創傷治癒のための方法及び薬剤組成物
【課題】本発明の課題は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物を提供することである。
【解決手段】損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分である、治療有効量のインスリン及び前記インスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、治療有効量のインスリン、及び前記インスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質を投与するステップを含む。
【解決手段】損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分である、治療有効量のインスリン及び前記インスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、治療有効量のインスリン、及び前記インスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質を投与するステップを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖及び／又は細胞分化を誘導及び／又は促進し、それによって創傷の治癒プロセスを促進するための方法及び薬剤組成物に関する。より詳細には、本発明は、細胞増殖及び／又は細胞分化及び／又は細胞移動を誘導及び／又は促進し、それによって創傷の治癒プロセスを促進するための、ＰＫＣとしても知られるセリン／スレオニンタンパク質キナーゼの、例えば膜転位及び活性化によって開始される発現及び／又は活性化の調節の使用に関する。本発明の教示に従って、（ｉ）ＰＫＣ発現構築物での創傷細胞の形質転換、（ｉｉ）創傷細胞の内因性ＰＫＣ遺伝子と隣接したその上流に挿入するシス作用性エレメントを用いた創傷細胞の形質転換、（ｉｉｉ）創傷細胞においてＰＫＣの発現及び／又は活性化を誘導するインスリンの投与、（ｉｖ）インスリン発現構築物から産生され、発現され分泌されるインスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、そのインスリン発現構築物での創傷細胞の形質転換、（ｖ）発現され分泌されるインスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、創傷細胞の内因性インスリン遺伝子と隣接したその上流に挿入するシス作用性エレメントでの創傷細胞の形質転換、（ｖｉ）創傷へのインスリン分泌細胞の移植、（ｖｉｉ）インスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、内因性インスリンの産生及び分泌を誘導するトランス作用性因子、例えばＰＤＸ１での創傷細胞の形質転換、並びに（ｖｉｉｉ）創傷へのＰＫＣ調節因子の投与によって、そのような発現の調節を実施することができる。
【０００２】
本発明は、上記の方法のいずれかによって実現されるように、皮膚移植片の産生のためにｅｘ ｖｉｖｏで実施することもできる。
【背景技術】
【０００３】
創傷治療での第一の目標は、創傷閉鎖を達成することである。皮膚開放創は、創傷の主要な部類の１つに相当し、それには、熱傷創、神経障害性潰瘍、褥瘡、静脈うっ血性潰瘍、及び糖尿病性潰瘍がある。
【０００４】
皮膚開放創は、６個の主要な構成要素：（ｉ）炎症、（ｉｉ）線維芽細胞増殖、（ｉｉｉ）血管増殖、（ｉｖ）結合組織合成、（ｖ）上皮化、及び（ｖｉ）創傷収縮を含むプロセスによって通常治癒する。これらの構成要素が、個々に又は全体として適切に機能しないとき、創傷治癒は障害される。栄養不良、感染、薬剤作用物質（例えば、アクチノマイシン及びステロイド）、高齢及び糖尿病を含めて、多数のファクターが創傷治癒に影響を及ぼす可能性がある（非特許文献１を参照）。
【０００５】
糖尿病について、真性糖尿病は、インスリンシグナル伝達の障害、血漿グルコースの上昇、いくつかの独特の組織が関与する慢性合併症を発症する傾向を特徴とする。真性糖尿病の慢性合併症すべての中で、足部潰瘍化を引き起こす創傷治癒の障害は、最も研究が十分でない。さらに、糖尿病患者における皮膚の潰瘍化は、驚くほどの個人的金銭的なコストがかかる（非特許文献１及び非特許文献２）。さらに、足部潰瘍、及びそれに続く下肢切断は、糖尿病患者の中で入院の最も一般的な原因である（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献５）。糖尿病では、創傷治癒プロセスは障害され、治癒した創傷は、創傷の強度が減弱していることを特徴とする。組織修復の欠陥は、神経障害、血管疾患及び感染を含めたいくつかのファクターと関係している。しかし、異常なインスリンシグナル伝達と関係する糖尿病状態が創傷治癒を障害し、皮膚の生理状態を変化させる他の機構は、解明されていない。
【０００６】
身体の種々の部分での外科手術後、手術は成功するが創傷切開が治癒しないという創傷治癒の一般的な問題も存在する。
【０００７】
皮膚とは、層を成す扁平上皮であり、皮膚では増殖し分化する細胞が厳密に区画化されている。生理状態では、増殖は、基底膜と接着している基底細胞に限定されている。分化とは、基底細胞が基底膜との接着を喪失し、ＤＮＡ合成を中止し、一連の形態的生化学的変化を受ける空間的なプロセスである。その最終的な成熟化ステップは、皮膚の保護障壁を形成する角化層の産生である（非特許文献７及び非特許文献８）。基底細胞が分化に傾くときに観察される最も初期の変化は、基底膜から脱離し、遠くへ移動する基底細胞の能力と関係する（非特許文献９）。同様の変化が、細胞が創傷領域へと移動し、増殖能も促進される創傷治癒プロセスと関係する。これらのプロセスは、皮膚層の再構築、及び表皮層の適切な分化の誘導に必須である。
【０００８】
表皮細胞の増殖及び分化を制御する機構の分析は、マウス及びヒトのケラチン生成細胞培養系の開発によって非常に容易となった（非特許文献８及び非特許文献１０）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ケラチン生成細胞は、高増殖速度の基底増殖細胞として維持することができる。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの表皮の成熟パターンに従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化を誘導することができる。初期の事象には、半接着斑の構成成分の喪失（非特許文献９及び非特許文献１１）、及びα６β４インテグリンの選択的喪失、及びマトリックスタンパク質との細胞接着がある。このことは、インテグリン発現の変化が、ケラチン生成細胞分化の初期事象であることを示唆するものである。半接着斑の接触の初期喪失は、ケラチン生成細胞の基底膜上の移動を引き起こし、培養ケラチン生成細胞及び皮膚でのケラチン１（Ｋ１）の誘導へとつながる（非特許文献７、非特許文献９及び非特許文献１２）。顆粒層の表現型へのさらなる分化は、β１とβ４両方のインテグリン発現の下方制御、すべてのマトリックスタンパク質との接着可能性の喪失を伴い、その後に角化膜が形成され、細胞死が起こる。分化細胞は、成熟扁平細胞として培養皿から最終的に分離する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのこの分化プログラムは、ｉｎ ｖｉｖｏでの表皮の成熟パターンに密接に従う。
【０００９】
ケラチン生成細胞の生物学における最近の研究は、皮膚の増殖及び分化を制御するタンパク質キナーゼＣ経路の寄与を明らかにするものである。タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーのセリン−スレオニンキナーゼは、様々な生物学的現象に重要な制御の役割を果たす（非特許文献１３及び非特許文献１４）。ＰＫＣファミリーは、少なくとも１２個の個々のアイソフォームからなり、それらは、３つの異なる種類：（ｉ）Ｃａ２＋、ホルボールエステル、及びホスホリパーゼＣによって細胞内で遊離するジアシルグリセロールによって活性化される従来型アイソフォーム（α、β１、β２、γ）、（ｉｉ）やはりホルボールエステル及びジアシルグリセロールによって活性化されるが、Ｃａ２＋では活性化されない新規アイソフォーム（δ、ε、η、θ）、並びに（ｉｉｉ）Ｃａ２＋、ホルボールエステル又はジアシルグリセロールによって活性化されない非定型的な（ζ、λ、ι）構成要素のファミリーに属する。
【００１０】
活性化後、全部ではないがほとんどのアイソフォームが細胞質から原形質膜へと転位すると考えられている。アイソフォームの型、及び分布のパターンは、異なる組織間で様々であり、表現型の機能として変化することもある。ホルモン作用の多種多様な細胞の評価項目の中でそれが重要であるので、多数の研究からＰＫＣの構造及び機能が特徴付けられている。５つのＰＫＣアイソフォームα、δ、ε、η、及びζがｉｎ ｖｉｖｏ及び培養下の皮膚で同定されている。最近の研究から、ＰＫＣシグナル伝達経路が、分化反応の主要な細胞内媒介物であることが示された（非特許文献１５及び非特許文献１６）。さらに、ＰＫＣの薬剤活性化物質は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでケラチン生成細胞分化の強力な誘導物質であり（非特許文献１０及び非特許文献１７）、ＰＫＣ抑制物質は、分化マーカーの発現を妨げる（非特許文献１５）。
【００１１】
本発明を考え出す間、ＰＫＣアイソフォームの過剰発現及び／又は活性化は、創傷治癒プロセスの促進に有益である可能性があると仮定した。皮膚細胞の増殖及び／又は分化における別個のＰＫＣアイソフォームの役割を調べることについての制約は、従来の方法で外来遺伝子を効率よく初代細胞に導入することが困難であることによって拘束されてきた。寿命が短く、分化の可能性があり、安定な形質転換体を単離できないことから、初代皮膚細胞に外来遺伝子を効率よく形質導入することは不可能である。
【００１２】
従来技術では、創傷治癒の治療用作用物質としてのインスリンの潜在的な使用について記載がある。したがって、特許文献１、特許文献２及び特許文献３は、創傷治癒を促進する、創傷へのインスリンの局所塗布について記載するものである。しかし、インスリンの機能が、グルコース摂取を促進し、それによって創傷治癒を促進することであるため、これらの特許は、グルコースと組み合わせたインスリンの使用について記載するものである。
【００１３】
特許文献４及び特許文献５は、皮膚の健康状態を改善し、又は浅い皮膚損傷を治療する目的で、皮膚への局所塗布用のインスリンを含む組成物について記載するものである。しかし、これらの特許出願は、慢性の、第２度の又は深い損傷を治療するためのインスリンの使用を教示するものではない。
【００１４】
特許文献６は、創傷治癒のためのインスリン又は銀と組み合わせたシアノアクリレートポリマー密封剤の使用について記載するものである。しかし、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節することができる他の生物学的に活性な作用物質と組み合わせたインスリンの使用は、この出願では教示されず示唆されない。
【００１５】
特許文献７は、糖尿病を治療するためのインスリンの局所塗布について記載するものである。しかし、この特許出願は、糖尿病非関連の創傷を治療する目的でのインスリンの使用を教示するものではない。
【００１６】
特許文献８は、インスリンを含むことができる治療用マイクロエマルジョン製剤について記載するものである。しかし、創傷治癒の目的での製剤インスリンの使用は、この開示では教示されない。
【００１７】
特許文献９及び特許文献１０は、上皮増殖因子及びインスリンを含む、ヒトケラチン生成細胞及び表皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏクローン性増殖のための組成物について記載するものである。このどちらの特許も、移植に使用することができる培養皮膚細胞の発育のためのインスリンの使用を教示するものである。しかし、創傷に対するｉｎ ｖｉｖｏでのインスリンの塗布は、これらの特許では教示されない。
【００１８】
上記で引用した従来技術の文献は、創傷の治癒プロセスを促進するように、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節するためのインスリンの使用を教示又は示唆するものではない。さらに、従来技術は、創傷の治癒プロセスを促進するように、インスリンを創傷に供給するための核酸構築物又は遺伝子形質転換技術の利用を教示又は示唆するものではない。
【００１９】
創傷治癒に関連するプロセスを促進する新たな手法についての必要性が広く認識され、それを有すると非常に有利となるはずである。さらに、細胞の増殖及び／又は分化のプロセス並びに創傷治癒を促進する、皮膚細胞への組換え遺伝子挿入の効率のよい方法についての必要性が広く認識され、それを有すると非常に有利となるはずである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５，５９１，７０９号
【特許文献２】米国特許第５，４６１，０３０号
【特許文献３】米国特許第５，１４５，６７９号
【特許文献４】米国特許出願第０９／７４８，４６６号
【特許文献５】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１７９４
【特許文献６】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０２４５
【特許文献７】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／００６９５
【特許文献８】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０３０８６
【特許文献９】米国特許第４，６７３，６４９号
【特許文献１０】米国特許第４，９４０，６６０号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Hunt and Goodson in Current Surgical Diagnosis & Treatment (Way; Appleton; and Lange), pp. 86-98, 1988.
【非特許文献２】Knighton, D. R. and Fiegel, V. D. Growth factors and comprehensive surgical care of diabetic wounds. Curr. Opin. Gen. Surg., : 32-9, 1993.
【非特許文献３】Shaw, J. E. and Bouton, A. J. The pathogenesis of diabetic foot problems: an overview. Diabetes, 46 Suppl 2 : S58-61, 1997.
【非特許文献４】Coghlan, M. P. , Pillay, T. S. , Tavare, J. M., and Siddle, K. Site-specific anti-phosphopeptide antibodies: use in assessing insulin receptor serine/threonine phosphorylation state and identification of serine-1327 as a novel site of phorbol ester- induced phosphorylation. Biochem. J. , 303: 893-899, 1994.
【非特許文献５】Grunfeld, C. Diabetic foot ulcers: etiology, treatment, and prevention. Adv. Intern. Med. , 37: 103-32 : 103-132,1992.
【非特許文献６】Reiber, G. E. , Lipsky, B. A. , and Gibbons, G. W. The burden of diabetic foot ulcers. Am. J. Surg., 176 : 5S-lOS, 1998.
【非特許文献７】Hennings, H. , Michael, D. , Cheng, C. , Steinert, P. , Holbrook, K.,and Yuspa, S. H. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell, 19 : 245-254, 1980.
【非特許文献８】Yuspa, S. H. , Kilkenny, A. E. , Steinert, P. M. , and Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J. Cell Biol., 109 : 1207-1217, 1989.
【非特許文献９】Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J. Cell Biol., 111 : 2807-2814, 1990.
【非特許文献１０】Yuspa, S. H. The pathogenesis of squamous cell cancer: lessons learned from studies of skin carcinogenesis--Thirty-third G. H. A. Clowes Memorial Award Lecture. Cancer Res., 54 : 1178-1189,1994.
【非特許文献１１】Hennings, H. and Holbrook, K. A. Calcium regulation of cell-cell contact and differentiation of epidermal cells in culture. An ultrastructural study. Exp. Cell Res., 143 : 127-142, 1983.
【非特許文献１２】Tennenbaum, T. , Li, L., Belanger, A. J. , De Luca, L. M. , and Yuspa, S. H. Selective changes in laminin adhesion and α6β4 integrin regulation are associated with the initial steps in keratinocyte maturation. Cell Growth Differ., 7: 615-628, 1996.
【非特許文献１３】Nishizuka, Y. The molecular heterogeneity of PKC and its implications for cellular regulation. Nature, 334 : 661-665, 1988.
【非特許文献１４】9. Nishizuka, Y. The family of protein kinase C for signal transduction. JAMA, 262: 1826-1833, 1989.
【非特許文献１５】10. Denning, M. F., Dlugosz, A. A. , Williams, E. K. , Szallasi, Z. , Blumberg, P. M. , and Yuspa, S. H. Specific protein kinase C isozymes mediate the induction of keratinocyte differentiation markers by calcium. Cell Growth Differ., 6 : 149-157, 1995.
【非特許文献１６】11. Dlugosz, A. A., Pettit, G. R. , and Yuspa, S. H. Involvement of Protein kinase C in Ca2+-mediated differentiation on cultured primary mouse keratinocytes. J. Invest. Dermatol., 94 : 519-519,1990. (Abstract)
【非特許文献１７】12. Dlugosz, A. A. and Yuspa, S. H. Coordinate changes in gene expression which mark the spinous to granular cell transition in epidermis are regulated by protein kinase C. J. Cell Biol., 120 : 217-225,1993.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明を実施に移す間、本発明者らは、インスリンを単独で創傷に投与すると、過度の血管新生、炎症、表皮細胞過形成や瘢痕化など有害な副作用を引き起こす可能性があることを明らかにした（以下の実施例の項中の実施例２３を参照）。さらに、本発明者らは、創傷領域に定着している細胞でＰＫＣの発現及び／又は活性を調節することができる１種又は複数種の作用物質とインスリンを組み合わせることによって創傷治癒プロセスを実質的に促進する間に、インスリンが誘導する副作用を有効に回避できることを明らかにした。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、創傷領域に有効量のインスリン、並びに／或いは創傷定着細胞でＰＫＣの発現及び／又は活性を調節しインスリンと相乗的に作用することができる他の作用物質を供給して創傷治癒のプロセスを促進することによって、効率よく、且つ有害な副作用を伴わずに創傷を治療する新規の方法及び組成物を提供する。
【００２４】
したがって、本発明の一態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、ＰＫＣ産生及び／又はＰＫＣ活性化を調節する治療有効量の作用物質を投与するステップを含む。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、ＰＫＣの産生及び／又は活性を調節する治療有効量の少なくとも１種の作用物質と、製剤上許容される担体とを含む。
【００２６】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、治療有効量のインスリン、及びインスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質を投与するステップを含む。
【００２７】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である治療有効量のインスリン及びインスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００２８】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、単回投与量の治療有効量のインスリンを投与し、それによって損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するステップを含む。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進することができるように選択された単回投与単位のインスリンと、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００３０】
本発明の他の態様によれば、古い皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、古い皮膚創傷に、単回投与量の治療有効量のインスリンを投与し、それによって古い皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するステップを含む。
【００３１】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、治療有効量のインスリン分泌細胞を移植するステップを含む。
【００３２】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分であるインスリン分泌細胞と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷の細胞を形質転換して、インスリンを産生し分泌するステップを含む。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、損傷した皮膚又は皮膚創傷の細胞を形質転換してインスリンを産生し分泌するように設計された核酸構築物と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００３５】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷の細胞を形質転換して、タンパク質キナーゼＣを産生するステップを含む。
【００３６】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、損傷した皮膚又は皮膚創傷の細胞を形質転換してタンパク質キナーゼＣを産生するように設計された核酸構築物と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００３７】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、治療有効量のＰＫＣ活性化物質を投与するステップを含む。
【００３８】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するための治療有効量のＰＫＣ活性化物質と、製剤上許容される担体とを含む。
【００３９】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、治療有効量のコポリマー１を投与するステップを含む。
【００４０】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である治療有効量のコポリマー１と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００４１】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である治療有効量のコポリマー１と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００４２】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷に定着している皮膚細胞において少なくとも１種のＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節するステップと、ＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節するステップを行いながら、ホルモン、増殖因子、アディポカイン、ＰＫＣδＲＡＣＫ、及びＧＷ９６６２からなる群から選択される治療有効量の少なくとも１種のさらなる作用物質を皮膚細胞に投与して、それによって、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するステップとを含む。
【００４３】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、少なくとも１種のＰＫＣアイソフォームの発現又は活性化を調節する治療有効量の物質、及びホルモン、増殖因子、アディポカイン、ＰＫＣδＲＡＣＫ、及びＧＷ９６６２からなる群から選択される少なくとも１種のさらなる作用物質と、製剤上許容される担体とを含む。
【００４４】
下記に記載する本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、創傷は、潰瘍、糖尿病関連の創傷、熱傷、日焼け、加齢による皮膚創傷、角膜潰瘍化による創傷、炎症性消化管疾患による創傷、腸炎症性疾患による創傷、クローン病による創傷、潰瘍性大腸炎、痔核、表皮水疱症による創傷、皮膚水疱形成性創傷、乾癬による創傷、脂漏性皮膚炎による創傷、動物の皮膚の創傷、動物の糖尿病による創傷、網膜症による創傷、口腔の創傷（粘膜炎）、膣粘膜炎による創傷、歯周病による創傷、裂傷、外科的切除による創傷、及び外科的接着後の創傷からなる群から選択される。
【００４５】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、潰瘍は、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、胃潰瘍、及びＨＩＶ関連潰瘍である。
【００４６】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリンは組換え体である。
【００４７】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリンは天然の供給源に由来する。
【００４８】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、さらなる作用物質は、血小板由来増殖因子である。
【００４９】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、さらなる作用物質はＰＫＣ−α抑制物質である。
【００５０】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、投与は、単回塗布によって実施する。
【００５１】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、古い皮膚創傷は、少なくとも２日前のものである。
【００５２】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリンの濃度は、０．１μＭ〜１０μＭである。記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリンの投与単位は、薬剤組成物０．０１〜０．２ｍｌ中に０．００１〜５ｎＭである。
【００５３】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリンの投与量は、薬剤組成物０．０１〜０．２ｍｌ中に０．０１〜０．５ｎＭである。
【００５４】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、薬剤組成物は、水溶液剤、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、噴霧剤、懸濁液剤、粉末剤、分散液剤、膏薬及び軟膏剤からなる群から選択される。
【００５５】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、薬剤組成物は、固体支持体を含む。
【００５６】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞を形質転換して、インスリンを産生し分泌する。
【００５７】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞を組換えＰＤＸ１遺伝子で形質転換し、それによって細胞が天然のインスリンを産生し分泌する。
【００５８】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞の内因性インスリン遺伝子の上流に組み込むシス作用性エレメント配列で細胞を形質転換し、それによって細胞が天然のインスリンを産生し分泌する。
【００５９】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、分泌顆粒を形成することができる。
【００６０】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、内分泌細胞である。
【００６１】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、ヒト供給源に由来する。
【００６２】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、組織適合性をヒト化した動物供給源に由来する。
【００６３】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、ヒトインスリンを分泌する。
【００６４】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、自己の細胞である。
【００６５】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞は、線維芽細胞、上皮細胞及びケラチン生成細胞からなる群から選択される。
【００６６】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞を形質転換して、タンパク質キナーゼＣ転写活性化物質を産生し、それによって細胞が天然のタンパク質キナーゼＣを産生する。
【００６７】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞の内因性タンパク質キナーゼＣの上流に組み込むシス作用性エレメント配列で細胞を形質転換し、それによって細胞が天然のタンパク質キナーゼＣを産生する。
【００６８】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、組換えタンパク質キナーゼＣ遺伝子で細胞を形質転換し、それによって細胞が組換えタンパク質キナーゼＣを産生する。
【００６９】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、タンパク質キナーゼＣは、ＰＫＣ−β１、ＰＫＣ−β２、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−θ、ＰＫＣ−λ、及びＰＫＣ−ιからなる群から選択される。
【００７０】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、タンパク質キナーゼＣは、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−δ、ＰＫＣ−ε、ＰＫＣ−η、及びＰＫＣ−ζからなる群から選択される。
【００７１】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、コポリマー１は、局所塗布に適合された薬剤組成物中に含まれる。
【００７２】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、ＰＫＣアイソフォームは、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−δ、及びＰＫＣ−ζからなる群から選択される。
【００７３】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、ホルモンはインスリンである。
【００７４】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、増殖因子はＩＬ−６、ＫＦＧ及びＴＮＦαからなる群から選択される。
【００７５】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、アディポカインは、アディプシン又はアディポネクチンである。
【００７６】
本発明は、損傷した皮膚又は皮膚創傷に対処する新たな治療を提供することによって、現在知られている構成の欠点の対処に成功するものである。
【００７７】
本発明は、本明細書で、添付の図面を参照して例示される。ここで詳細について図面を具体的に参照する際に、図示される特定の実施形態は例示であって、本発明の好ましい実施形態の例証的な議論の目的のみのためであり、本発明の原理及び概念上の態様の最も有用で容易に理解されると考えられているものを提供する目的で提示されることが強調される。この点に関して、本発明の基本的な理解のために必要であるよりもさらに詳しく本発明の構造上の詳細を示すための試みはなされず、これらの図面とともに本明細書を見ると、本発明のいくつかの形態が実用上いかにして具体化され得るかは、当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】組換えアデノウイルスベクターを利用するＰＫＣアイソフォームの効果的な過剰発現を実証する：左のパネル：４日齢の初代ケラチン生成細胞に、感染の４８時間後のβ−ｇａｌアデノウイルスを利用して１時間感染させ、細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼタンパク質の活性化を、未感染のケラチン生成細胞と比較して青色反応の誘導によって定量した。右のパネル：４日齢の初代ケラチン生成細胞に、組換えアイソフォーム特異的ＰＫＣアデノウイルスを利用して、１時間感染させた。２４時間後、感染した（Ａｄ）及び非感染対照（Ｃ）の培養のタンパク質をウェスタンブロット分析のために抽出し、サンプルを、上記の実施例の節において記載されるアイソフォーム特異的抗ＰＫＣ抗体を使用して分析した。
【図２】ブリオスタチン１によるＰＫＣ活性化が、過剰発現されたＰＫＣアイソフォームのトランスロケーションを誘導することを示す。４日齢初代ケラチノサイトに、アイソフォーム特異的組換えＰＫＣアデノウイルスを用いて１時間感染させた。感染の２４時間後、細胞を、未処理か（Ｃ）、又はブリオスタチン１で３０分間刺激したか（Ｂ）のいずれかを行い、分画した。タンパク質サンプルをウェスタンブロッティングに供し、アイソフォーム特異的抗ＰＫＣ抗体を使用して分析した。
【図３】過剰発現されたＰＫＣアイソフォームがそれらのネイティブ型で活性であることを示す。４日齢初代ケラチノサイトを、アイソフォーム特異的組換えＰＫＣアデノウイルスで１時間感染させた。注射の１８時間後、未感染対照細胞（Ｃ）及びＰＫＣアイソフォーム過剰発現細胞（ＯＥ）からの細胞溶解物を、アイソフォーム特異的抗ＰＫＣ抗体を使用して免疫沈殿させた。免疫沈殿物を、上記の実施例の節において記載されるようなＰＫＣ活性アッセイに供した。
【図４】特異的ＰＫＣアイソフォームの過剰発現が初代ケラチン生成細胞における独特な形態学的変化を誘導することを実証する。初代ケラチノサイトは、未処理のままであるか（Ｃ）、又は組換えＰＫＣα、δ、若しくはζのアデノウイルスで感染されたかのいずれかであった。２４時間後、培養物を明視野顕微鏡によって観察し、写真撮影した（×２０）。
【図５】感染した初代ケラチン生成細胞における過剰発現されたＰＫＣアイソフォームの独特な局在を示す。初代ケラチン生成細胞を、ラミニン５−コートされたガラススライド上にプレートした。培養物は、未処理のままであるか、又は異なる組換えＰＫＣアデノウイルスで感染されたかのいずれかであった。感染の２４時間後、細胞を固定し、洗浄し、風乾した。培養物は、アイソフォーム特異的抗ＰＫＣ抗体、続いてＦＩＴＣ結合体化二次抗体を使用して、免疫蛍光によって分析された。細胞を、共焦点顕微鏡によってスキャンし、代表的な視野を写真撮影した。
【図６】ＰＫＣアイソフォームが、α６β４インテグリン発現を特異的に調節することを実証する。５日齢初代マウス皮膚ケラチン生成細胞は、未処理であるか、又は、ＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζの組換えアデノウイルスで感染された。感染の４８時間後、膜細胞画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供し、ニトロセルロールフィルターに転写し、抗α６及び抗β４抗体でイムノブロットを行い、ＥＣＬによって分析した。
【図７】ＰＫＣη及びＰＫＣδの過剰発現が、ケラチン生成細胞増殖を誘導することを示す。５日齢初代マウス皮膚ケラチン生成細胞は、未処理であるか、又は、ＰＫＣδ、ＰＫＣα、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζの組換えアデノウイルスで感染された。感染の４８時間後、細胞増殖を、実験手順において記載されているように、１時間の３Ｈ−チミジン取り込みによって分析した。結果は、β−ガラクトシダーゼ感染ケラチン生成細胞と比較した、ｃｐｍ／ディッシュとして表される。値は、３回の別々の実験における３連の測定の平均±標準偏差として表される。
【図８】ＰＫＣアイソフォームの過剰発現が、α６β４インテグリンの半接着斑局在をもたらすことを実証する。初代ケラチン生成細胞は、ラミニン５コートされたガラススライド上にプレートされ、ケラチノサイト培養は、４８時間の間、低Ｃａ２＋ＭＥＭ中で維持された。この時間の後で、培養物は未処理のままであるか（Ａ）、又はＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζの組換えアデノウイルス（それぞれ、Ｂ−Ｅ）で感染される。感染の２４時間後、実験手順において記載されているように、ケラチン生成細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、続いて、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で穏やかに抽出し、ＰＢＳ中で洗浄し、風乾した。培養物を、実験手順において記載されているように、アイソフォーム特異的抗α６抗体、続いてＦＩＴＣ結合体化二次抗体を利用する免疫蛍光分析に供した。
【図９Ａ】過剰発現されたＰＫＣδ及びＰＫＣζがケラチン生成細胞脱着をインビトロで誘導することを示す。（Ａ）初代ケラチン生成細胞は、未処理であるか（Ｃ）、又は組換えＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζのアデノウイルスで感染される。細胞接着を、感染の２４時間後及び４８時間後に、細胞を持ち上げること、及びそれらをマトリックスコートされたディッシュ上に再プレートすることによって分析した。細胞の計数は、接着細胞のタンパク質濃度（ｍｇ／ディッシュ）として提示される。（Ｂ）初代ケラチン生成細胞は、未処理であるか（Ｃ）、又は組換えのＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζのアデノウイルスで感染されるかのいずれかであった。細胞脱着を、感染の２４時間後に、培養培地中で脱着した浮遊している細胞を収集することによって分析した。細胞の計数は、脱着細胞のタンパク質濃度（ｍｇ／ディッシュ）として提示される。
【図９Ｂ】過剰発現されたＰＫＣδ及びＰＫＣζがケラチン生成細胞脱着をインビトロで誘導することを示す。（Ａ）初代ケラチン生成細胞は、未処理であるか（Ｃ）、又は組換えＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζのアデノウイルスで感染される。細胞接着を、感染の２４時間後及び４８時間後に、細胞を持ち上げること、及びそれらをマトリックスコートされたディッシュ上に再プレートすることによって分析した。細胞の計数は、接着細胞のタンパク質濃度（ｍｇ／ディッシュ）として提示される。（Ｂ）初代ケラチン生成細胞は、未処理であるか（Ｃ）、又は組換えのＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζのアデノウイルスで感染されるかのいずれかであった。細胞脱着を、感染の２４時間後に、培養培地中で脱着した浮遊している細胞を収集することによって分析した。細胞の計数は、脱着細胞のタンパク質濃度（ｍｇ／ディッシュ）として提示される。
【図１０】ＰＫＣηが活発に増殖しているケラチン生成細胞中で発現されることを実証する。初代ケラチン生成細胞はラミニン５−コートしたガラススライド上にプレートした。プレーティングの４８時間後、ケラチン生成細胞をＢｒｄＵ溶液と１時間インキュベートし、続いて、上記の実施例の節において記載されるように、抗ＰＫＣη（赤色）抗体及び抗ＢｒｄＵ（緑色）抗体を使用する免疫蛍光分析を行った。細胞を共焦点顕微鏡によってスキャンし、代表的な視野を写真撮影した。
【図１１】ＰＫＣηがケラチン生成細胞増殖を誘導するが、ＰＫＣη変異体はそれを減少することを実証する。初代皮膚ケラチン生成細胞に、組換えのＰＫＣηアデノウイルス又はＰＫＣηの顕性不活性変異体（ＤＮＰＫＣη又はＰＫＣ ＤＮη）アデノウイルスで１時間感染させた。感染の４８時間後、細胞増殖を、上記の実施例の節において記載される１時間の３Ｈ−チミジン取り込みによって分析した。結果を、ｃｐｍ／ディッシュとして提示する。対照は非感染細胞である。
【図１２Ａ】ＰＫＣη及びＤＮＰＫＣηの過剰発現が、ＰＫＣ局在化及び細胞形態を特異的に調節することを実証する。一次皮膚ケラチン生成細胞に、組換えＰＫＣηアデノウイルス又は顕性不活性変異体ＰＫＣη（ＰＫＣ ＤＮη）アデノウイルスを１時間感染させた。感染の４８時間後、ケラチン生成細胞を固定し、（Ａ）明視野写真撮影（×２０）及び（Ｂ）実験手順において記載されるような、ＰＫＣη特異的抗体、続いてＦＩＴＣ結合体化二次抗体を利用する免疫蛍光分析に供する。対照は非感染細胞である。
【図１２Ｂ】ＰＫＣη及びＤＮＰＫＣηの過剰発現が、ＰＫＣ局在化及び細胞形態を特異的に調節することを実証する。一次皮膚ケラチン生成細胞に、組換えＰＫＣηアデノウイルス又は顕性不活性変異体ＰＫＣη（ＰＫＣ ＤＮη）アデノウイルスを１時間感染させた。感染の４８時間後、ケラチン生成細胞を固定し、（Ａ）明視野写真撮影（×２０）及び（Ｂ）実験手順において記載されるような、ＰＫＣη特異的抗体、続いてＦＩＴＣ結合体化二次抗体を利用する免疫蛍光分析に供する。対照は非感染細胞である。
【図１３Ａ】ＰＫＣη発現の阻害が、増殖しているケラチン生成細胞におけるケラチン生成細胞分化を誘導することを示す。初代皮膚ケラチン生成細胞を低Ｃａ２＋培地中で増殖状態に維持するか、又は０．１２ｍＭ Ｃａ２＋中で２４時間分化させるかのいずれかであった。その後、ケラチン生成細胞に、組換えＰＫＣηアデノウイルス又はＰＫＣηの顕性不活性変異体（ＰＫＣ ＤＮη）アデノウイルスで１時間感染させた。感染の２４時間後、ケラチン生成細胞を、低Ｃａ２＋培地中で維持するか、又は０．１２ｍＭ Ｃａ２＋を含む分化培地に２４時間移すかのいずれかであった。感染の２４時間後、ケラチン生成細胞を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供した。ＰＫＣη（Ａ）及びケラチン１（Ｂ）の発現を、ウェスタンブロッティングによって分析した。
【図１３Ｂ】ＰＫＣη発現の阻害が、増殖しているケラチン生成細胞におけるケラチン生成細胞分化を誘導することを示す。初代皮膚ケラチン生成細胞を低Ｃａ２＋培地中で増殖状態に維持するか、又は０．１２ｍＭ Ｃａ２＋中で２４時間分化させるかのいずれかであった。その後、ケラチン生成細胞に、組換えＰＫＣηアデノウイルス又はＰＫＣηの顕性不活性変異体（ＰＫＣ ＤＮη）アデノウイルスで１時間感染させた。感染の２４時間後、ケラチン生成細胞を、低Ｃａ２＋培地中で維持するか、又は０．１２ｍＭ Ｃａ２＋を含む分化培地に２４時間移すかのいずれかであった。感染の２４時間後、ケラチン生成細胞を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供した。ＰＫＣη（Ａ）及びケラチン１（Ｂ）の発現を、ウェスタンブロッティングによって分析した。
【図１４】ＰＫＣηの局所的インビボ発現が顆粒組織の形成を増強し、且つマウス切開性創傷における創傷治癒を加速することを実証する。全体の皮膚の７ｍｍの切開をヌードマウスの背に作製した。対照β−ｇａｌ、ＰＫＣη、及びＰＫＣαのアデノウイルス懸濁液の局所塗布を、創傷の１日後及び４日後に行った。全体の皮膚の創傷を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、皮膚切片をＨ＆Ｅ染色及び明視野顕微鏡によって組織学的に分析した。Ｅ−表皮、Ｄ−真皮。
【図１５】インスリンが、増殖しているケラチン生成細胞中でＰＫＣδのトランスロケーションを特異的に誘導するが、ＩＧＦ１は誘導しないことを実証する。初代ケラチン生成細胞は、上記の実施例の節において記載されるように、単離及びプレートされた。増殖しているケラチン生成細胞は、それらが８０％コンフルエンシーに達するまで、低Ｃａ２＋培地（０．０５ｍＭ）中で５日間維持された。細胞を、１０−７Ｍインスリン（Ｉｎｓ）又は１０−８Ｍ ＩＧＦ１（ＩＧＦ）で１５分間刺激した。記載されるように、細胞を溶解し、刺激された細胞及び対照の未刺激（Ｃｏｎｔ）細胞の２０μｇの膜又は細胞質ゾル抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び転写に供した。ブロットを、各ＰＫＣアイソフォームに対する特異的ポリクローナル抗体でプローブした。
【図１６】インスリンがＰＫＣδ活性を誘導するが、ＩＧＦ１は誘導しないことを示す。ＰＫＣδ活性を決定するために、５日間のケラチン生成細胞培養を、１０−７Ｍインスリン（Ｉｎｓ）又は１０−８Ｍ ＩＧＦ１（ＩＧＦ）で所定の時間（１、１５、又は３０分間）刺激した。ＰＫＣδを、特異的抗ＰＫＣδ抗体を使用して、膜画分（青色バー、ｍｅｍ）及び細胞質ゾル画分（紫色バー、ｃｙｔｏ）から免疫沈殿した。ＰＫＣδ免疫沈殿物を、実験手順において記載されるように、インビトロキナーゼアッセイを利用するＰＫＣについて分析した。各バーは、３つの別々の実験における３回の測定の平均±ＳＥを表す。値はｐｍｏｌ ＡＴＰ／ディッシュ／分として表される。
【図１７Ａ】インスリン及びＩＧＦ１がケラチン生成細胞増殖に対する相加的な効果を有することを示す。増殖しているケラチン生成細胞を、これらが８０％コンフルエンスに達するまで、低Ｃａ２＋培地（０．０５ｍＭ）中で５日間維持した。（Ａ）５日間のケラチン生成細胞培養を、所定濃度でのインスリン又はＩＧＦ１で２４時間刺激した。（Ｂ）並行して、ケラチン生成細胞を、１０−７Ｍインスリン（Ｉｎｓ）及び増加用量のＩＧＦ１（ＩＧＦ）で刺激した。各濃度において、右のカラム（縞模様のバー）は、両方のホルモンが一緒に加えられたときに観察される増殖を表す。左のバーは、１０−７Ｍインスリン（赤いバー）及び増加濃度のＩＧＦ１（灰色のバー）の別々の効果を実証する。チミジン取り込みは、実験手順に記載されているように測定した。示される結果は６回の実験を表す。各バーは、対照の未刺激ケラチン生成細胞の上のパーセントとして表される、３回の測定の平均±ＳＥを表す。
【図１７Ｂ】インスリン及びＩＧＦ１がケラチン生成細胞増殖に対する相加的な効果を有することを示す。増殖しているケラチン生成細胞を、これらが８０％コンフルエンスに達するまで、低Ｃａ２＋培地（０．０５ｍＭ）中で５日間維持した。（Ａ）５日間のケラチン生成細胞培養を、所定濃度でのインスリン又はＩＧＦ１で２４時間刺激した。（Ｂ）並行して、ケラチン生成細胞を、１０−７Ｍインスリン（Ｉｎｓ）及び増加用量のＩＧＦ１（ＩＧＦ）で刺激した。各濃度において、右のカラム（縞模様のバー）は、両方のホルモンが一緒に加えられたときに観察される増殖を表す。左のバーは、１０−７Ｍインスリン（赤いバー）及び増加濃度のＩＧＦ１（灰色のバー）の別々の効果を実証する。チミジン取り込みは、実験手順に記載されているように測定した。示される結果は６回の実験を表す。各バーは、対照の未刺激ケラチン生成細胞の上のパーセントとして表される、３回の測定の平均±ＳＥを表す。
【図１８Ａ】組換えＰＫＣアデノウイルス構築物の過剰発現を実証する。ケラチン生成細胞培養物を、野生型ＰＫＣδ（ＷＴＰＫＣδ）、野生型ＰＫＣα（ＷＴＰＫＣα）、又は顕性不活性ＰＫＣδ変異体（ＤＮＰＫＣδ）を含む組換えアデノウイルス構築物を利用して感染させた。（Ａ）感染後、細胞を２４時間培養し、収集し、２０μｇのタンパク質抽出物を、特異的抗ＰＫＣα抗体又は抗ＰＫＣδ抗体を使用して、ウェスタンブロッティングによって分析した。提示されるブロットは、５回の別々の実験を表す。（Ｂ）感染の２４時間後、細胞を収集し、ＰＫＣα又はＰＫＣδの免疫沈殿物を、インビトロキナーゼアッセイによって評価した。
【図１８Ｂ】組換えＰＫＣアデノウイルス構築物の過剰発現を実証する。ケラチン生成細胞培養物を、野生型ＰＫＣδ（ＷＴＰＫＣδ）、野生型ＰＫＣα（ＷＴＰＫＣα）、又は顕性不活性ＰＫＣδ変異体（ＤＮＰＫＣδ）を含む組換えアデノウイルス構築物を利用して感染させた。（Ａ）感染後、細胞を２４時間培養し、収集し、２０μｇのタンパク質抽出物を、特異的抗ＰＫＣα抗体又は抗ＰＫＣδ抗体を使用して、ウェスタンブロッティングによって分析した。提示されるブロットは、５回の別々の実験を表す。（Ｂ）感染の２４時間後、細胞を収集し、ＰＫＣα又はＰＫＣδの免疫沈殿物を、インビトロキナーゼアッセイによって評価した。
【図１９】インスリン又はＩＧＦ１で誘導される増殖に対するＰＫＣ過剰発現の効果を示す。非感染（明るい青いバー）、又はＷＴＰＫＣδを過剰発現する細胞（暗い青いバー）若しくはＤＮＰＫＣδを過剰発現する細胞（斜線をつけた青いバー）を、１０−７Ｍインスリン（Ｉｎｓ）、１０−８Ｍ ＩＧＦ１（ＩＧＦ）、又は両方（Ｉｎｓ＋ＩＧＦ）で２４時間処理した。チミジン取り込みを、実験手順に記載されるように測定した。各バーは、別々の培地に対して行った３つの実験における３回の測定の平均±ＳＥを表す。値は、各実験における同じ培養物からの、対照の未刺激細胞のパーセントとして表される。
【図２０】ＰＫＣδ活性の阻害が、インスリン誘導性のケラチン生成細胞増殖を特異的に無効にすることを示す。初代ケラチン生成細胞を、上記の実施例の節において記載されるように培養した。非感染細胞又はＤＮＰＫＣδで感染したケラチン生成細胞を、以下の増殖因子濃度で２４時間刺激した：１０−７Ｍ インスリン（Ｉｎｓ）、１０−８Ｍ ＩＧＦ１（ＩＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ、１ｎｇ／ｍｌ ＫＧＦ、又は５ｎｇ／ｍｌ ＥＣＧＦ。チミジン取り込みを、上記の実施例の節において記載されるように測定した。各バーは、別々の培地に対して行った３つの実験における３回の測定の平均±ＳＥを表す。値は、各実験における同じ培養物からの、対照の未刺激細胞のパーセントとして表される。
【図２１】ＰＫＣδの過剰発現がインスリン誘導性のケラチン生成細胞増殖を特異的に媒介することを示す。初代ケラチン生成細胞を図１の下に記載されるように培養した。非感染細胞又は過剰発現ＷＴＰＫＣδで感染されたケラチン生成細胞を、以下の増殖因子濃度で２４時間刺激した：１０−７Ｍ インスリン（Ｉｎｓ）、１０−８Ｍ ＩＧＦ１（ＩＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ、１ｎｇ／ｍｌ ＫＧＦ、又は５ｎｇ／ｍｌ ＥＣＧＦ。チミジン取り込みを、上記の実施例の節において記載されるように測定した。各バーは、別々の培地に対して行った３つの実験における３回の測定の平均±ＳＥを表す。値は、各実験における同じ培養物からの、対照の未刺激細胞のパーセントとして表される。
【図２２Ａ】インビボでの皮膚の創傷治癒プロセスにおけるＰＫＣδ及びＰＫＣζの有意さを実証する。新規に開発された、アイソフォーム特異的な無ＰＫＣマウス、無ＰＫＣαマウス、無ＰＫＣδマウス、及び無ＰＫＣζマウス、並びにそれらの野生型同腹仔のインビボマウスモデルを利用することが、創傷治癒の研究に供された。マウスは麻酔され、直径４ｍｍのパンチ生検を通した皮膚がマウスの背に作製された。１週間の追跡後、マウスの皮膚を取り出し、皮膚の創傷治癒を、破裂チャンバー技術を利用する創傷強度試験に皮膚弁を供することによって定量した。値は、破裂が起こるまでモニターされるチャンバー内の最大圧力を表す破裂圧力として表される。結果は、１２〜２０匹のマウスの別個の群において得られる測定を表す。実験を少なくとも３回繰り返した。
【図２２Ｂ】インビボでの皮膚の創傷治癒プロセスにおけるＰＫＣδ及びＰＫＣζの有意さを実証する。新規に開発された、アイソフォーム特異的な無ＰＫＣマウス、無ＰＫＣαマウス、無ＰＫＣδマウス、及び無ＰＫＣζマウス、並びにそれらの野生型同腹仔のインビボマウスモデルを利用することが、創傷治癒の研究に供された。マウスは麻酔され、直径４ｍｍのパンチ生検を通した皮膚がマウスの背に作製された。１週間の追跡後、マウスの皮膚を取り出し、皮膚の創傷治癒を、破裂チャンバー技術を利用する創傷強度試験に皮膚弁を供することによって定量した。値は、破裂が起こるまでモニターされるチャンバー内の最大圧力を表す破裂圧力として表される。結果は、１２〜２０匹のマウスの別個の群において得られる測定を表す。実験を少なくとも３回繰り返した。
【図２３】初代皮膚ケラチン生成細胞におけるＳＴＡＴ３とＰＫＣδの間の特異的相互作用を同定する。初代ケラチン生成細胞は、未処理であるか（上のパネル）、又はアイソフォーム特異的な、組換えＰＫＣアデノウイルスで１時間感染されたか（下のパネル）のいずれかであった。細胞を抽出し、アイソフォーム特異的ＰＫＣ抗体で免疫沈殿（ＩＰ）させた。この免疫沈殿物を、抗ＰＫＣ又は抗ＳＴＡＴ３抗体を使用するウェスタンブロット分析に供した。
【図２４】インスリン誘導性のＳＴＡＴ３の転写活性化に対するＰＫＣδ活性化の重要性を実証する。初代ケラチン生成細胞をガラススライド上に配置し、それらが８０％コンフルエントに達するまで、低Ｃａ＋＋培地（０．０５ｍｍｏｌ／ｌ）中で５日間維持した。細胞は未処理であるか（Ｃｏｎｔ、上のパネル）又は５μＭロットレリンで７分間前処理し（Ｒ、下のパネル）、続いて１０−７Ｍインスリンで５分間処理した（Ｉｎｓ）。細胞をメタノールで固定し、洗浄し、風乾した。培養物を、抗ホスホ−Ｔｙｒ−７０５−ＳＴＡＴ３抗体、続いてＦＩＴＣ結合体化二次抗体を使用する免疫蛍光によって分析した。細胞を共焦点顕微鏡によってスキャンした。
【図２５】ＤＮ ＰＫＣδの過剰発現が、ＰＫＣδ及びＳＴＡＴ３の過剰発現によって誘導されたケラチン生成細胞増殖を阻害することを実証する。初代ケラチン生成細胞を、β−Ｇａｌ（対照のため）、ＰＫＣδ、ＷＴ ＳＴＡＴ３、ＤＮ ＳＴＡＴ３、又はＤＮ ＰＫＣδ、続いてＳＴＡＴ３での二重感染を含む組換えアデノウイルス構築物で１時間感染させた。感染の２４時間後、細胞増殖を、１時間の３Ｈ−チミジン取り込みによって分析した。結果はＤＰＭ／ｍｇタンパク質として提示される。各バーは、同じ培養からのプレート中での３回の測定の平均を表す。
【図２６】インビボでの創傷治癒に対するインスリン濃度及び塗布の頻度の重要性を実証する。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、ＰＢＳ（対照）を用いて、又は異なる濃度及び頻度のインスリン塗布（すなわち、１日に７回の反復塗布対単回塗布）を用いて処置した。マウスを創傷形成の７日後に屠殺し、処置した創傷の面積を測定した。結果を、ｍｍ２創傷面積として提示し、各バーは６回の複製の平均±標準偏差を表す（ｐ＜０．００５）。
【図２７】インビボでの創傷治癒に対するインスリン濃度及び塗布の頻度の組織学的効果を実証する。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、異なる濃度及び頻度のインスリン塗布（すなわち、１日に７回の反復塗布対単回塗布）を用いて処置した。組織学的創傷切片を、創傷形成の７日後に実行し、表皮及び真皮の閉鎖（創傷収縮）について分析した。表皮閉鎖はケラチン１４（Ｋ１４）抗体染色によって評価し（左のパネル）、創傷が全体のギャップを横切ってポジティブに染色された場合にポジティブと見なした。真皮閉鎖は、両方の真皮の創傷の側が×１００倍率の単一の視野において光学顕微鏡下で観察可能であった場合にポジティブと見なした（右のパネル）。結果を、対照に対する創傷閉鎖のパーセントとして提示し、各バーは６回の複製の平均を表す。
