動物飼料用添加剤
【課題】健康動物体重増加率を改良しえる動物飼料添加用組合せ化合物の提供、コクシジウム症または壊死性腸炎等の細菌感染の予防および／または治療用薬剤の製造への前記化合物の使用の提供、動物体重増加率を低下させるアイメリア感染の危険を防止する、動物飼料用の組合せ添加物の提供を目的とする。
【解決手段】プロテアーゼ及びベタインから成るアイメリア感染動物における体重増加促進用飼料添加物、当該飼料添加物から成る動物飼料および当該飼料添加物から成る動物アイメリア感染治療または予防のための薬剤。
【解決手段】プロテアーゼ及びベタインから成るアイメリア感染動物における体重増加促進用飼料添加物、当該飼料添加物から成る動物飼料および当該飼料添加物から成る動物アイメリア感染治療または予防のための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物飼料用添加剤に関し、より詳しくは、飼料への添加により、動物体重増加率を改良する添加剤に関する。更に、本発明は、コクシジウム症および／または細菌感染、並びに壊死性腸炎を起こす疾病等の治療および／または予防に有用な添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の異なるタイプの動物の飼育畜産は、ヒト消費用食料生産のため、世界的に重要である。これら動物は、飼育中に、アイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）、キャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ：グラム陰性桿菌）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サルモネラ、Ｅ．ｃｏｌｉ及びリステリア等の種々の感染性細菌および寄生生物と接触する。
【０００３】
コクシジウム症は、集中的に飼育される家畜、特に家禽類における疾病の共通原因となる。コクシジウム症は、アピコンプレサ亜門の原生動物、単細胞寄生生物により起こされる。家畜に疾病を起こす多くの種は、アイメリア属に属する。これら寄生生物は、腸上皮内で増殖する。鶏では、アイメリアの７種が、確認されており、この内５種が、病原性を有すると考えられる。具体的には、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ及びＥ．ｂｒｕｎｅｔｔｉが含まれる。
【０００４】
コクシジウムは、遍在性生物であり、一般に、養鶏地区の風土性を有する。疾病の症状は、重大感染から微感染まで種々存在する。多くの寄生原生動物と同様、アイメリアのライフサイクルは、比較的複雑であり、鶏腸内で有性および無性増殖する。この寄生生物の増殖および発育の工程中に、宿主組織が、破壊され、コクシジウム症発病で観測される種々の疾病に至る。生産および分泌されるオーシスト（接合子嚢）は、宿主の外部で更に発育し、他の鶏に感染する。実際、オーシストは、宿主外で長期間生存し、当初の感染宿主を取除いた後も、他の鳥類に感染可能である。これらオーシストは、ヒト、ペット、昆虫、齧歯類、ダスト及び他の鳥類等の他の要因により群れ間に広がる。
【０００５】
胞子形成したオーシストは、４つのスポロシスト（二次嚢胞）を含み、各スポロシストは、２つのスポロゾイトを更に含む。これらスポロゾイトは、鶏の消化管内の機械的および酵素的作用によって放出される。この放出により、スポロゾイトは、アイメリア種に応じて、腸または盲腸内の上皮細胞に侵入しえる。アイメリアの種および菌株間で病原性の差はあるが、感染動物は、血便、高死亡率、一般的傾眠、るい痩（痩せ細り）、飼料消費の顕著な減少、下痢及び産卵減少の１つ以上の症状を示す。おそらく、家禽類の不慮の死亡の約６〜１０％は、コクシジウム症が原因と考えられる。更に、準臨床疾病では、飼料転換率（ＦＣＲ）を増大させ、飼育効率を減少させる。従って、この疾病の経済的影響は、重大であり、最も好ましくないものである。
【０００６】
コクシジウム症を克服するため、種々の方法が研究されている。家禽類環境において、高水準の衛生および化学殺菌剤の使用に基づく経営戦略を通じて前記疾病を抑制しようとする試みが行われている。しかしながら、かかる対策により養鶏舎での当初の感染を低下できるものの、この厳密な衛生状態下においても、なお、コクシジウム症の発生が見つかっている。また、生ワクチン及び弱毒化ワクチンの両方が、抑制方法として研究されているが、これらは、比較的高価であるとともに、副作用として、動物の成長率を低下させる傾向がある。
【０００７】
現在、家禽類のコクシジウム症は、比較的高価な予防抗コクシジウム剤プログラムの使用により、ルーティン的に抑制されている。かかるプログラムは、コクシジウム感染を規制し、準臨床的疾病発病の抑制を試みるものである。この発病抑制は、通常、群れの生命当初からブロイラー屠殺までの期間において抗コクシジウム剤を飼料に連続混入させることにより、または制御された鶏間引きにより達成されている。当初の開発時、これら抗コクシジウム剤は、個別に使用された。この結果、薬剤耐性を有する寄生株が、次々生み出された。現在は、新薬の連続的導入によって、又は発育期間中（シャトルプログラム）又は頻繁な間隔（ローテーションプログラム）のいずれかで異なる生化学構造の抗コクシジウム剤を合理的に使用することを含む薬剤プログラムの使用によって、コクシジウム症の抑制が試みられている。家禽類における抗コクシジウム剤のルーティン的使用にも拘わらず、準臨床的コクシジウム症は、なお、家禽農場の大部分で見つかっている。
【０００８】
第４級アミンカルボン酸の内部塩は、浸透保護剤として機能する。かかる塩は、酵素活性に悪影響を及ぼすことなく細胞の浸透力を増加させ、酵素のイオン性または温度による不活性を防止する（非特許文献１〜５参照）。ある種の生物（及び組織）は、浸透ストレス下に浸透誘導合成によりベタイン等の内部塩を多量に蓄積することができるが、殆どの動物は、この能力を欠き、外からの内部塩摂取に依存する。例えば、単離されたサーモン肝臓ミトコンドリアは、浸透ストレスに晒された際、ベタイン摂取の増加を示すが、合成はできない（非特許文献６参照）。
【０００９】
コクシジウム症治療へのベタイン使用が、特許文献１に開示される。同様の目的にベタイン及びコクシジウム抑制薬の組合せ使用が、特許文献２に教示される。特許文献３には、コクシジウム症の治療及び／又は予防にプロテアーゼ及び／又はカルボハイドラーゼ等の酵素を使用することが示唆されている。
【００１０】
特許文献４には、動物飼料中に飼料消化促進酵素を含有させることにより、家畜の回腸内の細菌感染を治療することが教示されている。かかる酵素は、飼料の穀物成分中に存在する多糖類を、消化管内に存在する宿主良性微生物により食物源として使用されるオリゴ糖に分解する。この増殖の結果、病原性細菌は、競争排除工程に起因して成長することができない。この方法は、一般に、食物品質が悪い場合により効果がある（非特許文献７〜８参照）。
【００１１】
特許文献５及び特許文献６には、動物の消化機能を改良するため、ベタイン及び種々の酵素の組合せ使用が教示されている。しかしながら、上記従来技術のいずれにも、かかる組合せを、コクシジウム症または細菌感染の治療又は予防のため、若しくはコクシジウム症に侵された動物の成長率を保持するために使用するという示唆はない。
【００１２】
家畜における最も問題のある疾病の一つは、クロストリジウム・パーフリンゲンズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）により喚起される壊死性腸炎である。クロストリジウム感染に先立って、通常、コクシジウム症が起こる。コクシジウム症は、動物の免疫反応を弱め、その結果、動物は、以降に細菌感染に晒された場合に感応ができなくなる。しかしながら、ストレス、収容過多または飽和散乱状態等の他の要因も、寄与する。壊死性腸炎は、通常、動物飼料に、水溶性亜鉛バシトラシン、バージナマイシン又はペニシリンを添加することにより治療する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５８３４４７３号明細書
【特許文献２】国際公開第９４／２４８８６パンフレット
【特許文献３】欧州特許出願公開第０６８１７８７号明細書
【特許文献４】独国特許出願公開第２３２７３４５号明細書
【特許文献５】特開平１−２３８５３８号公報
【特許文献６】特開平１−１３２５３３号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｎａｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｓｔ． Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １９８２， Ｖｏｌ．９， ｐ．４７−５７
【非特許文献２】Ｙａｎｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８２， Ｖｏｌ．２２４，ｐ．１０６４−１０６９
【非特許文献３】Ｒｕｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， １９８６， Ｖｏｌ．２４５， ｐ．１３４−１４３
【非特許文献４】ＭｃＣｌｕｅ ａｎｄ Ｈａｎｓｏｎ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９０， Ｖｏｌ．８， ｐ．３５８−３６２
【非特許文献５】Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｒｅｓ． Ｉｎ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９９０， Ｖｏｌ．１， ｐ．９５７−９６９
【非特許文献６】Ｂｊｏｒｋｏｙ Ｇ．， サーモン（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）及びイガイ中のグリシンベタイン合成，ＭＳｃｔｈｅｓｉｓ，ノルウエーフィシャーズ単科大学、トロムセ大学、９４頁
【非特許文献７】Ｃｌａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． ２ｎｄ Ｅｕｒ． Ｓｙｍｐ． ｏｎ Ｆｅｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ， １９９５， ｐ．６５
【非特許文献８】Ｐａｃｋ ａｎｄ Ｂｅｄｆｏｒｄ．， Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， １９９８， ｐ．４３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の第一の目的は、健康動物体重増加率を改良しえる、動物飼料添加用組合せ化合物を提供することにある。本発明の第二の目的は、コクシジウム症または壊死性腸炎等の細菌感染の予防および／または治療用薬剤の製造への前記化合物の使用を提供することにある。本発明の第三の目的は、動物体重増加率を低下させるアイメリア感染の危険を防止する、動物飼料用の組合せ添加物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の要旨は、プロテアーゼ及びベタインから成るアイメリア感染動物における体重増加促進用飼料添加物に存する。
【００１７】
本発明の第２の要旨は、第１の要旨に記載の飼料添加物から成る動物飼料に存する。
【００１８】
本発明の第３の要旨は、第１の要旨に記載の飼料添加物から成る動物アイメリア感染治療または予防のための薬剤に存する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の動物飼料用添加剤は、飼料への添加により、動物体重増加率を改良する。更に、コクシジウム症および／または細菌感染、並びに壊死性腸炎を起こす疾病等の治療および／または予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】健康ブロイラー鶏の飼料に、ベタイン、プロテアーゼ、及びベタイン及びプロテアーゼの組合せを含有させた場合の効果を示すグラフ。
【図２】アイメリア・マクシマに侵されたブロイラー鶏の飼料に、ベタイン、プロテアーゼ、及びベタイン及びプロテアーゼの組合せを含有させた場合の効果を示すグラフ。
【図３】種々の添加飼料を与えられ、種々の病原体に侵された鶏の回腸内における、ウエルチ菌トキシン遺伝子の存在を示すゲルクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の記述および請求の範囲では、プロテアーゼ活性単位、キシラナーゼ活性単位およびα−アミラーゼ活性単位が記載される。これら活性は、混合酵素または液状酵素混合物に関し、以下のように分析する。
【００２２】
プロテアーゼ活性分析法
プロテアーゼ活性一単位は、以下の条件下において１分間に基質からフェノール性化合物１マイクログラム（ティロシン規定換算）を遊離する酵素量を示す。
【００２３】
＜試薬１＞ ０．６％（ｗ／ｖ）カゼイン基質：
乾燥ハンマーステン・カゼイン（メルク２２４２）０．６ｇを、２００ｍｌビーカーに秤量し、少量（約５ｍｌ）の蒸留水で湿潤させる。カゼインを充分に湿潤させた後、０．２Ｍリン酸水素ジナトリウム溶液２０ｍｌを添加する。得られた混合物を、攪拌下に６０℃で加熱し、カゼインを溶解して乳白溶液を得る。次いで、蒸留水６０ｍｌ及び、必要に応じて、オクチルアルコール（消泡剤：同様の物質を使用してもよい）１〜２滴を添加する。室温まで冷却した後、０．５Ｍ水酸化ナトリウム及び１Ｍ乳酸により溶液のｐＨ値を７．５に調整する。得られた溶液を、容量測定用フラスコに移し、蒸留水を加えて１００ｍｌとする。基質溶液は、低温室に貯蔵すれば、１週間は使用可能である。
