前立腺癌の処置のためのサイトカイン発現細胞ワクチン
前立腺癌の処置においてワクチンとして用いるための、遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞が提供される。より詳細には、β−フィラミンに対する免疫応答の増強を引き起こす手段としての遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦ発現細胞、および前立腺癌の処置における該細胞の使用が記載される。１つの局面において、本発明は、被検体における前立腺癌を処置する方法を提供する。この方法は、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦを産生するために第１の腫瘍細胞集団を遺伝子改変する工程；（ｂ）該腫瘍細胞を被検体に投与する工程；（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤ抗原に対する免疫応答を検出する工程であって、該免疫応答は、該投与の前には検出されない工程を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、前立腺癌の処置のためにワクチンとして用いるための、遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞に関する。より詳細には、本発明は、抗原であるβ−フィラミン（これは、遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦ発現細胞を前立腺癌患者へ投与することによって検出される）に対する増強された免疫応答の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫系は、多種多様な癌の病因に重要な役割を果たしている。癌が進行すると、免疫系が十分に応答しないか、または適切に応答せず、癌細胞が増殖可能になると広く考えられている。現在、化学療法、外科手術、放射線療法および細胞療法を含む、癌のための標準の医学的処置は、効力と毒性のいずれについても明らかな限界を有する。現在まで、これらのアプローチは、癌のタイプ、患者の全身的な健康状態、診断時の病期などに応じて、さまざまな程度で成功している。標準の医学的処置と組み合わせた、癌に対する免疫応答の特定の操作を組み合わせる改良ストラテジーは、効力の増強および毒性の低下のための手段を提供し得る。
【０００３】
免疫系が機能すると、抗原が処理されて、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子に関して細胞表面上に提示される。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子は、抗原に複合体化されると、それぞれＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞に認識される。この認識により、２次的な細胞内シグナルおよび特異的サイトカインのパラクリン放出の両方が生じ、これらは、細胞間の相互作用を媒介し、疾患を撃退するための宿主防御を促進する。次いで、サイトカインの放出は、抗原特異的免疫細胞の増殖を引き起こす。
【０００４】
多数のサイトカインが、腫瘍に対する免疫応答の調節に影響を及ぼすことがわかっている。例えば、米国特許第５，０９８，７０２号（特許文献１）は、既存の腫瘍を治療するのに相乗的に有効な量のＴＮＦ、ＩＬ−２およびＩＦＮ−βの組み合わせを使用することを記載している。米国特許第５，０７８，９９６号、同第５，６３７，４８３号および同第５，９０４，９２０号（特許文献２〜４）は、腫瘍の処置のためにＧＭ−ＣＳＦを使用することを記載している。しかし、癌治療のためのサイトカインの直接投与は、しばしば全身的に毒性であるため、実用的ではない場合がある。（例えば、Ａｓｈｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３２２７−３２３４，１９９１およびＨａｖｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１０６７−１０８５，１９８８（非特許文献１および２）を参照のこと）。
【０００５】
このアプローチの拡大は、ワクチン部位で局所的にサイトカインを発現する、遺伝子改変された腫瘍細胞の使用に関連する。ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦを含む多種多様な免疫調節サイトカインを用いた腫瘍モデルにおいて、それぞれ以下に記載されるように、活性が証明されている：Ｇｏｌｕｍｂｅｃｋ ＰＴら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１３−７１６，１９９１；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ Ｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４，１９９０；Ｆｅａｒｏｎ ＥＲら、Ｃｅｌｌ ６０：３９７−４０３，１９９０；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ Ｂら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：７８２０−２５，１９９０；Ｔｅｎｇ Ｍら、ＰＮＡＳ ８８：３５３５−３５３９，１９９１；Ｃｏｌｕｍｂｏ ＭＰら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１２９１−１２９８，１９９１；Ａｏｋｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８９（９）：３８５０−４，１９９２；Ｐｏｒｇａｄｏｒ Ａら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ．１３（２−３）：１１３−３０，１９９４；Ｄｒａｎｏｆｆ Ｇら、ＰＮＡＳ ９０：３５３９−３５４３，１９９３；Ｌｅｅ ＣＴら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１８７−１９３，１９９７；Ｎａｇａｉ Ｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｏｎｔｈｅｒ．４７：２−８０，１９９８およびＣｈａｎｇ Ａら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：８３９−８５０，２０００（非特許文献３〜１４）。抗腫瘍免疫を増強するためのワクチンとしての自己癌細胞の使用が、ここしばらく探究されてきた。例えば、Ｏｅｔｔｇｅｎら、「Ｔｈｅ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｄｅｖｉｔａら（編）Ｊ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ Ｃｏ．，ｐｐ８７−１９９，１９９１；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＴＤおよびＪａｆｆｅｅ ＥＭ，Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍ．１１（３）：６８１−９６，２００２；およびＢｏｄｅｙ Ｂら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０（４）：２６６５−７６，２０００（非特許文献１５〜１７）を参照のこと。
【０００６】
ＧＭ−ＣＳＦを分泌する自己または同種異系の腫瘍細胞ワクチンを用いた、いくつかの第一／第二段階の人体試験が実施されている（Ｓｉｍｏｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９ ５９：５１６０−８；Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８ ９５：１３１４１−６；Ｓｉｍｏｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７ ５７：１５３７−４６；Ｊａｆｆｅｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００１ １９：１４５−５６；Ｓａｌｇｉａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：６２４−３０；Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：３３４３−５０；Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００４年２月１８日、９６（４）：３２６−３１；ＢｏｒｅｌｌｏおよびＰａｒｄｏｌｌ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３（２）：１８５−９３，２００２；ならびにＴｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（３）２９７−３０６，２００４（非特許文献１８〜２６））。
【０００７】
遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦを発現する癌細胞を患者に投与すると、免疫応答の増強が結果として認められ、前立腺癌または他の癌に対する予備的な臨床効果が、第一／第二段階の臨床試験において証明された。しかしながら、前立腺癌の処置に用いるための細胞ワクチンの使用に関するストラテジーの改善の必要性が、依然として残されている。
【特許文献１】米国特許第５，０９８，７０２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，０７８，９９６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６３７，４８３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９０４，９２０号明細書
【非特許文献１】Ａｓｈｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３２２７−３２３４，１９９１
【非特許文献２】Ｈａｖｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１０６７−１０８５，１９８８
【非特許文献３】Ｇｏｌｕｍｂｅｃｋ ＰＴら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１３−７１６，１９９１
【非特許文献４】Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ Ｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４，１９９０
【非特許文献５】Ｆｅａｒｏｎ ＥＲら、Ｃｅｌｌ ６０：３９７−４０３，１９９０
【非特許文献６】Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ Ｂら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：７８２０−２５，１９９０
【非特許文献７】Ｔｅｎｇ Ｍら、ＰＮＡＳ ８８：３５３５−３５３９，１９９１
【非特許文献８】Ｃｏｌｕｍｂｏ ＭＰら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１２９１−１２９８，１９９１
【非特許文献９】Ａｏｋｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８９（９）：３８５０−４，１９９２
【非特許文献１０】Ｐｏｒｇａｄｏｒ Ａら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ．１３（２−３）：１１３−３０，１９９４
【非特許文献１１】Ｄｒａｎｏｆｆ Ｇら、ＰＮＡＳ ９０：３５３９−３５４３，１９９３
【非特許文献１２】Ｌｅｅ ＣＴら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１８７−１９３，１９９７
【非特許文献１３】Ｎａｇａｉ Ｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｏｎｔｈｅｒ．４７：２−８０，１９９８
【非特許文献１４】Ｃｈａｎｇ Ａら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：８３９−８５０，２０００
【非特許文献１５】Ｏｅｔｔｇｅｎら、「Ｔｈｅ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｄｅｖｉｔａら（編）Ｊ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ Ｃｏ．，ｐｐ８７−１９９，１９９１
【非特許文献１６】Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＴＤおよびＪａｆｆｅｅ ＥＭ，Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍ．１１（３）：６８１−９６，２００２
【非特許文献１７】Ｂｏｄｅｙ Ｂら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０（４）：２６６５−７６，２０００
【非特許文献１８】Ｓｉｍｏｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９ ５９：５１６０−８
【非特許文献１９】Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８ ９５：１３１４１−６
【非特許文献２０】Ｓｉｍｏｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７ ５７：１５３７−４６
【非特許文献２１】Ｊａｆｆｅｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００１ １９：１４５−５６
【非特許文献２２】Ｓａｌｇｉａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：６２４−３０
【非特許文献２３】Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：３３４３−５０
【非特許文献２４】Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００４年２月１８日、９６（４）：３２６−３１
【非特許文献２５】ＢｏｒｅｌｌｏおよびＰａｒｄｏｌｌ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３（２）：１８５−９３，２００２；
【非特許文献２６】Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（３）２９７−３０６，２００４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞を含む、被検体における前立腺癌を処置するための組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞を、前立腺癌の処置のために被検体に投与することによって、被検体における前立腺癌を処置する方法を含む。
【０００９】
この方法は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を産生するために第１の腫瘍細胞集団を遺伝子改変（形質導入）し、この第１の腫瘍細胞集団を単独かまたは第２の腫瘍細胞集団と組み合わせて被検体に投与することによって実行される。遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞の投与後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤ抗原に対する免疫応答が検出されるが、この免疫応答は、サイトカイン発現細胞を投与する前には検出されない。約２７８ｋＤ抗原は、β−フィラミンと同定された。
【００１０】
腫瘍細胞は、同じ個体由来の（自己の）腫瘍細胞であっても、異なる個体由来の（同種異系の）腫瘍細胞であっても、バイスタンダー細胞であってもよく、典型的には投与前に増殖不能にされる。典型的には、腫瘍細胞は、処置される腫瘍または癌と同じ型のものである。例えば、遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞は、前立腺細胞または前立腺癌細胞（例えば、ＰＣ−３細胞またはＬＮＣａＰ細胞）であり、被検体は、前立腺癌を有する。免疫応答は、体液性免疫応答であっても、細胞性免疫応答であってもよい。
【００１１】
サイトカイン発現細胞を前立腺癌患者に投与後に、患者に対する治療結果の改善が明らかであることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の上記および他の目的、その種々の特徴、ならびに本発明自体は、以下の説明が添付の図面と共に読まれると、より完全に理解され得る。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施では、他に指示がない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来技術を利用し、これらは、当該分野の範囲内である。
【００１４】
【化１】
（定義）
他に指示がない限り、本明細書中で使用されるすべての用語は、当業者が意図する意味と同じ意味を有する。
【００１５】
本明細書中に記載のすべての特許、特許出願、刊行物（公表された特許出願を含む）、およびデータベース登録番号を含む、刊行物および他の材料は、本発明の背景を明らかにするために、特に、実施についてさらなる詳細を提供する場合に、本明細書中で使用される。
【００１６】
本発明を記載するにあたり、以下の用語が使用され、これらの用語は下記のように定義されることが意図される。
【００１７】
用語「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそれらの重合体（「ポリヌクレオチド」）のことをいう。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドに類似した様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。他に指示がない限り、特定の核酸分子／ポリヌクレオチドはまた、保存的に改変されたそれらの改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列を、明示的に示された配列と同様に、暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。ヌクレオチドは、その塩基によって以下の標準的な略称に従って示される：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびグアニン（Ｇ）。
【００１８】
用語「コード配列」および「コード領域」とは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡなどのようなＲＮＡに転写される核酸配列をいう。１つの実施形態において、このＲＮＡは、次いで細胞内で翻訳されてタンパク質を産生する。
【００１９】
用語「ＯＲＦ」は、オープンリーディングフレームを意味する。
【００２０】
用語「遺伝子」とは、ゲノム内に位置し、かつ、上記コード配列に加えて、発現（すなわち、コード部分の転写および翻訳）の制御を担う他の（主に調節）核酸配列を含む、規定領域をいう。遺伝子はまた、他の５’および３’非翻訳配列および終止配列も含み得る。遺伝子の供給源に依存して、存在し得るさらなるエレメントは、例えばイントロンである。
【００２１】
用語「異種の」および「外来の」とは、プロモーターおよび遺伝子コード配列などのような核酸分子に関連して本明細書中で使用される場合、特定のベクターまたは宿主細胞にとって外来の供給源に由来する配列か、あるいは、同一の供給源に由来する場合には、その元の形態から改変された配列をいう。従って、ウイルスまたは細胞の異種遺伝子は、特定のウイルスまたは細胞にとって内因性であるが、例えばコドン最適化によって改変された遺伝子を含む。用語「異種の」および「外来の」はまた、天然に存在する核酸配列の天然に存在しない複数のコピーに関しても用いられ得る。従って、これらの用語は、ウイルスまたは細胞にとって外来または異種の核酸セグメント、あるいは、ウイルスまたは細胞にとって同種であるが、宿主ウイルスまたは細胞ゲノム内で通常見出されるのとは異なる位置に存在する核酸フラグメントをいう。
【００２２】
用語「同種の」とは、核酸分子に関連して本明細書中で使用される場合、宿主ウイルスまたは細胞に天然に関連する核酸配列をいう。
【００２３】
用語「相補体」および「相補的」とは、逆平行ヌクレオチド配列中の相補的な塩基残基間の水素結合形成の際に互いに対形成可能な逆平行ヌクレオチド配列を含む、２つのヌクレオチド配列をいう。
【００２４】
用語「ネイティブの」とは、野生型のウイルスまたは細胞のゲノムに存在する遺伝子またはタンパク質をいう。
【００２５】
用語「天然に存在する」または「野生型の」は、人によって人工的に作製されたものを除外して、天然に見出され得る対象物を記述するために使用される。例えば、生物体（ウイルスを含む）に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列であって、天然の供給源から単離され得、かつ、実験室で人によって意図的に改変されていないものは、天然に存在する。
【００２６】
用語「組換えの」とは、核酸分子に関連して本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡ技術を用いて子孫核酸分子に連結される核酸分子の組合せをいう。ウイルス、細胞、および生物体に関連して本明細書中で使用される場合、用語「組換えの」、「形質転換された」、および「トランスジェニック」とは、異種核酸分子が導入された宿主ウイルス、細胞、または生物体をいう。核酸分子は、宿主のゲノム中に安定的に組み込まれてもよく、核酸分子はまた、染色体外分子として存在してもよい。このような染色体外分子は、自己複製することができる。組換えウイルス、細胞、および生物体は、形質転換プロセスの最終産物のみならず、その組換え後代をも包含すると理解される。「非形質転換」、「非トランスジェニック」、または「非組換え」宿主とは、異種核酸分子を含まない野生型のウイルス、細胞、または生物体をいう。
【００２７】
「調節エレメント」は、ヌクレオチド配列の発現の制御に関与する配列である。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、および終止コドンを含む。調節エレメントはまた、典型的にはヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も包含する。
【００２８】
用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を含み、ＤＮＡの転写を開始させる、コード領域の上流に通常位置する非翻訳ＤＮＡ配列をいう。プロモーター領域はまた、遺伝子発現の調節因子として作用する他のエレメントを含んでもよい。用語「最小プロモーター」とは、プロモーターエレメント（特に、不活性であるか、または上流の活性化エレメントの非存在下でプロモーター活性が大幅に低下している、ＴＡＴＡエレメント）をいう。
【００２９】
本発明の意味の範囲内での用語「エンハンサー」は、任意の遺伝因子（例えば、コード配列に作動可能に連結された場合に、プロモーター自体によって達成される転写活性化よりも高い程度まで、プロモーターに作動可能に連結されたコード配列の転写を増加させる（すなわち、プロモーターからの転写を増加させる）ヌクレオチド配列）であってもよい。
【００３０】
用語「発現」とは、細胞内における内因性遺伝子、導入遺伝子またはコード領域の転写および／または翻訳をいう。アンチセンス構築物の場合、発現とは、アンチセンスＤＮＡのみの転写のことをいってもよい。
【００３１】
用語「アップレギュレートされた」とは、本明細書中で使用される場合、標的細胞において、別の細胞と比較して、特定の遺伝子のＲＮＡがより多量に検出され得ることを意味する。例えば、腫瘍細胞が、非腫瘍細胞と比較してより多くのテロメラーゼＲＮＡを産生する場合、腫瘍細胞は、テロメラーゼの発現をアップレギュレートしている。発現は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）中の特定のＲＮＡの量が、別の細胞（非腫瘍細胞）中におけるよりも少なくとも３倍大きい場合、アップレギュレートされたとみなされる。別の実施形態において、特定のＲＮＡの量は、少なくとも５倍大きい。別の実施形態において、特定のＲＮＡの量は、当業者によって慣用的に使用される技術（例えば、ノーザンブロット法）を用いて、少なくとも１０倍大きい。
【００３２】
用語「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「ポリヌクレオチドベクター構築物」、「核酸ベクター構築物」、および「ベクター構築物」は、本明細書中で交換可能に使用され、当業者によって理解されるように、遺伝子導入のための任意の核酸構築物を意味する。本発明において利用されるベクターは、必要に応じて選択マーカーをコードし得る。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「ウイルスベクター」は、当該分野で認められている意味に従って使用される。ウイルスベクターは、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子中にパッケージングされ得る、核酸ベクター構築物をいう。ウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかでＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸を細胞内に運搬する目的で利用され得る。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、ＨＳＶ）、バキュロウイルスベクター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクター、パピローマウイルスベクター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）ベクター、シンドビスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なウイルスベクターは、米国特許第６，０５７，１５５号、同第５，５４３，３２８号および同第５，７５６，０８６号（本明細書中に参考として明示的に援用される）に記載される。
【００３４】
用語「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ベクター粒子」、「ウイルスベクター粒子」、および「ビリオン」は、交換可能に用いられ、例えば、本発明のウイルスベクターが、感染性粒子の産生のために、適切な細胞または細胞株へ形質導入される場合に形成される、感染性ウイルス粒子を意味するものとして広く理解されるべきである。本発明に従うウイルス粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかでＤＮＡを細胞内に運搬する目的で利用され得る。
【００３５】
核酸配列が、別の核酸配列と機能的な関係で配置されている場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列とＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列の２つの配列が作動可能に連結される場合、あるいは、プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列または構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を及ぼすように位置する場合、該プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列は、該ＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に「作動可能に連結された」といわれる。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、典型的には近接しているが、必ずしもそうであるとは限らない。
【００３６】
「選択マーカー」は、細胞内における発現が、その細胞に選択的優位性を与えるタンパク質である。選択マーカー遺伝子で形質転換された細胞が有する選択的優位性は、非形質転換細胞と比較して、ネガティブ選択薬剤（例えば、抗生物質）の存在下で成長する能力に起因し得る。この形質転換された細胞が有する選択的優位性はまた、非形質転換細胞の成長と比較して、栄養分、成長因子またはエネルギー源として添加された化合物を利用する、増強された能力かまたは新規の能力に起因してもよい。選択マーカータンパク質としては、形質導入細胞の検出を可能にし、かつ、非形質転換細胞からの形質導入細胞の分離をできる限り可能にするものが挙げられる。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、選択マーカーとして用いられ得る。１つの実施形態において、細胞は、β−フィラミンまたはその免疫原性フラグメントとＧＦＰタンパク質の両方をコードするベクターで形質導入される。これらのＧＦＰを発現する形質導入細胞は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて分離される。選択マーカータンパク質により、形質導入細胞は、非形質導入細胞から大部分分離されることが可能になる。選択技術および分離技術が通常１００％ではないこと、ならびに、わずかな比率の非選択細胞集団が本発明では許容されることは、当業者であれば理解する。
【００３７】
用語「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特定のヌクレオチド配列に関連して本明細書中で使用される場合、特定の配列が、５’末端または３’末端のいずれかあるいはその両方にさらなる残基を有し得ることを意味し、このさらなる残基は、記載された配列の基本特性および新規特性に実質的に影響しない。
【００３８】
用語「形質導入」とは、物理的手段によって細胞内に外来性核酸を導入することを意味する。例えば、形質導入には、本発明のウイルス粒子を用いて細胞内に外来性核酸を導入することが含まれる。哺乳動物細胞を操作するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：５２７−５３７（１９９０）を参照のこと。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「パッケージング細胞」は、ウイルスゲノムまたはウイルス粒子を産生するために改変されたゲノムをパッケージ可能な細胞である。これにより、欠失した遺伝子産物またはその等価物を提供し得る。従って、パッケージング細胞は、ウイルスゲノムにおいて欠失している遺伝子を補完する機能を提供し得、ウイルス粒子中にウイルスゲノムをパッケージ可能である。このような粒子の産生は、ゲノムが複製され、かつ、感染性ウイルスを構築するのに必要なタンパク質が産生されることを必要とする。これらの粒子はまた、ウイルス粒子の成熟に必要な特定のタンパク質も必要とし得る。このようなタンパク質は、ベクターによるかまたはパッケージング細胞によって提供され得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「レトロウイルストランスファーベクター」とは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ、ベクターのパッケージングに必要なヌクレオチド配列をさらに含む発現ベクターをいう。好ましくは、レトロウイルストランスファーベクターはまた、細胞内で導入遺伝子を発現するのに必要な配列も含む。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「第２世代」レンチウイルスベクターシステムとは、機能的なアクセサリー遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージングシステム（例えば、アクセサリー遺伝子のｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠損しているかまたは不活性化されたもの）をいう。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１−８７５を参照のこと。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「第３世代」レンチウイルスベクターシステムとは、第２世代ベクターシステムの特性を有し、さらに機能的なｔａｔ遺伝子も欠く、レンチウイルスパッケージングシステム（例えば、ｔａｔ遺伝子が欠損しているかまたは不活性化されたもの）をいう。典型的には、ｒｅｖをコードする遺伝子は、別個の発現構築物上で提供される。例えば、Ｄｕｌｌら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−８４７１を参照のこと。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「シュードタイプ（偽型の）」とは、ネイティブのエンベロープタンパク質を、異種のエンベロープタンパク質かまたは機能的に改変されたエンベロープタンパク質と置き換えたものをいう。
【００４４】
用語「曝露すること」とは、本明細書中で使用される場合、導入遺伝子をコードするベクターを標的細胞と接触させて運び込むことを意味する。このような「曝露すること」は、インビトロでも、エキソビボでも、またはインビボで行われてもよい。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「安定的に形質転換された」、「安定的にトランスフェクトされた」および「トランスジェニック」とは、非ネイティブの（異種の）核酸配列がゲノムに組み込まれた細胞をいう。安定な形質転換は、トランスフェクトするＤＮＡを含む娘細胞集団から構成される細胞株またはクローンの確立によって実証される。ある場合には、「形質転換」は安定ではない（すなわち、一過性である）。一過性の形質転換の場合には、外来ＤＮＡまたは異種ＤＮＡが発現されるが、導入された配列はゲノムへ組み込まれない。
【００４６】
本明細書中において、用語「サイトカイン」または文法的に等価なものは、リンホカイン、モノカインなどを含む免疫系の細胞のホルモンの一般的分類を意味する。この定義は、限定されないが、局所的に作用し、かつ血中を循環しないホルモンを包含し、このホルモンが本発明に従って使用される場合、個体の免疫応答の変更をもたらす。用語「サイトカイン（単数）」または「サイトカイン（複数）」とは、本明細書中で使用される場合、免疫系の細胞に影響を及ぼす生物学的分子の一般的分類をいう。この定義は、局所的に作用するか血中を循環し得る生物学的分子を包含することを意味するが、これらに限定されず、この生物学的分子が本発明の組成物または方法で使用される場合、癌に対する個体の免疫応答を調節または変調する役割を果たす。本発明の実施に用いられる例示的なサイトカインとしては、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−２９、特に、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＭＩＰ３ａ、ＩＣＡＭ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション実験に関連して、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメータ下では異なる。配列が長いほど、高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列に対する熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜２０℃（好ましくは５℃）低くなるように選択される。典型的には、高度にストリンジェントな条件下では、プローブはその標的サブ配列にハイブリダイズするが、他の無関係の配列にはハイブリダイズしない。
【００４８】
Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍに等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットのフィルター上での１００を超える相補的残基を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミドで４２℃にてハイブリダイゼーションを一晩行う条件である。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１５Ｍ ＮａＣｌで７２℃にて約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃にて１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（下記）を参照のこと）。高ストリンジェンシー洗浄は、しばしば、バックグラウンドのプローブシグナルを除去するために、低ストリンジェンシー洗浄の後に行われる。例えば１００ヌクレオチドを超える二重鎖のための例示的な中程度のストリンジェンシー洗浄は、１×ＳＳＣで４５℃にて１５分間である。例えば１００ヌクレオチドを超える二重鎖のための例示的な低ストリンジェンシー洗浄は、４〜６×ＳＳＣで４０℃にて１５分間である。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）についてのストリンジェントな条件は、典型的には、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａイオン未満であり、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０〜８．３）であり、そして温度が、典型的には少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、無関係なプローブに見られるシグナル／ノイズ比に比べて２倍（または、より高い）シグナル／ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００４９】
２以上の核酸配列またはタンパク質配列に関連して、用語「同一」または「同一性」パーセントとは、本明細書中に記載される配列比較アルゴリズムの１つを用いるかまたは目視検査によって測定されるように、最大に一致するように比較および整列された場合に、同一であるか、あるいは同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合（パーセント）で有する、２以上の配列またはサブ配列をいう。
【００５０】
配列比較について、典型的には、１つの配列は試験配列が比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合は、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要であればサブ配列座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定のプログラムパラメータに基づき、参照配列と比較して試験配列（単数または複数）の配列同一性パーセントを算出する。
【００５１】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、局所ホモロジーアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））によって、ホモロジーアラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））によって、類似性検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８））によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手可能なソフトウェアを用いる、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭｏＩ Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））によって、あるいは、目視検査（概して、Ａｕｓｕｂｅｌら（下記）を参照のこと）によって、行われ得る。本発明の目的のために、比較のための配列の最適なアラインメントは、最も好ましくは、局所ホモロジーアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））によって行われる。
【００５２】
「正常な細胞状態」または「正常な生理的状態」は、正常な生理的条件で存在し、非分裂性かまたは調節された様式で分裂する細胞（すなわち、正常な生理的状態の細胞）の状態である。「異常な細胞状態」は、非分裂状態／調節された分裂状態で、かつ正常な生理的条件下の、同じ型の細胞に関して定義される。要するに、「異常な細胞状態」を有する細胞は、無秩序な細胞分裂を示すということである。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「癌」、「癌細胞」、「新生細胞」、「新生物形成」、「腫瘍」、および「腫瘍細胞」（交換可能に使用される）とは、相対的に自律的増殖を示し、その結果、細胞増殖の著しい制御不能を特徴とする、異常増殖の表現型または異常な細胞状態を示す細胞をいう。腫瘍細胞は、過形成細胞であっても、インビトロまたはインビボでの増殖の接触阻止の欠如を示す細胞であっても、インビボで転移できない細胞であっても、あるいはインビボで転移できる細胞であってもよい。新生細胞は、悪性であっても良性であってもよい。要するに、癌細胞は、異常な細胞状態を有するとみなされる、ということである。「腫瘍細胞」は、原発腫瘍由来であっても、腫瘍転移由来であってもよい。この「腫瘍細胞」は、患者から最近単離されたものであっても（「原発腫瘍細胞」）、長期のインビトロ培養の産物であってもよい。
【００５４】
用語「原発腫瘍細胞」は、当該分野における意味に従って使用される。原発腫瘍細胞は、哺乳動物の腫瘍から単離され、インビトロで広く培養されていない癌細胞である。
【００５５】
用語「腫瘍細胞由来の抗原」および「腫瘍抗原」および「腫瘍細胞抗原」は、本明細書中で交換可能に使用され得、免疫応答を惹起することができる、腫瘍細胞に由来するかまたは腫瘍細胞によって発現される任意のタンパク質、ペプチド、炭水化物または他の成分をいう。この定義は、全腫瘍細胞、腫瘍細胞フラグメント、腫瘍細胞から採取された原形質膜、腫瘍細胞の細胞表面または細胞膜から精製されたタンパク質、腫瘍細胞の細胞表面に付随する特有の炭水化物成分あるいは細胞内のベクターから発現される腫瘍抗原を包含することを意味するが、これらに限定されない。この定義はまた、アクセスするには細胞の特別な処理を必要とする、細胞の表面由来の抗原も包含する。
【００５６】
用語「遺伝子改変された腫瘍細胞」とは、本明細書中で使用される場合、導入遺伝子を発現させるために遺伝子改変され、癌処置レジメンの一部として患者に投与される、細胞の集団を含む組成物をいう。遺伝子改変された腫瘍細胞ワクチンは、処置を受ける患者にとって「自己の」または「同種異系の」腫瘍細胞、あるいは患者から採取された腫瘍細胞と混合された「バイスタンダー細胞」を含む。ＧＭ−ＣＳＦを発現する遺伝子改変腫瘍細胞ワクチンは、本明細書中で「ＧＶＡＸ」（登録商標）と呼ばれ得る。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように遺伝子改変され、続いて癌の処置のために患者に再投与された、自己の癌細胞および同種異系の癌細胞は、米国特許第５，６３７，４８３号、同第５，９０４，９２０号、同第６，２７７，３６８号および同第６，３５０，４４５号に記載される。膵癌の処置のためのＧＭ−ＣＳＦを発現する遺伝子改変癌細胞の１つの形態、すなわち「サイトカイン発現細胞ワクチン」は、米国特許第６，０３３，６７４号および同第５，９８５，２９０号（これらはいずれも本明細書中に参考として明示的に援用される）に記載される。一般的な免疫調節性のサイトカインを発現するバイスタンダー細胞株は、米国特許第６，４６４，９７３号（本明細書中に参考として明示的に援用される）に記載される。
【００５７】
用語「発現の増強」とは、本明細書中で使用される場合、天然に存在する細胞またはその細胞が由来する親細胞によって産生されるよりも高いレベルの特定のタンパク質を産生する細胞をいう。細胞は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）または抗原（この抗原に対する免疫応答が、サイトカイン発現細胞ワクチン（例えば、ＧＶＡＸ（登録商標））の投与後に増強される）の発現を増大させるために、遺伝子改変されてもよい。内因性抗原の発現は、抗原の産生を増大させるために、ゲノム配列のプロモーター領域を遺伝子改変するか、または細胞のシグナル伝達経路を遺伝子操作するなどの当該分野で公知の任意の方法を用いて増大され得る。また、細胞は、抗原またはその免疫原性フラグメントをコードするベクターで形質導入されてもよい。
【００５８】
本明細書中において、用語「全身性の免疫応答」または文法的に等価なものは、局所的ではなく個体全体として影響を及ぼすことにより、同じ刺激に対する特定のその後の応答を可能にする免疫応答を意味する。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「増殖不能の」または「不活化された」とは、複数回の有糸分裂を行うことはできないが、サイトカインまたは腫瘍抗原のようなタンパク質を発現する能力を依然として保持している細胞をいう。これは、当業者に公知の多数の方法によって実現され得る。本発明の実施形態は、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または実質的に１００％の細胞がさらに増殖するのを阻害する処理を含むが、これに限定されない。１つの実施形態において、これらの細胞は、哺乳動物に投与される前に、約５０〜約２００ラド／分または約１２０〜約１４０ラド／分の線量で照射される。典型的には、照射を用いる場合、必要とされるレベルは、２，５００ラド、５，０００ラド、１０，０００ラド、１５，０００ラドまたは２０，０００ラドである。本発明のいくつかの実施形態において、これらの細胞は、照射２日後、生細胞数について標準化した場合に照射前のレベルの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％または少なくとも約１００％の率で、β−フィラミンまたはその免疫原性フラグメントを産生する。本発明の１つの実施形態において、細胞は、被験体への投与前に照射によって増殖不能にされる。
