制御性Ｔ細胞は自己免疫を抑制する
本発明は、自己抗原特異的制御性Ｔ細胞濃縮組成物を作製する方法、並びに得られた組成物及び使用の方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ． Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ、Ｑｉｚｈｉ Ｔａｎｇ及びＥｍｍａ Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ
譲受人：Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
関連出願の相互参照
本願は、２００４年１月８日に出願された米国特許出願第６０／５３５，０８５号の優先権を主張する。
【０００２】
政府支援の確認
本研究は、ＮＩＨ ＮＣＲＲグラントＲ３７ ＡＩ４６６４３によって補助された。米国政府は、本願に対して発行される全ての特許に権利を有する場合がある。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は、今日、最も被害が大きく治療が困難な病気の多くを占め、代表的な自己免疫疾患には、とりわけ、糖尿病、ぶどう膜網膜炎および多発性硬化症が含まれる。
【０００４】
自己免疫を能動的に制御し、長期の寛容性を誘導するＴｒｅｇの潜在能力は、長期にわたる寛容性を誘導するための戦略として多大な活用性を秘めている。Ｔｒｅｇの活用は、この少量のＴ細胞サブセット（自己免疫傾向がある動物及び患者では、さらに少ない細胞の集団）を増殖し、性質を決定することができないために困難であった。例えば、最近の研究は、疾病の活動期中に抑制に対して抵抗性となる自己反応性Ｔ細胞のため、進行する自己免疫性糖尿病を回復させることは不可能であり得ることを示唆している。Ｔｒｅｇを生体外で増殖するための過去の尽力は、臨床的に十分な増殖及びインビボでの実証可能な効力を達成していない（例えば、Ｆｕ ｅｔ ａｌ． ， ２００４， Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ４，６５−７８）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数が少ないこと、それらのアネルギー性表現型及び多様な抗原特異性は、自己免疫及び移植拒絶を治療するためのこの強力な寛容原性集団を利用するための大きな困難となっている。
【０００５】
Ｈｏｒｗｉｔｚ（例えば、第６，８０３，０３６号及び第６，７９７，２６７号及び関連特許文献）、米国特許第６，５３４，０５５号；ＵＳ２００３／１２４１２２Ａ１；ＵＳ２００３／００８２８０６Ａ１；ＵＳ２００２／００５８０１９Ａ１；ＵＳ２００２／０１１９５６８Ａ１；ＵＳ２００３／０１１９１８５Ａ１；及びＵＳ２００２／００１９０４８Ａ１を含む、数多くの米国特許文献が、Ｔ細胞増殖について述べている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、自己抗原特異的制御性Ｔ細胞濃縮組成物を作製する方法、並びに得られた組成物及び使用の方法を提供する。一実施形態において、本発明は、（ａ）対象体適合性細胞の集団を取得することと；（ｂ）前記細胞の集団から得られた、自己抗原特異的制御性Ｔ細胞濃縮組成物を作製することと；及び（ｃ）前記対象体中での前記自己免疫反応を調節するために前記対象体中に前記組成物を導入することと；を含む、対象体中の自己免疫反応を調節する方法を提供する。
【０００７】
特定の実施形態において、前記細胞の集団は前記対象体から取得され、前記対象体とは異なるドナーから取得され、及び／又は末梢血から採取される。
【０００８】
特定の実施形態において、前記作製工程が、前記抗原特異的制御性Ｔ細胞を増殖すること及び／又は前記得られた細胞の集団から前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞を濃縮することを含む。
【０００９】
特定の実施形態では、前記増殖は、前記細胞の集団を自己抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物と接触させることによって達成される。
【００１０】
特定の実施形態では、制御性Ｔ細胞は、前記増殖工程の前に、または前記増殖工程の後に前記細胞の集団から濃縮される。
【００１１】
特定の実施形態では、前記刺激性組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原性ペプチド複合体、同時刺激因子又は第二の制御性Ｔ細胞刺激因子を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、前記同時刺激因子は、ＣＤ２８に結合するアゴニスト抗体などのアゴニスト抗体である。
【００１３】
特定の実施形態では、前記第二の刺激因子は、インターロイキン−２などのインターロイキンのようなサイトカインである。
【００１４】
特定の実施形態において、前記刺激性組成物は、細胞又はビーズなどの基材上に固定化される。
【００１５】
特定の実施形態において、前記作製工程は、含む。
【００１６】
特定の実施形態において、前記調節は、阻害することを含む。
【００１７】
本発明は、組成物の細胞の少なくとも５０％が天然の自己抗原特異的制御性Ｔ細胞である、細胞の集団を含む組成物も提供する。
【００１８】
特定の実施形態において、自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は、表Ａに示されているように、ＭＨＣクラスＩＩ分子中に提示されたペプチドに対して特異的である。
【００１９】
特定の実施形態において、前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は、対象に投与されたときに、自己免疫応答を調節するのに効果的である。
【００２０】
本発明は、自己抗原特異的制御性Ｔ細胞の組成物を作製するためのキットであって、（ａ）自己抗原特異的Ｔ細胞受容体刺激因子；及び（ｂ）同時刺激因子を含むキットも提供する。
【００２１】
特定の実施形態において、前記刺激因子は、ＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原ペプチド複合体である。
【００２２】
特定の実施形態において、前記同時刺激因子は、ＣＤ２８に結合する抗体などのアゴニスト抗体である。
【００２３】
特定の実施形態において、前記キットは、インターロイキン−２又はインターロイキン−１５などのインターロイキンのようなサイトカインなどの第二の制御性Ｔ細胞刺激因子をさらに含む。
【００２４】
特定の実施形態において、前記刺激因子及び前記同時刺激因子は、細胞又はビーズなどの基材上に固定化される。
【００２５】
本発明は、治療用制御性Ｔ細胞の生体外増殖のための方法及び組成物、並びに得られた組成物及び使用の方法を提供する。前記増殖方法は、一般的には、Ｔ細胞の混合集団からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）が濃縮された亜集団を単離する工程と；生体外増殖されたＴｒｅｇ細胞を取得するために、前記亜集団を（ｉ）ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子、（ｉｉ）ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子及び（ｉｉｉ）ＩＬ−２の有効量と接触させることによって、前記亜集団のＴｒｅｇ細胞を増殖する工程とを含み、前記増殖されたＴｒｅｇ細胞が免疫抑制を示し、前記単離工程は典型的には本明細書に記載された療法に適した自己免疫疾患に罹患し又は寛解しているヒト又は患者から得た前記集団を増殖させることによって典型的に始められる。
【００２６】
特定の実施形態において、前記亜集団は、＞９８％のＴｒｅｇ細胞、好ましくは＞９８％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔｒｅｇ細胞を含み；前記単離工程は陰性及び陽性免疫選択並びに細胞分取を含み；前記増殖工程が前記亜集団の少なくとも１００倍の増殖を達成し；ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子はＴＣＲ／ＣＤ３に対する多価抗体又はリガンドであり；ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子は、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、Ｂ７−１／２、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０又はＣＤ４０に対する多価抗体又はリガンドであり；ＩＬ−２の有効量は、２００ないし２５００ＩＵ ＩＬ−２／ｍＬ、及び／又はＴｒｅｇ細胞は、抗ＣＤ３又は同種異系抗原刺激されたＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖をインビトロで抑制し、又は移植片対宿主病を含む自己免疫をインビボで抑制する。
【００２７】
さらに特定の実施形態では、
糖尿病を有すると診断され、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、食後血糖値（ＰＰＧ）及び耐糖能（ＧＴＴ）から選択されるグルコース恒常性障害の兆候を示す患者中に導入された前記生体外増殖されたＴｒｅｇ細胞の有効量は、グルコース恒常性障害に改善をもたらし、前記改善は、１１０ｍｇ／ｄＬ以下のＦＰＧ、１４０ｍｇ／ｄＬ以下の２時間ＰＰＧ、及び７５ｇのグルコース負荷から２時間後における１４０ｍｇ／ｄＬ以下のＧＴＴから好ましくは選択され；
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子は抗ＣＤ３抗体であり、及び前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子が抗ＣＤ２８抗体であり、前記抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体が、１：１ないし１：２のＴｒｅｇ細胞：ビーズ比で与えられた常磁性ビーズ上に固定化されており；
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子及び前記増殖されたＴｒｅｇ細胞は抗原特異的であり、好ましくは、前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子がＭＨＣペプチド多量体であり、前記ペプチドが糖尿病関連自己抗原ペプチドであり、前記糖尿病関連自己抗原がグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、膵島細胞自己抗原（ＩＣＡ）及びインシュリンから選択され、前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子は抗ＣＤ２８抗体である。
【００２８】
本発明は、養子細胞免疫療法を必要としている患者中に、生体外で増殖された本発明のＴｒｅｇ細胞の有効量を導入する工程を含む養子細胞免疫療法に対する方法及び組成物も提供する。これらの方法は、一般的には、ヒトから得たＴ細胞の混合集団を抽出する工程と；Ｔ細胞の混合集団からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）が濃縮された亜集団を前記集団から単離する工程と；生体外増殖されたＴｒｅｇ細胞を取得するために、前記亜集団を（ｉ）ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子、（ｉｉ）ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子及び（ｉｉｉ）ＩＬ−２の有効量と接触させることによって、前記亜集団のＴｒｅｇ細胞を増殖する工程と；生体外増殖されたＴｒｅｇ細胞の有効量を患者中に導入する工程と；並びに得られた自己免疫の抑制を検出する工程とを含む。
【００２９】
特定の実施形態において、前記ヒト及び患者は糖尿病を有すると診断されて、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、食後血糖値（ＰＰＧ）及び耐糖能（ＧＴＴ）から選択されるグルコース恒常性障害の兆候を示す患者であり、前記亜集団が＞９８％のＴｒｅｇ細胞を含み；前記亜集団が＞９８％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇ細胞を含み；前記単離工程が陰性及び陽性免疫選択並びに細胞分取を含み；前記増殖工程が前記亜集団の少なくとも１００倍の増殖を実施し、前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子が、ＴＣＲ／ＣＤ３に対する多価抗体またはリガンドから選択され；前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子がＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０またはＣＤ４０Ｌに対する多価抗体及びリガンドから選択され；Ｉｌ−２の有効量が２００ないし２５００ ＩＵ ＩＬ−２／ｍＬであり；前記Ｔｒｅｇ細胞が抗ＣＤ３または同種異系抗原によって刺激されたＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を抑制し；及び／又は、生じたグルコース恒常性障害の改善として、得られた自己免疫の抑制が検出される。
【００３０】
さらに具体的な実施形態では、
前記改善は、１１０ｍｇ／ｄＬ以下のＦＰＧ、１４０ｍｇ／ｄＬ以下の２時間ＰＰＧ、及び７５ｇのグルコース負荷から２時間後における１４０ｍｇ／ｄＬ以下のＧＴＴから選択され；
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子は抗ＣＤ３抗体であり；及び前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子が抗ＣＤ２８抗体であり、前記抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体が、１：１ないし１：２のＴｒｅｇ細胞：ビーズ比で与えられた常磁性ビーズ上に固定化されており；及び／又は、
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子がＭＨＣペプチド多量体であり、前記ペプチドが糖尿病関連自己抗原ペプチドであり、糖尿病関連自己抗原がグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、膵島細胞自己抗原（ＩＣＡ）及びインシュリンから選択され、前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子は抗ＣＤ２８抗体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、所定の自己抗原特異的制御性Ｔ細胞濃縮組成物を作製する方法、並びに得られた組成物及び使用の方法を提供する。一実施形態において、本発明は、（ａ）対象体適合性細胞の集団を取得することと；（ｂ）前記細胞の集団から得られた、自己抗原特異的な、好ましくは所定の自己抗原特異的な制御性Ｔ細胞濃縮組成物を作製することと；及び（ｃ）前記対象体中での前記自己免疫反応を調節するために前記対象体中に前記組成物を導入することと；を含む、対象体中の自己免疫反応を調節する方法を提供する。
【００３２】
特定の実施形態において、前記細胞の集団は前記対象体から取得され、前記対象体とは異なるドナーから取得され、及び／又は末梢血から採取される。得られた細胞の集団は、自己抗原特異的制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を含み、末梢血、胸腺、リンパ節、脾臓及び骨髄などの自己抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞が存在する任意の取得源から得ることができる。ある種の実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞の取得源は死体の組織から得ることができる。
【００３３】
細胞の集団は、Ｔｒｅｇ濃縮組成物が引き続き導入される前記対象体から取得することができる。前記対象体は、自己免疫反応の調節が望まれる任意の哺乳動物とすることが可能である。興味深い哺乳動物には、げっ歯類、例えば、マウス、ラット；家畜、例えば、ブタ、ウマ、ウシなど、ペット、例えば、イヌ、ネコ；及び霊長類、例えば、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、前記対象体は自己免疫疾患の動物モデルである。多発性硬化症（ＥＡＥ：実験的自己免疫性脳脊髄炎）；重症筋無力症（ＥＭＧ：実験的重症筋無力症）及び神経炎（ＥＮＡ：実験的自己免疫性神経炎）など、寛容性を誘導するために自己抗原のＴ細胞エピトープを使用するための確立された動物モデルが多数存在する。別の実施形態では、前記対象体は、表Ａに列記されているいずれかの疾病／疾患などの自己免疫病又は疾患に罹患したヒトである。
【００３４】
別の実施形態では、前記細胞の集団は前記対象体とは異なるドナーから取得される。前記ドナーは、好ましくは、同系であるが、得られた細胞が、大規模な慢性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をもたらさずに、免疫抑制療法と必要に応じて組み合わせて対象体中に導入可能であるという点で対象体適合性であれば、同種異系、又は異種とすることも可能である。同種異系のドナー細胞は、好ましくは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性であり、典型的には、免疫抑制療法と組み合わせて投与される。対象体適合性とするために、異種細胞には、γ線照射又はＰＥＮ１１０処置を施すことができる（Ｆａｓｔ， ＬＤ ｅｔ ａｌ， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２００４ Ｆｅｂ； ４４ （２）：２８２−５）。
【００３５】
前記作製工程は、好ましくは、標的とされる自己免疫反応に関連する所定の自己抗原に特異的な、好ましくは標的とされる自己免疫反応と関連することが予め決定された前記細胞の集団から得られる所定の自己抗原特異的制御性Ｔ細胞濃縮組成物を提供する。特定の実施形態において、前記作製工程が、前記抗原特異的制御性Ｔ細胞を増殖すること及び／又は前記得られた細胞の集団から前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞を濃縮することを含む。
【００３６】
自己抗原特異的制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞濃縮組成物とは、自己抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞のパーセントが、細胞の最初に得られた集団中の自己抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞のパーセントより高い組成物である。具体的な実施形態には、前記組成物の前記細胞の少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％又は９８％が自己抗原特異的制御性Ｔ細胞である。特定の実施形態において、前記作製工程は、前記抗原特異的制御性Ｔ細胞を増殖すること及び／又は前記得られた細胞の集団から前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞を濃縮することを含む。
【００３７】
特定の実施形態では、制御性Ｔ細胞は、前記増殖工程の前に、又は前記増殖工程の後に前記細胞の集団から濃縮される。Ｔｒｅｇ細胞は、以下で実施例１及び２に記載されているように、免疫抑制性Ｔｒｅｇに対して特異的な細胞表面マーカーの選択を標的とし、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）などの自動化された細胞分取、固相磁気ビーズなどを用いて分離することによって濃縮することが可能である。濃縮を増強するために、陽性選択は、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６及びＣＤ５６を有する細胞の枯渇、及び以下に例示されているような非Ｔｒｅｇ細胞種に対して特異的な表面マーカーを含む細胞に対する陰性選択と組み合わせることができる。
【００３８】
特定の実施形態では、前記増殖は、前記細胞の集団を自己抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物と接触させることによって達成される。自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は、好ましくは少なくとも５０倍、並びに好ましくは少なくとも１００、２００、３００、５００及び８００倍に増殖される。自己抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物は、所望の自己抗原を認識するＴ細胞受容体を発現する自己抗原特異的制御性Ｔ細胞の生存、成長及び／又は増殖を促進する。
【００３９】
好ましい刺激組成物は、Ｔ細胞受容体複合体に抗原特異的に結合し、活性化させることによってＴ細胞を刺激する。架橋された、ペプチドが結合したＭＨＣ分子、抗体及び模倣物などの、様々な抗原特異的ＴＣＲ結合試薬を使用することができる。好ましい実施形態において、前記組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原ペプチド複合体、特にこのようなＭＣＨ／ペプチド複合体の会合体を含む。これらの複合体は、少なくとも、その中で自己抗原ペプチドが機能的に結合されているＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外ペプチド結合ドメインを含む。前記複合体は、溶液若しくは懸濁液中に存在することができ、又は細胞、特にＡＰＣの表面上に提示されるなど基材の上に固定化されることができる。ｌｉｔｅｒｕ中に見出し得るような、機能的ＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体を作製するための数多くの適用可能な方法が本分野において公知である。
【００４０】
一実施形態において、前記自己抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成できる天然に存在する自己抗原のペプチドである。典型的なＭＨＣクラスＩＩ分子／ペプチド複合体は、表Ａに列記されている。別の実施形態において、前記自己抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成できるミモトープペプチドである。
【００４１】
別の実施形態において、前記自己抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成できるミモトープペプチドである。ミモトープペプチドは、本文献中の以下でさらに、及び実施例１に記載されている。その他の点では従来どおりのＴ細胞からＴｒｅｇを増殖するために自己抗原ペプチドを使用するためのプロトコールには、細胞表面表現型とは独立に患者からＴｒｅｇを増殖するために、自己抗原特異的ＭＨＣペプチド四量体、ペプチドパルスＤＣ（Ｙａｍａｚａｋｉ， ｅｔ ａｌ， ２００３， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：２３５−４７）又は人工のＡＰＣ（Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０： １４３−８，２００２）を使用することが含まれる。さらに、インビトロ及びインビボアプローチの組み合わせが、前記療法の効果を増強することが可能である。例えば、最近の研究によって、自己抗原、変化されたペプチドリガンド及びＦｃＲ非結合抗ＣＤ３ｍＡｂなどの非特異的刺激の投与は、抗原特異的Ｔｒｅｇ活性を促進できることが示されている（Ａｐｏｓｔｏｌｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９：１４０１−８，２００３；Ｂｅｌｇｈｉｔｈ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２０２−８，２００３）。このように、Ｔｒｅｇを誘導するためのインビボ免疫化を生体外増殖と組み合わせること又はその逆は、有利であり得る。
【００４２】
ある種の実施形態では、前記刺激組成物は、一又は複数の追加因子、例えば、同時刺激因子、第二の制御性Ｔ細胞刺激因子又はＴ細胞の生存及び／又は成長を一般的に促進する因子をさらに含み得る。
【００４３】
ある種の実施形態において、前記同時刺激因子は、以下に記載されているように、ＣＤ２８又はＧＩＴＲなどのＴＣＲ同時刺激物質に対して特異的な抗体又はリガンドである。特定の実施形態では、前記同時刺激性因子は、ＣＤ２８に結合するアゴニスト抗体などのアゴニスト抗体である。
【００４４】
前記刺激組成物は、あるいは、第二の制御性Ｔ細胞刺激因子を含む。具体的な刺激因子には、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１３及びＩＬ−１５などのインターロイキン並びに肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が含まれる。特定の実施形態では、前記第二の刺激因子は、インターロイキン−２などのインターロイキンのようなサイトカインである。
【００４５】
特定の実施形態において、前記刺激性組成物の一又は複数の成分は、細胞又はビーズなどの基材上に固定化される。基質として使用するのに適切な細胞には、人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）（Ｋｉｍ， ＪＶ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００４ Ａｐｒ；２２（４）：４０３−１０； ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ， ＡＫ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２ Ｄｅｃ；１０５（３）：２５９−７２）が含まれる。ビーズは、典型的には１ないし２０ミクロンの範囲の、プラスチック、ガラス又は他の任意の適切な素材とすることができる。常磁性ビーズが好ましい。
【００４６】
前記刺激組成物の各成分の至適濃度、培養条件及び期間は、汎用の実験操作を用いて実験的に決定することが可能である。典型的な自己抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物は、実施例２に記載されている。
【００４７】
自己免疫反応を調節するために、増殖された及び／又は濃縮された自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は前記対象体中に導入される。例えば、前記対象体は、表Ａに列記されている疾病／疾患など、持続的又は再発性の自己免疫反応を有することを特徴とする疾病又は疾患に罹患し得る。特定の実施形態において、前記調節は、阻害することを含む。Ｔｒｅｇは、炎症の部位に、ＩＬ−４（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６： ４９７３−８０，２００１）、幹細胞増殖因子、血管新生制御因子、遺伝子の欠如などのような、抑制的又は他の生物学的因子を送達するための「トロイの木馬」としての役割を果たし得る。例えば、ｆｏｘｐ３の過剰発現は、そうでなければ病原性のＴ細胞をＴｒｅｇに形質転換することが示されており（Ｊａｅｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ２００４ Ｄｅｃ １０； ［Ｅｐｕｂ］）、極めて高い数及び効率性で強力な抗原特異的Ｔｒｅｇを生成するために、ポリクローナル性に増殖されたＴｒｅｇを、抗原特異的ＴＣＲプラスｆｏｘｐ３をコードする遺伝子で形質導入することが可能である（Ｍｅｋａｌａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２００４ Ｎｏｖ ４； ［Ｅｐｕｂ］）。このようにして、これらの抗原特異的アプローチは、Ｔｒｅｇ特異性と機能を最大化しつつ、高い細胞数に対する要求を減少させる。
【００４８】
抗原特異的Ｔｒｅｇは、感染症の病原性が病原体の細胞変性効果の結果ではなく、むしろ感染性因子に対する免疫炎症性応答によって引き起こされる組織損傷の結果である感染性疾患に特に適応される。Ｃ型肝炎又はＨＳＶによって誘導された角膜の炎症などの疾病において、Ｔｒｅｇ療法は、ウイルスによって誘導される免疫炎症性疾患を抑制するための好機を与える（Ｓｕｖａｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２：４１２３−４１３２，２００４）。コクサッキーなどのウイルスは、膵炎を引き起こすことが知られており、１型糖尿病の発症に関連している。このように、発現されたウイルス抗原を標的とするＴｒｅｇは、感染によって引き起こされる局所的な組織損傷を抑制し、自己免疫疾患の発症を誘発する炎症を低減するために使用することが可能である。
【００４９】
本発明は、組成物の細胞の少なくとも５０％が天然の（形質転換されていない）、好ましくは増殖された自己抗原特異的制御性Ｔ細胞であり、自己抗原特異性が好ましくは予め決定されており、好ましくは、標的とされる自己免疫反応抗原に対して予め決定されている、細胞の集団を含む組成物も提供する。前記組成物は、本明細書に記載されている方法によって作製される。前記組成物における自己抗原特異的制御性Ｔ細胞のパーセントは、実施例２に記載されている方法を用いて確認することが可能である。特定の実施形態には、前記組成物の前記細胞の少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％又は９８％が自己抗原特異的制御性Ｔ細胞である。
【００５０】
特定の実施形態において、前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は、表Ａに列記されているＭＨＣクラスＩＩ分子／ペプチド複合体に対して特異的である。
【００５１】
特定の実施形態において、前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は、対象体に投与されたときに、自己免疫応答を調節するのに効果的である。増殖された及び／又は濃縮された自己抗原特異的制御性細胞を使用する効果的且つ最適化された投薬量及び治療計画は、既存のＴ細胞注入療法の莫大な臨床実験から得られ、さらに実験的に決定することが可能である。
【００５２】
本発明の方法は、宿主中での異常な免疫応答の調節が望まれる様々な異なる症状の治療に用途を見出す。宿主中での異常な免疫応答とは、自己免疫応答として特徴付けられる対象体中での任意の免疫反応（例えば、自己免疫疾患）を意味する。一般的に、対象体の免疫系が自己抗原を外来として認識し、自己反応性エフェクター免疫細胞の産生をもたらすときに、自己免疫応答が生じる。自己反応性エフェクター免疫細胞には、細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及びＢ細胞を含む様々な系列から得られる細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。正確な機序は異なるが、自己免疫疾患に罹患している宿主中に自己反応性エフェクター免疫細胞が存在することによって、宿主の組織及び細胞の破壊が引き起こされ、病理的症候をもたらす。宿主中のこのような細胞の存在を、そして、それによる宿主中の抗原特異的自己免疫疾患などの自己免疫疾患の存在を決定するための数多くのアッセイが当業者に公知であり、容易に本発明の方法で使用される。興味が持たれるアッセイには、「Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２００３ Ｓｅｐ−Ｎｏｖ；３６（６−７）：３６１−６；Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２００３ Ｄｅｃ；２５ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ５７−６１；Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２００３ Ｎｏｖ；３（１１）：２０７７−８４；Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ． ２００３ Ｊａｎ；２（１）：４３−９」に記載されているアッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
治療とは、宿主中の異常な免疫応答を伴う症候の少なくとも改善が達成されることを意味し、ここで、軽減とは、治療されている症状に関連するパラメーター、例えば症候の規模が少なくとも低減することを表す広い意味で使用される。従って、治療とは宿主が症状、又は少なくとも該症状を特徴付ける症候にもはや罹患しないように、病理的症状又は少なくともこれに関連する症候が完全に阻害され（例えば、発生が抑制される）、又は停止される（例えば、終結される）状況も含む。
【００５４】
本発明の方法に従って、様々な宿主を治療することができる。ある種の実施形態において、このような宿主は、「哺乳動物」又は「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食動物目（例えば、イヌ及びネコ）、齧歯類（例えば、マウス、モルモット及びラット）、及び霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー及びサル）を含む哺乳綱に属する生物を記載するために広く使用される。多くの実施形態において、前記宿主はヒトである。
【００５５】
さらなる実施形態において、前記方法は、自己免疫疾患の存在を診断する工程を含む。診断とは、対象体の自己免疫応答が一般的に分類されること（例えば、糖尿病、ＳＬＥ、ＭＳなど）を意味する。さらに、異常な免疫応答が誘導される少なくとも一つの自己抗原が同定される。様々な診断法が本分野において公知であり、現在、開発中である。従って、本発明の方法は、宿主中の自己免疫疾患又はそれが誘導される抗原を診断するための特異的アッセイに限定されない。
【００５６】
上記方法の一又は複数を実施するための試薬及びそれらのキットも提供される。本発明の試薬及びそれらのキットは、極めて多様であり得る。ある種の実施形態において、該キットは、少なくとも抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物を含む。他の実施形態では、前記キットは、インターロイキン−２又はインターロイキン−１５などのインターロイキンのようなサイトカインなどの別の制御性Ｔ細胞刺激性因子を含む。ある種の実施形態において、前記キットは、培養皿又はフラスコ、培地、又は任意の必要な緩衝液、因子などを含む、前記抗原特異的制御性Ｔ細胞増殖工程を実施するための試薬をさらに含み得る。さらに別の実施形態において、前記キットは、前記制御性Ｔ細胞を含有する試料を採取するための手段と、制御性Ｔ細胞濃縮／精製を実行するために必要な試薬とを含む。
【００５７】
上記成分の他に、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための指示書をさらに含み得る。これらの指示書は様々な形態で本発明のキット中に存在することができ、一又は複数の指示書がキット中に存在することができる。これらの指示書が存在し得る一つの形態は、適切な媒体又は基材の上に情報を印刷することである（例えば、情報が印刷される一片又は複数片の紙の上、キットの包装中、パッケージ挿入物中など）。さらに別の手段は、その上に情報が記録されるコンピュータ読み出し可能な媒体（例えば、ディスケット、ＣＤなど）であり得る。存在し得るさらに別の手段は、離れた場所の情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。任意の便利な手段が、キット中に存在し得る。
【００５８】