【００２４】
＜試薬２＞ ０．２ＭＮａ２ＨＰＯ４溶液：
リン酸水素ジナトリウム二水和物１７．８０ｇを蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて５００ｍｌとする。
【００２５】
＜試薬３＞ ０．２ＭＮａＣｌ溶液：
塩化ナトリウム１．１６８ｇを蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて１，０００ｍｌとする。
【００２６】
＜試薬４＞ 沈殿試薬（ＴＣＡ）：
トリクロロ酢酸（ＣＣｌ３ＣＯＯＨ）１８．８０ｇ、無水酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）１８．１０ｇ及び酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）１８．８０ｇを蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて１，０００ｍｌとする。
【００２７】
＜試薬５＞ フェノール試薬：
分析直前に、フォリン−チオカルトフェノール試薬１部を、蒸留水１部に混合する。
【００２８】
＜試薬６＞ ０．５５ＭＮａ２ＣＯ３溶液：
炭酸ジナトリウム５８．２９５ｇを蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて１，０００ｍｌとする。
【００２９】
＜手順１＞ 酵素サンプル：
酵素希釈液（０．０２ＭＮａＣｌ溶液）１ｍｌを＋４０℃で（約５分間）平衡状態に保持し、これに平衡カゼイン基質５ｍｌを添加し、攪拌した後、＋４０℃正確に３０分培養する。次いで、沈殿剤５ｍｌを添加し、攪拌する。正確に３０分培養した後、即座に濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ−１又はＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ６４０ｗｅ）を通じて濾過する。
【００３０】
次いで、濾液２ｍｌ、０．５５ＭＮａ２ＣＯ３溶液５ｍｌおよびフェノール試薬１ｍｌをピペットにて添加する。得られた溶液を、＋４０℃で３０分攪拌培養する。室温に冷却して、蒸留水に対する６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００３１】
＜手順２＞ 酵素ブランク：
酵素希釈液（０．０２ＭＮａＣｌ溶液）１ｍｌを＋４０℃で（約５分間）平衡状態に保持し、沈殿剤５ｍｌを添加し、＋４０℃で正確に３０分攪拌培養する。これにカゼイン基質５ｍｌを添加した後、＋４０℃で正確に３０分攪拌培養する。得られた溶液を、即座に濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ−１又はＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ６４０ｗｅ）を通じて濾過する。
【００３２】
得られた濾液を、酵素ブランクとする。
【００３３】
酵素サンプルと酵素ブランクとの吸光度差は、０．２〜０．５の範囲にある必要がある。
【００３４】
＜手順３＞ 標準曲線：
Ｌ−チロシン１０ｍｇを、容積測定用フラスコに秤量して、チロシン株溶液を調製し、０．０２ＭＮａＣｌ溶液中に溶解した後、０．０２ＭＮａＣｌ溶液を加えて１００ｍｌとする。
【００３５】
０．０２ＭＮａＣｌ溶液を加えて、前記チロシン株溶液から以下の濃度の希釈液を調製する。
【００３６】
【表１】
【００３７】
各チロシン希釈液２ｍｌ、０．５５ＭＮａ２ＣＯ３溶液５ｍｌおよびフェノール試薬１ｍｌをピペットにて添加する。得られた溶液を、＋４０℃で３０分攪拌培養する。室温に冷却して、蒸留水に対する６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。
吸光度を関数として、チロシン濃度をプロットする。
【００３８】
計算法：
サンプルのプロテアーゼ活性を以下の式から計算する。
【００３９】
活性（Ｕ／ｇ）＝［Ａ（Ｘ）−Ａ（Ｏ）］×ｋ×Ｆ×Ｄｆ／ｔ
【００４０】
式中、Ａ（Ｘ）は、酵素サンプルの吸光度；Ａ（Ｏ）は、酵素ブランクの吸光度；ｋは、標準曲線の傾き；Ｆは、反応希釈係数（＝１１）；Ｄｆは、希釈係数；ｔは、反応時間（３０分）をそれぞれ示す。
【００４１】
キシラナーゼ活性分析法：
キシラナーゼ活性一単位は、以下の条件下において１分間に基質から還元糖１μモル（キシロース規定換算）を遊離する酵素量を示す。
【００４２】
＜試薬１＞ １％（ｗ／ｖ）キシラン基質：
キシラン（Ｆｌｕｋａ９５５９０）１．０ｇに、０．５Ｍ水酸化ナトリウム１０ｍｌを添加する。得られた液を、マグネチックスターラーにより３０分間混合する。ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液約４０ｍｌを添加する。次いで、１Ｍ酢酸によりｐＨ値を５．３に調整した後、ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を加えて、全量を１００ｍｌとする。基質は、使用時に混合して使用する。
【００４３】
＜試薬２＞ １Ｍ酢酸：
氷酢酸５．７ｍｌを、容積測定用フラスコにピペットにより添加し、蒸留水を加えて１００ｍｌとする。
【００４４】
＜試薬３＞ ０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．３：
Ａ：酢酸ナトリウム４．１９ｇを、蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて全量を１，０００ｍｌとする。Ｂ：氷酢酸３．０ｇを、蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて全量を１，０００ｍｌとする。溶液Ｂを使用して、溶液ＡのｐＨを５．３に調整する。
【００４５】
＜試薬４＞ ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）試薬：
３，５−ジニトロサリチル酸２０．０ｇを、蒸留水約８００ｍｌに懸濁する。得られた懸濁液に、水酸化ナトリウム溶液（蒸留水３００ｍｌ中にＮａＯＨ３２．０ｇを溶解した溶液）３００ｍｌを攪拌下に連続して徐々に添加する。懸濁液を、水浴（浴温：＋４８℃以下）中で攪拌下に溶液が透明になるまで、加熱する。次いで、酒石酸カリウムナトリウム６００ｇを徐々に添加する。得られた溶液を、必要に応じて、溶液が透明になるまで、＋４８℃以下の温度で加熱する。蒸留水で全量を２，０００ｍｌとした後、粗焼結ガラスフィルターを通じて濾過する。
【００４６】
得られた試薬は、室温下に暗色ボトル内に貯蔵する。この試薬は、最長６ヶ月間安定に保持できる。
【００４７】
＜手順１＞ 酵素サンプル：
酵素希釈液（ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中）１ｍｌを＋５０℃で平衡させ、これにキシラン基質１ｍｌを添加し、攪拌した後、＋５０℃正確に３０分培養する。次いで、ＤＮＳ試薬３ｍｌを添加攪拌し、得られた反応混合物を正確に５分間煮沸する。反応混合物を、冷水浴で室温に冷却した後、蒸留水に対する５４０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００４８】
＜手順２＞ 酵素ブランク：
キシラン基質１ｍｌを、＋５０℃で３０分培養する。次いで、ＤＮＳ試薬３ｍｌを添加攪拌する。酵素希釈液（ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中）１ｍｌを添加攪拌する。得られた混合物を正確に５分間煮沸する。反応混合物を、冷水浴中で室温に冷却した後、蒸留水に対する５４０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００４９】
酵素サンプルと酵素ブランクとの吸光度差は、０．３〜０．５の範囲にある必要がある。
【００５０】
＜手順３＞ 標準曲線：
ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中に無水キシロースを溶解して標準溶液を調製した。標準溶液中のキシロース濃度は、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲にある必要がある。標準溶液１ｍｌ、キシラン基質１ｍｌ及びＤＮＳ試薬３ｍｌをピペットにて試験管に取り、正確に５分間攪拌煮沸する。得られた反応液を、冷水浴中で室温に冷却した後、標準ブランクに対する５４０ｎｍにおける吸光度を測定する。標準ブランクは、キシロース溶液を、ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液１ｍｌで置換して調製する。その他は、標準ブランクは、キシロース標準溶液と同様に処理する。
【００５１】
吸光度の関数として、キシロース濃度をプロットする。新たなＤＮＳ試薬に対しては、別個の標準曲線を新たに作成する。
【００５２】
計算法：
サンプルのキシラナーゼ活性を以下の式から計算する。
【００５３】
活性（Ｕ／ｇ）＝
（［Ａ（Ｘ）−Ａ（Ｏ）］×ｋ×Ｃ０）×１０００×Ｄｆ／ＭＷｘｙｌ×ｔ
【００５４】
式中、Ａ（Ｘ）は、酵素サンプルの吸光度；Ａ（Ｏ）は、酵素ブランクの吸光度；ｋは、標準曲線の傾き；Ｃ０は、キシロース標準曲線の切片；１０００は、係数（ｍｍｏｌ＞μｍｏｌ）；Ｄｆは、希釈係数（ｍｌ／ｇ）；ＭＷｘｙｌは、キシロース分子量（１５０．１３ｍｇ／ｍｍｏｌ）；ｔは、反応時間（３０分）をそれぞれ示す。
【００５５】
アミラーゼ活性分析法：
α−アミラーゼ活性一単位とは、以下の条件下において１分間にグリコシド結合１μモルを加水分解する触媒量を示す。
【００５６】
＜試薬１＞ 基質：
基質として、生体外診断用フェイドバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）アミラーゼ試験タブレット（ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉｇｎｏｔｉｃｓ社製）を使用する。前記タブレットは、蒸留水中で、水溶性ブルースターチポリマー、ウシ血清アルブミン及び緩衝液から調製する。
【００５７】
＜試薬２＞ 試薬溶液：
塩化ナトリウム９．０ｇ、ウシ血清アルブミン２．０ｇ及び塩化カルシウム２．２ｇを蒸留水で希釈し、容積測定用フラスコに添加した後、更に蒸留水を加えて全量を１０００ｍｌとする。
【００５８】
＜試薬３＞ ０．５ＭＮａＯＨ溶液：
水酸化ナトリウム２０．０ｇを蒸留水に溶解し、容積測定用フラスコに添加した後、更に蒸留水を加えて全量を１，０００ｍｌとする。
【００５９】
＜試薬４＞ 濾紙：
Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ６４０ｍｎ又は等価物
【００６０】
＜手順１＞ 酵素サンプル：
試薬溶液中の適当な酵素希釈液２００μｌ及び試薬溶液４．０ｍｌをピペットにて試験管に取り、＋３７℃で５分間平衡さる。この溶液に、ペンチにより、基質タブレットを添加し、１０秒間よく混合する。得られた混合物を＋３７℃で正確に１５分間培養する。反応時間の計測は、タブレットの添加から開始する。次いで、０．５ＭＮａＯＨ溶液１．０ｍｌを添加し、よく攪拌する。得られた反応液を、濾過するか又は３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、試薬ブランクに対する６２０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００６１】
＜手順２＞ 試薬ブランク
試薬溶液４．２ｍｌを、＋３７℃で３０分間平衡させる。この溶液に、ペンチにより、基質タブレットを添加し、１０秒間よく混合する。得られた混合物を＋３７℃で正確に１５分間培養する。次いで、０．５ＭＮａＯＨ溶液１．０ｍｌを添加し、よく攪拌する。得られた反応液は、濾過するか又は３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
【００６２】
計算法：
サンプルの吸光度は、α−アミラーゼ活性に比例する。酵素希釈液のα−アミラーゼ活性は、タブレットキットに同封された一覧表から読み取る。各タブレットバッチには、検量表が添付されている。
【００６３】
サンプルのα−アミラーゼ活性を以下の式から計算する。
【００６４】
活性（Ｕ／ｇ）＝Ａｃｔ×Ｄｆ／１０００
【００６５】
式中、Ａｃｔは、フェイドバスアミラーゼ試験表から読み取った酵素希釈液のα−アミラーゼ活性値（Ｕ／ｌ）；Ｄｆは、希釈係数（ｍｌ／ｇ）；１０００は、（リットルをｍｌに換算するための）係数をそれぞれ示す。
【００６６】
以下の記載において、獣医免疫学および免疫病理学、ワクチン、動物薬学及び動物畜産学の当業者の一般的知識を構成する種々の方法論が参照される。かかる公知の方法論を記載した刊行物および他の資料としては以下のものが挙げられる。
【００６７】
獣医科学の一般原理は、例えば、「メルク・獣医学マニアル（Ｍｅｒｃｋ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第６版、フレザー（Ｆｒａｓｅｒ）他編（１９８６）；「食料および薬剤局（ＦＤＡ）１９９４、飼料添加剤解説」米国食料および薬剤局、１９９４；「獣医学研究および開発、パート６：抗コクシジウム」ロイド・エバンス（Ｌｌｏｙｄ−Ｅｖａｎｓ，Ｌ．Ｐ．Ｍ．）編、ＰＪＢパブリケーション社；「家禽類の疾病」カルネック（Ｂ．Ｗ．Ｃａｌｎｅｋ）編、アイオワ州立大学プレス、アメス、アイオワ、１９９１等に記載される。
