１４】
また、上記分析チップにおいて、排出部は、反応部から流出する液体試料を吸収するための吸収体を収納することが好ましい。
【００１５】
また、本発明は、上記分析チップと、該分析チップの反応部で発生する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答に基づいて、測定対象物質を分析するための分析装置と、を備える分析システムである。
【００１６】
また、本発明は、上記分析チップを用いて、液体試料中の測定対象物質を分析する分析方法であって、標識部を有する特異的結合物質または標識部を有する競合物質と、液体試料とを含有する反応液を反応部内に導入する工程と、反応部内で、反応液と、担体に予め固定化された特異的結合物質または競合物質とを競合反応させる工程と、競合反応させる工程の後に、反応液を排出部に流出させる工程と、流出させる工程の後に、反応部内に残存する標識部を有する競合物質または標識部を有する特異的結合物質に由来する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答に基づいて、測定対象物質を分析する工程と、を含む、分析方法である。
【００１７】
上記分析方法において、導入する工程は、反応液を導入部から導入する工程を含むことが好ましい。
【００１８】
また、上記分析方法において、流出させる工程は、反応部に洗浄液を流入させる工程を含むことが好ましい。
【００１９】
また、上記分析方法において、標識部が蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を発することが好ましい。
【００２０】
また、上記分析方法において、分析する工程は、標識部と酵素反応する基質を含有する基質溶液を反応部に流入させる工程を含み、基質は、標識部と酵素反応することによって、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を引き起こす物質であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の分析チップ、分析システムおよび分析方法によれば、簡便に、競合法による分析を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施の形態における分析チップの模式的な平面図である。
【図２】図１の基体の模式的な平面図である。
【図３】図１の基体の模式的な斜視図である。
【図４】担体の構成の一例を説明するための模式図である。
【図５】実施の形態における分析方法を示すフローチャートである。
【図６】（ａ）〜（ｄ）は、実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す平面図である。
【図７】（ａ）〜（ｄ）は、実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す断面図である。
【図８】（ａ）〜（ｃ）は、反応部における競合反応を説明するための模式図である。
【図９】実施の形態における分析システムを示す模式図である。
【図１０】実施例で分析されたコルチゾール濃度と蛍光強度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、図面に基づいて本発明の実施の形態を説明する。なお、以下の図面において同一または相当する部分には、同一の参照符号を付し、その説明は繰り返さない。なお、本明細書において、「液体」とは、液体試料、反応液、洗浄液および基質溶液のそれぞれを含み得る概念である。
【００２４】
＜分析チップ＞
図１に、実施の形態における分析チップの模式的な平面図を示す。
【００２５】
図１に示す分析チップ１００は、競合反応を用いることによって液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップである。本実施の形態においては、測定対象物質として、コルチコイドの一種であってストレスによって体内濃度が変化するホルモンとして知られているコルチゾールを用いる場合について説明するが、これに限られるものではない。
【００２６】
図１を参照し、分析チップ１００は、基体１０と、該基体１０の表面に形成された流路１１と、流路１１内に配置された担体２１および吸収体２２とを備えている。
【００２７】
図２および図３に、図１の基体の模式的な平面図および斜視図を示す。
図２および図３を参照し、基体１０の材質は特に限定されないが、透明基板であることが好ましい。透明基板としては、たとえば、アクリル系樹脂などの樹脂基板、または、ガラス、シリコン、あるいは石英などの無機材料基板を用いることができる。基体１０の形状は特に限定されず、たとえば、図１中左右方向の長さが７５〜９０ｍｍ、図１中の上下方向の幅が１４〜１８ｍｍ、厚みが３〜１０ｍｍの直方体とすることができる。
【００２８】
基体１０の表面に形成された流路１１は、上流側の導入部１２と、導入部１２の下流側に設けられた反応部１３と、反応部１３の下流側に設けられた排出部１４と、反応部１３と排出部１４との間に設けられた堰き止め部１５とから構成される。なお、各図の流路１１は、図中左側（導入部１２側）が上流側、右側（排出部１５側）が下流側となる。
【００２９】