具体的な実施形態において、前記刺激因子はＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原性ペプチド複合体である。典型的なＭＨＣクラスＩＩ分子／ペプチド複合体は、表Ａに列記されている。
【００５９】
前記同時刺激因子は、以下に記載されているように、ＣＤ２８又はＧＩＴＲなどのＴＣＲ同時刺激物質に対して特異的な抗体又はリガンドである。具体的な形態では、前記同時刺激因子は、ＣＤ２８に結合する抗体などのアゴニスト抗体である。
【００６０】
特定の実施形態において、前記刺激性因子及び前記同時刺激因子は、細胞又はビーズなどの基材上に固定化される。
【００６１】
本発明は、治療用制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の生体外増殖のための方法及び組成物、並びに自己免疫を抑制するための養子細胞免疫療法のためのこのような増殖されたＴｒｅｇ細胞の使用を提供する。
【００６２】
増殖方法は、ヒト又は患者からＴ細胞の混合集団をまず抽出することと、及びＴｒｅｇ細胞中で濃縮された亜集団を前記集団から単離することとを一般的に含む。効力を最大化するために、前記亜集団は少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％のＴｒｅｇ細胞、好ましくはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇ細胞になるように濃縮される。細胞は、一般的に、免疫制御性Ｔｒｅｇに対して特異的な選択細胞表面マーカーを標的とし、蛍光活性化細胞分取装置（ＦＡＣＳ）、固相磁気ビーズなどの自動化された細胞分取装置を用いて分離することによって濃縮される。濃縮を増強するために、陽性選択は、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６及びＣＤ５６を有する細胞の枯渇、及び以下に例示されているような非Ｔｒｅｇ細胞種に対して特異的な表面マーカーを含む細胞に対する陰性選択と組み合わせることができる。
【００６３】
次いで、Ｔｒｅｇ濃縮された亜集団は、ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子、ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子及びＩＬ−２の有効量の存在下で、前記細胞を培養することによって、生体外で増殖される。ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子は、抗ＣＤ３抗体などの抗原非特異的活性化因子を含む、ＴＣＲ／ＣＤ３に対する多価抗体又はリガンド、及びＭＨＣペプチド多量体（例えば、Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ， ｍｉｇｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， Ｄｅｃ １０，２００２ ； ９９（２５）：１６１６８−１６１７３；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｔ− Ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， Ｄｅｃ １，２００３；９（１６）：５９０２−５９０８； ａｎｄ Ｙｅｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ｍｅｌａｎｏｍａ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＴＬ ｆｒｏｍ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９９，１６２ ：２２２７−２２３参照）などの抗原特異的活性化因子から選択され、前記ペプチドは、典型的には、糖尿病関連自己抗原ペプチドなどの自己免疫疾患関連ペプチドであり、適切な糖尿病関連自己抗原には、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、膵島細胞自己抗原（ＩＣＡ）及びインシュリンが含まれ、このようなペプチドの組み合わせも使用することができる。
【００６４】
前記同時刺激物質活性化因子は、ＴＣＲ同時刺激物質、好ましくはＣＤ２８又はＧＩＴＲに対して特異的な多価抗体又はリガンドであるが（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２５ （＋）ＣＤ４（＋） ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＧＩＴＲ ｂｒｅａｋｓ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ， Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２ Ｆｅｂ； ３（２）：１３５−４２．Ｅｐｕｂ ２００２ Ｊａｎ ２２；Ｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｕｓｅ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ ｉｓ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００３ Ｄｅｃ ９；１００（２５）：１５０５９−６４． Ｅｐｕｂ ２００３ Ｎｏｖ ０７）、実験的に決定され得るように、適切な増殖がそのようして得られる場合には、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０及びＣＤ４０Ｌなどの別のＴＣＲ同時刺激物質も標的とすることができる。活性化及び増殖を促進するために、ＴＣＲ／ＣＤ３及びＴＣＲ同時刺激物質活性化因子は、典型的には、宿主細胞（例えば、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ， Ｄｅｃ ２００２， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０５，２５９−７２）又はビーズなどの三次元固相表面上に固定化される。特定の実施形態において、前記活性化因子は、２：１ないし１：５、好ましくは１：１ないし１：３のＴｒｅｇ細胞：ビーズ比で提供される常磁性ビーズ上に固定化される。最適なビーズサイズは、実験的に決定されるが、通例、１ないし２０ミクロンの直径の範囲にある。
【００６５】
ＩＬ−２は、典型的には組換え形態で与えられ、ＩＬ−２の有効量は、典型的には、２００ないし２５００ＩＵ ＩＬ−２／ｍＬである。本発明者らは、５００−２５００、好ましくは１０００ないし２０００ＩＵ ＩＬ−２／ｍＬの範囲にわたる通常ではなく上昇したＩＬ−２濃度を用いると、増殖が増加することを見出した。前記亜集団の標的Ｔｒｅｇ細胞は、好ましくは少なくとも５０倍、並びに好ましくは少なくとも１００、２００又は３００倍に増殖される。最大増殖は実験的に決定され、細胞の種類、インキュベーション条件などによって変動し得る。例示的な実施形態の場合、最大増殖は、約３００、５００及び８００倍であることが見出されている。
【００６６】
増殖されたＴｒｅｇ細胞の抑制機能は、インビトロ又はインビボで検出され得る。例えば、インビトロでは、増殖されたＴｒｅｇ細胞は、Ｆｃ受容体を有する細胞の存在下、抗ＣＤ３で刺激されたＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を又は被照射同種異系脾細胞で刺激されたＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を抑制することが示され得る。適切で典型的なインビボ動物モデル及びヒト臨床免疫抑制プロトコールは、以下でさらに記載されている。
【００６７】
特定の実施形態では、ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子及び増殖されたＴｒｅｇ細胞は自己抗原特異的である。例えば、このような特定の実施形態では、糖尿病と診断され（例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ： ｎｅｗ ｃｒｉｔｅｒｉａ， Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ． １９９８ Ｏｃｔ１５；５８（６）：１３５５−６２，１３６９−７０）、並びに空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、食後血糖値（ＰＰＧ）及び耐糖能（ＧＴＴ）などのグルコース恒常性障害の兆候を示す患者中に導入された、生体外で増殖されたＴｒｅｇ細胞の有効量は、特に、１１０ｍｇ／ｄＬ以下のＦＰＧ、１４０ｍｇ／ｄＬ以下の２時間ＰＰＧ、及び７５ｇのグルコース負荷から２時間後における１４０ｍｇ／ｄＬ以下のＧＴＴから選択される、グルコース恒常性障害の改善をもたらす。従って、本発明は、養子細胞免疫療法を必要としている患者中に、生体外で増殖された本発明のＴｒｅｇ細胞の有効量を導入することを含む養子細胞免疫療法のための方法及び組成物も提供する。
【００６８】
一般的に、これらの適用は、同じ患者から抽出された、増殖されたＴｒｅｇ細胞を再導入することを含むが、前記方法は、ドナー組織から得られたＴｒｅｇを用いた移植、特に骨髄移植に伴う植片対宿主病の治療のための養子細胞免疫療法にも適用することが可能である。
【００６９】
本明細書に開示されているように増殖されたＴｒｅｇの養子免疫伝達は、以下で例示されており、文献に記載されている動物モデル及びヒト臨床試験で実証されているように、糖尿病、ＧＶＨＤ、狼瘡、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、変性心疾患（例えば、Ｚｉａｄ Ｍａｌｌａｔ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｙｐｅ １ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ＥＢＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｉｃｅ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００３ Ｓｅｐ ９；１０８（１０）：１２３２−７）、炎症性腸疾患（クローン病）などを含む、多岐にわたる病原性自己免疫応答を抑制するのに有効である。
【００７０】
本発明者らの養子免疫細胞伝達プロトコールでは、まず、標的ドナーからＴ細胞の混合集団が抽出される。用途に応じて、Ｔ細胞は、寛解期の間に、又は病気の活動期の間に抽出され得る。典型的には、これは、全血を採取し、白血球分離採血法（ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって顆粒球を採取することによって行われる。例えば、大量白血球分離採血法（ＬＶＬ；ｌａｒｇｅ ｖｏｌｕｍｅ ｌｅｕｋａｐｈｅｒｉｓｉｓ）は、血液の白血球の収率を最大化させることが示されている。採取は、連続流アフェレーシス装置（Ｓｐｅｃｔｒａ， ＣＯＢＥ ＢＣＴ）を用いて、２０×１０６個細胞／Ｌに達する。低カルシウム血症の症候は、白血球分離採血法を通じて投与されるカルシウムの継続的注入によって回避される。典型的には、約１００ないし３００分にわたる時間の間に、全血液容量の約４倍に対応する１５ないし４５リットルの液体が採取される。
【００７１】
採取されたリンパ球は、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ６２などのＴｒｅｇ特異的細胞マーカーに基づいて、フローサイトメトリー又は他の細胞分離技術によって分離され、本明細書に記載されているように増殖され、次いで、養子免疫抑制のために患者（典型的には、細胞ドナー（ドナーとレシピエントが異なるＧＶＨＤを除く。））に注入され得る。あるいは、増殖に先立って及び／又は増殖に引き続き保存及び／又は輸送するために、細胞を凍結させてもよい。抗原非特異的増殖の場合、約１０９ないし１０１１個のＴｒｅｇが注入され、抗原特異的増殖の場合、治療的に有効な注入には、通例、約１０７ないし１０９個のＴｒｅｇ細胞が必要とされる。
【００７２】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）。生体外で増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、「Ｔａｙｌｏｒ， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９９，３４９３−９（２００２）」を改変した本発明者らの実験プロトコールにおいてＧＶＨＤの生成を阻害する。２×１０６個の新たに精製されたＢ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞プラス５×１０６個の骨髄細胞を、照射されたＢＡＬＢ／ｃｘＢ６（Ｆ１）レシピエント中に注入する。マウスの集団に、２ｘ１０６個の活性化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を別個に注射し、生存と重量をモニターする。生体外で増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の注入は、８０％のマウスで、１０日から１００日超まで、中央値生存時間を有意に増加させる。補充的な増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を与えられたマウスでの生存は、新鮮なＣＤ４＋Ｔ細胞のみを与えられた対照マウスとは有意には異ならず、保護効果は増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団に対して特異的であることを示唆している。「Ｅｄｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１１４４−５０（２００３）」から改変された実験的プロトコールでのＧＶＨＤの致死性を抑制するために、新鮮な（増殖されていない）ドナー由来ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を用いると、同様の結果が得られる。通常細胞とともに１：１の比で、生体外増殖されたＴｒｅｇ細胞を与えられた動物は、急性の致死的なＧＶＨＤから保護され、８０％超が１００日を上回って生存する。
【００７３】
増殖されたＴｒｅｇ細胞の同時移植後には、Ｔｃｏｎｖ細胞の移植片対腫瘍（ＧＶＴ；Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｔｕｍｏｒ）活性も維持される。ＧＶＨＤは、臨床的特徴及び生存、腫瘍増殖及び拒絶によって評価される。骨髄移植（ＢＭＴ）の時点で注入されたＡ２０−ｌｕｃ／ｙｆｐ細胞は、骨髄に遊走し、肝臓及びリンパ器官の二次的浸潤を伴う白血病をもたらす（Ｅｄｉｎｇｅｒ， ． ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ １０１，６４０−６４８（２００３））。Ｃ５７ＢＬ／６の動物から得たＴ細胞除去骨髄（ＴＣＤ ＢＭ）を移植され、１×１０４個のＡ２０−ｌｕｃ／ｙｆｐ白血病細胞を同時投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、長期にわたる生物発光画像法（ＢＬＩ）シグナル強度の増加によって実証されるように、白血病から３６日より前に死亡する。ＢＬＩ画像は、移植から５日後に腫瘍細胞が上腕骨、大腿骨及び胸骨の骨髄を浸潤し、１５日より前に、脾臓を含むその他の臓器を浸潤することを示す。ＴＣＤ ＢＭ及びＴｃｏｎｖ細胞を与えられた動物は、ＧＶＨＤよりさらに早く死亡するが、骨髄のみの対照群と同様の腫瘍細胞分布を示しながら、Ａ２０−ｌｕｃ／ｙｆｐ白血病の初期の移植を示す。これに対して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞とともにＴｃｏｎｖ細胞を与えられた動物の大多数は、６０日の観察期間中生存する。何れの動物も白血病の成長を示さないが、全ての動物が、５日の時点で、骨髄から初期腫瘍シグナルを示した。このことは、Ｔ細胞移植はＡ２０−ｌｕｃ／ｙｆｐ細胞の移植を妨害しないが、白血病細胞の活発な根絶は、ドナーＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞による致死的ＧＶＨＤから動物が保護されるときに達成されることを示している。これらのデータは、本発明者らの増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞によるＧＶＨＤ抑制が、養子免疫伝達されたドナーＴｃｏｎｖ細胞のＧＶＴ活性を抑制しないことを示している。
【００７４】
多発性硬化症（ＭＳ）。数多くの研究が、Ｔｒｅｇ細胞の喪失がＭＳ患者で観察される免疫制御の欠如に対する原因であること（例えば、Ｐｕｔｈｅｔｉ ｅｔａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ． ２００３ Ｓｅｐ； １０（５）：５２９−３５；Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６７：１２４５−５３． ２００１； Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２．１６９（１１）：６２１０−７；Ｓｃｈｍｉｅｄ， ｅｔ ａｌ． ， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００３ Ｍａｒ；１０６（３）：１６３−７４）、及び養子免疫細胞療法は疾病を軽減し得ること（例えば、Ｍｕｒａｒｏ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ ｏｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ２００３ Ａｕｇ；３２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ４１−４；Ｂｌｅｖｉｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ． ２００３ Ｊｕｎ； ２３（２）：１４７−５８； Ｋｏｈｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ ：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｃｔｉｖｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｎｏｖｌ， ２００２； １６９（９）：４７１２−４７１６． Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．２００３ Ｓｅｐ； １０（５）：５２９−３５）を示唆している。
【００７５】
ＭＳ患者を用いた養子免疫抑制療法の本発明者らによる初期の研究では、寛解期にＴ細胞を採取し、Ｔｒｅｇは抗ＣＤ３及びＣＤ２８抗体（上記）で増殖し、凍結して保存する。再発時に、前記増殖されたＴｒｅｇを注射によって注入し、ガドリニウムで増強した病変によって疾病の進行をモニターする（例えば、Ｈｏｒｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｕｓｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ． ２００３ Ａｐｒ；１７（４）：３８９−９７）。その後の研究では、抗原特異的増殖は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ；ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ；ｍｙｅｌｉｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｔｙｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ；ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）の免疫原性ペプチドと結合されたＤＲ２ ＭＨＣを用いて実施される。ＭＨＣペプチド多量体（上記）プラス抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２を用いて増殖が実施されることを除き、分離、増殖及び凍結保存を上述のように実施する。
【００７６】
関節リウマチ（ＲＡ）。以前の研究により、Ｔｒｅｇ細胞の喪失がＲＡ患者で観察される免疫制御の欠如に対する原因であることが示唆されており、治療的介入に対する動物モデルの正当性が確認されている。例えば、抗原特異的Ｔ細胞の規定された集団の役割を具体的に分析するために、慢性炎症性関節炎、オボアルブミンによって誘導された関節炎（ＯＩＡ；ｏｖａｌｂｕｍｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）の動物モデルが使用されてきた。例えば、「Ｈａｒｄｕｎｇ， Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ， Ｐｒｏｃ ３４ｔｈ Ａｎｎ Ｍｅｅｔ Ｇｅｒｍａｎ Ｓｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｓｅｐｔ ２４−２７，２００３」を参照。この系では、野生型の共通遺伝子レシピエント中に活性化された抗原特異的Ｔヘルパー細胞（Ｏｖａ−ＴＣＲｔｇ／ｔｇ）を伝達することは、抗原の関節内注射後に関節炎を誘導するのに十分であった。インビトロで分極されたＴｈ１細胞の伝達は、急性及び慢性の関節炎症をもたらした。さらに、Ｏｖａ−ＴＣＲｔｇ／ｔｇ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の同時伝達は、疾病の誘導を抑制した。
【００７７】
ＲＡ患者を用いた養子免疫抑制療法の本発明者らによる初期の研究では、寛解期に、ＰＢＭＣ又は関節の滑液からＴ細胞を採取し（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｒ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｏｒｇａｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００３ Ｊａｎ；３３（１）：２１５−２３）、Ｔｒｅｇは抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（上記）及びＩＬ−２とともに増殖し、凍結して保存する。増殖されたＴｒｅｇは、寛解期に注射によって注入し、確立された臨床的基準を用いて、疾病の進行をモニターする（Ｆｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｃｏｒｅ ｓｅｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｆｏｒ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ． Ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｍｅａｓｕｒｅｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ １９９３ Ｊｕｎ；３６（６）：７２９−４０； Ｆｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ． Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ １９９５ Ｊｕｎ； ３８（６）：７２７−３５）。
【００７８】
その後の研究では、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ＭＨＣ由来ペプチド及びＩＩ型コラーゲンなどの関節特異的抗原などのＲＡ関連自己抗原用のペプチドが結合されたＤＲ４ ＭＨＣを用いて、抗原特異的増殖が実施される（例えば、Ｋｏｔｚｉｎ， Ｕｓｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−ＤＲ４ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｓｙｎｏｖｉａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００ Ｊａｎ ４；９７（１）：２９１−６）。ＭＨＣペプチド多量体（上記）プラス抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２を用いて増殖が実施されることを除き、分離、増殖及び凍結保存を上述のように実施する。
【００７９】
乾癬。以前の研究により、Ｔｒｅｇ細胞の喪失が乾癬患者で観察される免疫制御の欠如に対する原因であることが示唆されており、治療的介入に対する動物モデルの正当性が確認されている（例えば、Ｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ：ｔｈｅ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １９９４ Ｎｏｖ； １０３，５ Ｓｕｐｐｌ，１５０Ｓ−１５３Ｓ参照）。
【００８０】
乾癬患者を用いた養子免疫抑制療法の本発明者らによる初期の研究では、寛解期にＰＢＭＣから又は病気の活動期に皮膚からＴ細胞を採取し、Ｔｒｅｇは抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（上記）及びＩＬ−３とともに増殖し、凍結して保存する。増殖されたＴｒｅｇは、寛解期に注射によって注入し、主要な臨床的終末点がベースラインと第１２週スコアを比較してＰＡＳＩスコアの平均パーセント変化である確立された臨床的基準を用いて、疾病の進行をモニターする（例えば、Ａｓｈｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ： ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｑｕａｌｉｔｙ． Ｂｒ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １９９９ Ａｕｇ； １４１（２）：１８５−９１）。
【００８１】
その後の研究では、抗原特異的増殖は、乾癬関連皮膚自己抗原のペプチドと結合されたＤＲ６ ＭＨＣを用いて、及び乾癬性関節炎の場合には関節自己抗原と結合されたＤＲ６ ＭＨＣを用いて実施される。ＭＨＣペプチド多量体（上記）プラス抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２を用いて増殖が実施されることを除き、分離、増殖及び凍結保存を上述のように実施する。
【００８２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎。以前の研究により、Ｔｒｅｇ細胞の喪失がＩＢＤ患者で観察される免疫制御の欠如に対する原因であることが示唆され、治療的介入に対する動物モデルの正当性が確認されている（例えば、Ａｓｓｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｉｔｏｇｅｎｉｃ Ｔｈｌ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｏｏｌ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｍｉｃｅ： ｃｏｎｔｒｏｌ ｂｙ ＣＤ４＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＩＬ−１０． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｊｕｌ １５； １７１（２）：９７１−８； Ｒｅａｄ， ｅｔ ａｌ．， １９９８．ＣＤ３８＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：３４３５； Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９８． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：６４９；Ａｓｓｅｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， １９９９． ＩＬ−１０ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ， ｗｈｉｃｈ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９０： ９９５参照）。
【００８３】
ＩＢＤ患者を用いた養子免疫抑制療法の本発明者らによる初期の研究では、寛解期にＰＢＭＣから又は病気の活動期に罹患した腸組織からＴ細胞を採取し、Ｔｒｅｇは抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（上記）及びＩＬ−２で増殖し、凍結して保存する。再発時に、前記増殖されたＴｒｅｇを注射によって注入し、炎症細胞の中度から重度の浸潤物、慢性的な間欠、長期の下痢、体重減少、嘔吐などを含む、胃腸炎の組織学的兆候と相関する確立された臨床基準を用いて疾病の進行をモニターする。ここでは、別の腸炎症の源は臨床的に除外される。
【００８４】
その後の研究では、抗原特異的増殖は、ＩＢＤ過敏性に関連する食事及び／又は細菌性抗原のペプチドに結合されたＨＬＡ−ＣＷ６を用いて実施される。ＭＨＣペプチド多量体（上記）プラス抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２を用いて増殖が実施されることを除き、分離、増殖及び凍結保存を上述のように実施する。
【００８５】
本発明は、本発明の方法によって作製されたＴｒｅｇ細胞組成物、特に、本明細書に記載されているように、自己免疫の抑制を必要としている患者中への注入に適合された組成物を提供する。例えば、このような組成物には、本明細書に記載されている増殖されたＴｒｅｇ細胞の注入可能な有効単位投薬量を含み、このような投薬量は、以下に記載されているように、キットとともに予め梱包してもよい。
【００８６】
本発明は、本発明の方法で使用するための試薬及び／又は材料を含み、本発明の方法について記載した指示媒体を必要に応じて含むキットを提供する。本発明は、本発明の方法又はキットの記述又は参照に対して特異的に適合され、及び／又は本発明の方法又はキットの記述又は参照を取り込む業務方法も提供する。
【００８７】
追加実施例
【実施例１】
【００８８】
インビトロで増殖された抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞は自己免疫性糖尿病を抑制する。
【００８９】
ここで、本発明者らは、自己免疫傾向のある非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウス由来の抗原特異的Ｔｒｅｇを増殖する着実な方法を記載する。インビトロで、２週間未満で、最大２００倍まで増殖されたＴｒｅｇは、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＦｏｘＰ３およびＧＩＴＲの発現を含むこのサブセットの典型的な特徴をすべて保持する伝統的なＴｒｅｇ表現型を発現し、インビトロおよびインビボの両方においてエフェクターＴ細胞機能を抑制するように機能する。インビボで前糖尿病性マウスおよび糖尿病性マウスにおいて糖尿病を抑制する、増殖されたＮＯＤＴｒｅｇの能力は、ポリクローナルＴｒｅｇと比較すると、自己抗原特異的Ｔ細胞を使用すると有意に亢進した。抗原特異的Ｔｒｅｇは、Ｔｒｅｇ欠乏性ＣＤ２８−／−マウスにおける糖尿病の発達を効果的に抑制し、慢性的に糖尿病の動物における同系膵島移植片拒絶反応を遮断し、先行する報告とは対照的に、Ｔｒｅｇは初めて、新たに発生した疾病を有するマウスにおいて糖尿病を回復させることが示される。それゆえ、これは少数の抗原特異的Ｔｒｅｇが疾病開始後に糖尿病を回復できるという最初の証明であり、自己免疫のための細胞内免疫療法への新規のアプローチを提供する。
【００９０】
自己抗原特異的ＴＣＲトランスジェニックＮＯＤマウス由来の調節性Ｔ細胞の増殖。先行研究は、ＮＯＤマウスにおいて１６〜２４週齢まで臨床的な疾病と相関する時間にわたり、Ｔｒｅｇが数および機能の上で減少することを示してきた。しかしながら、これらの細胞を治療上使用する能力は、循環またはリンパ系器官中の細胞が少数であるため、制限されている（ＮＯＤマウスにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞が５％未満、およびＴ１Ｄを有するヒトにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞が２％未満）。さらに、抗原特異性に基づいて細胞を選択することが困難であるために、数多くの細胞が必要とされる。それゆえ、本発明者らは、ＴＣＲトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおいて存在するこれらの細胞が、同時固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と外因性ＩＬ−２を使用して細胞周期へと駆動できるという知見に基づいて、自己抗原特異的Ｔｒｅｇの迅速かつ効率的な増殖のための技術を開発した。ＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８によりコーティングされたビーズとともに培養された、ＦＡＣＳ精製されたＮＯＤＴｒｅｇは、１１日間で１５０〜２２５倍に増殖した。一般に、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞はより激しく増殖した（複数の実験で３００〜８００倍の範囲）。したがって、ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかのわずかな夾雑がＴｒｅｇを増殖する能力に影響を与えるので、９８％を超える純度のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２＋Ｔ細胞はＴｒｅｇ増殖の成功にとって好ましかった。
【００９１】
免疫欠乏性ＮＯＤマウスにおいて疾病を転移させるための糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴｅｆｆ細胞の能力を、若齢ＮＯＤマウスから単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇが抑制したことを先行研究は報告している。しかしながら、前記処理は能率的ではなく、この設定におけるＴｒｅｇの抑制効果は、おそらく抗原特異的Ｔｒｅｇの低い前駆体頻度のためにＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆの０．５：１または１：１の比を必要とした。したがって本発明者らは、２つの異なる抗原特異的ＴＣＲＴｇマウス由来のＴｒｅｇがポリクローナルＮＯＤＴｒｅｇと同じ方法論を使用してインビトロで増殖できるか否かを検討した。ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇマウスは、β細胞の顆粒において発現される膵島抗原に特異的なＴＣＲを発現するのに対し、ＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇは前記膵島抗原から派生するペプチドであるグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）を認識する。ＴｒｅｇはＢＤＣ２．５マウスおよびＧＡＤ２８６マウスから精製され、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８とＩＬ−２カクテルを使用して増殖された。前記ＢＤＣ２．５細胞は、このＴＣＲと反応することがすでに示されているＭＨＣペプチド四量体で効率よく染色することに基づいてトランスジェニックＴＣＲαβを発現し、前記増殖されたＧＡＤ２８６ＴｒｅｇはＴｇＴＣＲβ鎖を発現した。ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２５−およびＴｒｅｇは、固定されたＭＨＣ−ペプチド二量体を使用して同様に効率よく増殖できる。これらの結果は、このプロトコールを使用して増殖できるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋の集団が野生型マウスおよびＴＣＲＴｇマウスの両者において存在することを示す。