【００６８】
動物畜産学の一般原理は、例えば、パトリック（Ｈ．Ｐａｔｒｉｃｋ）他著「家禽類」；「飼料および栄養摂取」第２版、ＡＶＩパブリッシング社、ウエストポート、コネチカット（１９８０）等に記載される。
【００６９】
また、薬剤科学の一般原理は、例えば、「レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ）薬剤科学」第１８版、ジェナロー（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）編、マック・パブリッシング社、イーストン、ペンシルバニア（１９９０）等に記載される。上記したように、本発明によれば、プロテアーゼ及び第４級アミンカルボン酸内部塩の、コクシジウム症、細菌感染または特にウエルチ菌感染から生じる壊死性腸炎の治療および／または予防用薬剤製造への使用が提供される。ベタイン及びプロテアーゼの組合せを含む飼料を使用した場合の利点としては、ルーチン的に飼料に添加されている抗菌剤の含量を減少させることができるか、または場合によっては、完全に省略することができる。かかる抗菌剤の使用が禁止されている地域では、本発明は、細菌症の抑制に新たなアプローチを提供するものである。
【００７０】
動物食から抗生物質を除くと、幾つかの更なる利点が得られる。以前は、屠殺前に動物食における抗生物質の使用を中止する必要があった。これによって、かかる薬剤を比較的に非含有である食肉を提供するとともに、当該食肉を、ヒトの消費に適合させていた。これと対照的に、動物食から抗生物質が完全に省略された場合、本発明で達成されたように、動物は、使用中止期間経過後でなくとも、如何なる年齢でも屠殺可能となる。これによって、農業従事者に柔軟性を持たせるとともに、動物が屠殺直前に感染する危険を取除くことができる。更に、確実に、抗生物質を非含有な食肉および鶏卵の生産が保証される。かかる保証の無い製品に比して、上記の食肉および鶏卵は、市場的に有利である。
【００７１】
本発明は、また、ヒトの健康に有利である。本発明の使用は、抗生物質を動物飼料から取除くことによって、細菌の耐抗生物質株の淘汰性を低下させることができる。従って、より抗生物質の利きやすい菌株が、動物の消化管に存在するため、同様のヒト条件で抗生物質を使用する場合、細菌致死効果をより確実に得ることができる。
【００７２】
本発明の飼料添加剤は、多数の方法で調製できる。前記飼料は、例えば、適当な異なる化合物を混合して簡単に製造することができる。得られる添加剤は、次いで、直接飼料と混合するか、又はより従来的には、製粉コムギ、トウモロコシ又は大豆粉等の穀物系キャリアー物質上に含浸させる。かかる含浸キャリアーは、また、本発明の第４の要旨に従った飼料添加剤を構成する。
【００７３】
飼料添加剤は、直接動物飼料と混合されてもよく、または、ビタミン飼料添加剤、ミネラル飼料添加剤またはアミノ酸飼料添加剤等の他の飼料添加剤の１種以上と混合されてもよい。得られた、幾つかの異なるタイプの成分を含む飼料添加剤は、次いで、適当な量で、飼料と混合される。また、上記飼料添加剤は、動物が摂取する第２の（異なる）飼料または飲料水中に添加することにより、動物食中に含有させることができる。従って、本発明の添加剤を、通常の穀物系動物主飼料に含有させることは、特に好ましい実施形態ではあるが、必ずしも必須ではない。
【００７４】
本発明により提供される飼料添加剤は、好ましい他の酵素との予備混合物として調合することもできる。前記予備混合物は、飼料製造前、飼料製造中、又は使用に供する前の飼料の最終段階で、原料に添加することができる。また、内部塩およびプロテアーゼの組合せを、ペレット又はマッシュ形状に予備成形された飼料物質に直接添加することができる。
【００７５】
本発明の添加剤を動物飼料に含有させた場合、得られた飼料は、穀類を、少なくとも２５重量％、好ましくは少なくとも３５重量％の割合で含有する。穀類としては、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、トリチケール（ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、イネ及びモロコシの１種以上を使用することができる。これらの中で、特に好ましい穀類としては、コムギ又はトウモロコシが挙げられる。穀類が、トウモロコシの場合、添加剤または薬剤は、好ましくは、更にα−アミラーゼを含む。
【００７６】
穀物系食餌の穀物成分は、タンパク源を構成するが、通常、食餌内に、魚粉、肉粉または野菜等から誘導される追加のタンパク源を含有させる必要がある。これら追加のタンパク源は、動物飼料に対し５０重量％以下の割合で含有される。植物タンパク源としては、脂肪分の豊富なダイズ、アブラナ、キャノーラ、大豆粉、アブラナ粉およびキャノーラ粉の少なくとも１種が含有される。
【００７７】
第４級アミンカルボン酸内部塩は、以下の一般構造式を有する。
【００７８】
Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｎ＋−Ｌ−ＣＯＯ−
【００７９】
式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に有機基を示し、好ましくはアルキル基、より好ましくは炭素数１〜６のアルキル基、最も好ましくは全てがメチル基であり；結合基−Ｌ−は、アルコキシアルキル又はアルキレン等の有機結合基、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキレン、最も好ましくはメチレンを示す。）第４級アミンカルボン酸内部塩の具体例としては、ベタイン（Ｍｅ３Ｎ＋ＣＨ２ＣＯＯ−）、Ｍｅ３Ｎ＋−ＣＨＭｅＣＯＯ−、Ｅｔ３Ｎ＋ＣＨ３ＣＯＯ−、Ｍｅ３ＥｔＮ＋ＣＨ２ＣＯＯ−、Ｍｅ３Ｎ＋ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−、Ｍｅ３Ｎ＋ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＯ−及びＭｅ３Ｎ＋Ｃ（ＣＨＭｅ３）ＨＣＯＯ−が挙げられる。好ましい内部塩としては、商品名「Ｂｅｔａｆｉｎ（登録商標）」の下にフィンフィーズ社から市販されるベタインが挙げられる。
【００８０】
内部塩は、飼料１ｋｇ当たり好ましくは０．０１〜２０ｇ、より好ましくは０．１〜１０ｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．５〜２ｇ／ｋｇの割合で、飼料中に含有される。
【００８１】
使用されるプロテアーゼは、如何なる形態でもよいが、４０，０００Ｕ以上の活性を有するバシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から誘導されるサブチリシンの使用が好ましい。かかるサブチリシンは、例えば、米国特許第４，７６０，０２５号に記載される。プロテアーゼは、飼料１ｋｇ当たり１００Ｕ〜１００，０００Ｕ、好ましくは５００Ｕ〜１０，０００Ｕに相当するプロテアーゼ活性を示す量で、飼料中に含有される。好適なプロテアーゼとしては、これに限定しないが、Ｎｏｖｏ ＮＥＵＴＲＡＳＥ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）及びＭＡＸＡＰＥＭ（商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社）等の市販プロテアーゼが挙げられる。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態において、薬剤または添加剤は、更に、キシラナーゼを含む。キシラナーゼは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ヒューミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ネオカリマスチス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）又はサーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）等の菌類から誘導することができる。好ましいキシラナーゼとしては、国際公開公報第ＷＯ９２／０６２０９号の実施例２２に記載されるトリコデルマ・ロンギブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）から得られる低ｐＩキシラナーゼ及び／又は高ｐＩキシラナーゼが、挙げられる。キシラナーゼは、また、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、マイクロテトラスポーラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）又はルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）等の細菌類から得ることができる。また、キシラナーゼは、宿主細菌または菌株内の適当な遺伝子の混入等の遺伝子操作を行った宿主から得ることもできる。キシラナーゼ活性は、約３，０００Ｕが好ましい。トリコデルマ・ロンギブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）から得られる３，０００Ｕ／ｇの最小活性を有するキシラナーゼは、「ＡＶＩＺＹＭＥ（登録商標）」の商品名でフィンフィーズ・インターナショナル社から市販されている。キシラナーゼは、飼料１ｋｇ当たり１００Ｕ〜１００，０００Ｕ、好ましくは２００Ｕ〜１，０００Ｕに相当するキシラナーゼ活性を示す量で、飼料中に含有される。
【００８３】
本発明の別の好ましい実施形態において、トウモロコシ含有飼料に添加される薬剤または添加剤中には、更に、α−アミラーゼが、含有されていてもよい。本発明では如何なる形態のα−アミラーゼも使用できるが、好ましくは、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から得られる４，０００Ｕ／ｇの最小活性を有するα−アミラーゼが使用される。かかるバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から得られる４，０００Ｕ／ｇの最小活性を有するα−アミラーゼは、「ＡＶＩＺＹＭＥ（登録商標）」の商品名でフィンフィーズ・インターナショナル社から市販されている。α−アミラーゼは、飼料１ｋｇ当たり１０Ｕ〜１００，０００Ｕ、好ましくは１００Ｕ〜４，０００Ｕに相当するα−アミラーゼ活性を示す量で、飼料中に含有される。
【００８４】
内部塩、プロテアーゼ、並びに任意にキシラナーゼ及びα−アミラーゼは、使用前に混合されても、又飼料に別々に添加されてもよい。プロテアーゼ、キシラナーゼ及びα−アミラーゼの組合せは、「ＡＶＩＺＹＭＥ（登録商標）１５１０」の商品名でフィンフィード・インターナショナル社から市販されている。これら酵素の別の組合せは、「ＡＶＩＺＹＭＥ（登録商標）１５００」の商品名で乾燥予備混合物の形態のものが市販されている。なお、プロテアーゼを他のタンパクと一緒に長期間保存すると、後者の変質を生じるため、一般には、このような保存は避けるべきである。
【００８５】
本発明の飼料添加剤は、広範囲の動物に使用可能であるが、特に、家畜類および放牧家畜に使用するのが好ましい。本発明が特に好ましく適用される動物としては、鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ等の家禽類、ウシ、ウマ、ヒツジ等の反芻動物、ブタ等のイノシシ類、ラビット等の齧歯類および魚類が挙げられる。本発明は、特に、ブロイラー鶏に有用である。
【００８６】
本発明の添加剤は、その効能レベルが、コクシジウム誘起病原体、特に、アイメリア種、例えば、アイメリア種に属するネカトリクス（ｎｅｃａｔｒｉｘ）、ガロパルボニス（ｇａｌｌｏｐａｒｖｏｎｉｓ）、メラグリミチス（ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）、イノキュア（ｉｎｎｏｃｕａ）、メラグリヂス（ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、サブロチュンダ（ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａ）、ディスパーサ（ｄｉｓｐｅｒｓａ）、トランカタ（ｔｒｕｎｃａｔａ）、アセルブリナ（ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、ブルネティ（ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、マクシマ（ｍａｘｉｍａ）、ミチス（ｍｉｔｉｓ）、プラコックス（ｐｒａｅｃｏｘ）及びテネラ（ｔｅｎｅｌｌａ）等の病原体に起因する影響を軽減するように処方することができる。より好ましくは、本添加剤は、アイメリア感染動物の体重回復増加を促進させる。
【００８７】
また、本発明の添加剤は、その効能レベルが、アイメリア種、特に、アイメリア種に属するＥ．アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、Ｅ．ブルネティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、Ｅ．マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、Ｅ．ミチス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、Ｅ．ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、Ｅ．プラコックス（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）及びＥ．テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）等の感染に起因する家禽類の悪影響を軽減するように処方することができる。