【００６０】
用語「個体」、「被験体」またはその文法的に等価なものは、任意の１個体の哺乳動物を意味する。
【００６１】
本明細書中において、用語「定着腫瘍の逆転」または文法的に等価なものは、先在する腫瘍の抑制、退縮、または部分的もしくは完全な消失を意味する。この定義は、先在する腫瘍のサイズ、勢力または成長速度の任意の減少を含むことを意味する。
【００６２】
用語「処置」、「治療用途」、または「医薬用途」は、本明細書中で使用される場合、どのような方法であれ、疾患状態または症状を改善するか、あるいは、疾患または他の望ましくない症状の進行を阻止するか、妨害するか、遅らせるか、または逆転させる、特許請求される組成物のありとあらゆる用途をいうものとする。
【００６３】
用語「投与された」とは、哺乳動物に本発明の細胞（例えば、癌ワクチン）を導入する任意の方法をいう。これには、皮内、非経口、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、静脈内（留置カテーテルによる方法を含む）、腫瘍内、輸入リンパ管による方法、または患者の状態を考慮して適切な別の経路による方法が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、被験体の任意の部位に投与されてもよい。例えば、本発明の組成物は、原発腫瘍に対して「遠位の」部位に、または原発腫瘍から「離れた」部位に送達され得る。
【００６４】
用語「免疫応答の増加」とは、本明細書中で使用される場合、特定の免疫活性化の検出可能な増加（例えば、Ｂ細胞および／またはＴ細胞応答の増加）が検出可能であることを意味する。免疫応答の増加の例は、本発明のサイトカイン発現細胞ワクチンの投与前には検出されないか、またはより低いレベルで検出される抗原に結合する抗体の量の増加である。別の例は、細胞性免疫応答の増加である。細胞性免疫応答にはＴ細胞が関与し、インビトロ（例えば、クロム遊離法によって測定される）またはインビボで観察され得る。免疫応答の増加は、典型的には、特定の免疫細胞集団の増加を伴う。
【００６５】
用語「腫瘍の成長を遅延させること」とは、腫瘍の成長速度の緩徐化、腫瘍サイズまたは腫瘍細胞数の増加の阻害、あるいは腫瘍細胞数、腫瘍サイズ、または腫瘍の数の減少を意味する。
【００６６】
用語「腫瘍成長を阻害すること」とは、腫瘍重量、腫瘍体積、腫瘍細胞の量または腫瘍の成長速度の任意の測定可能な減少をいう。腫瘍重量の測定可能な減少は、当業者に公知の多数の方法によって検出され得る。これらの方法としては、接近可能な腫瘍の直接測定、腫瘍細胞（例えば、血液中に存在する）の計数、腫瘍抗原（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ））の測定、および種々の視覚化技術（例えば、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャンおよびＸ線）が挙げられる。腫瘍成長速度の減少は、典型的には、癌を有する哺乳動物のより長い生存時間と相関する。
【００６７】
本明細書中において、用語「治療有効量」または文法的に等価なものは、刺激または抑制のいずれかによって個体の免疫応答を変調するのに十分な、薬剤（例えば、本発明のサイトカイン発現細胞ワクチン）の量をいう。この量は、異なる個体、異なる腫瘍型、および異なる調製物について、異なってもよい。「治療有効量」は、「治療結果の改善」がもたらされるように、当業者によって慣例的に用いられる手順を用いて決定される。
【００６８】
癌に関連して本明細書中で使用される場合、用語「治療結果の改善」および「治療効力の改善」とは、癌細胞または充実性腫瘍の成長の緩徐化または減少、あるいは癌細胞の総数または全身腫瘍組織量の減少をいう。従って、「治療結果の改善」または「治療効力の改善」は、平均余命の増加または生活の質の改善（本明細書中にさらに記載されるように）を含む、任意の臨床的に許容可能な基準に従う患者の状態の改善があることを意味する。
【００６９】
本明細書中において、用語「不活性化された細胞」および「増殖不能の細胞」または文法的に等価なものは、増殖不能にする処理によって不活性化された細胞を意味する。この処理により、複数回の有糸分裂を行うことができないが、サイトカインおよび／または腫瘍抗原のようなタンパク質を発現する能力を依然として保持している細胞を得る。これは、当業者に公知の多数の方法によって実現され得る。「照射を受けた細胞」は、このような不活性化された細胞の一例である。このような照射を受けた細胞は、増殖不能にするのに十分な照射に曝露されている。
【００７０】
（本発明の細胞ワクチン組成物）
本発明は、癌の治療的処置の一部として、遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞を被験体に投与することにより、被検体における前立腺癌を処置する方法に関する。この方法は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を産生するために第１の腫瘍細胞集団を遺伝子改変（形質導入）し、この第１の腫瘍細胞集団を単独でまたは第２の腫瘍細胞集団と組み合わせて被検体に投与することによって実行され、その結果、投与後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤ抗原に対する免疫応答が検出されるが、この免疫応答は、サイトカイン発現細胞を投与する前には検出されない。腫瘍細胞は、同じ個体由来の（自己の）腫瘍細胞であっても、異なる個体由来の（同種異系の）腫瘍細胞であっても、バイスタンダー細胞（以下にさらに記載される）であってもよい。典型的には、腫瘍細胞は、処置される腫瘍または癌と同じ型の腫瘍細胞株に由来する。例えば、改変された細胞は、前立腺または前立腺癌細胞であり、患者は、前立腺癌を有する。約２７８ｋＤ抗原は、β−フィラミンであると同定された。
【００７１】
本発明の１つの局面において、免疫応答は、体液性免疫応答である。典型的には、遺伝子改変された腫瘍細胞は、投与前に増殖不能にされる。１つの実施形態において、哺乳動物は、遺伝子改変されたサイトカイン発現腫瘍細胞と同じ型の前立腺腫瘍細胞を有するヒトである。好ましい実施形態において、治療結果の改善は、被験体への遺伝子改変されたサイトカイン発現腫瘍細胞の投与後に明らかである。当業者に公知の、前立腺癌患者に対する治療結果の改善の種々のパラメータのいずれかが、遺伝子改変されたサイトカイン発現腫瘍細胞療法の効力（例えば、血中ＰＳＡ濃度の減少）を評価するのに用いられ得る。
【００７２】
なお別の局面において、本発明は、増殖不能の遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞の治療有効量を被験体に投与することによって、前立腺癌患者における全身性の免疫応答を刺激する方法を提供する。腫瘍に対する全身性の免疫応答は、腫瘍退縮をもたらすか、または腫瘍の成長を阻害し得る。
【００７３】
本発明の１つの好ましい実施形態において、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを利用して、エキソビボでヒトＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子（コード配列）をヒト腫瘍細胞に送達する。形質導入後、これらの細胞を照射して、増殖不能にする。次いで、この増殖不能のＧＭ−ＣＳＦ発現腫瘍細胞は、患者に再投与され（例えば、皮内または皮下経路によって）、それによって、癌ワクチンとして機能する。ヒト腫瘍細胞は、原発腫瘍細胞であっても、腫瘍細胞株由来であってもよい。
【００７４】
一般に、本発明の実施に用いられる遺伝子改変された腫瘍細胞としては、１種以上の自己腫瘍細胞、同種異系腫瘍細胞および腫瘍細胞株（すなわち、バイスタンダー細胞）が挙げられる。これらの腫瘍細胞は、インビトロで、エキソビボで、またはインビボで形質導入され得る。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように遺伝子改変され、続いて癌の処置のために患者に再投与された、自己癌細胞および同種異系癌細胞は、米国特許第５，６３７，４８３号、同第５，９０４，９２０号および同第６，３５０，４４５号に記載される。膵癌の処置のための、ＧＭ−ＣＳＦを発現する遺伝子改変癌細胞の１つの形態、すなわち「サイトカイン発現細胞ワクチン」（「ＧＶＡＸ」（登録商標））は、米国特許第６，０３３，６７４号および同第５，９８５，２９０号に記載される。一般的な免疫調節性の遺伝子改変されたバイスタンダー細胞株は、米国特許第６，４６４，９７３号に記載される。
【００７５】
細胞ワクチンがＤＵ１４５、ＰＣ−３、およびＬＮＣａＰからなる群より選択される１種以上の前立腺腫瘍細胞株を含む、ＧＶＡＸ（登録商標）の同種異系の形態は、ＷＯ／００２６６７６に記載される。ＬＮＣａＰは、ＰＳＡを産生する前立腺腫瘍細胞株であり、一方、ＰＣ−３およびＤＵ−１４５は、ＰＳＡを産生しない前立腺腫瘍細胞株である（Ｐａｎｇ Ｓ．ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９５年１１月；６（ｌｌ）：１４１７−１４２６）。
【００７６】
ＧＭ−ＣＳＦ発現細胞ワクチン（ＧＶＡＸ（登録商標））を用いた臨床試験は、前立腺癌、黒色腫、肺癌、膵癌、腎癌、および多発性骨髄腫の処置のために行われてきた。とりわけ黒色腫、ならびに前立腺癌、腎癌および膵癌において、ＧＶＡＸ（登録商標）細胞ワクチンを用いた多くの臨床試験が記載されてきた（Ｓｉｍｏｎｓ ＪＷら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；５９：５１６０−５１６８；Ｓｉｍｏｎｓ ＪＷら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７；５７：１５３７−１５４６；Ｓｏｉｆｆｅｒ Ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８；９５：１３１４１−１３１４６；Ｊａｆｆｅｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００１；１９：１４５−１５６；Ｓａｌｇｉａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：６２４−３０；Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：３３４３−５０；Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，２００４年２月１８日，９６（４）：３２６−３１）。
【００７７】
例として、１つのアプローチにおいて、遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦ発現腫瘍細胞が同種異系またはバイスタンダー細胞株として提供され、そして１つ以上のさらなる癌治療薬が処置レジメンに含まれる。別のアプローチにおいて、１つ以上のさらなる導入遺伝子が同種異系またはバイスタンダー細胞株によって発現され、一方、サイトカイン（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ）が自己細胞または同種異系細胞によって発現される。ＧＭ−ＣＳＦコード配列は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターおよび当業者に一般に使用される慣用的な方法を用いて、腫瘍細胞に導入される。ＧＭ−ＣＳＦの好ましいコード配列は、Ｈｕｅｂｎｅｒ Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（４７３１）：１２８２−５（１９８５）に記載されたゲノム配列であるが、いくつかの場合においては、ＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ形態が、本発明を実施するのに役立つことが見出されている（Ｃａｎｔｒｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，６２５０−６２５４，１９８５）。
【００７８】
一般に、遺伝子改変された腫瘍細胞は、投与の前に凍結保存される。好ましくは、遺伝子改変された腫瘍細胞は、患者に投与される前に、約５０〜約２００ラド／分、さらにより好ましくは約１２０〜約１４０ラド／分の線量で照射される。好ましくは、細胞は、細胞のさらなる増殖を実質的に１００％阻害するのに十分な総線量で照射される。従って、細胞は、約１０，０００〜２０，０００ラドの総線量で、最適には、約１５，０００ラドの総線量で照射されるのが望ましい。
【００７９】
サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）産生細胞は、典型的には２回以上、治療過程で被験体に投与される。特定の治療過程に応じて、複数回の注射が単一時点で投与され、この処置が種々の時間間隔で繰り返されてもよい。例えば、初期処置または「初回刺激」処置に続いて、１回以上の「追加免疫」処置を行ってもよい。このような「初回刺激」および「追加免疫」処置は、典型的には、同じ投与経路で、および／またはほぼ同じ部位に投与される。複数回投与で投与される場合、最初の免疫化用量は、引き続く免疫化用量よりも高くてもよい。例えば、５×１０６個の初回刺激用量に続いて、複数回の１０６〜３×１０６個の追加抗原投与量で、ＧＭ−ＣＳＦ産生細胞を投与してもよい。
【００８０】
サイトカイン産生細胞の単回投与は、典型的には、約１０６〜１０８個の間の細胞、例えば、１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、６×１０６個、７×１０６個、８×１０６個、９×１０６個、１０７個、２×１０７個、５×１０７個、さらには１０８個の細胞である。１つの実施形態において、単位用量あたり１０６〜１０８個の間のサイトカイン産生細胞が存在する。サイトカイン産生細胞の数は、所定のサイトカイン産生細胞ワクチンによって産生されるサイトカインのレベルに従って調整され得る。
【００８１】
本発明の実施形態には、１００万個の細胞あたり２４時間で少なくとも５００ｎｇのＧＭ−ＣＳＦを産生することができる用量のサイトカイン産生細胞が含まれるが、これらに限定されない。最適な細胞投与量および割合の決定は、後に実施例の項で記載するように、日常的な決定事項であり、本明細書中に提供される開示を考慮すれば、当業者の技術範囲内である。
【００８２】
本発明の組成物および方法を用いた前立腺癌患者の処置において、主治医は、より低用量のサイトカイン発現腫瘍細胞ワクチンを投与して、患者の応答を観察してもよい。より大用量のサイトカイン発現腫瘍細胞ワクチンを、治療結果の改善が明らかになるまで投与してもよい。
【００８３】
本発明のサイトカイン産生細胞は、細胞を調製するのに用いられるほとんどの追加成分を除去するために処理される。特に、培地中のウシ胎仔血清、ウシ血清成分、または他の生物学的補充物質が除去される。１つの実施形態において、細胞は、例えば穏やかな遠心分離を繰り返すことによって、適切な薬理学的適合性の賦形剤中に洗い込まれる。適合性の賦形剤としては、生理学的適合性の緩衝液、例えばリン酸塩またはＨｅｐｅｓ、および栄養分、例えばデキストロース、生理学的適合性のイオン、またはアミノ酸（特に、他の免疫原性成分を含まないもの）を含むかあるいは含まない、種々の細胞培養培地、等張食塩水が挙げられる。担持試薬、例えばアルブミンおよび血漿画分ならびに非活性増粘剤も用いられ得る。
【００８４】
（自己由来）
自己の遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦ発現細胞の使用は利点を有する。なぜなら、各患者の腫瘍が、別の患者に由来する、組織学的に類似した、ＭＨＣが一致する腫瘍細胞上に見出される腫瘍抗原のセットとは異なり得る、ユニークな腫瘍抗原のセットを発現するためである。例えば、Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，６３８−６４３（１９９２）；Ｄａｒｒｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，３３２９−３３３５（１９８９）；およびＨｏｒｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１０，１５３−１６４（１９９１）を参照のこと。対照的に、ＭＨＣが一致する腫瘍細胞は、遺伝子改変された腫瘍細胞の産生のための患者の腫瘍のサンプルを得るために、患者に外科手術を行う必要がないという利点を有する。
【００８５】
１つの好ましい局面において、本発明は、以下の工程を実施することにより前立腺癌を処置する方法を含む：（ａ）前立腺腫瘍を有する哺乳動物被験体から腫瘍細胞を得る工程；（ｂ）この腫瘍細胞を、未改変の腫瘍細胞と比較して上昇したレベルのＧＭ−ＣＳＦの産生を可能にするために、遺伝子改変する工程；（ｃ）この改変された腫瘍細胞を増殖不能にする工程；および（ｄ）この遺伝子改変された腫瘍細胞を、この腫瘍細胞が得られた元の哺乳動物被験体へ、またはこの腫瘍細胞が得られた元の哺乳動物と同じＭＨＣ型を有する哺乳動物へ、再投与する工程。投与された腫瘍細胞は、自己由来であり、ＭＨＣが宿主と一致する。好ましくは、組成物は、哺乳動物被験体に皮内投与、皮下投与、または腫瘍内投与される。
【００８６】
いくつかの場合において、単一の自己腫瘍細胞は、ＧＭ−ＣＳＦのみを発現しても、またはＧＭ−ＣＳＦに加えて１つ以上のさらなる導入遺伝子を発現してもよい。他の場合において、ＧＭ−ＣＳＦおよび１つ以上のさらなる導入遺伝子は、異なる自己腫瘍細胞によって発現され得る。本発明の１つの局面において、自己腫瘍細胞は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列（その発現に必要なプロモーターおよび発現／制御配列に作動可能に連結されている）を含むベクターの導入によって改変される。別の局面において、この同じ自己腫瘍細胞または別の自己腫瘍細胞は、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をコードする核酸配列（その発現に必要なプロモーターおよび発現／制御配列に作動可能に連結されている）を含むベクターの導入によって改変される。この１つ以上の導入遺伝子をコードする核酸配列は、同じかまたは異なるベクターを用いて、同じかまたは異なる自己腫瘍細胞に導入される。導入遺伝子（単数または複数）をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー配列をさらに含んでも、含まなくてもよい。望ましくは、自己腫瘍細胞は、高レベルのＧＭ−ＣＳＦを発現する。
【００８７】
（同種異系）
Ｊａｆｆｅｅ（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２，８１−９１（１９９５））らによって概説されるように、研究者らは、腫瘍ワクチンとして、自己由来の、ＭＨＣが一致する細胞の代替を探求した。初期の腫瘍ワクチンストラテジーは、ワクチン接種細胞が、そのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子上に腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能して、免疫系のＴ細胞アームを直接活性化するという理解に基づいていた。Ｈｕａｎｇら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４，９６１−９６５，１９９４）の結果は、ワクチン接種細胞よりもむしろ宿主のプロフェッショナルＡＰＣが、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン（単数または複数）を分泌し、その結果、骨髄由来ＡＰＣが腫瘍の部位に補充されることによって、免疫系のＴ細胞アームを初回刺激することを示している。骨髄由来ＡＰＣは、腫瘍の全細胞タンパク質をプロセシングのために取り込み、次いで抗原ペプチド（単数または複数）をＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子上に提示することによって、免疫系のＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞アームを初回刺激し、その結果、全身性の腫瘍特異的な抗腫瘍免疫応答を引き起こす。理論に制約されるわけではないが、これらの結果から、抗癌免疫応答を惹起するために自己細胞またはＭＨＣが一致する細胞を用いることは必須ではないか、または最適ではない場合があること、および同種異系のＭＨＣ遺伝子（同じ種の遺伝的に異なる個体に由来する）の転座が腫瘍免疫原性を増強し得ることが示唆される。より詳細には、ある場合において、同種異系のＭＨＣクラスＩ分子を発現する腫瘍の拒絶により、未改変の親腫瘍でのその後のチャレンジに対する全身性の免疫応答が増強される。例えば、Ｊａｆｆｅｅら（前出）、およびＨｕａｎｇら（前出）を参照のこと。
【００８８】
本明細書中に記載されるように、「腫瘍細胞株」は、初めに腫瘍に由来した細胞を含む。このような細胞は、典型的には形質転換されている（すなわち、培養下で無限の増殖を示す）。１つの好ましい局面において、本発明は、以下の工程を実施することにより前立腺癌を処置する方法を提供する：（ａ）腫瘍細胞株を得る工程；（ｂ）この腫瘍細胞株を遺伝子改変して、これらの細胞がサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を未改変の腫瘍細胞株と比較して上昇したレベルで産生できるようにする工程；（ｃ）この改変された腫瘍細胞株を増殖不能にする工程；および（ｄ）この腫瘍細胞株を、この腫瘍細胞株が得られた元の腫瘍と同じ腫瘍型の少なくとも１つの腫瘍を有する哺乳動物被験体（宿主）に投与する工程。投与された腫瘍細胞株は、宿主と同種異系であり、ＭＨＣが一致しない。このような同種異系細胞株は、予め調製され、特徴づけられ、既知数の導入遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）発現細胞を含むバイアルに分取され、そして保存（すなわち凍結）され得るので、患者への投与のために十分に特徴づけられた細胞が得られるという利点を有する。遺伝子改変された同種異系細胞の産生方法は、例えばＷＯ００／７２６８６に記載される。
【００８９】
遺伝子改変された、ＧＭ−ＣＳＦを発現する同種異系細胞を調製する１つのアプローチにおいて、ＧＭ−ＣＳＦを単独でコードするかまたは１つ以上のさらなる導入遺伝子の核酸コード配列と組み合わせてコードする核酸配列（導入遺伝子）が、同種異系の腫瘍細胞株（すなわち、処置される個体以外の個体由来）である細胞株に導入される。別のアプローチにおいて、ＧＭ−ＣＳＦを単独でコードするかまたは１つ以上のさらなる導入遺伝子の核酸コード配列と組み合わせてコードする核酸配列（導入遺伝子）が、別々の同種異系の腫瘍細胞株に導入される。さらに別のアプローチにおいて、２つ以上の異なる遺伝子改変された同種異系のＧＭ−ＣＳＦ発現細胞株（例えば、ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３）が、組み合わせて（典型的には１：１の比で）投与される。一般に、細胞または細胞の集団は、処置される腫瘍または癌（例えば、前立腺癌）と同じ型の腫瘍細胞株に由来する。導入遺伝子（単数または複数）をコードする核酸配列は、同じかまたは異なるベクターを用いて、同じかまたは異なる同種異系腫瘍細胞に導入されてもよい。導入遺伝子（単数または複数）をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー配列をさらに含んでも、含まなくてもよい。望ましくは、同種異系細胞株は、高レベルのＧＭ−ＣＳＦを発現する。
【００９０】
本発明の別の局面において、１つ以上の、遺伝子改変された、ＧＭ−ＣＳＦを発現する同種異型細胞株は、抗原に対する患者の免疫応答がＧＭ−ＣＳＦ（例えば、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子改変された同種異系細胞またはバイスタンダー細胞）の存在下で増大するように、抗原に曝露される。このような曝露は、エキソビボで行われてもインビボで行われてもよい。１つの好ましい実施形態において、この抗原は、β−フィラミンであると同定された、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤ抗原である。β−フィラミンは、被験体に投与される細胞によって（細胞上に）提供されるか、または患者にネイティブな細胞によって提供され得る。このような場合、組成物は、典型的には照射（本明細書中にさらに記載されるように、これらの同種異型細胞は、組織培養プレート中で平板培養され、Ｃｓ線源を用いて室温で照射される）によって、増殖不能にされる。本発明の同種異系細胞ワクチン組成物は、同種異系細胞に加えて、遺伝子改変されていてもされていなくてもよい他の細胞（すなわち、異なる型の同種異型細胞、自己細胞、またはバイスタンダー細胞）を含み得る。遺伝子改変されている場合、異なる型の同種異型細胞、自己細胞、またはバイスタンダー細胞は、ＧＭ−ＣＳＦまたは別の導入遺伝子を発現し得る。所定の投与における同種異系細胞と他の細胞の比は、その組み合わせに応じて変動する。
【００９１】
同種異型細胞株の組成物を患者へ導入するために、任意の適切な投与経路が用いられ得、好ましくは、この組成物は、皮内に、皮下にまたは腫瘍内に投与される。
【００９２】
本発明の実施における同種異系細胞株の使用は、遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦ発現細胞株を癌患者へ投与することにより、自己癌抗原（ＧＭ−ＣＳＦのパラクリン産生）とともに、腫瘍に対する有効な免疫応答を引き起こすという、治療上の利点をもたらす。これにより、各患者につき自己腫瘍細胞を培養して形質導入する必要性が除去される。
【００９３】
（バイスタンダー）
１つのさらなる局面において、本発明は、少なくとも１つの導入遺伝子を発現する、一般的な免疫調節性の遺伝子改変された導入遺伝子を発現するバイスタンダー細胞を提供する。同じ一般的なバイスタンダー細胞株が、２つ以上の導入遺伝子を発現してもよく、異なる一般的なバイスタンダー細胞株によって、個々の導入遺伝子が発現されてもよい。一般的なバイスタンダー細胞株は、主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）抗原および主要組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）抗原を天然に欠失するか、またはＭＨＣ−Ｉ抗原およびＭＨＣ−ＩＩ抗原を欠失するように改変された細胞を含む。本発明の１つの局面において、一般的なバイスタンダー細胞株は、導入遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン）をコードする核酸配列（その発現に必要なプロモーターおよび発現制御配列に作動可能に連結されている）を含むベクターの導入によって改変される。別の局面において、この同じ一般的なバイスタンダー細胞株または別の一般的なバイスタンダー細胞株は、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をコードする核酸配列（その発現に必要なプロモーターおよび発現制御配列に作動可能に連結されている）を含むベクターの導入によって改変される。この導入遺伝子（単数または複数）をコードする核酸配列は、同じかまたは異なるベクターを用いて、同じかまたは異なる一般的なバイスタンダー細胞株に導入され得る。導入遺伝子（単数または複数）をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー配列をさらに含んでも、含まなくてもよい。抗腫瘍免疫応答を刺激する導入遺伝子（単数または複数）の任意の組み合わせが、本発明の実施に役立つことが見出されている。好ましくは、一般的なバイスタンダー細胞株は、規定培地（すなわち、無血清培地）中で、好ましくは懸濁液として、培養される。
【００９４】
好ましい一般的なバイスタンダー細胞株の一例は、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３；Ｌｏｚｚｉｏら、Ｂｌｏｏｄ ４５（３）：３２１−３３４（１９７５）；Ｋｌｅｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １８：４２１−４３１（１９７６））である。ヒトバイスタンダー細胞株の作製の詳細な記載は、例えば米国特許第６，４６４，９７３号に記載される。
【００９５】
望ましくは、一般的なバイスタンダー細胞株は、高レベルの導入遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン）を発現する。
【００９６】
本発明の実施において、１つ以上の一般的なバイスタンダー細胞株は、例えば自己腫瘍細胞によって提供される、自己癌抗原（一般的なバイスタンダー細胞株組成物を一緒に含む）とともにインキュベートされ、次いで、この一般的なバイスタンダー細胞株組成物が患者に投与される。一般的なバイスタンダー細胞株組成物を患者へ導入するために、任意の適切な投与経路が用いられ得る。好ましくは、この組成物は、皮内に、皮下にまたは腫瘍内に投与される。
【００９７】
典型的には、自己癌抗原は、処置される癌の細胞（すなわち、自己癌細胞）によって提供される。このような場合、組成物は、照射（上に詳述されるように、これらのバイスタンダー細胞および癌細胞は、組織培養プレート中で平板培養され、Ｃｓ線源を用いて室温で照射される）によって、増殖不能にされる。
【００９８】
所定の投与におけるバイスタンダー細胞と自己癌細胞の比は、その組み合わせに応じて変動する。ＧＭ−ＣＳＦを産生するバイスタンダー細胞に関して、所定の投与におけるバイスタンダー細胞と自己癌細胞の比は、治療上有効レベルのＧＭ−ＣＳＦが産生されるような比であるべきである。ＧＭ−ＣＳＦの閾値とは別に、バイスタンダー細胞と自己癌細胞の比は、１：１を超えるべきではない。バイスタンダー細胞と腫瘍細胞または腫瘍抗原との適切な比は、当該分野で公知の慣用的な方法を用いて決定され得る。
【００９９】
本発明の実施におけるバイスタンダー細胞株の使用は、サイトカインを発現するバイスタンダー細胞株および少なくとも１つのさらなる癌治療薬（同じかまたは異なる細胞によって発現される）を癌患者へ投与することにより、自己癌抗原（免疫調節性サイトカインのパラクリン産生）とともに、腫瘍に対する有効な免疫応答を引き起こすという、治療上の利点をもたらす。これにより、各患者につき自己腫瘍細胞を培養して形質導入する必要性が除去される。
【０１００】
最大約３０，０００ラドまでの線量が許容可能であるが、典型的には、最小線量の約３５００ラドが、細胞を不活性化し、かつ増殖不能にするのに十分である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物に投与される前に、約５０〜約２００ラド／分または約１２０〜約１４０ラド／分の線量で照射される。照射を用いる場合、必要なレベルは、典型的には２，５００ラド、５，０００ラド、１０，０００ラド、１５，０００ラドまたは２０，０００ラドである。１つの実施形態において、細胞を不活性化し、かつ増殖不能にするために、約１０，０００ラドの線量が用いられる。照射は、細胞を増殖不能にする１つの方法にすぎず、細胞が複数回の細胞分裂を行うことは不可能になるが、導入遺伝子（例えば、サイトカイン）を発現する能力は保持する他の不活性化方法も、本発明に包含されると理解される（例えば、マイトマイシンＣ、シクロヘキシミド、および概念的に類似する薬剤を用いた処理、または細胞による自殺遺伝子の取り込み）。
【０１０１】
（サイトカイン）
「サイトカイン」または文法的に等価なものは、限定されないが、局所的に作用し、かつ血中を循環しないホルモンを包含し、このホルモンが本発明に従って使用される場合、個体の免疫応答の変更をもたらす。このサイトカインの定義には、個体の免疫応答の変更をもたらす接着分子またはアクセサリー分子も含まれる。従って、サイトカインの例としては、ＩＬ−１（ａまたはＰ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＬＴ、ＴＧＦ−Ｐ、ｙ−ＩＦＮ、ａ−ＩＦＮ、Ｐ−ＩＦＮ、ＴＮＦ−ａ、ＢＣＧＦ、ＣＤ２またはＩＣＡＭが挙げられるが、これらに限定されない。上記のサイトカインおよび他の適用可能な免疫調節薬の説明は、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ａ．Ｓ．Ｈａｍｂｌｉｎ，Ｄ．Ｍａｌｅ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９３））、または「Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｎ．Ａ．Ｎｉｃｏｌａ（編），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９５））に見出され得る。ヒトにおける治療用途が意図される場合、サイトカインは、好ましくはヒト型のタンパク質に実質的に類似しているか、ヒト配列に由来する（すなわち、ヒト起源のサイトカイン）。１つの好ましい実施形態において、導入遺伝子は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）である。
【０１０２】
さらに、ヒト型の所定のサイトカインと実質的な構造上の相同性および／またはアミノ酸配列同一性を有する他の哺乳動物のサイトカインは、ヒト免疫系に対して類似の活性を示すことが証明されている場合に、本発明において有用である。同様に、任意の特定のサイトカインに実質的に類似しているが、タンパク質配列に保存的な変化を有するタンパク質もまた、本発明における用途が見出される。従って、タンパク質配列における保存的置換は、タンパク質分子の機能的能力を妨害することなく行われ得るので、タンパク質は、本発明においてサイトカインとして機能するが、現在既知の配列とはわずかに異なるアミノ酸配列を有するように作製され得る。このような保存的置換としては、典型的には、以下の群内での置換が挙げられる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【０１０３】
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、線維芽細胞、内皮細胞、Ｔ細胞およびマクロファージによって産生されるサイトカインである。このサイトカインは、顆粒球およびマクロファージ系の造血細胞の増殖を誘導することが示されている。さらに、このサイトカインはまた、免疫系の主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である樹状細胞の抗原プロセシングおよび提示機能を活性化する。動物モデル実験の結果は、ＧＭ−ＣＳＦ産生細胞（すなわち、ＧＶＡＸ（登録商標））が親の非形質転換細胞に対する免疫応答を誘導し得ることを、納得のいくように示した。
【０１０４】
ＧＭ−ＣＳＦは、強い抗腫瘍応答を刺激し得る樹状細胞（ＤＣ）のサブクラスの抗原提示能力を増強する（Ｇａｓｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、１９９１年３月１５日；７７（６）：１１３１−４５；Ｍａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００年６月１５日；６０（１２）：３２３９−４６；ＭａｃｈおよびＤｒａｎｏｆｆ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００年１０月；１２（５）：５７１−５に概説）。例えば、ＢｏｏｎおよびＯｌｄ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７年１０月１日；９（５）：６８１−３を参照のこと）。流入領域リンパ節におけるＴ細胞への腫瘍抗原エピトープの提示により、腫瘍転移に対する全身性の免疫応答が生じると予想される。また、照射されたＧＭ−ＣＳＦ発現腫瘍細胞は、腫瘍チャレンジに対する強力なワクチンとして機能することが示された（「ＧＶＡＸ（登録商標）」と題される、下記の節でさらに記載されるように）。遺伝子改変された細胞によって送達された局所的に高濃度の特定のサイトカインは、腫瘍退縮をもたらすことが見出されている（Ａｂｅら、Ｊ．Ｃａｎｅ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２１：５８７−５９２（１９９５）；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：７８２０−７８２５（１９９０）；Ｆｏｒｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ７：２８９−３０９（１９８８）。ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０００７２６８６は、種々のサイトカインを発現する腫瘍細胞を記載する。
【０１０５】
本発明の１つの実施形態において、細胞ワクチンは、ワクチンの細胞内での発現のための調節エレメントに作動可能に連結された、ＧＭ−ＣＳＦコード配列を含む。ＧＭ−ＣＳＦコード配列は、マウスまたはヒトのＧＭ−ＣＳＦをコードし得、ゲノムＤＮＡ（配列番号１）またはｃＤＮＡ（配列番号２）の形態であり得る。ｃＤＮＡの場合、ＧＭ−ＣＳＦのコード配列は、翻訳前にスプライスアウトされるイントロン配列を含まない。対照的に、ゲノムＧＭ−ＣＳＦについては、コード配列は、翻訳前にスプライスアウトされる少なくとも１つのネイティブのＧＭ−ＣＳＦイントロンを含む。１つの実施形態において、ＧＭ−ＣＳＦコード配列は、配列番号３をコードする。ＧＭ−ＣＳＦコード配列の他の例は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３７３８６８、ＡＣ０３４２２８、ＡＣ０３４２１６、Ｍ１０６６３およびＮＭ０００７５８に見出される。
【０１０６】
本発明によるＧＭ−ＣＳＦコード配列は、ストリンジェントな条件下で配列番号１または配列番号２に示される配列にハイブリダイズする、完全長の相補体であってもよい。「にハイブリダイズする」という句は、特定のヌクレオチド配列が複雑な混合物中に存在する（例えば、全細胞の）ＤＮＡまたはＲＮＡである場合、ストリンジェントな条件下でこのヌクレオチド配列に分子が結合するか、二重鎖を形成するか、またはハイブリダイズすることをいう。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸の間の相補的なハイブリダイゼーションをいい、標的核酸配列の所望の検出を達成するために、ハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低下させることにより適応され得る、軽微なミスマッチを包含する。
【０１０７】
従って、本発明によれば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインのコード配列は、ネイティブのＧＭ−ＣＳＦコード配列に対し、その全長にわたって少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性パーセントを有することになる。例えば、本発明によるＧＭ−ＣＳＦコード配列は、配列比較アルゴリズムで（上記のように）または目視検査によって測定されるように、最大一致について比較および整列される場合、配列番号１または配列番号２で示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。１つの実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約５０ヌクレオチド長の配列の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約１００ヌクレオチド長の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約２００ヌクレオチド長の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、配列の全長にわたって存在する。
【０１０８】
さらに、本発明によれば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインのアミノ酸配列は、最大一致について比較および整列される場合、配列番号３で示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１０９】
１つの実施形態において、細胞は、前立腺癌に対する免疫応答と関連する抗原（例えば、β−フィラミン）の発現を増強するように操作（遺伝子改変）され、かつ、前立腺癌に対する免疫応答を増強する１つ以上のタンパク質（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン）を発現するようにさらに操作されるか、または前立腺癌に対する免疫応答を増強する１つ以上のタンパク質（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン）を発現するようにさらに操作された異なる細胞と組み合わせて投与される。
【０１１０】
（β−フィラミン）
本発明の１つの実施形態は、β−フィラミンのような抗原に対する免疫応答の増強を引き起こす様式で前立腺癌を処置する方法であり、この免疫応答の増強は、被験体に対する治療結果の改善（例えば、患者の血清中のＰＳＡレベルの低下、癌に関連した痛みの減少、または任意の臨床的に許容可能な基準による患者の状態の改善（転移の減少、平均余命の増加、もしくは生活の質の改善が挙げられるが、これらに限定されない））と関連する。β−フィラミンは、患者のネイティブな細胞によって内因的に発現されてもよく、または被験体（患者）に外因的に提供されてもよい。
【０１１１】
哺乳動物は、３つのフィラミン遺伝子、フィラミン−Ａ、フィラミン−Ｂ（β−フィラミン；フィラミン−３）およびフィラミンＣを有する。ヒトフィラミンは、Ｎ末端のアクチン結合ドメインに続いて２４個の特徴的な繰り返しを含む、２８０ｋＤａのタンパク質である。ヒトフィラミンはまた、多くの他の細胞タンパク質と相互作用する。フィラミンは、通常、他のフィラミンとともに形成された約５６０ｋＤＡのホモダイマーまたはヘテロダイマーとして見出される。β−フィラミンはまた、ＡＢＰ−２７８／２７６としても知られている（Ｘｕら、１９９８、Ｂｌｏｏｄ ９２：１２６８−１２７６）。例えば、Ｔａｋａｆｕｔａら１９９８ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：１７５３１−１７５３８；Ｆｌｉｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５６（２）３６１−３７６，２００２を参照のこと。２６０２アミノ酸のβ−フィラミンタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１４４８で見出され得る。フィラミンＢおよびフィラミン−Ａの発現パターンは、例えば、Ｓｈｅｅｎら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１１（２３）２８４５−２８５４，２００２に記載される。Ｌｅｅｄｍａｎら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９０（１３）：５９９４−８，１９９３）は、後に指定されたβ−フィラミンである、アクチン結合タンパク質に関連するタンパク質のクローニングを記載する。
【０１１２】
本発明に従う１つの実施形態において、前立腺癌に対する免疫応答と関連する抗原（例えば、β−フィラミン）のコード配列は、ストリンジェントな条件下で配列番号４に示した配列にハイブリダイズする全長の相補体を有する。「にハイブリダイズする」という句は、特定のヌクレオチド配列が複雑な混合物（例えば、全細胞）中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡである場合、ストリンジェントな条件下でこのヌクレオチド配列に分子が結合するか、二重鎖を形成するか、またはハイブリダイズすることをいう。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸の間の相補的なハイブリダイゼーションをいい、標的核酸配列の所望の検出を達成するために、ハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低下させることにより適応され得る、軽微なミスマッチを包含する。
【０１１３】
従って、本発明によれば、前立腺癌に対する免疫応答と関連する抗原（例えば、β−フィラミン）のコード配列は、ネイティブのコード配列に対し、その全長にわたって少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性パーセントを有することになる。例えば、本発明によるβ−フィラミンコード配列は、配列比較アルゴリズムで（上記のように）または目視検査によって測定されるように、最大一致について比較および整列される場合、配列番号４で示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。１つの実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約５０ヌクレオチド長の配列の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約１００ヌクレオチド長の配列の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約２００ヌクレオチド長の配列の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、配列の全長にわたって存在する。
【０１１４】
さらに、本発明によれば、前立腺癌に対する免疫応答と関連する抗原（例えば、β−フィラミン）のアミノ酸配列は、最大一致について比較および整列される場合、配列番号５で示されるネイティブのβ−フィラミン配列に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１１５】