【図２８】インビボでの創傷治癒に対する、インスリン及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を組み合わせることの相乗作用を実証する。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、インスリン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、又はインスリン及びＰＤＧＦ−ＢＢの組み合わせの単回塗布を用いて処置した。処置したマウスを創傷形成の７日後に屠殺し、表皮及び真皮の閉鎖（創傷収縮）の組織学的分析のために生検を採取した。表皮閉鎖はケラチン１４（Ｋ１４）抗体染色によって評価し（左のパネル）、創傷が全体のギャップを横切ってポジティブに染色された場合にポジティブと見なした。真皮閉鎖は、両方の真皮の創傷の側が×１００倍率の単一の視野において光学顕微鏡下で観察可能であった場合にポジティブと見なした（右のパネル）。結果を、対照に対する創傷閉鎖のパーセントとして棒グラフ中に要約されたように提示し、各バーは６回の複製の平均を表す。
【図２９】インビボでの創傷治癒に対する、インスリン及びＰＫＣα阻害剤を組み合わせることの形態学的効果を例証する写真である。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、処置しないか（対照）、又はＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）と組み合わせたインスリン（ＨＯ／０１）を用いて処置したかのいずれかであった。形態学的観察のために、皮膚生検を創傷形成の７日後に取り出した。図２９Ａ〜Ｂは対照創傷を示すのに対し、図２９Ｃ−Ｄは処置した創傷を示す。
【図３０】真皮閉鎖（創傷収縮）に対するインスリン及びＰＫＣα阻害剤の組み合わせ効果を例証する組織顕微鏡写真である。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、処置しないか（対照）、又はＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）と組み合わせたインスリン（ＨＯ／０１）を用いて毎日処置したかのいずれかであった。処置したマウスを創傷形成の７日後に屠殺した。組織学的創傷切片を実行し、光学顕微鏡下で観察した。真皮閉鎖は、両方の真皮の創傷の側が×１００倍率の単一の視野において観察可能であった場合にポジティブと見なした。未処置対照切片における開いた創傷の領域（左のパネル）は大きすぎて×１００倍率の単一の視野に含まれなかったのに対して、処置した創傷切片（右のパネル）はポジティブな真皮閉鎖を示す。黄色の斑点状の線は真皮の端の印である。
【図３１】表皮閉鎖に対する、インスリン及びＰＫＣαの組み合わせ効果を例証する組織顕微鏡像である。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、処置しないか、又はＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）と組み合わせたインスリン（ＨＯ／０１）を用いて毎日処置したかのいずれかであった。処置したマウスを創傷形成の７日後に屠殺した。組織学的創傷切片を実行し、ケラチン１４（基底ケラチン生成細胞の指標）で染色し、光学顕微鏡下で観察した。未処置対照切片（左のパネル）における開いた創傷の領域（矢印で示す）は大きすぎて×１００倍率の単一の視野に含まれなかったのに対して、処置した創傷切片（右のパネル）は全体の創傷ギャップを通して表皮閉鎖を示す。
【図３２】表皮細胞の空間的分化に対する、インスリン及びＰＫＣα阻害剤の組み合わせ効果を例証する組織顕微鏡像である。創傷を有するマウス（Ｃ５７ＢＬ、８〜１０週齢）を、ＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）と組み合わせたインスリン（ＨＯ／０１）の局所的塗布を用いて毎日処置した。処置したマウスを創傷形成の７日後に屠殺した。組織学的創傷切片を実行し、空間的細胞分化の初期段階を強調するケラチン１（Ｋ１）抗体で染色した。未処置対照切片（左のパネル）は巨大な未分化創傷領域（矢印で示す）を示すのに対して、処置した創傷切片（右のパネル）においては大規模な表皮再構築が観察可能である。
【図３３】インビボでの創傷治癒に対する、ＰＫＣα阻害剤と組み合わせたインスリンの定量的効果を実証する。創傷を有するマウス（Ｃ５７ＢＬ、８〜１０週齢）を、ＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）と組み合わせたインスリン（ＨＯ／０１）の局所的塗布を用いて毎日処置した。処置したマウスを創傷形成の７日後に屠殺した。組織学的創傷切片を実行し、上記の図３０〜３２に記載されるのと同様に、真皮収縮、表皮閉鎖、及び空間的分化について分析した。棒グラフは、各処置群中の組織学的分析によって決定されるような、完全に治癒した創傷の発生（パーセンテージ）を示す。
【図３４】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、ＰＫＣαの発現及び／若しくは活性を阻害すること、並びに真皮細胞における別のＰＫＣアイソフォームの発現及び／若しくは活性を調節すること、又は真皮細胞にホルモンを投与することの組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚線維芽細胞を、顕性不活性（ＤＮ）キナーゼ不活性ＰＫＣαで感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３４Ａ）、又は野生型（ＷＴ）ＰＫＣδ（図３４Ｂ）、ＰＫＣη（図３４Ｃ）、ＷＴ ＰＫＣζ（図３４Ｄ）、若しくはＷＴ ＰＫＣε（図３４Ｅ）で感染させたかのいずれかであった。代替的には、ＰＫＣα阻害された培養物は、アディプシン（２μｇ／ｍｌ；図３４Ｆ）又はインスリン（６．７×１０−７Ｍ；図３４Ｇ）で処置した。写真撮影を、処置の２４時間後に行った。
【図３５】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、ＰＫＣαの発現及び／若しくは活性を阻害すること、並びに真皮細胞における別のＰＫＣアイソフォームの発現及び／若しくは活性を調節すること、又は真皮細胞への増殖因子の投与の組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚ケラチン生成細胞を、顕性不活性（ＤＮ）キナーゼ不活性ＰＫＣαで感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３５Ａ）、又は野生型（ＷＴ）ＰＫＣε（図３５Ｄ）、ＷＴ ＰＫＣζ（図３５Ｅ）、若しくはＷＴ ＰＫＣη（図３５Ｆ）で感染させたかのいずれかであった。代替的には、ＰＫＣα阻害された培養物は、ＩＬ−６（１μｇ／ディッシュ；図３５Ｂ）、ＫＧＦ（１μｇ／ディッシュ；図３５Ｃ）、ＰＫＣδ ＲＡＣＫ（１０−７Ｍ；図３５Ｈ）、又はＴＮＦα（１２μｇ／ｍｌ；図３５Ｇ）で処置した。写真撮影を、処置の２４時間後に行った。
【図３６】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、真皮細胞中のＰＫＣζの発現及び／又は活性を阻害すること、並びに真皮細胞に増殖因子を投与することの組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚線維芽細胞を、顕性不活性（ＤＮ）キナーゼ不活性型のＰＫＣζ（ＤＮζ）で感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３６Ａ）、又はＫＧＦ（１μｇ／ディッシュ；図３６Ｂ）で処置したかのいずれかであった。写真撮影を、処置の２４時間後に行った。
【図３７】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、真皮細胞におけるＰＫＣζの発現及び／又は活性を阻害すること、並びに真皮細胞に増殖因子又はホルモンを投与することの組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚ケラチン生成細胞を、顕性不活性（ＤＮ）キナーゼ不活性型のＰＫＣζ（ＤＮζ）で感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３７Ａ）、又はＩＬ−６（１μｇ／ディッシュ；図３７Ｂ）、ＴＮＦα（１２μｇ／ｍｌ；図３７Ｃ）、若しくはアディポネクチン（１μｇ／ディッシュ；図３７Ｄ）で処置したかのいずれかであった。写真撮影を、処置の２４時間後に行った。
【図３８】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、真皮細胞におけるＰＫＣβの発現及び／又は活性を阻害すること、並びに真皮細胞に増殖因子、インスリン、又はＧＷ９６６２を投与することの組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚線維芽細胞を、顕性不活性（ＤＮ）キナーゼ不活性型のＰＫＣβ（ＤＮβ）で感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３８Ａ）、又はＫＦＧ（１μｇ／ディッシュ；図３８Ｂ）ＩＬ−６（１μｇ／ディッシュ；図３８Ｃ）、インスリン（６．７×１０−７Ｍ；図３８Ｄ）、又はＧＷ９６６２（１μｇ／ディッシュ；図３８Ｅ）で処置したかのいずれかであった。写真撮影を、処置の２４時間後に行った。
【図３９】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、ＰＫＣδの発現及び／又は活性を促進すること、並びに真皮細胞における別のＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節すること、又は真皮細胞にホルモンを投与することの組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚ケラチン生成細胞を、ＰＫＣδ（ＤＮδ）の野生型（ＷＴ）のキナーゼ型で感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３９Ａ）、又はＷＴ ＰＫＣζ（ＰＫＣζ；図３９Ｂ）、ＷＴ ＰＫＣε（ＰＫＣε；図３９Ｃ）、又はＤＮ ＰＫＣα（ＰＫＣα、図３０Ｄ）で処置したかのいずれかであった。代替的には、ＰＫＣδ促進された培養物は、アディプシン（２μｇ／ｍｌ；図３９Ｅ）で処置した。写真撮影を、処置の４８時間後に行った。
【図４０】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、コポリマー１、インスリン、ＰＫＣα偽基質、又はこれらの組み合わせを投与することの効果を例証する写真である。培養した初代皮膚ケラチン生成細胞を、未処置のままであるか（図４０Ａ）、又はインスリンのみ（６．７×１０−７Ｍ；図４０Ｂ）、コポリマー１のみ（５５μｇ／ディッシュ；図４０Ｃ）、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ６．７×１０−７Ｍ及び１０７Ｍ；図４０Ｄ）、コポリマー１及びインスリンの混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ及び６．７×１０−７Ｍ；図４０Ｅ）、若しくはコポリマー１、インスリン、及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ、６．７×１０−７Ｍ、及び１０７Ｍ；図４０Ｆ）で処置したかのいずれかであった。写真撮影を、処置の４８時間後に行った。
【図４１Ａ】インビボでの創傷の治癒に対する、コポリマー１、インスリン、ＰＫＣα偽基質、又はこれらの組み合わせの効果を例証する写真である。創傷を有するマウスを、未処置のままであるか（図４１Ａ）、又はコポリマー１（５５μｇ／ｍｌ；図４１Ｂ）、コポリマー１及びインスリンの混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ及び１μＭ；図４１Ｃ）、若しくはコポリマー１、インスリン、及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ５５μｇ／ｍｌ、１μＭ、及び１μＭ；図４１Ｄ）の局所的塗布を用いて４日間毎日処置した。写真撮影を、処置の４日後に行った。
【図４１Ｂ】インビボでの創傷の治癒に対する、コポリマー１、インスリン、ＰＫＣα偽基質、又はこれらの組み合わせの効果を例証する写真である。創傷を有するマウスを、未処置のままであるか（図４１Ａ）、又はコポリマー１（５５μｇ／ｍｌ；図４１Ｂ）、コポリマー１及びインスリンの混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ及び１μＭ；図４１Ｃ）、若しくはコポリマー１、インスリン、及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ５５μｇ／ｍｌ、１μＭ、及び１μＭ；図４１Ｄ）の局所的塗布を用いて４日間毎日処置した。写真撮影を、処置の４日後に行った。
【図４１Ｃ】インビボでの創傷の治癒に対する、コポリマー１、インスリン、ＰＫＣα偽基質、又はこれらの組み合わせの効果を例証する写真である。創傷を有するマウスを、未処置のままであるか（図４１Ａ）、又はコポリマー１（５５μｇ／ｍｌ；図４１Ｂ）、コポリマー１及びインスリンの混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ及び１μＭ；図４１Ｃ）、若しくはコポリマー１、インスリン、及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ５５μｇ／ｍｌ、１μＭ、及び１μＭ；図４１Ｄ）の局所的塗布を用いて４日間毎日処置した。写真撮影を、処置の４日後に行った。
【図４１Ｄ】インビボでの創傷の治癒に対する、コポリマー１、インスリン、ＰＫＣα偽基質、又はこれらの組み合わせの効果を例証する写真である。創傷を有するマウスを、未処置のままであるか（図４１Ａ）、又はコポリマー１（５５μｇ／ｍｌ；図４１Ｂ）、コポリマー１及びインスリンの混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ及び１μＭ；図４１Ｃ）、若しくはコポリマー１、インスリン、及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ５５μｇ／ｍｌ、１μＭ、及び１μＭ；図４１Ｄ）の局所的塗布を用いて４日間毎日処置した。写真撮影を、処置の４日後に行った。
【図４２Ａ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｂ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｃ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｄ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｅ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｆ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｇ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｈ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４３】創傷及び損傷した皮膚の治癒に対する、ＰＫＣα阻害剤と組み合わせたインスリンの効果を例証する写真である。長軸方向の創傷切開を、Ｌａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅｓ ＆ Ｌａｎｄｒａｃｅ家畜用ブタの背に行い、ＰＢＳ（対照）又は１μＭ インスリン及び１μＭ ＰＫＣα偽基質（ＨＯ／０３／０３）の混合物のいずれかで、１５日間毎日処置した。創傷を、創傷形成の３０日後に写真撮影した。ＨＯ／０３／０３処置された創傷は、瘢痕形成を伴わずに完全に治癒し、緩衝液対照と比較して、顕著に改善された皮膚の美観を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本発明は、細胞増殖及び／又は細胞分化を誘導及び／又は促進するために、ＰＫＣとしても知られるセリン／スレオニンタンパク質キナーゼの発現及び／又は活性化を調節するように設計された方法及び薬剤組成物の発明であり、それによって創傷の治癒プロセスを促進する。本発明の教示に従って、例えば、（ｉ）ＰＫＣ発現構築物での創傷細胞の形質転換、（ｉｉ）創傷細胞の内因性ＰＫＣ遺伝子と隣接したその上流に挿入するシス作用性エレメントでの創傷細胞の形質転換、（ｉｉｉ）創傷細胞でＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節するインスリン、並びにインスリンと相乗的に作用する他の作用物質の投与、（ｉｖ）インスリン発現構築物から産生され、発現され分泌されるインスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、そのインスリン発現構築物での創傷細胞の形質転換、（ｖ）発現され分泌されるインスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、創傷細胞の内因性インスリン遺伝子と隣接したその上流に挿入するシス作用性エレメントでの創傷細胞の形質転換、（ｖｉ）創傷へのインスリン分泌細胞の移植、（ｖｉｉ）インスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、内因性インスリンの産生及び分泌を誘導するトランス作用性因子、例えばＰＤＸ１での創傷細胞の形質転換、並びに（ｖｉｉｉ）創傷へのＰＫＣ調節因子の投与によって、そのような発現の調節を実施することができる。本発明に従った方法及び薬剤組成物の原理及び操作は、図面及び添付した説明を参照するとよりよく理解することができる。
【００８０】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、その適用において、下記の説明で示し、又は実施例の項で例示する構築の詳細、及び構成要素の配置に限らないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態も可能であり、或いは様々な形で実施又は実行することも可能である。また、本明細書で使用する語法及び専門用語が、説明を目的とするものであり、限定するものと見なすべきでないことも理解されたい。
【００８１】
成体の皮膚は、２つの層：角質化した層を成す表皮、並びに支持及び栄養をもたらす、底にある厚い層のコラーゲンに富む皮膚結合組織を含む。皮膚は、外界に対する保護障壁として働く。したがって、皮膚でのどんな損傷又は破損も、迅速に且つ効率よく修復しなければならない。上記の背景の項で記載したように、修復の第１段階は、最初の創傷を塞ぐ血餅の形成によって達成される。その後、炎症細胞、線維芽細胞及び毛細血管が血餅に侵入して、肉芽組織を形成する。続いての段階では、創傷の再上皮化がなされ、基底のケラチン生成細胞が半接着斑の接触を喪失しなければならず、ケラチン生成細胞がその肉芽組織の上に移動して創傷を覆う。ケラチン生成細胞の移動後、ケラチン生成細胞は増殖促進に入り、損傷の間に喪失した細胞の補充を可能にする。創傷がケラチン生成細胞の単層で覆われた後、層を成す新たな表皮が形成され、新たな基底膜が再構築される（２０〜２３）。ＥＧＦファミリーの増殖因子、ＫＧＦ、ＰＤＧＦ及びＴＧＦβ１を含めて、いくつかの増殖因子がこのプロセスに関与することが示されている（２２〜２４）。これらの増殖因子の中で、ＥＧＦとＫＧＦの両方が、表皮ケラチン生成細胞の増殖及び移動の制御に密接に関与すると考えられている（２５、２６）。創傷治癒の生物学の理解に対する基本は、創傷中の細胞の移動、増殖、及び創傷の間隙中の新たな基質の定着を誘発するシグナルの知識である。
【００８２】
以下の開示中で示す本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を下記に定義する。
【００８３】
「創傷」という用語は、様々な形（例えば、長い寝床での静止状態からの褥瘡、外傷、切傷、潰瘍、熱傷などで誘導される創傷）のいずれかで惹起される皮膚及び皮下組織に対する損傷を広く指し、様々な特徴を伴う。創傷は通常、創傷の深さに応じて４つの程度のうち１つに分類される：（ｉ）第１度：上皮に限局した創傷；（ｉｉ）第２度：真皮まで拡大した創傷；（ｉｉｉ）第３度：皮下組織まで拡大した創傷；及び（ｉｖ）第４度（又は全層創傷）：骨が露出した（例えば、大転子や仙骨などの骨の圧点）創傷。
【００８４】
「部分層創傷」という用語は、第１度〜第３度を包含する創傷を指す；部分層創傷の例には、熱傷創、褥瘡、静脈うっ血性潰瘍、及び糖尿病性潰瘍がある。
【００８５】
「深い創傷」とは、第３度と第４度の両方の創傷を含むことを意味する。
【００８６】
創傷に関して「治癒」という用語は、瘢痕形成によるように、創傷を修復するプロセスを指す。
【００８７】
「皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する」という語句は、創傷収縮の肉芽組織形成の誘導及び／又は上皮化の誘導（すなわち、上皮中の新たな細胞の発生）を指す。創傷治癒は、好都合なことに、創傷領域の減少によって測定される。
【００８８】
本発明は、深い創傷及び慢性創傷を含めて、創傷の型すべてを治療することを意図するものである。
【００８９】
「慢性創傷」という用語は、３０日以内に治癒しなかった創傷を指す。
【００９０】
「形質転換細胞」という語句は、外因性核酸の取り込みによる細胞の核酸の内容の一時的な又は永久的な変化を指し、それを細胞ゲノムに組み込み細胞を遺伝子改変する、又は組み込まれない状態のままにする。
【００９１】
「シス作用性エレメント」という用語は、本明細書において、ＤＮＡ結合タンパク質の結合部位（例えば、エンハンサー、オペレーター及びプロモーター）として使用し、それによって同じ染色体上の１つ又は複数の遺伝子の活性に影響を及ぼす遺伝子領域を示すのに使用する。
【００９２】
「トランス作用性因子」という語句は、本明細書において、シス作用性エレメントと結合し、それからの遺伝子発現に関してその活性を調節する因子を示すのに使用する。したがって、ＰＤＸ１は、インスリン遺伝子プロモーターと結合し、その活性を調節するトランス作用性因子である。
【００９３】
「転写活性化物質」という語句は、本明細書において、遺伝子発現を増大させる因子を示すのに使用する。トランス作用性因子は、直接的な転写活性化物質の一例である。
【００９４】
「活性化物質」という用語は、本明細書において、活性を促進する分子を示すのに使用する。
【００９５】
本明細書において「発現及び／又は活性化の調節」という語句は、発現及び／又は活性化の促進又は抑制を指す。
【００９６】
ＰＫＣは、ケラチン生成細胞の増殖及び分化を媒介する主要なシグナル伝達経路である。ＰＫＣアイソフォームα、δ、ε、η及びζが皮膚で発現している（４、１０）。本発明を考え出す間、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節すると、細胞増殖及び／又は細胞分化が誘導され、それによって創傷の治癒プロセスが促進される可能性があると仮定した。本発明を実施に移す間、この理論は、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節すると、実際に細胞増殖及び細胞分化が誘導され、創傷の治癒プロセスが促進されることを示す多数の実験によって認められた。本明細書で非常に詳細までさらに述べるように、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節して、それによって創傷の治癒プロセスを促進する様々な異なる手法に着手した。実験による知見に基づいて、他の手法を考え出した。本発明を実施に移す間に、インスリンがＰＫＣの発現及び／又は活性化の調節因子として働くという際立った新規な現象が発見された。そのようなものとして、インスリンは、創傷の治癒プロセスを促進するように、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節する治療用作用物質として働くことができる。
【００９７】
別個のＰＫＣアイソフォームの特徴、並びに細胞の増殖及び／又は分化に対するその特異的な効果は、皮膚の創傷治癒の生物学に非常に重要である。ＰＫＣアデノウイルス構築物を利用すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒プロセスにおける様々なＰＫＣアイソフォームの特異的な役割を同定することが可能となる。すべてのアイソフォームが、ケラチン生成細胞の増殖及び分化の異なる側面に特異的に影響を及ぼすことができる。２種のアイソフォームＰＫＣδ及びＰＫＣζは、インテグリンの制御（下記の実施例６を参照）、基底膜との接着（下記の実施例９を参照）及び半接着斑形成（下記の実施例８を参照）を特異的に制御することができた。２種のアイソフォームＰＫＣδ及びＰＫＣηは、表皮ケラチン生成細胞の増殖の潜在的可能性を制御することが分かった（下記の実施例７及び１１を参照）。さらに、ＰＫＣηの顕性不活性アイソフォーム（ＤＮＰＫＣη）は、活発に増殖しているケラチン生成細胞の分化を特異的に誘導することができた（下記の実施例１２を参照）。最後に、皮膚での創傷治癒プロセスに対する別個のＰＫＣアイソフォームの重要性は、ｉｎ ｖｉｖｏ系でも実証された。別個のＰＫＣアイソフォームの発現が消失した無ＰＫＣマウスを利用して、皮膚ケラチン生成細胞の接着と運動のプロセスのどちらにも必要であることが分かったＰＫＣδ及びＰＫＣζが、動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ創傷治癒プロセスでも重要であることを本明細書において示す（実施例１９を参照）。無ＰＫＣの皮膚での皮膚全体の全層生検から、ＰＫＣδもＰＫＣζも創傷の適切な治癒に必須であるが、ＰＫＣαは必須ではないことが示唆された。さらに、下記の実施例２２は、ＰＫＣα抑制物質がｉｎ ｖｉｖｏで創傷治癒を有効に促進し、それによってＰＫＣαアイソフォームが創傷治癒に拮抗性である可能性があることが示唆されることを示すものである。
【００９８】
ＰＫＣηは、独特の組織分布を示す。それは上皮組織で主に発現する（２７、２８）。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる検討、並びに免疫組織化学的な検討から、ＰＫＣηが分化中の層及び分化能のある層で高度に発現することが示された（２７）。本明細書で提示する結果から、ＰＫＣηが、細胞生理に応じて皮膚の増殖と分化のどちらの機能的制御因子としても役割を有することが示唆される。ケラチン生成細胞が低Ｃａ２＋条件下で増殖状態に維持されているとき、ＰＫＣηは、対照ケラチン生成細胞より５〜７倍高い増殖速度を誘導した。しかし、Ｃａ２＋濃度を上昇させることによって細胞に分化を誘導したとき、対照細胞と比べて迅速且つ高い速度で分化が誘導された（実施例１２を参照）。増殖能と分化層の形成のどちらも実現されたので、このことから、ＰＫＣηが創傷治癒及び肉芽組織の形成を急激に誘導することができることを説明することができた。興味深いことに、ｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒の結果、及び成体期では通常高レベルでＰＫＣηを発現しない胚組織でのＰＫＣηの発現から、ＰＫＣηが同様に他の組織の増殖及び組織構成に役割を有すると考えられることが示唆された。これには、神経組織並びに皮膚組織及び筋組織があり、それらは創傷の肉芽組織中で効率よく治癒した。さらに、顕性不活性突然変異体を利用することによってケラチン生成細胞の分化を特異的に制御し、活発に増殖している細胞で正常な分化を誘導できると、特異的に分化を操作し、創傷治癒に関与する過剰増殖異常を調節することが可能となる。
【００９９】
ＰＫＣηの治癒能が、ヌードマウスの背中に作り出した創傷に対してｉｎ ｖｉｖｏで発揮されることが、本明細書において例示される。下記の実施例１４は、創傷にＰＫＣη発現構築物を投与すると、局所感染させてから４日後に肉芽組織が形成されたことを示すものである。
【０１００】
全体として、本明細書で提示する結果は、別個のＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性化（膜可動化）の調節が、創傷に対処する有効な手段であることを実証するものである。したがって、アイソフォームＰＫＣδ、ＰＫＣη及びＰＫＣζの発現及び／又は活性を増大させることによって、或いはアイソフォームＰＫＣαの発現及び／又は活性を抑制することによって創傷治癒を促進することができる。
【０１０１】
したがって、本発明の一態様によれば、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、皮膚創傷に、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節する少なくとも１種の作用物質を治療有効量投与することによって実施される。したがって、本発明のこの態様に従った方法を実施するための薬剤組成物は、有効成分である、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節する治療有効量の少なくとも１種の作用物質、並びに製剤上許容される担体を含む。
【０１０２】
本明細書において、「皮膚創傷」という語句は、それだけに限らないが、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、胃潰瘍やＨＩＶ関連潰瘍などの潰瘍、糖尿病関連の創傷、熱傷、日焼け、加齢による皮膚創傷、角膜潰瘍化による創傷、炎症性消化管疾患による創傷、腸炎症性疾患による創傷、クローン病による創傷、潰瘍性大腸炎、痔核、表皮水疱症による創傷、皮膚水疱形成性創傷、乾癬による創傷、動物の皮膚の創傷、動物の糖尿病による創傷、網膜症による創傷、口腔の創傷（粘膜炎）、膣粘膜炎による創傷、歯周病による創傷、裂傷、外科的切除による創傷、及び外科的接着後の創傷を含めて、任意の型の上皮創傷を指す。
【０１０３】
本明細書において「皮膚損傷」という語句は、例えば、しわ（例えば、紫外線照射誘導性のしわ）、皮膚の筋、間隙、隆起、大型の孔（例えば、汗腺の管路、皮脂腺や毛包などの付属器構造に伴うもの）やむら又は荒れ、皮膚の弾性の喪失（機能的な皮膚エラスチンの喪失及び／又は不活性化）、たるみ（眼の領域及び顎の腫脹を含む）、皮膚の堅固さの喪失、皮膚の締まりの喪失、皮膚の変形からの反跳の喪失、変色（眼下の隈を含む）、痣、黄ばみ、染みやそばかすなどの色素沈着過剰な皮膚の領域、角化上皮症、異常分化、ケラチン過剰生成、弾性線維症、コラーゲン崩壊や、角質層、真皮、表皮、皮膚の血管系（例えば毛細血管拡張症又はクモ状血管）、及び基底にある組織、特に皮膚と隣接する組織における他の組織変化など、任意の型の皮膚の損傷又は状態を指す。
【０１０４】
皮膚は、古典的なインスリン反応性の組織でないと考えられている。したがって、皮膚におけるインスリンの効果は、密接に関連するＩＧＦＲをそれが活性化できることに主に起因すると考えられる。ケラチン形成細胞では、インスリンもＩＧＦ１も、どちらの受容体も刺激し、類似した下流のエフェクターを活性化することができることが示された（３４）。しかし、本発明は、どちらの増殖因子も投与量依存的にケラチン生成細胞増殖を誘導するが、各ホルモンは異なるシグナル伝達経路を介してその効果を発揮することを示すものである。インスリン及びＩＧＦ１によるケラチン生成細胞増殖の差次的な制御についての最初の示唆は、これらのホルモンが、一緒に添加したときに、各ホルモンの増殖を誘導する最大濃度でケラチン生成細胞増殖に対する相加的な効果を有するという知見によって確認された（実施例１５を参照）。ケラチン生成細胞増殖の制御におけるインスリンとＩＧＦ１のシグナル伝達経路の分岐点を同定するために、ケラチン生成細胞増殖も制御し、インスリンシグナル伝達の下流のエフェクターとしても働くことが知られているエレメントを調べた。これらの検討から、インスリンシグナル伝達が、ケラチン生成細胞増殖においてＰＫＣδによって特異的に媒介されることが明らかとなった（実施例１７を参照）。ＰＫＣδは、ＰＫＣファミリーのタンパク質の中で独特のアイソフォームであり、様々な細胞型の増殖及び成熟に特異的に関与する（３５）。しかし、ＰＫＣδが、ＥＧＦ、血小板由来増殖因子及び神経伝達物質を含めたいくつかの増殖因子の刺激によって特異的に制御されることが示されたが、その生理的な効果は、アポトーシス、分化、及び細胞周期遅延又は停止を含めて、増殖因子による細胞増殖抑制に関与することが示された（３６〜４１）。最近、Ｃａ２＋の上昇後１２〜２４時間以内に、培養マウスケラチン生成細胞でα６β４インテグリン複合体の選択的な喪失が、Ｋ１の誘導へとつながることが示された（６）。α６β４タンパク質発現の喪失は、α６鎖及びβ４鎖のプロセシングの促進を含む転写及び翻訳後の事象の結果である。予備的な検討では、ＰＫＣの活性化と、α６β４インテグリンのプロセシング及び制御とのつながりが明らかとなった。これらの結果は、ケラチン生成細胞の脱離を誘導するα６β４発現及び半接着斑形成の喪失におけるＰＫＣδ並びにＰＫＣζの役割に対する以前の結果と一致する。しかし、本発明は、インスリン誘導性のケラチン生成細胞増殖の標的としての、ＰＫＣδの他の役割を同定するものである。下記の実施例は、それだけに限らないが、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＣＧＦ及びＩＧＦ１を含む種々の増殖因子ではなく、インスリン刺激だけが、転位し、皮膚で発現される他のＰＫＣアイソフォームのいずれでもなくＰＫＣδを活性化することができることを示すものである。インスリン刺激に対するＰＫＣδの重要性は、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＣＧＦ及びＩＧＦ１による分裂促進刺激がＰＫＣδの顕性不活性突然変異体によって抑止されなかったときにさらに確認され、インスリンは、ケラチン生成細胞増殖の制御におけるこのＰＫＣアイソフォームの主要な活性化物質であるように思われた（実施例１７を参照）。しかし、ケラチン生成細胞をＷＴのＰＫＣδに感染させたとき、ＥＧＦ及びＫＧＦによるケラチン生成細胞の分裂促進刺激が増強された。このことは、ＰＫＣδの活性化が、上流のシグナル伝達経路による他の増殖因子の増殖刺激にも不可欠であることを示すものである。さらに、インスリン誘導性のＰＫＣδ活性化及びケラチン生成細胞増殖を媒介する下流のエレメントを特徴付け、このプロセスでの転写活性化物質であるＳＴＡＴ３の関与を同定した。ＳＴＡＴ（転写シグナル伝達因子及び活性化因子（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ））タンパク質は、様々なサイトカイン及び増殖因子によって動員される転写因子ファミリーである。既知のＳＴＡＴファミリーの構成要素７個中で、ＳＴＡＴ３は独特である。他のＳＴＡＴファミリーの構成要素ではなくＳＴＡＴ３を標的として破壊すると、早期の胚性致死に至る。特に、皮膚でＳＴＡＴ３の条件付き除去を行ったとき、皮膚の再構築が重度に崩壊した。活性化後、ＳＴＡＴタンパク質はホモダイマー又はヘテロダイマーを形成し、核へと転位し、標的遺伝子のＤＮＡ反応エレメントと結合して転写を誘導する。ケラチン生成細胞では、皮膚で発現される他のＰＫＣアイソフォーム（ＰＫＣα、ζ、η及びε）ではなくＰＫＣδがＳＴＡＴ３と構成的に結合していることが分かった（実施例１８を参照）。さらに、インスリンは、ＰＫＣδの特異的な活性化を介してＳＴＡＴ３のリン酸化、活性化及び核への転位を制御する。薬剤抑制物質ロットレリンにより、又は顕性不活性ＰＫＣδ突然変異体の過剰発現によりＰＫＣδ活性を抑制すると、インスリン誘導性のＳＴＡＴ３の活性化及び核への転位が抑止された。最後に、顕性不活性ＰＫＣδ突然変異体を過剰発現させると、ＳＴＡＴ３の過剰発現によって誘導されるケラチン生成細胞増殖が抑制された（実施例１８を参照）。これらの結果から、皮膚ケラチン生成細胞増殖における、ＳＴＡＴ３による転写活性化でのインスリン誘導性ＰＫＣδ活性の役割が示唆される。ＳＴＡＴ３が皮膚の再構築に重要であり、様々なサイトカイン及び増殖因子によって動員される下流のエフェクターであるので、これらの結果全体から、様々な皮膚増殖因子によるケラチン生成細胞の増殖を媒介する主要な下流のエフェクターとしてＰＫＣδが活性化することが示唆される。特に、ＰＫＣδは、糖尿病患者で見られる創傷治癒欠損の原因の主要な候補である可能性がある。ＰＫＣδと創傷治癒のつながりは、ｉｎ ｖｉｖｏでも確認された。新たに構築した無ＰＫＣδマウスを利用して、ＰＫＣδの欠如によってマウス皮膚での創傷治癒が遅延することが本明細書で示される（実施例１９を参照）。ＰＫＣδとインスリンシグナル伝達のつながりも、他のいくつかの系で明らかとなっている。例えば、筋培養物中で、ＰＫＣδがインスリン誘導性のグルコース輸送を媒介することが最近示された（４２、４３）。同様に、インスリン受容体を過剰発現している細胞では、インスリン刺激がＰＫＣδの活性化と関連することが示された（４４〜４６）。しかし、これらの研究ではインスリンが媒介するＰＫＣδの活性化をインスリンの代謝効果と結び付けているが、これは、ＰＫＣδを、インスリンが媒介する細胞増殖と結び付ける最初の報告である。ケラチン生成細胞の増殖と、細胞がその下にある基底膜との接着を喪失する初期分化段階の調節の両方の制御におけるＰＫＣδの確認された二重の役割が明らかとなった。このことから、インスリン誘導性ＰＫＣδが、皮膚における増殖と分化の生理的均衡を制御する主要な候補であることが示唆される。
【０１０５】
したがって、本発明の教示によれば、創傷細胞をインスリンにさらすことによってＰＫＣの発現及び／又は活性化の調節を実施する。これは、以下でさらに例示するように、複数の選択方法の１つによって実行することができる。
【０１０６】
１つの方法は、創傷へのインスリンの直接投与である。以下の実施例２１及び２２で記載するように、インスリンを創傷に濃度０．１〜１０μＭで局所塗布すると、表皮及び皮膚の閉鎖、続いて創傷治癒が有効に促進された。さらに、驚くべきことに且つ意外なことに、インスリンをＰＤＧＦ−ＢＢ増殖因子又はＰＫＣα抑制物質と組み合わせて塗布すると、インスリン単独よりも創傷治癒プロセスが実質的に且つ相乗的に向上した。
【０１０７】
したがって、本発明の他の態様によれば、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供される。その方法は、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、皮膚創傷に、治療有効量のインスリン、及びインスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質を投与することによって実施する。好ましくは、その作用物質はＰＫＣα抑制物質である。さらに好ましくは、その作用物質は、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＫＧＦ、ＥＣＧＦやＩＧＦ１などの増殖因子であり、最も好ましくは、その作用物質はＰＤＧＦ−ＢＢである。
【０１０８】
単独での又は他の作用物質と組み合わせてのインスリンの直接投与は、単回又は反復塗布によって実施することができる。本発明を実施に移す間、本発明者らは、驚くべきことに、濃度１μＭでのインスリンの単回塗布での治療が、同様の濃度でのインスリンの７回反復する毎日の塗布よりも創傷治癒において実質的に有効であることを発見した（下記の実施例２０を参照）。
【０１０９】
したがって、本発明の他の態様によれば、皮膚の創傷に単回投与量単位の治療有効量のインスリンを投与することによって、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供される。好ましくは、単回投与量単位は、皮膚創傷の１ｃｍの領域を覆うのに十分な量、例えば０．０１〜０．２ｍｌの例えば水溶液剤、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、噴霧剤、懸濁液剤、粉末剤、分散液剤、膏薬剤又は軟膏剤中に０．００１〜５ｎＭの、好ましくは０．０１〜０．５ｎＭのインスリンを含む。
【０１１０】
下記の実施例の項中の実施例２０で例示するように、インスリンを創傷に投与する時期は決定的に重要である可能性がある。例えば、４日前の創傷にインスリンを単回塗布すると、有効に創傷が治癒した。したがって、本発明の他の態様によれば、創傷に単回投与量の治療有効量のインスリンを投与することによって、古い皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供される。
【０１１１】
本明細書において「古い皮膚創傷」という語句は、少なくとも１日前の、少なくとも２日前の、少なくとも３日前の、好ましくは、少なくとも４日前の皮膚創傷を指す。
【０１１２】
本発明の他の態様に従って、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分である、治療有効量のインスリン及びインスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。好ましくは、その作用物質は、ＰＫＣα抑制物質、又はＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＫＧＦ、ＥＣＧＦやＩＧＦ１などの増殖因子であり、最も好ましくは、ＰＤＧＦ−ＢＢである。下記でさらに詳細に説明するように、製剤上許容される担体は、それだけに限らないが、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、噴霧剤、懸濁液剤、粉末剤、分散液剤、膏薬及び軟膏剤でもよい。創傷へのインスリンの放出を持続させるために固体支持体を使用することもできる。インスリンは、ヒト又は他の任意の供給源に由来する、天然のものでもよく、或いは好ましくは組換えによるものでもよいことが理解されるであろう。
【０１１３】
本発明の他の態様によれば、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進することができるように選択された単回投与単位のインスリン、及び薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体を含んでよい。好ましくは、単回投与量単位のインスリンは、０．０１〜０．２ｍｌの製剤投与量単位中で０．００１〜５ｎＭであり、好ましくは０．０１〜０．５ｎＭである。
【０１１４】
本発明の代替の実施形態では、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、インスリンを発現し分泌する細胞を創傷に移植する。そのようなインスリン産生細胞は、インスリンを天然に産生する細胞でもよく、或いは、そのような細胞を形質転換して、インスリンを産生し分泌する。例えば、インスリンの産生及び分泌に対するトランス作用性因子である組換えＰＤＸ１遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ００５７１２、ＡＦ０３５２６０、ＡＦ０３５２５９を参照）で細胞を形質転換することができる。或いは、細胞を形質転換して天然のインスリンを過剰産生し分泌するために、遺伝子ノックインにより細胞の内因性インスリン遺伝子の上流に組み込まれた強く構成的な又は誘導性のプロモーターなどのシス作用性エレメント配列で細胞を形質転換することもできる。インスリン遺伝子の上流領域がクローン化されている（アクセッション番号Ｅ０００１１、ＮＭ０００２０７を参照）ので、これを得ることは可能である。或いは、組換えインスリン遺伝子（例えば、アクセッション番号Ｊ０２５４７）で細胞を形質転換し、それによって細胞が組換えインスリンを産生し分泌する。
【０１１５】
したがって、本発明のこの態様に従って皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分であるインスリン分泌細胞と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。創傷に投与するインスリン分泌細胞は、それによって産生されるインスリンを分泌するために、分泌顆粒を形成することができると有利である。インスリン分泌細胞は、内分泌細胞でもよい。それは、ヒト供給源に由来するものでもよく、或いは、組織適合性をヒト化した動物供給源に由来するものでもよい。最も好ましくは、形質転換又は非形質転換インスリン分泌細胞は、自己の供給源由来のものである。好ましくは、インスリン分泌細胞によって分泌されるインスリンは、ヒトインスリンであり、又はヒトインスリンのアミノ酸配列を有する。インスリン分泌細胞は、そのような細胞にインスリンを産生し分泌するために上記に記載の形質転換を使用することを条件として、線維芽細胞、上皮細胞又はケラチン生成細胞でもよい。
【０１１６】
代替の実施形態では、皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、皮膚創傷の細胞を形質転換して、インスリンを産生し分泌する。
【０１１７】
したがって、本発明のこの態様に従って皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分である、皮膚創傷の細胞を形質転換してインスリンを産生し分泌するように設計された核酸構築物と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【０１１８】
上記に記載した形質転換の方法、例えばインスリンをコードする構築物での形質転換、遺伝子ノックインにより内因性インスリン遺伝子の下流に挿入するシス作用性エレメントを有する構築物での形質転換、並びに内因性インスリン産生及び分泌を活性化するトランス作用性因子をコードする構築物での形質転換のいずれかを、本発明のこの実施形態の場面で使用することができる。
【０１１９】
皮膚における別個のＰＫＣアイソフォームの効果についての以前の研究は、寿命が短く、分化の可能性があり、安定な形質転換体を単離できないことにより、従来の方法で外来遺伝子を効率よく初代細胞に導入することが困難であることによって拘束されていた。これらの障害を克服するために、対象とする遺伝子の導入にウイルスベクターが使用されつつある。複製能が欠損したウイルスの形にウイルスゲノムを改変することによって、ウイルスベクターが開発された。最も広く使用されているウイルスベクターは、レトロウイルス及びアデノウイルスであり、それらは実験並びに遺伝子治療の目的で使用される（１３）。特に、非複製細胞でのアデノウイルス感染の効率が高く、ウイルスの力価が高く、形質導入タンパク質の発現が高いことから、この系は、レトロウイルスベクターと比べて初代培養物にとって非常に有利となる。アデノウイルスが宿主ゲノム中に組み込まれず、安定したウイルス力価によって複製欠損にすることができるので、これらのウイルス構築物の、ヒト並びに動物モデルで伴う悪性リスクは最小限である（１４）。今までに、皮膚でも、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの手法を用いて高い感染効率でのアデノウイルス構築物の使用に成功している（１５、１６）。Ｉ．Ｓａｉｔｏ及びその共同研究者らによって開発されたアデノウイルスベクター（１７）を、本研究に使用した。コスミドカセット（ｐＡｘＣＡｗｔ）は、ほぼ完全長のアデノウイルス５ゲノムを有するが、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ及びＥ３領域を欠き、そのことがウイルスを複製欠損にしている。それは、複合ＣＡＧプロモーターを含み、そのプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、及び挿入したＤＮＡの発現を強く誘導するウサギβグロビンポリアデニル化シグナルからなる（１３、１７）。対象とする遺伝子をコスミドカセット中に挿入し、次いでヒト胎児腎２９３細胞中に、アデノウイルスＤＮＡ末端タンパク質複合体（ＴＰＣ）とともにそれを同時トランスフェクトする。Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ領域を発現する２９３細胞では、コスミドカセットとアデノウイルスＤＮＡ−ＴＰＣの間で組換えが起こり、従来の方法の１００倍の効率で所望の組換えウイルスが得られる。そのような高い効率は、タンパク質分解酵素処理したＤＮＡの代わりにアデノウイルスＤＮＡ−ＴＰＣを使用することに主に起因する。さらに、長い相同領域が存在すると、相同組換えの効率が高くなる。複製能を有するウイルスの再生は、複数のＥｃｏＴ２２１部位が存在することにより回避される。これに関連して、ケラチン生成細胞を別個のＰＫＣの組換えアデノウイルスに感染させ、その２４時間後にＰＫＣアイソフォームの有効な過剰発現が示されたことに留意されたい（実施例１を参照）。
【０１２０】
したがって、本発明に従ってＰＫＣの発現及び／又は活性化の調節を実施する他の方法は、皮膚創傷細胞でＰＫＣの過剰発現を誘導することによって行うものである。このことは、相同組換えにより細胞の内因性タンパク質キナーゼＣの上流に組み込むシス作用性エレメント配列で細胞を形質転換し、それによって細胞に天然のタンパク質キナーゼＣを産生することで実現することができる。或いは、このことは、それだけに限らないが、ＰＫＣ−β１遺伝子（アクセッション番号Ｘ０６３１８、ＮＭ００２７３８）、ＰＫＣ−β２遺伝子（アクセッション番号Ｘ０７１０９）、ＰＫＣ−γ遺伝子（アクセッション番号Ｌ２８０３５）、ＰＫＣ−θ遺伝子（アクセッション番号Ｌ０７０３２）、ＰＫＣ−λ遺伝子（アクセッション番号Ｄ２８５７７）、ＰＫＣ−ι遺伝子（アクセッション番号Ｌ１８９６４）、ＰＫＣ−α遺伝子（アクセッション番号Ｘ５２４７９）、ＰＫＣ−δ遺伝子（アクセッション番号Ｌ０７８６０、Ｌ０７８６１）、ＰＫＣ−ε遺伝子（アクセッション番号Ｘ７２９７４）、ＰＫＣ−η遺伝子（アクセッション番号Ｚ１５１０８）やＰＫＣ−ζ遺伝子（アクセッション番号Ｚ１５１０８、Ｘ７２９７３、ＮＭ００２７４４）などの組換えタンパク質キナーゼＣ遺伝子で細胞を形質転換し、それによって細胞に組換えタンパク質キナーゼＣを産生することで実現することができる。
【０１２１】
したがって、本発明のこの態様に従って皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分である、皮膚創傷の細胞を形質転換してタンパク質キナーゼＣを産生するように設計された核酸構築物と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【０１２２】
本発明に従ってＰＫＣの発現及び／又は活性化の調節を実施する他の方法は、皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するための、それだけに限らないが、Ｃａ２＋、インスリンやブリオスタチン１などのＰＫＣ活性化物質によって行うものである。
【０１２３】
したがって、本発明のこの態様に従って皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分である、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進するための治療有効量のＰＫＣ活性化物質と、製剤上許容される担体とを含む。
【０１２４】
本発明に従ってＰＫＣの発現及び／又は活性化の調節を実施する他の方法は、ＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を下方制御することによって行うものである。
【０１２５】
ＰＫＣアイソフォームの活性の下方制御は、例えば、ＰＫＣα、ＰＫＣζ又はＰＫＣηの偽基質抑制物質（ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ、米国カリフォルニア州）などのＰＫＣ偽基質アイソフォーム抑制物質、或いは、例えば薬剤ペプチドＬＹ３７９１９６（Ｅｌｌｙ Ｌｉｌｌｙ、米国）などの他のＰＫＣアイソフォーム抑制物質によって実施することができる。
【０１２６】
或いは、ＰＫＣアイソフォームの活性の下方制御は、下記の実施例の項で記載するような顕性不活性（ＤＮ）ＰＫＣアデノウイルス構築物によって実施することもできる。
【０１２７】
ＰＫＣアイソフォームの活性の下方制御は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子によって実施することができる。ＲＮＡ干渉は、２ステップのプロセスである。第１ステップは、開始ステップと呼ばれ、大抵の場合、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼの構成要素であり、ＡＴＰ依存的にｄｓＲＮＡ（直接或いは導入遺伝子又はウイルスを介して導入）をプロセシングする（切断する）ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）の作用によって投入ｄｓＲＮＡを消化して、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にする。連続した切断事象によって、ＲＮＡを、それぞれが２ヌクレオチドの３’突出を有する１９〜２１ｂｐの二重鎖（ｓｉＲＮＡ）に分解する［Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２）；並びにＢｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６（２００１）］。
【０１２８】
実行ステップでは、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ヌクレアーゼ複合体と結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡ二重鎖のＡＴＰ依存的な巻き戻しは、ＲＩＳＣの活性化に必要である。次いで、活性なＲＩＳＣは、塩基対形成の相互作用によって相同な転写物を標的とし、ｍＲＮＡを切断してｓｉＲＮＡの３’末端から１２ヌクレオチドの断片にする［Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２）；Ｈａｍｍｏｎｄら、（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９（２００１）；並びにＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５−９０（２００１）］。その切断の機構は依然として明らかとなっていないが、各ＲＩＳＣが単一のｓｉＲＮＡ及びＲＮａｓｅを含むことが研究から示唆される［Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２）］。
【０１２９】
ＲＮＡｉの顕著な効果のため、ＲＮＡｉ経路内での増幅ステップが提唱されている。より多くのｓｉＲＮＡを発生させる投入ｄｓＲＮＡの複製によって、又は形成されるｓｉＲＮＡの複製によって増幅を行うことができる。或いは又はさらには、ＲＩＳＣの複数の代謝回転事象によって増幅を実施することができる［Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９（２００１）；Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５−９０（２００１）；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２）］。ＲＮＡｉについてより多くの情報を得るには、下記の総説Ｔｕｓｃｈｌ、ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５（２００１）；Ｃｕｌｌｅｎ、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９（２００２）；及びＢｒａｎｔｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ．１５７５：１５−２５（２００２）を参照されたい。
【０１３０】
本発明での使用に適したＲＮＡｉ分子の合成を下記のように実施することができる。第１に、ＰＫＣアイソフォームのｍＲＮＡ配列を、ＡＵＧ開始コドンの下流にＡＡジヌクレオチド配列があるかどうか調べる。それぞれのＡＡの出現及び３’に隣接する１９ヌクレオチドを、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、制御性のタンパク質結合部位に富むので、好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位は、オープンリーディングフレームから選択される。ＵＴＲ結合タンパク質及び／又は翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉することができる［Ｔｕｓｃｈｌ、ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５］。しかし、ＧＡＰＤＨについて、５’ＵＴＲを対象とするｓｉＲＮＡが細胞ＧＡＰＤＨｍＲＮＡの約９０％の低下を媒介し、タンパク質レベルを完全に消失させたことが示された（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）ように、非翻訳領域を対象とするｓｉＲＮＡも有効である可能性があることが理解されるであろう。
【０１３１】
第２に、ＮＣＢＩサーバーから利用可能なＢＬＡＳＴソフトウェア（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）など、任意の配列アラインメントソフトウェアを用いて、潜在的な標的部位を、適当なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較する。他のコード配列と有意な相同性を示す推定標的部位は取り除く。
【０１３２】
限定した標的配列を、ｓｉＲＮＡ合成用の鋳型として選択する。好ましい配列は、Ｇ／Ｃ含量が低いものであり、これは、Ｇ／Ｃ含量が５５％より高いものと比べて遺伝子サイレンシングの媒介に有効であることが証明されている。評価する標的遺伝子の全長に沿っていくつかの標的部位を選択することが好ましい。選択したｓｉＲＮＡをよりよく評価するには、陰性対照を併せて使用することが好ましい。陰性対照ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成であるが、ゲノムとの有意な相同性を欠くことが好ましい。したがって、それが他のどんな遺伝子とも有意な相同性を示さないことを条件として、乱雑にしたヌクレオチド配列のｓｉＲＮＡを使用することが好ましい。本発明に従った適切なｓｉＲＮＡは、例えば、配列番号１〜１６で示す核酸配列のいずれかなど、ＰＫＣα発現を抑制することができるｓｉＲＮＡでもよい。