【００９２】
本発明者らは、次に、前記増殖されたＴｒｅｇの表現型をフローサイトメトリー、ウェスタンブロットおよびリアルタイムＰＣＲにより検討した。前記増殖されたＴｒｅｇは、増殖されたＣＤ２５−Ｔ細胞と比較して、ＣＤ２５の高レベルの発現を維持したのに対し、ＣＤ６２Ｌの発現は両細胞タイプにおいて高いままであった。さらに、同様に増殖されたＣＤ２５−Ｔ細胞と比較して、Ｔｒｅｇがすべて高レベルのＳＯＣＳ２、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４を発現することを定量的ＰＣＲは示した。さらに、最近同定されたマーカーであるニューロピリンおよびＴＲＡＩＬも、前記増殖されたＴｒｅｇにおいて多量に発現した。高レベルの細胞表面ＧＩＴＲ発現は、増殖されたＴｒｅｇにおいて観察されたが、このすでに同定されたＴｒｅｇマーカーも増殖されたＣＤ２５−Ｔ細胞においても誘導された。定量的ＰＣＲ研究が５つの個別の増殖されたＴｒｅｇ集団（ポリクローナルＴｒｅｇおよびＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｒｅｇの両者を含む。）に関して実行され、その相対的な発現が高度に再現可能であったことは留意されるべきである。最後に、本発明者らは、Ｔｒｅｇについて最近同定された線形マーカーであるＦｏｘＰ３を検討した。ＲＴ−ＰＣＲ分析およびウェスタンブロット分析の両者によって示されるように、前記増殖されたＴｒｅｇは、新鮮なＴｒｅｇにおいて観察されるのと同様のレベルのＦｏｘＰ３を発現し、新鮮なまたは増殖されたＣＤ２５−Ｔ細胞よりも有意に高いレベルのＦｏｘＰ３を発現した。ＲＮＡ発現（１０倍）およびタンパク質量（２０倍）は、新鮮なＴｒｅｇに関する先行研究と一致したが、ＣＤ２５−Ｔｅｆｆ細胞中でのＦｏｘＰ３に明らかにいくらかの亢進があり、この培養条件がＣＤ２５−サブセット内でいくつかの制御性Ｔ細胞を誘導するかもしれないことを示している。
【００９３】
本発明者らは、また、サイトカインを分泌する前記増殖されたＴｒｅｇの能力も検討した。活性化されたＣＤ２５−Ｔ細胞とは異なり、ＴｒｅｇはＩＬ−２もＩＦＮγも産生しないが、むしろ免疫抑制性サイトカインであるＩＬ−１０およびＴＧＦβを発現した。したがって、Ｔｒｅｇの大規模な活性化と増殖は、ＣＤ２５−Ｔ細胞サブセットとは異なったままであるＴｒｅｇの表現型を変化させない。
【００９４】
インビトロで増殖されたＴｒｅｇの機能的活性。先行研究は、Ｔｒｅｇが抗ＣＤ３および脾臓ＡＰＣで刺激されるＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖性反応を効果的に抑制できることを示してきた。増殖されたＮＯＤＴｒｅｇは増殖性反応並びにＩＬ−２およびＩＦＮγを含むサイトカインの産生を効率よく抑制した。実際、複数の実験において、前記増殖されたＴｒｅｇは、新鮮なＮＯＤＴｒｅｇよりも有意に抑制した。前記抑制は１：１０未満のＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比で定期的に観察された。増殖されたＢＤＣ２．５ＴｒｅｇがポリクローナルＮＯＤＴ細胞と同様にＢＤＣ２．５の増殖性反応を抑制する上で効果的であるので、ＴＣＲＴｇマウス由来の増殖されたＴｒｅｇを使用して同様の結果が、観察された。Ｔｒｅｇ抑制機序の検討は細胞間接触が必要であることを実証する他の研究を裏付けた。前記増殖されたＴｒｅｇは有意なレベルのＩＬ−１０およびＴＧＦβを発現したが、抑制活性は抗ＩＬ−１０、抗ＴＧＦβ、または両抗体の組み合わせをインビトロ培養物へ添加することによって影響を及ぼさなかった。これらの結果は、細胞間接触がインビトロ設定における免疫抑制の基本的手段であるＴｒｅｇ抑制の数多くのモデルと一致する。
【００９５】
前記増殖されたＴｒｅｇの抗原特異性をさらに評価し、前記増殖されたＴｒｅｇが構成的に抑制性であるか否かを決定するため、正常ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の増殖されたＴｒｅｇが、ＯＶＡ特異的ＤＯ１１．１０ＴＣＲＴｇマウス由来のＴ細胞を抑制するそれらの能力について検討した。ＴｒｅｇおよびＤＯ１１．１０ＴｇＴｅｆｆ細胞を、（Ｔｅｆｆ細胞のみを活性化する）ＯＶＡ抗原または（ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇの両者を活性化する）抗ＣＤ３の存在下で共培養した。増殖されたＢＡＬＢ／ｃＴｒｅｇは、ＯＶＡペプチドにより刺激されるＤＯ１１．１０Ｔ細胞の増殖性反応を抑制しなかった。しかしながら、抗ＣＤ３反応は、低いＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比で完全に抑制された。このことは、増殖されたＴｒｅｇの構成的抑制活性の欠失および効果的な免疫抑制のためのＴｒｅｇの抗原特異的活性化についての必要性を裏付ける。この結果はまた、高レベルのＣＤ２５発現を通じて入手可能なＩＬ−２を消費することによって細胞が培養物を抑制しているという小さな可能性も除外した。
【００９６】
増殖されたＴｒｅｇの生体内生存および活性化。Ｔｒｅｇによる生体内での免疫反応の効果的な抑制は、細胞が適切な部位へ移動し、抗原に反応し、長時間生存することを要する。本発明者らは、ＣＤ２８／Ｂ７経路の遮断が生体内でのＴｒｅｇの迅速な損失およびその後の決定的な免疫調節の損失に至ることを最近観察した。したがって、本発明者らは、生体内で生存および増殖するための増殖されたＴｒｅｇの能力を検討した。ＮＯＤ、ＢＤＣ２．５、およびＧＡＤ２８６のマウス由来の増殖されたＴｒｅｇをＣＳＦＥで標識し、正常な非リンパ球減少症ＮＯＤマウスへと転移した。転移７日後、前記マウスを屠殺し、生存および増殖からの読み取りとしてＣＳＦＥ＋細胞の数について検討した。異なる系のマウス由来の増殖されたＴｒｅｇで転移したマウスから有意な数のＣＳＦＥ＋細胞を回収した。実際、ＣＦＳＥ＋ＴｒｅｇはＴｈｙ１．１により標識されたＴｒｅｇと同様、少なくとも転移５０日後に観察され、その数は同じ方法で転移された新鮮なＴｒｅｇで観察されるものと等しかった。
【００９７】
次に、本発明者らは、抗原に反応し、生体内で増殖する養子免疫伝達されたＴｒｅｇの能力を分析した。リンパ球減少症によって増殖が駆動される可能性を未然に防ぐため、Ｔｒｅｇを正常マウスへと導入した。少数だが有意な数のＴｒｅｇはＣＳＦＥ希釈に基づいて増殖した。しかしながら、膵臓リンパ節（ｐａｎｃＬＮ）におけるＮＯＤＴｒｅｇの選択的増殖がなかった。このことは、ＮＯＤＴｒｅｇレパートリーの範囲内で膵島自己抗原特異的細胞の有意な数がないことを示す。実際、ＮＯＤｐａｎｃＬＮ細胞中では、増殖されたＴｒｅｇの量が他のＬＮ細胞において観察されるよりも少なく、そのことは膵島特異的ＴｒｅｇがＮＯＤにおいて除去された可能性を示す。ＮＯＤＴｒｅｇとは対照的に、ＢＤＣ２．５Ｔｇマウス由来のＴｒｅｇは７日間の間、少なくとも３〜４倍に分割するｐａｎｃＬＮにおいて広範囲かつ選択的に増殖および増大された。興味深いことに、前記増殖されたＴｒｅｇはＣＤ６２Ｌ発現を下方制御した。細胞が導入前にインビトロで複数回の増殖周期を経験し、高レベルのＣＤ６２Ｌ発現を維持したため、このことは驚くべきことである。ＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇとは対照的に、ＧＡＤ２８６Ｔｒｅｇは生体内で増殖しなかった。先行研究はこれら２つのＴＣＲＴｇマウスがそれらの胸腺発達において有意に異なることを示唆する。前記ＢＤＣ２．５Ｔｇマウスは胸腺における膵島特異性を負に選択せず、むしろこの動物に存在する有力なエフェクター細胞により疾病を遮断することが示されてきたＴｒｅｇを小さいが再生可能な数発達させる。比較すると、逸出する細胞が代わりのＴＣＲα鎖を利用するように、ＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇＴ細胞は前記胸腺において負に選択される。末梢のＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇ細胞はインビトロでＧＡＤペプチドに反応するが、その反応性は弱く、およびＢＤＣ２．６とは対照的に、養子免疫伝達に際して糖尿病を誘導できない。このことは、自己反応性レパートリーの「欠如」を示す。したがって、前記増殖されたＴｒｅｇを使用するこれらの結果は、生体内において帰巣および生存し、さらなる信号を受信して抗原特異的サブセットをさらに活性化および増殖する、循環自己反応性ＴｒｅｇをＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇマウスではなくＢＣＤ２．５ＴＣＲＴｇマウスが有することを示す。
【００９８】
インビトロで増殖されたＴｒｅｇは生体内での糖尿病の養子免疫伝達を抑制する。次に、本発明者らは、活性化されたＢＤＣ２．５Ｔ細胞のＮＯＤ．ＲＡＧマウスへの生体内での同時導入後に糖尿病を抑制する前記増殖されたＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇの能力を検討した。前記Ｔｒｅｇは糖尿病の導入を遮断する上で効果的であり、Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆが１：９の比と同程度で低く機能するのに対し、前記ＧＡＤ２８６Ｔｒｅｇは１：１のＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆでさえ保護しなかった。実際、前記増殖されたＢＤＣ２．５ＴｒｅｇはポリクローナルＴ細胞によって媒介される疾病を抑制した。僅か２×１０６個の増殖されたＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇが、疾病を導入する２５×１０６個の糖尿病誘発性ＮＯＤ脾細胞の能力を遮断した。前記ＢＤＣ２．５マウス由来の増殖された抗原特異的Ｔｒｅｇは糖尿病の開始を予防する上で増殖されたポリクローナルＮＯＤＴｒｅｇよりもさらに効果的であり、上述の異なる増殖性の差異と一致した。８×１０６個に達する増殖されたＮＯＤＴｒｅｇは、１／４の数の前記抗原特異的ＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇを使用する疾病導入の総遮断と比較すると、糖尿病誘発性細胞の導入されたＲＡＧレシピエントの２５％で糖尿病を予防するにすぎなかった。この結果は、Ｔｅｆｆ細胞に対するポリクローナルＴｒｅｇの高い比がこの設定における疾病導入を効率よく抑制するのに必要であることを示唆する先行研究の知見と一致する。重要なことに、これらのデータは、Ｔｒｅｇのインビトロでの反応性がこの疾病における生体内機能を推定しないことを示す。
【００９９】
増殖されたＴｒｅｇは非リンパ球減少症の設定において生体内で糖尿病を予防する。Ｔｒｅｇの免疫調節性活性を示す複数のモデルはあるが、そのシステムの多くはＴｒｅｇ増殖を亢進するリンパ球減少症マウスを利用する養子免疫伝達モデルに基づいている８，２１−２４。それゆえ本発明者らは、非リンパ球減少症動物モデルにおける糖尿病を予防するための前記増殖されたＴｒｅｇの能力を検討した。先行研究は、ＣＤ２８−／−ＮＯＤマウスが正常数のＴ細胞およびＴｈ１反応を有することを示してきた。実際、これらのマウスは強くＣＤ２８依存性であることが示されているＴｈ２およびＴｒｅｇの欠乏性のため、悪化した自己免疫性を発達させる。したがって、本発明者らは、野生型により増殖されたＢＤＣ２．５ＴｒｅｇがＣＤ２８−／−ＮＯＤマウスへと導入できるかどうか、及び疾病の開始を遅延または予防できるかどうかを検討した。５×１０５個のＴｒｅｇを５週齢のＣＤ２８−／−ＮＯＤマウスへと導入し、糖尿病について観察した。増殖されたＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇの導入は、導入後２０週もの間検討されたマウスの１００％において糖尿病の発達を予防した。対照的に、増殖されたＮＯＤＴｒｅｇの導入は疾病の発症に何ら影響しなかった。これらの結果は、抗原特異的な増殖されたＴｒｅｇが完全に機能的な病原性Ｔ細胞反応に直面して生体内で機能したことを示す。
【０１００】
増殖されたＴｒｅｇは生体内で糖尿病を回復させる。Ｔｒｅｇ療法の最終的な有用性は、進行する疾病を有する個体を治療できることによって決まる。したがって本発明者らは、糖尿病の明らかなモデルにおけるこれらの増殖されたＴｒｅｇの調節効果の検討を展開した。最初に、本発明者らは同系のＮＯＤ膵島移植片の拒絶を遮断する増殖されたＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇの能力を検討した。少なくとも２週間の間インスリンペレットを使用して、糖尿病ＮＯＤマウスにおいて正常血糖を維持した。そのとき、前記マウスに５００個の同系膵島細胞のみをまたは増殖されたＴｒｅｇと同時に導入した。５×１０６個のＮＯＤではなく、２×１０６個のＢＤＣ２．５の増殖されたＴｒｅｇを同時伝達すると、この条件で進行する自己免疫性を遮断する抑制細胞の能力と一致して、前記同系の膵島の拒絶を遮断した。より重要なことに、増殖されたＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇの養子免疫伝達は、明瞭に糖尿病のＮＯＤマウスにおける糖尿病を回復させた。この設定において、１×１０７個のＴｒｅｇは、血糖レベルの上昇（３００ｍｇ／ｄＬ超）に基づいて最近疾病を発症したと診断されたＮＯＤマウスへと伝達された。前記伝達されたＴｒｅｇは前記マウスの６０％において糖尿病を回復させた。したがって、前記増殖されたＴｒｅｇは、進行する自己免疫設定において糖尿病を遮断および回復させることに特に効果的である。
【０１０１】
Ｔｒｅｇが糖尿病を回復できるという本発明者らの見解は、臨床自己免疫療法に対する本発明者らの方法の適用可能性を示すものであり、そこではＴｒｅｇが（例えばＳＬＥまたはＭＳの場合）寛解期または（例えばＴ１Ｄの場合）疾病発症直後のいずれかの患者から単離される。前記細胞を次に増殖し、最大疾病活性の時点で再導入し、前記炎症反応を抑制する。本発明者らは、この療法がラパマイシン、抗ＣＤ３、またはＴｒｅｇに影響せずに病原性細胞の欠失を惹起する他の薬物と組み合わせることができることを発見した。総合して、これらの療法はいずれも短期病原性反応を低下させる一方で、長期間の耐性誘導のための恒常性平衡を回復する。
【実施例２】
【０１０２】
ＮＯＤマウス由来の機能的内因性抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の増殖：抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は自己免疫性糖尿病を調節する。
【０１０３】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、自己免疫性を調節するために極めて重要である。証拠は、Ｔｒｅｇの発達および機能が抗原特異性に依存することを示唆する。これにもかかわらず、自然の状態で生じる抗原特異的Ｔｒｅｇについてほとんどわかっていない。この実施例において、本発明者らは非肥満性糖尿病マウスにおいて膵島ペプチド擬似体を認識し、自然に惹起するＴｒｅｇを同定しおよび特徴付ける。抗原特異的Ｔｒｅｇは、原型の表面マーカーおよびサイトカインを発現する。増殖されたＴｒｅｇは、抗原特異的様式で活性化されるが、インビトロおよび生体内の両者においてバイスタンダー抑制（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）できた。重要なことに、前記膵島ペプチド擬似体特異的Ｔｒｅｇは、自己免疫性糖尿病を抑制する上でポリクローナルＴｒｅｇよりも効率がよかった。本発明者らの開示は器官特異的自己免疫性に対する治療剤としてのＴｒｅｇの利用を示す。
【０１０４】
自己免疫性１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、自己抗原に対する耐性を維持することに関与する機構の崩壊により発症し、Ｔ細胞により仲介される膵臓のインスリン産生膵島細胞の破壊に至る。潜在的に病原性の自己反応性Ｔ細胞は、正常な末梢Ｔ細胞レパートリーに存在するが、健常な個体では、抑制因子または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって一部調節される（１，２）。Ｔｒｅｇのクラスのうち、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇは自己免疫性を調節するのに重要な独特な細胞サブセットである（３，４）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴｒｅｇまたはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの発達および抑制因子機能を調節する転写因子であるＦｏｘｐ３を欠乏するマウスおよびヒトは多臓器自己免疫性疾患を経験する（５−１１）。ＣＤ４＋Ｃ２５＋Ｔｒｅｇの抑制因子機能の低下または悪化は、Ｔ１Ｄ、多発性硬化症、関節リウマチおよび他の自己免疫性疾患と関連付けられてきた（１２−１６）。比較すると、ポリクローナルＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の導入は、Ｔ１Ｄのマウスモデルである非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおける自己免疫性糖尿病を含む多くのシステムにおける自己免疫を予防した（１７，１８）。しかしながら、前記過程は非効率的であり、多数のＴｒｅｇの導入を必要とした。本発明者らは、最近、ＩＬ−２並びに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂでコーティングされたビーズの組み合わせを使用して、膵島抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＢＤＣ２．５Ｔ細胞受容体トランスジェニック（ＴＣＲＴｇ＋）Ｔｒｅｇのインビトロ増殖のための方法を記載した（１９）。前記増殖された膵島特異的Ｔｒｅｇは、ポリクローナルＮＯＤＴｒｅｇと比較して有意に減少した数のＴｒｅｇを使用して、ＮＯＤマウスにおける糖尿病を遮断および回復させる上で効果的であり、Ｔｒｅｇの抗原特異性が治療の有効性に重要であることを示した。それゆえ、効果的な臨床療法は、ポリクローナル集団由来の関連する抗原特異的Ｔｒｅｇを同定および増殖する能力に依存する（２０）。
【０１０５】
自然条件下で生じるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの抗原特異性については比較的わずかなことが分かっているにすぎない。本研究において、本発明者らは、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋マウスが有意な割合の膵島抗原特異的Ｔｒｅｇを有しているため、この特異性は同様に既存のＮＯＤマウスにおいて存在するかもしれないと仮説を立案した（１９，２１，２２）。したがって、本発明者らは、抗ＣＤ３ｍＡｂを、ＢＤＣ２．５ＴＣＲミモトープペプチド１０４０−３１（ｐ３１）を呈する組み換えＭＨＣクラスＩＩのＩ−Ａｇ７と置換することによって、ＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇ研究に使用される増殖プロトコールを適応させた（２３）。内因性ＢＤＣ２．５抗原がまだ同定されていないため、前記ミモトープペプチドを使用した（２４）。ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７ビーズがポリクローナル集団由来の低頻度の抗原特異的細胞を増殖できるか否かを決定するため、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋ＴｒｅｇをＮＯＤマウス由来のポリクローナルＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞へと播いた。前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７および抗ＣＤ２８によってコーティングされたビーズは、外因性ＩＬ−２の存在下でＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇを増殖する上で特に効率よかった。０．１％ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇで最初に播いた培養物は約４倍に増殖されたのに対し、０．０１％および０．００１％ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇで播いた培養物は感知できるほどには増殖しなかった。しかしながら、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体を使用して抗原特異的細胞を検出するフローサイトメトリー分析によって、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇがすべての培養物において増殖されたことが評価された。最低濃度の播種において、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇは０．００１％から３４．３％の集団へと成育した。このことは、１０日間の培養で前記抗原特異的細胞のほぼ５０００倍の増殖に至る培養期間中における１２細胞よりも多い細胞分裂を反映した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇがペプチド−Ｉ−Ａｇ７でコーティングされたビーズによる増大後の調節活性を保持することを確認するため、新鮮に単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５−ＢＤＣ２．５Ｔｇ＋レスポンダー細胞を、増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＢＤＣ２．５Ｔｇ＋Ｔｒｅｇの滴定と組み合わせて使用して抑制アッセイを実行した。増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇは、前記ＢＤＣ２．５ミモトープペプチド１０４０−３１で刺激される培養物において投与量依存的な態様で、前記ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞反応を効率よく抑制した。さらに、抑制活性はインビトロでの複数回の刺激後に喪失されなかった。０．００１％で最初に播き、およびペプチド−Ｉ−Ａｇ７ビーズによる２回の刺激の後５０％にまで増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＢＤＣ２．５Ｔｇ＋細胞は、前記ｐ３１ペプチドにより刺激されるＣＤ４＋ＣＤ２５−ＢＤＣ２．５Ｔｇ＋細胞を抑制した。したがって、抗原特異的ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇ細胞が総ポリクローナルＴｒｅｇ集団の非常にわずかな割合を呈したときでさえ、前記手法は、抑制機能を保持する抗原特異的Ｔｒｅｇの大きな増殖に至った。
【０１０６】
本発明者らは、次に、このアプローチを既存のＮＯＤマウス由来の抗原特異的ＣＤ４＋Ｃ２５＋Ｔｒｅｇの増殖へ適用した。ＮＯＤマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞を材料および方法において記載されるようなｐ３１−Ｉ−Ａｇ７ビーズとともに培養した（２５）。７〜１４日間かけて、前記総集団は、最初の細胞入力と比較して１〜１０倍に典型的に増殖された。フローサイトメトリー分析は、前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７ビーズによる増殖の後、１０％にまで上るＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体に対して正に染色するのに対し、抗ＣＤ３によりコーティングされたビーズで増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞はバックグラウンドレベルを超えるｐ３１−Ｉ−Ａｇ７に対する正の染色には至らないことを示した。同じ培養条件下で、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）は典型的に、前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体に対して４０〜５０％正に染色するとともに１０倍増殖された。しかしながら、多量体染色は明らかに、インビトロ増殖アッセイに基づいた前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７反応性Ｔｒｅｇ細胞の過小評価であった。増殖されたＴｒｅｇ細胞をカルボキシフルオロセインスクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および抗ＣＤ２８の存在下でｐ３１ペプチドまたは対照の卵白アルブミン（ＯＶＡ）ペプチドとともに培養した。ＣＦＳＥ希釈アッセイの結果は、卵白アルブミンにより刺激された培養物中の１４％のバックグラウンド増殖と比較して、５０％を超えるｐ３１−Ｉ−Ａｇ７で培養したＴｒｅｇが細胞周期へと入ることを示した。前記ＯＶＡペプチドで観察される高程度のバックグラウンド増殖は、培養物がその中にあるビーズの連続した存在により１００％休止していなかったことを反映するのかもしれない。刺激の前に、この同じ細胞集団は、フローサイトメトリーによりｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体結合について分析されるとき、たった６．４％のｐ３１反応性細胞を有していた。これらの結果は、低い結合活性を有するＴ細胞が多量体染色によってほとんど検出されないことを示し、前記ＴＣＲがＢＤＣ２．５特異性のｐ３１ミモトープと正確には同じではない内因性抗原に特異的であるという事実を反映するのかもしれない。この解釈の妥当性を探究するため、本発明者らは前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴ細胞のＶβレパートリーを検討した。前記ＢＤＣ２．５Ｔ細胞受容体はＶβ４ファミリー由来のＴＣＲβを発現する（２６）。しかしながら、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇ細胞よびＴｅｆｆ細胞がｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体および異なるＴＣＲＶβ試薬で同時染色されるとき、いずれの集団もモノクローナルではなかった。代わりに、両集団は、いくつものＶβ集団を提示する幅広いレパートリーを示した。興味深いことに、有意な数のＶβ４＋ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体＋Ｔ細胞がＴｒｅｇ培養物中に存在したが、他のＴＣＲＶβも有意な数で存在し、例えば、Ｖβ２よびＶβ１２はこの代表的な培養物中でｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体＋Ｔｒｅｇのそれぞれ１０．２％および１３．７％を占めた。ＴＣＲＶβ４＋Ｔ細胞は、前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体＋Ｔエフェクター集団中に一般に存在したが、より低い割合であった。これらの結果を総合すると、膵島ペプチド擬似体に対して反応性のある幅広いレパートリーのＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞が既存のＮＯＤマウスにおいて存在することを示す。本結果はまた、膵島ペプチド擬似体反応性Ｔｒｅｇレパートリーが膵島ペプチド擬似体反応性Ｔｅｆｆレパートリーと同一ではないことも示す。
【０１０７】
抗ＣＤ３により増殖された培養物についてすでに観察されるように、ペプチド−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇは、同様の方法で培養されるＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋細胞とは対照的に、培養期間を通じてＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋表現型を保持した。ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋細胞は活性化に際しＣＤ２５ｈｉｇｈになったが、初期の活性化の後、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７反応性Ｔｒｅｇ細胞と比較してＣＤ２５をわずかに下方制御した。ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７反応性Ｔエフェクター細胞の大部分は前記培養期間にＣＤ６２Ｌを下方制御した。本発明者らは、また、定量的リアルタイムＰＣＲを使用してＴｒｅｇ系列マーカーであるＦｏｘｐ３の発現について前記増殖されたＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞を検討した。ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７反応性細胞が分析されることを確認するため、分析前に、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇを蛍光により活性化される細胞選別（ＦＡＣＳ）により、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体陽性および陰性集団へと選別した。代表的な実験において、増殖されたｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体＋Ｔｒｅｇは、増殖されたｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体陽性Ｔエフェクターに対して約３０００倍のＦｏｘｐ３を発現した。増殖されたｐ３１−Ｉ−Ａｇ７Ｔｒｅｇはまた、フローサイトメトリーにより分析されるとき、典型的なＴｒｅｇ表面マーカーであるＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＧＩＴＲも発現した。本発明者らは、次に、抗原による負荷試験に際しｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇによるサイトカイン分泌を検討した。Ｔｒｅｇについてすでに報告されているデータと一致して、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇは、低レベルの炎症前サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＦＮγを発現し、および高レベルの抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を発現した。
【０１０８】
先行研究は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴｒｅｇがインビトロでのＣＤ４＋エフェクターの増殖を抑制でき、および前記抑制効果がそのＴＣＲを通じてのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの刺激に依存することを示した。それゆえ、増殖されたｐ３１−Ｉ−Ａｇ７Ｔｒｅｇ細胞をインビトロで抑制活性および特異性について検討した。培養物をポリクローナル活性化因子である抗ＣＤ３で刺激したとき、増殖されたｐ３１−Ｉ−Ａｇ７は、新鮮に単離されるポリクローナルＣＤ４＋Ｔ細胞および抗原特異的ＣＤ４＋ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋マウスの増殖を投与量特異的な形式で効果的に抑制した。より重要なことに、前記培養物をその中の１０４０−３１ペプチド反応性細胞による特異的抑制を呈する１０４０−３１ペプチドで刺激すると、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７ＴｒｅｇはＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制した。対照的に、増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５−ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７Ｔｅｆｆは、新鮮に単離されたＢＤＣ２．５ＣＤ４＋Ｔ細胞を抑制することができず、増殖を増大させた。興味深いことに、前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｅｆｆ細胞ではなくＴｒｅｇ細胞は、新鮮に単離されるＴｒｅｇについての報告どおり、ＣＤ２８の同時刺激の欠如のもとでの刺激（ｐ３１ペプチドおよび抗ＣＤ３の両者）に対してアネルギー性であった。前記増殖されたＴｒｅｇの抗原特異性をさらに特徴付けるため、抗ＣＤ３を介するポリクローナルＴ細胞活性化または抗原特異的Ｔ細胞活性化のいずれかを通じて、増殖されたポリクローナルＴｒｅｇおよびｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇを、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋またはグルタミン酸脱炭酸酵素ペプチド２８６特異的（ＧＡＤ２８６）ＴＣＲＴｇ＋ＣＤ４＋細胞を抑制する能力について評価した。ポリクローナルＴｒｅｇおよびｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇはいずれも、抗ＣＤ３により刺激されるとき、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋レスポンダーを抑制したのに対し、前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇのみが、前記ＢＤＣ２．５ １０４０−３１ペプチドで刺激される培養物を抑制した。同様に、ポリクローナルＴｒｅｇおよびｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇの両者は、抗ＣＤ３により刺激されるとき、ＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の反応を抑制した。しかしながら、前記ポリクローナルＴｒｅｇ集団も前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇ集団も、前記ＧＡＤ（２８６−３００）ペプチドで刺激されるとき、ＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇ＋レスポンダーを抑制しなかった。最も重要なことに、前記培養物を前記ＧＡＤ（２８６−３００）および前記１０４０−３１ペプチドの両者で刺激するとき、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇはＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇ＋レスポンダーを抑制できた。これらのデータを総合すると、前記ペプチド−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇの抑制活性が前記ＴＣＲを通じての抗原特異的刺激に依存するが、同族の抗原で一度刺激されると、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇはバイスタンダー抑制を発揮できることを示す。
【０１０９】