【００８８】
更に、本発明の添加剤は、その効能レベルが、アイメリア種に属するズエリニ（ｚｕｅｒｎｉｉ）、ボビス（ｂｏｖｉｓ：スミシィ（ｓｍｉｔｈｉｉ））、エリプソイドリス（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｌｉｓ）等に感染したウシに誘起される悪影響を軽減するように処方することができる。
【００８９】
本発明の添加剤は、その効能レベルが、アイメリア種のアルロインギ Ａ（ａｒｌｏｉｎｇｉ Ａ：オビナ（ｏｖｉｎａ））、ウェイブリッジエンシス（ｗｅｙｂｒｉｄｇｅｎｓｉｓ：アルロンギス Ｂ（ａｒｌｏｎｇｉｓ Ｂ））、クランダリス（ｃｒａｎｄａｌｉｓ）、アサタ（ａｈｓａｔａ）、オビノイダリス（ｏｖｉｎｏｉｄａｌｉｓ）、ギルルーシ（ｇｉｌｒｕｔｈｉ）等に感染したヒツジに誘起される悪影響を軽減するように処方することができる。
【００９０】
本発明の添加剤は、その効能レベルが、アイメリア種に感染した、例えば、アイメリア種に属するアルロインギ（ａｒｌｏｉｎｇｉ）、ファウレイ（ｆａｕｒｅｉ）、カプロイナ（ｃａｐｒｏｉｎａ）、ニナコールヤキモバ（ｎｉｎａｋｏｈｌｙａｋｉｎｏｖａｅ）、クリステンセニ（ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉ）等によるイミュニゼーション状態のヤギに誘起される悪影響を軽減するように処方することができる。
【００９１】
本発明の添加剤は、その効能レベルが、アイメリア種に感染した、例えば、アイメリア種に属するデブリーキ（ｄｅｂｌｉｅｃｋｉ）、スカブラ（ｓｃａｂｒａ）、ペニニュータ（ｐｅｎｎｉｎｕｔａ）等によるイミュニゼーション状態のブタに誘起される悪影響、並びにイソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）種、例えば、イソスポラ・スイス（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｓｕｉｓ）によって誘起される悪影響を軽減するように処方することができる。
【００９２】
本発明の添加剤は、その効能レベルが、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サルモネラ、キャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ：グラム陰性桿菌）、Ｅ．ｃｏｌｉ及びリステリア（ｌｉｓｔｅｒｉａ）、特に、ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）及びキャンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）等の細菌に感染した家禽類に誘起される悪影響を軽減するように処方することができる。ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）は、壊死性腸炎の主原因の一つであるため、本発明の栄養添加剤は、従って、壊死性腸炎の治療および／または予防用薬剤調製に使用することができる。
【００９３】
更なる薬学的方法を使用することによって、作用期間を制御することもできる。ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プロタミンサルフェート等の適当なマクロ分子を選択し、かつこれらを確かな手順にしたがって組み合わせることによって、薬剤の制御放出が可能となる。また、内部塩およびプロテアーゼの作用期間は、これら薬剤を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリ乳酸またはエチレン酢酸ビニル共重合体等のポリマー粉末に包含させることによって制御できる。別の方法としては、内部塩およびプロテアーゼを、マイクロカプセル内に封入してもよい。上記マイクロカプセルの製造および使用に関する種々の材料および方法は、「レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ）薬剤科学」第１６版、オスロー（Ａ．Ｏｓｌｏｗ）編、マック・パブリッシング社、イーストン、ペンシルバニア（１９８０）に記載される。
【００９４】
内部塩およびプロテアーゼを動物飼料の形で動物に投与する本発明の上記実施形態に加えて、本発明の更なる実施形態では、内部塩およびプロテアーゼを含有する他の組成物を、ワクチン、栄養分または医薬を含む所望の組成物と共に、投与することもできる。
【実施例】
【００９５】
実施例１：
以下の実施例では、本発明の飼料添加剤を、健康動物の飼料に包含させた場合の効果、並びにアイメリア感染の治療用薬剤の製造に適用した場合を示す。
【００９６】
（ａ）一般手順：
９６羽の雌ブロイラーひな鳥（ロス（Ｒｏｓｓ）２０８）を、２４羽ずつ４つのグループに分けた。飼料投与を０日目より開始し、１４日目にアイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）の投与を行った。かかる投与は、アイメリア・アサービュリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）及びアイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）のオーシストを水道水２ｍｌ中に溶かし込んで、ひな鳥のソノウに接種した。一羽当たりの投与量は、アイメリア・アサービュリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）１００，０００オーシスト及びアイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）５０，０００オーシストであった。これら２種のアイメリア種は、空間的に腸内で分離される。即ち、アイメリア・アサービュリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）は、十二指腸及び空腸前部に感染し、一方アイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）は、小腸中央部、つまり空腸末端から回腸中央までの部分を好む。被験鳥を、ケージで０〜１４日間、木くずを敷いた開放オリで１４〜２１日間保持した。
【００９７】
被験鳥に投与された飼料は、コクシジウム抑制薬非含有のコーン・大豆系飼料であった。飼料は、直径約５ｍｍの脆い小ペレットにコールドプレスした。開始飼料は、０〜１４日で使用され、仕上げ飼料は、１４〜２１日で使用された。添加剤を、飼料ペレットに噴霧した。具体的には、ベタイン水溶液を、飼料１ｋｇ当たり１ｇの投与量で、及びキシラナーゼ３００Ｕ／ｇ、プロテアーゼ４，０００Ｕ／ｇ及びα−アミラーゼ４００Ｕ／ｇから成る、「ＡＶＩＺＹＭＥ（登録商標）１５１０」（フィンフィード・インターナショナル社製）の水溶液を、飼料１ｋｇ当たり１ｇの投与量で、飼料に添加した。使用した飼料組成を、以下の表に示す。
【００９８】
【表２】
【００９９】
これら飼料の栄養組成を、以下の表に示す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
（ｂ）結果：
被験鳥の体重を、１４日目のアイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）の投与直前に測定した。表４に示すように、ベタイン及びプロテアーゼの組合せ使用は、これら化合物を個別に飼料に添加した場合に比して、大きな体重増加を示すことが判る。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
表４の結果を、図１にグラフで示す。
【０１０４】
被験鳥の体重を、２１日目、即ち、アイメリア投与から７日目に再び測定した。結果を、表５に要約する。グループＤでは、ベタイン又はプロテアーゼのいずれかを添加した飼料を使用したグループＢ及びＣに比して、体重の改善が見られた。また、これら２成分の組合せによって、個々の成分の効果の合計よりも大きな向上が見られた。
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
表５の結果を、図２にグラフで示す。
【０１０７】
実施例２：
本実施例では、ウェルチ菌感染に対する、実施例１で使用されたベタイン及びプロテアーゼの組合せの活性を検証する。使用飼料は、実施例１に記載の仕上げ飼料と同一である。
【０１０８】
（ａ）一般手順：
生後２１日の１２羽の鶏を、４羽ずつの３つのグループＥ、Ｆ及びＧに分けた。グループＥには、アイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）を投与し、グループＦは、ウェルチ菌を投与し、グループＧは、アイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）とウェルチ菌を同時投与した。ウェルチ菌α−トキシン遺伝子が、以下のように全体微生物ＤＮＡから検出された。ウェルチ菌α−トキシン遺伝子の公知のヌクレオシド配列に従って形成されたプライマーを使用して、盲腸の全体微生物ＤＮＡを、ポリマラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）させた。α−トキシンプライマーの配列およびＰＣＲ反応の実施条件は、ソンガー（Ｓｏｎｇｅｒ）及びデ・ミーア（ｄｅ Ｍｅｅｒ）著「Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．」１９９７年６月；５８（７）、７０２〜７０５頁に記載される。
【０１０９】
（ｂ）結果
図３で示すゲルクロマトグラムのレーン３における強い帯域は、動物内に内因性ウェルチ菌α−トキシン遺伝子が存在することを示す。レーン２及び４における強い帯域の欠如により、アイメリア投与が、ウェルチ菌感染の必須前提条件であることが判る。何かの理論を持ち出すまでもなく、アイメリア投与は、腸内のプロテアーゼの通常レベルを低下させ、腸上部域での栄養分摂取を減少させ、この結果盲腸内でのタンパクレベルを増加（ウェルチ菌に好適な成長条件）させることが分かる。更に重要な点は、宿主動物の免疫系に対するアイメリア投与の効果である。免疫系が、既にアイメリア投与により先に占有されている場合は、ウェルチ菌投与に対する免疫応答が弱まる傾向がある。
【０１１０】
図３に示すレーン６及び７の比較から、ウェルチ菌α−トキシン遺伝子を示す帯域が、プロテアーゼのみの処理（レーン６）では観測されるが、ベタイン及びプロテアーゼを組合せ使用した場合（レーン７）では観測されないことが分かる。更に、ベタインはウェルチ菌投与に対し有効でないことが、一般共通知識となっている。従って、ベタイン及びプロテアーゼの組合せは、ウェルチ菌感染に対し有効であるが、他方ベタイン又はプロテアーゼのいずれか一方を個別に使用した場合は、ウェルチ菌感染を効果的に抑制できない。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明の動物飼料用添加剤は、飼料への添加により、動物体重増加率を改良する。更に、コクシジウム症および／または細菌感染、並びに壊死性腸炎を起こす疾病等の治療および／または予防に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物飼料用添加剤に関し、より詳しくは、飼料への添加により、動物体重増加率を改良する添加剤に関する。更に、本発明は、コクシジウム症および／または細菌感染、並びに壊死性腸炎を起こす疾病等の治療および／または予防に有用な添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の異なるタイプの動物の飼育畜産は、ヒト消費用食料生産のため、世界的に重要である。これら動物は、飼育中に、アイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）、キャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ：グラム陰性桿菌）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サルモネラ、Ｅ．ｃｏｌｉ及びリステリア等の種々の感染性細菌および寄生生物と接触する。
【０００３】
コクシジウム症は、集中的に飼育される家畜、特に家禽類における疾病の共通原因となる。コクシジウム症は、アピコンプレサ亜門の原生動物、単細胞寄生生物により起こされる。家畜に疾病を起こす多くの種は、アイメリア属に属する。これら寄生生物は、腸上皮内で増殖する。鶏では、アイメリアの７種が、確認されており、この内５種が、病原性を有すると考えられる。具体的には、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ及びＥ．ｂｒｕｎｅｔｔｉが含まれる。
【０００４】