【０１３３】
ＰＫＣアイソフォームを下方制御することができる他の作用物質は、ＰＫＣアイソフォームのｍＲＮＡ転写物又はＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖ポリヌクレオチドであり、一本鎖と二本鎖の両方の標的配列を切断することができる（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５；２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国 １９９７；９４３：４２６２）。ＤＮＡザイムについて一般的なモデル（「１０〜２３」モデル）が提案されている。「１０〜２３」ＤＮＡザイムは、それぞれ７〜９個のデオキシリボヌクレオチドからなる２つの基質認識ドメインが隣接した、１５個のデオキシリボヌクレオチドからなる触媒ドメインを有する。この型のＤＮＡザイムは、プリン：ピリミジン結合でその基質ＲＮＡを有効に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国 １９９；ＤＮＡザイムの総説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ［Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ４：１１９−２１（２００２）］を参照）。
【０１３４】
一本鎖及び二本鎖の標的切断部位を認識する、合成され工学的に作製されるＤＮＡザイムの構築及び増幅の例は、Ｊｏｙｃｅらの米国特許第６，３２６，１７４号で開示されている。最近、ヒトウロキナーゼ受容体を対象とする同様の設計のＤＮＡザイムが、ウロキナーゼ受容体発現を抑制することが観察され、ｉｎ ｖｉｖｏで結腸癌細胞転移の抑制に成功した（Ｉｔｏｈら、２０００２，Ａｂｓｔｒａｃｔ ４０９，Ａｎｎ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。他の適用例では、ｂｃｒ−ａｂｌ癌遺伝子と相補的なＤＮＡザイムが、白血病細胞での癌遺伝子発現の抑制、並びにＣＭＬ及びＡＬＬ症例における自己骨髄移植での再発率の減少に成功した。
【０１３５】
ＰＫＣアイソフォームの下方制御は、ＰＫＣアイソフォームをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを使用することによって実施することもできる。
【０１３６】
ＰＫＣアイソフォームを効率よく下方制御するのに使用することができるアンチセンス分子の設計は、アンチセンスの手法に重要な２つの側面を考慮しながら実施しなければならない。第１の側面は、適当な細胞の細胞質中へのオリゴヌクレオチドの送達であり、第２の側面は、その翻訳を抑制する形で、細胞内の指定されたｍＲＮＡと特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
【０１３７】
従来技術から、オリゴヌクレオチドを多種多様な細胞型に効率よく送達するのに使用することができるいくつかの送達の戦略が教示される［例えば、Ｌｕｆｔ、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６：７５−６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔら、Ｂｌｏｏｄ ９１：８５２−６２（１９９８）；Ｒａｊｕｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ８：９３５−４０（１９９７）；Ｌａｖｉｇｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３７：５６６−７１（１９９７）及びＡｏｋｉら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３１：５４０−５（１９９７）を参照］。
【０１３８】
さらに、標的ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドのどちらの構造変化のエネルギー現象も明らかにする熱力学サイクルに基づいて、その標的ｍＲＮＡについて最も高い予測結合親和性でそれらの配列を同定するアルゴリズムも利用可能である［例えば、Ｗａｌｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：１−９（１９９９）を参照］。
【０１３９】
そのようなアルゴリズムを使用して、細胞でアンチセンスの手法を実施することに成功している。例えば、Ｗａｌｔｏｎらによって開発されたアルゴリズムによって、科学者によるウサギβグロビン（ＲＢＧ）及びマウス腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）転写物のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計を可能にすることに成功した。同じ研究グループは、３種のモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸脱水素酵素Ａ及びＢ並びにラットｇｐ１３０）に対して合理的に選択されたオリゴヌクレオチドの、動態ＰＣＲの技術によって評価される細胞培養物中のアンチセンス活性が、ホスホジエステル及びホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化学物質での、２種の細胞型における３種の異なる標的に対する試験を含めて、ほとんどすべての場合で有効であると証明されたことをさらに最近報告した。
【０１４０】
さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系を用いて特定のオリゴヌクレオチドの効果を設計し予測するいくつかの手法も公開されている［Ｍａｔｖｅｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１３７４−１３７５（１９９８）］。
【０１４１】
いくつかの臨床試験によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性及び活性が示されている。例えば、癌の治療に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドは使用に成功している［Ｈｏｌｍｕｎｄら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １：３７２−８５（１９９９）］が、ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３及びＢｃｌ−２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを介する血液系の悪性腫瘍の治療は、臨床試験に入り、患者によって許容されることが示されている［Ｇｅｒｗｉｔｚ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １：２９７−３０６（１９９９）］。
【０１４２】
さらに最近では、アンチセンス媒介性のヒトヘパラナーゼ遺伝子発現抑制が、マウスモデルにおいてヒト癌細胞の胸膜播種を抑制することが報告されている［Ｕｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：７８５５−６０（２００１）］。
【０１４３】
したがって、現在の総意は、上記に記載のように、高度に正確なアンチセンス設計アルゴリズム、及び多種多様なオリゴヌクレオチド送達系の創出へと導いたアンチセンス技術分野での最近の開発によって、当業者が、過度の試験及び誤った実験に頼ることなく、既知の配列の発現を下方制御するのに適したアンチセンスの手法を設計し実施することができることである。
【０１４４】
ＰＫＣアイソフォームを下方制御することができる他の作用物質は、ＰＫＣアイソフォームをコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。リボザイムは、対象とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的な抑制にますます使用されてきている［Ｗｅｌｃｈら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４８６−９６（１９９８）］。任意の特定の標的ＲＮＡを切断するリボザイムを設計できる可能性があることによって、それが基礎研究にも治療への適用にも有益な手段となっている。治療の分野では、リボザイムを利用して、感染性疾患におけるウイルスＲＮＡ、癌における優性の癌遺伝子、及び遺伝子異常における特定の体細胞変異を標的化している［Ｗｅｌｃｈら、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｖｉｒｏｌ．１０：１６３−７１（１９９８）］。最も注目すべきは、ＨＩＶ患者に対するいくつかのリボザイム遺伝子治療のプロトコールがすでに第１相試験に入っていることである。さらに最近では、トランスジェニック動物の研究、遺伝子標的の検証及び経路の解明にリボザイムが使用されている。いくつかのリボザイムが、臨床試験の種々の段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床試験で試験される最初の化学合成リボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管新生経路での鍵となる構成成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に抑制する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．並びに他の企業が、動物モデルで抗血管新生治療の重要性を示している。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するように設計されたリボザイムであるＨＥＰＴＡＺＹＭＥは、細胞培養アッセイでＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの減少に有効であることが明らかとなった（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、ＷＥＢホームページ）。
【０１４５】
好ましくは、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、ホルモン、増殖因子、アディポカイン、ＰＫＣδＲＡＣＫ及びＧＷ９６６２からなる群から選択される少なくとも１種のさらなる作用物質をさらに含む。適切なホルモンは、それだけに限らないが、インスリンでもよい。適切な増殖因子は、それだけに限らないが、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ケラチン生成細胞増殖因子（ＫＦＧ）又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）でもよい。適切なアディポカインは、それだけに限らないが、アディプシン又はアディポネクチンでもよい。
【０１４６】
本発明を実施に移す間、本発明者らは、驚くべきことに且つ意外なことに、コポリマー１（ガラティラマーアセテート（ｇｌａｔｉｒｅｍａｒ ａｃｅｔａｔｅ））が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで創傷治癒を実質的に促進することができることを発見した（下記の実施例の項の実施例２６を参照）。コポリマー１は、多発性硬化症及び中枢神経系異常の治療に使用する免疫調節剤として以前から知られている（米国特許第６，６２０，８４７号、第６，３６２，１６１号、第６，３４２，４７６号、第６，０５４，４３０号、第６，０４６，８９８号、第５，９８１，５８９号、及び第５，８００，８０８号；米国特許出願第１０／６１５８６５号、第１０／６６６８５７号、及び第１０／０１４４７７号）が、従来技術では、創傷治癒のプロセスを促進するコポリマー１の使用について記載又は示唆されていない。
【０１４７】
したがって、本発明の他の態様によれば、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、皮膚の創傷又は損傷に、治療有効量のコポリマー１を、好ましくは１〜５００μｇ／ｍｌの濃度で投与することにより、その方法を実施する。したがって、本発明のこの態様に従った方法を実施するための薬剤組成物は、有効成分である治療有効量のコポリマー１と、製剤上許容される担体とを含む。
【０１４８】
本発明の治療上／製剤上の有効成分は、創傷にそれ自体を投与することもでき、或いは、適切な担体及び／又は賦形剤と混合した薬剤組成物として投与することもできる。本発明の場面での使用に適した薬剤組成物は、意図された治療効果を達成するのに有効な量の有効成分が含まれるそれらの組成物を含む。
【０１４９】
本明細書において、「薬剤組成物」とは、旧来の薬剤、生理的に適切な担体や添加剤など他の化学物質の構成成分を含む、タンパク質、化学物質、核酸又は細胞のいずれかの、本明細書に記載の１種又は複数種の有効成分、或いはその生理的に許容される塩又はプロドラッグの製剤を指す。薬剤組成物の目的は、生物への化合物又は細胞の投与を容易にすることである。本発明の薬剤組成物は、当技術分野で周知のプロセスによって、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖剤作製、湿式粉砕、乳化、被包化、閉じ込め又は凍結乾燥のプロセスによって製造することができる。
【０１５０】
以下で、「生理的に適切な担体」及び「製剤上許容される担体」という語句は、同義的に使用され、生物に著しい刺激を起こさず、投与した結合体の生物学的な活性及び特性を消失させない担体又は希釈剤を指す。
【０１５１】
本明細書において、「賦形剤」という用語は、有効成分のプロセス及び投与をさらに容易にするために薬剤組成物に添加する不活性な物質を指す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及び種々のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコールがある。
【０１５２】
有効成分の製剤及び投与の技術は、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、最新版中に認めることができ、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
本発明の目的での有効成分の投与について様々な経路が考えられ、以前に記載されているが、局所経路が好ましく、局所用の担体によって補助される。局所用の担体は、局所の有効成分投与に一般に適したものであり、当業者に知られている任意のそのような物質を含む。局所用の担体は、所望の形で、例えば液体又は非液体の担体、ローション剤、クリーム剤、ペースト剤、ゲル剤、粉末剤、軟膏剤、溶媒、液体の希釈剤、点滴剤などとして組成物が提供されるように選択され、天然に存在するもの又は合成のものに由来する物質からなるものでもよい。選択された担体が、局所製剤の活性な作用物質又は他の構成成分に有害な影響を及ぼさず、局所製剤のすべての構成成分に対して安定であることが明らかに必須である。本明細書において使用に適した局所用の担体の例には、水、アルコール及び他の非毒性有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコン、石油ゼリー、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、蝋などがある。本明細書において好ましい製剤は、無色無臭の軟膏剤、液剤、ローション剤、クリーム剤及びゲル剤である。
【０１５４】
軟膏剤は、半固体の製剤であり、通常ワセリン又は他の石油誘導体を基礎とする。当業者には理解されるであろうが、使用される特定の軟膏基剤は、最適な有効成分送達をもたらし、好ましくは、その上他の所望の特性、例えば緩和性などをもたらすものである。他の担体又は賦形剤の場合と同様に、軟膏基剤は、不活性であり、安定であり、刺激性がなく、且つ感作性がないべきである。レミントン：製薬学の科学及び実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第１９版（ペンシルバニア州、イーストン：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９５）の１３９９〜１４０４ページで説明されているように、軟膏基剤は油脂性基剤、乳化性基剤、乳剤性基剤、及び水溶性基剤の４種類に分類することができる。油脂性軟膏基剤には、例えば、植物油、動物から得られた脂肪、及び石油から得られた半個体の炭化水素が含まれる。乳化性軟膏基剤は、吸収性軟膏基剤としても知られ、水を少ししか又は全く含まず、それには、例えば、硫酸ヒドロキシステアリン、無水ラノリン及び親水性ワセリンが含まれる。乳剤性軟膏基剤は、油中水（Ｗ／Ｏ）型乳剤又は水中油（Ｏ／Ｗ）型乳剤であり、それには、例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリン、ラノリン及びステアリン酸が含まれる。好ましい水溶性軟膏基剤は様々な分子量のポリエチレングリコールから調製される。また、さらなる情報を得るには、レミントン：製薬学の科学及び実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）を参照することができる。
【０１５５】
ローション剤は、摩擦なしで皮膚表面に塗布する製剤であり、典型的には、有効成分を含めた固体粒子が水又はアルコール基剤中に存在する液体又は半液体の製剤である。ローション剤は、通常固体の懸濁液剤であり、水中油型の液体の油性乳剤を含んでよい。より流動性のある組成物を塗布することが容易であるので、ローション剤は、本明細書において大きな身体領域の治療に好ましい製剤である。ローション剤中の不溶性物質は、細かく分割することが一般に必要である。ローション剤は、典型的には、より良好な分散をもたらす懸濁化剤、並びに皮膚と接触して有効成分を局在させ保持させるのに有用な化合物、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを含む。
【０１５６】
選択された有効成分を含むクリーム剤は、当技術分野で知られているように、水中油型又は油中水型の粘性のある液体又は半固体の乳剤である。クリーム基剤は、水で洗浄可能であり、油相、乳化剤及び水相を含む。油相は、時折「内部」相とも呼ばれ、一般にワセリン、及びセチルアルコールやステアリルアルコールなどの脂肪族アルコールからなり、水相は通常、必ずしもというわけではないが、体積で油相を上回り、一般に湿潤剤を含む。上記のレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）で説明されているように、クリーム製剤中の乳化剤は、一般に非イオン性、陰イオン性、陽イオン性又は両性の界面活性剤である。
【０１５７】
ゲル製剤は、頭皮への塗布に好ましい。局所有効成分製剤の分野の従事者には理解されるであろうが、ゲル剤は、半固体の懸濁液型の系統である。単相ゲル剤は、通常水性である担体の液体全体にわたって実質的に均一に分布する有機高分子を含むが、好ましくは、アルコールも含み、場合によっては油を含む。
【０１５８】
核酸の担体には、それだけに限らないが、標的リポソームを含めたリポソーム、核酸複合体化剤、ウイルス被覆などが含まれる。しかし、むき出しの核酸での形質転換を使用することもできる。
【０１５９】
当業者に知られている様々な添加剤が、本発明の局所製剤に含まれてもよい。例えば、溶媒を使用して、特定の有効成分物質を可溶化することができる。他の任意選択の添加剤には、皮膚浸透促進剤、乳白剤、抗酸化剤、ゲル化剤、増粘剤、安定化剤などがある。
【０１６０】
上記ですでに言及してきたように、本発明に従って創傷を治療するための局所製剤は、そのような創傷の治療に伝統的に用いられる、薬剤として活性な他の作用物質又は成分を含んでもよい。これには、シクロスポリンなどの免疫抑制剤、メトトレキセートなどの代謝拮抗剤、コルチコステロイド、ビタミンＤ及びビタミンＤアナログ、ビタミンＡ又はエトレチナートなどのそのアナログ、タール、コールタール、カデ油などの鎮痒薬及び角質形成剤、サリチル酸などの角質溶解剤、緩和剤、潤滑剤、殺菌剤ジトラノール（アントラリンとしても知られている）などの防腐剤及び消毒剤、ソラレンやメトキサレンなどの光増感剤、並びにＵＶ照射がある。抗菌剤、抗真菌剤、抗生物質や抗炎症剤などの他の作用物質を添加することもできる。酸素化（高酸素圧）による治療を同時に使用することもできる。
【０１６１】
本発明の局所組成物は、従来の皮膚型の貼布又は物品を用いて皮膚に送達することもでき、有効成分の組成物は、皮膚に貼り付ける薬剤送達装置として働く積層状の構造内に含まれる。そのような構造では、有効成分の組成物は、上部の裏打ち層の下にある層又は「貯蔵器」中に含まれる。その積層状の構造は、単一の貯蔵器を含んでもよく、或いは複数の貯蔵器を含んでもよい。一実施形態では、貯蔵器は、製剤上許容されるコンタクト接着物質のポリマー基質を含み、それは、有効成分の送達の間、その系を皮膚に貼り付けるのに働く。適切な皮膚のコンタクト接着物質の例には、それだけに限らないが、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、ポリウレタンなどがある。選択される特定のポリマー接着物質は、特定の有効成分、賦形剤などに依存し、すなわち、接着物質は、有効成分を含む組成物のすべての構成成分と適合しなければならない。或いは、有効成分を含む貯蔵器及び皮膚のコンタクト接着物質は別々の異なる層として存在し、接触物質が貯蔵器の下にあり、この場合、その貯蔵器は上記に記載のポリマー基質でもよく、或いは液体又はヒドロゲルの貯蔵器でもよく、或いは一部の他の形をとってもよい。
【０１６２】
その装置の上部表面として働くこれらの積層の裏打ち層は、積層状の構造の主要な構造成分として機能し、その装置に大きな柔軟性をもたらす。裏打ち物質に選択する物質は、それが有効成分及び有効成分を含む組成物の任意の他の構成成分に対して実質的に不浸透性であり、それによってその装置の上部表面を介するどんな構成成分の喪失も防止されるように選択されるべきである。裏打ち層は、皮膚が有効成分送達の間に水和されることが望ましいかどうかに応じて、閉鎖性でもよく或いは非閉鎖性でもよい。好ましくは、裏打ち層は、好ましくは柔軟なエラストマー物質のシート又はフィルムから作製される。裏打ち層に適しているポリマーの例には、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリエステルがある。
【０１６３】
貯蔵中及び使用前、その積層状の構造は、剥離ライナーを含む。使用直前に、この層を装置から取り除いて、その系を皮膚に貼り付けることができるように、その基底表面の有効成分の貯蔵器又は別々のコンタクト接着物質の層をさらす。剥離ライナーは、有効成分／賦形剤非浸透性の物質から作製されるべきである。
【０１６４】
当技術分野で知られている従来の技術を用いて、例えば裏打ち層上で接着物質、有効成分及び賦形剤の液体混合物を鋳造し、その後剥離ライナーを積層化することによって、そのような装置を製作することができる。同様に、接着混合物を剥離ライナー上に鋳造し、その後裏打ち層を積層化することができる。或いは、有効成分又は賦形剤の不在下で有効成分の貯蔵器を調製し、次いで有効成分／賦形剤の混合物中にそれを「浸す」ことによって充填することもできる。
【０１６５】
本発明の局所製剤の場合と同様に、この積層系の有効成分の貯蔵器内に含まれる有効成分の組成物は、いくつかの構成成分を含んでもよい。ある場合では、有効成分を「純粋なまま（ｎｅａｔ）」、すなわちさらなる液体の不在下で送達することができる。しかし、ほとんどの場合では、製剤上許容される適切な賦形剤、典型的には溶媒又はゲル中で有効成分を溶解、分散又は懸濁する。存在してもよい他の構成成分には、保存剤、安定化剤、界面活性剤などがある。
【０１６６】
本明細書に記載した薬剤組成物はまた、適切な固相又はゲル相の担体又は賦形剤を含んでもよい。そのような担体又は賦形剤の例としては、それだけに限らないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーがある。
【０１６７】
投与は、苦痛の型、重症度及び症状発現に依存し、有効成分に対する対象の反応性、並びに使用する剤形、特定の結合体の効果、及び使用する投与経路に依存する。当業者は、最適な投与量、投与法及び反復率を容易に決定することができる。患者の状態を考慮して、個々の医師が的確な製剤、投与経路及び投与量を選択することができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「治療の薬理学的基礎（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、第１章１ページを参照）。
【０１６８】
したがって、治療する状態の重症度及び反応性に応じて、投与は単回投与又は反復投与でもよく、治療の過程は数日から数週間、或いは治癒が達成され又は皮膚損傷の縮小が実現されるまで継続する。
【０１６９】
ある態様では、本発明は、細胞の形質転換及び遺伝子ノックイン型の形質転換を使用するｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療、及びｅｘ ｖｉｖｏの（細胞の）遺伝子治療の技術を利用する。本明細書において、遺伝子治療とは、対象とする遺伝物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主に導入して、遺伝性又は後天性の疾患又は状態又は表現型を治療又は予防することを指す。対象とする遺伝物質は、ｉｎ ｖｉｖｏでの産生が所望される産物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）をコードする。例えば、対象とする遺伝物質は、治療上の価値があるホルモン、受容体、酵素、ポリペプチド又はペプチドをコードするものでもよい。総説については、一般に、教科書「遺伝子治療（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」（薬理学の進歩４０（Ａｄｖａｎｃｅｄ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７）を参照されたい。
【０１７０】
（１）ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療、及び（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療という遺伝子治療に対する２つの基本的な手法が発展してきた。ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療では、細胞は、患者から取り出し、又は他の供給源に由来し、培養している間にそれをｉｎ ｖｉｔｒｏで治療する。一般に、適当な遺伝子送達媒体／方法（トランスフェクション、形質導入、相同組換えなど）、及び必要である場合には発現系を介して機能的な置換遺伝子を細胞内に導入し、次いで改変した細胞を培養下で増殖させ、宿主／患者に戻す。この遺伝的に再移植された細胞は、トランスフェクトされた遺伝物質をｉｎ ｓｉｔｕで発現することが示されている。
【０１７１】
ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療では、標的細胞は対象から取り出さず、むしろ、導入する遺伝物質を、レシピエント内にあるレシピエント生物の細胞内にｉｎ ｓｉｔｕで導入する。代替の実施形態では、宿主遺伝子に欠陥がある場合、遺伝子をｉｎ ｓｉｔｕで修復する（Ｃｕｌｖｅｒ、１９９８、（抄録）アンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡを基礎とする治療（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＤＮＡ ＆ ＲＮＡ ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、１９９８年２月、カリフォルニア州コロナド）。この遺伝的に変化した細胞は、トランスフェクトされた遺伝物質をｉｎ ｓｉｔｕで発現することが示されている。
【０１７２】
遺伝子発現用媒体は、異種の核酸を宿主細胞に送達／導入することができる。発現用媒体は、当技術分野で知られているように、細胞選択的な形で核酸の標的導入、発現及び転写を調節するエレメントを含んでよい。遺伝子の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲを、発現用媒体の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲでしばしば置換できることに留意されたい。したがって、本明細書において、発現用媒体は、必要に応じて、導入する実際の遺伝子の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲを含まず、特定のアミノ酸コード領域だけを含んでもよい。
【０１７３】
発現用媒体は、異種の物質の転写を調節するプロモーターを含んでよく、それは、選択的な転写を可能にする構成的な又は誘導性のプロモーターでもよい。場合によっては、必要な転写レベルを得るのに必要となることがあるエンハンサーを含んでもよい。エンハンサーは、一般に任意の非翻訳ＤＮＡ配列であり、コード配列に隣接して（シス型に）働いて、プロモーターによって指示された基底の転写レベルを変化させる。発現用媒体はまた、本明細書で下記に記載する選択遺伝子を含んでもよい。
【０１７４】
当技術分野内で知られている様々な方法のいずれかによって、ベクターを細胞又は組織内に導入することができる。そのような方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８９、１９９２；Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、メリーランド州ボルチモア、１９８９；Ｃｈａｎｇら、体細胞遺伝子治療（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ミシガン州アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）、１９９５；Ｖｅｇａら、遺伝子ターゲティング（Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ミシガン州アナーバー（９９５）；ベクター：分子クローニングベクター及びその使用についての調査（Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ）、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、マサチューセッツ州ボストン、１９８８；並びにＧｉｌｂｏａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４−５１２，１９８６）の記載に認めることができ、それには、例えば、安定な又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション及び組換えウイルスベクターでの感染が含まれる。さらに、中枢神経系に関与するベクターについては米国特許第４，８６６，０４２号を、また正負の選択方法については米国特許第５，４６４，７６４号及び第５，４８７，９９２号も参照されたい。
【０１７５】
感染による核酸の導入は、列挙した他の方法を上回るいくつかの利点をもたらす。その感染する性質により、高い効率を得ることができる。さらに、ウイルスは非常に特殊化しており、通常は特定の細胞型に感染し増殖する。したがって、その天然の特異性を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで或いは組織内で又は細胞の混合培養物内で、ベクターに特定の細胞型を標的とさせることができる。特異的な受容体又はリガンドでウイルスベクターを改変して、受容体が媒介する事象を介して標的特異性を変化させることもできる。
【０１７６】
組換え配列を導入し発現させるＤＮＡウイルスベクターの特定の例は、アデノウイルス由来ベクターＡｄｅｎｏｐ５３ＴＫである。このベクターは、正又は負の選択用のヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、及び所望の組換え配列の発現カセットを発現する。このベクターを使用して、アデノウイルス受容体を有する細胞を感染させることができ、それは上皮由来のほとんどの組織、並びに他の組織を含む。このベクター並びに類似した所望の機能を示す他のベクターを使用して、細胞の混合集団を治療することができ、それには、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの細胞培養物、組織又はヒト対象が含まれる可能性がある。
【０１７７】
また、特定の細胞型に対して発現を制限する特徴を含んでもよい。そのような特徴には、例えば、所望の細胞型に特異的なプロモーター及び制御エレメントがある。
【０１７８】
さらに、組換えウイルスベクターは、それが側方感染や標的特異性などの利点をもたらすので、所望の核酸のｉｎ ｖｉｖｏ発現に有用である。側方感染は、例えばレトロウイルスの生活環に固有であり、単一の感染細胞が、多数の後代ウイルス粒子を産生し、それが出芽し、隣接する細胞に感染するプロセスである。その結果、広い領域が急速に感染し、そのほとんどが、元のウイルス粒子が最初に感染したものではない。このことは、感染性作用物質が娘後代細胞を介してのみ広がる垂直型の感染と対照的である。側方に広がることができないウイルスベクターを作製することもできる。この特徴は、所望の目的が、限局した数の標的細胞のみへと特定の遺伝子を導入することである場合に有用である可能性がある。
【０１７９】
上記に記載のように、ウイルスは、非常に特殊化した感染性作用物質であり、多くの場合、宿主の防御機構を回避するように進化してきた。通常、ウイルスは特定の細胞型に感染し増殖する。ウイルスベクターの標的特異性は、その天然の特異性を利用して、所定の細胞型を特異的に標的とするものであり、それによって感染細胞中に組換え遺伝子が導入される。本発明の方法及び組成物に使用されるベクターは、標的とする所望の細胞型に依存し、当業者に知られている。
【０１８０】
レトロウイルスベクターを構築して、感染性粒子として機能させ、又は最初の１回限りの感染を起こすことができる。前者の場合では、新たなウイルスタンパク質及びＲＮＡを合成するための必要な遺伝子すべて、制御配列及びパッケージングシグナルを維持するようにウイルスのゲノムを改変する。これらの分子が合成された後、宿主細胞は、新たなウイルス粒子中にＲＮＡを詰め込み、この粒子はさらなる感染を起こすことができる。ベクターのゲノムはまた、所望の組換え遺伝子をコードし発現するように工学的に作製する。非感染性のウイルスベクターの場合では、ベクターのゲノムは通常、ＲＮＡをウイルス粒子中に被包化するのに必要なウイルスのパッケージングシグナルを破壊する突然変異を受けている。そのようなシグナルがないと、形成されるどんな粒子もゲノムを含まず、したがって、続いての感染に進むことができない。特定の型のベクターは、意図された適用に依存する。実際のベクターはまた、当技術分野内で知られ容易に利用可能であり、又は周知の方法を用いて当業者により構築することができる。
【０１８１】
組換えベクターは、いくつかの方法で投与することができる。ウイルスベクターを使用する場合、例えば、その手順は、その標的特異性を利用することができ、その結果、疾患部位に局所投与する必要はない。しかし、局所投与によって、より速く有効に治療することができる。
【０１８２】
ノックインの手順で使用する相同組換えを含むｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の形質転換の手順は、例えば、米国特許第５，４８７，９９２号、第５，４６４，７６４号、第５，３８７，７４２号、第５，３６０，７３５号、第５，３４７，０７５号、第５，２９８，４２２号、第５，２８８，８４６号、第５，２２１，７７８号、第５，１７５，３８５号、第５，１７５，３８４号、第５，１７５，３８３号、第４，７３６，８６６号、並びにＢｕｒｋｅ及びＯｌｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２５１−２７０ １９９１；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２ １９８９；Ｄａｖｉｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０（１１）２６９３−２６９８ １９９２；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２（８）：１２９９−１３０２ １９９３；Ｄｕｆｆ及びＬｉｎｃｏｌｎ、「ヒトＡＰＰ遺伝子を含む酵母人工染色体への病原性突然変異の挿入及びＥＳ細胞での発現（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＡＰＰ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ）」、アルツハイマー病及びその関連疾患における研究の進歩（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、１９９５；Ｈｕｘｌｅｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，９：７４２−７５０ １９９１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２６１ １９９３；Ｌａｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５：２２−２９ １９９３；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＣｈｏｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国 １９９３．９０：１０５７８−８２；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２８１−３０１ １９９１；Ｓｃｈｅｄｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５８−２６１ １９９３；Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１９０４−１９０７ １９９３で説明されている。さらに、特許出願ＷＯ９４／２３０４９、ＷＯ９３／１４２００、ＷＯ９４／０６９０８、ＷＯ９４／２８１２３も情報を提供するものである。
【０１８３】
本発明のさらなる対象、利点、及び新たな特徴は、以下の実施例の検討後、当業者に明らかとなるであろうが、その実施例は限定を意図するものではない。さらに、上記に記載し、下記の特許請求の範囲の項で請求する本発明の様々な実施形態及び態様はそれぞれ、以下の実施例中に実験上の支持を認めるものである。
【実施例】
【０１８４】
以下の実施例を参照して、上記の説明とともに、非限定的な様式で本発明を例証する。
【０１８５】
一般的に、本明細書において使用される命名法及び本発明において利用される実験室手順は、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術、及び組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献中に徹底的に説明されている。例えば、以下を参照のこと：「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．ら編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ボルチモア、メリーランド州（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「分子クローニングの実用ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「ゲノム分析：実験室マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、第１巻〜第４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号及び同第５，２７２，０５７号に記載されている方法論；「細胞生物学：実験室ハンドブック（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「動物細胞の培養−基礎技術のマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク（１９９４）、第３版；「免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻 Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）「基礎的及び臨床的免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク、コネチカット州（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（編）「細胞免疫学における精選方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ニューヨーク（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは特許及び科学文献に広範に記載されており、例えば、以下を参照のこと：米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号及び同第５，２８１，５２１号；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「転写及び翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「固定化細胞及び酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；分子クローニングの実用ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）及び「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」第１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲプロトコール：方法及び応用のガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンジエゴ、カリフォルニア州（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら「タンパク質精製及び特徴付けのストラテジー：研究課程マニュアル（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ）」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらのすべては、あたかも全体が本明細書に記載されるかのように参照として援用される。他の一般的な参考文献はこの文献を通して提供される。そこに記載される手順は当該分野において周知であると考えられており、読者の便宜のために提供される。そこに含まれるすべての情報は、参照として本明細書に援用される。
【０１８６】
材料及び実験方法
材料：組織培養培地及び血清は生物学関連企業（Ｂｅｉｔ ＨａＥｍｅｋ、イスラエル）より購入した。増強化学発光（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（ＥＣＬ）はＢｉｏＲａｄ（イスラエル）から購入したキットを用いて行った。モノクローナル抗ｐ−ｔｙｒ抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ニューヨーク州、米国）から購入した。ＰＫＣアイソフォームに対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（カリフォルニア州、米国）及びＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ケンタッキー州）から購入した。α６ラット抗マウスｍＡｂ（ＧｏＨ３）は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（サンジエゴ、カリフォルニア州）から購入した。α６Ａ細胞質ドメインに対する抗体６８４４は、Ｖ．Ｑｕａｒａｎｔａ博士（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）より恵与された。マウスβ４の細胞外ドメインに対して指向されるラットｍＡｂ（３４６−１１Ａ）は、Ｓ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｌ博士（Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）から恵与された。ホスホチロシンに対するラットｍＡｂはＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入し、ウサギ抗ホスホセリンはＺｙｍｅｄ（サンフランシスコ、カリフォルニア州）から購入した。西洋わさびペルオキシダーゼ−抗ウサギ及び抗マウスＩｇＧはＢｉｏ−Ｒａｄ（イスラエル）から入手した。ロイペプチン、アプロチニン、ＰＭＳＦ、ＤＴＴ、Ｎａ−オルトバナジウム酸、及びペプスタチンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。インスリン（ｈｕｍｕｌｉｎＲ−組換えヒトインスリン）はＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ フランス ＳＡ（Ｆｅｒｇｅｒｓｈｅｉｍ、フランス）から購入した。ＩＧＦ１はＣｙｔｏｌａｂ（イスラエル）から恵与された。ケラチン１４抗体はＢａｂｃｏ−Ｃｏｎｖａｎｃｅ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）から購入した。ＢＤＧＦ−ＢＢはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス）から購入した。ＰＫＣα偽基質（ミリストイル化）はＣａｌｂｉｎｏｃｈｅｍ（サンジエゴ、カリフォルニア州）から購入した。
【０１８７】
マウスケラチン生成細胞の単離及び培養：初代ケラチン生成細胞を、以前に記載されたように（１８）新生皮膚から単離した。ケラチン生成細胞は、ウシ胎仔血清で処理された、８％Ｃｈｅｌｅｘ（Ｃｈｅｌｅｘ−１００、ＢｉｏＲａｄ）を含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。増殖性基底細胞表現型を維持するために、最終的なＣａ２＋濃度は０．０５ｍＭに調整した。実験は、プレーティングの５〜７日後に実行した。
【０１８８】
細胞抽出物の調製及びウェスタンブロッティング分析：粗膜画分については、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２μｇ／ｍｌ ペプスタチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２００μＭ ＮａＶＯ４、及び１０ｍＭ ＮａＦを含むＰＢＳ中に、細胞を擦り落とすことによって、全体の細胞溶解物を調製した。均質化及び４回の凍結／融解サイクルの後で、溶解物を４℃、２０分間、最大速度で、微量遠心機で遠心分離した。可溶性細胞質ゾルタンパク質画分を含む上清を別のチューブに移した。ペレットを、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤とともに１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２５０μｌＰＢＳ中に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートし、４℃で最大速度で微量遠心機で遠心分離した。上清は膜画分を含む。タンパク質濃度を、改変ローリーアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣタンパク質アッセイキット）を使用して測定した。細胞タンパク質画分のウェスタンブロット分析を記載されるように（６）実行した。
【０１８９】
免疫沈殿のための細胞溶解物の調製：ケラチン生成細胞を含む細胞ディッシュを、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳで洗浄した。細胞を、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤のカクテル（２０μｇ／ｍｌ ロイペプチン；１０μｇ／ｍｌ アプロチニン；０．１ｍＭ ＰＭＳＦ；１ｍＭ ＤＴＴ；２００μＭ オルトバナジウム酸；２μｇ／ｍｌ ペプスタチン）を含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ ＮａＦ；１％ Ｔｒｉｔｏｎ ｘ１００；０．１％ ＳＤＳ、１％ デオキシコール酸ナトリウム）中で機械的に脱着した。調製物を、４℃で、最大速度で２０分間、微量遠心機で遠心分離した。上清を免疫沈殿のために使用した。
【０１９０】
免疫沈殿：溶解物は、３００μｇの細胞溶解物を２５μｌのタンパク質Ａ／Ｇセファロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州、米国）と混合することによってあらかじめ清澄化し、懸濁物を４℃で３０分間連続して回転させた。次いで、調製物を最大速度で１０分間、４℃で遠心分離し、３０μｌのＡ／Ｇセファロースを、個々の抗原に対する特異的ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（希釈１：１００）とともに上清に加えた。サンプルを４℃で一晩回転させた。次いで、この懸濁物を最大速度で１０分間、４℃で遠心分離し、ペレットをＲＩＰＡ緩衝液で洗浄した。再度、懸濁物を１５，０００×ｇで遠心分離し（４℃で１０分間）、ＴＢＳＴ中で４回洗浄した。サンプル緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ６．８；１０％ ＳＤＳ；１０％ グリセロール；４％ ２β−メルカプトエタノール；０．０５％ ブロモフェノールブルー）を加え、サンプルを５分間煮沸し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【０１９１】
接着アッセイ：２４ウェルペトリプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、ＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌのマトリックスタンパク質で、１時間、３７℃にてコートした（２５０μｌ／ウェル）。インキュベーション後、プレートを洗浄し、０．１％ ＢＳＡで３０分間、室温にてインキュベートして、非特異的結合をブロックした。ケラチン生成細胞培養物を、０．２５％トリプシンで手短にトリプシン処理し、脱着後、細胞を再懸濁し、ケラチン生成細胞（１×１０６）をコートされたウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。非接着細胞を除去し、ウェルをＰＢＳで２回すすぎ、残存した細胞を１Ｍ ＮａＯＨ中で抽出した。細胞計数は、改変ローリーアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣタンパク質アッセイキット）を使用して、タンパク質濃度によって決定した。結果を、未処理対照に対するパーセンテージによって計算した。
【０１９２】
免疫蛍光：初代ケラチン生成細胞を、ラミニン５コートしたガラススライド上にプレートした。２日齢ケラチン生成細胞を、１時間ＰＫＣアデノウイルスに感染させ、ＰＢＳで２回洗浄し、低Ｃａ２＋ＭＥＭ中で培養物中に維持した。感染の２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中に３０分間固定し、続いて０．２％ Ｔｒｉｔｏｎで５分間透過化処理を行った。分析のために、対照及びＰＫＣ感染したケラチン生成細胞をＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡに希釈したＰＫＣ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とともに４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、スライドをＰＢＳで２回１０分間洗浄し、ビオチン化抗ウサギ二次抗体と２０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣと２０分間インキュベートした。α６β４染色の分析のために、ガラススライドを、氷上で５分間、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理し、続いてメタノール中で５分間固定化を行った。このスライドを抗α６抗体又は抗β４抗体とともに一晩インキュベートし、続いて、それぞれビオチン化抗ラット二次抗体との２０分間のインキュベーションを行い、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣと２０分間インキュベートした。ＰＢＳ中での２回の洗浄後、スライドを、１％のｐ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）を含むグリセロール緩衝液を用いてマウントし、蛍光をレーザー走査共焦点像顕微鏡（ＭＲＣ１０２４、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、英国）によって調べた。
【０１９３】
アデノウイルス構築物：組換えアデノウイルスベクターを、以前に記載されたように構築した（１９）。マウスＰＫＣの顕性不活性変異体を、ＡＴＰ結合部位におけるリジン残基のアラニンとの置換によって生成した。変異体ｃＤＮＡを、ＳＲＤ発現ベクターからＥｃｏＲＩで切断し、ｐＡｘＣＡ１ｗコスミドカセットに連結して、Ａｘベクターを構築した。遺伝子の顕性不活性活性は、その自己リン酸化の抑止によって実証された。
【０１９４】
ＰＫＣアイソフォーム遺伝子を用いるケラチン生成細胞の形質導入：培養培地を吸引除去し、ケラチン生成細胞培養物を、ＰＫＣ組換えアデノウイルスを含むウイルス上清で１時間感染させた。次いで、培養物を、ＭＥＭで２回洗浄し、再度培地を与えた。感染の１０時間後、細胞を、血清を含まない低Ｃａ２＋含有ＭＥＭに２４時間移した。対照及びインスリン処理培養又はＩＧＦ１処理培養からのケラチン生成細胞を、増殖アッセイ、８６Ｒｂ取り込みのために使用し、又は免疫沈殿、免疫蛍光、及びウェスタンブロッティングのために、記載されるように抽出し、並びに細胞質ゾル画分及び膜画分に分画した。
【０１９５】
ＰＫＣ活性：特異的ＰＫＣ活性は、適切な処理後のケラチン生成細胞培養物からの新鮮に調製した免疫沈殿物中で測定した。これらの溶解物は、ＮａＦを含まないＲＩＰＡ緩衝液中で調製した。活性は、ＳｉｇｍａＴＥＣＴタンパク質キナーゼＣアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州、米国）の使用により、製造業者の指示書に従って測定した。ＰＫＣα偽基質をこれらの研究における基質として使用した。
【０１９６】
細胞増殖：細胞増殖は、２４ウェルプレートにおいて、［３Ｈ］チミジンの取り込みによって測定した。細胞を、［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）で一晩パルスした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで５回洗浄し、５％ ＴＣＡを各ウェルに３０分間加えた。溶液を除去し、細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で可溶化した。細胞に取り込まれた標識されたチミジンを、Ｔｒｉｃａｒｂ液体シンチレーションカウンターの３Ｈウィンドウで計数した。
【０１９７】
Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプ活性：Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプ活性を、２ｍＭ ＲｂＣｌ及び２．５μＣｉの８６Ｒｂを含む、Ｋ＋を含まない１ｍｌのＰＢＳ中の全細胞による、８６Ｒｂのウアバイン感受性の取り込みの測定によって決定した。１５分後、Ｒｂ取り込みを培地の吸引除去によって終結させ、その後、細胞をＫ＋を含まない４℃の冷ＰＢＳ中で迅速に４回すすぎ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で可溶化した。ディッシュからの細胞を、シンチレーションバイアル中の３ｍｌ Ｈ２Ｏに加えた。サンプルを、Ｔｒｉｃａｒｂ液体シンチレーションカウンターの３Ｈウィンドウで計数した。Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプ活性に特異的に関連するＲｂ取り込みを、１０−４Ｍウアバインの存在下で蓄積したｃｐｍの、阻害剤の非存在下で測定した取り込みからの減算によって決定した。
【０１９８】