本発明者らは次に、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖された少数のＴｒｅｇが、ＣＤ２８−／−ＮＯＤマウスにおけるポリクローナルＴ細胞仲介性糖尿病を抑制する能力について検査した。ＣＤ２８−／−ＮＯＤマウスは、正常な数のエフェクターＴ細胞およびＴｈ１反応を有し、末梢部分における恒常性についてＣＤ２８に依存するＴｒｅｇの欠乏により、自己免疫性糖尿病の加速した形態を発症する（１７，２８）。先行研究は、多数（８−２０×１０６個）のポリクローナルＴｒｅｇの導入が糖尿病の開始を遅延または予防できることを示した（１７）。したがって本発明者らは、ＣＤ２８−／−マウスへ導入されるｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇが糖尿病を予防できるか否かを検討した。１．８〜２×１０６個と同数のｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇを５〜７週齢のマウスへと導入することにより、１５週齢と同程度の齢のマウスの５５％において糖尿病の発達を予防した。前記導入した集団はフローサイトメトリーに基づいて〜１０％のｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体＋細胞を典型的に含んでいたが、絶対頻度は前記ＣＦＳＥ増殖アッセイに基づくと明らかに高かった。それゆえ本発明者らは、前記導入した集団が、ポリクローナルＮＯＤＴｒｅｇで実行される同様の研究よりも実質的に少数の１０６個以下の抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を含んでいたと概算する。したがって、抗原特異的ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖された細胞は、十分に機能的なポリクローナルＴ細胞反応によって誘導される糖尿病の開始を保護する上で非常に効率が高かった。さらに、ｐ３１−ＩＡｇ７により増殖されたＴｒｅｇを与えられ、１５週齢および１６週齢で糖尿病から保護される動物は、糖尿病であり且つ８〜１０週齢で検討されて、処理されていないマウスおよびポリクローナルＴｒｅｇにより処理されたマウスと比較して、唾液腺および甲状腺で、より高い程度のリンパ球性浸潤を示したため、ｐ３１−ＩＡｇ７により増殖されたＴｒｅｇによる自己免疫性の抑制は器官特異的であった。
【０１１０】
この実施例において本発明者らは、膵島ペプチド擬似体に反応性のある抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが、糖尿病感受性ＮＯＤマウスの末梢に存在することを示す。さらに本発明者らは、抗原特異的細胞がポリクローナル集団からインビトロで選択的に増殖でき、および新鮮に単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの表現型特徴および機能的特徴を、これらの増殖されたＴｒｅｇが保持することを示す。本発明者らは、増殖された抗原特異的Ｔｒｅｇが生体内で器官特異的自己免疫性を調節する点で非常に効率よいことを示す。これらの結果はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇによる免疫調節がＴｒｅｇの抗原特異性に依存することを示す先行研究を支持し、およびＴｒｅｇがＴ細胞ニッチについて競合することにより抗原非特異的形式で機能することを示唆する報告と一致しない（１９，２２，２９）。
【０１１１】
本発明者らの知見は臨床療法のためのＴｒｅｇベースのアプローチを提供し、それは末梢血からの器官特異的Ｔｒｅｇの増殖を必要とする。制限されたレパートリーの少数の自己抗原特異的Ｔｒｅｇが増殖される場合でさえ、バイスタンダーサイトカイン産生およびまたは内因性制御性細胞の動員のいずれかによってポリクローナルＴ細胞反応を抑制する能力のため、これらの自己抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞は臨床的に有効でありうる。Ｔ１Ｄおよび多発性硬化症のような自己免疫性疾患に関与する多くの器官特異的抗原が同定されており、および現在入手可能なヒトＭＨＣ多量体試薬は自己免疫性疾患の治療のためにヒト器官特異的Ｔｒｅｇを増殖するために採用できる（２）。
【０１１２】
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ１． Ｓ． Ａｒｉｆ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１３，４５１ （２００４）．
２． Ｎ． Ａ． Ｄａｎｋｅ， ｅｔ ａｌ． ｋ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２，５９６７ （２００４）．
３． Ｌ． Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ， Ｂ． Ｓａｌｏｍｏｎ， Ｊ． Ａ． Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １８２，１４９ （２００１）．
４． Ｓ． Ｓａｋａｇｕｃｈｉ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２，５３１ （２００４）．
５． Ｔ． Ａ． Ｃｈａｔｉｌａ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０６， Ｒ７５ （２０００）．
６． Ｃ． Ｌ． Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ． ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２７，２０ （２００１）．
７． Ｍ． Ｅ． Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ． ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２７，６８（２００１）．
８． Ｒ． Ｓ． Ｗｉｌｄｉｎ ｅｔａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２７，１８（２００１）．
９． Ｊ． Ｄ． Ｆｏｎｔｅｎｏｔ， Ｍ． Ａ． Ｇａｖｉｎ， Ａ． Ｙ． Ｒｕｄｅｎｓｋｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４，３３０ （２００３）．
１０． Ｒ． Ｋｈａｔｔｒｉ， Ｔ． Ｃｏｘ， Ｓ． Ａ． Ｙａｓａｙｋｏ， Ｆ． Ｒａｍｓｄｅｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４，３３７ （２００３）．
１１． Ｓ． Ｈｏｒｉ， Ｔ． Ｎｏｍｕｒａ， Ｓ． Ｓａｋａｇｕｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，１０５７ （２００３）．
１２． Ａ． Ｋｕｋｒｅｊａ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０９，１３１ （２００２）．
１３． Ｍ． Ｒ． Ｅｈｒｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２００，２７７ （２００４）．
１４． Ｍ． Ａ． Ｋｒｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９，１２８５ （２００４）．
１５． Ｖ． Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９，９７１ （２００４）．
１６． Ｃ． Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ， Ｄ． Ａ． Ｈａｆｌｅｒ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２００，２７３ （２００４）．
１７． Ｂ． Ｓａｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２， ４３１ （２０００）．
１８． Ｓ． Ｇｒｅｇｏｒｉ， Ｎ． Ｇｉａｒｒａｔａｎａ， Ｓ． Ｓｍｉｒｏｌｄｏ， Ｌ． Ａｄｏｒｉｎｉ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１，４０４０ （２００３）．
１９． Ｑ． Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９，１４５５ （２００４）．
２０． Ｊ． Ａ． Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ， Ｑ． Ｔａｎｇ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０１，１４６２２ （２００４）．
２１． Ａ． Ｅ． Ｈｅｒｍａｎ， Ｇ． Ｊ． Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｄ． Ｍａｔｈｉｓ， Ｃ． Ｂｅｎｏｉｓｔ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９，１４７９ （２００４）．
２２． Ｋ． Ｖ． Ｔａｒｂｅｌｌ， ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９，１４６７ （２００４）．
２３． Ｅ． Ｌ． Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１，５５８７ （２００３）．
２４． Ｖ．Ｊｕｄｋｏ． ｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６，９０８（２００１）．
２５． Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｏｎｌｉｎｅ．
２６． Ｊ． Ｄ． Ｋａｔｚ， Ｂ． Ｗａｎｇ， Ｋ．Ｈａｓｋｉｎｓ， Ｃ． Ｂｅｎｏｉｓｔ， Ｄ． Ｍａｔｈｉｓ， Ｃｅｌｌ ７４，１０８９ （１９９３）．
２７． Ｋ． Ｖ． Ｔａｒｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９６，４８１ （２００２）．
２８． Ｑ． Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１，３３４８ （２００３）．
２９． Ｔ． Ｂａｒｔｈｌｏｔｔ， Ｇ． Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ， Ｂ． Ｓｔｏｃｋｉｎｇｅｒ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９７，４５１ （２００３）．
【実施例３】
【０１１３】
増殖されたＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達後のループス腎炎の臨床的寛解
研究サイズ：被験者の総数２０名；部位の総数２箇所
研究期間：１２〜２４ヶ月
標的集団：ループス腎炎患者
理論的根拠：自己免疫性の調節における制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の重要性は今やさまざまな実験動物モデルにおいて十分に確立されている（ＭｃＨｕｇｈ他、Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：６９３−７０２，２００２）。さらに、Ｔｒｅｇ欠乏がヒト自己免疫性疾患の根本的な原因であるかもしれないことを示唆する多数の研究がある。最も重要なことに、免疫恒常性の不可欠な要素としてのＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の出現は活発な免疫調節および長期の耐性誘導のための有力な治療機会を提供する。しかしながら、Ｔｒｅｇは、数％（２％未満）のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を占めるにすぎず、自己免疫性ヒトにおいては、数および機能を低下させ、増殖的にアネルギーであると一般に考慮される。本発明者らはヒト由来のＴｒｅｇ細胞を増殖する強力な方法を開発した。３週間未満で２００倍にまで増殖された細胞は伝統的なＴｒｅｇ表現型（ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋）を発現し、Ｔ細胞エフェクター増殖およびサイトカイン産生を抑制するよう機能する。
【０１１４】
本研究は、ループス腎炎患者由来の増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の安全性および有効性を検査するよう企図された。予備段階データは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者は、寛解時に高いＴｒｅｇ活性をおよび再発時に低下という病状によるＴｒｅｇ活性における変動性を示すことを示唆した（Ｃｒｉｓｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ ２１：２７３−２７６，２００３）。本発明者らは、本発明者らが寛解時に患者由来のＴｒｅｇを同定、選択、および増殖することができ、並びにそれらの細胞を凍結保存によって保存でき、再発時に再導入できるか否かを決定しようとした。本研究は、そのような自家性Ｔｒｅｇ療法の安全性を検査し、および疾病の進行および免疫学的因子に及ぼすこの療法の効果を決定するよう企図された。
【０１１５】
研究デザイン／治療プロトコール：本研究は２つの相からなる。第一相において本発明者らは、活発なループス腎炎を有する５名の患者および寛解にあるループス腎炎の病歴を持つ５名の患者（免疫抑制療法停止）由来のＴｒｅｇを増殖する。この相は活発なおよび不活発な疾病を有する患者由来のＴｒｅｇを増殖する相対的な可能性を示し、および前記増殖された細胞の機能的能力を実証する。
【０１１６】
第二相は、２つの異なるデザインプロトコールを使用する、活発なループス腎炎を有する患者におけるＴｒｅｇ注入の非盲検治験である。第一プロトコールにおいて、本発明者らは活発な疾病を有する患者由来の機能的Ｔｒｅｇを増殖し、次にこれらの患者はすぐに患者自体の増殖された細胞のレシピエントとなるだろう。流入判定基準には、活発なループス腎炎に加えて、抗二本鎖ＤＮＡ抗体および低補体血症の存在が含まれる。流入判定基準にはまた腎炎のための適切な根本的治療も含まれる（例、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、等）。しかしながら、シクロホスファミド（ＣＴＸ）療法は、ＣＴＸがＴｒｅｇの効果をより干渉しがちであるかもしれないという懸念に基づいて排除された。一次評価項目は一般的な臨床因子および疾病活性を観察することによって査定される自家性導入の安全性である。二次評価項目（疾病活性、血清学、および機構的研究）は治療３０日後、６０日後、９０日後、１８０日後、および３６５日後で測定される。
【０１１７】
第二プロトコールは、十分なＴｒｅｇが活発なループス腎炎患者から回収できない場合に適用される。ここでは、細胞は疾病の寛解期間に患者から回収され、生体外で増殖され、およびその後再発時の注入に備えて凍結される。より大きな患者プールおよびより長い期間以外は、この治験のデザインは上述のデザインと並行した。
【０１１８】
本方法および材料は、糖尿病患者における養子性細胞導入に関する本発明者らのフェイズＩの研究について以下に記載されるものと同様である。本発明者らの選択したＦＤＡにより承認される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズおよび前記指定されたモノクローナル抗体は、Ｘｃｙｔｅ ＴｈｅｒａｐｉｅｓおよびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎからそれぞれ入手可能である。本発明者らは、個々の患者由来の約１０９個のＴｒｅｇを増殖および凍結保存するための選別および増殖手法を一定の基準に従って調節した。
【０１１９】
一次結果：安全性
二次結果：１）クレアチニン、タンパク尿、および尿沈渣により査定される腎機能、２）抗二本鎖ＤＮＡ抗体および補体により査定されるループス血清学、３）ＳＬＥＤＡＩおよびまたはＢＩＬＡＧにより査定され、および患者の包括的な査定による疾病活性指数、および４）機構的研究
機構的研究：１）抗二本鎖ＤＮＡおよび補体の測定、２）自家抗体産生Ｂ細胞の頻度の査定、３）Ｔｒｅｇ表現型を検出するための循環しているリンパ球の表現型分析、４）Ｔｒｅｇ活性の査定、および５）Ｔｈ１およびＴｒｅｇサイトカインについてのＥＬＩＳＰＯＴ
解釈：この研究は、ループス腎炎患者由来のＴｒｅｇ細胞が前記患者における健康または疾病の進行に及ぼす有害な効果がなく、および養子免疫伝達療法がこれらの患者における腎機能を改善することを示す。
【実施例４】
【０１２０】
増殖されたＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達後の真性糖尿病の臨床的寛解
この治験は、増殖されたＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達後の真性糖尿病の臨床的寛解を示す。本発明者らの研究であるリンパ球回収および注入プロトコールはＲａｐｏｐｏｒｔ、他：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＭＬ ａｆｔｅｒ ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（印刷に先立ち電子出版、２００４年１０月２７日）から適応した。
【０１２１】
患者の適格性および登録。本発明者らは、書面による事前のインフォームドコンセントがすべての患者から、施設内倫理委員会の指針にしたがって得られることを必要とした。患者は臨床的および実験的特徴に基づいた真性糖尿病を有することが必要とされる。適切な腎機能、心機能、肺機能、および肝機能が必要とされ、および患者は活発な感染またはＨＩＶ血清陽性を有していない。
【０１２２】
定常状態のリンパ球の回収。患者はまず自動細胞分離装置（Ｃｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ細胞回収装置または応分の装置）を使用して定常状態の白血球分離採血法を受ける。約２０−３０ｌの血液が大きな内腔のカテーテルを通じて処理され、体重１ｋｇあたり約１．５×１０８個の単核細胞を得る。後で本発明者らの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８培養システムにおいて増殖するために、これらの細胞を凍結保存する。
【０１２３】
Ｔリンパ球の生体外同時刺激および増殖。ＦＤＡにより承認された研究上の新薬適用において指定されるようにＴ細胞を培養する。自家移植相の初日前後に、前記凍結保存された単核細胞を解凍し、および１％ヒト血清アルブミン入りのＰＢＳで３回洗浄した。もし初期の凍結保存時に実行されなければ、前記単核細胞は閉システムにおいて磁気ビーズを使用して単球枯渇する。前記細胞を次に、プールされた５％のＡＢ血清入りのＸ−ＶＩＶＯを含有する気体透過性フラスコ（Ｂａｘｔｅｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）へと播く。固定した抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８（９．３）モノクローナル抗体を有する常磁性ビーズをビーズ：ＣＤ３＋細胞の比を２：１で添加し、およびＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍｌ）で補強された培養物は１４日間まで維持した後、回収して注入のために調製した（上述）。前記細胞を毎日計数し、および１０００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２により補強された新鮮培地を添加して、前記細胞を０．７５〜２×１０６個／ｍｌの密度で維持する。細胞培養の完了後、Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｍａｘｓｅｐ磁気細胞分離デバイスを使用して前記磁気ビーズを除去する。ビーズの除去後、前記細胞を洗浄し、濃縮し、およびＢａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用して１％ヒト血清アルブミンを含有する１００〜２５０ｍｌのＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ中に再懸濁する。
【０１２４】
生体外で増殖されたＴ細胞の再注入。放出前に、前記回収した産物はすべて、細胞生存率（７０％）、滅菌性（バクテリアおよび菌についてのネガティブ培地、ネガティブ菌体内毒素アッセイ）、およびビーズ夾雑（３×１０６個の細胞あたりビーズ１００個未満）についての基準に合うことを必要とされる。前記回収した細胞を細胞産生設備から患者へと配達媒体により輸送し、同日に注入する。前記細胞を白血球フィルターなしで２０−６０分かけて注入する。患者はアセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンで定期的にあらかじめ投薬されてもよい。
【実施例５】
【０１２５】
増殖されたＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達後の真性糖尿病の臨床的寛解。
【０１２６】
この治験は、増殖されたＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達後の真性糖尿病の臨床的寛解を示す。本発明者らの研究であるリンパ球回収および注入プロトコールは、Ｒａｐｏｐｏｒｔ、他：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＭＬ ａｆｔｅｒ ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（印刷に先立ち電子出版、２００４年１０月２７日）から適応した。
【０１２７】
患者の適格性および登録：本発明者らは、書面による事前のインフォームドコンセントがすべての患者から施設内倫理委員会の指針にしたがって得られることを必要とした。患者は臨床的および実験的特徴に基づいた真性糖尿病を有する必要がある。適切な腎機能、心機能、肺機能、および肝機能が必要であり、および患者は活発な感染またはＨＩＶ血清陽性を有していない。
【０１２８】
定常状態のリンパ球の回収。患者はまず自動細胞分離装置（Ｃｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ細胞回収装置または応分の装置）を使用する定常状態の白血球分離採血法を受ける。約２０−３０ｌの血液が大きな内腔のカテーテルを通じて処理され、体重１ｋｇあたり約１．５×１０８個の単核細胞を得る。後で本発明者らのＭＨＣクラスＩＩ分子／ペプチド複合体−同時刺激剤培養システムにおいて増殖するために、これらの細胞を凍結保存する。
【０１２９】
Ｔリンパ球の生体外同時刺激および増殖。ＦＤＡにより承認された研究上の新薬適用において指定されるようにＴ細胞を培養する。自家移植相の初日前後に、前記凍結保存された単核細胞を解凍し、および１％ヒト血清アルブミン入りのＰＢＳで３回洗浄した。もし初期の凍結保存時に実行されなければ、前記単核細胞は閉システムにおいて磁気ビーズを使用して単球枯渇する。前記細胞を次に、プールされた５％のＡＢ血清入りのＸ−ＶＩＶＯを含有する気体透過性フラスコ（Ｂａｘｔｅｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）へと播く。固定したＭＨＣ複合体ＩＩ型ＤＱ０６０２／インスリンＢペプチド（ａａ５〜１５）および抗ＣＤ２８（９．３）モノクローナル抗体を有する常磁性ビーズをビーズ：ＣＤ３＋細胞の比を２：１で添加し、およびＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍｌ）で補強された培養物は１４日間まで維持した後、回収して注入のために調製した（上述）。前記細胞を毎日計数し、および１０００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２により補強された新鮮培地を添加して、前記細胞を０．７５〜２×１０６個／ｍｌの密度で維持する。細胞培養の完了後、Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｍａｘｓｅｐ磁気細胞分離デバイスを使用して前記磁気ビーズを除去する。ビーズの除去後、前記細胞を洗浄し、濃縮し、およびＢａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用して１％ヒト血清アルブミンを含有する１００〜２５０ｍｌのＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ中に再懸濁する。
【０１３０】
生体外で増殖されたＴ細胞の再注入。放出前に、前記回収した産物はすべて、細胞生存率（７０％）、滅菌性（バクテリアおよび菌についてのネガティブ培地、ネガティブ菌体内毒素アッセイ）、およびビーズ夾雑（３×１０６個の細胞あたりビーズ１００個未満）についての基準に合うことを必要とされる。前記回収した細胞を細胞産生設備から患者へと配達媒体により輸送し、同日に注入する。前記細胞を白血球フィルターなしで２０−６０分かけて注入する。患者はアセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンで定期的にあらかじめ投薬されてもよい。
【０１３１】
具体的な実施形態及び実施例の前記記述は、例示のために提供されており、限定のために提供されているものではない。別段の記載がなければ、これらの記述及び本明細書全体を通じて、「１つの」という用語は、一又は複数を意味し、「又は」という用語は、及び／又はを意味する。本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許出願並びにこれらに引用されている刊行物は、各刊行物が参照により具体的且つ個別的に組み込まれる旨の記載が為されている場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。前記発明は、理解を明瞭にする目的で、例示および実施例によって、幾分詳細に記載されているが、当業者であれば、本発明の教示に照らして、付属の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、本発明に何らかの変化及び修飾を加え得ることが自明であろう。
【０１３２】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ． Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ、Ｑｉｚｈｉ Ｔａｎｇ及びＥｍｍａ Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ
譲受人：Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
関連出願の相互参照
本願は、２００４年１月８日に出願された米国特許出願第６０／５３５，０８５号の優先権を主張する。
【０００２】
政府支援の確認
本研究は、ＮＩＨ ＮＣＲＲグラントＲ３７ ＡＩ４６６４３によって補助された。米国政府は、本願に対して発行される全ての特許に権利を有する場合がある。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は、今日、最も被害が大きく治療が困難な病気の多くを占め、代表的な自己免疫疾患には、とりわけ、糖尿病、ぶどう膜網膜炎および多発性硬化症が含まれる。
【０００４】
自己免疫を能動的に制御し、長期の寛容性を誘導するＴｒｅｇの潜在能力は、長期にわたる寛容性を誘導するための戦略として多大な活用性を秘めている。Ｔｒｅｇの活用は、この少量のＴ細胞サブセット（自己免疫傾向がある動物及び患者では、さらに少ない細胞の集団）を増殖し、性質を決定することができないために困難であった。例えば、最近の研究は、疾病の活動期中に抑制に対して抵抗性となる自己反応性Ｔ細胞のため、進行する自己免疫性糖尿病を回復させることは不可能であり得ることを示唆している。Ｔｒｅｇを生体外で増殖するための過去の尽力は、臨床的に十分な増殖及びインビボでの実証可能な効力を達成していない（例えば、Ｆｕ ｅｔ ａｌ． ， ２００４， Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ４，６５−７８）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数が少ないこと、それらのアネルギー性表現型及び多様な抗原特異性は、自己免疫及び移植拒絶を治療するためのこの強力な寛容原性集団を利用するための大きな困難となっている。
【０００５】
Ｈｏｒｗｉｔｚ（例えば、第６，８０３，０３６号及び第６，７９７，２６７号及び関連特許文献）、米国特許第６，５３４，０５５号；ＵＳ２００３／１２４１２２Ａ１；ＵＳ２００３／００８２８０６Ａ１；ＵＳ２００２／００５８０１９Ａ１；ＵＳ２００２／０１１９５６８Ａ１；ＵＳ２００３／０１１９１８５Ａ１；及びＵＳ２００２／００１９０４８Ａ１を含む、数多くの米国特許文献が、Ｔ細胞増殖について述べている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、自己抗原特異的制御性Ｔ細胞濃縮組成物を作製する方法、並びに得られた組成物及び使用の方法を提供する。一実施形態において、本発明は、（ａ）対象体適合性細胞の集団を取得することと；（ｂ）前記細胞の集団から得られた、自己抗原特異的制御性Ｔ細胞濃縮組成物を作製することと；及び（ｃ）前記対象体中での前記自己免疫反応を調節するために前記対象体中に前記組成物を導入することと；を含む、対象体中の自己免疫反応を調節する方法を提供する。
【０００７】
特定の実施形態において、前記細胞の集団は前記対象体から取得され、前記対象体とは異なるドナーから取得され、及び／又は末梢血から採取される。
【０００８】
特定の実施形態において、前記作製工程が、前記抗原特異的制御性Ｔ細胞を増殖すること及び／又は前記得られた細胞の集団から前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞を濃縮することを含む。
【０００９】
特定の実施形態では、前記増殖は、前記細胞の集団を自己抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物と接触させることによって達成される。
【００１０】
特定の実施形態では、制御性Ｔ細胞は、前記増殖工程の前に、または前記増殖工程の後に前記細胞の集団から濃縮される。
【００１１】
特定の実施形態では、前記刺激性組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原性ペプチド複合体、同時刺激因子又は第二の制御性Ｔ細胞刺激因子を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、前記同時刺激因子は、ＣＤ２８に結合するアゴニスト抗体などのアゴニスト抗体である。
【００１３】
特定の実施形態では、前記第二の刺激因子は、インターロイキン−２などのインターロイキンのようなサイトカインである。
【００１４】
特定の実施形態において、前記刺激性組成物は、細胞又はビーズなどの基材上に固定化される。
【００１５】
特定の実施形態において、前記作製工程は、含む。
【００１６】
特定の実施形態において、前記調節は、阻害することを含む。
【００１７】
本発明は、組成物の細胞の少なくとも５０％が天然の自己抗原特異的制御性Ｔ細胞である、細胞の集団を含む組成物も提供する。
【００１８】
特定の実施形態において、自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は、表Ａに示されているように、ＭＨＣクラスＩＩ分子中に提示されたペプチドに対して特異的である。
【００１９】
特定の実施形態において、前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は、対象に投与されたときに、自己免疫応答を調節するのに効果的である。
【００２０】
本発明は、自己抗原特異的制御性Ｔ細胞の組成物を作製するためのキットであって、（ａ）自己抗原特異的Ｔ細胞受容体刺激因子；及び（ｂ）同時刺激因子を含むキットも提供する。
【００２１】
特定の実施形態において、前記刺激因子は、ＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原ペプチド複合体である。
【００２２】
特定の実施形態において、前記同時刺激因子は、ＣＤ２８に結合する抗体などのアゴニスト抗体である。
【００２３】
特定の実施形態において、前記キットは、インターロイキン−２又はインターロイキン−１５などのインターロイキンのようなサイトカインなどの第二の制御性Ｔ細胞刺激因子をさらに含む。
【００２４】
特定の実施形態において、前記刺激因子及び前記同時刺激因子は、細胞又はビーズなどの基材上に固定化される。
【００２５】
本発明は、治療用制御性Ｔ細胞の生体外増殖のための方法及び組成物、並びに得られた組成物及び使用の方法を提供する。前記増殖方法は、一般的には、Ｔ細胞の混合集団からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）が濃縮された亜集団を単離する工程と；生体外増殖されたＴｒｅｇ細胞を取得するために、前記亜集団を（ｉ）ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子、（ｉｉ）ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子及び（ｉｉｉ）ＩＬ−２の有効量と接触させることによって、前記亜集団のＴｒｅｇ細胞を増殖する工程とを含み、前記増殖されたＴｒｅｇ細胞が免疫抑制を示し、前記単離工程は典型的には本明細書に記載された療法に適した自己免疫疾患に罹患し又は寛解しているヒト又は患者から得た前記集団を増殖させることによって典型的に始められる。
【００２６】
特定の実施形態において、前記亜集団は、＞９８％のＴｒｅｇ細胞、好ましくは＞９８％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔｒｅｇ細胞を含み；前記単離工程は陰性及び陽性免疫選択並びに細胞分取を含み；前記増殖工程が前記亜集団の少なくとも１００倍の増殖を達成し；ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子はＴＣＲ／ＣＤ３に対する多価抗体又はリガンドであり；ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子は、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、Ｂ７−１／２、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０又はＣＤ４０に対する多価抗体又はリガンドであり；ＩＬ−２の有効量は、２００ないし２５００ＩＵ ＩＬ−２／ｍＬ、及び／又はＴｒｅｇ細胞は、抗ＣＤ３又は同種異系抗原刺激されたＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖をインビトロで抑制し、又は移植片対宿主病を含む自己免疫をインビボで抑制する。
【００２７】
さらに特定の実施形態では、
糖尿病を有すると診断され、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、食後血糖値（ＰＰＧ）及び耐糖能（ＧＴＴ）から選択されるグルコース恒常性障害の兆候を示す患者中に導入された前記生体外増殖されたＴｒｅｇ細胞の有効量は、グルコース恒常性障害に改善をもたらし、前記改善は、１１０ｍｇ／ｄＬ以下のＦＰＧ、１４０ｍｇ／ｄＬ以下の２時間ＰＰＧ、及び７５ｇのグルコース負荷から２時間後における１４０ｍｇ／ｄＬ以下のＧＴＴから好ましくは選択され；
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子は抗ＣＤ３抗体であり、及び前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子が抗ＣＤ２８抗体であり、前記抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体が、１：１ないし１：２のＴｒｅｇ細胞：ビーズ比で与えられた常磁性ビーズ上に固定化されており；