流路１１は、液体試料、その他競合反応に用いられる洗浄液、基質溶液などの液体を上流側から下流側へ流すための流路であり、流路１１中における隣接する各部は互いに連通している。このような流路１１は、たとえば、基体１０の表面を切削することによって形成することができる。流路１１の深さは特に限定されないが、たとえば、１〜５ｍｍとすることができる。なお、流路１１は、少なくとも、導入部１２、反応部１３、排出部１４および堰き止め部１５を含んでいればよい。
【００３０】
流路１１のうちの導入部１２は、狭い流路幅を有する直線状に形成されており、液体試料を流路１１に導入するために用いることができる部分である。導入部１２から液体試料を導入することにより、液体試料は、導入部１２の下流側に位置する反応部１３へと流れることができる。液体試料の導入部１２への導入方法としては、たとえば、導入部１２よりもさらに上流側の基体１０の表面に液体試料を配置する方法がある。このように液体試料を配置することによって、液体試料を自重によって導入部１２内に落ち込ませることができるため、結果的に、流路１１内に液体試料を導入することができる。また、導入部１２の流路幅Ｗ12を狭くすることにより、毛細管現象によって液体試料を導入部１２内に早い速度で導入することができ、さらに反応部１３に向けて流れさせることができる。
【００３１】
なかでも、図１〜３に示すように、導入部１２の流路幅Ｗ12を反応部１３の流路幅Ｗ13よりも狭くし、導入部１２の上流側を閉塞させ、導入部１２の流路長（図１〜３中の左右方向）を流路幅Ｗ12よりも十分に長くすることが好ましい。導入部１２がこのような形状を有することによって、基体１０の表面に液体試料を配置した際の液体試料の速度などの運動状態の影響を、流路壁との摩擦で平坦化（均一化）することができるため、反応部１３内での競合反応のばらつきを抑制することができる。たとえば、導入部１２は、流路長が１０ｍｍ、流路幅Ｗ12が１ｍｍの直線形状とすることができる。なお、本明細書において、流路幅とは、流路１１の上流側から下流側に向かう方向に直交する方向における流路１１の幅である。
【００３２】
流路１１のうちの反応部１３は、図１〜図３に示すように、上流側から下流側にかけて流路幅が連続的に増大した後に引き続き連続的に減少する形状に形成されており、液体試料中の測定対象物質を競合反応させることができる部分である。反応部１３は、図１〜図３に示すような形状を有することにより、導入部１２側から流入した液体試料を反応部１３内に均一に分散させることができる。たとえば、反応部１３は、流路長１２〜１５ｍｍで、流路幅が、上流側から下流側にかけて１ｍｍ（導入部１２の流路幅Ｗ12）から連続的に増大して最大となる部分の流路幅Ｗ13が６ｍｍとなった後、連続的に減少して１ｍｍ（堰き止め部１５の流路幅Ｗ15）まで狭くなる形状とすることが好ましい。また、反応部１３は、たとえば、流路長１２〜１５ｍｍで、流路幅が、上流側から下流側にかけて１ｍｍから連続的に増大して６ｍｍに到達した後、その最大流路幅の部分を所定長さ、たとえば３ｍｍ維持し、引き続き連続的に減少して１ｍｍまで狭くなる形状に形成されてもよい。
【００３３】
流路１１のうちの堰き止め部１５は、液体試料が、反応部１３から排出部１４に流出するのを抑制することのできる部分である。堰き止め部１５を反応部１３の下流側に隣接して配置させることにより、堰き止め部１５の上流側に液体試料を留めおくことができるため、反応部１３内での均一な競合反応を促進させることができる。
【００３４】
堰き止め部１５の流路幅Ｗ15は、反応部１３の流路幅Ｗ13よりも狭いことが好ましい。この形状により、反応部１３から排出部１４に液体試料が流出するのを抑制することができる。この場合、図１〜図３に示すように、堰き止め部１５は反応部１３の下流側を狭窄した構造となる。たとえば、堰き止め部１５の形状は、流路長が１ｍｍ、流路幅Ｗ15が１ｍｍの形状することができる。また、堰き止め部１５を構成する流路を、液体試料を流路の表面ではじくことが可能な撥液性にすることによっても、反応部１３から排出部１４に反応液が流出するのを抑制することができる。この場合、たとえば、堰き止め部１５を構成する基体１０の壁部をフッ素コートすることによって撥液性の堰き止め部１５を構成できる。特に、図１〜図３に示すように、堰き止め部１５を狭窄してその流路幅Ｗ15を反応部１３の流路幅Ｗ13よりも十分に狭くし、さらに、堰き止め部１５を構成する流路を撥液性とすることによって、液体試料の排出部１４への流出を抑制する効果を高めることができる。
【００３５】
このように、堰き止め部１５は、たとえば、開閉可能なバルブ構造のような複雑な構造ではなく、狭窄構造および／または撥液性を付与した構造のような簡素な構造とすることによって、反応部１３から排出部１４への液体試料の流れを抑制することができる。また、堰き止め部１５の構造をこのような構造とすることにより、堰き止め部１５より上流側の流路１１内の液量が所定量（堰き止め部１５が流出を抑制可能な液量）を超えた場合には、反応部１３から排出部１４への液体の流出を可能とする。このように、堰き止め部１５においては、反応部１３から排出部１４への液体試料の流出の有無を容易に制御することができる。したがって、堰き止め部１５が反応部１３から排出部１４への液体試料の流出を抑制する（無とする）ことによって、反応部１３内において均一な競合反応を促進させることができる。一方、堰き止め部１５が反応部１３から排出部１４への液体試料の流出を可能とする（有とする）ことによって、競合反応後の液体試料を排出部１４へ容易に流出させることができるため、反応部１３内の液体を、競合反応後の定量分析に必要な液体に容易に置換することができる。