ＰＫＣイムノキナーゼアッセイ：精製及び標準化されたＰＫＣアイソザイムは、Ｐ．Ｂｌｕｍｂｅｒｇ博士（ＮＣＩ、ＮＩＨ、Ｕ．Ｓ．）及びＭａｒｃｅｌｌｏ Ｇ．Ｋａｚａｎｉｅｔｚ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から恵与された。初代ケラチン生成細胞を、５００μｌの１％ Ｔｒｉｔｏｎ溶解緩衝液（１×ＰＢＳ中の１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン及びロイペプチン、２μｇ／ｍｌ ペプスタチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００μＭ Ｎａ２ＶＯ４、１０ｍＭ ＮａＦ）中で収集した。溶解物を４℃で３０分間インキュベートし、１６，０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離した。上清を新鮮なチューブに移した。細胞溶解物の免疫沈殿を、５μｇ／サンプルの抗α６／ＧｏＨ３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）及び３０μｌ／サンプルのタンパク質Ａ／Ｇ−Ｐｌｕｓアガローススラリー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて４℃で一晩実行した。ビーズを、ＲＩＰＡ緩衝液で１回、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５で２回洗浄した。３５μｌの反応緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ２、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５）を各アッセイに加えた。各アッセイについて、ＤＭＳＯ又は１０ｍＭ ＴＰＡのいずれかを含む５．５μｌ／アッセイのリン脂質ベシクルの懸濁物を、標準化量の特異的ＰＫＣアイソザイムとともにスラリーに加えた。反応を、１０μｌ／アッセイの１２５ｍＭ ＡＴＰ（１．２５μＣｉ／アッセイ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えることによって開始し、３０℃で１０分間継続させた。次いで、ビーズをＲＩＰＡ緩衝液で２回洗浄した。３０μｌ／サンプルのタンパク質負荷色素（３×Ｌａｅｍｍｌｉ、５％ ＳＤＳ）を加え、サンプルをウォーターバス中で５分間煮沸した。タンパク質を、８．５％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｐｒｏｔｒａｎメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に転写し、オートラジオグラフィーによって可視化した。ヒストンのリン酸化及びＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を、ＰＫＣ活性のための対照として使用した。
【０１９９】
実験結果
（実施例１）
組換えアデノウイルスベクターを利用するＰＫＣアイソフォームの効果的な過剰発現
組換えβ−ガラクトシダーゼアデノウイルスを利用することによって、高い感染割合が達成され、培養されたケラチン生成細胞集団の９０％より多くが組換えタンパク質を発現した。組換えβ−ガラクトシダーゼアデノウイルス感染は、細胞の生存度又は細胞増殖に影響を与えなかった。さらに、β−ガラクトシダーゼ発現は培養の２週間まで持続され、次の実験における対照感染として使用した。組換えＰＫＣアデノウイルスが、タンパク質発現を誘導し、及びマウスケラチン生成細胞培養において正しく活性化される効率を調べた。図１におけるウェスタンブロッティングによって見られるように、組換えＰＫＣアデノウイルス構築物を用いる１時間感染の２４時間後、特異的ＰＫＣタンパク質発現の劇的な増加が、特異的アイソフォームの内因性の発現レベルよりも５倍から１０倍上で観察された。組換えタンパク質は、感染後早くも６時間で、感染したケラチン生成細胞培養物において検出可能であり、ピーク発現は２４時間までに得られた。タンパク質発現は、培養期間の全体を通して持続した（１４日まで）。
【０２００】
（実施例２）
過剰発現されたＰＫＣアイソフォームはＰＫＣアクチベーターによって活性化される
ＰＫＣアイソフォームの組換えタンパク質は、典型的にはＰＫＣアクチベーターに応答した。図２において見られるように、ブリオスタチン１を用いる処理は、ＰＫＣαタンパク質及びＰＫＣδタンパク質の膜画分へのトランスロケーションを誘導し、ＰＫＣη及びＰＫＣζのアイソフォームに対してはより低い効果を有した。このことは、内因性アイソフォームを用いて得られた結果と同様であり、これらのコファクター要求性から予測される通りである。
【０２０１】
（実施例３）
過剰発現されたＰＫＣアイソフォームはそれらのネイティブ型で活性である
感染後早くとも１８時間で、ＰＫＣキナーゼアッセイは、独特なＰＫＣアイソフォームの免疫沈殿物が、ＰＫＣアクチベーターによる刺激のさらなる必要性を伴うことなく、酵素的に活性であることを明らかにした（図３）。
【０２０２】
（実施例４）
特異的ＰＫＣアイソフォームの過剰発現は初代ケラチン生成細胞において独特な形態学的変化を誘導する
利用されたＰＫＣアデノウイルス構築物の各々は、初代ケラチン生成細胞において特異的形態学的変化を誘導した（図４）。非感染初代マウスケラチン生成細胞培養物及びβ−ガラクトシダーゼ感染細胞は、培養中に、増殖性の基底細胞の特徴に典型的である立方体形態を提示した。アイソフォーム特異性に関わりなく、ケラチン生成細胞を過剰発現するすべてのＰＫＣは、細胞の伸長及びニューロン様突出の出現を含む、ＰＫＣ活性化に典型的な形態学的変化を示した。しかし、ＰＫＣアイソフォームの各々１つは、ケラチン生成細胞形態に対して特徴的な効果を有した。ＰＫＣα感染は、典型的な平板化された形態を有する、ケラチン生成細胞の層状化を誘導した。対照的に、ＰＫＣηは、迅速な速度で増殖する基底細胞の形態学的特徴を提示する、細胞の濃密なクローンとして見られた（図４）。２つのアイソフォームは、細胞マトリックス並びに細胞−細胞結合をもたらすように見られた。ＰＫＣδ感染の１８〜４８時間後、細胞は、ニューロン様突出を有して、細長く且つ伸長して見られた。これに続いて、徐々に培養ディッシュからの細胞の喪失が起こり、これは培養期間の過程で漸次的に起こった。過剰発現ＰＫＣζケラチン生成細胞は、円形のケラチン生成細胞クラスターとして見られ、これは、培養ディッシュにゆるく結合しており、感染の数日後に次第に失われた。
【０２０３】
（実施例５）
感染した初代ケラチン生成細胞中の過剰発現ＰＫＣアイソフォームの独特の局在化
独特の形態学的変化は、免疫蛍光分析によって特徴付けられるような独特な細胞局在化と関連した。増殖しているケラチン生成細胞において、ＰＫＣα、ＰＫＣδ、及びＰＫＣζは、細胞質並びに原形質膜において発現された。内因性タンパク質発現と同様に、ＰＫＣηアイソフォームは、ケラチン生成細胞の核周辺領域に局在した（図５）。分布の劇的な変化がＰＫＣδ及びＰＫＣζに関連し、ここでは、細胞脱着に続いて、ＰＫＣアイソフォーム発現が、細胞膜に優先的に局在した（図５）。
【０２０４】
（実施例６）
ＰＫＣアイソフォームによるα６β４発現の調節
実験結果
増殖性基底層の基底表現型の特徴であるタンパク質を調節する、特異的ＰＫＣアイソフォームの能力を試験した。α６β４インテグリンの下方制御がケラチン生成細胞分化の間に起こる初期事象の１つであるので、種々のＰＫＣアイソフォームがα６β４インテグリン（基底層の半接着斑に特異的に局在するインテグリン）の発現を調節する能力を評価した。図６において提示されるイムノブロットにおいて見られることができるように、ＰＫＣδ及びＰＫＣζアイソフォームのみが、対照ケラチン生成細胞のα６β４インテグリンサブユニットレベルとの比較において、α６β４発現を下方制御することが可能であった。同時に、α３又はβ１インテグリンサブユニットレベルは減少しなかった。対照的に、一貫して、ＰＫＣαアイソフォームの過剰発現は、対照発現よりも２〜３倍上に増加したα６β４レベルを生じた（図６）。ＰＫＣηの過剰発現は、α６β４タンパク質発現に影響を与えなかった。いくつかの特徴が分化に対する細胞の関与に付随しており、これはα６β４タンパク質の下方制御に続き、増殖速度の減少、新規なケラチンの合成、細胞脱着、及び基底膜成分への接着の喪失が含まれる。ケラチン発現の変化は、異なるＰＫＣアイソフォームの過剰発現によっては観察されなかった。これには、基底の増殖しているケラチン生成細胞の特徴であるＫ５及びＫ１４の発現、並びに棘層分化の初期段階の特徴であるＫ１及びＫ１０の発現が含まれた。さらに、増殖速度が３Ｈ−チミジン取り込みによって分析された場合、α６β４発現と増殖能力の喪失の間の相関は存在しなかった。
【０２０５】
（実施例７）
過剰発現したＰＫＣη及びＰＫＣδはインビトロでケラチン生成細胞増殖を誘導する
ＰＫＣη及びＰＫＣδの過剰発現は、ケラチン生成細胞増殖を、対照レベルよりもそれぞれ５倍及び２倍、有意に誘導する（図７）。ＰＫＣζ及びＰＫＣαは細胞増殖に影響を与えなかった。
【０２０６】
（実施例８）
過剰発現したＰＫＣδ及びζはインビトロでケラチン生成細胞脱着を誘導する
ＰＫＣδ及びζが過剰発現したケラチン生成細胞の接着特性を研究した。対照ケラチン生成細胞と比較して、特異的マトリックスタンパク質（ラミニン１、ラミニン５、フィブロネクチン、及びコラーゲンを含む）への接着能力の変化は観察されなかった（データは示していない）。しかし、ＰＫＣδアイソフォーム及びＰＫＣζアイソフォームを過剰発現する細胞においては、培養ディッシュとの細胞接触の喪失が、培養ディッシュからの段階的なケラチン生成細胞脱着に付随した（図４）。
【０２０７】
（実施例９）
α６β４インテグリンの半接着斑局在に対するＰＫＣアイソフォームの過剰発現効果
α６β４発現は半接着斑接着複合体の形成のために必須であるので、半接着斑へのα６β４局在化とのα６β４下方制御及び細胞脱着の関連を試験した。図８は、半接着斑複合体とのα６β４結合の免疫蛍光分析を提示する。図８において見られるように、対照の感染したケラチン生成細胞と比較して、過剰発現しているＰＫＣαケラチン生成細胞におけるα６β４インテグリン発現の上方制御（図６）は、半接着斑複合体へのα６β４の組み込みの増加と関連する。ＰＫＣηを過剰発現する細胞はまた、半接着斑複合体とのα６β４インテグリンの結合を誘導するが、過剰発現しているＰＫＣα細胞において観察されるものよりも少なかった。予測されるように、ＰＫＣδ及びＰＫＣζを過剰発現するケラチン生成細胞におけるα６β４インテグリンの有意な下方制御が、細胞の半接着斑複合体とのα６β４の組み込みの減少に付随することを見い出した（図８）。これらの結果は、α６β４インテグリンが、細胞−マトリックス結合及びケラチン生成細胞が根底にある基底膜につながれることにおいて重要な役割を果たすことを示唆する。さらに、ＰＫＣδ及びζは、ケラチン生成細胞分化プロセスからの識別可能な経路において、α６β４下方制御を媒介し、ケラチン生成細胞の細胞脱着を開始する。最後に、ＰＫＣ媒介α６β４下方制御を関連付け、半接着斑α６β４組み込み及びケラチン生成細胞脱着への特異的形態学的変化を減少するために、培養期間の間に異なるＰＫＣアイソフォームを過剰発現する接着した細胞及び脱着した細胞の量の変化を追跡した。図９において、接着した細胞をＰＫＣアデノウイルス感染の２４時間後及び４８時間後に培養中で計数した。明瞭に観察することができるように、ＰＫＣδ及びＰＫＣζの両方はインビトロで細胞損失を誘導した。並行して、培養中での細胞の損失は、下層の培地に浮遊する培地の増加と相関した。これらの結果は、ＰＫＣδ及びＰＫＣζが、細胞の分化及び移動の初期段階と関連する脱着工程の制御のために重要であることを示す。
【０２０８】
（実施例１０）
ＰＫＣηは生理学的設定下でケラチン生成細胞の増殖及び分化を示差的に調節する
図７において明瞭に示されるように、ＰＫＣηアイソフォームを過剰発現する細胞は、対照の非感染細胞よりも５〜７倍上に加速した速度で増殖し、他のＰＫＣアイソフォームを過剰発現するケラチン生成細胞培養よりも一貫して高かった。しかし、増殖の誘導は培地中のＣａ２＋濃度を調節することによって決定されるような、ケラチン生成細胞の分化状態に依存した。低Ｃａ２＋濃度（０．０５ｍＭ）よりも下に維持されたケラチン生成細胞を増殖する際に、内因性ＰＫＣηは、増殖している細胞の大部分の核周辺領域に局在化した（図１０）。これらの条件下において、ＰＫＣηの過剰発現は、ケラチン生成細胞増殖に劇的な増加を誘導した（図１１）。しかし、ケラチン生成細胞がＣａ２＋濃度を０．１２ｍＭまで上昇させることによって分化された場合、ＰＫＣηの過剰発現は増殖を誘導しなかったが、ケラチン生成細胞分化をさらに刺激した。これらの結果は、過剰発現したＰＫＣηは生理学的に増殖している細胞においてのみ増殖を誘導するが、細胞分化に干渉しないことを示唆する。ＰＫＣη発現の調節の相違はまた、インビボにおいても見られた。活発に増殖している皮膚並びに胚のニューロン細胞におけるＰＫＣη発現が同定されたのに対して、成熟成体脳においては、ＰＫＣηは観察されず、表皮ＰＫＣηは皮膚の下流層に局在した。
【０２０９】
（実施例１１）
ＰＫＣη及びＤＮＰＫＣηの過剰発現は、ＰＫＣ局在化及び細胞形態を特異的に調節する
ケラチン生成細胞における増殖又は分化の両方の状態におけるＰＫＣηについてのポジティブな役割を支持する結果をさらに検証するために、キナーゼ不活性顕性不活性アデノウイルスＰＫＣη構築物の効果を、増殖しているケラチン生成細胞及び分化しているケラチン生成細胞における感染の効果を研究することによって分析した。図１２において見られるように、ＰＫＣη及びＤＮＰＫＣηの両方のアデノウイルス感染は、増殖状態及び分化状態の両方において効率的であった。予測されるように、増殖しているケラチン生成細胞において、ＤＮＰＫＣηは、Ｃａ２＋誘導性分化と関連する形態学的変化に類似する細胞形態の劇的な変化（細胞の平板化、細胞−細胞境界の喪失を含む）を伴うケラチン生成細胞分化を誘導した（図１２Ａ〜Ｂ）。さらに、これらの変化は、ケラチン生成細胞増殖の停止（図１１）及び分化マーカー（ケラチン１、ケラチン１０、ロリクリン、及びフィラグリンを含む）の劇的な誘導に付随し、これらは、インビボでの正常皮膚において提示されるのと同様のレベルまで上昇した（図１３Ａ〜Ｂ）。同時に、分化プログラムの開始に際して、ＤＮＰＫＣηの過剰発現はＣａ２＋誘導性分化を抑止しなかった。これらの結果は、ＰＫＣη及びＤＮＰＫＣηが、生理学的設定下で、ケラチン生成細胞の増殖及び分化を示差的に調節するために使用可能であることを示唆する。
【０２１０】
（実施例１２）
インビボ実験
ＰＫＣηがインビボで細胞の増殖及び分化を示差的に調節する能力を試験するために、ヌードマウスの背に作製した完全な切開性創傷の治癒をＰＫＣηが誘導する能力を評価した。外因性組換えタンパク質を発現するケラチン生成細胞の能力を、対照β−ｇａｌアデノウイルスを利用することによって確認した。図１４において見られることができるように、感染の２週間後、β−ｇａｌ発現は、インビトロケラチン生成細胞並びにインビボ皮膚で維持される。興味深いことに、創傷治癒プロセスが、対照、ＰＫＣα、及びＰＫＣηのアデノウイルス構築物を用いる局所的感染後にマウスにおいて試験されたときに、ＰＫＣηのみが、局所的感染の早くも４日後で顆粒組織の形成を誘導した。これはまた、筋肉、脂肪、及び真皮層の組織化された形成もまた含んだ。同時に、対照及びＰＫＣα感染皮膚において、濃密な顆粒組織は見い出されず、創傷の閉鎖は観察されなかった（図１４）。それゆえに、ＰＫＣηは、創傷治癒プロセスの誘導において皮膚の増殖及び分化を調節する第１の候補物質であると見なされることが可能である。
【０２１１】
（実施例１３）
インスリンは、増殖しているケラチン生成細胞におけるＰＫＣδのトランスロケーションを特異的に誘導する
皮膚において発現される２種のＰＫＣアイソフォームが、ケラチン生成細胞増殖に影響を与えることが見い出された：ＰＫＣη及びＰＫＣδである。皮膚分化を調節する特異的ＰＫＣアイソフォームを活性化する内因性因子に取り組み且つこれを同定するために、ケラチン生成細胞増殖を促進することが知られているいくつかの増殖因子（ＥＧＦ、ＫＧＦ、インスリン、ＰＤＧＦ、及びＩＧＦ１を含む）が増殖依存性の様式で特異的ＰＫＣアイソフォームを活性化する能力を評価した。ＰＫＣアイソフォームα、δ、ε、η、及びζは皮膚において発現される。ＰＫＣアイソフォームの活性化は膜画分へのそれらのトランスロケーションと関連するので、種々のＰＫＣアイソフォームの細胞質ゾルから膜へのトランスロケーションに対するこれらの増殖因子の効果を試験した。図１５において見られるように、刺激の早くも５分後に、インスリンは細胞質画分から膜画分へのＰＫＣδのトランスロケーションを特異的に誘導した。ＰＫＣδの膜発現は、インスリン刺激後数時間維持された。対照的に、ＩＧＦ１は、膜におけるＰＫＣδ発現を減少し、且つ細胞質画分におけるその発現の相対的レベルを増加した。他の増殖因子は、ＰＫＣδのトランスロケーション及び局在化に有意に影響を与えなかった。他のＰＫＣアイソフォームの分布の変化は、ＩＧＦ１及びインスリンを含むいずれの増殖因子による刺激後にも見られなかった。
【０２１２】
（実施例１４）
インスリンは、増殖しているケラチン生成細胞においてＰＫＣδの活性化を特異的に誘導する
ＰＫＣδのトランスロケーションが活性化のために十分であるか否かを決定するために、インスリン及びＩＧＦ１で処理したケラチン生成細胞の細胞質及び膜の画分からのＰＫＣ免疫沈殿物のキナーゼ活性を測定した。図１６に示されるように、インスリンは膜画分中のＰＫＣδの活性を増加したがＩＧＦ１は増加しなかった。ＰＫＣα活性の上昇は、細胞質画分においては観察されなかった。インスリン誘導性活性化はＰＫＣδに特異的であり、ＰＫＣα、ε、η、又はζの活性化は、インスリン刺激の３０分後まで観察されなかった。要するに、これらの結果は、インスリンによるがＩＧＦ１によらないＰＫＣδ活性化の選択的刺激を示唆する。
【０２１３】
（実施例１５）
インスリン及びＩＧＦ１はケラチン生成細胞増殖に対して相加的効果を有する
ＰＫＣδの特異的活性化が、ケラチン生成細胞における特異的インスリン誘導性の分裂促進的経路を意味するか否かを分析するために、インスリンとＩＧＦ１の両方の分裂促進的効果を、チミジン取り込みによって測定されるようなケラチン生成細胞増殖を誘導するそれらの能力を研究することによって試験した。図１７Ａにおいて示されるように、インスリンとＩＧＦ１の両方が、用量依存的な様式でチミジン取り込みを刺激し、それぞれ１０−７Ｍ及び１０−８Ｍで最大誘導が達成された。各濃度において、ＩＧＦ１による最大刺激はインスリンによるそれよりも高かった。興味深いことに、すべての濃度において、両方のホルモンを一緒に与えた場合、分裂促進的効果は相加的であった（図１７Ｂ）。これらの結果は、インスリンが、ＩＧＦ１誘導性のケラチン生成細胞増殖に非依存的な独特な経路を通してケラチン生成細胞増殖を調節することを示唆する。
【０２１４】
（実施例１６）
インスリン誘導性ＰＫＣδ活性化とインスリン誘導性ケラチン生成細胞増殖の間の関連性
インスリン誘導性ＰＫＣδ活性化とインスリン誘導性ケラチン生成細胞増殖の間の関連性を直接的に研究するために、組換えＰＫＣアデノウイルス構築物を使用して、野生型ＰＫＣδ（ＷＴＰＫＣδ）並びにＰＫＣのキナーゼ不活性顕性不活性変異体（これは内因性ＰＫＣδ活性を抑止する）（ＤＮＰＫＣδ）の両方を過剰発現させた。インスリン誘導性ケラチン生成細胞増殖に対する、ＷＴＰＫＣδ及びＤＮＰＫＣδの過剰発現の効果を試験した。両方の構築物、並びにＰＫＣα構築物は、ケラチン生成細胞において効率的に発現された（図１８Ａ）。さらに、ＰＫＣδ及びＰＫＣαを用いる感染は、対照レベルよりも数倍上のアイソフォーム特異的ＰＫＣ活性を誘導した（図１８Ｂ）。予測されるように、ＤＮＰＫＣδの過剰発現はＰＫＣ活性を誘導しなかった。図１９Ａにおいて見られることができるように、トランスフェクトされていない細胞のインスリン処理又はインスリン処理を伴わないＷＴＰＫＣδの過剰発現は、未処理細胞、又はＰＫＣαで形質導入された細胞よりも２〜３倍とほぼ同じレベルまでチミジン取り込みを増加した。さらに、すでにＷＴＰＫＣδを過剰発現している細胞へのインスリンの付加は、チミジン取り込みのさらなる増加を引き起こさなかった。ＩＧＦ１は、非感染細胞並びにＷＴＰＫＣδ及びＰＫＣαを過剰発現する細胞の両方において同様にチミジン取り込みを増加した（図１９Ａ）。インスリン誘導された増殖におけるＰＫＣδの直接的関与は、ＰＫＣδ活性を抑止することによって証明された。図１９Ｂにおいて見られるように、顕性不活性ＰＫＣδを過剰発現する細胞におけるベースのチミジン取り込みはわずかであるが有意であり、非感染細胞におけるそれよりも低かった。ＤＮＰＫＣδの過剰発現は、インスリン誘導性の増殖を完全に除去したが、ＩＧＦ１誘導性増殖に影響を与えなかった。さらに、インスリン及びＩＧＦ１の相加的効果は、ＩＧＦ１単独のそれまで減少した。
【０２１５】
（実施例１７）
ＰＫＣδ活性化のインスリン媒介経路への特異性
ＰＫＣδ活性化のインスリン媒介経路への特異性を、種々の増殖因子（ＩＧＦ１、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＥＣＧＦ、及びＰＤＧＦを含む）に対する分裂促進的応答へのＰＫＣδ及びＤＮＰＫＣδの効果を研究することによって分析した。図２０において見られるように、ＤＮＰＫＣδの過剰発現は、インスリンによって誘導される増殖性効果を選択的に除外したが、試験された他の増殖因子のいずれの効果もブロックしなかった。しかし、ＰＫＣδの過剰発現は、インスリン誘導性増殖を模倣し、ＩＧＦ１誘導性増殖に影響を与えなかった。ＥＧＦ及びＫＧＦを用いる刺激によって誘導される増殖は増加した（図２１）。これらのデータは、インスリンによるＰＫＣδ活性化が、ＰＫＣδを含む経路を通してケラチン生成細胞の増殖を媒介すること、及びこの経路が、ケラチン生成細胞増殖を調節することが知られている２つの主要な増殖因子であるＥＧＦ及びＫＧＦのシグナル伝達の上流にあることを示す。全体として、インスリンは、ＰＫＣδ活性の特異的レギュレーターであることが見い出され、この活性は、インスリン、ＥＧＦ、及びＫＧＦによって誘導されるケラチン生成細胞増殖を調節する際の特異的候補である可能性がある。
【０２１６】
（実施例１８）
インスリン誘導性ＰＫＣδ活性及びケラチン生成細胞増殖は、ＳＴＡＴ３転写活性化によって媒介される
インスリンシグナル伝達におけるＰＫＣδの役割をさらに特徴付けし、これがＳＴＡＴ３によって媒介される転写活性化の誘導を含むことを見い出した。図２３において見られるように、初代ケラチン生成細胞において、ＰＫＣδは、ＳＴＡＴ３と特異的に関連性があることが示された。インスリン刺激後、ＰＫＣδは活性化され、次には、ＳＴＡＴ３をリン酸化及び活性化する（図２４）。さらに、薬理学的阻害剤（ロットレリン）によるＰＫＣδ活性の抑止は、ＳＴＡＴ３の活性化並びに核トランスロケーションを阻害する。さらに、図２５において見られるように、ＳＴＡＴ３の過剰発現は、インスリンによって、及びＰＫＣδの過剰発現によって誘導されるのと同様の増殖を誘導し、顕性不活性ＰＫＣδ変異体の過剰発現によるＰＫＣδ活性の抑止は、ＳＴＡＴ３がケラチン生成細胞増殖を誘導する能力を消滅させる。全体として、これらの結果は、インスリン及びＰＫＣδが、ケラチン生成細胞増殖と関連した転写活性化において役割を果たすことを示唆する。
【０２１７】
（実施例１９）
ＰＫＣδ及びＰＫＣζはインビボでの創傷治癒プロセスに必須である
インビボでの創傷治癒プロセスにおけるＰＫＣアイソフォームの重要性は、アイソフォーム特異的無ＰＫＣマウスを利用して確立された。図２２Ａ〜Ｂにおいて見られるように、全層創傷が、無ＰＫＣδマウス、無ＰＫＣζマウス、無ＰＫＣαマウス（ノックアウト、ＫＯ）及びそれらの野生型同腹仔の背において作製されたときに、創傷治癒の遅延が無ＰＫＣδマウス及び無ＰＫＣζマウスにおいて観察されたが、無ＰＫＣαマウスにおいては観察されなかった。このデータは、糖尿病バックグラウンドの非存在下においてさえ、特異的ＰＫＣアイソフォームが皮膚における創傷治癒プロセスのために必須であることを示す。
【０２１８】
（実施例２０）
インビボでの創傷治癒のためのインスリンの単回対複数回塗布
創傷を切開により８〜１０週齢のＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、以下のように処置した：（ｉ）インスリン０．１μＭ、７日間毎日塗布；（ｉｉ）インスリン１μＭ、７日間毎日塗布；（ｉｉｉ）インスリン１０μＭ、７日間毎日塗布；（ｉｖ）インスリン１μＭ、創傷形成の４日後に１回塗布；及び（ｖ）媒体（ＰＢＳ）対照、７日間毎日塗布。すべてのマウスを創傷形成の７日後に屠殺し、それらの開いた創傷領域を測定した。図２６に見られるように、１μＭ濃度におけるインスリンの毎日の処置は、より低濃度（０．１μＭ）又はより高濃度（１０μＭ）でのインスリンの毎日の処置よりも有意に効果的であった。驚くべきことに、１μＭ濃度におけるインスリンの単回塗布の処置は、同じ濃度のインスリンの７回の日々の反復塗布の処置よりも実質的に有効であった。
【０２１９】
観察された創傷は瘢痕組織で覆われていたので、創傷の実際の閉鎖及び再構築した表皮の形成を正確に評価することが困難であった。それゆえに、創傷組織の表皮及び真皮の閉鎖に対するインスリンの効果を、組織学的パラメーターによって決定した。創傷の表皮閉鎖を、創傷ギャップにおける基底細胞の形成を強調する、ケラチン１４抗体（Ｋ１４、Ｂａｂｃｏ−Ｃｏｎｖａｎｃｅ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州、米国）を用いて創傷切片を染色することによって決定した。創傷の真皮閉鎖を、×１００拡大における光学顕微鏡下で観察される単一の視野において、真皮が両方の創傷の側で観察可能である場合に、ポジティブであると見なした。
【０２２０】
図２７において見られるように、すべてのインスリン処置は、表皮及び真皮の閉鎖を効果的に促進した。図２６において示される結果と同様に、１μＭ濃度でのインスリンの日々の処置は、０．１μＭ又は１０μＭの濃度でのインスリンの日々の処置よりも有意に効果的であった。さらに、１μＭ濃度におけるインスリンの単回塗布は、同じ濃度におけるインスリンの１日に７回の反復塗布の効果よりも実質的に有効であった。
【０２２１】
したがって、これらの結果は、形態学的並びに組織学的なパラメーターによって決定されるように、インビボでの創傷治癒に対するインスリンの治療的効力を明確に立証する。これらの結果は、驚くべきことに、インスリンの最適な塗布の回数及び／又は頻度を決定することが、適切に創傷を治療するための決定的な工程であることを示す。
【０２２２】
（実施例２１）
インビボでの創傷治癒のためのインスリン及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）の組み合わせ
創傷を切開により８〜１０週齢のＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、創傷形成の４日後に以下のように処置した：（ｉ）媒体（ＰＢＳ）対照；（ｉｉ）インスリン １μＭ；（ｉｉｉ）ＰＤＧＦ−ＢＢ １０μＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、米国）；及び（ｉｖ）インスリン １μＭ＋ＰＤＧＦ−ＢＢ １０μＭ。処置の３日後にすべてのマウスを屠殺し、処置した創傷を、例えば、上記の実施例２０に記載されるように、表皮閉鎖及び真皮閉鎖について組織学的に分析した。
【０２２３】
図２８において見られるように、インスリン又はＰＤＧＦ−ＢＢいずれか単独を用いる処置は、表皮閉鎖に対して（対照よりも３０〜４０％の増加）及び真皮閉鎖に対して（対照よりも１０〜２０％の増加）部分的に有効であった。しかし、インスリン及びＰＤＧＦ−ＢＢを組み合わせた処置は、実質的により高い表皮閉鎖（対照よりも約８０％増加）並びに真皮閉鎖（約６０％増加）を生じた。したがって、これらの結果は、インスリン及びＰＤＧＦ−ＢＢの組み合わせが相乗的な様式で創傷治癒に影響を与えることを示す。これらの結果はさらに、創傷の治療的処置のために、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＫＧＦなどの他の増殖因子又はトランスフォーミング因子とインスリンを組み合わせることの潜在能力を示す。
【０２２４】
（実施例２２）
インビボでの創傷治癒のためのインスリン及びＰＫＣα阻害剤の組み合わせ
創傷を切開により８〜１０週齢のＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、媒体（ＰＢＳ）対照、又はＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２；ＰＫＣα偽基質、ミリストイル化；Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ、サンジエゴ、カリフォルニア州、米国と組み合わせた、０．６７μＭ インスリン（ＨＯ／０１；Ｈｕｍｕｌｉｎ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、米国）のいずれかを用いて７日間毎日処置した。創傷形成の７日後、すべてのマウスを屠殺し、処置された創傷を、創傷閉鎖、表皮閉鎖、真皮閉鎖、及び表皮細胞の空間的分化について分析した。創傷閉鎖を、開いた創傷領域を測定することによって決定した。創傷の真皮閉鎖は、両方の創傷の側において真皮が×１００倍率における光学顕微鏡下で観察される単一の視野において観察可能である場合にポジティブであると見なした。創傷の表皮閉鎖は、創傷ギャップにおける基底細胞の形成を強調するＫ１４抗体を用いて創傷切片を染色することによって決定した。表皮細胞の空間的分化は、新規に形成された表皮細胞を強調するＫ１抗体を用いて創傷切片を染色することによって決定した。
【０２２５】
図２８〜３２に図示されるように、インスリン（ＨＯ／０１）及びＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）の組み合わせ塗布は、創傷閉鎖（図２９Ａ〜Ｂ）、真皮閉鎖（図３０）、表皮閉鎖（図３１）、及び表皮細胞の空間的分化（図３２）を実質的に促進した。図３３において見ることが可能であるように、ＰＫＣα阻害剤ＨＯ／０２と組み合わせたインスリンＨＯ／０１の処置は、それぞれ、媒体対照と比較して、約１５〜７０％表皮閉鎖を増加し、約１５〜５０％真皮閉鎖を増加し、約１５〜５０％表皮細胞の空間的分化を増加した。
【０２２６】
したがって、これらの結果は、ＰＫＣα阻害剤と組み合わせたインスリンによる創傷の治療的処置は、表皮閉鎖、真皮閉鎖、表皮細胞の空間的分化、及び引き続く創傷治癒を効果的に促進した。
【０２２７】
（実施例２３）
インスリン及びＰＫＣα阻害剤の組み合わせは、インスリンのみの処置によって引き起こされる有害な副作用を回避する
創傷を切開により８〜１０週齢のＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、媒体（ＰＢＳ）対照、又は１μＭ インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、米国）若しくは１μＭ ＰＫＣα偽基質（Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ、サンジエゴ、カリフォルニア州、米国）と組み合わせた１μＭ インスリンの混合物のいずれかを用いて７日間毎日処置した。創傷形成の７日後、すべてのマウスを屠殺し、処置された創傷を、表皮の増殖能力（ＰＣＮＡ）、血管形成、炎症、表皮細胞、及び創傷ギャップにおける再構築プロセスについて組織学的に分析した。
【０２２８】
以下の表１において見られることができるように、インスリンのみの処置は、緩衝液対照と比較した場合に、創傷領域において異常な血管形成の発生の実質的な増加を引き起こした（それぞれ、６０％及び２５％）。創傷治癒プロセスは迅速に増殖する表皮細胞を含むので、このような増加した血管形成はまた、癌の発生を開始するリスクを増加させるかもしれない。他方、インスリンがＰＫＣα阻害剤と組み合わせられた場合には、処置した創傷領域において血管形成は観察されなかった。
【表１】
【０２２９】
さらに、インスリンのみの処置は炎症の増加、表皮細胞の過形成、表皮細胞の棘層の分化の遅れ、及び瘢痕の増加を生じた。インスリンのみの処置から生じた有害な副作用は、ＰＫＣα阻害剤がインスリンと組み合わされた場合にはいずれも観察されなかった。
【０２３０】
（実施例２４）
ＰＫＣα阻害剤は創傷炎症を減少する
創傷における後期で且つ重篤な炎症性応答は治癒のプロセスを抑制する可能性があり、したがって、このような炎症を発生から防ぐことは、創傷治癒プロセスを促進するかもしれない。したがって、創傷炎症に対するＰＫＣα阻害剤及びインスリンの効果を、以下の実験において試験した。
【０２３１】
創傷を切開によりＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、以下を用いて７日間毎日処置した：（ｉ）ＰＢＳ、対照；（ｉｉ）１μＭ ＰＫＣα阻害剤（偽基質、ミリストイル化；Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ、米国）；（ｉｉｉ）１μＭ インスリン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、米国）；又は１μＭ ＰＫＣα阻害剤及び１μＭ インスリンの混合物。創傷形成の７日後、すべてのマウスを屠殺し、処置された創傷を炎症について顕微鏡下で観察した。創傷領域中で観察された重篤な炎症の得られる発生率は、以下に続く表１ａにおいて要約される。
【表２】
【０２３２】
これらの結果は、創傷へのＰＫＣα阻害剤の投与が、対照と比較して、重篤な創傷炎症の発生率の実質的な減少（３３．３％）を引き起こすことを示す。インスリン単独では、これらの実験条件下では抗炎症性効果を有さなかった。
【０２３３】
これらの結果は、ＰＫＣα阻害剤が、創傷の重篤な炎症を制御するために治療において使用可能であることを示す。ＰＫＣα阻害剤が炎症を減少させる実証された能力は、表皮閉鎖、真皮閉鎖、及び表皮細胞の空間的分化を促進するその能力と結び付けられて（本明細書中上記の実施例２２を参照のこと）、これを創傷治癒のために潜在的に最も有効な治療剤にする。
【０２３４】
（実施例２５）
インビトロでの創傷閉鎖を加速することに対する、真皮細胞における特異的ＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節すること、並びに細胞に種々の薬剤を投与することの組み合わせ効果
材料及び方法
試薬：Ｄ因子（アディプシン）ヒト、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州、米国；組換えＴＮＦα マウス、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス 米国；ＧＷ９６６２、Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ、米国；タンパク質キナーゼＣα偽基質阻害剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州、米国；タンパク質キナーゼＣζ偽基質阻害剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州、米国；タンパク質キナーゼＣη偽基質阻害剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州、米国；ＰＤＧＦ−ＢＢ、Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル；ＩＬ−６、Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル；ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル、ＩＧＦ−１、Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル；ＴＧＦβ２、Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル；上皮増殖因子（ＥＧＦ）、マウス、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州、米国；ＰＫＣδ ＲＡＣＫ、ＡｎａＳｐｅｃ、カリフォルニア州、米国；ロジグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎ）、ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ、カリフォルニア州、米国；アディポネクチン、ＭＢＬ、マサチューセッツ州、米国及びコパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）（登録商標）、ＴＥＶＡ、イスラエル。
【０２３５】
インビトロ創傷閉鎖アッセイ：ケラチン生成細胞及び線維芽細胞（真皮細胞）をペトリ皿（内径５ｃｍ）で５日間培養し、次いで人工的な交差型の擦過傷を、２００μｌピペットチップを使用して各ペトリ皿において形成した。培養した細胞を、特異的ＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節可能なアデノウイルス構築物で感染させた。したがって、野生型（ＷＴ）ＰＫＣアデノウイルス構築物は特異的ＰＫＣを活性化するために使用したのに対して、顕性不活性（ＤＮ）ＰＫＣアデノウイルス構築物は、特異的ＰＫＣを阻害するために使用した。培養細胞は、以下の薬剤の１つをさらに供給された：インスリン（６．７×１０−７Ｍ）、アディポネクチン（１μｇ／ディッシュ）、アディプシン（２μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１μｇ／ディッシュ）、ＧＷ９６６２（１μｇ／ディッシュ）、ＫＧＦ（１μｇ／ディッシュ）、ＴＮＦα（１２μｇ／ｍｌ）、ＴＧＦβ、ロジグリタゾン、ＳＲＣ阻害剤、ＰＫＣδ ＲＡＣＫ（１０−７Ｍ）、及びＰＫＣα偽基質阻害ペプチド（１０７Ｍ）。得られる創傷治癒レベルは、０（閉鎖なし）〜１０（完全な閉鎖）までの範囲の指標値を使用して、処置の２４〜４８時間後に決定した。
【０２３６】
結果：
インビトロでの線維芽細胞創傷閉鎖に対する組み合わせ治療の効果は、以下の表２ａ〜ｂ及び表３ａ〜ｂに要約されている。これらの結果は、線維芽細胞におけるＰＫＣαの発現及び／又は活性の阻害が、細胞へのアディプシン又はインスリンの投与と組み合わせた場合に、創傷閉鎖を実質的に促進することを示す（それぞれ、１０及び８の創傷閉鎖指標値）。創傷閉鎖はまた、線維芽細胞におけるＰＫＣηの阻害、ＰＫＣεの阻害、ＰＫＣδの活性化、又はＰＫＣζの活性化と組み合わせたＰＫＣαの阻害によって加速された（それぞれ、９、９、９、及び７の創傷閉鎖指標値；図３４Ａ〜Ｅ）。さらに、創傷閉鎖は、細胞へのＫＦＧの投与と組み合わせた、線維芽細胞中でのＰＫＣζの阻害によって促進された（７の創傷閉鎖指標値；図３６）。さらに加えて、創傷閉鎖は、インスリン、ＩＬ−６、ＫＧＦ、又はＧＷ９６６２の投与と組み合わせた、線維芽細胞におけるＰＫＣβの阻害によって加速された（それぞれ、８、７、９、及び８の創傷閉鎖指標値；図３８Ａ〜Ｅ）。
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【０２３７】
インビトロでのケラチン生成細胞創傷閉鎖に対する組み合わせ処置の効果を以下の表４ａ〜ｂ及び表５ａ〜ｂに要約する。これらの結果は、ケラチン生成細胞におけるＰＫＣαの発現及び／又は活性の阻害が、細胞へのＫＧＦ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、又はＰＫＣδ ＲＡＣＫペプチドの投与と組み合わせた場合に、創傷閉鎖を実質的に促進したことを示す（それぞれ６、８、１０、及び８の創傷閉鎖指標値；図３５Ａ〜Ｃ及びＧ）。創傷閉鎖はまた、細胞中のＰＫＣη、ＰＫＣε、又はＰＫＣζの刺激と組み合わせて、ケラチン生成細胞中のＰＫＣαの阻害によって増強された（それぞれ、１０、９、及び６の創傷閉鎖指標値；図３５Ａ、Ｄ〜Ｆ及びＨ）。さらに、創傷閉鎖は、細胞へのＩＬ−６、ＴＮＦα、又はアディポネクチンの投与と組み合わせた、ケラチン生成細胞におけるＰＫＣζの阻害によって促進された（それぞれ９、９、及び７の創傷閉鎖指標値；図３７Ａ〜Ｄ）。さらに加えて、創傷閉鎖は、細胞中でＰＫＣεを活性化すること、ＰＫＣζを活性化すること、若しくはＰＫＣαを阻害することと組み合わせた、ケラチン生成細胞におけるＰＫＣδ活性及び／若しくは発現の促進によって、又は細胞へのアディプシンの投与によって加速された（それぞれ７、８、８、及び８の創傷閉鎖指標値；図３９Ａ〜Ｅ）。
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【０２３８】
したがって、これらの結果は、創傷閉鎖が、ＩＬ−６、ＫＧＦ、ＴＮＦαなどの増殖因子、インスリンなどのホルモン、アディプシン若しくはアディポネクチンなどのアディポカイン、ＰＫＣδ ＲＡＣＫ及び／又はＧＷ９６６２を細胞に投与することと組み合わせた場合に、創傷領域にコロニー形成した真皮細胞及び表皮細胞中での特異的ＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節することによって実質的に加速可能であることを示す。
【０２３９】
（実施例２６）
インビトロ及びインビボでの創傷治癒のためのコポリマー１の投与
材料及び方法
コポリマー１：コポリマー１（酢酸ガラティラメル）は、多発性硬化症を治療するために臨床的に使用されている薬物コパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）（登録商標）（Ｔｅｖａ、イスラエル）の活性成分である。コポリマー１は、ミエリン鞘の天然成分であるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の合成ポリペプチドアナログである。化学的には、コポリマー１は、Ｌ−アラニン、Ｌ−リジン、及びＬ−チロシンを有するＬ−グルタミン酸ポリマー、酢酸（塩）と呼ばれる。その構造式は：（Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ）ｘ．ＸＣＨ３ＣＯＯＨ（Ｃ５Ｈ９ＮＯ４・Ｃ３Ｈ７ＮＯ２・Ｃ６Ｈ１４Ｎ２Ｏ２・Ｃ９Ｈ１１ＮＯ３）ｘ・ｘＣ２Ｈ４Ｏ２である。酢酸ガラティラメルの平均分子量は４，７００〜１１，０００ダルトンである。これは、２３，０００ダルトンの平均分子量を有する生成物を形成する４種のアミノ酸を化学的に重合することによって合成される（米国特許第３，８４９，５５０号）。
【０２４０】
インビトロアッセイ：アッセイを、本質的に本明細書中上記の実施例２４に記載されるように実行した。コポリマー１は５５μｇ／ディッシュの濃度で、単独で、又はＰＫＣα偽基質（１μＭ）及び／若しくはインスリン（１μＭ）と組み合わせて、培養したケラチン生成細胞に供給した。得られる創傷閉鎖レベルを、処置の４８時間後に、０（閉鎖なし）〜１０（完全な閉鎖）までの範囲の指標値を使用して決定した。
【０２４１】
インビボアッセイ：創傷を切開（２０ｍｍ）によりＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、以下のように創傷形成の４日後に処置した：（ｉ）媒体（ＰＢＳ）対照；（ｉｉ）コポリマー１（５５μｇ／ｍｌ）；（ｉｉｉ）コポリマー１（５５μｇ／ｍｌ）及びインスリン（１μＭ）の混合物；（ｉｖ）ＰＫＣα偽基質阻害ペプチド（１μＭ）及びインスリン（１μＭ）の混合物；並びに（ｖ）コポリマー１（５５μｇ／ｍｌ）、ＰＫＣα偽基質阻害ペプチド（１μＭ）、及びインスリン（１μＭ）の混合物。創傷を、（ｉ）創傷閉鎖、（ｉｉ）痂皮形成、及び（ｉｉｉ）創傷の出血／滲出について形態学的に評価した。
【０２４２】
結果：
インビトロアッセイ：培養したケラチン生成細胞へのコポリマー１の投与は、０（閉鎖なし）〜１０（完全な閉鎖）までのスケール上で８の指標値にインビトロ創傷の閉鎖を促進した。ＰＫＣα偽基質阻害ペプチド、又はＰＫＣα偽基質及びインスリンの混合物とのコポリマー１の組み合わせは、同様の効果を生じた（それぞれ、８及び９の創傷閉鎖指標値；図４０Ａ〜Ｆ）。したがって、これらの結果は、コポリマー１それ自体が、インビトロでの創傷閉鎖を実質的に加速可能であることを示す。
【０２４３】
インビボアッセイ：コポリマー１を、単独で又はインスリン及び／若しくはＰＫＣα偽基質と組み合わせて、切開創傷に投与することは、未処置対照と比較して、創傷ギャップを実質的に減少させ、創傷中の痂皮形成を加速した。さらに、コポリマー１を用いるすべての処置は、創傷領域における出血及び滲出を効果的に予防した。
【０２４４】
したがって、これらの結果は、有効量のコポリマー１を、単独で又はインスリン及び／若しくはＰＫＣα偽基質阻害ペプチドと組み合わせて、創傷組織に投与することは、創傷治癒プロセスを実質的に加速可能であることを示す。
【０２４５】
（実施例２７）
創傷治癒プロセスに対する胸腺分泌物質の影響
材料及び方法：
創傷切開を、正常成体齧歯類又はＳＴＺ糖尿病マウスの上背（首の近く）で実行した。これらの動物を処置の７日後又は９日後に屠殺し、創傷を、上記の実施例２０において記載されるような染色手順を使用して、創傷領域に近接した胸腺の存在について、並びに創傷の表皮及び真皮の閉鎖について、組織学的に分析した。
【０２４６】
結果：
図４２Ａ〜Ｈにおいて見られることができるように、創傷ギャップに密接に近接した胸腺の存在は、表皮形成の加速、組織の顆粒化、及び創傷中の真皮収縮と相関した。これらの観察は、胸腺分泌物質が創傷の治癒プロセスに効果的に寄与するかもしれないことを示す。したがって、サイモシン、β−サイモシン（例えば、サイモシンβ４、サイモシンβ１０、サイモシンβ９、サイモシンβ１２、サイモシンβ１４）、αサイモシン（例えば、サイモシンα、１／ゼダキシン、プロサイモシンα、パラサイモシンα）、サイムリン、ＩＧＦＩ、ＩＧＦＩＩ、ＮＧＦ、ソマトスタチン、サイログロブリン、副甲状腺ホルモン、及び／又は胸腺ホルモンペプチド（ＴＨＰ）などの胸腺由来物質は、創傷の治癒プロセスを加速するための処置において使用されてもよい。
【０２４７】
別々の実施形態の状況において、明瞭化のために記載される本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態における組み合わせで提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態の状況において記載される種々の本発明の特徴は、別々に、又は任意の適切な小さな組み合わせ（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）でもまた提供されてもよい。
【０２４８】
本発明をその特定の実施形態と併せて記載してきたが、多くの代替、改変、及び変形が当業者には明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神及び広い範囲内にある、すべてのこのような代替、改変、及び変形を含めるものとする。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に援用され、個々の刊行物、特許、特許出願が、具体的且つ個別に引用されて、参照により本明細書に援用される。さらに、本願におけるいかなる参考文献の引用及び同定も、このような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認と解釈されるべきではない。
【０２４９】
（参考文献）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖及び／又は細胞分化を誘導及び／又は促進し、それによって創傷の治癒プロセスを促進するための方法及び薬剤組成物に関する。より詳細には、本発明は、細胞増殖及び／又は細胞分化及び／又は細胞移動を誘導及び／又は促進し、それによって創傷の治癒プロセスを促進するための、ＰＫＣとしても知られるセリン／スレオニンタンパク質キナーゼの、例えば膜転位及び活性化によって開始される発現及び／又は活性化の調節の使用に関する。本発明の教示に従って、（ｉ）ＰＫＣ発現構築物での創傷細胞の形質転換、（ｉｉ）創傷細胞の内因性ＰＫＣ遺伝子と隣接したその上流に挿入するシス作用性エレメントを用いた創傷細胞の形質転換、（ｉｉｉ）創傷細胞においてＰＫＣの発現及び／又は活性化を誘導するインスリンの投与、（ｉｖ）インスリン発現構築物から産生され、発現され分泌されるインスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、そのインスリン発現構築物での創傷細胞の形質転換、（ｖ）発現され分泌されるインスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、創傷細胞の内因性インスリン遺伝子と隣接したその上流に挿入するシス作用性エレメントでの創傷細胞の形質転換、（ｖｉ）創傷へのインスリン分泌細胞の移植、（ｖｉｉ）インスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、内因性インスリンの産生及び分泌を誘導するトランス作用性因子、例えばＰＤＸ１での創傷細胞の形質転換、並びに（ｖｉｉｉ）創傷へのＰＫＣ調節因子の投与によって、そのような発現の調節を実施することができる。
【０００２】
本発明は、上記の方法のいずれかによって実現されるように、皮膚移植片の産生のためにｅｘ ｖｉｖｏで実施することもできる。
【背景技術】
【０００３】
創傷治療での第一の目標は、創傷閉鎖を達成することである。皮膚開放創は、創傷の主要な部類の１つに相当し、それには、熱傷創、神経障害性潰瘍、褥瘡、静脈うっ血性潰瘍、及び糖尿病性潰瘍がある。
【０００４】
皮膚開放創は、６個の主要な構成要素：（ｉ）炎症、（ｉｉ）線維芽細胞増殖、（ｉｉｉ）血管増殖、（ｉｖ）結合組織合成、（ｖ）上皮化、及び（ｖｉ）創傷収縮を含むプロセスによって通常治癒する。これらの構成要素が、個々に又は全体として適切に機能しないとき、創傷治癒は障害される。栄養不良、感染、薬剤作用物質（例えば、アクチノマイシン及びステロイド）、高齢及び糖尿病を含めて、多数のファクターが創傷治癒に影響を及ぼす可能性がある（非特許文献１を参照）。
【０００５】
糖尿病について、真性糖尿病は、インスリンシグナル伝達の障害、血漿グルコースの上昇、いくつかの独特の組織が関与する慢性合併症を発症する傾向を特徴とする。真性糖尿病の慢性合併症すべての中で、足部潰瘍化を引き起こす創傷治癒の障害は、最も研究が十分でない。さらに、糖尿病患者における皮膚の潰瘍化は、驚くほどの個人的金銭的なコストがかかる（非特許文献１及び非特許文献２）。さらに、足部潰瘍、及びそれに続く下肢切断は、糖尿病患者の中で入院の最も一般的な原因である（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献５）。糖尿病では、創傷治癒プロセスは障害され、治癒した創傷は、創傷の強度が減弱していることを特徴とする。組織修復の欠陥は、神経障害、血管疾患及び感染を含めたいくつかのファクターと関係している。しかし、異常なインスリンシグナル伝達と関係する糖尿病状態が創傷治癒を障害し、皮膚の生理状態を変化させる他の機構は、解明されていない。
【０００６】
身体の種々の部分での外科手術後、手術は成功するが創傷切開が治癒しないという創傷治癒の一般的な問題も存在する。
【０００７】
皮膚とは、層を成す扁平上皮であり、皮膚では増殖し分化する細胞が厳密に区画化されている。生理状態では、増殖は、基底膜と接着している基底細胞に限定されている。分化とは、基底細胞が基底膜との接着を喪失し、ＤＮＡ合成を中止し、一連の形態的生化学的変化を受ける空間的なプロセスである。その最終的な成熟化ステップは、皮膚の保護障壁を形成する角化層の産生である（非特許文献７及び非特許文献８）。基底細胞が分化に傾くときに観察される最も初期の変化は、基底膜から脱離し、遠くへ移動する基底細胞の能力と関係する（非特許文献９）。同様の変化が、細胞が創傷領域へと移動し、増殖能も促進される創傷治癒プロセスと関係する。これらのプロセスは、皮膚層の再構築、及び表皮層の適切な分化の誘導に必須である。
【０００８】
表皮細胞の増殖及び分化を制御する機構の分析は、マウス及びヒトのケラチン生成細胞培養系の開発によって非常に容易となった（非特許文献８及び非特許文献１０）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ケラチン生成細胞は、高増殖速度の基底増殖細胞として維持することができる。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの表皮の成熟パターンに従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化を誘導することができる。初期の事象には、半接着斑の構成成分の喪失（非特許文献９及び非特許文献１１）、及びα６β４インテグリンの選択的喪失、及びマトリックスタンパク質との細胞接着がある。このことは、インテグリン発現の変化が、ケラチン生成細胞分化の初期事象であることを示唆するものである。半接着斑の接触の初期喪失は、ケラチン生成細胞の基底膜上の移動を引き起こし、培養ケラチン生成細胞及び皮膚でのケラチン１（Ｋ１）の誘導へとつながる（非特許文献７、非特許文献９及び非特許文献１２）。顆粒層の表現型へのさらなる分化は、β１とβ４両方のインテグリン発現の下方制御、すべてのマトリックスタンパク質との接着可能性の喪失を伴い、その後に角化膜が形成され、細胞死が起こる。分化細胞は、成熟扁平細胞として培養皿から最終的に分離する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのこの分化プログラムは、ｉｎ ｖｉｖｏでの表皮の成熟パターンに密接に従う。
【０００９】
ケラチン生成細胞の生物学における最近の研究は、皮膚の増殖及び分化を制御するタンパク質キナーゼＣ経路の寄与を明らかにするものである。タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーのセリン−スレオニンキナーゼは、様々な生物学的現象に重要な制御の役割を果たす（非特許文献１３及び非特許文献１４）。ＰＫＣファミリーは、少なくとも１２個の個々のアイソフォームからなり、それらは、３つの異なる種類：（ｉ）Ｃａ２＋、ホルボールエステル、及びホスホリパーゼＣによって細胞内で遊離するジアシルグリセロールによって活性化される従来型アイソフォーム（α、β１、β２、γ）、（ｉｉ）やはりホルボールエステル及びジアシルグリセロールによって活性化されるが、Ｃａ２＋では活性化されない新規アイソフォーム（δ、ε、η、θ）、並びに（ｉｉｉ）Ｃａ２＋、ホルボールエステル又はジアシルグリセロールによって活性化されない非定型的な（ζ、λ、ι）構成要素のファミリーに属する。
【００１０】
活性化後、全部ではないがほとんどのアイソフォームが細胞質から原形質膜へと転位すると考えられている。アイソフォームの型、及び分布のパターンは、異なる組織間で様々であり、表現型の機能として変化することもある。ホルモン作用の多種多様な細胞の評価項目の中でそれが重要であるので、多数の研究からＰＫＣの構造及び機能が特徴付けられている。５つのＰＫＣアイソフォームα、δ、ε、η、及びζがｉｎ ｖｉｖｏ及び培養下の皮膚で同定されている。最近の研究から、ＰＫＣシグナル伝達経路が、分化反応の主要な細胞内媒介物であることが示された（非特許文献１５及び非特許文献１６）。さらに、ＰＫＣの薬剤活性化物質は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでケラチン生成細胞分化の強力な誘導物質であり（非特許文献１０及び非特許文献１７）、ＰＫＣ抑制物質は、分化マーカーの発現を妨げる（非特許文献１５）。
【００１１】
本発明を考え出す間、ＰＫＣアイソフォームの過剰発現及び／又は活性化は、創傷治癒プロセスの促進に有益である可能性があると仮定した。皮膚細胞の増殖及び／又は分化における別個のＰＫＣアイソフォームの役割を調べることについての制約は、従来の方法で外来遺伝子を効率よく初代細胞に導入することが困難であることによって拘束されてきた。寿命が短く、分化の可能性があり、安定な形質転換体を単離できないことから、初代皮膚細胞に外来遺伝子を効率よく形質導入することは不可能である。
【００１２】
従来技術では、創傷治癒の治療用作用物質としてのインスリンの潜在的な使用について記載がある。したがって、特許文献１、特許文献２及び特許文献３は、創傷治癒を促進する、創傷へのインスリンの局所塗布について記載するものである。しかし、インスリンの機能が、グルコース摂取を促進し、それによって創傷治癒を促進することであるため、これらの特許は、グルコースと組み合わせたインスリンの使用について記載するものである。
【００１３】
特許文献４及び特許文献５は、皮膚の健康状態を改善し、又は浅い皮膚損傷を治療する目的で、皮膚への局所塗布用のインスリンを含む組成物について記載するものである。しかし、これらの特許出願は、慢性の、第２度の又は深い損傷を治療するためのインスリンの使用を教示するものではない。
【００１４】
特許文献６は、創傷治癒のためのインスリン又は銀と組み合わせたシアノアクリレートポリマー密封剤の使用について記載するものである。しかし、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節することができる他の生物学的に活性な作用物質と組み合わせたインスリンの使用は、この出願では教示されず示唆されない。
【００１５】
特許文献７は、糖尿病を治療するためのインスリンの局所塗布について記載するものである。しかし、この特許出願は、糖尿病非関連の創傷を治療する目的でのインスリンの使用を教示するものではない。
【００１６】
特許文献８は、インスリンを含むことができる治療用マイクロエマルジョン製剤について記載するものである。しかし、創傷治癒の目的での製剤インスリンの使用は、この開示では教示されない。
【００１７】
特許文献９及び特許文献１０は、上皮増殖因子及びインスリンを含む、ヒトケラチン生成細胞及び表皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏクローン性増殖のための組成物について記載するものである。このどちらの特許も、移植に使用することができる培養皮膚細胞の発育のためのインスリンの使用を教示するものである。しかし、創傷に対するｉｎ ｖｉｖｏでのインスリンの塗布は、これらの特許では教示されない。
【００１８】
上記で引用した従来技術の文献は、創傷の治癒プロセスを促進するように、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節するためのインスリンの使用を教示又は示唆するものではない。さらに、従来技術は、創傷の治癒プロセスを促進するように、インスリンを創傷に供給するための核酸構築物又は遺伝子形質転換技術の利用を教示又は示唆するものではない。
【００１９】
創傷治癒に関連するプロセスを促進する新たな手法についての必要性が広く認識され、それを有すると非常に有利となるはずである。さらに、細胞の増殖及び／又は分化のプロセス並びに創傷治癒を促進する、皮膚細胞への組換え遺伝子挿入の効率のよい方法についての必要性が広く認識され、それを有すると非常に有利となるはずである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５，５９１，７０９号
【特許文献２】米国特許第５，４６１，０３０号
【特許文献３】米国特許第５，１４５，６７９号
【特許文献４】米国特許出願第０９／７４８，４６６号
【特許文献５】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１７９４
【特許文献６】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０２４５
【特許文献７】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／００６９５
【特許文献８】国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０３０８６
【特許文献９】米国特許第４，６７３，６４９号
【特許文献１０】米国特許第４，９４０，６６０号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Hunt and Goodson in Current Surgical Diagnosis & Treatment (Way; Appleton; and Lange), pp. 86-98, 1988.