本発明の実施において、β−フィラミンに対する免疫応答は、サイトカイン発現細胞ワクチン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ発現腫瘍細胞（すなわちＧＶＡＸ（登録商標））の患者への投与の後に増強される。
【０１１６】
本発明の１つの実施形態において、β−フィラミンを発現する細胞の集団は、細胞ワクチンの一部として患者に投与される。β−フィラミン発現細胞は、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインを発現する細胞と同じであっても、異なっていてもよい。本発明の別の実施形態において、細胞ワクチンは、精製されたβ−フィラミンタンパク質またはその免疫原性フラグメントから構成される。細胞ワクチンは、免疫増強剤（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン、アジュバントなど）をさらに含み得る。本発明の実施において、完全長のβ−フィラミンタンパク質は、抗原として用いられ得る。しかし、β−フィラミンに対する検出された免疫応答は、β−フィラミンのフラグメントへの被験体の曝露後か、または外因的に提供されたβ−フィラミンの非存在下における細胞ワクチン（例えば、ＧＶＡＸ（登録商標））の投与の際にも明らかであることが、当業者には理解される。β−フィラミンフラグメントは、完全長のアミノ酸配列または選択的スプライシングバリアントの線状セグメント、欠失変異体あるいは他の変異体を含み得る。本発明で有用であるために、β−フィラミンフラグメントは、免疫原性フラグメントである（すなわち、免疫応答を惹起し得る）べきである。
【０１１７】
細胞は、当業者に公知の種々の方法によって、β−フィラミン発現について増強され得る。例えば、細胞は、β−フィラミンコード配列に作動可能に連結された、β−フィラミンをコードするベクターで形質導入され得る。適切なプロモーターは、当業者に公知であり、かつ入手可能である。細胞を形質導入するのに有用なベクターは、β−フィラミンの発現の増強をもたらすのに有効な任意のベクターであり得る。１つの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターのようなレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター）である。ベクターはまた、被験体における癌に対する免疫応答を増強するタンパク質（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン）のコード領域を細胞に形質導入するのに用いられ得る。このコード領域とβ−フィラミンコード領域は、１つのベクターに配置されても、別々のベクターに配置されてもよく、かつ、同じ細胞に導入されても、異なる細胞に導入されてもよい。別々のベクターに配置される場合、この別々のベクターは、同じ起源の（例えば、レトロウイルスの）ベクターであっても、異なる起源のベクターであってもよい。１つの実施形態において、細胞は、まずβ−フィラミンをコードするベクターで形質導入され、次いで、ＧＭ−ＣＳＦをコードするベクターで形質導入される。別の実施形態において、細胞は、まず前立腺癌に対する免疫応答を増強する少なくとも１つのタンパク質をコードするベクターで形質導入され、次いで、β−フィラミンをコードするベクターで形質導入される。
【０１１８】
本発明の１つの実施形態において、ベクター内のβ−フィラミンコード配列は、ネイティブ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００１４５７；配列番号４）または「再コード化（ｒｅｃｏｄｅｄ）」配列である。「再コード化」遺伝子とは、核酸によってコードされるポリペプチドがもとの配列のまま変化しないが、ポリペプチドをコードする核酸配列が変化するように改変されるコード配列をいう。遺伝暗号の縮重のため、同じアミノ酸翻訳産物をコードし得る複数のＤＮＡおよびＲＮＡコドンが存在することが、当該分野で周知である。さらに、異なる生物体は、アミノ酸を合成するための特定のコドンの利用について異なる優先度を有することも公知である。従って、本発明の１つの実施形態において、ベクターは、ヒトに好ましいコドンで再コード化されたβ−フィラミンコード配列を含む。１つの実施形態において、β−フィラミンコード配列は、選択的にスプライスされた形態のβ−フィラミンをコードする。選択的にスプライスされた形態のβ−フィラミンは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３５３６６６およびＡＦ３５３６６７ならびにｖａｎ ｄｅｒ Ｆｌｉｅｒらに記載される。
【０１１９】
本発明の別の実施形態は、腫瘍細胞および／またはβ−フィラミンに対する免疫応答を増加させる方法であって、この方法は、本発明の遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞を前立腺癌患者に投与して、患者に治療結果の改善をもたらす工程を包含する。本発明の別の実施形態は、腫瘍細胞および／またはβ−フィラミンに対する免疫応答を増加させる方法であって、この方法は、β−フィラミンの発現の増強を示す遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞を前立腺癌患者に投与し、この投与後に、前立腺癌に対する患者の免疫応答が増加する工程を包含する。本発明のさらに別の実施形態は、腫瘍細胞およびβ−フィラミンに対する免疫応答を増加させる方法であって、この方法は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の発現の増強を示す遺伝子改変された細胞を前立腺癌患者に投与し、投与後に、β−フィラミンに対する哺乳動物の免疫応答が増加する工程を包含する。１つの実施形態において、増加した免疫応答は、体液性である。なお別の実施形態において、増加した免疫応答は、細胞性である。なおさらなる実施形態において、増加した免疫応答は、細胞性および体液性の両方である。本発明の好ましい局面において、遺伝子改変されたサイトカイン産生細胞の投与後に、前立腺癌細胞の増殖が阻害される。
【０１２０】
これらの細胞が、検出可能なレベルのβ−フィラミンを発現するか否か、および／または、β−フィラミンに対する免疫応答が、サイトカイン発現細胞ワクチンの投与後に変化したか否かを決定するアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ＦＡＣＳまたは電気化学発光（ＥＣＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
（癌ワクチンとして使用するための細胞の遺伝子改変）
本発明の方法および組成物は、特定のベクターシステムによって本明細書中に詳細に例示されるが、同じ方法および組成物が、遺伝子送達システムとは無関係に、前立腺癌の処置に有用であることが見出されることを、当業者は容易に理解する。
【０１２２】
本発明は、哺乳動物細胞へのＧＭ−ＣＳＦまたはβ−フィラミンのような導入遺伝子の導入のための任意のベクターの使用を企図する。例示的なベクターとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（その複製可能型、複製欠損型および弱い型（ｇｕｔｌｅｓｓ ｆｏｒｍ）を含む）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターおよび非ウイルス性プラスミドベクターのような、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。１つの好ましいアプローチにおいて、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスは、効率的に細胞に形質導入して、ウイルス自体のＤＮＡを宿主細胞に導入することができる。組換えウイルスベクターを作製する際に、非必須遺伝子は、異種（または非ネイティブの）タンパク質の遺伝子またはコード配列に置換される。
【０１２３】
ウイルスベクターを構築する際に、非必須遺伝子は、１つ以上の治療化合物または因子をコードする１つ以上の遺伝子に置換される。典型的には、ベクターは、複製開始点を含み、かつ、ベクターは、ベクターを同定および選択可能にする「マーカー」または「選択マーカー」機能をさらに含んでも、含まなくてもよい。任意の選択マーカーが使用され得るが、このような発現ベクターで用いる選択マーカーは、一般に当該分野で公知であり、適切な選択マーカーの選択は、宿主細胞に依存する。抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、メトトレキサート、テトラサイクリン、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．，Ｊ ＭｏＩ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．１９８２；１（４）：３２７−４１（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２−７（１９８０））、ピューロマイシン、ゼオマイシン、ハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、ＭｏＩ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５（２）：４１０−３（１９８５））またはＧ４１８が挙げられる。
【０１２４】
アデノウイルス遺伝子治療ベクターは、インビトロでの強力な発現、優れた力価、ならびにインビボでの分裂および非分裂細胞に形質導入する能力を示すことが知られている（Ｈｉｔｔら、Ａｄｖ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ５５：４７９−５０５（２０００））。これらのベクターは、インビボで用いられる場合、ベクター骨格に対して惹起される免疫応答により、強力であるが一過性の遺伝子発現を引き起こす。本発明で用いられる組換えＡｄベクターは、以下を含む：（１）複製欠損Ａｄビリオンへのベクターの組み込みを可能にするパッケージング部位；および（２）治療化合物コード配列。感染性ビリオンへの組み込みに必要であるか、または組み込みに役立つ他のエレメントとしては、５’および３’Ａｄ ＩＴＲ、Ｅ２およびＥ３遺伝子などが挙げられる。
【０１２５】
本発明の組換えＡｄベクターをカプセル化する複製欠損Ａｄビリオンは、Ａｄパッケージング細胞およびパッケージ技術を用いる当該分野で公知の標準技術によって作製される。これらの方法の例は、例えば、米国特許第５，８７２，００５号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。治療化合物をコードする遺伝子は、一般に、アデノウイルスのウイルスゲノムの欠失させたＥ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ３領域に挿入される。本発明の実施に用いられる好ましいアデノウイルスベクターは、１つ以上の野生型Ａｄ遺伝子産物（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）を発現しない。好ましい実施形態は、典型的に、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４および必要に応じてＥ３遺伝子領域の機能を補完するパッケージング細胞株とともに用いられるビリオンである。例えば、米国特許第５，８７２，００５号、同第５，９９４，１０６号、同第６，１３３，０２８号および同第６，１２７，１７５号を参照のこと。アデノウイルスベクターは、当該分野で公知の標準技術を用いて、精製および処方される。組換えＡＡＶベクターは、標的化細胞において選択された遺伝子組換え産物の発現および産生を行わせ得ることを特徴とする。従って、組換えベクターは、キャプシド形成に必須のＡＡＶの配列および標的細胞の感染のための物理的構造の少なくともすべてを含む。
【０１２６】
本発明の実施に用いられる組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンは、当業者に公知の標準的な方法論を用いて作製され得、かつ、これらのビリオンは、構成要素が転写の方向に作動可能に連結されるように、転写開始および終止配列を含む制御配列、ならびに治療化合物のコード配列またはその生物活性フラグメントを含むように構築される。これらの構成要素は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列によって５’および３’末端に結合される。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングを目的として機能することを意味する。従って、本発明のベクターで用いるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよく、あるいはＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のうちのいずれかに由来するものであってもよい。ＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターであり、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいＡＡＶベクターは、野生型ＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子の全部または一部を欠失しているが、機能的なフランキングＩＴＲ配列を保持している。表１は、遺伝子導入に用いる例示的なＡＡＶ血清型を示す。
【０１２７】
【表１】
典型的には、ＡＡＶ発現ベクターは、プロデューサー細胞内へ導入され、続いてＡＡＶヘルパー構築物の導入が行われるが、このヘルパー構築物は、プロデューサー細胞内で発現され得るＡＡＶコード領域を含み、ＡＡＶベクターに欠けているＡＡＶヘルパー機能を補完する。ヘルパー構築物は、米国特許第６，５４８，２８６号に記載されるように、典型的にはｐ５に続く開始コドンをＡＴＧからＡＣＧまで変異させることによって、大きなＲＥＰタンパク質（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）の発現をダウンレギュレートするように設計され得る。続いて、プロデューサー細胞内へのヘルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターの導入が行われるが、このヘルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターは、効率的なｒＡＡＶウイルス産生を支持し得る補助機能を提供する。次いで、このプロデューサー細胞は培養されて、ｒＡＡＶを産生する。これらの工程は、標準的な方法論を用いて実施される。本発明の組換えＡＡＶベクターをカプセル化する複製欠損ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶパッケージング細胞およびパッケージング技術を用いる当該分野で公知の標準技術によって作製される。これらの方法の例は、例えば、米国特許第５，４３６，１４６号；同第５，７５３，５００号、同第６，０４０，１８３号、同第６，０９３，５７０号および同第６，５４８，２８６号に見出され得る。ＡＡＶをパッケージングするためのさらなる組成物および方法は、Ｗａｎｇら（ＵＳ２００２／０１６８３４２）に記載され、当業者の知識の範囲内の技術を含む。
【０１２８】
ＡＡＶの多数の血清型が現在公知であるが、新しい血清型および既存の血清型の変種が今日依然として同定されており、本発明の範囲内であると考えられる。Ｇａｏら（２００２），ＰＮＡＳ ９９（１８）：１１８５４−６；Ｇａｏら（２００３），ＰＮＡＳ １００（１０）：６０８１−６；ＢｏｓｓｉｓおよびＣｈｉｏｒｉｎｉ（２００３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（１２）：６７９９−８１０）を参照のこと。特定の標的細胞の形質導入を最適化するために、または特定の標的組織（例えば、脳）内の特定の細胞型を標的化するために、種々のＡＡＶ血清型が用いられる。種々のＡＡＶ血清型の使用は、悪性組織の標的化を容易にし得る。ＡＡＶ血清型（１型、２型、４型、５型および６型を含む）は、脳組織に形質導入することが示されている。例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２０００），ＰＮＡＳ ９７（７）３４２８−３２；Ｐａｓｓｉｎｉら（２００３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７７（１２）：７０３４−４０）を参照のこと。特定のＡＡＶ血清型は、標的組織または細胞をより効率的に標的化し得、そして／あるいは標的組織または細胞内で複製し得る。単一の自己相補的ＡＡＶベクターは、形質導入効率を増加させ、その結果、導入遺伝子発現のより速い開始をもたらすために、本発明の実施に用いられ得る（ＭｃＣａｒｔｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１年８月；８（１６）：１２４８−５４）。
【０１２９】
本発明の実施において、ｒＡＡＶビリオンを産生するための宿主細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、微生物および酵母が挙げられる。宿主細胞はまた、ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子が宿主細胞内に安定して維持されるパッケージング細胞であってもよく、あるいは宿主細胞は、ＡＡＶベクターゲノムが安定して維持されるプロデューサー細胞であってもよい。例示的なパッケージング細胞およびプロデューサー細胞は、２９３細胞、Ａ５４９細胞またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、当該分野で公知の標準技術を用いて精製および処方される。
【０１３０】
レトロウイルスベクターは、遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０）。レトロウイルスベクター、およびより詳細にはレンチウイルスベクターは、本発明を実施するのに用いられ得る。レトロウイルスベクターは、試験されて、広範な標的細胞のゲノムＤＮＡへ種々の目的の遺伝子を安定して導入するのに適した送達ビヒクルであることが見出されている。再配列されていない単一コピー導入遺伝子を細胞内に送達するレトロウイルスベクターの能力により、レトロウイルスベクターは、遺伝子を細胞内に移すのに十分に適したものになっている。さらに、レトロウイルスは、宿主細胞上の特定細胞表面レセプターへのレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質の結合によって、宿主細胞に入る。従って、コードされたネイティブのエンベロープタンパク質が、このネイティブのエンベロープタンパク質とは異なる細胞特異性を有する（例えば、ネイティブのエンベロープタンパク質と比較して異なる細胞表面レセプターに結合する）異種エンベロープタンパク質で置換された、シュードタイプレトロウイルスベクターも、本発明の実施に有用であることが見出され得る。特定の型の標的細胞に対して導入遺伝子をコードするレトロウイルスベクターの送達を行う能力は、遺伝子治療用途に非常に望ましい。
【０１３１】
本発明は、例えば、１つ以上の導入遺伝子配列を含むレトロウイルストランスファーベクターおよび１つ以上のパッケージングエレメントを含むレトロウイルスパッケージングベクターを含む、レトロウイルスベクターを提供する。特に、本発明は、シュードタイプレトロウイルスを産生するために、異種のエンベロープタンパク質かまたは機能的に改変されたエンベロープタンパク質をコードする、シュードタイプレトロウイルスベクターを提供する。
【０１３２】
本発明のレトロウイルスベクターのコア配列は、例えば、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型レトロウイルス、ならびにスプマウイルスおよびレンチウイルスを含む、多種多様なレトロウイルスから容易に得られ得る（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８５を参照のこと）。本発明の組成物および方法に用いるのに適したレトロウイルスの例としては、レンチウイルスが挙げられるが、これに限定されない。本発明の組成物および方法に用いるのに適した他のレトロウイルスとしては、ニワトリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス誘導ウイルス（Ｍｉｎｋ−Ｃｅｌｌ Ｆｏｃｕｓ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ）、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９：１９−２５，１９７６）、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、Ｇｒａｆｆｉ、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、Ｋｉｒｓｔｅｎ、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルスおよびＲａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）、ならびにモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）が挙げられる。このようなレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）のような保管所またはコレクションから容易に得られるか、または一般に利用可能な技術を用いて既知の供給源から単離され得る。
【０１３３】
好ましくは、本発明のレトロウイルスベクター配列は、レンチウイルスに由来する。好ましいレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、１型または２型（すなわち、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２であり、ＨＩＶ−１は、以前はリンパ節症関連ウイルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれていた）、あるいは、同定されており、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患に関連する、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に関連する別のウイルスである。他のレンチウイルスベクターとしては、ヒツジビスナ／マエディウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられる。
【０１３４】
本組成物および方法に用いるのに適したレトロウイルスの種々の属および系統は、当該分野で周知である（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６）を参照、例えば、第５８章、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１７６８−１７７１頁（表１を含む）を参照（本明細書中に参考として援用される））。
【０１３５】
本発明は、レトロウイルスを産生するプロデューサー細胞およびプロデューサー細胞株を作製するためのレトロウイルスパッケージングシステム、ならびにこのようなパッケージングシステムを作製する方法を提供する。従って、本発明はまた、このようなパッケージングシステム内にレトロウイルストランスファーベクターを導入することによって（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）作製されるプロデューサー細胞および細胞株、ならびにこのようなパッケージング細胞および細胞株を作製する方法も提供する。
【０１３６】
本発明の実施に用いられるレトロウイルスパッケージングシステムは、以下の少なくとも２つのパッケージングベクターを含む：ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、またはｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列を含む、第１のパッケージングベクター；ならびに異種のエンベロープ遺伝子かまたは機能的に改変されたエンベロープ遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列を含む、第２のパッケージングベクター。好ましい実施形態において、レトロウイルスエレメントは、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）に由来する。好ましくは、ベクターは、機能的なｔａｔ遺伝子および／または機能的なアクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｎｅｆ）を欠く。別の好ましい実施形態において、このシステムは、ｒｅｖ遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む、第３のパッケージングベクターをさらに含む。このパッケージングシステムは、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および必要に応じて第３のヌクレオチド配列を含むパッケージング細胞の形態で提供され得る。
【０１３７】
本発明は、種々のレトロウイルスのシステムに適用可能であり、レトロウイルスの異なる群間で共有される共通のエレメントを当業者は認識する。本明細書中での記載は、代表的な例としてレンチウイルスのシステムを用いる。しかし、すべてのレトロウイルスは、表面突起で包まれたビリオンの特徴を共有し、１分子の直鎖状のポジティブセンス一本鎖ＲＮＡ、ダイマーからなるゲノム、ならびに共通のタンパク質であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。
【０１３８】
レンチウイルスは、エンベロープ糖タンパク質ＳＵ（ｇｐｌ２０）およびＴＭ（ｇｐ４１）（これらは、ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）；ＣＡ（ｐ２４）、ＭＡ（ｐ１７）およびＮＣ（ｐ７−１１）（これらは、ｇａｇ遺伝子によってコードされる）；ならびにｐｏｌ遺伝子によってコードされるＲＴ、ＰＲおよびＩＮを含む、いくつかの構造ビリオンタンパク質を共有する。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２は、ウイルスＲＮＡの合成およびプロセシングならびに他の複製機能の調節に関与する、アクセサリータンパク質および他のタンパク質を含む。ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ／ｖｐｘ、およびｎｅｆ遺伝子によってコードされるアクセサリータンパク質は、組換えシステムから削除（または不活性化）され得る。さらに、ｔａｔおよびｒｅｖは、例えば変異または欠失によって、削除または不活性化され得る。
【０１３９】
第１世代のレンチウイルスベクターパッケージングシステムは、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖごとに別個のパッケージング構築物を提供し、そして典型的には、安全上の理由で、異種のエンベロープタンパク質かまたは機能的に改変されたエンベロープタンパク質を用いる。第２世代のレンチウイルスベクターシステムでは、アクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆ）が削除されるかまたは不活性化される。第３世代のレンチウイルスベクターシステムは、ｔａｔ遺伝子が削除されたかさもなければ不活性化されたものである（例えば、変異によって）。
【０１４０】
ｔａｔによって通常提供される転写の調節に対する補償は、強力な構成的プロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス前初期（ＨＣＭＶ−ＩＥ）エンハンサー／プロモーター）の使用によって提供され得る。他のプロモーター／エンハンサーは、当該分野で理解されるように、構成的プロモーター活性の強さ、標的組織に対する特異性（例えば、肝臓特異的プロモーター）、または発現の所望の制御に関連する他の因子に基づいて選択され得る。例えば、いくつかの実施形態において、制御された発現を達成するために、ｔｅｔのような誘導性プロモーターを使用することが望ましい。Ｒｅｖをコードする遺伝子は、好ましくは別個の発現構築物上に提供され、その結果、典型的な第３世代レンチウイルスベクターシステムは、以下の４つのプラスミドを含む：ｇａｇｐｏｌのプラスミド、ｒｅｖのプラスミド、エンベロープのプラスミドおよびトランスファーベクターのプラスミド。使用されたパッケージングシステムの世代にかかわらず、ｇａｇおよびｐｏｌは、単一の構築物上かまたは別個の構築物上に提供され得る。
【０１４１】
典型的には、パッケージングベクターは、パッケージング細胞内に含まれており、トランスフェクション、形質導入または感染によってこの細胞内に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染の方法は、当業者に周知である。本発明のレトロウイルストランスファーベクターは、トランスフェクション、形質導入または感染によってパッケージング細胞株へ導入されて、プロデューサー細胞または細胞株を作製し得る。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む標準方法によって、ヒト細胞または細胞株へ導入され得る。いくつかの実施形態において、パッケージングベクターは、優性選択マーカー（例えば、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎ合成酵素またはＡＤＡ）とともに細胞へ導入され、続いて、適切な薬剤の存在下での選択およびクローンの単離が行われる。選択マーカー遺伝子は、パッケージングベクターによってコードされる遺伝子に物理的に連結され得る。
【０１４２】
パッケージング機能が適切なパッケージング細胞によって発現されるように構成されている、安定な細胞株が公知である。例えば、米国特許第５，６８６，２７９号；およびＯｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）９３：１１４００−１１４０６（これらは、パッケージング細胞について記載する）を参照のこと。安定な細胞株の作製のさらなる記載は、Ｄｕｌｌら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１１）：８４６３−８４７１；およびＺｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１２）：９８７３−９８８０；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：８７１−８７５に見出され得、これらは、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含むｐｏｌの３’配列が削除されているレンチウイルスパッケージングプラスミドを教示する。この構築物は、ｔａｔおよびｒｅｖ配列を含み、３’ＬＴＲがポリＡ配列で置換されている。５’ＬＴＲおよびｐｓｉ配列は、別のプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）で置換されている。例えば、ＣＭＶプロモーターまたはその誘導体が用いられ得る。
【０１４３】
目的のパッケージングベクターは、レンチウイルスタンパク質発現を増強し、かつ、安全性を高めるために、パッケージング機能にさらなる変更を含み得る。例えば、ｇａｇの上流のＨＩＶ配列はすべて除去され得る。また、エンベロープの下流の配列も、除去され得る。さらに、ベクターを改変する工程を行って、ＲＮＡのスプライシングおよび翻訳を増強し得る。
【０１４４】
必要に応じて、Ｄｕｌｌら（１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１１）：８４６３−８４７１）に記載されるように、条件付きパッケージングシステムが用いられる。また、例えばＺｕｆｆｅｒｅｙら（１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１２）：９８７３−９８８０）に記載されるように、ＨＩＶ−１末端反復配列（ＬＴＲ）の欠失によってベクターのバイオセイフティーを改善する、自己不活性化ベクター（ＳＩＮ）の使用も好ましい。誘導性ベクターも用いられ得る（例えば、ｔｅｔ誘導性ＬＴＲによる）。
【０１４５】
（調節エレメント）
本発明の遺伝子治療ベクターは、典型的には、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、腫瘍選択的プロモーターおよびエンハンサーが挙げられるがこれらに限定されない、異種の制御配列を含み、これらとしては、Ｅ２Ｆプロモーターおよびテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａ Ｈ．ら１９９１．Ｇｅｎｅ １０８（２）：１９３−９）；伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１−αプロモーター）（Ｋｉｍ ＤＷら、１９９０．Ｇｅｎｅ．９１（２）：２１７−２３およびＧｕｏ ＺＳら１９９６．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（９）：８０２−１０）；グリア特異的プロモーター（例えば、グリア細胞繊維性酸性タンパク質プロモーター）およびニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターまたはシナプシンプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
いくつかの場合において、構成的プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＣＡＧプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）またはＳＶ−４０プロモーター）が使用され得る。本発明の遺伝子治療ベクターはまた、シグナルペプチドのエンハンサーおよびコード配列も含み得る。ベクター構築物は、イントロンを含んでも含まなくてもよい。従って、本発明の遺伝子治療ベクターが、多数の導入遺伝子、導入遺伝子の組み合わせ、および導入遺伝子／調節エレメントの組み合わせのうちのいずれかを含み得ることが理解される。
【０１４７】
（本発明の方法および組成物）
本発明は、単独で用いられても従来の治療法と組み合わせて用いられてもよい、前立腺癌の処置に対する代替アプローチを提供する。
【０１４８】
本発明の１つの実施形態は、遺伝子改変された細胞（代表的には、前立腺癌患者への投与後にβ−フィラミンタンパク質に対する免疫応答の増強が検出される、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインを発現する細胞）から構成される癌ワクチンである。さらなる実施形態において、細胞は、哺乳動物の腫瘍細胞と同じ型である。一般に、癌ワクチンは、遺伝子改変された腫瘍細胞から構成されるが、非腫瘍性前立腺細胞もまた、本発明の実施に有用であることが見出されている。これらの細胞は、インビトロで増殖および維持される樹立細胞株であってもよい。本発明の実施に用いられる樹立腫瘍細胞株としては、ＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４３５）、ＨｅＩａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）、ＬＮＣａＰ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７４０）、Ｈ１５７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−５８０２）、またはＨ１３５９細胞が挙げられるが、これらに限定されない。１つのアプローチにおいて、遺伝子改変された細胞は、被験体から単離された腫瘍細胞に由来し、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の発現の増強を引き起こすベクターで形質導入される。次いで、遺伝子改変された細胞は、癌ワクチンの一部として、もとの同じ被験体かまたは異なる被験体に投与され得る。細胞の子孫が、親細胞と完全には同一でなくてもよい（形態学的に、遺伝子型的に、または表現型的に、のいずれかで）ことが理解される。さらに、細胞は、未選択の細胞の集団または特定の細胞のクローンのいずれかであり得る。例えば、細胞は、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインまたはβ−フィラミンのような抗原の高い発現レベルについてスクリーニングされ得るか、あるいは遺伝子改変され得る。これらの細胞は、典型的にはヒト細胞であり、そして一般に、被験体に投与される前に凍結保存された細胞である。典型的には、これらの細胞は、増殖不能である。１つの実施形態において、細胞は、エキソビボ培養で樹立された原発前立腺腫瘍の子孫である。
【０１４９】
前立腺癌の重症度は、種々の系に基づき、その１つは以下に例示する疾患の病期分類である：
病期１：癌は非常に小さく、完全に前立腺の内部であり、直腸診を行った場合、正常に感じられる。
【０１５０】
病期２：癌は依然として前立腺の内部であるが、より大きく、直腸診を行った場合、しこりまたは硬い領域が感じられる場合がある。
【０１５１】
病期３：癌は前立腺の被膜を通り抜けて、膀胱頸または精嚢内に成長している場合がある。
【０１５２】
病期４：癌は体の別の部分に転移し、前立腺癌が転移する最も一般的な部位は骨である。他の臓器に転移することはめったにない。
【０１５３】
前立腺癌疾患の重症度を評価するために適用される別の基準は、グリーソンスコア（等級を表す別の方法）である。生検が行われると、癌細胞を示す各領域が、細胞の外観に従い、重症度が最も低いかまたは最も正常に見える場合を１とし、重症度が最も高いかまたは最も正常には見えない場合を５として、１〜５段階で評価される。グリーソンスコアは、重症度が最も高い細胞を含む２つの領域の平均に基づいて作成され、これらのスコアを合計してグリーソンスコアを得る。
【０１５４】
グレード／グリーソンは、単に、いかに前立腺癌が進行し、かつ／または処置に応答するかの見解を医師に与えるにすぎない。
【０１５５】
本発明によるサイトカイン発現細胞ワクチンを含む薬学的組成物は、被験体における前立腺癌を処置するための他の治療に続いて、他の治療に先行して、他の治療の代わりに、または他の治療と組み合わせて、前立腺癌の任意の段階で患者を処置するのに用いられ得る。例えば、被験体は、以下にさらに記載されるように、化学療法、外照射放射線療法、および他の形態の免疫療法／細胞療法によって、予めまたは同時に処置され得る。
【０１５６】
前立腺癌の処置レジメンは、外科手術（すなわち、前立腺全摘出術）；放射線療法（すなわち、外照射または近接照射療法）；例えば「アンドロゲン除去」（例えば、抗アンドロゲンの投与）のようなホルモン療法；および化学療法の１つ以上を含むがこれらに限定されない、ある範囲の治療選択肢を含み、かつ変動する。
【０１５７】
前立腺癌の処置において最もよく用いられる抗アンドロゲンとしては、前立腺癌を処置するのに用いられる注射可能な合成ホルモンである、ロイプロリドが挙げられるが、これに限定されない。ロイプロリド（リュプロン）は、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログであり、進行した前立腺癌の処置に使用され得る。ロイプロリドは、ゴセレリン（ゾラデックス（登録商標））およびカソデックス（ビカルタミド）の一方または両方と組み合わせて用いられ得る。ゴセレリン（ゾラデックス（登録商標））は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）（性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストアナログとしても公知）の合成デカペプチドアナログを含む。カソデックス（ビカルタミド）は、活性成分ビカルタミドを含む経口非ステロイド性抗アンドロゲンである。カソデックス（ビカルタミド）は、テストステロンのような男性ホルモンの作用をブロックすることによって作用する。
【０１５８】
フルタミドもまた、進行した前立腺癌の処置に使用され得る。フルタミドは、テストステロンが前立腺のアンドロゲンレセプターに結合するのを阻止することによって作用する。フルタミドはまた、視床下部と呼ばれる脳の領域にも作用し、体内で産生されるテストステロンの量を最終的に減少させる。前立腺癌の処置において、フルタミドは、しばしばＬＨＲＨアナログと組み合わせて用いられる。ＬＨＲＨアナログは、前立腺癌の標準的な処置の１つであり、ブセレリン、ゴセレリン、リュープロレリンおよびトリプトレリンなどの医薬が挙げられる。
【０１５９】
前立腺癌の処置に用いられる別の薬物は、アンドロゲンレセプターに対して親和性を有する（しかし、プロゲストゲンレセプター、エストロゲンレセプター、またはグルココルチコイドレセプターに対しては有さない）、非ステロイド性抗アンドロゲンのニルタミド（アナンドロン（登録商標））である。
【０１６０】
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙの第３８回年次大会およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ＡＳＣＯ）の第４０回年次大会で示された結果によると、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）、エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））およびプレドニゾンを含む処置レジメンは、ホルモン抵抗性前立腺癌（ＨＲＰＣ）の処置においてかなり有効であった。
【０１６１】
本発明によるサイトカイン発現細胞ワクチンを含む薬学的組成物は、現在使用されている任意の前立腺癌治療（そのいくつかの例は、上に記載される）に続いて、または現在使用されている任意の前立腺癌治療と組み合わせて、前立腺癌患者に投与されてもよい。
【０１６２】
被検体における前立腺癌をモニタリングする代表的な手段は、当該分野で一般に公知のように、抗原に対する免疫応答（この抗原に対する免疫応答の増強は、本発明によるサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）発現細胞ワクチンの投与後に検出される）の評価と組み合わせて実施される。患者は、腫瘍重量、腫瘍体積、腫瘍細胞の数または腫瘍の成長速度の評価のような多数の方法のいずれかをモニターされ得る。評価され得るパラメータとしては、接近可能な腫瘍の直接測定、腫瘍細胞（例えば、血中の）の計数、腫瘍抗原（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）など）の測定、種々の可視化技術（例えば、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャンおよびＸ線）、骨密度の決定、または骨転移の評価が挙げられるが、これらに限定されない。これらの分析から得られた情報は、個体の応答を最適化し、かつ前立腺癌に関する治療結果の改善をもたらすために、細胞ワクチンの投与の用量またはスケジュールを調整するのに有用である。所望の作用が得られるまで、典型的には隔週の頻度で、さらなる用量が必要に応じて投与され得る。その後、さらなる追加免疫用量または維持量が、必要に応じて投与されてもよい。典型的な処置レジメンにおいて、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）発現細胞ワクチンは、腕、脚または腹部の皮膚に皮内注射（皮膚の下に直接針が配置される）で投与される。
【０１６３】
本発明の１つの局面は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）発現細胞ワクチンの最初の投与前に、および処置の開始後の種々の時点で、前立腺癌患者から血清サンプルを得ることによってβ−フィラミンに対する免疫応答を検出するためのアッセイを含む。次いで、各時点でのβ−フィラミンに結合する抗体の量が比較される。サンプル中の抗β−フィラミン抗体の量を定量する任意のアッセイが、β−フィラミンに結合する抗体について血清を分析するのに用いられ得る。β−フィラミンに結合する抗体についての血清の分析に用いられ得るアッセイの例としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ＦＡＣＳまたは電気化学発光（ＥＣＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、ウエスタンブロットは、β−フィラミン抗原の供給源として、ＰＣ−３細胞の細胞溶解物を用いる。
【０１６４】
本発明の実施において、β−フィラミンに対する細胞性免疫応答は、抗原特異的細胞アッセイ、増殖アッセイ、細胞溶解性細胞アッセイ、および組換え腫瘍関連抗原または免疫原性フラグメントまたは抗原由来のペプチドを用いたインビボ遅延型過敏性試験を用いて、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）発現細胞ワクチンの最初の投与前に、および処置の開始後の種々の時点で、患者において評価され得る。免疫応答の増加を測定するためのさらなる方法としては、遅延型過敏性試験、ペプチド主要組織適合遺伝子複合体テトラマーを用いたフローサイトメトリー、リンパ球増殖アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法、酵素結合免疫スポット検定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ａｓｓａｙ）、サイトカインフローサイトメトリー、直接細胞毒性アッセイ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によるサイトカインｍＲＮＡの測定、および限界希釈法のような、Ｔ細胞応答を測定するのに現在用いられているアッセイが挙げられる。例えば、Ｌｙｅｒｌｙ ＨＫ，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００３年６月；３０（３補遺８）：９−１６を参照のこと。