コクシジウムは、遍在性生物であり、一般に、養鶏地区の風土性を有する。疾病の症状は、重大感染から微感染まで種々存在する。多くの寄生原生動物と同様、アイメリアのライフサイクルは、比較的複雑であり、鶏腸内で有性および無性増殖する。この寄生生物の増殖および発育の工程中に、宿主組織が、破壊され、コクシジウム症発病で観測される種々の疾病に至る。生産および分泌されるオーシスト（接合子嚢）は、宿主の外部で更に発育し、他の鶏に感染する。実際、オーシストは、宿主外で長期間生存し、当初の感染宿主を取除いた後も、他の鳥類に感染可能である。これらオーシストは、ヒト、ペット、昆虫、齧歯類、ダスト及び他の鳥類等の他の要因により群れ間に広がる。
【０００５】
胞子形成したオーシストは、４つのスポロシスト（二次嚢胞）を含み、各スポロシストは、２つのスポロゾイトを更に含む。これらスポロゾイトは、鶏の消化管内の機械的および酵素的作用によって放出される。この放出により、スポロゾイトは、アイメリア種に応じて、腸または盲腸内の上皮細胞に侵入しえる。アイメリアの種および菌株間で病原性の差はあるが、感染動物は、血便、高死亡率、一般的傾眠、るい痩（痩せ細り）、飼料消費の顕著な減少、下痢及び産卵減少の１つ以上の症状を示す。おそらく、家禽類の不慮の死亡の約６〜１０％は、コクシジウム症が原因と考えられる。更に、準臨床疾病では、飼料転換率（ＦＣＲ）を増大させ、飼育効率を減少させる。従って、この疾病の経済的影響は、重大であり、最も好ましくないものである。
【０００６】
コクシジウム症を克服するため、種々の方法が研究されている。家禽類環境において、高水準の衛生および化学殺菌剤の使用に基づく経営戦略を通じて前記疾病を抑制しようとする試みが行われている。しかしながら、かかる対策により養鶏舎での当初の感染を低下できるものの、この厳密な衛生状態下においても、なお、コクシジウム症の発生が見つかっている。また、生ワクチン及び弱毒化ワクチンの両方が、抑制方法として研究されているが、これらは、比較的高価であるとともに、副作用として、動物の成長率を低下させる傾向がある。
【０００７】
現在、家禽類のコクシジウム症は、比較的高価な予防抗コクシジウム剤プログラムの使用により、ルーティン的に抑制されている。かかるプログラムは、コクシジウム感染を規制し、準臨床的疾病発病の抑制を試みるものである。この発病抑制は、通常、群れの生命当初からブロイラー屠殺までの期間において抗コクシジウム剤を飼料に連続混入させることにより、または制御された鶏間引きにより達成されている。当初の開発時、これら抗コクシジウム剤は、個別に使用された。この結果、薬剤耐性を有する寄生株が、次々生み出された。現在は、新薬の連続的導入によって、又は発育期間中（シャトルプログラム）又は頻繁な間隔（ローテーションプログラム）のいずれかで異なる生化学構造の抗コクシジウム剤を合理的に使用することを含む薬剤プログラムの使用によって、コクシジウム症の抑制が試みられている。家禽類における抗コクシジウム剤のルーティン的使用にも拘わらず、準臨床的コクシジウム症は、なお、家禽農場の大部分で見つかっている。
【０００８】
第４級アミンカルボン酸の内部塩は、浸透保護剤として機能する。かかる塩は、酵素活性に悪影響を及ぼすことなく細胞の浸透力を増加させ、酵素のイオン性または温度による不活性を防止する（非特許文献１〜５参照）。ある種の生物（及び組織）は、浸透ストレス下に浸透誘導合成によりベタイン等の内部塩を多量に蓄積することができるが、殆どの動物は、この能力を欠き、外からの内部塩摂取に依存する。例えば、単離されたサーモン肝臓ミトコンドリアは、浸透ストレスに晒された際、ベタイン摂取の増加を示すが、合成はできない（非特許文献６参照）。
【０００９】
コクシジウム症治療へのベタイン使用が、特許文献１に開示される。同様の目的にベタイン及びコクシジウム抑制薬の組合せ使用が、特許文献２に教示される。特許文献３には、コクシジウム症の治療及び／又は予防にプロテアーゼ及び／又はカルボハイドラーゼ等の酵素を使用することが示唆されている。
【００１０】
特許文献４には、動物飼料中に飼料消化促進酵素を含有させることにより、家畜の回腸内の細菌感染を治療することが教示されている。かかる酵素は、飼料の穀物成分中に存在する多糖類を、消化管内に存在する宿主良性微生物により食物源として使用されるオリゴ糖に分解する。この増殖の結果、病原性細菌は、競争排除工程に起因して成長することができない。この方法は、一般に、食物品質が悪い場合により効果がある（非特許文献７〜８参照）。
【００１１】
特許文献５及び特許文献６には、動物の消化機能を改良するため、ベタイン及び種々の酵素の組合せ使用が教示されている。しかしながら、上記従来技術のいずれにも、かかる組合せを、コクシジウム症または細菌感染の治療又は予防のため、若しくはコクシジウム症に侵された動物の成長率を保持するために使用するという示唆はない。
【００１２】
家畜における最も問題のある疾病の一つは、クロストリジウム・パーフリンゲンズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）により喚起される壊死性腸炎である。クロストリジウム感染に先立って、通常、コクシジウム症が起こる。コクシジウム症は、動物の免疫反応を弱め、その結果、動物は、以降に細菌感染に晒された場合に感応ができなくなる。しかしながら、ストレス、収容過多または飽和散乱状態等の他の要因も、寄与する。壊死性腸炎は、通常、動物飼料に、水溶性亜鉛バシトラシン、バージナマイシン又はペニシリンを添加することにより治療する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５８３４４７３号明細書
【特許文献２】国際公開第９４／２４８８６パンフレット
【特許文献３】欧州特許出願公開第０６８１７８７号明細書
【特許文献４】独国特許出願公開第２３２７３４５号明細書
【特許文献５】特開平１−２３８５３８号公報
【特許文献６】特開平１−１３２５３３号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｎａｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｓｔ． Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １９８２， Ｖｏｌ．９， ｐ．４７−５７
【非特許文献２】Ｙａｎｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８２， Ｖｏｌ．２２４，ｐ．１０６４−１０６９
【非特許文献３】Ｒｕｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， １９８６， Ｖｏｌ．２４５， ｐ．１３４−１４３
【非特許文献４】ＭｃＣｌｕｅ ａｎｄ Ｈａｎｓｏｎ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９０， Ｖｏｌ．８， ｐ．３５８−３６２
【非特許文献５】Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｒｅｓ． Ｉｎ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９９０， Ｖｏｌ．１， ｐ．９５７−９６９
【非特許文献６】Ｂｊｏｒｋｏｙ Ｇ．， サーモン（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）及びイガイ中のグリシンベタイン合成，ＭＳｃｔｈｅｓｉｓ，ノルウエーフィシャーズ単科大学、トロムセ大学、９４頁
【非特許文献７】Ｃｌａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． ２ｎｄ Ｅｕｒ． Ｓｙｍｐ． ｏｎ Ｆｅｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ， １９９５， ｐ．６５
【非特許文献８】Ｐａｃｋ ａｎｄ Ｂｅｄｆｏｒｄ．， Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， １９９８， ｐ．４３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の第一の目的は、健康動物体重増加率を改良しえる、動物飼料添加用組合せ化合物を提供することにある。本発明の第二の目的は、コクシジウム症または壊死性腸炎等の細菌感染の予防および／または治療用薬剤の製造への前記化合物の使用を提供することにある。本発明の第三の目的は、動物体重増加率を低下させるアイメリア感染の危険を防止する、動物飼料用の組合せ添加物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の要旨は、プロテアーゼ及びベタインから成るアイメリア感染動物における体重増加促進用飼料添加物に存する。
【００１７】
本発明の第２の要旨は、第１の要旨に記載の飼料添加物から成る動物飼料に存する。
【００１８】
本発明の第３の要旨は、第１の要旨に記載の飼料添加物から成る動物アイメリア感染治療または予防のための薬剤に存する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の動物飼料用添加剤は、飼料への添加により、動物体重増加率を改良する。更に、コクシジウム症および／または細菌感染、並びに壊死性腸炎を起こす疾病等の治療および／または予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】健康ブロイラー鶏の飼料に、ベタイン、プロテアーゼ、及びベタイン及びプロテアーゼの組合せを含有させた場合の効果を示すグラフ。
【図２】アイメリア・マクシマに侵されたブロイラー鶏の飼料に、ベタイン、プロテアーゼ、及びベタイン及びプロテアーゼの組合せを含有させた場合の効果を示すグラフ。
【図３】種々の添加飼料を与えられ、種々の病原体に侵された鶏の回腸内における、ウエルチ菌トキシン遺伝子の存在を示すゲルクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の記述および請求の範囲では、プロテアーゼ活性単位、キシラナーゼ活性単位およびα−アミラーゼ活性単位が記載される。これら活性は、混合酵素または液状酵素混合物に関し、以下のように分析する。
【００２２】
プロテアーゼ活性分析法
プロテアーゼ活性一単位は、以下の条件下において１分間に基質からフェノール性化合物１マイクログラム（ティロシン規定換算）を遊離する酵素量を示す。
【００２３】
＜試薬１＞ ０．６％（ｗ／ｖ）カゼイン基質：
乾燥ハンマーステン・カゼイン（メルク２２４２）０．６ｇを、２００ｍｌビーカーに秤量し、少量（約５ｍｌ）の蒸留水で湿潤させる。カゼインを充分に湿潤させた後、０．２Ｍリン酸水素ジナトリウム溶液２０ｍｌを添加する。得られた混合物を、攪拌下に６０℃で加熱し、カゼインを溶解して乳白溶液を得る。次いで、蒸留水６０ｍｌ及び、必要に応じて、オクチルアルコール（消泡剤：同様の物質を使用してもよい）１〜２滴を添加する。室温まで冷却した後、０．５Ｍ水酸化ナトリウム及び１Ｍ乳酸により溶液のｐＨ値を７．５に調整する。得られた溶液を、容量測定用フラスコに移し、蒸留水を加えて１００ｍｌとする。基質溶液は、低温室に貯蔵すれば、１週間は使用可能である。
【００２４】
＜試薬２＞ ０．２ＭＮａ２ＨＰＯ４溶液：
リン酸水素ジナトリウム二水和物１７．８０ｇを蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて５００ｍｌとする。
【００２５】
＜試薬３＞ ０．２ＭＮａＣｌ溶液：
塩化ナトリウム１．１６８ｇを蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて１，０００ｍｌとする。
【００２６】
＜試薬４＞ 沈殿試薬（ＴＣＡ）：
トリクロロ酢酸（ＣＣｌ３ＣＯＯＨ）１８．８０ｇ、無水酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）１８．１０ｇ及び酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）１８．８０ｇを蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて１，０００ｍｌとする。
【００２７】
＜試薬５＞ フェノール試薬：
分析直前に、フォリン−チオカルトフェノール試薬１部を、蒸留水１部に混合する。
【００２８】
＜試薬６＞ ０．５５ＭＮａ２ＣＯ３溶液：
炭酸ジナトリウム５８．２９５ｇを蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて１，０００ｍｌとする。
【００２９】
＜手順１＞ 酵素サンプル：
酵素希釈液（０．０２ＭＮａＣｌ溶液）１ｍｌを＋４０℃で（約５分間）平衡状態に保持し、これに平衡カゼイン基質５ｍｌを添加し、攪拌した後、＋４０℃正確に３０分培養する。次いで、沈殿剤５ｍｌを添加し、攪拌する。正確に３０分培養した後、即座に濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ−１又はＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ６４０ｗｅ）を通じて濾過する。
【００３０】
次いで、濾液２ｍｌ、０．５５ＭＮａ２ＣＯ３溶液５ｍｌおよびフェノール試薬１ｍｌをピペットにて添加する。得られた溶液を、＋４０℃で３０分攪拌培養する。室温に冷却して、蒸留水に対する６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００３１】
＜手順２＞ 酵素ブランク：