【００３６】
流路１１のうちの排出部１４は、広い流路幅を有する直線状に形成されており、反応部１３から流出してきた液体試料を内部に留めて逆流させないようにするための部分である。反応部１３から堰き止め部１５を介して排出部１４に流入した液体試料は排出部１４内に留めおかれる。このため、排出部１４の形状は特に限定されないが、液体試料の逆流を抑制することのできる形状であることが好ましい。たとえば、排出部１４は、流路長が４７〜５９ｍｍ、流路幅Ｗ14が８〜１２ｍｍの長方形状とすることができる。この場合、排出部１４は反応部１３と比較して大きな容量を有するため、一度排出部１４に流入してきた液体試料などの液体が反応部１３に逆流するのを抑制することができる。
【００３７】
また、流路１１は、基体１０の上面に載置される蓋体（図示せず）などによって、閉塞されていてもよい。この場合、蓋体の導入部１２に対応する領域の一部に導入口を設けることによって、液体試料などの液体を流路１１内へ簡便に導入することができる。分析チップ１００が、基体１０の上面（流路１１が形成されている面）に蓋体を有することによって、クリーンな環境での分析が可能となり、分析の制度を向上させることができる。
【００３８】
また、図１に示すように、反応部１３には、測定対象物質であるコルチゾールの競合物質が予め固定化された担体２１が収納される。これにより、反応部１３は、反応部１３内に流入した液体試料中のコルチゾールの競合反応の場として機能することができる。
【００３９】
図４に、担体２１の構成の一例を説明するための模式図を示す。担体２１の表面には、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）３２が固定されており、ＢＳＡ３２に競合物質としてのコルチゾール３１が固定されている。このような担体２１は、たとえば、以下のように作製することができる。
【００４０】
すなわち、まず、担体２１の一例としてのメンブレンを準備する。次に、準備したメンブレンを、コルチゾールとＢＳＡとを結合させたＢＳＡ−ＣＯＲＴ結合体を含む溶液に浸漬してインキュベーションし、さらに、このメンブレンを５％ＦＢＳ（非働化ウシ胎仔血清）溶液などに浸漬してインキュベーションする。そして、浸漬後のメンブレンをリン酸バッファーなどで洗浄した後、室温環境下などで乾燥させる。なお、ＢＳＡ−ＣＯＲＴ結合体は、市販品を用いてもよく、適宜作製してもよい。以上の処理により、図４に示すように、リンカーであるＢＳＡ３２を介して、コルチゾール３１が固定化された担体２１が作製される。
【００４１】
担体２１の材料は特に限定されないが、タンパク質の吸着能に優れたメンブレン、たとえば、ポリスチレン、塩化ビニル、ニトロセルロースなどからなるメンブレンを好適に用いることができる。また、担体２１の形状も特に限定されないが、反応部１３内における液体の流れに影響を及ぼさない形状、たとえば、円、楕円状であることが好ましい。なお、担体２１は、反応部１３内に固定されていてもよく、反応部１３内に交換可能に配置されてもよい。担体２１を交換可能な状態で反応部１３内に配置することにより、分析チップ１００の繰り返しの利用が可能となり、分析コストの低減に繋がる。
【００４２】
また、図１に示すように、排出部１４には、吸収体２２が収納されていることが好ましい。吸収体２２は、液体試料などの液体を吸収することができる部材であればよく、たとえば、吸収性繊維、多孔性樹脂、高分子吸収体、または海綿により構成される部材が好ましい。とくに、ポリスチレン、塩化ビニルなどを好適に用いることができる。排出部１４内への吸収体２２の配置は必要不可欠ではないが、このような吸収体２２を排出部１４に収納させることにより、排出部１４の液体の吸収性能を高めることができる。また、吸収体２２を収納することにより、排出部１４に流入した液体を吸収体２２に留めおくことができるため、一度排出部１４に流入した液体が堰き止め部１５を介して反応部１３に逆流するのを効果的に抑制することができる。なお、吸収体２２は、排出部１４に固定されていてもよく、交換可能に配置されていてもよい。
【００４３】
以上説明したように、本実施の形態の分析チップ１００によれば、反応部１３から排出部１４への液体試料の流れを抑制することが可能な堰き止め部１５を備えることにより、反応部１３内に液体試料を留めおいて、反応部１３内での競合反応を十分かつ均一的に行わせることができる。また、競合反応後は、反応部１３内の液体試料を容易に排出部１４に流出させることができるため、競合反応を利用した定量分析を容易に実現することが可能となる。
【００４４】
＜分析方法＞
図５は、本発明の実施の形態における分析方法を示すフローチャートである。図６（ａ）〜（ｄ）は、本発明の実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す平面図である。図７（ａ）〜（ｄ）は、本発明の実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す断面図である。図８（ａ）〜（ｃ）は、反応部における競合反応を説明するための模式図である。以下、図５〜図８を参照して、一実施の形態における分析チップ１００を用いた分析方法、より具体的には、液体試料中のコルチゾールの濃度を測定する分析方法について説明する。なお、図７には、図１に一点破線で示す中心線に沿った断面を示している。