【０１６５】
本発明を以下の実施例を参照することにより説明するが、これらの実施例は、例示の目的で挙げられるものであり、本発明を限定することを何ら意図するものではない。当該分野で周知の標準技術または以下に具体的に記載される技術が利用される。
【０１６６】
本発明の方法および組成物は、種々の実施形態（その少数のみが本明細書中に開示される）の形態で組み込まれ得ることが理解される。他の実施形態が存在し、本発明の趣旨から逸脱しないことが、当業者には明らかである。従って、記載された実施形態は例示的なものであって、限定的なものとして解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１６７】
実施例１：ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンの調製のための組換えウイルスベクターの作製
サイトカインをコードする以下のウイルスベクターを、腫瘍細胞株中かまたは切除されたヒト腫瘍から得られた原発腫瘍細胞中への導入のために構築した。
（１）レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターの構築には、当該分野で十分に理解されている標準的な連結技術および制限技術を使用する。目的のサイトカインをコードする遺伝子（単数または複数）を含む種々のレトロウイルスベクターを用いた。ＭＦＧベクターは、米国特許第６，５４４，７７１号および同第５，６３７，４８３号に記載される。これらはまた、特にサイトカインをコードする遺伝子の組み込みおよび発現に関して以下に記載される。さらに、数種のＭＦＧベクターがＡＴＣＣに寄託されている：未改変のＭＦＧベクターは、ＡＴＣＣ受諾番号６８７５４として寄託され；第ＶＩＩＩ因子が挿入されたＭＦＧベクターは、ＡＴＣＣ受諾番号６８７２６として寄託され；そしてｔＰＡが挿入されたＭＦＧベクターは、ＡＴＣＣ受諾番号６８７２７として寄託された。ＭＦＧベクターは、ｐＥｍベクターと類似している（以下に記載され、かつ米国特許第６，５４４，７７１号および同第５，６３７，４８３号に記載される）が、パッケージング細胞株における組換えゲノムのキャプシド形成を増加させるために、ＭｏＭｕＬＶの１０３８塩基対のｇａｇ配列を含み、かつ、スプライスアクセプター配列を含むＭＯＶ−９に由来する３５０塩基対を含む。Ｎｃｏ Ｉ部位およびＢａｍ ＨＩ部位を含む１８塩基対のオリゴヌクレオチドは、ＭＯＶ−９配列に直接続き、適合する部位での遺伝子の簡便な挿入を可能にする。この遺伝子のコード領域を、Ｎｃｏ Ｉ部位およびＢａｍ ＨＩ部位でＭＦＧベクターの骨格に導入した。ＡＴＧ開始メチオニンコドンをＮｃｏ Ｉ部位にインフレームでサブクローン化し、かつ、生成物を不安定にすることと、あいまいな部位を導入することを避けるために、終止コドンより後にはわずかな（たとえあったとしても）配列も含まなかった。結果として、インサートのＡＴＧは、ベクター中の野生型ウイルスＡＴＧが存在する部位に存在した。従って、スプライスは、モロニーマウス白血病ウイルスで生じるスプライスと本質的に同じであり、ウイルスは非常に良好に機能した。ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲは転写を制御し、そして得られたｍＲＮＡは、ネイティブのｇａｇ転写産物の真正の５’非翻訳領域（その後に、挿入された遺伝子のオープンリーディングフレームが直接続く）を含む。このベクターにおいて、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）末端反復配列を用いて、全長ウイルスＲＮＡ（ウイルス粒子中へのキャプシド形成のため）、および挿入された配列の発現を担うサブゲノムｍＲＮＡ（Ｍｏ−ＭｕＬＶ ｅｎｖ ｍＲＮＡと類似している）の両方を産生させた。このウイルスｇａｇ領域に両方の配列を保持するベクターは、ｅｎｖ ｍＲＮＡの産生に必要な正常な５’および３’スプライス部位ならびにウイルスＲＮＡのキャプシド形成の改善を示した。すべてのオリゴヌクレオチド結合を、ジデオキシ終止法およびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いて配列決定した。このウイルスは、優性選択マーカーを含まない（必要に応じて挿入され得るが）という点でマーカーフリーであり、かつ、ベクターの構造に固有の高レベルの形質導入効率および発現を示し、ＭＦＧ誘導体での形質導入は、一般に選択工程を含まないかまたは必要としない。
【０１６８】
以下のタンパク質の遺伝子を含むＭＦＧベクターを構築した：マウスＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、γ−ＩＦＮ、ＩＬ−６、ＩＣＡＭ、ＣＤ２、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１−ＲＡ（インターロイキン−１−レセプターアンタゴニスト）。さらに、公的に利用可能な配列情報を用いて、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２をコードするヒト配列を構築した。ＭＦＧへサブクローン化された正確なｃＤＮＡ配列は、以下のとおりであった：マウスＩＬ−２塩基対４９−５６４；マウスＩＬ−４塩基対５６−４７９；マウスＩＬ−５塩基対４４−４６２；マウスＧＭ−ＣＳＦ（２９）塩基対７０−５６１；マウスＩＣＡＭ−１塩基対３０−１６５７；マウスＣＤ２塩基対４８−１０７９；マウスＩＬ−１レセプターアンタゴニスト塩基対１６−５６３；ヒトＴＮＦ−α塩基対８６−７８８。
（２）アデノウイルスベクター
ヒトＧＭ−ＣＳＦのコード配列の細胞への導入のためのアデノウイルスベクター（ヒトＧＭ−ＣＳＦ；ＡＶ−ＧＭ−ＣＳＦ）は、アデノウイルス５型のＥ１遺伝子で置換され、ウイルスゲノムのＥ３領域をさらに欠失しているＧＭ−ＣＳＦ発現カセットを含む。Ａｄ５の完全なＧｅｎＢａｎｋ配列（登録番号Ｍ７３２６０）によれば、欠失はＥ１領域の４５５〜３３２７である。番号付けは、左側逆方向末端反復の第一塩基から始まる。
【０１６９】
アデノウイルスベクターの構築には、当該分野で十分に理解されている標準的な連結技術および制限技術を使用する。野生型３００（Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇより）（０〜２７３３０）とｄｌ３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら（１９８２）Ｃｅｌｌ ３１：５４３−５５１）（２１５６１〜右端）との間の重複組換えによって、Ｅ３欠失を導入した。ＣＲＥ８細胞におけるｐＡｄｌｏｘ ＭＣ ｈＧＭとＥ３欠失アデノウイルスとの間のｃｒｅ／ｌｏｘ媒介組換えによって、ＧＭ−ＣＳＦ発現カセットをＥ１領域に組み込んだ（Ｈａｒｄｙら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１８４２−１９４９）。ｐＡｄｌｏｘ ＭＤ ｈＧＭは、ｐＡｄｌｏｘ（Ｈａｒｄｙら（１９９７）およびｐＭＤ．Ｇ（Ｎａｌｄｉｎｉら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７）から誘導され、以下の配列を含む：Ａｄ５に由来する０〜４５５、ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＩＬ−２（Ｃｕｌｌｅｎ（１９８６）Ｃｅｌｌ ４６：９７３−９８２）に由来するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター／エンハンサー（ヌクレオチド位置−６７０〜＋７２、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３９２２）、ヒトβグロビンエキソン２の小領域および短縮された第２介在配列（ＩＶＳ２）（ヌクレオチド位置６２６１３〜６２７２０＋６３０８８〜６３５３２、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ００１７９）、ヒトβグロビンに由来するエキソン３およびポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド位置６３５３２〜６４２９７）、エキソン３（位置６３５３０）に挿入されたＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ、ＳＶ４０に由来する第２ポリアデニル化部位（位置２６８１〜２５３４）、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０２４００）およびｌｏｘＰ部位に続いてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに由来する細菌の配列。ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡは、プラスミドから得た（ＤＮＡＸ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞における機能的発現によりコンカナバリンＡ活性化ヒトＴ細胞クローンから調製されたｃＤＮＡライブラリーから単離した。このｃＤＮＡ（遺伝子の全配列を含む）の単離および特徴づけは、科学文献に報告されている。（Ｌｅｅら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：４３６０−４３６４）。クローンの同一性は、受け取った際に制限エンドヌクレアーゼ消化によって確認した。ＭＤ発現カセットは、ＩＶＳ２の下流に導入遺伝子の挿入のためのＰｍｌＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識部位を含むように、ＰＣＲによって改変した。ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを、ｐＭＦＧ−Ｓ ｈＧＭ（Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９７）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１１１−１２３）からＰｍｌＩおよびＢａｍＨＩを用いて除去し、ＭＤカセットのＰｍｌＩおよびＢｇｌＩＩ部位に挿入した。アデノウイルス（Ａｄ ＧＭウイルス）に組み込まれたｐＡｄｌｏｘ ＭＤ ｈＧＭプラスミドの領域を、両鎖について配列決定した。初期のウイルス構築物の正確な構造は、感染ＨｅＬａ細胞からのＧＭ−ＣＳＦ産物の制限分析およびＥＬＩＳＡ試験によって確認した。次いで、組換えウイルスを２回のプラーク精製に供した。プラークからの組換えウイルスを制限酵素マッピングし、２９３細胞（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓからの保証された細胞）内での増殖による２回の継代を行って、研究用ウイルスストックを作製した。ウイルス中のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の配列を、研究用ウイルスストックから調製したウイルスＤＮＡの直接配列決定によって決定した。最終的に、研究用ウイルスストックからの組換えウイルスを、マイコプラズマおよび無菌性について試験し、陰性であるとわかった場合、マスターウイルスストックとして細胞を感染させるために用いた。
【０１７０】
実施例２：自己の前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験
９人の患者が、自己前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験に参加した。各患者は、測定可能な転移性疾患の所見またはホルモン療法歴がなく、かつ、処置の開始時に少なくとも１．０ｎｇ／ｍｌよりも高いベースラインＰＳＡを有する、２回の連続的なＰＳＡレベルの異常上昇によって規定されるような、外科手術後に進行性の微小転移性前立腺癌を有する１８歳以上であった。患者は、外科手術とともに適切な併用薬を受けた。疾患の病理学的診断および病期分類は、外科手術の間に終えた。
【０１７１】
切除した腫瘍の一部を初代培養で増殖させ、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を有するＭＦＧウイルスベクターで形質導入し、照射して細胞を増殖不能にし、そして自己ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンを調製するために使用されるまで液体窒素中で保存した。外科手術の約６０日後に、ワクチンは臨床施設で使用可能であった。各ワクチン接種について、細胞を０．９％塩化ナトリウム溶液中または２．５％ヒト血清アルブミンを含む０．９％塩化ナトリウム溶液中で融解、洗浄、および再懸濁することによって、ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンを注射用に調製および処方した。
【０１７２】
外科手術の約６０日後に、ワクチン接種前来診では、ベースライン値を得、かつ自己の非形質導入細胞の最初のＤＴＨ評価を開始する予定であった。血清を採取し、そしてＰＳＡのレベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ワクチン接種前来診の２日後に、各患者は、各１４日間の３回のワクチン接種サイクルが予定された。３回のワクチン接種の後、累積的毒性が認められず、かつ、十分なワクチン細胞が残存した場合、この患者は、最大３回までの追加接種（計６回のワクチン接種）を受ける適格者であった。
【０１７３】
ワクチン接種部位の間隔および位置を、以下の表２に示す。各用量を、外来患者方式で患者に投与した後、退院前に外来診療部門で臨床観察を行った。
【０１７４】
【表２】
注射剤は、グリッドパターンにしたがって患者の肢に皮内投与した。各注射は、隣接する注射から針侵入位置で少なくとも５ｃｍである。用量レベル１については、注射剤を１本の肢に、連続サイクルごとに異なる肢を用いて、３人の患者に投与した。用量レベル２については、注射剤を６人の患者に、連続サイクルごとに２本の異なる肢を用い、所定のサイクルで２本の肢に等分して投与した。最初のワクチン接種を０日目に行い、続いて１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、および７０日目に行った。局所毒性および全身毒性、ならびに抗腫瘍免疫応答の誘導の評価を続いて行った。自己免疫の徴候も評価した。
【０１７５】
ＮＣＩ ＣＴＣ用量制限毒性は、計４１回の十分に評価可能なワクチン接種を受けた、８人のワクチン接種患者間で観察されなかった。皮内部位の生検は、有効性の前臨床モデルにおいて観察されたのと類似の、マクロファージ、樹状細胞、好酸球およびＴ細胞で構成される特有の炎症性浸潤を示した。１００％の患者が、形質導入されていない自己のＰＣＡ標的細胞に対するＤＴＨ反応性を示した。外科手術前の血清ＰＳＡの中央値は２８．８５（６．７〜７．５の範囲）であり、最初のワクチン接種時のＰＳＡレベルの中央値は０．６５（０．１〜３０．４の範囲）であった。高感度の血清ＰＳＡによると、８人中６人の患者が、外科手術後およびワクチン接種後に進行した：平均Ｆ／Ｕ２４か月。この研究は、インビボでＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を形質導入したＰＣＡワクチンの実現可能性、外来患者安全性、および生物活性を実証している。
【０１７６】
実施例３：同種異系の前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験
３０人の患者が、第２の自己前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験に参加した。各患者は、測定可能な転移性疾患の疾患またはホルモン療法歴がなく、かつ、処置の開始時に少なくとも１．０ｎｇ／ｍｌよりも高いベースラインＰＳＡを有する、２回の連続的なＰＳＡレベルの異常上昇によって規定されるような、外科手術後に進行性の微小転移性前立腺癌を有する１８歳以上であった。同種異系の前立腺癌細胞株ワクチンは、２４時間で１０６細胞当たり１４８〜６３９ｎｇのＧＭ−ＣＳＦを分泌するように遺伝子改変された、等しい細胞用量の２種の同種異系前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３）で構成される。あるいは、ワクチンは、２４時間で１０６細胞当たり２００〜３００ｎｇのＧＭ−ＣＳＦを分泌するように遺伝子改変された、３種の異なる照射済み自己前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３およびＤＵ１４５）の混合物で構成される。ワクチンの各バイアルは、グリセロールおよびヒト血清アルブミン中の直接注射可能物質として調製される。各細胞株ワクチン接種の用量を、下の表３に示す。
【０１７７】
【表３】
所定のワクチン接種日に、総細胞数１．２×１０８細胞（１つの細胞株当たり６×１０７細胞）を、各１．０ｃｃの４回の皮内注射（１つの細胞株当たり２回の注射）で、患者に投与した。各注射は皮内注射であった。０日目以降のワクチン接種日には、注射部位を交代した。１．２×１０８細胞の全量を、４回の注射に分けて、毎週１回、８週間投与している。
【０１７８】
処置サイクルの間、ワクチン接種に対する局所的全身性反応の評価を、ワクチン接種日に行った（１、２、３、４、５、６、７および８週目）。１回目のワクチン接種から始めて、
ＰＳＡ測定値を４ヶ月間、毎月決定し、次いで第２部の研究においては、２年間、４ヶ月ごとに決定した。臨床的に必要であれば、ＰＳＡレベルを４ヶ月ごとよりも頻繁に評価した。ＰＣＲ試験用の血液サンプルは、１回目のワクチン接種の前に採取した。第１部の最後の来診は、最後のワクチン接種（８週目）の２週間後に行った。少なくとも１回のワクチン接種を受けた登録患者は、ＰＳＡチェックのために長期追跡調査評価に参加した。患者は、患者が死亡するかまたは同種異系前立腺癌細胞株ワクチンがＦＤＡに認可されるまで、健康診断およびその後の臨床評価を年１回か、あるいは臨床的に必要であればより頻繁に受けた。
【０１７９】
実施例４：前立腺腫瘍関連抗原の同定
Ａ．血清の調製
研究に用いた血清は、自己のまたは同種異系の前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験において、ワクチン接種の２時間前および最後のワクチン接種の２週間後に患者から採取された血液から調製した。
【０１８０】
Ｂ．細胞可溶化物の調製
前立腺間質、前立腺上皮、前立腺平滑筋、および肺線維芽細胞に由来する初代細胞株をＣｌｏｎｔｅｎｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入し、ＳＣＧＭ、ＰｒＥＧＭ、ＳｍＧＭ、およびＦＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｔｅｎｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で生育した。細胞を１０％ウシ胎仔血清、ペニシリウム／ストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）、およびグルタミンを含むＤＭＥＭ＋Ｆ１２培地（ＪＨＲ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）で生育した。細胞密度がＴ−１７５フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中で８０％コンフルエンスに達すると、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いてＶｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で１０〜３０分間インキュベーションして、細胞をフラスコから剥離させた。次いで、細胞を収集し、卓上遠心機（ＣＳ−６Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で、１，０００ｒｐｍで１０分間遠心沈殿した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。非接着細胞（ジャーカット細胞および末梢血細胞）については、細胞を収集し、遠心沈殿し、そしてＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、２×１０７細胞を１ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ＮＰ４０、１ｍＭ ＰＭＳＦ、および１％プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（カタログ番号５３９１３４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で溶解し、続いて氷上で１時間インキュベーションした。次いで、不溶性の細胞片を４℃で３０分間、卓上エッペンドルフ遠心機を用いて遠心除去した。上清を除去し、タンパク質濃度をＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で測定した。
【０１８１】
Ｃ．ウエスタンブロット分析
示された量の細胞可溶化物中のタンパク質（２５〜３５μｇ／レーン）または精製ＰＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または他の癌関連マーカーを、４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｒｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で分離し、続いて膜転写装置（Ｘｃｅｌｌ ＩＩ，Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ，Ｎｏｒｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、２５ｍＶの定電圧で２〜３時間、ニトロセルロース膜（Ｎｏｒｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に電気的転写した。転写後、ニトロセルロース膜をブロッキング溶液（１０％脱脂乳／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で４℃にて一晩ブロットした。一晩ブロッキングの後、膜を患者の血清（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で１：１０００希釈）とともに室温で２時間インキュベートし、続いてＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。ＨＰＲＴ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ＋Ｇ＋Ａ（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で１：３０００希釈）を膜とともに１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。結果を、化学蛍光発光（例えば、ＥＣＬウエスタンブロッティングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて）によって示した。
【０１８２】
実施例５：自己ＧＶＡＸ（登録商標）臨床試験において同定される前立腺腫瘍関連抗原
１つの研究において、癌関連抗原を以下のように同定した。自己前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンを調製するために、前立腺腫瘍を８人の患者から摘出して、初代前立腺癌細胞株を作製した。ヒトＧＭ−ＣＳＦを含むレトロウイルスベクターをこれらの初代細胞株に形質導入して、ＧＭ−ＣＳＦを分泌する細胞を作製した。患者にワクチンを、皮内注射によって２週ごとに、これらのＧＭ−ＣＳＦを発現する自己の初代前立腺癌細胞の形態で投与した。患者１、２、および３には、１×１０７細胞を６回投与し；患者４には、１×１０７細胞を５回投与し；患者５および７には、５×１０７細胞を６回投与し；患者７には、１×１０７細胞を３回投与し；そして患者８には、５×１０７細胞を３回投与した。以下の研究に用いた血清は、ワクチン接種の２時間前（ワクチン接種前として）および最後のワクチン接種の２週間後（ワクチン接種後として）に採取した血液から調製した。
【０１８３】
最後のワクチン接種後の自己前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験において、患者の血清中の抗体によって認識される特異的な抗原の同定を、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株のウエスタンブロット分析によって行った。２５μｇのＬＮＣａＰ溶解物を、４〜２０％勾配ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動し、続いてニトロセルロース膜に転写した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中の患者血清の１：１０００〜１：３０００の範囲での希釈物を、ウエスタンブロット分析における一次抗体に用いた。ペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ｍ＋Ａの１：３０００の希釈物を、二次抗体に用いた。結果を化学蛍光発光ＥＣＬキットによって示した。ＰＳＡに無関係であり、かつ、ＬＮＣａＰ細胞によって発現される種々の抗原（「ｐａｎ」腫瘍関連抗原を含む）が、ＷＯ／００２６６７６にさらに記載されるように、自己ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験においてワクチン接種の前後に得られた血清を比較することによって、新たに同定された。
【０１８４】
実施例６：同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）臨床試験において同定される前立腺腫瘍関連抗原
新規の抗原も、同種異型のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンで処置した患者の血清によって同定された。同種異系の前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験において、２１人の患者を、１．２×１０７個のＧＭ−ＣＳＦ発現ＬＮＣａＰ（ＬＮＣａＰ／ＧＭ）細胞およびＧＭ−ＣＳＦ発現（ＰＣ−３／ＧＭ）細胞の両方で、８週間毎週ワクチン接種した。血清は、ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン投与の２時間前（「ワクチン接種前」として）および最後のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン投与の２週間後（「ワクチン接種後」として）に採取した血液から調製した。数人の同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン処置患者に由来する血清を、さらなる研究のために選択した。このデータを以下の表４に要約する；
【０１８５】
【表４−１】
【０１８６】
【表４−２】
大多数の場合に、ＬＮＣａＰ細胞および／またはＰＣ３細胞に対する体液性免疫応答が観察された。このような抗ＰＣ３抗体応答および抗ＬＮＣａＰ抗体応答の誘導、ならびに同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン処置を行った前立腺癌患者２１人中１５人に観察されたＰＳＡ速度の低下により、同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）の場合、前立腺腫瘍の処置において体液性免疫応答が治療的役割を果たすことが示唆される。次いで、同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン処置後の患者由来の血清の能力を、ＰＳＡに対する抗体について試験した。３μｇのＰＳＡを４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、続いて患者３０１、３０５、３１４、３０７、および３１２からの血清を用いてウエスタン分析を行った。これらの結果は、ＰＳＡがこれらの血清によって認識されないことを示し、これは、ＰＳＡが腫瘍成長を根絶するのに応じた免疫応答を惹起することができないことを示す。これらの新規の抗原をさらに特徴づけするために、多数の患者に由来するワクチン接種前後の血清を用いてウエスタンブロット分析を行った。以下の癌細胞株のパネルを試験した：ＬＮＣａＰ（前立腺）；ＰＣ−３（前立腺）；Ａ５４９（肺）；ＬＳ−１７４Ｔ（大腸）；ＭＣＦ７（乳房）；ＤＵ−１４５（前立腺）；ＫＬＥＢ（卵巣）；ジャーカット（白血病）；およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ（乳房）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される、約２７８ｋＤおよび約１６０ｋＤ抗原の組織／細胞特異的発現を、この癌細胞株および正常初代前立腺細胞株のパネルを用いて特徴づけした。約１６０ｋＤ抗原は、ＰＣ−３癌および正常前立腺上皮細胞に発現がみられ、Ａ５４９（肺癌）およびＭＣＦ７（乳癌）に弱く発現がみられたが、試験した他のタイプの癌にも、そして前立腺間質または平滑筋細胞にも発現がみられなかった。これらの結果は、約１６０ｋＤ抗原（ｐ１６０）が前立腺特異的抗原であることを示す（データは示さず）。同実験により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤの分子量を有する腫瘍関連抗原（ｐ２７８）が、前立腺癌細胞株ＰＣ−３およびＤＵ−１４５、ならびにＡ５４９肺癌に発現することが見出された。ｐ２７８はまた、正常前立腺上皮細胞にも発現がみられたが、間質細胞または平滑筋細胞には発現がみられなかった。これらの結果は、ｐ２７８が、少なくとも前立腺特異的抗原および腫瘍関連抗原であることを強く示唆している。正常な前立腺特異的抗原（例えば、ｐ２７８およびｐ１６０）に対する抗体応答が存在するという事実から、同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンは寛容を破綻させ、腫瘍関連抗原を認識することによりこのような腫瘍に対する免疫系の応答の開始を引き起こし得ることが示される。
【０１８７】
実施例７：第二段階の同種異系ＧＶＡＸ（登録商標）臨床試験において同定される前立腺腫瘍関連抗原
他の新規の抗原も、さらなる臨床試験において、同種異型のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンで処置した患者の血清によって同定された。この同種異系の前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験において、転移性骨疾患を有する２４人のホルモン抵抗性の患者に、初回用量の５億個のＧＭ−ＣＳＦ発現ＬＮＣａＰ細胞およびＧＭ−ＣＳＦ発現ＰＣ−３細胞を投与した後、２週間間隔で１２回の追加抗原投与量（各々１億個の細胞）を投与し、そして１０人の患者には、同じ初回用量およびより高い追加抗原投与量である３億個の細胞を投与した。血清は、ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン投与の２時間前（「ワクチン接種前」として）および最後のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン投与の２週間後（「ワクチン接種後」として）に採取した血液から調製した。患者由来の血清を、さらに研究した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによってワクチン接種後に認識されたいくつかの抗原を、以下の表５に要約する：
【０１８８】
【表５−１】
【０１８９】
【表５−２】
大多数の場合に、ＬＮＣａＰ細胞および／またはＰＣ３細胞に対する体液性免疫応答が観察された。ワクチン接種後の血清は、抗ＰＳＡ抗体を全く含まなかった。患者８０４に対して完全なＰＳＡ応答が観察された（図２）。患者８０４とＰＣ−３またはＬＮＣａＰ細胞型のいずれかとの間のＨＬＡクラスＩ型適合はなかった。
【０１９０】
患者８０４のＧＶＡＸ（登録商標）処置に対する体液性応答を特徴付けするために、患者８０４由来のワクチン接種前後の血清をウエスタンブロット分析に用いた。ワクチン接種後血清は、ＰＣ−３細胞に存在するがＬＮＣａＰ細胞に存在しない約２７８ｋＤに移動する抗原を認識することが見出された（図３）。約２７８ｋＤ抗原はまた、初代正常前立腺上皮、前立腺間質、および前立腺平滑筋（ＰｒＥＣ、ＰｒＳＣ、およびＰｒＳｍＣ）細胞株においても検出されたが、ＰＣ−３細胞におけるよりも低レベルであった（図４）。この抗原はまた、非小細胞肺癌細胞株であるＨ１５７において過剰発現している（図５）。
【０１９１】
ＰＣ−３細胞可溶化物を、水平次元に沿って３．５〜１０のｐＨ勾配を有する２次元ゲル電気泳動に供した。約２７８ｋＤ抗原の移動を、ブロット分析によって決定した。関連するバンドを切り取り、ＭＡＬＤＩ−ＭＳタンパク質配列決定に供した。約２７８ｋＤ抗原のタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１４４８（アクチン結合タンパク質）に見られるβ−フィラミンの配列と一致した。
【０１９２】
Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）のウサギ抗ヒトフィラミンモノクローナル抗体は、ウエスタンブロットにより、ＰＣ−３において発現されるがＬＮＣａＰ細胞においては発現されない約２７８ｋＤタンパク質と反応することが実証された（図６）。
【０１９３】
実施例８：β−フィラミンおよびＧＭ−ＣＳＦを発現する同種異系細胞のワクチン接種
ＷＯ／００２６６７６に記載されるような標準技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１４５７に記載して示すβ−フィラミンのコード領域とＧＭ−ＣＳＦのコード配列を一緒に挿入することによって、レトロウイルスベクターを調製する。ＰＣ−３細胞およびＬＮＣａＰ細胞は、β−フィラミンを発現するように形質導入および遺伝子改変されるが、ＰＣ−３細胞は、形質導入されていないＰＣ−３細胞よりも高レベルのβ−フィラミンを発現するように遺伝子改変される。形質導入されたＰＣ−３細胞およびＬＮＣａＰ細胞を１：１の割合で混合して細胞ワクチンを形成し、そしてこれらの細胞を照射によって増殖不能にする。いずれのワクチンの２億の細胞も、１日当たり１０６細胞当たり約１００μｇのＧＭ−ＣＳＦを分泌する。
【０１９４】
前立腺腺癌を有し、ＰＳＡが上昇し、ＥＣＯＧ一般状態が０〜１であり、正常な肝臓、腎臓および骨髄機能を有し、化学療法または遺伝子治療歴がなく、活動性自己免疫疾患がなく、前立腺癌の併用療法がなく、そして骨スキャン陽性であるが麻薬性鎮痛薬を必要とする骨痛のない転移性疾患を有する患者を選択した。群Ａの患者をワクチンＡで処置し、群Ｂの患者をワクチンＢで処置する。各群につき、初回用量の５億細胞に続いて、２週間間隔で１２回の追加抗原投与量の１億または２億細胞を投与する。血清を、最初のワクチン投与の２時間前および最後のワクチン投与の２週間後に各患者から採取された血液から調製する。
【０１９５】
骨スキャン、骨密度評価、ＣＴスキャン、ＰＳＡレベル、および生存によって測定されるような疾患の進行に対する応答を、時間とともにモニターする。
【０１９６】
【表６】
前述の発明は、明瞭さや理解のために、説明および実施例を挙げていくらか詳細に記載されているが、特定の変更および改変がなされ得ることは当業者に明白である。本発明の種々の局面は、一連の実験によって達成され、それらの一部は、以下の非限定的な実施例によって説明される。従って、この説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、添付の特許請求の範囲により示される。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の方法および組成物に有用な、ＭＦＧベクターの略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の方法および組成物に有用な、ＭＦＧベクターの略図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明の方法および組成物に有用な、ＭＦＧベクターの略図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明の方法および組成物に有用な、ＭＦＧベクターの略図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、本発明の方法およびワクチンに有用な、ＧＭ−ＣＳＦをコードするアデノウイルスベクター（ＡＶ−ＧＭ−ＣＳＦ）の略図である。
【図１Ｆ】図１Ｆは、本発明の方法およびワクチンに有用な、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のベクタープラスミド（ＳＳＶ９／ＭＤ２−ｈＧＭ）の略図である。
【図１Ｇ】図１Ｇは、本発明の方法およびワクチンに有用な、ＨＩＶ ＬＴＲに隣接したＧＭ−ＣＳＦ発現カセットを含む、組換えレンチウイルスベクターの略図である。
【図１Ｈ】図１Ｈは、本発明の方法およびワクチンに有用な、ＩＣＰ２２ ＨＳＶ遺伝子に置き換えてＧＭ−ＣＳＦ発現カセットを含む、ＨＳＶ−Ｉ系ベクターの略図である。
【図１Ｉ】図１Ｉは、本発明の方法およびワクチンに有用な、ＧＭ−ＣＳＦ発現カセット、ＳＶ４０複製開始点、およびウイルスの後期遺伝子を含む、ＳＶ４０系プラスミド（ｐＳＶ ＭＤ ＧＭ−ＣＳＦＩＩ）の略図である。
【図１Ｊ】図１Ｊは、本発明の方法およびワクチンに有用な、ワクシニアウイルスプロモーターおよび終始配列ならびにＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを含む、ワクシニアウイルス発現カセットの略図である。
【図２】図２は、同種異系前立腺のＧＶＡＸ（登録商標）臨床試験における患者８０４の完全なＰＳＡ応答を示す。ワクチン処置の初回量は、０日目に投与された。
【図３】図３は、ウエスタンブロット分析の結果を示す。この図から、ワクチン接種後の患者８０４由来の血清が、ＬＮＣａＰ細胞ではなくＰＣ−３細胞に存在する、約２７８ｋＤに移動する抗原を認識することが見出されたことを示す。
【図４】図４は、ワクチン接種前（０週目）およびワクチン接種後（２４週目）の患者８０４由来の血清を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。この図から、ワクチン接種後の患者８０４由来の血清が、約２７８ｋＤ抗原を認識することが見出されたことを示し、この抗原はまた、初代正常前立腺上皮細胞株、前立腺間質細胞株、および前立腺平滑筋細胞株（それぞれ、ＰｒＥＣ、ＰｒＳＣ、およびＰｒＳｍＣ）において検出されるが、ＰＣ−３におけるよりも低いレベルである。
【図５】図５は、ワクチン接種前（０週目）およびワクチン接種後（２４週目）の患者８０４由来の血清を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。この図から、ワクチン接種後の患者８０４由来の血清はまた、約２７８ｋＤ抗原を認識することが見出されたことを示し、この抗原は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）Ｈ１５７において過剰発現されるが、Ｈ１３９５ ＮＳＣＬＣ腺癌細胞株においては発現されない。
【図６】図６は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）によるウサギ抗ヒトフィラミンモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。この図から、ＰＣ−３細胞において発現されるがＬＮＣａＰ細胞においては発現されない、約２７８ｋＤのタンパク質との反応性を示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、前立腺癌の処置のためにワクチンとして用いるための、遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞に関する。より詳細には、本発明は、抗原であるβ−フィラミン（これは、遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦ発現細胞を前立腺癌患者へ投与することによって検出される）に対する増強された免疫応答の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫系は、多種多様な癌の病因に重要な役割を果たしている。癌が進行すると、免疫系が十分に応答しないか、または適切に応答せず、癌細胞が増殖可能になると広く考えられている。現在、化学療法、外科手術、放射線療法および細胞療法を含む、癌のための標準の医学的処置は、効力と毒性のいずれについても明らかな限界を有する。現在まで、これらのアプローチは、癌のタイプ、患者の全身的な健康状態、診断時の病期などに応じて、さまざまな程度で成功している。標準の医学的処置と組み合わせた、癌に対する免疫応答の特定の操作を組み合わせる改良ストラテジーは、効力の増強および毒性の低下のための手段を提供し得る。
【０００３】
免疫系が機能すると、抗原が処理されて、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子に関して細胞表面上に提示される。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子は、抗原に複合体化されると、それぞれＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞に認識される。この認識により、２次的な細胞内シグナルおよび特異的サイトカインのパラクリン放出の両方が生じ、これらは、細胞間の相互作用を媒介し、疾患を撃退するための宿主防御を促進する。次いで、サイトカインの放出は、抗原特異的免疫細胞の増殖を引き起こす。
【０００４】
多数のサイトカインが、腫瘍に対する免疫応答の調節に影響を及ぼすことがわかっている。例えば、米国特許第５，０９８，７０２号（特許文献１）は、既存の腫瘍を治療するのに相乗的に有効な量のＴＮＦ、ＩＬ−２およびＩＦＮ−βの組み合わせを使用することを記載している。米国特許第５，０７８，９９６号、同第５，６３７，４８３号および同第５，９０４，９２０号（特許文献２〜４）は、腫瘍の処置のためにＧＭ−ＣＳＦを使用することを記載している。しかし、癌治療のためのサイトカインの直接投与は、しばしば全身的に毒性であるため、実用的ではない場合がある。（例えば、Ａｓｈｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３２２７−３２３４，１９９１およびＨａｖｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１０６７−１０８５，１９８８（非特許文献１および２）を参照のこと）。
【０００５】
このアプローチの拡大は、ワクチン部位で局所的にサイトカインを発現する、遺伝子改変された腫瘍細胞の使用に関連する。ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦを含む多種多様な免疫調節サイトカインを用いた腫瘍モデルにおいて、それぞれ以下に記載されるように、活性が証明されている：Ｇｏｌｕｍｂｅｃｋ ＰＴら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１３−７１６，１９９１；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ Ｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４，１９９０；Ｆｅａｒｏｎ ＥＲら、Ｃｅｌｌ ６０：３９７−４０３，１９９０；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ Ｂら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：７８２０−２５，１９９０；Ｔｅｎｇ Ｍら、ＰＮＡＳ ８８：３５３５−３５３９，１９９１；Ｃｏｌｕｍｂｏ ＭＰら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１２９１−１２９８，１９９１；Ａｏｋｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８９（９）：３８５０−４，１９９２；Ｐｏｒｇａｄｏｒ Ａら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ．１３（２−３）：１１３−３０，１９９４；Ｄｒａｎｏｆｆ Ｇら、ＰＮＡＳ ９０：３５３９−３５４３，１９９３；Ｌｅｅ ＣＴら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１８７−１９３，１９９７；Ｎａｇａｉ Ｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｏｎｔｈｅｒ．４７：２−８０，１９９８およびＣｈａｎｇ Ａら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：８３９−８５０，２０００（非特許文献３〜１４）。抗腫瘍免疫を増強するためのワクチンとしての自己癌細胞の使用が、ここしばらく探究されてきた。例えば、Ｏｅｔｔｇｅｎら、「Ｔｈｅ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｄｅｖｉｔａら（編）Ｊ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ Ｃｏ．，ｐｐ８７−１９９，１９９１；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＴＤおよびＪａｆｆｅｅ ＥＭ，Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍ．１１（３）：６８１−９６，２００２；およびＢｏｄｅｙ Ｂら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０（４）：２６６５−７６，２０００（非特許文献１５〜１７）を参照のこと。