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子及び前記増殖されたＴｒｅｇ細胞は抗原特異的であり、好ましくは、前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子がＭＨＣペプチド多量体であり、前記ペプチドが糖尿病関連自己抗原ペプチドであり、前記糖尿病関連自己抗原がグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、膵島細胞自己抗原（ＩＣＡ）及びインシュリンから選択され、前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子は抗ＣＤ２８抗体である。
【００２８】
本発明は、養子細胞免疫療法を必要としている患者中に、生体外で増殖された本発明のＴｒｅｇ細胞の有効量を導入する工程を含む養子細胞免疫療法に対する方法及び組成物も提供する。これらの方法は、一般的には、ヒトから得たＴ細胞の混合集団を抽出する工程と；Ｔ細胞の混合集団からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）が濃縮された亜集団を前記集団から単離する工程と；生体外増殖されたＴｒｅｇ細胞を取得するために、前記亜集団を（ｉ）ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子、（ｉｉ）ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子及び（ｉｉｉ）ＩＬ−２の有効量と接触させることによって、前記亜集団のＴｒｅｇ細胞を増殖する工程と；生体外増殖されたＴｒｅｇ細胞の有効量を患者中に導入する工程と；並びに得られた自己免疫の抑制を検出する工程とを含む。
【００２９】
特定の実施形態において、前記ヒト及び患者は糖尿病を有すると診断されて、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、食後血糖値（ＰＰＧ）及び耐糖能（ＧＴＴ）から選択されるグルコース恒常性障害の兆候を示す患者であり、前記亜集団が＞９８％のＴｒｅｇ細胞を含み；前記亜集団が＞９８％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇ細胞を含み；前記単離工程が陰性及び陽性免疫選択並びに細胞分取を含み；前記増殖工程が前記亜集団の少なくとも１００倍の増殖を実施し、前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子が、ＴＣＲ／ＣＤ３に対する多価抗体またはリガンドから選択され；前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子がＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０またはＣＤ４０Ｌに対する多価抗体及びリガンドから選択され；Ｉｌ−２の有効量が２００ないし２５００ ＩＵ ＩＬ−２／ｍＬであり；前記Ｔｒｅｇ細胞が抗ＣＤ３または同種異系抗原によって刺激されたＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を抑制し；及び／又は、生じたグルコース恒常性障害の改善として、得られた自己免疫の抑制が検出される。
【００３０】
さらに具体的な実施形態では、
前記改善は、１１０ｍｇ／ｄＬ以下のＦＰＧ、１４０ｍｇ／ｄＬ以下の２時間ＰＰＧ、及び７５ｇのグルコース負荷から２時間後における１４０ｍｇ／ｄＬ以下のＧＴＴから選択され；
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子は抗ＣＤ３抗体であり；及び前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子が抗ＣＤ２８抗体であり、前記抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体が、１：１ないし１：２のＴｒｅｇ細胞：ビーズ比で与えられた常磁性ビーズ上に固定化されており；及び／又は、
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子がＭＨＣペプチド多量体であり、前記ペプチドが糖尿病関連自己抗原ペプチドであり、糖尿病関連自己抗原がグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、膵島細胞自己抗原（ＩＣＡ）及びインシュリンから選択され、前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子は抗ＣＤ２８抗体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、所定の自己抗原特異的制御性Ｔ細胞濃縮組成物を作製する方法、並びに得られた組成物及び使用の方法を提供する。一実施形態において、本発明は、（ａ）対象体適合性細胞の集団を取得することと；（ｂ）前記細胞の集団から得られた、自己抗原特異的な、好ましくは所定の自己抗原特異的な制御性Ｔ細胞濃縮組成物を作製することと；及び（ｃ）前記対象体中での前記自己免疫反応を調節するために前記対象体中に前記組成物を導入することと；を含む、対象体中の自己免疫反応を調節する方法を提供する。
【００３２】
特定の実施形態において、前記細胞の集団は前記対象体から取得され、前記対象体とは異なるドナーから取得され、及び／又は末梢血から採取される。得られた細胞の集団は、自己抗原特異的制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を含み、末梢血、胸腺、リンパ節、脾臓及び骨髄などの自己抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞が存在する任意の取得源から得ることができる。ある種の実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞の取得源は死体の組織から得ることができる。
【００３３】
細胞の集団は、Ｔｒｅｇ濃縮組成物が引き続き導入される前記対象体から取得することができる。前記対象体は、自己免疫反応の調節が望まれる任意の哺乳動物とすることが可能である。興味深い哺乳動物には、げっ歯類、例えば、マウス、ラット；家畜、例えば、ブタ、ウマ、ウシなど、ペット、例えば、イヌ、ネコ；及び霊長類、例えば、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、前記対象体は自己免疫疾患の動物モデルである。多発性硬化症（ＥＡＥ：実験的自己免疫性脳脊髄炎）；重症筋無力症（ＥＭＧ：実験的重症筋無力症）及び神経炎（ＥＮＡ：実験的自己免疫性神経炎）など、寛容性を誘導するために自己抗原のＴ細胞エピトープを使用するための確立された動物モデルが多数存在する。別の実施形態では、前記対象体は、表Ａに列記されているいずれかの疾病／疾患などの自己免疫病又は疾患に罹患したヒトである。
【００３４】
別の実施形態では、前記細胞の集団は前記対象体とは異なるドナーから取得される。前記ドナーは、好ましくは、同系であるが、得られた細胞が、大規模な慢性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をもたらさずに、免疫抑制療法と必要に応じて組み合わせて対象体中に導入可能であるという点で対象体適合性であれば、同種異系、又は異種とすることも可能である。同種異系のドナー細胞は、好ましくは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性であり、典型的には、免疫抑制療法と組み合わせて投与される。対象体適合性とするために、異種細胞には、γ線照射又はＰＥＮ１１０処置を施すことができる（Ｆａｓｔ， ＬＤ ｅｔ ａｌ， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２００４ Ｆｅｂ； ４４ （２）：２８２−５）。
【００３５】
前記作製工程は、好ましくは、標的とされる自己免疫反応に関連する所定の自己抗原に特異的な、好ましくは標的とされる自己免疫反応と関連することが予め決定された前記細胞の集団から得られる所定の自己抗原特異的制御性Ｔ細胞濃縮組成物を提供する。特定の実施形態において、前記作製工程が、前記抗原特異的制御性Ｔ細胞を増殖すること及び／又は前記得られた細胞の集団から前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞を濃縮することを含む。
【００３６】
自己抗原特異的制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞濃縮組成物とは、自己抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞のパーセントが、細胞の最初に得られた集団中の自己抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞のパーセントより高い組成物である。具体的な実施形態には、前記組成物の前記細胞の少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％又は９８％が自己抗原特異的制御性Ｔ細胞である。特定の実施形態において、前記作製工程は、前記抗原特異的制御性Ｔ細胞を増殖すること及び／又は前記得られた細胞の集団から前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞を濃縮することを含む。
【００３７】
特定の実施形態では、制御性Ｔ細胞は、前記増殖工程の前に、又は前記増殖工程の後に前記細胞の集団から濃縮される。Ｔｒｅｇ細胞は、以下で実施例１及び２に記載されているように、免疫抑制性Ｔｒｅｇに対して特異的な細胞表面マーカーの選択を標的とし、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）などの自動化された細胞分取、固相磁気ビーズなどを用いて分離することによって濃縮することが可能である。濃縮を増強するために、陽性選択は、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６及びＣＤ５６を有する細胞の枯渇、及び以下に例示されているような非Ｔｒｅｇ細胞種に対して特異的な表面マーカーを含む細胞に対する陰性選択と組み合わせることができる。
【００３８】
特定の実施形態では、前記増殖は、前記細胞の集団を自己抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物と接触させることによって達成される。自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は、好ましくは少なくとも５０倍、並びに好ましくは少なくとも１００、２００、３００、５００及び８００倍に増殖される。自己抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物は、所望の自己抗原を認識するＴ細胞受容体を発現する自己抗原特異的制御性Ｔ細胞の生存、成長及び／又は増殖を促進する。
【００３９】
好ましい刺激組成物は、Ｔ細胞受容体複合体に抗原特異的に結合し、活性化させることによってＴ細胞を刺激する。架橋された、ペプチドが結合したＭＨＣ分子、抗体及び模倣物などの、様々な抗原特異的ＴＣＲ結合試薬を使用することができる。好ましい実施形態において、前記組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原ペプチド複合体、特にこのようなＭＣＨ／ペプチド複合体の会合体を含む。これらの複合体は、少なくとも、その中で自己抗原ペプチドが機能的に結合されているＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外ペプチド結合ドメインを含む。前記複合体は、溶液若しくは懸濁液中に存在することができ、又は細胞、特にＡＰＣの表面上に提示されるなど基材の上に固定化されることができる。ｌｉｔｅｒｕ中に見出し得るような、機能的ＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体を作製するための数多くの適用可能な方法が本分野において公知である。
【００４０】
一実施形態において、前記自己抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成できる天然に存在する自己抗原のペプチドである。典型的なＭＨＣクラスＩＩ分子／ペプチド複合体は、表Ａに列記されている。別の実施形態において、前記自己抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成できるミモトープペプチドである。
【００４１】
別の実施形態において、前記自己抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成できるミモトープペプチドである。ミモトープペプチドは、本文献中の以下でさらに、及び実施例１に記載されている。その他の点では従来どおりのＴ細胞からＴｒｅｇを増殖するために自己抗原ペプチドを使用するためのプロトコールには、細胞表面表現型とは独立に患者からＴｒｅｇを増殖するために、自己抗原特異的ＭＨＣペプチド四量体、ペプチドパルスＤＣ（Ｙａｍａｚａｋｉ， ｅｔ ａｌ， ２００３， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：２３５−４７）又は人工のＡＰＣ（Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０： １４３−８，２００２）を使用することが含まれる。さらに、インビトロ及びインビボアプローチの組み合わせが、前記療法の効果を増強することが可能である。例えば、最近の研究によって、自己抗原、変化されたペプチドリガンド及びＦｃＲ非結合抗ＣＤ３ｍＡｂなどの非特異的刺激の投与は、抗原特異的Ｔｒｅｇ活性を促進できることが示されている（Ａｐｏｓｔｏｌｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９：１４０１−８，２００３；Ｂｅｌｇｈｉｔｈ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２０２−８，２００３）。このように、Ｔｒｅｇを誘導するためのインビボ免疫化を生体外増殖と組み合わせること又はその逆は、有利であり得る。
【００４２】
ある種の実施形態では、前記刺激組成物は、一又は複数の追加因子、例えば、同時刺激因子、第二の制御性Ｔ細胞刺激因子又はＴ細胞の生存及び／又は成長を一般的に促進する因子をさらに含み得る。
【００４３】
ある種の実施形態において、前記同時刺激因子は、以下に記載されているように、ＣＤ２８又はＧＩＴＲなどのＴＣＲ同時刺激物質に対して特異的な抗体又はリガンドである。特定の実施形態では、前記同時刺激性因子は、ＣＤ２８に結合するアゴニスト抗体などのアゴニスト抗体である。
【００４４】
前記刺激組成物は、あるいは、第二の制御性Ｔ細胞刺激因子を含む。具体的な刺激因子には、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１３及びＩＬ−１５などのインターロイキン並びに肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が含まれる。特定の実施形態では、前記第二の刺激因子は、インターロイキン−２などのインターロイキンのようなサイトカインである。
【００４５】
特定の実施形態において、前記刺激性組成物の一又は複数の成分は、細胞又はビーズなどの基材上に固定化される。基質として使用するのに適切な細胞には、人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）（Ｋｉｍ， ＪＶ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００４ Ａｐｒ；２２（４）：４０３−１０； ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ， ＡＫ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２ Ｄｅｃ；１０５（３）：２５９−７２）が含まれる。ビーズは、典型的には１ないし２０ミクロンの範囲の、プラスチック、ガラス又は他の任意の適切な素材とすることができる。常磁性ビーズが好ましい。
【００４６】
前記刺激組成物の各成分の至適濃度、培養条件及び期間は、汎用の実験操作を用いて実験的に決定することが可能である。典型的な自己抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物は、実施例２に記載されている。
【００４７】
自己免疫反応を調節するために、増殖された及び／又は濃縮された自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は前記対象体中に導入される。例えば、前記対象体は、表Ａに列記されている疾病／疾患など、持続的又は再発性の自己免疫反応を有することを特徴とする疾病又は疾患に罹患し得る。特定の実施形態において、前記調節は、阻害することを含む。Ｔｒｅｇは、炎症の部位に、ＩＬ−４（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６： ４９７３−８０，２００１）、幹細胞増殖因子、血管新生制御因子、遺伝子の欠如などのような、抑制的又は他の生物学的因子を送達するための「トロイの木馬」としての役割を果たし得る。例えば、ｆｏｘｐ３の過剰発現は、そうでなければ病原性のＴ細胞をＴｒｅｇに形質転換することが示されており（Ｊａｅｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ２００４ Ｄｅｃ １０； ［Ｅｐｕｂ］）、極めて高い数及び効率性で強力な抗原特異的Ｔｒｅｇを生成するために、ポリクローナル性に増殖されたＴｒｅｇを、抗原特異的ＴＣＲプラスｆｏｘｐ３をコードする遺伝子で形質導入することが可能である（Ｍｅｋａｌａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２００４ Ｎｏｖ ４； ［Ｅｐｕｂ］）。このようにして、これらの抗原特異的アプローチは、Ｔｒｅｇ特異性と機能を最大化しつつ、高い細胞数に対する要求を減少させる。
【００４８】
抗原特異的Ｔｒｅｇは、感染症の病原性が病原体の細胞変性効果の結果ではなく、むしろ感染性因子に対する免疫炎症性応答によって引き起こされる組織損傷の結果である感染性疾患に特に適応される。Ｃ型肝炎又はＨＳＶによって誘導された角膜の炎症などの疾病において、Ｔｒｅｇ療法は、ウイルスによって誘導される免疫炎症性疾患を抑制するための好機を与える（Ｓｕｖａｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２：４１２３−４１３２，２００４）。コクサッキーなどのウイルスは、膵炎を引き起こすことが知られており、１型糖尿病の発症に関連している。このように、発現されたウイルス抗原を標的とするＴｒｅｇは、感染によって引き起こされる局所的な組織損傷を抑制し、自己免疫疾患の発症を誘発する炎症を低減するために使用することが可能である。
【００４９】
本発明は、組成物の細胞の少なくとも５０％が天然の（形質転換されていない）、好ましくは増殖された自己抗原特異的制御性Ｔ細胞であり、自己抗原特異性が好ましくは予め決定されており、好ましくは、標的とされる自己免疫反応抗原に対して予め決定されている、細胞の集団を含む組成物も提供する。前記組成物は、本明細書に記載されている方法によって作製される。前記組成物における自己抗原特異的制御性Ｔ細胞のパーセントは、実施例２に記載されている方法を用いて確認することが可能である。特定の実施形態には、前記組成物の前記細胞の少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％又は９８％が自己抗原特異的制御性Ｔ細胞である。
【００５０】
特定の実施形態において、前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は、表Ａに列記されているＭＨＣクラスＩＩ分子／ペプチド複合体に対して特異的である。
【００５１】
特定の実施形態において、前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞は、対象体に投与されたときに、自己免疫応答を調節するのに効果的である。増殖された及び／又は濃縮された自己抗原特異的制御性細胞を使用する効果的且つ最適化された投薬量及び治療計画は、既存のＴ細胞注入療法の莫大な臨床実験から得られ、さらに実験的に決定することが可能である。
【００５２】
本発明の方法は、宿主中での異常な免疫応答の調節が望まれる様々な異なる症状の治療に用途を見出す。宿主中での異常な免疫応答とは、自己免疫応答として特徴付けられる対象体中での任意の免疫反応（例えば、自己免疫疾患）を意味する。一般的に、対象体の免疫系が自己抗原を外来として認識し、自己反応性エフェクター免疫細胞の産生をもたらすときに、自己免疫応答が生じる。自己反応性エフェクター免疫細胞には、細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及びＢ細胞を含む様々な系列から得られる細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。正確な機序は異なるが、自己免疫疾患に罹患している宿主中に自己反応性エフェクター免疫細胞が存在することによって、宿主の組織及び細胞の破壊が引き起こされ、病理的症候をもたらす。宿主中のこのような細胞の存在を、そして、それによる宿主中の抗原特異的自己免疫疾患などの自己免疫疾患の存在を決定するための数多くのアッセイが当業者に公知であり、容易に本発明の方法で使用される。興味が持たれるアッセイには、「Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２００３ Ｓｅｐ−Ｎｏｖ；３６（６−７）：３６１−６；Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２００３ Ｄｅｃ；２５ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ５７−６１；Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２００３ Ｎｏｖ；３（１１）：２０７７−８４；Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ． ２００３ Ｊａｎ；２（１）：４３−９」に記載されているアッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
治療とは、宿主中の異常な免疫応答を伴う症候の少なくとも改善が達成されることを意味し、ここで、軽減とは、治療されている症状に関連するパラメーター、例えば症候の規模が少なくとも低減することを表す広い意味で使用される。従って、治療とは宿主が症状、又は少なくとも該症状を特徴付ける症候にもはや罹患しないように、病理的症状又は少なくともこれに関連する症候が完全に阻害され（例えば、発生が抑制される）、又は停止される（例えば、終結される）状況も含む。
【００５４】
本発明の方法に従って、様々な宿主を治療することができる。ある種の実施形態において、このような宿主は、「哺乳動物」又は「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食動物目（例えば、イヌ及びネコ）、齧歯類（例えば、マウス、モルモット及びラット）、及び霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー及びサル）を含む哺乳綱に属する生物を記載するために広く使用される。多くの実施形態において、前記宿主はヒトである。
【００５５】
さらなる実施形態において、前記方法は、自己免疫疾患の存在を診断する工程を含む。診断とは、対象体の自己免疫応答が一般的に分類されること（例えば、糖尿病、ＳＬＥ、ＭＳなど）を意味する。さらに、異常な免疫応答が誘導される少なくとも一つの自己抗原が同定される。様々な診断法が本分野において公知であり、現在、開発中である。従って、本発明の方法は、宿主中の自己免疫疾患又はそれが誘導される抗原を診断するための特異的アッセイに限定されない。
【００５６】
上記方法の一又は複数を実施するための試薬及びそれらのキットも提供される。本発明の試薬及びそれらのキットは、極めて多様であり得る。ある種の実施形態において、該キットは、少なくとも抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物を含む。他の実施形態では、前記キットは、インターロイキン−２又はインターロイキン−１５などのインターロイキンのようなサイトカインなどの別の制御性Ｔ細胞刺激性因子を含む。ある種の実施形態において、前記キットは、培養皿又はフラスコ、培地、又は任意の必要な緩衝液、因子などを含む、前記抗原特異的制御性Ｔ細胞増殖工程を実施するための試薬をさらに含み得る。さらに別の実施形態において、前記キットは、前記制御性Ｔ細胞を含有する試料を採取するための手段と、制御性Ｔ細胞濃縮／精製を実行するために必要な試薬とを含む。
【００５７】
上記成分の他に、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための指示書をさらに含み得る。これらの指示書は様々な形態で本発明のキット中に存在することができ、一又は複数の指示書がキット中に存在することができる。これらの指示書が存在し得る一つの形態は、適切な媒体又は基材の上に情報を印刷することである（例えば、情報が印刷される一片又は複数片の紙の上、キットの包装中、パッケージ挿入物中など）。さらに別の手段は、その上に情報が記録されるコンピュータ読み出し可能な媒体（例えば、ディスケット、ＣＤなど）であり得る。存在し得るさらに別の手段は、離れた場所の情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。任意の便利な手段が、キット中に存在し得る。
【００５８】
具体的な実施形態において、前記刺激因子はＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原性ペプチド複合体である。典型的なＭＨＣクラスＩＩ分子／ペプチド複合体は、表Ａに列記されている。
【００５９】
前記同時刺激因子は、以下に記載されているように、ＣＤ２８又はＧＩＴＲなどのＴＣＲ同時刺激物質に対して特異的な抗体又はリガンドである。具体的な形態では、前記同時刺激因子は、ＣＤ２８に結合する抗体などのアゴニスト抗体である。
【００６０】
特定の実施形態において、前記刺激性因子及び前記同時刺激因子は、細胞又はビーズなどの基材上に固定化される。
【００６１】
本発明は、治療用制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の生体外増殖のための方法及び組成物、並びに自己免疫を抑制するための養子細胞免疫療法のためのこのような増殖されたＴｒｅｇ細胞の使用を提供する。
【００６２】
増殖方法は、ヒト又は患者からＴ細胞の混合集団をまず抽出することと、及びＴｒｅｇ細胞中で濃縮された亜集団を前記集団から単離することとを一般的に含む。効力を最大化するために、前記亜集団は少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％のＴｒｅｇ細胞、好ましくはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔｒｅｇ細胞になるように濃縮される。細胞は、一般的に、免疫制御性Ｔｒｅｇに対して特異的な選択細胞表面マーカーを標的とし、蛍光活性化細胞分取装置（ＦＡＣＳ）、固相磁気ビーズなどの自動化された細胞分取装置を用いて分離することによって濃縮される。濃縮を増強するために、陽性選択は、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６及びＣＤ５６を有する細胞の枯渇、及び以下に例示されているような非Ｔｒｅｇ細胞種に対して特異的な表面マーカーを含む細胞に対する陰性選択と組み合わせることができる。
【００６３】
次いで、Ｔｒｅｇ濃縮された亜集団は、ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子、ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子及びＩＬ−２の有効量の存在下で、前記細胞を培養することによって、生体外で増殖される。ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子は、抗ＣＤ３抗体などの抗原非特異的活性化因子を含む、ＴＣＲ／ＣＤ３に対する多価抗体又はリガンド、及びＭＨＣペプチド多量体（例えば、Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ， ｍｉｇｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， Ｄｅｃ １０，２００２ ； ９９（２５）：１６１６８−１６１７３；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｔ− Ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， Ｄｅｃ １，２００３；９（１６）：５９０２−５９０８； ａｎｄ Ｙｅｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ｍｅｌａｎｏｍａ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＴＬ ｆｒｏｍ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９９，１６２ ：２２２７−２２３参照）などの抗原特異的活性化因子から選択され、前記ペプチドは、典型的には、糖尿病関連自己抗原ペプチドなどの自己免疫疾患関連ペプチドであり、適切な糖尿病関連自己抗原には、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、膵島細胞自己抗原（ＩＣＡ）及びインシュリンが含まれ、このようなペプチドの組み合わせも使用することができる。
【００６４】
前記同時刺激物質活性化因子は、ＴＣＲ同時刺激物質、好ましくはＣＤ２８又はＧＩＴＲに対して特異的な多価抗体又はリガンドであるが（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２５ （＋）ＣＤ４（＋） ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＧＩＴＲ ｂｒｅａｋｓ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ， Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２ Ｆｅｂ； ３（２）：１３５−４２．Ｅｐｕｂ ２００２ Ｊａｎ ２２；Ｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｕｓｅ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ ｉｓ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００３ Ｄｅｃ ９；１００（２５）：１５０５９−６４． Ｅｐｕｂ ２００３ Ｎｏｖ ０７）、実験的に決定され得るように、適切な増殖がそのようして得られる場合には、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０及びＣＤ４０Ｌなどの別のＴＣＲ同時刺激物質も標的とすることができる。活性化及び増殖を促進するために、ＴＣＲ／ＣＤ３及びＴＣＲ同時刺激物質活性化因子は、典型的には、宿主細胞（例えば、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ， Ｄｅｃ ２００２， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０５，２５９−７２）又はビーズなどの三次元固相表面上に固定化される。特定の実施形態において、前記活性化因子は、２：１ないし１：５、好ましくは１：１ないし１：３のＴｒｅｇ細胞：ビーズ比で提供される常磁性ビーズ上に固定化される。最適なビーズサイズは、実験的に決定されるが、通例、１ないし２０ミクロンの直径の範囲にある。
【００６５】
ＩＬ−２は、典型的には組換え形態で与えられ、ＩＬ−２の有効量は、典型的には、２００ないし２５００ＩＵ ＩＬ−２／ｍＬである。本発明者らは、５００−２５００、好ましくは１０００ないし２０００ＩＵ ＩＬ−２／ｍＬの範囲にわたる通常ではなく上昇したＩＬ−２濃度を用いると、増殖が増加することを見出した。前記亜集団の標的Ｔｒｅｇ細胞は、好ましくは少なくとも５０倍、並びに好ましくは少なくとも１００、２００又は３００倍に増殖される。最大増殖は実験的に決定され、細胞の種類、インキュベーション条件などによって変動し得る。例示的な実施形態の場合、最大増殖は、約３００、５００及び８００倍であることが見出されている。
【００６６】
増殖されたＴｒｅｇ細胞の抑制機能は、インビトロ又はインビボで検出され得る。例えば、インビトロでは、増殖されたＴｒｅｇ細胞は、Ｆｃ受容体を有する細胞の存在下、抗ＣＤ３で刺激されたＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を又は被照射同種異系脾細胞で刺激されたＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を抑制することが示され得る。適切で典型的なインビボ動物モデル及びヒト臨床免疫抑制プロトコールは、以下でさらに記載されている。
【００６７】
特定の実施形態では、ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子及び増殖されたＴｒｅｇ細胞は自己抗原特異的である。例えば、このような特定の実施形態では、糖尿病と診断され（例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ： ｎｅｗ ｃｒｉｔｅｒｉａ， Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ． １９９８ Ｏｃｔ１５；５８（６）：１３５５−６２，１３６９−７０）、並びに空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、食後血糖値（ＰＰＧ）及び耐糖能（ＧＴＴ）などのグルコース恒常性障害の兆候を示す患者中に導入された、生体外で増殖されたＴｒｅｇ細胞の有効量は、特に、１１０ｍｇ／ｄＬ以下のＦＰＧ、１４０ｍｇ／ｄＬ以下の２時間ＰＰＧ、及び７５ｇのグルコース負荷から２時間後における１４０ｍｇ／ｄＬ以下のＧＴＴから選択される、グルコース恒常性障害の改善をもたらす。従って、本発明は、養子細胞免疫療法を必要としている患者中に、生体外で増殖された本発明のＴｒｅｇ細胞の有効量を導入することを含む養子細胞免疫療法のための方法及び組成物も提供する。
【００６８】
一般的に、これらの適用は、同じ患者から抽出された、増殖されたＴｒｅｇ細胞を再導入することを含むが、前記方法は、ドナー組織から得られたＴｒｅｇを用いた移植、特に骨髄移植に伴う植片対宿主病の治療のための養子細胞免疫療法にも適用することが可能である。
【００６９】
本明細書に開示されているように増殖されたＴｒｅｇの養子免疫伝達は、以下で例示されており、文献に記載されている動物モデル及びヒト臨床試験で実証されているように、糖尿病、ＧＶＨＤ、狼瘡、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、変性心疾患（例えば、Ｚｉａｄ Ｍａｌｌａｔ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｙｐｅ １ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ＥＢＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｉｃｅ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００３ Ｓｅｐ ９；１０８（１０）：１２３２−７）、炎症性腸疾患（クローン病）などを含む、多岐にわたる病原性自己免疫応答を抑制するのに有効である。