【００４５】
まず、図５に示すように、調製された反応液を反応部１３内に導入する（ステップＳ１）。なお、本実施の形態において、反応液とは、コルチゾールの濃度が不明である液体試料と、標識部を有する特異的結合物質（以下、「標識化特異的結合物質」という。）とを含有する液体を示す。
【００４６】
このような反応液を反応部１３内に導入する方法としては、たとえば、図６（ａ）および図７（ａ）に示すように、予め調製された、液体試料に標識化特異的結合物質を混合させた反応液４０を導入部１２上に配置する方法がある。これにより、導入部１２上の反応液４０は、反応液４０の自重により、導入部１２内に導入される。導入部１２内に導入された反応液４０は、たとえば、図６（ｂ）および図７（ｂ）に示すように反応部１３内に流入する。
【００４７】
導入部１２から反応部１３内に流入する際の反応液４０の流速は、導入部１２の流路幅Ｗ12が狭いことによって、比較的大きな速度となる。反応液４０の速度は、導入部１２よりも広い流路幅Ｗ13を有する反応部１３内で減速する。このとき、反応部１３の下流側には、堰き止め部１５が隣接しているため、反応部１３から排出部１４へと向かう流れは、堰き止め部１５によって抑制される。したがって、反応液４０は、反応部１３内に均一に分散されるとともに、反応部１３内に留めおかれる。
【００４８】
また、液体試料と、標識化特異的結合物質を含有する液体とを、それぞれ別々に導入部１２上にマウントしてもよい。この場合、導入部１２内に順に導入された液体試料と標識化特異的結合物質を含有する液体とが流路１１内で混合されるため、図６（ｂ）および図７（ｂ）に示すように、反応部１３内において、反応液４０として存在することができる。なお、堰き止め部１５が流出を抑制できる反応液４０の容量は、反応部１３の容量および堰き止め部１５の形状などによって適宜変化するため、あらかじめ、堰き止め部１５によって流出を抑制することが可能な反応液４０の液量を調べておくことが好ましい。
【００４９】
次に、図５に示すように、反応部１３内において、競合反応を行なう（ステップＳ２）。この競合反応について、図８（ａ）および（ｂ）を用いて説明する。
【００５０】
図８（ａ）を参照し、本工程において、反応部１３内には、担体２１の表面にＢＳＡ３２を介して固定化されたコルチゾール（以下、「固定化コルチゾール」という。）３１と、反応液４０中の液体試料に由来するコルチゾール３３と、標識化特異的結合物質３４とが存在している。なお、標識化特異的結合物質３４としては、たとえば、特異的結合物質としてのコルチゾール抗体３４ａに、標識としてのＨＲＰ（西洋わさび由来のHorseradish Peroxidase）３４ｂが結合された物質を用いることができる。固定化コルチゾール３１、コルチゾール３３、コルチゾール抗体３４ａが反応部１３内に存在することにより、図８（ｂ）に示すように、固定化コルチゾール３１とコルチゾール３３とが競合してコルチゾール抗体３４ａと結合する競合反応が起こる。
【００５１】
上述のように、本工程においては、反応液４０が存在する反応部１３内で、コルチゾール抗体３４ａを、固定化コルチゾール３１とコルチゾール３３とに均一に競合反応させることができる。なお、この競合反応を反応部１３内でより均一に行なうためには、反応液４０を反応部１３内に３０秒以上留めておくことが好ましく、１分以上留めておくことがより好ましい。
【００５２】
次に、図５に示すように、反応部１３内の反応液４０を排出部１４に排出する（ステップＳ３）。具体的には、図６（ｃ）および図７（ｃ）に示すように、流路１１のうちの堰き止め部１５の上流側の液量が、堰き止め部１５が抑制可能な液量より多くなるように、導入部１２から洗浄液４１を導入する。洗浄液４１を流路１１内に流入させて、堰き止め部１５の上流側に存在する液体の容量を堰き止め部１５が抑制可能な液量を超えさせることによって、反応部１３内の反応液４０を排出部１４へと排出させることができる。
【００５３】
堰き止め部１５から流出した反応液４０は、排出部１４の流路幅Ｗ14が堰き止め部１５の流路幅Ｗ15よりも十分に広いことにより、大きな流速で排出部１４に流入させることができる。また、排出部１４に流入した反応液４０は吸収体２２で吸収されるため、反応液３０の逆流を効果的に抑制することができる。なお、図７（ｃ）中に、吸収体２２に吸収された液体２２ａを概念的に示している。
【００５４】
本工程により、反応部１３内の反応液４０を排出部１４に流出させることができるため、図８（ｃ）に示すように、標識化特異的結合物質３４と結合したコルチゾール３３や、未結合の標識化特異的結合物質３４を反応部１３から除去することができる。なお、このとき、堰き止め部１５よりも上流側には洗浄液４１が存在していることになる（図６（ｃ）および図７（ｃ）参照）。
【００５５】
次に、図５に示すように、標識化特異的結合物質３４のＨＲＰ３４ｂに由来する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を測定する（ステップＳ４）。本工程は、たとえば、以下のように行なうことができる。