【０００６】
ＧＭ−ＣＳＦを分泌する自己または同種異系の腫瘍細胞ワクチンを用いた、いくつかの第一／第二段階の人体試験が実施されている（Ｓｉｍｏｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９ ５９：５１６０−８；Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８ ９５：１３１４１−６；Ｓｉｍｏｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７ ５７：１５３７−４６；Ｊａｆｆｅｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００１ １９：１４５−５６；Ｓａｌｇｉａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：６２４−３０；Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：３３４３−５０；Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００４年２月１８日、９６（４）：３２６−３１；ＢｏｒｅｌｌｏおよびＰａｒｄｏｌｌ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３（２）：１８５−９３，２００２；ならびにＴｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（３）２９７−３０６，２００４（非特許文献１８〜２６））。
【０００７】
遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦを発現する癌細胞を患者に投与すると、免疫応答の増強が結果として認められ、前立腺癌または他の癌に対する予備的な臨床効果が、第一／第二段階の臨床試験において証明された。しかしながら、前立腺癌の処置に用いるための細胞ワクチンの使用に関するストラテジーの改善の必要性が、依然として残されている。
【特許文献１】米国特許第５，０９８，７０２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，０７８，９９６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６３７，４８３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９０４，９２０号明細書
【非特許文献１】Ａｓｈｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３２２７−３２３４，１９９１
【非特許文献２】Ｈａｖｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１０６７−１０８５，１９８８
【非特許文献３】Ｇｏｌｕｍｂｅｃｋ ＰＴら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１３−７１６，１９９１
【非特許文献４】Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ Ｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４，１９９０
【非特許文献５】Ｆｅａｒｏｎ ＥＲら、Ｃｅｌｌ ６０：３９７−４０３，１９９０
【非特許文献６】Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ Ｂら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：７８２０−２５，１９９０
【非特許文献７】Ｔｅｎｇ Ｍら、ＰＮＡＳ ８８：３５３５−３５３９，１９９１
【非特許文献８】Ｃｏｌｕｍｂｏ ＭＰら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１２９１−１２９８，１９９１
【非特許文献９】Ａｏｋｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８９（９）：３８５０−４，１９９２
【非特許文献１０】Ｐｏｒｇａｄｏｒ Ａら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ．１３（２−３）：１１３−３０，１９９４
【非特許文献１１】Ｄｒａｎｏｆｆ Ｇら、ＰＮＡＳ ９０：３５３９−３５４３，１９９３
【非特許文献１２】Ｌｅｅ ＣＴら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１８７−１９３，１９９７
【非特許文献１３】Ｎａｇａｉ Ｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｏｎｔｈｅｒ．４７：２−８０，１９９８
【非特許文献１４】Ｃｈａｎｇ Ａら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：８３９−８５０，２０００
【非特許文献１５】Ｏｅｔｔｇｅｎら、「Ｔｈｅ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｄｅｖｉｔａら（編）Ｊ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ Ｃｏ．，ｐｐ８７−１９９，１９９１
【非特許文献１６】Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＴＤおよびＪａｆｆｅｅ ＥＭ，Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍ．１１（３）：６８１−９６，２００２
【非特許文献１７】Ｂｏｄｅｙ Ｂら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０（４）：２６６５−７６，２０００
【非特許文献１８】Ｓｉｍｏｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９ ５９：５１６０−８
【非特許文献１９】Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８ ９５：１３１４１−６
【非特許文献２０】Ｓｉｍｏｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７ ５７：１５３７−４６
【非特許文献２１】Ｊａｆｆｅｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００１ １９：１４５−５６
【非特許文献２２】Ｓａｌｇｉａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：６２４−３０
【非特許文献２３】Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：３３４３−５０
【非特許文献２４】Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００４年２月１８日、９６（４）：３２６−３１
【非特許文献２５】ＢｏｒｅｌｌｏおよびＰａｒｄｏｌｌ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３（２）：１８５−９３，２００２；
【非特許文献２６】Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（３）２９７−３０６，２００４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞を含む、被検体における前立腺癌を処置するための組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞を、前立腺癌の処置のために被検体に投与することによって、被検体における前立腺癌を処置する方法を含む。
【０００９】
この方法は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を産生するために第１の腫瘍細胞集団を遺伝子改変（形質導入）し、この第１の腫瘍細胞集団を単独かまたは第２の腫瘍細胞集団と組み合わせて被検体に投与することによって実行される。遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞の投与後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤ抗原に対する免疫応答が検出されるが、この免疫応答は、サイトカイン発現細胞を投与する前には検出されない。約２７８ｋＤ抗原は、β−フィラミンと同定された。
【００１０】
腫瘍細胞は、同じ個体由来の（自己の）腫瘍細胞であっても、異なる個体由来の（同種異系の）腫瘍細胞であっても、バイスタンダー細胞であってもよく、典型的には投与前に増殖不能にされる。典型的には、腫瘍細胞は、処置される腫瘍または癌と同じ型のものである。例えば、遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞は、前立腺細胞または前立腺癌細胞（例えば、ＰＣ−３細胞またはＬＮＣａＰ細胞）であり、被検体は、前立腺癌を有する。免疫応答は、体液性免疫応答であっても、細胞性免疫応答であってもよい。
【００１１】
サイトカイン発現細胞を前立腺癌患者に投与後に、患者に対する治療結果の改善が明らかであることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の上記および他の目的、その種々の特徴、ならびに本発明自体は、以下の説明が添付の図面と共に読まれると、より完全に理解され得る。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施では、他に指示がない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来技術を利用し、これらは、当該分野の範囲内である。
【００１４】
【化１】
（定義）
他に指示がない限り、本明細書中で使用されるすべての用語は、当業者が意図する意味と同じ意味を有する。
【００１５】
本明細書中に記載のすべての特許、特許出願、刊行物（公表された特許出願を含む）、およびデータベース登録番号を含む、刊行物および他の材料は、本発明の背景を明らかにするために、特に、実施についてさらなる詳細を提供する場合に、本明細書中で使用される。
【００１６】
本発明を記載するにあたり、以下の用語が使用され、これらの用語は下記のように定義されることが意図される。
【００１７】
用語「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそれらの重合体（「ポリヌクレオチド」）のことをいう。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドに類似した様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。他に指示がない限り、特定の核酸分子／ポリヌクレオチドはまた、保存的に改変されたそれらの改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列を、明示的に示された配列と同様に、暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。ヌクレオチドは、その塩基によって以下の標準的な略称に従って示される：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびグアニン（Ｇ）。
【００１８】
用語「コード配列」および「コード領域」とは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡなどのようなＲＮＡに転写される核酸配列をいう。１つの実施形態において、このＲＮＡは、次いで細胞内で翻訳されてタンパク質を産生する。
【００１９】
用語「ＯＲＦ」は、オープンリーディングフレームを意味する。
【００２０】
用語「遺伝子」とは、ゲノム内に位置し、かつ、上記コード配列に加えて、発現（すなわち、コード部分の転写および翻訳）の制御を担う他の（主に調節）核酸配列を含む、規定領域をいう。遺伝子はまた、他の５’および３’非翻訳配列および終止配列も含み得る。遺伝子の供給源に依存して、存在し得るさらなるエレメントは、例えばイントロンである。
【００２１】
用語「異種の」および「外来の」とは、プロモーターおよび遺伝子コード配列などのような核酸分子に関連して本明細書中で使用される場合、特定のベクターまたは宿主細胞にとって外来の供給源に由来する配列か、あるいは、同一の供給源に由来する場合には、その元の形態から改変された配列をいう。従って、ウイルスまたは細胞の異種遺伝子は、特定のウイルスまたは細胞にとって内因性であるが、例えばコドン最適化によって改変された遺伝子を含む。用語「異種の」および「外来の」はまた、天然に存在する核酸配列の天然に存在しない複数のコピーに関しても用いられ得る。従って、これらの用語は、ウイルスまたは細胞にとって外来または異種の核酸セグメント、あるいは、ウイルスまたは細胞にとって同種であるが、宿主ウイルスまたは細胞ゲノム内で通常見出されるのとは異なる位置に存在する核酸フラグメントをいう。
【００２２】
用語「同種の」とは、核酸分子に関連して本明細書中で使用される場合、宿主ウイルスまたは細胞に天然に関連する核酸配列をいう。
【００２３】
用語「相補体」および「相補的」とは、逆平行ヌクレオチド配列中の相補的な塩基残基間の水素結合形成の際に互いに対形成可能な逆平行ヌクレオチド配列を含む、２つのヌクレオチド配列をいう。
【００２４】
用語「ネイティブの」とは、野生型のウイルスまたは細胞のゲノムに存在する遺伝子またはタンパク質をいう。
【００２５】
用語「天然に存在する」または「野生型の」は、人によって人工的に作製されたものを除外して、天然に見出され得る対象物を記述するために使用される。例えば、生物体（ウイルスを含む）に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列であって、天然の供給源から単離され得、かつ、実験室で人によって意図的に改変されていないものは、天然に存在する。
【００２６】
用語「組換えの」とは、核酸分子に関連して本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡ技術を用いて子孫核酸分子に連結される核酸分子の組合せをいう。ウイルス、細胞、および生物体に関連して本明細書中で使用される場合、用語「組換えの」、「形質転換された」、および「トランスジェニック」とは、異種核酸分子が導入された宿主ウイルス、細胞、または生物体をいう。核酸分子は、宿主のゲノム中に安定的に組み込まれてもよく、核酸分子はまた、染色体外分子として存在してもよい。このような染色体外分子は、自己複製することができる。組換えウイルス、細胞、および生物体は、形質転換プロセスの最終産物のみならず、その組換え後代をも包含すると理解される。「非形質転換」、「非トランスジェニック」、または「非組換え」宿主とは、異種核酸分子を含まない野生型のウイルス、細胞、または生物体をいう。
【００２７】
「調節エレメント」は、ヌクレオチド配列の発現の制御に関与する配列である。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、および終止コドンを含む。調節エレメントはまた、典型的にはヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も包含する。
【００２８】
用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を含み、ＤＮＡの転写を開始させる、コード領域の上流に通常位置する非翻訳ＤＮＡ配列をいう。プロモーター領域はまた、遺伝子発現の調節因子として作用する他のエレメントを含んでもよい。用語「最小プロモーター」とは、プロモーターエレメント（特に、不活性であるか、または上流の活性化エレメントの非存在下でプロモーター活性が大幅に低下している、ＴＡＴＡエレメント）をいう。
【００２９】
本発明の意味の範囲内での用語「エンハンサー」は、任意の遺伝因子（例えば、コード配列に作動可能に連結された場合に、プロモーター自体によって達成される転写活性化よりも高い程度まで、プロモーターに作動可能に連結されたコード配列の転写を増加させる（すなわち、プロモーターからの転写を増加させる）ヌクレオチド配列）であってもよい。
【００３０】
用語「発現」とは、細胞内における内因性遺伝子、導入遺伝子またはコード領域の転写および／または翻訳をいう。アンチセンス構築物の場合、発現とは、アンチセンスＤＮＡのみの転写のことをいってもよい。
【００３１】
用語「アップレギュレートされた」とは、本明細書中で使用される場合、標的細胞において、別の細胞と比較して、特定の遺伝子のＲＮＡがより多量に検出され得ることを意味する。例えば、腫瘍細胞が、非腫瘍細胞と比較してより多くのテロメラーゼＲＮＡを産生する場合、腫瘍細胞は、テロメラーゼの発現をアップレギュレートしている。発現は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）中の特定のＲＮＡの量が、別の細胞（非腫瘍細胞）中におけるよりも少なくとも３倍大きい場合、アップレギュレートされたとみなされる。別の実施形態において、特定のＲＮＡの量は、少なくとも５倍大きい。別の実施形態において、特定のＲＮＡの量は、当業者によって慣用的に使用される技術（例えば、ノーザンブロット法）を用いて、少なくとも１０倍大きい。
【００３２】
用語「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「ポリヌクレオチドベクター構築物」、「核酸ベクター構築物」、および「ベクター構築物」は、本明細書中で交換可能に使用され、当業者によって理解されるように、遺伝子導入のための任意の核酸構築物を意味する。本発明において利用されるベクターは、必要に応じて選択マーカーをコードし得る。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「ウイルスベクター」は、当該分野で認められている意味に従って使用される。ウイルスベクターは、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子中にパッケージングされ得る、核酸ベクター構築物をいう。ウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかでＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸を細胞内に運搬する目的で利用され得る。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、ＨＳＶ）、バキュロウイルスベクター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクター、パピローマウイルスベクター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）ベクター、シンドビスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なウイルスベクターは、米国特許第６，０５７，１５５号、同第５，５４３，３２８号および同第５，７５６，０８６号（本明細書中に参考として明示的に援用される）に記載される。
【００３４】
用語「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ベクター粒子」、「ウイルスベクター粒子」、および「ビリオン」は、交換可能に用いられ、例えば、本発明のウイルスベクターが、感染性粒子の産生のために、適切な細胞または細胞株へ形質導入される場合に形成される、感染性ウイルス粒子を意味するものとして広く理解されるべきである。本発明に従うウイルス粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかでＤＮＡを細胞内に運搬する目的で利用され得る。
【００３５】
核酸配列が、別の核酸配列と機能的な関係で配置されている場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列とＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列の２つの配列が作動可能に連結される場合、あるいは、プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列または構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を及ぼすように位置する場合、該プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列は、該ＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に「作動可能に連結された」といわれる。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、典型的には近接しているが、必ずしもそうであるとは限らない。
【００３６】
「選択マーカー」は、細胞内における発現が、その細胞に選択的優位性を与えるタンパク質である。選択マーカー遺伝子で形質転換された細胞が有する選択的優位性は、非形質転換細胞と比較して、ネガティブ選択薬剤（例えば、抗生物質）の存在下で成長する能力に起因し得る。この形質転換された細胞が有する選択的優位性はまた、非形質転換細胞の成長と比較して、栄養分、成長因子またはエネルギー源として添加された化合物を利用する、増強された能力かまたは新規の能力に起因してもよい。選択マーカータンパク質としては、形質導入細胞の検出を可能にし、かつ、非形質転換細胞からの形質導入細胞の分離をできる限り可能にするものが挙げられる。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、選択マーカーとして用いられ得る。１つの実施形態において、細胞は、β−フィラミンまたはその免疫原性フラグメントとＧＦＰタンパク質の両方をコードするベクターで形質導入される。これらのＧＦＰを発現する形質導入細胞は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて分離される。選択マーカータンパク質により、形質導入細胞は、非形質導入細胞から大部分分離されることが可能になる。選択技術および分離技術が通常１００％ではないこと、ならびに、わずかな比率の非選択細胞集団が本発明では許容されることは、当業者であれば理解する。
【００３７】
用語「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特定のヌクレオチド配列に関連して本明細書中で使用される場合、特定の配列が、５’末端または３’末端のいずれかあるいはその両方にさらなる残基を有し得ることを意味し、このさらなる残基は、記載された配列の基本特性および新規特性に実質的に影響しない。
【００３８】
用語「形質導入」とは、物理的手段によって細胞内に外来性核酸を導入することを意味する。例えば、形質導入には、本発明のウイルス粒子を用いて細胞内に外来性核酸を導入することが含まれる。哺乳動物細胞を操作するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：５２７−５３７（１９９０）を参照のこと。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「パッケージング細胞」は、ウイルスゲノムまたはウイルス粒子を産生するために改変されたゲノムをパッケージ可能な細胞である。これにより、欠失した遺伝子産物またはその等価物を提供し得る。従って、パッケージング細胞は、ウイルスゲノムにおいて欠失している遺伝子を補完する機能を提供し得、ウイルス粒子中にウイルスゲノムをパッケージ可能である。このような粒子の産生は、ゲノムが複製され、かつ、感染性ウイルスを構築するのに必要なタンパク質が産生されることを必要とする。これらの粒子はまた、ウイルス粒子の成熟に必要な特定のタンパク質も必要とし得る。このようなタンパク質は、ベクターによるかまたはパッケージング細胞によって提供され得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「レトロウイルストランスファーベクター」とは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ、ベクターのパッケージングに必要なヌクレオチド配列をさらに含む発現ベクターをいう。好ましくは、レトロウイルストランスファーベクターはまた、細胞内で導入遺伝子を発現するのに必要な配列も含む。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「第２世代」レンチウイルスベクターシステムとは、機能的なアクセサリー遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージングシステム（例えば、アクセサリー遺伝子のｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠損しているかまたは不活性化されたもの）をいう。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１−８７５を参照のこと。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「第３世代」レンチウイルスベクターシステムとは、第２世代ベクターシステムの特性を有し、さらに機能的なｔａｔ遺伝子も欠く、レンチウイルスパッケージングシステム（例えば、ｔａｔ遺伝子が欠損しているかまたは不活性化されたもの）をいう。典型的には、ｒｅｖをコードする遺伝子は、別個の発現構築物上で提供される。例えば、Ｄｕｌｌら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−８４７１を参照のこと。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「シュードタイプ（偽型の）」とは、ネイティブのエンベロープタンパク質を、異種のエンベロープタンパク質かまたは機能的に改変されたエンベロープタンパク質と置き換えたものをいう。
【００４４】
用語「曝露すること」とは、本明細書中で使用される場合、導入遺伝子をコードするベクターを標的細胞と接触させて運び込むことを意味する。このような「曝露すること」は、インビトロでも、エキソビボでも、またはインビボで行われてもよい。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「安定的に形質転換された」、「安定的にトランスフェクトされた」および「トランスジェニック」とは、非ネイティブの（異種の）核酸配列がゲノムに組み込まれた細胞をいう。安定な形質転換は、トランスフェクトするＤＮＡを含む娘細胞集団から構成される細胞株またはクローンの確立によって実証される。ある場合には、「形質転換」は安定ではない（すなわち、一過性である）。一過性の形質転換の場合には、外来ＤＮＡまたは異種ＤＮＡが発現されるが、導入された配列はゲノムへ組み込まれない。
【００４６】
本明細書中において、用語「サイトカイン」または文法的に等価なものは、リンホカイン、モノカインなどを含む免疫系の細胞のホルモンの一般的分類を意味する。この定義は、限定されないが、局所的に作用し、かつ血中を循環しないホルモンを包含し、このホルモンが本発明に従って使用される場合、個体の免疫応答の変更をもたらす。用語「サイトカイン（単数）」または「サイトカイン（複数）」とは、本明細書中で使用される場合、免疫系の細胞に影響を及ぼす生物学的分子の一般的分類をいう。この定義は、局所的に作用するか血中を循環し得る生物学的分子を包含することを意味するが、これらに限定されず、この生物学的分子が本発明の組成物または方法で使用される場合、癌に対する個体の免疫応答を調節または変調する役割を果たす。本発明の実施に用いられる例示的なサイトカインとしては、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−２９、特に、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＭＩＰ３ａ、ＩＣＡＭ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション実験に関連して、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメータ下では異なる。配列が長いほど、高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列に対する熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜２０℃（好ましくは５℃）低くなるように選択される。典型的には、高度にストリンジェントな条件下では、プローブはその標的サブ配列にハイブリダイズするが、他の無関係の配列にはハイブリダイズしない。
【００４８】
Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍに等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットのフィルター上での１００を超える相補的残基を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミドで４２℃にてハイブリダイゼーションを一晩行う条件である。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１５Ｍ ＮａＣｌで７２℃にて約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃にて１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（下記）を参照のこと）。高ストリンジェンシー洗浄は、しばしば、バックグラウンドのプローブシグナルを除去するために、低ストリンジェンシー洗浄の後に行われる。例えば１００ヌクレオチドを超える二重鎖のための例示的な中程度のストリンジェンシー洗浄は、１×ＳＳＣで４５℃にて１５分間である。例えば１００ヌクレオチドを超える二重鎖のための例示的な低ストリンジェンシー洗浄は、４〜６×ＳＳＣで４０℃にて１５分間である。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）についてのストリンジェントな条件は、典型的には、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａイオン未満であり、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０〜８．３）であり、そして温度が、典型的には少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、無関係なプローブに見られるシグナル／ノイズ比に比べて２倍（または、より高い）シグナル／ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００４９】
２以上の核酸配列またはタンパク質配列に関連して、用語「同一」または「同一性」パーセントとは、本明細書中に記載される配列比較アルゴリズムの１つを用いるかまたは目視検査によって測定されるように、最大に一致するように比較および整列された場合に、同一であるか、あるいは同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合（パーセント）で有する、２以上の配列またはサブ配列をいう。
【００５０】
配列比較について、典型的には、１つの配列は試験配列が比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合は、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要であればサブ配列座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定のプログラムパラメータに基づき、参照配列と比較して試験配列（単数または複数）の配列同一性パーセントを算出する。
【００５１】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、局所ホモロジーアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））によって、ホモロジーアラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））によって、類似性検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８））によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手可能なソフトウェアを用いる、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭｏＩ Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））によって、あるいは、目視検査（概して、Ａｕｓｕｂｅｌら（下記）を参照のこと）によって、行われ得る。本発明の目的のために、比較のための配列の最適なアラインメントは、最も好ましくは、局所ホモロジーアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））によって行われる。
【００５２】
「正常な細胞状態」または「正常な生理的状態」は、正常な生理的条件で存在し、非分裂性かまたは調節された様式で分裂する細胞（すなわち、正常な生理的状態の細胞）の状態である。「異常な細胞状態」は、非分裂状態／調節された分裂状態で、かつ正常な生理的条件下の、同じ型の細胞に関して定義される。要するに、「異常な細胞状態」を有する細胞は、無秩序な細胞分裂を示すということである。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「癌」、「癌細胞」、「新生細胞」、「新生物形成」、「腫瘍」、および「腫瘍細胞」（交換可能に使用される）とは、相対的に自律的増殖を示し、その結果、細胞増殖の著しい制御不能を特徴とする、異常増殖の表現型または異常な細胞状態を示す細胞をいう。腫瘍細胞は、過形成細胞であっても、インビトロまたはインビボでの増殖の接触阻止の欠如を示す細胞であっても、インビボで転移できない細胞であっても、あるいはインビボで転移できる細胞であってもよい。新生細胞は、悪性であっても良性であってもよい。要するに、癌細胞は、異常な細胞状態を有するとみなされる、ということである。「腫瘍細胞」は、原発腫瘍由来であっても、腫瘍転移由来であってもよい。この「腫瘍細胞」は、患者から最近単離されたものであっても（「原発腫瘍細胞」）、長期のインビトロ培養の産物であってもよい。
【００５４】
用語「原発腫瘍細胞」は、当該分野における意味に従って使用される。原発腫瘍細胞は、哺乳動物の腫瘍から単離され、インビトロで広く培養されていない癌細胞である。
【００５５】
用語「腫瘍細胞由来の抗原」および「腫瘍抗原」および「腫瘍細胞抗原」は、本明細書中で交換可能に使用され得、免疫応答を惹起することができる、腫瘍細胞に由来するかまたは腫瘍細胞によって発現される任意のタンパク質、ペプチド、炭水化物または他の成分をいう。この定義は、全腫瘍細胞、腫瘍細胞フラグメント、腫瘍細胞から採取された原形質膜、腫瘍細胞の細胞表面または細胞膜から精製されたタンパク質、腫瘍細胞の細胞表面に付随する特有の炭水化物成分あるいは細胞内のベクターから発現される腫瘍抗原を包含することを意味するが、これらに限定されない。この定義はまた、アクセスするには細胞の特別な処理を必要とする、細胞の表面由来の抗原も包含する。
【００５６】
用語「遺伝子改変された腫瘍細胞」とは、本明細書中で使用される場合、導入遺伝子を発現させるために遺伝子改変され、癌処置レジメンの一部として患者に投与される、細胞の集団を含む組成物をいう。遺伝子改変された腫瘍細胞ワクチンは、処置を受ける患者にとって「自己の」または「同種異系の」腫瘍細胞、あるいは患者から採取された腫瘍細胞と混合された「バイスタンダー細胞」を含む。ＧＭ−ＣＳＦを発現する遺伝子改変腫瘍細胞ワクチンは、本明細書中で「ＧＶＡＸ」（登録商標）と呼ばれ得る。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように遺伝子改変され、続いて癌の処置のために患者に再投与された、自己の癌細胞および同種異系の癌細胞は、米国特許第５，６３７，４８３号、同第５，９０４，９２０号、同第６，２７７，３６８号および同第６，３５０，４４５号に記載される。膵癌の処置のためのＧＭ−ＣＳＦを発現する遺伝子改変癌細胞の１つの形態、すなわち「サイトカイン発現細胞ワクチン」は、米国特許第６，０３３，６７４号および同第５，９８５，２９０号（これらはいずれも本明細書中に参考として明示的に援用される）に記載される。一般的な免疫調節性のサイトカインを発現するバイスタンダー細胞株は、米国特許第６，４６４，９７３号（本明細書中に参考として明示的に援用される）に記載される。
【００５７】
用語「発現の増強」とは、本明細書中で使用される場合、天然に存在する細胞またはその細胞が由来する親細胞によって産生されるよりも高いレベルの特定のタンパク質を産生する細胞をいう。細胞は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）または抗原（この抗原に対する免疫応答が、サイトカイン発現細胞ワクチン（例えば、ＧＶＡＸ（登録商標））の投与後に増強される）の発現を増大させるために、遺伝子改変されてもよい。内因性抗原の発現は、抗原の産生を増大させるために、ゲノム配列のプロモーター領域を遺伝子改変するか、または細胞のシグナル伝達経路を遺伝子操作するなどの当該分野で公知の任意の方法を用いて増大され得る。また、細胞は、抗原またはその免疫原性フラグメントをコードするベクターで形質導入されてもよい。
【００５８】
本明細書中において、用語「全身性の免疫応答」または文法的に等価なものは、局所的ではなく個体全体として影響を及ぼすことにより、同じ刺激に対する特定のその後の応答を可能にする免疫応答を意味する。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「増殖不能の」または「不活化された」とは、複数回の有糸分裂を行うことはできないが、サイトカインまたは腫瘍抗原のようなタンパク質を発現する能力を依然として保持している細胞をいう。これは、当業者に公知の多数の方法によって実現され得る。本発明の実施形態は、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または実質的に１００％の細胞がさらに増殖するのを阻害する処理を含むが、これに限定されない。１つの実施形態において、これらの細胞は、哺乳動物に投与される前に、約５０〜約２００ラド／分または約１２０〜約１４０ラド／分の線量で照射される。典型的には、照射を用いる場合、必要とされるレベルは、２，５００ラド、５，０００ラド、１０，０００ラド、１５，０００ラドまたは２０，０００ラドである。本発明のいくつかの実施形態において、これらの細胞は、照射２日後、生細胞数について標準化した場合に照射前のレベルの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％または少なくとも約１００％の率で、β−フィラミンまたはその免疫原性フラグメントを産生する。本発明の１つの実施形態において、細胞は、被験体への投与前に照射によって増殖不能にされる。
【００６０】
用語「個体」、「被験体」またはその文法的に等価なものは、任意の１個体の哺乳動物を意味する。
【００６１】
本明細書中において、用語「定着腫瘍の逆転」または文法的に等価なものは、先在する腫瘍の抑制、退縮、または部分的もしくは完全な消失を意味する。この定義は、先在する腫瘍のサイズ、勢力または成長速度の任意の減少を含むことを意味する。
【００６２】
用語「処置」、「治療用途」、または「医薬用途」は、本明細書中で使用される場合、どのような方法であれ、疾患状態または症状を改善するか、あるいは、疾患または他の望ましくない症状の進行を阻止するか、妨害するか、遅らせるか、または逆転させる、特許請求される組成物のありとあらゆる用途をいうものとする。
【００６３】
用語「投与された」とは、哺乳動物に本発明の細胞（例えば、癌ワクチン）を導入する任意の方法をいう。これには、皮内、非経口、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、静脈内（留置カテーテルによる方法を含む）、腫瘍内、輸入リンパ管による方法、または患者の状態を考慮して適切な別の経路による方法が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、被験体の任意の部位に投与されてもよい。例えば、本発明の組成物は、原発腫瘍に対して「遠位の」部位に、または原発腫瘍から「離れた」部位に送達され得る。
【００６４】
用語「免疫応答の増加」とは、本明細書中で使用される場合、特定の免疫活性化の検出可能な増加（例えば、Ｂ細胞および／またはＴ細胞応答の増加）が検出可能であることを意味する。免疫応答の増加の例は、本発明のサイトカイン発現細胞ワクチンの投与前には検出されないか、またはより低いレベルで検出される抗原に結合する抗体の量の増加である。別の例は、細胞性免疫応答の増加である。細胞性免疫応答にはＴ細胞が関与し、インビトロ（例えば、クロム遊離法によって測定される）またはインビボで観察され得る。免疫応答の増加は、典型的には、特定の免疫細胞集団の増加を伴う。
【００６５】
用語「腫瘍の成長を遅延させること」とは、腫瘍の成長速度の緩徐化、腫瘍サイズまたは腫瘍細胞数の増加の阻害、あるいは腫瘍細胞数、腫瘍サイズ、または腫瘍の数の減少を意味する。
【００６６】
用語「腫瘍成長を阻害すること」とは、腫瘍重量、腫瘍体積、腫瘍細胞の量または腫瘍の成長速度の任意の測定可能な減少をいう。腫瘍重量の測定可能な減少は、当業者に公知の多数の方法によって検出され得る。これらの方法としては、接近可能な腫瘍の直接測定、腫瘍細胞（例えば、血液中に存在する）の計数、腫瘍抗原（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ））の測定、および種々の視覚化技術（例えば、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャンおよびＸ線）が挙げられる。腫瘍成長速度の減少は、典型的には、癌を有する哺乳動物のより長い生存時間と相関する。
【００６７】
本明細書中において、用語「治療有効量」または文法的に等価なものは、刺激または抑制のいずれかによって個体の免疫応答を変調するのに十分な、薬剤（例えば、本発明のサイトカイン発現細胞ワクチン）の量をいう。この量は、異なる個体、異なる腫瘍型、および異なる調製物について、異なってもよい。「治療有効量」は、「治療結果の改善」がもたらされるように、当業者によって慣例的に用いられる手順を用いて決定される。
【００６８】
癌に関連して本明細書中で使用される場合、用語「治療結果の改善」および「治療効力の改善」とは、癌細胞または充実性腫瘍の成長の緩徐化または減少、あるいは癌細胞の総数または全身腫瘍組織量の減少をいう。従って、「治療結果の改善」または「治療効力の改善」は、平均余命の増加または生活の質の改善（本明細書中にさらに記載されるように）を含む、任意の臨床的に許容可能な基準に従う患者の状態の改善があることを意味する。
【００６９】
本明細書中において、用語「不活性化された細胞」および「増殖不能の細胞」または文法的に等価なものは、増殖不能にする処理によって不活性化された細胞を意味する。この処理により、複数回の有糸分裂を行うことができないが、サイトカインおよび／または腫瘍抗原のようなタンパク質を発現する能力を依然として保持している細胞を得る。これは、当業者に公知の多数の方法によって実現され得る。「照射を受けた細胞」は、このような不活性化された細胞の一例である。このような照射を受けた細胞は、増殖不能にするのに十分な照射に曝露されている。
【００７０】
（本発明の細胞ワクチン組成物）
本発明は、癌の治療的処置の一部として、遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞を被験体に投与することにより、被検体における前立腺癌を処置する方法に関する。この方法は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を産生するために第１の腫瘍細胞集団を遺伝子改変（形質導入）し、この第１の腫瘍細胞集団を単独でまたは第２の腫瘍細胞集団と組み合わせて被検体に投与することによって実行され、その結果、投与後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤ抗原に対する免疫応答が検出されるが、この免疫応答は、サイトカイン発現細胞を投与する前には検出されない。腫瘍細胞は、同じ個体由来の（自己の）腫瘍細胞であっても、異なる個体由来の（同種異系の）腫瘍細胞であっても、バイスタンダー細胞（以下にさらに記載される）であってもよい。典型的には、腫瘍細胞は、処置される腫瘍または癌と同じ型の腫瘍細胞株に由来する。例えば、改変された細胞は、前立腺または前立腺癌細胞であり、患者は、前立腺癌を有する。約２７８ｋＤ抗原は、β−フィラミンであると同定された。
【００７１】
本発明の１つの局面において、免疫応答は、体液性免疫応答である。典型的には、遺伝子改変された腫瘍細胞は、投与前に増殖不能にされる。１つの実施形態において、哺乳動物は、遺伝子改変されたサイトカイン発現腫瘍細胞と同じ型の前立腺腫瘍細胞を有するヒトである。好ましい実施形態において、治療結果の改善は、被験体への遺伝子改変されたサイトカイン発現腫瘍細胞の投与後に明らかである。当業者に公知の、前立腺癌患者に対する治療結果の改善の種々のパラメータのいずれかが、遺伝子改変されたサイトカイン発現腫瘍細胞療法の効力（例えば、血中ＰＳＡ濃度の減少）を評価するのに用いられ得る。
【００７２】
なお別の局面において、本発明は、増殖不能の遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞の治療有効量を被験体に投与することによって、前立腺癌患者における全身性の免疫応答を刺激する方法を提供する。腫瘍に対する全身性の免疫応答は、腫瘍退縮をもたらすか、または腫瘍の成長を阻害し得る。
