本発明は、標的核酸配列を含む試料を上流および下流オリゴヌクレオチドとともにインキュベートすることにより、切断構造を形成する段階、ならびにシグナルを生成するために切断構造をヌクレアーゼで切断する段階を含む、試料中の標的核酸配列の存在を示すシグナルを生成するための、方法、組成物およびキットを提供する。検出可能なシグナルの存在は、標的核酸配列および非侵入性の切断構造の存在を示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 以下を提供する段階:
3'から5'方向の順に第一の領域および第二の領域を含む、標的核酸、
3'から5'方向の順に第一の領域および第二の領域を含む、鋳型核酸、
該標的核酸の該第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、第一のオリゴヌクレオチド、
3'領域が、該標的核酸の該第二の領域に相補的であり、かつ
5'領域が、該標的核酸に相補的ではないが、該鋳型核酸の該第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、
5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド、
3'領域が、該鋳型核酸の該第二の領域に少なくとも部分的に相補的であり、かつ
5'領域が、該鋳型核酸に相補的ではない、
5'領域および3'領域を含む第三のオリゴヌクレオチド、
切断因子、および
重合因子;
(b) 該標的核酸、該鋳型核酸、該第一のオリゴヌクレオチド、該第二のオリゴヌクレオチド、該第三のオリゴヌクレオチド、該切断因子および該重合因子を、以下を可能とする反応条件の下で混合する段階：
第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一の切断構造の第一のフラップを形成する、該標的核酸と該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドのそれぞれとの間の二本鎖の形成、
第一のフラップの遊離を可能とする、該切断因子による第一のフラップの切断、
第三のオリゴヌクレオチドの5'領域が第二の切断構造の第二のフラップを形成する、遊離された第一のフラップと、該鋳型核酸と、該第三のオリゴヌクレオチドとによる第二の二本鎖の形成、および
該切断因子による第二のフラップの切断; ならびに
(c)第一の二本鎖が形成されると、該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドが少なくともニックによって分離される場合のみ、シグナルが生成される、第二のフラップの切断から生成した該シグナルを検出する段階
を含む、標的核酸を検出する方法。
【請求項２】
第一のオリゴヌクレオチドが、標的ヌクレオチド酸に非相補的な単一の3'ヌクレオチドを有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第二および第三のオリゴヌクレオチドが、切断抵抗性のオリゴヌクレオチドである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
遊離されたフラップが、鋳型核酸に非相補的な単一の3'ヌクレオチドを有する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第一のオリゴヌクレオチドが、標的ヌクレオチド酸に非相補的な二つまたはそれ以上の3'ヌクレオチドを有する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
第一のオリゴヌクレオチドおよび/または遊離されたフラップが3'ブロックを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
遊離されたフラップが、鋳型核酸に非相補的な二つまたはそれ以上の3'ヌクレオチドを有する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
第一の二本鎖が形成された場合に、第一および第二のオリゴヌクレオチドがニックによって分離される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
第一の二本鎖が形成された場合に、第一および第二のオリゴヌクレオチドが1ヌクレオチドギャップによって分離される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
第一の二本鎖が形成された場合に、第一および第二のオリゴヌクレオチドが2ヌクレオチドギャップによって分離される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
第一の二本鎖が形成された場合に、第一および第二のオリゴヌクレオチドが3ヌクレオチドギャップによって分離される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
第二の二本鎖が形成された場合に、遊離されたフラップおよび第三のオリゴヌクレオチドがニックによって分離される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
第二の二本鎖が形成された場合に、遊離されたフラップおよび第三のオリゴヌクレオチドが1ヌクレオチドギャップによって分離される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
第二の二本鎖が形成された場合に、遊離されたフラップおよび第三のオリゴヌクレオチドが2ヌクレオチドギャップによって分離される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
第二の二本鎖が形成された場合に、遊離されたフラップおよび第三のオリゴヌクレオチドが3ヌクレオチドギャップによって分離される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
フォワードプライマーをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
フォワードプライマーが標的核酸の第一の領域に相補的である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
リバースプライマーをさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
重合因子が5'から3'方向のエキソヌクレアーゼ活性を欠く、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
重合因子が熱安定性である、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
単一の酵素が重合因子および切断因子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
酵素が、大腸菌(E.coli) DNAポリメラーゼI、T7 DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、またはTaq DNAポリメラーゼである、請求項22記載の方法。
【請求項２３】
第一の酵素が重合因子を含み、かつ
第二の酵素が切断因子を含む、
請求項1記載の方法。
【請求項２４】
切断因子が5'ヌクレアーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
切断因子がFEN-1ヌクレアーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
5'ヌクレアーゼが熱安定性である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
第一および第二の酵素が単一の配合物中で提供される、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
第一の酵素がPfu DNAポリメラーゼであり、かつ
第二の酵素がFEN-1ヌクレアーゼである、
請求項23記載の方法。
【請求項２９】
反応条件が核酸重合反応条件である、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
核酸重合反応条件がポリメラーゼ連鎖反応条件である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