【００７０】
本発明者らの養子免疫細胞伝達プロトコールでは、まず、標的ドナーからＴ細胞の混合集団が抽出される。用途に応じて、Ｔ細胞は、寛解期の間に、又は病気の活動期の間に抽出され得る。典型的には、これは、全血を採取し、白血球分離採血法（ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって顆粒球を採取することによって行われる。例えば、大量白血球分離採血法（ＬＶＬ；ｌａｒｇｅ ｖｏｌｕｍｅ ｌｅｕｋａｐｈｅｒｉｓｉｓ）は、血液の白血球の収率を最大化させることが示されている。採取は、連続流アフェレーシス装置（Ｓｐｅｃｔｒａ， ＣＯＢＥ ＢＣＴ）を用いて、２０×１０６個細胞／Ｌに達する。低カルシウム血症の症候は、白血球分離採血法を通じて投与されるカルシウムの継続的注入によって回避される。典型的には、約１００ないし３００分にわたる時間の間に、全血液容量の約４倍に対応する１５ないし４５リットルの液体が採取される。
【００７１】
採取されたリンパ球は、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ６２などのＴｒｅｇ特異的細胞マーカーに基づいて、フローサイトメトリー又は他の細胞分離技術によって分離され、本明細書に記載されているように増殖され、次いで、養子免疫抑制のために患者（典型的には、細胞ドナー（ドナーとレシピエントが異なるＧＶＨＤを除く。））に注入され得る。あるいは、増殖に先立って及び／又は増殖に引き続き保存及び／又は輸送するために、細胞を凍結させてもよい。抗原非特異的増殖の場合、約１０９ないし１０１１個のＴｒｅｇが注入され、抗原特異的増殖の場合、治療的に有効な注入には、通例、約１０７ないし１０９個のＴｒｅｇ細胞が必要とされる。
【００７２】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）。生体外で増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、「Ｔａｙｌｏｒ， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９９，３４９３−９（２００２）」を改変した本発明者らの実験プロトコールにおいてＧＶＨＤの生成を阻害する。２×１０６個の新たに精製されたＢ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞プラス５×１０６個の骨髄細胞を、照射されたＢＡＬＢ／ｃｘＢ６（Ｆ１）レシピエント中に注入する。マウスの集団に、２ｘ１０６個の活性化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を別個に注射し、生存と重量をモニターする。生体外で増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の注入は、８０％のマウスで、１０日から１００日超まで、中央値生存時間を有意に増加させる。補充的な増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を与えられたマウスでの生存は、新鮮なＣＤ４＋Ｔ細胞のみを与えられた対照マウスとは有意には異ならず、保護効果は増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団に対して特異的であることを示唆している。「Ｅｄｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１１４４−５０（２００３）」から改変された実験的プロトコールでのＧＶＨＤの致死性を抑制するために、新鮮な（増殖されていない）ドナー由来ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を用いると、同様の結果が得られる。通常細胞とともに１：１の比で、生体外増殖されたＴｒｅｇ細胞を与えられた動物は、急性の致死的なＧＶＨＤから保護され、８０％超が１００日を上回って生存する。
【００７３】
増殖されたＴｒｅｇ細胞の同時移植後には、Ｔｃｏｎｖ細胞の移植片対腫瘍（ＧＶＴ；Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｔｕｍｏｒ）活性も維持される。ＧＶＨＤは、臨床的特徴及び生存、腫瘍増殖及び拒絶によって評価される。骨髄移植（ＢＭＴ）の時点で注入されたＡ２０−ｌｕｃ／ｙｆｐ細胞は、骨髄に遊走し、肝臓及びリンパ器官の二次的浸潤を伴う白血病をもたらす（Ｅｄｉｎｇｅｒ， ． ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ １０１，６４０−６４８（２００３））。Ｃ５７ＢＬ／６の動物から得たＴ細胞除去骨髄（ＴＣＤ ＢＭ）を移植され、１×１０４個のＡ２０−ｌｕｃ／ｙｆｐ白血病細胞を同時投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、長期にわたる生物発光画像法（ＢＬＩ）シグナル強度の増加によって実証されるように、白血病から３６日より前に死亡する。ＢＬＩ画像は、移植から５日後に腫瘍細胞が上腕骨、大腿骨及び胸骨の骨髄を浸潤し、１５日より前に、脾臓を含むその他の臓器を浸潤することを示す。ＴＣＤ ＢＭ及びＴｃｏｎｖ細胞を与えられた動物は、ＧＶＨＤよりさらに早く死亡するが、骨髄のみの対照群と同様の腫瘍細胞分布を示しながら、Ａ２０−ｌｕｃ／ｙｆｐ白血病の初期の移植を示す。これに対して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞とともにＴｃｏｎｖ細胞を与えられた動物の大多数は、６０日の観察期間中生存する。何れの動物も白血病の成長を示さないが、全ての動物が、５日の時点で、骨髄から初期腫瘍シグナルを示した。このことは、Ｔ細胞移植はＡ２０−ｌｕｃ／ｙｆｐ細胞の移植を妨害しないが、白血病細胞の活発な根絶は、ドナーＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞による致死的ＧＶＨＤから動物が保護されるときに達成されることを示している。これらのデータは、本発明者らの増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞によるＧＶＨＤ抑制が、養子免疫伝達されたドナーＴｃｏｎｖ細胞のＧＶＴ活性を抑制しないことを示している。
【００７４】
多発性硬化症（ＭＳ）。数多くの研究が、Ｔｒｅｇ細胞の喪失がＭＳ患者で観察される免疫制御の欠如に対する原因であること（例えば、Ｐｕｔｈｅｔｉ ｅｔａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ． ２００３ Ｓｅｐ； １０（５）：５２９−３５；Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６７：１２４５−５３． ２００１； Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２．１６９（１１）：６２１０−７；Ｓｃｈｍｉｅｄ， ｅｔ ａｌ． ， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００３ Ｍａｒ；１０６（３）：１６３−７４）、及び養子免疫細胞療法は疾病を軽減し得ること（例えば、Ｍｕｒａｒｏ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ ｏｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ２００３ Ａｕｇ；３２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ４１−４；Ｂｌｅｖｉｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ． ２００３ Ｊｕｎ； ２３（２）：１４７−５８； Ｋｏｈｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ ：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｃｔｉｖｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｎｏｖｌ， ２００２； １６９（９）：４７１２−４７１６． Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．２００３ Ｓｅｐ； １０（５）：５２９−３５）を示唆している。
【００７５】
ＭＳ患者を用いた養子免疫抑制療法の本発明者らによる初期の研究では、寛解期にＴ細胞を採取し、Ｔｒｅｇは抗ＣＤ３及びＣＤ２８抗体（上記）で増殖し、凍結して保存する。再発時に、前記増殖されたＴｒｅｇを注射によって注入し、ガドリニウムで増強した病変によって疾病の進行をモニターする（例えば、Ｈｏｒｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｕｓｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ． ２００３ Ａｐｒ；１７（４）：３８９−９７）。その後の研究では、抗原特異的増殖は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ；ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ；ｍｙｅｌｉｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｔｙｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ；ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）の免疫原性ペプチドと結合されたＤＲ２ ＭＨＣを用いて実施される。ＭＨＣペプチド多量体（上記）プラス抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２を用いて増殖が実施されることを除き、分離、増殖及び凍結保存を上述のように実施する。
【００７６】
関節リウマチ（ＲＡ）。以前の研究により、Ｔｒｅｇ細胞の喪失がＲＡ患者で観察される免疫制御の欠如に対する原因であることが示唆されており、治療的介入に対する動物モデルの正当性が確認されている。例えば、抗原特異的Ｔ細胞の規定された集団の役割を具体的に分析するために、慢性炎症性関節炎、オボアルブミンによって誘導された関節炎（ＯＩＡ；ｏｖａｌｂｕｍｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）の動物モデルが使用されてきた。例えば、「Ｈａｒｄｕｎｇ， Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ， Ｐｒｏｃ ３４ｔｈ Ａｎｎ Ｍｅｅｔ Ｇｅｒｍａｎ Ｓｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｓｅｐｔ ２４−２７，２００３」を参照。この系では、野生型の共通遺伝子レシピエント中に活性化された抗原特異的Ｔヘルパー細胞（Ｏｖａ−ＴＣＲｔｇ／ｔｇ）を伝達することは、抗原の関節内注射後に関節炎を誘導するのに十分であった。インビトロで分極されたＴｈ１細胞の伝達は、急性及び慢性の関節炎症をもたらした。さらに、Ｏｖａ−ＴＣＲｔｇ／ｔｇ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の同時伝達は、疾病の誘導を抑制した。
【００７７】
ＲＡ患者を用いた養子免疫抑制療法の本発明者らによる初期の研究では、寛解期に、ＰＢＭＣ又は関節の滑液からＴ細胞を採取し（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｒ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｏｒｇａｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００３ Ｊａｎ；３３（１）：２１５−２３）、Ｔｒｅｇは抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（上記）及びＩＬ−２とともに増殖し、凍結して保存する。増殖されたＴｒｅｇは、寛解期に注射によって注入し、確立された臨床的基準を用いて、疾病の進行をモニターする（Ｆｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｃｏｒｅ ｓｅｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｆｏｒ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ． Ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｍｅａｓｕｒｅｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ １９９３ Ｊｕｎ；３６（６）：７２９−４０； Ｆｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ． Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ １９９５ Ｊｕｎ； ３８（６）：７２７−３５）。
【００７８】
その後の研究では、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ＭＨＣ由来ペプチド及びＩＩ型コラーゲンなどの関節特異的抗原などのＲＡ関連自己抗原用のペプチドが結合されたＤＲ４ ＭＨＣを用いて、抗原特異的増殖が実施される（例えば、Ｋｏｔｚｉｎ， Ｕｓｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−ＤＲ４ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｓｙｎｏｖｉａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００ Ｊａｎ ４；９７（１）：２９１−６）。ＭＨＣペプチド多量体（上記）プラス抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２を用いて増殖が実施されることを除き、分離、増殖及び凍結保存を上述のように実施する。
【００７９】
乾癬。以前の研究により、Ｔｒｅｇ細胞の喪失が乾癬患者で観察される免疫制御の欠如に対する原因であることが示唆されており、治療的介入に対する動物モデルの正当性が確認されている（例えば、Ｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ：ｔｈｅ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １９９４ Ｎｏｖ； １０３，５ Ｓｕｐｐｌ，１５０Ｓ−１５３Ｓ参照）。
【００８０】
乾癬患者を用いた養子免疫抑制療法の本発明者らによる初期の研究では、寛解期にＰＢＭＣから又は病気の活動期に皮膚からＴ細胞を採取し、Ｔｒｅｇは抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（上記）及びＩＬ−３とともに増殖し、凍結して保存する。増殖されたＴｒｅｇは、寛解期に注射によって注入し、主要な臨床的終末点がベースラインと第１２週スコアを比較してＰＡＳＩスコアの平均パーセント変化である確立された臨床的基準を用いて、疾病の進行をモニターする（例えば、Ａｓｈｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ： ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｑｕａｌｉｔｙ． Ｂｒ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １９９９ Ａｕｇ； １４１（２）：１８５−９１）。
【００８１】
その後の研究では、抗原特異的増殖は、乾癬関連皮膚自己抗原のペプチドと結合されたＤＲ６ ＭＨＣを用いて、及び乾癬性関節炎の場合には関節自己抗原と結合されたＤＲ６ ＭＨＣを用いて実施される。ＭＨＣペプチド多量体（上記）プラス抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２を用いて増殖が実施されることを除き、分離、増殖及び凍結保存を上述のように実施する。
【００８２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎。以前の研究により、Ｔｒｅｇ細胞の喪失がＩＢＤ患者で観察される免疫制御の欠如に対する原因であることが示唆され、治療的介入に対する動物モデルの正当性が確認されている（例えば、Ａｓｓｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｉｔｏｇｅｎｉｃ Ｔｈｌ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｏｏｌ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｍｉｃｅ： ｃｏｎｔｒｏｌ ｂｙ ＣＤ４＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＩＬ−１０． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｊｕｌ １５； １７１（２）：９７１−８； Ｒｅａｄ， ｅｔ ａｌ．， １９９８．ＣＤ３８＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：３４３５； Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９８． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：６４９；Ａｓｓｅｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， １９９９． ＩＬ−１０ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ， ｗｈｉｃｈ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９０： ９９５参照）。
【００８３】
ＩＢＤ患者を用いた養子免疫抑制療法の本発明者らによる初期の研究では、寛解期にＰＢＭＣから又は病気の活動期に罹患した腸組織からＴ細胞を採取し、Ｔｒｅｇは抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（上記）及びＩＬ−２で増殖し、凍結して保存する。再発時に、前記増殖されたＴｒｅｇを注射によって注入し、炎症細胞の中度から重度の浸潤物、慢性的な間欠、長期の下痢、体重減少、嘔吐などを含む、胃腸炎の組織学的兆候と相関する確立された臨床基準を用いて疾病の進行をモニターする。ここでは、別の腸炎症の源は臨床的に除外される。
【００８４】
その後の研究では、抗原特異的増殖は、ＩＢＤ過敏性に関連する食事及び／又は細菌性抗原のペプチドに結合されたＨＬＡ−ＣＷ６を用いて実施される。ＭＨＣペプチド多量体（上記）プラス抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２を用いて増殖が実施されることを除き、分離、増殖及び凍結保存を上述のように実施する。
【００８５】
本発明は、本発明の方法によって作製されたＴｒｅｇ細胞組成物、特に、本明細書に記載されているように、自己免疫の抑制を必要としている患者中への注入に適合された組成物を提供する。例えば、このような組成物には、本明細書に記載されている増殖されたＴｒｅｇ細胞の注入可能な有効単位投薬量を含み、このような投薬量は、以下に記載されているように、キットとともに予め梱包してもよい。
【００８６】
本発明は、本発明の方法で使用するための試薬及び／又は材料を含み、本発明の方法について記載した指示媒体を必要に応じて含むキットを提供する。本発明は、本発明の方法又はキットの記述又は参照に対して特異的に適合され、及び／又は本発明の方法又はキットの記述又は参照を取り込む業務方法も提供する。
【００８７】
追加実施例
【実施例１】
【００８８】
インビトロで増殖された抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞は自己免疫性糖尿病を抑制する。
【００８９】
ここで、本発明者らは、自己免疫傾向のある非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウス由来の抗原特異的Ｔｒｅｇを増殖する着実な方法を記載する。インビトロで、２週間未満で、最大２００倍まで増殖されたＴｒｅｇは、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＦｏｘＰ３およびＧＩＴＲの発現を含むこのサブセットの典型的な特徴をすべて保持する伝統的なＴｒｅｇ表現型を発現し、インビトロおよびインビボの両方においてエフェクターＴ細胞機能を抑制するように機能する。インビボで前糖尿病性マウスおよび糖尿病性マウスにおいて糖尿病を抑制する、増殖されたＮＯＤＴｒｅｇの能力は、ポリクローナルＴｒｅｇと比較すると、自己抗原特異的Ｔ細胞を使用すると有意に亢進した。抗原特異的Ｔｒｅｇは、Ｔｒｅｇ欠乏性ＣＤ２８−／−マウスにおける糖尿病の発達を効果的に抑制し、慢性的に糖尿病の動物における同系膵島移植片拒絶反応を遮断し、先行する報告とは対照的に、Ｔｒｅｇは初めて、新たに発生した疾病を有するマウスにおいて糖尿病を回復させることが示される。それゆえ、これは少数の抗原特異的Ｔｒｅｇが疾病開始後に糖尿病を回復できるという最初の証明であり、自己免疫のための細胞内免疫療法への新規のアプローチを提供する。
【００９０】
自己抗原特異的ＴＣＲトランスジェニックＮＯＤマウス由来の調節性Ｔ細胞の増殖。先行研究は、ＮＯＤマウスにおいて１６〜２４週齢まで臨床的な疾病と相関する時間にわたり、Ｔｒｅｇが数および機能の上で減少することを示してきた。しかしながら、これらの細胞を治療上使用する能力は、循環またはリンパ系器官中の細胞が少数であるため、制限されている（ＮＯＤマウスにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞が５％未満、およびＴ１Ｄを有するヒトにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞が２％未満）。さらに、抗原特異性に基づいて細胞を選択することが困難であるために、数多くの細胞が必要とされる。それゆえ、本発明者らは、ＴＣＲトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおいて存在するこれらの細胞が、同時固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と外因性ＩＬ−２を使用して細胞周期へと駆動できるという知見に基づいて、自己抗原特異的Ｔｒｅｇの迅速かつ効率的な増殖のための技術を開発した。ＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８によりコーティングされたビーズとともに培養された、ＦＡＣＳ精製されたＮＯＤＴｒｅｇは、１１日間で１５０〜２２５倍に増殖した。一般に、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞はより激しく増殖した（複数の実験で３００〜８００倍の範囲）。したがって、ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかのわずかな夾雑がＴｒｅｇを増殖する能力に影響を与えるので、９８％を超える純度のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２＋Ｔ細胞はＴｒｅｇ増殖の成功にとって好ましかった。
【００９１】
免疫欠乏性ＮＯＤマウスにおいて疾病を転移させるための糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴｅｆｆ細胞の能力を、若齢ＮＯＤマウスから単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇが抑制したことを先行研究は報告している。しかしながら、前記処理は能率的ではなく、この設定におけるＴｒｅｇの抑制効果は、おそらく抗原特異的Ｔｒｅｇの低い前駆体頻度のためにＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆの０．５：１または１：１の比を必要とした。したがって本発明者らは、２つの異なる抗原特異的ＴＣＲＴｇマウス由来のＴｒｅｇがポリクローナルＮＯＤＴｒｅｇと同じ方法論を使用してインビトロで増殖できるか否かを検討した。ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇマウスは、β細胞の顆粒において発現される膵島抗原に特異的なＴＣＲを発現するのに対し、ＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇは前記膵島抗原から派生するペプチドであるグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）を認識する。ＴｒｅｇはＢＤＣ２．５マウスおよびＧＡＤ２８６マウスから精製され、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８とＩＬ−２カクテルを使用して増殖された。前記ＢＤＣ２．５細胞は、このＴＣＲと反応することがすでに示されているＭＨＣペプチド四量体で効率よく染色することに基づいてトランスジェニックＴＣＲαβを発現し、前記増殖されたＧＡＤ２８６ＴｒｅｇはＴｇＴＣＲβ鎖を発現した。ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２５−およびＴｒｅｇは、固定されたＭＨＣ−ペプチド二量体を使用して同様に効率よく増殖できる。これらの結果は、このプロトコールを使用して増殖できるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋の集団が野生型マウスおよびＴＣＲＴｇマウスの両者において存在することを示す。
【００９２】
本発明者らは、次に、前記増殖されたＴｒｅｇの表現型をフローサイトメトリー、ウェスタンブロットおよびリアルタイムＰＣＲにより検討した。前記増殖されたＴｒｅｇは、増殖されたＣＤ２５−Ｔ細胞と比較して、ＣＤ２５の高レベルの発現を維持したのに対し、ＣＤ６２Ｌの発現は両細胞タイプにおいて高いままであった。さらに、同様に増殖されたＣＤ２５−Ｔ細胞と比較して、Ｔｒｅｇがすべて高レベルのＳＯＣＳ２、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４を発現することを定量的ＰＣＲは示した。さらに、最近同定されたマーカーであるニューロピリンおよびＴＲＡＩＬも、前記増殖されたＴｒｅｇにおいて多量に発現した。高レベルの細胞表面ＧＩＴＲ発現は、増殖されたＴｒｅｇにおいて観察されたが、このすでに同定されたＴｒｅｇマーカーも増殖されたＣＤ２５−Ｔ細胞においても誘導された。定量的ＰＣＲ研究が５つの個別の増殖されたＴｒｅｇ集団（ポリクローナルＴｒｅｇおよびＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｒｅｇの両者を含む。）に関して実行され、その相対的な発現が高度に再現可能であったことは留意されるべきである。最後に、本発明者らは、Ｔｒｅｇについて最近同定された線形マーカーであるＦｏｘＰ３を検討した。ＲＴ−ＰＣＲ分析およびウェスタンブロット分析の両者によって示されるように、前記増殖されたＴｒｅｇは、新鮮なＴｒｅｇにおいて観察されるのと同様のレベルのＦｏｘＰ３を発現し、新鮮なまたは増殖されたＣＤ２５−Ｔ細胞よりも有意に高いレベルのＦｏｘＰ３を発現した。ＲＮＡ発現（１０倍）およびタンパク質量（２０倍）は、新鮮なＴｒｅｇに関する先行研究と一致したが、ＣＤ２５−Ｔｅｆｆ細胞中でのＦｏｘＰ３に明らかにいくらかの亢進があり、この培養条件がＣＤ２５−サブセット内でいくつかの制御性Ｔ細胞を誘導するかもしれないことを示している。
【００９３】
本発明者らは、また、サイトカインを分泌する前記増殖されたＴｒｅｇの能力も検討した。活性化されたＣＤ２５−Ｔ細胞とは異なり、ＴｒｅｇはＩＬ−２もＩＦＮγも産生しないが、むしろ免疫抑制性サイトカインであるＩＬ−１０およびＴＧＦβを発現した。したがって、Ｔｒｅｇの大規模な活性化と増殖は、ＣＤ２５−Ｔ細胞サブセットとは異なったままであるＴｒｅｇの表現型を変化させない。
【００９４】
インビトロで増殖されたＴｒｅｇの機能的活性。先行研究は、Ｔｒｅｇが抗ＣＤ３および脾臓ＡＰＣで刺激されるＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖性反応を効果的に抑制できることを示してきた。増殖されたＮＯＤＴｒｅｇは増殖性反応並びにＩＬ−２およびＩＦＮγを含むサイトカインの産生を効率よく抑制した。実際、複数の実験において、前記増殖されたＴｒｅｇは、新鮮なＮＯＤＴｒｅｇよりも有意に抑制した。前記抑制は１：１０未満のＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比で定期的に観察された。増殖されたＢＤＣ２．５ＴｒｅｇがポリクローナルＮＯＤＴ細胞と同様にＢＤＣ２．５の増殖性反応を抑制する上で効果的であるので、ＴＣＲＴｇマウス由来の増殖されたＴｒｅｇを使用して同様の結果が、観察された。Ｔｒｅｇ抑制機序の検討は細胞間接触が必要であることを実証する他の研究を裏付けた。前記増殖されたＴｒｅｇは有意なレベルのＩＬ−１０およびＴＧＦβを発現したが、抑制活性は抗ＩＬ−１０、抗ＴＧＦβ、または両抗体の組み合わせをインビトロ培養物へ添加することによって影響を及ぼさなかった。これらの結果は、細胞間接触がインビトロ設定における免疫抑制の基本的手段であるＴｒｅｇ抑制の数多くのモデルと一致する。
【００９５】
前記増殖されたＴｒｅｇの抗原特異性をさらに評価し、前記増殖されたＴｒｅｇが構成的に抑制性であるか否かを決定するため、正常ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の増殖されたＴｒｅｇが、ＯＶＡ特異的ＤＯ１１．１０ＴＣＲＴｇマウス由来のＴ細胞を抑制するそれらの能力について検討した。ＴｒｅｇおよびＤＯ１１．１０ＴｇＴｅｆｆ細胞を、（Ｔｅｆｆ細胞のみを活性化する）ＯＶＡ抗原または（ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇの両者を活性化する）抗ＣＤ３の存在下で共培養した。増殖されたＢＡＬＢ／ｃＴｒｅｇは、ＯＶＡペプチドにより刺激されるＤＯ１１．１０Ｔ細胞の増殖性反応を抑制しなかった。しかしながら、抗ＣＤ３反応は、低いＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比で完全に抑制された。このことは、増殖されたＴｒｅｇの構成的抑制活性の欠失および効果的な免疫抑制のためのＴｒｅｇの抗原特異的活性化についての必要性を裏付ける。この結果はまた、高レベルのＣＤ２５発現を通じて入手可能なＩＬ−２を消費することによって細胞が培養物を抑制しているという小さな可能性も除外した。
【００９６】
増殖されたＴｒｅｇの生体内生存および活性化。Ｔｒｅｇによる生体内での免疫反応の効果的な抑制は、細胞が適切な部位へ移動し、抗原に反応し、長時間生存することを要する。本発明者らは、ＣＤ２８／Ｂ７経路の遮断が生体内でのＴｒｅｇの迅速な損失およびその後の決定的な免疫調節の損失に至ることを最近観察した。したがって、本発明者らは、生体内で生存および増殖するための増殖されたＴｒｅｇの能力を検討した。ＮＯＤ、ＢＤＣ２．５、およびＧＡＤ２８６のマウス由来の増殖されたＴｒｅｇをＣＳＦＥで標識し、正常な非リンパ球減少症ＮＯＤマウスへと転移した。転移７日後、前記マウスを屠殺し、生存および増殖からの読み取りとしてＣＳＦＥ＋細胞の数について検討した。異なる系のマウス由来の増殖されたＴｒｅｇで転移したマウスから有意な数のＣＳＦＥ＋細胞を回収した。実際、ＣＦＳＥ＋ＴｒｅｇはＴｈｙ１．１により標識されたＴｒｅｇと同様、少なくとも転移５０日後に観察され、その数は同じ方法で転移された新鮮なＴｒｅｇで観察されるものと等しかった。
【００９７】
次に、本発明者らは、抗原に反応し、生体内で増殖する養子免疫伝達されたＴｒｅｇの能力を分析した。リンパ球減少症によって増殖が駆動される可能性を未然に防ぐため、Ｔｒｅｇを正常マウスへと導入した。少数だが有意な数のＴｒｅｇはＣＳＦＥ希釈に基づいて増殖した。しかしながら、膵臓リンパ節（ｐａｎｃＬＮ）におけるＮＯＤＴｒｅｇの選択的増殖がなかった。このことは、ＮＯＤＴｒｅｇレパートリーの範囲内で膵島自己抗原特異的細胞の有意な数がないことを示す。実際、ＮＯＤｐａｎｃＬＮ細胞中では、増殖されたＴｒｅｇの量が他のＬＮ細胞において観察されるよりも少なく、そのことは膵島特異的ＴｒｅｇがＮＯＤにおいて除去された可能性を示す。ＮＯＤＴｒｅｇとは対照的に、ＢＤＣ２．５Ｔｇマウス由来のＴｒｅｇは７日間の間、少なくとも３〜４倍に分割するｐａｎｃＬＮにおいて広範囲かつ選択的に増殖および増大された。興味深いことに、前記増殖されたＴｒｅｇはＣＤ６２Ｌ発現を下方制御した。細胞が導入前にインビトロで複数回の増殖周期を経験し、高レベルのＣＤ６２Ｌ発現を維持したため、このことは驚くべきことである。ＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇとは対照的に、ＧＡＤ２８６Ｔｒｅｇは生体内で増殖しなかった。先行研究はこれら２つのＴＣＲＴｇマウスがそれらの胸腺発達において有意に異なることを示唆する。前記ＢＤＣ２．５Ｔｇマウスは胸腺における膵島特異性を負に選択せず、むしろこの動物に存在する有力なエフェクター細胞により疾病を遮断することが示されてきたＴｒｅｇを小さいが再生可能な数発達させる。比較すると、逸出する細胞が代わりのＴＣＲα鎖を利用するように、ＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇＴ細胞は前記胸腺において負に選択される。末梢のＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇ細胞はインビトロでＧＡＤペプチドに反応するが、その反応性は弱く、およびＢＤＣ２．６とは対照的に、養子免疫伝達に際して糖尿病を誘導できない。このことは、自己反応性レパートリーの「欠如」を示す。したがって、前記増殖されたＴｒｅｇを使用するこれらの結果は、生体内において帰巣および生存し、さらなる信号を受信して抗原特異的サブセットをさらに活性化および増殖する、循環自己反応性ＴｒｅｇをＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇマウスではなくＢＣＤ２．５ＴＣＲＴｇマウスが有することを示す。
【００９８】
インビトロで増殖されたＴｒｅｇは生体内での糖尿病の養子免疫伝達を抑制する。次に、本発明者らは、活性化されたＢＤＣ２．５Ｔ細胞のＮＯＤ．ＲＡＧマウスへの生体内での同時導入後に糖尿病を抑制する前記増殖されたＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇの能力を検討した。前記Ｔｒｅｇは糖尿病の導入を遮断する上で効果的であり、Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆが１：９の比と同程度で低く機能するのに対し、前記ＧＡＤ２８６Ｔｒｅｇは１：１のＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆでさえ保護しなかった。実際、前記増殖されたＢＤＣ２．５ＴｒｅｇはポリクローナルＴ細胞によって媒介される疾病を抑制した。僅か２×１０６個の増殖されたＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇが、疾病を導入する２５×１０６個の糖尿病誘発性ＮＯＤ脾細胞の能力を遮断した。前記ＢＤＣ２．５マウス由来の増殖された抗原特異的Ｔｒｅｇは糖尿病の開始を予防する上で増殖されたポリクローナルＮＯＤＴｒｅｇよりもさらに効果的であり、上述の異なる増殖性の差異と一致した。８×１０６個に達する増殖されたＮＯＤＴｒｅｇは、１／４の数の前記抗原特異的ＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇを使用する疾病導入の総遮断と比較すると、糖尿病誘発性細胞の導入されたＲＡＧレシピエントの２５％で糖尿病を予防するにすぎなかった。この結果は、Ｔｅｆｆ細胞に対するポリクローナルＴｒｅｇの高い比がこの設定における疾病導入を効率よく抑制するのに必要であることを示唆する先行研究の知見と一致する。重要なことに、これらのデータは、Ｔｒｅｇのインビトロでの反応性がこの疾病における生体内機能を推定しないことを示す。