酵素希釈液（０．０２ＭＮａＣｌ溶液）１ｍｌを＋４０℃で（約５分間）平衡状態に保持し、沈殿剤５ｍｌを添加し、＋４０℃で正確に３０分攪拌培養する。これにカゼイン基質５ｍｌを添加した後、＋４０℃で正確に３０分攪拌培養する。得られた溶液を、即座に濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ−１又はＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ６４０ｗｅ）を通じて濾過する。
【００３２】
得られた濾液を、酵素ブランクとする。
【００３３】
酵素サンプルと酵素ブランクとの吸光度差は、０．２〜０．５の範囲にある必要がある。
【００３４】
＜手順３＞ 標準曲線：
Ｌ−チロシン１０ｍｇを、容積測定用フラスコに秤量して、チロシン株溶液を調製し、０．０２ＭＮａＣｌ溶液中に溶解した後、０．０２ＭＮａＣｌ溶液を加えて１００ｍｌとする。
【００３５】
０．０２ＭＮａＣｌ溶液を加えて、前記チロシン株溶液から以下の濃度の希釈液を調製する。
【００３６】
【表１】
【００３７】
各チロシン希釈液２ｍｌ、０．５５ＭＮａ２ＣＯ３溶液５ｍｌおよびフェノール試薬１ｍｌをピペットにて添加する。得られた溶液を、＋４０℃で３０分攪拌培養する。室温に冷却して、蒸留水に対する６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。
吸光度を関数として、チロシン濃度をプロットする。
【００３８】
計算法：
サンプルのプロテアーゼ活性を以下の式から計算する。
【００３９】
活性（Ｕ／ｇ）＝［Ａ（Ｘ）−Ａ（Ｏ）］×ｋ×Ｆ×Ｄｆ／ｔ
【００４０】
式中、Ａ（Ｘ）は、酵素サンプルの吸光度；Ａ（Ｏ）は、酵素ブランクの吸光度；ｋは、標準曲線の傾き；Ｆは、反応希釈係数（＝１１）；Ｄｆは、希釈係数；ｔは、反応時間（３０分）をそれぞれ示す。
【００４１】
キシラナーゼ活性分析法：
キシラナーゼ活性一単位は、以下の条件下において１分間に基質から還元糖１μモル（キシロース規定換算）を遊離する酵素量を示す。
【００４２】
＜試薬１＞ １％（ｗ／ｖ）キシラン基質：
キシラン（Ｆｌｕｋａ９５５９０）１．０ｇに、０．５Ｍ水酸化ナトリウム１０ｍｌを添加する。得られた液を、マグネチックスターラーにより３０分間混合する。ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液約４０ｍｌを添加する。次いで、１Ｍ酢酸によりｐＨ値を５．３に調整した後、ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を加えて、全量を１００ｍｌとする。基質は、使用時に混合して使用する。
【００４３】
＜試薬２＞ １Ｍ酢酸：
氷酢酸５．７ｍｌを、容積測定用フラスコにピペットにより添加し、蒸留水を加えて１００ｍｌとする。
【００４４】
＜試薬３＞ ０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．３：
Ａ：酢酸ナトリウム４．１９ｇを、蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて全量を１，０００ｍｌとする。Ｂ：氷酢酸３．０ｇを、蒸留水に溶解し、更に蒸留水を加えて全量を１，０００ｍｌとする。溶液Ｂを使用して、溶液ＡのｐＨを５．３に調整する。
【００４５】
＜試薬４＞ ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）試薬：
３，５−ジニトロサリチル酸２０．０ｇを、蒸留水約８００ｍｌに懸濁する。得られた懸濁液に、水酸化ナトリウム溶液（蒸留水３００ｍｌ中にＮａＯＨ３２．０ｇを溶解した溶液）３００ｍｌを攪拌下に連続して徐々に添加する。懸濁液を、水浴（浴温：＋４８℃以下）中で攪拌下に溶液が透明になるまで、加熱する。次いで、酒石酸カリウムナトリウム６００ｇを徐々に添加する。得られた溶液を、必要に応じて、溶液が透明になるまで、＋４８℃以下の温度で加熱する。蒸留水で全量を２，０００ｍｌとした後、粗焼結ガラスフィルターを通じて濾過する。
【００４６】
得られた試薬は、室温下に暗色ボトル内に貯蔵する。この試薬は、最長６ヶ月間安定に保持できる。
【００４７】
＜手順１＞ 酵素サンプル：
酵素希釈液（ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中）１ｍｌを＋５０℃で平衡させ、これにキシラン基質１ｍｌを添加し、攪拌した後、＋５０℃正確に３０分培養する。次いで、ＤＮＳ試薬３ｍｌを添加攪拌し、得られた反応混合物を正確に５分間煮沸する。反応混合物を、冷水浴で室温に冷却した後、蒸留水に対する５４０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００４８】
＜手順２＞ 酵素ブランク：
キシラン基質１ｍｌを、＋５０℃で３０分培養する。次いで、ＤＮＳ試薬３ｍｌを添加攪拌する。酵素希釈液（ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中）１ｍｌを添加攪拌する。得られた混合物を正確に５分間煮沸する。反応混合物を、冷水浴中で室温に冷却した後、蒸留水に対する５４０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００４９】
酵素サンプルと酵素ブランクとの吸光度差は、０．３〜０．５の範囲にある必要がある。
【００５０】
＜手順３＞ 標準曲線：
ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中に無水キシロースを溶解して標準溶液を調製した。標準溶液中のキシロース濃度は、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲にある必要がある。標準溶液１ｍｌ、キシラン基質１ｍｌ及びＤＮＳ試薬３ｍｌをピペットにて試験管に取り、正確に５分間攪拌煮沸する。得られた反応液を、冷水浴中で室温に冷却した後、標準ブランクに対する５４０ｎｍにおける吸光度を測定する。標準ブランクは、キシロース溶液を、ｐＨ５．３の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液１ｍｌで置換して調製する。その他は、標準ブランクは、キシロース標準溶液と同様に処理する。
【００５１】
吸光度の関数として、キシロース濃度をプロットする。新たなＤＮＳ試薬に対しては、別個の標準曲線を新たに作成する。
【００５２】
計算法：
サンプルのキシラナーゼ活性を以下の式から計算する。
【００５３】
活性（Ｕ／ｇ）＝
（［Ａ（Ｘ）−Ａ（Ｏ）］×ｋ×Ｃ０）×１０００×Ｄｆ／ＭＷｘｙｌ×ｔ
【００５４】
式中、Ａ（Ｘ）は、酵素サンプルの吸光度；Ａ（Ｏ）は、酵素ブランクの吸光度；ｋは、標準曲線の傾き；Ｃ０は、キシロース標準曲線の切片；１０００は、係数（ｍｍｏｌ＞μｍｏｌ）；Ｄｆは、希釈係数（ｍｌ／ｇ）；ＭＷｘｙｌは、キシロース分子量（１５０．１３ｍｇ／ｍｍｏｌ）；ｔは、反応時間（３０分）をそれぞれ示す。
【００５５】
アミラーゼ活性分析法：
α−アミラーゼ活性一単位とは、以下の条件下において１分間にグリコシド結合１μモルを加水分解する触媒量を示す。
【００５６】
＜試薬１＞ 基質：
基質として、生体外診断用フェイドバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）アミラーゼ試験タブレット（ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉｇｎｏｔｉｃｓ社製）を使用する。前記タブレットは、蒸留水中で、水溶性ブルースターチポリマー、ウシ血清アルブミン及び緩衝液から調製する。
【００５７】
＜試薬２＞ 試薬溶液：
塩化ナトリウム９．０ｇ、ウシ血清アルブミン２．０ｇ及び塩化カルシウム２．２ｇを蒸留水で希釈し、容積測定用フラスコに添加した後、更に蒸留水を加えて全量を１０００ｍｌとする。
【００５８】
＜試薬３＞ ０．５ＭＮａＯＨ溶液：
水酸化ナトリウム２０．０ｇを蒸留水に溶解し、容積測定用フラスコに添加した後、更に蒸留水を加えて全量を１，０００ｍｌとする。
【００５９】
＜試薬４＞ 濾紙：
Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ６４０ｍｎ又は等価物
【００６０】
＜手順１＞ 酵素サンプル：
試薬溶液中の適当な酵素希釈液２００μｌ及び試薬溶液４．０ｍｌをピペットにて試験管に取り、＋３７℃で５分間平衡さる。この溶液に、ペンチにより、基質タブレットを添加し、１０秒間よく混合する。得られた混合物を＋３７℃で正確に１５分間培養する。反応時間の計測は、タブレットの添加から開始する。次いで、０．５ＭＮａＯＨ溶液１．０ｍｌを添加し、よく攪拌する。得られた反応液を、濾過するか又は３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、試薬ブランクに対する６２０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００６１】
＜手順２＞ 試薬ブランク
試薬溶液４．２ｍｌを、＋３７℃で３０分間平衡させる。この溶液に、ペンチにより、基質タブレットを添加し、１０秒間よく混合する。得られた混合物を＋３７℃で正確に１５分間培養する。次いで、０．５ＭＮａＯＨ溶液１．０ｍｌを添加し、よく攪拌する。得られた反応液は、濾過するか又は３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
【００６２】
計算法：
サンプルの吸光度は、α−アミラーゼ活性に比例する。酵素希釈液のα−アミラーゼ活性は、タブレットキットに同封された一覧表から読み取る。各タブレットバッチには、検量表が添付されている。
【００６３】
サンプルのα−アミラーゼ活性を以下の式から計算する。
【００６４】
活性（Ｕ／ｇ）＝Ａｃｔ×Ｄｆ／１０００
【００６５】
式中、Ａｃｔは、フェイドバスアミラーゼ試験表から読み取った酵素希釈液のα−アミラーゼ活性値（Ｕ／ｌ）；Ｄｆは、希釈係数（ｍｌ／ｇ）；１０００は、（リットルをｍｌに換算するための）係数をそれぞれ示す。
【００６６】
以下の記載において、獣医免疫学および免疫病理学、ワクチン、動物薬学及び動物畜産学の当業者の一般的知識を構成する種々の方法論が参照される。かかる公知の方法論を記載した刊行物および他の資料としては以下のものが挙げられる。
【００６７】
獣医科学の一般原理は、例えば、「メルク・獣医学マニアル（Ｍｅｒｃｋ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第６版、フレザー（Ｆｒａｓｅｒ）他編（１９８６）；「食料および薬剤局（ＦＤＡ）１９９４、飼料添加剤解説」米国食料および薬剤局、１９９４；「獣医学研究および開発、パート６：抗コクシジウム」ロイド・エバンス（Ｌｌｏｙｄ−Ｅｖａｎｓ，Ｌ．Ｐ．Ｍ．）編、ＰＪＢパブリケーション社；「家禽類の疾病」カルネック（Ｂ．Ｗ．Ｃａｌｎｅｋ）編、アイオワ州立大学プレス、アメス、アイオワ、１９９１等に記載される。
【００６８】
動物畜産学の一般原理は、例えば、パトリック（Ｈ．Ｐａｔｒｉｃｋ）他著「家禽類」；「飼料および栄養摂取」第２版、ＡＶＩパブリッシング社、ウエストポート、コネチカット（１９８０）等に記載される。
【００６９】
また、薬剤科学の一般原理は、例えば、「レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ）薬剤科学」第１８版、ジェナロー（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）編、マック・パブリッシング社、イーストン、ペンシルバニア（１９９０）等に記載される。上記したように、本発明によれば、プロテアーゼ及び第４級アミンカルボン酸内部塩の、コクシジウム症、細菌感染または特にウエルチ菌感染から生じる壊死性腸炎の治療および／または予防用薬剤製造への使用が提供される。ベタイン及びプロテアーゼの組合せを含む飼料を使用した場合の利点としては、ルーチン的に飼料に添加されている抗菌剤の含量を減少させることができるか、または場合によっては、完全に省略することができる。かかる抗菌剤の使用が禁止されている地域では、本発明は、細菌症の抑制に新たなアプローチを提供するものである。
【００７０】
動物食から抗生物質を除くと、幾つかの更なる利点が得られる。以前は、屠殺前に動物食における抗生物質の使用を中止する必要があった。これによって、かかる薬剤を比較的に非含有である食肉を提供するとともに、当該食肉を、ヒトの消費に適合させていた。これと対照的に、動物食から抗生物質が完全に省略された場合、本発明で達成されたように、動物は、使用中止期間経過後でなくとも、如何なる年齢でも屠殺可能となる。これによって、農業従事者に柔軟性を持たせるとともに、動物が屠殺直前に感染する危険を取除くことができる。更に、確実に、抗生物質を非含有な食肉および鶏卵の生産が保証される。かかる保証の無い製品に比して、上記の食肉および鶏卵は、市場的に有利である。
【００７１】
本発明は、また、ヒトの健康に有利である。本発明の使用は、抗生物質を動物飼料から取除くことによって、細菌の耐抗生物質株の淘汰性を低下させることができる。従って、より抗生物質の利きやすい菌株が、動物の消化管に存在するため、同様のヒト条件で抗生物質を使用する場合、細菌致死効果をより確実に得ることができる。
【００７２】
本発明の飼料添加剤は、多数の方法で調製できる。前記飼料は、例えば、適当な異なる化合物を混合して簡単に製造することができる。得られる添加剤は、次いで、直接飼料と混合するか、又はより従来的には、製粉コムギ、トウモロコシ又は大豆粉等の穀物系キャリアー物質上に含浸させる。かかる含浸キャリアーは、また、本発明の第４の要旨に従った飼料添加剤を構成する。