【００５６】
すなわち、図６（ｄ）および図７（ｄ）に示すように、標識部であるＨＲＰ３４ｂの基質を含有する基質溶液４２を反応部１３に導入する。具体的には、導入部１２から流路１１内へ基質溶液４２を導入することによって、反応部１３内の洗浄液４１が排出部１４へ流出させられるとともに、反応部１３内に基質溶液４２が満たされる。反応部１３内において、基質溶液４２中の基質は、固定化コルチゾール３１に結合した標識化特異的結合物質３４のＨＲＰ３４ｂとの酵素反応によって、蛍光を発する化合物、特異的な波長の光を発光する化合物、および特異的な波長を吸光する化合物のいずれか１種に変化する。
【００５７】
このような基質の化学変化に由来する蛍光、発光および吸光の少なくとも１つの応答を、分光光度計、フルオロメーターなどを用いて検出し、定量化することによって、固定化コルチゾール３１に結合したコルチゾール抗体３４ａの量を算出することができる。そして、このコルチゾール抗体３４ａの量から、液体試料中のコルチゾール３３の量を算出することができる。
【００５８】
ＨＲＰ３４ｂの基質としては、たとえば、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＲＥＤを用いることができる。Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＲＥＤは非蛍光物質であり、ＨＲＰによって化学変化することによって、蛍光物質であるレゾルフィンへと変化する。このため、レゾルフィン由来の蛍光を測定することによって、固定化コルチゾール３１に結合したコルチゾール抗体３４ａの量を算出することができ、これに基づいて液体試料中のコルチゾール３３の濃度を算出することができる。
【００５９】
また、標識部自体が、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を発する化合物であってもよい。たとえば、フルオレセインなどの蛍光物質を標識部として用いることによって、上述のような基質溶液を用いなくても、固定化コルチゾール３１に結合したコルチゾール抗体３４ａの量を、標識部自体の蛍光の強度から算出することができる。
【００６０】
また、本実施の形態の分析方法において、洗浄液４１を導入する工程を行わなくても良い。この場合、基質溶液４２を反応部１３内に過剰に流入させて、反応液４０を反応部１３から排出させるとともに、反応部１３内に基質溶液４２を満たすことによって、ステップＳ４とステップＳ５を同時に行なうことができる。この場合には、ステップＳ４とステップＳ５とを１つの工程で行なうことができるため、分析方法をより簡易にすることができる。
【００６１】
以上説明したように、本実施の形態の分析方法によれば、競合法を用いた定量分析を、上述の分析チップ１００を用いて簡便に行なうことができる。
【００６２】
＜分析システム＞
図９は、本実施の形態における分析システムを示す模式図である。以下、図９を参照して、一実施の形態における分析システムを説明する。
【００６３】
図９を参照し、分析システム２００は、分析チップ１００と、測定装置５０とを備える。測定装置５０は、分析チップ１００の反応部１３からの蛍光、発光および吸光からなる群から選択されたいずれか１つの応答に基づいて、液体試料中のコルチゾール３３を定量分析できる装置であれば特に限定されない。たとえば、上述のように、ＨＲＰ３４ｂの基質として、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＲＥＤを用いた場合、測定装置５０は、レゾルフィンの励起波長を出射する光出射器５１と、レゾルフィンから発生する蛍光を測定する検出器５２とを含む構成であればよい。この場合、たとえば、検出器５２が検出した蛍光の強度とレゾルフィンの検量線とを比較することによって、液体試料中のコルチゾールの濃度を測定することができる。
【００６４】
また、図９に示すように、分析システム２００は、測定結果を示すモニター５３を備えていてもよい。モニター５３を備えることにより、測定者が測定結果を容易に確認することができる。また、分析システム２００は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）と接続される構成であってもよい。この場合、分析システム２００の分析結果を容易にＰＣで処理することができる。
【００６５】
以上、本発明の分析チップの一実施形態、本発明の分析方法の一実施形態、および本発明の分析システムの一実施形態について、図１〜図９を用いて説明した。
【００６６】
本発明の分析チップによれば、反応部１３が、競合物質が予め固定化された担体２１を収納することができ、また、反応部１３の下流側に隣接する堰き止め部１５が、液体試料を含有する反応液を反応部１３内に留めおくことができる。これにより、反応部１３内での均一な競合反応が可能となる。また、堰き止め部１５は、堰き止め部１５よりも上流側に留めおかれている液量が堰き止め部１５がその下流側への流出を抑制できる液量を超えた場合に、反応部１３から下流側への液体の流出を許すことができる。これにより、反応部１３内の液体の置換が容易となり、競合反応に基づく蛍光、発光および吸光からなる群から選択されたいずれか１種を測定することができる。したがって、本発明の分析チップによれば、競合法を利用した測定対象物質の定量が容易となる。