【００９９】
増殖されたＴｒｅｇは非リンパ球減少症の設定において生体内で糖尿病を予防する。Ｔｒｅｇの免疫調節性活性を示す複数のモデルはあるが、そのシステムの多くはＴｒｅｇ増殖を亢進するリンパ球減少症マウスを利用する養子免疫伝達モデルに基づいている８，２１−２４。それゆえ本発明者らは、非リンパ球減少症動物モデルにおける糖尿病を予防するための前記増殖されたＴｒｅｇの能力を検討した。先行研究は、ＣＤ２８−／−ＮＯＤマウスが正常数のＴ細胞およびＴｈ１反応を有することを示してきた。実際、これらのマウスは強くＣＤ２８依存性であることが示されているＴｈ２およびＴｒｅｇの欠乏性のため、悪化した自己免疫性を発達させる。したがって、本発明者らは、野生型により増殖されたＢＤＣ２．５ＴｒｅｇがＣＤ２８−／−ＮＯＤマウスへと導入できるかどうか、及び疾病の開始を遅延または予防できるかどうかを検討した。５×１０５個のＴｒｅｇを５週齢のＣＤ２８−／−ＮＯＤマウスへと導入し、糖尿病について観察した。増殖されたＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇの導入は、導入後２０週もの間検討されたマウスの１００％において糖尿病の発達を予防した。対照的に、増殖されたＮＯＤＴｒｅｇの導入は疾病の発症に何ら影響しなかった。これらの結果は、抗原特異的な増殖されたＴｒｅｇが完全に機能的な病原性Ｔ細胞反応に直面して生体内で機能したことを示す。
【０１００】
増殖されたＴｒｅｇは生体内で糖尿病を回復させる。Ｔｒｅｇ療法の最終的な有用性は、進行する疾病を有する個体を治療できることによって決まる。したがって本発明者らは、糖尿病の明らかなモデルにおけるこれらの増殖されたＴｒｅｇの調節効果の検討を展開した。最初に、本発明者らは同系のＮＯＤ膵島移植片の拒絶を遮断する増殖されたＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇの能力を検討した。少なくとも２週間の間インスリンペレットを使用して、糖尿病ＮＯＤマウスにおいて正常血糖を維持した。そのとき、前記マウスに５００個の同系膵島細胞のみをまたは増殖されたＴｒｅｇと同時に導入した。５×１０６個のＮＯＤではなく、２×１０６個のＢＤＣ２．５の増殖されたＴｒｅｇを同時伝達すると、この条件で進行する自己免疫性を遮断する抑制細胞の能力と一致して、前記同系の膵島の拒絶を遮断した。より重要なことに、増殖されたＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇの養子免疫伝達は、明瞭に糖尿病のＮＯＤマウスにおける糖尿病を回復させた。この設定において、１×１０７個のＴｒｅｇは、血糖レベルの上昇（３００ｍｇ／ｄＬ超）に基づいて最近疾病を発症したと診断されたＮＯＤマウスへと伝達された。前記伝達されたＴｒｅｇは前記マウスの６０％において糖尿病を回復させた。したがって、前記増殖されたＴｒｅｇは、進行する自己免疫設定において糖尿病を遮断および回復させることに特に効果的である。
【０１０１】
Ｔｒｅｇが糖尿病を回復できるという本発明者らの見解は、臨床自己免疫療法に対する本発明者らの方法の適用可能性を示すものであり、そこではＴｒｅｇが（例えばＳＬＥまたはＭＳの場合）寛解期または（例えばＴ１Ｄの場合）疾病発症直後のいずれかの患者から単離される。前記細胞を次に増殖し、最大疾病活性の時点で再導入し、前記炎症反応を抑制する。本発明者らは、この療法がラパマイシン、抗ＣＤ３、またはＴｒｅｇに影響せずに病原性細胞の欠失を惹起する他の薬物と組み合わせることができることを発見した。総合して、これらの療法はいずれも短期病原性反応を低下させる一方で、長期間の耐性誘導のための恒常性平衡を回復する。
【実施例２】
【０１０２】
ＮＯＤマウス由来の機能的内因性抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の増殖：抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は自己免疫性糖尿病を調節する。
【０１０３】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、自己免疫性を調節するために極めて重要である。証拠は、Ｔｒｅｇの発達および機能が抗原特異性に依存することを示唆する。これにもかかわらず、自然の状態で生じる抗原特異的Ｔｒｅｇについてほとんどわかっていない。この実施例において、本発明者らは非肥満性糖尿病マウスにおいて膵島ペプチド擬似体を認識し、自然に惹起するＴｒｅｇを同定しおよび特徴付ける。抗原特異的Ｔｒｅｇは、原型の表面マーカーおよびサイトカインを発現する。増殖されたＴｒｅｇは、抗原特異的様式で活性化されるが、インビトロおよび生体内の両者においてバイスタンダー抑制（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）できた。重要なことに、前記膵島ペプチド擬似体特異的Ｔｒｅｇは、自己免疫性糖尿病を抑制する上でポリクローナルＴｒｅｇよりも効率がよかった。本発明者らの開示は器官特異的自己免疫性に対する治療剤としてのＴｒｅｇの利用を示す。
【０１０４】
自己免疫性１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、自己抗原に対する耐性を維持することに関与する機構の崩壊により発症し、Ｔ細胞により仲介される膵臓のインスリン産生膵島細胞の破壊に至る。潜在的に病原性の自己反応性Ｔ細胞は、正常な末梢Ｔ細胞レパートリーに存在するが、健常な個体では、抑制因子または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって一部調節される（１，２）。Ｔｒｅｇのクラスのうち、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇは自己免疫性を調節するのに重要な独特な細胞サブセットである（３，４）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴｒｅｇまたはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの発達および抑制因子機能を調節する転写因子であるＦｏｘｐ３を欠乏するマウスおよびヒトは多臓器自己免疫性疾患を経験する（５−１１）。ＣＤ４＋Ｃ２５＋Ｔｒｅｇの抑制因子機能の低下または悪化は、Ｔ１Ｄ、多発性硬化症、関節リウマチおよび他の自己免疫性疾患と関連付けられてきた（１２−１６）。比較すると、ポリクローナルＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の導入は、Ｔ１Ｄのマウスモデルである非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおける自己免疫性糖尿病を含む多くのシステムにおける自己免疫を予防した（１７，１８）。しかしながら、前記過程は非効率的であり、多数のＴｒｅｇの導入を必要とした。本発明者らは、最近、ＩＬ−２並びに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂでコーティングされたビーズの組み合わせを使用して、膵島抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＢＤＣ２．５Ｔ細胞受容体トランスジェニック（ＴＣＲＴｇ＋）Ｔｒｅｇのインビトロ増殖のための方法を記載した（１９）。前記増殖された膵島特異的Ｔｒｅｇは、ポリクローナルＮＯＤＴｒｅｇと比較して有意に減少した数のＴｒｅｇを使用して、ＮＯＤマウスにおける糖尿病を遮断および回復させる上で効果的であり、Ｔｒｅｇの抗原特異性が治療の有効性に重要であることを示した。それゆえ、効果的な臨床療法は、ポリクローナル集団由来の関連する抗原特異的Ｔｒｅｇを同定および増殖する能力に依存する（２０）。
【０１０５】
自然条件下で生じるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの抗原特異性については比較的わずかなことが分かっているにすぎない。本研究において、本発明者らは、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋マウスが有意な割合の膵島抗原特異的Ｔｒｅｇを有しているため、この特異性は同様に既存のＮＯＤマウスにおいて存在するかもしれないと仮説を立案した（１９，２１，２２）。したがって、本発明者らは、抗ＣＤ３ｍＡｂを、ＢＤＣ２．５ＴＣＲミモトープペプチド１０４０−３１（ｐ３１）を呈する組み換えＭＨＣクラスＩＩのＩ−Ａｇ７と置換することによって、ＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇ研究に使用される増殖プロトコールを適応させた（２３）。内因性ＢＤＣ２．５抗原がまだ同定されていないため、前記ミモトープペプチドを使用した（２４）。ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７ビーズがポリクローナル集団由来の低頻度の抗原特異的細胞を増殖できるか否かを決定するため、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋ＴｒｅｇをＮＯＤマウス由来のポリクローナルＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞へと播いた。前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７および抗ＣＤ２８によってコーティングされたビーズは、外因性ＩＬ−２の存在下でＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇを増殖する上で特に効率よかった。０．１％ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇで最初に播いた培養物は約４倍に増殖されたのに対し、０．０１％および０．００１％ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇで播いた培養物は感知できるほどには増殖しなかった。しかしながら、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体を使用して抗原特異的細胞を検出するフローサイトメトリー分析によって、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇがすべての培養物において増殖されたことが評価された。最低濃度の播種において、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇは０．００１％から３４．３％の集団へと成育した。このことは、１０日間の培養で前記抗原特異的細胞のほぼ５０００倍の増殖に至る培養期間中における１２細胞よりも多い細胞分裂を反映した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇがペプチド−Ｉ−Ａｇ７でコーティングされたビーズによる増大後の調節活性を保持することを確認するため、新鮮に単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５−ＢＤＣ２．５Ｔｇ＋レスポンダー細胞を、増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＢＤＣ２．５Ｔｇ＋Ｔｒｅｇの滴定と組み合わせて使用して抑制アッセイを実行した。増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＢＤＣ２．５Ｔｒｅｇは、前記ＢＤＣ２．５ミモトープペプチド１０４０−３１で刺激される培養物において投与量依存的な態様で、前記ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞反応を効率よく抑制した。さらに、抑制活性はインビトロでの複数回の刺激後に喪失されなかった。０．００１％で最初に播き、およびペプチド−Ｉ−Ａｇ７ビーズによる２回の刺激の後５０％にまで増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＢＤＣ２．５Ｔｇ＋細胞は、前記ｐ３１ペプチドにより刺激されるＣＤ４＋ＣＤ２５−ＢＤＣ２．５Ｔｇ＋細胞を抑制した。したがって、抗原特異的ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋Ｔｒｅｇ細胞が総ポリクローナルＴｒｅｇ集団の非常にわずかな割合を呈したときでさえ、前記手法は、抑制機能を保持する抗原特異的Ｔｒｅｇの大きな増殖に至った。
【０１０６】
本発明者らは、次に、このアプローチを既存のＮＯＤマウス由来の抗原特異的ＣＤ４＋Ｃ２５＋Ｔｒｅｇの増殖へ適用した。ＮＯＤマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞を材料および方法において記載されるようなｐ３１−Ｉ−Ａｇ７ビーズとともに培養した（２５）。７〜１４日間かけて、前記総集団は、最初の細胞入力と比較して１〜１０倍に典型的に増殖された。フローサイトメトリー分析は、前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７ビーズによる増殖の後、１０％にまで上るＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体に対して正に染色するのに対し、抗ＣＤ３によりコーティングされたビーズで増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞はバックグラウンドレベルを超えるｐ３１−Ｉ−Ａｇ７に対する正の染色には至らないことを示した。同じ培養条件下で、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）は典型的に、前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体に対して４０〜５０％正に染色するとともに１０倍増殖された。しかしながら、多量体染色は明らかに、インビトロ増殖アッセイに基づいた前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７反応性Ｔｒｅｇ細胞の過小評価であった。増殖されたＴｒｅｇ細胞をカルボキシフルオロセインスクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および抗ＣＤ２８の存在下でｐ３１ペプチドまたは対照の卵白アルブミン（ＯＶＡ）ペプチドとともに培養した。ＣＦＳＥ希釈アッセイの結果は、卵白アルブミンにより刺激された培養物中の１４％のバックグラウンド増殖と比較して、５０％を超えるｐ３１−Ｉ−Ａｇ７で培養したＴｒｅｇが細胞周期へと入ることを示した。前記ＯＶＡペプチドで観察される高程度のバックグラウンド増殖は、培養物がその中にあるビーズの連続した存在により１００％休止していなかったことを反映するのかもしれない。刺激の前に、この同じ細胞集団は、フローサイトメトリーによりｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体結合について分析されるとき、たった６．４％のｐ３１反応性細胞を有していた。これらの結果は、低い結合活性を有するＴ細胞が多量体染色によってほとんど検出されないことを示し、前記ＴＣＲがＢＤＣ２．５特異性のｐ３１ミモトープと正確には同じではない内因性抗原に特異的であるという事実を反映するのかもしれない。この解釈の妥当性を探究するため、本発明者らは前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴ細胞のＶβレパートリーを検討した。前記ＢＤＣ２．５Ｔ細胞受容体はＶβ４ファミリー由来のＴＣＲβを発現する（２６）。しかしながら、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇ細胞よびＴｅｆｆ細胞がｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体および異なるＴＣＲＶβ試薬で同時染色されるとき、いずれの集団もモノクローナルではなかった。代わりに、両集団は、いくつものＶβ集団を提示する幅広いレパートリーを示した。興味深いことに、有意な数のＶβ４＋ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体＋Ｔ細胞がＴｒｅｇ培養物中に存在したが、他のＴＣＲＶβも有意な数で存在し、例えば、Ｖβ２よびＶβ１２はこの代表的な培養物中でｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体＋Ｔｒｅｇのそれぞれ１０．２％および１３．７％を占めた。ＴＣＲＶβ４＋Ｔ細胞は、前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体＋Ｔエフェクター集団中に一般に存在したが、より低い割合であった。これらの結果を総合すると、膵島ペプチド擬似体に対して反応性のある幅広いレパートリーのＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞が既存のＮＯＤマウスにおいて存在することを示す。本結果はまた、膵島ペプチド擬似体反応性Ｔｒｅｇレパートリーが膵島ペプチド擬似体反応性Ｔｅｆｆレパートリーと同一ではないことも示す。
【０１０７】
抗ＣＤ３により増殖された培養物についてすでに観察されるように、ペプチド−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇは、同様の方法で培養されるＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋細胞とは対照的に、培養期間を通じてＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋表現型を保持した。ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋細胞は活性化に際しＣＤ２５ｈｉｇｈになったが、初期の活性化の後、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７反応性Ｔｒｅｇ細胞と比較してＣＤ２５をわずかに下方制御した。ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７反応性Ｔエフェクター細胞の大部分は前記培養期間にＣＤ６２Ｌを下方制御した。本発明者らは、また、定量的リアルタイムＰＣＲを使用してＴｒｅｇ系列マーカーであるＦｏｘｐ３の発現について前記増殖されたＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞を検討した。ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７反応性細胞が分析されることを確認するため、分析前に、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇを蛍光により活性化される細胞選別（ＦＡＣＳ）により、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体陽性および陰性集団へと選別した。代表的な実験において、増殖されたｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体＋Ｔｒｅｇは、増殖されたｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体陽性Ｔエフェクターに対して約３０００倍のＦｏｘｐ３を発現した。増殖されたｐ３１−Ｉ−Ａｇ７Ｔｒｅｇはまた、フローサイトメトリーにより分析されるとき、典型的なＴｒｅｇ表面マーカーであるＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＧＩＴＲも発現した。本発明者らは、次に、抗原による負荷試験に際しｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇによるサイトカイン分泌を検討した。Ｔｒｅｇについてすでに報告されているデータと一致して、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇは、低レベルの炎症前サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＦＮγを発現し、および高レベルの抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を発現した。
【０１０８】
先行研究は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴｒｅｇがインビトロでのＣＤ４＋エフェクターの増殖を抑制でき、および前記抑制効果がそのＴＣＲを通じてのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの刺激に依存することを示した。それゆえ、増殖されたｐ３１−Ｉ−Ａｇ７Ｔｒｅｇ細胞をインビトロで抑制活性および特異性について検討した。培養物をポリクローナル活性化因子である抗ＣＤ３で刺激したとき、増殖されたｐ３１−Ｉ−Ａｇ７は、新鮮に単離されるポリクローナルＣＤ４＋Ｔ細胞および抗原特異的ＣＤ４＋ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋マウスの増殖を投与量特異的な形式で効果的に抑制した。より重要なことに、前記培養物をその中の１０４０−３１ペプチド反応性細胞による特異的抑制を呈する１０４０−３１ペプチドで刺激すると、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７ＴｒｅｇはＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制した。対照的に、増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５−ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７Ｔｅｆｆは、新鮮に単離されたＢＤＣ２．５ＣＤ４＋Ｔ細胞を抑制することができず、増殖を増大させた。興味深いことに、前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｅｆｆ細胞ではなくＴｒｅｇ細胞は、新鮮に単離されるＴｒｅｇについての報告どおり、ＣＤ２８の同時刺激の欠如のもとでの刺激（ｐ３１ペプチドおよび抗ＣＤ３の両者）に対してアネルギー性であった。前記増殖されたＴｒｅｇの抗原特異性をさらに特徴付けるため、抗ＣＤ３を介するポリクローナルＴ細胞活性化または抗原特異的Ｔ細胞活性化のいずれかを通じて、増殖されたポリクローナルＴｒｅｇおよびｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇを、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋またはグルタミン酸脱炭酸酵素ペプチド２８６特異的（ＧＡＤ２８６）ＴＣＲＴｇ＋ＣＤ４＋細胞を抑制する能力について評価した。ポリクローナルＴｒｅｇおよびｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇはいずれも、抗ＣＤ３により刺激されるとき、ＢＤＣ２．５ＴＣＲＴｇ＋レスポンダーを抑制したのに対し、前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇのみが、前記ＢＤＣ２．５ １０４０−３１ペプチドで刺激される培養物を抑制した。同様に、ポリクローナルＴｒｅｇおよびｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇの両者は、抗ＣＤ３により刺激されるとき、ＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の反応を抑制した。しかしながら、前記ポリクローナルＴｒｅｇ集団も前記ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇ集団も、前記ＧＡＤ（２８６−３００）ペプチドで刺激されるとき、ＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇ＋レスポンダーを抑制しなかった。最も重要なことに、前記培養物を前記ＧＡＤ（２８６−３００）および前記１０４０−３１ペプチドの両者で刺激するとき、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇはＧＡＤ２８６ＴＣＲＴｇ＋レスポンダーを抑制できた。これらのデータを総合すると、前記ペプチド−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇの抑制活性が前記ＴＣＲを通じての抗原特異的刺激に依存するが、同族の抗原で一度刺激されると、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇはバイスタンダー抑制を発揮できることを示す。
【０１０９】
本発明者らは次に、ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖された少数のＴｒｅｇが、ＣＤ２８−／−ＮＯＤマウスにおけるポリクローナルＴ細胞仲介性糖尿病を抑制する能力について検査した。ＣＤ２８−／−ＮＯＤマウスは、正常な数のエフェクターＴ細胞およびＴｈ１反応を有し、末梢部分における恒常性についてＣＤ２８に依存するＴｒｅｇの欠乏により、自己免疫性糖尿病の加速した形態を発症する（１７，２８）。先行研究は、多数（８−２０×１０６個）のポリクローナルＴｒｅｇの導入が糖尿病の開始を遅延または予防できることを示した（１７）。したがって本発明者らは、ＣＤ２８−／−マウスへ導入されるｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇが糖尿病を予防できるか否かを検討した。１．８〜２×１０６個と同数のｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖されたＴｒｅｇを５〜７週齢のマウスへと導入することにより、１５週齢と同程度の齢のマウスの５５％において糖尿病の発達を予防した。前記導入した集団はフローサイトメトリーに基づいて〜１０％のｐ３１−Ｉ−Ａｇ７多量体＋細胞を典型的に含んでいたが、絶対頻度は前記ＣＦＳＥ増殖アッセイに基づくと明らかに高かった。それゆえ本発明者らは、前記導入した集団が、ポリクローナルＮＯＤＴｒｅｇで実行される同様の研究よりも実質的に少数の１０６個以下の抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を含んでいたと概算する。したがって、抗原特異的ｐ３１−Ｉ−Ａｇ７により増殖された細胞は、十分に機能的なポリクローナルＴ細胞反応によって誘導される糖尿病の開始を保護する上で非常に効率が高かった。さらに、ｐ３１−ＩＡｇ７により増殖されたＴｒｅｇを与えられ、１５週齢および１６週齢で糖尿病から保護される動物は、糖尿病であり且つ８〜１０週齢で検討されて、処理されていないマウスおよびポリクローナルＴｒｅｇにより処理されたマウスと比較して、唾液腺および甲状腺で、より高い程度のリンパ球性浸潤を示したため、ｐ３１−ＩＡｇ７により増殖されたＴｒｅｇによる自己免疫性の抑制は器官特異的であった。
【０１１０】
この実施例において本発明者らは、膵島ペプチド擬似体に反応性のある抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが、糖尿病感受性ＮＯＤマウスの末梢に存在することを示す。さらに本発明者らは、抗原特異的細胞がポリクローナル集団からインビトロで選択的に増殖でき、および新鮮に単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの表現型特徴および機能的特徴を、これらの増殖されたＴｒｅｇが保持することを示す。本発明者らは、増殖された抗原特異的Ｔｒｅｇが生体内で器官特異的自己免疫性を調節する点で非常に効率よいことを示す。これらの結果はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇによる免疫調節がＴｒｅｇの抗原特異性に依存することを示す先行研究を支持し、およびＴｒｅｇがＴ細胞ニッチについて競合することにより抗原非特異的形式で機能することを示唆する報告と一致しない（１９，２２，２９）。
【０１１１】
本発明者らの知見は臨床療法のためのＴｒｅｇベースのアプローチを提供し、それは末梢血からの器官特異的Ｔｒｅｇの増殖を必要とする。制限されたレパートリーの少数の自己抗原特異的Ｔｒｅｇが増殖される場合でさえ、バイスタンダーサイトカイン産生およびまたは内因性制御性細胞の動員のいずれかによってポリクローナルＴ細胞反応を抑制する能力のため、これらの自己抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞は臨床的に有効でありうる。Ｔ１Ｄおよび多発性硬化症のような自己免疫性疾患に関与する多くの器官特異的抗原が同定されており、および現在入手可能なヒトＭＨＣ多量体試薬は自己免疫性疾患の治療のためにヒト器官特異的Ｔｒｅｇを増殖するために採用できる（２）。
【０１１２】
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ１． Ｓ． Ａｒｉｆ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１３，４５１ （２００４）．
２． Ｎ． Ａ． Ｄａｎｋｅ， ｅｔ ａｌ． ｋ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２，５９６７ （２００４）．
３． Ｌ． Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ， Ｂ． Ｓａｌｏｍｏｎ， Ｊ． Ａ． Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １８２，１４９ （２００１）．
４． Ｓ． Ｓａｋａｇｕｃｈｉ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２，５３１ （２００４）．
５． Ｔ． Ａ． Ｃｈａｔｉｌａ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０６， Ｒ７５ （２０００）．
６． Ｃ． Ｌ． Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ． ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２７，２０ （２００１）．
７． Ｍ． Ｅ． Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ． ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２７，６８（２００１）．
８． Ｒ． Ｓ． Ｗｉｌｄｉｎ ｅｔａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２７，１８（２００１）．
９． Ｊ． Ｄ． Ｆｏｎｔｅｎｏｔ， Ｍ． Ａ． Ｇａｖｉｎ， Ａ． Ｙ． Ｒｕｄｅｎｓｋｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４，３３０ （２００３）．
１０． Ｒ． Ｋｈａｔｔｒｉ， Ｔ． Ｃｏｘ， Ｓ． Ａ． Ｙａｓａｙｋｏ， Ｆ． Ｒａｍｓｄｅｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４，３３７ （２００３）．
１１． Ｓ． Ｈｏｒｉ， Ｔ． Ｎｏｍｕｒａ， Ｓ． Ｓａｋａｇｕｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，１０５７ （２００３）．
１２． Ａ． Ｋｕｋｒｅｊａ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０９，１３１ （２００２）．
１３． Ｍ． Ｒ． Ｅｈｒｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２００，２７７ （２００４）．
１４． Ｍ． Ａ． Ｋｒｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９，１２８５ （２００４）．
１５． Ｖ． Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９，９７１ （２００４）．
１６． Ｃ． Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ， Ｄ． Ａ． Ｈａｆｌｅｒ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２００，２７３ （２００４）．
１７． Ｂ． Ｓａｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２， ４３１ （２０００）．
１８． Ｓ． Ｇｒｅｇｏｒｉ， Ｎ． Ｇｉａｒｒａｔａｎａ， Ｓ． Ｓｍｉｒｏｌｄｏ， Ｌ． Ａｄｏｒｉｎｉ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１，４０４０ （２００３）．
１９． Ｑ． Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９，１４５５ （２００４）．
２０． Ｊ． Ａ． Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ， Ｑ． Ｔａｎｇ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０１，１４６２２ （２００４）．
２１． Ａ． Ｅ． Ｈｅｒｍａｎ， Ｇ． Ｊ． Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｄ． Ｍａｔｈｉｓ， Ｃ． Ｂｅｎｏｉｓｔ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９，１４７９ （２００４）．
２２． Ｋ． Ｖ． Ｔａｒｂｅｌｌ， ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９，１４６７ （２００４）．
２３． Ｅ． Ｌ． Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１，５５８７ （２００３）．
２４． Ｖ．Ｊｕｄｋｏ． ｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６，９０８（２００１）．
２５． Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｏｎｌｉｎｅ．
２６． Ｊ． Ｄ． Ｋａｔｚ， Ｂ． Ｗａｎｇ， Ｋ．Ｈａｓｋｉｎｓ， Ｃ． Ｂｅｎｏｉｓｔ， Ｄ． Ｍａｔｈｉｓ， Ｃｅｌｌ ７４，１０８９ （１９９３）．
２７． Ｋ． Ｖ． Ｔａｒｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９６，４８１ （２００２）．