【非特許文献２】Knighton, D. R. and Fiegel, V. D. Growth factors and comprehensive surgical care of diabetic wounds. Curr. Opin. Gen. Surg., : 32-9, 1993.
【非特許文献３】Shaw, J. E. and Bouton, A. J. The pathogenesis of diabetic foot problems: an overview. Diabetes, 46 Suppl 2 : S58-61, 1997.
【非特許文献４】Coghlan, M. P. , Pillay, T. S. , Tavare, J. M., and Siddle, K. Site-specific anti-phosphopeptide antibodies: use in assessing insulin receptor serine/threonine phosphorylation state and identification of serine-1327 as a novel site of phorbol ester- induced phosphorylation. Biochem. J. , 303: 893-899, 1994.
【非特許文献５】Grunfeld, C. Diabetic foot ulcers: etiology, treatment, and prevention. Adv. Intern. Med. , 37: 103-32 : 103-132,1992.
【非特許文献６】Reiber, G. E. , Lipsky, B. A. , and Gibbons, G. W. The burden of diabetic foot ulcers. Am. J. Surg., 176 : 5S-lOS, 1998.
【非特許文献７】Hennings, H. , Michael, D. , Cheng, C. , Steinert, P. , Holbrook, K.,and Yuspa, S. H. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell, 19 : 245-254, 1980.
【非特許文献８】Yuspa, S. H. , Kilkenny, A. E. , Steinert, P. M. , and Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J. Cell Biol., 109 : 1207-1217, 1989.
【非特許文献９】Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J. Cell Biol., 111 : 2807-2814, 1990.
【非特許文献１０】Yuspa, S. H. The pathogenesis of squamous cell cancer: lessons learned from studies of skin carcinogenesis--Thirty-third G. H. A. Clowes Memorial Award Lecture. Cancer Res., 54 : 1178-1189,1994.
【非特許文献１１】Hennings, H. and Holbrook, K. A. Calcium regulation of cell-cell contact and differentiation of epidermal cells in culture. An ultrastructural study. Exp. Cell Res., 143 : 127-142, 1983.
【非特許文献１２】Tennenbaum, T. , Li, L., Belanger, A. J. , De Luca, L. M. , and Yuspa, S. H. Selective changes in laminin adhesion and α6β4 integrin regulation are associated with the initial steps in keratinocyte maturation. Cell Growth Differ., 7: 615-628, 1996.
【非特許文献１３】Nishizuka, Y. The molecular heterogeneity of PKC and its implications for cellular regulation. Nature, 334 : 661-665, 1988.
【非特許文献１４】9. Nishizuka, Y. The family of protein kinase C for signal transduction. JAMA, 262: 1826-1833, 1989.
【非特許文献１５】10. Denning, M. F., Dlugosz, A. A. , Williams, E. K. , Szallasi, Z. , Blumberg, P. M. , and Yuspa, S. H. Specific protein kinase C isozymes mediate the induction of keratinocyte differentiation markers by calcium. Cell Growth Differ., 6 : 149-157, 1995.
【非特許文献１６】11. Dlugosz, A. A., Pettit, G. R. , and Yuspa, S. H. Involvement of Protein kinase C in Ca2+-mediated differentiation on cultured primary mouse keratinocytes. J. Invest. Dermatol., 94 : 519-519,1990. (Abstract)
【非特許文献１７】12. Dlugosz, A. A. and Yuspa, S. H. Coordinate changes in gene expression which mark the spinous to granular cell transition in epidermis are regulated by protein kinase C. J. Cell Biol., 120 : 217-225,1993.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明を実施に移す間、本発明者らは、インスリンを単独で創傷に投与すると、過度の血管新生、炎症、表皮細胞過形成や瘢痕化など有害な副作用を引き起こす可能性があることを明らかにした（以下の実施例の項中の実施例２３を参照）。さらに、本発明者らは、創傷領域に定着している細胞でＰＫＣの発現及び／又は活性を調節することができる１種又は複数種の作用物質とインスリンを組み合わせることによって創傷治癒プロセスを実質的に促進する間に、インスリンが誘導する副作用を有効に回避できることを明らかにした。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、創傷領域に有効量のインスリン、並びに／或いは創傷定着細胞でＰＫＣの発現及び／又は活性を調節しインスリンと相乗的に作用することができる他の作用物質を供給して創傷治癒のプロセスを促進することによって、効率よく、且つ有害な副作用を伴わずに創傷を治療する新規の方法及び組成物を提供する。
【００２４】
したがって、本発明の一態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、ＰＫＣ産生及び／又はＰＫＣ活性化を調節する治療有効量の作用物質を投与するステップを含む。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、ＰＫＣの産生及び／又は活性を調節する治療有効量の少なくとも１種の作用物質と、製剤上許容される担体とを含む。
【００２６】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、治療有効量のインスリン、及びインスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質を投与するステップを含む。
【００２７】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である治療有効量のインスリン及びインスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００２８】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、単回投与量の治療有効量のインスリンを投与し、それによって損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するステップを含む。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進することができるように選択された単回投与単位のインスリンと、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００３０】
本発明の他の態様によれば、古い皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、古い皮膚創傷に、単回投与量の治療有効量のインスリンを投与し、それによって古い皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するステップを含む。
【００３１】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、治療有効量のインスリン分泌細胞を移植するステップを含む。
【００３２】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分であるインスリン分泌細胞と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷の細胞を形質転換して、インスリンを産生し分泌するステップを含む。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、損傷した皮膚又は皮膚創傷の細胞を形質転換してインスリンを産生し分泌するように設計された核酸構築物と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００３５】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷の細胞を形質転換して、タンパク質キナーゼＣを産生するステップを含む。
【００３６】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、損傷した皮膚又は皮膚創傷の細胞を形質転換してタンパク質キナーゼＣを産生するように設計された核酸構築物と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００３７】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、治療有効量のＰＫＣ活性化物質を投与するステップを含む。
【００３８】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するための治療有効量のＰＫＣ活性化物質と、製剤上許容される担体とを含む。
【００３９】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷に、治療有効量のコポリマー１を投与するステップを含む。
【００４０】
本発明の他の態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である治療有効量のコポリマー１と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００４１】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である治療有効量のコポリマー１と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【００４２】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、損傷した皮膚又は皮膚創傷に定着している皮膚細胞において少なくとも１種のＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節するステップと、ＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節するステップを行いながら、ホルモン、増殖因子、アディポカイン、ＰＫＣδＲＡＣＫ、及びＧＷ９６６２からなる群から選択される治療有効量の少なくとも１種のさらなる作用物質を皮膚細胞に投与して、それによって、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するステップとを含む。
【００４３】
本発明のさらなる態様によれば、損傷した皮膚又は皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物が提供され、その薬剤組成物は、有効成分である、少なくとも１種のＰＫＣアイソフォームの発現又は活性化を調節する治療有効量の物質、及びホルモン、増殖因子、アディポカイン、ＰＫＣδＲＡＣＫ、及びＧＷ９６６２からなる群から選択される少なくとも１種のさらなる作用物質と、製剤上許容される担体とを含む。
【００４４】
下記に記載する本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、創傷は、潰瘍、糖尿病関連の創傷、熱傷、日焼け、加齢による皮膚創傷、角膜潰瘍化による創傷、炎症性消化管疾患による創傷、腸炎症性疾患による創傷、クローン病による創傷、潰瘍性大腸炎、痔核、表皮水疱症による創傷、皮膚水疱形成性創傷、乾癬による創傷、脂漏性皮膚炎による創傷、動物の皮膚の創傷、動物の糖尿病による創傷、網膜症による創傷、口腔の創傷（粘膜炎）、膣粘膜炎による創傷、歯周病による創傷、裂傷、外科的切除による創傷、及び外科的接着後の創傷からなる群から選択される。
【００４５】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、潰瘍は、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、胃潰瘍、及びＨＩＶ関連潰瘍である。
【００４６】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリンは組換え体である。
【００４７】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリンは天然の供給源に由来する。
【００４８】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、さらなる作用物質は、血小板由来増殖因子である。
【００４９】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、さらなる作用物質はＰＫＣ−α抑制物質である。
【００５０】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、投与は、単回塗布によって実施する。
【００５１】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、古い皮膚創傷は、少なくとも２日前のものである。
【００５２】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリンの濃度は、０．１μＭ〜１０μＭである。記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリンの投与単位は、薬剤組成物０．０１〜０．２ｍｌ中に０．００１〜５ｎＭである。
【００５３】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリンの投与量は、薬剤組成物０．０１〜０．２ｍｌ中に０．０１〜０．５ｎＭである。
【００５４】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、薬剤組成物は、水溶液剤、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、噴霧剤、懸濁液剤、粉末剤、分散液剤、膏薬及び軟膏剤からなる群から選択される。
【００５５】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、薬剤組成物は、固体支持体を含む。
【００５６】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞を形質転換して、インスリンを産生し分泌する。
【００５７】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞を組換えＰＤＸ１遺伝子で形質転換し、それによって細胞が天然のインスリンを産生し分泌する。
【００５８】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞の内因性インスリン遺伝子の上流に組み込むシス作用性エレメント配列で細胞を形質転換し、それによって細胞が天然のインスリンを産生し分泌する。
【００５９】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、分泌顆粒を形成することができる。
【００６０】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、内分泌細胞である。
【００６１】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、ヒト供給源に由来する。
【００６２】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、組織適合性をヒト化した動物供給源に由来する。
【００６３】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、ヒトインスリンを分泌する。
【００６４】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、インスリン分泌細胞は、自己の細胞である。
【００６５】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞は、線維芽細胞、上皮細胞及びケラチン生成細胞からなる群から選択される。
【００６６】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞を形質転換して、タンパク質キナーゼＣ転写活性化物質を産生し、それによって細胞が天然のタンパク質キナーゼＣを産生する。
【００６７】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞の内因性タンパク質キナーゼＣの上流に組み込むシス作用性エレメント配列で細胞を形質転換し、それによって細胞が天然のタンパク質キナーゼＣを産生する。
【００６８】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、組換えタンパク質キナーゼＣ遺伝子で細胞を形質転換し、それによって細胞が組換えタンパク質キナーゼＣを産生する。
【００６９】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、タンパク質キナーゼＣは、ＰＫＣ−β１、ＰＫＣ−β２、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−θ、ＰＫＣ−λ、及びＰＫＣ−ιからなる群から選択される。
【００７０】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、タンパク質キナーゼＣは、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−δ、ＰＫＣ−ε、ＰＫＣ−η、及びＰＫＣ−ζからなる群から選択される。
【００７１】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、コポリマー１は、局所塗布に適合された薬剤組成物中に含まれる。
【００７２】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、ＰＫＣアイソフォームは、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−δ、及びＰＫＣ−ζからなる群から選択される。
【００７３】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、ホルモンはインスリンである。
【００７４】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、増殖因子はＩＬ−６、ＫＦＧ及びＴＮＦαからなる群から選択される。
【００７５】
記載する好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、アディポカインは、アディプシン又はアディポネクチンである。
【００７６】
本発明は、損傷した皮膚又は皮膚創傷に対処する新たな治療を提供することによって、現在知られている構成の欠点の対処に成功するものである。
【００７７】
本発明は、本明細書で、添付の図面を参照して例示される。ここで詳細について図面を具体的に参照する際に、図示される特定の実施形態は例示であって、本発明の好ましい実施形態の例証的な議論の目的のみのためであり、本発明の原理及び概念上の態様の最も有用で容易に理解されると考えられているものを提供する目的で提示されることが強調される。この点に関して、本発明の基本的な理解のために必要であるよりもさらに詳しく本発明の構造上の詳細を示すための試みはなされず、これらの図面とともに本明細書を見ると、本発明のいくつかの形態が実用上いかにして具体化され得るかは、当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】組換えアデノウイルスベクターを利用するＰＫＣアイソフォームの効果的な過剰発現を実証する：左のパネル：４日齢の初代ケラチン生成細胞に、感染の４８時間後のβ−ｇａｌアデノウイルスを利用して１時間感染させ、細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼタンパク質の活性化を、未感染のケラチン生成細胞と比較して青色反応の誘導によって定量した。右のパネル：４日齢の初代ケラチン生成細胞に、組換えアイソフォーム特異的ＰＫＣアデノウイルスを利用して、１時間感染させた。２４時間後、感染した（Ａｄ）及び非感染対照（Ｃ）の培養のタンパク質をウェスタンブロット分析のために抽出し、サンプルを、上記の実施例の節において記載されるアイソフォーム特異的抗ＰＫＣ抗体を使用して分析した。
【図２】ブリオスタチン１によるＰＫＣ活性化が、過剰発現されたＰＫＣアイソフォームのトランスロケーションを誘導することを示す。４日齢初代ケラチノサイトに、アイソフォーム特異的組換えＰＫＣアデノウイルスを用いて１時間感染させた。感染の２４時間後、細胞を、未処理か（Ｃ）、又はブリオスタチン１で３０分間刺激したか（Ｂ）のいずれかを行い、分画した。タンパク質サンプルをウェスタンブロッティングに供し、アイソフォーム特異的抗ＰＫＣ抗体を使用して分析した。
【図３】過剰発現されたＰＫＣアイソフォームがそれらのネイティブ型で活性であることを示す。４日齢初代ケラチノサイトを、アイソフォーム特異的組換えＰＫＣアデノウイルスで１時間感染させた。注射の１８時間後、未感染対照細胞（Ｃ）及びＰＫＣアイソフォーム過剰発現細胞（ＯＥ）からの細胞溶解物を、アイソフォーム特異的抗ＰＫＣ抗体を使用して免疫沈殿させた。免疫沈殿物を、上記の実施例の節において記載されるようなＰＫＣ活性アッセイに供した。
【図４】特異的ＰＫＣアイソフォームの過剰発現が初代ケラチン生成細胞における独特な形態学的変化を誘導することを実証する。初代ケラチノサイトは、未処理のままであるか（Ｃ）、又は組換えＰＫＣα、δ、若しくはζのアデノウイルスで感染されたかのいずれかであった。２４時間後、培養物を明視野顕微鏡によって観察し、写真撮影した（×２０）。
【図５】感染した初代ケラチン生成細胞における過剰発現されたＰＫＣアイソフォームの独特な局在を示す。初代ケラチン生成細胞を、ラミニン５−コートされたガラススライド上にプレートした。培養物は、未処理のままであるか、又は異なる組換えＰＫＣアデノウイルスで感染されたかのいずれかであった。感染の２４時間後、細胞を固定し、洗浄し、風乾した。培養物は、アイソフォーム特異的抗ＰＫＣ抗体、続いてＦＩＴＣ結合体化二次抗体を使用して、免疫蛍光によって分析された。細胞を、共焦点顕微鏡によってスキャンし、代表的な視野を写真撮影した。
【図６】ＰＫＣアイソフォームが、α６β４インテグリン発現を特異的に調節することを実証する。５日齢初代マウス皮膚ケラチン生成細胞は、未処理であるか、又は、ＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζの組換えアデノウイルスで感染された。感染の４８時間後、膜細胞画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供し、ニトロセルロールフィルターに転写し、抗α６及び抗β４抗体でイムノブロットを行い、ＥＣＬによって分析した。
【図７】ＰＫＣη及びＰＫＣδの過剰発現が、ケラチン生成細胞増殖を誘導することを示す。５日齢初代マウス皮膚ケラチン生成細胞は、未処理であるか、又は、ＰＫＣδ、ＰＫＣα、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζの組換えアデノウイルスで感染された。感染の４８時間後、細胞増殖を、実験手順において記載されているように、１時間の３Ｈ−チミジン取り込みによって分析した。結果は、β−ガラクトシダーゼ感染ケラチン生成細胞と比較した、ｃｐｍ／ディッシュとして表される。値は、３回の別々の実験における３連の測定の平均±標準偏差として表される。
【図８】ＰＫＣアイソフォームの過剰発現が、α６β４インテグリンの半接着斑局在をもたらすことを実証する。初代ケラチン生成細胞は、ラミニン５コートされたガラススライド上にプレートされ、ケラチノサイト培養は、４８時間の間、低Ｃａ２＋ＭＥＭ中で維持された。この時間の後で、培養物は未処理のままであるか（Ａ）、又はＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζの組換えアデノウイルス（それぞれ、Ｂ−Ｅ）で感染される。感染の２４時間後、実験手順において記載されているように、ケラチン生成細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、続いて、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で穏やかに抽出し、ＰＢＳ中で洗浄し、風乾した。培養物を、実験手順において記載されているように、アイソフォーム特異的抗α６抗体、続いてＦＩＴＣ結合体化二次抗体を利用する免疫蛍光分析に供した。
【図９Ａ】過剰発現されたＰＫＣδ及びＰＫＣζがケラチン生成細胞脱着をインビトロで誘導することを示す。（Ａ）初代ケラチン生成細胞は、未処理であるか（Ｃ）、又は組換えＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζのアデノウイルスで感染される。細胞接着を、感染の２４時間後及び４８時間後に、細胞を持ち上げること、及びそれらをマトリックスコートされたディッシュ上に再プレートすることによって分析した。細胞の計数は、接着細胞のタンパク質濃度（ｍｇ／ディッシュ）として提示される。（Ｂ）初代ケラチン生成細胞は、未処理であるか（Ｃ）、又は組換えのＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζのアデノウイルスで感染されるかのいずれかであった。細胞脱着を、感染の２４時間後に、培養培地中で脱着した浮遊している細胞を収集することによって分析した。細胞の計数は、脱着細胞のタンパク質濃度（ｍｇ／ディッシュ）として提示される。
【図９Ｂ】過剰発現されたＰＫＣδ及びＰＫＣζがケラチン生成細胞脱着をインビトロで誘導することを示す。（Ａ）初代ケラチン生成細胞は、未処理であるか（Ｃ）、又は組換えＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζのアデノウイルスで感染される。細胞接着を、感染の２４時間後及び４８時間後に、細胞を持ち上げること、及びそれらをマトリックスコートされたディッシュ上に再プレートすることによって分析した。細胞の計数は、接着細胞のタンパク質濃度（ｍｇ／ディッシュ）として提示される。（Ｂ）初代ケラチン生成細胞は、未処理であるか（Ｃ）、又は組換えのＰＫＣα、ＰＫＣδ、ＰＫＣη、若しくはＰＫＣζのアデノウイルスで感染されるかのいずれかであった。細胞脱着を、感染の２４時間後に、培養培地中で脱着した浮遊している細胞を収集することによって分析した。細胞の計数は、脱着細胞のタンパク質濃度（ｍｇ／ディッシュ）として提示される。
【図１０】ＰＫＣηが活発に増殖しているケラチン生成細胞中で発現されることを実証する。初代ケラチン生成細胞はラミニン５−コートしたガラススライド上にプレートした。プレーティングの４８時間後、ケラチン生成細胞をＢｒｄＵ溶液と１時間インキュベートし、続いて、上記の実施例の節において記載されるように、抗ＰＫＣη（赤色）抗体及び抗ＢｒｄＵ（緑色）抗体を使用する免疫蛍光分析を行った。細胞を共焦点顕微鏡によってスキャンし、代表的な視野を写真撮影した。
【図１１】ＰＫＣηがケラチン生成細胞増殖を誘導するが、ＰＫＣη変異体はそれを減少することを実証する。初代皮膚ケラチン生成細胞に、組換えのＰＫＣηアデノウイルス又はＰＫＣηの顕性不活性変異体（ＤＮＰＫＣη又はＰＫＣ ＤＮη）アデノウイルスで１時間感染させた。感染の４８時間後、細胞増殖を、上記の実施例の節において記載される１時間の３Ｈ−チミジン取り込みによって分析した。結果を、ｃｐｍ／ディッシュとして提示する。対照は非感染細胞である。
【図１２Ａ】ＰＫＣη及びＤＮＰＫＣηの過剰発現が、ＰＫＣ局在化及び細胞形態を特異的に調節することを実証する。一次皮膚ケラチン生成細胞に、組換えＰＫＣηアデノウイルス又は顕性不活性変異体ＰＫＣη（ＰＫＣ ＤＮη）アデノウイルスを１時間感染させた。感染の４８時間後、ケラチン生成細胞を固定し、（Ａ）明視野写真撮影（×２０）及び（Ｂ）実験手順において記載されるような、ＰＫＣη特異的抗体、続いてＦＩＴＣ結合体化二次抗体を利用する免疫蛍光分析に供する。対照は非感染細胞である。
【図１２Ｂ】ＰＫＣη及びＤＮＰＫＣηの過剰発現が、ＰＫＣ局在化及び細胞形態を特異的に調節することを実証する。一次皮膚ケラチン生成細胞に、組換えＰＫＣηアデノウイルス又は顕性不活性変異体ＰＫＣη（ＰＫＣ ＤＮη）アデノウイルスを１時間感染させた。感染の４８時間後、ケラチン生成細胞を固定し、（Ａ）明視野写真撮影（×２０）及び（Ｂ）実験手順において記載されるような、ＰＫＣη特異的抗体、続いてＦＩＴＣ結合体化二次抗体を利用する免疫蛍光分析に供する。対照は非感染細胞である。
【図１３Ａ】ＰＫＣη発現の阻害が、増殖しているケラチン生成細胞におけるケラチン生成細胞分化を誘導することを示す。初代皮膚ケラチン生成細胞を低Ｃａ２＋培地中で増殖状態に維持するか、又は０．１２ｍＭ Ｃａ２＋中で２４時間分化させるかのいずれかであった。その後、ケラチン生成細胞に、組換えＰＫＣηアデノウイルス又はＰＫＣηの顕性不活性変異体（ＰＫＣ ＤＮη）アデノウイルスで１時間感染させた。感染の２４時間後、ケラチン生成細胞を、低Ｃａ２＋培地中で維持するか、又は０．１２ｍＭ Ｃａ２＋を含む分化培地に２４時間移すかのいずれかであった。感染の２４時間後、ケラチン生成細胞を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供した。ＰＫＣη（Ａ）及びケラチン１（Ｂ）の発現を、ウェスタンブロッティングによって分析した。
【図１３Ｂ】ＰＫＣη発現の阻害が、増殖しているケラチン生成細胞におけるケラチン生成細胞分化を誘導することを示す。初代皮膚ケラチン生成細胞を低Ｃａ２＋培地中で増殖状態に維持するか、又は０．１２ｍＭ Ｃａ２＋中で２４時間分化させるかのいずれかであった。その後、ケラチン生成細胞に、組換えＰＫＣηアデノウイルス又はＰＫＣηの顕性不活性変異体（ＰＫＣ ＤＮη）アデノウイルスで１時間感染させた。感染の２４時間後、ケラチン生成細胞を、低Ｃａ２＋培地中で維持するか、又は０．１２ｍＭ Ｃａ２＋を含む分化培地に２４時間移すかのいずれかであった。感染の２４時間後、ケラチン生成細胞を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供した。ＰＫＣη（Ａ）及びケラチン１（Ｂ）の発現を、ウェスタンブロッティングによって分析した。
【図１４】ＰＫＣηの局所的インビボ発現が顆粒組織の形成を増強し、且つマウス切開性創傷における創傷治癒を加速することを実証する。全体の皮膚の７ｍｍの切開をヌードマウスの背に作製した。対照β−ｇａｌ、ＰＫＣη、及びＰＫＣαのアデノウイルス懸濁液の局所塗布を、創傷の１日後及び４日後に行った。全体の皮膚の創傷を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、皮膚切片をＨ＆Ｅ染色及び明視野顕微鏡によって組織学的に分析した。Ｅ−表皮、Ｄ−真皮。
【図１５】インスリンが、増殖しているケラチン生成細胞中でＰＫＣδのトランスロケーションを特異的に誘導するが、ＩＧＦ１は誘導しないことを実証する。初代ケラチン生成細胞は、上記の実施例の節において記載されるように、単離及びプレートされた。増殖しているケラチン生成細胞は、それらが８０％コンフルエンシーに達するまで、低Ｃａ２＋培地（０．０５ｍＭ）中で５日間維持された。細胞を、１０−７Ｍインスリン（Ｉｎｓ）又は１０−８Ｍ ＩＧＦ１（ＩＧＦ）で１５分間刺激した。記載されるように、細胞を溶解し、刺激された細胞及び対照の未刺激（Ｃｏｎｔ）細胞の２０μｇの膜又は細胞質ゾル抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び転写に供した。ブロットを、各ＰＫＣアイソフォームに対する特異的ポリクローナル抗体でプローブした。
【図１６】インスリンがＰＫＣδ活性を誘導するが、ＩＧＦ１は誘導しないことを示す。ＰＫＣδ活性を決定するために、５日間のケラチン生成細胞培養を、１０−７Ｍインスリン（Ｉｎｓ）又は１０−８Ｍ ＩＧＦ１（ＩＧＦ）で所定の時間（１、１５、又は３０分間）刺激した。ＰＫＣδを、特異的抗ＰＫＣδ抗体を使用して、膜画分（青色バー、ｍｅｍ）及び細胞質ゾル画分（紫色バー、ｃｙｔｏ）から免疫沈殿した。ＰＫＣδ免疫沈殿物を、実験手順において記載されるように、インビトロキナーゼアッセイを利用するＰＫＣについて分析した。各バーは、３つの別々の実験における３回の測定の平均±ＳＥを表す。値はｐｍｏｌ ＡＴＰ／ディッシュ／分として表される。
【図１７Ａ】インスリン及びＩＧＦ１がケラチン生成細胞増殖に対する相加的な効果を有することを示す。増殖しているケラチン生成細胞を、これらが８０％コンフルエンスに達するまで、低Ｃａ２＋培地（０．０５ｍＭ）中で５日間維持した。（Ａ）５日間のケラチン生成細胞培養を、所定濃度でのインスリン又はＩＧＦ１で２４時間刺激した。（Ｂ）並行して、ケラチン生成細胞を、１０−７Ｍインスリン（Ｉｎｓ）及び増加用量のＩＧＦ１（ＩＧＦ）で刺激した。各濃度において、右のカラム（縞模様のバー）は、両方のホルモンが一緒に加えられたときに観察される増殖を表す。左のバーは、１０−７Ｍインスリン（赤いバー）及び増加濃度のＩＧＦ１（灰色のバー）の別々の効果を実証する。チミジン取り込みは、実験手順に記載されているように測定した。示される結果は６回の実験を表す。各バーは、対照の未刺激ケラチン生成細胞の上のパーセントとして表される、３回の測定の平均±ＳＥを表す。
【図１７Ｂ】インスリン及びＩＧＦ１がケラチン生成細胞増殖に対する相加的な効果を有することを示す。増殖しているケラチン生成細胞を、これらが８０％コンフルエンスに達するまで、低Ｃａ２＋培地（０．０５ｍＭ）中で５日間維持した。（Ａ）５日間のケラチン生成細胞培養を、所定濃度でのインスリン又はＩＧＦ１で２４時間刺激した。（Ｂ）並行して、ケラチン生成細胞を、１０−７Ｍインスリン（Ｉｎｓ）及び増加用量のＩＧＦ１（ＩＧＦ）で刺激した。各濃度において、右のカラム（縞模様のバー）は、両方のホルモンが一緒に加えられたときに観察される増殖を表す。左のバーは、１０−７Ｍインスリン（赤いバー）及び増加濃度のＩＧＦ１（灰色のバー）の別々の効果を実証する。チミジン取り込みは、実験手順に記載されているように測定した。示される結果は６回の実験を表す。各バーは、対照の未刺激ケラチン生成細胞の上のパーセントとして表される、３回の測定の平均±ＳＥを表す。
【図１８Ａ】組換えＰＫＣアデノウイルス構築物の過剰発現を実証する。ケラチン生成細胞培養物を、野生型ＰＫＣδ（ＷＴＰＫＣδ）、野生型ＰＫＣα（ＷＴＰＫＣα）、又は顕性不活性ＰＫＣδ変異体（ＤＮＰＫＣδ）を含む組換えアデノウイルス構築物を利用して感染させた。（Ａ）感染後、細胞を２４時間培養し、収集し、２０μｇのタンパク質抽出物を、特異的抗ＰＫＣα抗体又は抗ＰＫＣδ抗体を使用して、ウェスタンブロッティングによって分析した。提示されるブロットは、５回の別々の実験を表す。（Ｂ）感染の２４時間後、細胞を収集し、ＰＫＣα又はＰＫＣδの免疫沈殿物を、インビトロキナーゼアッセイによって評価した。
【図１８Ｂ】組換えＰＫＣアデノウイルス構築物の過剰発現を実証する。ケラチン生成細胞培養物を、野生型ＰＫＣδ（ＷＴＰＫＣδ）、野生型ＰＫＣα（ＷＴＰＫＣα）、又は顕性不活性ＰＫＣδ変異体（ＤＮＰＫＣδ）を含む組換えアデノウイルス構築物を利用して感染させた。（Ａ）感染後、細胞を２４時間培養し、収集し、２０μｇのタンパク質抽出物を、特異的抗ＰＫＣα抗体又は抗ＰＫＣδ抗体を使用して、ウェスタンブロッティングによって分析した。提示されるブロットは、５回の別々の実験を表す。（Ｂ）感染の２４時間後、細胞を収集し、ＰＫＣα又はＰＫＣδの免疫沈殿物を、インビトロキナーゼアッセイによって評価した。
【図１９】インスリン又はＩＧＦ１で誘導される増殖に対するＰＫＣ過剰発現の効果を示す。非感染（明るい青いバー）、又はＷＴＰＫＣδを過剰発現する細胞（暗い青いバー）若しくはＤＮＰＫＣδを過剰発現する細胞（斜線をつけた青いバー）を、１０−７Ｍインスリン（Ｉｎｓ）、１０−８Ｍ ＩＧＦ１（ＩＧＦ）、又は両方（Ｉｎｓ＋ＩＧＦ）で２４時間処理した。チミジン取り込みを、実験手順に記載されるように測定した。各バーは、別々の培地に対して行った３つの実験における３回の測定の平均±ＳＥを表す。値は、各実験における同じ培養物からの、対照の未刺激細胞のパーセントとして表される。
【図２０】ＰＫＣδ活性の阻害が、インスリン誘導性のケラチン生成細胞増殖を特異的に無効にすることを示す。初代ケラチン生成細胞を、上記の実施例の節において記載されるように培養した。非感染細胞又はＤＮＰＫＣδで感染したケラチン生成細胞を、以下の増殖因子濃度で２４時間刺激した：１０−７Ｍ インスリン（Ｉｎｓ）、１０−８Ｍ ＩＧＦ１（ＩＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ、１ｎｇ／ｍｌ ＫＧＦ、又は５ｎｇ／ｍｌ ＥＣＧＦ。チミジン取り込みを、上記の実施例の節において記載されるように測定した。各バーは、別々の培地に対して行った３つの実験における３回の測定の平均±ＳＥを表す。値は、各実験における同じ培養物からの、対照の未刺激細胞のパーセントとして表される。
【図２１】ＰＫＣδの過剰発現がインスリン誘導性のケラチン生成細胞増殖を特異的に媒介することを示す。初代ケラチン生成細胞を図１の下に記載されるように培養した。非感染細胞又は過剰発現ＷＴＰＫＣδで感染されたケラチン生成細胞を、以下の増殖因子濃度で２４時間刺激した：１０−７Ｍ インスリン（Ｉｎｓ）、１０−８Ｍ ＩＧＦ１（ＩＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ、１ｎｇ／ｍｌ ＫＧＦ、又は５ｎｇ／ｍｌ ＥＣＧＦ。チミジン取り込みを、上記の実施例の節において記載されるように測定した。各バーは、別々の培地に対して行った３つの実験における３回の測定の平均±ＳＥを表す。値は、各実験における同じ培養物からの、対照の未刺激細胞のパーセントとして表される。
【図２２Ａ】インビボでの皮膚の創傷治癒プロセスにおけるＰＫＣδ及びＰＫＣζの有意さを実証する。新規に開発された、アイソフォーム特異的な無ＰＫＣマウス、無ＰＫＣαマウス、無ＰＫＣδマウス、及び無ＰＫＣζマウス、並びにそれらの野生型同腹仔のインビボマウスモデルを利用することが、創傷治癒の研究に供された。マウスは麻酔され、直径４ｍｍのパンチ生検を通した皮膚がマウスの背に作製された。１週間の追跡後、マウスの皮膚を取り出し、皮膚の創傷治癒を、破裂チャンバー技術を利用する創傷強度試験に皮膚弁を供することによって定量した。値は、破裂が起こるまでモニターされるチャンバー内の最大圧力を表す破裂圧力として表される。結果は、１２〜２０匹のマウスの別個の群において得られる測定を表す。実験を少なくとも３回繰り返した。
【図２２Ｂ】インビボでの皮膚の創傷治癒プロセスにおけるＰＫＣδ及びＰＫＣζの有意さを実証する。新規に開発された、アイソフォーム特異的な無ＰＫＣマウス、無ＰＫＣαマウス、無ＰＫＣδマウス、及び無ＰＫＣζマウス、並びにそれらの野生型同腹仔のインビボマウスモデルを利用することが、創傷治癒の研究に供された。マウスは麻酔され、直径４ｍｍのパンチ生検を通した皮膚がマウスの背に作製された。１週間の追跡後、マウスの皮膚を取り出し、皮膚の創傷治癒を、破裂チャンバー技術を利用する創傷強度試験に皮膚弁を供することによって定量した。値は、破裂が起こるまでモニターされるチャンバー内の最大圧力を表す破裂圧力として表される。結果は、１２〜２０匹のマウスの別個の群において得られる測定を表す。実験を少なくとも３回繰り返した。
【図２３】初代皮膚ケラチン生成細胞におけるＳＴＡＴ３とＰＫＣδの間の特異的相互作用を同定する。初代ケラチン生成細胞は、未処理であるか（上のパネル）、又はアイソフォーム特異的な、組換えＰＫＣアデノウイルスで１時間感染されたか（下のパネル）のいずれかであった。細胞を抽出し、アイソフォーム特異的ＰＫＣ抗体で免疫沈殿（ＩＰ）させた。この免疫沈殿物を、抗ＰＫＣ又は抗ＳＴＡＴ３抗体を使用するウェスタンブロット分析に供した。
【図２４】インスリン誘導性のＳＴＡＴ３の転写活性化に対するＰＫＣδ活性化の重要性を実証する。初代ケラチン生成細胞をガラススライド上に配置し、それらが８０％コンフルエントに達するまで、低Ｃａ＋＋培地（０．０５ｍｍｏｌ／ｌ）中で５日間維持した。細胞は未処理であるか（Ｃｏｎｔ、上のパネル）又は５μＭロットレリンで７分間前処理し（Ｒ、下のパネル）、続いて１０−７Ｍインスリンで５分間処理した（Ｉｎｓ）。細胞をメタノールで固定し、洗浄し、風乾した。培養物を、抗ホスホ−Ｔｙｒ−７０５−ＳＴＡＴ３抗体、続いてＦＩＴＣ結合体化二次抗体を使用する免疫蛍光によって分析した。細胞を共焦点顕微鏡によってスキャンした。
【図２５】ＤＮ ＰＫＣδの過剰発現が、ＰＫＣδ及びＳＴＡＴ３の過剰発現によって誘導されたケラチン生成細胞増殖を阻害することを実証する。初代ケラチン生成細胞を、β−Ｇａｌ（対照のため）、ＰＫＣδ、ＷＴ ＳＴＡＴ３、ＤＮ ＳＴＡＴ３、又はＤＮ ＰＫＣδ、続いてＳＴＡＴ３での二重感染を含む組換えアデノウイルス構築物で１時間感染させた。感染の２４時間後、細胞増殖を、１時間の３Ｈ−チミジン取り込みによって分析した。結果はＤＰＭ／ｍｇタンパク質として提示される。各バーは、同じ培養からのプレート中での３回の測定の平均を表す。
【図２６】インビボでの創傷治癒に対するインスリン濃度及び塗布の頻度の重要性を実証する。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、ＰＢＳ（対照）を用いて、又は異なる濃度及び頻度のインスリン塗布（すなわち、１日に７回の反復塗布対単回塗布）を用いて処置した。マウスを創傷形成の７日後に屠殺し、処置した創傷の面積を測定した。結果を、ｍｍ２創傷面積として提示し、各バーは６回の複製の平均±標準偏差を表す（ｐ＜０．００５）。
【図２７】インビボでの創傷治癒に対するインスリン濃度及び塗布の頻度の組織学的効果を実証する。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、異なる濃度及び頻度のインスリン塗布（すなわち、１日に７回の反復塗布対単回塗布）を用いて処置した。組織学的創傷切片を、創傷形成の７日後に実行し、表皮及び真皮の閉鎖（創傷収縮）について分析した。表皮閉鎖はケラチン１４（Ｋ１４）抗体染色によって評価し（左のパネル）、創傷が全体のギャップを横切ってポジティブに染色された場合にポジティブと見なした。真皮閉鎖は、両方の真皮の創傷の側が×１００倍率の単一の視野において光学顕微鏡下で観察可能であった場合にポジティブと見なした（右のパネル）。結果を、対照に対する創傷閉鎖のパーセントとして提示し、各バーは６回の複製の平均を表す。
【図２８】インビボでの創傷治癒に対する、インスリン及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を組み合わせることの相乗作用を実証する。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、インスリン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、又はインスリン及びＰＤＧＦ−ＢＢの組み合わせの単回塗布を用いて処置した。処置したマウスを創傷形成の７日後に屠殺し、表皮及び真皮の閉鎖（創傷収縮）の組織学的分析のために生検を採取した。表皮閉鎖はケラチン１４（Ｋ１４）抗体染色によって評価し（左のパネル）、創傷が全体のギャップを横切ってポジティブに染色された場合にポジティブと見なした。真皮閉鎖は、両方の真皮の創傷の側が×１００倍率の単一の視野において光学顕微鏡下で観察可能であった場合にポジティブと見なした（右のパネル）。結果を、対照に対する創傷閉鎖のパーセントとして棒グラフ中に要約されたように提示し、各バーは６回の複製の平均を表す。
【図２９】インビボでの創傷治癒に対する、インスリン及びＰＫＣα阻害剤を組み合わせることの形態学的効果を例証する写真である。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、処置しないか（対照）、又はＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）と組み合わせたインスリン（ＨＯ／０１）を用いて処置したかのいずれかであった。形態学的観察のために、皮膚生検を創傷形成の７日後に取り出した。図２９Ａ〜Ｂは対照創傷を示すのに対し、図２９Ｃ−Ｄは処置した創傷を示す。
【図３０】真皮閉鎖（創傷収縮）に対するインスリン及びＰＫＣα阻害剤の組み合わせ効果を例証する組織顕微鏡写真である。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、処置しないか（対照）、又はＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）と組み合わせたインスリン（ＨＯ／０１）を用いて毎日処置したかのいずれかであった。処置したマウスを創傷形成の７日後に屠殺した。組織学的創傷切片を実行し、光学顕微鏡下で観察した。真皮閉鎖は、両方の真皮の創傷の側が×１００倍率の単一の視野において観察可能であった場合にポジティブと見なした。未処置対照切片における開いた創傷の領域（左のパネル）は大きすぎて×１００倍率の単一の視野に含まれなかったのに対して、処置した創傷切片（右のパネル）はポジティブな真皮閉鎖を示す。黄色の斑点状の線は真皮の端の印である。
【図３１】表皮閉鎖に対する、インスリン及びＰＫＣαの組み合わせ効果を例証する組織顕微鏡像である。創傷切開を、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬマウスの背で実行し、処置しないか、又はＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）と組み合わせたインスリン（ＨＯ／０１）を用いて毎日処置したかのいずれかであった。処置したマウスを創傷形成の７日後に屠殺した。組織学的創傷切片を実行し、ケラチン１４（基底ケラチン生成細胞の指標）で染色し、光学顕微鏡下で観察した。未処置対照切片（左のパネル）における開いた創傷の領域（矢印で示す）は大きすぎて×１００倍率の単一の視野に含まれなかったのに対して、処置した創傷切片（右のパネル）は全体の創傷ギャップを通して表皮閉鎖を示す。
【図３２】表皮細胞の空間的分化に対する、インスリン及びＰＫＣα阻害剤の組み合わせ効果を例証する組織顕微鏡像である。創傷を有するマウス（Ｃ５７ＢＬ、８〜１０週齢）を、ＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）と組み合わせたインスリン（ＨＯ／０１）の局所的塗布を用いて毎日処置した。処置したマウスを創傷形成の７日後に屠殺した。組織学的創傷切片を実行し、空間的細胞分化の初期段階を強調するケラチン１（Ｋ１）抗体で染色した。未処置対照切片（左のパネル）は巨大な未分化創傷領域（矢印で示す）を示すのに対して、処置した創傷切片（右のパネル）においては大規模な表皮再構築が観察可能である。
【図３３】インビボでの創傷治癒に対する、ＰＫＣα阻害剤と組み合わせたインスリンの定量的効果を実証する。創傷を有するマウス（Ｃ５７ＢＬ、８〜１０週齢）を、ＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）と組み合わせたインスリン（ＨＯ／０１）の局所的塗布を用いて毎日処置した。処置したマウスを創傷形成の７日後に屠殺した。組織学的創傷切片を実行し、上記の図３０〜３２に記載されるのと同様に、真皮収縮、表皮閉鎖、及び空間的分化について分析した。棒グラフは、各処置群中の組織学的分析によって決定されるような、完全に治癒した創傷の発生（パーセンテージ）を示す。
【図３４】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、ＰＫＣαの発現及び／若しくは活性を阻害すること、並びに真皮細胞における別のＰＫＣアイソフォームの発現及び／若しくは活性を調節すること、又は真皮細胞にホルモンを投与することの組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚線維芽細胞を、顕性不活性（ＤＮ）キナーゼ不活性ＰＫＣαで感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３４Ａ）、又は野生型（ＷＴ）ＰＫＣδ（図３４Ｂ）、ＰＫＣη（図３４Ｃ）、ＷＴ ＰＫＣζ（図３４Ｄ）、若しくはＷＴ ＰＫＣε（図３４Ｅ）で感染させたかのいずれかであった。代替的には、ＰＫＣα阻害された培養物は、アディプシン（２μｇ／ｍｌ；図３４Ｆ）又はインスリン（６．７×１０−７Ｍ；図３４Ｇ）で処置した。写真撮影を、処置の２４時間後に行った。
【図３５】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、ＰＫＣαの発現及び／若しくは活性を阻害すること、並びに真皮細胞における別のＰＫＣアイソフォームの発現及び／若しくは活性を調節すること、又は真皮細胞への増殖因子の投与の組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚ケラチン生成細胞を、顕性不活性（ＤＮ）キナーゼ不活性ＰＫＣαで感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３５Ａ）、又は野生型（ＷＴ）ＰＫＣε（図３５Ｄ）、ＷＴ ＰＫＣζ（図３５Ｅ）、若しくはＷＴ ＰＫＣη（図３５Ｆ）で感染させたかのいずれかであった。代替的には、ＰＫＣα阻害された培養物は、ＩＬ−６（１μｇ／ディッシュ；図３５Ｂ）、ＫＧＦ（１μｇ／ディッシュ；図３５Ｃ）、ＰＫＣδ ＲＡＣＫ（１０−７Ｍ；図３５Ｈ）、又はＴＮＦα（１２μｇ／ｍｌ；図３５Ｇ）で処置した。写真撮影を、処置の２４時間後に行った。
【図３６】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、真皮細胞中のＰＫＣζの発現及び／又は活性を阻害すること、並びに真皮細胞に増殖因子を投与することの組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚線維芽細胞を、顕性不活性（ＤＮ）キナーゼ不活性型のＰＫＣζ（ＤＮζ）で感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３６Ａ）、又はＫＧＦ（１μｇ／ディッシュ；図３６Ｂ）で処置したかのいずれかであった。写真撮影を、処置の２４時間後に行った。
【図３７】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、真皮細胞におけるＰＫＣζの発現及び／又は活性を阻害すること、並びに真皮細胞に増殖因子又はホルモンを投与することの組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚ケラチン生成細胞を、顕性不活性（ＤＮ）キナーゼ不活性型のＰＫＣζ（ＤＮζ）で感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３７Ａ）、又はＩＬ−６（１μｇ／ディッシュ；図３７Ｂ）、ＴＮＦα（１２μｇ／ｍｌ；図３７Ｃ）、若しくはアディポネクチン（１μｇ／ディッシュ；図３７Ｄ）で処置したかのいずれかであった。写真撮影を、処置の２４時間後に行った。
【図３８】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、真皮細胞におけるＰＫＣβの発現及び／又は活性を阻害すること、並びに真皮細胞に増殖因子、インスリン、又はＧＷ９６６２を投与することの組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚線維芽細胞を、顕性不活性（ＤＮ）キナーゼ不活性型のＰＫＣβ（ＤＮβ）で感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３８Ａ）、又はＫＦＧ（１μｇ／ディッシュ；図３８Ｂ）ＩＬ−６（１μｇ／ディッシュ；図３８Ｃ）、インスリン（６．７×１０−７Ｍ；図３８Ｄ）、又はＧＷ９６６２（１μｇ／ディッシュ；図３８Ｅ）で処置したかのいずれかであった。写真撮影を、処置の２４時間後に行った。