【００６７】
また、本発明の分析方法によれば、本発明の分析チップを用いて、簡便に、競合法を用いた測定対象物質の定量を行なうことができる。また、マイクロウェルを用いた分析方法では、洗浄処理などの操作が複雑であり、高い定量性を維持するためには、その操作に熟練性が必要とされていたが、本発明の分析方法によれば、少なくとも、反応液の液量を調節することによって、簡便に高い定量性を維持することができる。
【００６８】
また、本発明の分析システムによれば、本発明の分析チップおよび分析方法を用いて、競合法を用いた定量が可能となる。また、蛍光、発光および吸光からなる群から選択される少なくとも１種を測定する分光光度計、フルオロメーターのような測定装置は小さく設計することが可能であるため、本発明の分析システムは容易に持ち運び可能な構成とすることができる。したがって、たとえば、液体試料を採取した場所でのフローアッセイを容易に行なうことができる。
【００６９】
また、本発明の分析チップ、分析方法および分析システムは、試験紙上の発色の有無基づいて、測定対象物質の有無を分析するような技術と異なり、液体中での蛍光、発光または吸光を測定して測定対象物質の濃度を分析することができる。このため、たとえば、分光測定の際のバックグラウンドを十分に低くすることができ、より高い定量性を維持することができる。特に、標識物質との反応によって蛍光を発する化合物へと変化する基質を用いることにより、感度の高い酵素反応を短時間で行なうことができ、もって、感度の高い迅速な定量分析が可能となる。また、試験紙を用いた場合と異なり、競合反応や酵素反応を液体中で行なうことができるため、各反応時のばらつきを低減することができ、もってよりばらつきのない正確な定量分析が可能となる。
【００７０】
なお、本実施の形態では、液体試料中の測定対象物質（濃度不明のコルチゾール）の競合物質（濃度既知のコルチゾール）を担体２１に固定化し、特異的結合物質（濃度既知の標識化されたコルチゾール抗体）と液体試料とを含有する反応液を流路１１内に導入した場合について説明したが、本発明はこれに限られない。たとえば、液体試料中の測定対象物質（濃度不明のコルチゾール）の特定的結合物質（濃度既知のコルチゾール抗体）を担体２１に固定化し、競合物質（濃度既知の標識化されたコルチゾール）と液体試料とを含有する反応液を流路１１内に導入してもよい。この場合、担体２１と結合した競合物質の標識部に由来する発光などを測定することにより、液体試料中のコルチゾールの濃度を分析することができる。
【００７１】
また、上述の本発明の説明では、コルチゾールを分析する場合について詳細に説明したが、反応部１３内の担体２１に固定化する物質を入れ替えることにより、競合法で分析可能な他のタンパク質を測定することができる。
【実施例】
【００７２】
（分析チップ）
基体１０として、幅１４ｍｍ、長さ７５ｍｍ、厚さ３ｍｍの直方体のアクリル樹脂基板を用いた。基体１０の表面には、長さ１０ｍｍ、流路幅１ｍｍの導入部１２、長さ１２ｍｍ、最大流路幅６ｍｍの反応部１３、長さ４７ｍｍ、流路幅９ｍｍの排出部１４、および長さ１ｍｍ、流路幅１ｍｍの部１５から構成される、図１〜図３に示すような流路１１を形フッ素コートが施された堰き止め成した。なお、流路１１の深さは２ｍｍとした。
【００７３】
担体２１として、直径６ｍｍのポリスチレンメンブレンを用い、その一方の表面に、ＢＳＡ−ＣＯＲＴ結合体を固定化したメンブレンを用い、吸収体として、幅１２ｍｍ、長さ５０ｍｍ、厚さ１ｍｍのセルロースからなる吸収体２２を用いた。なお、担体２１は、以下のようにして作製した。
【００７４】
すなわち、まず、ポリスチレンメンブレンを、ＢＳＡ−ＣＯＲＴ結合体（Fitzgerald社製）を０．８μｇ／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳバッファーに浸漬して３７℃で１２時間インキュベートした。次に、このポリスチレンメンブレンを、５％ＦＢＳ溶液に浸漬して３７℃で３０分インキュベートした。次に、このポリスチレンメンブレンをＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄し、３７℃で静置乾燥させて、担体２１を作製した。
【００７５】
上記担体２１を反応部１３内に収納し、上記吸収体２２を排出部１４内に収納し、この基体１０の上面に、蓋体として、幅１４ｍｍ、長さ７５ｍｍ、厚さ３ｍｍの直方体のアクリル樹脂基板を設置し、基体１０と蓋体がずれないように、両者を接着剤で接着させた。なお、蓋体のうち、導入部１２の最上流側に対応する部分に、導入口として直径１ｍｍの孔を設けた。以上の操作により、分析チップ１００を準備した。
【００７６】
（反応液）
液体試料として、コルチゾール（シグマアルドリッチ社製）の濃度が、それぞれ０ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を準備した。また、標識化特異的結合物質３４として、ＨＲＰ３４ｂが標識されたコルチゾール抗体３４ａを０．６μｇ／ｍｌの濃度で含有するＰＢＳバッファーを準備した。そして、各溶液（コルチゾール含有のＰＢＳ溶液およびコルチゾール抗体含有のＰＢＳバッファー）を１：１で混合することによって、反応液を調製した。
【００７７】