【００７３】
本発明の１つの好ましい実施形態において、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを利用して、エキソビボでヒトＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子（コード配列）をヒト腫瘍細胞に送達する。形質導入後、これらの細胞を照射して、増殖不能にする。次いで、この増殖不能のＧＭ−ＣＳＦ発現腫瘍細胞は、患者に再投与され（例えば、皮内または皮下経路によって）、それによって、癌ワクチンとして機能する。ヒト腫瘍細胞は、原発腫瘍細胞であっても、腫瘍細胞株由来であってもよい。
【００７４】
一般に、本発明の実施に用いられる遺伝子改変された腫瘍細胞としては、１種以上の自己腫瘍細胞、同種異系腫瘍細胞および腫瘍細胞株（すなわち、バイスタンダー細胞）が挙げられる。これらの腫瘍細胞は、インビトロで、エキソビボで、またはインビボで形質導入され得る。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように遺伝子改変され、続いて癌の処置のために患者に再投与された、自己癌細胞および同種異系癌細胞は、米国特許第５，６３７，４８３号、同第５，９０４，９２０号および同第６，３５０，４４５号に記載される。膵癌の処置のための、ＧＭ−ＣＳＦを発現する遺伝子改変癌細胞の１つの形態、すなわち「サイトカイン発現細胞ワクチン」（「ＧＶＡＸ」（登録商標））は、米国特許第６，０３３，６７４号および同第５，９８５，２９０号に記載される。一般的な免疫調節性の遺伝子改変されたバイスタンダー細胞株は、米国特許第６，４６４，９７３号に記載される。
【００７５】
細胞ワクチンがＤＵ１４５、ＰＣ−３、およびＬＮＣａＰからなる群より選択される１種以上の前立腺腫瘍細胞株を含む、ＧＶＡＸ（登録商標）の同種異系の形態は、ＷＯ／００２６６７６に記載される。ＬＮＣａＰは、ＰＳＡを産生する前立腺腫瘍細胞株であり、一方、ＰＣ−３およびＤＵ−１４５は、ＰＳＡを産生しない前立腺腫瘍細胞株である（Ｐａｎｇ Ｓ．ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９５年１１月；６（ｌｌ）：１４１７−１４２６）。
【００７６】
ＧＭ−ＣＳＦ発現細胞ワクチン（ＧＶＡＸ（登録商標））を用いた臨床試験は、前立腺癌、黒色腫、肺癌、膵癌、腎癌、および多発性骨髄腫の処置のために行われてきた。とりわけ黒色腫、ならびに前立腺癌、腎癌および膵癌において、ＧＶＡＸ（登録商標）細胞ワクチンを用いた多くの臨床試験が記載されてきた（Ｓｉｍｏｎｓ ＪＷら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；５９：５１６０−５１６８；Ｓｉｍｏｎｓ ＪＷら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７；５７：１５３７−１５４６；Ｓｏｉｆｆｅｒ Ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８；９５：１３１４１−１３１４６；Ｊａｆｆｅｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００１；１９：１４５−１５６；Ｓａｌｇｉａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：６２４−３０；Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３ ２１：３３４３−５０；Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，２００４年２月１８日，９６（４）：３２６−３１）。
【００７７】
例として、１つのアプローチにおいて、遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦ発現腫瘍細胞が同種異系またはバイスタンダー細胞株として提供され、そして１つ以上のさらなる癌治療薬が処置レジメンに含まれる。別のアプローチにおいて、１つ以上のさらなる導入遺伝子が同種異系またはバイスタンダー細胞株によって発現され、一方、サイトカイン（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ）が自己細胞または同種異系細胞によって発現される。ＧＭ−ＣＳＦコード配列は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターおよび当業者に一般に使用される慣用的な方法を用いて、腫瘍細胞に導入される。ＧＭ−ＣＳＦの好ましいコード配列は、Ｈｕｅｂｎｅｒ Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（４７３１）：１２８２−５（１９８５）に記載されたゲノム配列であるが、いくつかの場合においては、ＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ形態が、本発明を実施するのに役立つことが見出されている（Ｃａｎｔｒｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，６２５０−６２５４，１９８５）。
【００７８】
一般に、遺伝子改変された腫瘍細胞は、投与の前に凍結保存される。好ましくは、遺伝子改変された腫瘍細胞は、患者に投与される前に、約５０〜約２００ラド／分、さらにより好ましくは約１２０〜約１４０ラド／分の線量で照射される。好ましくは、細胞は、細胞のさらなる増殖を実質的に１００％阻害するのに十分な総線量で照射される。従って、細胞は、約１０，０００〜２０，０００ラドの総線量で、最適には、約１５，０００ラドの総線量で照射されるのが望ましい。
【００７９】
サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）産生細胞は、典型的には２回以上、治療過程で被験体に投与される。特定の治療過程に応じて、複数回の注射が単一時点で投与され、この処置が種々の時間間隔で繰り返されてもよい。例えば、初期処置または「初回刺激」処置に続いて、１回以上の「追加免疫」処置を行ってもよい。このような「初回刺激」および「追加免疫」処置は、典型的には、同じ投与経路で、および／またはほぼ同じ部位に投与される。複数回投与で投与される場合、最初の免疫化用量は、引き続く免疫化用量よりも高くてもよい。例えば、５×１０６個の初回刺激用量に続いて、複数回の１０６〜３×１０６個の追加抗原投与量で、ＧＭ−ＣＳＦ産生細胞を投与してもよい。
【００８０】
サイトカイン産生細胞の単回投与は、典型的には、約１０６〜１０８個の間の細胞、例えば、１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、６×１０６個、７×１０６個、８×１０６個、９×１０６個、１０７個、２×１０７個、５×１０７個、さらには１０８個の細胞である。１つの実施形態において、単位用量あたり１０６〜１０８個の間のサイトカイン産生細胞が存在する。サイトカイン産生細胞の数は、所定のサイトカイン産生細胞ワクチンによって産生されるサイトカインのレベルに従って調整され得る。
【００８１】
本発明の実施形態には、１００万個の細胞あたり２４時間で少なくとも５００ｎｇのＧＭ−ＣＳＦを産生することができる用量のサイトカイン産生細胞が含まれるが、これらに限定されない。最適な細胞投与量および割合の決定は、後に実施例の項で記載するように、日常的な決定事項であり、本明細書中に提供される開示を考慮すれば、当業者の技術範囲内である。
【００８２】
本発明の組成物および方法を用いた前立腺癌患者の処置において、主治医は、より低用量のサイトカイン発現腫瘍細胞ワクチンを投与して、患者の応答を観察してもよい。より大用量のサイトカイン発現腫瘍細胞ワクチンを、治療結果の改善が明らかになるまで投与してもよい。
【００８３】
本発明のサイトカイン産生細胞は、細胞を調製するのに用いられるほとんどの追加成分を除去するために処理される。特に、培地中のウシ胎仔血清、ウシ血清成分、または他の生物学的補充物質が除去される。１つの実施形態において、細胞は、例えば穏やかな遠心分離を繰り返すことによって、適切な薬理学的適合性の賦形剤中に洗い込まれる。適合性の賦形剤としては、生理学的適合性の緩衝液、例えばリン酸塩またはＨｅｐｅｓ、および栄養分、例えばデキストロース、生理学的適合性のイオン、またはアミノ酸（特に、他の免疫原性成分を含まないもの）を含むかあるいは含まない、種々の細胞培養培地、等張食塩水が挙げられる。担持試薬、例えばアルブミンおよび血漿画分ならびに非活性増粘剤も用いられ得る。
【００８４】
（自己由来）
自己の遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦ発現細胞の使用は利点を有する。なぜなら、各患者の腫瘍が、別の患者に由来する、組織学的に類似した、ＭＨＣが一致する腫瘍細胞上に見出される腫瘍抗原のセットとは異なり得る、ユニークな腫瘍抗原のセットを発現するためである。例えば、Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，６３８−６４３（１９９２）；Ｄａｒｒｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，３３２９−３３３５（１９８９）；およびＨｏｒｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１０，１５３−１６４（１９９１）を参照のこと。対照的に、ＭＨＣが一致する腫瘍細胞は、遺伝子改変された腫瘍細胞の産生のための患者の腫瘍のサンプルを得るために、患者に外科手術を行う必要がないという利点を有する。
【００８５】
１つの好ましい局面において、本発明は、以下の工程を実施することにより前立腺癌を処置する方法を含む：（ａ）前立腺腫瘍を有する哺乳動物被験体から腫瘍細胞を得る工程；（ｂ）この腫瘍細胞を、未改変の腫瘍細胞と比較して上昇したレベルのＧＭ−ＣＳＦの産生を可能にするために、遺伝子改変する工程；（ｃ）この改変された腫瘍細胞を増殖不能にする工程；および（ｄ）この遺伝子改変された腫瘍細胞を、この腫瘍細胞が得られた元の哺乳動物被験体へ、またはこの腫瘍細胞が得られた元の哺乳動物と同じＭＨＣ型を有する哺乳動物へ、再投与する工程。投与された腫瘍細胞は、自己由来であり、ＭＨＣが宿主と一致する。好ましくは、組成物は、哺乳動物被験体に皮内投与、皮下投与、または腫瘍内投与される。
【００８６】
いくつかの場合において、単一の自己腫瘍細胞は、ＧＭ−ＣＳＦのみを発現しても、またはＧＭ−ＣＳＦに加えて１つ以上のさらなる導入遺伝子を発現してもよい。他の場合において、ＧＭ−ＣＳＦおよび１つ以上のさらなる導入遺伝子は、異なる自己腫瘍細胞によって発現され得る。本発明の１つの局面において、自己腫瘍細胞は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列（その発現に必要なプロモーターおよび発現／制御配列に作動可能に連結されている）を含むベクターの導入によって改変される。別の局面において、この同じ自己腫瘍細胞または別の自己腫瘍細胞は、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をコードする核酸配列（その発現に必要なプロモーターおよび発現／制御配列に作動可能に連結されている）を含むベクターの導入によって改変される。この１つ以上の導入遺伝子をコードする核酸配列は、同じかまたは異なるベクターを用いて、同じかまたは異なる自己腫瘍細胞に導入される。導入遺伝子（単数または複数）をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー配列をさらに含んでも、含まなくてもよい。望ましくは、自己腫瘍細胞は、高レベルのＧＭ−ＣＳＦを発現する。
【００８７】
（同種異系）
Ｊａｆｆｅｅ（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２，８１−９１（１９９５））らによって概説されるように、研究者らは、腫瘍ワクチンとして、自己由来の、ＭＨＣが一致する細胞の代替を探求した。初期の腫瘍ワクチンストラテジーは、ワクチン接種細胞が、そのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子上に腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能して、免疫系のＴ細胞アームを直接活性化するという理解に基づいていた。Ｈｕａｎｇら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４，９６１−９６５，１９９４）の結果は、ワクチン接種細胞よりもむしろ宿主のプロフェッショナルＡＰＣが、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン（単数または複数）を分泌し、その結果、骨髄由来ＡＰＣが腫瘍の部位に補充されることによって、免疫系のＴ細胞アームを初回刺激することを示している。骨髄由来ＡＰＣは、腫瘍の全細胞タンパク質をプロセシングのために取り込み、次いで抗原ペプチド（単数または複数）をＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子上に提示することによって、免疫系のＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞アームを初回刺激し、その結果、全身性の腫瘍特異的な抗腫瘍免疫応答を引き起こす。理論に制約されるわけではないが、これらの結果から、抗癌免疫応答を惹起するために自己細胞またはＭＨＣが一致する細胞を用いることは必須ではないか、または最適ではない場合があること、および同種異系のＭＨＣ遺伝子（同じ種の遺伝的に異なる個体に由来する）の転座が腫瘍免疫原性を増強し得ることが示唆される。より詳細には、ある場合において、同種異系のＭＨＣクラスＩ分子を発現する腫瘍の拒絶により、未改変の親腫瘍でのその後のチャレンジに対する全身性の免疫応答が増強される。例えば、Ｊａｆｆｅｅら（前出）、およびＨｕａｎｇら（前出）を参照のこと。
【００８８】
本明細書中に記載されるように、「腫瘍細胞株」は、初めに腫瘍に由来した細胞を含む。このような細胞は、典型的には形質転換されている（すなわち、培養下で無限の増殖を示す）。１つの好ましい局面において、本発明は、以下の工程を実施することにより前立腺癌を処置する方法を提供する：（ａ）腫瘍細胞株を得る工程；（ｂ）この腫瘍細胞株を遺伝子改変して、これらの細胞がサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を未改変の腫瘍細胞株と比較して上昇したレベルで産生できるようにする工程；（ｃ）この改変された腫瘍細胞株を増殖不能にする工程；および（ｄ）この腫瘍細胞株を、この腫瘍細胞株が得られた元の腫瘍と同じ腫瘍型の少なくとも１つの腫瘍を有する哺乳動物被験体（宿主）に投与する工程。投与された腫瘍細胞株は、宿主と同種異系であり、ＭＨＣが一致しない。このような同種異系細胞株は、予め調製され、特徴づけられ、既知数の導入遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）発現細胞を含むバイアルに分取され、そして保存（すなわち凍結）され得るので、患者への投与のために十分に特徴づけられた細胞が得られるという利点を有する。遺伝子改変された同種異系細胞の産生方法は、例えばＷＯ００／７２６８６に記載される。
【００８９】
遺伝子改変された、ＧＭ−ＣＳＦを発現する同種異系細胞を調製する１つのアプローチにおいて、ＧＭ−ＣＳＦを単独でコードするかまたは１つ以上のさらなる導入遺伝子の核酸コード配列と組み合わせてコードする核酸配列（導入遺伝子）が、同種異系の腫瘍細胞株（すなわち、処置される個体以外の個体由来）である細胞株に導入される。別のアプローチにおいて、ＧＭ−ＣＳＦを単独でコードするかまたは１つ以上のさらなる導入遺伝子の核酸コード配列と組み合わせてコードする核酸配列（導入遺伝子）が、別々の同種異系の腫瘍細胞株に導入される。さらに別のアプローチにおいて、２つ以上の異なる遺伝子改変された同種異系のＧＭ−ＣＳＦ発現細胞株（例えば、ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３）が、組み合わせて（典型的には１：１の比で）投与される。一般に、細胞または細胞の集団は、処置される腫瘍または癌（例えば、前立腺癌）と同じ型の腫瘍細胞株に由来する。導入遺伝子（単数または複数）をコードする核酸配列は、同じかまたは異なるベクターを用いて、同じかまたは異なる同種異系腫瘍細胞に導入されてもよい。導入遺伝子（単数または複数）をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー配列をさらに含んでも、含まなくてもよい。望ましくは、同種異系細胞株は、高レベルのＧＭ−ＣＳＦを発現する。
【００９０】
本発明の別の局面において、１つ以上の、遺伝子改変された、ＧＭ−ＣＳＦを発現する同種異型細胞株は、抗原に対する患者の免疫応答がＧＭ−ＣＳＦ（例えば、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子改変された同種異系細胞またはバイスタンダー細胞）の存在下で増大するように、抗原に曝露される。このような曝露は、エキソビボで行われてもインビボで行われてもよい。１つの好ましい実施形態において、この抗原は、β−フィラミンであると同定された、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤ抗原である。β−フィラミンは、被験体に投与される細胞によって（細胞上に）提供されるか、または患者にネイティブな細胞によって提供され得る。このような場合、組成物は、典型的には照射（本明細書中にさらに記載されるように、これらの同種異型細胞は、組織培養プレート中で平板培養され、Ｃｓ線源を用いて室温で照射される）によって、増殖不能にされる。本発明の同種異系細胞ワクチン組成物は、同種異系細胞に加えて、遺伝子改変されていてもされていなくてもよい他の細胞（すなわち、異なる型の同種異型細胞、自己細胞、またはバイスタンダー細胞）を含み得る。遺伝子改変されている場合、異なる型の同種異型細胞、自己細胞、またはバイスタンダー細胞は、ＧＭ−ＣＳＦまたは別の導入遺伝子を発現し得る。所定の投与における同種異系細胞と他の細胞の比は、その組み合わせに応じて変動する。
【００９１】
同種異型細胞株の組成物を患者へ導入するために、任意の適切な投与経路が用いられ得、好ましくは、この組成物は、皮内に、皮下にまたは腫瘍内に投与される。
【００９２】
本発明の実施における同種異系細胞株の使用は、遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦ発現細胞株を癌患者へ投与することにより、自己癌抗原（ＧＭ−ＣＳＦのパラクリン産生）とともに、腫瘍に対する有効な免疫応答を引き起こすという、治療上の利点をもたらす。これにより、各患者につき自己腫瘍細胞を培養して形質導入する必要性が除去される。
【００９３】
（バイスタンダー）
１つのさらなる局面において、本発明は、少なくとも１つの導入遺伝子を発現する、一般的な免疫調節性の遺伝子改変された導入遺伝子を発現するバイスタンダー細胞を提供する。同じ一般的なバイスタンダー細胞株が、２つ以上の導入遺伝子を発現してもよく、異なる一般的なバイスタンダー細胞株によって、個々の導入遺伝子が発現されてもよい。一般的なバイスタンダー細胞株は、主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）抗原および主要組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）抗原を天然に欠失するか、またはＭＨＣ−Ｉ抗原およびＭＨＣ−ＩＩ抗原を欠失するように改変された細胞を含む。本発明の１つの局面において、一般的なバイスタンダー細胞株は、導入遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン）をコードする核酸配列（その発現に必要なプロモーターおよび発現制御配列に作動可能に連結されている）を含むベクターの導入によって改変される。別の局面において、この同じ一般的なバイスタンダー細胞株または別の一般的なバイスタンダー細胞株は、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をコードする核酸配列（その発現に必要なプロモーターおよび発現制御配列に作動可能に連結されている）を含むベクターの導入によって改変される。この導入遺伝子（単数または複数）をコードする核酸配列は、同じかまたは異なるベクターを用いて、同じかまたは異なる一般的なバイスタンダー細胞株に導入され得る。導入遺伝子（単数または複数）をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー配列をさらに含んでも、含まなくてもよい。抗腫瘍免疫応答を刺激する導入遺伝子（単数または複数）の任意の組み合わせが、本発明の実施に役立つことが見出されている。好ましくは、一般的なバイスタンダー細胞株は、規定培地（すなわち、無血清培地）中で、好ましくは懸濁液として、培養される。
【００９４】
好ましい一般的なバイスタンダー細胞株の一例は、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３；Ｌｏｚｚｉｏら、Ｂｌｏｏｄ ４５（３）：３２１−３３４（１９７５）；Ｋｌｅｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １８：４２１−４３１（１９７６））である。ヒトバイスタンダー細胞株の作製の詳細な記載は、例えば米国特許第６，４６４，９７３号に記載される。
【００９５】
望ましくは、一般的なバイスタンダー細胞株は、高レベルの導入遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン）を発現する。
【００９６】
本発明の実施において、１つ以上の一般的なバイスタンダー細胞株は、例えば自己腫瘍細胞によって提供される、自己癌抗原（一般的なバイスタンダー細胞株組成物を一緒に含む）とともにインキュベートされ、次いで、この一般的なバイスタンダー細胞株組成物が患者に投与される。一般的なバイスタンダー細胞株組成物を患者へ導入するために、任意の適切な投与経路が用いられ得る。好ましくは、この組成物は、皮内に、皮下にまたは腫瘍内に投与される。
【００９７】
典型的には、自己癌抗原は、処置される癌の細胞（すなわち、自己癌細胞）によって提供される。このような場合、組成物は、照射（上に詳述されるように、これらのバイスタンダー細胞および癌細胞は、組織培養プレート中で平板培養され、Ｃｓ線源を用いて室温で照射される）によって、増殖不能にされる。
【００９８】
所定の投与におけるバイスタンダー細胞と自己癌細胞の比は、その組み合わせに応じて変動する。ＧＭ−ＣＳＦを産生するバイスタンダー細胞に関して、所定の投与におけるバイスタンダー細胞と自己癌細胞の比は、治療上有効レベルのＧＭ−ＣＳＦが産生されるような比であるべきである。ＧＭ−ＣＳＦの閾値とは別に、バイスタンダー細胞と自己癌細胞の比は、１：１を超えるべきではない。バイスタンダー細胞と腫瘍細胞または腫瘍抗原との適切な比は、当該分野で公知の慣用的な方法を用いて決定され得る。
【００９９】
本発明の実施におけるバイスタンダー細胞株の使用は、サイトカインを発現するバイスタンダー細胞株および少なくとも１つのさらなる癌治療薬（同じかまたは異なる細胞によって発現される）を癌患者へ投与することにより、自己癌抗原（免疫調節性サイトカインのパラクリン産生）とともに、腫瘍に対する有効な免疫応答を引き起こすという、治療上の利点をもたらす。これにより、各患者につき自己腫瘍細胞を培養して形質導入する必要性が除去される。
【０１００】
最大約３０，０００ラドまでの線量が許容可能であるが、典型的には、最小線量の約３５００ラドが、細胞を不活性化し、かつ増殖不能にするのに十分である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物に投与される前に、約５０〜約２００ラド／分または約１２０〜約１４０ラド／分の線量で照射される。照射を用いる場合、必要なレベルは、典型的には２，５００ラド、５，０００ラド、１０，０００ラド、１５，０００ラドまたは２０，０００ラドである。１つの実施形態において、細胞を不活性化し、かつ増殖不能にするために、約１０，０００ラドの線量が用いられる。照射は、細胞を増殖不能にする１つの方法にすぎず、細胞が複数回の細胞分裂を行うことは不可能になるが、導入遺伝子（例えば、サイトカイン）を発現する能力は保持する他の不活性化方法も、本発明に包含されると理解される（例えば、マイトマイシンＣ、シクロヘキシミド、および概念的に類似する薬剤を用いた処理、または細胞による自殺遺伝子の取り込み）。
【０１０１】
（サイトカイン）
「サイトカイン」または文法的に等価なものは、限定されないが、局所的に作用し、かつ血中を循環しないホルモンを包含し、このホルモンが本発明に従って使用される場合、個体の免疫応答の変更をもたらす。このサイトカインの定義には、個体の免疫応答の変更をもたらす接着分子またはアクセサリー分子も含まれる。従って、サイトカインの例としては、ＩＬ−１（ａまたはＰ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＬＴ、ＴＧＦ−Ｐ、ｙ−ＩＦＮ、ａ−ＩＦＮ、Ｐ−ＩＦＮ、ＴＮＦ−ａ、ＢＣＧＦ、ＣＤ２またはＩＣＡＭが挙げられるが、これらに限定されない。上記のサイトカインおよび他の適用可能な免疫調節薬の説明は、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ａ．Ｓ．Ｈａｍｂｌｉｎ，Ｄ．Ｍａｌｅ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９３））、または「Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｎ．Ａ．Ｎｉｃｏｌａ（編），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９５））に見出され得る。ヒトにおける治療用途が意図される場合、サイトカインは、好ましくはヒト型のタンパク質に実質的に類似しているか、ヒト配列に由来する（すなわち、ヒト起源のサイトカイン）。１つの好ましい実施形態において、導入遺伝子は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）である。
【０１０２】
さらに、ヒト型の所定のサイトカインと実質的な構造上の相同性および／またはアミノ酸配列同一性を有する他の哺乳動物のサイトカインは、ヒト免疫系に対して類似の活性を示すことが証明されている場合に、本発明において有用である。同様に、任意の特定のサイトカインに実質的に類似しているが、タンパク質配列に保存的な変化を有するタンパク質もまた、本発明における用途が見出される。従って、タンパク質配列における保存的置換は、タンパク質分子の機能的能力を妨害することなく行われ得るので、タンパク質は、本発明においてサイトカインとして機能するが、現在既知の配列とはわずかに異なるアミノ酸配列を有するように作製され得る。このような保存的置換としては、典型的には、以下の群内での置換が挙げられる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【０１０３】
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、線維芽細胞、内皮細胞、Ｔ細胞およびマクロファージによって産生されるサイトカインである。このサイトカインは、顆粒球およびマクロファージ系の造血細胞の増殖を誘導することが示されている。さらに、このサイトカインはまた、免疫系の主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である樹状細胞の抗原プロセシングおよび提示機能を活性化する。動物モデル実験の結果は、ＧＭ−ＣＳＦ産生細胞（すなわち、ＧＶＡＸ（登録商標））が親の非形質転換細胞に対する免疫応答を誘導し得ることを、納得のいくように示した。
【０１０４】
ＧＭ−ＣＳＦは、強い抗腫瘍応答を刺激し得る樹状細胞（ＤＣ）のサブクラスの抗原提示能力を増強する（Ｇａｓｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、１９９１年３月１５日；７７（６）：１１３１−４５；Ｍａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００年６月１５日；６０（１２）：３２３９−４６；ＭａｃｈおよびＤｒａｎｏｆｆ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００年１０月；１２（５）：５７１−５に概説）。例えば、ＢｏｏｎおよびＯｌｄ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７年１０月１日；９（５）：６８１−３を参照のこと）。流入領域リンパ節におけるＴ細胞への腫瘍抗原エピトープの提示により、腫瘍転移に対する全身性の免疫応答が生じると予想される。また、照射されたＧＭ−ＣＳＦ発現腫瘍細胞は、腫瘍チャレンジに対する強力なワクチンとして機能することが示された（「ＧＶＡＸ（登録商標）」と題される、下記の節でさらに記載されるように）。遺伝子改変された細胞によって送達された局所的に高濃度の特定のサイトカインは、腫瘍退縮をもたらすことが見出されている（Ａｂｅら、Ｊ．Ｃａｎｅ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２１：５８７−５９２（１９９５）；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：７８２０−７８２５（１９９０）；Ｆｏｒｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ７：２８９−３０９（１９８８）。ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０００７２６８６は、種々のサイトカインを発現する腫瘍細胞を記載する。
【０１０５】
本発明の１つの実施形態において、細胞ワクチンは、ワクチンの細胞内での発現のための調節エレメントに作動可能に連結された、ＧＭ−ＣＳＦコード配列を含む。ＧＭ−ＣＳＦコード配列は、マウスまたはヒトのＧＭ−ＣＳＦをコードし得、ゲノムＤＮＡ（配列番号１）またはｃＤＮＡ（配列番号２）の形態であり得る。ｃＤＮＡの場合、ＧＭ−ＣＳＦのコード配列は、翻訳前にスプライスアウトされるイントロン配列を含まない。対照的に、ゲノムＧＭ−ＣＳＦについては、コード配列は、翻訳前にスプライスアウトされる少なくとも１つのネイティブのＧＭ−ＣＳＦイントロンを含む。１つの実施形態において、ＧＭ−ＣＳＦコード配列は、配列番号３をコードする。ＧＭ−ＣＳＦコード配列の他の例は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３７３８６８、ＡＣ０３４２２８、ＡＣ０３４２１６、Ｍ１０６６３およびＮＭ０００７５８に見出される。
【０１０６】
本発明によるＧＭ−ＣＳＦコード配列は、ストリンジェントな条件下で配列番号１または配列番号２に示される配列にハイブリダイズする、完全長の相補体であってもよい。「にハイブリダイズする」という句は、特定のヌクレオチド配列が複雑な混合物中に存在する（例えば、全細胞の）ＤＮＡまたはＲＮＡである場合、ストリンジェントな条件下でこのヌクレオチド配列に分子が結合するか、二重鎖を形成するか、またはハイブリダイズすることをいう。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸の間の相補的なハイブリダイゼーションをいい、標的核酸配列の所望の検出を達成するために、ハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低下させることにより適応され得る、軽微なミスマッチを包含する。
【０１０７】
従って、本発明によれば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインのコード配列は、ネイティブのＧＭ−ＣＳＦコード配列に対し、その全長にわたって少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性パーセントを有することになる。例えば、本発明によるＧＭ−ＣＳＦコード配列は、配列比較アルゴリズムで（上記のように）または目視検査によって測定されるように、最大一致について比較および整列される場合、配列番号１または配列番号２で示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。１つの実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約５０ヌクレオチド長の配列の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約１００ヌクレオチド長の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約２００ヌクレオチド長の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、配列の全長にわたって存在する。
【０１０８】
さらに、本発明によれば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインのアミノ酸配列は、最大一致について比較および整列される場合、配列番号３で示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１０９】
１つの実施形態において、細胞は、前立腺癌に対する免疫応答と関連する抗原（例えば、β−フィラミン）の発現を増強するように操作（遺伝子改変）され、かつ、前立腺癌に対する免疫応答を増強する１つ以上のタンパク質（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン）を発現するようにさらに操作されるか、または前立腺癌に対する免疫応答を増強する１つ以上のタンパク質（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン）を発現するようにさらに操作された異なる細胞と組み合わせて投与される。
【０１１０】
（β−フィラミン）
本発明の１つの実施形態は、β−フィラミンのような抗原に対する免疫応答の増強を引き起こす様式で前立腺癌を処置する方法であり、この免疫応答の増強は、被験体に対する治療結果の改善（例えば、患者の血清中のＰＳＡレベルの低下、癌に関連した痛みの減少、または任意の臨床的に許容可能な基準による患者の状態の改善（転移の減少、平均余命の増加、もしくは生活の質の改善が挙げられるが、これらに限定されない））と関連する。β−フィラミンは、患者のネイティブな細胞によって内因的に発現されてもよく、または被験体（患者）に外因的に提供されてもよい。
【０１１１】
哺乳動物は、３つのフィラミン遺伝子、フィラミン−Ａ、フィラミン−Ｂ（β−フィラミン；フィラミン−３）およびフィラミンＣを有する。ヒトフィラミンは、Ｎ末端のアクチン結合ドメインに続いて２４個の特徴的な繰り返しを含む、２８０ｋＤａのタンパク質である。ヒトフィラミンはまた、多くの他の細胞タンパク質と相互作用する。フィラミンは、通常、他のフィラミンとともに形成された約５６０ｋＤＡのホモダイマーまたはヘテロダイマーとして見出される。β−フィラミンはまた、ＡＢＰ−２７８／２７６としても知られている（Ｘｕら、１９９８、Ｂｌｏｏｄ ９２：１２６８−１２７６）。例えば、Ｔａｋａｆｕｔａら１９９８ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：１７５３１−１７５３８；Ｆｌｉｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５６（２）３６１−３７６，２００２を参照のこと。２６０２アミノ酸のβ−フィラミンタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１４４８で見出され得る。フィラミンＢおよびフィラミン−Ａの発現パターンは、例えば、Ｓｈｅｅｎら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１１（２３）２８４５−２８５４，２００２に記載される。Ｌｅｅｄｍａｎら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９０（１３）：５９９４−８，１９９３）は、後に指定されたβ−フィラミンである、アクチン結合タンパク質に関連するタンパク質のクローニングを記載する。
【０１１２】
本発明に従う１つの実施形態において、前立腺癌に対する免疫応答と関連する抗原（例えば、β−フィラミン）のコード配列は、ストリンジェントな条件下で配列番号４に示した配列にハイブリダイズする全長の相補体を有する。「にハイブリダイズする」という句は、特定のヌクレオチド配列が複雑な混合物（例えば、全細胞）中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡである場合、ストリンジェントな条件下でこのヌクレオチド配列に分子が結合するか、二重鎖を形成するか、またはハイブリダイズすることをいう。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸の間の相補的なハイブリダイゼーションをいい、標的核酸配列の所望の検出を達成するために、ハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低下させることにより適応され得る、軽微なミスマッチを包含する。
【０１１３】
従って、本発明によれば、前立腺癌に対する免疫応答と関連する抗原（例えば、β−フィラミン）のコード配列は、ネイティブのコード配列に対し、その全長にわたって少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性パーセントを有することになる。例えば、本発明によるβ−フィラミンコード配列は、配列比較アルゴリズムで（上記のように）または目視検査によって測定されるように、最大一致について比較および整列される場合、配列番号４で示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。１つの実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約５０ヌクレオチド長の配列の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約１００ヌクレオチド長の配列の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、少なくとも約２００ヌクレオチド長の配列の領域にわたって存在する。別の実施形態において、所定の配列同一性パーセントは、配列の全長にわたって存在する。
【０１１４】
さらに、本発明によれば、前立腺癌に対する免疫応答と関連する抗原（例えば、β−フィラミン）のアミノ酸配列は、最大一致について比較および整列される場合、配列番号５で示されるネイティブのβ−フィラミン配列に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１１５】
本発明の実施において、β−フィラミンに対する免疫応答は、サイトカイン発現細胞ワクチン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ発現腫瘍細胞（すなわちＧＶＡＸ（登録商標））の患者への投与の後に増強される。
【０１１６】
本発明の１つの実施形態において、β−フィラミンを発現する細胞の集団は、細胞ワクチンの一部として患者に投与される。β−フィラミン発現細胞は、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインを発現する細胞と同じであっても、異なっていてもよい。本発明の別の実施形態において、細胞ワクチンは、精製されたβ−フィラミンタンパク質またはその免疫原性フラグメントから構成される。細胞ワクチンは、免疫増強剤（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン、アジュバントなど）をさらに含み得る。本発明の実施において、完全長のβ−フィラミンタンパク質は、抗原として用いられ得る。しかし、β−フィラミンに対する検出された免疫応答は、β−フィラミンのフラグメントへの被験体の曝露後か、または外因的に提供されたβ−フィラミンの非存在下における細胞ワクチン（例えば、ＧＶＡＸ（登録商標））の投与の際にも明らかであることが、当業者には理解される。β−フィラミンフラグメントは、完全長のアミノ酸配列または選択的スプライシングバリアントの線状セグメント、欠失変異体あるいは他の変異体を含み得る。本発明で有用であるために、β−フィラミンフラグメントは、免疫原性フラグメントである（すなわち、免疫応答を惹起し得る）べきである。
【０１１７】
細胞は、当業者に公知の種々の方法によって、β−フィラミン発現について増強され得る。例えば、細胞は、β−フィラミンコード配列に作動可能に連結された、β−フィラミンをコードするベクターで形質導入され得る。適切なプロモーターは、当業者に公知であり、かつ入手可能である。細胞を形質導入するのに有用なベクターは、β−フィラミンの発現の増強をもたらすのに有効な任意のベクターであり得る。１つの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターのようなレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター）である。ベクターはまた、被験体における癌に対する免疫応答を増強するタンパク質（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン）のコード領域を細胞に形質導入するのに用いられ得る。このコード領域とβ−フィラミンコード領域は、１つのベクターに配置されても、別々のベクターに配置されてもよく、かつ、同じ細胞に導入されても、異なる細胞に導入されてもよい。別々のベクターに配置される場合、この別々のベクターは、同じ起源の（例えば、レトロウイルスの）ベクターであっても、異なる起源のベクターであってもよい。１つの実施形態において、細胞は、まずβ−フィラミンをコードするベクターで形質導入され、次いで、ＧＭ−ＣＳＦをコードするベクターで形質導入される。別の実施形態において、細胞は、まず前立腺癌に対する免疫応答を増強する少なくとも１つのタンパク質をコードするベクターで形質導入され、次いで、β−フィラミンをコードするベクターで形質導入される。
【０１１８】
本発明の１つの実施形態において、ベクター内のβ−フィラミンコード配列は、ネイティブ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００１４５７；配列番号４）または「再コード化（ｒｅｃｏｄｅｄ）」配列である。「再コード化」遺伝子とは、核酸によってコードされるポリペプチドがもとの配列のまま変化しないが、ポリペプチドをコードする核酸配列が変化するように改変されるコード配列をいう。遺伝暗号の縮重のため、同じアミノ酸翻訳産物をコードし得る複数のＤＮＡおよびＲＮＡコドンが存在することが、当該分野で周知である。さらに、異なる生物体は、アミノ酸を合成するための特定のコドンの利用について異なる優先度を有することも公知である。従って、本発明の１つの実施形態において、ベクターは、ヒトに好ましいコドンで再コード化されたβ−フィラミンコード配列を含む。１つの実施形態において、β−フィラミンコード配列は、選択的にスプライスされた形態のβ−フィラミンをコードする。選択的にスプライスされた形態のβ−フィラミンは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３５３６６６およびＡＦ３５３６６７ならびにｖａｎ ｄｅｒ Ｆｌｉｅｒらに記載される。
【０１１９】
本発明の別の実施形態は、腫瘍細胞および／またはβ−フィラミンに対する免疫応答を増加させる方法であって、この方法は、本発明の遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞を前立腺癌患者に投与して、患者に治療結果の改善をもたらす工程を包含する。本発明の別の実施形態は、腫瘍細胞および／またはβ−フィラミンに対する免疫応答を増加させる方法であって、この方法は、β−フィラミンの発現の増強を示す遺伝子改変されたサイトカイン発現細胞を前立腺癌患者に投与し、この投与後に、前立腺癌に対する患者の免疫応答が増加する工程を包含する。本発明のさらに別の実施形態は、腫瘍細胞およびβ−フィラミンに対する免疫応答を増加させる方法であって、この方法は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の発現の増強を示す遺伝子改変された細胞を前立腺癌患者に投与し、投与後に、β−フィラミンに対する哺乳動物の免疫応答が増加する工程を包含する。１つの実施形態において、増加した免疫応答は、体液性である。なお別の実施形態において、増加した免疫応答は、細胞性である。なおさらなる実施形態において、増加した免疫応答は、細胞性および体液性の両方である。本発明の好ましい局面において、遺伝子改変されたサイトカイン産生細胞の投与後に、前立腺癌細胞の増殖が阻害される。
【０１２０】
これらの細胞が、検出可能なレベルのβ−フィラミンを発現するか否か、および／または、β−フィラミンに対する免疫応答が、サイトカイン発現細胞ワクチンの投与後に変化したか否かを決定するアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ＦＡＣＳまたは電気化学発光（ＥＣＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
（癌ワクチンとして使用するための細胞の遺伝子改変）
本発明の方法および組成物は、特定のベクターシステムによって本明細書中に詳細に例示されるが、同じ方法および組成物が、遺伝子送達システムとは無関係に、前立腺癌の処置に有用であることが見出されることを、当業者は容易に理解する。
【０１２２】