【図３９】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、ＰＫＣδの発現及び／又は活性を促進すること、並びに真皮細胞における別のＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節すること、又は真皮細胞にホルモンを投与することの組み合わせ効果を例証する写真である。培養した初代皮膚ケラチン生成細胞を、ＰＫＣδ（ＤＮδ）の野生型（ＷＴ）のキナーゼ型で感染させた。２４時間後、擦過傷を実行し、培養物を、未処置のままであるか（図３９Ａ）、又はＷＴ ＰＫＣζ（ＰＫＣζ；図３９Ｂ）、ＷＴ ＰＫＣε（ＰＫＣε；図３９Ｃ）、又はＤＮ ＰＫＣα（ＰＫＣα、図３０Ｄ）で処置したかのいずれかであった。代替的には、ＰＫＣδ促進された培養物は、アディプシン（２μｇ／ｍｌ；図３９Ｅ）で処置した。写真撮影を、処置の４８時間後に行った。
【図４０】インビトロでの皮膚創傷の閉鎖に対する、コポリマー１、インスリン、ＰＫＣα偽基質、又はこれらの組み合わせを投与することの効果を例証する写真である。培養した初代皮膚ケラチン生成細胞を、未処置のままであるか（図４０Ａ）、又はインスリンのみ（６．７×１０−７Ｍ；図４０Ｂ）、コポリマー１のみ（５５μｇ／ディッシュ；図４０Ｃ）、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ６．７×１０−７Ｍ及び１０７Ｍ；図４０Ｄ）、コポリマー１及びインスリンの混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ及び６．７×１０−７Ｍ；図４０Ｅ）、若しくはコポリマー１、インスリン、及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ、６．７×１０−７Ｍ、及び１０７Ｍ；図４０Ｆ）で処置したかのいずれかであった。写真撮影を、処置の４８時間後に行った。
【図４１Ａ】インビボでの創傷の治癒に対する、コポリマー１、インスリン、ＰＫＣα偽基質、又はこれらの組み合わせの効果を例証する写真である。創傷を有するマウスを、未処置のままであるか（図４１Ａ）、又はコポリマー１（５５μｇ／ｍｌ；図４１Ｂ）、コポリマー１及びインスリンの混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ及び１μＭ；図４１Ｃ）、若しくはコポリマー１、インスリン、及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ５５μｇ／ｍｌ、１μＭ、及び１μＭ；図４１Ｄ）の局所的塗布を用いて４日間毎日処置した。写真撮影を、処置の４日後に行った。
【図４１Ｂ】インビボでの創傷の治癒に対する、コポリマー１、インスリン、ＰＫＣα偽基質、又はこれらの組み合わせの効果を例証する写真である。創傷を有するマウスを、未処置のままであるか（図４１Ａ）、又はコポリマー１（５５μｇ／ｍｌ；図４１Ｂ）、コポリマー１及びインスリンの混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ及び１μＭ；図４１Ｃ）、若しくはコポリマー１、インスリン、及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ５５μｇ／ｍｌ、１μＭ、及び１μＭ；図４１Ｄ）の局所的塗布を用いて４日間毎日処置した。写真撮影を、処置の４日後に行った。
【図４１Ｃ】インビボでの創傷の治癒に対する、コポリマー１、インスリン、ＰＫＣα偽基質、又はこれらの組み合わせの効果を例証する写真である。創傷を有するマウスを、未処置のままであるか（図４１Ａ）、又はコポリマー１（５５μｇ／ｍｌ；図４１Ｂ）、コポリマー１及びインスリンの混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ及び１μＭ；図４１Ｃ）、若しくはコポリマー１、インスリン、及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ５５μｇ／ｍｌ、１μＭ、及び１μＭ；図４１Ｄ）の局所的塗布を用いて４日間毎日処置した。写真撮影を、処置の４日後に行った。
【図４１Ｄ】インビボでの創傷の治癒に対する、コポリマー１、インスリン、ＰＫＣα偽基質、又はこれらの組み合わせの効果を例証する写真である。創傷を有するマウスを、未処置のままであるか（図４１Ａ）、又はコポリマー１（５５μｇ／ｍｌ；図４１Ｂ）、コポリマー１及びインスリンの混合物（それぞれ５５μｇ／ディッシュ及び１μＭ；図４１Ｃ）、若しくはコポリマー１、インスリン、及びＰＫＣα偽基質の混合物（それぞれ５５μｇ／ｍｌ、１μＭ、及び１μＭ；図４１Ｄ）の局所的塗布を用いて４日間毎日処置した。写真撮影を、処置の４日後に行った。
【図４２Ａ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｂ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｃ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｄ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｅ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｆ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｇ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４２Ｈ】創傷治癒プロセスに対する、創傷ギャップへの胸腺近接の効果を例証する組織顕微鏡像である。図４２Ａ〜Ｂは、×２００倍率における正常成体齧歯類胸腺を示す。図４２Ｃは、×４０に拡大された７日齢創傷で、胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察されることを示す（赤四角；図４２Ｄでは×２００拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。図４２Ｅ〜Ｆは、×４０拡大（図４２Ｅ）及び×２００拡大（図４２Ｆ）されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示し、胸腺は創傷ギャップの密接した近接で観察されず、再表皮形成、組織顆粒化、又は真皮収縮は観察されない。図４２Ｇは、×４０拡大されたＳＴＺ糖尿病マウスの９日齢創傷を示す。創傷を、インスリン及びＰＫＣα偽基質の混合物で処置した。胸腺が創傷ギャップの密接した近接で観察される（赤四角；図４２Ｈにおいて×２０拡大）。創傷は再表皮形成し、顆粒組織が形成し、真皮収縮が進行している。
【図４３】創傷及び損傷した皮膚の治癒に対する、ＰＫＣα阻害剤と組み合わせたインスリンの効果を例証する写真である。長軸方向の創傷切開を、Ｌａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅｓ ＆ Ｌａｎｄｒａｃｅ家畜用ブタの背に行い、ＰＢＳ（対照）又は１μＭ インスリン及び１μＭ ＰＫＣα偽基質（ＨＯ／０３／０３）の混合物のいずれかで、１５日間毎日処置した。創傷を、創傷形成の３０日後に写真撮影した。ＨＯ／０３／０３処置された創傷は、瘢痕形成を伴わずに完全に治癒し、緩衝液対照と比較して、顕著に改善された皮膚の美観を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本発明は、細胞増殖及び／又は細胞分化を誘導及び／又は促進するために、ＰＫＣとしても知られるセリン／スレオニンタンパク質キナーゼの発現及び／又は活性化を調節するように設計された方法及び薬剤組成物の発明であり、それによって創傷の治癒プロセスを促進する。本発明の教示に従って、例えば、（ｉ）ＰＫＣ発現構築物での創傷細胞の形質転換、（ｉｉ）創傷細胞の内因性ＰＫＣ遺伝子と隣接したその上流に挿入するシス作用性エレメントでの創傷細胞の形質転換、（ｉｉｉ）創傷細胞でＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節するインスリン、並びにインスリンと相乗的に作用する他の作用物質の投与、（ｉｖ）インスリン発現構築物から産生され、発現され分泌されるインスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、そのインスリン発現構築物での創傷細胞の形質転換、（ｖ）発現され分泌されるインスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、創傷細胞の内因性インスリン遺伝子と隣接したその上流に挿入するシス作用性エレメントでの創傷細胞の形質転換、（ｖｉ）創傷へのインスリン分泌細胞の移植、（ｖｉｉ）インスリンがＰＫＣ発現及び／又は活性化の上方制御因子として働くときの、内因性インスリンの産生及び分泌を誘導するトランス作用性因子、例えばＰＤＸ１での創傷細胞の形質転換、並びに（ｖｉｉｉ）創傷へのＰＫＣ調節因子の投与によって、そのような発現の調節を実施することができる。本発明に従った方法及び薬剤組成物の原理及び操作は、図面及び添付した説明を参照するとよりよく理解することができる。
【００８０】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、その適用において、下記の説明で示し、又は実施例の項で例示する構築の詳細、及び構成要素の配置に限らないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態も可能であり、或いは様々な形で実施又は実行することも可能である。また、本明細書で使用する語法及び専門用語が、説明を目的とするものであり、限定するものと見なすべきでないことも理解されたい。
【００８１】
成体の皮膚は、２つの層：角質化した層を成す表皮、並びに支持及び栄養をもたらす、底にある厚い層のコラーゲンに富む皮膚結合組織を含む。皮膚は、外界に対する保護障壁として働く。したがって、皮膚でのどんな損傷又は破損も、迅速に且つ効率よく修復しなければならない。上記の背景の項で記載したように、修復の第１段階は、最初の創傷を塞ぐ血餅の形成によって達成される。その後、炎症細胞、線維芽細胞及び毛細血管が血餅に侵入して、肉芽組織を形成する。続いての段階では、創傷の再上皮化がなされ、基底のケラチン生成細胞が半接着斑の接触を喪失しなければならず、ケラチン生成細胞がその肉芽組織の上に移動して創傷を覆う。ケラチン生成細胞の移動後、ケラチン生成細胞は増殖促進に入り、損傷の間に喪失した細胞の補充を可能にする。創傷がケラチン生成細胞の単層で覆われた後、層を成す新たな表皮が形成され、新たな基底膜が再構築される（２０〜２３）。ＥＧＦファミリーの増殖因子、ＫＧＦ、ＰＤＧＦ及びＴＧＦβ１を含めて、いくつかの増殖因子がこのプロセスに関与することが示されている（２２〜２４）。これらの増殖因子の中で、ＥＧＦとＫＧＦの両方が、表皮ケラチン生成細胞の増殖及び移動の制御に密接に関与すると考えられている（２５、２６）。創傷治癒の生物学の理解に対する基本は、創傷中の細胞の移動、増殖、及び創傷の間隙中の新たな基質の定着を誘発するシグナルの知識である。
【００８２】
以下の開示中で示す本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を下記に定義する。
【００８３】
「創傷」という用語は、様々な形（例えば、長い寝床での静止状態からの褥瘡、外傷、切傷、潰瘍、熱傷などで誘導される創傷）のいずれかで惹起される皮膚及び皮下組織に対する損傷を広く指し、様々な特徴を伴う。創傷は通常、創傷の深さに応じて４つの程度のうち１つに分類される：（ｉ）第１度：上皮に限局した創傷；（ｉｉ）第２度：真皮まで拡大した創傷；（ｉｉｉ）第３度：皮下組織まで拡大した創傷；及び（ｉｖ）第４度（又は全層創傷）：骨が露出した（例えば、大転子や仙骨などの骨の圧点）創傷。
【００８４】
「部分層創傷」という用語は、第１度〜第３度を包含する創傷を指す；部分層創傷の例には、熱傷創、褥瘡、静脈うっ血性潰瘍、及び糖尿病性潰瘍がある。
【００８５】
「深い創傷」とは、第３度と第４度の両方の創傷を含むことを意味する。
【００８６】
創傷に関して「治癒」という用語は、瘢痕形成によるように、創傷を修復するプロセスを指す。
【００８７】
「皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する」という語句は、創傷収縮の肉芽組織形成の誘導及び／又は上皮化の誘導（すなわち、上皮中の新たな細胞の発生）を指す。創傷治癒は、好都合なことに、創傷領域の減少によって測定される。
【００８８】
本発明は、深い創傷及び慢性創傷を含めて、創傷の型すべてを治療することを意図するものである。
【００８９】
「慢性創傷」という用語は、３０日以内に治癒しなかった創傷を指す。
【００９０】
「形質転換細胞」という語句は、外因性核酸の取り込みによる細胞の核酸の内容の一時的な又は永久的な変化を指し、それを細胞ゲノムに組み込み細胞を遺伝子改変する、又は組み込まれない状態のままにする。
【００９１】
「シス作用性エレメント」という用語は、本明細書において、ＤＮＡ結合タンパク質の結合部位（例えば、エンハンサー、オペレーター及びプロモーター）として使用し、それによって同じ染色体上の１つ又は複数の遺伝子の活性に影響を及ぼす遺伝子領域を示すのに使用する。
【００９２】
「トランス作用性因子」という語句は、本明細書において、シス作用性エレメントと結合し、それからの遺伝子発現に関してその活性を調節する因子を示すのに使用する。したがって、ＰＤＸ１は、インスリン遺伝子プロモーターと結合し、その活性を調節するトランス作用性因子である。
【００９３】
「転写活性化物質」という語句は、本明細書において、遺伝子発現を増大させる因子を示すのに使用する。トランス作用性因子は、直接的な転写活性化物質の一例である。
【００９４】
「活性化物質」という用語は、本明細書において、活性を促進する分子を示すのに使用する。
【００９５】
本明細書において「発現及び／又は活性化の調節」という語句は、発現及び／又は活性化の促進又は抑制を指す。
【００９６】
ＰＫＣは、ケラチン生成細胞の増殖及び分化を媒介する主要なシグナル伝達経路である。ＰＫＣアイソフォームα、δ、ε、η及びζが皮膚で発現している（４、１０）。本発明を考え出す間、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節すると、細胞増殖及び／又は細胞分化が誘導され、それによって創傷の治癒プロセスが促進される可能性があると仮定した。本発明を実施に移す間、この理論は、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節すると、実際に細胞増殖及び細胞分化が誘導され、創傷の治癒プロセスが促進されることを示す多数の実験によって認められた。本明細書で非常に詳細までさらに述べるように、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節して、それによって創傷の治癒プロセスを促進する様々な異なる手法に着手した。実験による知見に基づいて、他の手法を考え出した。本発明を実施に移す間に、インスリンがＰＫＣの発現及び／又は活性化の調節因子として働くという際立った新規な現象が発見された。そのようなものとして、インスリンは、創傷の治癒プロセスを促進するように、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節する治療用作用物質として働くことができる。
【００９７】
別個のＰＫＣアイソフォームの特徴、並びに細胞の増殖及び／又は分化に対するその特異的な効果は、皮膚の創傷治癒の生物学に非常に重要である。ＰＫＣアデノウイルス構築物を利用すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒プロセスにおける様々なＰＫＣアイソフォームの特異的な役割を同定することが可能となる。すべてのアイソフォームが、ケラチン生成細胞の増殖及び分化の異なる側面に特異的に影響を及ぼすことができる。２種のアイソフォームＰＫＣδ及びＰＫＣζは、インテグリンの制御（下記の実施例６を参照）、基底膜との接着（下記の実施例９を参照）及び半接着斑形成（下記の実施例８を参照）を特異的に制御することができた。２種のアイソフォームＰＫＣδ及びＰＫＣηは、表皮ケラチン生成細胞の増殖の潜在的可能性を制御することが分かった（下記の実施例７及び１１を参照）。さらに、ＰＫＣηの顕性不活性アイソフォーム（ＤＮＰＫＣη）は、活発に増殖しているケラチン生成細胞の分化を特異的に誘導することができた（下記の実施例１２を参照）。最後に、皮膚での創傷治癒プロセスに対する別個のＰＫＣアイソフォームの重要性は、ｉｎ ｖｉｖｏ系でも実証された。別個のＰＫＣアイソフォームの発現が消失した無ＰＫＣマウスを利用して、皮膚ケラチン生成細胞の接着と運動のプロセスのどちらにも必要であることが分かったＰＫＣδ及びＰＫＣζが、動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ創傷治癒プロセスでも重要であることを本明細書において示す（実施例１９を参照）。無ＰＫＣの皮膚での皮膚全体の全層生検から、ＰＫＣδもＰＫＣζも創傷の適切な治癒に必須であるが、ＰＫＣαは必須ではないことが示唆された。さらに、下記の実施例２２は、ＰＫＣα抑制物質がｉｎ ｖｉｖｏで創傷治癒を有効に促進し、それによってＰＫＣαアイソフォームが創傷治癒に拮抗性である可能性があることが示唆されることを示すものである。
【００９８】
ＰＫＣηは、独特の組織分布を示す。それは上皮組織で主に発現する（２７、２８）。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる検討、並びに免疫組織化学的な検討から、ＰＫＣηが分化中の層及び分化能のある層で高度に発現することが示された（２７）。本明細書で提示する結果から、ＰＫＣηが、細胞生理に応じて皮膚の増殖と分化のどちらの機能的制御因子としても役割を有することが示唆される。ケラチン生成細胞が低Ｃａ２＋条件下で増殖状態に維持されているとき、ＰＫＣηは、対照ケラチン生成細胞より５〜７倍高い増殖速度を誘導した。しかし、Ｃａ２＋濃度を上昇させることによって細胞に分化を誘導したとき、対照細胞と比べて迅速且つ高い速度で分化が誘導された（実施例１２を参照）。増殖能と分化層の形成のどちらも実現されたので、このことから、ＰＫＣηが創傷治癒及び肉芽組織の形成を急激に誘導することができることを説明することができた。興味深いことに、ｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒の結果、及び成体期では通常高レベルでＰＫＣηを発現しない胚組織でのＰＫＣηの発現から、ＰＫＣηが同様に他の組織の増殖及び組織構成に役割を有すると考えられることが示唆された。これには、神経組織並びに皮膚組織及び筋組織があり、それらは創傷の肉芽組織中で効率よく治癒した。さらに、顕性不活性突然変異体を利用することによってケラチン生成細胞の分化を特異的に制御し、活発に増殖している細胞で正常な分化を誘導できると、特異的に分化を操作し、創傷治癒に関与する過剰増殖異常を調節することが可能となる。
【００９９】
ＰＫＣηの治癒能が、ヌードマウスの背中に作り出した創傷に対してｉｎ ｖｉｖｏで発揮されることが、本明細書において例示される。下記の実施例１４は、創傷にＰＫＣη発現構築物を投与すると、局所感染させてから４日後に肉芽組織が形成されたことを示すものである。
【０１００】
全体として、本明細書で提示する結果は、別個のＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性化（膜可動化）の調節が、創傷に対処する有効な手段であることを実証するものである。したがって、アイソフォームＰＫＣδ、ＰＫＣη及びＰＫＣζの発現及び／又は活性を増大させることによって、或いはアイソフォームＰＫＣαの発現及び／又は活性を抑制することによって創傷治癒を促進することができる。
【０１０１】
したがって、本発明の一態様によれば、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、その方法は、皮膚創傷に、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節する少なくとも１種の作用物質を治療有効量投与することによって実施される。したがって、本発明のこの態様に従った方法を実施するための薬剤組成物は、有効成分である、ＰＫＣの発現及び／又は活性化を調節する治療有効量の少なくとも１種の作用物質、並びに製剤上許容される担体を含む。
【０１０２】
本明細書において、「皮膚創傷」という語句は、それだけに限らないが、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、胃潰瘍やＨＩＶ関連潰瘍などの潰瘍、糖尿病関連の創傷、熱傷、日焼け、加齢による皮膚創傷、角膜潰瘍化による創傷、炎症性消化管疾患による創傷、腸炎症性疾患による創傷、クローン病による創傷、潰瘍性大腸炎、痔核、表皮水疱症による創傷、皮膚水疱形成性創傷、乾癬による創傷、動物の皮膚の創傷、動物の糖尿病による創傷、網膜症による創傷、口腔の創傷（粘膜炎）、膣粘膜炎による創傷、歯周病による創傷、裂傷、外科的切除による創傷、及び外科的接着後の創傷を含めて、任意の型の上皮創傷を指す。
【０１０３】
本明細書において「皮膚損傷」という語句は、例えば、しわ（例えば、紫外線照射誘導性のしわ）、皮膚の筋、間隙、隆起、大型の孔（例えば、汗腺の管路、皮脂腺や毛包などの付属器構造に伴うもの）やむら又は荒れ、皮膚の弾性の喪失（機能的な皮膚エラスチンの喪失及び／又は不活性化）、たるみ（眼の領域及び顎の腫脹を含む）、皮膚の堅固さの喪失、皮膚の締まりの喪失、皮膚の変形からの反跳の喪失、変色（眼下の隈を含む）、痣、黄ばみ、染みやそばかすなどの色素沈着過剰な皮膚の領域、角化上皮症、異常分化、ケラチン過剰生成、弾性線維症、コラーゲン崩壊や、角質層、真皮、表皮、皮膚の血管系（例えば毛細血管拡張症又はクモ状血管）、及び基底にある組織、特に皮膚と隣接する組織における他の組織変化など、任意の型の皮膚の損傷又は状態を指す。
【０１０４】
皮膚は、古典的なインスリン反応性の組織でないと考えられている。したがって、皮膚におけるインスリンの効果は、密接に関連するＩＧＦＲをそれが活性化できることに主に起因すると考えられる。ケラチン形成細胞では、インスリンもＩＧＦ１も、どちらの受容体も刺激し、類似した下流のエフェクターを活性化することができることが示された（３４）。しかし、本発明は、どちらの増殖因子も投与量依存的にケラチン生成細胞増殖を誘導するが、各ホルモンは異なるシグナル伝達経路を介してその効果を発揮することを示すものである。インスリン及びＩＧＦ１によるケラチン生成細胞増殖の差次的な制御についての最初の示唆は、これらのホルモンが、一緒に添加したときに、各ホルモンの増殖を誘導する最大濃度でケラチン生成細胞増殖に対する相加的な効果を有するという知見によって確認された（実施例１５を参照）。ケラチン生成細胞増殖の制御におけるインスリンとＩＧＦ１のシグナル伝達経路の分岐点を同定するために、ケラチン生成細胞増殖も制御し、インスリンシグナル伝達の下流のエフェクターとしても働くことが知られているエレメントを調べた。これらの検討から、インスリンシグナル伝達が、ケラチン生成細胞増殖においてＰＫＣδによって特異的に媒介されることが明らかとなった（実施例１７を参照）。ＰＫＣδは、ＰＫＣファミリーのタンパク質の中で独特のアイソフォームであり、様々な細胞型の増殖及び成熟に特異的に関与する（３５）。しかし、ＰＫＣδが、ＥＧＦ、血小板由来増殖因子及び神経伝達物質を含めたいくつかの増殖因子の刺激によって特異的に制御されることが示されたが、その生理的な効果は、アポトーシス、分化、及び細胞周期遅延又は停止を含めて、増殖因子による細胞増殖抑制に関与することが示された（３６〜４１）。最近、Ｃａ２＋の上昇後１２〜２４時間以内に、培養マウスケラチン生成細胞でα６β４インテグリン複合体の選択的な喪失が、Ｋ１の誘導へとつながることが示された（６）。α６β４タンパク質発現の喪失は、α６鎖及びβ４鎖のプロセシングの促進を含む転写及び翻訳後の事象の結果である。予備的な検討では、ＰＫＣの活性化と、α６β４インテグリンのプロセシング及び制御とのつながりが明らかとなった。これらの結果は、ケラチン生成細胞の脱離を誘導するα６β４発現及び半接着斑形成の喪失におけるＰＫＣδ並びにＰＫＣζの役割に対する以前の結果と一致する。しかし、本発明は、インスリン誘導性のケラチン生成細胞増殖の標的としての、ＰＫＣδの他の役割を同定するものである。下記の実施例は、それだけに限らないが、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＣＧＦ及びＩＧＦ１を含む種々の増殖因子ではなく、インスリン刺激だけが、転位し、皮膚で発現される他のＰＫＣアイソフォームのいずれでもなくＰＫＣδを活性化することができることを示すものである。インスリン刺激に対するＰＫＣδの重要性は、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＣＧＦ及びＩＧＦ１による分裂促進刺激がＰＫＣδの顕性不活性突然変異体によって抑止されなかったときにさらに確認され、インスリンは、ケラチン生成細胞増殖の制御におけるこのＰＫＣアイソフォームの主要な活性化物質であるように思われた（実施例１７を参照）。しかし、ケラチン生成細胞をＷＴのＰＫＣδに感染させたとき、ＥＧＦ及びＫＧＦによるケラチン生成細胞の分裂促進刺激が増強された。このことは、ＰＫＣδの活性化が、上流のシグナル伝達経路による他の増殖因子の増殖刺激にも不可欠であることを示すものである。さらに、インスリン誘導性のＰＫＣδ活性化及びケラチン生成細胞増殖を媒介する下流のエレメントを特徴付け、このプロセスでの転写活性化物質であるＳＴＡＴ３の関与を同定した。ＳＴＡＴ（転写シグナル伝達因子及び活性化因子（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ））タンパク質は、様々なサイトカイン及び増殖因子によって動員される転写因子ファミリーである。既知のＳＴＡＴファミリーの構成要素７個中で、ＳＴＡＴ３は独特である。他のＳＴＡＴファミリーの構成要素ではなくＳＴＡＴ３を標的として破壊すると、早期の胚性致死に至る。特に、皮膚でＳＴＡＴ３の条件付き除去を行ったとき、皮膚の再構築が重度に崩壊した。活性化後、ＳＴＡＴタンパク質はホモダイマー又はヘテロダイマーを形成し、核へと転位し、標的遺伝子のＤＮＡ反応エレメントと結合して転写を誘導する。ケラチン生成細胞では、皮膚で発現される他のＰＫＣアイソフォーム（ＰＫＣα、ζ、η及びε）ではなくＰＫＣδがＳＴＡＴ３と構成的に結合していることが分かった（実施例１８を参照）。さらに、インスリンは、ＰＫＣδの特異的な活性化を介してＳＴＡＴ３のリン酸化、活性化及び核への転位を制御する。薬剤抑制物質ロットレリンにより、又は顕性不活性ＰＫＣδ突然変異体の過剰発現によりＰＫＣδ活性を抑制すると、インスリン誘導性のＳＴＡＴ３の活性化及び核への転位が抑止された。最後に、顕性不活性ＰＫＣδ突然変異体を過剰発現させると、ＳＴＡＴ３の過剰発現によって誘導されるケラチン生成細胞増殖が抑制された（実施例１８を参照）。これらの結果から、皮膚ケラチン生成細胞増殖における、ＳＴＡＴ３による転写活性化でのインスリン誘導性ＰＫＣδ活性の役割が示唆される。ＳＴＡＴ３が皮膚の再構築に重要であり、様々なサイトカイン及び増殖因子によって動員される下流のエフェクターであるので、これらの結果全体から、様々な皮膚増殖因子によるケラチン生成細胞の増殖を媒介する主要な下流のエフェクターとしてＰＫＣδが活性化することが示唆される。特に、ＰＫＣδは、糖尿病患者で見られる創傷治癒欠損の原因の主要な候補である可能性がある。ＰＫＣδと創傷治癒のつながりは、ｉｎ ｖｉｖｏでも確認された。新たに構築した無ＰＫＣδマウスを利用して、ＰＫＣδの欠如によってマウス皮膚での創傷治癒が遅延することが本明細書で示される（実施例１９を参照）。ＰＫＣδとインスリンシグナル伝達のつながりも、他のいくつかの系で明らかとなっている。例えば、筋培養物中で、ＰＫＣδがインスリン誘導性のグルコース輸送を媒介することが最近示された（４２、４３）。同様に、インスリン受容体を過剰発現している細胞では、インスリン刺激がＰＫＣδの活性化と関連することが示された（４４〜４６）。しかし、これらの研究ではインスリンが媒介するＰＫＣδの活性化をインスリンの代謝効果と結び付けているが、これは、ＰＫＣδを、インスリンが媒介する細胞増殖と結び付ける最初の報告である。ケラチン生成細胞の増殖と、細胞がその下にある基底膜との接着を喪失する初期分化段階の調節の両方の制御におけるＰＫＣδの確認された二重の役割が明らかとなった。このことから、インスリン誘導性ＰＫＣδが、皮膚における増殖と分化の生理的均衡を制御する主要な候補であることが示唆される。
【０１０５】
したがって、本発明の教示によれば、創傷細胞をインスリンにさらすことによってＰＫＣの発現及び／又は活性化の調節を実施する。これは、以下でさらに例示するように、複数の選択方法の１つによって実行することができる。
【０１０６】
１つの方法は、創傷へのインスリンの直接投与である。以下の実施例２１及び２２で記載するように、インスリンを創傷に濃度０．１〜１０μＭで局所塗布すると、表皮及び皮膚の閉鎖、続いて創傷治癒が有効に促進された。さらに、驚くべきことに且つ意外なことに、インスリンをＰＤＧＦ−ＢＢ増殖因子又はＰＫＣα抑制物質と組み合わせて塗布すると、インスリン単独よりも創傷治癒プロセスが実質的に且つ相乗的に向上した。
【０１０７】
したがって、本発明の他の態様によれば、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供される。その方法は、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、皮膚創傷に、治療有効量のインスリン、及びインスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質を投与することによって実施する。好ましくは、その作用物質はＰＫＣα抑制物質である。さらに好ましくは、その作用物質は、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＫＧＦ、ＥＣＧＦやＩＧＦ１などの増殖因子であり、最も好ましくは、その作用物質はＰＤＧＦ−ＢＢである。
【０１０８】
単独での又は他の作用物質と組み合わせてのインスリンの直接投与は、単回又は反復塗布によって実施することができる。本発明を実施に移す間、本発明者らは、驚くべきことに、濃度１μＭでのインスリンの単回塗布での治療が、同様の濃度でのインスリンの７回反復する毎日の塗布よりも創傷治癒において実質的に有効であることを発見した（下記の実施例２０を参照）。
【０１０９】
したがって、本発明の他の態様によれば、皮膚の創傷に単回投与量単位の治療有効量のインスリンを投与することによって、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供される。好ましくは、単回投与量単位は、皮膚創傷の１ｃｍの領域を覆うのに十分な量、例えば０．０１〜０．２ｍｌの例えば水溶液剤、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、噴霧剤、懸濁液剤、粉末剤、分散液剤、膏薬剤又は軟膏剤中に０．００１〜５ｎＭの、好ましくは０．０１〜０．５ｎＭのインスリンを含む。
【０１１０】
下記の実施例の項中の実施例２０で例示するように、インスリンを創傷に投与する時期は決定的に重要である可能性がある。例えば、４日前の創傷にインスリンを単回塗布すると、有効に創傷が治癒した。したがって、本発明の他の態様によれば、創傷に単回投与量の治療有効量のインスリンを投与することによって、古い皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供される。
【０１１１】
本明細書において「古い皮膚創傷」という語句は、少なくとも１日前の、少なくとも２日前の、少なくとも３日前の、好ましくは、少なくとも４日前の皮膚創傷を指す。
【０１１２】
本発明の他の態様に従って、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分である、治療有効量のインスリン及びインスリンと相乗的に作用する少なくとも１種のさらなる作用物質と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。好ましくは、その作用物質は、ＰＫＣα抑制物質、又はＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＫＧＦ、ＥＣＧＦやＩＧＦ１などの増殖因子であり、最も好ましくは、ＰＤＧＦ−ＢＢである。下記でさらに詳細に説明するように、製剤上許容される担体は、それだけに限らないが、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、噴霧剤、懸濁液剤、粉末剤、分散液剤、膏薬及び軟膏剤でもよい。創傷へのインスリンの放出を持続させるために固体支持体を使用することもできる。インスリンは、ヒト又は他の任意の供給源に由来する、天然のものでもよく、或いは好ましくは組換えによるものでもよいことが理解されるであろう。
【０１１３】
本発明の他の態様によれば、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進することができるように選択された単回投与単位のインスリン、及び薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体を含んでよい。好ましくは、単回投与量単位のインスリンは、０．０１〜０．２ｍｌの製剤投与量単位中で０．００１〜５ｎＭであり、好ましくは０．０１〜０．５ｎＭである。
【０１１４】
本発明の代替の実施形態では、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、インスリンを発現し分泌する細胞を創傷に移植する。そのようなインスリン産生細胞は、インスリンを天然に産生する細胞でもよく、或いは、そのような細胞を形質転換して、インスリンを産生し分泌する。例えば、インスリンの産生及び分泌に対するトランス作用性因子である組換えＰＤＸ１遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ００５７１２、ＡＦ０３５２６０、ＡＦ０３５２５９を参照）で細胞を形質転換することができる。或いは、細胞を形質転換して天然のインスリンを過剰産生し分泌するために、遺伝子ノックインにより細胞の内因性インスリン遺伝子の上流に組み込まれた強く構成的な又は誘導性のプロモーターなどのシス作用性エレメント配列で細胞を形質転換することもできる。インスリン遺伝子の上流領域がクローン化されている（アクセッション番号Ｅ０００１１、ＮＭ０００２０７を参照）ので、これを得ることは可能である。或いは、組換えインスリン遺伝子（例えば、アクセッション番号Ｊ０２５４７）で細胞を形質転換し、それによって細胞が組換えインスリンを産生し分泌する。
【０１１５】
したがって、本発明のこの態様に従って皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分であるインスリン分泌細胞と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。創傷に投与するインスリン分泌細胞は、それによって産生されるインスリンを分泌するために、分泌顆粒を形成することができると有利である。インスリン分泌細胞は、内分泌細胞でもよい。それは、ヒト供給源に由来するものでもよく、或いは、組織適合性をヒト化した動物供給源に由来するものでもよい。最も好ましくは、形質転換又は非形質転換インスリン分泌細胞は、自己の供給源由来のものである。好ましくは、インスリン分泌細胞によって分泌されるインスリンは、ヒトインスリンであり、又はヒトインスリンのアミノ酸配列を有する。インスリン分泌細胞は、そのような細胞にインスリンを産生し分泌するために上記に記載の形質転換を使用することを条件として、線維芽細胞、上皮細胞又はケラチン生成細胞でもよい。
【０１１６】
代替の実施形態では、皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するために、皮膚創傷の細胞を形質転換して、インスリンを産生し分泌する。
【０１１７】
したがって、本発明のこの態様に従って皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分である、皮膚創傷の細胞を形質転換してインスリンを産生し分泌するように設計された核酸構築物と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【０１１８】
上記に記載した形質転換の方法、例えばインスリンをコードする構築物での形質転換、遺伝子ノックインにより内因性インスリン遺伝子の下流に挿入するシス作用性エレメントを有する構築物での形質転換、並びに内因性インスリン産生及び分泌を活性化するトランス作用性因子をコードする構築物での形質転換のいずれかを、本発明のこの実施形態の場面で使用することができる。
【０１１９】
皮膚における別個のＰＫＣアイソフォームの効果についての以前の研究は、寿命が短く、分化の可能性があり、安定な形質転換体を単離できないことにより、従来の方法で外来遺伝子を効率よく初代細胞に導入することが困難であることによって拘束されていた。これらの障害を克服するために、対象とする遺伝子の導入にウイルスベクターが使用されつつある。複製能が欠損したウイルスの形にウイルスゲノムを改変することによって、ウイルスベクターが開発された。最も広く使用されているウイルスベクターは、レトロウイルス及びアデノウイルスであり、それらは実験並びに遺伝子治療の目的で使用される（１３）。特に、非複製細胞でのアデノウイルス感染の効率が高く、ウイルスの力価が高く、形質導入タンパク質の発現が高いことから、この系は、レトロウイルスベクターと比べて初代培養物にとって非常に有利となる。アデノウイルスが宿主ゲノム中に組み込まれず、安定したウイルス力価によって複製欠損にすることができるので、これらのウイルス構築物の、ヒト並びに動物モデルで伴う悪性リスクは最小限である（１４）。今までに、皮膚でも、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの手法を用いて高い感染効率でのアデノウイルス構築物の使用に成功している（１５、１６）。Ｉ．Ｓａｉｔｏ及びその共同研究者らによって開発されたアデノウイルスベクター（１７）を、本研究に使用した。コスミドカセット（ｐＡｘＣＡｗｔ）は、ほぼ完全長のアデノウイルス５ゲノムを有するが、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ及びＥ３領域を欠き、そのことがウイルスを複製欠損にしている。それは、複合ＣＡＧプロモーターを含み、そのプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、及び挿入したＤＮＡの発現を強く誘導するウサギβグロビンポリアデニル化シグナルからなる（１３、１７）。対象とする遺伝子をコスミドカセット中に挿入し、次いでヒト胎児腎２９３細胞中に、アデノウイルスＤＮＡ末端タンパク質複合体（ＴＰＣ）とともにそれを同時トランスフェクトする。Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ領域を発現する２９３細胞では、コスミドカセットとアデノウイルスＤＮＡ−ＴＰＣの間で組換えが起こり、従来の方法の１００倍の効率で所望の組換えウイルスが得られる。そのような高い効率は、タンパク質分解酵素処理したＤＮＡの代わりにアデノウイルスＤＮＡ−ＴＰＣを使用することに主に起因する。さらに、長い相同領域が存在すると、相同組換えの効率が高くなる。複製能を有するウイルスの再生は、複数のＥｃｏＴ２２１部位が存在することにより回避される。これに関連して、ケラチン生成細胞を別個のＰＫＣの組換えアデノウイルスに感染させ、その２４時間後にＰＫＣアイソフォームの有効な過剰発現が示されたことに留意されたい（実施例１を参照）。
【０１２０】
したがって、本発明に従ってＰＫＣの発現及び／又は活性化の調節を実施する他の方法は、皮膚創傷細胞でＰＫＣの過剰発現を誘導することによって行うものである。このことは、相同組換えにより細胞の内因性タンパク質キナーゼＣの上流に組み込むシス作用性エレメント配列で細胞を形質転換し、それによって細胞に天然のタンパク質キナーゼＣを産生することで実現することができる。或いは、このことは、それだけに限らないが、ＰＫＣ−β１遺伝子（アクセッション番号Ｘ０６３１８、ＮＭ００２７３８）、ＰＫＣ−β２遺伝子（アクセッション番号Ｘ０７１０９）、ＰＫＣ−γ遺伝子（アクセッション番号Ｌ２８０３５）、ＰＫＣ−θ遺伝子（アクセッション番号Ｌ０７０３２）、ＰＫＣ−λ遺伝子（アクセッション番号Ｄ２８５７７）、ＰＫＣ−ι遺伝子（アクセッション番号Ｌ１８９６４）、ＰＫＣ−α遺伝子（アクセッション番号Ｘ５２４７９）、ＰＫＣ−δ遺伝子（アクセッション番号Ｌ０７８６０、Ｌ０７８６１）、ＰＫＣ−ε遺伝子（アクセッション番号Ｘ７２９７４）、ＰＫＣ−η遺伝子（アクセッション番号Ｚ１５１０８）やＰＫＣ−ζ遺伝子（アクセッション番号Ｚ１５１０８、Ｘ７２９７３、ＮＭ００２７４４）などの組換えタンパク質キナーゼＣ遺伝子で細胞を形質転換し、それによって細胞に組換えタンパク質キナーゼＣを産生することで実現することができる。
【０１２１】
したがって、本発明のこの態様に従って皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分である、皮膚創傷の細胞を形質転換してタンパク質キナーゼＣを産生するように設計された核酸構築物と、薬剤組成物の局所塗布用に設計された製剤上許容される担体とを含む。
【０１２２】
本発明に従ってＰＫＣの発現及び／又は活性化の調節を実施する他の方法は、皮膚創傷の治癒プロセスを誘導又は促進するための、それだけに限らないが、Ｃａ２＋、インスリンやブリオスタチン１などのＰＫＣ活性化物質によって行うものである。
【０１２３】
したがって、本発明のこの態様に従って皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、有効成分である、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進するための治療有効量のＰＫＣ活性化物質と、製剤上許容される担体とを含む。
【０１２４】
本発明に従ってＰＫＣの発現及び／又は活性化の調節を実施する他の方法は、ＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を下方制御することによって行うものである。
【０１２５】
ＰＫＣアイソフォームの活性の下方制御は、例えば、ＰＫＣα、ＰＫＣζ又はＰＫＣηの偽基質抑制物質（ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ、米国カリフォルニア州）などのＰＫＣ偽基質アイソフォーム抑制物質、或いは、例えば薬剤ペプチドＬＹ３７９１９６（Ｅｌｌｙ Ｌｉｌｌｙ、米国）などの他のＰＫＣアイソフォーム抑制物質によって実施することができる。
【０１２６】
或いは、ＰＫＣアイソフォームの活性の下方制御は、下記の実施例の項で記載するような顕性不活性（ＤＮ）ＰＫＣアデノウイルス構築物によって実施することもできる。
【０１２７】
ＰＫＣアイソフォームの活性の下方制御は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子によって実施することができる。ＲＮＡ干渉は、２ステップのプロセスである。第１ステップは、開始ステップと呼ばれ、大抵の場合、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼの構成要素であり、ＡＴＰ依存的にｄｓＲＮＡ（直接或いは導入遺伝子又はウイルスを介して導入）をプロセシングする（切断する）ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）の作用によって投入ｄｓＲＮＡを消化して、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にする。連続した切断事象によって、ＲＮＡを、それぞれが２ヌクレオチドの３’突出を有する１９〜２１ｂｐの二重鎖（ｓｉＲＮＡ）に分解する［Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２）；並びにＢｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６（２００１）］。
【０１２８】
実行ステップでは、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ヌクレアーゼ複合体と結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡ二重鎖のＡＴＰ依存的な巻き戻しは、ＲＩＳＣの活性化に必要である。次いで、活性なＲＩＳＣは、塩基対形成の相互作用によって相同な転写物を標的とし、ｍＲＮＡを切断してｓｉＲＮＡの３’末端から１２ヌクレオチドの断片にする［Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２）；Ｈａｍｍｏｎｄら、（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９（２００１）；並びにＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５−９０（２００１）］。その切断の機構は依然として明らかとなっていないが、各ＲＩＳＣが単一のｓｉＲＮＡ及びＲＮａｓｅを含むことが研究から示唆される［Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２）］。
【０１２９】
ＲＮＡｉの顕著な効果のため、ＲＮＡｉ経路内での増幅ステップが提唱されている。より多くのｓｉＲＮＡを発生させる投入ｄｓＲＮＡの複製によって、又は形成されるｓｉＲＮＡの複製によって増幅を行うことができる。或いは又はさらには、ＲＩＳＣの複数の代謝回転事象によって増幅を実施することができる［Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９（２００１）；Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５−９０（２００１）；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２）］。ＲＮＡｉについてより多くの情報を得るには、下記の総説Ｔｕｓｃｈｌ、ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５（２００１）；Ｃｕｌｌｅｎ、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９（２００２）；及びＢｒａｎｔｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ．１５７５：１５−２５（２００２）を参照されたい。
【０１３０】
本発明での使用に適したＲＮＡｉ分子の合成を下記のように実施することができる。第１に、ＰＫＣアイソフォームのｍＲＮＡ配列を、ＡＵＧ開始コドンの下流にＡＡジヌクレオチド配列があるかどうか調べる。それぞれのＡＡの出現及び３’に隣接する１９ヌクレオチドを、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、制御性のタンパク質結合部位に富むので、好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位は、オープンリーディングフレームから選択される。ＵＴＲ結合タンパク質及び／又は翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉することができる［Ｔｕｓｃｈｌ、ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５］。しかし、ＧＡＰＤＨについて、５’ＵＴＲを対象とするｓｉＲＮＡが細胞ＧＡＰＤＨｍＲＮＡの約９０％の低下を媒介し、タンパク質レベルを完全に消失させたことが示された（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）ように、非翻訳領域を対象とするｓｉＲＮＡも有効である可能性があることが理解されるであろう。
【０１３１】
第２に、ＮＣＢＩサーバーから利用可能なＢＬＡＳＴソフトウェア（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）など、任意の配列アラインメントソフトウェアを用いて、潜在的な標的部位を、適当なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較する。他のコード配列と有意な相同性を示す推定標的部位は取り除く。
【０１３２】
限定した標的配列を、ｓｉＲＮＡ合成用の鋳型として選択する。好ましい配列は、Ｇ／Ｃ含量が低いものであり、これは、Ｇ／Ｃ含量が５５％より高いものと比べて遺伝子サイレンシングの媒介に有効であることが証明されている。評価する標的遺伝子の全長に沿っていくつかの標的部位を選択することが好ましい。選択したｓｉＲＮＡをよりよく評価するには、陰性対照を併せて使用することが好ましい。陰性対照ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成であるが、ゲノムとの有意な相同性を欠くことが好ましい。したがって、それが他のどんな遺伝子とも有意な相同性を示さないことを条件として、乱雑にしたヌクレオチド配列のｓｉＲＮＡを使用することが好ましい。本発明に従った適切なｓｉＲＮＡは、例えば、配列番号１〜１６で示す核酸配列のいずれかなど、ＰＫＣα発現を抑制することができるｓｉＲＮＡでもよい。
【０１３３】
ＰＫＣアイソフォームを下方制御することができる他の作用物質は、ＰＫＣアイソフォームのｍＲＮＡ転写物又はＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖ポリヌクレオチドであり、一本鎖と二本鎖の両方の標的配列を切断することができる（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５；２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国 １９９７；９４３：４２６２）。ＤＮＡザイムについて一般的なモデル（「１０〜２３」モデル）が提案されている。「１０〜２３」ＤＮＡザイムは、それぞれ７〜９個のデオキシリボヌクレオチドからなる２つの基質認識ドメインが隣接した、１５個のデオキシリボヌクレオチドからなる触媒ドメインを有する。この型のＤＮＡザイムは、プリン：ピリミジン結合でその基質ＲＮＡを有効に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国 １９９；ＤＮＡザイムの総説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ［Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ４：１１９−２１（２００２）］を参照）。
【０１３４】
一本鎖及び二本鎖の標的切断部位を認識する、合成され工学的に作製されるＤＮＡザイムの構築及び増幅の例は、Ｊｏｙｃｅらの米国特許第６，３２６，１７４号で開示されている。最近、ヒトウロキナーゼ受容体を対象とする同様の設計のＤＮＡザイムが、ウロキナーゼ受容体発現を抑制することが観察され、ｉｎ ｖｉｖｏで結腸癌細胞転移の抑制に成功した（Ｉｔｏｈら、２０００２，Ａｂｓｔｒａｃｔ ４０９，Ａｎｎ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。他の適用例では、ｂｃｒ−ａｂｌ癌遺伝子と相補的なＤＮＡザイムが、白血病細胞での癌遺伝子発現の抑制、並びにＣＭＬ及びＡＬＬ症例における自己骨髄移植での再発率の減少に成功した。
【０１３５】
ＰＫＣアイソフォームの下方制御は、ＰＫＣアイソフォームをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを使用することによって実施することもできる。
【０１３６】
ＰＫＣアイソフォームを効率よく下方制御するのに使用することができるアンチセンス分子の設計は、アンチセンスの手法に重要な２つの側面を考慮しながら実施しなければならない。第１の側面は、適当な細胞の細胞質中へのオリゴヌクレオチドの送達であり、第２の側面は、その翻訳を抑制する形で、細胞内の指定されたｍＲＮＡと特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
【０１３７】
従来技術から、オリゴヌクレオチドを多種多様な細胞型に効率よく送達するのに使用することができるいくつかの送達の戦略が教示される［例えば、Ｌｕｆｔ、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６：７５−６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔら、Ｂｌｏｏｄ ９１：８５２−６２（１９９８）；Ｒａｊｕｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ８：９３５−４０（１９９７）；Ｌａｖｉｇｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３７：５６６−７１（１９９７）及びＡｏｋｉら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３１：５４０−５（１９９７）を参照］。
【０１３８】
さらに、標的ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドのどちらの構造変化のエネルギー現象も明らかにする熱力学サイクルに基づいて、その標的ｍＲＮＡについて最も高い予測結合親和性でそれらの配列を同定するアルゴリズムも利用可能である［例えば、Ｗａｌｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：１−９（１９９９）を参照］。
【０１３９】
そのようなアルゴリズムを使用して、細胞でアンチセンスの手法を実施することに成功している。例えば、Ｗａｌｔｏｎらによって開発されたアルゴリズムによって、科学者によるウサギβグロビン（ＲＢＧ）及びマウス腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）転写物のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計を可能にすることに成功した。同じ研究グループは、３種のモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸脱水素酵素Ａ及びＢ並びにラットｇｐ１３０）に対して合理的に選択されたオリゴヌクレオチドの、動態ＰＣＲの技術によって評価される細胞培養物中のアンチセンス活性が、ホスホジエステル及びホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化学物質での、２種の細胞型における３種の異なる標的に対する試験を含めて、ほとんどすべての場合で有効であると証明されたことをさらに最近報告した。