【００７３】
飼料添加剤は、直接動物飼料と混合されてもよく、または、ビタミン飼料添加剤、ミネラル飼料添加剤またはアミノ酸飼料添加剤等の他の飼料添加剤の１種以上と混合されてもよい。得られた、幾つかの異なるタイプの成分を含む飼料添加剤は、次いで、適当な量で、飼料と混合される。また、上記飼料添加剤は、動物が摂取する第２の（異なる）飼料または飲料水中に添加することにより、動物食中に含有させることができる。従って、本発明の添加剤を、通常の穀物系動物主飼料に含有させることは、特に好ましい実施形態ではあるが、必ずしも必須ではない。
【００７４】
本発明により提供される飼料添加剤は、好ましい他の酵素との予備混合物として調合することもできる。前記予備混合物は、飼料製造前、飼料製造中、又は使用に供する前の飼料の最終段階で、原料に添加することができる。また、内部塩およびプロテアーゼの組合せを、ペレット又はマッシュ形状に予備成形された飼料物質に直接添加することができる。
【００７５】
本発明の添加剤を動物飼料に含有させた場合、得られた飼料は、穀類を、少なくとも２５重量％、好ましくは少なくとも３５重量％の割合で含有する。穀類としては、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、トリチケール（ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、イネ及びモロコシの１種以上を使用することができる。これらの中で、特に好ましい穀類としては、コムギ又はトウモロコシが挙げられる。穀類が、トウモロコシの場合、添加剤または薬剤は、好ましくは、更にα−アミラーゼを含む。
【００７６】
穀物系食餌の穀物成分は、タンパク源を構成するが、通常、食餌内に、魚粉、肉粉または野菜等から誘導される追加のタンパク源を含有させる必要がある。これら追加のタンパク源は、動物飼料に対し５０重量％以下の割合で含有される。植物タンパク源としては、脂肪分の豊富なダイズ、アブラナ、キャノーラ、大豆粉、アブラナ粉およびキャノーラ粉の少なくとも１種が含有される。
【００７７】
第４級アミンカルボン酸内部塩は、以下の一般構造式を有する。
【００７８】
Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｎ＋−Ｌ−ＣＯＯ−
【００７９】
式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に有機基を示し、好ましくはアルキル基、より好ましくは炭素数１〜６のアルキル基、最も好ましくは全てがメチル基であり；結合基−Ｌ−は、アルコキシアルキル又はアルキレン等の有機結合基、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキレン、最も好ましくはメチレンを示す。）第４級アミンカルボン酸内部塩の具体例としては、ベタイン（Ｍｅ３Ｎ＋ＣＨ２ＣＯＯ−）、Ｍｅ３Ｎ＋−ＣＨＭｅＣＯＯ−、Ｅｔ３Ｎ＋ＣＨ３ＣＯＯ−、Ｍｅ３ＥｔＮ＋ＣＨ２ＣＯＯ−、Ｍｅ３Ｎ＋ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−、Ｍｅ３Ｎ＋ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＯ−及びＭｅ３Ｎ＋Ｃ（ＣＨＭｅ３）ＨＣＯＯ−が挙げられる。好ましい内部塩としては、商品名「Ｂｅｔａｆｉｎ（登録商標）」の下にフィンフィーズ社から市販されるベタインが挙げられる。
【００８０】
内部塩は、飼料１ｋｇ当たり好ましくは０．０１〜２０ｇ、より好ましくは０．１〜１０ｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．５〜２ｇ／ｋｇの割合で、飼料中に含有される。
【００８１】
使用されるプロテアーゼは、如何なる形態でもよいが、４０，０００Ｕ以上の活性を有するバシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から誘導されるサブチリシンの使用が好ましい。かかるサブチリシンは、例えば、米国特許第４，７６０，０２５号に記載される。プロテアーゼは、飼料１ｋｇ当たり１００Ｕ〜１００，０００Ｕ、好ましくは５００Ｕ〜１０，０００Ｕに相当するプロテアーゼ活性を示す量で、飼料中に含有される。好適なプロテアーゼとしては、これに限定しないが、Ｎｏｖｏ ＮＥＵＴＲＡＳＥ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）及びＭＡＸＡＰＥＭ（商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社）等の市販プロテアーゼが挙げられる。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態において、薬剤または添加剤は、更に、キシラナーゼを含む。キシラナーゼは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ヒューミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ネオカリマスチス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）又はサーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）等の菌類から誘導することができる。好ましいキシラナーゼとしては、国際公開公報第ＷＯ９２／０６２０９号の実施例２２に記載されるトリコデルマ・ロンギブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）から得られる低ｐＩキシラナーゼ及び／又は高ｐＩキシラナーゼが、挙げられる。キシラナーゼは、また、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、マイクロテトラスポーラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）又はルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）等の細菌類から得ることができる。また、キシラナーゼは、宿主細菌または菌株内の適当な遺伝子の混入等の遺伝子操作を行った宿主から得ることもできる。キシラナーゼ活性は、約３，０００Ｕが好ましい。トリコデルマ・ロンギブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）から得られる３，０００Ｕ／ｇの最小活性を有するキシラナーゼは、「ＡＶＩＺＹＭＥ（登録商標）」の商品名でフィンフィーズ・インターナショナル社から市販されている。キシラナーゼは、飼料１ｋｇ当たり１００Ｕ〜１００，０００Ｕ、好ましくは２００Ｕ〜１，０００Ｕに相当するキシラナーゼ活性を示す量で、飼料中に含有される。
【００８３】
本発明の別の好ましい実施形態において、トウモロコシ含有飼料に添加される薬剤または添加剤中には、更に、α−アミラーゼが、含有されていてもよい。本発明では如何なる形態のα−アミラーゼも使用できるが、好ましくは、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から得られる４，０００Ｕ／ｇの最小活性を有するα−アミラーゼが使用される。かかるバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から得られる４，０００Ｕ／ｇの最小活性を有するα−アミラーゼは、「ＡＶＩＺＹＭＥ（登録商標）」の商品名でフィンフィーズ・インターナショナル社から市販されている。α−アミラーゼは、飼料１ｋｇ当たり１０Ｕ〜１００，０００Ｕ、好ましくは１００Ｕ〜４，０００Ｕに相当するα−アミラーゼ活性を示す量で、飼料中に含有される。
【００８４】
内部塩、プロテアーゼ、並びに任意にキシラナーゼ及びα−アミラーゼは、使用前に混合されても、又飼料に別々に添加されてもよい。プロテアーゼ、キシラナーゼ及びα−アミラーゼの組合せは、「ＡＶＩＺＹＭＥ（登録商標）１５１０」の商品名でフィンフィード・インターナショナル社から市販されている。これら酵素の別の組合せは、「ＡＶＩＺＹＭＥ（登録商標）１５００」の商品名で乾燥予備混合物の形態のものが市販されている。なお、プロテアーゼを他のタンパクと一緒に長期間保存すると、後者の変質を生じるため、一般には、このような保存は避けるべきである。
【００８５】
本発明の飼料添加剤は、広範囲の動物に使用可能であるが、特に、家畜類および放牧家畜に使用するのが好ましい。本発明が特に好ましく適用される動物としては、鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ等の家禽類、ウシ、ウマ、ヒツジ等の反芻動物、ブタ等のイノシシ類、ラビット等の齧歯類および魚類が挙げられる。本発明は、特に、ブロイラー鶏に有用である。
【００８６】
本発明の添加剤は、その効能レベルが、コクシジウム誘起病原体、特に、アイメリア種、例えば、アイメリア種に属するネカトリクス（ｎｅｃａｔｒｉｘ）、ガロパルボニス（ｇａｌｌｏｐａｒｖｏｎｉｓ）、メラグリミチス（ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）、イノキュア（ｉｎｎｏｃｕａ）、メラグリヂス（ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、サブロチュンダ（ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａ）、ディスパーサ（ｄｉｓｐｅｒｓａ）、トランカタ（ｔｒｕｎｃａｔａ）、アセルブリナ（ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、ブルネティ（ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、マクシマ（ｍａｘｉｍａ）、ミチス（ｍｉｔｉｓ）、プラコックス（ｐｒａｅｃｏｘ）及びテネラ（ｔｅｎｅｌｌａ）等の病原体に起因する影響を軽減するように処方することができる。より好ましくは、本添加剤は、アイメリア感染動物の体重回復増加を促進させる。
【００８７】
また、本発明の添加剤は、その効能レベルが、アイメリア種、特に、アイメリア種に属するＥ．アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、Ｅ．ブルネティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、Ｅ．マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、Ｅ．ミチス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、Ｅ．ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、Ｅ．プラコックス（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）及びＥ．テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）等の感染に起因する家禽類の悪影響を軽減するように処方することができる。
【００８８】
更に、本発明の添加剤は、その効能レベルが、アイメリア種に属するズエリニ（ｚｕｅｒｎｉｉ）、ボビス（ｂｏｖｉｓ：スミシィ（ｓｍｉｔｈｉｉ））、エリプソイドリス（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｌｉｓ）等に感染したウシに誘起される悪影響を軽減するように処方することができる。
【００８９】
本発明の添加剤は、その効能レベルが、アイメリア種のアルロインギ Ａ（ａｒｌｏｉｎｇｉ Ａ：オビナ（ｏｖｉｎａ））、ウェイブリッジエンシス（ｗｅｙｂｒｉｄｇｅｎｓｉｓ：アルロンギス Ｂ（ａｒｌｏｎｇｉｓ Ｂ））、クランダリス（ｃｒａｎｄａｌｉｓ）、アサタ（ａｈｓａｔａ）、オビノイダリス（ｏｖｉｎｏｉｄａｌｉｓ）、ギルルーシ（ｇｉｌｒｕｔｈｉ）等に感染したヒツジに誘起される悪影響を軽減するように処方することができる。
【００９０】
本発明の添加剤は、その効能レベルが、アイメリア種に感染した、例えば、アイメリア種に属するアルロインギ（ａｒｌｏｉｎｇｉ）、ファウレイ（ｆａｕｒｅｉ）、カプロイナ（ｃａｐｒｏｉｎａ）、ニナコールヤキモバ（ｎｉｎａｋｏｈｌｙａｋｉｎｏｖａｅ）、クリステンセニ（ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉ）等によるイミュニゼーション状態のヤギに誘起される悪影響を軽減するように処方することができる。
【００９１】
本発明の添加剤は、その効能レベルが、アイメリア種に感染した、例えば、アイメリア種に属するデブリーキ（ｄｅｂｌｉｅｃｋｉ）、スカブラ（ｓｃａｂｒａ）、ペニニュータ（ｐｅｎｎｉｎｕｔａ）等によるイミュニゼーション状態のブタに誘起される悪影響、並びにイソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）種、例えば、イソスポラ・スイス（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｓｕｉｓ）によって誘起される悪影響を軽減するように処方することができる。
【００９２】