本発明は、哺乳動物細胞へのＧＭ−ＣＳＦまたはβ−フィラミンのような導入遺伝子の導入のための任意のベクターの使用を企図する。例示的なベクターとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（その複製可能型、複製欠損型および弱い型（ｇｕｔｌｅｓｓ ｆｏｒｍ）を含む）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターおよび非ウイルス性プラスミドベクターのような、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。１つの好ましいアプローチにおいて、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスは、効率的に細胞に形質導入して、ウイルス自体のＤＮＡを宿主細胞に導入することができる。組換えウイルスベクターを作製する際に、非必須遺伝子は、異種（または非ネイティブの）タンパク質の遺伝子またはコード配列に置換される。
【０１２３】
ウイルスベクターを構築する際に、非必須遺伝子は、１つ以上の治療化合物または因子をコードする１つ以上の遺伝子に置換される。典型的には、ベクターは、複製開始点を含み、かつ、ベクターは、ベクターを同定および選択可能にする「マーカー」または「選択マーカー」機能をさらに含んでも、含まなくてもよい。任意の選択マーカーが使用され得るが、このような発現ベクターで用いる選択マーカーは、一般に当該分野で公知であり、適切な選択マーカーの選択は、宿主細胞に依存する。抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、メトトレキサート、テトラサイクリン、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．，Ｊ ＭｏＩ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．１９８２；１（４）：３２７−４１（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２−７（１９８０））、ピューロマイシン、ゼオマイシン、ハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、ＭｏＩ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５（２）：４１０−３（１９８５））またはＧ４１８が挙げられる。
【０１２４】
アデノウイルス遺伝子治療ベクターは、インビトロでの強力な発現、優れた力価、ならびにインビボでの分裂および非分裂細胞に形質導入する能力を示すことが知られている（Ｈｉｔｔら、Ａｄｖ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ５５：４７９−５０５（２０００））。これらのベクターは、インビボで用いられる場合、ベクター骨格に対して惹起される免疫応答により、強力であるが一過性の遺伝子発現を引き起こす。本発明で用いられる組換えＡｄベクターは、以下を含む：（１）複製欠損Ａｄビリオンへのベクターの組み込みを可能にするパッケージング部位；および（２）治療化合物コード配列。感染性ビリオンへの組み込みに必要であるか、または組み込みに役立つ他のエレメントとしては、５’および３’Ａｄ ＩＴＲ、Ｅ２およびＥ３遺伝子などが挙げられる。
【０１２５】
本発明の組換えＡｄベクターをカプセル化する複製欠損Ａｄビリオンは、Ａｄパッケージング細胞およびパッケージ技術を用いる当該分野で公知の標準技術によって作製される。これらの方法の例は、例えば、米国特許第５，８７２，００５号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。治療化合物をコードする遺伝子は、一般に、アデノウイルスのウイルスゲノムの欠失させたＥ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ３領域に挿入される。本発明の実施に用いられる好ましいアデノウイルスベクターは、１つ以上の野生型Ａｄ遺伝子産物（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）を発現しない。好ましい実施形態は、典型的に、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４および必要に応じてＥ３遺伝子領域の機能を補完するパッケージング細胞株とともに用いられるビリオンである。例えば、米国特許第５，８７２，００５号、同第５，９９４，１０６号、同第６，１３３，０２８号および同第６，１２７，１７５号を参照のこと。アデノウイルスベクターは、当該分野で公知の標準技術を用いて、精製および処方される。組換えＡＡＶベクターは、標的化細胞において選択された遺伝子組換え産物の発現および産生を行わせ得ることを特徴とする。従って、組換えベクターは、キャプシド形成に必須のＡＡＶの配列および標的細胞の感染のための物理的構造の少なくともすべてを含む。
【０１２６】
本発明の実施に用いられる組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンは、当業者に公知の標準的な方法論を用いて作製され得、かつ、これらのビリオンは、構成要素が転写の方向に作動可能に連結されるように、転写開始および終止配列を含む制御配列、ならびに治療化合物のコード配列またはその生物活性フラグメントを含むように構築される。これらの構成要素は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列によって５’および３’末端に結合される。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングを目的として機能することを意味する。従って、本発明のベクターで用いるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよく、あるいはＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のうちのいずれかに由来するものであってもよい。ＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターであり、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいＡＡＶベクターは、野生型ＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子の全部または一部を欠失しているが、機能的なフランキングＩＴＲ配列を保持している。表１は、遺伝子導入に用いる例示的なＡＡＶ血清型を示す。
【０１２７】
【表１】
典型的には、ＡＡＶ発現ベクターは、プロデューサー細胞内へ導入され、続いてＡＡＶヘルパー構築物の導入が行われるが、このヘルパー構築物は、プロデューサー細胞内で発現され得るＡＡＶコード領域を含み、ＡＡＶベクターに欠けているＡＡＶヘルパー機能を補完する。ヘルパー構築物は、米国特許第６，５４８，２８６号に記載されるように、典型的にはｐ５に続く開始コドンをＡＴＧからＡＣＧまで変異させることによって、大きなＲＥＰタンパク質（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）の発現をダウンレギュレートするように設計され得る。続いて、プロデューサー細胞内へのヘルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターの導入が行われるが、このヘルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターは、効率的なｒＡＡＶウイルス産生を支持し得る補助機能を提供する。次いで、このプロデューサー細胞は培養されて、ｒＡＡＶを産生する。これらの工程は、標準的な方法論を用いて実施される。本発明の組換えＡＡＶベクターをカプセル化する複製欠損ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶパッケージング細胞およびパッケージング技術を用いる当該分野で公知の標準技術によって作製される。これらの方法の例は、例えば、米国特許第５，４３６，１４６号；同第５，７５３，５００号、同第６，０４０，１８３号、同第６，０９３，５７０号および同第６，５４８，２８６号に見出され得る。ＡＡＶをパッケージングするためのさらなる組成物および方法は、Ｗａｎｇら（ＵＳ２００２／０１６８３４２）に記載され、当業者の知識の範囲内の技術を含む。
【０１２８】
ＡＡＶの多数の血清型が現在公知であるが、新しい血清型および既存の血清型の変種が今日依然として同定されており、本発明の範囲内であると考えられる。Ｇａｏら（２００２），ＰＮＡＳ ９９（１８）：１１８５４−６；Ｇａｏら（２００３），ＰＮＡＳ １００（１０）：６０８１−６；ＢｏｓｓｉｓおよびＣｈｉｏｒｉｎｉ（２００３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（１２）：６７９９−８１０）を参照のこと。特定の標的細胞の形質導入を最適化するために、または特定の標的組織（例えば、脳）内の特定の細胞型を標的化するために、種々のＡＡＶ血清型が用いられる。種々のＡＡＶ血清型の使用は、悪性組織の標的化を容易にし得る。ＡＡＶ血清型（１型、２型、４型、５型および６型を含む）は、脳組織に形質導入することが示されている。例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２０００），ＰＮＡＳ ９７（７）３４２８−３２；Ｐａｓｓｉｎｉら（２００３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７７（１２）：７０３４−４０）を参照のこと。特定のＡＡＶ血清型は、標的組織または細胞をより効率的に標的化し得、そして／あるいは標的組織または細胞内で複製し得る。単一の自己相補的ＡＡＶベクターは、形質導入効率を増加させ、その結果、導入遺伝子発現のより速い開始をもたらすために、本発明の実施に用いられ得る（ＭｃＣａｒｔｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１年８月；８（１６）：１２４８−５４）。
【０１２９】
本発明の実施において、ｒＡＡＶビリオンを産生するための宿主細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、微生物および酵母が挙げられる。宿主細胞はまた、ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子が宿主細胞内に安定して維持されるパッケージング細胞であってもよく、あるいは宿主細胞は、ＡＡＶベクターゲノムが安定して維持されるプロデューサー細胞であってもよい。例示的なパッケージング細胞およびプロデューサー細胞は、２９３細胞、Ａ５４９細胞またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、当該分野で公知の標準技術を用いて精製および処方される。
【０１３０】
レトロウイルスベクターは、遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０）。レトロウイルスベクター、およびより詳細にはレンチウイルスベクターは、本発明を実施するのに用いられ得る。レトロウイルスベクターは、試験されて、広範な標的細胞のゲノムＤＮＡへ種々の目的の遺伝子を安定して導入するのに適した送達ビヒクルであることが見出されている。再配列されていない単一コピー導入遺伝子を細胞内に送達するレトロウイルスベクターの能力により、レトロウイルスベクターは、遺伝子を細胞内に移すのに十分に適したものになっている。さらに、レトロウイルスは、宿主細胞上の特定細胞表面レセプターへのレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質の結合によって、宿主細胞に入る。従って、コードされたネイティブのエンベロープタンパク質が、このネイティブのエンベロープタンパク質とは異なる細胞特異性を有する（例えば、ネイティブのエンベロープタンパク質と比較して異なる細胞表面レセプターに結合する）異種エンベロープタンパク質で置換された、シュードタイプレトロウイルスベクターも、本発明の実施に有用であることが見出され得る。特定の型の標的細胞に対して導入遺伝子をコードするレトロウイルスベクターの送達を行う能力は、遺伝子治療用途に非常に望ましい。
【０１３１】
本発明は、例えば、１つ以上の導入遺伝子配列を含むレトロウイルストランスファーベクターおよび１つ以上のパッケージングエレメントを含むレトロウイルスパッケージングベクターを含む、レトロウイルスベクターを提供する。特に、本発明は、シュードタイプレトロウイルスを産生するために、異種のエンベロープタンパク質かまたは機能的に改変されたエンベロープタンパク質をコードする、シュードタイプレトロウイルスベクターを提供する。
【０１３２】
本発明のレトロウイルスベクターのコア配列は、例えば、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型レトロウイルス、ならびにスプマウイルスおよびレンチウイルスを含む、多種多様なレトロウイルスから容易に得られ得る（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８５を参照のこと）。本発明の組成物および方法に用いるのに適したレトロウイルスの例としては、レンチウイルスが挙げられるが、これに限定されない。本発明の組成物および方法に用いるのに適した他のレトロウイルスとしては、ニワトリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス誘導ウイルス（Ｍｉｎｋ−Ｃｅｌｌ Ｆｏｃｕｓ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ）、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９：１９−２５，１９７６）、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、Ｇｒａｆｆｉ、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、Ｋｉｒｓｔｅｎ、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルスおよびＲａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）、ならびにモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）が挙げられる。このようなレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）のような保管所またはコレクションから容易に得られるか、または一般に利用可能な技術を用いて既知の供給源から単離され得る。
【０１３３】
好ましくは、本発明のレトロウイルスベクター配列は、レンチウイルスに由来する。好ましいレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、１型または２型（すなわち、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２であり、ＨＩＶ−１は、以前はリンパ節症関連ウイルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれていた）、あるいは、同定されており、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患に関連する、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に関連する別のウイルスである。他のレンチウイルスベクターとしては、ヒツジビスナ／マエディウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられる。
【０１３４】
本組成物および方法に用いるのに適したレトロウイルスの種々の属および系統は、当該分野で周知である（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６）を参照、例えば、第５８章、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１７６８−１７７１頁（表１を含む）を参照（本明細書中に参考として援用される））。
【０１３５】
本発明は、レトロウイルスを産生するプロデューサー細胞およびプロデューサー細胞株を作製するためのレトロウイルスパッケージングシステム、ならびにこのようなパッケージングシステムを作製する方法を提供する。従って、本発明はまた、このようなパッケージングシステム内にレトロウイルストランスファーベクターを導入することによって（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）作製されるプロデューサー細胞および細胞株、ならびにこのようなパッケージング細胞および細胞株を作製する方法も提供する。
【０１３６】
本発明の実施に用いられるレトロウイルスパッケージングシステムは、以下の少なくとも２つのパッケージングベクターを含む：ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、またはｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列を含む、第１のパッケージングベクター；ならびに異種のエンベロープ遺伝子かまたは機能的に改変されたエンベロープ遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列を含む、第２のパッケージングベクター。好ましい実施形態において、レトロウイルスエレメントは、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）に由来する。好ましくは、ベクターは、機能的なｔａｔ遺伝子および／または機能的なアクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｎｅｆ）を欠く。別の好ましい実施形態において、このシステムは、ｒｅｖ遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む、第３のパッケージングベクターをさらに含む。このパッケージングシステムは、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および必要に応じて第３のヌクレオチド配列を含むパッケージング細胞の形態で提供され得る。
【０１３７】
本発明は、種々のレトロウイルスのシステムに適用可能であり、レトロウイルスの異なる群間で共有される共通のエレメントを当業者は認識する。本明細書中での記載は、代表的な例としてレンチウイルスのシステムを用いる。しかし、すべてのレトロウイルスは、表面突起で包まれたビリオンの特徴を共有し、１分子の直鎖状のポジティブセンス一本鎖ＲＮＡ、ダイマーからなるゲノム、ならびに共通のタンパク質であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。
【０１３８】
レンチウイルスは、エンベロープ糖タンパク質ＳＵ（ｇｐｌ２０）およびＴＭ（ｇｐ４１）（これらは、ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）；ＣＡ（ｐ２４）、ＭＡ（ｐ１７）およびＮＣ（ｐ７−１１）（これらは、ｇａｇ遺伝子によってコードされる）；ならびにｐｏｌ遺伝子によってコードされるＲＴ、ＰＲおよびＩＮを含む、いくつかの構造ビリオンタンパク質を共有する。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２は、ウイルスＲＮＡの合成およびプロセシングならびに他の複製機能の調節に関与する、アクセサリータンパク質および他のタンパク質を含む。ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ／ｖｐｘ、およびｎｅｆ遺伝子によってコードされるアクセサリータンパク質は、組換えシステムから削除（または不活性化）され得る。さらに、ｔａｔおよびｒｅｖは、例えば変異または欠失によって、削除または不活性化され得る。
【０１３９】
第１世代のレンチウイルスベクターパッケージングシステムは、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖごとに別個のパッケージング構築物を提供し、そして典型的には、安全上の理由で、異種のエンベロープタンパク質かまたは機能的に改変されたエンベロープタンパク質を用いる。第２世代のレンチウイルスベクターシステムでは、アクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆ）が削除されるかまたは不活性化される。第３世代のレンチウイルスベクターシステムは、ｔａｔ遺伝子が削除されたかさもなければ不活性化されたものである（例えば、変異によって）。
【０１４０】
ｔａｔによって通常提供される転写の調節に対する補償は、強力な構成的プロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス前初期（ＨＣＭＶ−ＩＥ）エンハンサー／プロモーター）の使用によって提供され得る。他のプロモーター／エンハンサーは、当該分野で理解されるように、構成的プロモーター活性の強さ、標的組織に対する特異性（例えば、肝臓特異的プロモーター）、または発現の所望の制御に関連する他の因子に基づいて選択され得る。例えば、いくつかの実施形態において、制御された発現を達成するために、ｔｅｔのような誘導性プロモーターを使用することが望ましい。Ｒｅｖをコードする遺伝子は、好ましくは別個の発現構築物上に提供され、その結果、典型的な第３世代レンチウイルスベクターシステムは、以下の４つのプラスミドを含む：ｇａｇｐｏｌのプラスミド、ｒｅｖのプラスミド、エンベロープのプラスミドおよびトランスファーベクターのプラスミド。使用されたパッケージングシステムの世代にかかわらず、ｇａｇおよびｐｏｌは、単一の構築物上かまたは別個の構築物上に提供され得る。
【０１４１】
典型的には、パッケージングベクターは、パッケージング細胞内に含まれており、トランスフェクション、形質導入または感染によってこの細胞内に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染の方法は、当業者に周知である。本発明のレトロウイルストランスファーベクターは、トランスフェクション、形質導入または感染によってパッケージング細胞株へ導入されて、プロデューサー細胞または細胞株を作製し得る。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む標準方法によって、ヒト細胞または細胞株へ導入され得る。いくつかの実施形態において、パッケージングベクターは、優性選択マーカー（例えば、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎ合成酵素またはＡＤＡ）とともに細胞へ導入され、続いて、適切な薬剤の存在下での選択およびクローンの単離が行われる。選択マーカー遺伝子は、パッケージングベクターによってコードされる遺伝子に物理的に連結され得る。
【０１４２】
パッケージング機能が適切なパッケージング細胞によって発現されるように構成されている、安定な細胞株が公知である。例えば、米国特許第５，６８６，２７９号；およびＯｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）９３：１１４００−１１４０６（これらは、パッケージング細胞について記載する）を参照のこと。安定な細胞株の作製のさらなる記載は、Ｄｕｌｌら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１１）：８４６３−８４７１；およびＺｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１２）：９８７３−９８８０；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：８７１−８７５に見出され得、これらは、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含むｐｏｌの３’配列が削除されているレンチウイルスパッケージングプラスミドを教示する。この構築物は、ｔａｔおよびｒｅｖ配列を含み、３’ＬＴＲがポリＡ配列で置換されている。５’ＬＴＲおよびｐｓｉ配列は、別のプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）で置換されている。例えば、ＣＭＶプロモーターまたはその誘導体が用いられ得る。
【０１４３】
目的のパッケージングベクターは、レンチウイルスタンパク質発現を増強し、かつ、安全性を高めるために、パッケージング機能にさらなる変更を含み得る。例えば、ｇａｇの上流のＨＩＶ配列はすべて除去され得る。また、エンベロープの下流の配列も、除去され得る。さらに、ベクターを改変する工程を行って、ＲＮＡのスプライシングおよび翻訳を増強し得る。
【０１４４】
必要に応じて、Ｄｕｌｌら（１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１１）：８４６３−８４７１）に記載されるように、条件付きパッケージングシステムが用いられる。また、例えばＺｕｆｆｅｒｅｙら（１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１２）：９８７３−９８８０）に記載されるように、ＨＩＶ−１末端反復配列（ＬＴＲ）の欠失によってベクターのバイオセイフティーを改善する、自己不活性化ベクター（ＳＩＮ）の使用も好ましい。誘導性ベクターも用いられ得る（例えば、ｔｅｔ誘導性ＬＴＲによる）。
【０１４５】
（調節エレメント）
本発明の遺伝子治療ベクターは、典型的には、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、腫瘍選択的プロモーターおよびエンハンサーが挙げられるがこれらに限定されない、異種の制御配列を含み、これらとしては、Ｅ２Ｆプロモーターおよびテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａ Ｈ．ら１９９１．Ｇｅｎｅ １０８（２）：１９３−９）；伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１−αプロモーター）（Ｋｉｍ ＤＷら、１９９０．Ｇｅｎｅ．９１（２）：２１７−２３およびＧｕｏ ＺＳら１９９６．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（９）：８０２−１０）；グリア特異的プロモーター（例えば、グリア細胞繊維性酸性タンパク質プロモーター）およびニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターまたはシナプシンプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
いくつかの場合において、構成的プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＣＡＧプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）またはＳＶ−４０プロモーター）が使用され得る。本発明の遺伝子治療ベクターはまた、シグナルペプチドのエンハンサーおよびコード配列も含み得る。ベクター構築物は、イントロンを含んでも含まなくてもよい。従って、本発明の遺伝子治療ベクターが、多数の導入遺伝子、導入遺伝子の組み合わせ、および導入遺伝子／調節エレメントの組み合わせのうちのいずれかを含み得ることが理解される。
【０１４７】
（本発明の方法および組成物）
本発明は、単独で用いられても従来の治療法と組み合わせて用いられてもよい、前立腺癌の処置に対する代替アプローチを提供する。
【０１４８】
本発明の１つの実施形態は、遺伝子改変された細胞（代表的には、前立腺癌患者への投与後にβ−フィラミンタンパク質に対する免疫応答の増強が検出される、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインを発現する細胞）から構成される癌ワクチンである。さらなる実施形態において、細胞は、哺乳動物の腫瘍細胞と同じ型である。一般に、癌ワクチンは、遺伝子改変された腫瘍細胞から構成されるが、非腫瘍性前立腺細胞もまた、本発明の実施に有用であることが見出されている。これらの細胞は、インビトロで増殖および維持される樹立細胞株であってもよい。本発明の実施に用いられる樹立腫瘍細胞株としては、ＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４３５）、ＨｅＩａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）、ＬＮＣａＰ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７４０）、Ｈ１５７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−５８０２）、またはＨ１３５９細胞が挙げられるが、これらに限定されない。１つのアプローチにおいて、遺伝子改変された細胞は、被験体から単離された腫瘍細胞に由来し、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の発現の増強を引き起こすベクターで形質導入される。次いで、遺伝子改変された細胞は、癌ワクチンの一部として、もとの同じ被験体かまたは異なる被験体に投与され得る。細胞の子孫が、親細胞と完全には同一でなくてもよい（形態学的に、遺伝子型的に、または表現型的に、のいずれかで）ことが理解される。さらに、細胞は、未選択の細胞の集団または特定の細胞のクローンのいずれかであり得る。例えば、細胞は、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインまたはβ−フィラミンのような抗原の高い発現レベルについてスクリーニングされ得るか、あるいは遺伝子改変され得る。これらの細胞は、典型的にはヒト細胞であり、そして一般に、被験体に投与される前に凍結保存された細胞である。典型的には、これらの細胞は、増殖不能である。１つの実施形態において、細胞は、エキソビボ培養で樹立された原発前立腺腫瘍の子孫である。
【０１４９】
前立腺癌の重症度は、種々の系に基づき、その１つは以下に例示する疾患の病期分類である：
病期１：癌は非常に小さく、完全に前立腺の内部であり、直腸診を行った場合、正常に感じられる。
【０１５０】
病期２：癌は依然として前立腺の内部であるが、より大きく、直腸診を行った場合、しこりまたは硬い領域が感じられる場合がある。
【０１５１】
病期３：癌は前立腺の被膜を通り抜けて、膀胱頸または精嚢内に成長している場合がある。
【０１５２】
病期４：癌は体の別の部分に転移し、前立腺癌が転移する最も一般的な部位は骨である。他の臓器に転移することはめったにない。
【０１５３】
前立腺癌疾患の重症度を評価するために適用される別の基準は、グリーソンスコア（等級を表す別の方法）である。生検が行われると、癌細胞を示す各領域が、細胞の外観に従い、重症度が最も低いかまたは最も正常に見える場合を１とし、重症度が最も高いかまたは最も正常には見えない場合を５として、１〜５段階で評価される。グリーソンスコアは、重症度が最も高い細胞を含む２つの領域の平均に基づいて作成され、これらのスコアを合計してグリーソンスコアを得る。
【０１５４】
グレード／グリーソンは、単に、いかに前立腺癌が進行し、かつ／または処置に応答するかの見解を医師に与えるにすぎない。
【０１５５】
本発明によるサイトカイン発現細胞ワクチンを含む薬学的組成物は、被験体における前立腺癌を処置するための他の治療に続いて、他の治療に先行して、他の治療の代わりに、または他の治療と組み合わせて、前立腺癌の任意の段階で患者を処置するのに用いられ得る。例えば、被験体は、以下にさらに記載されるように、化学療法、外照射放射線療法、および他の形態の免疫療法／細胞療法によって、予めまたは同時に処置され得る。
【０１５６】
前立腺癌の処置レジメンは、外科手術（すなわち、前立腺全摘出術）；放射線療法（すなわち、外照射または近接照射療法）；例えば「アンドロゲン除去」（例えば、抗アンドロゲンの投与）のようなホルモン療法；および化学療法の１つ以上を含むがこれらに限定されない、ある範囲の治療選択肢を含み、かつ変動する。
【０１５７】
前立腺癌の処置において最もよく用いられる抗アンドロゲンとしては、前立腺癌を処置するのに用いられる注射可能な合成ホルモンである、ロイプロリドが挙げられるが、これに限定されない。ロイプロリド（リュプロン）は、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログであり、進行した前立腺癌の処置に使用され得る。ロイプロリドは、ゴセレリン（ゾラデックス（登録商標））およびカソデックス（ビカルタミド）の一方または両方と組み合わせて用いられ得る。ゴセレリン（ゾラデックス（登録商標））は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）（性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストアナログとしても公知）の合成デカペプチドアナログを含む。カソデックス（ビカルタミド）は、活性成分ビカルタミドを含む経口非ステロイド性抗アンドロゲンである。カソデックス（ビカルタミド）は、テストステロンのような男性ホルモンの作用をブロックすることによって作用する。
【０１５８】
フルタミドもまた、進行した前立腺癌の処置に使用され得る。フルタミドは、テストステロンが前立腺のアンドロゲンレセプターに結合するのを阻止することによって作用する。フルタミドはまた、視床下部と呼ばれる脳の領域にも作用し、体内で産生されるテストステロンの量を最終的に減少させる。前立腺癌の処置において、フルタミドは、しばしばＬＨＲＨアナログと組み合わせて用いられる。ＬＨＲＨアナログは、前立腺癌の標準的な処置の１つであり、ブセレリン、ゴセレリン、リュープロレリンおよびトリプトレリンなどの医薬が挙げられる。
【０１５９】
前立腺癌の処置に用いられる別の薬物は、アンドロゲンレセプターに対して親和性を有する（しかし、プロゲストゲンレセプター、エストロゲンレセプター、またはグルココルチコイドレセプターに対しては有さない）、非ステロイド性抗アンドロゲンのニルタミド（アナンドロン（登録商標））である。
【０１６０】
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙの第３８回年次大会およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ＡＳＣＯ）の第４０回年次大会で示された結果によると、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）、エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））およびプレドニゾンを含む処置レジメンは、ホルモン抵抗性前立腺癌（ＨＲＰＣ）の処置においてかなり有効であった。
【０１６１】
本発明によるサイトカイン発現細胞ワクチンを含む薬学的組成物は、現在使用されている任意の前立腺癌治療（そのいくつかの例は、上に記載される）に続いて、または現在使用されている任意の前立腺癌治療と組み合わせて、前立腺癌患者に投与されてもよい。
【０１６２】
被検体における前立腺癌をモニタリングする代表的な手段は、当該分野で一般に公知のように、抗原に対する免疫応答（この抗原に対する免疫応答の増強は、本発明によるサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）発現細胞ワクチンの投与後に検出される）の評価と組み合わせて実施される。患者は、腫瘍重量、腫瘍体積、腫瘍細胞の数または腫瘍の成長速度の評価のような多数の方法のいずれかをモニターされ得る。評価され得るパラメータとしては、接近可能な腫瘍の直接測定、腫瘍細胞（例えば、血中の）の計数、腫瘍抗原（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）など）の測定、種々の可視化技術（例えば、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャンおよびＸ線）、骨密度の決定、または骨転移の評価が挙げられるが、これらに限定されない。これらの分析から得られた情報は、個体の応答を最適化し、かつ前立腺癌に関する治療結果の改善をもたらすために、細胞ワクチンの投与の用量またはスケジュールを調整するのに有用である。所望の作用が得られるまで、典型的には隔週の頻度で、さらなる用量が必要に応じて投与され得る。その後、さらなる追加免疫用量または維持量が、必要に応じて投与されてもよい。典型的な処置レジメンにおいて、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）発現細胞ワクチンは、腕、脚または腹部の皮膚に皮内注射（皮膚の下に直接針が配置される）で投与される。
【０１６３】
本発明の１つの局面は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）発現細胞ワクチンの最初の投与前に、および処置の開始後の種々の時点で、前立腺癌患者から血清サンプルを得ることによってβ−フィラミンに対する免疫応答を検出するためのアッセイを含む。次いで、各時点でのβ−フィラミンに結合する抗体の量が比較される。サンプル中の抗β−フィラミン抗体の量を定量する任意のアッセイが、β−フィラミンに結合する抗体について血清を分析するのに用いられ得る。β−フィラミンに結合する抗体についての血清の分析に用いられ得るアッセイの例としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ＦＡＣＳまたは電気化学発光（ＥＣＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、ウエスタンブロットは、β−フィラミン抗原の供給源として、ＰＣ−３細胞の細胞溶解物を用いる。
【０１６４】
本発明の実施において、β−フィラミンに対する細胞性免疫応答は、抗原特異的細胞アッセイ、増殖アッセイ、細胞溶解性細胞アッセイ、および組換え腫瘍関連抗原または免疫原性フラグメントまたは抗原由来のペプチドを用いたインビボ遅延型過敏性試験を用いて、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）発現細胞ワクチンの最初の投与前に、および処置の開始後の種々の時点で、患者において評価され得る。免疫応答の増加を測定するためのさらなる方法としては、遅延型過敏性試験、ペプチド主要組織適合遺伝子複合体テトラマーを用いたフローサイトメトリー、リンパ球増殖アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法、酵素結合免疫スポット検定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ａｓｓａｙ）、サイトカインフローサイトメトリー、直接細胞毒性アッセイ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によるサイトカインｍＲＮＡの測定、および限界希釈法のような、Ｔ細胞応答を測定するのに現在用いられているアッセイが挙げられる。例えば、Ｌｙｅｒｌｙ ＨＫ，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００３年６月；３０（３補遺８）：９−１６を参照のこと。
【０１６５】
本発明を以下の実施例を参照することにより説明するが、これらの実施例は、例示の目的で挙げられるものであり、本発明を限定することを何ら意図するものではない。当該分野で周知の標準技術または以下に具体的に記載される技術が利用される。
【０１６６】
本発明の方法および組成物は、種々の実施形態（その少数のみが本明細書中に開示される）の形態で組み込まれ得ることが理解される。他の実施形態が存在し、本発明の趣旨から逸脱しないことが、当業者には明らかである。従って、記載された実施形態は例示的なものであって、限定的なものとして解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１６７】
実施例１：ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンの調製のための組換えウイルスベクターの作製
サイトカインをコードする以下のウイルスベクターを、腫瘍細胞株中かまたは切除されたヒト腫瘍から得られた原発腫瘍細胞中への導入のために構築した。
（１）レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターの構築には、当該分野で十分に理解されている標準的な連結技術および制限技術を使用する。目的のサイトカインをコードする遺伝子（単数または複数）を含む種々のレトロウイルスベクターを用いた。ＭＦＧベクターは、米国特許第６，５４４，７７１号および同第５，６３７，４８３号に記載される。これらはまた、特にサイトカインをコードする遺伝子の組み込みおよび発現に関して以下に記載される。さらに、数種のＭＦＧベクターがＡＴＣＣに寄託されている：未改変のＭＦＧベクターは、ＡＴＣＣ受諾番号６８７５４として寄託され；第ＶＩＩＩ因子が挿入されたＭＦＧベクターは、ＡＴＣＣ受諾番号６８７２６として寄託され；そしてｔＰＡが挿入されたＭＦＧベクターは、ＡＴＣＣ受諾番号６８７２７として寄託された。ＭＦＧベクターは、ｐＥｍベクターと類似している（以下に記載され、かつ米国特許第６，５４４，７７１号および同第５，６３７，４８３号に記載される）が、パッケージング細胞株における組換えゲノムのキャプシド形成を増加させるために、ＭｏＭｕＬＶの１０３８塩基対のｇａｇ配列を含み、かつ、スプライスアクセプター配列を含むＭＯＶ−９に由来する３５０塩基対を含む。Ｎｃｏ Ｉ部位およびＢａｍ ＨＩ部位を含む１８塩基対のオリゴヌクレオチドは、ＭＯＶ−９配列に直接続き、適合する部位での遺伝子の簡便な挿入を可能にする。この遺伝子のコード領域を、Ｎｃｏ Ｉ部位およびＢａｍ ＨＩ部位でＭＦＧベクターの骨格に導入した。ＡＴＧ開始メチオニンコドンをＮｃｏ Ｉ部位にインフレームでサブクローン化し、かつ、生成物を不安定にすることと、あいまいな部位を導入することを避けるために、終止コドンより後にはわずかな（たとえあったとしても）配列も含まなかった。結果として、インサートのＡＴＧは、ベクター中の野生型ウイルスＡＴＧが存在する部位に存在した。従って、スプライスは、モロニーマウス白血病ウイルスで生じるスプライスと本質的に同じであり、ウイルスは非常に良好に機能した。ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲは転写を制御し、そして得られたｍＲＮＡは、ネイティブのｇａｇ転写産物の真正の５’非翻訳領域（その後に、挿入された遺伝子のオープンリーディングフレームが直接続く）を含む。このベクターにおいて、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）末端反復配列を用いて、全長ウイルスＲＮＡ（ウイルス粒子中へのキャプシド形成のため）、および挿入された配列の発現を担うサブゲノムｍＲＮＡ（Ｍｏ−ＭｕＬＶ ｅｎｖ ｍＲＮＡと類似している）の両方を産生させた。このウイルスｇａｇ領域に両方の配列を保持するベクターは、ｅｎｖ ｍＲＮＡの産生に必要な正常な５’および３’スプライス部位ならびにウイルスＲＮＡのキャプシド形成の改善を示した。すべてのオリゴヌクレオチド結合を、ジデオキシ終止法およびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いて配列決定した。このウイルスは、優性選択マーカーを含まない（必要に応じて挿入され得るが）という点でマーカーフリーであり、かつ、ベクターの構造に固有の高レベルの形質導入効率および発現を示し、ＭＦＧ誘導体での形質導入は、一般に選択工程を含まないかまたは必要としない。
【０１６８】
以下のタンパク質の遺伝子を含むＭＦＧベクターを構築した：マウスＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、γ−ＩＦＮ、ＩＬ−６、ＩＣＡＭ、ＣＤ２、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１−ＲＡ（インターロイキン−１−レセプターアンタゴニスト）。さらに、公的に利用可能な配列情報を用いて、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２をコードするヒト配列を構築した。ＭＦＧへサブクローン化された正確なｃＤＮＡ配列は、以下のとおりであった：マウスＩＬ−２塩基対４９−５６４；マウスＩＬ−４塩基対５６−４７９；マウスＩＬ−５塩基対４４−４６２；マウスＧＭ−ＣＳＦ（２９）塩基対７０−５６１；マウスＩＣＡＭ−１塩基対３０−１６５７；マウスＣＤ２塩基対４８−１０７９；マウスＩＬ−１レセプターアンタゴニスト塩基対１６−５６３；ヒトＴＮＦ−α塩基対８６−７８８。
（２）アデノウイルスベクター
ヒトＧＭ−ＣＳＦのコード配列の細胞への導入のためのアデノウイルスベクター（ヒトＧＭ−ＣＳＦ；ＡＶ−ＧＭ−ＣＳＦ）は、アデノウイルス５型のＥ１遺伝子で置換され、ウイルスゲノムのＥ３領域をさらに欠失しているＧＭ−ＣＳＦ発現カセットを含む。Ａｄ５の完全なＧｅｎＢａｎｋ配列（登録番号Ｍ７３２６０）によれば、欠失はＥ１領域の４５５〜３３２７である。番号付けは、左側逆方向末端反復の第一塩基から始まる。
【０１６９】