【０１４０】
さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系を用いて特定のオリゴヌクレオチドの効果を設計し予測するいくつかの手法も公開されている［Ｍａｔｖｅｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１３７４−１３７５（１９９８）］。
【０１４１】
いくつかの臨床試験によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性及び活性が示されている。例えば、癌の治療に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドは使用に成功している［Ｈｏｌｍｕｎｄら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １：３７２−８５（１９９９）］が、ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３及びＢｃｌ−２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを介する血液系の悪性腫瘍の治療は、臨床試験に入り、患者によって許容されることが示されている［Ｇｅｒｗｉｔｚ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １：２９７−３０６（１９９９）］。
【０１４２】
さらに最近では、アンチセンス媒介性のヒトヘパラナーゼ遺伝子発現抑制が、マウスモデルにおいてヒト癌細胞の胸膜播種を抑制することが報告されている［Ｕｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：７８５５−６０（２００１）］。
【０１４３】
したがって、現在の総意は、上記に記載のように、高度に正確なアンチセンス設計アルゴリズム、及び多種多様なオリゴヌクレオチド送達系の創出へと導いたアンチセンス技術分野での最近の開発によって、当業者が、過度の試験及び誤った実験に頼ることなく、既知の配列の発現を下方制御するのに適したアンチセンスの手法を設計し実施することができることである。
【０１４４】
ＰＫＣアイソフォームを下方制御することができる他の作用物質は、ＰＫＣアイソフォームをコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。リボザイムは、対象とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的な抑制にますます使用されてきている［Ｗｅｌｃｈら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４８６−９６（１９９８）］。任意の特定の標的ＲＮＡを切断するリボザイムを設計できる可能性があることによって、それが基礎研究にも治療への適用にも有益な手段となっている。治療の分野では、リボザイムを利用して、感染性疾患におけるウイルスＲＮＡ、癌における優性の癌遺伝子、及び遺伝子異常における特定の体細胞変異を標的化している［Ｗｅｌｃｈら、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｖｉｒｏｌ．１０：１６３−７１（１９９８）］。最も注目すべきは、ＨＩＶ患者に対するいくつかのリボザイム遺伝子治療のプロトコールがすでに第１相試験に入っていることである。さらに最近では、トランスジェニック動物の研究、遺伝子標的の検証及び経路の解明にリボザイムが使用されている。いくつかのリボザイムが、臨床試験の種々の段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床試験で試験される最初の化学合成リボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管新生経路での鍵となる構成成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に抑制する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．並びに他の企業が、動物モデルで抗血管新生治療の重要性を示している。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するように設計されたリボザイムであるＨＥＰＴＡＺＹＭＥは、細胞培養アッセイでＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの減少に有効であることが明らかとなった（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、ＷＥＢホームページ）。
【０１４５】
好ましくは、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する薬剤組成物は、ホルモン、増殖因子、アディポカイン、ＰＫＣδＲＡＣＫ及びＧＷ９６６２からなる群から選択される少なくとも１種のさらなる作用物質をさらに含む。適切なホルモンは、それだけに限らないが、インスリンでもよい。適切な増殖因子は、それだけに限らないが、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ケラチン生成細胞増殖因子（ＫＦＧ）又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）でもよい。適切なアディポカインは、それだけに限らないが、アディプシン又はアディポネクチンでもよい。
【０１４６】
本発明を実施に移す間、本発明者らは、驚くべきことに且つ意外なことに、コポリマー１（ガラティラマーアセテート（ｇｌａｔｉｒｅｍａｒ ａｃｅｔａｔｅ））が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで創傷治癒を実質的に促進することができることを発見した（下記の実施例の項の実施例２６を参照）。コポリマー１は、多発性硬化症及び中枢神経系異常の治療に使用する免疫調節剤として以前から知られている（米国特許第６，６２０，８４７号、第６，３６２，１６１号、第６，３４２，４７６号、第６，０５４，４３０号、第６，０４６，８９８号、第５，９８１，５８９号、及び第５，８００，８０８号；米国特許出願第１０／６１５８６５号、第１０／６６６８５７号、及び第１０／０１４４７７号）が、従来技術では、創傷治癒のプロセスを促進するコポリマー１の使用について記載又は示唆されていない。
【０１４７】
したがって、本発明の他の態様によれば、皮膚の創傷又は損傷の治癒プロセスを誘導又は促進する方法が提供され、皮膚の創傷又は損傷に、治療有効量のコポリマー１を、好ましくは１〜５００μｇ／ｍｌの濃度で投与することにより、その方法を実施する。したがって、本発明のこの態様に従った方法を実施するための薬剤組成物は、有効成分である治療有効量のコポリマー１と、製剤上許容される担体とを含む。
【０１４８】
本発明の治療上／製剤上の有効成分は、創傷にそれ自体を投与することもでき、或いは、適切な担体及び／又は賦形剤と混合した薬剤組成物として投与することもできる。本発明の場面での使用に適した薬剤組成物は、意図された治療効果を達成するのに有効な量の有効成分が含まれるそれらの組成物を含む。
【０１４９】
本明細書において、「薬剤組成物」とは、旧来の薬剤、生理的に適切な担体や添加剤など他の化学物質の構成成分を含む、タンパク質、化学物質、核酸又は細胞のいずれかの、本明細書に記載の１種又は複数種の有効成分、或いはその生理的に許容される塩又はプロドラッグの製剤を指す。薬剤組成物の目的は、生物への化合物又は細胞の投与を容易にすることである。本発明の薬剤組成物は、当技術分野で周知のプロセスによって、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖剤作製、湿式粉砕、乳化、被包化、閉じ込め又は凍結乾燥のプロセスによって製造することができる。
【０１５０】
以下で、「生理的に適切な担体」及び「製剤上許容される担体」という語句は、同義的に使用され、生物に著しい刺激を起こさず、投与した結合体の生物学的な活性及び特性を消失させない担体又は希釈剤を指す。
【０１５１】
本明細書において、「賦形剤」という用語は、有効成分のプロセス及び投与をさらに容易にするために薬剤組成物に添加する不活性な物質を指す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及び種々のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコールがある。
【０１５２】
有効成分の製剤及び投与の技術は、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、最新版中に認めることができ、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
本発明の目的での有効成分の投与について様々な経路が考えられ、以前に記載されているが、局所経路が好ましく、局所用の担体によって補助される。局所用の担体は、局所の有効成分投与に一般に適したものであり、当業者に知られている任意のそのような物質を含む。局所用の担体は、所望の形で、例えば液体又は非液体の担体、ローション剤、クリーム剤、ペースト剤、ゲル剤、粉末剤、軟膏剤、溶媒、液体の希釈剤、点滴剤などとして組成物が提供されるように選択され、天然に存在するもの又は合成のものに由来する物質からなるものでもよい。選択された担体が、局所製剤の活性な作用物質又は他の構成成分に有害な影響を及ぼさず、局所製剤のすべての構成成分に対して安定であることが明らかに必須である。本明細書において使用に適した局所用の担体の例には、水、アルコール及び他の非毒性有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコン、石油ゼリー、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、蝋などがある。本明細書において好ましい製剤は、無色無臭の軟膏剤、液剤、ローション剤、クリーム剤及びゲル剤である。
【０１５４】
軟膏剤は、半固体の製剤であり、通常ワセリン又は他の石油誘導体を基礎とする。当業者には理解されるであろうが、使用される特定の軟膏基剤は、最適な有効成分送達をもたらし、好ましくは、その上他の所望の特性、例えば緩和性などをもたらすものである。他の担体又は賦形剤の場合と同様に、軟膏基剤は、不活性であり、安定であり、刺激性がなく、且つ感作性がないべきである。レミントン：製薬学の科学及び実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第１９版（ペンシルバニア州、イーストン：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９５）の１３９９〜１４０４ページで説明されているように、軟膏基剤は油脂性基剤、乳化性基剤、乳剤性基剤、及び水溶性基剤の４種類に分類することができる。油脂性軟膏基剤には、例えば、植物油、動物から得られた脂肪、及び石油から得られた半個体の炭化水素が含まれる。乳化性軟膏基剤は、吸収性軟膏基剤としても知られ、水を少ししか又は全く含まず、それには、例えば、硫酸ヒドロキシステアリン、無水ラノリン及び親水性ワセリンが含まれる。乳剤性軟膏基剤は、油中水（Ｗ／Ｏ）型乳剤又は水中油（Ｏ／Ｗ）型乳剤であり、それには、例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリン、ラノリン及びステアリン酸が含まれる。好ましい水溶性軟膏基剤は様々な分子量のポリエチレングリコールから調製される。また、さらなる情報を得るには、レミントン：製薬学の科学及び実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）を参照することができる。
【０１５５】
ローション剤は、摩擦なしで皮膚表面に塗布する製剤であり、典型的には、有効成分を含めた固体粒子が水又はアルコール基剤中に存在する液体又は半液体の製剤である。ローション剤は、通常固体の懸濁液剤であり、水中油型の液体の油性乳剤を含んでよい。より流動性のある組成物を塗布することが容易であるので、ローション剤は、本明細書において大きな身体領域の治療に好ましい製剤である。ローション剤中の不溶性物質は、細かく分割することが一般に必要である。ローション剤は、典型的には、より良好な分散をもたらす懸濁化剤、並びに皮膚と接触して有効成分を局在させ保持させるのに有用な化合物、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを含む。
【０１５６】
選択された有効成分を含むクリーム剤は、当技術分野で知られているように、水中油型又は油中水型の粘性のある液体又は半固体の乳剤である。クリーム基剤は、水で洗浄可能であり、油相、乳化剤及び水相を含む。油相は、時折「内部」相とも呼ばれ、一般にワセリン、及びセチルアルコールやステアリルアルコールなどの脂肪族アルコールからなり、水相は通常、必ずしもというわけではないが、体積で油相を上回り、一般に湿潤剤を含む。上記のレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）で説明されているように、クリーム製剤中の乳化剤は、一般に非イオン性、陰イオン性、陽イオン性又は両性の界面活性剤である。
【０１５７】
ゲル製剤は、頭皮への塗布に好ましい。局所有効成分製剤の分野の従事者には理解されるであろうが、ゲル剤は、半固体の懸濁液型の系統である。単相ゲル剤は、通常水性である担体の液体全体にわたって実質的に均一に分布する有機高分子を含むが、好ましくは、アルコールも含み、場合によっては油を含む。
【０１５８】
核酸の担体には、それだけに限らないが、標的リポソームを含めたリポソーム、核酸複合体化剤、ウイルス被覆などが含まれる。しかし、むき出しの核酸での形質転換を使用することもできる。
【０１５９】
当業者に知られている様々な添加剤が、本発明の局所製剤に含まれてもよい。例えば、溶媒を使用して、特定の有効成分物質を可溶化することができる。他の任意選択の添加剤には、皮膚浸透促進剤、乳白剤、抗酸化剤、ゲル化剤、増粘剤、安定化剤などがある。
【０１６０】
上記ですでに言及してきたように、本発明に従って創傷を治療するための局所製剤は、そのような創傷の治療に伝統的に用いられる、薬剤として活性な他の作用物質又は成分を含んでもよい。これには、シクロスポリンなどの免疫抑制剤、メトトレキセートなどの代謝拮抗剤、コルチコステロイド、ビタミンＤ及びビタミンＤアナログ、ビタミンＡ又はエトレチナートなどのそのアナログ、タール、コールタール、カデ油などの鎮痒薬及び角質形成剤、サリチル酸などの角質溶解剤、緩和剤、潤滑剤、殺菌剤ジトラノール（アントラリンとしても知られている）などの防腐剤及び消毒剤、ソラレンやメトキサレンなどの光増感剤、並びにＵＶ照射がある。抗菌剤、抗真菌剤、抗生物質や抗炎症剤などの他の作用物質を添加することもできる。酸素化（高酸素圧）による治療を同時に使用することもできる。
【０１６１】
本発明の局所組成物は、従来の皮膚型の貼布又は物品を用いて皮膚に送達することもでき、有効成分の組成物は、皮膚に貼り付ける薬剤送達装置として働く積層状の構造内に含まれる。そのような構造では、有効成分の組成物は、上部の裏打ち層の下にある層又は「貯蔵器」中に含まれる。その積層状の構造は、単一の貯蔵器を含んでもよく、或いは複数の貯蔵器を含んでもよい。一実施形態では、貯蔵器は、製剤上許容されるコンタクト接着物質のポリマー基質を含み、それは、有効成分の送達の間、その系を皮膚に貼り付けるのに働く。適切な皮膚のコンタクト接着物質の例には、それだけに限らないが、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、ポリウレタンなどがある。選択される特定のポリマー接着物質は、特定の有効成分、賦形剤などに依存し、すなわち、接着物質は、有効成分を含む組成物のすべての構成成分と適合しなければならない。或いは、有効成分を含む貯蔵器及び皮膚のコンタクト接着物質は別々の異なる層として存在し、接触物質が貯蔵器の下にあり、この場合、その貯蔵器は上記に記載のポリマー基質でもよく、或いは液体又はヒドロゲルの貯蔵器でもよく、或いは一部の他の形をとってもよい。
【０１６２】
その装置の上部表面として働くこれらの積層の裏打ち層は、積層状の構造の主要な構造成分として機能し、その装置に大きな柔軟性をもたらす。裏打ち物質に選択する物質は、それが有効成分及び有効成分を含む組成物の任意の他の構成成分に対して実質的に不浸透性であり、それによってその装置の上部表面を介するどんな構成成分の喪失も防止されるように選択されるべきである。裏打ち層は、皮膚が有効成分送達の間に水和されることが望ましいかどうかに応じて、閉鎖性でもよく或いは非閉鎖性でもよい。好ましくは、裏打ち層は、好ましくは柔軟なエラストマー物質のシート又はフィルムから作製される。裏打ち層に適しているポリマーの例には、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリエステルがある。
【０１６３】
貯蔵中及び使用前、その積層状の構造は、剥離ライナーを含む。使用直前に、この層を装置から取り除いて、その系を皮膚に貼り付けることができるように、その基底表面の有効成分の貯蔵器又は別々のコンタクト接着物質の層をさらす。剥離ライナーは、有効成分／賦形剤非浸透性の物質から作製されるべきである。
【０１６４】
当技術分野で知られている従来の技術を用いて、例えば裏打ち層上で接着物質、有効成分及び賦形剤の液体混合物を鋳造し、その後剥離ライナーを積層化することによって、そのような装置を製作することができる。同様に、接着混合物を剥離ライナー上に鋳造し、その後裏打ち層を積層化することができる。或いは、有効成分又は賦形剤の不在下で有効成分の貯蔵器を調製し、次いで有効成分／賦形剤の混合物中にそれを「浸す」ことによって充填することもできる。
【０１６５】
本発明の局所製剤の場合と同様に、この積層系の有効成分の貯蔵器内に含まれる有効成分の組成物は、いくつかの構成成分を含んでもよい。ある場合では、有効成分を「純粋なまま（ｎｅａｔ）」、すなわちさらなる液体の不在下で送達することができる。しかし、ほとんどの場合では、製剤上許容される適切な賦形剤、典型的には溶媒又はゲル中で有効成分を溶解、分散又は懸濁する。存在してもよい他の構成成分には、保存剤、安定化剤、界面活性剤などがある。
【０１６６】
本明細書に記載した薬剤組成物はまた、適切な固相又はゲル相の担体又は賦形剤を含んでもよい。そのような担体又は賦形剤の例としては、それだけに限らないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーがある。
【０１６７】
投与は、苦痛の型、重症度及び症状発現に依存し、有効成分に対する対象の反応性、並びに使用する剤形、特定の結合体の効果、及び使用する投与経路に依存する。当業者は、最適な投与量、投与法及び反復率を容易に決定することができる。患者の状態を考慮して、個々の医師が的確な製剤、投与経路及び投与量を選択することができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「治療の薬理学的基礎（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、第１章１ページを参照）。
【０１６８】
したがって、治療する状態の重症度及び反応性に応じて、投与は単回投与又は反復投与でもよく、治療の過程は数日から数週間、或いは治癒が達成され又は皮膚損傷の縮小が実現されるまで継続する。
【０１６９】
ある態様では、本発明は、細胞の形質転換及び遺伝子ノックイン型の形質転換を使用するｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療、及びｅｘ ｖｉｖｏの（細胞の）遺伝子治療の技術を利用する。本明細書において、遺伝子治療とは、対象とする遺伝物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主に導入して、遺伝性又は後天性の疾患又は状態又は表現型を治療又は予防することを指す。対象とする遺伝物質は、ｉｎ ｖｉｖｏでの産生が所望される産物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）をコードする。例えば、対象とする遺伝物質は、治療上の価値があるホルモン、受容体、酵素、ポリペプチド又はペプチドをコードするものでもよい。総説については、一般に、教科書「遺伝子治療（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」（薬理学の進歩４０（Ａｄｖａｎｃｅｄ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７）を参照されたい。
【０１７０】
（１）ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療、及び（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療という遺伝子治療に対する２つの基本的な手法が発展してきた。ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療では、細胞は、患者から取り出し、又は他の供給源に由来し、培養している間にそれをｉｎ ｖｉｔｒｏで治療する。一般に、適当な遺伝子送達媒体／方法（トランスフェクション、形質導入、相同組換えなど）、及び必要である場合には発現系を介して機能的な置換遺伝子を細胞内に導入し、次いで改変した細胞を培養下で増殖させ、宿主／患者に戻す。この遺伝的に再移植された細胞は、トランスフェクトされた遺伝物質をｉｎ ｓｉｔｕで発現することが示されている。
【０１７１】
ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療では、標的細胞は対象から取り出さず、むしろ、導入する遺伝物質を、レシピエント内にあるレシピエント生物の細胞内にｉｎ ｓｉｔｕで導入する。代替の実施形態では、宿主遺伝子に欠陥がある場合、遺伝子をｉｎ ｓｉｔｕで修復する（Ｃｕｌｖｅｒ、１９９８、（抄録）アンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡを基礎とする治療（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＤＮＡ ＆ ＲＮＡ ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、１９９８年２月、カリフォルニア州コロナド）。この遺伝的に変化した細胞は、トランスフェクトされた遺伝物質をｉｎ ｓｉｔｕで発現することが示されている。
【０１７２】
遺伝子発現用媒体は、異種の核酸を宿主細胞に送達／導入することができる。発現用媒体は、当技術分野で知られているように、細胞選択的な形で核酸の標的導入、発現及び転写を調節するエレメントを含んでよい。遺伝子の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲを、発現用媒体の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲでしばしば置換できることに留意されたい。したがって、本明細書において、発現用媒体は、必要に応じて、導入する実際の遺伝子の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲを含まず、特定のアミノ酸コード領域だけを含んでもよい。
【０１７３】
発現用媒体は、異種の物質の転写を調節するプロモーターを含んでよく、それは、選択的な転写を可能にする構成的な又は誘導性のプロモーターでもよい。場合によっては、必要な転写レベルを得るのに必要となることがあるエンハンサーを含んでもよい。エンハンサーは、一般に任意の非翻訳ＤＮＡ配列であり、コード配列に隣接して（シス型に）働いて、プロモーターによって指示された基底の転写レベルを変化させる。発現用媒体はまた、本明細書で下記に記載する選択遺伝子を含んでもよい。
【０１７４】
当技術分野内で知られている様々な方法のいずれかによって、ベクターを細胞又は組織内に導入することができる。そのような方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８９、１９９２；Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、メリーランド州ボルチモア、１９８９；Ｃｈａｎｇら、体細胞遺伝子治療（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ミシガン州アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）、１９９５；Ｖｅｇａら、遺伝子ターゲティング（Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ミシガン州アナーバー（９９５）；ベクター：分子クローニングベクター及びその使用についての調査（Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ）、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、マサチューセッツ州ボストン、１９８８；並びにＧｉｌｂｏａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４−５１２，１９８６）の記載に認めることができ、それには、例えば、安定な又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション及び組換えウイルスベクターでの感染が含まれる。さらに、中枢神経系に関与するベクターについては米国特許第４，８６６，０４２号を、また正負の選択方法については米国特許第５，４６４，７６４号及び第５，４８７，９９２号も参照されたい。
【０１７５】
感染による核酸の導入は、列挙した他の方法を上回るいくつかの利点をもたらす。その感染する性質により、高い効率を得ることができる。さらに、ウイルスは非常に特殊化しており、通常は特定の細胞型に感染し増殖する。したがって、その天然の特異性を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで或いは組織内で又は細胞の混合培養物内で、ベクターに特定の細胞型を標的とさせることができる。特異的な受容体又はリガンドでウイルスベクターを改変して、受容体が媒介する事象を介して標的特異性を変化させることもできる。
【０１７６】
組換え配列を導入し発現させるＤＮＡウイルスベクターの特定の例は、アデノウイルス由来ベクターＡｄｅｎｏｐ５３ＴＫである。このベクターは、正又は負の選択用のヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、及び所望の組換え配列の発現カセットを発現する。このベクターを使用して、アデノウイルス受容体を有する細胞を感染させることができ、それは上皮由来のほとんどの組織、並びに他の組織を含む。このベクター並びに類似した所望の機能を示す他のベクターを使用して、細胞の混合集団を治療することができ、それには、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの細胞培養物、組織又はヒト対象が含まれる可能性がある。
【０１７７】
また、特定の細胞型に対して発現を制限する特徴を含んでもよい。そのような特徴には、例えば、所望の細胞型に特異的なプロモーター及び制御エレメントがある。
【０１７８】
さらに、組換えウイルスベクターは、それが側方感染や標的特異性などの利点をもたらすので、所望の核酸のｉｎ ｖｉｖｏ発現に有用である。側方感染は、例えばレトロウイルスの生活環に固有であり、単一の感染細胞が、多数の後代ウイルス粒子を産生し、それが出芽し、隣接する細胞に感染するプロセスである。その結果、広い領域が急速に感染し、そのほとんどが、元のウイルス粒子が最初に感染したものではない。このことは、感染性作用物質が娘後代細胞を介してのみ広がる垂直型の感染と対照的である。側方に広がることができないウイルスベクターを作製することもできる。この特徴は、所望の目的が、限局した数の標的細胞のみへと特定の遺伝子を導入することである場合に有用である可能性がある。
【０１７９】
上記に記載のように、ウイルスは、非常に特殊化した感染性作用物質であり、多くの場合、宿主の防御機構を回避するように進化してきた。通常、ウイルスは特定の細胞型に感染し増殖する。ウイルスベクターの標的特異性は、その天然の特異性を利用して、所定の細胞型を特異的に標的とするものであり、それによって感染細胞中に組換え遺伝子が導入される。本発明の方法及び組成物に使用されるベクターは、標的とする所望の細胞型に依存し、当業者に知られている。
【０１８０】
レトロウイルスベクターを構築して、感染性粒子として機能させ、又は最初の１回限りの感染を起こすことができる。前者の場合では、新たなウイルスタンパク質及びＲＮＡを合成するための必要な遺伝子すべて、制御配列及びパッケージングシグナルを維持するようにウイルスのゲノムを改変する。これらの分子が合成された後、宿主細胞は、新たなウイルス粒子中にＲＮＡを詰め込み、この粒子はさらなる感染を起こすことができる。ベクターのゲノムはまた、所望の組換え遺伝子をコードし発現するように工学的に作製する。非感染性のウイルスベクターの場合では、ベクターのゲノムは通常、ＲＮＡをウイルス粒子中に被包化するのに必要なウイルスのパッケージングシグナルを破壊する突然変異を受けている。そのようなシグナルがないと、形成されるどんな粒子もゲノムを含まず、したがって、続いての感染に進むことができない。特定の型のベクターは、意図された適用に依存する。実際のベクターはまた、当技術分野内で知られ容易に利用可能であり、又は周知の方法を用いて当業者により構築することができる。
【０１８１】
組換えベクターは、いくつかの方法で投与することができる。ウイルスベクターを使用する場合、例えば、その手順は、その標的特異性を利用することができ、その結果、疾患部位に局所投与する必要はない。しかし、局所投与によって、より速く有効に治療することができる。
【０１８２】
ノックインの手順で使用する相同組換えを含むｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の形質転換の手順は、例えば、米国特許第５，４８７，９９２号、第５，４６４，７６４号、第５，３８７，７４２号、第５，３６０，７３５号、第５，３４７，０７５号、第５，２９８，４２２号、第５，２８８，８４６号、第５，２２１，７７８号、第５，１７５，３８５号、第５，１７５，３８４号、第５，１７５，３８３号、第４，７３６，８６６号、並びにＢｕｒｋｅ及びＯｌｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２５１−２７０ １９９１；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２ １９８９；Ｄａｖｉｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０（１１）２６９３−２６９８ １９９２；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２（８）：１２９９−１３０２ １９９３；Ｄｕｆｆ及びＬｉｎｃｏｌｎ、「ヒトＡＰＰ遺伝子を含む酵母人工染色体への病原性突然変異の挿入及びＥＳ細胞での発現（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＡＰＰ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ）」、アルツハイマー病及びその関連疾患における研究の進歩（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、１９９５；Ｈｕｘｌｅｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，９：７４２−７５０ １９９１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２６１ １９９３；Ｌａｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５：２２−２９ １９９３；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＣｈｏｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国 １９９３．９０：１０５７８−８２；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２８１−３０１ １９９１；Ｓｃｈｅｄｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５８−２６１ １９９３；Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１９０４−１９０７ １９９３で説明されている。さらに、特許出願ＷＯ９４／２３０４９、ＷＯ９３／１４２００、ＷＯ９４／０６９０８、ＷＯ９４／２８１２３も情報を提供するものである。
【０１８３】
本発明のさらなる対象、利点、及び新たな特徴は、以下の実施例の検討後、当業者に明らかとなるであろうが、その実施例は限定を意図するものではない。さらに、上記に記載し、下記の特許請求の範囲の項で請求する本発明の様々な実施形態及び態様はそれぞれ、以下の実施例中に実験上の支持を認めるものである。
【実施例】
【０１８４】
以下の実施例を参照して、上記の説明とともに、非限定的な様式で本発明を例証する。
【０１８５】
一般的に、本明細書において使用される命名法及び本発明において利用される実験室手順は、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術、及び組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献中に徹底的に説明されている。例えば、以下を参照のこと：「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．ら編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ボルチモア、メリーランド州（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「分子クローニングの実用ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「ゲノム分析：実験室マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、第１巻〜第４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号及び同第５，２７２，０５７号に記載されている方法論；「細胞生物学：実験室ハンドブック（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「動物細胞の培養−基礎技術のマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク（１９９４）、第３版；「免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻 Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）「基礎的及び臨床的免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク、コネチカット州（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（編）「細胞免疫学における精選方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ニューヨーク（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは特許及び科学文献に広範に記載されており、例えば、以下を参照のこと：米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号及び同第５，２８１，５２１号；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「転写及び翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「固定化細胞及び酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；分子クローニングの実用ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）及び「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」第１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲプロトコール：方法及び応用のガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンジエゴ、カリフォルニア州（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら「タンパク質精製及び特徴付けのストラテジー：研究課程マニュアル（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ）」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらのすべては、あたかも全体が本明細書に記載されるかのように参照として援用される。他の一般的な参考文献はこの文献を通して提供される。そこに記載される手順は当該分野において周知であると考えられており、読者の便宜のために提供される。そこに含まれるすべての情報は、参照として本明細書に援用される。
【０１８６】
材料及び実験方法
材料：組織培養培地及び血清は生物学関連企業（Ｂｅｉｔ ＨａＥｍｅｋ、イスラエル）より購入した。増強化学発光（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（ＥＣＬ）はＢｉｏＲａｄ（イスラエル）から購入したキットを用いて行った。モノクローナル抗ｐ−ｔｙｒ抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ニューヨーク州、米国）から購入した。ＰＫＣアイソフォームに対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（カリフォルニア州、米国）及びＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ケンタッキー州）から購入した。α６ラット抗マウスｍＡｂ（ＧｏＨ３）は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（サンジエゴ、カリフォルニア州）から購入した。α６Ａ細胞質ドメインに対する抗体６８４４は、Ｖ．Ｑｕａｒａｎｔａ博士（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）より恵与された。マウスβ４の細胞外ドメインに対して指向されるラットｍＡｂ（３４６−１１Ａ）は、Ｓ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｌ博士（Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）から恵与された。ホスホチロシンに対するラットｍＡｂはＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入し、ウサギ抗ホスホセリンはＺｙｍｅｄ（サンフランシスコ、カリフォルニア州）から購入した。西洋わさびペルオキシダーゼ−抗ウサギ及び抗マウスＩｇＧはＢｉｏ−Ｒａｄ（イスラエル）から入手した。ロイペプチン、アプロチニン、ＰＭＳＦ、ＤＴＴ、Ｎａ−オルトバナジウム酸、及びペプスタチンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。インスリン（ｈｕｍｕｌｉｎＲ−組換えヒトインスリン）はＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ フランス ＳＡ（Ｆｅｒｇｅｒｓｈｅｉｍ、フランス）から購入した。ＩＧＦ１はＣｙｔｏｌａｂ（イスラエル）から恵与された。ケラチン１４抗体はＢａｂｃｏ−Ｃｏｎｖａｎｃｅ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）から購入した。ＢＤＧＦ−ＢＢはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス）から購入した。ＰＫＣα偽基質（ミリストイル化）はＣａｌｂｉｎｏｃｈｅｍ（サンジエゴ、カリフォルニア州）から購入した。
【０１８７】
マウスケラチン生成細胞の単離及び培養：初代ケラチン生成細胞を、以前に記載されたように（１８）新生皮膚から単離した。ケラチン生成細胞は、ウシ胎仔血清で処理された、８％Ｃｈｅｌｅｘ（Ｃｈｅｌｅｘ−１００、ＢｉｏＲａｄ）を含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。増殖性基底細胞表現型を維持するために、最終的なＣａ２＋濃度は０．０５ｍＭに調整した。実験は、プレーティングの５〜７日後に実行した。
【０１８８】
細胞抽出物の調製及びウェスタンブロッティング分析：粗膜画分については、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２μｇ／ｍｌ ペプスタチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２００μＭ ＮａＶＯ４、及び１０ｍＭ ＮａＦを含むＰＢＳ中に、細胞を擦り落とすことによって、全体の細胞溶解物を調製した。均質化及び４回の凍結／融解サイクルの後で、溶解物を４℃、２０分間、最大速度で、微量遠心機で遠心分離した。可溶性細胞質ゾルタンパク質画分を含む上清を別のチューブに移した。ペレットを、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤とともに１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２５０μｌＰＢＳ中に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートし、４℃で最大速度で微量遠心機で遠心分離した。上清は膜画分を含む。タンパク質濃度を、改変ローリーアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣタンパク質アッセイキット）を使用して測定した。細胞タンパク質画分のウェスタンブロット分析を記載されるように（６）実行した。
【０１８９】
免疫沈殿のための細胞溶解物の調製：ケラチン生成細胞を含む細胞ディッシュを、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳで洗浄した。細胞を、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤のカクテル（２０μｇ／ｍｌ ロイペプチン；１０μｇ／ｍｌ アプロチニン；０．１ｍＭ ＰＭＳＦ；１ｍＭ ＤＴＴ；２００μＭ オルトバナジウム酸；２μｇ／ｍｌ ペプスタチン）を含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ ＮａＦ；１％ Ｔｒｉｔｏｎ ｘ１００；０．１％ ＳＤＳ、１％ デオキシコール酸ナトリウム）中で機械的に脱着した。調製物を、４℃で、最大速度で２０分間、微量遠心機で遠心分離した。上清を免疫沈殿のために使用した。
【０１９０】
免疫沈殿：溶解物は、３００μｇの細胞溶解物を２５μｌのタンパク質Ａ／Ｇセファロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州、米国）と混合することによってあらかじめ清澄化し、懸濁物を４℃で３０分間連続して回転させた。次いで、調製物を最大速度で１０分間、４℃で遠心分離し、３０μｌのＡ／Ｇセファロースを、個々の抗原に対する特異的ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（希釈１：１００）とともに上清に加えた。サンプルを４℃で一晩回転させた。次いで、この懸濁物を最大速度で１０分間、４℃で遠心分離し、ペレットをＲＩＰＡ緩衝液で洗浄した。再度、懸濁物を１５，０００×ｇで遠心分離し（４℃で１０分間）、ＴＢＳＴ中で４回洗浄した。サンプル緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ６．８；１０％ ＳＤＳ；１０％ グリセロール；４％ ２β−メルカプトエタノール；０．０５％ ブロモフェノールブルー）を加え、サンプルを５分間煮沸し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【０１９１】
接着アッセイ：２４ウェルペトリプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、ＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌのマトリックスタンパク質で、１時間、３７℃にてコートした（２５０μｌ／ウェル）。インキュベーション後、プレートを洗浄し、０．１％ ＢＳＡで３０分間、室温にてインキュベートして、非特異的結合をブロックした。ケラチン生成細胞培養物を、０．２５％トリプシンで手短にトリプシン処理し、脱着後、細胞を再懸濁し、ケラチン生成細胞（１×１０６）をコートされたウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。非接着細胞を除去し、ウェルをＰＢＳで２回すすぎ、残存した細胞を１Ｍ ＮａＯＨ中で抽出した。細胞計数は、改変ローリーアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣタンパク質アッセイキット）を使用して、タンパク質濃度によって決定した。結果を、未処理対照に対するパーセンテージによって計算した。
【０１９２】
免疫蛍光：初代ケラチン生成細胞を、ラミニン５コートしたガラススライド上にプレートした。２日齢ケラチン生成細胞を、１時間ＰＫＣアデノウイルスに感染させ、ＰＢＳで２回洗浄し、低Ｃａ２＋ＭＥＭ中で培養物中に維持した。感染の２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中に３０分間固定し、続いて０．２％ Ｔｒｉｔｏｎで５分間透過化処理を行った。分析のために、対照及びＰＫＣ感染したケラチン生成細胞をＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡに希釈したＰＫＣ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とともに４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、スライドをＰＢＳで２回１０分間洗浄し、ビオチン化抗ウサギ二次抗体と２０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣと２０分間インキュベートした。α６β４染色の分析のために、ガラススライドを、氷上で５分間、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理し、続いてメタノール中で５分間固定化を行った。このスライドを抗α６抗体又は抗β４抗体とともに一晩インキュベートし、続いて、それぞれビオチン化抗ラット二次抗体との２０分間のインキュベーションを行い、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣと２０分間インキュベートした。ＰＢＳ中での２回の洗浄後、スライドを、１％のｐ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）を含むグリセロール緩衝液を用いてマウントし、蛍光をレーザー走査共焦点像顕微鏡（ＭＲＣ１０２４、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、英国）によって調べた。
【０１９３】
アデノウイルス構築物：組換えアデノウイルスベクターを、以前に記載されたように構築した（１９）。マウスＰＫＣの顕性不活性変異体を、ＡＴＰ結合部位におけるリジン残基のアラニンとの置換によって生成した。変異体ｃＤＮＡを、ＳＲＤ発現ベクターからＥｃｏＲＩで切断し、ｐＡｘＣＡ１ｗコスミドカセットに連結して、Ａｘベクターを構築した。遺伝子の顕性不活性活性は、その自己リン酸化の抑止によって実証された。
【０１９４】
ＰＫＣアイソフォーム遺伝子を用いるケラチン生成細胞の形質導入：培養培地を吸引除去し、ケラチン生成細胞培養物を、ＰＫＣ組換えアデノウイルスを含むウイルス上清で１時間感染させた。次いで、培養物を、ＭＥＭで２回洗浄し、再度培地を与えた。感染の１０時間後、細胞を、血清を含まない低Ｃａ２＋含有ＭＥＭに２４時間移した。対照及びインスリン処理培養又はＩＧＦ１処理培養からのケラチン生成細胞を、増殖アッセイ、８６Ｒｂ取り込みのために使用し、又は免疫沈殿、免疫蛍光、及びウェスタンブロッティングのために、記載されるように抽出し、並びに細胞質ゾル画分及び膜画分に分画した。
【０１９５】
ＰＫＣ活性：特異的ＰＫＣ活性は、適切な処理後のケラチン生成細胞培養物からの新鮮に調製した免疫沈殿物中で測定した。これらの溶解物は、ＮａＦを含まないＲＩＰＡ緩衝液中で調製した。活性は、ＳｉｇｍａＴＥＣＴタンパク質キナーゼＣアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州、米国）の使用により、製造業者の指示書に従って測定した。ＰＫＣα偽基質をこれらの研究における基質として使用した。
【０１９６】
細胞増殖：細胞増殖は、２４ウェルプレートにおいて、［３Ｈ］チミジンの取り込みによって測定した。細胞を、［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）で一晩パルスした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで５回洗浄し、５％ ＴＣＡを各ウェルに３０分間加えた。溶液を除去し、細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で可溶化した。細胞に取り込まれた標識されたチミジンを、Ｔｒｉｃａｒｂ液体シンチレーションカウンターの３Ｈウィンドウで計数した。
【０１９７】
Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプ活性：Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプ活性を、２ｍＭ ＲｂＣｌ及び２．５μＣｉの８６Ｒｂを含む、Ｋ＋を含まない１ｍｌのＰＢＳ中の全細胞による、８６Ｒｂのウアバイン感受性の取り込みの測定によって決定した。１５分後、Ｒｂ取り込みを培地の吸引除去によって終結させ、その後、細胞をＫ＋を含まない４℃の冷ＰＢＳ中で迅速に４回すすぎ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で可溶化した。ディッシュからの細胞を、シンチレーションバイアル中の３ｍｌ Ｈ２Ｏに加えた。サンプルを、Ｔｒｉｃａｒｂ液体シンチレーションカウンターの３Ｈウィンドウで計数した。Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプ活性に特異的に関連するＲｂ取り込みを、１０−４Ｍウアバインの存在下で蓄積したｃｐｍの、阻害剤の非存在下で測定した取り込みからの減算によって決定した。
【０１９８】
ＰＫＣイムノキナーゼアッセイ：精製及び標準化されたＰＫＣアイソザイムは、Ｐ．Ｂｌｕｍｂｅｒｇ博士（ＮＣＩ、ＮＩＨ、Ｕ．Ｓ．）及びＭａｒｃｅｌｌｏ Ｇ．Ｋａｚａｎｉｅｔｚ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から恵与された。初代ケラチン生成細胞を、５００μｌの１％ Ｔｒｉｔｏｎ溶解緩衝液（１×ＰＢＳ中の１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン及びロイペプチン、２μｇ／ｍｌ ペプスタチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００μＭ Ｎａ２ＶＯ４、１０ｍＭ ＮａＦ）中で収集した。溶解物を４℃で３０分間インキュベートし、１６，０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離した。上清を新鮮なチューブに移した。細胞溶解物の免疫沈殿を、５μｇ／サンプルの抗α６／ＧｏＨ３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）及び３０μｌ／サンプルのタンパク質Ａ／Ｇ−Ｐｌｕｓアガローススラリー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて４℃で一晩実行した。ビーズを、ＲＩＰＡ緩衝液で１回、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５で２回洗浄した。３５μｌの反応緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ２、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５）を各アッセイに加えた。各アッセイについて、ＤＭＳＯ又は１０ｍＭ ＴＰＡのいずれかを含む５．５μｌ／アッセイのリン脂質ベシクルの懸濁物を、標準化量の特異的ＰＫＣアイソザイムとともにスラリーに加えた。反応を、１０μｌ／アッセイの１２５ｍＭ ＡＴＰ（１．２５μＣｉ／アッセイ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えることによって開始し、３０℃で１０分間継続させた。次いで、ビーズをＲＩＰＡ緩衝液で２回洗浄した。３０μｌ／サンプルのタンパク質負荷色素（３×Ｌａｅｍｍｌｉ、５％ ＳＤＳ）を加え、サンプルをウォーターバス中で５分間煮沸した。タンパク質を、８．５％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｐｒｏｔｒａｎメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に転写し、オートラジオグラフィーによって可視化した。ヒストンのリン酸化及びＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を、ＰＫＣ活性のための対照として使用した。