２８． Ｑ． Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７１，３３４８ （２００３）．
２９． Ｔ． Ｂａｒｔｈｌｏｔｔ， Ｇ． Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ， Ｂ． Ｓｔｏｃｋｉｎｇｅｒ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９７，４５１ （２００３）．
【実施例３】
【０１１３】
増殖されたＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達後のループス腎炎の臨床的寛解
研究サイズ：被験者の総数２０名；部位の総数２箇所
研究期間：１２〜２４ヶ月
標的集団：ループス腎炎患者
理論的根拠：自己免疫性の調節における制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の重要性は今やさまざまな実験動物モデルにおいて十分に確立されている（ＭｃＨｕｇｈ他、Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：６９３−７０２，２００２）。さらに、Ｔｒｅｇ欠乏がヒト自己免疫性疾患の根本的な原因であるかもしれないことを示唆する多数の研究がある。最も重要なことに、免疫恒常性の不可欠な要素としてのＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の出現は活発な免疫調節および長期の耐性誘導のための有力な治療機会を提供する。しかしながら、Ｔｒｅｇは、数％（２％未満）のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を占めるにすぎず、自己免疫性ヒトにおいては、数および機能を低下させ、増殖的にアネルギーであると一般に考慮される。本発明者らはヒト由来のＴｒｅｇ細胞を増殖する強力な方法を開発した。３週間未満で２００倍にまで増殖された細胞は伝統的なＴｒｅｇ表現型（ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋）を発現し、Ｔ細胞エフェクター増殖およびサイトカイン産生を抑制するよう機能する。
【０１１４】
本研究は、ループス腎炎患者由来の増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の安全性および有効性を検査するよう企図された。予備段階データは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者は、寛解時に高いＴｒｅｇ活性をおよび再発時に低下という病状によるＴｒｅｇ活性における変動性を示すことを示唆した（Ｃｒｉｓｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ ２１：２７３−２７６，２００３）。本発明者らは、本発明者らが寛解時に患者由来のＴｒｅｇを同定、選択、および増殖することができ、並びにそれらの細胞を凍結保存によって保存でき、再発時に再導入できるか否かを決定しようとした。本研究は、そのような自家性Ｔｒｅｇ療法の安全性を検査し、および疾病の進行および免疫学的因子に及ぼすこの療法の効果を決定するよう企図された。
【０１１５】
研究デザイン／治療プロトコール：本研究は２つの相からなる。第一相において本発明者らは、活発なループス腎炎を有する５名の患者および寛解にあるループス腎炎の病歴を持つ５名の患者（免疫抑制療法停止）由来のＴｒｅｇを増殖する。この相は活発なおよび不活発な疾病を有する患者由来のＴｒｅｇを増殖する相対的な可能性を示し、および前記増殖された細胞の機能的能力を実証する。
【０１１６】
第二相は、２つの異なるデザインプロトコールを使用する、活発なループス腎炎を有する患者におけるＴｒｅｇ注入の非盲検治験である。第一プロトコールにおいて、本発明者らは活発な疾病を有する患者由来の機能的Ｔｒｅｇを増殖し、次にこれらの患者はすぐに患者自体の増殖された細胞のレシピエントとなるだろう。流入判定基準には、活発なループス腎炎に加えて、抗二本鎖ＤＮＡ抗体および低補体血症の存在が含まれる。流入判定基準にはまた腎炎のための適切な根本的治療も含まれる（例、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、等）。しかしながら、シクロホスファミド（ＣＴＸ）療法は、ＣＴＸがＴｒｅｇの効果をより干渉しがちであるかもしれないという懸念に基づいて排除された。一次評価項目は一般的な臨床因子および疾病活性を観察することによって査定される自家性導入の安全性である。二次評価項目（疾病活性、血清学、および機構的研究）は治療３０日後、６０日後、９０日後、１８０日後、および３６５日後で測定される。
【０１１７】
第二プロトコールは、十分なＴｒｅｇが活発なループス腎炎患者から回収できない場合に適用される。ここでは、細胞は疾病の寛解期間に患者から回収され、生体外で増殖され、およびその後再発時の注入に備えて凍結される。より大きな患者プールおよびより長い期間以外は、この治験のデザインは上述のデザインと並行した。
【０１１８】
本方法および材料は、糖尿病患者における養子性細胞導入に関する本発明者らのフェイズＩの研究について以下に記載されるものと同様である。本発明者らの選択したＦＤＡにより承認される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズおよび前記指定されたモノクローナル抗体は、Ｘｃｙｔｅ ＴｈｅｒａｐｉｅｓおよびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎからそれぞれ入手可能である。本発明者らは、個々の患者由来の約１０９個のＴｒｅｇを増殖および凍結保存するための選別および増殖手法を一定の基準に従って調節した。
【０１１９】
一次結果：安全性
二次結果：１）クレアチニン、タンパク尿、および尿沈渣により査定される腎機能、２）抗二本鎖ＤＮＡ抗体および補体により査定されるループス血清学、３）ＳＬＥＤＡＩおよびまたはＢＩＬＡＧにより査定され、および患者の包括的な査定による疾病活性指数、および４）機構的研究
機構的研究：１）抗二本鎖ＤＮＡおよび補体の測定、２）自家抗体産生Ｂ細胞の頻度の査定、３）Ｔｒｅｇ表現型を検出するための循環しているリンパ球の表現型分析、４）Ｔｒｅｇ活性の査定、および５）Ｔｈ１およびＴｒｅｇサイトカインについてのＥＬＩＳＰＯＴ
解釈：この研究は、ループス腎炎患者由来のＴｒｅｇ細胞が前記患者における健康または疾病の進行に及ぼす有害な効果がなく、および養子免疫伝達療法がこれらの患者における腎機能を改善することを示す。
【実施例４】
【０１２０】
増殖されたＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達後の真性糖尿病の臨床的寛解
この治験は、増殖されたＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達後の真性糖尿病の臨床的寛解を示す。本発明者らの研究であるリンパ球回収および注入プロトコールはＲａｐｏｐｏｒｔ、他：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＭＬ ａｆｔｅｒ ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（印刷に先立ち電子出版、２００４年１０月２７日）から適応した。
【０１２１】
患者の適格性および登録。本発明者らは、書面による事前のインフォームドコンセントがすべての患者から、施設内倫理委員会の指針にしたがって得られることを必要とした。患者は臨床的および実験的特徴に基づいた真性糖尿病を有することが必要とされる。適切な腎機能、心機能、肺機能、および肝機能が必要とされ、および患者は活発な感染またはＨＩＶ血清陽性を有していない。
【０１２２】
定常状態のリンパ球の回収。患者はまず自動細胞分離装置（Ｃｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ細胞回収装置または応分の装置）を使用して定常状態の白血球分離採血法を受ける。約２０−３０ｌの血液が大きな内腔のカテーテルを通じて処理され、体重１ｋｇあたり約１．５×１０８個の単核細胞を得る。後で本発明者らの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８培養システムにおいて増殖するために、これらの細胞を凍結保存する。
【０１２３】
Ｔリンパ球の生体外同時刺激および増殖。ＦＤＡにより承認された研究上の新薬適用において指定されるようにＴ細胞を培養する。自家移植相の初日前後に、前記凍結保存された単核細胞を解凍し、および１％ヒト血清アルブミン入りのＰＢＳで３回洗浄した。もし初期の凍結保存時に実行されなければ、前記単核細胞は閉システムにおいて磁気ビーズを使用して単球枯渇する。前記細胞を次に、プールされた５％のＡＢ血清入りのＸ−ＶＩＶＯを含有する気体透過性フラスコ（Ｂａｘｔｅｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）へと播く。固定した抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８（９．３）モノクローナル抗体を有する常磁性ビーズをビーズ：ＣＤ３＋細胞の比を２：１で添加し、およびＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍｌ）で補強された培養物は１４日間まで維持した後、回収して注入のために調製した（上述）。前記細胞を毎日計数し、および１０００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２により補強された新鮮培地を添加して、前記細胞を０．７５〜２×１０６個／ｍｌの密度で維持する。細胞培養の完了後、Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｍａｘｓｅｐ磁気細胞分離デバイスを使用して前記磁気ビーズを除去する。ビーズの除去後、前記細胞を洗浄し、濃縮し、およびＢａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用して１％ヒト血清アルブミンを含有する１００〜２５０ｍｌのＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ中に再懸濁する。
【０１２４】
生体外で増殖されたＴ細胞の再注入。放出前に、前記回収した産物はすべて、細胞生存率（７０％）、滅菌性（バクテリアおよび菌についてのネガティブ培地、ネガティブ菌体内毒素アッセイ）、およびビーズ夾雑（３×１０６個の細胞あたりビーズ１００個未満）についての基準に合うことを必要とされる。前記回収した細胞を細胞産生設備から患者へと配達媒体により輸送し、同日に注入する。前記細胞を白血球フィルターなしで２０−６０分かけて注入する。患者はアセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンで定期的にあらかじめ投薬されてもよい。
【実施例５】
【０１２５】
増殖されたＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達後の真性糖尿病の臨床的寛解。
【０１２６】
この治験は、増殖されたＴｒｅｇ細胞の養子免疫伝達後の真性糖尿病の臨床的寛解を示す。本発明者らの研究であるリンパ球回収および注入プロトコールは、Ｒａｐｏｐｏｒｔ、他：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＭＬ ａｆｔｅｒ ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（印刷に先立ち電子出版、２００４年１０月２７日）から適応した。
【０１２７】
患者の適格性および登録：本発明者らは、書面による事前のインフォームドコンセントがすべての患者から施設内倫理委員会の指針にしたがって得られることを必要とした。患者は臨床的および実験的特徴に基づいた真性糖尿病を有する必要がある。適切な腎機能、心機能、肺機能、および肝機能が必要であり、および患者は活発な感染またはＨＩＶ血清陽性を有していない。
【０１２８】
定常状態のリンパ球の回収。患者はまず自動細胞分離装置（Ｃｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ細胞回収装置または応分の装置）を使用する定常状態の白血球分離採血法を受ける。約２０−３０ｌの血液が大きな内腔のカテーテルを通じて処理され、体重１ｋｇあたり約１．５×１０８個の単核細胞を得る。後で本発明者らのＭＨＣクラスＩＩ分子／ペプチド複合体−同時刺激剤培養システムにおいて増殖するために、これらの細胞を凍結保存する。
【０１２９】
Ｔリンパ球の生体外同時刺激および増殖。ＦＤＡにより承認された研究上の新薬適用において指定されるようにＴ細胞を培養する。自家移植相の初日前後に、前記凍結保存された単核細胞を解凍し、および１％ヒト血清アルブミン入りのＰＢＳで３回洗浄した。もし初期の凍結保存時に実行されなければ、前記単核細胞は閉システムにおいて磁気ビーズを使用して単球枯渇する。前記細胞を次に、プールされた５％のＡＢ血清入りのＸ−ＶＩＶＯを含有する気体透過性フラスコ（Ｂａｘｔｅｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）へと播く。固定したＭＨＣ複合体ＩＩ型ＤＱ０６０２／インスリンＢペプチド（ａａ５〜１５）および抗ＣＤ２８（９．３）モノクローナル抗体を有する常磁性ビーズをビーズ：ＣＤ３＋細胞の比を２：１で添加し、およびＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍｌ）で補強された培養物は１４日間まで維持した後、回収して注入のために調製した（上述）。前記細胞を毎日計数し、および１０００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２により補強された新鮮培地を添加して、前記細胞を０．７５〜２×１０６個／ｍｌの密度で維持する。細胞培養の完了後、Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｍａｘｓｅｐ磁気細胞分離デバイスを使用して前記磁気ビーズを除去する。ビーズの除去後、前記細胞を洗浄し、濃縮し、およびＢａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用して１％ヒト血清アルブミンを含有する１００〜２５０ｍｌのＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ中に再懸濁する。
【０１３０】
生体外で増殖されたＴ細胞の再注入。放出前に、前記回収した産物はすべて、細胞生存率（７０％）、滅菌性（バクテリアおよび菌についてのネガティブ培地、ネガティブ菌体内毒素アッセイ）、およびビーズ夾雑（３×１０６個の細胞あたりビーズ１００個未満）についての基準に合うことを必要とされる。前記回収した細胞を細胞産生設備から患者へと配達媒体により輸送し、同日に注入する。前記細胞を白血球フィルターなしで２０−６０分かけて注入する。患者はアセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンで定期的にあらかじめ投薬されてもよい。
【０１３１】
具体的な実施形態及び実施例の前記記述は、例示のために提供されており、限定のために提供されているものではない。別段の記載がなければ、これらの記述及び本明細書全体を通じて、「１つの」という用語は、一又は複数を意味し、「又は」という用語は、及び／又はを意味する。本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許出願並びにこれらに引用されている刊行物は、各刊行物が参照により具体的且つ個別的に組み込まれる旨の記載が為されている場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。前記発明は、理解を明瞭にする目的で、例示および実施例によって、幾分詳細に記載されているが、当業者であれば、本発明の教示に照らして、付属の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、本発明に何らかの変化及び修飾を加え得ることが自明であろう。
【０１３２】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象体適合性細胞の集団を取得することと；
前記細胞の集団から得られた、所定の自己抗原特異的制御性Ｔ細胞濃縮組成物を作製することと；及び
前記対象体中での前記自己免疫反応を調節するために前記対象体中に前記組成物を導入することと；
を含む、対象体中の自己免疫反応を調節する方法。
【請求項２】
前記細胞の集団が前記対象体から取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の集団が前記対象体とは異なるドナーから取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞の集団が末梢血から採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記作製工程が前記抗原特異的制御性Ｔ細胞を増殖することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記増殖が、前記細胞の集団を自己抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物と接触させることによって達成される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
制御性Ｔ細胞が、前記増殖工程の前に、前記細胞の集団から濃縮される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
制御性Ｔ細胞が、前記増殖工程の後に、前記細胞の集団から濃縮される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記刺激組成物がＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原ペプチド複合体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記刺激組成物が同時刺激因子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記同時刺激因子がアゴニスト抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アゴニスト抗体がＣＤ２８に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記刺激組成物が第二の制御性Ｔ細胞刺激因子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記第二の刺激因子がサイトカインである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サイトカインがインターロイキンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記インターロイキンがインターロイキン−２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記刺激組成物が基材上に固定化される、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記基材が細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記基材がビーズである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記作製工程が前記取得された細胞の集団から前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞を濃縮することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記調節が阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
組成物の細胞の少なくとも５０％が自己抗原特異的制御性Ｔ細胞である、天然細胞の集団を含む組成物。
【請求項２３】
前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞が、表ＡのＭＨＣクラスＩＩ分子中に提示された自己抗原ペプチドに対して特異的である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞が、対象体に投与されたときに、自己免疫応答を調節するのに効果的である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項２２に記載の自己抗原特異的制御性Ｔ細胞の組成物を作製するためのキットであって、
自己抗原特異的Ｔ細胞受容体刺激因子；及び
同時刺激因子を含むキット。
【請求項２６】
前記刺激因子がＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原ペプチド複合体である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記同時刺激因子がアゴニスト抗体である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記抗体がＣＤ２８に結合する、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
第二の制御性Ｔ細胞刺激因子をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
前記第二の刺激因子がサイトカインである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記サイトカインがインターロイキンである、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記インターロイキンがインターロイキン−２である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記インターロイキンがインターロイキン−１５である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
前記刺激因子及び前記同時刺激因子が基材上に固定化される、請求項２５に記載のキット。
【請求項３５】
前記基材が細胞である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記基材がビーズである、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
糖尿病を有すると診断されて、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、食後血糖値（ＰＰＧ）及び耐糖能（ＧＴＴ）から選択されるグルコース恒常性障害の兆候を示す患者からＴ細胞の混合集団を抽出する工程と；
＞９８％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を含む亜集団を、陰性及び陽性免疫選択並びに細胞分取によって前記集団から単離する工程と；
生体外で増殖されたＴｒｅｇ細胞を取得するために、前記亜集団を、（ｉ）ＴＣＲ／ＣＤ３に対する多価抗体及びリガンドから選択されるＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子；（ｉｉ）ＣＤ２８に対する多価抗体及びリガンドから選択されるＴＣＲ同時刺激物質活性化因子；並びに（ｉｉｉ）有効量が２００ないし２５００ ＩＵ ＩＬ−２／ｍＬであるＩｌ−２の、有効量と接触させることによって、前記亜集団のＴｒｅｇ細胞を少なくとも１００倍増殖させる工程と；
生体外で増殖された１０７ないし１０１１個のＴｒｅｇ細胞を前記患者中に導入する工程と；並びに
生じたグルコース恒常性障害の改善を検出する工程と、
を含む、養子細胞免疫治療の方法。
【請求項３８】
前記改善が、１１０ｍｇ／ｄＬ以下のＦＰＧ、１４０ｍｇ／ｄＬ以下の２時間ＰＰＧ、及び７５ｇのグルコース負荷から２時間後における１４０ｍｇ／ｄＬ以下のＧＴＴから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子が抗ＣＤ３抗体であり、前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子が抗ＣＤ２８抗体であり、前記抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体が、１：１ないし１：２のＴｒｅｇ細胞：ビーズ比で与えられた常磁性ビーズ上に固定化されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子がＭＨＣペプチド多量体であり、前記ペプチドが糖尿病関連自己抗原ペプチドであり、糖尿病関連自己抗原がグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、膵島細胞自己抗原（ＩＣＡ）及びインシュリンから選択され、前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子が抗ＣＤ２８抗体であり、導入工程で生体外で増殖された１０７ないし１０９個のＴｒｅｇ細胞を前記患者中に導入する、請求項３７に記載の方法。
【請求項１】
対象体適合性細胞の集団を取得することと；
前記細胞の集団から得られた、所定の自己抗原特異的制御性Ｔ細胞濃縮組成物を作製することと；及び
前記対象体中での前記自己免疫反応を調節するために前記対象体中に前記組成物を導入することと；
を含む、対象体中の自己免疫反応を調節する方法。
【請求項２】
前記細胞の集団が前記対象体から取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の集団が前記対象体とは異なるドナーから取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞の集団が末梢血から採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記作製工程が前記抗原特異的制御性Ｔ細胞を増殖することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記増殖が、前記細胞の集団を自己抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物と接触させることによって達成される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
制御性Ｔ細胞が、前記増殖工程の前に、前記細胞の集団から濃縮される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
制御性Ｔ細胞が、前記増殖工程の後に、前記細胞の集団から濃縮される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記刺激組成物がＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原ペプチド複合体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記刺激組成物が同時刺激因子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記同時刺激因子がアゴニスト抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アゴニスト抗体がＣＤ２８に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記刺激組成物が第二の制御性Ｔ細胞刺激因子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記第二の刺激因子がサイトカインである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サイトカインがインターロイキンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記インターロイキンがインターロイキン−２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記刺激組成物が基材上に固定化される、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記基材が細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記基材がビーズである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記作製工程が前記取得された細胞の集団から前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞を濃縮することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記調節が阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
組成物の細胞の少なくとも５０％が自己抗原特異的制御性Ｔ細胞である、天然細胞の集団を含む組成物。
【請求項２３】
前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞が、表ＡのＭＨＣクラスＩＩ分子中に提示された自己抗原ペプチドに対して特異的である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記自己抗原特異的制御性Ｔ細胞が、対象体に投与されたときに、自己免疫応答を調節するのに効果的である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項２２に記載の自己抗原特異的制御性Ｔ細胞の組成物を作製するためのキットであって、
自己抗原特異的Ｔ細胞受容体刺激因子；及び
同時刺激因子を含むキット。
【請求項２６】
前記刺激因子がＭＨＣクラスＩＩ／自己抗原ペプチド複合体である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記同時刺激因子がアゴニスト抗体である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記抗体がＣＤ２８に結合する、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
第二の制御性Ｔ細胞刺激因子をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
前記第二の刺激因子がサイトカインである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記サイトカインがインターロイキンである、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記インターロイキンがインターロイキン−２である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記インターロイキンがインターロイキン−１５である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
前記刺激因子及び前記同時刺激因子が基材上に固定化される、請求項２５に記載のキット。
【請求項３５】
前記基材が細胞である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記基材がビーズである、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
糖尿病を有すると診断されて、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、食後血糖値（ＰＰＧ）及び耐糖能（ＧＴＴ）から選択されるグルコース恒常性障害の兆候を示す患者からＴ細胞の混合集団を抽出する工程と；
＞９８％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を含む亜集団を、陰性及び陽性免疫選択並びに細胞分取によって前記集団から単離する工程と；
生体外で増殖されたＴｒｅｇ細胞を取得するために、前記亜集団を、（ｉ）ＴＣＲ／ＣＤ３に対する多価抗体及びリガンドから選択されるＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子；（ｉｉ）ＣＤ２８に対する多価抗体及びリガンドから選択されるＴＣＲ同時刺激物質活性化因子；並びに（ｉｉｉ）有効量が２００ないし２５００ ＩＵ ＩＬ−２／ｍＬであるＩｌ−２の、有効量と接触させることによって、前記亜集団のＴｒｅｇ細胞を少なくとも１００倍増殖させる工程と；
生体外で増殖された１０７ないし１０１１個のＴｒｅｇ細胞を前記患者中に導入する工程と；並びに
生じたグルコース恒常性障害の改善を検出する工程と、
を含む、養子細胞免疫治療の方法。
【請求項３８】
前記改善が、１１０ｍｇ／ｄＬ以下のＦＰＧ、１４０ｍｇ／ｄＬ以下の２時間ＰＰＧ、及び７５ｇのグルコース負荷から２時間後における１４０ｍｇ／ｄＬ以下のＧＴＴから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子が抗ＣＤ３抗体であり、前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子が抗ＣＤ２８抗体であり、前記抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体が、１：１ないし１：２のＴｒｅｇ細胞：ビーズ比で与えられた常磁性ビーズ上に固定化されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＣＲ／ＣＤ３活性化因子がＭＨＣペプチド多量体であり、前記ペプチドが糖尿病関連自己抗原ペプチドであり、糖尿病関連自己抗原がグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、膵島細胞自己抗原（ＩＣＡ）及びインシュリンから選択され、前記ＴＣＲ同時刺激物質活性化因子が抗ＣＤ２８抗体であり、導入工程で生体外で増殖された１０７ないし１０９個のＴｒｅｇ細胞を前記患者中に導入する、請求項３７に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５３８０００（Ｐ２００７−５３８０００Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４９４３３（Ｐ２００６−５４９４３３）
【出願日】平成１７年１月８日（２００５．１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０００５０２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７００９０
【国際公開日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【出願人】（５０６２３５２８１）リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・カリフオルニア (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月８日（２００５．１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０００５０２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７００９０
【国際公開日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【出願人】（５０６２３５２８１）リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・カリフオルニア (2)
【Ｆターム（参考）】
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