アデノウイルスベクターの構築には、当該分野で十分に理解されている標準的な連結技術および制限技術を使用する。野生型３００（Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇより）（０〜２７３３０）とｄｌ３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら（１９８２）Ｃｅｌｌ ３１：５４３−５５１）（２１５６１〜右端）との間の重複組換えによって、Ｅ３欠失を導入した。ＣＲＥ８細胞におけるｐＡｄｌｏｘ ＭＣ ｈＧＭとＥ３欠失アデノウイルスとの間のｃｒｅ／ｌｏｘ媒介組換えによって、ＧＭ−ＣＳＦ発現カセットをＥ１領域に組み込んだ（Ｈａｒｄｙら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１８４２−１９４９）。ｐＡｄｌｏｘ ＭＤ ｈＧＭは、ｐＡｄｌｏｘ（Ｈａｒｄｙら（１９９７）およびｐＭＤ．Ｇ（Ｎａｌｄｉｎｉら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７）から誘導され、以下の配列を含む：Ａｄ５に由来する０〜４５５、ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＩＬ−２（Ｃｕｌｌｅｎ（１９８６）Ｃｅｌｌ ４６：９７３−９８２）に由来するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター／エンハンサー（ヌクレオチド位置−６７０〜＋７２、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３９２２）、ヒトβグロビンエキソン２の小領域および短縮された第２介在配列（ＩＶＳ２）（ヌクレオチド位置６２６１３〜６２７２０＋６３０８８〜６３５３２、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ００１７９）、ヒトβグロビンに由来するエキソン３およびポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド位置６３５３２〜６４２９７）、エキソン３（位置６３５３０）に挿入されたＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ、ＳＶ４０に由来する第２ポリアデニル化部位（位置２６８１〜２５３４）、（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０２４００）およびｌｏｘＰ部位に続いてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに由来する細菌の配列。ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡは、プラスミドから得た（ＤＮＡＸ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞における機能的発現によりコンカナバリンＡ活性化ヒトＴ細胞クローンから調製されたｃＤＮＡライブラリーから単離した。このｃＤＮＡ（遺伝子の全配列を含む）の単離および特徴づけは、科学文献に報告されている。（Ｌｅｅら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：４３６０−４３６４）。クローンの同一性は、受け取った際に制限エンドヌクレアーゼ消化によって確認した。ＭＤ発現カセットは、ＩＶＳ２の下流に導入遺伝子の挿入のためのＰｍｌＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識部位を含むように、ＰＣＲによって改変した。ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを、ｐＭＦＧ−Ｓ ｈＧＭ（Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９７）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１１１−１２３）からＰｍｌＩおよびＢａｍＨＩを用いて除去し、ＭＤカセットのＰｍｌＩおよびＢｇｌＩＩ部位に挿入した。アデノウイルス（Ａｄ ＧＭウイルス）に組み込まれたｐＡｄｌｏｘ ＭＤ ｈＧＭプラスミドの領域を、両鎖について配列決定した。初期のウイルス構築物の正確な構造は、感染ＨｅＬａ細胞からのＧＭ−ＣＳＦ産物の制限分析およびＥＬＩＳＡ試験によって確認した。次いで、組換えウイルスを２回のプラーク精製に供した。プラークからの組換えウイルスを制限酵素マッピングし、２９３細胞（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓからの保証された細胞）内での増殖による２回の継代を行って、研究用ウイルスストックを作製した。ウイルス中のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の配列を、研究用ウイルスストックから調製したウイルスＤＮＡの直接配列決定によって決定した。最終的に、研究用ウイルスストックからの組換えウイルスを、マイコプラズマおよび無菌性について試験し、陰性であるとわかった場合、マスターウイルスストックとして細胞を感染させるために用いた。
【０１７０】
実施例２：自己の前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験
９人の患者が、自己前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験に参加した。各患者は、測定可能な転移性疾患の所見またはホルモン療法歴がなく、かつ、処置の開始時に少なくとも１．０ｎｇ／ｍｌよりも高いベースラインＰＳＡを有する、２回の連続的なＰＳＡレベルの異常上昇によって規定されるような、外科手術後に進行性の微小転移性前立腺癌を有する１８歳以上であった。患者は、外科手術とともに適切な併用薬を受けた。疾患の病理学的診断および病期分類は、外科手術の間に終えた。
【０１７１】
切除した腫瘍の一部を初代培養で増殖させ、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を有するＭＦＧウイルスベクターで形質導入し、照射して細胞を増殖不能にし、そして自己ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンを調製するために使用されるまで液体窒素中で保存した。外科手術の約６０日後に、ワクチンは臨床施設で使用可能であった。各ワクチン接種について、細胞を０．９％塩化ナトリウム溶液中または２．５％ヒト血清アルブミンを含む０．９％塩化ナトリウム溶液中で融解、洗浄、および再懸濁することによって、ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンを注射用に調製および処方した。
【０１７２】
外科手術の約６０日後に、ワクチン接種前来診では、ベースライン値を得、かつ自己の非形質導入細胞の最初のＤＴＨ評価を開始する予定であった。血清を採取し、そしてＰＳＡのレベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ワクチン接種前来診の２日後に、各患者は、各１４日間の３回のワクチン接種サイクルが予定された。３回のワクチン接種の後、累積的毒性が認められず、かつ、十分なワクチン細胞が残存した場合、この患者は、最大３回までの追加接種（計６回のワクチン接種）を受ける適格者であった。
【０１７３】
ワクチン接種部位の間隔および位置を、以下の表２に示す。各用量を、外来患者方式で患者に投与した後、退院前に外来診療部門で臨床観察を行った。
【０１７４】
【表２】
注射剤は、グリッドパターンにしたがって患者の肢に皮内投与した。各注射は、隣接する注射から針侵入位置で少なくとも５ｃｍである。用量レベル１については、注射剤を１本の肢に、連続サイクルごとに異なる肢を用いて、３人の患者に投与した。用量レベル２については、注射剤を６人の患者に、連続サイクルごとに２本の異なる肢を用い、所定のサイクルで２本の肢に等分して投与した。最初のワクチン接種を０日目に行い、続いて１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、および７０日目に行った。局所毒性および全身毒性、ならびに抗腫瘍免疫応答の誘導の評価を続いて行った。自己免疫の徴候も評価した。
【０１７５】
ＮＣＩ ＣＴＣ用量制限毒性は、計４１回の十分に評価可能なワクチン接種を受けた、８人のワクチン接種患者間で観察されなかった。皮内部位の生検は、有効性の前臨床モデルにおいて観察されたのと類似の、マクロファージ、樹状細胞、好酸球およびＴ細胞で構成される特有の炎症性浸潤を示した。１００％の患者が、形質導入されていない自己のＰＣＡ標的細胞に対するＤＴＨ反応性を示した。外科手術前の血清ＰＳＡの中央値は２８．８５（６．７〜７．５の範囲）であり、最初のワクチン接種時のＰＳＡレベルの中央値は０．６５（０．１〜３０．４の範囲）であった。高感度の血清ＰＳＡによると、８人中６人の患者が、外科手術後およびワクチン接種後に進行した：平均Ｆ／Ｕ２４か月。この研究は、インビボでＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を形質導入したＰＣＡワクチンの実現可能性、外来患者安全性、および生物活性を実証している。
【０１７６】
実施例３：同種異系の前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験
３０人の患者が、第２の自己前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験に参加した。各患者は、測定可能な転移性疾患の疾患またはホルモン療法歴がなく、かつ、処置の開始時に少なくとも１．０ｎｇ／ｍｌよりも高いベースラインＰＳＡを有する、２回の連続的なＰＳＡレベルの異常上昇によって規定されるような、外科手術後に進行性の微小転移性前立腺癌を有する１８歳以上であった。同種異系の前立腺癌細胞株ワクチンは、２４時間で１０６細胞当たり１４８〜６３９ｎｇのＧＭ−ＣＳＦを分泌するように遺伝子改変された、等しい細胞用量の２種の同種異系前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３）で構成される。あるいは、ワクチンは、２４時間で１０６細胞当たり２００〜３００ｎｇのＧＭ−ＣＳＦを分泌するように遺伝子改変された、３種の異なる照射済み自己前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３およびＤＵ１４５）の混合物で構成される。ワクチンの各バイアルは、グリセロールおよびヒト血清アルブミン中の直接注射可能物質として調製される。各細胞株ワクチン接種の用量を、下の表３に示す。
【０１７７】
【表３】
所定のワクチン接種日に、総細胞数１．２×１０８細胞（１つの細胞株当たり６×１０７細胞）を、各１．０ｃｃの４回の皮内注射（１つの細胞株当たり２回の注射）で、患者に投与した。各注射は皮内注射であった。０日目以降のワクチン接種日には、注射部位を交代した。１．２×１０８細胞の全量を、４回の注射に分けて、毎週１回、８週間投与している。
【０１７８】
処置サイクルの間、ワクチン接種に対する局所的全身性反応の評価を、ワクチン接種日に行った（１、２、３、４、５、６、７および８週目）。１回目のワクチン接種から始めて、
ＰＳＡ測定値を４ヶ月間、毎月決定し、次いで第２部の研究においては、２年間、４ヶ月ごとに決定した。臨床的に必要であれば、ＰＳＡレベルを４ヶ月ごとよりも頻繁に評価した。ＰＣＲ試験用の血液サンプルは、１回目のワクチン接種の前に採取した。第１部の最後の来診は、最後のワクチン接種（８週目）の２週間後に行った。少なくとも１回のワクチン接種を受けた登録患者は、ＰＳＡチェックのために長期追跡調査評価に参加した。患者は、患者が死亡するかまたは同種異系前立腺癌細胞株ワクチンがＦＤＡに認可されるまで、健康診断およびその後の臨床評価を年１回か、あるいは臨床的に必要であればより頻繁に受けた。
【０１７９】
実施例４：前立腺腫瘍関連抗原の同定
Ａ．血清の調製
研究に用いた血清は、自己のまたは同種異系の前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験において、ワクチン接種の２時間前および最後のワクチン接種の２週間後に患者から採取された血液から調製した。
【０１８０】
Ｂ．細胞可溶化物の調製
前立腺間質、前立腺上皮、前立腺平滑筋、および肺線維芽細胞に由来する初代細胞株をＣｌｏｎｔｅｎｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入し、ＳＣＧＭ、ＰｒＥＧＭ、ＳｍＧＭ、およびＦＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｔｅｎｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で生育した。細胞を１０％ウシ胎仔血清、ペニシリウム／ストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）、およびグルタミンを含むＤＭＥＭ＋Ｆ１２培地（ＪＨＲ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）で生育した。細胞密度がＴ−１７５フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中で８０％コンフルエンスに達すると、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いてＶｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で１０〜３０分間インキュベーションして、細胞をフラスコから剥離させた。次いで、細胞を収集し、卓上遠心機（ＣＳ−６Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で、１，０００ｒｐｍで１０分間遠心沈殿した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。非接着細胞（ジャーカット細胞および末梢血細胞）については、細胞を収集し、遠心沈殿し、そしてＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、２×１０７細胞を１ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ＮＰ４０、１ｍＭ ＰＭＳＦ、および１％プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（カタログ番号５３９１３４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で溶解し、続いて氷上で１時間インキュベーションした。次いで、不溶性の細胞片を４℃で３０分間、卓上エッペンドルフ遠心機を用いて遠心除去した。上清を除去し、タンパク質濃度をＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で測定した。
【０１８１】
Ｃ．ウエスタンブロット分析
示された量の細胞可溶化物中のタンパク質（２５〜３５μｇ／レーン）または精製ＰＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または他の癌関連マーカーを、４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｒｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で分離し、続いて膜転写装置（Ｘｃｅｌｌ ＩＩ，Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ，Ｎｏｒｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、２５ｍＶの定電圧で２〜３時間、ニトロセルロース膜（Ｎｏｒｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に電気的転写した。転写後、ニトロセルロース膜をブロッキング溶液（１０％脱脂乳／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で４℃にて一晩ブロットした。一晩ブロッキングの後、膜を患者の血清（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で１：１０００希釈）とともに室温で２時間インキュベートし、続いてＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。ＨＰＲＴ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ＋Ｇ＋Ａ（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で１：３０００希釈）を膜とともに１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。結果を、化学蛍光発光（例えば、ＥＣＬウエスタンブロッティングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて）によって示した。
【０１８２】
実施例５：自己ＧＶＡＸ（登録商標）臨床試験において同定される前立腺腫瘍関連抗原
１つの研究において、癌関連抗原を以下のように同定した。自己前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンを調製するために、前立腺腫瘍を８人の患者から摘出して、初代前立腺癌細胞株を作製した。ヒトＧＭ−ＣＳＦを含むレトロウイルスベクターをこれらの初代細胞株に形質導入して、ＧＭ−ＣＳＦを分泌する細胞を作製した。患者にワクチンを、皮内注射によって２週ごとに、これらのＧＭ−ＣＳＦを発現する自己の初代前立腺癌細胞の形態で投与した。患者１、２、および３には、１×１０７細胞を６回投与し；患者４には、１×１０７細胞を５回投与し；患者５および７には、５×１０７細胞を６回投与し；患者７には、１×１０７細胞を３回投与し；そして患者８には、５×１０７細胞を３回投与した。以下の研究に用いた血清は、ワクチン接種の２時間前（ワクチン接種前として）および最後のワクチン接種の２週間後（ワクチン接種後として）に採取した血液から調製した。
【０１８３】
最後のワクチン接種後の自己前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験において、患者の血清中の抗体によって認識される特異的な抗原の同定を、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株のウエスタンブロット分析によって行った。２５μｇのＬＮＣａＰ溶解物を、４〜２０％勾配ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動し、続いてニトロセルロース膜に転写した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中の患者血清の１：１０００〜１：３０００の範囲での希釈物を、ウエスタンブロット分析における一次抗体に用いた。ペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ｍ＋Ａの１：３０００の希釈物を、二次抗体に用いた。結果を化学蛍光発光ＥＣＬキットによって示した。ＰＳＡに無関係であり、かつ、ＬＮＣａＰ細胞によって発現される種々の抗原（「ｐａｎ」腫瘍関連抗原を含む）が、ＷＯ／００２６６７６にさらに記載されるように、自己ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験においてワクチン接種の前後に得られた血清を比較することによって、新たに同定された。
【０１８４】
実施例６：同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）臨床試験において同定される前立腺腫瘍関連抗原
新規の抗原も、同種異型のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンで処置した患者の血清によって同定された。同種異系の前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験において、２１人の患者を、１．２×１０７個のＧＭ−ＣＳＦ発現ＬＮＣａＰ（ＬＮＣａＰ／ＧＭ）細胞およびＧＭ−ＣＳＦ発現（ＰＣ−３／ＧＭ）細胞の両方で、８週間毎週ワクチン接種した。血清は、ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン投与の２時間前（「ワクチン接種前」として）および最後のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン投与の２週間後（「ワクチン接種後」として）に採取した血液から調製した。数人の同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン処置患者に由来する血清を、さらなる研究のために選択した。このデータを以下の表４に要約する；
【０１８５】
【表４−１】
【０１８６】
【表４−２】
大多数の場合に、ＬＮＣａＰ細胞および／またはＰＣ３細胞に対する体液性免疫応答が観察された。このような抗ＰＣ３抗体応答および抗ＬＮＣａＰ抗体応答の誘導、ならびに同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン処置を行った前立腺癌患者２１人中１５人に観察されたＰＳＡ速度の低下により、同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）の場合、前立腺腫瘍の処置において体液性免疫応答が治療的役割を果たすことが示唆される。次いで、同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン処置後の患者由来の血清の能力を、ＰＳＡに対する抗体について試験した。３μｇのＰＳＡを４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、続いて患者３０１、３０５、３１４、３０７、および３１２からの血清を用いてウエスタン分析を行った。これらの結果は、ＰＳＡがこれらの血清によって認識されないことを示し、これは、ＰＳＡが腫瘍成長を根絶するのに応じた免疫応答を惹起することができないことを示す。これらの新規の抗原をさらに特徴づけするために、多数の患者に由来するワクチン接種前後の血清を用いてウエスタンブロット分析を行った。以下の癌細胞株のパネルを試験した：ＬＮＣａＰ（前立腺）；ＰＣ−３（前立腺）；Ａ５４９（肺）；ＬＳ−１７４Ｔ（大腸）；ＭＣＦ７（乳房）；ＤＵ−１４５（前立腺）；ＫＬＥＢ（卵巣）；ジャーカット（白血病）；およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ（乳房）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される、約２７８ｋＤおよび約１６０ｋＤ抗原の組織／細胞特異的発現を、この癌細胞株および正常初代前立腺細胞株のパネルを用いて特徴づけした。約１６０ｋＤ抗原は、ＰＣ−３癌および正常前立腺上皮細胞に発現がみられ、Ａ５４９（肺癌）およびＭＣＦ７（乳癌）に弱く発現がみられたが、試験した他のタイプの癌にも、そして前立腺間質または平滑筋細胞にも発現がみられなかった。これらの結果は、約１６０ｋＤ抗原（ｐ１６０）が前立腺特異的抗原であることを示す（データは示さず）。同実験により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤの分子量を有する腫瘍関連抗原（ｐ２７８）が、前立腺癌細胞株ＰＣ−３およびＤＵ−１４５、ならびにＡ５４９肺癌に発現することが見出された。ｐ２７８はまた、正常前立腺上皮細胞にも発現がみられたが、間質細胞または平滑筋細胞には発現がみられなかった。これらの結果は、ｐ２７８が、少なくとも前立腺特異的抗原および腫瘍関連抗原であることを強く示唆している。正常な前立腺特異的抗原（例えば、ｐ２７８およびｐ１６０）に対する抗体応答が存在するという事実から、同種異系のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンは寛容を破綻させ、腫瘍関連抗原を認識することによりこのような腫瘍に対する免疫系の応答の開始を引き起こし得ることが示される。
【０１８７】
実施例７：第二段階の同種異系ＧＶＡＸ（登録商標）臨床試験において同定される前立腺腫瘍関連抗原
他の新規の抗原も、さらなる臨床試験において、同種異型のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチンで処置した患者の血清によって同定された。この同種異系の前立腺ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン試験において、転移性骨疾患を有する２４人のホルモン抵抗性の患者に、初回用量の５億個のＧＭ−ＣＳＦ発現ＬＮＣａＰ細胞およびＧＭ−ＣＳＦ発現ＰＣ−３細胞を投与した後、２週間間隔で１２回の追加抗原投与量（各々１億個の細胞）を投与し、そして１０人の患者には、同じ初回用量およびより高い追加抗原投与量である３億個の細胞を投与した。血清は、ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン投与の２時間前（「ワクチン接種前」として）および最後のＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン投与の２週間後（「ワクチン接種後」として）に採取した血液から調製した。患者由来の血清を、さらに研究した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによってワクチン接種後に認識されたいくつかの抗原を、以下の表５に要約する：
【０１８８】
【表５−１】
【０１８９】
【表５−２】
大多数の場合に、ＬＮＣａＰ細胞および／またはＰＣ３細胞に対する体液性免疫応答が観察された。ワクチン接種後の血清は、抗ＰＳＡ抗体を全く含まなかった。患者８０４に対して完全なＰＳＡ応答が観察された（図２）。患者８０４とＰＣ−３またはＬＮＣａＰ細胞型のいずれかとの間のＨＬＡクラスＩ型適合はなかった。
【０１９０】
患者８０４のＧＶＡＸ（登録商標）処置に対する体液性応答を特徴付けするために、患者８０４由来のワクチン接種前後の血清をウエスタンブロット分析に用いた。ワクチン接種後血清は、ＰＣ−３細胞に存在するがＬＮＣａＰ細胞に存在しない約２７８ｋＤに移動する抗原を認識することが見出された（図３）。約２７８ｋＤ抗原はまた、初代正常前立腺上皮、前立腺間質、および前立腺平滑筋（ＰｒＥＣ、ＰｒＳＣ、およびＰｒＳｍＣ）細胞株においても検出されたが、ＰＣ−３細胞におけるよりも低レベルであった（図４）。この抗原はまた、非小細胞肺癌細胞株であるＨ１５７において過剰発現している（図５）。
【０１９１】
ＰＣ−３細胞可溶化物を、水平次元に沿って３．５〜１０のｐＨ勾配を有する２次元ゲル電気泳動に供した。約２７８ｋＤ抗原の移動を、ブロット分析によって決定した。関連するバンドを切り取り、ＭＡＬＤＩ−ＭＳタンパク質配列決定に供した。約２７８ｋＤ抗原のタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１４４８（アクチン結合タンパク質）に見られるβ−フィラミンの配列と一致した。
【０１９２】
Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）のウサギ抗ヒトフィラミンモノクローナル抗体は、ウエスタンブロットにより、ＰＣ−３において発現されるがＬＮＣａＰ細胞においては発現されない約２７８ｋＤタンパク質と反応することが実証された（図６）。
【０１９３】
実施例８：β−フィラミンおよびＧＭ−ＣＳＦを発現する同種異系細胞のワクチン接種
ＷＯ／００２６６７６に記載されるような標準技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１４５７に記載して示すβ−フィラミンのコード領域とＧＭ−ＣＳＦのコード配列を一緒に挿入することによって、レトロウイルスベクターを調製する。ＰＣ−３細胞およびＬＮＣａＰ細胞は、β−フィラミンを発現するように形質導入および遺伝子改変されるが、ＰＣ−３細胞は、形質導入されていないＰＣ−３細胞よりも高レベルのβ−フィラミンを発現するように遺伝子改変される。形質導入されたＰＣ−３細胞およびＬＮＣａＰ細胞を１：１の割合で混合して細胞ワクチンを形成し、そしてこれらの細胞を照射によって増殖不能にする。いずれのワクチンの２億の細胞も、１日当たり１０６細胞当たり約１００μｇのＧＭ−ＣＳＦを分泌する。
【０１９４】
前立腺腺癌を有し、ＰＳＡが上昇し、ＥＣＯＧ一般状態が０〜１であり、正常な肝臓、腎臓および骨髄機能を有し、化学療法または遺伝子治療歴がなく、活動性自己免疫疾患がなく、前立腺癌の併用療法がなく、そして骨スキャン陽性であるが麻薬性鎮痛薬を必要とする骨痛のない転移性疾患を有する患者を選択した。群Ａの患者をワクチンＡで処置し、群Ｂの患者をワクチンＢで処置する。各群につき、初回用量の５億細胞に続いて、２週間間隔で１２回の追加抗原投与量の１億または２億細胞を投与する。血清を、最初のワクチン投与の２時間前および最後のワクチン投与の２週間後に各患者から採取された血液から調製する。
【０１９５】
骨スキャン、骨密度評価、ＣＴスキャン、ＰＳＡレベル、および生存によって測定されるような疾患の進行に対する応答を、時間とともにモニターする。
【０１９６】
【表６】
前述の発明は、明瞭さや理解のために、説明および実施例を挙げていくらか詳細に記載されているが、特定の変更および改変がなされ得ることは当業者に明白である。本発明の種々の局面は、一連の実験によって達成され、それらの一部は、以下の非限定的な実施例によって説明される。従って、この説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、添付の特許請求の範囲により示される。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の方法および組成物に有用な、ＭＦＧベクターの略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の方法および組成物に有用な、ＭＦＧベクターの略図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明の方法および組成物に有用な、ＭＦＧベクターの略図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明の方法および組成物に有用な、ＭＦＧベクターの略図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、本発明の方法およびワクチンに有用な、ＧＭ−ＣＳＦをコードするアデノウイルスベクター（ＡＶ−ＧＭ−ＣＳＦ）の略図である。
【図１Ｆ】図１Ｆは、本発明の方法およびワクチンに有用な、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のベクタープラスミド（ＳＳＶ９／ＭＤ２−ｈＧＭ）の略図である。
【図１Ｇ】図１Ｇは、本発明の方法およびワクチンに有用な、ＨＩＶ ＬＴＲに隣接したＧＭ−ＣＳＦ発現カセットを含む、組換えレンチウイルスベクターの略図である。
【図１Ｈ】図１Ｈは、本発明の方法およびワクチンに有用な、ＩＣＰ２２ ＨＳＶ遺伝子に置き換えてＧＭ−ＣＳＦ発現カセットを含む、ＨＳＶ−Ｉ系ベクターの略図である。
【図１Ｉ】図１Ｉは、本発明の方法およびワクチンに有用な、ＧＭ−ＣＳＦ発現カセット、ＳＶ４０複製開始点、およびウイルスの後期遺伝子を含む、ＳＶ４０系プラスミド（ｐＳＶ ＭＤ ＧＭ−ＣＳＦＩＩ）の略図である。
【図１Ｊ】図１Ｊは、本発明の方法およびワクチンに有用な、ワクシニアウイルスプロモーターおよび終始配列ならびにＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを含む、ワクシニアウイルス発現カセットの略図である。
【図２】図２は、同種異系前立腺のＧＶＡＸ（登録商標）臨床試験における患者８０４の完全なＰＳＡ応答を示す。ワクチン処置の初回量は、０日目に投与された。
【図３】図３は、ウエスタンブロット分析の結果を示す。この図から、ワクチン接種後の患者８０４由来の血清が、ＬＮＣａＰ細胞ではなくＰＣ−３細胞に存在する、約２７８ｋＤに移動する抗原を認識することが見出されたことを示す。
【図４】図４は、ワクチン接種前（０週目）およびワクチン接種後（２４週目）の患者８０４由来の血清を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。この図から、ワクチン接種後の患者８０４由来の血清が、約２７８ｋＤ抗原を認識することが見出されたことを示し、この抗原はまた、初代正常前立腺上皮細胞株、前立腺間質細胞株、および前立腺平滑筋細胞株（それぞれ、ＰｒＥＣ、ＰｒＳＣ、およびＰｒＳｍＣ）において検出されるが、ＰＣ−３におけるよりも低いレベルである。
【図５】図５は、ワクチン接種前（０週目）およびワクチン接種後（２４週目）の患者８０４由来の血清を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。この図から、ワクチン接種後の患者８０４由来の血清はまた、約２７８ｋＤ抗原を認識することが見出されたことを示し、この抗原は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）Ｈ１５７において過剰発現されるが、Ｈ１３９５ ＮＳＣＬＣ腺癌細胞株においては発現されない。
【図６】図６は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）によるウサギ抗ヒトフィラミンモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。この図から、ＰＣ−３細胞において発現されるがＬＮＣａＰ細胞においては発現されない、約２７８ｋＤのタンパク質との反応性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体における前立腺癌を処置する方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＭ−ＣＳＦを産生するために第１の腫瘍細胞集団を遺伝子改変する工程；
（ｂ）該腫瘍細胞を被検体に投与する工程；
（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤ抗原に対する免疫応答を検出する工程であって、該免疫応答は、該投与の前には検出されない、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記約２７８ｋＤ抗原が、β−フィラミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫応答が、体液性免疫応答である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の腫瘍細胞集団が、増殖不能である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の腫瘍細胞集団が、同種異系の腫瘍細胞集団である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の腫瘍細胞集団が、自己の腫瘍細胞集団である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の腫瘍細胞集団が、バイスタンダー細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の腫瘍細胞集団が、ＰＣ−３細胞またはＬＮＣａＰ細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫応答が、体液性免疫応答である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第２の腫瘍細胞集団がＧＭ−ＣＳＦを産生するように遺伝子改変され、前記第１の腫瘍細胞集団と同時投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の腫瘍細胞集団が、ＰＣ−３細胞またはＬＮＣａＰ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫応答が、体液性免疫応答である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の腫瘍細胞集団が、増殖不能である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の腫瘍細胞集団が、同種異系の腫瘍細胞集団である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の腫瘍細胞集団が、自己の腫瘍細胞集団である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の腫瘍細胞集団が、バイスタンダー細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の腫瘍細胞集団が、同種異系の腫瘍細胞集団である、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の腫瘍細胞集団が、自己の腫瘍細胞集団である、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の腫瘍細胞集団が、バイスタンダー細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の腫瘍細胞集団が、同種異系の腫瘍細胞集団である、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の腫瘍細胞集団が、自己の腫瘍細胞集団である、請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の腫瘍細胞集団が、バイスタンダー細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の腫瘍細胞集団がＰＣ−３細胞であり、前記第２の腫瘍細胞集団がＬＮＣａＰ細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫応答が、体液性免疫応答である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前立腺癌患者におけるＰＳＡのレベルを低下させる方法であって、該方法は、以下の工程：
ＧＭ−ＣＳＦを産生するために第１の腫瘍細胞集団を遺伝子改変する工程；
該細胞を被検体に投与する工程；
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤ抗原に対する免疫応答を検出する工程であって、該免疫応答は、該投与の前には検出されない、工程
を包含する、方法。
【請求項２６】
前記約２７８ｋＤ抗原が、β−フィラミンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫応答が、体液性免疫応答である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の腫瘍細胞集団が、増殖不能である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の腫瘍細胞集団が、同種異系の腫瘍細胞集団である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の腫瘍細胞集団が、自己の腫瘍細胞集団である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の腫瘍細胞集団が、バイスタンダー細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の腫瘍細胞集団が、ＰＣ−３細胞、ＬＮＣａＰ細胞、および、ＰＣ−３細胞＋ＬＮＣａＰ細胞からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項１】
被検体における前立腺癌を処置する方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＭ−ＣＳＦを産生するために第１の腫瘍細胞集団を遺伝子改変する工程；
（ｂ）該腫瘍細胞を被検体に投与する工程；
（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤ抗原に対する免疫応答を検出する工程であって、該免疫応答は、該投与の前には検出されない、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記約２７８ｋＤ抗原が、β−フィラミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫応答が、体液性免疫応答である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の腫瘍細胞集団が、増殖不能である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の腫瘍細胞集団が、同種異系の腫瘍細胞集団である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の腫瘍細胞集団が、自己の腫瘍細胞集団である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の腫瘍細胞集団が、バイスタンダー細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の腫瘍細胞集団が、ＰＣ−３細胞またはＬＮＣａＰ細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫応答が、体液性免疫応答である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第２の腫瘍細胞集団がＧＭ−ＣＳＦを産生するように遺伝子改変され、前記第１の腫瘍細胞集団と同時投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の腫瘍細胞集団が、ＰＣ−３細胞またはＬＮＣａＰ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫応答が、体液性免疫応答である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の腫瘍細胞集団が、増殖不能である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の腫瘍細胞集団が、同種異系の腫瘍細胞集団である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の腫瘍細胞集団が、自己の腫瘍細胞集団である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の腫瘍細胞集団が、バイスタンダー細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の腫瘍細胞集団が、同種異系の腫瘍細胞集団である、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の腫瘍細胞集団が、自己の腫瘍細胞集団である、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の腫瘍細胞集団が、バイスタンダー細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の腫瘍細胞集団が、同種異系の腫瘍細胞集団である、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の腫瘍細胞集団が、自己の腫瘍細胞集団である、請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の腫瘍細胞集団が、バイスタンダー細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の腫瘍細胞集団がＰＣ−３細胞であり、前記第２の腫瘍細胞集団がＬＮＣａＰ細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫応答が、体液性免疫応答である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前立腺癌患者におけるＰＳＡのレベルを低下させる方法であって、該方法は、以下の工程：
ＧＭ−ＣＳＦを産生するために第１の腫瘍細胞集団を遺伝子改変する工程；
該細胞を被検体に投与する工程；
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される約２７８ｋＤ抗原に対する免疫応答を検出する工程であって、該免疫応答は、該投与の前には検出されない、工程
を包含する、方法。
【請求項２６】
前記約２７８ｋＤ抗原が、β−フィラミンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫応答が、体液性免疫応答である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の腫瘍細胞集団が、増殖不能である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の腫瘍細胞集団が、同種異系の腫瘍細胞集団である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の腫瘍細胞集団が、自己の腫瘍細胞集団である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の腫瘍細胞集団が、バイスタンダー細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の腫瘍細胞集団が、ＰＣ−３細胞、ＬＮＣａＰ細胞、および、ＰＣ−３細胞＋ＬＮＣａＰ細胞からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図１Ｊ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図１Ｊ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５１２４９１（Ｐ２００８−５１２４９１Ａ）
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３１４１６（Ｐ２００７−５３１４１６）
【出願日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３２３５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３１７０３
【国際公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【出願人】（５９７０７８９８３）セル ジェネシス インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３２３５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３１７０３
【国際公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【出願人】（５９７０７８９８３）セル ジェネシス インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
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