（洗浄液および基質溶液）
洗浄液として、ＰＢＳ−Ｔを準備した。また、基質溶液として、２６０ｍｇのＡｍｐｌｅｘ（登録商標）ＲＥＤを５ｍｌのＰＢＳ溶液に含有させた第１溶液と、２ｍＭの過酸化水素を含むＰＢＳ溶液からなる第２溶液とを準備した。なお、基質溶液は、導入口から流路内に導入させる直前に第１溶液と第２溶液とを混合して調製した。
【００７８】
（分析方法）
まず、分析チップ１００の蓋体の導入口上に１００μｌの反応液をマウントし、流路１１内に反応液を導入させた。導入後、反応液は迅速に反応部１３内に流入し、反応部１３内に溜まった（ステップＳ１）。その状態で分析チップ１００を１分間静置して、反応部１３内での競合反応を行なった後（ステップＳ２）、洗浄液を導入口から５００μｌ導入して、反応部１３内の反応液を排出部１４に排出させた（ステップＳ３）。そして、第１溶液と第２溶液とを１：１で混合した基質溶液を導入口から２００μｌ導入して、反応部１３内でのＨＲＰと基質の酵素反応を３分間行い、この反応部１３に向けて、フルオロメーターを用いて、波長５６０ｎｍの励起光を照射して、波長５９０ｎｍの蛍光を測定した（ステップＳ４）。なお、反応液の導入開始から酵素反応の終了までの操作は５分間以内で行うことができた。
【００７９】
（測定結果）
各反応液の競合反応後の測定結果を図１０のグラフに示す。図１０において、各反応液中のコルチゾール濃度が増加するに連れて、測定されたレゾルフィン由来の蛍光の強度が相対的に低下していることがわかった。したがって、競合反応を用いて、短期間で、高い感度でコルチゾールの濃度を測定することができた。また、たとえば、コルチゾールの各濃度に対応した検量線などを予め作成しておくことで、コルチゾールの濃度が未知の液体試料中のコルチゾール濃度を分析することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の分析チップ、分析方法及び分析システムは、競合法による測定対象物質の定量に好適に利用することができる。
【符号の説明】
【００８１】
１０ 基体、１１ 流路、１２ 導入部、１３ 反応部、１４ 排出部、１５ 堰き止め部、２１ 担体、２２ 吸収体、３１ 固定化コルチゾール、３２ ＢＳＡ、３３ コルチゾール、３４ 標識化特異的結合物質、３４ａ コルチゾール抗体、３４ｂ ＨＲＰ、４０ 反応液、４１ 洗浄液、４２ 基質溶液、５０ 測定装置、５１ 光出射器、５２ 検出器、５３ モニター、１００ 分析チップ、２００ 分析システム。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップであって、
基体と、該基体の表面に形成された、上流側から下流側へ前記液体試料を流すための流路と、を備え、
前記流路は、前記液体試料を前記流路に導入するための導入部と、該導入部の下流側に設けられた、前記液体試料を競合反応させるための反応部と、該反応部の下流側に設けられた排出部と、前記反応部と前記排出部との間に設けられた、前記反応部から前記排出部に前記液体試料が流れるのを抑制するための堰き止め部と、を含み、
前記反応部は、前記測定対象物質が特異的に結合する特異的結合物質または前記測定対象物質の競合物質が予め固定化された担体を収納する、分析チップ。
【請求項２】
前記堰き止め部の流路幅が前記反応部の流路幅よりも狭い、請求項１に記載の分析チップ。
【請求項３】
前記堰き止め部を構成する流路が撥液性である、請求項１または２に記載の分析チップ。
【請求項４】
前記導入部の流路幅が前記反応部の流路幅よりも狭い、請求項１から３のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項５】
前記排出部は、前記反応部から流出した前記液体試料を吸収するための吸収体を収納する、請求項１から４のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の分析チップと、
前記分析チップの前記反応部で発生する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答に基づいて、前記測定対象物質を分析するための分析装置と、を備える分析システム。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の分析チップを用いて、液体試料中の測定対象物質を分析する分析方法であって、
標識部を有する特異的結合物質または前記標識部を有する競合物質と、前記液体試料とを含有する反応液を前記反応部内に導入する工程と、
前記反応部内で、前記反応液と、前記担体に予め固定化された前記特異的結合物質または前記競合物質とを競合反応させる工程と、
前記競合反応させる工程の後に、前記反応液を前記排出部に流出させる工程と、
前記流出させる工程の後に、前記反応部内に残存する前記標識部を有する競合物質または前記標識部を有する特異的結合物質に由来する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答に基づいて、前記測定対象物質を分析する工程と、を含む、分析方法。
【請求項８】
前記導入する工程は、前記反応液を前記導入部から導入する工程を含む、請求項７に記載の分析方法。
【請求項９】