本発明の添加剤は、その効能レベルが、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サルモネラ、キャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ：グラム陰性桿菌）、Ｅ．ｃｏｌｉ及びリステリア（ｌｉｓｔｅｒｉａ）、特に、ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）及びキャンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）等の細菌に感染した家禽類に誘起される悪影響を軽減するように処方することができる。ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）は、壊死性腸炎の主原因の一つであるため、本発明の栄養添加剤は、従って、壊死性腸炎の治療および／または予防用薬剤調製に使用することができる。
【００９３】
更なる薬学的方法を使用することによって、作用期間を制御することもできる。ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プロタミンサルフェート等の適当なマクロ分子を選択し、かつこれらを確かな手順にしたがって組み合わせることによって、薬剤の制御放出が可能となる。また、内部塩およびプロテアーゼの作用期間は、これら薬剤を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリ乳酸またはエチレン酢酸ビニル共重合体等のポリマー粉末に包含させることによって制御できる。別の方法としては、内部塩およびプロテアーゼを、マイクロカプセル内に封入してもよい。上記マイクロカプセルの製造および使用に関する種々の材料および方法は、「レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ）薬剤科学」第１６版、オスロー（Ａ．Ｏｓｌｏｗ）編、マック・パブリッシング社、イーストン、ペンシルバニア（１９８０）に記載される。
【００９４】
内部塩およびプロテアーゼを動物飼料の形で動物に投与する本発明の上記実施形態に加えて、本発明の更なる実施形態では、内部塩およびプロテアーゼを含有する他の組成物を、ワクチン、栄養分または医薬を含む所望の組成物と共に、投与することもできる。
【実施例】
【００９５】
実施例１：
以下の実施例では、本発明の飼料添加剤を、健康動物の飼料に包含させた場合の効果、並びにアイメリア感染の治療用薬剤の製造に適用した場合を示す。
【００９６】
（ａ）一般手順：
９６羽の雌ブロイラーひな鳥（ロス（Ｒｏｓｓ）２０８）を、２４羽ずつ４つのグループに分けた。飼料投与を０日目より開始し、１４日目にアイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）の投与を行った。かかる投与は、アイメリア・アサービュリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）及びアイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）のオーシストを水道水２ｍｌ中に溶かし込んで、ひな鳥のソノウに接種した。一羽当たりの投与量は、アイメリア・アサービュリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）１００，０００オーシスト及びアイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）５０，０００オーシストであった。これら２種のアイメリア種は、空間的に腸内で分離される。即ち、アイメリア・アサービュリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）は、十二指腸及び空腸前部に感染し、一方アイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）は、小腸中央部、つまり空腸末端から回腸中央までの部分を好む。被験鳥を、ケージで０〜１４日間、木くずを敷いた開放オリで１４〜２１日間保持した。
【００９７】
被験鳥に投与された飼料は、コクシジウム抑制薬非含有のコーン・大豆系飼料であった。飼料は、直径約５ｍｍの脆い小ペレットにコールドプレスした。開始飼料は、０〜１４日で使用され、仕上げ飼料は、１４〜２１日で使用された。添加剤を、飼料ペレットに噴霧した。具体的には、ベタイン水溶液を、飼料１ｋｇ当たり１ｇの投与量で、及びキシラナーゼ３００Ｕ／ｇ、プロテアーゼ４，０００Ｕ／ｇ及びα−アミラーゼ４００Ｕ／ｇから成る、「ＡＶＩＺＹＭＥ（登録商標）１５１０」（フィンフィード・インターナショナル社製）の水溶液を、飼料１ｋｇ当たり１ｇの投与量で、飼料に添加した。使用した飼料組成を、以下の表に示す。
【００９８】
【表２】
【００９９】
これら飼料の栄養組成を、以下の表に示す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
（ｂ）結果：
被験鳥の体重を、１４日目のアイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）の投与直前に測定した。表４に示すように、ベタイン及びプロテアーゼの組合せ使用は、これら化合物を個別に飼料に添加した場合に比して、大きな体重増加を示すことが判る。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
表４の結果を、図１にグラフで示す。
【０１０４】
被験鳥の体重を、２１日目、即ち、アイメリア投与から７日目に再び測定した。結果を、表５に要約する。グループＤでは、ベタイン又はプロテアーゼのいずれかを添加した飼料を使用したグループＢ及びＣに比して、体重の改善が見られた。また、これら２成分の組合せによって、個々の成分の効果の合計よりも大きな向上が見られた。
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
表５の結果を、図２にグラフで示す。
【０１０７】
実施例２：
本実施例では、ウェルチ菌感染に対する、実施例１で使用されたベタイン及びプロテアーゼの組合せの活性を検証する。使用飼料は、実施例１に記載の仕上げ飼料と同一である。
【０１０８】
（ａ）一般手順：
生後２１日の１２羽の鶏を、４羽ずつの３つのグループＥ、Ｆ及びＧに分けた。グループＥには、アイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）を投与し、グループＦは、ウェルチ菌を投与し、グループＧは、アイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）とウェルチ菌を同時投与した。ウェルチ菌α−トキシン遺伝子が、以下のように全体微生物ＤＮＡから検出された。ウェルチ菌α−トキシン遺伝子の公知のヌクレオシド配列に従って形成されたプライマーを使用して、盲腸の全体微生物ＤＮＡを、ポリマラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）させた。α−トキシンプライマーの配列およびＰＣＲ反応の実施条件は、ソンガー（Ｓｏｎｇｅｒ）及びデ・ミーア（ｄｅ Ｍｅｅｒ）著「Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．」１９９７年６月；５８（７）、７０２〜７０５頁に記載される。
【０１０９】
（ｂ）結果
図３で示すゲルクロマトグラムのレーン３における強い帯域は、動物内に内因性ウェルチ菌α−トキシン遺伝子が存在することを示す。レーン２及び４における強い帯域の欠如により、アイメリア投与が、ウェルチ菌感染の必須前提条件であることが判る。何かの理論を持ち出すまでもなく、アイメリア投与は、腸内のプロテアーゼの通常レベルを低下させ、腸上部域での栄養分摂取を減少させ、この結果盲腸内でのタンパクレベルを増加（ウェルチ菌に好適な成長条件）させることが分かる。更に重要な点は、宿主動物の免疫系に対するアイメリア投与の効果である。免疫系が、既にアイメリア投与により先に占有されている場合は、ウェルチ菌投与に対する免疫応答が弱まる傾向がある。
【０１１０】
図３に示すレーン６及び７の比較から、ウェルチ菌α−トキシン遺伝子を示す帯域が、プロテアーゼのみの処理（レーン６）では観測されるが、ベタイン及びプロテアーゼを組合せ使用した場合（レーン７）では観測されないことが分かる。更に、ベタインはウェルチ菌投与に対し有効でないことが、一般共通知識となっている。従って、ベタイン及びプロテアーゼの組合せは、ウェルチ菌感染に対し有効であるが、他方ベタイン又はプロテアーゼのいずれか一方を個別に使用した場合は、ウェルチ菌感染を効果的に抑制できない。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明の動物飼料用添加剤は、飼料への添加により、動物体重増加率を改良する。更に、コクシジウム症および／または細菌感染、並びに壊死性腸炎を起こす疾病等の治療および／または予防に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ及び第４級アミンカルボン酸内部塩（Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｎ＋−Ｌ−ＣＯＯ−で示され、Ｒ１Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に有機基を示し、結合基−Ｌ−は有機結合基を示す）から成るアイメリア感染動物における体重増加促進用飼料添加物。
【請求項２】
更にキシラナーゼ及び／又はα−アミラーゼを含む請求項１に記載の飼料添加物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の飼料添加物から成る動物飼料。
【請求項４】
動物飼料中の第４級アミンカルボン酸内部塩含有量が、飼料１ｋｇ当たり０．０１〜２０ｇである請求項３に記載の動物飼料。
【請求項５】
動物飼料中のプロテアーゼ含有量が、飼料１ｋｇ当たり１００〜１００，０００Ｕのプロテアーゼ活性に相当する請求項３又は４に記載の動物飼料。
【請求項６】
キシラーゼを含有し、飼料中のキシラーゼ含有量が、飼料１ｋｇ当たり１００〜１００，０００Ｕのキシラーゼ活性に相当する請求項３〜５の何れかに記載の動物飼料。
【請求項７】
α−アミラーゼを含有し、飼料中のα−アミラーゼ含有量が、飼料１ｋｇ当たり１０〜１００，０００Ｕのα−アミラーゼ活性に相当する請求項３〜６の何れかに記載の動物飼料。
【請求項８】
少なくとも２５重量％の穀類を含有する請求項３〜７の何れかに記載の動物飼料。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の飼料添加物から成る動物アイメリア感染治療または予防のための薬剤。
【請求項１】
プロテアーゼ及び第４級アミンカルボン酸内部塩（Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｎ＋−Ｌ−ＣＯＯ−で示され、Ｒ１Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に有機基を示し、結合基−Ｌ−は有機結合基を示す）から成るアイメリア感染動物における体重増加促進用飼料添加物。
【請求項２】
更にキシラナーゼ及び／又はα−アミラーゼを含む請求項１に記載の飼料添加物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の飼料添加物から成る動物飼料。
【請求項４】
動物飼料中の第４級アミンカルボン酸内部塩含有量が、飼料１ｋｇ当たり０．０１〜２０ｇである請求項３に記載の動物飼料。
【請求項５】
動物飼料中のプロテアーゼ含有量が、飼料１ｋｇ当たり１００〜１００，０００Ｕのプロテアーゼ活性に相当する請求項３又は４に記載の動物飼料。
【請求項６】
キシラーゼを含有し、飼料中のキシラーゼ含有量が、飼料１ｋｇ当たり１００〜１００，０００Ｕのキシラーゼ活性に相当する請求項３〜５の何れかに記載の動物飼料。
【請求項７】
α−アミラーゼを含有し、飼料中のα−アミラーゼ含有量が、飼料１ｋｇ当たり１０〜１００，０００Ｕのα−アミラーゼ活性に相当する請求項３〜６の何れかに記載の動物飼料。
【請求項８】
少なくとも２５重量％の穀類を含有する請求項３〜７の何れかに記載の動物飼料。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の飼料添加物から成る動物アイメリア感染治療または予防のための薬剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−４１５７６（Ｐ２０１１−４１５７６Ａ）
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５６２６３（Ｐ２０１０−２５６２６３）
【出願日】平成２２年１１月１６日（２０１０．１１．１６）
【分割の表示】特願２００１−５４３１３９（Ｐ２００１−５４３１３９）の分割
【原出願日】平成１２年１２月８日（２０００．１２．８）
【出願人】（５０００２６５２２）フィンフィーズ・インターナショナル・エルティーディー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１６日（２０１０．１１．１６）
【分割の表示】特願２００１−５４３１３９（Ｐ２００１−５４３１３９）の分割
【原出願日】平成１２年１２月８日（２０００．１２．８）
【出願人】（５０００２６５２２）フィンフィーズ・インターナショナル・エルティーディー (1)
【Ｆターム（参考）】
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