【０１９９】
実験結果
（実施例１）
組換えアデノウイルスベクターを利用するＰＫＣアイソフォームの効果的な過剰発現
組換えβ−ガラクトシダーゼアデノウイルスを利用することによって、高い感染割合が達成され、培養されたケラチン生成細胞集団の９０％より多くが組換えタンパク質を発現した。組換えβ−ガラクトシダーゼアデノウイルス感染は、細胞の生存度又は細胞増殖に影響を与えなかった。さらに、β−ガラクトシダーゼ発現は培養の２週間まで持続され、次の実験における対照感染として使用した。組換えＰＫＣアデノウイルスが、タンパク質発現を誘導し、及びマウスケラチン生成細胞培養において正しく活性化される効率を調べた。図１におけるウェスタンブロッティングによって見られるように、組換えＰＫＣアデノウイルス構築物を用いる１時間感染の２４時間後、特異的ＰＫＣタンパク質発現の劇的な増加が、特異的アイソフォームの内因性の発現レベルよりも５倍から１０倍上で観察された。組換えタンパク質は、感染後早くも６時間で、感染したケラチン生成細胞培養物において検出可能であり、ピーク発現は２４時間までに得られた。タンパク質発現は、培養期間の全体を通して持続した（１４日まで）。
【０２００】
（実施例２）
過剰発現されたＰＫＣアイソフォームはＰＫＣアクチベーターによって活性化される
ＰＫＣアイソフォームの組換えタンパク質は、典型的にはＰＫＣアクチベーターに応答した。図２において見られるように、ブリオスタチン１を用いる処理は、ＰＫＣαタンパク質及びＰＫＣδタンパク質の膜画分へのトランスロケーションを誘導し、ＰＫＣη及びＰＫＣζのアイソフォームに対してはより低い効果を有した。このことは、内因性アイソフォームを用いて得られた結果と同様であり、これらのコファクター要求性から予測される通りである。
【０２０１】
（実施例３）
過剰発現されたＰＫＣアイソフォームはそれらのネイティブ型で活性である
感染後早くとも１８時間で、ＰＫＣキナーゼアッセイは、独特なＰＫＣアイソフォームの免疫沈殿物が、ＰＫＣアクチベーターによる刺激のさらなる必要性を伴うことなく、酵素的に活性であることを明らかにした（図３）。
【０２０２】
（実施例４）
特異的ＰＫＣアイソフォームの過剰発現は初代ケラチン生成細胞において独特な形態学的変化を誘導する
利用されたＰＫＣアデノウイルス構築物の各々は、初代ケラチン生成細胞において特異的形態学的変化を誘導した（図４）。非感染初代マウスケラチン生成細胞培養物及びβ−ガラクトシダーゼ感染細胞は、培養中に、増殖性の基底細胞の特徴に典型的である立方体形態を提示した。アイソフォーム特異性に関わりなく、ケラチン生成細胞を過剰発現するすべてのＰＫＣは、細胞の伸長及びニューロン様突出の出現を含む、ＰＫＣ活性化に典型的な形態学的変化を示した。しかし、ＰＫＣアイソフォームの各々１つは、ケラチン生成細胞形態に対して特徴的な効果を有した。ＰＫＣα感染は、典型的な平板化された形態を有する、ケラチン生成細胞の層状化を誘導した。対照的に、ＰＫＣηは、迅速な速度で増殖する基底細胞の形態学的特徴を提示する、細胞の濃密なクローンとして見られた（図４）。２つのアイソフォームは、細胞マトリックス並びに細胞−細胞結合をもたらすように見られた。ＰＫＣδ感染の１８〜４８時間後、細胞は、ニューロン様突出を有して、細長く且つ伸長して見られた。これに続いて、徐々に培養ディッシュからの細胞の喪失が起こり、これは培養期間の過程で漸次的に起こった。過剰発現ＰＫＣζケラチン生成細胞は、円形のケラチン生成細胞クラスターとして見られ、これは、培養ディッシュにゆるく結合しており、感染の数日後に次第に失われた。
【０２０３】
（実施例５）
感染した初代ケラチン生成細胞中の過剰発現ＰＫＣアイソフォームの独特の局在化
独特の形態学的変化は、免疫蛍光分析によって特徴付けられるような独特な細胞局在化と関連した。増殖しているケラチン生成細胞において、ＰＫＣα、ＰＫＣδ、及びＰＫＣζは、細胞質並びに原形質膜において発現された。内因性タンパク質発現と同様に、ＰＫＣηアイソフォームは、ケラチン生成細胞の核周辺領域に局在した（図５）。分布の劇的な変化がＰＫＣδ及びＰＫＣζに関連し、ここでは、細胞脱着に続いて、ＰＫＣアイソフォーム発現が、細胞膜に優先的に局在した（図５）。
【０２０４】
（実施例６）
ＰＫＣアイソフォームによるα６β４発現の調節
実験結果
増殖性基底層の基底表現型の特徴であるタンパク質を調節する、特異的ＰＫＣアイソフォームの能力を試験した。α６β４インテグリンの下方制御がケラチン生成細胞分化の間に起こる初期事象の１つであるので、種々のＰＫＣアイソフォームがα６β４インテグリン（基底層の半接着斑に特異的に局在するインテグリン）の発現を調節する能力を評価した。図６において提示されるイムノブロットにおいて見られることができるように、ＰＫＣδ及びＰＫＣζアイソフォームのみが、対照ケラチン生成細胞のα６β４インテグリンサブユニットレベルとの比較において、α６β４発現を下方制御することが可能であった。同時に、α３又はβ１インテグリンサブユニットレベルは減少しなかった。対照的に、一貫して、ＰＫＣαアイソフォームの過剰発現は、対照発現よりも２〜３倍上に増加したα６β４レベルを生じた（図６）。ＰＫＣηの過剰発現は、α６β４タンパク質発現に影響を与えなかった。いくつかの特徴が分化に対する細胞の関与に付随しており、これはα６β４タンパク質の下方制御に続き、増殖速度の減少、新規なケラチンの合成、細胞脱着、及び基底膜成分への接着の喪失が含まれる。ケラチン発現の変化は、異なるＰＫＣアイソフォームの過剰発現によっては観察されなかった。これには、基底の増殖しているケラチン生成細胞の特徴であるＫ５及びＫ１４の発現、並びに棘層分化の初期段階の特徴であるＫ１及びＫ１０の発現が含まれた。さらに、増殖速度が３Ｈ−チミジン取り込みによって分析された場合、α６β４発現と増殖能力の喪失の間の相関は存在しなかった。
【０２０５】
（実施例７）
過剰発現したＰＫＣη及びＰＫＣδはインビトロでケラチン生成細胞増殖を誘導する
ＰＫＣη及びＰＫＣδの過剰発現は、ケラチン生成細胞増殖を、対照レベルよりもそれぞれ５倍及び２倍、有意に誘導する（図７）。ＰＫＣζ及びＰＫＣαは細胞増殖に影響を与えなかった。
【０２０６】
（実施例８）
過剰発現したＰＫＣδ及びζはインビトロでケラチン生成細胞脱着を誘導する
ＰＫＣδ及びζが過剰発現したケラチン生成細胞の接着特性を研究した。対照ケラチン生成細胞と比較して、特異的マトリックスタンパク質（ラミニン１、ラミニン５、フィブロネクチン、及びコラーゲンを含む）への接着能力の変化は観察されなかった（データは示していない）。しかし、ＰＫＣδアイソフォーム及びＰＫＣζアイソフォームを過剰発現する細胞においては、培養ディッシュとの細胞接触の喪失が、培養ディッシュからの段階的なケラチン生成細胞脱着に付随した（図４）。
【０２０７】
（実施例９）
α６β４インテグリンの半接着斑局在に対するＰＫＣアイソフォームの過剰発現効果
α６β４発現は半接着斑接着複合体の形成のために必須であるので、半接着斑へのα６β４局在化とのα６β４下方制御及び細胞脱着の関連を試験した。図８は、半接着斑複合体とのα６β４結合の免疫蛍光分析を提示する。図８において見られるように、対照の感染したケラチン生成細胞と比較して、過剰発現しているＰＫＣαケラチン生成細胞におけるα６β４インテグリン発現の上方制御（図６）は、半接着斑複合体へのα６β４の組み込みの増加と関連する。ＰＫＣηを過剰発現する細胞はまた、半接着斑複合体とのα６β４インテグリンの結合を誘導するが、過剰発現しているＰＫＣα細胞において観察されるものよりも少なかった。予測されるように、ＰＫＣδ及びＰＫＣζを過剰発現するケラチン生成細胞におけるα６β４インテグリンの有意な下方制御が、細胞の半接着斑複合体とのα６β４の組み込みの減少に付随することを見い出した（図８）。これらの結果は、α６β４インテグリンが、細胞−マトリックス結合及びケラチン生成細胞が根底にある基底膜につながれることにおいて重要な役割を果たすことを示唆する。さらに、ＰＫＣδ及びζは、ケラチン生成細胞分化プロセスからの識別可能な経路において、α６β４下方制御を媒介し、ケラチン生成細胞の細胞脱着を開始する。最後に、ＰＫＣ媒介α６β４下方制御を関連付け、半接着斑α６β４組み込み及びケラチン生成細胞脱着への特異的形態学的変化を減少するために、培養期間の間に異なるＰＫＣアイソフォームを過剰発現する接着した細胞及び脱着した細胞の量の変化を追跡した。図９において、接着した細胞をＰＫＣアデノウイルス感染の２４時間後及び４８時間後に培養中で計数した。明瞭に観察することができるように、ＰＫＣδ及びＰＫＣζの両方はインビトロで細胞損失を誘導した。並行して、培養中での細胞の損失は、下層の培地に浮遊する培地の増加と相関した。これらの結果は、ＰＫＣδ及びＰＫＣζが、細胞の分化及び移動の初期段階と関連する脱着工程の制御のために重要であることを示す。
【０２０８】
（実施例１０）
ＰＫＣηは生理学的設定下でケラチン生成細胞の増殖及び分化を示差的に調節する
図７において明瞭に示されるように、ＰＫＣηアイソフォームを過剰発現する細胞は、対照の非感染細胞よりも５〜７倍上に加速した速度で増殖し、他のＰＫＣアイソフォームを過剰発現するケラチン生成細胞培養よりも一貫して高かった。しかし、増殖の誘導は培地中のＣａ２＋濃度を調節することによって決定されるような、ケラチン生成細胞の分化状態に依存した。低Ｃａ２＋濃度（０．０５ｍＭ）よりも下に維持されたケラチン生成細胞を増殖する際に、内因性ＰＫＣηは、増殖している細胞の大部分の核周辺領域に局在化した（図１０）。これらの条件下において、ＰＫＣηの過剰発現は、ケラチン生成細胞増殖に劇的な増加を誘導した（図１１）。しかし、ケラチン生成細胞がＣａ２＋濃度を０．１２ｍＭまで上昇させることによって分化された場合、ＰＫＣηの過剰発現は増殖を誘導しなかったが、ケラチン生成細胞分化をさらに刺激した。これらの結果は、過剰発現したＰＫＣηは生理学的に増殖している細胞においてのみ増殖を誘導するが、細胞分化に干渉しないことを示唆する。ＰＫＣη発現の調節の相違はまた、インビボにおいても見られた。活発に増殖している皮膚並びに胚のニューロン細胞におけるＰＫＣη発現が同定されたのに対して、成熟成体脳においては、ＰＫＣηは観察されず、表皮ＰＫＣηは皮膚の下流層に局在した。
【０２０９】
（実施例１１）
ＰＫＣη及びＤＮＰＫＣηの過剰発現は、ＰＫＣ局在化及び細胞形態を特異的に調節する
ケラチン生成細胞における増殖又は分化の両方の状態におけるＰＫＣηについてのポジティブな役割を支持する結果をさらに検証するために、キナーゼ不活性顕性不活性アデノウイルスＰＫＣη構築物の効果を、増殖しているケラチン生成細胞及び分化しているケラチン生成細胞における感染の効果を研究することによって分析した。図１２において見られるように、ＰＫＣη及びＤＮＰＫＣηの両方のアデノウイルス感染は、増殖状態及び分化状態の両方において効率的であった。予測されるように、増殖しているケラチン生成細胞において、ＤＮＰＫＣηは、Ｃａ２＋誘導性分化と関連する形態学的変化に類似する細胞形態の劇的な変化（細胞の平板化、細胞−細胞境界の喪失を含む）を伴うケラチン生成細胞分化を誘導した（図１２Ａ〜Ｂ）。さらに、これらの変化は、ケラチン生成細胞増殖の停止（図１１）及び分化マーカー（ケラチン１、ケラチン１０、ロリクリン、及びフィラグリンを含む）の劇的な誘導に付随し、これらは、インビボでの正常皮膚において提示されるのと同様のレベルまで上昇した（図１３Ａ〜Ｂ）。同時に、分化プログラムの開始に際して、ＤＮＰＫＣηの過剰発現はＣａ２＋誘導性分化を抑止しなかった。これらの結果は、ＰＫＣη及びＤＮＰＫＣηが、生理学的設定下で、ケラチン生成細胞の増殖及び分化を示差的に調節するために使用可能であることを示唆する。
【０２１０】
（実施例１２）
インビボ実験
ＰＫＣηがインビボで細胞の増殖及び分化を示差的に調節する能力を試験するために、ヌードマウスの背に作製した完全な切開性創傷の治癒をＰＫＣηが誘導する能力を評価した。外因性組換えタンパク質を発現するケラチン生成細胞の能力を、対照β−ｇａｌアデノウイルスを利用することによって確認した。図１４において見られることができるように、感染の２週間後、β−ｇａｌ発現は、インビトロケラチン生成細胞並びにインビボ皮膚で維持される。興味深いことに、創傷治癒プロセスが、対照、ＰＫＣα、及びＰＫＣηのアデノウイルス構築物を用いる局所的感染後にマウスにおいて試験されたときに、ＰＫＣηのみが、局所的感染の早くも４日後で顆粒組織の形成を誘導した。これはまた、筋肉、脂肪、及び真皮層の組織化された形成もまた含んだ。同時に、対照及びＰＫＣα感染皮膚において、濃密な顆粒組織は見い出されず、創傷の閉鎖は観察されなかった（図１４）。それゆえに、ＰＫＣηは、創傷治癒プロセスの誘導において皮膚の増殖及び分化を調節する第１の候補物質であると見なされることが可能である。
【０２１１】
（実施例１３）
インスリンは、増殖しているケラチン生成細胞におけるＰＫＣδのトランスロケーションを特異的に誘導する
皮膚において発現される２種のＰＫＣアイソフォームが、ケラチン生成細胞増殖に影響を与えることが見い出された：ＰＫＣη及びＰＫＣδである。皮膚分化を調節する特異的ＰＫＣアイソフォームを活性化する内因性因子に取り組み且つこれを同定するために、ケラチン生成細胞増殖を促進することが知られているいくつかの増殖因子（ＥＧＦ、ＫＧＦ、インスリン、ＰＤＧＦ、及びＩＧＦ１を含む）が増殖依存性の様式で特異的ＰＫＣアイソフォームを活性化する能力を評価した。ＰＫＣアイソフォームα、δ、ε、η、及びζは皮膚において発現される。ＰＫＣアイソフォームの活性化は膜画分へのそれらのトランスロケーションと関連するので、種々のＰＫＣアイソフォームの細胞質ゾルから膜へのトランスロケーションに対するこれらの増殖因子の効果を試験した。図１５において見られるように、刺激の早くも５分後に、インスリンは細胞質画分から膜画分へのＰＫＣδのトランスロケーションを特異的に誘導した。ＰＫＣδの膜発現は、インスリン刺激後数時間維持された。対照的に、ＩＧＦ１は、膜におけるＰＫＣδ発現を減少し、且つ細胞質画分におけるその発現の相対的レベルを増加した。他の増殖因子は、ＰＫＣδのトランスロケーション及び局在化に有意に影響を与えなかった。他のＰＫＣアイソフォームの分布の変化は、ＩＧＦ１及びインスリンを含むいずれの増殖因子による刺激後にも見られなかった。
【０２１２】
（実施例１４）
インスリンは、増殖しているケラチン生成細胞においてＰＫＣδの活性化を特異的に誘導する
ＰＫＣδのトランスロケーションが活性化のために十分であるか否かを決定するために、インスリン及びＩＧＦ１で処理したケラチン生成細胞の細胞質及び膜の画分からのＰＫＣ免疫沈殿物のキナーゼ活性を測定した。図１６に示されるように、インスリンは膜画分中のＰＫＣδの活性を増加したがＩＧＦ１は増加しなかった。ＰＫＣα活性の上昇は、細胞質画分においては観察されなかった。インスリン誘導性活性化はＰＫＣδに特異的であり、ＰＫＣα、ε、η、又はζの活性化は、インスリン刺激の３０分後まで観察されなかった。要するに、これらの結果は、インスリンによるがＩＧＦ１によらないＰＫＣδ活性化の選択的刺激を示唆する。
【０２１３】
（実施例１５）
インスリン及びＩＧＦ１はケラチン生成細胞増殖に対して相加的効果を有する
ＰＫＣδの特異的活性化が、ケラチン生成細胞における特異的インスリン誘導性の分裂促進的経路を意味するか否かを分析するために、インスリンとＩＧＦ１の両方の分裂促進的効果を、チミジン取り込みによって測定されるようなケラチン生成細胞増殖を誘導するそれらの能力を研究することによって試験した。図１７Ａにおいて示されるように、インスリンとＩＧＦ１の両方が、用量依存的な様式でチミジン取り込みを刺激し、それぞれ１０−７Ｍ及び１０−８Ｍで最大誘導が達成された。各濃度において、ＩＧＦ１による最大刺激はインスリンによるそれよりも高かった。興味深いことに、すべての濃度において、両方のホルモンを一緒に与えた場合、分裂促進的効果は相加的であった（図１７Ｂ）。これらの結果は、インスリンが、ＩＧＦ１誘導性のケラチン生成細胞増殖に非依存的な独特な経路を通してケラチン生成細胞増殖を調節することを示唆する。
【０２１４】
（実施例１６）
インスリン誘導性ＰＫＣδ活性化とインスリン誘導性ケラチン生成細胞増殖の間の関連性
インスリン誘導性ＰＫＣδ活性化とインスリン誘導性ケラチン生成細胞増殖の間の関連性を直接的に研究するために、組換えＰＫＣアデノウイルス構築物を使用して、野生型ＰＫＣδ（ＷＴＰＫＣδ）並びにＰＫＣのキナーゼ不活性顕性不活性変異体（これは内因性ＰＫＣδ活性を抑止する）（ＤＮＰＫＣδ）の両方を過剰発現させた。インスリン誘導性ケラチン生成細胞増殖に対する、ＷＴＰＫＣδ及びＤＮＰＫＣδの過剰発現の効果を試験した。両方の構築物、並びにＰＫＣα構築物は、ケラチン生成細胞において効率的に発現された（図１８Ａ）。さらに、ＰＫＣδ及びＰＫＣαを用いる感染は、対照レベルよりも数倍上のアイソフォーム特異的ＰＫＣ活性を誘導した（図１８Ｂ）。予測されるように、ＤＮＰＫＣδの過剰発現はＰＫＣ活性を誘導しなかった。図１９Ａにおいて見られることができるように、トランスフェクトされていない細胞のインスリン処理又はインスリン処理を伴わないＷＴＰＫＣδの過剰発現は、未処理細胞、又はＰＫＣαで形質導入された細胞よりも２〜３倍とほぼ同じレベルまでチミジン取り込みを増加した。さらに、すでにＷＴＰＫＣδを過剰発現している細胞へのインスリンの付加は、チミジン取り込みのさらなる増加を引き起こさなかった。ＩＧＦ１は、非感染細胞並びにＷＴＰＫＣδ及びＰＫＣαを過剰発現する細胞の両方において同様にチミジン取り込みを増加した（図１９Ａ）。インスリン誘導された増殖におけるＰＫＣδの直接的関与は、ＰＫＣδ活性を抑止することによって証明された。図１９Ｂにおいて見られるように、顕性不活性ＰＫＣδを過剰発現する細胞におけるベースのチミジン取り込みはわずかであるが有意であり、非感染細胞におけるそれよりも低かった。ＤＮＰＫＣδの過剰発現は、インスリン誘導性の増殖を完全に除去したが、ＩＧＦ１誘導性増殖に影響を与えなかった。さらに、インスリン及びＩＧＦ１の相加的効果は、ＩＧＦ１単独のそれまで減少した。
【０２１５】
（実施例１７）
ＰＫＣδ活性化のインスリン媒介経路への特異性
ＰＫＣδ活性化のインスリン媒介経路への特異性を、種々の増殖因子（ＩＧＦ１、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＥＣＧＦ、及びＰＤＧＦを含む）に対する分裂促進的応答へのＰＫＣδ及びＤＮＰＫＣδの効果を研究することによって分析した。図２０において見られるように、ＤＮＰＫＣδの過剰発現は、インスリンによって誘導される増殖性効果を選択的に除外したが、試験された他の増殖因子のいずれの効果もブロックしなかった。しかし、ＰＫＣδの過剰発現は、インスリン誘導性増殖を模倣し、ＩＧＦ１誘導性増殖に影響を与えなかった。ＥＧＦ及びＫＧＦを用いる刺激によって誘導される増殖は増加した（図２１）。これらのデータは、インスリンによるＰＫＣδ活性化が、ＰＫＣδを含む経路を通してケラチン生成細胞の増殖を媒介すること、及びこの経路が、ケラチン生成細胞増殖を調節することが知られている２つの主要な増殖因子であるＥＧＦ及びＫＧＦのシグナル伝達の上流にあることを示す。全体として、インスリンは、ＰＫＣδ活性の特異的レギュレーターであることが見い出され、この活性は、インスリン、ＥＧＦ、及びＫＧＦによって誘導されるケラチン生成細胞増殖を調節する際の特異的候補である可能性がある。
【０２１６】
（実施例１８）
インスリン誘導性ＰＫＣδ活性及びケラチン生成細胞増殖は、ＳＴＡＴ３転写活性化によって媒介される
インスリンシグナル伝達におけるＰＫＣδの役割をさらに特徴付けし、これがＳＴＡＴ３によって媒介される転写活性化の誘導を含むことを見い出した。図２３において見られるように、初代ケラチン生成細胞において、ＰＫＣδは、ＳＴＡＴ３と特異的に関連性があることが示された。インスリン刺激後、ＰＫＣδは活性化され、次には、ＳＴＡＴ３をリン酸化及び活性化する（図２４）。さらに、薬理学的阻害剤（ロットレリン）によるＰＫＣδ活性の抑止は、ＳＴＡＴ３の活性化並びに核トランスロケーションを阻害する。さらに、図２５において見られるように、ＳＴＡＴ３の過剰発現は、インスリンによって、及びＰＫＣδの過剰発現によって誘導されるのと同様の増殖を誘導し、顕性不活性ＰＫＣδ変異体の過剰発現によるＰＫＣδ活性の抑止は、ＳＴＡＴ３がケラチン生成細胞増殖を誘導する能力を消滅させる。全体として、これらの結果は、インスリン及びＰＫＣδが、ケラチン生成細胞増殖と関連した転写活性化において役割を果たすことを示唆する。
【０２１７】
（実施例１９）
ＰＫＣδ及びＰＫＣζはインビボでの創傷治癒プロセスに必須である
インビボでの創傷治癒プロセスにおけるＰＫＣアイソフォームの重要性は、アイソフォーム特異的無ＰＫＣマウスを利用して確立された。図２２Ａ〜Ｂにおいて見られるように、全層創傷が、無ＰＫＣδマウス、無ＰＫＣζマウス、無ＰＫＣαマウス（ノックアウト、ＫＯ）及びそれらの野生型同腹仔の背において作製されたときに、創傷治癒の遅延が無ＰＫＣδマウス及び無ＰＫＣζマウスにおいて観察されたが、無ＰＫＣαマウスにおいては観察されなかった。このデータは、糖尿病バックグラウンドの非存在下においてさえ、特異的ＰＫＣアイソフォームが皮膚における創傷治癒プロセスのために必須であることを示す。
【０２１８】
（実施例２０）
インビボでの創傷治癒のためのインスリンの単回対複数回塗布
創傷を切開により８〜１０週齢のＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、以下のように処置した：（ｉ）インスリン０．１μＭ、７日間毎日塗布；（ｉｉ）インスリン１μＭ、７日間毎日塗布；（ｉｉｉ）インスリン１０μＭ、７日間毎日塗布；（ｉｖ）インスリン１μＭ、創傷形成の４日後に１回塗布；及び（ｖ）媒体（ＰＢＳ）対照、７日間毎日塗布。すべてのマウスを創傷形成の７日後に屠殺し、それらの開いた創傷領域を測定した。図２６に見られるように、１μＭ濃度におけるインスリンの毎日の処置は、より低濃度（０．１μＭ）又はより高濃度（１０μＭ）でのインスリンの毎日の処置よりも有意に効果的であった。驚くべきことに、１μＭ濃度におけるインスリンの単回塗布の処置は、同じ濃度のインスリンの７回の日々の反復塗布の処置よりも実質的に有効であった。
【０２１９】
観察された創傷は瘢痕組織で覆われていたので、創傷の実際の閉鎖及び再構築した表皮の形成を正確に評価することが困難であった。それゆえに、創傷組織の表皮及び真皮の閉鎖に対するインスリンの効果を、組織学的パラメーターによって決定した。創傷の表皮閉鎖を、創傷ギャップにおける基底細胞の形成を強調する、ケラチン１４抗体（Ｋ１４、Ｂａｂｃｏ−Ｃｏｎｖａｎｃｅ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州、米国）を用いて創傷切片を染色することによって決定した。創傷の真皮閉鎖を、×１００拡大における光学顕微鏡下で観察される単一の視野において、真皮が両方の創傷の側で観察可能である場合に、ポジティブであると見なした。
【０２２０】
図２７において見られるように、すべてのインスリン処置は、表皮及び真皮の閉鎖を効果的に促進した。図２６において示される結果と同様に、１μＭ濃度でのインスリンの日々の処置は、０．１μＭ又は１０μＭの濃度でのインスリンの日々の処置よりも有意に効果的であった。さらに、１μＭ濃度におけるインスリンの単回塗布は、同じ濃度におけるインスリンの１日に７回の反復塗布の効果よりも実質的に有効であった。
【０２２１】
したがって、これらの結果は、形態学的並びに組織学的なパラメーターによって決定されるように、インビボでの創傷治癒に対するインスリンの治療的効力を明確に立証する。これらの結果は、驚くべきことに、インスリンの最適な塗布の回数及び／又は頻度を決定することが、適切に創傷を治療するための決定的な工程であることを示す。
【０２２２】
（実施例２１）
インビボでの創傷治癒のためのインスリン及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）の組み合わせ
創傷を切開により８〜１０週齢のＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、創傷形成の４日後に以下のように処置した：（ｉ）媒体（ＰＢＳ）対照；（ｉｉ）インスリン １μＭ；（ｉｉｉ）ＰＤＧＦ−ＢＢ １０μＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、米国）；及び（ｉｖ）インスリン １μＭ＋ＰＤＧＦ−ＢＢ １０μＭ。処置の３日後にすべてのマウスを屠殺し、処置した創傷を、例えば、上記の実施例２０に記載されるように、表皮閉鎖及び真皮閉鎖について組織学的に分析した。
【０２２３】
図２８において見られるように、インスリン又はＰＤＧＦ−ＢＢいずれか単独を用いる処置は、表皮閉鎖に対して（対照よりも３０〜４０％の増加）及び真皮閉鎖に対して（対照よりも１０〜２０％の増加）部分的に有効であった。しかし、インスリン及びＰＤＧＦ−ＢＢを組み合わせた処置は、実質的により高い表皮閉鎖（対照よりも約８０％増加）並びに真皮閉鎖（約６０％増加）を生じた。したがって、これらの結果は、インスリン及びＰＤＧＦ−ＢＢの組み合わせが相乗的な様式で創傷治癒に影響を与えることを示す。これらの結果はさらに、創傷の治療的処置のために、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＫＧＦなどの他の増殖因子又はトランスフォーミング因子とインスリンを組み合わせることの潜在能力を示す。
【０２２４】
（実施例２２）
インビボでの創傷治癒のためのインスリン及びＰＫＣα阻害剤の組み合わせ
創傷を切開により８〜１０週齢のＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、媒体（ＰＢＳ）対照、又はＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２；ＰＫＣα偽基質、ミリストイル化；Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ、サンジエゴ、カリフォルニア州、米国と組み合わせた、０．６７μＭ インスリン（ＨＯ／０１；Ｈｕｍｕｌｉｎ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、米国）のいずれかを用いて７日間毎日処置した。創傷形成の７日後、すべてのマウスを屠殺し、処置された創傷を、創傷閉鎖、表皮閉鎖、真皮閉鎖、及び表皮細胞の空間的分化について分析した。創傷閉鎖を、開いた創傷領域を測定することによって決定した。創傷の真皮閉鎖は、両方の創傷の側において真皮が×１００倍率における光学顕微鏡下で観察される単一の視野において観察可能である場合にポジティブであると見なした。創傷の表皮閉鎖は、創傷ギャップにおける基底細胞の形成を強調するＫ１４抗体を用いて創傷切片を染色することによって決定した。表皮細胞の空間的分化は、新規に形成された表皮細胞を強調するＫ１抗体を用いて創傷切片を染色することによって決定した。
【０２２５】
図２８〜３２に図示されるように、インスリン（ＨＯ／０１）及びＰＫＣα阻害剤（ＨＯ／０２）の組み合わせ塗布は、創傷閉鎖（図２９Ａ〜Ｂ）、真皮閉鎖（図３０）、表皮閉鎖（図３１）、及び表皮細胞の空間的分化（図３２）を実質的に促進した。図３３において見ることが可能であるように、ＰＫＣα阻害剤ＨＯ／０２と組み合わせたインスリンＨＯ／０１の処置は、それぞれ、媒体対照と比較して、約１５〜７０％表皮閉鎖を増加し、約１５〜５０％真皮閉鎖を増加し、約１５〜５０％表皮細胞の空間的分化を増加した。
【０２２６】
したがって、これらの結果は、ＰＫＣα阻害剤と組み合わせたインスリンによる創傷の治療的処置は、表皮閉鎖、真皮閉鎖、表皮細胞の空間的分化、及び引き続く創傷治癒を効果的に促進した。
【０２２７】
（実施例２３）
インスリン及びＰＫＣα阻害剤の組み合わせは、インスリンのみの処置によって引き起こされる有害な副作用を回避する
創傷を切開により８〜１０週齢のＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、媒体（ＰＢＳ）対照、又は１μＭ インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、米国）若しくは１μＭ ＰＫＣα偽基質（Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ、サンジエゴ、カリフォルニア州、米国）と組み合わせた１μＭ インスリンの混合物のいずれかを用いて７日間毎日処置した。創傷形成の７日後、すべてのマウスを屠殺し、処置された創傷を、表皮の増殖能力（ＰＣＮＡ）、血管形成、炎症、表皮細胞、及び創傷ギャップにおける再構築プロセスについて組織学的に分析した。
【０２２８】
以下の表１において見られることができるように、インスリンのみの処置は、緩衝液対照と比較した場合に、創傷領域において異常な血管形成の発生の実質的な増加を引き起こした（それぞれ、６０％及び２５％）。創傷治癒プロセスは迅速に増殖する表皮細胞を含むので、このような増加した血管形成はまた、癌の発生を開始するリスクを増加させるかもしれない。他方、インスリンがＰＫＣα阻害剤と組み合わせられた場合には、処置した創傷領域において血管形成は観察されなかった。
【表１】
【０２２９】
さらに、インスリンのみの処置は炎症の増加、表皮細胞の過形成、表皮細胞の棘層の分化の遅れ、及び瘢痕の増加を生じた。インスリンのみの処置から生じた有害な副作用は、ＰＫＣα阻害剤がインスリンと組み合わされた場合にはいずれも観察されなかった。
【０２３０】
（実施例２４）
ＰＫＣα阻害剤は創傷炎症を減少する
創傷における後期で且つ重篤な炎症性応答は治癒のプロセスを抑制する可能性があり、したがって、このような炎症を発生から防ぐことは、創傷治癒プロセスを促進するかもしれない。したがって、創傷炎症に対するＰＫＣα阻害剤及びインスリンの効果を、以下の実験において試験した。
【０２３１】
創傷を切開によりＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、以下を用いて７日間毎日処置した：（ｉ）ＰＢＳ、対照；（ｉｉ）１μＭ ＰＫＣα阻害剤（偽基質、ミリストイル化；Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ、米国）；（ｉｉｉ）１μＭ インスリン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、米国）；又は１μＭ ＰＫＣα阻害剤及び１μＭ インスリンの混合物。創傷形成の７日後、すべてのマウスを屠殺し、処置された創傷を炎症について顕微鏡下で観察した。創傷領域中で観察された重篤な炎症の得られる発生率は、以下に続く表１ａにおいて要約される。
【表２】
【０２３２】
これらの結果は、創傷へのＰＫＣα阻害剤の投与が、対照と比較して、重篤な創傷炎症の発生率の実質的な減少（３３．３％）を引き起こすことを示す。インスリン単独では、これらの実験条件下では抗炎症性効果を有さなかった。
【０２３３】
これらの結果は、ＰＫＣα阻害剤が、創傷の重篤な炎症を制御するために治療において使用可能であることを示す。ＰＫＣα阻害剤が炎症を減少させる実証された能力は、表皮閉鎖、真皮閉鎖、及び表皮細胞の空間的分化を促進するその能力と結び付けられて（本明細書中上記の実施例２２を参照のこと）、これを創傷治癒のために潜在的に最も有効な治療剤にする。
【０２３４】
（実施例２５）
インビトロでの創傷閉鎖を加速することに対する、真皮細胞における特異的ＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節すること、並びに細胞に種々の薬剤を投与することの組み合わせ効果
材料及び方法
試薬：Ｄ因子（アディプシン）ヒト、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州、米国；組換えＴＮＦα マウス、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス 米国；ＧＷ９６６２、Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ、米国；タンパク質キナーゼＣα偽基質阻害剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州、米国；タンパク質キナーゼＣζ偽基質阻害剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州、米国；タンパク質キナーゼＣη偽基質阻害剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州、米国；ＰＤＧＦ−ＢＢ、Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル；ＩＬ−６、Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル；ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル、ＩＧＦ−１、Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル；ＴＧＦβ２、Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル；上皮増殖因子（ＥＧＦ）、マウス、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州、米国；ＰＫＣδ ＲＡＣＫ、ＡｎａＳｐｅｃ、カリフォルニア州、米国；ロジグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎ）、ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ、カリフォルニア州、米国；アディポネクチン、ＭＢＬ、マサチューセッツ州、米国及びコパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）（登録商標）、ＴＥＶＡ、イスラエル。
【０２３５】
インビトロ創傷閉鎖アッセイ：ケラチン生成細胞及び線維芽細胞（真皮細胞）をペトリ皿（内径５ｃｍ）で５日間培養し、次いで人工的な交差型の擦過傷を、２００μｌピペットチップを使用して各ペトリ皿において形成した。培養した細胞を、特異的ＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節可能なアデノウイルス構築物で感染させた。したがって、野生型（ＷＴ）ＰＫＣアデノウイルス構築物は特異的ＰＫＣを活性化するために使用したのに対して、顕性不活性（ＤＮ）ＰＫＣアデノウイルス構築物は、特異的ＰＫＣを阻害するために使用した。培養細胞は、以下の薬剤の１つをさらに供給された：インスリン（６．７×１０−７Ｍ）、アディポネクチン（１μｇ／ディッシュ）、アディプシン（２μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１μｇ／ディッシュ）、ＧＷ９６６２（１μｇ／ディッシュ）、ＫＧＦ（１μｇ／ディッシュ）、ＴＮＦα（１２μｇ／ｍｌ）、ＴＧＦβ、ロジグリタゾン、ＳＲＣ阻害剤、ＰＫＣδ ＲＡＣＫ（１０−７Ｍ）、及びＰＫＣα偽基質阻害ペプチド（１０７Ｍ）。得られる創傷治癒レベルは、０（閉鎖なし）〜１０（完全な閉鎖）までの範囲の指標値を使用して、処置の２４〜４８時間後に決定した。
【０２３６】
結果：
インビトロでの線維芽細胞創傷閉鎖に対する組み合わせ治療の効果は、以下の表２ａ〜ｂ及び表３ａ〜ｂに要約されている。これらの結果は、線維芽細胞におけるＰＫＣαの発現及び／又は活性の阻害が、細胞へのアディプシン又はインスリンの投与と組み合わせた場合に、創傷閉鎖を実質的に促進することを示す（それぞれ、１０及び８の創傷閉鎖指標値）。創傷閉鎖はまた、線維芽細胞におけるＰＫＣηの阻害、ＰＫＣεの阻害、ＰＫＣδの活性化、又はＰＫＣζの活性化と組み合わせたＰＫＣαの阻害によって加速された（それぞれ、９、９、９、及び７の創傷閉鎖指標値；図３４Ａ〜Ｅ）。さらに、創傷閉鎖は、細胞へのＫＦＧの投与と組み合わせた、線維芽細胞中でのＰＫＣζの阻害によって促進された（７の創傷閉鎖指標値；図３６）。さらに加えて、創傷閉鎖は、インスリン、ＩＬ−６、ＫＧＦ、又はＧＷ９６６２の投与と組み合わせた、線維芽細胞におけるＰＫＣβの阻害によって加速された（それぞれ、８、７、９、及び８の創傷閉鎖指標値；図３８Ａ〜Ｅ）。
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【０２３７】
インビトロでのケラチン生成細胞創傷閉鎖に対する組み合わせ処置の効果を以下の表４ａ〜ｂ及び表５ａ〜ｂに要約する。これらの結果は、ケラチン生成細胞におけるＰＫＣαの発現及び／又は活性の阻害が、細胞へのＫＧＦ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、又はＰＫＣδ ＲＡＣＫペプチドの投与と組み合わせた場合に、創傷閉鎖を実質的に促進したことを示す（それぞれ６、８、１０、及び８の創傷閉鎖指標値；図３５Ａ〜Ｃ及びＧ）。創傷閉鎖はまた、細胞中のＰＫＣη、ＰＫＣε、又はＰＫＣζの刺激と組み合わせて、ケラチン生成細胞中のＰＫＣαの阻害によって増強された（それぞれ、１０、９、及び６の創傷閉鎖指標値；図３５Ａ、Ｄ〜Ｆ及びＨ）。さらに、創傷閉鎖は、細胞へのＩＬ−６、ＴＮＦα、又はアディポネクチンの投与と組み合わせた、ケラチン生成細胞におけるＰＫＣζの阻害によって促進された（それぞれ９、９、及び７の創傷閉鎖指標値；図３７Ａ〜Ｄ）。さらに加えて、創傷閉鎖は、細胞中でＰＫＣεを活性化すること、ＰＫＣζを活性化すること、若しくはＰＫＣαを阻害することと組み合わせた、ケラチン生成細胞におけるＰＫＣδ活性及び／若しくは発現の促進によって、又は細胞へのアディプシンの投与によって加速された（それぞれ７、８、８、及び８の創傷閉鎖指標値；図３９Ａ〜Ｅ）。
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【０２３８】
したがって、これらの結果は、創傷閉鎖が、ＩＬ−６、ＫＧＦ、ＴＮＦαなどの増殖因子、インスリンなどのホルモン、アディプシン若しくはアディポネクチンなどのアディポカイン、ＰＫＣδ ＲＡＣＫ及び／又はＧＷ９６６２を細胞に投与することと組み合わせた場合に、創傷領域にコロニー形成した真皮細胞及び表皮細胞中での特異的ＰＫＣアイソフォームの発現及び／又は活性を調節することによって実質的に加速可能であることを示す。
【０２３９】
（実施例２６）
インビトロ及びインビボでの創傷治癒のためのコポリマー１の投与
材料及び方法
コポリマー１：コポリマー１（酢酸ガラティラメル）は、多発性硬化症を治療するために臨床的に使用されている薬物コパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）（登録商標）（Ｔｅｖａ、イスラエル）の活性成分である。コポリマー１は、ミエリン鞘の天然成分であるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の合成ポリペプチドアナログである。化学的には、コポリマー１は、Ｌ−アラニン、Ｌ−リジン、及びＬ−チロシンを有するＬ−グルタミン酸ポリマー、酢酸（塩）と呼ばれる。その構造式は：（Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ）ｘ．ＸＣＨ３ＣＯＯＨ（Ｃ５Ｈ９ＮＯ４・Ｃ３Ｈ７ＮＯ２・Ｃ６Ｈ１４Ｎ２Ｏ２・Ｃ９Ｈ１１ＮＯ３）ｘ・ｘＣ２Ｈ４Ｏ２である。酢酸ガラティラメルの平均分子量は４，７００〜１１，０００ダルトンである。これは、２３，０００ダルトンの平均分子量を有する生成物を形成する４種のアミノ酸を化学的に重合することによって合成される（米国特許第３，８４９，５５０号）。
【０２４０】
インビトロアッセイ：アッセイを、本質的に本明細書中上記の実施例２４に記載されるように実行した。コポリマー１は５５μｇ／ディッシュの濃度で、単独で、又はＰＫＣα偽基質（１μＭ）及び／若しくはインスリン（１μＭ）と組み合わせて、培養したケラチン生成細胞に供給した。得られる創傷閉鎖レベルを、処置の４８時間後に、０（閉鎖なし）〜１０（完全な閉鎖）までの範囲の指標値を使用して決定した。
【０２４１】
インビボアッセイ：創傷を切開（２０ｍｍ）によりＣ５７ＢＬマウスの背に作製し、以下のように創傷形成の４日後に処置した：（ｉ）媒体（ＰＢＳ）対照；（ｉｉ）コポリマー１（５５μｇ／ｍｌ）；（ｉｉｉ）コポリマー１（５５μｇ／ｍｌ）及びインスリン（１μＭ）の混合物；（ｉｖ）ＰＫＣα偽基質阻害ペプチド（１μＭ）及びインスリン（１μＭ）の混合物；並びに（ｖ）コポリマー１（５５μｇ／ｍｌ）、ＰＫＣα偽基質阻害ペプチド（１μＭ）、及びインスリン（１μＭ）の混合物。創傷を、（ｉ）創傷閉鎖、（ｉｉ）痂皮形成、及び（ｉｉｉ）創傷の出血／滲出について形態学的に評価した。
【０２４２】
結果：
インビトロアッセイ：培養したケラチン生成細胞へのコポリマー１の投与は、０（閉鎖なし）〜１０（完全な閉鎖）までのスケール上で８の指標値にインビトロ創傷の閉鎖を促進した。ＰＫＣα偽基質阻害ペプチド、又はＰＫＣα偽基質及びインスリンの混合物とのコポリマー１の組み合わせは、同様の効果を生じた（それぞれ、８及び９の創傷閉鎖指標値；図４０Ａ〜Ｆ）。したがって、これらの結果は、コポリマー１それ自体が、インビトロでの創傷閉鎖を実質的に加速可能であることを示す。
【０２４３】
インビボアッセイ：コポリマー１を、単独で又はインスリン及び／若しくはＰＫＣα偽基質と組み合わせて、切開創傷に投与することは、未処置対照と比較して、創傷ギャップを実質的に減少させ、創傷中の痂皮形成を加速した。さらに、コポリマー１を用いるすべての処置は、創傷領域における出血及び滲出を効果的に予防した。
【０２４４】
したがって、これらの結果は、有効量のコポリマー１を、単独で又はインスリン及び／若しくはＰＫＣα偽基質阻害ペプチドと組み合わせて、創傷組織に投与することは、創傷治癒プロセスを実質的に加速可能であることを示す。
【０２４５】
（実施例２７）
創傷治癒プロセスに対する胸腺分泌物質の影響
材料及び方法：
創傷切開を、正常成体齧歯類又はＳＴＺ糖尿病マウスの上背（首の近く）で実行した。これらの動物を処置の７日後又は９日後に屠殺し、創傷を、上記の実施例２０において記載されるような染色手順を使用して、創傷領域に近接した胸腺の存在について、並びに創傷の表皮及び真皮の閉鎖について、組織学的に分析した。
【０２４６】
結果：
図４２Ａ〜Ｈにおいて見られることができるように、創傷ギャップに密接に近接した胸腺の存在は、表皮形成の加速、組織の顆粒化、及び創傷中の真皮収縮と相関した。これらの観察は、胸腺分泌物質が創傷の治癒プロセスに効果的に寄与するかもしれないことを示す。したがって、サイモシン、β−サイモシン（例えば、サイモシンβ４、サイモシンβ１０、サイモシンβ９、サイモシンβ１２、サイモシンβ１４）、αサイモシン（例えば、サイモシンα、１／ゼダキシン、プロサイモシンα、パラサイモシンα）、サイムリン、ＩＧＦＩ、ＩＧＦＩＩ、ＮＧＦ、ソマトスタチン、サイログロブリン、副甲状腺ホルモン、及び／又は胸腺ホルモンペプチド（ＴＨＰ）などの胸腺由来物質は、創傷の治癒プロセスを加速するための処置において使用されてもよい。
【０２４７】
別々の実施形態の状況において、明瞭化のために記載される本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態における組み合わせで提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態の状況において記載される種々の本発明の特徴は、別々に、又は任意の適切な小さな組み合わせ（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）でもまた提供されてもよい。
【０２４８】
本発明をその特定の実施形態と併せて記載してきたが、多くの代替、改変、及び変形が当業者には明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神及び広い範囲内にある、すべてのこのような代替、改変、及び変形を含めるものとする。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に援用され、個々の刊行物、特許、特許出願が、具体的且つ個別に引用されて、参照により本明細書に援用される。さらに、本願におけるいかなる参考文献の引用及び同定も、このような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認と解釈されるべきではない。
【０２４９】
（参考文献）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のＰＫＣアイソフォームの発現および／または活性を調節することができる物質および少なくとも１種のさらなる作用物質の、損傷した皮膚または皮膚創傷の治癒プロセスを誘導または促進するための局所適用用薬剤組成物を製造するための使用であって、該ＰＫＣアイソフォームがＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣηまたはＰＫＣζであり、該作用物質がインスリン、増殖因子、アディポカイン、ＰＫＣδＲＡＣＫおよびＧＷ９６６２からなる群から選ばれる、上記使用。
【請求項２】
該増殖因子が、ＩＬ−６、ＫＦＧまたはＴＮＦαであり、該アディポカインがアディプシンまたはアディポネクチンである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該物質が、ＰＫＣアイソフォーム抑制物質である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＰＫＣアイソフォーム抑制物質がＰＫＣα抑制物質、好ましくはＮ−ミリストイル化ＰＫＣα偽基質ペプチドである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ＰＫＣアイソフォーム抑制物質がＰＫＣη抑制物質、好ましくは、Ｎ−ミリストイル化ＰＫＣη偽基質ペプチド、または、ＰＫＣζ抑制物質、好ましくは、Ｎ−ミリストイル化ＰＫＣζ偽基質ペプチドである、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
該物質がＮ−ミリストイル化ＰＫＣα偽基質ペプチドであり、該作用物質がインスリンである、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
該物質がＰＫＣアイソフォーム活性化物質、好ましくは、インスリンまたはＰＫＣδＲＡＣＫから選ばれるＰＫＣδ活性化物質である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
皮膚創傷が、潰瘍、糖尿病関連の創傷、熱傷、日焼け、加齢による皮膚創傷、角膜潰瘍化による創傷、炎症性消化管疾患による創傷、腸炎症性疾患による創傷、クローン病による創傷、潰瘍性大腸炎、痔核、表皮水疱症による創傷、皮膚水疱形成性創傷、乾癬による創傷、動物の皮膚の創傷、動物の糖尿病による創傷、網膜症による創傷、口腔の創傷（粘膜炎）、膣粘膜炎による創傷、歯周病による創傷、裂傷、外科的切除による創傷、および外科的接着後の創傷からなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
潰瘍が、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、胃潰瘍、およびＨＩＶ関連潰瘍からなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
薬剤組成物が、水溶液剤、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、噴霧剤、懸濁液剤、粉末剤、分散液剤、膏薬、および軟膏剤からなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
薬剤組成物が固体支持体を含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
損傷した皮膚または皮膚創傷の治癒プロセスを誘導または促進するための局所適用用薬剤組成物であって、少なくとも１種のＰＫＣアイソフォームの発現および／または活性を調節することができる物質および少なくとも１種のさらなる作用物質の治療有効量を含み、該ＰＫＣアイソフォームがＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣηまたはＰＫＣ−ζであり、該作用物質がインスリン、増殖因子、アディポカイン、ＰＫＣδＲＡＣＫおよびＧＷ９６６２からなる群から選ばれる、上記薬剤組成物。
【請求項１】
少なくとも１種のＰＫＣアイソフォームの発現および／または活性を調節することができる物質および少なくとも１種のさらなる作用物質の、損傷した皮膚または皮膚創傷の治癒プロセスを誘導または促進するための局所適用用薬剤組成物を製造するための使用であって、該ＰＫＣアイソフォームがＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣηまたはＰＫＣζであり、該作用物質がインスリン、増殖因子、アディポカイン、ＰＫＣδＲＡＣＫおよびＧＷ９６６２からなる群から選ばれる、上記使用。
【請求項２】
該増殖因子が、ＩＬ−６、ＫＦＧまたはＴＮＦαであり、該アディポカインがアディプシンまたはアディポネクチンである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該物質が、ＰＫＣアイソフォーム抑制物質である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＰＫＣアイソフォーム抑制物質がＰＫＣα抑制物質、好ましくはＮ−ミリストイル化ＰＫＣα偽基質ペプチドである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ＰＫＣアイソフォーム抑制物質がＰＫＣη抑制物質、好ましくは、Ｎ−ミリストイル化ＰＫＣη偽基質ペプチド、または、ＰＫＣζ抑制物質、好ましくは、Ｎ−ミリストイル化ＰＫＣζ偽基質ペプチドである、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
該物質がＮ−ミリストイル化ＰＫＣα偽基質ペプチドであり、該作用物質がインスリンである、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
該物質がＰＫＣアイソフォーム活性化物質、好ましくは、インスリンまたはＰＫＣδＲＡＣＫから選ばれるＰＫＣδ活性化物質である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
皮膚創傷が、潰瘍、糖尿病関連の創傷、熱傷、日焼け、加齢による皮膚創傷、角膜潰瘍化による創傷、炎症性消化管疾患による創傷、腸炎症性疾患による創傷、クローン病による創傷、潰瘍性大腸炎、痔核、表皮水疱症による創傷、皮膚水疱形成性創傷、乾癬による創傷、動物の皮膚の創傷、動物の糖尿病による創傷、網膜症による創傷、口腔の創傷（粘膜炎）、膣粘膜炎による創傷、歯周病による創傷、裂傷、外科的切除による創傷、および外科的接着後の創傷からなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
潰瘍が、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、胃潰瘍、およびＨＩＶ関連潰瘍からなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
薬剤組成物が、水溶液剤、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、噴霧剤、懸濁液剤、粉末剤、分散液剤、膏薬、および軟膏剤からなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
薬剤組成物が固体支持体を含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
損傷した皮膚または皮膚創傷の治癒プロセスを誘導または促進するための局所適用用薬剤組成物であって、少なくとも１種のＰＫＣアイソフォームの発現および／または活性を調節することができる物質および少なくとも１種のさらなる作用物質の治療有効量を含み、該ＰＫＣアイソフォームがＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣηまたはＰＫＣ−ζであり、該作用物質がインスリン、増殖因子、アディポカイン、ＰＫＣδＲＡＣＫおよびＧＷ９６６２からなる群から選ばれる、上記薬剤組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１Ａ】
【図４１Ｂ】
【図４１Ｃ】
【図４１Ｄ】
【図４２Ａ】
【図４２Ｂ】
【図４２Ｃ】
【図４２Ｄ】
【図４２Ｅ】
【図４２Ｆ】
【図４２Ｇ】
【図４２Ｈ】
【図４３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１Ａ】
【図４１Ｂ】
【図４１Ｃ】
【図４１Ｄ】
【図４２Ａ】
【図４２Ｂ】
【図４２Ｃ】
【図４２Ｄ】
【図４２Ｅ】
【図４２Ｆ】
【図４２Ｇ】
【図４２Ｈ】
【図４３】
【公開番号】特開２０１１−５７７１０（Ｐ２０１１−５７７１０Ａ）
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８５８０９（Ｐ２０１０−２８５８０９）
【出願日】平成２２年１２月２２日（２０１０．１２．２２）
【分割の表示】特願２００６−５２０１０４（Ｐ２００６−５２０１０４）の分割
【原出願日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０４１６４２０６）バーイラン ユニバーシティー (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２２日（２０１０．１２．２２）
【分割の表示】特願２００６−５２０１０４（Ｐ２００６−５２０１０４）の分割
【原出願日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０４１６４２０６）バーイラン ユニバーシティー (7)
【Ｆターム（参考）】
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