前記流出させる工程は、前記反応部に洗浄液を流入させる工程を含む、請求項７または８に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記標識部が、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を発する、請求項７から９のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１１】
前記分析する工程は、前記標識部と酵素反応する基質を含有する基質溶液を前記反応部に流入させる工程を含み、前記基質は、前記標識部と酵素反応することによって、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を引き起こす物質である、請求項７から９のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１】
液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップであって、
基体と、該基体の表面に形成された、上流側から下流側へ前記液体試料を流すための流路と、を備え、
前記流路は、前記液体試料を前記流路に導入するための導入部と、該導入部の下流側に設けられた、前記液体試料を競合反応させるための反応部と、該反応部の下流側に設けられた排出部と、前記反応部と前記排出部との間に設けられた、前記反応部から前記排出部に前記液体試料が流れるのを抑制するための堰き止め部と、を含み、
前記反応部は、前記測定対象物質が特異的に結合する特異的結合物質または前記測定対象物質の競合物質が予め固定化された担体を収納する、分析チップ。
【請求項２】
前記堰き止め部の流路幅が前記反応部の流路幅よりも狭い、請求項１に記載の分析チップ。
【請求項３】
前記堰き止め部を構成する流路が撥液性である、請求項１または２に記載の分析チップ。
【請求項４】
前記導入部の流路幅が前記反応部の流路幅よりも狭い、請求項１から３のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項５】
前記排出部は、前記反応部から流出した前記液体試料を吸収するための吸収体を収納する、請求項１から４のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の分析チップと、
前記分析チップの前記反応部で発生する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答に基づいて、前記測定対象物質を分析するための分析装置と、を備える分析システム。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の分析チップを用いて、液体試料中の測定対象物質を分析する分析方法であって、
標識部を有する特異的結合物質または前記標識部を有する競合物質と、前記液体試料とを含有する反応液を前記反応部内に導入する工程と、
前記反応部内で、前記反応液と、前記担体に予め固定化された前記特異的結合物質または前記競合物質とを競合反応させる工程と、
前記競合反応させる工程の後に、前記反応液を前記排出部に流出させる工程と、
前記流出させる工程の後に、前記反応部内に残存する前記標識部を有する競合物質または前記標識部を有する特異的結合物質に由来する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答に基づいて、前記測定対象物質を分析する工程と、を含む、分析方法。
【請求項８】
前記導入する工程は、前記反応液を前記導入部から導入する工程を含む、請求項７に記載の分析方法。
【請求項９】
前記流出させる工程は、前記反応部に洗浄液を流入させる工程を含む、請求項７または８に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記標識部が、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を発する、請求項７から９のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１１】
前記分析する工程は、前記標識部と酵素反応する基質を含有する基質溶液を前記反応部に流入させる工程を含み、前記基質は、前記標識部と酵素反応することによって、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか１つの応答を引き起こす物質である、請求項７から９のいずれかに記載の分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１２−２０２９２５（Ｐ２０１２−２０２９２５Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６９９４６（Ｐ２０１１−６９９４６）
【出願日】平成２３年３月２８日（２０１１．３．２８）
【出願人】（０００１１６０２４）ローム株式会社 (3,539)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２８日（２０１１．３．２８）
【出願人】（０００１１６０２４）ローム株式会社 (3,539)
【Ｆターム（参考）】
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