第三のオリゴヌクレオチドが相互作用性標識の対を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
相互作用性標識の対の第一のメンバーが、第三のオリゴヌクレオチドの5'フラップに機能的に結合される、請求項1記載の方法。
【請求項３３】
相互作用性標識の対の第二のメンバーが、第三のオリゴヌクレオチドの+1位に機能的に結合される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
相互作用性標識の対の第二のメンバーが、第三のオリゴヌクレオチドの+2位に機能的に結合される、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
相互作用性標識の対が、フルオロフォアおよびクエンチャーを含む、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
クエンチャーが、第三のオリゴヌクレオチドの+1位に機能的に結合され、かつ
フルオロフォアが、第三のオリゴヌクレオチドの5'フラップに機能的に結合される、
請求項35記載の方法。
【請求項３７】
シグナルの検出が、
第三のオリゴヌクレオチドが切断されると、相互作用性標識の対の第一のメンバーと第二のメンバーとの間の蛍光の変化を検出する段階
を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
第二のオリゴヌクレオチドおよび第三のオリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドがブロックされる、請求項1記載の方法。
【請求項３９】
(a) 以下を提供する段階:
3'から5'方向の順に第一の領域および第二の領域を含む、標的核酸、
3'から5'方向の順に第一の領域および第二の領域を含む、鋳型核酸、
該標的核酸の該第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、第一のオリゴヌクレオチド、
3'領域が、該標的核酸の該第二の領域に相補的であり、かつ
5'領域が、該標的核酸に相補的ではないが、該鋳型核酸の該第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、
5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド、
3'領域が、該鋳型核酸の該第二の領域に少なくとも部分的に相補的であり、かつ
5'領域が、該鋳型核酸に相補的ではない、
5'領域および3'領域を含む第三のオリゴヌクレオチド、
切断因子、および
重合因子;
(b) 該標的核酸、該第一のオリゴヌクレオチド、該第二のオリゴヌクレオチド、該切断因子および該重合因子を、以下を可能とする反応条件の下で混合することにより、反応混合物を形成させる段階：
第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一の切断構造の第一のフラップを形成する、該標的核酸と該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドのそれぞれとの間の二本鎖の形成、および
第一のフラップの遊離を可能とする、該切断因子による第一のフラップの切断;
(c)反応混合物中の、遊離された第一のフラップ、該第三のオリゴヌクレオチド、および該鋳型核酸を、以下を可能とする反応条件の下で混合する段階：
第三のオリゴヌクレオチドの5'領域が第二の切断構造の第二のフラップを形成する、遊離された第一のフラップと、該鋳型核酸と、該第三のオリゴヌクレオチドとによる第二の二本鎖の形成、および
該切断因子による第二のフラップの切断; ならびに
(d)該第一の二本鎖が形成されると、該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドが少なくともニックによって分離される場合のみ、シグナルが生成される、第二のフラップの切断から生成した該シグナルを検出する段階
を含む、標的核酸を検出する方法。
【請求項４０】
以下を含む、組成物:
(i) 標的核酸の第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、第一のオリゴヌクレオチド;
(ii) 3'領域が、標的核酸の第二の領域に少なくとも部分的に相補的であり、かつ
5'領域が、標的核酸に非相補的であるが、鋳型核酸の第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、
5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド; ならびに
(iii) 3'領域が、鋳型核酸の第二の領域に少なくとも部分的に相補的であり、かつ
5'領域が、鋳型核酸に非相補的であり、かつ
相互作用性標識の対の第一のメンバーが、5'領域に機能的に結合され、かつ
相互作用性標識の対の第二のメンバーが、3'領域に機能的に結合される、
5'領域および3'領域を含む第三のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
第一の領域および第二の領域を3'から5'方向の順に含む鋳型核酸をさらに含む、請求項40記載の組成物。
【請求項４２】
相互作用性標識の対の第二のメンバーが、第三のオリゴヌクレオチドの+1位に機能的に結合される、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
切断因子をさらに含む、請求項40記載の組成物。
【請求項４４】
重合因子をさらに含む、請求項40記載の組成物。
【請求項４５】
請求項40記載の組成物、およびその包装材料を含むキット。
【請求項４６】
切断因子をさらに含む、請求項45記載のキット。
【請求項４７】
重合因子をさらに含む、請求項45記載のキット。
【請求項４８】
(a) 以下を提供する段階:
3'から5'方向の順に第一の領域および第二の領域を含む、標的核酸、
該標的核酸の該第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、第一のオリゴヌクレオチド、
3'領域が、該標的核酸の該第二の領域に相補的であり、かつ
5'領域が、該標的核酸に相補的ではない、
5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド、
切断因子、および
重合因子;
(b) 該標的核酸、該第一のオリゴヌクレオチド、該第二のオリゴヌクレオチド、該切断因子および該重合因子を、以下を可能とする反応条件の下で混合する段階：
第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が切断構造の第一のフラップを形成する、該標的核酸と該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドのそれぞれとの間の二本鎖の形成、
該切断因子による第一のフラップの切断; ならびに
(c)第一の二本鎖が形成されると、該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドの相補的部分が少なくともニックによって分離される場合のみ、シグナルが生成される、第一のフラップの切断から生成した該シグナルを検出する段階
を含む、標的核酸を検出する方法。

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図２Ｆ】

【図２Ｇ】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【公表番号】特表２０１０−５１２７５４（Ｐ２０１０−５１２７５４Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４１６２８（Ｐ２００９−５４１６２８）
【出願日】平成１９年１２月１５日（２００７．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８７６８５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７６９４８
【国際公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０９２９１３１２）ホロジック　インコーポレイティッド (4)
【Ｆターム（参考）】